ES2517872T3 - Anticuerpos humanos de alta afinidad para el factor de crecimiento nervioso humano - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo humano o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo que se une específicamente con el factor de crecimiento nervioso humano (NGF) con una KD de 1 pM o menos, medida por resonancia de plasmón superficial, donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende (a) una región determinante de complementariedad de cadena pesada 3 (HCDR3) y una CDR3 de cadena ligera (LCDR3), donde la HCDR3 y LCDR3 comprenden las secuencias de aminoácidos expuestas en SEC ID Nº: 90 y 98, respectivamente, y (b) una HCDR1, HCDR2, LCDR1 y LCDR2, donde la HCDR1 es SEC ID Nº: 86, HCDR2 es SEC ID Nº: 88, LCDR1 es SEC ID Nº: 94 y LCDR2 es SEC ID Nº: 96.

Description

Anticuerpos humanos de alta afinidad para el factor de crecimiento nervioso humano

5 Campo de la invención

La presente invención se refiere a anticuerpos humanos y a fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos humanos que se unen específicamente con el factor de crecimiento nervioso humano (NGF), y a métodos terapéuticos para usar esos anticuerpos.

Declaración de técnica relacionada

El factor de crecimiento nervioso (NGF) fue la primera neurotrofina identificada, y su papel en el desarrollo y supervivencia de neuronas tanto periféricas como centrales se ha caracterizado bien. Se ha mostrado que el NGF es

15 un factor de supervivencia y mantenimiento crítico en el desarrollo de neuronas sensoriales embrionarias y simpáticas periféricas y de neuronas colinérgicas del prosencéfalo basal (Smeyne et al. (1994) Nature 368: 246-249; Crowley et al. (1994) Cell 76: 1001-1011). El NGF regula positivamente la expresión de neuropéptidos en neuronas sensoriales (Lindsay et al. (1989) Nature 337: 362-364) y su actividad está mediada mediante dos receptores unidos a membrana diferentes, el receptor TrkA y el receptor de neurotrofina común p75.

El NGF está elevado en líquido sinovial en pacientes que padecen artritis reumatoide y otros tipos de artritis. Se ha mostrado que los antagonistas de NGF previenen la hiperalgesia y alodinia en modelos animales de dolor inflamatorio neuropático y crónico.

25 Se describen anticuerpos anti-NGF, por ejemplo, en los documentos WO 01/78698, WO 02/096458, WO 2004/032870, Publicaciones de Patente de Estados Unidos 2005/0074821, 2004/0237124 y 2004/0219144.

Breve sumario de la invención

La invención se refiere a anticuerpos completamente humanos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen específicamente con el factor de crecimiento nervioso humano (NGF) con una KD de 1 pM o menos y no reaccionan de forma cruzada con neurotrofina-3 (NT-3). Estos anticuerpos se caracterizan por unirse con NGF con alta afinidad, alta especificidad y por la capacidad de neutralizar la actividad de NGF. En realizaciones preferidas, el anticuerpo o fragmento del mismo se une con NGF humano aproximadamente 2-10 veces más que NGF de rata y/o

35 NGF de ratón.

Los anticuerpos pueden ser de longitud completa (por ejemplo, un anticuerpo IgG1 o IgG4) o pueden comprender solamente una parte de unión a antígeno (por ejemplo, un fragmento Fab, F(ab’)2 o scFv), y pueden modificarse para efectuar funcionalidad, por ejemplo, para eliminar funciones efectoras residuales (Glu que elimina funciones efectoras residuales (Reddy et al. (2000) J. Immunol. 164: 1925-1933).

La invención proporciona por lo tanto un anticuerpo humano o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo que se une específicamente con el factor de crecimiento nervioso humano (NGF) con una KD de 1 pM o menos, medida por resonancia de plasmón superficial, donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende (a) una región

45 determinante de complementariedad de cadena pesada 3 (HCDR3) y una CDR3 de cadena ligera (LCDR3), comprendiendo la HCDR3 y LCDR3 las secuencias de aminoácidos expuestas en SEC ID Nº: 90 y 98, respectivamente, y (b) una HCDR1, HCDR2, LCDR1 y LCDR2, donde la HCDR1 es SEC ID Nº: 86, HCDR2 es SEC ID Nº: 88, LCDR1 es SEC ID Nº: 94 y LCDR2 es SEC ID Nº: 96.

En realizaciones específicas, el anticuerpo o fragmento del mismo comprende un par de secuencias HCVR y LCVR (HCVR/LCVR) de SEC ID Nº: 108/110.

La invención también proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican dichos anticuerpos anti-NGF o fragmentos de los mismos. La invención abarca también vectores de expresión recombinante que portan los ácidos

55 nucleicos de la invención, y células hospedadoras en las que se han introducido dichos vectores, así como métodos para producir los anticuerpos cultivando las células hospedadoras en condiciones que permitan la producción de los anticuerpos, y recuperando los anticuerpos producidos.

La invención presenta un anticuerpo completamente humano o fragmento de anticuerpo que bloquea la actividad de NGF con una CI50 de menos de aproximadamente 10 nM, medida en un el ensayo basado en células PC12 in vitro (descrito posteriormente). En una realización preferida, el anticuerpo de la invención muestra una CI50 de aproximadamente 500 pM o menos; aún más preferentemente, una CI50 de aproximadamente 100 pM o menos; aproximadamente 50 pM o menos; o aproximadamente 25 pM o menos.

65 La invención proporciona un anticuerpo humano aislado, o una parte de unión a antígeno del mismo, que se une con el NGF con una KD de menos de aproximadamente 1 pM, como se determina por resonancia de plasmón superficial

(BIACORE™). En una realización preferida, el anticuerpo anti-NGF humano o fragmento de anticuerpo de la invención se une con el NGF humano con una KD de aproximadamente 0,5 pM o menos. El anticuerpo o fragmento del mismo también se une preferentemente con NGF humano con una afinidad aproximadamente 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces o 10 veces mayor que con el NGF de rata y aproximadamente

5 2 veces, 2,5 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces o 10 veces mayor que con el NGF de ratón.

En una realización preferida, el anticuerpo o fragmento del mismo muestra alta especificidad por el NGF humano, por ejemplo, no reacciona de forma cruzada con la neurotrofina-3 (NT-3) estrechamente relacionada. Por lo tanto, en 10 una realización preferida, el anticuerpo de alta afinidad y alta selectividad o fragmento del mismo muestra una KD, medida por resonancia de plasmón superficial, por el NGF humano de 1,0 pM o menos, inhibe la unión del NGF con los receptores TrkA y p75, y no reacciona de forma cruzada con la NT-3 humana. La NT-3 desempeña un papel crítico en procesos fisiológicos tales como, por ejemplo, coordinación de las neuronas motoras musculares y, por lo tanto, anticuerpos o fragmentos de anticuerpo que no reaccionan de forma cruzada con NT-3 proporcionan una 15 ventaja terapéutica y clínica inesperada frente a los anticuerpos de la técnica anterior. Se ha mostrado que la NT-3 previene el desarrollo de hiperalgesia térmica en el modelo de CCI de dolor neuropático (véase, por ejemplo, Wilson-Gerwing et al. (2005) J Neuroscience 25: 58-767). Más recientemente, se ha mostrado que la NT-3 exógena reduce significativamente la expresión de estos canales de sodio que parecen desempeñar un papel en la generación del dolor neuropático (Wilson-Gerwing y Verge (2006) Neuroscience 141: 2075-2085). Estos datos sugieren un papel

20 beneficioso de la NT-3 en el dolor neuropático.

La invención abarca anticuerpos anti-NGF que tienen un patrón de glucosilación modificado. En algunas aplicaciones, la modificación para retirar sitios de glucosilación indeseables puede ser útil, o un anticuerpo que carece de un resto de fucosa presente en la cadena de oligosacáridos, por ejemplo, para aumentar la función de

25 citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) (véase Shield et al. (2002) JBC 277: 26733). En otras aplicaciones, puede realizarse una modificación de la galactosilación para modificar la citotoxicidad dependiente de complemento (CDC).

La invención presenta una composición que comprende un anticuerpo humano recombinante o fragmento del mismo

30 que se une específicamente con NGF y un vehículo aceptable. En un aspecto relacionado, la invención presenta una composición que es una combinación de un inhibidor de NGF y un segundo agente terapéutico. En una realización, el inhibidor de NGF es un anticuerpo o fragmento del mismo. En una realización preferida, el segundo agente terapéutico es cualquier agente terapéutico adecuado que se combine provechosamente con un inhibidor de NGF.

35 La invención se refiere a la inhibición de la actividad de NGF humano usando el anticuerpo anti-NGF o parte de unión a antígeno del anticuerpo de la invención. El trastorno tratado es cualquier enfermedad o afección que se mejore, alivie, inhiba o prevenga por la retirada, inhibición o reducción de la actividad de NGF. Más específicamente, la invención se refiere al tratamiento de una afección o enfermedad mediada por NGF tal como dolor inflamatorio, dolor por incisión postoperatorio, síndrome de dolor regional complejo, dolor por cáncer de hueso metastásico o

40 primario, dolor neuropático, dolor por fractura, dolor por fractura osteoporótico, dolor resultante de quemaduras, osteoporosis, dolor de articulación gotosa, dolores asociados con crisis de anemia falciforme, y otros dolores nocicépticos, así como carcinoma hepatocelular, cáncer de mama y cirrosis hepática, administrando un inhibidor de NGF, tal como el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invención, como un único agente, o con un segundo agente terapéutico. En realizaciones preferidas del dolor neuropático, se tratan preferentemente neuralgia del

45 trigémino referida, neuralgia postherpética, dolor de miembro fantasma, fibromialgia, distrofia simpática refleja y afecciones de dolor neurogénico. El segundo agente terapéutico puede ser un inhibidor de interleucina-1 (IL-1), por ejemplo, una proteína de fusión tal como la descrita en el documento U.S. 6.927.044; o un fármaco antiepiléptico, tal como gabapentina, pregabalina, topiramato; o un antidepresivo tricíclico, tal como amitriptilina; celecoxib; un antagonista de citocina, tal como una proteína antagonista o anticuerpo contra IL-1, IL-6, IL-6R, IL-18 o IL-18R. El

50 segundo agente terapéutico puede ser una neurotrofina, por ejemplo, NT-3.

La invención también proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno como se ha descrito anteriormente para su uso para atenuar o inhibir una enfermedad o afección mediada por NGF en un ser humano. La enfermedad

o afección mediada por NGF se inhibe sin deterioro significativo de la coordinación motora, y es una de dolor

55 inflamatorio, dolor por incisión postoperatoria, dolor neuropático, dolor por fractura, dolor de articulación gotosa, neuralgia postherpética, dolor resultante de quemaduras, dolor por cáncer, osteoartritis o dolor por artritis reumatoide, ciática, dolor asociado con crisis de anemia falciforme o neuralgia postherpética.

En un aspecto relacionado, la invención proporciona el uso de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de un

60 anticuerpo como se ha descrito anteriormente en la preparación de un medicamento para su uso para atenuar o inhibir una enfermedad o afección mediada por NGF en un ser humano como se ha enumerado anteriormente.

Otros objetos y ventajas resultarán evidentes a partir de una revisión de la siguiente descripción detallada.

Descripción detallada

Debe entenderse que la presente invención no se limita a métodos particulares y condiciones experimentales descritas, ya que dichos métodos y condiciones pueden variar. También debe entenderse que la terminología usada 5 en el presente documento es para el fin de describir solamente realizaciones particulares, y no se pretende que sea limitante, ya que el alcance de la presente invención estará limitado solamente por las reivindicaciones adjuntas.

A no ser que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que se entiende habitualmente por un experto habitual en la materia a la que pertenece la presente invención. Aunque puede usarse cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en el presente documento en la práctica o ensayo de la presente invención, se describen ahora los métodos y materiales preferidos.

Definiciones

15 La expresión “factor de crecimiento nervioso humano” o “NGF”, como se usa en el presente documento, se refiere a NGF humano que tiene la secuencia de ácido nucleico mostrada en SEC ID Nº: 1 y la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 2, o un fragmento biológicamente activo del mismo.

Se entiende que el término “anticuerpo”, como se usa en el presente documento, se refiere a moléculas de inmunoglobulina que comprenden cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras

(L) interconectadas por enlaces disulfuro. Cada cadena pesada comprende una región variable de cadena pesada (abreviada en el presente documento como HCVR o VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada comprende tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera comprende una

25 región variable de cadena ligera (abreviada en el presente documento como LCVR o VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera comprende un dominio, CL. Las regiones VH y VL pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco conservadas (FR). Cada VH y VL está compuesta de tres CDR y cuatro FR, dispuestas del extremo amino terminal al carboxilo terminal en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

La expresión “parte de unión a antígeno” de un anticuerpo (o simplemente “parte de anticuerpo” o “fragmento de anticuerpo”), como se usa en el presente documento, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que conservan la capacidad para unirse específicamente con un antígeno (por ejemplo, NGF). Se han mostrado que la 35 función de unión a antígeno de un anticuerpo puede realizarse por fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Los ejemplos de fragmentos de unión abarcados dentro de la expresión “parte de unión a antígeno” de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab’)2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un enlace disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de una única rama de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward et al. (1989) Nature 241: 544-546), que consiste en un dominio VH; y (vi) una región determinante de complementariedad (CDR) aislada. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, se codifican por genes separados, se pueden unir, usando métodos recombinantes, por un enlazador sintético que permite que se compongan como una única cadena proteica en la que las regiones VL y VH se emparejan para formar moléculas monovalentes (conocidas

45 como FV monocatenario (scFv); véase, por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; y Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883). También se pretende que dichos anticuerpos monocatenarios estén abarcados dentro de la expresión “parte de unión a antígeno” de un anticuerpo. También están abarcadas otras formas de anticuerpos monocatenarios, tales como diacuerpos. Los diacuerpos son anticuerpos bivalentes, biespecíficos en los que se expresan dominios VH y VL en una única cadena polipeptídica, pero usando un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, obligando de este modo a los dominios a emparejarse con dominios complementarios de otra cadena y creando dos sitios de unión a antígeno (véase, por ejemplo, Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad Sci. USA 90: 6444-6448; Poljak et al. (1994) Structure 2: 1121-1123).

55 Además, un anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo puede ser parte de moléculas de inmunoadhesión mayores, formadas por asociación covalente o no covalente del anticuerpo o parte del anticuerpo con una o más proteínas o péptidos adicionales. Los ejemplos de dichas moléculas de inmunoadhesión incluyen el uso de la región central de estreptavidina para crear una molécula scFv tetramérica (Kipriyanov et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6: 93-101) y uso de un resto de cisteína, un péptido marcador y un marcador de polihistidina C-terminal para realizar moléculas scFv bivalentes y biotiniladas (Kipriyanov et al. (1994) Mol. Immunol. 31: 1047-1058). Pueden prepararse partes de anticuerpo, tales como fragmentos Fab y F(ab’)2, a partir de anticuerpos completos usando técnicas convencionales, tales como digestión con papaína o pepsina, respectivamente, de anticuerpos completos. Además, pueden obtenerse anticuerpos, partes de anticuerpos y moléculas de inmunoadhesión usando técnicas de ADN recombinante convencionales, como se ha descrito en el presente documento.

65 Se entiende que la expresión “anticuerpo humano”, como se usa en el presente documento, incluye anticuerpos que

tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir restos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica in vitro o por mutación somática in vivo), por ejemplo en las CDR y en particular CDR3. Sin embargo, no

5 se pretende que la expresión “anticuerpo humano”, como se usa en el presente documento, incluya anticuerpos en los que se han insertado secuencias de CDR derivadas de la línea germinal de otra especie de mamífero, tal como un ratón, en secuencias de marco conservado humanas.

Se entiende que la expresión “anticuerpo humano recombinante”, como se usa en el presente documento, incluye todos los anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o aíslan por medios recombinantes, tales como anticuerpos expresados usando un vector de expresión recombinante transfectado en una célula hospedadora (descrita adicionalmente posteriormente), anticuerpos aislados de una biblioteca de anticuerpos humanos recombinante, combinatoria (descrita adicionalmente posteriormente), anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico para genes de inmunoglobulina humana (véase por ejemplo, Taylor et al.

15 (1992) Nucl. Acids Res. 20: 6287-6295) o anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implique corte y empalme de secuencias de genes de inmunoglobulina humana en otras secuencias de ADN. Dichos anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. En ciertas realizaciones, sin embargo, dichos anticuerpos humanos recombinantes se someten a mutagénesis in vitro (o, cuando se usa un animal transgénico para secuencias Ig humanas, mutagénesis somática in vivo) y por lo tanto las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque derivan de y están relacionadas con secuencias VH y VL de línea germinal humana, pueden no existir de forma natural dentro del repertorio de línea germinal de anticuerpos humanos in vivo.

25 Se entiende que un “anticuerpo aislado”, como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo que está sustancialmente sin otros anticuerpos que tienen especificidades antigénicas diferentes (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se une específicamente con NGF está sustancialmente sin anticuerpos que se unen específicamente a antígenos distintos de NGF). Un anticuerpo aislado que se une específicamente con NGF puede, sin embargo, tener reactividad cruzada con otros antígenos, tales como moléculas de NGF de otra especie. Además, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente sin otro material celular y/o productos químicos.

Se entiende que un “anticuerpo neutralizador”, como se usa en el presente documento (o un “anticuerpo que neutraliza la actividad de NGF”), se refiere a un anticuerpo cuya unión con NGF da como resultado la inhibición de la actividad biológica de NGF. Esta inhibición de la actividad biológica de NGF puede evaluarse midiendo uno o más

35 indicadores de la actividad biológica de NGF, tal como la activación celular inducida por NGF y la unión de NGF con el receptor de NGF. Estos indicadores de la actividad biológica de NGF pueden evaluarse por uno o más de varios ensayos in vitro o in vivo convencionales conocidos en la técnica (véase ejemplos posteriores).

Una “CDR” o región determinante de complementariedad es una región de hipervariabilidad intercalada con regiones que están más conservadas, denominadas “regiones marco conservadas”. Un grupo de CDR puede definirse como una secuencia de aminoácidos consenso.

La expresión “resonancia de plasmón superficial”, como se usa en el presente documento, se refiere a un fenómeno óptico que permite el análisis de interacciones bioespecíficas en tiempo real mediante la detección de alteraciones

45 en las concentraciones de proteínas dentro de una matriz biosensora, por ejemplo usando el sistema BIACORE™ (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suecia y Piscataway, N.J.).

Se entiende que el término “KD” como se usa en el presente documento, se refiere a la constante de disociación en equilibrio de una interacción anticuerpo-antígeno particular.

Se entiende que la expresión “molécula de ácido nucleico aislada”, como se usa en el presente documento en referencia a ácidos nucleicos que codifican anticuerpos o partes de anticuerpo (por ejemplo, VH, VL, CDR3) que se unen con NGF se refiere a una molécula de ácido nucleico en la que las secuencias de nucleótidos que codifican el anticuerpo o parte del anticuerpo están sin otras secuencias de nucleótidos que codifican anticuerpos o partes de

55 anticuerpos que se unen con antígenos distintos a NGF, pudiendo dichas otras secuencias flanquear de forma natural el ácido nucleico en ADN genómico humano. Por lo tanto, por ejemplo, un ácido nucleico aislado de la invención que codifica una región VH de un anticuerpo anti-NGF no contiene otras secuencias que codifican otras regiones VH que se unen con antígenos distintos del NGF humano.

