ES2464532T3 - Métodos y composiciones para la producción de pares ortogonales de ARNt-aminoacil-ARNt sintetasa - Google Patents

Abstract

Un par de aminoacil ARNt sintetasa y ARNt, que dirige la incorporación de un aminoácido no natural en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido, donde la aminoacil ARNt sintetasa presenta selectividad por el aminoácido no natural en comparación con cualquiera de los veinte aminoácidos comunes, dicho ARNt es específico para un codón de parada ámbar en el ARNm que codifica el polipéptido y la aminoacil ARNt sintetasa aminoacila el ARNt con el aminoácido no natural, donde dicho aminoácido no natural se selecciona entre el grupo que consiste en: para acetil fenilalanina, para amino fenilalanina y para nitro fenilalanina, y donde la aminoacil ARNt sintetasa se puede obtener mediante un método que comprende: crear una biblioteca de aminoacil ARNt sintetasas mutadas de Methanococcus jannaschii; seleccionar positivamente de la biblioteca de aminoacil ARNt sintetasas mutadas de Methanococcus jannaschii miembros que aminoacilen dicho ARNt en presencia de dicho aminoácido no natural y un aminoácido natural, proporcionando de este modo una reserva de aminoacil ARNt sintetasas mutadas activas de Methanococcus jannaschii; seleccionar negativamente de la reserva de aminoacil ARNt sintetasas mutadas activas de Methanococcus jannaschii aminoacil ARNt sintetasas mutantes de Methanococcus jannaschii que aminoacilen dicho ARNt en ausencia del aminoácido no natural; y obtener de este modo la aminoacil ARNt sintetasa que aminoacila preferentemente dicho ARNt con dicho aminoácido no natural.

Description

Métodos y composiciones para la producción de pares ortogonales de ARNt-aminoacil-ARNt sintetasa

Campo de la invención

La invención se refiere al campo de bioquímica de traducción. En particular, la invención se refiere a métodos para producir ARNt ortogonales mutados, aminoacil-ARNt sintetasas ortogonales mutadas, y pares de los mismos. También se proporcionan métodos para identificar pares ortogonales, que se usan para la incorporación de aminoácidos no naturales en proteínas in vivo, y composiciones relacionadas.

Antecedentes de la invención

Las proteínas portan casi todos los procesos complejos de la vida, desde la fotosíntesis hasta la transducción de señales y la respuesta inmune. Para comprender y controlar estas actividades intrincadas, se necesita una mejor comprensión de la relación entre la estructura y la función de las proteínas.

A diferencia de la síntesis de moléculas orgánicas pequeñas donde casi cualquier cambio estructural puede hacerse para influir en las propiedades funcionales de un compuesto, la síntesis de proteínas está limitada a cambios codificados por los veinte aminoácidos naturales. El código genético de todo organismo conocido, desde bacterias a seres humanos, codifica los mismos veinte aminoácidos comunes. Estos aminoácidos pueden modificarse por modificación post-traduccional de proteínas, por ejemplo, glucosilación, fosforilación u oxidación, y en casos más raros, mediante modificación enzimática de los ARNt supresores aminoacilados, por ejemplo, en el caso de selenocisteína. No obstante, los polipéptidos, que se sintetizan a partir de solamente estos 20 bloques de construcción simple, portan todos los procesos complejos de la vida.

Tanto la mutagénesis dirigida al sitio como la mutagénesis aleatoria, en que aminoácidos específicos en una proteína pueden remplazarse con cualquiera de los otros diecinueve aminoácidos comunes, se han convertido en herramientas importantes para comprender la relación entre la estructura y la función de las proteínas. Estas metodologías han hecho posible la generación de proteínas con propiedades potenciadas, incluyendo estabilidad, actividad catalítica y especificidad de unión. No obstante, los cambios en las proteínas se limitan a los 20 aminoácidos comunes, la mayoría de los cuales tienen grupos funcionales simples. Véase, Knowles, J. R. Tinkering with enzymes: what are we learning? Science, 236:1252-1258 (1987); y, Zoller, M. J., Smith, M. Oligonucleotidedirected mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors, Methods Enzymol, 100:468-500 (1983). Expandiendo el código genético para incluir aminoácidos adicionales con nuevas propiedades biológicas, químicas o físicas, pueden modificarse las propiedades de las proteínas, por ejemplo, el tamaño, la acidez, la nucleofilicidad, los enlaces de hidrogeno, las propiedades hidrófobas, etc., en comparación con una proteína compuesta solamente de aminoácidos de los 20 aminoácidos comunes, por ejemplo, como en una proteína de origen natural.

Se han empleado varias estrategias para introducir aminoácidos no naturales en proteínas. Los primeros experimentos implicaron la derivatización de aminoácidos con cadenas laterales reactivas tales como Lys, Cys y Tyr, por ejemplo, la conversión de lisina en N!-acetil-lisina. La síntesis química también proporciona un método directo para incorporar aminoácidos no naturales, pero la síntesis de péptidos rutinaria en fase sólida generalmente está limitada a péptidos pequeños o proteínas con menos de 100 restos. Con el reciente desarrollo del ligamiento enzimático y el ligamiento químico nativo de fragmentos peptídicos, es posible fabricar proteínas más grandes, pero dichos métodos no son fácilmente escalables. Véase, por ejemplo, P. E. Dawson y S. B. H. Kent, Annu. Rev. Biochem., 69:923 (2000). Un método biosintético in vitro general en que se añade un ARNt supresor acilado químicamente con el aminoácido no natural deseado a un extracto in vitro capaz de soportar la biosíntesis de proteínas, se ha usado para incorporar de forma específica de sitio más de 100 aminoácidos no naturales en una diversidad de proteínas de casi cualquier tamaño. Véase, por ejemplo, V. W. Cornish, D. Mendel y P. G. Schultz, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 1995, 34:621 (1995); C. J. Noren, S.J. Anthony-Cahill, M.C. Griffith, P. G. Schultz, A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins, Science 244 182-188 (1989); y,

J. D. Bain, C. G. Glabe, T. A. Dix, A. R. Chamberlin, E. S. Diala, Biosynthetic site-specific incorporation of a nonnatural amino acid into a polypeptide, J. Am. Chem. Soc. 111 8013-8014 (1989). Se ha introducido una amplia gama de grupos funcionales en proteínas para estudios de estabilidad proteica, plegamiento proteico, mecanismo enzimático, y transducción de señales. Aunque estos estudios demuestran que la maquinaria sintética de proteínas tolera una amplia diversidad de cadenas laterales de aminoácido, el método es técnicamente complejo, y los rendimientos de proteínas mutantes son bajos.

Hace más de 50 años, se descubrió que muchos análogos de aminoácidos naturales inhiben el crecimiento bacteriano. El análisis de las proteínas producidas en presencia de estos análogos de aminoácidos reveló que se habían sustituido en el lugar de sus equivalentes naturales en diversos grados. Véase. Por ejemplo, M. H. Richmond, Bacteriol. Rev., 26:398 (1962). Esto sucede porque la aminoacil-ARNt sintetasa, la enzima responsable de la unión del aminoácido correcto a su ARNt afín, no puede distinguir de forma rigurosa el análogo del aminoácido natural correspondiente. Por ejemplo, la norleucina se carga por la metionil-ARNt sintetasa, y la p-fluorofenilalanina se carga por la fenilalanina-ARNt sintetasa. Véase, por ejemplo, D. B. Cowie, G. N. Cohen, E. T. Bolton y H. de

Robichon-Szulmajster, Biochim. Biophys. Acta, 1959, 34:39 (1959); y, R. Munier y G. N. Cohen, Biochim. Biophys. Acta, 1959, 31:378 (1959).

Un método in vivo, llamado incorporación por presión selectiva, se desarrolló posteriormente para explotar la promiscuidad de las sintetasas de tipo silvestre. Véase, por ejemplo, N. Budisa, C. Minks, S. Alefelder, W. Wenger,

F. M. Dong, L. Moroder y R. Huber, FASEB J., 13:41 (1999). Una cepa auxotrófica, en que la vía metabólica relevante que suministra a la célula un aminoácido natural particular está desactivada, se cultiva en medio mínimo que contiene concentraciones limitadas del aminoácido natural, mientras se bloquea la transcripción del gen diana. Al inicio de una fase de crecimiento estacionaria, el aminoácido natural se consume y remplaza con el análogo no natural del aminoácido. La inducción de la expresión de la proteína recombinante provoca la acumulación de una proteína que contiene el análogo no natural. Por ejemplo, usando esta estrategia, se han incorporado o, m y pfluorofenilalaninas en proteínas, y muestran dos hombros característicos en el espectro UV que pueden identificarse fácilmente, véase, por ejemplo, C. Minks, R. Huber, L. Moroder y N. Budisa, Anal. Biochem., 284:29 (2000); se ha usado trifluorometionina para remplazar metionina en la lisozima del bacteriófago ∀ para estudiar su interacción con ligandos de quitooligosacárido por 19F NMR, véase, por ejemplo, H. Duewel, E. Daub, V. Robinson y J. F. Honek, Biochemistry, 36: 3404 (1997); y se ha insertado trifluoroleucina en lugar de leucina, provocando una estabilidad térmica y química aumentada de una proteína de cremallera de leucina. Véase, por ejemplo, Y. Tang, G. Ghirlanda,

W. A. Petka, T. Nakajima, W. F. DeGrado y D. A. Tirrell, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 40:1494 (2001). Además, se incorporan selenometionina y telurometionina en diversas proteínas recombinantes para facilitar la solución de fases en cristalografía de rayos-X. Véase, por ejemplo, W. A. Hendrickson, J. R. Horton y D. M. Lemaster, EMBO J., 9:1665 (1990); J. O. Boles, K. Lewinski, M. Kunkle, J. D. Odom, B. Dunlap, L. Lebioda y M. Hatada, Nat. Struct. Biol.,

1:283 (1994); N. Budisa, B. Steipe, P. Demange, C. Eckerskorn, J. Kellermann y R. Huber, Eur. J. Biochem., 230:788 (1995); y, N. Budisa, W. Karnbrock, S. Steinbacher, A. Humm, L. Prade, T. Neuefeind, L. Moroder y R. Huber, J. Mol. Biol., 270:616 (1997). También se han insertado de forma eficaz análogos de metionina con funcionalidades alqueno

o alquino, permitiendo la modificación adicional de las proteínas por medios químicos. Véase, por ejemplo, J. C. M. van Hest y D. A. Tirrell, FEBS Lett., 428:68 (1998); J. C. M. van Hest, K. L. Kiick y D. A. Tirrell, J. Am. Chem. Soc., 122:1282 (2000); y, K. L. Kiick y D. A. Tirrell, Tetrahedron, 56:9487 (2000).

