JP2023543005A - 疼痛を処置するための化合物及び方法 - Google Patents

疼痛を処置するための化合物及び方法 Download PDF

Info

Publication number
JP2023543005A
JP2023543005A JP2023519051A JP2023519051A JP2023543005A JP 2023543005 A JP2023543005 A JP 2023543005A JP 2023519051 A JP2023519051 A JP 2023519051A JP 2023519051 A JP2023519051 A JP 2023519051A JP 2023543005 A JP2023543005 A JP 2023543005A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
amino acid
seq
pain
subject
acid sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2023519051A
Other languages
English (en)
Inventor
ウェルシュ，フレイザー
チェッセル，タラニ
タン，キース
オステンフェルド，ソー
ジェンキンス，リチャード
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
MedImmune Ltd
Original Assignee
MedImmune Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by MedImmune Ltd filed Critical MedImmune Ltd
Publication of JP2023543005A publication Critical patent/JP2023543005A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/241—Tumor Necrosis Factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific

Abstract

本開示は、疼痛の処置又は予防での使用のための新規の方法及び投与量レジメンであって、結合分子は、ＮＧＦアンタゴニストドメインと、ＴＮＦαアンタゴニストドメインとを含み、ＮＧＦアンタゴニストドメインは、抗ＮＧＦ抗体又はその抗原結合断片であり、ＴＮＦαアンタゴニストドメインは、ＴＮＦＲの可溶性ＴＮＦα結合断片を含む、新規の方法及び投与量レジメンを提供する。