El término “epítopo” incluye cualquier determinante, preferentemente un determinante polipeptídico, capaz de unirse específicamente con una inmunoglobulina o receptor de linfocitos T. En ciertas realizaciones, los determinantes epitópicos incluyen agrupamientos superficiales químicamente activos de moléculas tales como aminoácidos, cadenas laterales de azúcares, grupos fosforilo, o grupos sulfonilo y, en ciertas realizaciones, pueden tener características estructurales tridimensionales específicas y/o características de carga específicas. Un epítopo es una 65 región de un antígeno que se une con un anticuerpo. En ciertas realizaciones, se dice que un anticuerpo se une específicamente con un antígeno cuando reconoce preferentemente su antígeno diana en una mezcla compleja de

proteínas y/o macromoléculas. En realizaciones preferidas, se dice que un anticuerpo se une específicamente con un antígeno cuando la constante de disociación en equilibrio es menor de o igual a 10-8 M, más preferentemente cuando la constante de disociación en equilibrio es menor de o igual a 10-9 M, y más preferentemente cuando la constante de disociación es menor de o igual a 10-10 M.

5 La expresión “identidad sustancial” o “sustancialmente idéntico”, cuando se hace referencia a un ácido nucleico o fragmento del mismo, indica que, cuando se alinea de forma óptima con inserciones o deleciones de nucleótidos apropiadas con otro ácido nucleico (o su cadena complementaria), hay una identidad de secuencia de nucleótidos en al menos aproximadamente el 90 %, y más preferentemente al menos aproximadamente el 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de las bases de nucleótidos, medida por cualquier algoritmo bien conocido de identidad de secuencias, tales como FASTA, BLAST o GAP, como se analiza posteriormente.

Como se aplica a los polipéptidos, la expresión “similitud sustancial” o “sustancialmente similar” significa que dos secuencias peptídicas, cuando se alinean de forma óptima, tal como por los programas GAP o BESTFIT usando 15 pesos de hueco por defecto, comparten al menos el 90 % de identidad de secuencia, aún más preferentemente al menos el 95 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia. Preferentemente, las posiciones de restos que no son idénticas difieren en sustituciones de aminoácidos conservativas. Una “sustitución de aminoácidos conservativa” es una en la que un resto de aminoácido se sustituye por otro resto de aminoácido que tiene una cadena lateral (grupo R) con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad). En general, una sustitución de aminoácidos conservativa no cambiará sustancialmente las propiedades funcionales de una proteína. En casos donde dos o más secuencias de aminoácidos difieran entre sí por sustituciones conservativas, el porcentaje o grado de similitud puede ajustarse hacia arriba para corregir la naturaleza conservativa de la sustitución. Los expertos en la materia conocen bien medios para realizar este ajuste. Véase, por ejemplo, Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331. Los ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con propiedades químicas similares

25 incluyen 1) cadenas laterales alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; 2) cadenas laterales de hidroxilo alifático: serina y treonina; 3) cadenas laterales que contienen amida: asparagina y glutamina; 4) cadenas laterales aromáticas: fenilalanina, tirosina y triptófano; 5) cadenas laterales básicas: lisina, arginina e histidina; 6) cadenas laterales ácidas: aspartato y glutamato y 7) cadenas laterales que contienen azufre: cisteína y metionina. Son grupos de sustitución de aminoácidos conservativa preferidos: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato y asparagina-glutamina. Como alternativa, un reemplazo conservativo es cualquier cambio que tenga un valor positivo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250 divulgada en Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443 45. Un reemplazo “moderadamente conservativo” es cualquier cambio que tenga un valor no negativo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250.

35 La similitud de secuencia para polipéptidos se mide típicamente usando software de análisis de secuencias. El software de análisis de proteínas empareja secuencias similares usando medidas de similitud asignadas a diversas sustituciones, deleciones u otras modificaciones, incluyendo sustituciones de aminoácidos conservativas. Por ejemplo, el software GCG contiene programas tales como GAP y BESTFIT que pueden usarse con parámetros por defecto para determinar la homología de secuencias o identidad de secuencias entre polipéptidos estrechamente relacionados, tales como polipéptidos homólogos de diferentes especies de organismos o entre una proteína de tipo silvestre y una muteína de la misma. Véase, por ejemplo, GCG Versión 6.1. También pueden compararse secuencias polipeptídicas usando FASTA con parámetros por defecto o recomendados; un programa en GCG Versión 6.1. FASTA (por ejemplo, FASTA2 y FASTA3) proporciona alineamientos y porcentaje de identidad de secuencia de las regiones del mejor solapamiento entre las secuencias de consulta y búsqueda (Pearson (2000)

45 mencionado anteriormente). Otro algoritmo preferido cuando se compara una secuencia de la invención con una base de datos que contiene un gran número de secuencias de diferentes organismos es el programa informático BLAST, especialmente BLASTP o TBLASTN, usando parámetros por defecto. Véase, por ejemplo, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403 410 y Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389 402.

Preparación de anticuerpos humanos

Los métodos para generar anticuerpos humanos incluyen, por ejemplo, tecnología VELOCIMMUNE™, XENOMOUSE™ (Green et al. (1994) Nature Genetics 7: 13-21), el enfoque de “minilocus” y presentación de fagos. La tecnología VELOCIMNUNE™ (documento US 6.596.541, Regeneron Pharmaceuticals) abarca un método para

55 generar un anticuerpo completamente humano de alta especificidad para un antígeno seleccionado. Esta tecnología implica la generación de un ratón transgénico que tiene un genoma que comprende regiones variables de cadena pesada y ligera humanas unidas operativamente con loci de región constante de ratón endógenos de modo que el ratón produce un anticuerpo que comprende una región variable humana y una región constante de ratón en respuesta a la estimulación antigénica. El ADN que codifica las regiones variables de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo se aísla y se une operativamente con ADN que codifica las regiones constantes de cadena pesada y ligera humanas. El ADN se expresa después en una célula capaz de expresar el anticuerpo completamente humano. En una realización específica, la célula es una célula CHO.

Los anticuerpos pueden ser terapéuticamente útiles en el bloqueo de una interacción ligando-receptor o la inhibición

65 de la interacción de componentes del receptor, en lugar de destruyendo células mediante la fijación de complemento y participación en citotoxicidad dependiente de complemento (CDC), o destruyendo células mediante citotoxicidad

mediada por células dependientes de anticuerpo (ADCC). La región constante de un anticuerpo es por lo tanto importante en la capacidad de un anticuerpo para fijar el complemento y mediar en la citotoxicidad dependiente de células. Por lo tanto, el isotipo de un anticuerpo puede seleccionarse basándose en si es deseable que el anticuerpo medie en la citotoxicidad.

5 Las inmunoglobulinas humanas pueden existir en dos formas que se asocian con heterogeneidad de la bisagra. En una forma, una molécula de inmunoglobulina comprende una construcción de cuatro cadenas estable de aproximadamente 150-160 kDa en la que los dímeros se mantienen juntos por un enlace disulfuro de cadena pesada intercatenario. En una segunda forma, los dímeros no se unen mediante enlaces disulfuro intercatenarios y se forma una molécula de aproximadamente 75-80 kDa compuesta de una cadena ligera y pesada acoplada covalentemente (medio anticuerpo). Estas formas han sido extremadamente difíciles de separar, incluso después de la purificación de afinidad.

La frecuencia de aparición de la segunda forma en diversos isotipos IgG intactos se debe, pero sin limitación, a

15 diferencias estructurales asociadas con el isotipo de región bisagra del anticuerpo. Una única sustitución de aminoácidos en la región bisagra de la bisagra IgG4 humana puede reducir significativamente la aparición de la segunda forma (Angal et al. (1993) Molecular Immunology 30: 105) a niveles observados típicamente usando una bisagra IgG1 humana. La presente invención abarca anticuerpos que tienen una o más mutaciones en la región bisagra, CH2 o CH3 que pueden ser deseables, por ejemplo, en la producción, para mejorar el rendimiento de la forma de anticuerpo deseada.

Los anticuerpos de la invención se preparan preferentemente con el uso de tecnología VELOCIMMUNE™. Un ratón transgénico en el que las regiones variables de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina endógena se reemplazan con las regiones variables humanas correspondientes se expone al antígeno de interés, y se recuperan

25 células linfáticas (tales como linfocitos B) de los ratones que expresan anticuerpos. Las células linfáticas pueden fusionarse con una línea celular de mieloma para preparar líneas celulares de hibridoma inmortales, y dichas líneas celulares de hibridomas se exploran y se seleccionan para identificar líneas celulares de hibridoma que producen anticuerpos específicos para el antígeno de interés. Puede aislarse ADN que codifica las regiones variables de la cadena pesada y cadena ligera y unirse con regiones constantes isotípicas deseables de la cadena pesada y la cadena ligera. Dicha proteína de anticuerpo puede producirse en una célula, tal como una célula CHO. Como alternativa, puede aislarse ADN que codifica los anticuerpos quiméricos específicos de antígeno o los dominios variables de las cadenas ligera y pesada directamente de linfocitos específicos de antígeno.

En general, los anticuerpos de la presente invención poseen afinidades muy altas, poseyendo típicamente KD de

35 aproximadamente 10-10 a aproximadamente 10-12 M o mayor, por ejemplo, al menos 10-10 M, al menos 10-11 M o al menos 10-12 M, cuando se miden uniendo con el antígeno bien inmovilizado en fase sólida o bien en fase de solución.

Inicialmente, se aíslan anticuerpos quiméricos de alta afinidad que tienen una región variable humana y una región constante de ratón. Como se describe posteriormente, los anticuerpos se caracterizan y seleccionan con respecto a las características deseables, incluyendo afinidad, selectividad, epítopo, etc. Las regiones constantes de ratón se reemplazan con una región constante humana deseada para generar el anticuerpo completamente humano de la invención, por ejemplo IgG1 o IgG4 de tipo silvestre o modificado (por ejemplo, SEC ID Nº: 541, 542 o 543). Aunque la región constante seleccionada puede variar de acuerdo con su uso específico, en la región variable residen

45 características de unión a antígeno de alta afinidad y especificidad de diana.

Mapeo de epítopos y tecnologías relacionadas

Para explorar con respecto a anticuerpos que se unen con un epítopo particular (por ejemplo, los que bloquean la unión de IgE con su receptor de alta afinidad), puede realizarse un ensayo de bloqueo cruzado rutinario tal como el descrito en Harlow y Lane (1990) mencionado anteriormente. Otros métodos incluyen mutantes de exploración de alanina, transferencias de péptidos (Reineke (2004) Methods Mol Biol 248: 443-63), o análisis de escisión de péptidos. Además, se pueden emplear métodos tales como escisión de epítopos, extracción de epítopos y modificación química de antígenos (Tomer (2000) Protein Science 9: 487-496).

55 El término “epítopo” se refiere a un sitio en un antígeno al que responden linfocitos B y/o T. Pueden formarse epítopos de linfocitos B de aminoácidos contiguos o aminoácidos no contiguos yuxtapuestos por el plegamiento terciario de una proteína. Los epítopos formados a partir de aminoácidos contiguos se conservan típicamente tras la exposición a disolventes desnaturalizantes, mientras que los epítopos formados por plegamiento terciario típicamente se pierden tras el tratamiento con disolventes desnaturalizantes. Un epítopo típicamente incluye al menos 3, y más habitualmente, al menos 5 u 8-10 aminoácidos en una conformación espacial única.

El Perfil Asistido por Modificación (MAP), también conocido como Perfil de Anticuerpos Basado en Estructura de Antígenos (ASAP) es un método que categoriza grandes números de anticuerpos monoclonales (mAb) dirigidos

65 contra el mismo antígeno de acuerdo con las similitudes del perfil de unión de cada anticuerpo con superficies de antígenos modificadas química o enzimáticamente (documento US 2004/0101920). Cada categoría puede reflejar un

único epítopo claramente diferente de o parcialmente solapante con el epítopo representado por otra categoría. Esta tecnología permite la filtración rápida de anticuerpos genéticamente idénticos, de modo que la caracterización puede centrarse en anticuerpos genéticamente distintos. Cuando se aplica a exploración de hibridoma, el MAP puede facilitar la identificación de clones de hibridoma poco comunes que producen mAb que tienen las características

5 deseadas. El MAP puede usarse para clasificar los anticuerpos anti-NGF de la invención en grupos de anticuerpos que se unen con diferentes epítopos.

Inmunoconjugados

La invención abarca un anticuerpo monoclonal anti-NGF humano conjugado con un resto terapéutico (“inmunoconjugado”), tal como una citotoxina, un fármaco quimioterapéutico, un inmunosupresor o un radioisótopo. Los agentes citotóxicos incluyen cualquier agente que sea perjudicial para las células. Se conocen en la técnica ejemplos de agentes citotóxicos y agentes quimioterapéuticos para formar inmunoconjugados, véase, por ejemplo, documento WO 05/103081.

Biespecíficos

Los anticuerpos de la presente invención pueden ser monoespecíficos, biespecíficos o multiespecíficos. Los anticuerpos multiespecíficos pueden ser específicos para diferentes epítopos de un polipéptido diana o pueden contener dominios de unión a antígeno específicos para más de un polipéptido diana. Véase, por ejemplo, Tutt et al. (1991) J. Immunol. 147: 60-69. Los anticuerpos anti-NGF humanos pueden unirse o co-expresarse con otra molécula funcional, por ejemplo, otro péptido o proteína. Por ejemplo, un anticuerpo o fragmento del mismo puede unirse funcionalmente (por ejemplo, mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otro modo) con una o más entidades moleculares adicionales, tales como otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo,

25 para producir un anticuerpo biespecífico o uno multiespecífico con una segunda especificidad de unión.

Administración terapéutica y formulaciones

La invención proporciona composiciones terapéuticas que comprenden los anticuerpos anti-NGF o fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la presente invención. La administración de composiciones terapéuticas de acuerdo con la invención se administrará con vehículos adecuados, excipientes y otros agentes que se incorporan en formulaciones para proporcionar transferencia, suministro, tolerancia mejoradas y similares. Puede encontrarse una multitud de formulaciones apropiadas en el formulario conocido por todos los químicos farmacéuticos: Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Estas formulaciones incluyen, por

35 ejemplo, polvos, pastas, pomadas, gelatinas, ceras, aceites, lípidos, vesículas que contienen lípidos (catiónicos o aniónicos) (tales como LIPOFECTIN™), conjugados de ADN, pastas de absorción anhídridas, emulsiones de aceite en agua y agua en aceite, emulsiones carbowax (polietilenglicoles de diversos pesos moleculares), geles semisólidos y mezclas semisólidas que contienen carbowax. Véase también Powell et al. “Compendium of excipients for parenteral formulations” PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52: 238-311.

La dosis puede variar dependiendo de la edad y el tamaño de un sujeto para administrar, enfermedad diana, afecciones, vía de administración y similares. Cuando el anticuerpo de la presente invención se usa para tratar diversas afecciones y enfermedades asociadas con el NGF, incluyendo dolor inflamatorio, dolor neuropático y/o nocicéptico, carcinoma hepatocelular, cáncer de mama, cirrosis hepática y similares, en un paciente adulto, es

45 ventajoso administrar por vía intravenosa el anticuerpo de la presente invención normalmente a una única dosis de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal, más preferentemente de aproximadamente 0,02 a aproximadamente 7, de aproximadamente 0,03 a aproximadamente 5, o de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 3 mg/kg de peso corporal, preferentemente de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal, y más preferentemente de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal. Dependiendo de la gravedad de la afección, la frecuencia y la duración del tratamiento pueden ajustarse.

Se conocen diversos sistemas de suministro y pueden usarse para administrar la composición farmacéutica de la invención, por ejemplo, encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar los virus mutantes, endocitosis mediada por receptor (véase, por ejemplo, Wu et al. (1987) J. Biol.

55 Chem. 262: 4429-4432). Los métodos de introducción incluyen, pero sin limitación, vías intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural y oral. La composición puede administrarse por cualquier vía conveniente, por ejemplo mediante infusión o inyección de embolada, mediante absorción a través de los revestimientos epitelial o mucocutáneo (por ejemplo, mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.) y puede administrarse junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local.

La composición farmacéutica también puede suministrarse en una vesícula, en particular un liposoma (véase (1990) Science 249: 1527-1533; Treat et al. (1989) en Liposomes in the Therapy of Infectious Disease y Cancer, Lopez Berestein y Fidler (eds.), Liss, Nueva York, pp. 353-365; Lopez-Berestein, misma referencia., 317-327; véase en general la misma referencia.

65 En ciertas situaciones, la composición farmacéutica puede suministrarse en un sistema de liberación controlada. En

una realización, puede usarse una bomba (véase Langer, mencionado anteriormente; Sefton (1987) CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14: 201). En otra realización, pueden usarse materiales poliméricos. (Véase Medical Applications of Controlled Release, Langer y Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974)). En otra realización más, puede situarse un sistema de liberación controlada próximo a la diana de la composición, requiriendo de este modo

5 solamente una fracción de la dosis sistémica (véase, por ejemplo, Goodson, en Medical Applications of Controlled Release, mencionado anteriormente, vol. 2, pp. 115-138, 1984). Otros sistemas de liberación controlada se analizan en la revisión de Langer (1990) Science 249: 1527-1533.

Las preparaciones inyectables pueden incluir formas de dosificación para inyecciones intravenosas, subcutáneas, intracutáneas e intramusculares, infusiones de goteo, etc. Estas preparaciones inyectables pueden prepararse por métodos públicamente conocidos. Por ejemplo, las preparaciones inyectables pueden prepararse, por ejemplo, disolviendo, suspendiendo o emulsionando el anticuerpo o su sal descrito anteriormente en un medio acuoso estéril

o un medio oleoso usado convencionalmente para inyecciones. Como el medio acuoso para inyecciones hay, por ejemplo, solución salina fisiológica, una solución isotónica que contiene glucosa y otros agentes adyuvantes, etc.,

15 que pueden usarse en combinación con un agente solubilizante apropiado tal como un alcohol (por ejemplo, etanol), un polialcohol (por ejemplo, propilenglicol, polietilenglicol), un tensioactivo no iónico [por ejemplo, polisorbato 80, HCO-50 (aducto de polioxietileno (50 mol) de aceite de ricino hidrogenado)], etc. Como el medio oleoso, se emplean, por ejemplo, aceite de sésamo, aceite de soja, etc., que pueden usarse en combinación con un agente solubilizante tal como bencil benzoato, alcohol bencílico, etc. La inyección preparada de este modo se carga preferentemente en una ampolla apropiada.

Provechosamente, las composiciones farmacéuticas para uso oral o parenteral descritas anteriormente se preparan en forma de dosificación en una dosis unitaria adaptada para ajustarse a una dosis de los principios activos. Dichas formas de dosificación en una dosis unitaria incluyen, por ejemplo, comprimidos, píldoras, cápsulas, inyecciones

25 (ampollas), supositorios, etc. La cantidad del anticuerpo contenido es generalmente de aproximadamente 5 a 500 mg por forma de dosificación en una dosis unitaria; en la forma de inyección, se prefiere que el anticuerpo esté contenido en aproximadamente 5 a 100 mg y en aproximadamente 10 a 250 mg para las otras formas de dosificación.