El éxito de este método depende del reconocimiento de los análogos no naturales de aminoácido por las aminoacil-ARNt sintetasas que, en general, requiere alta selectividad para asegurar la fidelidad de la traducción de la proteína. Por lo tanto, el intervalo de funcionalidad química accesible mediante esta vía está limitado. Por ejemplo, aunque puede incorporarse tiaprolina de forma cuantitativa en proteínas, no puede incorporarse oxaprolina y selenoprolina. Véase, N. Budisa, C. Minks, F. J. Medrano, J. Lutz, R. Huber y L. Moroder, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 95:455 (1998). Un modo para expandir el alcance de este método es relajar la especificidad de sustrato de las aminoacil-ARNt sintetasas, que se ha conseguido en una cantidad limitada de casos. Por ejemplo, se descubrió que el remplazo de Ala294 por Gly en fenilalanil-ARNt sintetasa (PheRS) de Escherichia coli aumenta el tamaño del bolsillo de unión a sustrato, y provoca la acilación del ARNtPhe por p-CI-fenilalanina (p-CI-Phe). Véase, M. Ibba, P. Kast y

H. Hennecke, Biochemistry, 33:7107 (1994). Una cepa de Escherichia coli que alberga esta PheRS mutante permite la incorporación de p-CI-fenilalanina o p-Br-fenilalanina en lugar de fenilalanina. Véase, por ejemplo, M. Ibba y H. Hennecke, FEBS Lett., 364:272 (1995); y, N. Sharma, R. Furter, P. Kast y D. A. Tirrell, FEBS Lett., 467:37 (2000). Así mismo, una mutación puntual Phe130Ser cerca del sitio de unión del aminoácido de la tirosil-ARNt sintetasa de Escherichia coli demostró permitir la incorporación de azatirosina de forma más eficaz que tirosina. Véase, F. Hamano-Takaku, T. Iwama, S. Saito-Yano, K. Takaku, Y. Monden, M. Kitabatake, D. Soll y S. Nishimura, J. Biol. Chem., 275:40324 (2000).

La fidelidad de la aminoacilación se mantiene tanto a nivel de discriminación de sustrato como la corrección de intermedios no afines y productos. Por lo tanto, una estrategia alternativa para incorporar aminoácidos no naturales en proteínas in vivo es modificar las sintetasas que tienen mecanismos de corrección. Estas sintetasas no pueden discriminar por lo tanto activan aminoácidos que son estructuralmente similares a los aminoácidos naturales afines. Este error se corrige en un sitio diferente, que desacila el aminoácido mal cargado del ARNt para mantener la fidelidad de la traducción de la proteína. Si la actividad correctora de la sintetasa se deshabilita, pueden escapar análogos estructurales que están mal activados a la función de edición y pueden incorporarse. Este enfoque se ha demostrado recientemente con la valil-ARNt sintetasa (ValRS). Véase, V. Doring, H. D. Mootz, L. A. Nangle, T. L. Hendrickson, V. de Crecy-Lagard, P. Schimmel y P. Marliere, Science, 292:501 (2001). ValRS puede aminoacilar erróneamente ARNtVal con Cys, Thr, o aminobutirato (Abu); estos aminoácidos no afines posteriormente se hidrolizan por el dominio de edición. Tras mutagénesis aleatoria del cromosoma de Escherichia coli, se seleccionó una cepa mutante de Escherichia coli que tiene una mutación en el sitio de edición de ValRS. Esta ValRS deficiente en edición carga de forma incorrecta ARNtVal con Cys. Como Abu se parece de forma estérica a Cys (el grupo -SH de Cys se remplaza con -CH3 en Abu), la ValRS mutante también incorpora Abu en proteínas cuando esta cepa mutante de Escherichia coli se cultiva en presencia de Abu. El análisis espectrométrico de masas muestra que el 24 % de las valinas se remplaza por Abu en cada posición de valina en la proteína nativa.

Al menos una limitación principal de los métodos descritos anteriormente es que todos los sitios correspondientes a un aminoácido natural particular en toda la proteína se remplazan. El grado de incorporación del aminoácido natural y no natural también puede variar -solamente en casos raros puede conseguirse sustitución cuantitativa ya que es difícil eliminar completamente el aminoácido natural afín dentro de la célula. Otra limitación es que estas estrategias hacen difícil estudiar la proteína mutante en células vivas, porque la incorporación en múltiples sitios de análogos a menudo provoca toxicidad. Finalmente, este método es aplicable en general solamente a análogos estructurales cercanos de los aminoácidos comunes, de nuevo porque las sustituciones deben tolerarse en todos los sitios en el genoma.

5 Los métodos de síntesis en fase sólida y semi-sintéticos también han permitido la síntesis de varias proteínas pequeñas que contienen nuevos aminoácidos. Por ejemplo, véanse las siguientes publicaciones y referencias citadas en: Crick, F.J.C., Barrett, L. Brenner, S. Watts-Tobin, R. General nature of the genetic code for proteins. Nature , 192:1227-1232 (1961); Hofmann, K., Bohn, H. Studies on polypeptides. XXXVI. The effect of

10 pyrazoleimidazole replacements on the S-protein activating potency of an S-peptide fragment, J. Am. Chem. , 59145919 (1966); Kaiser, E. T. Synthetic approaches to biologically active peptides and proteins including enzymes, Acc. Chem. Res., 47-54 (1989); Nakatsuka, T., Sasaki, T., Kaiser, E. T. Peptide segment coupling catalyzed by the semisynthetic enzyme thiosubtilisin, J. Am. Chem. Soc. , 109:3808-3810 (1987); Schnolzer, M., Kent, S B H. Constructing proteins by dovetailing unprotected synthetic peptides: backbone-engineered HIV protease, Science,

15 256(5054):221-225 (1992); Chaiken, I. M. Semisynthetic peptides and proteins, CRC Crit. Rev. Biochem., 11 (3):255301 (1981); Offord, R. E. Protein engineering by chemical means? Protein Eng., 1(3):151-157 (1987); y, Jackson, D.Y., Bumier, J., Quan, C., Stanley, M., Tom, J., Wells, J. A. A Designed Peptide Ligase for Total Synthesis of Ribonuclease A with Unnatural Catalytic Residues, Science, 266(5183):243-247(1994).

20 Se ha usado modificación química para introducir una diversidad de cadenas laterales no naturales, incluyendo cofactores, marcadores de espín y oligonucleótidos en proteínas in vitro. Véase, por ejemplo, Corey, D. R., Schultz,

P. G. Generation of a hybrid sequence-specific single-stranded deoxyribonuclease, Science, 283(4832):1401-1403 (1987); Kaiser, E. T., Lawrence D. S., Rokita, S. E. The chemical modification of enzymatic specificity, Rev. Biochem. , 54:565-595 (1985); Kaiser, E. T., Lawrence, D. S. Chemical mutation of enzyme active sites, Science,

25 226(4674):505-511 (1984); Neet, K. E., Nanci A, Koshland, D. E. Properties of thiol-subtilisin, J. Biol. Chem., 243(24):6392-6401 (1968); Polgar, L. B., M. L. A new enzyme containing a synthetically formed active site. Thiolsubtilisin. J. Am. Chem. Soc., 88:3153-3154 (1966); y, Pollack, S.J., Nakayama, G. Schultz, P. G. Introduction of nucleophiles and spectroscopic probes into antibody combining sites, Science, 242 (4881):1038-1040 (1988).

30 Como alternativa, se ha usado métodos biosintéticos que emplean aminoacil-ARNt químicamente modificados para incorporar varias sondas biofísicas en proteínas sintetizadas in vitro. Véanse las siguientes publicaciones y referencias citadas en: Brunner, J. New Photolabeling and crosslinking methods, Annu. Rev. Biochem., 62:483-514 (1993); y, Krieg, U. C., Walter, P., Hohnson, A. E. Photocrosslinking of the signal sequence of nascent preprolactin of the 54-kilodalton polypeptide of the signal recognition particle, Proc. Natl. Acad. Sci, 83(22):8604-8608 (1986).

35 Previamente, se había demostrado que pueden incorporarse de forma específica de sitio aminoácidos no naturales en proteínas in vitro mediante la adición de ARNt supresores químicamente aminoacilados a reacciones de síntesis de proteínas programadas con un gen que contiene una mutación ámbar sin sentido deseada. Usando estos enfoques, pueden sustituirse varios de los veinte aminoácidos comunes con homólogos estructurales cercanos, por

40 ejemplo, fluorofenilalanina para fenilalanina, usando cepas auxotróficas para un aminoácido particular. Véase, por ejemplo, Noren, C. J., Anthony-Cahill, Griffith, M.C., Schultz, P. G. A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins, Science, 244:182-188 (1989); M. W. Nowak, et al., Science 268:439-42 (1995); Bain, J.D., Glabe, C. G., Dix, T. A., Chamberlin, A. R., Diala, E. S. Biosynthetic site-specific Incorporation of a nonnatural amino acid into a polypeptide, J. Am. Chem. Soc., 111:8013-8014 (1989); N. Budisa et al., FASEB J. 13:41

45 51 (1999); Ellman, J. A., Mendel, D., Anthony-Cahill, S., Noren, C. J., Schultz, P. G. Biosynthetic method for introducing unnatural amino acids site-specifically into proteins, Methods in Enz., 301-336 (1992); y, Mendel, D., Cornish, V.W. & Schultz, P. G. Site-Directed Mutagenesis with an Expanded Genetics Code, Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 24, 435-62 (1995).

50 Por ejemplo, se preparó un ARNt supresor que reconocía el codón de parada UAG y se aminoaciló de forma química con un aminoácido no natural. Se usó mutagénesis dirigida al sitio convencional para introducir el codón de parada TAG, en el sitio de interés en el gen proteico. Véase, por ejemplo, Sayers, J. R., Schmidt, W. Eckstein, F. 5', 3' Exonuclease in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucleic Acids Res., 16(3):791-802 (1988). Cuando el ARNt supresor acilado y el gen mutante se combinaron en un sistema de transcripción/traducción

55 in vitro, se incorporó el aminoácido no natural en respuesta al codón UAG que dio una proteína que contenía el aminoácido en la posición especificada. Experimentos usando [3H]-Phe y experimentos con #-hidroxiácidos demostraron que solamente el aminoácido deseado se incorpora en la posición especificada por el codón UAG y que este aminoácido no se incorpora en ningún otro sitio en la proteína. Véase, por ejemplo, Noren, et al, supra; y, Ellman, J. A., Mendel, D., Schultz, P. G. Site-specific incorporation of novel backbone structures into proteins,

60 Science, 197-200 (1992).

En general, estos enfoques in vitro están limitados por las dificultades en conseguir incorporación específica de sitio de los aminoácidos, por la necesidad de que los aminoácidos sean derivados simples de los veinte aminoácidos comunes o problemas inherentes en la síntesis de proteínas o fragmentos peptídicos grandes.