Description

疼痛は、医学的支援が求められる最も一般的な症状の１つであり、医師を訪れる全ての患者の半数の主訴である。多くの鎮痛剤の存在及び幅広い使用にもかかわらず、疼痛（特に慢性疼痛）の排除は、成功していない。そのため、社会への負担は、大きいままである。様々な研究から、疼痛により、毎年５０００万日の就業日が失われており、且つ６１２億ドルの生産性が失われていると推定されている。慢性疼痛患者では、利用可能な処方処置の選択肢で疼痛を管理可能であるのは、約半数にすぎない。また、鎮痛剤の総市場は、１年当たり約２５０億ドルである。
疼痛は、変形性関節症の主な症状であり、変形性関節症は、高齢者における能力障害の主因であり、且つ社会的コストの原因である。人口の高齢化及び肥満の増加により、この症候群は、過去数十年よりも更に蔓延している（非特許文献１）。変形性関節症での疼痛に対する現在の処置として、低用量の経口ＮＳＡＩＤが挙げられる。しかしながら、心血管事象に起因する死亡率の増加との関連に起因して、ＮＳＡＩＤの使用は、好ましくは、短期間の使用に限定される（非特許文献２）。これらのデータから示唆されるように、安全で有効な新規の鎮痛薬が依然として大いに必要とされている。
分泌される神経成長因子（ＮＧＦ又はベータ－ＮＧＦ）の組織レベルを低下させるか又は効果を阻害する治療薬は、まさにこのような新規な鎮痛薬である可能性がある。ＮＧＦは、神経系の発達において公知の中心的役割を果たすが、ＮＧＦは、動物及びヒトで疼痛を引き起こすことから、疼痛に対する十分に検証された標的でもある。成人では、ＮＧＦは、特に中枢及び末梢の神経細胞のサブセットの健康及び生存を促進する（非特許文献３）。ＮＧＦは、これらの神経細胞の機能的特徴の調節にも寄与し、侵害受容器と呼ばれる感覚疼痛受容器の感受性又は興奮性の緊張性制御を行う（非特許文献４、非特許文献５）。侵害受容器は、疼痛の知覚（侵害受容）を生じる様々な侵害刺激を感知して中枢神経系に伝達する。ＮＧＦ受容体は、侵害受容器上に位置する。ＮＧＦの発現は、傷害を受けて炎症を起こした組織で増大し、ヒトの疼痛状態では上方制御される。そのため、侵害受容でのＮＧＦの役割から、ＮＧＦのレベルを低下させるＮＧＦ結合剤には、鎮痛剤療法としての有用性がある。
腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）は、カケクチンとも呼ばれ、細胞毒性、免疫細胞増殖、炎症、腫瘍発生及びウイルス複製等の広範囲の生物学的活性を有する多面的なサイトカインである。非特許文献６。ＴＮＦαは、膜貫通型タンパク質（ｔｍＴＮＦα）として最初に産生され、次いでメタロプロテイナーゼにより可溶型（ｓＴＮＦα）に開裂される。非特許文献７。ＴＮＦα（約１７ｋＤａ）は、強固なホモ三量体分子として存在し、細胞表面ＴＮＦ受容体１又はＴＮＦ受容体２に結合し、受容体のオリゴマー形成及びシグナル伝達を誘発する。炎症性サイトカイン（特にＴＮＦα）は、痛覚過敏の発生において役割を果たすことが知られている。非特許文献８。いくつかの予備データから、ＴＮＦα阻害剤は、神経障害性疼痛の制御で有用であり得ることが示されている。例えば、非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献１１を参照されたい。神経障害性疼痛の処置における単一療法としてＴＮＦα阻害剤を試験している臨床試験の結果は、依然として結論が出ていない。非特許文献１２を参照されたい。
抗ＮＧＦ抗原結合断片と可溶性ＴＮＦＲ－２部分とを含む、既に開示されている結合分子は、ＮＧＦ及びＴＮＦαの両方の強力な阻害剤であることが分かっている。更に、この結合分子は、疼痛の動物モデルにおける疼痛の徴候の軽減での治療効果が分かっている。例えば、特許文献１（その全体が参照により組み込まれる）を参照されたい。これらの結合分子の明確な治療上での有効性を考慮して、疼痛（例えば、変形性関節症疼痛）の処置（例えば、軽減又は予防）を、それを必要とする対象において行うための結合分子の改善された投与量レジメンが必要とされている。
米国特許第９，８８４，９１１号明細書
Ｈｕｎｔｅｒ＆Ｂｉｅｒｍａ－Ｚｅｉｎｓｔｒａ Ｌａｎｃｅｔ，３９３：１７４５－５９（２０１９） Ｋｏｌａｓｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｃａｒｅ＆Ｒｅｓｅａｒｃｈ，７２（２）１４９－１６２（２０２０） Ｈｕａｎｇ＆Ｒｅｉｃｈａｒｄｔ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２４：６７７－７３６（２００１） Ｐｒｉｅｓｔｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．８０：４９５－５０５（２００２） Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｔｉｓｔ ７：１３－１７（２００１） Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３７４，１３７４（２００７） Ｗａｌｌｉｓ，Ｌａｎｃｅｔ Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．８（１０）：６０１（２００８） Ｌｅｕｎｇ，Ｌ．，ａｎｄ Ｃａｈｉｌｌ，ＣＭ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ７：２７（２０１０） Ｓｏｍｍｅｒ Ｃ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｅｒｉｐｈｅｒ．Ｎｅｒｖ．Ｓｙｓｔ．６：６７－７２（２００１） Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ，Ａ＆Ａ Ｆｅｂ ２０１３，１１６，２，４５５－４６２ Ｇｅｎｅｖａｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ Ｒｈｅｕｍ Ｄｉｓ ２００４，６３，１１２０－１１２３ Ｌｅｕｎｇ ａｎｄ Ｃａｈｉｌｌ（２０１０）
本開示は、疼痛の処置（例えば、対象の疼痛の軽減又は予防）のための新規の方法及び投与レジメンであって、結合分子の皮下固定用量を対象に投与することを含み、結合分子は、ＮＧＦアンタゴニスト部分と、ＴＮＦαアンタゴニスト部分とを含む、新規の方法及び投与レジメンを提供する。一部の実施形態では、この投与は、単独で投与された等量のＮＧＦアンタゴニスト又はＴＮＦαアンタゴニストと比べて有効に対象の疼痛を制御する。
一部の実施形態では、本開示は、疼痛の軽減又は予防を、それを必要とする対象において行う方法であって、結合分子の皮下固定用量を対象に投与することを含み、この結合分子は、ＮＧＦアンタゴニストドメインと、ＴＮＦαアンタゴニストドメインとを含み、ＮＧＦアンタゴニストドメインは、抗ＮＧＦ抗体又はその抗原結合断片であり、ＴＮＦαアンタゴニストドメインは、ＴＮＦＲの可溶性ＴＮＦα結合断片を含み、この方法は、対象の疼痛を軽減又は予防する、方法を提供する。一部の実施形態では、結合分子の皮下固定用量は、５～２００ｍｇである。一部の実施形態では、結合分子の皮下固定用量は、７．５～１５０ｍｇである。一部の実施形態では、結合分子の皮下固定用量は、７．５、２５、７５又は１５０ｍｇである。一部の実施形態では、皮下固定用量は、結合分子の３０ｍｇの静脈内固定用量と同等である。一部の実施形態では、固定用量は、少なくとも２週間毎に投与される。一部の実施形態では、固定用量は、少なくとも１２週間にわたって投与される。一部の実施形態では、疼痛は、慢性疼痛を含む。一部の実施形態では、疼痛は、変形性関節症疼痛を含む。一部の実施形態では、疼痛は、膝の変形性関節症疼痛を含む。
一部の実施形態では、対象は、結合分子の投与前に３ヶ月以上にわたって疼痛を患っている。一部の実施形態では、疼痛は、関節炎を伴う。一部の実施形態では、対象は、変形性関節症を有する。一部の実施形態では、対象は、膝の片側性変形性関節症（ｕｎｉｌａｔｅｒａｌ ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ）を有する。一部の実施形態では、対象は、中央リーダー評価（ｃｅｎｔｒａｌ ｒｅａｄｅｒ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ）による０～４のケルグレン・ローレンス（ＫＬ）評価スケールで膝関節のグレード２の変形性関節症を有する。
一部の実施形態では、本方法は、対象への結合分子の投与前に、ａ．ＮＳＡＩＤ、強オピオイド、弱オピオイド、ＣＯＸ－２阻害剤、アセトアミノフェン又はこれらの組合せを対象に投与することと、ｂ．ｉ）ＮＳＡＩＤ、強オピオイド、弱オピオイド、ＣＯＸ－２阻害剤、アセトアミノフェン若しくはこれらの組合せが対象の疼痛を軽減若しくは予防しないことを決定し、且つ／又はｉｉ）対象がＮＳＡＩＤ、強オピオイド、弱オピオイド、ＣＯＸ－２阻害剤、アセトアミノフェン若しくはこれらの組合せに対して不耐性であることを決定することとを含む。一部の実施形態では、ＮＳＡＩＤ、強オピオイド、弱オピオイド、ＣＯＸ－２阻害剤、アセトアミノフェン又はこれらの組合せは、少なくとも２週間にわたって投与される。一部の実施形態では、ＮＳＡＩＤ、強オピオイド、弱オピオイド、ＣＯＸ－２阻害剤、アセトアミノフェン又はこれらの組合せは、結合分子の投与前に少なくとも２週間にわたって対象に投与されている。一部の実施形態では、対象は、ＮＳＡＩＤ、強オピオイド、弱オピオイド、ＣＯＸ－２阻害剤、アセトアミノフェン（パラセタモール）又はこれらの組合せに対して不耐性である。
一部の実施形態では、本方法は、結合分子の固定用量の投与前に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２感染に関して対象を検査することを含む。一部の実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２感染に関して対象を検査することは、結合分子の固定用量の投与前に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２遺伝物質に関して対象を検査することを含む。一部の実施形態では、対象は、ベースライン時にＳＡＲＳ－ＣｏＶ２に感染していない。
一部の実施形態では、対象は、ベースライン時において、疼痛の数値評価スケール（ＮＲＳ）で測定された場合、関節の少なくとも５の平均疼痛強度スコアを有する。一部の実施形態では、本方法は、対象の１日当たりのＮＲＳ疼痛スコアの週平均をベースラインから低減させる。一部の実施形態では、固定用量は、１２週間にわたって２週間毎に投与され、本方法は、少なくとも１２週目までに対象の１日当たりのＮＲＳ疼痛スコアの週平均をベースラインから低減させる。一部の実施形態では、本方法は、対象の１日当たりのＮＲＳ疼痛スコアの週平均をベースラインから少なくとも３０％低減させる。一部の実施形態では、本方法は、対象の１日当たりのＮＲＳ疼痛スコアの週平均をベースラインから少なくとも５０％低減させる。
一部の実施形態では、対象は、ベースライン時において、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｏｎｔａｒｉｏ ａｎｄ ＭｃＭａｓｔｅｒ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｉｅｓ Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ（ＷＯＭＡＣ）指標の疼痛サブスケールを使用して測定された場合、関節の少なくとも５の平均ＷＯＭＡＣ疼痛スコアを有する。一部の実施形態では、本方法は、対象のＷＯＭＡＣ疼痛サブスケールスコアをベースラインから低減させる。一部の実施形態では、固定用量は、１２週間にわたって２週間毎に投与され、本方法は、少なくとも１２週目までに対象の１日当たりのＷＯＭＡＣ疼痛スコアの週平均をベースラインから低減させる。一部の実施形態では、本方法は、対象のＷＯＭＡＣ疼痛サブスケールスコアをベースラインから少なくとも３０％低減させる。一部の実施形態では、本方法は、対象のＷＯＭＡＣ疼痛サブスケールスコアをベースラインから少なくとも５０％低減させる。一部の実施形態では、本方法は、対象のＷＯＭＡＣ身体サブスケールスコアをベースラインから少なくとも３０％低減させる。一部の実施形態では、本方法は、対象のＷＯＭＡＣ身体サブスケールスコアをベースラインから少なくとも５０％低減させる。
一部の実施形態では、本方法は、変形性関節症の患者全般評価（ＰＧＡ）をベースラインから改善する。一部の実施形態では、固定用量は、１２週間にわたって２週間毎に投与され、方法は、少なくとも１２週目までに変形性関節症のＰＧＡをベースラインから低減させる。一部の実施形態では、本方法は、変形性関節症のＰＧＡを少なくとも２ポイント改善する。
一部の実施形態では、疼痛の軽減は、対象における結合分子の単回用量投与後に観察される。一部の実施形態では、本方法は、対象にＮＳＡＩＤを投与することを含む。一部の実施形態では、本方法は、対象にオピオイドを投与することを含む。一部の実施形態では、本方法は、対象にパラセタモールを投与することを含む。一部の実施形態では、本方法は、対象にＣＯＸ－２阻害剤を投与することを含む。
一部の実施形態では、抗ＮＧＦ抗体又はその断片は、ＴｒｋＡ、ｐ７５ＮＲＴ又はＴｒｋＡ及びＰ７５ＮＲＴの両方へのＮＧＦの結合を阻害し得る。一部の実施形態では、抗ＮＧＦ抗体又はその断片は、ｐ７５ＮＲＴへのＮＧＦの結合よりもＴｒｋＡへのＮＧＦの結合を優先的にブロックする。一部の実施形態では、抗ＮＧＦ抗体又はその断片は、約０．２５～０．４４ｎＭの親和性でヒトＮＧＦに結合する。一部の実施形態では、抗ＮＧＦ抗体又はその断片は、ＣＤＲ ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３のセットを含む抗体ＶＨドメインと、ＣＤＲ ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のセットを含む抗体ＶＬドメインとを含み、ＨＣＤＲ１は、配列番号４のアミノ酸配列又は最大で２つのアミノ酸置換を有する配列番号４のアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ２は、配列番号５のアミノ酸配列又は最大で２つのアミノ酸置換を有する配列番号５のアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ３は、配列番号６のアミノ酸配列若しくは最大で２つのアミノ酸置換を有する配列番号６のアミノ酸配列、ＳＳＲＩＹＤＦＮＳＡＬＩＳＹＹＤＭＤＶ（配列番号１１）又はＳＳＲＩＹＤＭＩＳＳＬＱＰＹＹＤＭＤＶ（配列番号１２）を有し、ＬＣＤＲ１は、配列番号８のアミノ酸配列又は最大で２つのアミノ酸置換を有する配列番号８のアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ２は、配列番号９のアミノ酸配列又は最大で２つのアミノ酸置換を有する配列番号９のアミノ酸配列を有し、及びＬＣＤＲ３は、配列番号１０のアミノ酸配列又は最大で２つのアミノ酸置換を有する配列番号１０のアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、抗ＮＧＦ抗体又はその断片は、ＣＤＲ ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３のセットを含む抗体ＶＨドメインと、ＣＤＲ ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のセットを含む抗体ＶＬドメインとを含み、ＨＣＤＲ１は、配列番号４のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２は、配列番号５のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ３は、配列番号６のアミノ酸配列、ＳＳＲＩＹＤＦＮＳＡＬＩＳＹＹＤＭＤＶ（配列番号１１）又はＳＳＲＩＹＤＭＩＳＳＬＱＰＹＹＤＭＤＶ（配列番号１２）を含み、ＬＣＤＲ１は、配列番号８のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２は、配列番号９のアミノ酸配列を含み、及びＬＣＤＲ３は、配列番号１０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、抗ＮＧＦ抗体又はその断片は、配列番号３又は９４のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を有するＶＨを含む。一部の実施形態では、抗ＮＧＦ抗体又はその断片は、配列番号７又は９５のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を有するＶＬを含む。一部の実施形態では、抗ＮＧＦ抗体又はその断片は、完全Ｈ２Ｌ２抗体、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）２断片又は一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片である。一部の実施形態では、抗ＮＧＦ抗体又はその断片は、ヒト化されているか、キメラであるか、霊長類化されているか又は完全ヒトである。一部の実施形態では、抗ＮＧＦ ｓｃＦｖ断片は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、１５個のアミノ酸のリンカー配列（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号１５）及び配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬを含む。一部の実施形態では、抗ＮＧＦ ｓｃＦｖ断片は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号９４のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、２０個のアミノ酸のリンカー配列（ＧＧＧＧＳ）４（配列番号１９）及び配列番号９５のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
一部の実施形態では、ＴＮＦＲは、ＴＮＦＲ－２である。一部の実施形態では、ＴＮＦＲ－２断片は、免疫グロブリンＦｃドメインに融合されている。一部の実施形態では、免疫グロブリンＦｃドメインは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。一部の実施形態では、ＴＮＦαアンタゴニストドメインは、配列番号１３に記載されているアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列又はその機能的断片を含む。
一部の実施形態では、結合分子は、リンカーを介してＴＮＦαアンタゴニストに融合されているＮＧＦアンタゴニストを含む融合タンパク質を含む。一部の実施形態では、結合分子は、融合タンパク質のホモ二量体を含む。一部の実施形態では、結合分子は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号１３のアミノ酸１～２３５に対応する配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＴＮＦＲ－２のＴＮＦα結合断片、ヒトＩｇＧ１Ｆｃドメイン、１０個のアミノ酸のリンカー配列（ＧＧＧＧＳ）２（配列番号９８）、配列番号３又は９４のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、１５個のアミノ酸のリンカー配列（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号１５）及び配列番号７又は９５のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬを含む融合ポリペプチドのホモ二量体を含む。一部の実施形態では、結合分子は、配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドのホモ二量体を含む。一部の実施形態では、結合分子は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＴＮＦＲ－２のＴＮＦα結合７５ｋＤ断片、１０個のアミノ酸のリンカー配列（ＧＧＧＧＳ）２（配列番号９８）、配列番号９４のアミノ酸配列を含むＶＨ、２０個のアミノ酸のリンカー配列（ＧＧＧＧＳ）４（配列番号１９）及び配列番号９５のアミノ酸配列を含むＶＬを含む融合ポリペプチドのホモ二量体を含む。一部の実施形態では、配列番号７の１０２、１０３又は１０４位に対応するアミノ酸位置のグリン残基は、システイン残基に改変されており、配列番号３の４４位に対応するアミノ酸位置のグリシン残基は、システイン残基に改変されている。一部の実施形態では、結合分子は、配列番号１７のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドのホモ二量体を含む。一部の実施形態では、結合分子は、配列番号１７のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドのホモ二量体を含む。
本開示は、疼痛の軽減又は予防を、それを必要とする対象において行う方法での使用のための結合分子であって、この方法は、結合分子の皮下固定用量を対象に投与することを含み、結合分子は、ＮＧＦアンタゴニストドメインと、ＴＮＦαアンタゴニストドメインとを含み、ＮＧＦアンタゴニストドメインは、抗ＮＧＦ抗体又はその抗原結合断片であり、ＴＮＦαアンタゴニストドメインは、ＴＮＦＲの可溶性ＴＮＦα結合断片を含み、この方法は、対象の疼痛を軽減又は予防する、結合分子を提供する。
ＴＮＦＲ２－Ｆｃ融合タンパク質（パネルＡ）及び抗ＮＧＦ ｓｃＦｖドメインに融合したＴＮＦＲ２－Ｆｃドメインを含む例示的な多重特異性結合分子ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４（パネルＢ）の概略図である。 ［図２Ａ］精製されたＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４のバッチにおける凝集体、単量体及びタンパク質断片化のレベルのＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析の結果を示す。［図２Ｂ］還元条件下及び非還元条件下での、精製されたＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４及び精製されたＴＮＦＲ２－Ｆｃタンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルローディング順：１．ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４、２．ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＬ－ＶＨ（抗ＮＧＦ ｓｃＦｖに融合したＴＮＦＲ２－Ｆｃであり、可変ドメインの遺伝子の向きが逆である）、３．ＴＮＦＲ２－Ｆｃ無関係ｓｃＦｖ １、４．ＴＮＦＲ２－Ｆｃ、５．ＴＮＦＲ２－Ｆｃ無関係ｓｃＦｖ ２。 ［図３Ａ－Ｂ］図３Ａは、プロテインＡカラム精製後のＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４の純度を示す。図３Ｂは、ＳＰセファロースカラムによる２回目の精製工程後のＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４の純度を示す。 示差走査熱量測定を使用するＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４の安定性分析を示す。 ＥＬＩＳＡにより決定した場合の、ＴＮＦα及びＮＧＦ（単独及び一緒の両方）へのＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４の結合を示す。図５Ａは、ＮＧＦへの結合を示し、図５Ｂは、ＴＮＦαへの結合を示し、図５Ｃは、ＴＮＦα及びＮＧＦへの同時結合を示す。 ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４に関する表面プラズモン共鳴結合アッセイのセンサーグラムを示す。ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４多重特異性抗体の同時抗原結合を、ＢＩＡｃｏｒｅ ２０００を使用して実施した。同時抗原結合を、センサー表面に結合したＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４上にＴＮＦα及びＮＧＲを連続的に結合させることにより評価した。センサーグラムの第１の部分は、多重特異性抗体へのＴＮＦαの飽和量の結合を示し、センサーグラムの第２の部分は、再度のＴＮＦα（表面が飽和していることを示す）又はＴＮＦα及びＮＧＦの等モル混合物のいずれかの第２の抗原を適用した場合の結合を示す。共鳴単位の増加は、多重特異性分子へのＮＧＦの結合と同等であり、従って同時抗原結合と同等であった。このアッセイを逆の順序の抗原添加でも実施して、これらのデータを確認した。 ＴＦ－１細胞のＮＧＦ媒介性増殖の抑制を示す。Ａ．添加されるＮＧＦアンタゴニストの非存在下でのＮＧＦ媒介性増殖。Ｂ．ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４によるヒトＮＧＦ反応の阻害。Ｃ．ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４．によるマウスＮＧＦ反応の阻害。ＮＧＦの活性は、通常、ＲＬＵ－相対発単位として表され、ＮＧＦ媒介性増殖の％は、以下の式：１００×（ウェルＲＬＵ－バックグランウドＲＬＵ）／（全ＲＬＵ－バックグラウンドＲＬＵ）（式中、バックグラウンドＲＬＵ＝培地コントロールの平均値であり、及び全ＲＬＵ＝リガンド単独コントロールの平均値である）を使用して、ＮＧＦリガンド単独に対する反応％として算出される。Ｄ．ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶａｒＢ及びヌディマブ（ｎｄｉｍａｂ）ＶａｒＢによるヒトＮＧＦ反応の阻害。Ｅ．ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶａｒＢ及びヌディマブＶａｒＢによるマウスＮＧＦ反応の阻害。 Ｕ９３７細胞におけるＴＮＦα誘発性カスパーゼ３活性の阻害を示す。Ａ．添加されるＴＮＦαアンタゴニストの非存在下でのＵ９３７細胞におけるＴＮＦα誘発性カスパーゼ３活性。Ｂ．添加されるアンタゴニストの非存在下での反応率として示されている、Ｕ９３７細胞におけるＴＮＦα誘発性カスパーゼ３活性の阻害。ＴＮＦの活性は、通常、ＲＬＵ－相対発単位として表され、ＴＮＦ媒介性カスパーゼ３放出の％は、図７Ｃにおいて上記で説明されている式を使用して、ＴＮＦリガンド単独に対する反応％として算出された。Ｃ．関連する分子ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢ及びヌディマブＶａｒＢに関して示されている同様の結果。 部分的坐骨神経ライゲーション誘発性機械的痛覚過敏に対するエタネルセプト及びＭＥＤＩ－５７８による併用処置の効果を示す。結果を同側／反対側比として示す。１つの群当たりＮ＝９～１０。依存因子として時間及び処置を用いる二元配置ＡＮＯＶＡ分析を使用してデータを解析した。続いて、統計的有意性を、ボンフェローニの事後検定を使用して得た。＊＊＊Ｏｐ＋ＣＡＴ－２５１コントロールに対してｐ＜０．００１。 ［図１０Ａ－Ｂ］図１０Ａは、部分的坐骨神経ライゲーション誘発性機械的痛覚過敏に対するＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４の効果を示す。結果を同側／反対側比として示す。１つの群当たりＮ＝１０。依存因子として時間及び処置を用いる二元配置ＡＮＯＶＡ分析を使用してデータを解析した。続いて、統計的有意性を、ボンフェローニの事後検定を使用して得た。＊＊＊二重特異性アイソタイプコントロールに対してｐ＜０．００１。図１０Ｂは、関連分子であるＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢによる同様の結果を示す。 機械的過敏の関節痛モデルにおける疼痛減少に対するＭＥＤＩ－５７８及びエタネルセプトの共投与の効果を示す。１つの群当たりＮ＝９～１０。二元配置ＡＮＯＶＡ分析を使用してデータを解析した。続いて、統計的有意性を、ボンフェローニの事後検定を使用して得た。＊Ｐ＞０．０５；＊＊＊ＣＡＴ－２５１に対してＰ＜０．００１。 機械的過敏の関節痛モデルにおける疼痛減少に対するＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４の効果を示す。１つの群当たりＮ＝９～１０。二元配置ＡＮＯＶＡ分析を使用してデータを解析した。続いて、統計的有意性を、ボンフェローニの事後検定を使用して得た。＊＊＊二重特異性アイソタイプコントロールに対してＰ＜０．００１。 ラットモデルにおけるＣＦＡ誘発性痛覚過敏に対するＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢの５つの異なる用量の効果を示す。 ホスホ－ｐ３８反応からのＨＴＲＦ比を示すヒートマップである。 ｐ３８リン酸化に対するＴＮＦα、ＮＧＦ又はＴＮＦα及びＮＧＦの組合せの効果を示す用量反応曲線である。 ホスホ－ＥＲＫ反応からのＨＴＲＦ比を示すヒートマップである。 ＥＲＫリン酸化に対するＴＮＦα、ＮＧＦ又はＴＮＦα及びＮＧＦの組合せの効果を示す用量反応曲線である。 ［図１８Ａ－Ｂ］図１８Ａは、インターリーブ単回漸増用量（ＳＡＤ）及び複数回漸増用量（ＭＡＤ）試験の簡略図を示す。図１８Ｂは、各コホートの試験デザインを表形式で示す。「ＲｏＡ」は、投与経路であり、「ＩＶ」は、静脈内であり、「ＳＣ」は、皮下である。予測される平均ＮＧＦ抑制率も示す。 ［図１９Ａ－Ｂ］図１９Ａは、採点された１日当たりの疼痛の平均へのＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢの単回静脈内用量の効果が時間（用量後の日数）に対してプロットされているグラフを示す。上部の水平な赤線は、用量前の全ての対象の１日当たりの疼痛スコアの平均である。下部の水平な赤線は、プラセボを投与した全ての対象の１日当たりの疼痛スコアの平均である。図１９Ｂは、列挙された用量での予測される平均ＮＧＦ抑制率及びプラセボ（ＰＢＯ）に対するピークＮＲＳ変化を示す表である。 ［図２０Ａ－Ｂ］図２０Ａは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢの投与後のベースライン調整された平均疼痛ＷＯＭＡＣのグラフである。対象は、疼痛（歩行時、階段昇段時、夜間時、安静時及び体重負荷時）に特に焦点を当てる５つの質問に答える。各質問を５点スケール（０～４）でスコア化し、０は、「全くない」であり、４は、「非常にある」である。スコアが高いほど、その活動を実行する際に経験した疼痛がひどい（又は知覚される機能障害が大きい）。５つ全ての疼痛質問に回答した対象は、最大スコア２０を有し得、ここでは、疼痛ＮＲＳスコアと比較可能にするために１０までスケールダウンされている。ベースライン時（投与前１日目）並びに８、１５、２２、２９日目（且つ２５０及び１０００μｇ／ｋｇコホートのみに関して４３及び５６日目）に診療所内で質問表に回答するように対象に求めた。図２０Ｂは、ＳＡＤ試験におけるプラセボ対様々なＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢ用量のＷＯＭＡＣスコアの比較のためのｐ値を提供する表である。 ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢの３つの統計的に有意な単回用量について、用量後２週間にわたるピーク及び平均での測定されたＮＧＦ抑制％を示す表であり、括弧内は、予測されるＮＧＦ抑制レベルである。これらの３つの用量のそれぞれに関して、プラセボに対するピークＷＯＭＡＣ疼痛サブスケール変化も表す。ピーク効果は、５０及び２５０μｇ／ｋｇの用量でのそれぞれ４６～５５％の遊離ＮＧＦの測定された抑制と対応することに留意されたい。 ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢの単回用量の投与の結果としての血漿中遊離ＮＧＦの抑制を示す。簡潔に説明すると、下記の時点：用量前、用量後１、８及び２４時間、８、１５、２２、２９日目（２つの最高用量のみに関して４３及び５６日目）で各対象から血液サンプルを採取した。血漿サンプルを調製し、Ｓｉｎｇｕｌｅｘ，Ｅｒｅｎｎａ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙを使用して分析した。遊離ＮＧＦの抑制を算出し、各濃度での用量後１４日にわたる平均抑制を算出した。１４日にわたる遊離ＮＧＦの平均抑制は、０（１ｋｇ当たり０．３μｇ）～約６５％（１ｋｇ当たり１０００μｇ）の範囲である。 ＳＡＤコホート１～４（０．３～５０μｇ／ｋｇ）の各対象に関するＮＧＦレベルの上昇をプロットした一連のグラフである。 時間に対する各コホートに関するベースラインからのＣＸＣＬ－１３レベルの平均変化率をプロットしたグラフである。 ０．３～１０００μｇ／ｋｇの範囲の単回静脈内用量及び５０μｇ／ｋｇの単回皮下用量でのＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢ（ＭＥＤＩ７３５２で示されている）の幾何平均血清中薬物動態プロファイルを示す。図２５は、データを対数スケールで示す。５０μｇ／ｋｇまでの用量の場合、用量後２９日目までサンプルを採取した。２５０及び１０００μｇ／ｋｇの用量の場合、用量後４３日目及び５６日目までサンプリングを延長した。２５０μｇ／ｋｇに関するデータは、コホート中の全ての対象の値が４３日目及び５６日目に定量下限を下回っていたことから、２９日目を超えて示されていない。１０００μｇ／ｋｇの場合、値は、４３日目には３例のみの対象で定量下限を超えており、５６日目では１例の対象で定量下限を超えていた。ＬＬＯＱ＝定量下限。 １～４５０μｇ／ｋｇの範囲の反復静脈内用量でのＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢ（ＭＥＤＩ７３５２で示されている）の幾何平均血清中薬物動態プロファイルを示す。図２６Ａは、データを線形スケールで表す。図２６Ｂは、データを対数スケールで示す。１μｇ／ｋｇに関するデータは、コホート中の全ての対象の値が６４、７１及び８４日目に定量下限を下回っていたことから、用量後５７日目を超えて示されていない。５０μｇ／ｋｇに関するデータは、全ての対象が定量下限を下回る濃度であったことから、８４日目に関して示されていない。４５０μｇ／ｋｇに関して、５７日目を超えて利用可能な濃度データはない。 用量後４３日目でのＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢの観察された最大血清中濃度（Ｃｍａｘ；上のグラフ）と、１～４５０μｇ／ｋｇの範囲のＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢの反復静脈内用量後のベースラインからのＷＯＭＡＣ疼痛スコアの関連する変化（下のグラフ）とを示す。 ［図２８Ａ－Ｃ］図２８は、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢの反復用量後の疼痛レベルを示す。図２８Ａは、プラセボ、１５０μｇ／ｋｇ又は４５０μｇ／ｋｇのＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢを投与した患者における、０～８４日目からのＮＲＳ疼痛のベースラインからの変化を示す。図２８Ｂは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢの反復用量の効果と、タネズマブ２．５ｍｇ、タネズマブ５ｍｇ、オキシコドン４０ｍｇ又はプラセボとを比較する。図２８Ｃは、様々な用量のファシヌマブ、フルラヌマブ（ｆｕｌｒａｎｕｍａｂ）、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢ（ＭＥＤＩ７３５２で示されている）及びタネズマブにより誘発された、ベースラインからのＷＯＭＡＣ疼痛サブスケールの変化により決定される疼痛軽減を示す。 ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢ（ＭＥＤＩ７３５２で示されている）濃度と、ＷＯＭＡＣ疼痛サブスケール（上のグラフ）又はＮＲＳ疼痛サブスケール（下のグラフ）の変化により決定される疼痛軽減とに対するＡＤＡ力価の効果を示す。 ０．３～１０００μｇ／ｋｇの範囲の単回静脈内用量でのＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢの幾何平均血清中薬物動態プロファイルと、ＡＤＡ力価のレベルにより分類された１～４５０μｇ／ｋｇの範囲の反復静脈内用量とを示す。 ４種の週２回用量後の体重に対するＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢクリアランスの散布図である。凡例は、ＭＡＤコホート番号及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢ用量を示す。クリアランスデータをノンコンパートメント解析から得た。プロットは、９５％信頼限界（破線）である線形回帰分析（実線）を示す。０．６１のｐ値は、クリアランスと体重との間に有意な関連がないことを示す。 皮下固定用量試験の簡略図を示す。
定義
「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」実体という用語は、この実体の１つ又は複数を指すことに留意されたい。従って、「１つの（ａ）」（又は「１つの（ａｎ）」）、「１つ又は複数」及び「少なくとも１つ」という用語は、本明細書では互換的に使用され得る。
更に、本明細書で使用する「及び／又は」は、他方の有無にかかわらず、２つの指定された特徴又は構成要素のそれぞれの具体的な開示と見なされるべきである。従って、「及び／又は」という用語は、本明細書において「Ａ及び／又はＢ」等の語句で使用される場合、「Ａ及びＢ」、「Ａ又はＢ」、「Ａ」（単独）及び「Ｂ」（単独）を含むことが意図されている。同様に、「及び／又は」という用語は、「Ａ、Ｂ及び／又はＣ」等の語句で使用される場合、下記の態様のそれぞれを包含することが意図されている：Ａ、Ｂ及びＣ；Ａ、Ｂ又はＣ；Ａ又はＣ；Ａ又はＢ；Ｂ又はＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；並びにＣ（単独）。
態様が「含む」という語と共に本明細書で説明される場合には常に、「からなる」及び／又は「から本質的になる」という用語で説明される類似の態様も提供されることを理解されたい。
「約」又は「およそ」という用語は、当業者により決定される場合の特定の値に対する許容可能な誤差範囲内を意味しており、この値がどのように測定されるか又は決定されるかに部分的に依存し、即ち測定システムの限界に部分的に依存する。例えば、「約」は、当技術分野での慣例により、１つ又は複数の標準偏差内を意味し得る。代わりに、「約」は、所与の値の最大で２０％、最大で１５％、最大で１０％、最大で５％又は最大で１％上下の範囲を意味し得る。
別途定義されない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は全て、本開示が関連する技術分野の当業者により通常理解されるのと同じ意味を有する。例えば、Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｏ，Ｐｅｉ－Ｓｈｏｗ，２ｎｄ ｅｄ．，２００２，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ；Ｔｈｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ ｅｄ．，１９９９，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；及びＯｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ Ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｅｖｉｓｅｄ，２０００，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓは、本開示で使用される用語の多くの一般辞書を当業者に提供する。
単位、接頭辞及び記号は、これらの国際単位系（ＳＩ）で認められている形態で表記される。数値範囲には、この範囲を画定する数字が含まれる。別途指示されない限り、アミノ酸配列は、アミノからカルボキシ方向に向けて左から右に記述される。本明細書中で提供される見出しは、全体として本明細書を参照することによって得られる本開示の様々な態様の限定ではない。従って、直下に定義する用語は、本明細書を全体として参照することによってより詳細に定義される。
本明細書で使用される場合、「結合分子」という用語は、その広義の意味において、抗原決定基（例えば抗原）に特異的に結合する分子を指す。結合分子の非限定的な例として、抗体又はその断片、可溶性受容体融合タンパク質又はその断片、非免疫グロブリン足場又はその断片が挙げられ、それぞれ、抗原特異的結合を保持する。例示的な可溶性受容体融合タンパク質及び抗体を下記に示す。特定の実施形態では、結合分子を、そのような抗体又はその断片、可溶性受容体融合タンパク質又はその断片及び非免疫グロブリンベースの足場又はその断片の組合せを含むように操作する可能性がある。
結合分子又は抗原を認識する、結合分子の任意の部分は、本明細書では、「結合ドメイン」と称される。天然に存在する抗体等のフルサイズの結合分子に具体的に言及しない限り、「結合分子」という用語は下記を包含するが、これらに限定されない：フルサイズの抗体又は他の非抗体結合分子及びそのような結合分子の抗原結合断片、バリアント、類似体又は誘導体、例えば天然に存在する抗体若しくは免疫グロブリン分子又はフルサイズの結合分子と同様の方法で抗原に結合する操作された結合分子若しくは断片。
特定の実施形態では、本開示は、特定の多重特異性結合分子（例えば、二重特異性、三重特異性、四重特異性等の結合分子）又はその抗原結合断片、バリアント若しくは誘導体を提供する。本明細書で使用される場合、多重特異性結合分子は、１つ若しくは複数の抗体結合ドメイン、１つ若しくは複数の非抗体結合ドメイン又はこれらの組合せを含み得る。
文献ではベータ－神経成長因子とも称されている「神経成長因子」（「ＮＧＦ」）という用語は、本明細書で使用される場合、様々な神経細胞の成長及び生存で機能する分泌タンパク質を指す。ヒトＮＧＦは、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ＮＰ＿００２４９７．２で示されており、本明細書では配列番号１で示される。ＮＧＦという用語は、本明細書で使用される場合、ヒトＮＧＦに限定されず、ヒトＮＧＦの全ての種オルソログを含む。「ＮＧＦ」という用語は、ＮＧＦのプロフォーム、プロＮＧＦ、完全長ＮＧＦ及び細胞内でのプロセシングにより生じるあらゆる形態のＮＧＦを包含する。この用語は、ＮＧＦの天然に存在するバリアント（例えば、スプライスバリアント、対立遺伝子バリアント）及びアイソフォームも包含する。ＮＧＦは、下記の２種の受容体に結合し得る：ｐ７５ニューロトロフィン受容体（ｐ７５（ＮＴＲ））及び膜貫通チロシンキナーゼであるＴｒｋＡ。ＮＧＦは、侵害受容器の感作を媒介することが知られている、疼痛の十分に検証された標的である。
ＮＧＦ媒介性疼痛は、本明細書に記載されている結合分子による安全な且つ有効な処置に特に十分に適しており、なぜならば、ＮＧＦレベルは侵害刺激に応答して末梢で上昇し、且つ抗体は血液脳関門透過性が低いからである。本明細書で説明されている治療及び組成物で使用され得る多くの抗ＮＧＦ抗体及びその抗原結合断片は、文献中に見出され得、例えばＰＣＴ公開国際公開第０２／０９６４５８号パンフレット及び同第０４／０３２８７０号パンフレットを参照されたい。
「ＭＥＤＩ－５７８」という用語は、ＮＧＦに特異的に結合する抗体を指し、ＮＧＦは、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２００６／０００２３８号パンフレット及び米国特許出願公開第２００８／０１０７６５８Ａ１号明細書の主題であり、これらの両方は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。ＭＥＤＩ－５７８の重鎖及び軽鎖の配列をそれぞれ配列番号３及び７で示す。
ＮＧＦ－ＮＧという用語は、ＮＧＦに特異的に結合する抗体を指す。ＮＧＦ－ＮＧの重鎖及び軽鎖の配列をそれぞれ配列番号２４及び２６に示す。
文献ではカケクチン、ＡＣＰ１タンパク質：腫瘍壊死因子；ＴＮＦ；又は腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリメンバー２とも称されている「腫瘍壊死因子アルファ」（「ＴＮＦα」）という用語は、本明細書で使用される場合、特定のＴＮＦαタンパク質を指し、且つＴＮＦリガンドのスーパーファミリを指すものではない。ヒトＴＮＦαは、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ＮＰ＿０００５８５．２で示されており、配列番号２で示される。ＴＮＦαという用語は、本明細書で使用される場合、ヒトＴＮＦに限定されず、ヒトＴＮＦαの全ての種オルソログを含む。「ＴＮＦα」という用語は、ＴＮＦαのプロフォーム、プロＴＮＦα、完全長ＴＮＦα及び細胞内でのプロセシングにより生じるあらゆる形態のＴＮＦαを包含する。この用語は、ＴＮＦαの天然に存在するバリアント及び天然には存在しないバリアント（例えば、スプライスバリアント、対立遺伝子バリアント）並びにアイソフォームも包含する。ＴＮＦαは、下記の２種の受容体に結合し得る：ＴＮＦＲ１（ＴＮＦ受容体１型；ＣＤ１２０ａ；ｐ５５／６０）及びＴＮＦＲ２（ＴＮＦ受容体２型；ＣＤ１２０ｂ；ｐ７５／８０）。ＴＮＦαは、炎症促進性サイトカインとして機能し、例えば神経炎症で機能する。例えば、ＴＮＦαは、神経障害性疼痛の発生に機能的に関与すると考えられている（Ｌｅｕｎｇ，Ｌ．，ａｎｄ Ｃａｈｉｌｌ，ＣＭ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ７：２７（２０１０））。
「単離された」結合分子、ポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞又は組成物は、天然に存在しない形態である結合分子、ポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞又は組成物を指す。単離された結合分子、ポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞又は組成物は、これらがもはや自然界では見出される形態ではない程度まで変更されているか、適合されているか、組合わされているか、再編成されているか、操作されているか又は他の方法で操作されているものを含む。一部の実施形態では、単離されっている結合分子、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞又は組成物は、「組換え体」である。
本明細書で使用される場合、「多機能性ポリペプチド」及び「二機能性ポリペプチド」という用語は、２種以上の抗原を標的とするように設計された、天然に存在しない結合分子を指す。本明細書で説明されている例示的な多機能性ポリペプチドは、抗ＮＧＦ抗原結合断片又は抗体部分と、可溶性ＴＮＦＲ２部分とを含む多機能性結合分子である。
「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子であって、この免疫グロブリン分子の可変領域内の少なくとも１箇所の抗原認識部位を介して、標的（例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質又は前述の組み合わせ）を認識して特異的に結合する免疫グロブリン分子を意味する。本明細書で使用される場合、「抗体」という抗体は、下記を包含する：インタクトなポリクローナル抗体、インタクトなモノクローナル抗体、抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ断片）、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）変異体、少なくとも２種のインタクトな抗体から作製された多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体）、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体の抗原決定部分を含む融合タンパク質及び抗体が所望の生物学的活性を示す限りは抗原認識部位を含む任意の他の改変免疫グロブリン分子。抗体は、免疫グロブリンの下記の５つの主要なクラスのいずれかであり得る：それぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ及びミューと呼ばれる、重鎖定常ドメインの同一性に基づくＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ又はこれらのサブクラス（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）。免疫グロブリンの様々なクラスは、様々な公知のサブユニット構造及び３次元配置を有する。
一部の実施形態では、「ブロッキング」結合分子（例えばブロッキング抗体）又は「アンタゴニスト」結合分子（例えばアンタゴニスト抗体若しくは融合タンパク質）は、ＮＧＦ又はＴＮＦα等の結合する抗原の生物学的活性を阻害又は低減するものである。特定の態様では、ブロッキング抗体又はアンタゴニスト結合分子は、抗原の生物学的活性を実質的に又は完全に阻害する。例えば、生物学的活性を０．０１％、０．１％、０．５％、１％、５％、１０％、２０％、３０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は更に１００％低減し得る。
「アンタゴニスト」及び「アンタゴニストドメイン」は、本明細書で使用される場合、標的（例えば、ＴＮＦα又はＮＧＦ）に結合し、それにより標的が受容体と相互作用することがブロックされるか又は阻害されるポリペプチド又は他の分子を含む。そのため、ＮＧＦ及び／又はＴＮＦαアンタゴニストは、ＮＧＦとｔｒｋＡ若しくはｐ７５ニューロトロフィンとの相互作用又はＴＮＦαとＴＮＦＲ－１若しくはＴＮＦＲ－２との相互作用をブロックするか又は阻害する分子を含む。ＮＧＦ及び／又はＴＮＦαアンタゴニストは、ｐ３８リン酸化及び／又はＥＲＫリン酸化を低減する分子も含む。例示的なアンタゴニストとして下記が挙げられるが、これらに限定されない：抗ＮＧＦ抗体又はその抗原結合断片及び標的特異的で可溶性の非シグナル伝達ＴＮＦ－アルファ受容体ペプチド（「デコイ受容体」又はそのリガンド結合断片）。
「抗体断片」という用語は、インタクトな抗体の一部を指し、且つインタクトな抗体の抗原決定可変領域を指す。抗体断片の例として下記が挙げられるが、これらに限定されない：Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ断片、線状抗体、一本鎖抗体並びに抗体断片から形成される多重特異性抗体。本明細書の他の箇所で説明されている非抗体結合分子の抗原結合断片も、本開示により提供される。
「モノクローナル抗体」は、単一の抗原決定基又はエピトープの高度に特異的な認識及び結合に関与する均質な抗体集団を指す。これは、典型的には異なる抗原決定基に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体と対照的である。「モノクローナル抗体」という用語は、下記を包含する：インタクトなモノクローナル抗体及び完全長モノクローナル抗体の両方並びに抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ）、一本鎖（ｓｃＦｖ）変異体、抗体部分を含む融合タンパク質並びに抗原認識部位を含む任意の他の改変免疫グロブリン分子。更に、「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ、ファージ選択、組換え発現及びトランスジェニック動物によるものが挙げられるが、これらに限定されないいくつかの方法で製造されるような抗体を指す。
「ヒト化抗体」という用語は、最小限の非ヒト（例えばネズミ科）配列を含む特定の免疫グロブリン鎖、キメラ免疫グロブリンである非ヒト（例えばネズミ科）抗体又はその断片の形態を指す。典型的には、ヒト化抗体は、相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が、所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種（例えば、マウス、ラット、ウサギ又はハムスター）のＣＤＲ由来の残基に置き換えられているヒト免疫グロブリンである（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２－５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３－３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４－１５３６）。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ又はＦＷ）残基は、所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種由来の抗体中の対応する残基に置き換えられている。ヒト化抗体を、Ｆｖフレームワーク領域中の及び／又は置き換えられた非ヒト残基内の更なる残基の置換により更に改変して、抗体の特異性、親和性及び／又は能力を洗練して最適化し得る。一般に、ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンに対応するＣＤＲ領域の全て又は実質的に全てを含むが、ＦＲ領域の全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである少なくとも１つ、典型的には２つ又は３つの可変ドメインの実質的に全てを含むことになる。ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域又はドメイン（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部も含み得る。ヒト化抗体を生成するために使用される方法の例は、米国特許第５，２２５，５３９号明細書又は同第５，６３９，６４１号明細書で説明されている。
抗体の「可変領域」は、単独の又は組み合わせられた抗体軽鎖の可変領域又は抗体重鎖の可変領域を指す。重鎖及び軽鎖の可変領域は、それぞれ、超可変領域としても既知の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）により接続された４つのフレームワーク領域（ＦＲ又はＦＷ）からなる。各鎖のＣＤＲは、ＦＲにより近接して一体に保持されており、他方の鎖からのＣＤＲと共に抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。ＣＤＲを決定するために、下記の少なくとも２種の技術が存在する：（１）異種間の配列可変性に基づくアプローチ（即ちＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，（５ｔｈ ｅｄ．，１９９１，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，ＢｅｔｈｅｓｄａＭｄ．））；及び（２）抗原－抗体複合体の結晶学的研究に基づくアプローチ（Ａｌ－ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７－９４８））。加えて、当技術分野では、これらの２つのアプローチの組合せを使用してＣＤＲを決定することがある。
Ｋａｂａｔ付番方式は、一般に、可変ドメイン内の残基（概ね、軽鎖の残基１～１０７及び重鎖の残基１～１１３）を指す際に使用される（例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））。
Ｋａｂａｔにあるようなアミノ酸位置の付番は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）における抗体編集物の重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインに使用される付番方式を指す。この付番方式を使用して、実際の直鎖状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲ又はＣＤＲの短縮又はこれらへの挿入に対応するより少ない又は追加のアミノ酸を含み得る。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後の１つのアミノ酸の挿入（Ｋａｂａｔによれば残基５２ａ）並びに重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入された残基（例えば、Ｋａｂａｔによれば残基８２ａ、８２ｂ及び８２ｃ等）を含み得る。残基のＫａｂａｔ付番は、所与の抗体について、相同性領域でのこの抗体の配列と「標準」Ｋａｂａｔ付番配列とのアラインメントにより決定され得る。Ｃｈｏｔｈｉａは、代わりに、構造ループの位置を指す（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７））。Ｋａｂａｔ付番規則を使用して付番した場合のＣｈｏｔｈｉａ ＣＤＲ－Ｈ１ループの末端は、このループの長さに応じてＨ３２～Ｈ３４で変化する（これは、Ｋａｂａｔ付番スキームがＨ３５Ａ及びＨ３５Ｂに挿入を置くためであり、３５Ａも３５Ｂも存在しない場合、このループは、３２で終わり、３５Ａのみが存在する場合、このループは、３３で終わり、３５Ａ及び３５Ｂの両方が存在する場合、このループは、３４で終わる）。ＡｂＭ超可変領域は、Ｋａｂａｔ ＣＤＲとＣｈｏｔｈｉａ構造ループとの妥協案を示し、Ｏｘｆｏｒｄ ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアにより使用される。比較を下記の表１に示す。