Terapias individuales y de combinación. La invención proporciona métodos terapéuticos en los que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invención es útil para tratar el dolor asociado con una diversidad de afecciones que implican al NGF. Los anticuerpos anti-NGF o fragmentos de anticuerpos de la invención son particularmente útiles para el tratamiento del dolor resultante de cualquier afección asociada con dolor neurogénico, neuropático o nocicéptico. En realizaciones preferidas del dolor neuropático, se tratan preferentemente neuralgia del trigémino

35 referida, neuralgia post-herpética, dolor de miembro fantasma, fibromialgia, distrofia simpática refleja y afecciones de dolor neurogénico. En otras realizaciones preferidas, se tratan preferentemente dolor por cáncer, particularmente, dolor por cáncer de hueso, dolor de osteoartritis o artritis reumatoide, dolor lumbar, dolor por incisión postoperatoria, dolor por fractura, dolor por fractura osteoporótica, osteoporosis, dolor de articulación gotosa, neuropatía diabética, ciática, dolores asociados con crisis de anemia falciforme, migraña y otro dolor neuropático y/o nocicéptico.

Otras indicaciones incluyen, por ejemplo, tratamiento para cáncer de mama (Adriaenssens et al. (2008) Cancer Res

68: 346-51). En realizaciones específicas de los métodos terapéuticos de la invención, un sujeto que padece dolor de las articulaciones asociado con la gota se trata con una combinación de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invención y opcionalmente con un segundo agente terapéutico. En una realización, el segundo agente 45 terapéutico es preferentemente un antagonista de interleucina-1 (IL-1) tal como rilonacept (“trampa de IL-1”; Regeneron). Los segundos agentes terapéuticos adecuados pueden ser uno o más agentes seleccionados del grupo que consiste en rilonacept, anakinra (KINERET, Amgen), una forma recombinante, no glucosilada del antagonista del receptor de IL-1 humano (IL1Ra), un fármaco anti-IL-18 tal como IL-18BP o un derivado, una Trampa de IL-18, o un anticuerpo tal como un anticuerpo anti-IL-18, anti-IL-18R1, anti-IL-18Racp, anti-IL-6 y/o anti-IL6Ra. Otras coterapias que pueden combinarse con un anticuerpo de NGF o fragmento de unión a antígeno del mismo, solas o en combinación con un antagonista de IL-1 incluyen colchicina de dosis baja, aspirina u otro AINE, esteroides tales como prednisolona, metotrexato, ciclosporina A de dosis bajas, inhibidores de TNF tales como ENBREL o HUMIRA, otros inhibidores inflamatorios tales como inhibidores de caspasa-1, p38, IKK1/2, CTLA-4lg, etc., y/o coterapias tales como inhibidores de síntesis de ácido úrico para inhibir la acumulación de ácido úrico en el cuerpo, por

55 ejemplo, alopurinol, promotores de la excreción de ácido úrico para acelerar la rápida excreción de ácido úrico acumulado en el cuerpo, por ejemplo, probenecid, sulfinpirazona y/o benzbromarona son ejemplos de promotores de la excreción de ácido úrico; corticosteroides; fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE), fármacos antiepilépticos tales como topiramato; gabapentina, pregabablina; celecoxib; o una neurotrofina, tal como NT-3.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se exponen para proporcionar a los expertos en la materia una divulgación y descripción completa de cómo preparar y usar los métodos y composiciones de la invención, y no se pretende que limiten el alcance de lo que los inventores consideran su invención. Se han realizado intentos para asegurar la precisión con 65 respecto a los números usados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.), pero deberían suponerse algunos errores y desviaciones experimentales. A no ser que se indique de otro modo, las partes son partes en peso, el peso

molecular es el peso molecular medio, la temperatura está en grados Centígrados, y la presión es la atmosférica o cercana. Los análisis estadísticos se realizaron de acuerdo con ANOVA Factorial mixto con ensayos post hoc de Bonferroni o post hoc de HSD de Tukey.

5 Ejemplo 1. Inmunización y generación de anticuerpos

Puede realizarse inmunización de roedores por cualquier método conocido en la técnica (véase, por ejemplo, Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual: Cold Spring Harbor Press, Nueva York; Malik y Lillehoj, Antibody techniques: Academic Press, San Diego). En una realización preferida, se administra proteína de NGF humana directamente a ratones que tienen loci de ADN que codifican tanto la región variable de cadena pesada de Ig humana como la región variable de cadena ligera Kappa (VELOCIMMUNE™, Regeneron; documento US 6.596.541), con un adyuvante para estimular la respuesta inmunitaria. Dicho adyuvante incluye adyuvante completo e incompleto de Freund, sistema de adyuvante de MPL+TDM (Sigma) o RIBI (dipéptidos de muramilo) (véase O’Hagan Vaccine Adjuvant, Human Press, 2000, Totawa, NJ). Dicho adyuvante puede prevenir la dispersión rápida 15 del polipéptido secuestrando el antígeno en un depósito local, y puede contener factores que pueden estimular la respuesta inmunitaria del hospedador. En una realización, se administra el NGF indirectamente como un plásmido de ADN que contiene el gen del NGF y expresa NGF usando la maquinaria de expresión de proteína celular del hospedador para producir un polipéptido antigénico in vivo. En ambos enfoques, para obtener respuestas antiantígeno óptimas, se proporciona a los ratones inyecciones de refuerzo cada 3-4 semanas y se cogen muestras de suero 10 días después de cada inyección. La respuesta inmunitaria del anticuerpo se controla usando métodos de ELISA de unión indirecta a antígeno convencional. Se aplican muestras de suero después del refuerzo diluidas en diluciones en serie 3 veces a placas recubiertas con NGF. El título de suero se define como la dilución de muestra de suero que produjo dos veces la señal de fondo en el ensayo. Los animales con respuestas óptimas reciben un refuerzo final mediante inyecciones intravenosas e intraperitoneales sin un adyuvante 3-4 días antes del sacrificio.

25 Los esplenocitos recogidos se procesan como se describe posteriormente para obtener anticuerpos monoclonales específicos de antígeno.

Ejemplo 2. Aislamiento de anticuerpos monoclonales

En una realización, se fusionan linfocitos B que expresan el anticuerpo con células de mieloma de ratón para formar células de hibridoma. Las células híbridas se siembran en placas de 96 pocillos con selección de HAT y se permite que crezcan durante 10 a 20 días. Los medios acondicionados de pocillos con células de hibridoma crecientes se exploran con respecto a unión a antígeno y actividades de bloqueo del receptor como se describe posteriormente. Las células de hibridoma que expresan anticuerpos de interés se subclonan en células individuales usando

35 citometría de flujo, y se clonan y secuencian genes de VH y VL de células de hibridoma clonales. También se purifican proteínas de anticuerpos de cultivos de hibridomas específicos de antígeno usando medio con IgG agotado (Invitrogen) y se caracterizan como se describe posteriormente.

En otra realización, se aíslan anticuerpos específicos de antígeno directamente de linfocitos B positivos para antígeno sin inmortalizarse con células de mieloma específicas, y se genera una célula CHO hospedadora que produce un anticuerpo recombinante estable, como se describe en el documento USSN 11/809.482 (Publicación de Patente de Estados Unidos Nº 2007/0280945).

Ejemplo 3. Unión del antígeno primario y exploración del bloqueo del receptor

45 Para identificar hibridomas productores de anticuerpos específicos de antígeno, se tomaron muestras de medios acondicionados de placas de cultivo de 96 pocillos de 10 a 20 días después de la fusión, y se determinó la especificidad de unión a antígeno usando ELISA de unión directa de alto rendimiento. Brevemente, se permitió que los medios acondicionados a una dilución de 1:10 y 1:100 veces se unieran con placas MAXISORB™ recubiertas con proteínas de NGF recombinante (Nunc) a 100 ng/pocillo. Los anticuerpos unidos a placas se detectaron usando un anticuerpo policlonal conjugado con HRP específico anti-Fc IgG de ratón de cabra (Jackson Immuno Lab). Las placas se desarrollaron usando sustratos TMB (BD Pharmingen) y se registró la densidad óptica a DO450nm. En paralelo, se aplicaron muestras a las mismas diluciones a placas de NGF marcadas con biotina presentadas con estreptavidina, y se detectaron los anticuerpos unidos a placa. Los pocillos que mostraban actividad de unión para

55 una de las placas se seleccionaron para expansión de cultivo celular y se crio-conservaron, y se usaron sobrenadantes que contenían anticuerpos para análisis posterior para obtener el perfil de especificidad, afinidad y funcionalidad.

Además de la exploración de unión a antígeno directa, también se utilizó la exploración funcional para identificar clones que secretaban anticuerpos con propiedades deseables. Las placas Maxisorb se recubrieron con TrkA-hFc humana recombinante 100 ng/pocillo durante una noche a 4 ºC. Se permitió que los medios acondicionados a diluciones 1:2 y 1:10 veces se unieran con biotina-NGF 2 ng/ml en solución durante 1 hora antes de transferencia a las placas recubiertas con TrkA-hFc para la medición de biotina-NGF unida a placa. La biotina-NGF unida a placa se detectó usando estreptavidina conjugada con HRP (Pierce) y se desarrolló usando sustratos TMB (BD Pharmingen)

65 y se registró la densidad óptica. Los hibridomas en los que los medios de cultivo evitaban la unión de biotina-NGF con TrkA-hFc se identificaron como bloqueadores potenciales y se caracterizaron adicionalmente.

Se aplicaron exploraciones in vitro similares a medio acondicionado de 96 pocillos de células CHO transfectadas con el IgG completamente humano que contenía genes V aislados directamente de linfocitos B positivos para antígeno. Además, las muestras se exploraron con respecto a actividad de unión al NGF usando perlas LUMINEX™ recubiertas con antígeno, para las que se detectó anticuerpo unido específico de antígeno usando anticuerpos 5 policlonales específicos anti-Fc IgG humano de cabra conjugados con PE. Los anticuerpos de unión a antígeno se sometieron a medición de afinidad usando BIACORE™. Brevemente, se capturaron anticuerpos de sobrenadantes del cultivo en bruto en una superficie de anticuerpo policlonal específica de hFc acoplada con amina. Se controló la unión a antígeno a una única concentración. Se usó un modelo de interacción biomolecular 1:1 para ajustar el sensograma de unión para determinar las afinidades de unión al antígeno (KD) usando las constantes de velocidad 10 cinética ka y kd para cada interacción de anticuerpo en condiciones idénticas. Específicamente, se acoplaron covalentemente anticuerpos policlonales específicos anti-Fc IgG humano de cabra en superficies de microplacas CM-5, y se inyectaron sobrenadantes de CHO que contenían anticuerpos a 1 l/min durante 5 minutos seguido de un lavado con tampón. Se inyectó NGF humano (25 nM) durante 3 minutos para permitir que el NGF se uniera con la superficie con anticuerpos humanos inmovilizados. Inmediatamente después de la inyección de NGF, se inyectó

15 tampón en las superficies a 100 l/min durante  10 minutos y se registró la degradación de la señal de UR. Las superficies se regeneraron para retirar el anticuerpo unido y NGF, y el ciclo se repitió con la siguiente muestra de sobrenadante de CHO.

Ejemplo 4. Determinación de la afinidad de unión a antígeno

20 Las afinidades de unión a antígeno de los anticuerpos para NGF humanos se determinaron por cinética de superficie usando un ensayo de resonancia de plasmón superficial biosensora en tiempo real (BIACORE™). Los anticuerpos se capturaron en una superficie de anticuerpo policlonal IgG anti-humano o anti-ratón de cabra creada por acoplamiento de amina directo del anticuerpo de captura en una microplaca BIACORE™. Se inyectaron diversas

25 concentraciones de NGF humano sobre las superficies de anticuerpo capturado mientras que la asociación del antígeno con el anticuerpo y la disociación del complejo unido se controlaron en tiempo real. Se realizó análisis cinético para obtener la constante de disociación en equilibrio (KD) y constante de velocidad de disociación, y esta última se usó para calcular el t1/2 de disociación del complejo antígeno/anticuerpo (Tabla 1). Se usó un anticuerpo monoclonal anti-NGF humano humanizado E3 (“RN624”) (tanezumab; CAS Nº de Registro 880266-57-9; Publicación

30 de Patente de Estados Unidos 2004/0237124) como el control.

Tabla 1

Anticuerpo

KD (pM) t1/2

301272-1D07-B10

0,5 34,6 h

301272-1H07-G9

60,1 32,8 min

301272-1H08-G8

0,2 55,6 h

301272-3D08-C11

0,7 6,9 h

301272-3F12-D7

190,0 13,2 min

301272-3G11-C1

1,1 14,6 h

301272-3H10-A10

0,1 25,2 h

301272-3H11-A3

23,8 4,3 h

301272-6E07-D10

13,0 4,5 h

301272-6G10-D7

7,7 44,3 min

301272-7A10-D7

75,0 11,6 min

301272-7C05-G1

162,0 10,1 min

301272-7E05-F6

0,4 40,0 h

301272-7F11-A8

5,8 5,3 h

301272-7G09-E4

17,0 4,3 h

301272-7G10-E1

292,0 10,1 min

301272-7G11-F6

4,9 2,9 h

301272-7H05-D4

77,6 1,0 h

301272-7H07-C12

9,8 6,0 h

VAT 8C10-8

102,0 14,7 min

13F5-5

156,0 13,7 min

VAT 12A10-13

109,0 9,4 min

VAT 2C2-1

959,0 9,0 min

Control (RN624)

1,3 35,0 h

También se determinaron las afinidades de unión a antígeno de anticuerpos purificados seleccionados para NGF por

35 cinética de superficie empleando un ensayo de resonancia de plasmón superficial biosensora en tiempo real (BIACORE™) como se ha descrito anteriormente. Por conveniencia, el anticuerpo 301272-3H10-A10 se renombró “REGN261” (HCVR/LCVR SEC ID Nº: 84/92 y hIgG1 SEC ID Nº: 541); 301272-6E07-D10 se renombró “REGN263” (HCVR/LCVR SEC ID Nº: 208/216 y hIgG1 SEC ID Nº: 541). Los anticuerpos derivados ensayados incluían REGN472 (HCVR/LCVR SEC ID Nº: 100/102 y hIgG1 SEC ID Nº: 541), REGN474 (HCVR/LCVR SEC ID Nº:

100/102 y hIgG4 mutante SEC ID Nº: 543), REGN475 (HCVR/LCVR SEC ID Nº: 108/110 y hIgG4 mutante SEC ID Nº: 543), REGN476 (HCVR/LCVR SEC ID Nº: 224/226 y hIgG4 mutante SEC ID Nº: 543), y REGN477 (HCVR/LCVR SEC ID Nº: 232/234 y hIgG4 mutante SEC ID Nº: 543).

Tabla 2

Anticuerpo

KD (pM) t1/2 (h)

REGN472

0,41 30

REGN474

0,41 31

REGN475

0,18 57

REGN476

8,91 4

REGN477

7,98 4

Control (RN624)

1,25 35

Ejemplo 5. Reactividad cruzada con neurotrofina-3 (NT-3)

NGF y NT-3 pertenecen a la familia del factor de crecimiento nervioso y son proteínas pequeñas, básicas, secretoras

10 que permiten la supervivencia de poblaciones neuronales específicas. Aunque estas dos neurotrofinas comparten algunas identidades de aminoácidos, las funciones biológicas pueden variar (Barde et al. 1990 Prog Growth Factor Res 2(4): 237-48).

Los anticuerpos anti-NGF se examinaron con respecto a reactividad cruzada de unión con NT-3 humana.

15 Brevemente, el anticuerpo policlonal anti-IgG humano de cabra se unió químicamente con una microplaca CM5. Se inyectaron anticuerpos monoclonales anti-NGF formando una superficie de aproximadamente 50 a 900 UR de anticuerpo inmovilizado mediante la interacción con los anticuerpos policlonales acoplados a la microplaca. Se inyectó proteína de NGF o NT-3 a una concentración de 20 nM sobre la superficie, seguido de un lavado con tampón para permitir que se disociara el ligando unido. Las fases tanto de asociación como de disociación se controlaron y

20 los datos se analizaron. Los resultados se muestran en la Tabla 3 (NB = sin actividad de unión observada). A diferencia del anticuerpo de control (RN624), ninguno de los anticuerpos de ensayo mostró unión medible con NT-3, lo que indica de este modo un mayor grado de especificidad de antígeno en relación con el anticuerpo de control.

Tabla 3

Anticuerpo

NGF KD (pM) NT-3 KD (nM)

301272-1D07-B10

0,5 NB

301272-1H07-G9

60,1 NB

301272-1H08-G8

0,2 NB

301272-3D08-C11

0,7 NB

301272-3F12-D7

190,0 NB

301272-3G11-C1

1,1 NB

301272-3H10-A10

0,1 NB

301272-3H11-A3

23,8 NB

301272-6E07-D10

4,3 NB

301272-6G10-D7

7,7 NB

301272-7A10-D7

75,0 NB

301272-7C05-G1

162,0 NB

301272-7E05-F6

0,1 NB

301272-7F11-A8

7,5 NB

301272-7G09-E4

5,5 NB

301272-7G10-E1

292,0 NB

301272-7G11-F6

4,9 NB

301272-7H05-D4

77,6 NB

301272-7H07-C12

9,8 NB

Control (RN624)

1,3 1,1

25 También se emplearon ensayos de competición de solución basados en OCTET™ para medir la capacidad de REGN475 y RN624 para competir en solución por la unión con NT-3, NGF o factor neurotrófico derivado de cerebro humano (hBDNF). Brevemente, se prepararon muestras de anticuerpo-antígeno preincubando el anticuerpo de control RN624 (2,5 g/ml) o REGN475 (2,5 g/ml), con diversas concentraciones de NT-3 (de 0 a 4 M), hBDNF (de

30 0 a4 M) o NGF (de 0 a 0,2 M) durante 1 hora a 30 ºC. Se incubaron sensores de FA de alta unión con estreptavidina (HBS, ForteBio, Inc., CA) con biotina-NGF a 2 g/ml durante 10 min a 30 ºC. Después se incubaron sensores unidos con biotina-NGF con las muestras de antígeno-anticuerpo pre-incubadas durante 10 min a 30 ºC. Se midieron los cambios en el grosor de la capa biológica después de la incubación. La unión se normalizó como un porcentaje de unión relativa a la unión de anticuerpo en ausencia de competidor. Como se muestra en la Tabla 4, la

35 unión entre NGF y RN624 se bloqueó por NT-3 de una manera dependiente de dosis, mientras que la unión entre REGN475 y NGF no se bloqueó por NT-3. La presencia de hBDNF no bloqueó la unión de RN623 o REGN475 con

NGF, mientras que la presencia de NGF soluble bloqueó casi completamente la unión tanto de RN624 como de REGN475 con NGF inmovilizado.