Las técnicas de microinyección también han estado usando la incorporación de aminoácidos no naturales en proteínas. Véase, por ejemplo, M. W. Nowak, P. C. Kearney, J. R. Sampson, M. E. Saks, C. G. Labarca, S. K. Silverman, W. G. Zhong, J. Thorson, J. N. Abelson, N. Davidson, P. G. Schultz, D. A. Dougherty y H. A. Lester, Science, 268:439 (1995); y, D. A. Dougherty, Curr. Opin. Chem. Biol., 4:645 (2000). Se co-inyectó un ovocito de Xenopus con dos especies de ARN fabricadas in vitro: un ARNm que codifica la proteína diana con un codón de parada UAG en la posición aminoacídica de interés y un ARNt supresor ámbar aminoacilado con el aminoácido no natural deseado. La maquinaria de traducción del ovocito entonces insertó el aminoácido no natural en la posición especificada por UAG. Este método ha permitido estudios de estructura-función in vivo de proteínas de membrana integrales, que generalmente no son susceptibles a sistemas de expresión in vitro. Ejemplos incluyen la incorporación de un aminoácido fluorescente en el receptor de taquinina nueroquinina-2 para medir distancias por transferencia de energía de resonancia de fluorescencia, véase, por ejemplo, G. Turcatti, K. Nemeth, M. D. Edgerton, U. Meseth, F. Talabot, M. Peitsch, J. Knowles, H. Vogel y A. Chollet, J. Biol. Chem., 271:19991 (1996); la incorporación de aminoácidos biotinilados para identificar restos expuestos en superficie en canales de iones, véase, por ejemplo, J. P. Gallivan, H. A. Lester y D. A. Dougherty, Chem. Biol., 4:739 (1997); el uso de análogos de tirosina enjaulados para controlar cambios conformacionales en un canal de iones a tiempo real, véase, por ejemplo, J. C. Miller, S. K. Silverman, P. M. England, D. A. Dougherty y H. A. Lester, Neuron, 20:619 (1998); y, el uso de #-hidroxi aminoácidos para cambiar las estructuras de canales de iones para sondear sus mecanismos de abertura, véase, por ejemplo, P. M. England, Y. Zhang, D. A. Dougherty y H. A. Lester, Cell, 96:89 (1999); y, T. Lu, A. Y. Ting, J. Mainland, L. Y. Jan, P. G. Schultz y J. Yang, Nat. Neurosci., 4:239 (2001).

Sin embargo, existen limitaciones en el método de microinyección, por ejemplo, el ARNt supresor tiene que aminoacilarse químicamente con el aminoácido no natural in vitro, y el ARNt acilado se consume como reactivo estequiométrico durante la traducción y no puede regenerarse. Esta limitación provoca una mala eficacia de supresión y bajos rendimientos de proteína, necesitando técnicas altamente sensibles para ensayar la proteína mutante, tal como mediciones electrofisiológicas. Además, este método es solamente aplicable a células que pueden microinyectarse.

Liu et al., 1997, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, Vol. 94, pág.10092-10097, describen el diseño por ingeniería de un ARNt y una aminoacil-ARNt sintetasa para la incorporación específica de sitio de aminoácidos no naturales en proteínas in vivo.

Pastranak et al., 2000, Helvetica Chimica Acta, Vol. 83, pág. 2277-2286, describen un par ortogonal de ARNt supresor/aminoacil-ARNt sintetasa para desarrollar un organismo con un código genético expandido.

Wang et al., 2000, J. Am. Chem. Soc., Vol. 122, pág. 5010-5011, describen un par funcional de ARNt supresor/aminoacil ARNt sintetasa para incorporación in vivo de aminoácidos no naturales en proteínas.

La capacidad de incorporar aminoácidos no naturales directamente en proteínas in vivo ofrece las ventajas de altos rendimientos de proteínas mutantes, facilidad técnica, el potencial de estudiar las proteínas mutantes en células o posiblemente en organismos vivos y el uso de estas proteínas mutantes en tratamientos terapéuticos. La capacidad de incluir aminoácidos no naturales con diversos tamaños, acideces, nucleofilicidades, hidrofobicidades, y otras propiedades en proteínas puede expandir enormemente nuestra capacidad de manipular de forma racionar y sistemática las estructuras de proteínas, tanto para sondear una función proteica como para crear nuevas proteínas u organismos con nuevas propiedades. Sin embargo, el proceso es difícil, a causa de la naturaleza compleja de las interacciones ARNt-sintetasa que son necesarias para conseguir un elevado grado de fidelidad en la traducción de la proteína. Por lo tanto, se necesitan mejoras al proceso para proporcionar métodos más eficaces y efectivos para alterar la maquinaria biosintética de la célula. La presente invención aborda estas y otras necesidades, que serán evidentes tras la revisión de la siguiente descripción.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona composiciones de componentes usados en la maquinaria biosintética de proteínas, que son como se define en las reivindicaciones.

En un primer aspecto, la presente invención proporciona un par de aminoacil ARNt sintetasa y ARNt, que dirige la incorporación de un aminoácido no natural en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido, donde la aminoacil ARNt sintetasa presenta selectividad por el aminoácido no natural en comparación con cualquiera de los veinte aminoácidos comunes, dicho ARNt es específico por un codón de parada ámbar en el ARNm que codifica al polipéptido, y la aminoacil ARNt sintetasa aminoacila el ARNt con el aminoácido no natural, donde dicho aminoácido no natural se selecciona entre el grupo que consiste en: para acetil fenilalanina, para amino fenilalanina y para nitro fenilalanina, y donde la aminoacil ARNt sintetasa se puede obtener por un método que comprende:

crear una biblioteca de aminoacil ARNt sintetasas de Methanococcus jannaschii mutado; seleccionar positivamente de la biblioteca miembros de aminoacil ARNt sintetasas de Methanococcus jannaschii mutado que aminoacilan dicho ARNt en presencia de dicho aminoácido no natural y un aminoácido natural,

proporcionando de este modo una reserva de aminoacil ARNt sintetasas activas de Methanococcus jannaschii mutado; seleccionar negativamente de la reserva de aminoacil ARNt sintetasas activas de Methanococcus jannaschii mutado aminoacil ARNt sintetasas mutantes de Methanococcus jannaschii que aminoacilan dicho ARNt en

5 ausencia del aminoácido no natural; y obtener de este modo la aminoacil ARNt sintetasa que aminoacila dicho ARNt con dicho aminoácido no natural de forma preferente.

En algunos casos de acuerdo con el par de aminoacil ARNt sintetasa y ARNt de este aspecto de la presente invención, el aminoácido no natural no es un sustrato para otras sintetasas.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una célula que comprende el par de aminoacil ARNt sintetasa y ARNt de acuerdo con el primer aspecto de la invención.

15 En algunos casos de acuerdo con este aspecto de la presente invención, el aminoácido no natural no es un sustrato para sintetasas endógenas de la célula.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 ilustra esquemáticamente la incorporación específica de sitio de aminoácidos no naturales en proteínas in vivo. Una aminoacil ARNt sintetasa ortogonal aminoacila un ARNt ortogonal con una aminoácido no natural. El ARNt ortogonal acilado inserta el aminoácido no natural en la posición especificada por un codón selector, por ejemplo, un codón único, que se introduce en el gen que codifica una proteína de interés.

25 La Figura 2, Panel A y Panel B, ilustra esquemáticamente ejemplos de métodos de selección para sintetasas activas que aminoacilan con aminoácidos no naturales. El Panel A ilustra la selección/el cribado general de aminoacil ARNt sintetasas con especificidades por aminoácidos no naturales. En la selección positiva, se identifican sintetasas activas con especificidades por aminoácidos naturales o no naturales; en la selección negativa, se eliminan sintetasas con especificidades para aminoácidos naturales. Solamente las sintetasas que cargan el ARNt ortogonal con el aminoácido no natural pueden sobrevivir a ambas selecciones/exploraciones. El Panel B ilustra esquemáticamente una realización de la selección/el cribado de sintetasas que aminoacilan preferentemente un O-ARNt con un aminoácido no natural. Por ejemplo, se introducen vectores de expresión que contienen un ARNt supresor ortogonal y miembro de una biblioteca de RS mutadas con un marcador de selección positiva, por ejemplo, ∃-lactamasa, con un codón selector, por ejemplo, un codón ámbar, en un

35 organismo y se cultivan en presencia de un agente selector, por ejemplo, ampicilina. La expresión del marcador de selección positiva permite a la célula sobrevivir en el agente de selección. Los supervivientes codifican sintetasas capaces de cargar cualquier aminoácido natural o no natural (aa) en el O-ARNt. Las sintetasas activas se introducen por transformación en una segunda cepa en el vector de expresión, y un vector de expresión con un marcador de selección negativa, por ejemplo, un gen tóxico, tal como barnasa, que cuando se expresa elimina las células, con uno o más codones selectores, por ejemplo, TAG. Las células se cultivan sin el aminoácido no natural. Si la sintetasa proporcionada aminoacila el O-ARNt con un aminoácido natural, el marcador de selección negativa se expresa y la célula muere. Si la sintetasa aminoacila de forma preferente el O-ARNt, no se expresa marcador de selección negativa, porque no existe aminoácido no natural y la célula vive. Esto proporciona al menos una sintetasa ortogonal que aminoacila de forma preferente el O-ARNt con el codón

45 no natural deseado.

La Figura 3 ilustra mutaciones específicas de sitio para generar bibliotecas dirigidas para análogo de tirosina.

La Figura 4 ilustra una secuencia consenso para la selección con pentafluorofenilalanina para generar bibliotecas dirigidas para estos análogos.

La Figura 5 ilustra esquemáticamente el trasplante de un dominio, por ejemplo, el dominio CPI, de un organismo, por ejemplo, Escherichia coli, a la sintetasa de otro organismo, por ejemplo, TyrRS de Methanococcus jannaschii.