Figure 2023543005000001
「ヒト抗体」という用語は、天然ヒト抗体又は当技術分野で既知の任意の技術を使用して製造された、天然ヒト抗体に対応するアミノ酸配列を有する抗体を意味する。ヒト抗体のこの定義には、インタクトな若しくは完全長の抗体、その断片並びに／又は少なくとも１つのヒト重鎖及び／若しくは軽鎖ポリペプチドを含む抗体、例えばマウス軽鎖及びヒト重鎖のポリペプチドを含む抗体が含まれる。
「キメラ抗体」という用語は、免疫グロブリン分子のアミノ酸配列が２種以上に由来する抗体を指す。典型的には、軽鎖及び重鎖の両方の可変領域は、哺乳類（例えば、マウス、ラット、ウサギ等）の一種に由来する、所望の特異性、親和性及び能力を有する抗体の可変領域に相当する一方、定常領域は、別の種（通常、ヒト）における免疫反応を誘発することを回避するために、この種に由来する抗体中の配列に相同である。多重特異性結合分子（例えば、１つ若しくは複数の抗体結合ドメイン、１つ若しくは複数の非抗体結合ドメイン又はこれらの組合せを含む；例えば、本明細書で提供されるＴＮＦαアンタゴニスト及び／又はＮＧＦアンタゴニスト）は、抗体定常領域（例えばＦｃ領域）であって、所望の生化学的特性（例えば、ネイティブの又は変更されていない定常領域を含む、ほぼ同一の免疫原性の抗体と比較した場合の高い腫瘍局在化又は低い血清半減期）を提供するために、この定常領域ドメインの１つ又は複数の少なくとも一部が欠失しているか又は他の方法で変更されている、抗体定常領域を含み得る。本明細書で提供される改変定常領域は、３つの重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２若しくはＣＨ３）の１つ又は複数及び／又は軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）に対する変更又は改変を含み得る。一部の態様では、１つ又は複数の定常ドメインを部分的に又は完全に欠失させ得る。一部の態様では、ＣＨ２ドメイン全体を欠失させ得る（ΔＣＨ２構築物）。例えば、Ｏｇａｎｅｓｙａｎ Ｖ，ｅｔ ａｌ．，２００８ Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．６４：７００－４；Ｏｇａｎｅｓｙａｎ Ｖ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．４６：１７５０－５；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ，Ｗ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，２００６．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１：２３５１４－２３５２４；及びＤａｌｌ’Ａｃｑｕａ，ｅｔ ａｌ．，２００２．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：５１７１－５１８０を参照されたい。
「エピトープ」又は「抗原決定基」という用語は、本明細書では互換的に使用されており、特定の抗体が認識して特異的に結合し得る抗原の部分を指す。抗原がポリペプチドである場合、エピトープは、連続アミノ酸及びタンパク質の３次折り畳みによって並置された不連続アミノ酸の両方から形成され得る。連続アミノ酸から形成されたエピトープは、典型的には、タンパク質変性時に維持されるが、３次折り畳みにより形成されたエピトープは、典型的にはタンパク質変性時に失われる。エピトープは、典型的には少なくとも３つ、より一般的には少なくとも５つ又は８～１０個の独自の空間的な立体構造のアミノ酸を含む。本明細書で説明されているエピトープを、このエピトープを形成する特定のアミノ酸まで定義する必要はない。一部の態様では、エピトープをポリペプチド抗原のペプチドサブユニットへの結合の調査により同定し得るか、又は一群の抗原特異性抗体による抗原への競合結合を調査することにより同定し得る。
「対象」、又は「個体」、又は「動物」、又は「患者」、又は「哺乳類」が意味するのは、診断、予後又は治療が所望されるあらゆる対象（特に哺乳類対象）である。哺乳類対象として、ヒト、家畜、農業動物、競技動物及び動物園動物、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、クマ等が挙げられる。
「組成物」及び「医薬組成物」という用語は、活性成分の生物学的活性が有効であることを可能にするような形態であり且つ組成物が投与されるであろう対象が許容できないほど毒性の追加成分を含まない製剤を指す。そのような組成物は、無菌であり得る。
本明細書で使用される場合、「有効な量」及び「治療上有効な量」という用語は、対象の疼痛を処置するか又は制御するのに有効である、１種又は複数の治療用組成物の量を指す。「疼痛を処置する」、「疼痛を制御する」という用語及び文法上の均等物は、本明細書では、疼痛の制御を必要とする対象での任意の有益な又は所望の効果を説明するために使用される。例えば、本明細書で説明されている１種又は複数の治療用組成物の有効な量により、例えば対象の疼痛を予防し得、疼痛の許容可能なレベルを維持し得、疼痛を寛解させ得、疼痛を軽減し得、疼痛を最小限に抑え得、且つ／又は疼痛を除去し得る。特に、「疼痛を処置する」、「疼痛を制御する」という用語及び文法上の均等物は、本明細書では、疼痛の軽減及び／又は疼痛の予防を説明するために使用される。
「投与する」という用語は、本明細書で使用される場合、本明細書で説明されている１種又は複数の治療用組成物（例えば、ＧＮＦアンタゴニストドメインとＴＮＦαアンタゴニストドメインとを含む二機能性ポリペプチド）を対象に投与することを指す。「共投与する」という用語は、２種以上の治療用組成物を対象に投与することを指す。本明細書で使用される場合、共投与するは、２種以上の治療用組成物を対象に同時に投与することを含むが、この投与である必要はない。２種以上の治療用組成物は、例えば、３０分間隔、１時間間隔、２時間間隔、３時間間隔、４時間間隔又は５時間以上の間隔で順次対象に投与され得る。本明細書で説明されている共投与の順序及びタイミングは、固定され得るか、又は医療専門家の判断に基づいて変更され得る。
「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、共有結合的に連結されたヌクレオチド残基で構成された高分子化合物を指す。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、一本鎖若しくは二本鎖、ベクター、プラスミド、ファージ又はウイルスであり得る。
「ベクター」という用語は、宿主細胞で１種又は複数の目的の遺伝子又は配列を送達可能且つ発現可能である構築物を意味する。ベクターの例として下記が挙げられるが、これらに限定されない：ウイルスベクター、ネイキッドＤＮＡ又はＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミド又はファージベクター、カチオン性縮合剤に会合したＤＮＡ又はＲＮＡ発現ベクター、リポソームに封入されたＤＮＡ又はＲＮＡ発現ベクター及びプロデューサー細胞等の特定の真核細胞。
「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は、本明細書では、あらゆる長さのアミノ酸のポリマーに言及するために互換的に使用される。ポリマーは、線状又は分枝状であり得、改変アミノ酸を含み得、且つ非アミノ酸により中断され得る。この用語は、天然に改変されているか又は介入により改変されているアミノ酸ポリマーも包含し、例えばジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質付加、アセチル化、リン酸化又は任意の他の操作若しくは改変、例えば標識成分とのコンジュゲーションにより改変されているアミノ酸ポリマーも包含する。この定義には、例えば、アミノ酸（例えば、非天然アミノ酸等）の１種又は複数の類似体を含むポリペプチド及び当技術分野で既知の他の改変も含まれる。
「保存的アミノ酸置換」とは、あるアミノ酸残基が、同様の側鎖を有する別のアミノ酸残基に置き換えられることである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリは、当技術分野で定義されており、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分枝側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。例えば、フェニルアラニンのチロシンとの置換は、保存的置換である。特定の態様では、本明細書で提供されるポリペプチド及び抗体の配列における保存的置換により、このアミノ酸配列を含むポリペプチドの結合活性又は他の機能的活性は抑制されない。機能に影響を及ぼさないヌクレオチド及びアミノ酸の保存的置換を同定する方法は、当技術分野で公知である（例えば、Ｂｒｕｍｍｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：１１８０－１１８７（１９９３）；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１２：８７９－８８４（１９９９）；及びＢｕｒｋｓ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：．４１２－４１７（１９９７）を参照されたい）。
ＮＧＦアンタゴニストドメインとＴＮＦαアンタゴニストドメインとを含む結合分子
本開示は、（例えば、本明細書で開示されている投与レジメンのいずれかによる）本明細書で開示されている方法のいずれかでの使用のための、ＮＧＦアンタゴニストドメインとＴＮＦαアンタゴニストドメインとを含む二機能性ポリペプチドを提供する。特定の態様では、本明細書で提供される二機能性ポリペプチドの有効な量の投与は、それを必要とする対象において、単独で投与されるＮＧＦアンタゴニスト又はＴＮＦαアンタゴニストの等量と比べて有効に疼痛を制御し得る。本明細書で提供される二機能性ポリペプチドは、任意の順序、構造又は立体構造でＮＧＦアンタゴニストドメインとＴＮＦαアンタゴニストドメインとを含み得る。任意の好適なＮＧＦアンタゴニスト又はＴＮＦαアンタゴニストは、本明細書で提供される二機能性ポリペプチドの一部であり得る。例示的なＮＧＦアンタゴニスト及びＴＮＦαアンタゴニストが、本開示で説明されている。
特定の態様では、ＮＧＦアンタゴニストは、抗ＮＧＦ抗体又はその抗原結合断片である。特定の態様では、本明細書で提供される二機能性分子（例えば、多重特異性結合分子）での使用のための抗ＮＧＦアンタゴニスト（例えば、アンタゴニスト抗体又はその断片）は、ｐ７５ＮＲＴへのＮＧＦの結合よりもＴｒｋＡへのＮＧＦの結合を優先的にブロックし得る。
二機能性ポリペプチド（例えば、本明細書で開示されている多重特異性結合分子）での使用のための例示的な抗体又はその断片は、全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００８／０１０７６５８号明細書で入手可能である。特定の態様では、抗ＮＧＦ抗体又はその断片は、抗ＮＧＦ抗体ＭＥＤＩ－５７８と比べて高い親和性でＮＧＦと同一のエピトープに結合するか、ＮＧＦを競合的に阻害し得るか又はＮＧＦに結合し得る。特定の実施形態では、抗ＮＧＦ抗体又はその断片は、１、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３又は０．２ｎＭ未満の親和性でヒトＮＧＦ及び／又はラットＮＧＦに結合する。例えば、抗ＮＧＦ抗体又はその断片は、約０．２～０．８、０．２～０．７、０．２～０６、０．２～０．５及び／又は０．２５～０．４４ｎＭの親和性でヒトＮＧＦに結合し得、且つ約０．２～０．９、０．２～０．８及び／又は０．２５～０．７０ｎＭの親和性でラットＮＧＦに結合し得る。
特定の態様では、抗ＮＧＦ抗体又はその断片は、ＭＥＤＩ－５７８である。ＭＥＤＩ－５７８は、米国特許出願公開第２００８／０１０７６５８号明細書においてクローン１２５２Ａ５として開示されている。他の態様では、抗ＮＧＦ抗体又はその断片は、下記である：タネズマブ（ＲＮ－６２４）、ヒト化抗ＮＧＦ ｍＡｂ（Ｐｆｉｚｅｒ；Ｋｉｖｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，（２０１３）ＰＡＩＮ，１５４，９，１６０３－１６１で説明されている）、フルラヌマブ、完全ヒト抗ＮＧＦ ｍＡｂ（Ａｍｇｅｎ；Ｓａｎｇａ ｅｔ ａｌ．，ＰＡＩＮ，Ｖｏｌｕｍｅ １５４，Ｉｓｓｕｅ １０，Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１３，Ｐａｇｅｓ １９１０－１９１９で説明されている）；ＲＥＧＮ４７５／ＳＡＲ１６４８７７、完全ヒト抗ＮＧＦ ｍＡｂ（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ／Ｓａｎａｆｉ－Ａｖｅｎｔｉｓ）；ＡＢＴ－１１０（ＰＧ１１０）、ヒト化抗ＮＧＦ ｍＡｂ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）；ファシヌマブ、ヒト抗ＮＧＦ ｍＡｂ（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ，米国特許出願公開第２００９／００４１７１７号明細書においてクローンＲＥＧＮ４７５として開示されている）。二機能性ポリペプチド（例えば、本明細書で提供される多重特異性結合分子）に含まれる抗ＮＧＦ抗体又はその断片は、例えば、ヒト化され得るか、キメラであるか、霊長類化され得るか又は完全ヒトであり得る。
特定の態様では、抗ＮＧＦ抗体又はその断片は、ＭＥＤＩ－５７８のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３の各ドメインを含む抗体ＶＨドメイン、最大で１、２、３、４、５つ又はより多くのアミノ酸置換（例えば保存的アミノ酸置換）を有するＭＥＤＩ－５７８重鎖ＣＤＲのバリアントを含む。例えば、抗ＮＧＦ抗体又はその断片は、配列番号４の正確なアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１を含み得るか、又は１つ若しくは複数（例えば、１、２、３、４、５つ若しくはより多く）のアミノ酸置換を有する配列番号４のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１を含み得る。同様に、抗ＮＧＦ抗体又はその断片は、配列番号５の正確なアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２を含み得るか、又は１つ若しくは複数（例えば、１、２、３、４、５つ若しくはより多く）のアミノ酸置換を有する配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２を含み得る。同様に、抗ＮＧＦ抗体又はその断片は、配列番号６の正確なアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３を含み得るか、又は１つ若しくは複数（例えば、１、２、３、４、５つ若しくはより多く）のアミノ酸置換を有する配列番号６のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３を含み得る。特定の態様では、ＨＣＤＲ３は、アミノ酸配列ＳＳＲＩＹＤＦＮＳＡＬＩＳＹＹＤＭＤＶ（配列番号１１）又はＳＳＲＩＹＤＭＩＳＳＬＱＰＹＹＤＭＤＶ（配列番号１２）を含み得る。
特定の態様では、抗ＮＧＦ抗体又はその断片は、ＭＥＤＩ－５７８のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３の各ドメインを含む抗体ＶＬドメイン、最大で１、２、３、４、５つ又はより多くのアミノ酸置換（例えば保存的アミノ酸置換）を有するＭＥＤＩ－５７８軽鎖ＣＤＲのバリアントを含む。特定の態様では、抗ＮＧＦ抗体又はその断片は、配列番号８の正確なアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１を含み得るか、又は１つ若しくは複数（例えば、１、２、３、４、５つ若しくはより多く）のアミノ酸置換を有する配列番号８のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１を含み得る。同様に、抗ＮＧＦ抗体又はその断片は、配列番号９の正確なアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２を含み得るか、又は１つ若しくは複数（例えば、１、２、３、４、５つ若しくはより多く）のアミノ酸置換を有する配列番号９のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２を含み得る。同様に、抗ＮＧＦ抗体又はその断片は、配列番号１０の正確なアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２を含み得るか、又は１つ若しくは複数（例えば、１、２、３、４、５つ若しくはより多く）のアミノ酸置換を有する配列番号１０のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２を含み得る。
特定の態様では、抗ＮＧＦ抗体又はその断片は、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のＶＨアミノ酸配列を含む抗体ＶＨドメインを含む。一部の態様では、抗ＮＧＦ抗体又はその断片は、配列番号３のＶＨアミノ酸配列を含む抗体ＶＨドメインを含む。
特定の態様では、抗ＮＧＦ抗体又はその断片は、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のＶＬアミノ酸配列を含む抗体ＶＬドメインを含む。一部の態様では、抗ＮＧＦ抗体又はその断片は、配列番号７のＶＬアミノ酸配列を含む抗体ＶＬドメインを含む。
特定の態様では、抗ＮＧＦ抗体又はその断片は、配列番号９４のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のＶＨアミノ酸配列を含む抗体ＶＨドメインを含む。一部の態様では、抗ＮＧＦ抗体又はその断片は、配列番号９４のＶＨアミノ酸配列を含む抗体ＶＨドメインを含む。
特定の態様では、抗ＮＧＦ抗体又はその断片は、配列番号９５のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のＶＬアミノ酸配列を含む抗体ＶＬドメインを含む。一部の態様では、抗ＮＧＦ抗体又はその断片は、配列番号９５のＶＬアミノ酸配列を含む抗体ＶＬドメインを含む。
特定の態様では、抗ＮＧＦ抗体又はその断片は、配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６及び９６のいずれか１つのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３の各ドメインを含むか、又は最大で１、２、３、４、５つ若しくはより多くのアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）を有するこれらのバリアントを含む抗体ＶＨドメインを含む。
特定の態様では、抗ＮＧＦ抗体又はその断片は、配列番号３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７及び９７のいずれか１つのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３の各ドメインを含むか、又は最大で１、２、３、４、５つ若しくはより多くのアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）を有するこれらのバリアントを含む抗体ＶＬドメインを含む。
特定の態様では、抗ＮＧＦ抗体又はその断片は、配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６及び９６のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のＶＨアミノ酸配列を含む抗体ＶＨドメインを含む。一部の態様では、抗ＮＧＦ抗体又はその断片は、配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６及び９６のいずれか１つのＶＨアミノ酸配列を含む抗体ＶＨドメインを含む。
特定の態様では、抗ＮＧＦ抗体又はその断片は、配列番号３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７及び９７のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のＶＬアミノ酸配列を含む抗体ＶＬドメインを含む。一部の態様では、抗ＮＧＦ抗体又はその断片は、配列番号３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７及び９７のいずれか１つのＶＬアミノ酸配列を含む抗体ＶＬドメインを含む。
特定の態様では、抗ＮＧＦ抗体又はその断片は、ＮＧＦ－ＮＧのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３の各ドメインを含む抗体ＶＨドメイン、最大で１、２、３、４、５つ又はより多くのアミノ酸置換（例えば保存的アミノ酸置換）を有するＮＧＦ－ＮＧ重鎖ＣＤＲのバリアントを含む。例えば、抗ＮＧＦ抗体又はその断片は、配列番号８８の正確なアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１を含み得るか、又は１つ若しくは複数（例えば、１、２、３、４、５つ若しくはより多く）のアミノ酸置換を有する配列番号８８のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１を含み得る。同様に、抗ＮＧＦ抗体又はその断片は、配列番号８９の正確なアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２を含み得るか、又は１つ若しくは複数（例えば、１、２、３、４、５つ若しくはより多く）のアミノ酸置換を有する配列番号８９のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２を含み得る。同様に、抗ＮＧＦ抗体又はその断片は、配列番号９０の正確なアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３を含み得るか、又は１つ若しくは複数（例えば、１、２、３、４、５つ若しくはより多く）のアミノ酸置換を有する配列番号９０のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３を含み得る。
特定の態様では、抗ＮＧＦ抗体又はその断片は、ＮＧＦ－ＮＧのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３の各ドメインを含む抗体ＶＬドメイン、最大で１、２、３、４、５つ又はより多くのアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）を有するＮＧＦ－ＮＧ軽鎖ＣＤＲのバリアントを含む。特定の態様では、抗ＮＧＦ抗体又はその断片は、配列番号９１の正確なアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１を含み得るか、又は１つ若しくは複数（例えば、１、２、３、４、５つ若しくはより多く）のアミノ酸置換を有する配列番号９１のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１を含み得る。同様に、抗ＮＧＦ抗体又はその断片は、配列番号９２の正確なアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２を含み得るか、又は１つ若しくは複数（例えば、１、２、３、４、５つ若しくはより多く）のアミノ酸置換を有する配列番号９２のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２を含み得る。同様に、抗ＮＧＦ抗体又はその断片は、配列番号９３の正確なアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３を含み得るか、又は１つ若しくは複数（例えば、１、２、３、４、５つ若しくはより多く）のアミノ酸置換を有する配列番号９３のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３を含み得る。
特定の態様では、抗ＮＧＦ抗体又はその断片は、配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のＶＨアミノ酸配列を含む抗体ＶＨドメインを含む。一部の態様では、抗ＮＧＦ抗体又はその断片は、配列番号２４のＶＨアミノ酸配列を含む抗体ＶＨドメインを含む。
特定の態様では、抗ＮＧＦ抗体又はその断片は、配列番号２６のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のＶＬアミノ酸配列を含む抗体ＶＬドメインを含む。一部の態様では、抗ＮＧＦ抗体又はその断片は、配列番号２６のＶＬアミノ酸配列を含む抗体ＶＬドメインを含む。
多機能性ポリペプチド（例えば、本開示により提供される多重特異性結合分子）は、完全抗ＮＧＦ抗体を含み得、即ちＨ２Ｌ２フォーマットで２本の完全重鎖及び２本の完全軽鎖を含む抗体を含み得る。抗ＮＧＦ抗体が完全抗体である場合、１つ又は複数のＴＮＦαアンタゴニストドメインをこの抗ＮＧＦ抗体の１本若しくは複数本の重鎖のＮ末端若しくはＣ末端に融合させ得るか、又はこの抗ＮＧＦ抗体の１本若しくは複数本の軽鎖のＮ末端若しくはＣ末端に融合させ得る。代わりに、多機能性ポリペプチド（例えば、本開示により提供される多重特異性結合分子）は、抗ＮＧＦ抗体の抗原結合断片を含み得る。ある態様では、抗ＮＧＦ抗体断片は、この抗体の定常ドメインの任意の部分を含み得るか又は可変ドメインのみを含み得る。二機能性ポリペプチド（例えば多重特異性結合分子）に含まれる例示的な抗ＮＧＦ抗体断片として下記が挙げられるが、これらに限定されない：Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）２断片又は一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片。
本明細書で提供される特定の例示的な組成物では、抗ＮＧＦ抗体は、ｓｃＦｖ断片（例えば、ＭＥＤＩ－５７８のｓｃＦｖ断片）又はそのＮＧＦ結合バリアントである。本明細書で提供される特定の例示的な組成物では、抗ＮＧＦ抗体は、ｓｃＦｖ断片（例えば、ＮＧＦ－ＮＧのｓｃＦｖ断片）又はそのＮＧＦ結合バリアントである。抗ＮＧＦ ｓｃＦｖポリペプチドは、Ｎ－ＶＨ－ＶＬ－Ｃ又はＮ－ＶＬ－ＶＨ－Ｃのいずれかの任意の順序でＶＨ及びＶＬの各ドメインを含み得る。ｓｃＦｖ分子は、典型的には、ＶＨ及びＶＬの各ドメインがフレキシブルなリンカーを介して接続されるように操作されている。様々なリンカーを含む例示的なｓｃＦｖ構造は、Ｄｉｍａｓｉ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．３９３：６７２－９２（２００９）及びＰＣＴ公開国際公開第２０１３／０７０５６５号パンフレットに見出され得、これらの両方は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。当業者により理解されるように、ｓｃＦｖ断片は、標準的なＦａｂ立体構造で存在する可変ドメインと比較して安定性が低下している可能性がある。一部の態様では、安定化変異を導入するか又は鎖間ジスルフィド結合を導入することにより、ｓｃＦｖを構造的に安定化させ得る（例えば、ＳＳ－安定化）。しかしながら、安定化変異及び／又は鎖間ジスルフィド結合の導入は、必須ではなく、特定の態様では存在しない。当技術分野で認識されている多くの方法を利用して、ｓｃＦｖポリペプチドを安定化させ得る。
リンカーを使用して、本明細書で提供される二機能性ポリペプチドのドメイン／領域を連結し得る。リンカーを使用して、二機能性分子のＮＧＦアンタゴニストドメイン及びＴＮＦαアンタゴニストドメインを接続し得、且つｓｃＦｖの可変重鎖及び可変軽鎖も相互に接続し得る。リンカーの例示的且つ非限定的な例は、少なくとも４つの残基を含むポリペプチド鎖である。そのようなリンカーの一部は、フレキシブルであり得、親水性であり得、更にそれ自体の二次構造（リンカー部分又はフレキシブルなリンカー部分）を殆ど有し得ないか又は全く有し得ない。少なくとも４つのアミノ酸のリンカーを使用して、二機能性ポリペプチド分子が集合した後、近傍に位置するドメイン及び／又は領域を相互に連結させ得る。より長いリンカーも使用し得る。そのため、リンカーは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５又は５０個の残基であり得る。リンカーは、例えば、約１００～１７５個の残基でもあり得る。複数のリンカーを使用して二機能性ポリペプチド分子の一部を相互に連結する場合、これらのリンカーは、同じであるか又は異なり得る（例えば、同じ又は異なる長さ及び／又はアミノ酸配列）。
二機能性ポリペプチド分子中のリンカーは、所望の構造の形成を容易にする。リンカーは、（Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）ｎ残基（式中、ｎは、少なくとも１、２及び最大で例えば３、４、５、６、１０、２０、５０、１００又はより大きい整数である）を含み得、溶解度を上昇させるために、いくつかのＧｌｕ又はＬｙｓ残基が全体的に分散されている。代わりに、特定のリンカーは、例えば、このリンカーがＯ－結合グリコシル化を受ける場合、セリン残基を全く含まない。一部の態様では、例えばリンカーの２量体化を使用して、二機能性ポリペプチドのドメインをこのドメインが適切に折りたたまれた構造にする場合、このリンカーは、システイン残基を含み得る。一部の態様では、二機能性ポリペプチドは、このポリペプチドのドメインを連結する少なくとも１、２、３、４又はより多くのポリペプチドリンカーを含み得る。
一部の態様では、ポリペプチドリンカーは、１～５０個の残基、１～２５個の残基、２５～５０個の残基又は３０～５０個の残基を含み得る。一部の態様では、ポリペプチドリンカーは、Ｆｃ部分の一部を含み得る。例えば、一部の態様では、ポリペプチドリンカーは、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体及び／若しくはＩｇＧ４抗体の免疫グロブリンヒンジドメイン又はそのバリアントの一部を含み得る。
一部の態様では、ポリペプチドリンカーは、ｇｌｙ－ｓｅｒリンカーを含み得るか又はｇｌｙ－ｓｅｒリンカーからなり得る。本明細書で使用される場合、「ｇｌｙ－ｓｅｒリンカー」という用語は、グリシン残基及びセリン残基からなるペプチドを指す。例示的なｇｌｙ－ｓｅｒリンカーは、式（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎは、少なくとも１、２及び最大で例えば３、４、５、６、１０、２０、５０、１００又はより大きい整数である）のアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ポリペプチドリンカーは、ヒンジ領域（例えば、ＩｇＧ１分子、ＩｇＧ２分子、ＩｇＧ３分子又はＩｇＧ４分子に由来する）の少なくとも一部及び一連のｇｌｙ－ｓｅｒアミノ酸残基（例えば、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ等のｇｌｙ－ｓｅｒリンカー）を含み得る。
多機能性ポリペプチド（例えば、多重特異性結合分子）がｓｃＦｖを含む場合、フレキシブルなリンカーは、ｓｃＦｖの重鎖及び軽鎖を接続し得る。このフレキシブルなリンカーは、一般にはヒンジ部分を含まず、むしろｇｌｙ－ｓｅｒリンカー又は他のフレキシブルなリンカーである。ｓｃＦｖのドメインを相互に接続するフレキシブルなリンカーの長さ及びアミノ酸配列を容易に選択して最適化し得る。
特定の態様では、多機能性ポリペプチド（例えば多重特異性結合分子）は、抗ＮＧＦ ｓｃＦｖ断片であって、Ｎ末端からＣ末端に、ＶＨ、１５個のアミノ酸のリンカー配列（ＧＧＧＧＳ）３及びＶＬを含む抗ＮＧＦ ｓｃＦｖ断片を含み得る。特定の実施形態では、ｓｃＦｖのＶＨ及びＶＬを連結するリンカーは、２０個のアミノ酸のリンカー配列（ＧＧＧＧＳ）４である。特定の態様では、ＶＨは、配列番号３のアミノ酸配列を含む。特定の態様では、ＶＬは、配列番号７のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、ＶＨは、配列番号２４、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、９４及び９６のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、ＶＬは、配列番号２６、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、９５及び９７のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。特定の態様では、ＶＨドメインは、配列番号３、２４、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、９４及び９６のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のアミノ酸配列を含む。特定の態様では、ＶＬドメインは、配列番号７、２６、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、９５及び９７のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のアミノ酸配列を含む。
他の態様では、ポリペプチドの安定性は、ＶＨ及びＶＬの各ドメイン内の特定の残基をシステイン残基に改変することによるＶＨドメインとＶＬドメインとの間での鎖間ジスルフィド結合の付加により改善され得る。例えば、Ｍｉｃｈａｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（２００９）ＭＡｂｓ １，１２８－４１；Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ，Ｕ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０，７５３８－４２；Ｙｏｕｎｇ，Ｎ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９５）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ３７７，１３５－９を参照されたい。例えば、ＶＬ（例えば配列番号７）の１０２、１０３又は１０４位でのグリシン残基をシステイン残基に改変し得、ＶＨ（例えば配列番号３）の４４位でのグリシン残基をシステイン残基に改変し得る。一部の実施形態では、配列番号７の１０２、１０３又は１０４位に対応するアミノ酸位置のグリシン残基は、システイン残基に改変されている。一部の実施形態では、配列番号３の４４位に対応するアミノ酸位置のグリシン残基は、システイン残基に改変されている。
多機能性ポリペプチド（例えば、本明細書で提供される多重特異性結合分子）は、ＴＮＦαアンタゴニストドメインを含む。特定の態様では、ＴＮＦαアンタゴニストドメインは、細胞の表面上のＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）へのＴＮＦαの結合を阻害し得、それによりＴＮＦ活性がブロックされる。
特定の態様では、ＴＮＦαアンタゴニストは、ＴＮＦ受容体（例えば、ＴＮＦＲ－１若しくはＴＮＦＲ－２）のＴＮＦα結合可溶性断片、又はそのバリアント、又はその可溶性断片である。特定の態様では、ＴＮＦＲ－１の可溶性断片は、５５ｋＤ断片である。特定の実施形態では、ＴＮＦＲ－２の可溶性断片は、７５ｋＤ断片である。特定の態様では、ＴＮＦ受容体断片は、異種ポリペプチドに融合しており、例えば、免疫グロブリンＦｃ断片に融合しており、例えばＩｇＧ１ Ｆｃドメインに融合している。特定の態様では、ＴＮＦαアンタゴニストは、配列番号１３に記載されているアミノ酸又はそのＴＮＦα結合断片を含む。ＴＮＦＲ－２部分は、配列番号１３のアミノ酸１～２３５を含む。特定の態様では、ＴＮＦＲ－２のＴＮＦα結合可溶性断片のバリアントは、配列番号１３のアミノ酸１～２３５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。特定の態様では、ＴＮＦＲ－２のＴＮＦα結合可溶性断片のバリアントは、例えば、１、２、３、４、５、１０、２０、２０、４０又は５０個のアミノ酸の挿入、置換又は欠失を除いて、配列番号１３のアミノ酸１～２３５を含む。ＩｇＧ１ Ｆｃ部分は、配列番号１３のアミノ酸２３６～４６７を含む。特定の態様では、ＴＮＦＲ－２のＴＮＦα結合可溶性断片を任意のヒト抗体若しくは非ヒト抗体のＦＣ部分と融合させ得るか、又は安定性をもたらすであろう任意の他のタンパク質若しくは非タンパク質物質（例えば、アルブミン若しくはポリエチレングリコール）と融合させ得る。特定の態様では、ＴＮＦＲ－２のＴＮＦα結合可溶性断片のバリアントは、配列番号１３のアミノ酸２３６～４６７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。特定の態様では、ＴＮＦＲ－２のＴＮＦα結合可溶性断片のバリアントは、例えば、１、２、３、４、５、１０、２０、２０、４０又は５０個のアミノ酸の挿入、置換又は欠失を除いて、配列番号１３のアミノ酸２３６～４６７を含む。特定の態様では、ＴＮＦＲ－２のＴＮＦα結合可溶性断片のバリアントは、配列番号１３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。特定の態様では、ＴＮＦＲ－２のＴＮＦα結合可溶性断片のバリアントは、例えば、１、２、３、４、５、１０、２０、２０、４０又は５０個のアミノ酸の挿入、置換又は欠失を除いて、配列番号１３を含む。
特定の態様では、ＴＮＦＲ－２のＴＮＦα結合可溶性断片は、一本鎖融合タンパク質である。特定の態様では、ＴＮＦＲ－２のＴＮＦα結合可溶性断片は、例えば、２つのＦｃドメイン間のジスルフィド結合を介して会合した２種の融合タンパク質の二量体である。
多機能性ポリペプチド（例えば、本明細書で提供される多重特異性結合分子）は、様々な異なる構造及び立体構造を有し得る。一態様では、本明細書で提供される多機能性ポリペプチドは、融合タンパク質であって、上記で説明されているＮＧＦアンタゴニストドメインが、フレキシブルなリンカーを介して、上記で説明されているＴＮＦαアンタゴニストドメインに融合されている、融合タンパク質を含む。リンカーの例は、本明細書の他の箇所で説明されている。特定の態様では、多機能性ポリペプチドは、融合タンパク質のホモ二量体を含む。
例示的な態様では、多機能性ポリペプチドであって、ＮＧＦアンタゴニストが、例えばＭＥＤＩ－５７８に由来する抗ＮＧＦ ｓｃＦｖドメインであり、ＴＮＦαアンタゴニストが、カルボキシ末端で免疫グロブリンＦｃドメインに融合しているＴＮＦＲ－２の可溶性のＴＮＦα結合断片である、多機能性ポリペプチドが提供される。一部の態様では、抗ＮＧＦ ｓｃＦｖを、リンカーを介して免疫グロブリンＦｃドメインのカルボキシ末端と融合させ得る。特定の態様では、この多機能性ポリペプチドの単量体は、ホモ二量体であって、各サブユニットが、Ｎ末端からＣ末端に、ＴＮＦＲ－２のＴＮＦα結合７５ｋＤ断片、ヒトＩｇＧ１Ｆｃドメイン、１０個のアミノ酸のリンカー（ＧＧＧＧＳ）２（配列番号９８）、配列番号３のアミノ酸配列を含む抗ＮＧＦ ＶＨ、１５個のアミノ酸のリンカー配列（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号１５）及び配列番号７のアミノ酸配列を含む抗ＮＧＦ ＶＬを含む、ホモ二量体を形成する。一態様では、多機能性ポリペプチドは、配列番号１４のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドのホモ二量体を含むＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４である。一部の態様では、多機能性ポリペプチドは、配列番号１４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ鎖配列を含む融合ポリペプチドのホモ二量体を含む。
別の例示的な態様では、多機能性ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、ＴＮＦＲ－２のＴＮＦα結合７５ｋＤ断片、ヒトＩｇＧ１Ｆｃドメイン、１０個のアミノ酸のリンカー（ＧＧＧＧＳ）２（配列番号９８）、配列番号９４のアミノ酸配列を含む抗ＮＧＦ ＶＨ、２０個のアミノ酸のリンカー配列（ＧＧＧＧＳ）４（配列番号１９）、配列番号９５のアミノ酸配列を含む抗ＮＧＦ ＶＬを含む。一部の実施形態では、結合分子は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号１３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＴＮＦＲ－２のＴＮＦα結合７５ｋＤ断片、ヒトＩｇＧ１Ｆｃドメイン、１０個のアミノ酸のリンカー（ＧＧＧＧＳ）２（配列番号９８）、配列番号９４のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含む抗ＮＧＦ ＶＨ、２０個のアミノ酸のリンカー配列（ＧＧＧＧＳ）４（配列番号１９）及び配列番号９５のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含む抗ＮＧＦ ＶＬを含む。一部の態様では、多機能性ポリペプチドは、配列番号１７のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドのホモ二量体を含むＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢである。一部の態様では、多機能性ポリペプチドは、配列番号１７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドのホモ二量体を含む。
ポリヌクレオチド、ベクター及び宿主細胞
本開示は、本明細書で開示されている方法のいずれか（及び例えば本明細書で開示されている投与レジメンのいずれか）での使用のための、本明細書で開示されている結合分子のいずれかをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子を提供する。本開示は、ＮＧＦアンタゴニスト及びＴＮＦαアンタゴニストをそれぞれ含む個々のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子を更に提供する。特定の態様では、そのようなポリヌクレオチドは、ＮＧＦ又はその断片に特異的に結合し、ＴＮＦα又はその断片にも特異的に結合するペプチドドメインをコードする。例えば、本開示は、抗ＮＧＦ抗体又はその抗原結合断片を含むポリペプチドドメインと、ＴＮＦαアンタゴニスト（例えば、抗ＴＮＦα抗体若しくはその抗原結合断片又はＴＮＦ受容体（例えばＴＮＦＲ２）の可溶性のＴＮＦα結合部分）を含むポリペプチドドメインとをコードするポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形態又はＤＮＡの形態であり得る。ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ及び合成ＤＮＡが含まれ；且つ二本鎖又は一本鎖であり得、一本鎖の場合、コード鎖又は非コード鎖（アンチセンス鎖）であり得る。
一部の実施形態では、本明細書で説明されている多機能性ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドは、配列番号１６、１８若しくは９９のヌクレオチド配列又はその断片を含むか、又は配列番号１６、１８若しくは９９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一の配列又はその断片を含む。
本明細書で説明されている単離ポリペプチドは、当技術分野で既知の任意の好適な方法によって作製され得る。そのような方法は、直接的なタンパク質合成方法から、単離ポリペプチド配列をコードするＤＮＡ配列を構築し、この配列を好適な形質転換宿主中で発現させることまで様々である。一部の態様では、ＤＮＡ配列を、ＮＧＦアンタゴニストドメインと、ＴＮＦαアンタゴニストドメインとを含む多機能性ポリペプチドをコードするか又はＮＧＦアンタゴニストドメイン及びＴＮＲアンタゴニストドメインをそれぞれ含む個々のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を単離するか又は合成することにより、組換え技術を使用して構築する。従って、本開示は、上記で詳述されているＮＧＦアンタゴニストドメインとＴＮＦαアンタゴニストドメインとを含む二機能性ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。更に提供されるのは、ＮＧＦアンタゴニストドメイン及びＴＮＦαアンタゴニストドメインをそれぞれ含む個々のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドである。
一部の態様では、多機能性ポリペプチド（例えば、目的の多重特異性結合分子又はＮＧＦアンタゴニストドメイン及びＴＮＦαアンタゴニストドメインをそれぞれ含む個々のポリペプチド）をコードするＤＮＡ配列を、オリゴヌクレオチド合成機を使用する化学合成により構築し得る。そのようなオリゴヌクレオチドを、所望の多機能性ポリペプチドのアミノ酸配列及び目的の組換えポリペプチドが産生される宿主細胞において有利なコドンの選択に基づいて設計し得る。標準方法を適用して、目的の多機能性ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド配列を合成し得る。例えば、完全なアミノ酸配列を使用して、逆翻訳遺伝子を構築し得る。更に、特定の多機能性ポリペプチド又は個々のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡオリゴマーを合成し得る。例えば、所望のポリペプチドの一部分をコードする幾つかの小さいオリゴヌクレオチドを合成し、次にライゲートし得る。個々のオリゴヌクレオチドは、典型的には、相補的構築のために５’又は３’オーバーハングを含む。
特定の態様では、本明細書で提供されるポリヌクレオチドは、例えば、コードされたポリペプチドの精製を可能にするマーカー配列に同一のリーディングフレームで融合した成熟ポリペプチドのコード配列を含み得る。例えば、マーカー配列は、ｐＱＥ－９ベクターにより供給されるヘキサヒスチジンタグであり得、それにより、細菌宿主の場合、マーカーと融合した成熟ポリペプチドの精製が可能となるか、又はマーカー配列は、哺乳類宿主（例えば、ＣＯＳ－７細胞）を使用する場合、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質に由来するヘマグルチニン（ＨＡ）タグであり得る。
本明細書で提供されるポリヌクレオチドは、コード領域、非コード領域又は両方での変更を更に含み得る。一部の態様では、ポリヌクレオチドバリアントは、サイレント置換、付加又は欠失を生じるが、コードされるポリペプチドの特性又は活性は変えない変更を含む。一部の態様では、ヌクレオチドバリアントを、遺伝子コードの縮重に起因するサイレント置換により作製する。多様な理由のため、例えば、特定の宿主のコドン発現を最適化する（ヒトｍＲＮＡ中のコドンを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）等の細菌宿主により優先されるものに変更する）ために、ポリヌクレオチドバリアントを作製し得る。
本明細書で説明されているポリヌクレオチドを含むベクター及び細胞も提供される。（合成、部位特異的変異誘発又は別の方法による）構築時、目的の特定の単離ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を発現ベクターに挿入し、所望の宿主中でのタンパク質発現に適した発現制御配列に作動的に作動可能に連結させ得る。本開示は、そのようなベクターを提供する。ヌクレオチド配列決定、制限マッピング及び好適な宿主中での生物学的に活性なポリペプチドの発現により、適切な構築を確認し得る。当技術分野で公知であるように、宿主における遺伝子導入遺伝子の高い発現レベルを達成するために、この遺伝子を、選択された発現宿主中で機能する転写及び翻訳発現制御配列に作動可能に連結しなければならない。
特定の態様では、組換え発現ベクターを使用して、ＮＧＦアンタゴニストドメインとＴＮＦαアンタゴニストドメインとを含む多機能性ポリペプチド（例えば多重特異性結合分子）をコードするか又はＮＧＦアンタゴニストドメイン及びＴＮＦαアンタゴニストドメインをそれぞれ含む個々のポリペプチドをコードするＤＮＡを増幅して発現させ得る。組換え発現ベクターは、哺乳類、微生物、ウイルス又は昆虫の遺伝子に由来する好適な転写又は翻訳調節エレメントに作動可能に連結された、多機能性ポリペプチドをコードするか又はＮＧＦアンタゴニストドメイン及びＴＮＦαアンタゴニストドメインをそれぞれ含む個々のポリペプチドをコードする合成又はｃＤＮＡ由来のＤＮＡ断片を有する複製可能なＤＮＡ構築物である。転写単位は、概して、下記で詳述するように、（１）遺伝子発現において調節的役割を有する１つ又は複数の遺伝エレメント、例えば転写プロモーター又はエンハンサーと、（２）ｍＲＮＡに転写され且つタンパク質に翻訳される構造又はコード配列と、（３）適切な転写及び翻訳開始及び終結配列との集合体を含む。そのような調節エレメントとして、転写を制御するオペレーター配列が挙げられ得る。一般に複製起点によって付与される宿主における複製能及び形質転換体の認識を促進する選択遺伝子が、更に組み込まれ得る。ＤＮＡ領域は、それらが機能上互いに関係している場合、作動可能に連結されている。例えば、シグナルペプチド（分泌リーダー）のＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与する前駆体として発現される場合、このポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結されており；プロモーターは、配列の転写を制御する場合、コード配列に作動可能に連結されており；又はリボソーム結合部位は、翻訳を可能にするような位置にある場合、コード配列に作動可能に連結されている。酵母発現系での使用が意図されている構造エレメントは、宿主細胞による翻訳タンパク質の細胞外分泌を可能にするリーダー配列を含む。代わりに、組換えタンパク質は、リーダー配列又は輸送配列なしに発現される場合、Ｎ末端メチオニン残基を含み得る。この残基は、その後、発現した組換えタンパク質から任意選択的に開裂されて、最終産物を提供し得る。
発現制御配列及び発現ベクターの選択は、宿主の選択に依存するであろう。多種多様な発現宿主／ベクターの組合せが利用可能である。真核宿主に有用な発現ベクターとして、例えば、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルス、アデノウイルス及びサイトメガロウイルスに由来する発現制御配列を含むベクターが挙げられる。細菌宿主に有用な発現ベクターとして、既知の細菌プラスミドが挙げられ、例えば、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９等の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のプラスミド及びこれらの誘導体、より広範な宿主プラスミド、例えば、Ｍ１３及び繊維状一本鎖ＤＮＡファージが挙げられる。
本開示は、本明細書で提供されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を更に提供する。本明細書で提供されるポリペプチドの発現に好適な宿主細胞として、適切なプロモーターの制御下にある、原核生物、酵母、昆虫又はより高等な真核細胞が挙げられる。原核生物として、グラム陰性生物又はグラム陽性生物が挙げられ、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）又は桿菌が挙げられる。高等真核細胞として、下記で説明されている哺乳類起源の確立された細胞系が挙げられる。無細胞翻訳系も利用し得る。細菌、真菌、酵母及び哺乳類の細胞宿主との使用に適切なクローニングベクター及び発現ベクターは、Ｐｏｕｗｅｌｓら（Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８５）で説明されており、この関連する開示は、参照により本明細書に組み込まれる。抗体作製を含むタンパク質作製の方法に関する追加情報は、例えば、米国特許出願公開第２００８／０１８７９５４号明細書、米国特許第６，４１３，７４６号明細書及び同第６，６６０，５０１号明細書並びに国際公開第０４００９８２３号パンフレット（それぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に見出され得る。
組換えタンパク質を発現させるために、様々な哺乳類又は昆虫の細胞培養系も有利に利用し得る。哺乳類細胞中での組換えタンパク質の発現を実施し得、なぜならば、そのようなタンパク質は概して正しく折り畳まれ、適切に改変され、且つ完全に機能するかである。好適な哺乳類宿主細胞株の例として、ＨＥＫ－２９３及びＨＥＫ－２９３Ｔ、Ｇｌｕｚｍａｎ（Ｃｅｌｌ ２３：１７５，１９８１）で説明されているサル腎細胞のＣＯＳ－７株並びに他の細胞株（例えば、Ｌ細胞、Ｃ１２７、３Ｔ３、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＨｅＬａ及びＢＨＫの細胞株）が挙げられる。哺乳類発現ベクターは、非転写エレメント、例えば複製起点、発現させる遺伝子に連結された好適なプロモーター及びエンハンサー、並びに他の５’又は３’フランキング非転写配列、並びに５’又は３’非翻訳配列、例えば必須リボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー及びアクセプター部位並びに転写終結配列を含み得る。昆虫細胞中での異種タンパク質の産生用のバキュロウイルス系は、Ｌｕｃｋｏｗ ａｎｄ Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：４７（１９８８）で概説されている。
本開示は、本明細書で説明されている多機能性ポリペプチドを製造するか又はＮＧＦアンタゴニスト及びＴＮＦαアンタゴニストをそれぞれ含む個々のポリペプチドを製造する方法を更に提供する。この方法は、多機能性ポリペプチド又は個々のポリペプチドの発現を促進する条件下において、上記で説明されている宿主細胞を培養することと、この多機能性ポリペプチド又は個々のポリペプチドを回収することとを伴う。
組換えタンパク質の長期的な高収率の産生のために、安定的発現が適切である。例えば、多機能性ポリペプチドを安定して発現する細胞株を操作し得る。ウイルス複製起点を含む発現ベクターを使用するのではなく、宿主細胞を、適切な発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位等）により制御されるＤＮＡ及び選択可能なマーカーで形質転換させ得る。外来性ＤＮＡの導入後、操作された細胞を強化培地で１～２日にわたって成長させ得、次いで選択培地に切り換える。組換えプラスミド中の選択可能なマーカーにより、選択に対する抵抗性が付与され、細胞がその染色体中にプラスミドを安定的に組み込むことが可能となり、且つ成長してフォーカスを形成することが可能となり、次いでこのフォーカスをクローニングして細胞株に拡大させ得る。この方法を使用して、多機能性ポリペプチドを発現する細胞株を操作し得る。
特定の実施形態では、本明細書で提示される多機能性ポリペプチドを、この多機能性ポリペプチドの一過性発現を呈する細胞株で発現させる。一過性遺伝子導入とは、細胞中に導入された核酸がこの細胞のゲノム中にも染色体ＤＮＡ中にも統合しないが、細胞中で染色体外エレメント（例えばエピソーム）として維持されるプロセスである。エピソームの核酸の転写プロセスは、影響を受けず、エピソームの核酸によりコードされるタンパク質が産生される。
安定的又は一過的に形質移入された細胞株を、ポリペプチドの発現及び産生をもたらす、当技術分野で既知の細胞培養培地及び条件下で維持する。特定の実施形態では、哺乳類細胞培養培地は、例えば、ＤＭＥＭ又はＨａｍ’ｓ Ｆ１２等の市販の培地製剤をベースとする。一部の実施形態では、細胞培養培地は、細胞成長及び生物学的タンパク質発現の両方の増加を支援するように改変されている。本明細書で使用される場合、「細胞培養培地」、「培養培地」及び「培地製剤」という用語は、多細胞生物又は組織以外の人工的インビトロ環境下での細胞の維持、成長、増殖又は拡大のための栄養液を指す。細胞培養培地は、例えば、細胞の成長を促進するように配合された細胞培養成長培地又は組換えタンパク質産生を促進するように配合された細胞培養産生培地を含め、特定の細胞培養用途に最適化され得る。栄養素、原料及び成分という用語は、細胞培養培地を構成する成分を指すために互換的に使用され得る。