Tabla 4

Competidor

% de Unión de REGN624 % de Unión de REGN475

NT-3 (4 M)

17 102

NT-3 (2 M)

26 102

NT-3 (1 M)

38 98

NT-3 (0,5 M)

52 93

NT-3 (0,25 M)

72 101

NT-3 (0 M)

100 100

BDNF (4 M)

103 116

BDNF (2 M)

104 115

BDNF (1 M)

104 106

BDNF (0 M)

100 100

NGF (0,2 M)

1 3

NGF (0,1 M)

-1 2

NGF (0,05 M)

0 1

NGF (0 M)

100 100

5 La unión entre el anticuerpo anti-NGF humano purificado seleccionado REGN472, REGN474, REGN475, REGN476, REGN477, o el anticuerpo de control RN624 y NT-3 también se evaluó usando el ensayo de BIACORE™ variando las concentraciones de NT-3 de 1,25 nM a 40 nM. Aunque el anticuerpo de control (RN624) se unía con NT-3 con una KD de 1,1 nM, ninguno de los anticuerpos de ensayo mostró afinidad medible por NT-3

Ejemplo 6. Reactividad cruzada con NGF murino y de rata

El NGF humano (NGF) es altamente homólogo en secuencia de aminoácidos del NGF de ratón (mNGF) y NGF de rata (rNGF) con aproximadamente el 90 % de identidad. Las afinidades de unión de los anticuerpos tanto con mNGF

15 como con rNGF se determinaron como se ha descrito anteriormente. Todos los anticuerpos mostraron reactividad cruzada tanto con mNGF como con rNGF. Un grupo de anticuerpos se unió con NGF de todas las especies fuertemente con un valor de KD de menos de 10 pM; un segundo grupo se unió preferentemente con NGF y mostró KD >  100 pM para mNGF y rNGF (control = RNF624) (Tabla 5).

20 Tabla 5

Anticuerpo

KD de NGFKD humano (pM) KD de mNGF (pM) KD de rNGF (pM)

301272-1D07-B10

0,5 3,0 6,6

301272-1H07-G9

60,1 2280,0 6330,0

301272-1H08-G8

0,2 1,7 0,7

301272-3D08-C11

0,7 5,0 8,5

301272-3F12-D7

190,0 3130,0 8710,0

301272-3G11-C1

1,1 6,1 5,9

301272-3H10-A10

0,1 0,2 0,6

301272-3H11-A3

23,8 619,0 800,0

301272-6E07-D10

13,0 362,0 360,0

301272-6G10-D7

7,7 94,7 157,0

301272-7A10-D7

75,0 2630,0 4900,0

301272-7C05-G1

162,0 2000,0 1790,0

301272-7E05-F6

0,4 4,1 1,6

301272-7F11-A8

5,8 320,0 459,0

301272-7G09-E4

16,8 379,0 425,0

301272-7G10-E1

292,0 7090,0 11800,0

301272-7G11-F6

4,9 157,0 160,0

301272-7H05-D4

77,6 5520,0 7090,0

301272-7H07-C12

9,8 1200,0 473,0

Control (RN624)

1,25 1,4 1,5

También se determinó la afinidad de unión de anticuerpos anti-NGF purificados seleccionados para mNGF y rNGF (Tabla 6).

Tabla 6

Anticuerpo

KD de NGF (pM) KD de mNGF (pM) KD de rNGF (pM)

REGN472

0,41 0,61 3,96

REGN474

0,41 0,43 3,42

REGN475

0,18 0,36 0,93

REGN476

8,91 115 155

REGN477

7,98 133 164

Control (RN624)

1,25 1,4 1,51

Ejemplo 7. Inhibición de la unión de NGF con los receptores TrkA/hFc y p75/hFc

5 Para identificar los anticuerpos de bloqueo, se diseñó un ensayo de bloqueo del receptor usando un instrumento BIACORE™ 3000. Las proteínas p75-hFc humana y TrkA-hFc humana recombinantes se acoplaron por amina con una microplaca CM5 a una densidad de aproximadamente 5000 – 6000 UR. Se unió NGF humano (10 nM a 25 nM) con la superficie de TrkA y p75 para determinar la UR máxima para la unión de NGF. La superficie se regeneró después y se mezcló NGF de 10 nM a 25 nM con concentraciones de exceso molar de los anticuerpos individuales o

10 cuerpos receptores solubles, y la solución se inyectó sobre la superficie de microplaca regenerada para determinar las señales de unión de NGF libre restantes. La Tabla 7 muestra el porcentaje de NGF libre unido con TrkA y p75 en presencia de anticuerpo o cuerpo receptor. Se asignó a la unión de UR máxima de NGF humano en ausencia de anticuerpo un valor relativo de 100 %. Como controles positivos, se usaron RN624, TrkA-hFc y p75-hFc en solución y, como control negativo, se usó control de IgG1 (AVASTIN; Genentech, CA).

Tabla 7

Anticuerpo

% de Unión de TrkA-hFc % de Unión de p75-hFc

NGF solo

100 100

301272-1D07-B10

2 4

301272-1H07-G9

20 25

301272-1H08-G8

1 3

301272-3D08-C11

1 2

301272-3F12-D7

25 23

301272-3G11-C1

1 1

301272-3H10-A10

1 2

301272-3H11-A3

18 20

301272-6E07-D10

4 6

301272-6G10-D7

2 2

301272-7A10-D7

31 26

301272-7C05-G1

1 1

301272-7E05-F6

1 1

301272-7F11-A8

4 3

301272-7G09-E4

8 16

301272-7G10-E1

62 62

301272-7G11-F6

1 1

301272-7H05-D4

14 20

301272-7H07-C12

42 81

VAT8C10-8

4 395

VAT13F5-5

4 5

VAT12A10-13

11 539

VAT2C2-1

11 360

REGN472

4 7

REGN474

6 9

REGN475

6 10

REGN476

6 13

REGN477

9 13

mAb de control (RN624)

10 16

Control (TrkA-hFc)

10 15

Control (p75-hFc)

3 5

Control de IgG1

116 116

La capacidad de los anticuerpos de ensayo seleccionados, REGN472, REGN474, REGN475, REGN476 y REGN477 y el anticuerpo de control RN624 para bloquear la unión de NGF humano con los receptores TrkA y p75 humanos 20 también se midió cuantitativamente con un ELISA de tipo sándwich de competición, en el que la presencia del anticuerpo con una concentración fija de NGF en solución evitó que NGF se uniera con TrkA-hFc o p75-hFc que recubrían una placa de microtitulación. El NGF humano usado en el ensayo fue una proteína recombinante producida en E. coli y las proteínas TrkA-hFc y p75-hFc humanas fueron proteínas de fusión diméricas consistentes

en los dominios extracelulares de los receptores respectivos fusionados en línea con la parte Fc de IgG1 humano. La proteína NGF marcada con biotina a una concentración fija de 50 pM se valoró con diversas cantidades del anticuerpo de 1,5 pM a 1,5 nM en solución durante una hora a temperatura ambiente. La cantidad de biotina-NGF libre no unido en las mezclas de solución se cuantificó después capturando la biotina-NGF en placas de 5 microtitulación recubiertas con bien hTrkA-hFc o bien hp75-hFc, seguido de detección de NGF-biotinilado unido a placa con Estreptavidina-HRP. Específicamente, las placas de microtitulación se prepararon recubriendo las placas con hTrkA-hFc 0,5 g/ml o solución de hp75-hFc 1 g/ml en tampón de PBS durante una noche a 4 ºC, seguido de bloqueo de las placas con BSA 0,5 % antes de su uso. Para medir la biotina-NGF no unida, el anticuerpo preincubado y las soluciones de biotina-NGF se transfirieron a las placas recubiertas con receptor seguido de 10 incubación de 1 hora a temperatura ambiente. El NGF biotinilado unido a placa se detectó con Estreptavidina-HRP y se desarrolló con un sustrato de TMB colorimétrico, y se registró la DO450 nm. La dependencia de los valores de DO450 nm de las concentraciones de REGN475 en las soluciones pre-unión se analizó usando un modelo de respuesta a dosis sigmoideo proporcionado por PRISM™ (Graph Pad, CA). El valor de CI50 predicho, que se define como la concentración de anticuerpo requerida para bloquear el 50 % de la unión de NGF-biotinilado 50 pM con las

15 placas recubiertas con receptor, se usó como un indicador de la potencia del anticuerpo en el bloqueo de la unión de NGF con hTrkA-hFc o hp75-hFc. La Tabla 8 muestra valores de CI50 de cada anticuerpo ensayado contra hTrkA-hFc y hp75-hFc. mAb de control = RN624. Tabla 8

CI50 de bloqueo de TrkA-hFc (pM)

CI50 de bloqueo de p75-hFc (pM)

REGN472

12 12

REGN474

8,1 6,3

REGN475

20 22

REGN476

65 61

REGN477

65 62

Control (RN624)

48 72

20 Ejemplo 8. Inhibición de la unión de NT-3 con los receptores TrkA-, TrkB-, TrkC-y p75-hFc

También se ensayó la unión de NT-3 humana 20 nM con superficies de TrkA-, TrkB-, TrkC-y p75-hFc humanas, respectivamente, en presencia de 500 nM de REGN475, RN624 y AVASTIN (control de IgG1). TrkA-hFc humano (9300 UR), TrkB-hFc humano (6000 UR), TrkC-hFc humano (9100 UR) y p75-hFc humano (7500 UR) se acoplaron 25 covalentemente con superficies de microplacas CM5 BIACORE por procedimiento de acoplamiento de amina. Se mezcló NT-3 humana 20 nM con control 500 nM (control de IgG1 AVASTIN), REGN475, RN624, hTrkA-hFc, TrkBhFc, TrkC-hFc o p75-hFc en solución. La mezcla de unión se incubó en primer lugar a temperatura ambiente hasta alcanzar el equilibrio (aproximadamente 1 h) y después se inyectó sobre las superficies de TrkA-hFc, TrkB-hFc, TrkC-hFc y p75-hFc. Se midió el nivel de unión de NT-3 humana en cada muestra. La UR de unión de cada mezcla

30 de muestra se normalizó de acuerdo con el valor de UR de la muestra de control negativo, (es decir, NT-3 humana 20 nM con AVASTIN 500 nM) y se presentó como el % de unión con superficies TrK (Tabla 9). REGN475 no mostró casi ninguna interferencia con la unión de NT-3 con los receptores, mientras que las muestras restantes mostraron bloqueo significativo de la unión de NT-3 con los receptores.

35 Tabla 9

Anticuerpo

TrkA-hFc TrkB-hFc TrkC-hFc p75-hFc

Control de IgG1

100 100 100 100

RN624

7 8 8 19

REGN475

90 99 101 103

TrkA-hFc

21 5 3 7

TrkB-hFc

6 0 0 0

TrkC-hFc

11 0 0 0

P75-hFc

14 2 2 4

Ejemplo 9. Neutralización de la actividad biológica de NGF in vitro

La capacidad de los anticuerpos de NGF para bloquear la actividad de crecimiento celular mediada por el receptor

40 Trka y dependiente de NGF se llevó a cabo usando células MG87 transfectadas de forma estable con un plásmido que codificaba el receptor TrkA humano. Brevemente, las células transfectadas se tripsinizaron y se resuspendieron a aproximadamente 2,5 x 105 células por ml y se sembraron a 5.000 células por pocillo en una placa de cultivo tisular de 96 pocillos. Las proteínas de anticuerpo purificadas se diluyeron en serie en medio definido más BSA 0,1 % y se añadieron a las células sembradas en placas a concentraciones que variaban de 0 a 500 nM. Se añadió NGF

45 humano a los pocillos a una concentración final de 373 pM. La respuesta se midió después de incubar las células durante 3 días a 37 ºC en un incubador de CO2 al 5 % humidificado. La actividad de crecimiento celular se midió con un kit CCK8 (Dojindo) y se registró la DO450 nm. Se analizó la dependencia de las señales de las concentraciones de anticuerpo y se presentaron los valores de CI50 (Tabla 10, columna 2).

También se midió la capacidad de los anticuerpos de NGF para bloquear la actividad mediada por el receptor p75 y TrkA con señalización de NGF in vitro usando una línea celular de médula adrenal de rata, PC12, que expresa ambos receptores de forma endógena (Urdiales et al. 1998 J. Neuroscience 18(17): 6767-6775). Brevemente, las células PC12 se transfectaron de forma estable con un plásmido indicador que contenía un elemento de respuesta a 5 suero (SRE) unido con un gen de luciferasa. Las células transfectadas se resuspendieron a aproximadamente 2,5 x 105 células por ml y se sembraron a 50.000 células por pocillo en una placa de cultivo tisular de 96 pocillos en medio Opti-MEM durante una noche. Las proteínas de anticuerpo purificadas se diluyeron en serie en medio (DMEM más BSA 0,1 %) y se añadieron a las células sembradas a concentraciones que variaban de 0 a 100 nM. Se añadió NGF humano a los pocillos a una concentración final de 12,5 pM. Se midió la actividad luciferasa después de incubar las

10 células durante 6 horas a 37 ºC en un incubador de CO2 al 7,5 % humidificado usando el sistema de ensayo de luciferasa BRIGHT GLOW™ (Promega). Se determinaron los valores de CI50 como se ha descrito anteriormente, y se presentaron en la Tabla 10, columna 3. mAb de control = RN624.

Tabla 10

Anticuerpo

CI50 de MG87 (nM) CI50 de PC12 (nM)

301272-1D07-B10

<0,186 0,011

301272-1H07-G9

2,000 0,261

301272-1H08-G8

< 0,186 0,006

301272-3D08-C11

0,576 0,005

301272-3F12-D7

< 0,186 --

301272-3G11-C1

< 0,186 0,019

301272-3H10-A10

< 0,186 0,009

301272-3H11-A3

16,000 0,842

301272-6E07-D10

0,293 0,726

301272-6G10-D7

106,000 0,087

301272-7A10-D7

15,000 --

301272-7C05-G1

< 0,186 0,035

301272-7E05-F6

< 0,186 0,018

301272-7F11-A8

0,428 0,071

301272-7G09-E4

3,000 --

301272-7G10-E1

< 0,186 --

301272-7G11-F6

9,000 0,088

301272-7H05-D4

3,000 -

301272-7H07-C12

0,383 0,183

VAT2C2-1

532,000 --

VAT8C10-8

41,000 -

VAT12A10-13

41,000 --

VAT13F5-5

5,000 --

Control (RN624)

< 0,186 0,021

15 También se evaluó la capacidad de los anticuerpos anti-NGF purificados seleccionados, REGN472, REGN474 y REGN475, y mAb de control RN624 para bloquear la señalización de NGF mediante la actividad mediada por el receptor p75 y TrkA en una línea celular PC12 con el ensayo de luciferasa descrito anteriormente (Tabla 11).

20 Tabla 11

Anticuerpo

CI50 (pM)

REGN472

4,5

REGN474

6,6

REGN475

9,6

Control (RN624)

4,9

Se evaluó la capacidad del anticuerpo anti-NGF, REGN475, y el anticuerpo de control para bloquear la señalización de NT-3 mediante la actividad mediada por el receptor p75 y TrkA en la línea celular PC12 con el ensayo de luciferasa descrito anteriormente, modificado reemplazando NGF 12,5 pM con NT-3 75 nM. Los resultados

25 mostraron que el mAb de control RN624 bloqueaba la señalización de NT-3 con una CI50 de aproximadamente 104,8 nM, mientras que REGN475 no afectaba a la señalización de NT-3 en las condiciones experimentales actuales.

Además, se desarrolló un bioensayos para determinar la capacidad de los anticuerpos anti-NGF, REGN475 y RN624, para neutralizar la función celular mediada por NT-3 mediante TrkC in vitro. Se transfectó una línea celular 30 HEK293 modificada por ingeniería genética que expresaba TrkC con un plásmido indicador de luciferasa-SRE. NT-3 conduce la expresión de luciferasa en un ensayo de 6 horas. La capacidad de REGN475 y RN624 para bloquear la señalización de NT-3 mediante actividad mediada por el receptor TrkC en esta línea celular obtenida por ingeniería genética se evaluó con el ensayo de luciferasa. La línea celular HEK293 modificada por ingeniería genética se sembró en placas de 96 pocillos a 1 x 104 células/pocillo en medio sin suero y se incubó durante una noche a 37 ºC,

CO2 5 %. Se preincubaron REGN475 y RN624 a concentraciones que variaban de 1,6 M a 28 pM con NT-3 15 pM durante 1 hora y la mezcla se añadió a las células. Las células se incubaron después a 37 ºC, CO2 5 % durante 6 horas. Se determinó la actividad luciferasa añadiendo un volumen de pocillo igual de BRIGHT GLOW™ (Promega). El resultado mostró que RN624 inhibía la actividad luciferasa mediada por NT-3 con una CI50 de  150-200 nM en

5 presencia de una concentración constante de NGF 15 pM, mientras que REGN475 no inhibía la actividad luciferasa mediada por NT-3.

Ejemplo 10. Neutralización de la actividad biológica de NGF in vivo

10 Ensayo de adyuvante completo de Freund (CFA) del dolor inflamatorio. Para determinar si los anticuerpos anti-NGF podrían aliviar el dolor en un modelo de ratón inflamatorio periférico crónico, se inyectó adyuvante completo de Freund (CFA) por vía subcutánea (s.c.) en la pata trasera de ratones macho C57BL/6 provocando hiperalgesia térmica, que se midió usando el ensayo de Hargreaves (Torres et al. (2007) Pain 130: 267-278). Los ratones de control recibieron solamente el vehículo (es decir, PBS). Después de aclimatar los ratones al aparato de Hargreaves

15 (modelo 335, IITC Life Science) durante 2-3 horas por día durante 3 días, se ensayaron en el aparato con un ajuste de intensidad activa del 17 %. Se usó un tiempo de punto de corte de 25 s para evitar el daño tisular. Para cada ratón, se obtuvieron 3 lecturas durante un periodo de 30 min por día y se usó la mediana de tiempo de espera para el análisis. Después de obtener una lectura de línea basal en el aparato de Hargreaves, se inyectaron anticuerpos anti-NGF de ensayo, 301272-7E05-F6 (REGN268) y 301272-7G09-E4 (REGN270), y anticuerpo anti-NGF

20 humanizado (RN624) como un control positivo, s.c. a 10 mg/kg o 25 mg/kg, 1 h antes de inyectar una solución al 50 % de CFA (10 mg/20 l) en la pata trasera intraplantar. El ensayo de Hargreaves se repitió diariamente durante hasta 4 días después de la inyección de CFA y se calculó el % de reducción desde la línea basal en el tiempo de espera de retirada de la pata (Tablas 12 y 13, % de cambio medio  ETM). Se observó una reducción significativa en la hiperalgesia térmica para al menos uno de los días examinados para cada uno de los anticuerpos ensayados, en

25 comparación con ratones de control que recibieron solamente vehículo (p<0,001-0,05). No hubo ninguna diferencia estadística entre los anticuerpos ensayados y el anticuerpo de control. Tabla 12: n = 7 para cada grupo; todos los grupos 10 mg/kg. Tabla 13: vehículo: n=5; RN624 de control: n=5, 10 mg/kg; ambos REGN269: n=9).