55 La Figura 6 ilustra esquemáticamente la construcción de sintetasas quiméricas de Methanococcus jannaschii/Escherichia coli.

La Figura 7 ilustra esquemáticamente la generación de una biblioteca de sintetasas quiméricas, por ejemplo, sintetasas de Methanococcus jannaschii/Escherichia coli.

La Figura 8 ilustra esquemáticamente un ejemplo para selección de ARNt supresores que son malos sustratos para sintetasas endógenas, por ejemplo, una sintetasa de Escherichia coli, y que se cargan de forma eficaz por una sintetasa afín de interés. Los vectores de expresión que contienen un miembro de una biblioteca de ARNt mutados y otro vector con un marcador de selección negativa, por ejemplo, un gen tóxico, tal como barnasa, con 65 uno o más codones selectores se introducen en una célula de un organismo. Los supervivientes de la selección negativa codifican ARNt mutados que son ortogonales para el organismo o no funcionales. Los vectores de los

supervivientes se aíslan y se introducen por transformación en otras células junto con un marcador de selección positiva, por ejemplo, el gen de la ∃-lactamasa, con un codón selector. Las células se cultivan en presencia de un agente de selección, por ejemplo, ampicilina, y una RS de un organismo de la misma fuente, por ejemplo, Methanococcus jannaschii, como ARNt. Los supervivientes de esta selección codifican ARNt mutantes que son

5 ortogonales para las sintetasas de la célula, por ejemplo, sintetasas de Escherichia coli, y que se aminoacilan por RS de la misma fuente que el ARNt.

La Figura 9, Panel A y B, ilustra esquemáticamente una biblioteca de ARNt con bucle anticodón mutado, Panel A, y una biblioteca con todos los bucles mutados, Panel B, de ARNtTyrCUA de Methanococcus jannaschii. Los nucleótidos mutados aleatoriamente (N) están sombreados en negro.

La Figura 10 ilustra esquemáticamente ejemplos de estructuras de pares de bases no naturales que aparean por fuerzas diferentes a los enlaces de hidrogeno (PICS:PICS, 3MN:3MN, 7AI:7AI, Dipic:Py).

15 La Figura 11 es un gráfico de resultados de un método de selección negativa para ARNt supresores, que muestra el porcentaje de células supervivientes que contienen una de tres construcciones, durante una cantidad dada de tiempo basándose en la supresión de dos codones ámbar en el gen de la barnasa introducido por un vector, por ejemplo, plásmido pSCB2. Este plásmido codifica el gen de la barnasa que contiene dos codones ámbar. Las selecciones se realizan en medio líquido GMML, y se usa 20 mM de arabinosa para inducir la expresión de barnasa. Se indican tres construcciones mediante lo siguiente: (1) un círculo que representa un plásmido de control sin ARNt supresor; (2) un triángulo que representa un ARNt supresor en el plásmido, pAC-YYG1; y, (3) un cuadrado que representa un ARNt supresor en el plásmido, pAC-JY.

La Figura 12 presenta histogramas de crecimiento, que ilustran la selección positiva basada en la supresión de

25 un codón ámbar en el gen de la ∃-lactamasa. Un vector que codifica un ARNt supresor, por ejemplo, el plásmido pAC, se introduce por co-transformación con un vector que codifica una sintetasa, por ejemplo, pBLAM-JYRS, en un organismo, por ejemplo, células de Escherichia coli DH10B. El crecimiento de las células que albergan la sintetasa y diferentes plásmidos pAC en medio líquido 2X YT con diversas concentraciones de ampicilina, por ejemplo, 0, 100 y 500 %g/ml, se muestra en el Panel A, donde pAC es un plásmido de control sin ARNt supresor, donde pAC-YYG1 es un plásmido con un ARNt supresor, y donde pAC-JY es un plásmido con un ARNt supresor. El Panel B muestra la selección positiva de las mismas construcciones usando placas de agar 2X YT con 500 %g/ml de ampicilina. Se indican tres construcciones mediante lo siguiente: (1) un círculo que representa un plásmido de control sin ARNt supresor; (2) un triángulo que representa un ARNt supresor en el plásmido, pAC-YYG1; y, (3) un cuadrado que representa un ARNt supresor en el plásmido, pAC-JY.

35 La Figura 13 ilustra secuencias de ADN de ARNt supresores mutantes seleccionados de una biblioteca con bucle anticodón y todos los bucles. JY significa ARNtCUATyrCUA de Methanococcus jannaschii de tipo silvestre.

La Figura 14 ilustra esquemáticamente una vista estereoscópica del sitio activo de TyrRS. Los restos de TyrRS de B. stearothermophilus se ilustran en la figura. Los restos correspondientes de TyrRS de Methanococcus jannaschii son Tyr32(Tyr34), Glu107 (Asn123), Asp151(Asp176), Ile159(Phe177), y Leu162(Leu180) con los restos de TyrRS de B. stearothermophilus en paréntesis.

La Figura 15 ilustra esquemáticamente una visión del sitio activo de TyrRS. Los restos de TyrRS de B.

45 stearothermophilus se ilustran en la figura. Los restos correspondientes de TyrRS de Methanococcus jannaschii son Tyr32(Tyr34), Asp158 (Asp176), Ile159(Phe177), Leu162(Leu180) y Ala167(Gln189) con los restos de TyrRS de B. stearothermophilus en paréntesis.

La Figura 16, Panel A y Panel B ilustra esquemáticamente un ejemplo de selección basada en FACS y métodos de selección usados para generar un componente de la presente invención, por ejemplo, la sintetasa ortogonal. El Panel A ilustra esquemáticamente vectores, por ejemplo, plásmidos, para la expresión de la biblioteca de sintetasas ortogonales y O-ARNt (plásmido de biblioteca) y para la ARN polimerasa T7/sistema indicador GFP (plásmido indicador), con uno o más codones selectores, por ejemplo, TAG. El Panel B ilustra esquemáticamente el esquema de selección positiva/cribado negativo, donde las células se cultivan en presencia

55 y ausencia del aminoácido no natural, en presencia y ausencia de un agente de selección, y se exploran para células fluorescentes y células no fluorescentes en el proceso de selección, donde el "+" y los círculos vacíos corresponden a células fluorescentes y no fluorescentes, respectivamente.

La Figura 17, Panel A, Panel B, Panel C y Panel D ilustra un sistema indicador de fluorescencia amplificable. El Panel A ilustra esquemáticamente vectores que pueden usarse en la selección, por ejemplo, plásmidos, tales como pREP, donde la transcripción por la ARN polimerasa T7 está controlada por el promotor ara; la expresión de la proteína depende de la supresión de codones ámbar en localizaciones variables en el gen. La expresión del indicador, por ejemplo, la expresión de GFPuv está controlada por la ARN polimerasa T7. El vector indicador, por ejemplo, el plásmido pREP, es compatible para su uso con un vector para expresión de un par ortogonal de 65 sintetasa/ARNt, por ejemplo, un plásmido ColE1. El Panel B ilustra composiciones y potenciación de la fluorescencia de construcciones con el gen de la ARN polimerasa T7 con pREP (1-12). El número de la

construcción se indica a la izquierda de cada una. Las potenciaciones de la fluorescencia, indicadas a la derecha de cada construcción, se calculan como la proporción corregida con la concentración de células de la fluorescencia, mediada de forma fluorométrica, de células que contienen pREP(1-12) y pQ o pQD. Se indica la posición de las mutaciones ámbar dentro de un gen. El Panel C ilustra el análisis citométrico de células que

5 contienen pREP (10) y pQD (parte superior) o pQ (parte inferior). El Panel D ilustra análisis fluorométrico de células que contienen pREP (10) y que expresan diversos ARNt supresores de Escherichia coli. "Ninguno" indica que las células no contienen ARNt supresor.

La Figura 18 ilustra esquemáticamente la selección basada en fago para la incorporación de aminoácidos no naturales en un epítopo superficial. Por ejemplo, se infecta Escherichia coli que porta la biblioteca de sintetasas mutantes por el fago con un codón de parada en un gen que codifica una proteína superficial. El fago que contiene una sintetasa activa presenta el aminoácido no natural en la superficie del fago y se selecciona con anticuerpos monoclonales inmovilizados.

15 La Figura 19 ilustra esquemáticamente un ejemplo de una molécula, por ejemplo, análogo de aminoalquil adenilato inmovilizado del intermedio aminoacil adenilato, usado para seleccionar sintetasas presentadas, por ejemplo, sintetasas presentadas en fago, con especificidad de aminoácidos no naturales.

La Figura 20 es un gráfico que ilustra la resistencia a ampicilina de diversos pares ortogonales a partir de una diversidad de organismos. La figura ilustra un ejemplo para hallar un par ortogonal usando construcciones indicadoras, que contienen cada una un gen indicador, por ejemplo, un gen de ∃-lactamasa, con un codón selector, por ejemplo, un codón ámbar, y un ARNt supresor (con un anticodón selector), donde el ARNt supresor puede ser de una diversidad de organismos, por ejemplo, A. fulgidus, Halobacterium NRC-1, P. furiosus, P. horikoshii, y Methanococcus jannaschii. Las construcciones indicadoras y las sintetasas clonadas de diferentes

25 organismos, por ejemplo, M. thermoautotrophicum, Methanococcus jannaschii, P. horikoshii, A. pernix, A. fulgidus, Halobacterium NRC-1, y Escherichia coli se introducen por transformación en una célula. Las células se cultivan en diversas concentraciones de un agente selector, por ejemplo, ampicilina. Las células que poseen un par ortogonal de ARNt/RS se seleccionan, por ejemplo, usando un ensayo de complementación in vivo. Como se muestra, dos sistemas mostraron niveles de supresión significativamente superiores que los observados con la sintetasa de Escherichia coli. Son M. thermoautotrophicum y Methanococcus jannaschii.

La Figura 21, Panel A y Panel B, ilustra ARNt supresores ámbar mutados de Halobacterium NRC-1, que se generan mutando, por ejemplo, aleatorizando, el bucle anticodón del leucil ARNt y seleccionando (Panel B) la supresión más eficaz de un codón selector, por ejemplo, un codón ámbar en uno o más genes indicadores, por

35 ejemplo, usando una combinación de etapas de selección, tal como selección basada en ∃-lactamasa y selección basada en barnasa. El Panel B ilustra los valores de CI50 en %g/ml de ampicilina para un sistema de supresión ámbar de ∃-lactamasa con tres construcciones de ARNt mutante, mutante ámbar original, bucle anticodón optimizado, y tronco aceptor optimizado, sólo o con una RS, por ejemplo, MtLRS. El anticodón optimizado y el tronco aceptor optimizado dieron los mayores valores en la etapa de selección con ∃-lactamasa.