様々な実施形態では、細胞株を、流加法を使用して維持する。本明細書で使用される場合、「流加法」は、初めに基礎培地でインキュベートした後、流加細胞培養物に更なる栄養素を供給する方法を指す。例えば、流加法は、所与の時間内に所定の補給スケジュールに従い補足培地を添加することを含み得る。そのため、「流加細胞培養」は、細胞（典型的には哺乳類）及び細胞培地を培養ベッセルに最初に供給し、追加の培養栄養素を培養中に培養物に継続的又は不連続的に増分して供給し、培養終了前の定期的な細胞及び／又は生成物回収を伴うか又は伴わない細胞培養を指す。
一部の実施形態では、細胞培養培地は、基礎培地及び改変基礎培地をもたらす少なくとも１種の加水分解物（例えば、ダイズベースの加水分解物、酵母ベースの加水分解物又はこれらの２つのタイプの加水分解物の組合せ）を含む。追加の栄養素は、濃縮基礎培地等の基礎培地のみを含み得ることもあり得るか、又は加水分解物若しくは濃縮加水分解物のみを含み得る。好適な基礎培地として下記が挙げられるが、これらに限定されない：ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＤＭＥ／Ｆ１２、最小必須培地（ＭＥＭ）、イーグル基礎培地（ＢＭＥ）、ＲＰＭＩ １６４０、Ｆ－１０、Ｆ－１２、α－最小必須培地（α－ＭＥＭ）、グラスゴー最小必須培地（Ｇ－ＭＥＭ）、ＰＦ ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯタンパク質不含培地（Ｓｉｇｍａ）又はＣＨＯ細胞タンパク質不含用のＥＸ－ＣＥＬＬ（商標）３２５ ＰＦ ＣＨＯ無血清培地（ＳＡＦＣ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を参照されたい）、及びイスコフ改変ダルベッコ培地。本明細書における技術で使用され得る基礎培地の他の例として、ＢＭＥ基礎培地（Ｇｉｂｃｏ－Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、粉末）（Ｇｉｂｃｏ－Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（＃３１６００））が挙げられる。
特定の実施形態では、基礎培地は無血清であり得、これは、培地が血清（例えば、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ウマ血清、ヤギ血清又は当業者に既知の任意の他の動物由来血清）を含まないこと又は動物タンパク質不含培地若しくは合成培地であることを意味する。
基礎培地は、標準の基礎培地中に見出される特定の非栄養成分（例えば、様々な無機及び有機緩衝液、界面活性剤並びに塩化ナトリウム）を除去するために改変され得る。そのような成分を基本細胞培地から除去することにより、残存する栄養成分の濃度上昇を可能にし、且つ全体的な細胞増殖及びタンパク質発現を改善し得る。加えて、除去された成分は、細胞培養条件の要求に従い、改変基本細胞培地を含む細胞培地に再び添加され得る。特定の実施形態では、細胞培養培地は、改変基礎細胞培地と、下記の栄養素：鉄源、組換え成長因子；緩衝剤；界面活性剤；容量オスモル濃度調節因子；エネルギー源；及び非動物性加水分解物の少なくとも１つとを含む。加えて、改変基礎細胞培地は、任意選択的に、アミノ酸、ビタミン又はアミノ酸及びビタミンの両方の組み合わせを含み得る。一部の実施形態では、改変基礎培地は、グルタミン、例えばＬ－グルタミン及び／又はメトトレキサートを更に含む。
一部の実施形態では、大量のタンパク質作製は、当技術分野で既知の流加法、バッチ法、パーフュージョン法又は連続フィードバイオリアクタ法を使用するバイオリアクタプロセスにより実行する。大規模バイオリアクタは、少なくとも５０リットルの容量を有し、約５００リットル超の容量又は１，０００～１００，０００リットルの容量を有することもある。このバイオリアクタは、撹拌機インペラを使用して、酸素及び栄養素を分配し得る。小規模バイオリアクタは、概して、容積が約１００リットル以下の細胞培養を指し、約１リットル～約１００リットルの範囲であり得る。代わりに、シングルユースバイオリアクタ（ＳＵＢ）は、大規模培養又は小規模培養のいずれにも使用され得る。
温度、ｐＨ、撹拌、曝気及び接種密度は、使用される宿主細胞及び発現させる組換えタンパク質に応じて異なり得る。例えば、組換えタンパク質細胞培養物を３０～４５摂氏度の温度で維持し得る。培養培地のｐＨは、培養プロセス中、ｐＨが最適なレベルに保たれるようにモニタリングされ得、最適なレベルは、特定の種の宿主細胞の場合に６．０～８．０のｐＨ範囲内であり得る。そのような培養方法での撹拌には、インペラ駆動による混合を使用し得る。インペラの回転速度は、約５０～２００ｃｍ／秒の先端速度であり得るが、培養される宿主細胞の種類に応じて、当技術分野で既知の他のエアリフト又は他の混合／曝気システムを使用し得る。十分な曝気を提供することにより、ここでもやはり培養される特定の宿主細胞に応じて、培養物中において約２０％～８０％空気飽和の溶存酸素濃度が維持される。代わりに、バイオリアクタにより、空気又は酸素を培養培地中に直接拡散させ得る。中空糸膜曝気装置を利用する無気泡曝気システム等の他の酸素供給方法が存在する。
タンパク質の精製
一部の実施形態では、本開示は、本明細書で開示されている方法のいずれか（例えば、本明細書で開示されている投与量レジメンのいずれか）での使用のための本明細書で開示されている結合分子のいずれかを精製する方法を提供する。上記で説明した形質転換宿主により産生されたタンパク質を任意の好適な方法に従って精製し得る。そのような標準的方法として、クロマトグラフィー法（例えば、イオン交換、アフィニティー及びサイズカラムクロマトグラフィー法）、遠心分離法、溶解度差法又は任意の他の標準的タンパク質精製技術による方法が挙げられる。ヘキサヒスチジン、マルトース結合ドメイン、インフルエンザコート配列及びグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ等のアフィニティータグをタンパク質に付着させて、適切なアフィニティーカラムに通過させることによる容易な精製が可能となり得る。単離されたタンパク質は、タンパク質分解、核磁気共鳴及びＸ線結晶学等の技術を使用して物理的に特徴付けることもできる。
例えば、培養培地中に組換えタンパク質を分泌する系の上清を、最初に市販のタンパク質濃縮フィルター（例えば、Ａｍｉｃｏｎ又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニット）を用いて濃縮し得る。この濃縮工程に続いて、濃縮物を好適な精製マトリックスに適用可能である。代わりに、陰イオン交換樹脂（例えば、ペンダントジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基を有するマトリックス又は基材）を利用し得る。このマトリックスは、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース又はタンパク質精製に一般に利用される他のタイプであり得る。代わりに、陽イオン交換工程を利用し得る。好適な陽イオン交換体として、スルホプロピル基又はカルボキシメチル基を含む様々な不溶性マトリックスが挙げられる。最後に、疎水性ＲＰ－ＨＰＬＣ媒体（例えば、ペンダントメチル基又は他の脂肪族基を有するシリカゲル）を利用する１種又は複数の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）工程を利用して、ＮＧＦ結合剤を更に精製し得る。前述の精製工程の一部又は全てを様々に組み合わせて利用して、均一な組換えタンパク質を得ることもできる。
細菌培養物中に産生された組換えタンパク質は、例えば、細胞ペレットからの最初の抽出、それに続く１つ又は複数の濃縮、塩析、水性イオン交換又はサイズ排除クロマトグラフィー工程により単離され得る。最終精製工程で高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を利用し得る。組換えタンパク質の発現で利用される微生物細胞は、凍結融解サイクル処理、音波処理、機械的破壊又は細胞溶解剤の使用等の任意の好都合な方法によって破壊し得る。
組換えポリペプチドを精製するための当技術分野で既知の方法として、例えば、米国特許出願公開第２００８／０３１２４２５号明細書、同第２００８／０１７７０４８号明細書及び同第２００９／０１８７００５号明細書（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）で説明されているものも挙げられる。
使用方法及び医薬組成物
本開示は、対象の疼痛を制御するか又は処置する（例えば、対象の疼痛を軽減する及び／又は予防する）方法であって、本明細書で提供されるＴＮＦα及びＮＧＦアンタゴニスト多機能性ポリペプチド（例えば多機能性結合分子）の治療上有効な量を投与することを含むか、又はＴＮＦαアンタゴニスト及びＮＧＦアンタゴニストの共投与を含む方法を提供する。特定の態様では、対象は、ヒトである。
本開示は、本明細書で説明されている結合分子のいずれかを含む医薬組成物を更に提供する。特定の態様では、この医薬組成物は、薬学的に許容されるビヒクルを更に含む。この医薬組成物は、疼痛（例えば、神経障害性疼痛及び炎症性（例えば、骨関節炎又はリウマチ関節炎の）疼痛）の処置（例えば、軽減又は予防）で有用である。
本明細書で提供されるＮＧＦアンタゴニスト及びＴＮＦαアンタゴニストを含む多機能性ポリペプチド及び組成物は、神経障害性疼痛等の疼痛の制御又は処置（例えば、軽減及び／又は予防）が挙げられるが、これらに限定されない様々な用途で有用であり得る。この使用方法は、インビトロ、エクスビボ又はインビボ方法であり得る。
特定の態様では、本ＮＧＦ結合剤（例えば、抗体又はポリペプチド）で処置される疾患、障害又は状態は、疼痛を伴う。特定の態様では、疼痛は、慢性侵害受容性疼痛、慢性腰痛、神経障害性疼痛、癌性疼痛、帯状疱疹後神経痛（ＰＨＮ）疼痛又は内臓痛の状態を伴う。特定の態様では、疼痛は、膝又は股関節の炎症等の関節炎を伴う。
本開示は、対象の疼痛を制御する（例えば、軽減又は予防する）方法であって、神経成長因子（ＮＧＦ）アンタゴニスト及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦα）アンタゴニストの有効な量を、疼痛制御を必要とする対象に投与することを含み、この投与により、単独で投与されたＮＧＦアンタゴニスト又はＴＮＦαアンタゴニストの等量と比べて有効に対象の疼痛を制御し得る（例えば、軽減し得るか又は予防し得る）、方法を提供する。
単独で投与された成分と比べて「有効に」疼痛を制御することは、併用処置は、個々に投与されたＮＧＦアンタゴニスト又はＴＮＦαアンタゴニストのいずれかの等量と比べて疼痛の制御で有効であることを意味する。特定の態様において且つ下記でより詳細に説明するように、本明細書で提供される疼痛を制御する（例えば、軽減又は予防する）方法により、相乗的な有効性を得ることができ、例えば、ＮＧＦアンタゴニスト及びＴＮＦαアンタゴニストの両方の投与の効果は、相加効果を超え得るか、又はＮＧＦアンタゴニストもＴＮＦαアンタゴニストも単独では有効ではない場合に有効であり得る。特定の態様では、この組合せにより、用量の節約が可能となり得、例えば、共投与された場合の個々の成分の有効な投与量は、単独でのいずれの成分の有効な量と比べて少ない可能性がある。
特定の態様では、本明細書で提供される疼痛を制御する（例えば、軽減又は予防する）方法は、単独で投与されたＮＧＦアンタゴニスト又はＴＮＦαアンタゴニストの等量と比べて、対象の疼痛の制御（例えば、軽減又は予防）で少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％有効である。特定の態様では、対象に共投与される個々のＮＧＦアンタゴニスト若しくはＴＮＦαアンタゴニストの投与量又は本明細書で提供される二機能性ポリペプチドの投与時に提供されるＮＧＦアンタゴニスト若しくはＴＮＦαアンタゴニストの相対用量の用量は、単独で投与された各成分に必要な投与量と比べて低くあり得、例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％低くあり得る。
一部の実施形態では、本開示は、特定の投与量レジメンにおいて、本明細書で開示されている結合分子のいずれかを対象に投与することを提供する。一部の実施形態では、本明細書で開示されている結合分子のいずれかを０．０４～０．２５ｍｇ／ｋｇの用量で、本明細書で開示されている対象のいずれかに投与する。一部の実施形態では、本明細書で開示されている結合分子のいずれかを０．０４～０．１５ｍｇ／ｋｇの用量で、本明細書で開示されている対象のいずれかに投与する。一部の実施形態では、本明細書で開示されている結合分子のいずれかを０．０４～０．１ｍｇ／ｋｇの用量で、本明細書で開示されている対象のいずれかに投与する。一部の実施形態では、本明細書で開示されている結合分子のいずれかを０．０４～０．０７５ｍｇ／ｋｇの用量で、本明細書で開示されている対象のいずれかに投与する。一部の実施形態では、本明細書で開示されている結合分子のいずれかを０．０４～０．０６ｍｇ／ｋｇの用量で、本明細書で開示されている対象のいずれかに投与する。一部の実施形態では、本明細書で開示されている結合分子のいずれかを約０．０５ｍｇ／ｋｇの用量で、本明細書で開示されている対象のいずれかに投与する。一部の実施形態では、本明細書で開示されている結合分子のいずれかを約０．１ｍｇ／ｋｇの用量で、本明細書で開示されている対象のいずれかに投与する。一部の実施形態では、本明細書で開示されている結合分子のいずれかを約０．１５ｍｇ／ｋｇの用量で、本明細書で開示されている対象のいずれかに投与する。一部の実施形態では、本明細書で開示されている結合分子のいずれかを約０．２ｍｇ／ｋｇの用量で、本明細書で開示されている対象のいずれかに投与する。一部の実施形態では、本明細書で開示されている結合分子のいずれかを静脈内投与する。一部の実施形態では、本明細書で開示されている結合分子のいずれかを皮下投与する。
一部の実施形態では、本開示は、疼痛の処置（例えば、軽減又は予防）を、それを必要とする対象において行う方法であって、本明細書で開示されている結合分子のいずれかの０．０４～０．２７５ｍｇ／ｋｇを対象に静脈内投与することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、この方法は、この結合分子の０．０４～０．２５ｍｇ／ｋｇを対象に静脈内投与することを含む。一部の実施形態では、この方法は、この結合分子の０．０４～０．２ｍｇ／ｋｇを対象に静脈内投与することを含む。一部の実施形態では、この方法は、この結合分子の０．０４～０．１５ｍｇ／ｋｇを対象に静脈内投与することを含む。一部の実施形態では、この方法は、この結合分子の０．０４～０．１ｍｇ／ｋｇを対象に静脈内投与することを含む。一部の実施形態では、この方法は、この結合分子の０．０４～０．０８ｍｇ／ｋｇを対象に静脈内投与することを含む。一部の実施形態では、この方法は、この結合分子の０．１～０．２７５ｍｇ／ｋｇを対象に静脈内投与することを含む。一部の実施形態では、この方法は、この結合分子の０．１～０．２５ｍｇ／ｋｇを対象に静脈内投与することを含む。一部の実施形態では、この方法は、この結合分子の０．１～０．２ｍｇ／ｋｇを対象に静脈内投与することを含む。一部の実施形態では、この方法は、この結合分子の０．１５～０．２５ｍｇ／ｋｇを対象に静脈内投与することを含む。一部の実施形態では、この方法は、この結合分子の約０．０５ｍｇ／ｋｇを対象に静脈内投与することを含む。一部の実施形態では、この方法は、この結合分子の約０．１ｍｇ／ｋｇを対象に静脈内投与することを含む。一部の実施形態では、この方法は、この結合分子の約０．１５ｍｇ／ｋｇを対象に静脈内投与することを含む。一部の実施形態では、この方法は、この結合分子の約０．２ｍｇ／ｋｇを対象に静脈内投与することを含む。
一部の実施形態では、本開示は、疼痛の処置（例えば、軽減又は予防）を、それを必要とする対象において行う方法であって、本明細書で開示されている結合分子のいずれかの０．１～１．２ｍｇ／ｋｇを対象に皮下投与することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、疼痛の処置（例えば、軽減又は予防）を、それを必要とする対象において行う方法であって、本明細書で開示されている結合分子のいずれかの０．１～１．０ｍｇ／ｋｇを対象に皮下投与することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、疼痛の処置（例えば、軽減又は予防）を、それを必要とする対象において行う方法であって、本明細書で開示されている結合分子のいずれかの０．１～０．８ｍｇ／ｋｇを対象に皮下投与することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、疼痛の処置（例えば、軽減又は予防）を、それを必要とする対象において行う方法であって、本明細書で開示されている結合分子のいずれかの０．１～０．６ｍｇ／ｋｇを対象に皮下投与することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、疼痛の処置（例えば、軽減又は予防）を、それを必要とする対象において行う方法であって、本明細書で開示されている結合分子のいずれかの０．１～０．４ｍｇ／ｋｇを対象に皮下投与することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、疼痛の処置（例えば、軽減又は予防）を、それを必要とする対象において行う方法であって、本明細書で開示されている結合分子のいずれかの０．１～０．２５ｍｇ／ｋｇを対象に皮下投与することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、疼痛の処置（例えば、軽減又は予防）を、それを必要とする対象において行う方法であって、本明細書で開示されている結合分子のいずれかの０．４～１．０ｍｇ／ｋｇを対象に皮下投与することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、疼痛の処置（例えば、軽減又は予防）を、それを必要とする対象において行う方法であって、本明細書で開示されている結合分子のいずれかの０．６～１．０ｍｇ／ｋｇを対象に皮下投与することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、疼痛の処置（例えば、軽減又は予防）を、それを必要とする対象において行う方法であって、本明細書で開示されている結合分子のいずれかの０．８～１．０ｍｇ／ｋｇを対象に皮下投与することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、疼痛の処置（例えば、軽減又は予防）を、それを必要とする対象において行う方法であって、本明細書で開示されている結合分子のいずれかの０．８～１．２ｍｇ／ｋｇを対象に皮下投与することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、疼痛の処置（例えば、軽減又は予防）を、それを必要とする対象において行う方法であって、本明細書で開示されている結合分子のいずれかの約０．２ｍｇ／ｋｇを対象に皮下投与することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、疼痛の処置（例えば、軽減又は予防）を、それを必要とする対象において行う方法であって、本明細書で開示されている結合分子のいずれかの約０．４ｍｇ／ｋｇを対象に皮下投与することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、疼痛の処置（例えば、軽減又は予防）を、それを必要とする対象において行う方法であって、本明細書で開示されている結合分子のいずれかの約０．６ｍｇ／ｋｇを対象に皮下投与することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、疼痛の処置（例えば、軽減又は予防）を、それを必要とする対象において行う方法であって、本明細書で開示されている結合分子のいずれかの約０．８ｍｇ／ｋｇを対象に皮下投与することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、疼痛の処置（例えば、軽減又は予防）を、それを必要とする対象において行う方法であって、本明細書で開示されている結合分子のいずれかの約１ｍｇ／ｋｇを対象に皮下投与することを含む方法を提供する。
一部の実施形態では、本開示は、疼痛の処置（例えば、軽減又は予防）を、それを必要とする対象において行う方法であって、固定投与量レジメンにおいて、本明細書で開示されている結合分子のいずれかを対象に投与することによる方法を提供する。本明細書で使用される場合、固定投与量レジメンは、各対象に投与される投与量が固定されており、対象の体重又は他の特性に左右されないことを意味する。一部の実施形態では、本明細書で開示されている結合分子のいずれかを５～２００ｍｇの固定用量で、本明細書で開示されている対象のいずれかに投与する。一部の実施形態では、本明細書で開示されている結合分子のいずれかを７．５～１５０ｍｇの用量で、本明細書で開示されている対象のいずれかに投与する。一部の実施形態では、本明細書で開示されている結合分子のいずれかを２５～１５０ｍｇの用量で、本明細書で開示されている対象のいずれかに投与する。一部の実施形態では、本明細書で開示されている結合分子のいずれかを７５～１５０ｍｇの用量で、本明細書で開示されている対象のいずれかに投与する。一部の実施形態では、本明細書で開示されている結合分子のいずれかを５、７．５、２５、７５、１５０又は２００ｍｇの用量で、本明細書で開示されている対象のいずれかに投与する。一部の実施形態では、本明細書で開示されている結合分子のいずれかを７．５、２５、７５又は１５０の用量で、本明細書で開示されている対象のいずれかに投与する。一部の実施形態では、本明細書で開示されている結合分子のいずれかを５ｍｇの用量で、本明細書で開示されている対象のいずれかに投与する。一部の実施形態では、本明細書で開示されている結合分子のいずれかを７．５ｍｇの用量で、本明細書で開示されている対象のいずれかに投与する。一部の実施形態では、本明細書で開示されている結合分子のいずれかを２５ｍｇの用量で、本明細書で開示されている対象のいずれかに投与する。一部の実施形態では、本明細書で開示されている結合分子のいずれかを７５ｍｇの用量で、本明細書で開示されている対象のいずれかに投与する。一部の実施形態では、本明細書で開示されている結合分子のいずれかを１５０ｍｇの用量で、本明細書で開示されている対象のいずれかに投与する。一部の実施形態では、本明細書で開示されている結合分子のいずれかを２００ｍｇの用量で、本明細書で開示されている対象のいずれかに投与する。一部の実施形態では、本明細書で開示されている結合分子のいずれかを、この結合分子の静脈内用量と等しい固定用量で、本明細書で開示されている対象のいずれかに投与する。一部の実施形態では、静脈内用量と等しい固定用量とは、静脈内用量と実質的に同一であるか又は同一である血清中薬物動態プロファイルを生じる固定用量である。一部の実施形態では、静脈内用量と等しい固定用量とは、静脈内用量と実質的に同一であるか又は同一である、薬物動態プロファイルプロットにおける曲線下幾何平均面積を生じる固定用量である。一部の実施形態では、本明細書で開示されている結合分子のいずれかを、この結合分子の静脈内固定用量と等しい固定用量で、本明細書で開示されている対象のいずれかに投与する。一部の実施形態では、本明細書で開示されている結合分子のいずれかを、この結合分子の３０ｍｇの固定静脈内用量と等しい固定用量で、本明細書で開示されている対象のいずれかに投与する。
一部の実施形態では、本明細書で開示されている結合分子のいずれかを静脈内投与する。一部の実施形態では、本明細書で開示されている結合分子のいずれかを、本明細書で開示されている対象のいずれかに静脈内投与する。一部の実施形態では、本明細書で開示されている結合分子のいずれかを固定用量で静脈内投与する。
一部の実施形態では、本明細書で開示されている結合分子のいずれかを皮下投与する。一部の実施形態では、本明細書で開示されている結合分子のいずれかを、本明細書で開示されている対象のいずれかに皮下投与する。一部の実施形態では、本明細書で開示されている結合分子のいずれかを固定用量で皮下投与する。一部の実施形態では、本明細書で開示されている結合分子のいずれかを、本明細書で開示されている固定用量のいずれかで皮下投与する。
一部の実施形態では、本開示は、疼痛の処置（例えば、予防又は軽減）を、それを必要とする対象において行う方法であって、皮下固定用量の、本明細書で開示されている結合分子のいずれかを対象に投与することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、この方法は、本明細書で開示されている結合分子のいずれかの５～２００ｍｇの固定用量を皮下投与することを含む。一部の実施形態では、この方法は、本明細書で開示されている結合分子のいずれかの７．５～１５０ｍｇの固定用量を皮下投与することを含む。一部の実施形態では、この方法は、本明細書で開示されている結合分子のいずれかの２５～１５０ｍｇの固定用量を皮下投与することを含む。一部の実施形態では、この方法は、本明細書で開示されている結合分子のいずれかの７５～１５０ｍｇの固定用量を皮下投与することを含む。一部の実施形態では、この方法は、本明細書で開示されている結合分子のいずれかの５、７．５、２５、７５、１５０又は２００ｍｇの固定用量を皮下投与することを含む。一部の実施形態では、この方法は、本明細書で開示されている結合分子のいずれかの７．５、２５、７５又は１５０ｍｇの固定用量を皮下投与することを含む。一部の実施形態では、本明細書で開示されている結合分子のいずれかを５ｍｇの用量で、本明細書で開示されている対象のいずれかに皮下投与する。一部の実施形態では、本明細書で開示されている結合分子のいずれかを７．５ｍｇの用量で、本明細書で開示されている対象のいずれかに皮下投与する。一部の実施形態では、本明細書で開示されている結合分子のいずれかを２５ｍｇの用量で、本明細書で開示されている対象のいずれかに皮下投与する。一部の実施形態では、本明細書で開示されている結合分子のいずれかを７５ｍｇの用量で、本明細書で開示されている対象のいずれかに皮下投与する。一部の実施形態では、本明細書で開示されている結合分子のいずれかを１５０ｍｇの用量で、本明細書で開示されている対象のいずれかに皮下投与する。一部の実施形態では、本明細書で開示されている結合分子のいずれかを２００ｍｇの用量で、本明細書で開示されている対象のいずれかに皮下投与する。一部の実施形態では、この方法は、この結合分子の静脈内固定用量と等しい固定用量を皮下投与することを含む。一部の実施形態では、この方法は、この結合分子の３０ｍｇの固定静脈内用量と等しい固定用量を皮下投与することを含む。
一部の実施形態では、疼痛を処置する（例えば、予防するか又は軽減する）方法は、投与量スケジュールに従い、本明細書で開示されている結合分子のいずれかを投与することを含む。一部の実施形態では、結合分子を対象に１回投与する。一部の実施形態では、結合分子を対象に複数回投与する。一部の実施形態では、結合分子の固定用量を対象に複数回投与する。一部の実施形態では、結合分子の同一の固定用量を対象に複数回投与する。一部の実施形態では、結合分子（例えば、結合分子の固定用量）を対象に１週間に少なくとも１回、１週間に１回以下、２週間毎に少なくとも１回、２週間毎に１回以下、３週間毎に少なくとも１回、３週間毎に１回以下、１ヶ月に少なくとも１回、１ヶ月に１回以下、１ヶ月に少なくとも２回、１ヶ月に２回以下、１ヶ月に少なくとも３回、１ヶ月に３回以下、６週間毎に少なくとも１回又は６週間毎に１回以下投与する。一部の実施形態では、結合分子（例えば、結合分子の固定用量）を対象に２週間毎に少なくとも１回投与する。一部の実施形態では、結合分子（例えば、結合分子の固定用量）を対象に２週間毎に１回以下投与する。一部の実施形態では、結合分子（例えば、結合分子の固定用量）を対象に２週間毎に１回投与する。一部の実施形態では、結合分子（例えば、結合分子の固定用量）を対象に３週間毎に少なくとも１回投与する。一部の実施形態では、結合分子を対象に３週間毎に１回以下投与する。一部の実施形態では、結合分子（例えば、結合分子の固定用量）を対象に３週間毎に１回投与する。一部の実施形態では、結合分子（例えば、結合分子の固定用量）を対象に１ヶ月に少なくとも１回投与する。一部の実施形態では、結合分子（例えば、結合分子の固定用量）を対象に１ヶ月に１回以下投与する。一部の実施形態では、結合分子（例えば、結合分子の固定用量）を対象に１ヶ月に１回投与する。
本開示は、疼痛を処置する（例えば、予防するか又は軽減する）方法であって、本明細書で開示されている結合分子のいずれかを投与するための投与量スケジュールを一定期間にわたって継続する、方法を提供する。例えば、結合分子の固定用量を少なくとも１２週間にわたって２週間毎に少なくとも１回投与し得る。一部の実施形態では、結合分子を少なくとも４週間、少なくとも８週間、少なくとも１２週間又は少なくとも１６週間にわたって投与する。一部の実施形態では、結合分子を少なくとも４週間にわたって投与する。一部の実施形態では、結合分子を少なくとも８週間にわたって投与する。一部の実施形態では、結合分子を少なくとも１２週間にわたって投与する。一部の実施形態では、結合分子を少なくとも１６週間にわたって投与する。一部の実施形態では、結合分子を１２週間にわたって投与する。一部の実施形態では、結合分子を少なくとも１２週間にわたって２週間毎に少なくとも１回投与する。一部の実施形態では、結合分子を少なくとも１２週間にわたって２週間毎に１回投与する。一部の実施形態では、結合分子を１２週間にわたって２週間毎に１回投与する。
本明細書で開示されている結合分子のいずれかを追加の疼痛処置と組み合わせて疼痛の軽減又は予防に使用し得る。この追加の疼痛処置は、本明細書で開示されている結合分子のいずれかと同時に施され得るか、又は本明細書で開示されている結合分子のいずれかから独立して施され得る。従って、本開示は、疼痛の軽減又は予防を、それを必要とする対象において行う方法であって、本明細書で開示されている結合分子のいずれかを投与することを含み、追加の疼痛処置を施すことを更に含む方法を提供する。一部の実施形態では、疼痛を予防するか又は軽減する方法は、対象にＮＳＡＩＤを投与することを更に含む。一部の実施形態では、この方法は、対象にオピオイドを投与することを更に含む。一部の実施形態では、この方法は、対象にアセトアミノフェンを投与することを更に含む。一部の実施形態では、この方法は、対象にパラセタモールを投与することを更に含む。一部の実施形態では、この方法は、対象にＣＯＸ－２阻害剤を投与することを更に含む。
疼痛処置を必要とする対象は、本明細書が開示されている結合分子のいずれかを投与する前に、しばらくの間にわたって疼痛を患っている場合がある。疼痛を予防するか又は軽減する方法の一部の実施形態では、対象は、この結合分子の投与前に１ヶ月以上にわたって疼痛を患っている。一部の実施形態では、対象は、この結合分子の投与前に３ヶ月以上にわたって疼痛を患っている。一部の実施形態では、対象は、この結合分子の投与前に６ヶ月以上にわたって疼痛を患っている。
本明細書で開示されている結合分子いずれかによる処置の開始前に、対象は、疼痛の代替処置が既に施されている場合がある。一部の実施形態では、疼痛を予防するか又は軽減する方法は、本明細書で開示されている結合分子のいずれかの投与前に、疼痛の代替処置を対象に施すことと、この疼痛の代替処置が対象の疼痛を軽減若しくは予防せず、且つ／又は対象が疼痛の代替処置に対して不耐性であることを決定することとを含む。一部の実施形態では、疼痛の代替処置は、ＮＡＳＡＩＤ、強オピオイド、弱オピオイド、ＣＯＸ－２阻害剤、アセトアミノフェン又はこれらの組合せである。一部の実施形態では、この方法は、対象への本結合分子の投与前に、ａ．ＮＳＡＩＤ、強オピオイド、弱オピオイド、ＣＯＸ－２阻害剤、アセトアミノフェン又はこれらの組合せを対象に投与する工程と、ｂ．ｉ）ＮＳＡＩＤ、強オピオイド、弱オピオイド、ＣＯＸ－２阻害剤、アセトアミノフェン若しくはこれらの組合せが対象の疼痛を軽減若しくは予防しないことを決定し、且つ／又はｉｉ）対象がＮＳＡＩＤ、強オピオイド、弱オピオイド、ＣＯＸ－２阻害剤、アセトアミノフェン若しくはこれらの組合せに対して不耐性であることを決定する工程とを含む。一部の実施形態では、ＮＳＡＩＤ、強オピオイド、弱オピオイド、ＣＯＸ－２阻害剤、アセトアミノフェン又はこれらの組合せを少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間又は少なくとも４週間にわたって投与する。一部の実施形態では、ＮＳＡＩＤ、強オピオイド、弱オピオイド、ＣＯＸ－阻害剤、アセトアミノフェン又はこれらの組合せを少なくとも２週間にわたって投与する。一部の実施形態では、ＮＳＡＩＤ、強オピオイド、弱オピオイド、ＣＯＸ－２阻害剤、アセトアミノフェン又はこれらの組合せを、本明細書で開示されている結合分子のいずれかの投与前に、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間又は少なくとも４週間にわたって対象に投与している。一部の実施形態では、ＮＳＡＩＤ、強オピオイド、弱オピオイド、ＣＯＸ－２阻害剤、アセトアミノフェン又はこれらの組合せを、本明細書で開示されている結合分子のいずれかの投与前に、少なくとも２週間にわたって対象に投与している。一部の実施形態では、対象は、ＮＳＡＩＤ、強オピオイド、弱オピオイド、ＣＯＸ－２阻害剤、アセトアミノフェン又はこれらの組合せに対して不耐性である。
本明細書で開示されている結合分子のいずれかによる処置の開始前に、感染の存在に関して対象を検査し得る。一部の実施形態絵では、疼痛を予防するか又は軽減する方法は、本明細書で開示されている結合分子のいずれかの投与前に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２感染に関して対象を検査することを含む。一部の実施形態では、この方法は、対象への結合分子の固定用量の投与前に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２感染に関して対象を検査することを含む。一部の実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２感染に関して対象を検査することは、対象への結合分子の固定用量の投与前に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２遺伝物質に関して対象を検査することを含む。一部の実施形態では、対象は、ベースライン時にＳＡＲＳ－ＣｏＶ２に感染していない。対象は、ＰＣＲにより検査した場合、ベースライン時にＳＡＲＳ－ＣｏＶ２リボ核酸（ＲＮＡ）に対して陰性であり得る。対象は、ＣＯＶＩＤ－１９感染又は急性ウイルス性呼吸器疾患と一致する臨床症状又は徴候（例えば、発熱、咳、呼吸困難、咽頭痛及び／又は味覚／嗅覚の喪失）を示さない場合がある。対象は、ＳＲＡＳ－ＣｏＶ２に対して陰性であり得、ＣＯＶＩＤ－１９抗体に対して陰性であり得る。
本発明は、疼痛を制御するか又は処置する（例えば、軽減又は予防する）方法を提供する。特定の態様では、この疼痛は、慢性侵害受容性疼痛、慢性腰痛、神経障害性疼痛、癌性疼痛、帯状疱疹後神経痛（ＰＨＮ）疼痛又は内臓痛の状態から選択される。特定の態様では、疼痛は、膝又は股関節の炎症等の関節炎を伴う。
本明細書で開示されている結合分子は、関節炎を伴う疼痛の軽減又は予防に特に有用であり得る。疼痛を予防するか又は軽減する方法の一部の実施形態では、対象は、変形性関節症を有する。一部の実施形態では、対象は、膝の片側性変形性関節症を有する。一部の実施形態では、対象は、中央リーダー評価による０～４のケルグレン・ローレンス（ＫＬ）評価スケールで膝関節の少なくともグレード２の変形性関節症を有する。一部の実施形態では、対象は、中央リーダー評価による０～４のＫＬ評価スケールで膝関節のグレード２の変形性関節症を有する（Ｋｏｈｎ ｅｔ ａｌ（２０１６）Ｃｌｉｎ Ｏｒｔｈｏｐ Ｒｅｌａｔ Ｒｅｓ ４７４：１８８６－１８９３及びＡｌｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．；２９（８）：１０３９－４９）。ＫＬ分類システムは、膝関節のＸ線像評価に基づいており、グレード０は、変形性関節症のＸ線像の特徴がないことを特徴とし、そのため、ＯＡが存在しないことを示し；グレード１は、関節腔の疑わしい狭窄を特徴とし；グレード２は、関節腔の狭窄及び骨棘の存在の可能性を特徴とし；グレード３は、明確な関節腔の狭窄及び複数の骨棘を特徴とし；グレード４は、関節腔の狭窄の発生、重度の硬化及び大きい骨棘を特徴とし、そのため、重度のＯＡを示す。
疼痛制御の有効性は、多くの様々なスケールに従い、経験している疼痛の質及び強度を評価することを患者に求めることにより測定され得る。言葉による疼痛スケールは、言葉を使用して、無痛、軽度の疼痛、中程度の疼痛及び重度の疼痛の範囲を、それぞれに割り当てられた０～３のスコアで説明する。代わりに、０（無痛）～１０（考えられる最悪の疼痛）の数値による疼痛スケールに従って疼痛を評価するように患者に求め得る。視覚的アナログスケール（ＶＡＳ）では、垂直線又は水平線には、無痛から考えられる最悪の疼痛までの疼痛を説明する言葉があり、現在の疼痛レベルを表す点に線を引くように患者に求める。ＭｃＧｉｌｌ疼痛指標は、一連の短いリスト（例えば、ズキズキする、燃えているよう、つねるよう）から疼痛を最もよく説明する言葉を選択することにより、疼痛の質及び強度の両方を患者が説明することを可能にする。ＶＡＳ又は数値スケールの使用が困難な成人には、他の疼痛スケール（例えばＦＡＣＥＳ）を使用し得、言葉を使えない患者には、例えば行動評価スケールを使用し得る。機能的活動スコアは、疼痛がある領域に関連するタスクを実行するように患者に求めることにより、患者が疼痛によりどの程度妨げられているかに関する。このタイプのスケールを使用する疼痛スコアの改善は、鎮痛剤の有効性の改善を潜在的に示すであろう。
対象が患う疼痛のベースラインレベルは、本明細書で開示されている結合分子のいずれかを対象に投与する前に決定され得る。一部の実施形態では、対象は、ベースライン時において、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｏｎｔａｒｉｏ ａｎｄ ＭｃＭａｓｔｅｒ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｉｅｓ Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ指標（ＷＯＭＡＣ）の疼痛サブスケールを使用して測定された場合、関節での少なくとも５の平均ＷＯＭＡＣ疼痛スコアを有する。
ＷＯＭＡＣマルチスケール指標を使用して、膝又は股関節のＯＡを有する対象の疼痛、こわばり及び関節機能性を評価する。ＷＯＭＡＣ疼痛サブスケールは、標的膝でのＯＡに起因する対象の疼痛を評価する５つの質問からなる、膝のＯＡを有する参加者を評価するための、広く使用される患者報告結果測定ツールである（Ｌｕｎｄｇｒｅｎ－Ｎｉｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｐａｔｉｅｎｔ－ｒｅｐｏｒｔｅｄ ｏｕｔｃｏｍｅ ｍｅａｓｕｒｅｓ ｉｎ ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ：ａ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｓｅａｒｃｈ ａｎｄ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅｉｒ ｕｓｅ ａｎｄ ｐｓｙｃｈｏｍｅｔｒｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．ＲＭＤ Ｏｐｅｎ．２０１８ Ｄｅｃ １６；４（２）：ｅ０００７１５）。各質問を０～１０のＮＲＳスケールで採点し、ＷＯＭＡＣ疼痛サブスケールスコアを５つ全ての質問からの平均スコアとして算出し、スコアが高いほど疼痛が高いことを表す。ＷＯＭＡＣ身体機能サブスケールは、標的膝でのＯＡに起因する対象の日常生活での活動の実施の困難さを評価する１７個の質問からなる。各質問を０～１０のＮＲＳスケールで採点し、ＷＯＭＡＣ疼痛サブスケールスコアを１７個全ての質問からの平均スコアとして算出し、スコアが高いほど機能の悪化を表す。ＷＯＭＡＣこわばり機能サブスケールは、標的膝でのＯＡに起因するこわばりを評価する２つの質問からなる。こわばりは、標的膝の動きやすさの低下の感覚として定義される。各質問を０～１０のＮＲＳスケールで採点し、ＷＯＭＡＣ疼痛サブスケールスコアを２つの質問からの平均スコアとして算出し、スコアが高いほどこわばりが高いことを表す。本明細書で使用される場合、ベースラインＷＯＭＡＣスコアは、本結合剤の投与日でのＷＯＭＡＣスコアと定義されている。
一部の実施形態では、対象は、ベースライン時において、疼痛の数値評価（ＮＲＳ）スケールで測定された場合、関節の少なくとも５の平均疼痛強度スコアを有する。ＮＲＳは、疼痛を評価するために使用される１１点リッカートスケールであり、対象には、０＝「無痛」～１０＝「過去２４時間で考えられる最も重度の疼痛」の数字を特定することにより、指標となる膝の平均疼痛を説明することを求める（Ａｌｇｈａｄｉｒ ｅｔ ａｌ．Ｔｅｓｔ－ｒｅｔｅｓｔ ｒｅｌｉａｂｉｌｉｔｙ，ｖａｌｉｄｉｔｙ，ａｎｄ ｍｉｎｉｍｕｍ ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ ｃｈａｎｇｅ ｏｆ ｖｉｓｕａｌ ａｎａｌｏｇ，ｎｕｍｅｒｉｃａｌ ｒａｔｉｎｇ，ａｎｄ ｖｅｒｂａｌ ｒａｔｉｎｇ ｓｃａｌｅｓ ｆｏｒ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｃ ｋｎｅｅ ｐａｉｎ．Ｊ Ｐａｉｎ Ｒｅｓ．２０１８ Ａｐｒ ２６；１１：８５１－６を参照されたい）。本明細書で使用される場合、ベースラインＮＲＳスコアは、本明細書で開示されている結合分子のいずれかによる処置の開始前－７日目から－１日目（含まれる）まで記録された毎日のＮＲＳ疼痛スコアの平均と定義される。
疼痛の軽減又は予防の有効性を、本明細書で開示されている結合分子のいずれかを投与した対象での疼痛レベルの変化と、本明細書で開示されている結合分子のいずれかを投与していないコントロール対象での疼痛レベルの変化とを比較することにより確認し得る。一部の実施形態では、本明細書で開示されている方法又は投与量レジメンのいずれかにより、疼痛は、本結合分子を投与していないコントロール対象（例えば、プラセボを投与したコントロール対象）でのＷｅｓｔｅｒｎ Ｏｎｔａｒｉｏ ａｎｄ ＭｃＭａｓｔｅｒ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｉｅｓ Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ指標（ＷＯＭＡＣ）スコアと比較して、（１～１０のスケールでスケーリングした場合には）ＷＯＭＡＣスケールが少なくとも１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５又は６ポイント低減される。一部の実施形態では、本明細書で開示されている方法又は投与量レジメンのいずれかにより、疼痛は、本結合分子を投与していないコントロール対象（例えば、プラセボを投与したコントロール対象）でのＷＯＭＡＣスコアと比較して、（０～４のスケールでスケーリングした場合には）ＷＯＭＡＣスケールが少なくとも１、１．５、２、２．５、３、３．５又は４ポイント低減される。
一部の実施形態では、本明細書で開示されている方法又は投与量レジメンのいずれかにより、疼痛は、本結合分子が投与されていないコントロール対象での疼痛の数値評価スケール（ＮＲＳ）スコアと比較して、（１～１０のスコアでスコアリングした場合には）ＮＲＳが少なくとも１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５又は６ポイント低減される。一部の実施形態では、疼痛の軽減は、対象への本結合分子の単回用量投与後に観察される。
疼痛の軽減又は予防の有効性を、本明細書で開示されている結合分子のいずれかを投与した対象における疼痛レベルの変化と、ベースライン時での対象における疼痛レベルとを比較することにより確認し得る。一部の実施形態では、本明細書で開示されている方法又は投与量レジメンのいずれかにより、対象のＷＯＭＡＣ疼痛サブスケールがベースラインから低減する。一部の実施形態では、本明細書で開示されている結合分子のいずれかは、１２週間にわたって２週間毎に固定用量で投与され、本方法は、本明細書で開示されている結合分子のいずれかの最初の投与から少なくとも１２週間後、対象のＷＯＭＡＣ疼痛サブスケールスコアをベースラインから低減させる。一部の実施形態では、本明細書で開示されている方法又は投与量レジメンのいずれかにより、対象のＷＯＭＡＣ疼痛サブスケールスコアは、ベースラインから少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％又は少なくとも５０％低減する。一部の実施形態では、本明細書で開示されている方法又は投与量レジメンのいずれかにより、対象のＷＯＭＡＣ疼痛サブスケールスコアは、ベースラインから少なくとも３０％低減する。一部の実施形態では、本明細書で開示されている方法又は投与量レジメンのいずれかにより、対象のＷＯＭＡＣ疼痛サブスケールスコアは、ベースラインから少なくとも５０％低減する。
一部の実施形態では、本明細書で開示されている方法又は投与量レジメンのいずれかにより、対象のＷＯＭＡＣ身体サブスケールスコアがベースラインから低減する。一部の実施形態では、本明細書で開示されている結合分子のいずれかは、１２週間にわたって２週間毎に固定用量で投与され、本方法は、本明細書で開示されている結合分子のいずれかの最初の投与から少なくとも１２週間後、対象のＷＯＭＡＣ身体サブスケールスコアをベースラインから低減させる。一部の実施形態では、本明細書で開示されている方法又は投与量レジメンのいずれかにより、対象のＷＯＭＡＣ身体サブスケールスコアは、ベースラインから少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％又は少なくとも５０％低減する。一部の実施形態では、本明細書で開示されている方法又は投与量レジメンのいずれかにより、対象のＷＯＭＡＣ身体サブスケールスコアは、ベースラインから少なくとも３０％低減する。一部の実施形態では、本明細書で開示されている方法又は投与量レジメンのいずれかにより、対象のＷＯＭＡＣ身体サブスケールスコアは、ベースラインから少なくとも５０％低減する。
一部の実施形態では、本明細書で開示されている方法又は投与量レジメンのいずれかにより、対象の１日当たりのＮＲＳ疼痛スコアの週平均がベースラインから低減する。一部の実施形態では、本明細書で開示されている結合分子のいずれかは、１２週間にわたって２週間毎に固定用量で投与され、本方法は、少なくとも１２週間までに対象の１日当たりのＮＲＳ疼痛スコアの週平均をベースラインから低減させる。一部の実施形態では、本明細書で開示されている方法又は投与量レジメンのいずれかにより、対象の１日当たりのＮＲＳ疼痛スコアの週平均は、ベースラインから少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％又は少なくとも５０％低減する。一部の実施形態では、本明細書で開示されている方法又は投与量レジメンのいずれかにより、対象の１日当たりのＮＲＳ疼痛スコアの週平均は、ベースラインから少なくとも３０％低減する。一部の実施形態では、本明細書で開示されている方法又は投与量レジメンのいずれかにより、対象の１日当たりのＮＲＳ疼痛スコアの週平均は、ベースラインから少なくとも５０％低減する。
一部の実施形態では、本明細書で開示されている方法又は投与量レジメンのいずれかにより、変形性関節症の患者全般評価（ＰＧＡ）がベースラインから改善される。本明細書で使用される場合、ベースラインＰＧＡは、本結合剤の投与日でのＰＧＡスコアと定義される。ＰＧＡは、膝のＯＡに起因する症状及び活動障害を評価するために使用される５点リッカートスケールである（例えば、Ｎｉｋｉｐｈｏｒｏｕ ｅｔ ａｌ（２０１６）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓ Ｔｈｅｒ １８：２５１を参照されたい）。対象には、「膝のＯＡがあなたに影響を及ぼす全ての方法を考慮して、今日の気分はどうですか？」という質問に基づいて、１＝非常に良好（無症状であり、通常の活動は制限されない）から５＝非常に不良（耐えられない非常に重度の症状があり、全ての通常の活動を実行することができない）までの数字を特定するように求められる。一部の実施形態では、本明細書で開示されている結合分子のいずれかは、１２週間にわたって２週間毎に固定用量で投与され、本方法は、少なくとも１２週間までに変形性関節症のＰＧＡをベースラインから改善する。一部の実施形態では、本明細書で開示されている方法又は投与量レジメンのいずれかにより、変形性関節症のＰＧＡが少なくとも２ポイント改善される。
疼痛の軽減又は予防の有効性を、対象のバイアマーカーのレベルの変化を測定することにより確認し得る。一部の実施形態では、本疼痛を予防するか又は軽減する方法により、対象でのＮＧＦ活性は、本結合分子を投与していないコントロール対象（例えば、プラセボを投与したコントロール対象）でのＮＧＦ活性と比較して、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％抑制される。一部の実施形態では、この方法により、対象でのＮＧＦ活性は、本結合分子を投与していないコントロール対象でのＮＧＦ活性と比較して、少なくとも４０％抑制される。一部の実施形態では、ＮＧＦの抑制は、対象への本結合分子の単回用量投与後に観察される。一部の実施形態では、ＮＧＦの抑制は、対象への本結合分子の複数回用量の投与後に観察される。
一部の実施形態では、本疼痛を予防するか又は軽減する方法により、対象でのＣＸＣＬ－１３レベルは、本結合分子を投与していないコントロール対象（例えば、プラセボを投与したコントロール対象）でのＣＸＣＬ－１３レベルと比較して、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％抑制される。一部の実施形態では、ＣＸＣＬ－１３の抑制は、対象への本結合分子の単回用量投与後に観察される。一部の実施形態では、ＣＸＣＬ－１３の抑制は、対象への本結合分子の複数回用量の投与後に観察される。
特定の態様では、ＴＮＦα及びＮＧＦアンタゴニスト多機能性ポリペプチド（例えば、本明細書で提供される多機能性結合分子）と、薬学的に許容されるビヒクル（例えば、担体、賦形剤）とを組み合わせることにより、保存及び使用のために製剤を調製する（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，２０００）。好適な薬学的に許容されるビヒクルとして下記が挙げられるが、これらに限定されない：非毒性緩衝剤、例えば、リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸；塩類、例えば塩化ナトリウム；抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸及びメチオニン；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾール）；低分子量ポリペプチド（例えば、約１０個未満のアミノ酸残基）；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリシン；炭水化物、例えば、単糖類、二糖類、グルコース、マンノース又はデキストリン；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖類、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩形成対イオン、例えばナトリウム；金属複合体（例えば、Ｚｎ－タンパク質複合体）；並びに非イオン性界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮ又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）。
本開示の多機能性ポリペプチドは、この分子の物理化学的特性及び送達経路に応じて液体、半固体又は固体の形態で製剤化され得る。製剤は、賦形剤又は賦形剤の組合せを含み得、例えば、糖類、アミノ酸及び界面活性剤を含み得る。液体製剤は、広範囲に及ぶポリペプチド濃度及びｐＨを含み得る。固体製剤を例えば凍結乾燥、噴霧乾燥又は超臨界流体技術による乾燥により製造し得る。一部の実施形態では、本明細書で説明されている製剤のいずれかは、凍結乾燥製剤である。
本明細書で提供される医薬組成物は、局所的な及び全身性の処置のために任意の数の方法で投与され得る。投与は、局所（例えば、膣及び直腸送達を含む粘膜への局所）、例えば、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、座薬、スプレー、液体及び粉末；肺（例えば、ネブライザによるもの等の粉末若しくはエアロゾルの吸入若しくは吹送によるもの；気管内、鼻腔内、表皮及び経皮）；経口；又は非経口、例えば、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内若しくは筋肉内への注射若しくは注入；又は頭蓋内（例えば、髄腔内若しくは脳室内）投与であり得る。
本明細書で提供されるＴＮＦα及びＮＧＦアンタゴニスト多機能性ポリペプチドは、併用療法としての医薬組合せ製剤又は投与レジメンにおいて、抗侵害受容性特性を有する第２の（又は第３の）化合物と更に組み合わされ得る。
疼痛の処置のために、ＴＮＦα及びＮＧＦアンタゴニスト多機能性ポリペプチド（例えば、本明細書で提供される多重特異性結合分子）の適切な投与量は、処置される疼痛の種類、疼痛の重症度及び経過、疼痛の反応性、この多機能性ポリペプチドを治療目的で投与するか又は予防目的で投与するか、過去の治療、患者の臨床歴並びに同類のものにより、全て処置する医師の裁量で決まる。多機能性ポリペプチドを１回投与するか又は数日～数ヶ月にわたる一連の処置で投与して、有効な疼痛制御を維持し得る。最適な投与スケジュールは、患者の体内の薬剤蓄積についての測定値から算出され得、個々の抗体又はポリペプチドの相対的な効力に依存して変動するであろう。投与している医者は、最適な投与量、投与手法及び反復率を容易に決定し得る。
多機能性ポリペプチド（例えば、本明細書で提供される多重特異性結合分子）の投与により、「相乗効果」がもたらされ得、「相乗的」であること（即ち有効成分が一緒に使用される場合に達成される効果）は、化合物を個別に使用することにより得られる効果の総和と比べて大きい場合に証明される。有効成分を単一の多機能性融合ポリペプチドとして投与する場合、相乗効果が達成され得る。
疼痛
最も広い用法では、「疼痛」は、これを経験している個体にとって非常に主観的であり且つ環境及び文化的背景等の個体の精神状態による影響を受ける体験的現象を指す。「身体的」疼痛は、通常、実際の又は潜在的な組織損傷の原因となる、第三者に知覚可能な刺激に関連付けされ得る。この意味では、疼痛は、国際疼痛学会（ＩＳＡＰ）によれば、「実際の若しくは潜在的な組織損傷と関連しているか又はそのような損傷の観点で説明されている感覚的で感情的な経験」と見なされ得る。しかしながら、疼痛の一部の例には、知覚可能な原因がない。例えば、心因性疼痛、例えば、心因性要因による既存の身体的疼痛の悪化又は疼痛の知覚可能な原因の証拠がない心理的障害を有する人における時に持続的に知覚される疼痛の症状。本発明に関連して、「疼痛」は、本明細書で開示されている疼痛の種類のいずれかであり得るか、又はこのいずれかを含み得る。
疼痛の種類
本発明に関連して、疼痛として、侵害受容性疼痛、神経障害性／神経原性疼痛、突破痛、アロディニア、痛覚過敏、知覚過敏、異常錯感覚、錯感覚、ヒペルパチー、幻肢痛、心因性疼痛、無知覚性疼痛症、神経痛、神経炎が挙げられる。他の分類には、悪性疼痛、狭心痛及び／又は特発性疼痛、複合性局所疼痛症候群Ｉ、複合性局所疼痛症候群ＩＩが含まれる。疼痛の種類及び症状は、互いに排他的である必要はない。これらの用語は、ＩＡＳＰにより定義された通りに意図されている。
侵害受容性疼痛は、侵害刺激に反応した末梢神経中の特殊な感覚侵害受容器により開始され、侵害刺激は活動電位にコードされる。侵害受容器は、一般に、Ａδ繊維及び（ポリモーダル）Ｃ繊維上に存在し、皮膚の直下、腱、関節及び体器官中で終わる自由神経終末である。後根神経節（ＤＲＧ）神経細胞は、末梢と脊髄との間の伝達部位を提供する。信号は、脊髄を通って脳幹及び視床部位に処理され、最終的には大脳皮質に処理され、通常（しかしながら、常にではない）疼痛の感覚を誘発する。侵害受容性疼痛は、身体組織を刺激するか又は損傷する可能性を有する多種多様な化学的な、熱的な、生物学的な（例えば炎症性の）又は機械的な事象から生じる可能性があり、この事象は、一般に、侵害受容器中で侵害受容活動を引き起こすのに必要な強度の特定の最小閾値を超えている。
神経障害性疼痛は、一般に、末梢神経系又は中枢神経系の異常な機能の結果であり、それぞれ、末梢神経障害性疼痛又は中枢神経障害性疼痛が生じる。神経障害性疼痛は、ＩＡＳＰにより、神経系での一時的な病変又は機能障害により開始されるか又は引き起こされる疼痛と定義されている。神経障害性疼痛は、特に慢性の場合、神経系への実際の損傷を伴うことが多い。炎症性侵害受容性疼痛は、一般に、組織損傷及び結果として起きる炎症過程の結果である。神経障害性疼痛は、組織に対する任意の観察可能な損傷の明らかな治癒後（例えば、数ヶ月後又は数年後）でも十分に継続している可能性がある。