Tabla 12

Tiempo después de la inyección de CFA

Vehículo Control (RN624) REGN268 REGN270

Línea basal

0,0  0,0 0,0  0,0 0,0  0,0 0,0  0,0

Día 1

-73,8  1,8 -58,3  5,5 -68,3  3,0 -55,8  9,2

Día 2

-67,9  2,1 -30,9  5,2 -44,7  9,5 -36,6  9,9

Día 3

-54,4  2,8 -20,7  6,3 -28,9  11,3 -38,1  5,6

Tabla 13

Tiempo después de la inyección de CFA

Vehículo Control (RN624) REGN269 10 mg/kg REGN269 25 mg/kg

Línea basal

0,0  0,0 0,0  0,0 0,0  0,0 0,0  0,0

Día 1

-82,6  1,6 -61,7  9,7 -79,8  1,8 -80,4  2,2

Día 2

-76,7  3,6 -33,1  17,9 -57,0  8,2 -54,0  5,2

Día 3

-60,8  5,5 -9,6  15,4 -23,9  12,4 -41,1  8,9

Día 4

-40,3  5,0 -0,4  18,5 -25,3  6,6 -16,9  12,6

Modelo de dolor por incisión post-operatorio. Se usó un modelo de roedor de dolor post-operatorio en el que una incisión plantar en la pata posterior provoca aumento de la sensibilidad al toque, comportamiento defensivo e 35 hiperalgesia térmica, para estudiar la eficacia de la terapia de anticuerpo anti-NGF. Para la cirugía de incisión plantar, los ratones C57BL/6 con isoflurano recibieron una incisión a través de la piel, fascia y después aislando el músculo flexor subyacente y biseccionando verticalmente. Después de la sutura y recuperación, los ratones se ensayaron con respecto a hiperalgesia térmica en el ensayo de Hargreaves y con respecto a comportamiento defensivo en el ensayo de soporte de peso (modelo 600, IITC Life Science) durante 5 días. Se administró una única 40 inyección s.c. de vehículo (n=7), mAb REGN268 (n=7) o mAb de control RN624 (n=7), a 10 mg/kg, 1 h antes de la escisión (Tabla 14, porcentaje medio de cambio desde la línea basal de Hargreaves  ETM. La Tabla 15 muestra los resultados del ensayo de soporte de peso (porcentaje medio de distribución de peso en la extremidad afectada  ETM) (n=7 para cada grupo, control RN624 y REGN268 cada uno 10 mg/kg). En ambos ensayos, el pre-tratamiento con el anticuerpo de ensayo o el anticuerpo de control redujo significativamente el dolor post-operatorio en

45 comparación con los ratones de control que recibieron vehículo solamente (p<0,001-0,05).

Tabla 14

Tiempo después de la cirugía

Vehículo Control (RN624) REGN268

Línea basal

0,00  0,0 0,00  0,0 0,00  0,0

Día 1

-72,4  4,4 -62,5  10,6 -59,9  8,9

Día 2

-72,7  3,5 -55,2  9,4 -34,4  21,3

Día 3

-63,8  7,4 -5,3  12,1 -19,8  18,8

Tiempo después de la cirugía

Vehículo Control (RN624) REGN268

Día 4

-52,1  7,8 -6,4  8,7 6,9  4,4

Día 5

-32,7  10,0 -5,3  5,6 6,8  7,8

Tabla 15

Tiempo después de la cirugía

Vehículo Control (RN624) REGN268

Día 0

49,7  0,9 49,0  0,5 50,3  0,7

Día 1

35,3  1,5 44,8  1,9 39,5  3,4

Día 2

34,3  1,9 42,7  1,8 40,7  2,0

Día 3

34,1  2,5 48,7  1,9 42,0  3,3

Día 4

42,2  0,8 47,2  1,2 44,8  1,0

Día 5

48,6  1,3 49,7  0,7 48,8  0,8

Para estudiar si los anticuerpos anti-NGF podrían aliviar el dolor establecido en el modelo de dolor por incisión post

5 operatorio, se inyectó por vía intraperitoneal (i.p.) REGN475 (25 mg/kg, n=7), RN624 (25 mg/kg, n=7) y anticuerpo de control IgG1 (25 mg/kg, n=7) el día 1 después de la cirugía tras realizar el trabajo conductual. Se estudió la hiperalgesia térmica en el ensayo de Hargreaves y se ensayó la alodinia mecánica en el ensayo de von Frey. En este último ensayo, los ratones se ensayaron después de aclimatarse durante 2-3 horas durante 4 días en un aparato con un suelo de malla de alambre. El ensayo se realizó aplicando, en orden ascendente, una serie de pelos

10 de von Frey a través de la malla de alambre a la superficie plantar de la pata trasera con la incisión. Una respuesta se consideró positiva si la pata se levantaba desde la plataforma en respuesta a la aplicación del filamento. Comenzando desde el pelo más fino, se aplicó cada filamento de von Frey hasta cinco veces hasta que se observó una respuesta. El resultado del ensayo de Hargreaves (Tabla 16) mostró que el tratamiento con anticuerpo REGN475 conducía a una inversión significativa de la hiperalgesia térmica a las 72 horas después de la cirugía

15 (p<0,001-0,01). Este regreso a la línea basal no se observó en la cohorte de ratones tratada con RN624, que se comportaron de forma similar al grupo tratado con el control de IgG. En el ensayo de von Frey (Umbral de Retirada de la Pata) (g) (Tabla 17), ambos anticuerpos anti-NGF provocaron un alivio similar de la alodinia mecánica (p<0,001-0,05) (control de IgG1 = AVASTIN, 25 mg/kg, n=7; RN624, 25 mg/kg, n=7; REGN475, 25 mg/kg, n=7).

20 Tabla 16

Tiempo después del tratamiento con anti-NGF

Control de IgG1 RN624 REGN475

Línea basal

0,0  0,0 0,0  0,0 0,0  0,0

Día 1

z-66,5  9,0 -74,7  4,3 -72,6  5,4

6 h

-79,8  3,8 -68,1  5,2 -59,3  9,6

23 h

-77,6  3,6 -40,5  8,9 -37,0  15,0

47 h

-61,2  6,6 -37,6  7,2 -30,5  10,8

72 h

-57,0  7,9 -47,2  8,0 2,1  17,3

Tabla 17

Tiempo después del tratamiento con anti-NGF

Control de IgG1 RN624 REGN475

Línea basal

1,314  0,137 1,314  0,137 1,286  0,074

Día 1

0,011  0,002 0,010  0,002 0,010  0,002

5 h

0,011  0,002 0,083  0,053 0,034  0,009

22 h

0,029  0,004 0,610  0,123 0,714  0,074

45 h

0,190  0,135 0,909  0,216 1,086  0,184

70 h

0,194  0,034 1,143  0,189 1,571  0,437

El día 4, después de completarse los ensayos conductuales de modelo de dolor post-incisión, se recogieron los

25 sueros de los ratones y se analizaron con respecto a niveles en circulación de neurotrofina-3 (NT-3) usando un ELISA de tipo sándwich. El límite de detección (40 pg/ml) se definió como dos desviaciones típicas (2 ) por encima del fondo con un mínimo de cinco patrones de NT-3 para definir la curva de respuesta a concentración. Los niveles de NT-3 de ratones tratados con RN624 (media  dt pg/ml, Tabla 18) mostraron un aumento significativo (172  114 pg/ml, n=7) con respecto a los tratados con REGN475 (no detectado = ND, n=7) o control de IgG (AVASTIN; ND,

30 n=7).

Tabla 18

Grupo

NT-3 en Suero

RN624

172  114

REGN475

ND

Control de IgG1

ND

Para comparación, se proporcionó a ratones C57BL/6 vírgenes con isoflurano una inyección s.c. (50 mg/kg) de REGN475, RN624 o mAb de control IgG1 (AVASTIN) y sus sueros se analizaron a 1, 7 y 14 días después del tratamiento con respecto a los niveles de NT-3 usando un ELISA de tipo sándwich. El límite de detección (40 pg/ml) se definió como dos desviaciones típicas (2 ) por encima del fondo con un mínimo de cinco patrones de NT-3 para definir la curva de respuesta a concentración. Los niveles de NT-3 (Tabla 19) en ratones tratados con RN624 (131199 pg/ml, n=6) estuvieron elevados en comparación con REGN475 (ND, n=6) o control de IgG (n=6), como se observó con el modelo de dolor por incisión post-operatoria descrito anteriormente.

Tabla 19

Grupo

NT-3 en Suero

Día 1

RN624

131  41

REGN475

ND

Control de IgG1

ND

Día 7

RN624

199  15

REGN475

ND

Control de IgG1

ND

Día 14

RN624

196  35

REGN475

ND

Control de IgG1

ND

10 Modelo de dolor de articulación gotosa agudo. Se usó un modelo de ratón de dolor de la articulación provocado por inyección de cristales de urato monosódico (MSU) en el tobillo para estudiar la eficacia de los anticuerpos de la invención para tratar dolor de articulaciones artríticas gotosas. Se inyectaron cristales de MSU sin endotoxinas (0,5 mg/20 l) por vía intra-articular en el tobillo de ratones C57BL/6 y los ratones se ensayaron después con respecto a

15 dolor térmico del talón en el ensayo de Hargreaves durante hasta 3 días después de la inyección de cristales de MSU. Los parámetros de aclimatación y el ajuste del aparato para el ensayo de Hargreaves son como se ha descrito anteriormente. Se inyectó s.c. mAb de ensayo 7E05-F6 (REGN268; n=7), 6E07-D10 (REGN263; n=7), o mAb humanizado de control (RN624; n=7) o vehículo (n=7) a 10 mg/kg 1 h antes de la inyección en el tobillo de cristales de MSU. Como se muestra en las Tablas 20 y 21, los anticuerpos de ensayo redujeron significativamente el dolor de

20 la articulación, en comparación con los ratones de control que recibieron solamente vehículo (p<0,001-0,05).

Tabla 20

Tiempo después de la inyección en el tobillo de cristales de MSU

Vehículo Control (RN624) REGN268 REGN263

Línea basal

0,0  0,0 0,0  0,0 0,0  0,0 0,0  0,0

Día 1

-62,4  3,1 -33,3  5,2 -28,1  7,8 -36,3  3,8

Día 2

-44,2  3,5 -4,5  11,2 29  19,3 16,8  22,3

Día 3

-24,9  7,9 -3,2  12,0 1 2,1  15,5 4,5  15,5

Día 4

-11,6  10,5 28,3  18,7 19,9 16,5 -9,0  5,5

Tabla 21

Tiempo después de la inyección en el tobillo de cristales de MSU

Vehículo Control (RN624) REGN268 REGN263

Línea basal

0,0  0,0 0,0  0,0 0,0  0,0 0,0  0,0

Día 1

-62,6  2,7 -36,0  6,8 -46,7  4,2 -53,9  4,0

Día 2

-54,8  2,7 -11,8  9,8 -28,5  8,4 -35,3  8,5

Día 3

-31,8  3,4 -5,3  8,2 -12,6  9,0 -28,5  8,6

25 La capacidad de un anticuerpo anti-NGF para aliviar el dolor establecido en el modelo de gota agudo se estudió adicionalmente en ratones inyectados con un antagonista de IL-1 (trampa de IL-1 (rinolacept), Economides et al. (2003) Nature 9: 47-52) o colchicina. Una día después de inyectar los cristales de MSU en los tobillos, se inyectó a los ratones trampa de mIL-1 (35 mg/kg; n=7), colchicina (1 mg/kg; n=7), mAb de control RN624 (10 mg/kg; n=7), o

30 vehículo (n=7), y se ensayaron con respecto a hiperalgesia térmica como se ha descrito anteriormente. Adicionalmente, otra cohorte de ratones (n=3) recibieron co-tratamiento tanto con trampa de mIL-1 como el RN624 de control. La terapia de combinación de anticuerpo anti-NGF y el antagonista de IL-1 alivió significativamente la hiperalgesia térmica establecida en comparación con el tratamiento solamente con vehículo (p<0,001-0,05), o bien solamente anticuerpo anti-NGF (p<0,001) o antagonista de IL-1 solamente (p<0,001) el Día 2 después del

35 tratamiento (Tabla 22).

Tabla 22

Tiempo

Vehículo Trampa de mIL-1 Colchicina Control (RN624) Trampa de mIL-1 + RN624

Línea basal

0,0  0,0 0,0  0,0 0,0  0,0 0,0  0,0 0,0  0,1

Día 1 después de la inyección de MSU

-51,9  3,0 -52,9  2,6 -52,8  2,1 -51,9  2,4 -46,6  4,3

7 h después del tratamiento

-54,8  2,0 -50,6  1,8 -33,1  4,9 -53,2  3,0 -43,3  4,4

Día 1 después del tratamiento

-46,8  2,1 -31,9  6,2 -23,1  7,1 -32,0  10,6 -3,7  11,0

Día 2 después del tratamiento

-37,3  3,6 -9,1  9,4 -23,0  7,6 -27,6  8,3 40,0  29,1

Día 3 después del tratamiento

-26,9  4,4 -12,4  10,4 -14,3  9,8 -9,1  10,9 21,9  19,9

Dolor neuropático. Se usó el modelo de ratón Seltzer de dolor neuropático (Malmberg et al. (1998) Pain 76: 215222) con ratones macho C57BL/6 en los que se produjo una lesión nerviosa parcial atando una ligadura estrecha 5 con una sutura de seda 7-0 de aproximadamente 1/3 a 1/2 el diámetro del nervio ciático de un único muslo por ratón. Después de la cirugía, se permitió que los ratones se recuperaran durante al menos dos días y después se estudiaron durante varias semanas después de la cirugía con respecto a hiperalgesia térmica en el ensayo de Hargreaves. Los controles fueron ratones operados de forma simulada en los que se expuso el nervio ciático y se elevó pero no se ató. Después de la cirugía, los ratones se ensayaron el día 4 y el día 7 después de la cirugía para 10 confirmar que se había desarrollado hiperalgesia térmica. El día 7 después de la cirugía, se inyectó a los ratones s.c. mAb REGN268 (100 mg/kg), control de IgG1 (AVASTIN 100 mg/kg), y vehículo. REGN268 alivió significativamente la hiperalgesia térmica establecida en este modelo de lesión nerviosa (Tabla 23; p<0,05). Este alivio del dolor no se observó en los ratones operados de forma simulada. Los resultados expresados como porcentaje de cambio medio de la línea basal de Hargreaves  ETM (vehículo-simulación, n=3; simulación-control de IgG1 100 mg/kg 15 (AVASTIN), n)4; simulación-REGN268 100 mg/kg, n=5; vehículo-Seltzer, n=5; Seltzer-control de IgG1 100 mg/kg

(AVASTIN), n=5; Seltzer-REGN268 100 mg/kg, n=8).

Tabla 23

Días después de la cirugía

Simulación-Vehículo Simulación – control de IgG1 Simulación -REGN268 Seltzer-Vehículo Seltzercontrol de IgG1 Seltzer-REGN268

0

0,0  0,0 0,0  0,0 0,0  0,0 0,0  0,0 0,0  0,0 0,0  0,0

4

8,5  3,9 -7,2  3,7 12,0  4,0 -42,5  3,0 -46,9  6,5 -46,4  3,7

7

4,5  1,3 8,7  13,2 8,7  7,7 -45,7  1,5 -55,3  6,4 -46,5  2,7

8

10,3  1,7 -9,4  4,1 3,0  5,1 -53,2  3,2 -55,6  4,3 -2,4  6,8

11

5,0  2,3 14,7  11,4 1,5  5,7 -61,5  4,2 -57,3  5,1 4,2  11,2

13

15,4  2,6 -6,9  3,3 28,7  13,8 -61,4  3,8 -59,7  6,5 1,2  5,7

16

4,2  4,0 2,3  3,0 9,0  1,4 -52,2  5,3 -51,2  4,0 2,1  12,1

18

10,2  7,8 0,2  2,8 6,3  4,8 -54,9  4,4 -57,7  4,6 2,2  100

20

7,8  6,0 3,6  2,4 5,0  4,5 -53,8  4,5 -53,2  4,9 -20,8  8,1

24

7,6  5,6 1,5  2,9 11,1  3,2 -56,4  3,0 -54,9  4,1 -26,4  6,8

28

11,1  6,0 0,7  2,5 10,9  5,0 -53,9  2,1 -51,81  4,1 -5,4  15,0

31

11,7  6,6 1,1  2,3 5,1  1,8 -49,6  4,1 -49,7  2,5 -23,3  11,7

20 En el segundo experimento, para ver si el tratamiento con anti-NGF podría aliviar la hiperalgesia térmica después del día 7 tras la cirugía, se inyectó anti-NGF REGN268 (100 mg/kg) s.c. los días 7, 14 o 21 después de la cirugía. Se obtuvo alivio del dolor significativo en los 3 puntos temporales en comparación con el control de IgG1 (AVASTIN 100 mg/kg; p<0,05) (Tabla 24, porcentaje de cambio medio desde la línea basal de Hargreaves  ETM; control de IgG1 100 mg/kg, n=6; REGN268 100 mg/kg, n=7).

Tabla 24

Días

Día 7 Día 14 Día 21

después de la cirugía

Control de IgG1 REGN268 Control de IgG1 REGN268 Control de IgG1 REGN268

Línea basal

0,0  0,0 0,0  0,0 0,0  0,0 0,0  0,0 0,0  0,0 0,0  0,0

Día 5

-53,5  5,9 -51,4  5,6 -60,0  4,8 -54,2  5,2 -55,5  5,0 -55,5  6,0

Día 7

-55,4  4,4 -50,0  6,6 -54,4  6,4 -47,9  3,6 -47,2  4,8 -40,7  8,5

Día 8

-56,7  3,8 17,3  13,5 -55,3  6,1 -47,2  3,2 -47,9  4,7 -41,2  7,3

Día 10

-64,3  2,6 -6,4  7,7 -52,8  7,2 -62,9  5,2 -55,0  6,7 -45,9  6,9

Días después de la cirugía

Día 7 Día 14 Día 21

Control de IgG1

REGN268 Control de IgG1 REGN268 Control de IgG1 REGN268

Día 14

-66,9  5,1 -4,9  3,4 -62,1  5,7 -59,7  2,1 -63,8  4,6 -61,2  3,4

Día 15

-60,6  4,0 -1,7  10,5 -63,0  5,8 -38,5  7,3 -54,5  5,0 -47,1  4,4

Día 17

-58,9  3,5 -0,8  10,5 -58,6  5,7 25,2  17,0 -52,4  5,3 -48,4  4,5

Día 21

-54,1  9,6 0,9  9,9 -57,1  4,4 2,1  14,8 -55,8  3,6 -48,1  5,0

Día 22

-56,3  4,9 -1,0  10,0 -55,4  5,1 -6,4  7,1 -50,6  5,3 -34,0  6,4

Día 24

-55,6  5,1 -1,0  10,3 -49,5  6,6 -2,1  11,4 -44,7  5,7 -3,2  10,8

Día 28

-54,1  3,5 -9,0  9,6 -53,6  5,4 -1,8  8,5 -46,0  7,6 13,9  12,0

Día 32

-41,9  8,3 -29,1  7,1 -40,9  13,1 -10,2  8,7 -32,8  4,8 8,0  12,9

Día 35

-43,9  6,8 -32,6  67,4 -42,9  10,3 -11,8  7,9 -39,8  4,5 12,2  12,4

Día 39

-42,5  6,9 -29,0  7,9 -39,0  11,4 -11,7  6,7 -34,6 10,0 12,3  10,8

Día 42

-35,0  6,6 -26,1  7,6 -38,1  12,5 -8,9  8,6 -33,9  9,9 13,5  11,5

En el tercer experimento, se ensayó la capacidad de otro anticuerpo anti-NGF REGN475 en el modelo de Seltzer. Después de la cirugía de Seltzer, se ensayaron los ratones los días 5 y 7 después de la cirugía para confirmar que se había desarrollado hiperalgesia térmica. Después, el día 7 después de la cirugía se inyectó a los ratones por vía 5 s.c. o i.p. REGN475 (50 mg/kg), mAb de control RN624 (50 mg/kg) o control de IgG1 (AVASTIN) (50 mg/kg). Se observó alivió del dolor significativo con ambos anticuerpos anti-NGF en ambas cohortes de ratones, bien inyectadas

s.c. (Tabla 25) o bien i.p. (Tabla 26), mientras que IgG1 de control no mostró ningún efecto (p<0,001-0,05) (porcentaje de cambio medio desde la línea basal de Hargreaves  ETM; control de IgG1 50 mg/kg, n=7; RN624 mg/kg, n=7; REGN475 50 mg/kg, n=7).