La Figura 22 ilustra un supresor de ARNt para un codón de bases. El supresor de ARNt ilustrado en esta figura se asiló de una biblioteca derivada del ARNt TTG de Halobacterium NRC-1, donde el bucle anticodón se aleatorizó con 8 nucleótidos y se sometió a selección con ampicilina con una construcción indicadora que contenía un gen de ∃-lactamasa con un codón AGGA en el sitio A 184.

45 La Figura 23 Paneles A-D, ilustra la actividad de la sintetasa dominante variante de cada experimento de evolución exitoso. La Figura 23A es una fotografía que ilustra la iluminación ultravioleta de longitud de onda larga de células que contienen pREP/YC-JYCUA y la sintetasa indicada variante, cultivadas en presencia (+) o ausencia (-) del aminoácido no natural correspondiente. La Figura 23B ilustra un análisis fluorométrico de células que contienen pREP/YC-JYCUA y la sintetasa indicada variante, cultivadas en presencia (izquierda) o ausencia (derecha) del aminoácido no natural correspondiente. La Figura 23C es una tabla que ilustra un análisis Cm CI50 de células que contienen pREP/YC-JYCUA y la sintetasa indicada variante, cultivadas en presencia o ausencia del aminoácido no natural correspondiente. La Figura 23D ilustra un análisis de expresión de proteínas de células que contienen pBAD/JYAMB-4TAG y la sintetasa indicada variante, cultivadas en presencia (+) o

55 ausencia (-) del aminoácido no natural correspondiente.

La Figura 24, ilustra comparaciones de actividad de variantes OAY-RS derivadas usando una selección basada en FACS negativa (OAY-RS(1,3,5)) o selección basada en barnasa negativa (OAY-RS(B)). Las células que contienen pREP/YC-JYCUA y la sintetasa indicada variante se cultivaron en presencia (bloque relleno, izquierda)

o usencia (bloque relleno, derecha) del aminoácido no natural correspondiente y se analizaron flourométricamente. La potenciación de la fluorescencia (barra. Negro) se calcula como la proporción corregida por la concentración de células de la fluorescencia de células cultivadas en presencia frente a ausencia del aminoácido no natural.

La Figura 25, Paneles A-B, ilustra componentes del sistema plasmídico indicador polivalente para dirigir la evolución de TyrRS de M. jannaschii. La Figura 25A ilustra el plásmido pREP/YC-JYCUA. El plásmido pREP/YC-JYCUA es compatible para su uso con el plásmido pBK y variantes. La Figura 25B ilustra estructuras de aminoácidos no naturales usados como dianas para la evolución de TyrRS de M. jannaschii.

La Figura 26 ilustra la estrategia de la evolución de una aminoacil ARNt sintetasa usando el plásmido pREP/YC-JYCUA. Las células fluorescentes y no fluorescentes se muestran en negro y blanco, respectivamente.

La Figura 27 ilustra una treonil-ARNt sintetasa de Thermus thermophilus.

La Figura 28 ilustra la generación de un ARNt ortogonal para un par ortogonal de treonil-ARNt/RS de T. thermophilus.

La Figura 29 ilustra aminoácidos no naturales ejemplares utilizados en la presente invención.

La Figura 30 ilustra aminoácidos no naturales ejemplares utilizados en la presente invención.

La Figura 31 ilustra aminoácidos no naturales ejemplares utilizados en la presente invención.

Descripción detallada

Introducción

Las proteínas están en la encrucijada de casi todos los procesos biológicos, desde la fotosíntesis y la visión hasta la transducción de señales y la respuesta inmune. Estas funciones complejas resultan de un polímero basado en poliamida que consta de veinte bloques de construcción relativamente simples dispuestos en una secuencia primaria definida.

La presente invención es como se define en las reivindicaciones. De forma importante, los aminoácidos no naturales se añaden al repertorio genético, en lugar de sustituirlos en el lugar de uno de los 20 aminoácidos comunes. La presente invención proporciona métodos para generar, métodos para identificar y composiciones que comprenden los componentes usados por la maquinaria biosintética para incorporar un aminoácido no natural en una proteína. La presente invención, por ejemplo, (i) permite la inserción selectiva de sitio de uno o más aminoácidos no naturales en cualquier posición deseada de cualquier proteína, (ii) es aplicable a células tanto procariotas como eucariotas, (iii) posibilita estudios in vivo de proteínas mutantes además de la generación de grandes cantidades de proteínas mutantes purificadas, y (iv) es adaptable para incorporar cualquiera de una gran diversidad de aminoácidos no naturales, en proteínas in vivo. Por tanto, en una secuencia polipeptídica específica son posibles varias inserciones diferentes selectivas de sitio de aminoácidos no naturales. Dichas inserciones son opcionalmente todas del mismo tipo (por ejemplo, múltiples ejemplos de un tipo de aminoácido no natural insertados en múltiples puntos en un polipéptido) o son opcionalmente de tipos diversos (por ejemplo, diferentes tipos de aminoácidos no naturales se insertan en múltiples puntos en un polipéptido).

Definiciones

Antes de describir la presente invención en detalle, debe entenderse que esta invención no está limitada a composiciones particulares o sistemas biológicos, que, por supuesto, pueden variar. También debe entenderse que la terminología usada en este documento es con propósito de describir realizaciones particulares solamente, y no pretender ser limitante. Como se usa en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el", "la", incluyen referencias plurales salvo que el contenido indique claramente otra cosa. Por tanto, por ejemplo, una referencia a "una molécula" opcionalmente incluye una combinación de dos o más de dichas moléculas, y similares.

Salvo que se defina de otro modo, se entiende que todos los términos científicos y técnicos tienen el mismo significado que el habitualmente usado en la técnica a la cual pertenecen. Para los propósitos de la presente invención, a continuación se definen los siguientes términos.

Como se usa en este documento, proteínas y/o secuencias proteicas son "homologas" cuando se obtienen, de forma natural o artificial, de una proteína o secuencia proteica ancestral común. Así mismo, los ácidos nucleicos y/o secuencias de ácido nucleico son homólogos cuando se obtienen, de forma natural o artificial, de un ácido nucleico o secuencia de ácido nucleico ancestral común. Por ejemplo, puede modificarse cualquier ácido nucleico de origen natural mediante cualquier método de mutagénesis disponible para incluir uno o más codones selectores. Cuando se expresa, este ácido nucleico mutagenizado codifica un polipéptido que comprende uno o más aminoácidos no naturales. El proceso de mutación puede, por supuesto, alterar adicionalmente uno o más codones convencionales, cambiando de este modo uno o más aminoácidos convencionales en la proteína mutante resultante también. La homología generalmente se deduce de la similitud de secuencia entre dos o más ácidos nucleicos o proteínas (o secuencias de los mismos). El porcentaje preciso de similitud entre secuencias que es útil para establecer la

homología varía con el ácido nucleico y proteína en cuestión, pero rutinariamente se usa una similitud de secuencia tan baja como del 25 % para establecer homología. También pueden usarse niveles mayores de similitud de secuencia, por ejemplo, el 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 99 % o más para establecer homología. Los métodos para determinar los porcentajes de similitud de secuencia (por ejemplo, BLASTP y BLASTN usando parámetros por defecto) se describen en este documento y están disponibles en líneas generales.

La expresión "aminoacila de forma preferente" se refiere a una eficacia, por ejemplo, de aproximadamente el 70 % eficaz, aproximadamente el 75 % eficaz, aproximadamente el 85 % eficaz, aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 95 %, aproximadamente el 99 % o más eficaz, en que una O-RS aminoacila un O-ARNt con un aminoácido no natural en comparación con un ARNt de origen natural o material de partida usado para generar el O-ARNt. El aminoácido no natural entonces se incorpora en una cadena polipeptídica creciente con alta fidelidad, por ejemplo, a más de aproximadamente el 75 % de eficacia para un codón selector dado, a más de aproximadamente el 85 % de eficacia para un codón selector dado, a más de aproximadamente el 90 % de eficacia para un codón selector dado, más de aproximadamente el 95 % de eficacia para un codón selector dado, o más de aproximadamente el 99 % de eficacia para un codón selector dado.

La expresión "codón selector" se refiere a codones reconocidos por el O-ARNt en el proceso de traducción y no reconocido por un ARNt endógeno. El bucle anticodón de O-ARNt reconoce el codón selector en el ARNm e incorpora su aminoácido, por ejemplo, un aminoácido no natural, en este sitio en el polipéptido. Los codones selectores pueden incluir, por ejemplo, codones sin sentido, tales como, codones de parada, por ejemplo, codones ámbar, ocre, y ópalo; codones de cuatro o más bases; codones derivados de pares de bases naturales o no naturales y similares. Para un sistema dado, un codón selector también puede incluir uno de los codones naturales de tres bases, donde el sistema endógeno no usa dicho codón natural de tres bases, por ejemplo, un sistema que carece de un ARNt que reconoce el codón natural de tres bases o un sistema donde el codón natural de tres bases es un codón raro.

Como se usa en este documento, el término "ortogonal" se refiere a una molécula (por ejemplo, un ARNt ortogonal (O-ARNt) y/o una aminoacil ARNt sintetasa ortogonal (O-RS)) que se usa con eficacia reducida por un sistema de interés (por ejemplo, un sistema de traducción, por ejemplo, una célula). Ortogonal se refiere a la incapacidad o eficacia reducida, por ejemplo, menos del 20 % de eficacia, menos del 10 % de eficacia, menos del 5 % de eficacia, o, por ejemplo, menos del 1 % de eficacia, de un ARNt ortogonal y/o RS ortogonal para funcionar en el sistema de traducción de interés. Por ejemplo, un ARNt ortogonal en un sistema de traducción de interés aminoacila cualquier RS endógena de un sistema de traducción de interés con eficacia reducida o incluso cero, en comparación con la aminoacilación de un ARNt endógeno por la RS endógena. En otro ejemplo, una RS ortogonal aminoacila cualquier ARNt endógeno en el sistema de traducción de interés con eficacia reducida o incluso cero, en comparación con la aminoacilación del ARNt endógeno por una RS endógena. "Mejora en la ortogonalidad" se refiere a ortogonalidad potenciada en comparación con un material de partida o un ARNt o RS de origen natural.

El término "complementario" se refiere a componentes de un par ortogonal, O-ARNt y O-RS que pueden funcionar juntos, por ejemplo, la O-RS aminoacila el O-ARNt.