神経障害性疼痛の場合、患部からの感覚処理に異常が生じる可能性があり、通常、疼痛を引き起こさないであろう無害の刺激（即ち熱、触覚／圧力）が、疼痛を引き起こす場合があるか（即ちアロディニア）、又は通常、疼痛を伴う刺激に反応して疼痛を誇張して感じる場合がある（即ち痛覚過敏）。加えて、電気的刺激若しくはショック又は「ピン及び針」と同様の感覚（即ち錯感覚）並びに／又は不快な特性を有する感覚（即ち異常感覚）が通常の刺激により誘発される場合がある。突出痛は、既存の慢性疼痛の悪化である。ヒペルパチーは、刺激に対する異常に有痛性の反応により生じる有痛性の症候群である。刺激は、殆どの場合、疼痛閾値が増加する反復性であり、疼痛閾値は、患者が疼痛として認識し得る疼痛の最小の経験と見なされ得る。
神経障害性疼痛の例として、下記が挙げられる：接触性アロディニア（例えば、神経損傷後に誘発される接触性アロディニア）、神経痛（例えば、ヘルペス後（又は帯状疱疹後）神経痛、三叉神経痛）、反射***感神経性ジストロフィー／カウサルギー（神経外傷）、癌性疼痛の構成成分（例えば、癌自体に起因する疼痛、又は炎症等の状態に関連する疼痛、又は化学療法、外科手術若しくは放射線療法等の処置に起因する疼痛）、幻肢痛、絞扼性ニューロパシー（例えば手根管症候群）並びに神経障害、例えば末梢神経障害（例えば、糖尿病、ＨＩＶ、慢性的なアルコールの使用、他の毒素（多くの化学療法を含む）に対する曝露、ビタミン欠乏症並びに多種多様な他の医学的状態。神経障害性疼痛として、様々な原因（例えば、外科手術、創傷、帯状疱疹、糖尿病性神経障害、脚又は腕の切断、癌及び同類のもの）に起因する神経損傷後の神経系の病理学的操作の発現により誘発される疼痛が挙げられる。神経障害性疼痛に関連する医学的状態として、外傷性神経損傷、脳卒中、多発性硬化症、脊髄空洞症、脊髄損傷及び癌が挙げられる。
疼痛を引き起こす刺激は、自体が疼痛の経験の一因となり得る炎症反応を呼び起こすことが多い。一部の状態では、疼痛は、侵害受容性因子及び神経障害因子の複雑な混合により引き起こされると思われる。例えば、慢性疼痛は、炎症性の侵害受容性疼痛若しくは神経障害性疼痛又は両方の混合を含むことが多い。最初の神経系の機能障害又は損傷により、炎症性メディエータの神経性放出及びその後の神経障害性炎症が誘発され得る。例えば、片頭痛は、神経障害性疼痛及び侵害受容性疼痛の混合を表し得る。また、筋筋膜痛は、筋肉からの侵害受容性インプットに対しておそらく二次的であるが、異常な筋肉活動性は、神経障害性状態の結果であり得る。
本発明で提供される疼痛を制御する（例えば、疼痛を軽減又は予防する）方法によれば、本明細書で開示されている結合分子のいずれかの投与は、疼痛制御を必要とする対象の疼痛を制御する（例えば、疼痛を軽減又は予防する）のに十分である。一部の実施形態では、疼痛の軽減は、対象への本明細書で開示されている結合分子のいずれかの単回用量投与後に観察される。一部の実施形態では、疼痛の軽減は、対象への本明細書で開示されている結合分子のいずれかの複数回用量の投与後に観察される。特定の実施形態では、本開示は、変形性関節症を伴う疼痛を軽減又は予防するための方法又は投与量レジメンを提供する。一部の実施形態では、変形性関節症を伴う疼痛は、変形性関節症を伴う膝の疼痛である。
疼痛を予防するか又は軽減する方法の一部の実施形態では、疼痛は、急性疼痛、短期間疼痛、持続性若しくは慢性の侵害受容性疼痛又は持続性若しくは慢性の神経障害性疼痛である。一部の実施形態では、疼痛は、慢性疼痛を含む。一部の実施形態では、疼痛は、関節炎（例えば、膝又は股関節の炎症）を伴う。一部の実施形態では、疼痛は、変形性関節症疼痛を含む。一部の実施形態では、疼痛は、膝の変形性関節症疼痛を含む。
ＴＮＦα及びＮＧＦアンタゴニストを含むキット
本開示は、本明細書で説明されている方法を実施するために使用され得る、本明細書で提供されるＴＮＦα及びＮＧＦアンタゴニスト多機能性ポリペプチド（例えば多重特異性結合分子）を含むキットを提供する。特定の態様では、キットは、１つ又は複数の容器中において、ＴＮＦαアンタゴニスト及びＮＧＦアンタゴニストを含む多機能性融合ポリペプチド（例えば、配列番号１４又は１７のアミノ酸配列を含むポリペプチド）を少なくとも含む。当業者は、当技術分野では公知の確立されたキットフォーマットの１つに、本明細書で提供される本開示のＴＮＦα及びＮＧＦアンタゴニストを容易に組み込み得ることを容易に認識するであろう。
以上で本開示を概略的に説明したが、下記の実施例を参照することにより、本発明をより容易に理解するであろう。この実施例は、単に本開示の特定の態様及び実施形態を例示するために含まれるにすぎず、本開示を限定することを意図するものではない。
実施例１ － 抗ＮＧＦ ｓｃＦｖ／ＴＮＦＲ２－Ｆｃ多重特異性結合分子の構築及びキャラクタリゼーション
多機能性分子（具体的には、抗ＮＧＦ抗体ドメインとＴＮＦＲ２－Ｆｃドメインとを含む多重特異性結合分子）を下記の通りに作製した。抗ＮＧＦ抗体ｓｃＦｖ断片を、Ｄｉｍａｓｉ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．３９３：６７２－９２（２００９）及び国際公開第２０１３／０７０５６５号パンフレットで説明されているＢｓ３Ａｂ形式に従い、重鎖ＣＨ３ドメインを介してＴＮＦＲ２－Ｆｃ融合タンパク質（配列番号１３）のＣ末端と融合させた。この構造の図を図１に示す。ＴＮＦＲ２－Ｆｃポリペプチド及び多重特異性結合分子をコードするＤＮＡ構築物をＧｅｎｅＡｒｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で合成した。多重特異性結合分子の場合、１５個のアミノ酸のリンカー配列（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号１５）を介して互いに連結されているＭＥＤＩ－５７８のＶＨドメイン（配列番号３）及びＶＬドメイン（配列番号７）を含む抗ＮＧＦ ｓｃＦｖを構築した。このｓｃＦｖのＮ末端を、１０個のアミノ酸のリンカー配列（ＧＧＧＧＳ）２を介して、配列番号１３のＣ末端と融合させた。この多重特異性結合分子は、本明細書ではＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４と称される。多重特異性結合分子をコードするＤＮＡ構築物を、Ｂｓ３Ａｂ発現ベクターへのクローニングのために、３’末端で停止コドン及びＥｃｏＲＩ制限部位を含むように操作した。ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４をコードするＤＮＡ配列を配列番号１６で表し、そのアミノ酸配列を配列番号１４で表す。
ＴＮＦ－ＮＧＦ多重特異性結合分子の熱安定性を、この多重特異性結合分子のＭＥＤＩ－５７８ ｓｃＦｖ部分のＶＨドメインとＶＬドメインとの間に鎖内ジスルフィド結合を付加することにより改善した。これは、ＶＬドメイン（配列番号９４）のアミノ酸４４及びＶＬドメイン（配列番号９５）のアミノ酸１０３でＧ→Ｃ変異を導入することにより行った。このクローンをＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢと命名した。ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢのアミノ酸配列を配列番号１７で表す。ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢをコードするＤＮＡ配列を配列番号１８で表す。ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢをコードするコドン最適化ＤＮＡ配列を配列番号９９で表す。ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢは、ｓｃＦｖ部分のＶＨ及びＶＬを連結する１５個のアミノ酸のリンカー配列（ＧＧＧＧＳ）３が２０個のアミノ酸のリンカー（ＧＧＧＧＳ）４（配列番号１９）に置き換えられている点でＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４と更に異なる。示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）を使用して、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢのＴｍを測定した。この方法により、高温への曝露時でのタンパク質ドメインの展開中に現れる疎水性表面に結合する蛍光色素Ｓｙｐｒｏ Ｏｒａｎｇｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の組込みが測定される。ＤＳＦアッセイでは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４のＴｍは６２℃であり、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢのＴｍは６６℃であった。従って、多重特異性分子のＭＥＤＩ－５７８ ｓｃＦｖ部分での鎖間ジスルフィド結合の付加により、この分子の熱安定性が４℃改善された。
ＴＮＦＲ２－Ｆｃタンパク質及びＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４を、遺伝子導入試薬としてポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、懸濁ＣＨＯ細胞中で一過的に発現させた。この細胞をＣＤ－ＣＨＯ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で維持した。小規模遺伝子導入からの培養回収物を、製造業者のプロトコル（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に従って１ｍｌ ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）アフィニティクロマトグラフィーを使用して精製し、続いて１％スクロース、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ Ｌ－アルギニン塩酸塩及び２５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．３）に緩衝液交換した。組換えタンパク質の純度を、還元条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用し、且つ分析用サイズ排除クロマトグラフィーを使用して分析し（下記の方法を参照されたい）、濃度を、理論的に決定された吸光係数を使用して２８０ｎｍでの吸光度を読み取ることにより決定した。
ＴＮＦＲ２－Ｆｃ融合タンパク質及びＴＮＦ－ＮＧＦ多重特異性構築物ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４の小規模一過性発現及びプロテインＡカラム精製により、それぞれ３６．６及び７９．９ｍｇ Ｌ－１の収量が得られた。
ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４のより大きいバッチを下記の通りに作製した。大規模遺伝子導入（最大で６Ｌ）からの粗培養回収物を、深層ろ過を使用してろ過し、緩衝液Ａ（リン酸緩衝生理食塩水ｐＨ７．２）で予め平衡化した１．６×２０ｃｍプロテインＡアガロースカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。次いで、このカラムを緩衝液Ａで洗浄し、生成物を緩衝液Ｂ（５０ｍＭ酢酸ナトリウム ｐＨ＜４．０）の工程勾配で溶出させた。この生成物を、緩衝液Ｃ（５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液 ｐＨ＜５．５）で予め平衡化した１．６×２０ｃｍ Ｐｏｒｏｓ ＨＳ ５０カラム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にロードして更に精製し、緩衝液Ｃで洗浄し、次いで生成物を５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ＜５．５中の０～１Ｍ ＮａＣｌの線形勾配で溶出させた。得られた溶出液をサイズ排除ＨＰＬＣで分析した。タンパク質濃度を、算出された吸光係数１．３６を使用して、Ｂｅｃｋｍａｎ ＤＵ５２０分光光度計によるＡ２８０分光法により決定した。
ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４のキャラクタリゼーション方法
標準的なプロトコルを使用して、ウエスタンブロット分析を実行した。製造業者の指示に従ってＸｃｅｌｌ ＳｕｒｅＬｏｃｋ（商標）システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、タンパク質をフッ化ポリビニリデン膜（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上に転写した。この膜を室温で１時間にわたりリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の３％（ｗ／ｖ）スキムミルク粉末でブロックした。ウエスタンブロットを、ＨＲＰコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ特異的抗体（Ｓｉｇｍａ）による標準的なプロトコルを使用して現像した。
サイズ排除ＨＰＬＣを、１ｍｌ／分の流速でのＤ－ＰＢＳ（ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の移動相によるＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ ＢｉｏＳｅｐ－ＳＥＣ－Ｓ３０００（３００×７．８ｍｍ）カラムにより、Ｇｉｌｓｏｎ ＨＰＬＣシステム（Ｉｓｏｃｒａｔｉｃ ｐｕｍｐ－３０７、ＵＶ／Ｖｉｓ－１５１検出器、Ｌｉｑｕｉｄ Ｈａｎｄｌｅｒ－２１５及びＩｎｊｅｃｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅ－８１９）を使用して実施した。このカラムにサンプル２５μＬを注入し、タンパク質種の分離をＡ２８０ｎｍでモニタリングした。
小規模の精製されたＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４の酵素的脱グリコシル化を、製造業者のプトロコルに従ってＥＤＧＬＹキット（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して実施した。タンパク質を変性条件及び天然条件の両方下で脱グリコシル化した。変性タンパク質の場合、３７℃で３時間にわたり、タンパク質３０μｇをＰＮＧアーゼＦ、Ｏ－グリコシダーゼ及びα－（２→３，６，８，９）－ノイラミニダーゼ、β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ及びβ－（１→４）－ガラクトシダーゼにより脱グリコシル化した。天然条件下でタンパク質３５μｇを３７℃で３日にわたり、上記と同一の酵素セットで脱グリコシル化した。脱グリコシル化タンパク質を、標準的なアッセイプロトコルを使用して、クーマシー染色ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットで分析した。
ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４のＮ末端アミノ酸の配列決定を下記の通りに実行した。標準的なプトロコルを使用して、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４約２μｇをＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上で泳動させた。製造業者の指示に従ってＸｃｅｌｌ ＳｕｒｅＬｏｃｋ（商標）システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、タンパク質をＰＶＤＦ膜上に転写した。この膜をオービタルシェイキングプラットフォーム上で約１５分にわたって０．１％（ｗ／ｖ）アミドブラックで染色し、次いでｄＨ２Ｏで洗浄して、このＰＤＶＦ膜のバックグラウンド染色を減少させた。この膜を風乾させた後、Ｎ末端を配列決定した。目的のバンドを切り出し、多重特異性結合分子のＮ末端の配列決定を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ １４０ＡマイクロＨＰＬＣを使用するオンラインフェニルチオヒダントイン分析と共に、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４９４ ＨＴシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）で実施した。
キャラクタリゼーション結果
精製されたＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４及びＴＮＦＲ２－Ｆｃの各タンパク質を凝集体、単量体及びタンパク質断片化のレベルに関してＳＥＣ－ＨＰＬＣでプロファイルした（図２Ａ及び２Ｂ）。単量体を含む主ピークは、存在する全タンパク質の約９０％を構成しており、タンパク質質量の残り約１０％は、カラム保持時間が短く、これは、より高次の種又は凝集体の存在を示す。しかしながら、ＳＥＣ－ＨＰＬＣからの単量体ピークには、２つの顕著な肩があり、これは、このピーク内のタンパク質が単一種ではなかったことを示す。クーマシー染色を伴うＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析から、還元条件下での、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４に関する２つの異なるバンド（約１００及び７５ｋＤ）並びにＴＮＦＲ２－Ｆｃ融合タンパク質に関する同様の２つの異なるバンド（約７０及び４５ｋＤ）が示された（図２Ｂ）。非還元条件下では、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４に関して３つの主要なバンドが存在し（１５０～２５０ｋＤ）、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ融合タンパク質に関して１つの主要なバンド及び１つの小さいバンド（それぞれ、約１５０及び１２０ｋＤ）が存在した。還元条件下での２つのバンド間の分子量差は、ｓｃＦｖ断片のサイズ（約２６．５ｋＤ）とほぼ等しかったことから、多重特異性結合分子がどのような形態で生成されているかを理解するために更なる分析を実施した。天然条件下での質量分析により、ＳＤＳ－ＰＡＧＥデータを確認し、２種の別々の精製されたタンパク質調製物に関して、精製されたＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４調製物中に３つの分子量（約１２５、１５２及び１７６ｋＤ）が存在した（図２Ｃ）。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにより観察されたバンドパターンが、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４の異なるグリコシル化に起因していた場合、脱グリコシル化時、これは、単一のバンドに分解されるであろう。しかしながら、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４が天然タンパク質又は変性タンパク質のいずれかとして脱グリコシル化された場合、還元条件下及び非還元条件下の両方でバンドパターンが維持された（データは示さない）。ポリクローナル抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ特異的抗体による、グリコシル化ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４及び脱グリコシル化ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４の両方のウエスタンブロット染色により、完全長の予想バンドと、より低い分子量のバンドとの両方が、抗Ｆｃ特異的抗体と反応することが示された（データは示さない）。
トランケートされた生成物の最終同定をこのタンパク質のＮ末端アミノ酸配列決定により行った。これにより、トランケートされたタンパク質のＮ末端の最初の８個のアミノ酸は、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４配列（配列番号１４）のアミノ酸１７６～１８３に対応するＳＭＡＰＧＡＶＨであることが明らかとなった。これは、ＴＮＦＲ２ドメインの４２個のアミノ酸のみが残るＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４のＮ末端での１７５個のアミノ酸のトランケーションを意味した。これにより、本発明者らは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、質量分析及びＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析からの質量データを正確に解釈することが可能となる。ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４二量体の可能な組合せは、下記の３通りであり、全てが、精製されたタンパク質調製物中に存在した：（１）完全長のホモ二量体、（２）完全長種とトランケートされた種とのヘテロ二量体、及び（３）トランケートされた種のホモ二量体。インビトロ及びインビボの両方での生物学的活性を正確に測定するために、完全長のホモ二量体の調製物を２段階カラムクロマトグラフィープロセスにより生成した。第１の工程では、プロテインＡ精製後、生成物は、８０．５％の単量体を含み（図３Ａ）、第２のカラム精製工程（ＳＰセファロース）後、単量体の割合は、９７．８％であった（図３Ｂ）。このプロセス全体の収率は、７．３％であった。
実施例２ － 示差走査熱量測定（ＤＳＣ）による熱安定性分析
熱量測定に自動型ＭｉｃｒｏＣａｌ ＶＰ－Ｃａｐｉｌｌａｒｙ ＤＳＣ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＵＳＡ）を使用した。タンパク質サンプルを２５ｍＭヒスチジン／ヒスチジン－ＨＣｌ緩衝液ｐＨ６．０中の１ｍｇ／ｍＬで試験した。このタンパク質サンプル及び緩衝液を１時間当たり９５℃の速度で２５℃～１００℃の線形ヒートランプに曝した。Ｏｒｉｇｉｎ ７ソフトウェアを使用して、緩衝液を基準としてタンパク質サンプルから減算し、熱転移を決定した。
ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４のサーモグラム（図４）は、変性温度（Ｔｍ）が６４、６７及び８４℃である３つの異なる展開転移を示す。本発明者らは、６４℃のＴｍは、ＴＮＦＲ２ドメイン及び抗ＮＧＦ ｓｃＦｖドメインの両方の変性に対応していると推定しており、６７℃及び８４℃のＴｍは、それぞれ、ＩｇＧ１ ＣＨ２及びＣＨ３の各ドメインの変性Ｔｍに特有である（例えば、Ｄｉｍａｓｉ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．３９３：６７２－９２（２００９）及び国際公開第２０１３／０７０５６５号パンフレット）。理論に拘束されることを望まないが、ｓｃＦｖは、一般には、他の抗体ドメインと比べて変性温度が低く、その展開は、単一の転移事象を特徴とする（Ｒｏｂｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｊｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｔｉｓｃｈｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。
実施例３ － ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４への抗原結合の確認
Ａ．ＥＬＩＳＡによる単一抗原結合及び二重抗原結合
Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐウェルを、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の５μｇｍｌ－１まで希釈したＴＮＦα（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）５０μｌで４℃において一晩コーティングした。翌日、このコーティング液を除去し、このウェルを室温で１時間にわたりブロッキング緩衝液［３％スキムミルク－ＰＢＳ］１５０μｌでブロックした。このウェルをＰＢＳで３回すすぎ、その後、ブロッキング緩衝液で作製したＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４ｊの希釈系列５０μｌを添加した。室温で１時間後、このウェルをＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ（０．１％ｖ／ｖ；ＰＢＳ－Ｔ）で３回洗浄した。次いで、このウェルにビオチン化ＮＧＦ ５０マイクロリットルを添加し、室温で更に１時間にわたってインキュベートし、その後、上記のように洗浄し、ストレプトアビジン－ＨＲＰ（１：１００）５０μｌを添加した。室温で１時間後、このウェルをＰＢＳ－Ｔで洗浄し、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン基質５０μｌを添加し、発色させた。この反応を１Ｍ Ｈ２ＳＯ４の添加により停止させ、４５０ｎｍｄでの吸光度を、マイクロタイタープレートリーダーを使用して測定した。得られたデータを、Ｐｒｉｓｍ ５ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して分析した。単一抗原結合ＥＬＩＳＡの場合、ウェルをＴＮＦα又はＮＧＦ－ビオチンのいずれかで上記のようにコーティングし、抗体結合を抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ特異的ＨＲＰコンジュゲート抗体（１：５０００）で検出し、上記のように発色させた。
ＥＬＩＳＡの結果を図５に示す。ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４を、ＴＮＦα抗原及びＮＧＦ抗原の両方に結合するように設計した。単一抗原結合を、最初に９６ウェルマイクロタイタープレート上に１種の抗原を固定化し、続いてＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４の連続希釈液を添加することにより実施した。特異的結合を、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート抗ＩｇＧ Ｆｃ特異的抗体を使用することにより検出した。二重抗原結合ＥＬＩＳＡの場合、第１の抗原ＴＮＦαをＥＬＩＳＡプレート上に固定し、次いでＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４の連続希釈液を添加し、続いて第２のビオチン化抗原ＮＧＦを固定濃度で添加した。特異的結合を、ＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジンを使用して検出した。単一抗原結合ＥＬＩＳＡでは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４は、ＴＮＦα及びＮＧＦに結合した（図５Ａ及び５Ｂ）。二重抗原結合ＥＬＩＳＡでは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４は、ＴＮＦα及びＮＧＦの両方に同時に結合した（図５Ｃ）。
Ｂ．表面プラズモン共鳴による同時抗原結合
同時抗原結合実験を、ＢＩＡｃｏｒｅ ２０００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、本質的にはＤｉｍａｓｉ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．３９３：６７２－９２（２００９）で説明されているように実行した。簡潔に説明すると、ＣＭ５センサーチップを使用して、１００ｎＭでＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４の約１５００共鳴単位を固定した。次いで、センサーチップ表面をＴＮＦα及びＮＧＦの同時結合に使用した。抗原をＨＢＳ－ＥＰ緩衝液［１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、０．００５％ Ｐ２０］で調製した。全ての結合測定に関して、３０μＬ／分の流速を使用した。ＴＮＦα及びＮＧＦに対する多重特異性抗体の同時結合を測定するために、１μＭ ＴＮＦα（分子量１７．５ｋＤ）をセンサーチップ表面上に注入し、注入の完了時にＴＮＦα及びＮＧＦ（分子量１３．５ｋＤ）（両方とも１μＭ）の混合物を注入した。ＮＧＦ結合段階中でのＴＮＦα解離に起因するシグナルロスを防止するために、ＴＮＦαをＮＧＦとの混合物に含めた。コントロールとして、同様の結合手順を実施し、最後の注入ではＴＮＦαのみを添加し、この注入に関する共鳴単位の更なる増加はなく、これは、ＴＮＦαが飽和レベルで結合していることを示した。ＴＮＦα及びＮＧＦの注入順序を逆にして、同様の結合実験及びコントロール実験を実施した。
ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４の同時抗原結合を表面プラズモン共鳴によりキャラクタライズした。結合事象を逐次的に定性分析した。アミノカップリング化学を使用して、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４をセンサーチップ表面上に共有結合的に固定した。その後、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４への結合が飽和レベルになるまで第１の抗原を注入し、第２の抗原を抗原１との等モル混合として注入した。結合センサーグラムから、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４がＴＮＦα及びＮＧＦに同時に結合することが明確に示された（図６）。抗原注入の順序に関係なく、これらの２種の抗原の同時結合が起きた。
実施例４ － ＮＧＦ誘発性ＴＦ－１細胞増殖の阻害
ＴＦ－１細胞（ＥＣＡＣＣカタログ番号９３０２２３０７）を９６ウェル組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ）中の血清フリー培養培地５０μｌに１．５×１０４個の細胞／ウェルで播種し、３７℃及び５％ＣＯ２で１８時間にわたってインキュベートした。組換えヒト（Ｓｉｇｍａ）又はマウスＮＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を９６ウェル丸底プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）中において、３７℃で３０分にわたり、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４、ＭＥＤＩ－５７８ ＩｇＧ１ ＴＭ ＹＴＥ、ＭＥＤＩ－５７８に関する結合していないＩｇＧ１ ＴＭ ＹＴＥアイソタイプコントロール又は結合していない二重特異性アイソタイプコントロールＲ３４７ Ｂｓ３Ａｂの希釈液と共に予めインキュベートした。次いで、この細胞プレートに各サンプル５０マイクロリットルを添加し、３７℃で４８時間にわたってインキュベートした。インキュベート期間後、細胞ＴＩＴＲＥ ＧＬＯ（登録商標）アッセイ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）１００μｌを添加し、このプレートを３７℃及び５％ＣＯ２で１０分にわたってインキュベートした。次いで、標準的な発光プロトコルを使用して発光を測定した。抗体の非存在下での標準的なＮＧＦ誘発性ＴＦ－１増殖を図７Ａに示す。
ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４の機能的活性を、ＮＧＦ誘発性ＴＦ－１増殖を使用して決定した。ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４は、ヒトＮＧＦにより誘発される増殖及びマウスＮＧＦにより誘発される増殖の両方を完全に阻害し得た（それぞれ、図７Ｂ及び７Ｃ）。図７Ｂ：ＴＦ－１細胞を、ＥＣ８０濃度に対応する組換えヒトＮＧＦで刺激した。細胞を、４８時間にわたり、抗体の希釈系列を有するリガンドと共にインキュベートし、その後、細胞ＴＩＴＲＥ ＧＬＯ（登録商標）アッセイ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）による１０分にわたる培養により、細胞増殖を定量した。図７Ｃ：ＴＦ－１細胞を、ＥＣ８０濃度に対応する組換えマウスＮＧＦで刺激した。細胞を、４８時間にわたり、抗体の希釈系列を有するリガンドと共にインキュベートし、その後、細胞ＴＩＴＲＥ ＧＬＯ（登録商標）アッセイ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）による１０分にわたる培養により、細胞増殖を定量した。これらのデータから、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４のＮＧＦ阻害部分は、生物学的に活性であり、ＩｇＧ１ＴＭと同様のＭＥＤＩ－５７８に対する効力でＮＧＦ誘発性増殖を阻害することが実証される。同様のデータは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢ及び別のＴＮＦ－ＮＧＦ多重特異性結合分子ヌディマブｖａｒＢに観察しても観察された（図７Ｄ及び７Ｅ）。ヌディマブｖａｒＢは、完全な抗ＴＮＦα抗体を含み、即ちＨ２Ｌ２形式で２本の完全な重鎖及び２本の完全な軽鎖を含む抗体を含み、ＭＥＤＩ－５７８ ｓｃＦｖは、抗ＴＮＦα抗体の重鎖のＣ末端に融合している。ヌディマブｖａｒＢの軽鎖は、配列番号２０で示されており、ヌディマブｖａｒＢの重鎖は、配列番号２２で示されている。
実施例５ － ＴＮＦαにより誘発されるＵ９３７細胞アポトーシスの阻害
Ｕ９３７細胞（ＥＣＡＣＣカタログ番号８５０１１４４０）を培養培地５０μｌ中に８×１０５個の細胞／ウェルの濃度において、壁が黒色の９６ウェル組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ）中に蒔いた。Ｕ９３７細胞を、ＥＣ８０濃度に対応する組換えヒトＴＮＦαで刺激した。細胞を、２時間にわたり、抗体の希釈系列を有するリガンドと共にインキュベートし、その後、カスパーゼ３活性をカスパーゼ３アッセイ反応緩衝液による２時間にわたる培養により定量した。ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４、結合していない二重特異性アイソタイプコントロール、Ｒ３４７ Ｂｓ３Ａｂ及びエタネルセプトを３７℃で３０分にわたって細胞と共に予めインキュベートした。これに続いて、組換えヒトＴＮＦα（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）５０μｌを添加して、最終アッセイ濃度２０ｎｇ／ｍｌを得、続いて３７℃で２時間インキュベートした。インキュベーション期間後、カスパーゼ３アッセイ反応緩衝液（０．２％ｗ／ｖ ＣＨＡＰＳ、０．５％ｖ／ｖ Ｉｇｅｐａｌ ＣＡ－６３０、２００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２０μＭ ＤＥＶＤ－Ｒ１１０基質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））５０μｌを添加し、細胞を３７℃で２．５時間にわたってインキュベートした。４７５ｎｍでの励起及び５１２ｎｍでの発光により、蛍光を測定した。ＴＮＦαアンタゴニストの非存在下でのカスパーゼ活性を図８Ａに示す。
ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４の機能的活性を、Ｕ９３７細胞におけるＴＮＦα誘発性カスパーゼ３活性アッセイを使用して決定した。ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４は、エタネルセプトと同様に、ＴＮＦα誘発性カスパーゼ３活性を完全に疎外した（図８Ｂ）。これにより、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４のＴＮＦα阻害部分は生物学的に活性であり、エタネルセプトと同様の効力を有することが明確に示されている。同様のデータをＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢ及びヌディマブｖａｒＢに関しても観察した（図８Ｃを参照されたい）。
実施例６ － インビボアッセイ
全てのインビボ処置をＵＫ Ｈｏｍｅ Ｏｆｆｉｃｅ Ａｎｉｍａｌｓ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）Ａｃｔ（１９８６）に従って実行しており、現地の倫理委員会の承認を得た。全体を通して、雌Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，ＵＫ）を使用した。マウスを、１２時間明／暗サイクル（点灯０７：００～１９：００）下において食餌及び水への自由なアクセスで、個別換気ケージ（ＩＶＣ）中において１つのケージ当たり５／６匹の群で飼育した。飼育及び処置の部屋を２４℃で維持しており、従来のラジオ局により、一定のバックグラウンドノイズを維持した。全てのマウスに対して、各試験開始の少なくとも５日前に、識別するために麻酔（酸素中に３％イソフルラン）下でトランスポンダを挿入した。
Ａ．神経障害性疼痛のＳｅｌｔｚｅｒモデル
機械的痛覚過敏を、無痛覚計を使用して決定した（Ｒａｎｄａｌｌ ＬＯ，Ｓｅｌｉｔｔｏ ＪＪ，Ａｒｃｈ Ｉｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎ Ｔｈｅｒ．１１１：４０９－１９（１９５７））（Ｕｇｏ Ｂａｓｉｌｅ）。離脱応答が観察されるまで、各後足の背面に順番に力を増加させながら加えた。この時点で力の適用を停止し、体重をグラムで記録した。データを同側の足及び反対側の足についてグラムでの離脱閾値として表した。ベースラインの読み取りの確立後、マウスを、ほぼ等しい同側／反対側比を有する２つ群に分割し、外科手術を施した。マウスを３％イソフルランで麻酔した。この後、左坐骨神経の約１ｃｍを大腿中央の位置で切開による鈍的切開によって露出させた。次いで、縫合糸（１０／０ Ｖｉｒｇｉｎ Ｓｉｌｋ：Ｅｔｈｉｃｏｎ）を背側の神経の３番に通して、きつく結んだ。接着剤を使用して切開を閉じて、試験開始前の少なくとも７日間にわたり、マウスを回復させた。偽手術を施したマウスは同じプロトコルを受けたが、神経の露出後、創傷を縫合して回復させた。マウスを手術後の７日目及び１０日目に痛覚過敏の発症について試験した。１０日目の試験後、手術したマウスを、ＣＡＴ２５１ ＩｇＧ１アイソタイプコントロール（０．０３ｍｇ／ｋｇ ｓ．ｃ．）、エタネルセプト（０．０１ｍｇ／ｋｇ ｓ．ｃ．）、ＭＥＤＩ－５７８（０．０３ｍｇ／ｋｇ ｓ．ｃ．）又はエタネルセプト（０．０１ｍｇ／ｋｇ ｓ．ｃ）及びＭＥＤＩ－５７８（０．０３ｍｇ／ｋｇ ｓ．ｃ）の組合せが投与された群に更に細分割した。偽手術を施したマウス全てにＣＡＴ２５１（０．０３ｍｇ／ｋｇ ｓ．ｃ．）を投与した。用量後４時間、１、２、３、４及び７日で機械的痛覚過敏を測定した。
機械的痛覚過敏モデルでのエタネルセプト及びＭＥＤＩ－５７８の共投与は、偽手術を施したコントロールと比較した場合、手術後１０日目に同側／反対側比における有意な低下として顕在化した（図９）。エタネルセプト（０．０１ｍｇ／ｋｇ ｓ．ｃ．）又はＭＥＤＩ－５７８（０．０３ｍｇ／ｋｇ ｓ．ｃ．）いずれかの単回用量の投与では、この痛覚過敏を有意に逆転させ得なかった。ＭＥＤＩ－５７８（０．０３ｍｇ／ｋｇ ｓ．ｃ．）と一緒のエタネルセプト（０．０１ｍｇ／ｋｇ ｓ．ｃ．）の共投与により、用量後４時間で機械的痛覚過敏が有意に逆転し、この効果は、用量後７日間を通して維持された。
第２の試験では、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４の効果を評価した。機械的痛覚過敏の確立後、手術後１３日目にＲ３４７ Ｂｓ３Ａｂアイソタイプコントロール（０．０３ｍｇ／ｋｇ ｓ．ｃ．）、エタネルセプト（０．０１ｍｇ／ｋｇ ｓ．ｃ．）、ＭＥＤＩ－５７８（０．０３ｍｇ／ｋｇ ｓ．ｃ．）又はＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４（０．０１ｍｇ／ｋｇ若しくは０．０３ｍｇ／ｋｇ ｓ．ｃ．）をマウスに投与した。偽準備した動物にＲ３４７ Ｂｓ３Ａｂアイソタイプコントロール（０．０３ｍｇ／ｋｇ ｓ．ｃ．）を投与した。マウスを、上記で説明したように、用量後４時間並びに用量後１、２、４及び７日目に機械的痛覚過敏に関して試験した。
ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４の投与により、偽手術を施したコントロールと比較した場合、手術後１０日目に同側／反対側比における有意な低下が生じた（図１０Ａ）。エタネルセプト（０．０１ｍｇ／ｋｇ ｓ．ｃ．）又はＭＥＤＩ－５７８（０．０３ｍｇ／ｋｇ ｓ．ｃ．）いずれかの投与では、機械的痛覚過敏を有意に逆転させ得なかった。しかしながら、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４（０．０１及び０．０３ｍｇ／ｋｇ ｓ．ｃ．）の投与により、用量後４時間で機械的痛覚過敏が有意に逆転し、効果は、用量後６日間を通して維持された。Ｒ３４７コントロールＢｓ３Ａｂの投与後には、効果が見られなかった。ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢを投与した場合、同様のデータが観察された（図１０Ｂを参照されたい）。これらのデータから、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４は、非常に低い用量で疼痛を有意に逆転させ得ることが示差されており、ＭＥＤＩ－５７８又はエタネルセプトいずれかの単独では、同等の用量は、効果がないか又は最小であることが示された。
Ｂ．慢性関節痛モデル
機械的過敏を、マウスインキャパシタンステスターを使用して決定した。マウスを別々のセンサーに後足を載せて装置中に置き、体重分布を、４秒の期間をかけて算出した。データをグラムでの同側及び反対側の体重負荷の比として表した。
ベースラインの読み取りの確立後、マウスを、ほぼ等しい同側／反対側比を有する２つ群に分割した。下記の技術を使用して、関節内注射を実行した：動物を、酸素中の３％イソフルランを使用して麻酔し、左膝を剪毛して清浄にした。各マウスの膝関節に、１００μｌ Ｈａｍｉｌｔｏｎシリンジに搭載された２５ゲージ針を使用して、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）（１０ｍｇ／ｍｌ）又はビヒクル（軽油）いずれか１０μｌを注射した。注射を膝関節の滑膜腔中に直接行った。上記で説明したように、マウスを回復させ、注射後７日目及び１０日目に機械的過敏の変化に関して再試験した。１０日目での試験後、ＦＣＡ処置マウスを群に更に無作為化し、１３日目にマウスにエタネルセプト（０．０１ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．）又はビヒクルを投与し、その後、ＭＥＤＩ－５７８（０．０３ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．）又はＣＡＴ２５１アイソタイプコントロール（０．０３ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．）の用量を投与した。上記で説明したように、用量後４時間並びに用量後１、２、４及び７日目にマウスを機械的過敏に関して試験した。
エタネルセプト及びＭＥＤＩ－５７８の共投与の効果を、炎症性疼痛の関節内ＦＣＡモデルを使用して評価した。ＦＣＡの関節内投与により、ビヒクルコントロールと比較した場合に７及び１０日目に同側／反対側比の有意な低下として顕在化した機械的過敏が引き起こされた（図１１）。偽処置群では、処置前のベースラインレベルと比較して、同側／反対側比の低下は観察されなかった。エタネルセプト（０．０１ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．）＋ＣＡＴ２５１（０．０３ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．）又はＰＢＳ（１０ｍｌ／ｋｇ ｉ．ｐ．）＋ＭＥＤＩ－５７８（０．０３ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．）の投与により、用量後４時間並びに用量後１、２、４及び７日目にＦＣＡ誘発性機械的過敏をわずかに逆転させたが、これは、統計学的有意性に達し得なかった。しかしながら、エタネルセプト（０．０１ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．）＋ＭＥＤＩ－５７８（０．０３ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ）の投与により、用量後の全ての試験時間でＦＣＡ誘発性機械的過敏を有意に逆転させた。
第２の試験では、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４の効果を評価した。ＦＣＡ誘発性機械的過敏の確立後、ＦＣＡ後１３日目にマウスにＲ３４７ Ｂｓ３Ａｂアイソタイプコントロール（０．０１ｍｇ／ｋｇ ｓ．ｃ．）、エタネルセプト（０．０１ｍｇ／ｋｇ ｓ．ｃ．）、ＭＥＤＩ－５７８（０．０１ｍｇ／ｋｇ ｓ．ｃ．）又はＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４（０．００３ｍｇ／ｋｇ若しくは０．０１ｍｇ／ｋｇ ｓ．ｃ．）を投与した。再び、上記で説明したように、用量後４時間後並びに用量後１、２、４及び７日目にマウスを機械的過敏に関して試験した。
エタネルセプト及びＭＥＤＩ－５７８個々の効果と比較したＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４（「二重特異性」）の効果を図１２に示す。エタネルセプト（０．０１ｍｇ／ｋｇ ｓ．ｃ．）もＭＥＤＩ－５７８（０．０１ｍｇ／ｋｇ ｓ．ｃ．）も、用量後のあらゆる時点でＦＣＡ誘発性機械的過敏を有意に逆転させなかった。しかしながら、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４の投与により、ＦＣＡ誘発性機械的過敏が有意に逆転した。高用量のＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４（０．０１ｍｇ／ｋｇ ｓ．ｃ．）は、この試験の持続期間中に有意な活性を示したが、低用量（０．００３ｍｇ／ｋｇ ｓ．ｃ．）は、用量後１日目に有意性に達し、この試験の持続期間中に高用量と同様のレベルのままであった。
Ｃ．ラットにおける機械的過敏の確立されたＦＣＡ誘発性モデル
フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）の足底内注射により、炎症反応が引き起こされ、この炎症反応により過敏症及び浮腫が誘発され、臨床的な炎症性疼痛のいくつかの側面が模倣される。これらの効果を、体重負荷を測定するために機器を使用して調べ得る。体重負荷方法を使用するＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４ ＦＣＡ誘発性過敏症の潜在的な抗痛覚過敏性質の評価。ナイーブラットは、このラットの体重を２本の後足間に等しく分配する。しかしながら、注射した（左）後足に炎症があり、且つ／又は痛みを感じる場合、体重は、冒された足により少ない体重がかかるように再分配される（損傷した足では体重負荷が低減する）。各後肢を通じた体重負荷を、ラットインキャパシタンステスター（Ｌｉｎｔｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＵＫ）を使用して測定する。ラットを別々のセンサーに後足を載せてインキャパシタンステスター中に置き、両後肢によって及ぼされた平均の力を４秒間にわたって記録する。
この試験のために、ナイーブラット（雄、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（Ｈａｒｌａｎ、ＵＫ）、１９８～２５８ｇ）をホームケージ中において処置室に気候順応させ、食餌及び水を自由に摂らせた。インキャパシタンステスターへの慣らしを数日かけて実施した。ベースラインの体重負荷の記録を取った後、傷害を導入した。ＦＣＡ（Ｓｉｇｍａから入手可能、１ｍｇ／ｍｌ溶液１００μｌ）の左後足へ足底内注射により、炎症性過敏症を誘発した。処置前の体重負荷測定を行って、ＦＣＡ後２３時間で過敏症を評価した。
次いで、動物をランク付けし、ラテン方格法における体重負荷ＦＣＡウインドウに従って処置群に無作為化した。ＦＣＡ注射後２４時間後、動物を、０．００３、０．０１、０．０３、０．３及び３ｍｇ／ｋｇでｉ．ｖ．投与するＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４（「二重特異性」）、３ｍｇ／ｋｇでｉ．ｖ．投与する陰性コントロール抗体ＮＩＰ２２８（ハプテンニトロフェノールに結合するように産生された抗体）、２ｍｌ／ｋｇでｐ．ｏ．投与するビヒクル（１％メチルセルロース）又は１０ｍｇ／ｋｇでｐ．ｏ．投与するインドメタシンのいずれかで処置した。
体重負荷を抗体／薬物処置の４及び２４時間後に評価した。各時点で処置群とビヒクルコントロール群とを比較することにより、データを分析した。統計学的分析には、ＩｎＶｉｖｏＳｔａｔ（ｉｎｖｉｖｏｓｔａｔ．ｃｏ．ｕｋ）を使用する反復測定ＡＮＯＶＡ及びこれに続く計画比較検定（ｐ＜０．０５を有意とみなした）が含まれた。結果を図１３に示す。４及び２４時間でインドメタシン（１０ｍｇ／ｋｇ）により過敏症の有意な逆転を観察した。０．３及び３ｍｇ／ｋｇを投与したＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４は、４及び２４時間の両方で過敏症の有意な逆転を示し、０．００３及び０．０３ｍｇ／ｋｇで投与したＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４も過敏症の有意な逆転を示したが、２４時間においてのみであった。アイソタイプコントロールであるＮＩＰ２２８は、いずれの時間点でもＦＣＡ反応に対する有意な効果がなかった。
実施例７ － ＴＮＦα及びＮＧＦによるｐ３８リン酸化
文献により、ｐ３８リン酸化が神経障害性疼痛の発症において重要な役割を果たすことが示唆されている。例えば、ｐ３８阻害剤による処置は、神経部分損傷モデルにおいて（Ｗｅｎ ＹＲ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌｏｇｙ ２００７，１０７：３１２－３２１）及び坐骨の炎症性神経障害モデルにおいて（Ｍｉｌｌｉｇａｎ ＥＤ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２００３，２３：１０２６－１０４０）、神経障害性疼痛の症状の発症を予防することが示されている。本実験では、ｐ３８リン酸化に関するＴＮＦα、ＮＧＦ並びにＴＮＦα及びＮＧＦの組合せの役割を細胞培養アッセイで調べた。簡潔に説明すると、Ｎｅｕｒｏｓｃｒｅｅｎ－１細胞（ＰＣ－１２ラット神経内分泌細胞のサブクローン）をＴＮＦα、ＮＧＦ又はＴＮＦα及びＮＧＦの組合せの漸増量と共にインキュベートした。２０分間のインキュベート期間後、ホスホ－３８を、均一時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）アッセイ（Ｃｉｓｂｉｏ）を使用して定量した。
ＨＴＲＦアッセイ：ＴＮＦα、ＮＧＦ又はＴＮＦα及びＮＧＦの組合せによる刺激後、細胞上清を速やかに除去し、細胞を溶解緩衝液に溶解させた。ホスホ－ｐ３８ ＭＡＰＫ（Ｔｈｒ１８０／Ｔｙｒ１８２）を、下記の２つの異なる特異的抗体：ユウロピウムクリプテート（ドナーフルオロフォア）にコンジュゲートしている抗ホスホ－ｐ３８抗体及びｄ２（アクセプターフルオロフォア）にコンジュゲートしている抗ｐ３８（全）抗体を使用するサンドイッチアッセイフォーマットで溶解物中において検出した。抗体を細胞溶解物と共にインキュベートし、ＨＴＲＦ比を、ＥｎＶｉｓｉｏｎ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して行った６６５ｎｍ及び６２０ｎｍでの蛍光測定値から算出した。
データを６６５ｎｍでの発光と６２０ｎｍでの発光との比として算出したＨＴＲＦ比として表す。ホスホ－ｐ３８反応からのＨＴＲＦ比を示すヒートマップを図１４に示す。ＴＮＦα、ＮＧＦ又はＴＮＦα及びＮＧＦの組合せの効果を示す用量反応曲線を図１５に示す。図１５から分かるように、ホスホ－ｐ３８に対する高濃度のＴＮＦα及びＮＧＦの併用効果は、いずれかの因子単独により誘発されるホスホ－ｐ３８シグナルの予測される合計と比べて大きい。このデータから、ＴＮＦα及びＮＧＦが一緒に作用してｐ３８リン酸化を誘発し得ることと、この２つ経路が、疼痛を引き起こす分子シグナル伝達に関与し得ることとが示唆される。
実施例８ － ＴＮＦα及びＮＧＦによるＥＲＫリン酸化
ｐ３８同様に、ＥＲＫも神経障害性疼痛発症中に活性化される（Ｚｈｕａｎｇ ＺＹ ｅｔ ａｌ．，Ｐａｉｎ ２００５，１１４：１４９－１５９）。本実験では、ＥＲＫリン酸化に関するＴＮＦα、ＮＧＦ並びにＴＮＦα及びＮＧＦの組合せの役割を細胞培養アッセイで調べた。簡潔に説明すると、Ｎｅｕｒｏｓｃｒｅｅｎ－１細胞（ＰＣ－１２ラット神経内分泌細胞のサブクローン）をＴＮＦα、ＮＧＦ又はＴＮＦα及びＮＧＦの組合せの漸増量と共にインキュベートした。２０分間のインキュベート期間後、ホスホ－ＥＲＫを、ＨＴＲＦアッセイ（Ｃｉｓｂｉｏ）を使用して定量した。
ＨＴＲＦアッセイ：刺激後、細胞上清を速やかに除去し、細胞を溶解緩衝液に溶解させた。ホスホ－ＥＲＫ ＭＡＰＫ（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）を、下記の２つの異なる特異的抗体：ユウロピウムクリプテート（ドナーフルオロフォア）にコンジュゲートしている抗ホスホ－ＥＲＫ抗体及びｄ２（アクセプターフルオロフォア）にコンジュゲートしている抗ＥＲＫ（全）抗体を使用するサンドイッチアッセイフォーマットで溶解物中において検出した。抗体を細胞溶解物と共にインキュベートし、ＨＴＲＦ比を、ＥｎＶｉｓｉｏｎ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して行った６６５ｎｍ及び６２０ｎｍでの蛍光測定値から算出した。
データを６６５ｎｍでの発光と６２０ｎｍでの発光との比として算出したＨＴＲＦ比として表す。ホスホ－ＥＲＫ反応からのＨＴＲＦ比を示すヒートマップを図１６に示す。ＴＮＦα、ＮＧＦ又はＴＮＦα及びＮＧＦの組合せの効果を示す用量反応曲線を図１７に示す。図１７から分かるように、低量のＴＮＦα単独では、ホスホ－ＥＲＫが誘発されなかったが、より高量では、ＮＧＦ誘発性ホスホ－ＥＲＫが増強された。このデータから、ＴＮＦα及びＮＧＦが一緒に作用してｐ３８リン酸化を誘発し得ることと、これらの２つ経路が、疼痛を引き起こす分子シグナル伝達に関与し得ることとが示唆される。
実施例９ － 膝の有痛性変形性関節症を有するヒトにおけるＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢの様々な用量の効果
膝の有痛性変形性関節症を有する１８～８０歳の対象に対して多施設無作為化二重盲検プラセボ対照インターリーブ単回漸増用量（ＳＡＤ）及び複数回漸増用量（ＭＡＤ）試験を計画した。ＳＡＤコホート１には、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢを投与した３例の患者と、プラセボを投与した２例とが含まれていた。ＳＡＤコホート２～７には、各８例の患者が含まれ、各コホートの６例には、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢを投与しており、各コホートの２例には、プラセボを投与した。ＭＡＤコホート８及び９には、各１８例の患者が含まれ、各コホートの１２例には、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢを投与しており、各コホートの６例には、プラセボを投与した。ＭＡＤコホート１０及び１１には、各１２例の患者が含まれ、各コホートの９例には、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢを投与しており、各コホートの３例には、プラセボを投与した。この試験デザインの簡略化したレイアウトを１８Ａ及び１８Ｂに示す。
ＳＡＤコホートの対象に二重盲検でＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢ又はプラセボのいずれかを単回注入した。退院後、経過観察期間の終了まで、２４時間の記憶を反映するために毎朝のほぼ同一時間に１１点ＮＲＳ（０～１０）で毎日疼痛を記録するように対象に指示した。