Tabla 25

Días después de la cirugía

Control de IgG1 RN624 REGN475

Línea basal

0,0  0,0 0,0  0,0 0,0  0,0

5

-51,2  5,2 -53,5  6,3 -55,2  3,5

7

-47,6  3,9 -48,4  6,2 -50,9  4,3

8

-31,1  11,9 4,5  9,0 10,3  14,1

9

-36,7  14,6 -15,2  8,5 8,2  7,2

12

-47,2  5,5 -4,2  12,0 -20,1  4,3

15

-46,7  8,5 2,1  10,9 -14,1  6,1

19

-28,6  7,5 -11,5  12,1 3,0  10,9

22

-34,9  7,9 -5,7  9,5 -13,7  13,4

Tabla 26

Días después de la cirugía

Control de IgG1 RN624 REGN475

Línea basal

0,0  0,0 0,0  0,0 0,0  0,0

5

-55,5  3,8 -56,6  2,3 -58,7  2,3

7

-61,6  1,8 -62,3  3,4 -61,7  2,7

8

-59,3  4,0 -3,3  16,0 -8,2  16,1

9

-51,0  4,2 -18,4  12,9 -7,9  9,6

12

-46,5  6,3 -7,0  11,8 -0,1  22,8

15

-43,3  6,6 -16,2  14,8 -10,8  18,0

15 Para determinar la capacidad de los anticuerpos para neutralizar las actividades de NGF humano in vivo, se realizaron ratones transgénicos de los que se reemplazó el locus de NGF de ratón endógeno con el gen de NGF humano. Estos ratones se usaron en un modelo de dolor neuropático de Seltzer para ensayar REGN268 y mAb de control. Después de la cirugía de Seltzer, estos ratones se ensayaron el día 4 y el día 8 después de la cirugía para confirmar que se había desarrollado la hiperalgesia térmica. Después, el día 8 después de la cirugía se inyectó a los

20 ratones s.c. mAb REGN268 50 mg/kg (n=7), RN624 de control 50 mg/kg (n=8) o control de IgG1 50 mg/kg (AVASTIN) (n=6). Los resultados (Tabla 27) mostraron que REGN268 era tan eficaz como un anticuerpo anti-NGF humanizado (RN264) en el alivio del dolor neuropático en los ratones de NGF humanizados, mientras que el control de IgG1 no tuvo ningún efecto (p<0,05).

25 Tabla 27

Días después de la cirugía

Control de IgG1 RN624 REGN268

Línea basal

0,0  0,0 0,0  0,0 0,0  0,0

8

-55,4  5,7 -38,1  6,4 -40,8  6,9

10

-54,3  8,0 -23,0  7,7 -16,8  54

12

-44,8  7,9 -18,4  8,4 -15,1 6 10,1

Días después de la cirugía

Control de IgG1 RN624 REGN268

14

-41,3  7,0 5,0  23,6 -6,7  12,9

16

-42,5  8,8 -12,7  9,5 5,2  16,3

20

-44,2  8,9 -15,7  13,0 -8,0  13,7

Ejemplo 11. Efecto de anti-NGF en la función motora animal

Para estudiar si el tratamiento con anti-NGF podría alterar la función motora, se evaluó la coordinación motora en el

5 ensayo de barra rotatoria en ratones C57BL/6 macho vírgenes. Los animales se entrenaron en primer lugar para permanecer en una barra rotatoria (Columbus Instruments, 3,5 cm de diámetro, 9 cm de ancho) rotando a velocidades progresivamente mayores (velocidad máxima 10 rpm). Los ratones permanecieron a 10 rpm en entrenamiento hasta que pudieron caminar durante 60 s consecutivamente, o hasta que habían pasado un total de 2 min caminando sobre la barra rotatoria a 10 rpm cada día durante tres días consecutivos. Después del

10 entrenamiento, cada ratón se colocó en la barra rotatoria a 10 rpm tres veces consecutivamente (con un breve descanso entre pruebas) y se registró el tiempo de espera hasta la caída. Los animales se retiraron después de 1 min, y se les asignó una puntuación de 60 s si no se caían. La mediana de la puntuación de 3 ensayos para cada ratón se usó en el análisis. Después de obtener una lectura de línea basal en la barra rotatoria, se inyectaron s.c. los mAb REGN475, RN624 o control negativo de IgG a 50 mg/kg o 100 mg/kg. Los ratones se ensayaron después

15 durante hasta 20 días después de la inyección de anticuerpo. Los resultados (Tabla 28, expresada como tiempo de espera hasta la caída en s) (media  ETM) mostraron que los ratones tratados con RN624 pero no REGN475, tenían una coordinación motora significativamente alterada (p<0,001-0,05). Resulta interesante que se ha indicado que los ratones con supresión de NT-3 y TrkC presentaban movimientos y posturas anómalos y propiocepción perdida (Ernfors et al. (1994) Cell 77: 503-512; y Klein et al. (1994) Nature 368: 249-251). Además de la barra rotatoria,

20 también se realizaron ensayos de Hargreaves y von Frey en ratones vírgenes a los que se inyectaron anticuerpos anti-NGF. No se observaron diferencias estadísticamente significativas para ningún grupo de ratones en los ensayos de Hargreaves y von Frey durante los 20 días después de la administración del anticuerpo (n=6 para cada grupo).

Tabla 28

Tiempo después del tratamiento con anti-NGF

control de IgG1 100mg/kg RN624 50mg/kg RN624 100mg/kg REGN475 50mg/kg REGN475 100mg/kg

Línea basal

57,7  1,6 54,2  4,6 60,0  0,0 55,0 60,0  0,0

Día 1

59,2  0,7 43,2  3,7 32,8  2,2 58,0  1,3 58,4  1,5

Día 4

52,8  4,8 36,3  4,3 32,5  3,2 52,5  4,3 53,2  3,3

Día 7

57,7  1,8 47,2  3,7 37,5  5,2 58,0  1,3 60,0  0,0

Día 11

58,7  1,0 50,0  4,7 44,7 6,2 55,2  2,1 60,0  0,0

Día 15

57,8  1,6 56,7  2,6 36,0  1,7 55,2  2,2 57,7  1,6

Día 20

57,8  1,8 57,8  1,3 45,7  5,0 51,8  3,3 53,7  3,1

Ejemplo 12. Tratamiento de un paciente que padece neuralgia post-herpética

A un paciente que ha desarrollado dolor crónico en el sitio de un herpes zóster se le diagnostica neuralgia postherpética. El paciente se trata por administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición 30 farmacéuticamente aceptable que comprende un mAb anti-NGF de la invención. La administración puede ser por inyección subcutánea o intravenosa, a las concentraciones de anticuerpo anti-NGF de, preferentemente, entre 0,1 y 10 mg/kg de peso corporal. La frecuencia de tratamiento puede ser cada 1-12 semanas, o según sea necesario. En un periodo de varios días después de la administración de la composición de anticuerpo anti-NGF, el dolor del paciente se alivia sustancialmente. La administración repetida de la composición de mAb anti-NGF mantiene este

35 alivio del dolor.

Ejemplo 13. Tratamiento de un paciente que padece dolor por osteoartritis

Un paciente que padece dolor de moderado a grave provocado por osteoartritis en cualquier articulación se trata

40 mediante la administración de la cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéuticamente aceptable que comprende un mAb anti-NGF de la invención. La composición puede administrarse por vía intravenosa a las concentraciones del anticuerpo anti-NGF entre 10 g/kg de peso corporal y 10 mg/kg de peso corporal. La frecuencia de tratamiento puede ser cada 1-12 semanas, o según sea necesario. En un periodo de varios días de la administración de la composición de anticuerpo anti-NGF, el dolor del paciente se alivia sustancialmente y recupera

45 la movilidad de la articulación afectada. El tratamiento puede repetirse tanto tiempo como sea necesario.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc. 50

<120> Anticuerpos humanos de alta afinidad para el factor de crecimiento nervioso humano

<130> 6060A-WO

<140> Por asignar

<141> 5

<150> 60/964.224

<151>

<150> 60/994.526 10 <151>

<150> 61/062.860

<151> 15 <150> 61/079.259

<151>

<160> 543 20 <170> FastSEQ para Windows Versión 4.0

<210> 1

<211> 847

<212> ADN 25 <213> Homo sapiens

<400> 1

<210> 2

<211> 115

<212> PRT

<213> Homo sapiens 35

<400> 2

<210> 3

<211> 349 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 10

<400> 3

15 <210> 4

<211> 116

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> Sintética

<400> 4

5

<210> 5 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia artificial

10

<220> <223> Sintética <400> 5 ggtggatcct tcagtgatta ctac 24

15

<210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Secuencia artificial

20

<220> <223> Sintética

<400> 6

25 30

<210> 7 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Sintética

35

<400> 7 atcaatcata ctggaagcac c 21

40

<210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> Secuencia artificial

<220> <223> Sintética

45

<400> 8

5

<210> 9 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Sintética

10

<400> 9 gcgagagagg aggtcatctg gttcgactcc 30

15

<210> 10 <211> 10 <212> PRT <213> Secuencia artificial

<220> <223> Sintética

20

<400> 10

<210> 11 25 <211> 325

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 30 <223> Sintética

<400> 11

35

<210> 12

<211> 108

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

40

<220>

<223> Sintética

<400> 12

45

5

<210> 13 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial

10

<220> <223> Sintética <400> 13 cagagtgtta gtaatagcca c 21

15

<210> 14 <211> 7 <212> PRT <213> Secuencia artificial

20

<220> <223> Sintética

<400> 14

25 30

<210> 15 <211> 9 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Sintética

35

<400> 15 agtgcatcc 9

40

<210> 16 <211> 3 <212> PRT <213> Secuencia artificial

<220> <223> Sintética

45

<400> 16

<210> 17

<211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial

5

<220> <223> Sintética

10 15

<400> 17 cagcagtatg gaagttcact gtacact <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> Sintética 27

20

<400> 18

<210> 19

<211> 367 25 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 30

<400> 19

35 <210> 20

<211> 122

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

40 <220>

<223> Sintética

<400> 20

5

<210> 21 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia artificial

10

<220> <223> Sintética <400> 21 ggattcacct tcagtagcta cgac 24

15

<210> 22 <211> 8 <212> PRT <213> Secuencia artificial

20

<220> <223> Sintética

<400> 22

25 30

<210> 23 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Sintética

35

<400> 23 atcggtgctg ctggtgacac a 21

40

<210> 24 <211> 7 <212> PRT <213> Secuencia artificial

<220> <223> Sintética

45

<400> 24

5

<210> 25 <211> 48 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Sintética

10

<400> 25 gcaagagagg gaaccggaac tacgaactac tattatggta tggacgtc 48

15

<210> 26 <211> 16 <212> PRT <213> Secuencia artificial

<220> <223> Sintética

20

<400> 26

<210> 27 25 <211> 322

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 30 <223> Sintética

<400> 27

35

<210> 28

<211> 107

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

40

<220>

<223> Sintética

<400> 28

45

<210> 29

<211> 18 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 10

<400> 29 cagagtgtta gcaggcac 18

<210> 30 15 <211> 6

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 20 <223> Sintética

<400> 30

<210> 31

<211> 9

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 30

<220>

<223> Sintética

<400> 31 35 agtgcatcc 9

<210> 32

<211> 3

<212> PRT 40 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<210> 33

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 5

<220>

<223> Sintética

<400> 33 10 cagcagtata gtagctcacc gatcacc 27

<210> 34

<211> 9

<212> PRT 15 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

20 <400> 34

<210> 35 25 <211> 367

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 30 <223> Sintética

<400> 35

35

<210> 36

<211> 122

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

40

<220>

<223> Sintética

<400> 36

45

5

<210> 37 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia artificial

10

<220> <223> Sintética <400> 37 ggattcacct tcagagccta cgac 24

15

<210> 38 <211> 8 <212> PRT <213> Secuencia artificial

20

<220> <223> Sintética

<400> 38

25 30

<210> 39 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Sintética

35

<400> 39 attggttctg ctggtgacac a 21

40

<210> 40 <211> 7 <212> PRT <213> Secuencia artificial

<220> <223> Sintética

45

<400> 40

5

<210> 41 <211> 48 <212> ADN <213> Secuencia artificial

10

<220> <223> Sintética <400> 41 gcaagagagg caactggaac tacgaactac tactacggta tggacgtc 48

15

<210> 42 <211> 16 <212> PRT <213> Secuencia artificial

20

<220> <223> Sintética

<400> 42

25

<210> 43

<211> 325

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

30

<220>

<223> Sintética

<400> 43

35

<210> 44

<211> 108 40 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 45

<400> 44

5

<210> 45 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial

10

<220> <223> Sintética <400> 45 cagaatatta gcggcaggtc c 21

15

<210> 46 <211> 7 <212> PRT <213> Secuencia artificial

20

<220> <223> Sintética

<400> 46

25 30

<210> 47 <211> 9 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Sintética

35

<400> 47 ggtgcgtcc 9

40

<210> 48 <211> 3 <212> PRT <213> Secuencia artificial

<220> <223> Sintética

45

<400> 48

<210> 49

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 5

<220>

<223> Sintética

<400> 49 10 cagcaatatg gtagctcacc gatcacc 27

<210> 50

<211> 9

<212> PRT 15 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

20 <400> 50

<210> 51 25 <211> 367

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 30 <223> Sintética

<400> 51

35

<210> 52

<211> 122

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

40

<220>

<223> Sintética

<400> 52

45

5

<210> 53 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia artificial

10

<220> <223> Sintética <400> 53 ggattcacct tcagtaactt cgac 24

15

<210> 54 <211> 8 <212> PRT <213> Secuencia artificial

20

<220> <223> Sintética

<400> 54

25 30

<210> 55 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Sintética

35

<400> 55 attggttctg ctggtgacac a 21

40

<210> 56 <211> 7 <212> PRT <213> Secuencia artificial

<220> <223> Sintética

45

<400> 56

5

<210> 57 <211> 48 <212> ADN <213> Secuencia artificial

10

<220> <223> Sintética <400> 57 gcaagagagg gaactggaac tacgaactat tactacggta tggacgtc 48

15

<210> 58 <211> 16 <212> PRT <213> Secuencia artificial

20

<220> <223> Sintética

<400> 58

25

<210> 59

<211> 322

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

30

<220>

<223> Sintética

<400> 59

35

<210> 60

<211> 107 40 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 45

<400> 60

<210> 61

<211> 18 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 10

<400> 61 cagagtgtta gcagtcac 18

<210> 62 15 <211> 6

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 20 <223> Sintética

<400> 62

25

<210> 63 <211> 9 <212> ADN <213> Secuencia artificial

30

<220> <223> Sintética

35 40

<400> 63 ggtgcttcc 9 <210> 64 <211> 3 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> Sintética

<400> 64

5

<210> 65 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Sintética

10

<400> 65 caacattata gtaagtcacc gatcacc 27

15

<210> 66 <211> 9 <212> PRT <213> Secuencia artificial

<220> <223> Sintética

20

<400> 66

<210> 67 25 <211> 367

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 30 <223> Sintética

<400> 67

35

<210> 68

<211> 122

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

40

<220>

<223> Sintética

<400> 68

45

5

<210> 69 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia artificial

10

<220> <223> Sintética <400> 69 ggattcacct tcagtaacta cgac 24

15

<210> 70 <211> 8 <212> PRT <213> Secuencia artificial

20

<220> <223> Sintética

<400> 70

25 30

<210> 71 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Sintética

35

<400> 71 attggtgctg ctggtgacac a 21

40

<210> 72 <211> 7 <212> PRT <213> Secuencia artificial

<220> <223> Sintética

45

<400> 72

5

<210> 73 <211> 48 <212> ADN <213> Secuencia artificial

10

<220> <223> Sintética <400> 73 gcaagagagg gaactggaac tacgaactac tactacggta tggacgtc 48