La expresión "derivado de" se refiere a un componente que se aísla de un organismo o se aísla o modifica, o genera, por ejemplo, se sintetiza de forma química, usando información del componente del organismo.

La expresión "sistema de traducción" se refiere a los componentes necesarios para incorporar un aminoácido de origen natural en una cadena polipeptídica (proteína) creciente. Por ejemplo, los componentes pueden incluir ribosomas, ARNt, sintetasas, ARNm y similares. Los componentes de la presente invención pueden añadirse al sistema de traducción, in vivo o in vitro.

La expresión "RS inactiva" se refiere a una sintetasa que se ha mutado de modo que ya no puede aminoacilar su ARNt afín con un aminoácido.

La expresión "agente de selección" se refiere a un agente que cuando está presente permite la selección de ciertos componentes desde una población, por ejemplo, un antibiótico, longitud de onda de luz, un anticuerpo, un nutriente o similares. El agente de selección puede variarse, por ejemplo, tal como la concentración, intensidad, etc.

La expresión "marcador de selección positiva" se refiere a un marcador que cuando está presente, por ejemplo, expresado, activado o similares, provoca la identificación de un organismo con el marcador de selección positiva entre aquellos sin el marcador de selección positiva.

La expresión "marcador de selección negativa" se refiere a un marcador que cuando está presente, por ejemplo, expresado, activado o similares, permite la identificación de un organismo que no posee la propiedad deseada (por ejemplo, en comparación con un organismo que sí posee la propiedad deseada).

El término "indicador" se refiere a un componente que puede usarse para seleccionar componentes descritos en la presente invención. Por ejemplo, un indicador puede incluir una proteína fluorescente verde, una proteína luciferasa

de luciérnaga, o genes tales como ∃-gal/lacZ (∃-galactosidasa), Adh (alcohol deshidrogenasa) o similares.

La expresión "no reconocido de forma eficaz" se refiere a una eficacia, por ejemplo, menor de aproximadamente el 10 %, menor de aproximadamente el 5 %, o menor de aproximadamente el 1 %, a la cual una RS de un organismo aminoacila el O-ARNt.

El término "eucariota" se refiere a organismos que pertenecen al dominio filogenético Eucarya tales como animales (por ejemplo, mamíferos, insectos, reptiles, pájaros, etc.), ciliados, plantas, hongos (por ejemplo, levaduras, etc.), flagelados, microsporidios, protistas, etc. Adicionalmente, el término "procariota" se refiere a organismos no eucariotas que pertenecen a los dominios filogenéticos Eubacteria (por ejemplo, Escherichia coli, Thermus thermophilus, etc.) y Archaea (por ejemplo, Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium tales como Haloferax volcanii y Halobacterium especies NRC-1, A. fulgidus, P. furiosus, P. horikoshii,

A. pernix, etc.).

Un "ARNt supresor" es un ARNt que altera la lectura de un ARN mensajero (ARNm) en un sistema de traducción dado. Un ARNt supresor puede leer hasta, por ejemplo, un codón de parada, un codón de cuatro bases, o un codón raro.

Discusión

La presente invención se refiere a métodos y composiciones para nuevos componentes de la maquinaria biosintética de traducción que permite la incorporación de aminoácidos no naturales en proteínas in vivo. Específicamente, se proporcionan composiciones que comprenden y métodos para generar ARNt ortogonales y RS ortogonales y pares de ARNt ortogonales/RS ortogonales. Estos componentes, cuando se introducen en una célula hospedadora, pueden usarse en el sistema de traducción de la célula para incorporar un aminoácido no natural in vivo en un polipéptido (proteína) de interés. Por ejemplo, esto puede proporcionar mutagénesis específica de sitio con aminoácidos no naturales; u, opcionalmente, mutagénesis aleatoria con aminoácidos no naturales. El ARNt ortogonal suministra el aminoácido no natural en respuesta a un codón selector y la sintetasa ortogonal aminoacila preferentemente un ARNt ortogonal con el aminoácido no natural. La O-RS no aminoacila de forma eficaz el ARNt ortogonal con cualquiera de los veinte aminoácidos comunes. También se proporcionan métodos para preparar e identificar pares ortogonales.

La incorporación específica de sitio de aminoácidos no naturales en proteínas in vivo se ilustra esquemáticamente en la Figura 1. Un codón selector, por ejemplo, un codón único, se introduce en un gen de interés. El gen se transcribe en ARNm y comienza la traducción convencional en el ribosoma. Las sintetasas endógenas aminoacilan ARNt endógenos con aminoácidos (aa) naturales en presencia de ATP. Un ARNt ortogonal se aminoacila enzimáticamente por una sintetasa ortogonal con un aminoácido no natural en presencia de ATP. Cuando el ribosoma encuentra un codón selector, un ARNt ortogonal, que está modificado para contener un anticodón selector, por ejemplo, un anticodón único, es capaz de descodificar la mutación como un aminoácido no natural, y procede la traducción hasta el producto de longitud completa con el aminoácido no natural incorporado.

Aminoacil ARNt sintetasa ortogonal, O-RS

Para incorporar específicamente un aminoácido no natural in vivo, se altera la especificidad de sustrato de la sintetasa de modo que se cargue solamente el aminoácido no natural deseado, pero no cualquiera de los veinte aminoácidos comunes al ARNt. Si la sintetasa ortogonal es promiscua, provocará proteínas mutantes con una mezcla de aminoácidos naturales y no naturales en la posición diana. Por ejemplo, en un intento por incorporar de forma específica de sitio p-F-Phe, se usó un par de ARNtPheCUA supresor ámbar de levadura/fenilalanil-ARNt sintetasa en una cepa p-F-Phe resistente, Phe auxotrófica de Escherichia coli. Véase, por ejemplo, R. Furter, Protein Sci., 7:419 (1998). Como la PheRS de levadura no tiene alta especificidad de sustrato por p-F-Phe, el sitio de mutagénesis se tradujo con un 64-75 % de p-F-Phe y el resto como Phe y Lys incluso en exceso de p-F-Phe añadido al medio de cultivo. Además, en las posiciones del codón Phe, se halló un 7 % de p-F-Phe, lo que indica que la PheRS endógena de Escherichia coli incorpora p-F-Phe además de Phe. A causa de su infidelidad de traducción, este enfoque no es generalmente aplicable a otros aminoácidos no naturales. Se esperaba que la modificación de la especificidad de sustrato de una sintetasa fuera difícil debido a la alta fidelidad intrínseca de las sintetasas naturales y el hecho de que los aminoácidos no naturales no son necesarios para cualquier función celular. La presente invención resuelve este problema y proporciona composiciones de, y métodos para, generar sintetasas que tengan especificidad de sustrato modificada, tal como un aminoácido no natural. Usando los componentes de la presente invención, la eficacia de incorporación de un aminoácido no natural es, por ejemplo, mayor de aproximadamente el 75 %, mayor de aproximadamente el 85 %, mayor de aproximadamente el 95 %, mayor de aproximadamente el 99 % o más.

Las composiciones de la presente invención incluyen una aminoacil ARNt sintetasa ortogonal (O-RS), donde la O-RS aminoacila preferentemente un ARNt ortogonal (O-ARNt) con un aminoácido no natural, opcionalmente, in vivo. En una realización, la O-RS comprende un ácido nucleico que comprende una secuencia polinucleotídica seleccionada entre el grupo que consiste en: SEC ID Nº 4-34 (véase, la Tabla 5) y una secuencia polinucleotídica complementaria de la misma. En otra realización, la O-RS tiene propiedades enzimáticas mejoradas o potenciadas, por ejemplo, la Km es inferior, la kcat es superior, el valor de kcat/Km es mayor o similares, para el aminoácido no natural en comparación con un aminoácido de origen natural, por ejemplo, uno de los veinte aminoácidos conocidos. Las secuencias de moléculas O-ARNt y O-RS ejemplares pueden hallarse en el Ejemplo 10.

5 Los métodos para producir una O-RS se basan en la generación de una reserva de sintetasas mutantes a partir de la región flanqueante de una sintetasa de tipo silvestre, y después en la selección de RS mutadas basándose en su especificidad por un aminoácido no natural relativa a los veinte comunes. Para aislar dicha sintetasa, los métodos de selección de la presente invención son: (i) sensibles, ya que la actividad de las sintetasas deseadas desde las rondas iniciales puede ser baja y la población pequeña; (ii) "afinable", ya que es deseable variar la rigurosidad de selección en diferentes rondas de selección; y, (iii) general, de modo que pueda usarse para diferentes aminoácidos no naturales.

La presente invención proporciona métodos para generar una aminoacil ARNt sintetasa ortogonal mutando la

15 sintetasa, por ejemplo, en el sitio activo en la sintetasa, en el sitio con mecanismo de edición en la sintetasa, en diferentes sitios combinando diferentes dominios de sintetasas, o similares, y aplicando un proceso de selección. La Figura 2, Panel A ilustra esquemáticamente una estrategia de selección/cribado in vivo, que se basa en la combinación de una selección positiva seguida por una selección negativa. En la selección positiva, la supresión del codón selector introducido en una o más posiciones no esenciales de un marcador positivo permite a las células sobrevivir bajo presión de selección positiva. En presencia de aminoácidos tanto naturales como no naturales, los supervivientes por tanto codifican sintetasas activas que cargan el ARNt supresor ortogonal con aminoácido natural

o no natural. En la selección negativa, la supresión de un codón selector introducido en una o más posiciones no esenciales de un marcador negativo elimina las sintetasas con especificidades por aminoácidos naturales. Los supervivientes de la selección negativa y positiva codifican sintetasas que aminoacilan (cargan) el ARNt supresor

25 ortogonal con aminoácidos no naturales solamente. Estas sintetasas después pueden someterse a mutagénesis adicional, por ejemplo, reorganización del ADN u otros métodos de mutagénesis recurrentes. Por supuesto, en otras realizaciones, la invención opcionalmente puede utilizar diferentes órdenes de las etapas para identificar (por ejemplo, O-RS, O-ARNt, pares, etc.), por ejemplo, selección/cribado negativa seguida por selección/cribado positiva

o viceversa o cualquiera de dichas combinaciones de los mismos.