驚くべきことに、２～１０００μｇ／ｋｇの用量の範囲でのＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢの単回静脈内用量は、プラセボに対して毎日の平均疼痛スコアを（ピーク効果で）０．６９～３．４５ポイント反転させるように思われた（図１９Ａ～１９Ｂ）。この効果は、５０、２５０及び１０００μｇ／ｋｇの用量で統計的に有意である（ｐ≦０．０１）。この効果の持続期間は、驚くべきことに、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢの半減期（３～４日）と比較して１０日超続いた。プラセボを投与した対象の疼痛スコアの減少は、約０．５ポイントであるように思われる。このプラセボ効果は、比較的低く、且つ安定しているように思われる。
Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｏｎｔａｒｉｏ ａｎｄ ＭｃＭａｓｔｅｒｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｉｅｓ ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ指標（ＷＯＭＡＣ）は、ＯＡを有する対象の慢性疼痛の結果としての機能障害を測定するための質問表ベースのツールである。驚くべきことに、０．３～１０００μｇ／ｋｇの範囲の用量でのＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢの単回投与により、平均ＷＯＭＡＣ疼痛サブスケールスコアが、１０日以上の期間にわたって最大で約３ポイント有意に低下した（図２０Ａ～２０Ｂ）。５０、２５０及び１０００μｇ／ｋｇの用量では、疼痛サブスケールスコアのピーク反転は、２．０～２．９の範囲であり、且つ統計的に有利であり、ｐ値は０．０６以下である。疼痛ＮＲＳエンドポイントと同様に、単回用量後の効果の持続期間（約１０日以上）は、半減期が３～４日である分子の予想よりも長かった。ピーク効果は、５０及び２５０μｇ／ｋｇそれぞれの用量で４６～５５％という遊離ＮＧＦの測定した抑制に対応していた（図２１）。
末梢中の遊離ＮＧＦのレベルへのＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢの効果を、Ｓｉｎｇｕｌｅｘ Ｅｒｅｎｎａアッセイを使用して決定した。簡潔に説明すると、用量前、用量後１、８及び２４時間、８、１５、２２、２９日目（２つの最高用量のみに関して４３及び５６日目）の時点で各対象から血液サンプルを採取した。血漿サンプルを下記の工程に従って調製してアッセイした：（１）サンプルと、抗ＮＧＦ ｍＡｂでコーティングされた磁気ビーズとを混合する、（２）捕捉されたＮＧＦ磁気ビーズ複合体を、蛍光標識された抗ヒトＮＧＦ抗体と混合する、（３）ビーズ複合体を溶出させて蛍光標識を放出させる、（４）Ｅｒｅｎｎａ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅリーダーで蛍光シグナルを読み取る。遊離ＮＧＦの抑制を算出し、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢの各濃度での用量後１４日期間にわたる平均抑制を算出してプロットした（図２２）。１４日にわたる遊離ＮＧＦの平均抑制は、０（０．３μｇ／ｋｇ）～約６５％（１０００μｇ／ｋｇ）の範囲であった。
末梢中の全ＮＧＦのレベルへのＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢの効果を、Ｑ２ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓにより開発されたＬＣ－ＭＳ／ＭＳアッセイを使用して決定した。簡潔に説明すると、用量前、用量後１、８及び２４時間、８、１５、２２、２９日目（２つの最高用量のみに関して４３及び５６日目）の時点で各対象から血液サンプルを採取した。血清サンプルを、Ｎｅｕｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，８５：１７１９－１７２６で説明されているものと同様の方法で調製してアッセイした。ＳＡＤコホート１～４（０．３～５０μｇ／ｋｇ）の各対象に関して、全ＮＧＦレベルの上昇を算出してプロットし、コホート１～７のそれぞれに関して、平均全ＮＧＦレベルを算出した。ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢの単回投与の用量の増加後、全ＮＧＦのレベルの明確な上昇を観察した（図２３；表２）。理論に拘束されることを望まないが、この上昇は、ＮＧＦが結合しているＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢの半減期と一致して増加するＮＧＦの半減期に起因している可能性がある。
Figure 2023543005000002
各コホートの２例の対象に関して、全ＮＧＦが明確に上昇しなかったことに留意すべきである。この試験は、本出願の出願時には盲検化されたままであることから、プラセボサンプルが存在することが予測される。コホート３及び４に関して、抗薬物抗体の全ＮＧＦレベルへの明確な効果が観察された。この効果は、おそらく、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢの暴露の減少及び効果の持続期間の対応する短縮に起因していた。
ＴＮＦαレベルのレベルを測定するための代理として、Ｓｉｍｏａプラットフォーム技術を使用してＣＸＣＬ－１３レベルを測定し得る。ＣＸＣＬ－１３遺伝子発現は、リンホトキシンアルファ経路により制御されている。ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢは、ＴＮＦα及びリンパ毒素アルファに結合しており、従って、ＣＸＣＬ－１３発現のレベルへの効果を有すると仮定した。用量前、用量後１、８及び２４時間、８、１５、２２、２９日目（２つの最高用量のみに関して４３及び５６日目）の時点で各対象から血液サンプルを採取した。血清サンプルを調製し、次いでＳｉｍｏａ ＣＸＣＬ－１３アッセイでアッセイした。明確な用量反応を観察しており、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢの増加した単回用量の投与後、ＣＸＣＬ－１３レベルの抑制の増加を観察した（図２４）。
静脈内投与したＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢの血清レベルを単回漸増用量後の様々な時間間隔で決定した。ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢの観察された血清中薬物動態から、全てのコホートが暴露されており、曝露量は平均して用量依存的に増加することが示された（図２５）。図２５は、皮下投与により、１０日超にわたってＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢｂの比較的安定した血清レベルが得られたことを示す。
皮下投与による絶対的バイオアベイラビリティを、表３に示すように、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢの５０μｇ／ｋｇの皮下投与対５０μｇ／ｋｇの静脈内投与の単回用量からの曲線下面積（ＡＵＣ）の幾何平均値（ｎ＝６）を比較することにより算出した。ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢの皮下投与のバイオアベイラビリティは驚くほど低いことが分かり、２１％と推定した。表３ａに示すように、推定される絶対的バイオアベイラビリティ値の９０％信頼区間は、０．１６２７～０．２７８１であった。
Figure 2023543005000003
Figure 2023543005000004
ＭＡＤコホートの対象に二重盲検法で２週間毎に１～４５０μｇ／ｋｇの範囲のＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢ（合計４回の用量）又はプラセボの反復静脈内注入を投与した。ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢの観察された血清中薬物動態から、全てのコホートが暴露されており、曝露量は平均して用量依存的に増加することが示された（図２６）。暴露反応分析から、１５０～４５０μｇ／ｋｇの静脈内用量範囲で最大の疼痛軽減効果に達したことが示唆される（図２７；表４）。
Figure 2023543005000005
退院後、経過観察期間の終了まで、２４時間の記憶を反映するために毎朝のほぼ同一時間に１１点ＮＲＳ（０～１０）で毎日疼痛を記録するように対象に指示した。１５０μｇ／ｋｇのＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢ及び４５０μｇ／ｋｇのＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢのいずれかの反復注射により、プラセボ処置コントロールと比較して疼痛が明確に軽減された（図２８Ａ）。これらの用量の両方は、オピオイドであるオキシコドンの４０ｍｇ用量、抗ＮＧＦ抗体であるタネズマブの２．５ｍｇ用量又は５ｍｇタネズマブと比較して疼痛も大きく軽減されており（図２８Ｂ）、且つファシヌマブ、フルラヌマブ又はタネズマブで達成された疼痛の最大軽減と比較して、疼痛の軽減でより有効であった（図２８Ｃ）。
抗薬物抗体（ＡＤＡ）レベルを免疫原性評価（Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ．Ｇｕｉｄａｎｃｅ ｆｏｒ ｉｎｄｕｓｔｒｙ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ．Ａｕｇｕｓｔ ２０１４。２０１８年７月２７日にアクセスしたｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ｄｏｗｎｌｏａｄｓ／ｄｒｕｇｓ／ｇｕｉｄａｎｃｅｃｏｍｐｌｉａｎｃｅｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ／ｇｕｉｄａｎｃｅｓ／ｕｃｍ３３８８５６．ｐｄｆ．から利用可能）により測定した。全体として、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢの反復用量を投与した対象におけるＡＤＡ有病率は、７０％であった（５０例の対象の３５例）。ＡＤＡ有病率を、任意の時点（ベースライン及び／又はベースライン後）でＡＤＡ陽性であった対象の割合と定義した。下記の表５に示すように、ごく一部の患者が高いＡＤＡ力価を有していたものの、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢ用量レベルとＡＤＡ有病率との間に明確な関係がなかった。高いＡＤＡ力価がＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢへの暴露及び有効性に影響を及ぼすかどうかを決定するために、１５０μｇ／ｋｇのＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢで処置した個々の対象において、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢへの暴露、ＡＤＡ力価及び疼痛軽減を測定した。驚くべきことに、高いＡＤＡ力価にもかかわらず、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢへの有意な暴露が観察されており、疼痛軽減効果が５０日超にわたって維持された（図２９）。加えて、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ｖａｒＢの半減期は、ＡＤＡ力価が低い対象ほど高く、４５０μｇ／ｋｇのＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢで処置された患者では、高いＡＤＡ力価はなかった（図３０）。重要なことに、ＡＤＡと有害事象との間に関連はなかった。
Figure 2023543005000006
驚くべきことに、この試験のＭＡＤ段階のデータを使用して、本発明者らは、体重が暴露に関する臨床的に有意な共変数ではないことも発見した（ｐ＝０．６１；図３１）。
実施例１０ － 膝の有痛性変形性関節症を有するヒトにおけるＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢの固定皮下用量の効果
体重はＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢへの暴露に関する臨床的に有意な共変数ではないという発見に基づいて、本発明者らは、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢの固定投与戦略がヒトにおける疼痛の処置に有効であろうと仮定した。そのため、膝の有痛性変形性関節症を有する１８～８０歳の対象に関して、多施設無作為化二重盲検プラセボ対照臨床試験を設計した。約２５５例の対象が処置期間を完了するようにするために、約３００例の適格対象をＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢ処置又はプラセボに無作為に割り当てる。対象に１２週間にわたって２週間毎に（Ｑ２Ｗ）、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢの４つの固定皮下用量（７．５ｍｇ、２５ｍｇ、７５ｍｇ及び１５０ｍｇ）の１つ又はプラセボを投与する。ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢのこれらの固定皮下用量を、それぞれ１５、５０、１５０及び３００μｇ／ｋｇのＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢの静脈内用量と同様の効果をもたらすと予測し、皮下投与されたＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢで観察されたバイオアベイラビリティと、ＯＡ患者の体重分布とに基づいて算出した。合計で、処置期間中に各対象にＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢ又はプラセボの６回の用量を投与する。この試験デザインの単純化されたレイアウトを図３２に示す。
処置開始の１４日前から開始して、ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢ又はプラセボの最終投与後少なくとも６週間まで、２４時間の記憶を反映するために毎朝のほぼ同一時間に１１点ＮＲＳ（０～１０）で毎日疼痛を記録するように対象に指示する。
処置の開始前に始まり且つＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢ又はプラセボの最終投与後少なくとも６週間に終わる特定の時点でＷＯＭＡＣ質問表に回答するように対象に指示する。
処置の開始前に始まり且つＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢ又はプラセボの最終投与後少なくとも６週間に終わる特定の時点で患者全般評価（ＰＧＡ）に回答するように対象に指示する。ＰＧＡは、膝のＯＡに起因する症状及び活動障害を評価するために使用される５点リッカートスケールである。「膝のＯＡがあなたに影響を及ぼす全ての方法を考慮して、今日の気分はどうですか？」という質問に基づいて、１＝非常に良好（無症状であり、通常の活動は制限されない）から５＝非常に不良（耐えられない非常に重度の症状があり、全ての通常の活動を実行することができない）までの数字を特定するように対象に求める。
末梢中の遊離ＮＧＦのレベルへのＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢの効果を測定し得る。例えば、末梢中の遊離ＮＧＦを投与の１日後に開始して最大で１２週目まで毎週測定し得、次いで１８週目及び２８週目に再度測定し得る。
末梢中の全ＮＧＦのレベルへのＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢの効果を測定し得る。例えば、末梢中の全ＮＧＦを投与の１日後に開始して最大で１２週目まで毎週測定し得、次いで１８週目及び２８週目に再度測定し得る。
ＴＮＦαレベルのレベルを測定するための代理として、ＣＸＣＬ－１３レベルを測定し得る。例えば、ＣＸＣＬ－１３レベルを投与の１日後に開始して最大で１２週目まで毎週測定し得、次いで１８週目及び２８週目に再度測定し得る。
配列表
配列番号１ ＮＰ＿００２４９７．２｜ベータ－神経成長因子前駆体［ヒト］
Figure 2023543005000007
 配列番号２ ＮＰ＿０００５８５．２｜腫瘍壊死因子［ヒト］
Figure 2023543005000008
 配列番号３ ＭＥＤＩ－５７８ ＶＨ（１２５６Ａ５ ＶＨ）
Figure 2023543005000009
 配列番号４ ＭＥＤＩ－５７８ ＶＨＣＤＲ１
１ ＴＹＧＩＳ
配列番号５ ＭＥＤＩ－５７８ ＶＨＣＤＲ２
１ ＧＩＩＰＩＦＤＴＧＮ ＳＡＱＳＦＱＧ
配列番号６ ＭＥＤＩ－５７８ ＶＨＣＤＲ３
１ ＳＳＲＩＹＤＬＮＰＳ ＬＴＡＹＹＤＭＤＶ
配列番号７ ＭＥＤＩ－５７８ ＶＬ（１２５６Ａ５ ＶＬ）
Figure 2023543005000010
 配列番号８ ＭＥＤＩ－５７８ ＶＬＣＤＲ１
１ ＳＧＳＳＳＮＩＧＮＮ ＹＶＳ
配列番号９ ＭＥＤＩ－５７８ ＶＬＣＤＲ２
１ ＤＮＮＫＲＰＳ
配列番号１０ ＭＥＤＩ－５７８ ＶＬＣＤＲ３
１ ＧＴＷＤＳＳＬＳＡＷ Ｖ
配列番号１１
１ ＳＳＲＩＹＤＦＮＳＡ ＬＩＳＹＹＤＭＤＶ
配列番号１２
１ ＳＳＲＩＹＤＭＩＳＳ ＬＱＰＹＹＤＭＤＶ
配列番号１３ 可溶性ＴＮＦＲ２アミノ酸配列
Figure 2023543005000011
 配列番号１４ ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４－アミノ酸配列
Figure 2023543005000012
 配列番号１５ （Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３ １５ａａリンカー配列
１ ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ ＧＧＧＧＳ
配列番号１６ ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ＶＨ＃４－ヌクレオチド配列
Figure 2023543005000013
 配列番号１７ － ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢ－アミノ酸配列
Figure 2023543005000014
 配列番号１８ － ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢ－ヌクレオチド配列
Figure 2023543005000015
 配列番号１９ － （Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４ ２０ａａリンカー配列
１ ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
配列番号２０ － ヌディマブｖａｒＢ－Ｌ鎖アミノ酸配列
Figure 2023543005000016
 配列番号２１ － ヌディマブｖａｒＢ－Ｌ鎖ヌクレオチド配列
Figure 2023543005000017
 配列番号２２ － ヌディマブｖａｒＢ－Ｈ鎖アミノ酸配列
Figure 2023543005000018
 配列番号２３ － ヌディマブｖａｒＢ－Ｈ鎖ヌクレオチド配列
Figure 2023543005000019
 配列番号２４ － ＮＧＦ－ＮＧ ＶＨアミノ酸配列
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＷＦＧＡＦＴＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＩＰＩＦＧＬＴＮＬＡＱＮＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＶＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＳＲＩＹＤＬＮＰＳＬＴＡＹＹＤＭＤＶＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
配列番号２５ － ＮＧＦ－ＮＧ ＶＨヌクレオチド配列
Figure 2023543005000020
 配列番号２６ － ＮＧＦ－ＮＧ ＶＬアミノ酸配列
ＱＳＶＬＴＱＰＰＳＶＳＡＡＰＧＱＫＶＴＩＳＣＳＧＳＳＳＤＩＧＮＮＹＶＳＷＹＱＱＬＰＧＴＡＰＫＬＬＩＹＤＮＮＫＲＰＳＧＩＰＤＲＦＳＧＳＫＳＧＴＳＡＴＬＧＩＴＧＬＱＴＧＤＥＡＤＹＹＣＧＴＷＤＳＳＬＳＡＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ
配列番号２７ － ＮＧＦ－ＮＧ ＶＬヌクレオチド配列
Figure 2023543005000021
 配列番号２８ － ヌディマブＶＨアミノ酸配列
Figure 2023543005000022
 配列番号２９ － ヌディマブＶＬアミノ酸配列
Figure 2023543005000023
 配列番号３０ － １１２６Ｆ１ ＶＨアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＱＴＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＴＹＧＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＧＩＩＰＩＦＤＴＧＮＳＡＱＳＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＶＳＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＳＳＳＲＩＹＤＡＮＲＱＡＶＰＹＹＤＭＤＶＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
配列番号３１ － １１２６Ｆ１ ＶＬアミノ酸配列
ＱＡＶＬＴＱＰＳＳＶＳＴＰＰＧＱＭＶＴＩＳＣＳＧＳＳＳＤＩＧＮＮＹＶＳＷＹＱＱＬＰＧＴＡＰＫＬＬＩＹＤＮＮＫＲＰＳＧＩＰＤＲＦＳＧＳＫＳＧＴＳＡＴＬＧＩＴＧＬＱＴＧＤＥＡＤＹＹＣＧＴＷＤＳＳＬＳＡＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ
配列番号３２ － １１２６Ｇ５ ＶＨアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＴＹＧＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＧＩＩＰＩＦＤＴＧＮＳＡＱＳＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＶＳＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＳＳＳＲＩＹＤＦＴＳＧＬＡＰＹＹＤＭＤＶＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
配列番号３３ － １１２６Ｇ５ ＶＬアミノ酸配列
ＱＡＶＬＴＱＰＳＳＶＳＴＰＰＧＱＫＶＴＩＳＣＳＧＳＳＳＮＩＧＮＮＹＶＳＷＹＱＱＬＰＧＴＡＰＫＬＬＩＹＤＮＮＫＲＰＰＧＩＰＤＲＦＳＧＳＫＳＧＴＳＡＴＬＧＩＴＧＬＱＴＧＤＥＡＤＹＹＣＧＴＷＤＳＳＬＳＴＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ
配列番号３４ － １１２６Ｈ５ ＶＨアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＴＹＧＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＧＩＩＰＩＦＤＡＧＮＳＡＱＳＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＨＭＥＶＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＳＳＳＲＩＹＤＨＨＩＱＫＧＧＹＹＤＭＤＶＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
配列番号３５ － １１２６Ｈ５ ＶＬアミノ酸配列
ＱＡＶＬＴＱＰＳＳＶＳＴＰＰＧＱＫＶＴＩＳＣＳＧＳＳＳＮＩＧＮＮＹＶＳＷＹＱＱＬＰＧＴＡＰＫＬＬＩＹＤＮＮＫＲＰＳＧＩＰＤＲＦＳＧＳＫＳＧＴＳＡＴＬＧＩＴＧＬＱＴＧＤＥＡＤＹＹＣＧＴＷＤＳＳＬＳＡＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ
配列番号３６ － １１２７Ｄ９ ＶＨアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＴＹＧＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＧＩＩＰＩＦＤＴＧＮＳＡＱＳＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＶＳＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＳＳＳＲＩＹＤＹＨＴＩＡＹＹＤ
配列番号３７ － １１２７Ｄ９ ＶＬアミノ酸配列
ＱＡＶＬＴＱＰＳＳＶＳＴＰＰＧＱＫＶＴＩＳＣＳＧＳＳＳＮＩＧＮＮＹＶＳＷＹＱＱＬＰＧＴＡＰＫＬＬＩＹＤＮＮＫＲＰＳＧＩＰＤＲＦＳＧＳＫＳＧＴＳＡＴＬＧＩＴＧＬＱＴＧＤＥＡＤＹＹＣＧＴＷＤＳＳＬＳＡＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ
配列番号３８ － １１２７Ｆ９ ＶＨアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＴＹＧＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＧＩＩＰＩＦＤＴＧＮＳＡＱＳＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＫＶＳＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＳＳＳＲＩＹＤＹＩＰＧＭＲＰＹＹＤＭＤＶＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
配列番号３９ － １１２７Ｆ９ ＶＬアミノ酸配列
ＱＡＶＬＴＱＰＳＳＶＳＴＰＰＧＱＫＶＴＩＳＣＳＧＮＳＳＮＩＧＮＮＹＶＳＷＹＱＱＬＰＧＴＡＰＫＬＬＩＹＤＮＮＫＲＰＳＧＩＰＤＲＦＳＧＳＲＳＧＴＬＡＴＬＧＩＴＧＬＱＴＧＤＥＡＤＹＹＣＧＴＷＤＳＳＬＳＡＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ
配列番号４０ － １１３１Ｄ７ ＶＨアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＴＹＧＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＧＩＩＰＩＦＤＴＧＮＳＡＱＳＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＶＳＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＳＳＳＲＩＹＤＦＮＳＳＬＩＡＹＹＤＭＤＶＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
配列番号４１ － １１３１Ｄ７ ＶＬアミノ酸配列
ＱＡＶＬＴＱＰＳＳＶＳＴＰＰＧＱＫＶＴＩＳＣＳＧＳＳＳＮＩＧＮＮＹＶＳＷＹＱＱＬＰＧＴＡＰＫＬＬＩＹＤＮＮＫＲＰＳＧＩＰＤＲＦＳＧＳＫＳＧＴＳＡＴＬＧＩＴＧＬＱＴＧＤＥＴＤＹＹＣＧＴＷＤＳＳＬＳＡＷＶＦＳＧＧＴＫＬＴＶＬ
配列番号４２ － １１３１Ｈ２ ＶＨアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＴＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＴＹＧＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＧＩＩＰＩＦＤＴＧＮＳＡＱＳＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＶＳＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＳＳＳＲＩＹＤＬＮＰＳＬＴＡＹＹＤＭＤＶＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
配列番号４３ － １１３１Ｈ２ ＶＬアミノ酸配列
ＱＡＶＬＴＱＰＳＳＶＳＴＰＰＧＱＫＶＴＩＳＣＳＧＴＳＳＮＩＧＮＮＹＶＳＷＹＱＱＬＰＧＴＡＰＫＬＬＩＹＤＮＮＫＲＰＳＧＩＰＤＲＦＳＧＳＫＳＧＴＳＡＴＬＧＩＴＧＬＱＴＧＤＥＡＤＹＹＣＧＴＷＤＳＳＬＳＡＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ
配列番号４４ － １３２Ａ９ ＶＨアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＴＹＧＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＧＩＩＰＩＦＧＴＧＮＳＡＱＳＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＶＳＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＳＳＳＲＩＹＤＦＥＰＳＬＩＹＹＹＤＭＤＶＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
配列番号４５ － １３２Ａ９ ＶＬアミノ酸配列
ＱＡＶＬＴＱＰＳＳＶＳＴＰＰＧＱＫＶＴＩＳＣＳＧＳＳＳＮＩＧＮＮＹＶＳＷＹＱＱＬＰＧＴＡＰＫＬＬＩＹＤＮＮＫＲＰＳＧＩＰＤＲＦＳＧＳＫＳＧＴＳＡＴＬＧＩＴＧＬＱＴＧＤＥＡＤＹＹＣＧＴＷＤＳＳＬＳＡＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ
配列番号４６ － １１３２Ｈ９ ＶＨアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＴＹＧＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＧＩＩＰＩＦＤＴＧＮＳＡＱＳＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＶＳＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＳＳＳＲＩＹＤＬＮＰＳＬＴＡＹＹＤＭＤＶＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
配列番号４７ － １１３２Ｈ９ ＶＬアミノ酸配列
ＱＡＶＬＴＱＰＳＳＶＳＴＰＰＧＱＫＶＴＩＳＣＳＧＳＳＳＤＩＧＮＮＹＶＳＷＹＱＱＬＰＧＴＡＰＫＬＬＩＹＤＮＮＫＲＰＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＫＳＧＴＳＡＴＬＧＩＴＧＬＱＴＧＤＥＡＤＹＹＣＧＴＷＤＳＳＬＳＡＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ
配列番号４８ － １１３３Ｃ１１ ＶＨアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＴＹＧＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＧＩＩＰＩＦＤＴＧＮＳＡＱＳＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＶＳＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＳＳＳＲＩＹＤＬＮＰＳＬＴＡＹＹＤＭＤＶＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
配列番号４９ － １１３３Ｃ１１ ＶＬアミノ酸配列
ＱＡＶＬＴＱＰＳＳＶＳＴＰＰＧＱＫＶＴＩＳＣＳＧＳＳＳＮＩＧＮＮＹＶＳＷＹＱＱＬＰＧＴＡＰＫＬＬＩＹＤＮＮＫＲＰＳＧＩＰＤＲＦＳＧＳＫＳＧＴＳＡＴＬＧＩＴＧＬＱＴＧＤＥＡＤＹＹＣＧＴＷＤＳＳＬＳＡＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ
配列番号５０ － １１３４Ｄ９ ＶＨアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＴＹＧＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＧＩＩＰＩＦＤＴＧＮＳＡＱＳＦＱＧＲＶＡＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＶＳＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＳＳＳＲＩＹＤＬＮＰＳＬＴＡＹＹＤＭＤＶＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
配列番号５１ － １１３４Ｄ９ ＶＬアミノ酸配列
ＱＡＶＬＴＱＰＳＳＶＳＴＰＰＧＱＫＶＴＩＳＣＳＧＳＳＳＮＩＧＮＮＹＶＳＷＹＱＱＬＰＧＴＡＰＫＬＬＩＹＤＮＮＫＲＰＳＧＩＰＤＲＦＳＧＳＫＳＧＴＳＡＴＬＧＩＴＧＬＱＴＧＤＥＡＤＹＹＣＧＴＷＤＳＧＬＳＡＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ
配列番号５２ － １１４５Ｄ１ ＶＨアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＴＹＧＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＧＩＩＰＩＦＤＴＳＮＳＡＱＳＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＶＳＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＳＳＳＲＩＹＤＦＲＴＬＹＳＴＹＹＤＭＤＶＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
配列番号５３ － １１４５Ｄ１ ＶＬアミノ酸配列
ＱＡＶＬＴＱＰＳＳＶＳＴＰＰＧＱＫＶＴＩＳＣＳＧＳＳＳＮＩＧＮＮＹＶＳＷＹＱＱＬＰＧＴＡＰＫＬＬＩＹＤＮＮＫＲＰＳＧＩＳＤＲＦＳＧＳＫＳＧＴＳＡＴＬＧＩＡＧＬＱＴＧＤＥＡＤＹＹＣＧＴＷＤＳＳＬＳＡＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ
配列番号５４ － １１４６Ｄ７ ＶＨアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＴＹＧＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＧＩＩＰＩＦＤＴＧＮＳＡＱＳＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＶＳＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＳＳＳＲＩＹＤＬＮＰＳＬＴＡＹＹＤＭＤＶＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
配列番号５５ － １１４６Ｄ７ ＶＬアミノ酸配列
ＱＡＶＬＴＱＰＳＳＶＳＴＰＰＧＱＥＶＴＩＳＣＳＧＳＳＴＮＩＧＮＮＹＶＳＷＹＱＱＬＰＧＴＡＰＫＬＬＩＹＤＮＮＫＲＰＳＧＩＰＤＲＦＳＧＳＫＳＧＴＳＡＴＬＧＩＴＧＬＱＴＧＤＥＡＤＹＹＣＧＴＷＤＳＳＬＳＡＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ
配列番号５６ － １１４７Ｄ２ ＶＨアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＲＩＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＴＹＧＶＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＧＩＩＰＩＦＤＴＧＮＳＡＱＳＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＶＳＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＳＳＳＲＩＹＤＬＮＰＳＬＴＡＹＹＤＭＤＶＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
配列番号５７ － １１４７Ｄ２ ＶＬアミノ酸配列
ＱＡＶＬＴＱＰＳＳＶＳＴＰＰＧＱＫＶＴＩＳＣＳＧＳＳＳＮＩＧＮＮＹＶＳＷＹＱＱＬＰＧＴＡＰＫＬＬＩＹＤＮＮＫＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＫＳＧＴＳＡＴＬＧＩＴＧＬＱＴＧＤＥＡＤＹＹＣＧＴＷＤＳＳＬＳＡＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ
配列番号５８ － １１４７Ｇ９ ＶＨアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＡＹＧＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＧＩＩＰＩＦＮＴＧＮＳＡＱＳＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＶＳＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＳＳＳＲＩＹＤＬＮＰＳＬＴＡＹＹＤＭＤＶＷＧＱＧＴＭＶＴＶ
配列番号５９ － １１４７Ｇ９ ＶＬアミノ酸配列
ＱＡＶＬＴＱＰＳＳＶＳＴＰＰＧＱＫＶＴＶＳＣＳＧＳＳＳＮＩＧＮＮＹＶＳＷＹＱＱＬＰＧＴＡＰＫＬＬＩＹＤＮＮＫＲＰＳＧＩＰＤＲＦＳＧＳＫＳＧＴＳＡＴＬＧＩＴＧＬＱＴＧＤＥＡＤＹＹＣＧＴＷＤＳＳＬＳＡＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ
配列番号６０ － １１５０Ｆ１ ＶＨアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＴＹＧＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＧＩＩＰＩＦＤＴＧＮＳＡＱＳＦＱＤＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＶＧＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＳＳＳＲＩＹＤＬＮＰＳＬＴＡＹＹＤＭＤＶＷＧＨＧＴＭＶＴＶＳＳ
配列番号６１ － １１５０Ｆ１ ＶＬアミノ酸配列
ＱＡＶＬＴＱＰＳＳＶＳＴＰＰＧＱＫＶＴＩＳＣＳＧＳＳＳＮＩＧＮＮＹＶＳＷＹＱＱＬＰＧＴＡＰＫＬＬＩＹＤＮＮＫＲＰＳＧＩＰＤＲＦＳＧＳＫＳＧＴＳＡＴＬＧＩＴＧＬＱＴＧＤＥＡＤＹＹＣＧＴＷＤＳＳＬＳＡＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ
配列番号６２ － １１５２Ｈ５ ＶＨアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＴＹＧＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＶＷＩＧＧＩＩＰＩＦＤＴＧＮＳＡＱＳＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＶＳＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＳＳＳＲＩＹＤＭＩＳＳＬＱＰＹＹＤＭＤＶＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
配列番号６３ － １１５２Ｈ５ ＶＬアミノ酸配列
ＱＡＶＬＴＱＰＳＳＶＳＴＰＰＧＱＫＡＴＩＳＣＳＧＳＳＳＮＩＧＮＮＹＶＳＷＹＱＱＬＰＧＴＡＰＫＬＬＩＹＤＮＮＫＲＰＳＧＩＰＤＲＦＳＧＳＫＳＧＴＳＡＴＬＧＩＴＧＬＱＴＧＤＥＡＤＹＹＣＧＴＷＤＳＳＬＳＡＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ
配列番号６４ － １１５５Ｈ１ ＶＨアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＴＹＧＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＧＩＩＰＩＦＤＴＧＮＳＡＱＳＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＶＳＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＳＳＳＲＩＹＤＦＨＬＡＮＫＧＹＹＤＭＤＶＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
配列番号６５ － １１５５Ｈ１ ＶＬアミノ酸配列
ＱＡＶＬＴＱＰＳＳＶＳＴＰＰＧＱＫＡＴＩＳＣＳＧＳＳＳＮＩＧＮＮＹＶＳＷＹＱＱＬＰＧＴＡＰＫＬＬＩＹＤＮＮＫＲＰＳＧＩＰＤＲＦＳＧＳＫＳＧＴＳＡＴＬＤＩＴＧＬＱＴＧＤＥＡＤＹＹＣＧＴＷＤＳＳＬＳＡＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ
配列番号６６ － １１５８Ａ１ ＶＨアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＴＹＧＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＧＩＩＰＩＦＧＴＧＮＳＡＱＳＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＶＳＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＳＳＳＲＩＹＤＨＨＮＨＶＧＧＹＹＤＭＤＶＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
配列番号６７ － １１５８Ａ１ ＶＬアミノ酸配列
ＱＡＶＬＴＱＰＳＳＶＳＴＰＰＧＱＫＶＴＩＳＣＳＧＳＳＳＮＩＧＮＮＹＡＳＷＹＱＱＬＰＧＴＡＰＫＬＬＩＹＤＮＮＫＲＰＳＧＩＰＤＲＦＳＧＳＫＳＧＴＳＡＴＬＧＩＴＧＬＱＴＧＤＥＡＤＹＹＣＧＴＷＤＧＳＬＳＡＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ
配列番号６８ － １１６０Ｅ３ ＶＨアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＡＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＴＹＧＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＧＩＩＰＩＦＤＴＧＮＳＡＱＳＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＶＳＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＳＳＳＲＩＹＤＬＮＰＳＬＴＡＹＹＤＭＤＶＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
配列番号６９ － １１６０Ｅ３ ＶＬアミノ酸配列
ＱＡＶＬＴＱＰＳＳＶＳＴＰＰＧＱＫＶＴＩＳＣＳＧＳＮＳＮＩＧＮＮＹＶＳＷＹＱＱＬＰＧＴＡＰＫＬＬＩＹＤＮＮＫＲＰＳＧＩＰＤＲＦＳＧＳＫＳＧＴＳＡＴＬＧＩＴＧＬＱＴＧＤＥＡＤＹＹＣＧＴＷＤＳＳＬＳＡＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶ
配列番号７０ － １１６５Ｄ４ ＶＨアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＴＹＧＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＧＩＩＰＩＦＤＴＧＮＳＡＱＳＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＶＳＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＳＳＳＲＩＹＤＬＮＰＳＬＴＡＹＹＤＭＤＶＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
配列番号７１ － １１６５Ｄ４ ＶＬアミノ酸配列
ＱＡＶＬＴＱＰＳＳＶＳＴＰＰＧＱＫＶＴＩＳＣＳＧＳＳＳＮＩＥＮＮＹＶＳＷＹＱＱＬＰＧＴＡＰＫＬＬＩＹＤＮＮＫＲＰＳＧＩＰＤＲＦＳＧＳＫＳＧＴＳＡＴＬＧＩＴＧＬＱＴＧＤＥＡＤＹＹＣＧＴＷＤＳＳＬＳＡＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ
配列番号７２ － １１７５Ｈ８ ＶＨアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＴＹＧＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＲＬＥＷＩＧＧＩＩＰＩＦＤＴＧＮＳＡＱＳＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＶＳＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＳＳＳＲＩＹＤＡＴＴＧＬＴＰＹＹＤＭＤＶＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
配列番号７３ － １１７５Ｈ８ ＶＬアミノ酸配列
ＱＡＶＬＴＱＰＳＳＶＳＴＰＰＧＱＫＶＴＩＳＣＳＧＳＳＳＮＩＧＮＮＹＶＳＷＹＱＱＬＰＧＴＡＰＫＬＬＩＹＤＮＮＫＲＰＳＧＩＰＤＲＦＳＧＳＫＳＧＴＳＡＴＬＧＩＴＧＬＲＴＧＤＥＡＤＹＹＣＧＴＷＤＳＳＬＳＡＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ
配列番号７４ － １２１１Ｇ１０ ＶＨアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＲＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＹＧＧＴＦＳＴＹＧＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＶＧＧＩＩＰＩＦＤＴＲＮＳＡＱＳＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＶＳＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＳＳＳＲＩＹＤＭＶＳＴＬＩＰＹＹＤＭＤＶＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
配列番号７５ － １２１１Ｇ１０ ＶＬアミノ酸配列
ＱＡＶＬＴＱＰＳＳＶＳＴＰＰＧＱＫＶＴＩＳＣＳＧＳＳＳＮＩＧＮＮＹＶＳＷＹＱＱＬＰＧＴＡＰＫＬＬＩＹＤＮＮＫＲＰＳＧＩＰＤＲＦＳＧＳＫＳＧＴＳＡＴＬＧＩＴＧＬＱＴＧＤＥＡＤＹＹＣＧＴＷＤＳＳＬＳＡＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ
配列番号７６ － １２１４Ａ１ ＶＨアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＲＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＴＹＧＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＧＩＩＰＩＦＤＴＧＮＳＡＱＳＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＶＳＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＳＳＳＲＩＹＤＡＨＬＱＡＹＹＤＭＤＶＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
配列番号７７ － １２１４Ａ１ ＶＬアミノ酸配列
ＱＡＶＬＴＱＰＳＳＶＳＴＰＰＧＱＫＶＴＩＳＣＳＧＳＳＳＮＩＧＮＮＹＶＳＷＹＱＱＬＰＧＴＡＰＫＬＬＩＹＤＮＮＫＲＰＰＧＩＰＤＲＦＳＧＳＫＳＧＴＳＡＴＬＧＩＴＧＬＱＴＧＤＥＡＤＹＹＣＧＴＲＤＳＳＬＳＡＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ
配列番号７８ － １２１４Ｄ１０ ＶＨアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＡＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＴＹＧＩＳＷＶＲＱＡＰＧＲＧＬＥＷＩＧＧＩＩＰＩＦＤＴＧＮＳＡＱＳＦＱＧＲＶＡＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＶＳＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＳＳＳＲＩＹＤＡＨＬＮＨＨＧＹＹＤＭＤＶＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
配列番号７９ － １２１４Ｄ１０ ＶＬアミノ酸配列
ＱＡＶＬＴＱＰＳＳＶＳＴＰＰＧＱＫＶＴＩＳＣＳＧＳＳＳＮＩＧＮＮＹＶＳＷＹＱＱＬＰＧＴＡＰＫＬＬＩＹＤＮＮＫＲＰＳＧＩＰＤＲＦＳＧＳＫＳＧＴＳＡＴＬＧＩＴＧＬＱＡＧＤＥＡＤＹＹＣＧＴＷＤＳＳＬＳＡＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ
配列番号８０ － １２１８Ｈ５ ＶＨアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＶＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＴＹＧＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＧＩＩＰＩＦＤＴＧＳＳＡＱＳＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＶＳＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＳＳＳＲＩＹＤＬＮＰＳＬＴＡＹＹＤＭＤＶＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
配列番号８１ － １２１８Ｈ５ ＶＬアミノ酸配列
ＱＡＶＬＴＱＰＳＳＶＳＴＰＰＧＱＫＶＴＩＳＣＳＧＳＳＳＮＴＧＮＮＹＶＳＷＹＱＱＬＳＧＴＡＰＫＬＬＩＹＤＮＮＫＲＰＳＧＩＰＤＲＦＳＧＳＫＳＧＴＳＡＴＬＧＩＴＧＬＱＴＧＤＥＡＤＹＹＣＧＴＷＤＳＳＬＳＡＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ
配列番号８２ － １２３０Ｈ７ ＶＨアミノ酸配列
ＥＭＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＴＹＧＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＧＩＩＰＩＦＤＴＧＮＳＡＱＳＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＶＳＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＳＳＳＲＩＹＤＦＮＳＡＬＩＳＹＹＤＭＤＶＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
配列番号８３ － １２３０Ｈ７ ＶＬアミノ酸配列
ＱＡＶＬＴＱＰＳＳＶＳＴＰＰＧＱＫＶＴＩＳＣＳＧＳＳＳＮＩＧＮＮＹＶＳＷＹＱＱＬＰＧＴＡＰＫＬＬＩＹＤＮＮＫＲＰＳＧＩＰＤＲＦＳＧＳＫＳＧＴＳＡＴＬＧＩＴＧＬＱＴＧＤＥＡＤＹＹＣＧＴＷＤＳＳＬＳＡＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶ
配列番号８４ － １０８３Ｈ４ ＶＨアミノ酸配列
ＱＭＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＴＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＡＹＨＹＬＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＩＰＩＦＧＴＴＮＹＡＱＲＦＱＤＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＳＡＤＹＶＷＧＳＹＲＰＤＷＹＦＤＬＷＧＲＧＴＭＶＴＶＳＳ
配列番号８５ － １０８３Ｈ４ ＶＬアミノ酸配列
ＱＳＶＬＴＱＰＰＳＡＳＧＴＰＧＱＲＶＴＩＳＣＳＧＳＳＳＮＩＧＳＮＴＶＮＷＹＱＲＬＰＧＡＡＰＱＬＬＩＹＮＮＤＱＲＰＳＧＩＰＤＲＦＳＧＳＫＳＧＴＳＧＳＬＶＩＳＧＬＱＳＥＤＥＡＤＹＹＣＡＳＷＤＤＳＬＮＧＲＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ
配列番号８６ － １２２７Ｈ８ ＶＨアミノ酸配列
ＱＭＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＴＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＨＴＦＡＹＨＹＬＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＩＰＩＦＧＴＴＮＹＡＱＲＦＱＤＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＳＡＤＹＡＷＥＳＹＱＰＰＱＩＮＧＶＷＧＲＧＴＭＶＴＶＳＳ
配列番号８７ － １２２７Ｈ８ ＶＬアミノ酸配列
ＱＳＶＬＴＱＰＰＳＶＳＡＡＰＧＱＫＶＴＩＴＣＳＧＳＴＳＮＩＧＮＮＹＶＳＷＹＱＱＨＰＧＫＡＰＫＬＭＩＹＤＶＳＫＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＫＳＧＮＳＡＳＬＤＩＳＧＬＱＳＥＤＥＡＤＹＹＣＡＡＷＤＤＳＬＳＥＦＦＦＧＴＧＴＫＬＴＶＬ
配列番号８８ － ＮＧＦ－ＮＧ ＨＣＤＲ１
ＦＧＡＦＴ
配列番号８９ － ＮＧＦ－ＮＧ ＨＣＤＲ２
ＧＩＩＰＩＦＧＬＴＮＬＡＱＮＦＱＧ
配列番号９０ － ＮＧＦ－ＮＧ ＨＣＤＲ３
ＳＳＲＩＹＤＬＮＰＳＬＴＡＹＹＤＭＤＶ
配列番号９１ － ＮＧＦ－ＮＧ ＬＣＤＲ１
ＳＧＳＳＳＤＩＧＮＮＹＶＳ
配列番号９２ － ＮＧＦ－ＮＧ ＬＣＤＲ２
ＤＮＮＫＲＰＳ
配列番号９３ － ＮＧＦ－ＮＧ ＬＣＤＲ３
ＧＴＷＤＳＳＬＳＡＷＶ
配列番号９４ － Ｇ→Ｃを有するＭＥＤＩ－５７８ ＶＨアミノ酸配列
Figure 2023543005000024
 配列番号９５ － Ｇ→Ｃを有するＭＥＤＩ－５７８ ＶＬアミノ酸配列
Figure 2023543005000025
 配列番号９６ － １２３０Ｄ８ ＶＨアミノ酸配列
ＱＭＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＴＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＰＹＨＹＬＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＩＰＩＦＧＴＴＮＹＡＱＲＦＱＤＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＦＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＳＡＤＹＶＷＥＳＹＨＰＡＴＳＬＳＬＷＧＲＧＴＭＶＴＶＳＳ
配列番号９７ － １２３０Ｄ８ ＶＬアミノ酸配列
ＱＳＶＬＴＱＰＰＳＶＳＡＡＰＧＱＫＶＴＩＳＣＰＧＳＴＳＮＩＧＮＮＹＶＳＷＹＱＱＲＰＧＫＡＰＫＬＭＩＹＤＶＳＫＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＫＳＧＮＳＡＳＬＤＩＳＥＬＱＳＥＤＥＡＤＹＹＣＡＡＷＤＤＳＬＳＥＦＬＦＧＴＧＴＫＬＴＶＬ
配列番号９８
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
配列番号９９ － ＴＮＦＲ２－Ｆｃ＿ｖａｒＢ－コドン最適化ヌクレオチド配列
Figure 2023543005000026
本開示は、本開示の個々の態様の１つの例示であることが意図される、説明されている特定の態様によって範囲を限定されず、機能的に均等なあらゆる組成物又は方法は、本開示の範囲内である。実際、本明細書で図示及び説明されているものに加えて、本開示の様々な変更形態が前述の説明及び添付の図面から当業者に明らかになるであろう。そのような変更形態は、添付の特許請求の範囲に含まれるものとする。
本明細書で述べた全ての刊行物及び特許出願は、あたかも各刊行物又は特許出願が具体的且つ個別に参照により組み込まれると示されているのと同程度まで、参照により本明細書に組み込まれるものとする。