15

<210> 74 <211> 16 <212> PRT <213> Secuencia artificial

20

<220> <223> Sintética

<400> 74

25

<210> 75

<211> 322

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

30

<220>

<223> Sintética

<400> 75

35

<210> 76

<211> 107 40 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 45

<400> 76

<210> 77

<211> 18 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 10

<400> 77 cagagtgtta gcagctac 18

<210> 78 15 <211> 6

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 20 <223> Sintética

<400> 78

25 30

<210> 79 <211> 9 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Sintética

35

<400> 79 ggtgcgtcc 9

40

<210> 80 <211> 3 <212> PRT <213> Secuencia artificial

<220> <223> Sintética

45

<400> 80

5

<210> 81 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Sintética

10

<400> 81 cagcagtatg ctagttcacc gatcacc 27

15

<210> 82 <211> 9 <212> PRT <213> Secuencia artificial

<220> <223> Sintética

20

<400> 82

<210> 83 25 <211> 357

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 30 <223> Sintética

<400> 83

35

<210> 84

<211> 119

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

40

<220>

<223> Sintética

<400> 84

45

5

<210> 85 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia artificial

10

<220> <223> Sintética <400> 85 ggattcaccc tcactgaatt atcc 24

15

<210> 86 <211> 8 <212> PRT <213> Secuencia artificial

20

<220> <223> Sintética

<400> 86

25 30

<210> 87 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Sintética

35

<400> 87 tttgatcctg aagatggtga aaca 24

40

<210> 88 <211> 8 <212> PRT <213> Secuencia artificial

<220> <223> Sintética

45

<400> 88

5

<210> 89 <211> 36 <212> ADN <213> Secuencia artificial

10

<220> <223> Sintética <400> 89 tcaacgattt ttggagtggt taccaacttt gacaac 36

15

<210> 90 <211> 12 <212> PRT <213> Secuencia artificial

20

<220> <223> Sintética

<400> 90

25

<210> 91

<211> 324

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

30

<220>

<223> Sintética

<400> 91

35

<210> 92

<211> 107 40 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 45

<400> 92

5

<210> 93 <211> 18 <212> ADN <213> Secuencia artificial

10

<220> <223> Sintética <400> 93 caggccatta gaaatgat 18

15

<210> 94 <211> 6 <212> PRT <213> Secuencia artificial

20

<220> <223> Sintética

<400> 94

25 30

<210> 95 <211> 9 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Sintética

35

<400> 95 gctgcattc 9

40

<210> 96 <211> 3 <212> PRT <213> Secuencia artificial

<220> <223> Sintética

45

<400> 96

<210> 97

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 5

<220>

<223> Sintética

<400> 97 10 caacagtata atagataccc gtggacg 27

<210> 98

<211> 9

<212> PRT 15 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

20 <400> 98

<210> 99 25 <211> 357

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 30 <223> Sintética

<400> 99

35

<210> 100

<211> 119

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

40

<220>

<223> Sintética

<400> 100

45

<210> 101

<211> 324 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 10

<400> 101

15 <210> 102

<211> 108

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> Sintética

<400> 102

<210> 103

<211> 357

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

5

<220>

<223> Sintética

<400> 103

10

<210> 104

<211> 119 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 20

<400> 104

25 <210> 105

<211> 324

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

30 <220>

<223> Sintética

<400> 105

<210> 106

<211> 108 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 10

<400> 106

15 <210> 107

<211> 357

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> Sintética

<400> 107

<210> 108

<211> 119

<212> PRT 30 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

35 <400> 108

<210> 109 5 <211> 324

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 10 <223> Sintética

<400> 109

15

<210> 110

<211> 108

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

20

<220>

<223> Sintética

<400> 110

25

<210> 111

<211> 357

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 111

<210> 112

<211> 119

<212> PRT 15 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

20 <400> 112

<210> 113 25 <211> 324

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 30 <223> Sintética

<400> 113

<210> 114

<211> 108

<212> PRT 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

10 <400> 114

<210> 115 15 <211> 357

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 20 <223> Sintética

<400> 115

25

<210> 116

<211> 119

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

30

<220>

<223> Sintética

<400> 116

35

5

<210> 117 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia artificial

10

<220> <223> Sintética <400> 117 ggatacaccc tcactgaatt atcc 24

15

<210> 118 <211> 8 <212> PRT <213> Secuencia artificial

20

<220> <223> Sintética

<400> 118

25 30

<210> 119 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Sintética

35

<400> 119 tttgatcctg aacatggtac aaca 24

40

<210> 120 <211> 8 <212> PRT <213> Secuencia artificial

<220> <223> Sintética

45

<400> 120

5

<210> 121 <211> 36 <212> ADN <213> Secuencia artificial

10

<220> <223> Sintética <400> 121 gtaatgattt ttggcgtggt taccaatttt gacaac 36

15

<210> 122 <211> 12 <212> PRT <213> Secuencia artificial

20

<220> <223> Sintética

<400> 122

25

<210> 123

<211> 321

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

30

<220>

<223> Sintética

<400> 123

35

<210> 124

<211> 107 40 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 45

<400> 124

<210> 125

<211> 18 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 10

<400> 125 cagggcatta gaaatgat 18

<210> 126 15 <211> 6

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 20 <223> Sintética

<400> 126

<210> 127

<211> 9

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 30

<220>

<223> Sintética

<400> 127 35 gctgcatcc 9

<210> 128

<211> 3

<212> PRT 40 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

5

<210> 129 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Sintética

10

<400> 129 tcacagtata ataattaccc gtggacg 27

15

<210> 130 <211> 9 <212> PRT <213> Secuencia artificial

<220> <223> Sintética

20

<400> 130

<210> 131 25 <211> 357

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 30 <223> Sintética

<400> 131

35

<210> 132

<211> 119

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

40

<220>

<223> Sintética

<400> 132

45

<210> 133

<211> 321 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 10

<400> 133

15 <210> 134

<211> 107

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> Sintética

<400> 134

<210> 135

<211> 357

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 135

10

<210> 136

<211> 119

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

15

<220>

<223> Sintética

<400> 136

20

<210> 137

<211> 321 25 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 30

<400> 137

<210> 138

<211> 107

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 138

10 <210> 139

<211> 357

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

15 <220>

<223> Sintética

<400> 139

<210> 140

<211> 119

<212> PRT 25 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

30 <400> 140 <210> 141

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 141 ggattcaccc tcactgaatt atcc 24

<210> 142

<211> 8

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 142

<210> 143

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 143 tttgatcctg aagatggtga aaca 24

<210> 144

<211> 8

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 144 <210> 148

5

<210> 145 <211> 36 <212> ADN <213> Secuencia artificial

10

<220> <223> Sintética <400> 145 tcaacgattt ttggagtggt taccaacttt gacaac 36

15

<210> 146 <211> 12 <212> PRT <213> Secuencia artificial

20

<220> <223> Sintética

<400> 146

25

<210> 147

<211> 321

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

30

<220>

<223> Sintética

<400> 147

35

<211> 107 40 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 45

<400> 148

<210> 149

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 149 caggccatta gaaatgat 18

<210> 150

<211> 6

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 150

<210> 151

<211> 9

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 151 gctgcattc 9

<210> 152

<211> 3

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 152 <210> 153

<211> 27 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 10

<400> 153 caacagtata atagataccc gtggacg 27

<210> 154 15 <211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 20 <223> Sintética

<400> 154

25

<210> 155

<211> 357

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

30

<220>

<223> Sintética

<400> 155

35

<210> 156

<211> 119 40 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 45

<400> 156 <210> 157

<211> 321 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 10

<400> 157

15 <210> 158

<211> 107

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> Sintética

<400> 158

<210> 159

<211> 357

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

5

<220>

<223> Sintética

<400> 159

10

<210> 160

<211> 119 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 20

<400> 160 <220>

25

<210> 161 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia artificial

30

<220> <223> Sintética

35 40

<400> 161 ggattcaccc tcaatgaatt atcc <210> 162 <211> 8 <212> PRT <213> Secuencia artificial 24

<223> Sintética

<400> 162

<210> 163

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 163 tttgatcctg aagatggtga agta 24

<210> 164

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 164

<210> 165

<211> 36

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 165 gtaatgattt ttggagtggt taccaacttt gacaat 36

<210> 166

<211> 12

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 166

<210> 167

<211> 321

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 167

5 <210> 168

<211> 107

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

10 <220>

<223> Sintética

<400> 168

<210> 169

<211> 18

<212> ADN 20 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

25 <400> 169 cagggcatta gaaatgat 18

<210> 170

<211> 6 30 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 35

<400> 170

40 <210> 171

<211> 9

<212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Sintética

<400> 171 5 ggtgcattc 9

<210> 172

<211> 3

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

15 <400> 172

<210> 173 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial

25

<220> <223> Sintética

<400> 173 ctacagtata atacttatcc gtggacg

27

<210> 174 <211> 9 <212> PRT <213> Secuencia artificial

35

<220> <223> Sintética

<400> 174

<210> 175

<211> 357

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 175

<210> 176

<211> 119

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 176

10 <210> 177

<211> 321

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

15 <220>

<223> Sintética

<400> 177

<210> 178

<211> 107

<212> PRT 25 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

30 <400> 178 <210> 179

<211> 357 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 10

<400> 179

15 <210> 180

<211> 119

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> Sintética

<400> 180

<210> 181

<211> 321

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 181

10

<210> 182

<211> 107

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

15

<220>

<223> Sintética

<400> 182

20

<210> 183

<211> 357 25 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 30

<400> 183

<210> 184

<211> 119

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 184

10

<210> 185 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia artificial

15

<220> <223> Sintética <400> 185 ggatacaccc tcactgaatt atcc 24

20

<210> 186 <211> 8 <212> PRT <213> Secuencia artificial

25

<220> <223> Sintética

<400> 186

30 35

<210> 187 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Sintética

40

<400> 187 tttgatcctg aacatggtga aaca 24

45

<210> 188 <211> 8 <212> PRT <213> Secuencia artificial

<220> <223> Sintética

<400> 188

5

<210> 189 <211> 36 <212> ADN <213> Secuencia artificial

10

<220> <223> Sintética

15 20

<400> 189 gcaatgattt ttggagtggt taccaacttt gactcc <210> 190 <211> 12 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> Sintética 36

25

<400> 190

<210> 191

<211> 321 30 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 35

<400> 191

40 <210> 192

<211> 107

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

45 <220>

<223> Sintética

<400> 192

<210> 193

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 193 cagggcatta gaaatgat 18

<210> 194

<211> 6

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 194

<210> 195

<211> 9

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 195 gctgcatcc 9

<210> 196

<211> 3

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 196

5

<210> 197 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Sintética

10

<400> 197 ctacagtata atagttaccc gtggacg 27

15

<210> 198 <211> 9 <212> PRT <213> Secuencia artificial

<220> <223> Sintética

20

<400> 198

<210> 199 25 <211> 357

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 30 <223> Sintética

<400> 199 <210> 201

35

<210> 200

<211> 119

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

40

<220>

<223> Sintética

<400> 200

45

<211> 321 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 10

<400> 201

15 <210> 202

<211> 107

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> Sintética

<400> 202

<210> 203

<211> 357

<212> ADN <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 203

10 <210> 204

<211> 119

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

15 <220>

<223> Sintética

<400> 204

<210> 205

<211> 321 25 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 30

<400> 205

<210> 206

<211> 107

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 206

10 <210> 207

<211> 375

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

15 <220>

<223> Sintética

<400> 207

<210> 208

<211> 125

<212> PRT 25 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

30 <400> 208 <210> 209

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 209 ggattcaact ttgatgatta tgcc 24

<210> 210

<211> 8

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 210

<210> 211

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 211 attagttgga atagtggtac tata 24

<210> 212

<211> 8

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 212 <210> 216

5

<210> 213 <211> 54 <212> ADN <213> Secuencia artificial

10

<220> <223> Sintética <400> 213 gcaaaagaag gggtatggtt cggaaaattg ttctcatcct acggtatgga cgtc 54

15

<210> 214 <211> 18 <212> PRT <213> Secuencia artificial

20

<220> <223> Sintética

<400> 214

25

<210> 215

<211> 321

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

30

<220>

<223> Sintética

<400> 215

35

<211> 107 40 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 45

<400> 216

<210> 217

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 217 cagagtgtta cttacaac 18

<210> 218

<211> 6

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 218

<210> 219

<211> 9

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 219 ggtgcatcc 9

<210> 220

<211> 3

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 220

<210> 221

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 5

<220>

<223> Sintética

<400> 221 10 cagcagtata ataactggcc gtacact 27

<210> 222

<211> 9

<212> PRT 15 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

20 <400> 222

<210> 223 25 <211> 375

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 30 <223> Sintética

<400> 223 <210> 225

35

<210> 224

<211> 125

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

40

<220>

<223> Sintética

<400> 224

45

<211> 324 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 10

<400> 225

15 <210> 226

<211> 108

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> Sintética

<400> 226

<210> 227

<211> 375

<212> ADN <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 227

10 <210> 228

<211> 125

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

15 <220>

<223> Sintética

<400> 228

<210> 229

<211> 324

<212> ADN 25 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

30 <400> 229

<210> 230

<211> 108

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 230

10 <210> 231

<211> 375

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

15 <220>

<223> Sintética

<400> 231

<210> 232

<211> 125

<212> PRT 25 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

30 <400> 232 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 10 <223> Sintética

<400> 233

15

<210> 234

<211> 108

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

20

<220>

<223> Sintética

<400> 234

25

<210> 235

<211> 375

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 235

<210> 236

<211> 125

<212> PRT 15 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

20 <400> 236

<210> 237 25 <211> 324

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 30 <223> Sintética

<400> 237 <210> 239

<210> 238

<211> 108

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

5

<220>

<223> Sintética

<400> 238

10

<211> 357 15 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 20

<400> 239

25 <210> 240

<211> 119

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

30 <220>

<223> Sintética

<400> 240

<210> 241

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 241 ggatacaccc tcactgaatt atcc 24

<210> 242

<211> 8

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 242

<210> 243

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 243 tttgatcctg aagatggtga aaca 24

<210> 244

<211> 8

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 244

5

<210> 245 <211> 36 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Sintética

10

<400> 245 gtaatgattt ttggcgtggt taccaacttt gacaac 36

15

<210> 246 <211> 12 <212> PRT <213> Secuencia artificial

<220> <223> Sintética

20

<400> 246

<210> 247 25 <211> 321

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 30 <223> Sintética

<400> 247

35

<210> 248

<211> 107

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

40

<220>

<223> Sintética

<400> 248

45

<210> 249

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 249 cagggcatta gaaatgat 18

<210> 250

<211> 6

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 250

<210> 251

<211> 9

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 251 gctgcatcc 9

<210> 252

<211> 3

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 252

<210>

253

<210>

255

<211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial

5

<220> <223> Sintética

10 15

<400> 253 tcacagtata atagttaccc gtggacg <210> 254 <211> 9 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> Sintética 27

20

<400> 254

<211> 357 25 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 30

<400> 255

35 <210> 256

<211> 119

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

40 <220>

<223> Sintética

<400> 256

<210> 257

<211> 321 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 10

<400> 257

15 <210> 258

<211> 107

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> Sintética

<400> 258

<210> 259

<211> 357

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 259

10

<210> 260

<211> 119

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

15

<220>

<223> Sintética

<400> 260

20

<210> 261

<211> 321 25 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 30

<400> 261

<210> 262

<211> 107

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 262

<210> 263

<211> 357 10 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 15

<400> 263

20 <210> 264

<211> 119

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

25 <220>

<223> Sintética

<400> 264

<210> 265

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 265 ggattcaccc tcactgaatt atcc 24

<210> 266

<211> 8

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 266

<210> 267

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 267 tttgatcctg aagatggtga aaca 24

<210> 268

<211> 8

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 268 <210> 272

5

<210> 269 <211> 36 <212> ADN <213> Secuencia artificial

10

<220> <223> Sintética <400> 269 tcaacgattt ttggagtggt taccaacttt gacaac 36

15

<210> 270 <211> 12 <212> PRT <213> Secuencia artificial

20

<220> <223> Sintética

<400> 270

25

<210> 271

<211> 321

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

30

<220>

<223> Sintética

<400> 271

35

<211> 107 40 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 45

<400> 272

<210> 273

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 273 caggccatta gaaatgat 18

<210> 274

<211> 6

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 274

<210> 275

<211> 9

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 275 gctgcattc 9

<210> 276

<211> 3

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 276 <210> 280

5

<210> 277 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial

10

<220> <223> Sintética <400> 277 ctacagtata atagttaccc gtggacg 27

15

<210> 278 <211> 9 <212> PRT <213> Secuencia artificial

20

<220> <223> Sintética

<400> 278

25

<210> 279

<211> 357

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

30

<220>

<223> Sintética

<400> 279

35

<211> 119 40 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 45

<400> 280 <210> 281

<211> 321 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 10

<400> 281

15 <210> 282

<211> 107

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> Sintética

<400> 282

<210> 283

<211> 357

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 283

<210> 284

<211> 119

<212> PRT 15 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

20 <400> 284

<210> 285 25 <211> 321

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

30 <223> Sintética

<400> 285

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

20 <223> Sintética

<210> 286

<211> 107

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

5

<220>

<223> Sintética

<400> 286

10

<400> 287

25

<210> 288

<211> 125

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

30

<220>

<223> Sintética

<400> 288

35

<210> 289

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 289 ggattcactt ttgatgatta ttcc 24

<210> 290

<211> 8

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 290

<210> 291

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 291 attagttgga atagtggaac tata 24

<210> 292

<211> 8

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 292 <210> 296

5

<210> 293 <211> 54 <212> ADN <213> Secuencia artificial

10

<220> <223> Sintética <400> 293 gcaaaagaag gggtatggtt cgggagatta ttttcatcct acggtatgga cgtc 54

15

<210> 294 <211> 16 <212> PRT <213> Secuencia artificial

20

<220> <223> Sintética

<400> 294

25

<210> 295

<211> 321

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

30

<220>

<223> Sintética

<400> 295

35

<211> 107 40 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 45

<400> 296

<210> 297

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 297 ccgagtgtta gcagcaac 18

<210> 298

<211> 6

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 298

<210> 299

<211> 9

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 299 ggtgcatcc 9

<210> 300

<211> 3

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 300

<210>

301

<210>

303

<211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial

5

<220> <223> Sintética

10 15

<400> 301 caacagtata gtaactggcc gtacact 27 <210> 302 <211> 9 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> Sintética

20

<400> 302

<211> 375 25 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 30

<400> 303

35 <210> 304

<211> 125

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

40 <220>

<223> Sintética

<400> 304

<210> 305

<211> 321 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 10

<400> 305

15 <210> 306

<211> 107

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> Sintética

<400> 306

<210> 307

<211> 375

<212> ADN <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 307

10 <210> 308

<211> 125

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

15 <220>

<223> Sintética

<400> 308

<210> 309

<211> 321

<212> ADN 25 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

30 <400> 309

<210> 310

<211> 107

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 310

10 <210> 311

<211> 375

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

15 <220>

<223> Sintética

<400> 311

<210> 312

<211> 125

<212> PRT 25 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

30 <400> 312 <210> 313

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 313 agattcacct ttgaagatta tgcc 24

<210> 314

<211> 8

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 314

<210> 315

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 315 attagttgga atagtggtag tata 24

<210> 316

<211> 8

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 316

5

<210> 317 <211> 54 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Sintética

10

<400> 317 gtaaaagaag gggtatggtt cgggaagtta ttctcatcct acggtctgga cgtc 54

15

<210> 318 <211> 16 <212> PRT <213> Secuencia artificial

<220> <223> Sintética

20

<400> 318

<210> 319 25 <211> 321

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 30 <223> Sintética

<400> 319

35

<210> 320

<211> 107

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

40

<220>

<223> Sintética

<400> 320

45

<210> 321

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 321 cagagtgtta gcagcaac 18

<210> 322

<211> 6

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 322

<210> 323

<211> 9

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 323 ggttcatcc 9

<210> 324

<211> 3

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 324 <210> 325

<211> 27 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 10

<400> 325 cagcagtata ataactggcc gtacact 27

<210> 326 15 <211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 20 <223> Sintética

<400> 326

25

<210> 327

<211> 375

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

30

<220>

<223> Sintética

<400> 327

35

<210> 328

<211> 125 40 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 45

<400> 328 <210> 329

<211> 321 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 10

<400> 329

15 <210> 330

<211> 107

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> Sintética

<400> 330

<210> 331

<211> 375

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 331

<210> 332

<211> 125

<212> PRT 15 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

20 <400> 332

<210> 333 25 <211> 321

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 30 <223> Sintética

<400> 333 <210> 334

<211> 107 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 10

<400> 334

15

<210> 335

<211> 375

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

20

<220>

<223> Sintética

<400> 335

25

<210> 336

<211> 125 30 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 35

<400> 336

<210> 337

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 337 ggattcaact ttgatgatta tgcc 24

<210> 338

<211> 8

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 338

<210> 339

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 339 attagttgga atagtggtag tata 24

<210> 340

<211> 8

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 340

5

<210> 341 <211> 54 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Sintética

10

<400> 341 gcaaaagaag gggtatggtt cggaaaatta ttctcatcct acggtatgga cgtc 54

15

<210> 342 <211> 18 <212> PRT <213> Secuencia artificial

<220> <223> Sintética

20

<400> 342

<210> 343 25 <211> 321

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 30 <223> Sintética

<400> 343

35

<210> 344

<211> 107

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

40

<220>

<223> Sintética

<400> 344

<210> 345

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 345 cagagtgtta gcagcaac 18

<210> 346

<211> 7

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 346

<210> 347

<211> 9

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 347 ggtgcatcc 9

<210> 348

<211> 3

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 348

<210>

349

<210>

351

<211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial

5

<220> <223> Sintética

10 15

<400> 349 cagcagtata ataactggcc gtacact 27 <210> 350 <211> 9 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> Sintética