Por ejemplo, véase, la Figura 2, Panel B. En la Figura 2, Panel B, se coloca un codón selector, por ejemplo, un codón ámbar, en un gen indicador, por ejemplo, un gen de resistencia a antibiótico, tal como ∃-lactamasa, con un codón selector, por ejemplo, TAG. Este se coloca en un vector de expresión con miembros de la biblioteca de RS mutadas. Este vector de expresión junto con un vector de expresión con un ARNt ortogonal, por ejemplo, un ARNt

35 supresor ortogonal, se introduce en una célula, que se cultiva en presencia de un agente de selección, por ejemplo, medio antibiótico, tal como ampicilina. Solamente si la sintetasa es capaz de aminoacilar (cargar) el ARNt supresor con algún aminoácido, el codón selector se descodificará permitiendo la supervivencia de la célula en medio antibiótico.

Aplicando esta selección en presencia del aminoácido no natural, los genes de sintetasa que codifican sintetasas que tienen alguna capacidad de aminoacilar se seleccionan de aquellas sintetasas que no tienen actividad. La reserva resultante de sintetasas puede estar cargando cualquiera de los veinte aminoácidos de origen natural o el aminoácido no natural. Para seleccionar adicionalmente aquellas sintetasas que cargan exclusivamente el aminoácido no natural, se aplica una segunda selección, por ejemplo, una selección negativa. En este caso, se usa 45 un vector de expresión que contiene un marcador de selección negativa y un O-ARNt, junto con un vector de expresión que contiene un miembro de la biblioteca de RS mutadas. Este marcador de selección negativa contiene al menos un codón selector, por ejemplo, TAG. Estos vectores de expresión se introducen en otra célula y se cultiva sin aminoácidos no naturales y, opcionalmente, un agente de selección, por ejemplo, tetraciclina. En la selección negativa, aquellas sintetasas con especificidades por aminoácidos naturales cargan el ARNt ortogonal, provocando la supresión de un codón selector en el marcador negativo y muerte celular. Como no se añade aminoácido no natural, las sintetasas con especificidades por el aminoácido no natural sobreviven. Por ejemplo, un codón selector, por ejemplo, un codón de parada, se introduce en el gen indicador, por ejemplo, un gen que codifica una proteína tóxica, tal como barnasa. Si la sintetasa es capaz de cargar el ARNt supresor en ausencia de aminoácido no natural, la célula se eliminará mediante la traducción del producto génico tóxico. Los supervivientes que pasan ambas

55 selecciones/exploraciones codifican sintetasas que cargan específicamente el ARNt ortogonal con un aminoácido no natural.

En una realización, los métodos para producir al menos una aminoacil ARNt sintetasa ortogonal (O-RS) recombinante incluyen: (a) generar una biblioteca de RS mutantes derivadas de al menos una aminoacil ARNt sintetasa (RS) de un primer organismo; (b) seleccionar la biblioteca de RS mutantes para miembros que aminoacilen un ARNt ortogonal (O-ARNt) en presencia de un aminoácido no natural y un aminoácido natural, proporcionando de este modo una reserva de RS mutantes activas; y, (c) seleccionar negativamente la reserva para RS mutantes activas que aminoacilen preferentemente el O-ARNt en ausencia del aminoácido no natural, proporcionando de este modo la al menos una O-RS recombinante; donde la al menos una O-RS recombinante aminoacila preferentemente 65 el O-ARNt con el aminoácido no natural. Opcionalmente, se introducen más mutaciones por mutagénesis, por ejemplo, mutagénesis aleatoria, recombinación o similares, en los genes seleccionados de sintetasa para generar

una biblioteca de sintetasas de segunda generación, que se usa para rondas adicionales de selección hasta que se desarrolle una sintetasa mutante con actividad deseada. Las O-RS recombinantes producidas por los métodos se incluyen en la presente invención. Como se explica a continuación, los pares ortogonales de ARNt/sintetasa de la invención también se generan opcionalmente importándolos de un primer organismo a un segundo organismo.

En una realización, la RS es una RS inactiva. La RS inactiva puede generarse mutando una RS activa. Por ejemplo, la RS inactiva puede generarse mutando al menos aproximadamente 5 aminoácidos en diferentes aminoácidos, por ejemplo, alanina.

La biblioteca de RS mutantes puede generarse usando diversas técnicas de mutagénesis conocidas en la técnica. Por ejemplo, las RS mutantes pueden generarse por mutaciones específicas de sitio, mutaciones puntuales aleatorias, recombinación homóloga in vitro, construcciones quiméricas o similares. En una realización, las mutaciones se introducen en el sitio de edición de la sintetasa para obstaculizar el mecanismo de edición y/o para alterar la especificidad de sustrato. Véase, por ejemplo, la Figura 3 y Figura 4. La Figura 3 ilustra mutaciones específicas de sitio para generar bibliotecas dirigidas para análogos de tirosina. La Figura 4 ilustra una secuencia consenso para la selección con pentafluorofenilalanina para generar bibliotecas dirigidas para estos análogos. Las bibliotecas de RS mutantes también incluyen bibliotecas de sintetasas quiméricas, por ejemplo, bibliotecas de sintetasas quiméricas de Methanococcus jannashii/Escherichia coli. El dominio de una sintetasa puede añadirse o intercambiarse con un dominio de otra sintetasa. La Figura 5 ilustra esquemáticamente el trasplante de un dominio, por ejemplo, el dominio CPI, de un organismo, por ejemplo, Escherichia coli, por la sintetasa de otro organismo, por ejemplo, TyrRS de Methanococcus jannashii. CPI puede trasplantarse desde TyrRS de Escherichia coli hasta TyrRS de H. sapiens. Véase, por ejemplo, Wakasugi, K., et al., EMBO J. 17:297-305 (1998). La Figura 6 ilustra esquemáticamente la construcción de sintetasas quiméricas de Methanococcus jannashii/Escherichia coli y la Figura 7 ilustra esquemáticamente la generación de una biblioteca de sintetasas quiméricas, por ejemplo, sintetasas de Methanococcus jannashii/Escherichia coli. Véase, por ejemplo, Sieber, et al., Nature Biotechnology, 19:456-460 (2001). La biblioteca quimérica se explora para una diversidad de propiedades, por ejemplo, para miembros que se expresan y en fase, para miembros que carecen de actividad con una sintetasa deseada, y/o para miembros que muestran actividad con una sintetasa deseada.

En una realización, la etapa de selección positiva incluye: introducir un marcador de selección positiva, por ejemplo, un gen de resistencia a antibiótico, o similar, y la biblioteca de RS mutantes en una pluralidad de células, donde el marcador de selección positiva comprende al menos un codón selector, por ejemplo, un codón ámbar; cultivar la pluralidad de células en presencia de un agente de selección; seleccionar las células que sobreviven en presencia del agente de selección suprimiendo el al menos un codón selector en el marcador de selección positiva, proporcionando de este modo un subconjunto de células seleccionadas positivamente que contiene la reserva de RS mutantes activas. Opcionalmente, puede variarse la concentración de agente de selección.

En una realización, la selección negativa incluye: introducir un marcador de selección negativa con la reserva de RS mutantes activas de la selección positiva en una pluralidad de células de un segundo organismo, donde el marcador de selección negativa es un gen de resistencia a antibiótico, por ejemplo, un gen de cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), que comprende al menos un codón selector; y, seleccionar las células que sobreviven en un primer medio suplementado con el aminoácido no natural y un agente de selección, pero que no logran sobrevivir en un segundo medio no suplementado con el aminoácido no natural y el agente de selección, proporcionando de este modo células supervivientes con la al menos una O-RS recombinante. Opcionalmente, se varía la concentración del agente de selección.

El primer y segundo medios descritos anteriormente pueden incluir, por ejemplo, un método de réplica en placa directo. Por ejemplo, después de pasar la selección positiva, las células se cultivan en presencia de ampicilina o cloranfenicol y ausencia del aminoácido no natural. Aquellas células que no sobreviven se aíslan de la réplica en placa suplementada con el aminoácido no natural. Se necesita ausencia de transformación en una segunda cepa de selección negativa, y se conoce el fenotipo. En comparación con otros marcadores de selección potenciales, una selección positiva basada en resistencia a antibiótico ofrece la capacidad de refinar la rigurosidad de selección variando la concentración del antibiótico, y de comparar la eficacia de supresión controlando la mayor concentración de antibiótico a que las células pueden sobrevivir. Además, el proceso de cultivo es también un procedimiento de enriquecimiento. Esto puede conducir a una rápida acumulación del fenotipo deseado.

En otra realización, la selección negativa de la reserva para RS mutantes activas incluye: aislar la reserva de RS mutantes activas de la etapa de selección positiva (b); introducir un marcador de selección negativa, donde el marcador de selección negativa es un gen marcador tóxico, por ejemplo, un gen de la ribonucleasa barnasa, que comprende al menos un codón selector, y la reserva de RS mutantes activas en una pluralidad de células de un segundo organismo; y seleccionar las células que sobreviven en un primer medio no suplementado con el aminoácido no natural, pero que no logran sobrevivir en un segundo medio suplementado con el aminoácido no natural, proporcionando de este modo células supervivientes con la al menos una O-RS recombinante, donde la al menos una O-RS recombinante es específica para el aminoácido no natural. Opcionalmente, el marcador de selección negativa comprende dos o más codones selectores. En un aspecto, la selección positiva se basa en la supresión de un codón selector en un marcador de selección positiva, por ejemplo, un gen de cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) que comprende un codón selector, por ejemplo, un codón de parada ámbar, en el gen CAT, de modo que puede aplicarse cloranfenicol como presión de selección positiva. Además, el gen de CAT puede usarse como marcador positivo y también como marcador negativo como se describe en este documento en presencia y ausencia del aminoácido no natural. Opcionalmente,

5 el gen de CAT que comprende un codón selector se usa para la selección positiva y un marcador de selección negativa, por ejemplo, un marcador tóxico, tal como un gen de la barnasa que comprende al menos uno o más codones selectores, se usa para la selección negativa.

En otro aspecto, la selección positiva se basa en la supresión de un codón selector en una posición no esencial en el gen de la ∃-lactamasa, que convierte a las células en resistentes a ampicilina; y se usa una selección negativa usando la ribonucleasa barnasa como marcador negativo. En contraste con la ∃-lactamasa, que se secreta en el periplasma, CAT se localiza en el citoplasma; además, la ampicilina es bactericida, mientras que el cloranfenicol es bacteriostático.