Claims (67)

  1. 疼痛の軽減又は予防を、それを必要とする対象において行う方法であって、結合分子の皮下固定用量を前記対象に投与することを含み、前記結合分子は、ＮＧＦアンタゴニストドメインと、ＴＮＦαアンタゴニストドメインとを含み、前記ＮＧＦアンタゴニストドメインは、抗ＮＧＦ抗体又はその抗原結合断片であり、前記ＴＮＦαアンタゴニストドメインは、ＴＮＦＲの可溶性ＴＮＦα結合断片を含み、前記方法は、前記対象の疼痛を軽減又は予防する、方法。
  2. 前記結合分子の前記皮下固定用量は、約５～２００ｍｇである、請求項１に記載の方法。
  3. 前記結合分子の前記皮下固定用量は、約７．５～１５０ｍｇである、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記結合分子の前記皮下固定用量は、約７．５ｍｇ、約２５ｍｇ、約７５ｍｇ又は約１５０ｍｇである、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記皮下固定用量は、前記結合分子の３０ｍｇの静脈内固定用量と同等である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記固定用量は、２週間毎に少なくとも１回投与される、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記固定用量は、少なくとも１２週間にわたって投与される、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記疼痛は、慢性疼痛を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記疼痛は、変形性関節症疼痛を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記疼痛は、膝の変形性関節症疼痛を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記対象は、前記結合分子の投与前に３ヶ月以上にわたって前記疼痛を患っている、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記疼痛は、関節炎を伴う、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記対象は、変形性関節症を有する、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記対象は、膝の片側性変形性関節症を有する、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記対象は、中央リーダー評価による０～４のケルグレン・ローレンス（ＫＬ）評価スケールで膝関節の少なくともグレード２の変形性関節症を有する、請求項１３又は１４に記載の方法。
  16. 前記対象への前記結合分子の投与前に、
    ａ．ＮＳＡＩＤ、強オピオイド、弱オピオイド、ＣＯＸ－２阻害剤、アセトアミノフェン又はこれらの組合せを前記対象に投与する工程と、
    ｂ．ｉ）前記ＮＳＡＩＤ、強オピオイド、弱オピオイド、ＣＯＸ－２阻害剤、アセトアミノフェン若しくはこれらの組合せが前記対象の疼痛を軽減若しくは予防しないことを決定し、且つ／又はｉｉ）前記対象が前記ＮＳＡＩＤ、強オピオイド、弱オピオイド、ＣＯＸ－２阻害剤、アセトアミノフェン若しくはこれらの組合せに対して不耐性であることを決定する工程と
    を含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記ＮＳＡＩＤ、強オピオイド、弱オピオイド、ＣＯＸ－２阻害剤、アセトアミノフェン又はこれらの組合せは、少なくとも２週間にわたって投与される、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記ＮＳＡＩＤ、強オピオイド、弱オピオイド、ＣＯＸ－２阻害剤、アセトアミノフェン又はこれらの組合せは、前記結合分子の投与前に少なくとも２週間にわたって前記対象に投与されている、請求項１６に記載の方法。
  19. 前記対象は、ＮＳＡＩＤ、強オピオイド、弱オピオイド、ＣＯＸ－２阻害剤、アセトアミノフェン又はこれらの組合せに対して不耐性である、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記結合分子の前記固定用量の投与前に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２感染に関して前記対象を検査することを含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２感染に関して前記対象を検査することは、前記結合分子の前記固定用量の投与前に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２遺伝物質に関して前記対象を検査することを含む、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記対象は、ベースライン時にＳＡＲＳ－ＣｏＶ２に感染していない、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. 前記対象は、ベースライン時において、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｏｎｔａｒｉｏ ａｎｄ ＭｃＭａｓｔｅｒ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｉｅｓ Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ（ＷＯＭＡＣ）指標の疼痛サブスケールを使用して測定された場合、関節の少なくとも５の平均ＷＯＭＡＣ疼痛スコアを有する、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. 前記対象は、ベースライン時において、疼痛の数値評価スケール（ＮＲＳ）で測定された場合、関節の少なくとも５の平均疼痛強度スコアを有する、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 前記対象の１日当たりのＮＲＳ疼痛スコアの週平均をベースラインから低減させる、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. 前記固定用量は、１２週間にわたって２週間毎に投与され、前記方法は、少なくとも１２週目までに前記対象の１日当たりのＮＲＳ疼痛スコアの週平均をベースラインから低減させる、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記対象の１日当たりのＮＲＳ疼痛スコアの週平均をベースラインから少なくとも３０％低減させる、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. 前記対象の１日当たりのＮＲＳ疼痛スコアの週平均をベースラインから少なくとも５０％低減させる、請求項１～２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 前記対象のＷＯＭＡＣ疼痛サブスケールスコアをベースラインから低減させる、請求項１～２８のいずれか一項に記載の方法。
  30. 前記固定用量は、１２週間にわたって２週間毎に投与され、前記方法は、少なくとも１２週目までに前記対象のＷＯＭＡＣ疼痛サブスケールスコアをベースラインから低減させる、請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法。
  31. 前記対象のＷＯＭＡＣ疼痛サブスケールスコアをベースラインから少なくとも３０％低減させる、請求項１～３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. 前記対象のＷＯＭＡＣ疼痛サブスケールスコアをベースラインから少なくとも５０％低減させる、請求項１～３１のいずれか一項に記載の方法。
  33. 前記対象のＷＯＭＡＣ身体サブスケールスコアをベースラインから少なくとも３０％低減させる、請求項１～３２のいずれか一項に記載の方法。
  34. 前記対象のＷＯＭＡＣ身体サブスケールスコアをベースラインから少なくとも５０％低減させる、請求項１～３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. 変形性関節症の患者全般評価（ＰＧＡ）をベースラインから改善する、請求項１～３４のいずれか一項に記載の方法。
  36. 前記固定用量は、１２週間にわたって２週間毎に投与され、方法は、少なくとも１２週目までに変形性関節症のＰＧＡをベースラインから改善する、請求項１～３５のいずれか一項に記載の方法。
  37. 変形性関節症のＰＧＡを少なくとも２ポイント改善する、請求項１～３６のいずれか一項に記載の方法。
  38. 疼痛の軽減は、前記対象における前記結合分子の単回用量投与後に観察される、請求項１～３７のいずれか一項に記載の方法。
  39. 前記対象にＮＳＡＩＤを投与することを含む、請求項１～３８のいずれか一項に記載の方法。
  40. 前記対象にオピオイドを投与することを含む、請求項１～３９のいずれか一項に記載の方法。
  41. 前記対象にアセトアミノフェンを投与することを含む、請求項１～４０のいずれか一項に記載の方法。
  42. 前記対象にＣＯＸ－２阻害剤を投与することを含む、請求項１～４１のいずれか一項に記載の方法。
  43. 前記抗ＮＧＦ抗体又はその断片は、ＴｒｋＡ、ｐ７５ＮＲＴ又はＴｒｋＡ及びＰ７５ＮＲＴの両方へのＮＧＦの結合を阻害し得る、請求項１～４２のいずれか一項に記載の方法。
  44. 前記抗ＮＧＦ抗体又はその断片は、ｐ７５ＮＲＴへのＮＧＦの結合よりもＴｒｋＡへのＮＧＦの結合を優先的にブロックする、請求項１～４３のいずれか一項に記載の方法。
  45. 前記抗ＮＧＦ抗体又はその断片は、約０．２５～０．４４ｎＭの親和性でヒトＮＧＦに結合する、請求項１～４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. 前記抗ＮＧＦ抗体又はその断片は、ＣＤＲ ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３のセットを含む抗体ＶＨドメインと、ＣＤＲ ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のセットを含む抗体ＶＬドメインとを含み、前記ＨＣＤＲ１は、配列番号４のアミノ酸配列又は最大で２つのアミノ酸置換を有する配列番号４のアミノ酸配列を有し、前記ＨＣＤＲ２は、配列番号５のアミノ酸配列又は最大で２つのアミノ酸置換を有する配列番号５のアミノ酸配列を有し、前記ＨＣＤＲ３は、配列番号６のアミノ酸配列若しくは最大で２つのアミノ酸置換を有する配列番号６のアミノ酸配列、ＳＳＲＩＹＤＦＮＳＡＬＩＳＹＹＤＭＤＶ（配列番号１１）又はＳＳＲＩＹＤＭＩＳＳＬＱＰＹＹＤＭＤＶ（配列番号１２）を有し、前記ＬＣＤＲ１は、配列番号８のアミノ酸配列又は最大で２つのアミノ酸置換を有する配列番号８のアミノ酸配列を有し、前記ＬＣＤＲ２は、配列番号９のアミノ酸配列又は最大で２つのアミノ酸置換を有する配列番号９のアミノ酸配列を有し、及び前記ＬＣＤＲ３は、配列番号１０のアミノ酸配列又は最大で２つのアミノ酸置換を有する配列番号１０のアミノ酸配列を有する、請求項１～４５のいずれか一項に記載の方法。
  47. 前記抗ＮＧＦ抗体又はその断片は、ＣＤＲ ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３のセットを含む抗体ＶＨドメインと、ＣＤＲ ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のセットを含む抗体ＶＬドメインとを含み、
    前記ＨＣＤＲ１は、配列番号４のアミノ酸配列を含み、
    前記ＨＣＤＲ２は、配列番号５のアミノ酸配列を含み、
    前記ＨＣＤＲ３は、配列番号６のアミノ酸配列、ＳＳＲＩＹＤＦＮＳＡＬＩＳＹＹＤＭＤＶ（配列番号１１）又はＳＳＲＩＹＤＭＩＳＳＬＱＰＹＹＤＭＤＶ（配列番号１２）を含み、
    前記ＬＣＤＲ１は、配列番号８のアミノ酸配列を含み、
    前記ＬＣＤＲ２は、配列番号９のアミノ酸配列を含み、及び
    前記ＬＣＤＲ３は、配列番号１０のアミノ酸配列を含む、請求項１～４６のいずれか一項に記載の方法。
  48. 前記抗ＮＧＦ抗体又はその断片は、配列番号３又は９４のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を有するＶＨを含む、請求項１～４７のいずれか一項に記載の方法。
  49. 前記抗ＮＧＦ抗体又はその断片は、配列番号７又は９５のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を有するＶＬを含む、請求項１～４８のいずれか一項に記載の方法。
  50. 前記抗ＮＧＦ抗体又はその断片は、完全Ｈ２Ｌ２抗体、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）２断片又は一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片である、請求項１～４９のいずれか一項に記載の方法。
  51. 前記抗ＮＧＦ抗体又はその断片は、ヒト化されているか、キメラであるか、霊長類化されているか又は完全ヒトである、請求項１～５０のいずれか一項に記載の方法。
  52. 前記抗ＮＧＦ ｓｃＦｖ断片は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、１５個のアミノ酸のリンカー配列（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号１５）及び配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、請求項１～５１のいずれか一項に記載の方法。
  53. 前記抗ＮＧＦ ｓｃＦｖ断片は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号９４のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、２０個のアミノ酸のリンカー配列（ＧＧＧＧＳ）４（配列番号１９）及び配列番号９５のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、請求項１～５２のいずれか一項に記載の方法。
  54. 前記ＴＮＦＲは、ＴＮＦＲ－２である、請求項１～５３のいずれか一項に記載の方法。
  55. 前記ＴＮＦＲ－２断片は、免疫グロブリンＦｃドメインに融合されている、請求項１～５４のいずれか一項に記載の方法。
  56. 前記免疫グロブリンＦｃドメインは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである、請求項１～５５のいずれか一項に記載の方法。
  57. 前記ＴＮＦαアンタゴニストは、配列番号１３に記載されているアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列又はその機能的断片を含む、請求項１～５６のいずれか一項に記載の方法。
  58. 前記結合分子は、リンカーを介して前記ＴＮＦαアンタゴニストに融合されている前記ＮＧＦアンタゴニストを含む融合タンパク質を含む、請求項１～５７のいずれか一項に記載の方法。
  59. 前記結合分子は、前記融合タンパク質のホモ二量体を含む、請求項１～５８のいずれか一項に記載の方法。
  60. 前記結合分子は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号１３のアミノ酸１～２３５に対応する配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＴＮＦＲ－２のＴＮＦα結合断片、ヒトＩｇＧ１Ｆｃドメイン、１０個のアミノ酸のリンカー配列（ＧＧＧＧＳ）２（配列番号９８）、配列番号３又は９４のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、１５個のアミノ酸のリンカー配列（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号１５）及び配列番号７又は９５のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬを含む融合ポリペプチドのホモ二量体を含む、請求項１～５９のいずれか一項に記載の方法。
  61. 前記結合分子は、配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドのホモ二量体を含む、請求項１～６０のいずれか一項に記載の方法。
  62. 前記結合分子は、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＴＮＦＲ－２のＴＮＦα結合７５ｋＤ断片、１０個のアミノ酸のリンカー配列（ＧＧＧＧＳ）２（配列番号９８）、配列番号９４のアミノ酸配列を含むＶＨ、２０個のアミノ酸のリンカー配列（ＧＧＧＧＳ）４（配列番号１９）及び配列番号９５のアミノ酸配列を含むＶＬを含む融合ポリペプチドのホモ二量体を含む、請求項１～６１のいずれか一項に記載の方法。
  63. 配列番号７の１０２、１０３又は１０４位に対応するアミノ酸位置のグリン残基は、システイン残基に改変されており、配列番号３の４４位に対応するアミノ酸位置のグリシン残基は、システイン残基に改変されている、請求項１～６２のいずれか一項に記載の方法。
  64. 前記結合分子は、配列番号１７のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドのホモ二量体を含む、請求項１～６３のいずれか一項に記載の方法。
  65. 前記結合分子は、配列番号１７のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドのホモ二量体を含む、請求項１～６４のいずれか一項に記載の方法。
  66. 疼痛の軽減又は予防を、それを必要とする対象において行う方法での使用のための結合分子であって、前記方法は、結合分子の皮下固定用量を前記対象に投与することを含み、前記結合分子は、ＮＧＦアンタゴニストドメインと、ＴＮＦαアンタゴニストドメインとを含み、前記ＮＧＦアンタゴニストドメインは、抗ＮＧＦ抗体又はその抗原結合断片であり、前記ＴＮＦαアンタゴニストドメインは、ＴＮＦＲの可溶性ＴＮＦα結合断片を含み、前記方法は、前記対象の疼痛を軽減又は予防する、結合分子。
  67. 請求項１～６５のいずれか一項に記載の方法での使用のための結合分子。
JP2023519051A 2020-09-28 2021-09-27 疼痛を処置するための化合物及び方法 Pending JP2023543005A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063084358P 2020-09-28 2020-09-28
US63/084,358 2020-09-28
PCT/EP2021/076524 WO2022064043A1 (en) 2020-09-28 2021-09-27 Compounds and methods for treating pain