20

<400> 350

<211> 375 25 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 30

<400> 351

35 <210> 352

<211> 125

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

40 <220>

<223> Sintética

<400> 352

<210> 353

<211> 321 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 10

<400> 353

15 <210> 354

<211> 107

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> Sintética

<400> 354

<210> 355

<211> 375

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 355

10

<210> 356

<211> 125

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

15

<220>

<223> Sintética

<400> 356

20

<210> 357 25 <211> 320

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 30 <223> Sintética

<400> 357

<210> 358

<211> 107

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 358

<210> 359

<211> 375

<212> ADN 15 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

20 <400> 359

<210> 360 25 <211> 125

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 30 <223> Sintética

<400> 360

<210> 361

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 361 ggattcacct ttgatgatta tgcc 24

<210> 362

<211> 8

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 362

<210> 363

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 363 attagttgga atagtggtag tata 24

<210> 364

<211> 8

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 364 <210> 368

5

<210> 365 <211> 54 <212> ADN <213> Secuencia artificial

10

<220> <223> Sintética <400> 365 gcaaaagaag gggtatggtt cggggagtta ttttcatcct acggtatgga cgtc 54

15

<210> 366 <211> 18 <212> PRT <213> Secuencia artificial

20

<220> <223> Sintética

<400> 366

25

<210> 367

<211> 321

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

30

<220>

<223> Sintética

<400> 367

35

<211> 107 40 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>

Sintética 45

<400> 368

<210> 369

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 369 ccgagtgtta gcagcaac 18

<210> 370

<211> 6

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 370

<210> 371

<211> 9

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 371 ggtgcatcc 9

<210> 372

<211> 3

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 372

<210> 373

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>

Sintética 5

<400> 373 cagcagtata gtaactggcc gtacact 27

<210> 374 10 <211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 15 <223> Sintética

<400> 374

20

<210> 375

<211> 375

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

25

<220>

<223> Sintética

<400> 375

30

<210> 376

<211> 125 35 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 40

<400> 376 <210> 377

<211> 321 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 10

<400> 377

15 <210> 378

<211> 107

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> Sintética

<400> 378

<210> 379

<211> 375

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 379

10

<210> 380

<211> 125

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

15

<220>

<223> Sintética

<400> 380

20

<210> 381

<211> 321 25 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 30

<400> 381

<210> 382

<211> 107

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 382

10

<210> 383

<211> 375

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

15

<220>

<223> Sintética

<400> 383

20

<210> 384

<211> 125 25 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 30

<400> 384

<210> 385

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 385 ggattcacct ttgatgatta tgcc 24

<210> 386

<211> 8

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 386

<210> 387

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 387 attagttgga atagtggtag tata 24

<210> 388

<211> 8

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 388 <210> 392

5

<210> 389 <211> 54 <212> ADN <213> Secuencia artificial

10

<220> <223> Sintética <400> 389 gcaaaagaag gggtatggtt cggggagtta ttttcatcct acggtatgga cgtc 54

15

<210> 390 <211> 18 <212> PRT <213> Secuencia artificial

20

<220> <223> Sintética

<400> 390

25

<210> 391

<211> 321

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

30

<220>

<223> Sintética

<400> 391

35

<211> 107 40 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 45

<400> 392

<210> 393

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 393 ccgagtgtta gcagcaac 18

<210> 394

<211> 6

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 394

<210> 395

<211> 9

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 395 ggtgcatcc 9

<210> 396

<211> 3

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 396

<210> 397

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 5

<220>

<223> Sintética

<400> 397 10 cagcagtata gtaactggcc gtacact 27

<210> 398

<211> 9

<212> PRT 15 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

20 <400> 398

<210> 399 25 <211> 375

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 30 <223> Sintética

<400> 399 <210> 401

35

<210> 400

<211> 125

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

40

<220>

<223> Sintética

<400> 400

45

<211> 321 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 10

<400> 401

15 <210> 402

<211> 107

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> Sintética

<400> 402

<210> 403

<211> 357

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 403

10

<210> 404

<211> 119

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

15

<220>

<223> Sintética

<400> 404

20

25

<210> 405 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia artificial

30

<220> <223> Sintética

<400> 405 ggattcactc tcactgaatt atcc

24

35

<210> 406 <211> 8 <212> PRT <213> Secuencia artificial

40

<220> <223> Sintética

<400> 406

5

<210> 407 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Sintética

<400> 407 tttgatcctg aagatggtga aaca

24

15

<210> 408 <211> 8 <212> PRT <213> Secuencia artificial

<220> <223> Sintética

<400> 408

25

<210> 409 <211> 36 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Sintética

35

<400> 409 tcaacgattt ttggagtggt taccaacttt gacaac 36

<210> 410 <211> 12 <212> PRT <213> Secuencia artificial

<220> <223> Sintética

45

<400> 410

<210> 411

<211> 321

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 411

<210> 412

<211> 107 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 10

<400> 412

15

<210> 413 <211> 18 <212> ADN <213> Secuencia artificial

20

<220> <223> Sintética

25 30

<400> 413 caggccatta gaaatgat 18 <210> 414 <211> 6 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> Sintética

35

<400< 414

<210> 415

<211> 9

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 415 5 gctgcattc 9

<210> 416

<211> 3

<212> PRT 10 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

15 <400> 416

<210> 417 20 <211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 25 <223> Sintética

<400> 417 caacagtata atagataccc gtggacg 27

30 <210> 418

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

35 <220>

<223> Sintética

<400> 418

<210> 419

<211> 357

<212> ADN 45 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

50 <400> 419

<210> 420

<211> 119

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 420

<210> 421

<211> 321 10 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 15

<400> 421

20 <210> 422

<211> 107

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

25 <220>

<223> Sintética

<400> 422

<210> 423

<211> 375 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 10

<400> 423

15 <210> 424

<211> 125

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> Sintética

<400> 424

<210> 425

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 425 ggattcaact ttgatgatta tgcc 24

<210> 426

<211> 8

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 426

<210> 427

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 427 attagttgga atagtggtac tata 24

<210> 428

<211> 8

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 428

<210> 429

<211> 54

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 429 gcaaaagaag gggtatggtt cggaaaattg ttctcatcct acggtatgga cgtc 54

<210> 430

<211> 18

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 430 <210> 431

<211> 321 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 10

<400> 431

15 <210> 432

<211> 107

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> Sintética

<400> 432

30

<210> 433 <211> 18 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Sintética

35

<400> 433 cggactgtta cttacaac 18

40

<210> 434 <211> 6 <212> PRT <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 434

<210> 435

<211> 9

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 435 ggtgcatcc 9

<210> 436

<211> 3

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 436

<210> 437

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 437 caacagtata ataactggcc gtacact 27

<210> 438

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 438

<210> 439

<211> 375

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 439

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 10 <223> Sintética

<400> 440

15 20

<210> 441 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Sintética

25

<400> 441 ggattcaact ttgatgatta tgcc 24

30

<210> 442 <211> 8 <212> PRT <213> Secuencia artificial

<220> <223> Sintética

35

<400> 442

<210> 443

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 443 attagttgga atagtggtag tatt 24

<210> 444

<211> 8

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 444

<210> 445

<211> 54

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 445 gcaaaagaag gggtatggtt cggaaaatta ttttcatcct acggtatgga cgtc 54

<210> 446

<211> 18

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 446

<210> 447

<211> 321

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 447

<210> 448

<211> 107

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

5

<220>

<223> Sintética

<400> 448

10

15

<210> 449 <211> 18 <212> ADN <213> Secuencia artificial

20

<220> <223> Sintética <400> 449 cagagtgtta ccttcaac 18

25

<210> 450 <211> 6 <212> PRT <213> Secuencia artificial

30

<220> <223> Sintética

<400> 450

35 40

<210> 451 <211> 9 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Sintética

45

<400> 451 ggtgcatcc 9

<210> 452

<211> 3

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 452

<210> 453

<211> 27 15 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 453 cagcagtata ataactggcc gtacact 27

<210> 454 25 <211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 454

35

<210> 455 <211> 375 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Sintética

45

<400> 455

<210> 456

<211> 125

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 456

<210> 457

<211> 321 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 10

<400> 457

15 <210> 458

<211> 107

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> Sintética

<400> 458

<210> 459

<211> 375

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 459

<210> 460

<211> 125

<212> PRT 15 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

20 <400> 460

<210> 461 25 <211> 321

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 30 <223> Sintética

<400> 461

<210> 462

<211> 107

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 462

<210> 463

<211> 375

<212> ADN 15 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

20 <400> 463

<210> 464 25 <211> 125

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 30 <223> Sintética

<400> 464

<210> 465

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 465 ggattcacct ttgatgatta tgcc 24

<210> 466

<211> 8

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 466

<210> 467

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 467 attagttgga atagtggtta taaa 24

<210> 468

<211> 8

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 468 <210> 472

5

<210> 469 <211> 54 <212> ADN <213> Secuencia artificial

10

<220> <223> Sintética <400> 469 gcaaaagaag gggtatggtt cggagaatta ttttcatcct acggtatgga cgtc 54

15

<210> 470 <211> 18 <212> PRT <213> Secuencia artificial

20

<220> <223> Sintética

<400> 470

25

<210> 471

<211> 321

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

30

<220>

<223> Sintética

<400> 471

35

<211> 107 40 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 45

<400> 472

<210> 473

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 473 ccgagtgtta gcagcaac 18

<210> 474

<211> 6

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 474

<210> 475

<211> 9

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 475 ggtacatcc 9

<210> 476

<211> 3

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 476

<210> 477

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 5

<220>

<223> Sintética

<400> 477 10 cagcagtata gtaactggcc atacact 27

<210> 478

<211> 9

<212> PRT 15 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

20 <400> 478

<210> 479 25 <211> 375

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 30 <223> Sintética

<400> 479 <210> 481

35

<210> 480

<211> 125

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

40

<220>

<223> Sintética

<400> 480

45

<211> 321 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 10

<400> 481

15 <210> 482

<211> 107

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> Sintética

<400> 482

<210> 483

<211> 375

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 483

<210> 484

<211> 125

<212> PRT 15 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

20 <400> 484

<210> 485 25 <211> 321

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 30 <223> Sintética

<400> 485 <210> 487

<210> 486

<211> 107

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

5

<220>

<223> Sintética

<400> 486

10

<211> 375 15 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 20

<400> 487

25 <210> 488

<211> 125

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

30 <220>

<223> Sintética

<400> 488

<210> 489

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 489 aaattcacct ttgaagatta tgcc 24

<210> 490

<211> 8

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 490

<210> 491

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 491 attagttgga atagtggtaa cata 24

<210> 492

<211> 8

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 492 <210> 496

5

<210> 493 <211> 54 <212> ADN <213> Secuencia artificial

10

<220> <223> Sintética <400> 493 gtgaaggaag gggtatggtt cgggaagtca ttttcatcct acggtttgga cgtc 54

15

<210> 494 <211> 18 <212> PRT <213> Secuencia artificial

20

<220> <223> Sintética

<400> 494

25

<210> 495

<211> 321

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

30

<220>

<223> Sintética

<400> 495

35

<211> 107 40 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 45

<400> 496

<210> 497

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 497 cagagtgtta gcagcaac 18

<210> 498

<211> 6

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 498

<210> 499

<211> 9

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 499 ggtgcatcc 9

<210> 500

<211> 3

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> <210> 504

5

<210> 501 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial

10

<220> <223> Sintética <400> 501 caacattata attactggcc gtacact 27

15

<210> 502 <211> 9 <212> PRT <213> Secuencia artificial

20

<220> <223> Sintética

<400> 502

25

<210> 503

<211> 375

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

30

<220>

<223> Sintética

<400> 503

35

<211> 125 40 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 45

<400> 504 <210> 505

<211> 321 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 10

<400> 505

15 <210> 506

<211> 107

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> Sintética

<400> 506

<210> 507

<211> 375

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 507

<210> 508

<211> 125

<212> PRT 15 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

20 <400> 508

<210> 509 25 <211> 321

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 30 <223> Sintética

<400> 509 <210> 510

<211> 107 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 10

<400> 510

15

<210> 511

<211> 357

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

20

<220>

<223> Sintética

<400> 511

25

<210> 512

<211> 119 30 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 35

<400> 512

<210> 513

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 513 ggatacaccc tcactgaatt atcc 24

<210> 514

<211> 8

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 514

<210> 515

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 515 tttgatcctg aacatggtac aaca 24

<210> 516

<211> 8

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 516 <210> 520

5

<210> 517 <211> 36 <212> ADN <213> Secuencia artificial

10

<220> <223> Sintética <400> 517 gtaatgattt ttggcgtggt taccaatttt gacaac 36

15

<210> 518 <211> 12 <212> PRT <213> Secuencia artificial

20

<220> <223> Sintética

<400> 518

25

<210> 519

<211> 321

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

30

<220>

<223> Sintética

<400> 519

35

<211> 107 40 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 45

<400> 520

<210> 521

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 521 cagggcatta gaaatgag 18

<210> 522

<211> 6

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 522

<210> 523

<211> 9

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 523 gctgcatcc 9

<210> 524

<211> 3

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<210> 525

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 5

<220>

<223> Sintética

<400> 525 10 tcacaggata acaatttccc gtggacg 27

<210> 526

<211> 9

<212> PRT 15 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

20 <400> 526

<210> 527 25 <211> 357

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 30 <223> Sintética

<400> 527 <210> 529

35

<210> 528

<211> 119

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

40

<220>

<223> Sintética

<400> 528

45

<211> 321 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 10

<400> 529

15 <210> 530

<211> 107

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> Sintética

<400> 530

<210> 531

<211> 357

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 531

10

<210> 532

<211> 119

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

15

<220>

<223> Sintética

<400> 532

20

<210> 533

<211> 321 25 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 30

<400> 533

<210> 534

<211> 107

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 534

10 <210> 535

<211> 8

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

15 <220>

<223> Sintética

<220>

<221> VARIANTE 20 <222> (1) ... (8)

<223> Xaa = Cualquier aminoácido

<400> 535

<210> 536

<211> 8

<212> PRT 30 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

35 <220>

<221> VARIANTE

<222> (1)...(8)

<223> Xaa = Cualquier aminoácido

40 <400> 536

<210> 537 45 <211> 18

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<220>

<221> VARIANTE

<222> (1)...(18)

<223> Xaa = Cualquier aminoácido

<400> 537

<210> 538

<211> 6

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<220>

<221> VARIANTE

<222> (1) ... (6)

<223> Xaa = Cualquier aminoácido

<400> 538

<210> 539

<211> 3

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<220>

<221> VARIANTE

<222> (1)...(3)

<223> Xaa = Cualquier aminoácido

<400> 539

<210> 540

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<220>

<221> VARIANTE

<222> (1) ... (9)

<223> Xaa = Cualquier aminoácido

<400> 540

<210> 541

<211> 330 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética 10

<400> 541

<210> 542

<211> 327

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 542

<210> 543 10 <211> 327

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 15 <223> Sintética

<400> 543

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un anticuerpo humano o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo que se une específicamente con el factor de crecimiento nervioso humano (NGF) con una KD de 1 pM o menos, medida por resonancia de plasmón superficial, donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende

   (a)

   una región determinante de complementariedad de cadena pesada 3 (HCDR3) y una CDR3 de cadena ligera (LCDR3), donde la HCDR3 y LCDR3 comprenden las secuencias de aminoácidos expuestas en SEC ID Nº: 90 y 98, respectivamente, y

   (b)

   una HCDR1, HCDR2, LCDR1 y LCDR2, donde la HCDR1 es SEC ID Nº: 86, HCDR2 es SEC ID Nº: 88, LCDR1 es SEC ID Nº: 94 y LCDR2 es SEC ID Nº: 96.

2. 2.

   Un anticuerpo humano o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 1, que se une específicamente con NGF humano con una KD de 0,5 pM o menos.

3. 3.

   Un anticuerpo humano o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 1 o 2, donde dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región variable de cadena pesada (HCVR) y una región variable de cadena ligera (LCVR), donde la HCVR y LCVR comprenden secuencias de aminoácidos expuestas en SEC ID Nº: 108 y 110 respectivamente.

4. 4.

   Un anticuerpo humano o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 1, 2 o 3, que se une con NGF humano con una KD de aproximadamente 2 a aproximadamente 10 veces mayor que con la que el anticuerpo o fragmento se une con NGF de rata y ratón.

5. 5.

   Una molécula de ácido nucleico que codifica el anticuerpo humano o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

6. 6.

   Un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 5.

7. 7.

   Un método para producir un anticuerpo anti-NGF humano o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo que comprende las etapas de introducir el vector de expresión de la reivindicación 6 en una célula hospedadora aislada, cultivar la célula en condiciones que permitan la producción del anticuerpo o fragmento de anticuerpo, y recuperar el anticuerpo o fragmento de anticuerpo producido de este modo, preferentemente donde la célula hospedadora es una célula de E. coli, una célula CHO o una célula COS.

8. 8.

   Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

9. 9.

   Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 8 que comprende además un agente terapéutico adicional seleccionado de un inhibidor de interleucina-1 (IL-1), un fármaco antiepiléptico, un antagonista de citocina, y una neurotrofina.

10. 10.

    Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para uso en un método para atenuar o inhibir una enfermedad o afección mediada por NGF en un ser humano seleccionada del dolor inflamatorio, dolor por incisión postoperatorio, dolor neuropático, dolor por fractura, dolor de articulación gotosa, neuralgia post-herpética, dolor resultante de quemaduras, dolor por cáncer, dolor por osteoartritis o artritis reumatoide, ciática, dolor asociado con crisis de anemia falciforme o neuralgia postherpética.

11. 11.

    Uso de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en la preparación de un medicamento para uso en un método para atenuar o inhibir una enfermedad o afección mediada por NGF en un ser humano seleccionada de dolor inflamatorio, dolor por incisión postoperatorio, dolor neuropático, dolor por fractura, dolor de articulación gotosa, neuralgia post-herpética, dolor resultante de quemaduras, dolor por cáncer, dolor por osteoartritis o artritis reumatoide, ciática, dolor asociado con crisis de anemia falciforme o neuralgia post-herpética.

12. 12.

    Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para el uso de acuerdo con la reivindicación 10, donde dicho método comprende administrar un primer y un segundo agente terapéutico a un sujeto humano que lo necesite, donde el primer agente terapéutico es dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, y preferentemente donde el segundo agente terapéutico es un inhibidor de interleucina-1 (IL-1), un fármaco antiepiléptico, un antagonista de citocina o una neurotrofina.

13. 13.

    Uso de acuerdo con la reivindicación 11 de dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde dicho método comprende administrar un primer y un segundo agente terapéutico a un sujeto humano que lo necesite, en el que primer agente terapéutico es dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, y preferentemente donde el segundo agente terapéutico es un inhibidor de interleucina-1 (IL-1),

    un fármaco antiepiléptico, un antagonista de citocina o una neurotrofina.

14. 14.

    Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para el uso de acuerdo con la reivindicación 10 o 12, donde la afección o enfermedad mediada por NGF se inhibe sin deterioro significativo de la coordinación motora.

15. 15.

    Uso de acuerdo con la reivindicación 11 o 13 de dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde la afección o enfermedad mediada por NGF se inhibe sin deterioro significativo de la coordinación motora.