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2023543005A true JP2023543005A (ja) 2023-10-12

Family

ID=78085879

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2023519051A Pending JP2023543005A (ja) 2020-09-28 2021-09-27 疼痛を処置するための化合物及び方法

Country Status (11)

Country Link
US (1) US20240026036A1 (ja)
EP (1) EP4217388A1 (ja)
JP (1) JP2023543005A (ja)
KR (1) KR20230084199A (ja)
CN (1) CN117279942A (ja)
AU (1) AU2021350424A1 (ja)
BR (1) BR112023004840A2 (ja)
CA (1) CA3195380A1 (ja)
IL (1) IL301548A (ja)
TW (1) TW202228768A (ja)
WO (1) WO2022064043A1 (ja)

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5681718A (en) 1986-03-14 1997-10-28 Celltech Limited Methods for enhanced production of tissue plasminogen activator in cell culture using alkanoic acids or salts thereof
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
CN101653604A (zh) 2001-05-30 2010-02-24 基因技术股份有限公司 抗ngf抗体用于治疗各种疾病
GB0216648D0 (en) 2002-07-18 2002-08-28 Lonza Biologics Plc Method of expressing recombinant protein in CHO cells
NZ539101A (en) 2002-10-08 2008-08-29 Rinat Neuroscience Corp Methods for treating post-surgical pain by administering a nerve growth factor antagonist and compositions containing the same
WO2005075514A2 (en) 2004-03-10 2005-08-18 Lonza Ltd. Method for producing antibodies
WO2006024497A1 (en) 2004-08-30 2006-03-09 Lonza Biologics Plc. Affinity- plus ion exchange- chromatography for purifying antibodies
PT1846451E (pt) 2005-01-24 2013-08-28 Elan Pharma Int Ltd Membros de ligação específica para ngf
US7691980B2 (en) 2007-01-09 2010-04-06 Bio-Rad Laboratories, Inc. Enhanced capacity and purification of antibodies by mixed mode chromatography in the presence of aqueous-soluble nonionic organic polymers
EP2572729A3 (en) 2007-08-10 2013-06-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. High affinity human antibodies to human nerve growth factor
EP2242762B1 (en) 2008-01-18 2015-12-16 Bio-Rad Laboratories, Inc. Enhanced purification of antibodies and antibody fragments by apatite chromatography
PE20121531A1 (es) * 2009-10-15 2012-12-22 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual
CN103906533A (zh) 2011-11-07 2014-07-02 米迪缪尼有限公司 多特异性和多价结合蛋白及其用途
WO2015114150A1 (en) 2014-02-02 2015-08-06 Medimmune Limited Chimeric protein composed of ngf antagonist domain and a tnfa antagonist domain
FI3863647T3 (fi) * 2018-10-10 2024-03-01 Paradigm Biopharmaceuticals Ltd Pahanlaatuisen luustokivun hoitaminen pentosaanipolysulfaatilla

Also Published As

Publication number Publication date
CN117279942A (zh) 2023-12-22
EP4217388A1 (en) 2023-08-02
BR112023004840A2 (pt) 2023-04-18
WO2022064043A1 (en) 2022-03-31
IL301548A (en) 2023-05-01
AU2021350424A1 (en) 2023-06-01
KR20230084199A (ko) 2023-06-12
CA3195380A1 (en) 2022-03-31
US20240026036A1 (en) 2024-01-25
TW202228768A (zh) 2022-08-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5969102B2 (ja) 治療用イヌ免疫グロブリンおよびそれを用いる方法
JP5990701B2 (ja) 治療用イヌ免疫グロブリンおよびそれを用いる方法
EP3099713B1 (en) Chimeric protein composed of ngf antagonist domain and a tnfa antagonist domain
SG187867A1 (en) Antibodies that bind myostatin, compositions and methods
US20210009671A1 (en) Compounds and methods for treating pain
JP2023543005A (ja) 疼痛を処置するための化合物及び方法
RU2788122C2 (ru) Химерный белок, составленный из домена антагониста NGF и домена антагониста TNFα
BR112016017698B1 (pt) Molécula ligante, polinucleotídeo isolado, vetor, microrganismo transgênico, composição, kit, e, uso de uma molécula ligante