15 La O-RS recombinante puede mutarse adicionalmente y seleccionarse. En una realización, los métodos para producir al menos una aminoacil ARNt sintetasa ortogonal (O-RS) recombinante puede comprender adicionalmente:

(d) aislar la al menos una O-RS recombinante; (e) generar una segunda serie de O-RS mutantes derivadas de la al menos una O-RS recombinante; y, (f) repetir las etapas (b) y (c) hasta que se obtenga una O-RS mutada que comprenda la capacidad de aminoacilar preferentemente el O-ARNt. Opcionalmente, se repiten las etapas (d)-(f), por ejemplo, al menos aproximadamente dos veces. En un aspecto, la segunda serie de O-RS mutadas puede generarse por mutagénesis, por ejemplo, mutagénesis aleatoria, mutagénesis específica de sitio, recombinación o una combinación de las mismas.

La rigurosidad de las etapas de selección, por ejemplo, la etapa de selección positiva (b), la etapa de selección

25 negativa (c) o tanto la etapa de selección positiva como negativa (b) y (c), en los métodos descritos anteriormente, opcionalmente incluyen variar la rigurosidad de selección. Por ejemplo, como la barnasa es una proteína extremadamente tóxica, la rigurosidad de la selección negativa puede controlarse introduciendo diferentes cantidades de codones selectores en el gen de la barnasa. En un aspecto de la presente invención, la rigurosidad se varía porque la actividad deseada puede ser baja durante las primeras rondas. Por tanto, se aplican criterios de selección menos rigurosos en las primeras rondas y se aplican criterios más rigurosos en las posteriores rondas de selección.

Pueden usarse otros tipos de selecciones en la presente invención para, por ejemplo, O-RS, O-ARNt, y el par O-ARNt/O-RS. Por ejemplo, la etapa de selección positiva (b), la etapa de selección negativa (c) o tanto la etapa de 35 selección positiva como negativa (b) y (c) pueden incluir usar un indicador, donde el indicador se detecta por clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). Por ejemplo, puede hacerse una selección positiva primero con un marcador de selección positiva, por ejemplo, el gen de la cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), donde el gen de CAT comprende un codón selector, por ejemplo, un codón de parada ámbar, en el gen de CAT, seguido por un cribado de selección negativa, que se basa en la incapacidad de suprimir uno o más codones selectores, por ejemplo, dos o más, en posiciones dentro de un marcador negativo, por ejemplo, el gen de la ARN polimerasa T7. En una realización, el marcador de selección positiva y el marcador de selección negativa pueden encontrarse en el mismo vector, por ejemplo, plásmido. La expresión del marcador negativo dirige la expresión del indicador, por ejemplo, proteína fluorescente verde (GFP). La rigurosidad de la selección y el cribado pueden variarse, por ejemplo, puede variarse la intensidad de la luz necesaria para la fluorescencia del indicador. En otra realización, puede

45 hacerse una selección positiva con un indicador, un marcador de selección positiva, que se explora por FACS, seguido por un cribado de selección negativa, que se basa en la incapacidad de suprimir uno o más codones selectores, por ejemplo, dos o más, en posiciones dentro de un marcador negativo, por ejemplo, el gen de la barnasa.

Opcionalmente, el indicador se presente en la superficie celular, por ejemplo, en una presentación de fago o similar. La presentación de superficie celular, por ejemplo, el sistema de presentación en superficie celular basado en Omp-A, depende de la expresión de un epítopo particular, por ejemplo, un péptido C3 de poliovirus fusionado a una porina de membrana externa Omp-A, sobre la superficie de la célula de Escherichia coli. El epítopo se presenta sobre la superficie celular solamente cuando un codón selector en el mensaje proteico se suprime durante la traducción. El

55 péptido presentado entonces contiene el aminoácido reconocido por una de las aminoacil ARNt sintetasas mutantes en la biblioteca, y la célula que contiene el gen de la sintetasa correspondiente puede aislarse con antibióticos creados contra péptidos que contienen aminoácidos no naturales específicos. El sistema de presentación en superficie celular basado en OmpA se desarrolló y optimizó por Georgiou et al. como alternativa a la presentación en fagos. Véase, Francisco, J. A., Campbell, R., Iverson, B. L. y Georgoiu, G. Production and fluorescence-activated cell sorting of Escherichia coli expressing a functional antibody fragment non the external surface. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 90:10444-8 (1993).

Otras realizaciones de la presente invención incluyen realizar una o más de las etapas de selección in vitro. El componente seleccionado, por ejemplo, la sintetasa y/o ARNt, entonces pueden introducirse en una célula para su

65 uso en incorporación in vivo de un aminoácido no natural. ARNt ortogonal

Las composiciones de un ARNt ortogonal (O-ARNt) son también una característica de la invención, por ejemplo, donde el O-ARNt reconoce un codón selector y el O-ARNt se aminoacila preferentemente con un aminoácido no natural por una aminoacil ARNt sintetasa ortogonal. En una realización, el O-ARNt comprende un ácido nucleico que comprende una secuencia polinucleotídica seleccionada entre el grupo que consiste en: SEC ID Nº 4-34 (véase, la Tabla 5) y una secuencia polinucleotídica complementaria de la misma.

Se proporcionan en este documento métodos para producir un ARNt ortogonal (O-ARNt) recombinante. Por ejemplo, para mejorar la ortogonalidad de un ARNt conservando al mismo tiempo su afinidad hacia una RS deseada, los métodos incluyen una combinación de selecciones negativas y positivas con una biblioteca de ARNt supresores mutantes en ausencia y presencia de la sintetasa afín, respectivamente. Véase, la Figura 8. En la selección negativa, se introduce uno o más codones selectores en un gen marcador, por ejemplo, un gen tóxico, tal como la barnasa, en una posición no esencial. Cuando se aminoacila un miembro de la biblioteca de ARNt mutados, por ejemplo, derivado de Methanococcus jannaschii, por el hospedador endógeno, por ejemplo, las sintetasas de Escherichia coli (es decir, no es ortogonal al hospedador, por ejemplo, sintetasas de Escherichia coli), el codón selector, por ejemplo un codón ámbar, se suprime y el producto génico tóxico producido conduce a muerte celular. Las células que albergan los ARNt ortogonales o ARNt no funcionales sobreviven. Los supervivientes después se someten a una selección positiva en que se coloca un codón selector, por ejemplo, un codón ámbar en un gen marcador positivo, por ejemplo, un gen de resistencia a fármacos, tal como un gen de la ∃-lactamasa. Estas células también contienen un vector de expresión con una RS afín. Estas células se cultivan en presencia de un agente de selección, por ejemplo, ampicilina. Los ARNt después se seleccionan por su capacidad de aminoacilarse por la sintetasa afín co-expresada y de insertar un aminoácido en respuesta a este codón selector. Las células que albergan ARNt no funcionales, o ARNt que no pueden reconocerse por la sintetasa de interés son sensibles al antibiótico. Por lo tanto, los ARNt que: (i) no son sustratos para el hospedador endógeno, por ejemplo, sintetasas de Escherichia coli; (ii) pueden aminoacilarse por al sintetasa de interés; y (iii) son funcionales en traducción sobreviven a ambas selecciones.

Los métodos para producir un O-ARNt recombinante incluyen: (a) generar una biblioteca de ARNt mutantes derivados de al menos un ARNt, por ejemplo, un ARNt supresor, de un primer organismo; (b) seleccionar negativamente la biblioteca para ARNt mutantes que se aminoacilen por una aminoacil ARNt sintetasa (RS) de un segundo organismo en ausencia de una RS del primer organismo, proporcionando de este modo una reserva de ARNt mutantes; y, (c) seleccionar la reserva de ARNt mutantes para miembros que se aminoacilen por una RS ortogonal (O-RS) introducida, proporcionando de este modo al menos un O-ARNt recombinante; donde el al menos un O-ARNt recombinante reconoce un codón selector y no se reconoce de forma eficaz por la RS del segundo organismo y se aminoacila preferentemente por la O-RS. En una realización, el O-ARNt recombinante posee una mejora de ortogonalidad.

Se construyen bibliotecas de ARNt mutados. Véase, por ejemplo, la Figura 9. Las mutaciones pueden introducirse en una o más posiciones específicas, por ejemplo, en una o más posiciones no conservativas, o en una posición conservativa, en una o más posiciones aleatorizadas, o una reserva de ambas en un bucle deseado de un ARNt, por ejemplo, un bucle anticodón, (brazo D, bucle V, brazo T&C) o una reserva de bucles o todos los bucles. Las bibliotecas quiméricas de ARNt también se incluyen en la presente invención. Debe apreciarse que las bibliotecas de ARNt sintetasas de diversos organismos (por ejemplo, microorganismos tales como eubacterias o arqueobacterias) tales como bibliotecas que comprenden diversidad natural (tales como bibliotecas que comprenden diversidad natural (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos Nº 6.238.884 de Short et al. y referencias en la misma, la patente de Estados Unidos Nº 5.756.316 de Schallenberger et al; la patente de Estados Unidos Nº 5.783.431 de Petersen et al; la patente de Estados Unidos Nº 5.824.485 de Thompson et al; y la patente de Estados Unidos Nº

5.958.672 de Short et al), se construyen opcionalmente y exploran para pares ortogonales.

En una realización, la selección negativa de la biblioteca de ARNt mutantes que se aminoacilan por una aminoacil ARNt sintetasa (etapa (b) anterior) incluye: introducir un gen marcador tóxico, donde el gen marcador tóxico comprende al menos uno de los codones selectores y la biblioteca de ARNt mutantes en una pluralidad de células del segundo organismo; y, seleccionar las células supervivientes, donde las células supervivientes contienen la reserva de ARNt mutantes que comprenden al menos un ARNt ortogonal o ARNt no funcional. Por ejemplo, el gen marcador tóxico es opcionalmente un gen de la ribonucleasa barnasa, donde el gen de la ribonucleasa barnasa comprende al menos un codón ámbar. Opcionalmente, el gen de la ribonucleasa barnasa puede incluir dos o más codones ámbar. Las células supervivientes pueden seleccionarse, por ejemplo, usando un ensayo de densidad celular de proporción comparativa.

En una realización, la selección de la reserva de ARNt mutantes para miembros que se aminoacilen por una RS ortogonal (O-RS) introducida puede incluir: introducir un gen marcador de selección positiva, donde el gen marcador de selección positiva comprende un gen de resistencia a fármaco, por ejemplo, un gen de ∃-lactamasa, que comprende al menos uno de los codones selectores, por ejemplo, un gen de ∃-lactamasa que comprende al menos un codón de parada ámbar, la O-RS, y la reserva de ARNt mutantes en una pluralidad de células del segundo organismo; y, seleccionar células supervivientes cultivadas en presencia de un agente de selección, por ejemplo, un antibiótico, proporcionando de este modo una reserva de células que poseen el al menos un ARNt recombinante, donde el ARNt recombinante se aminoacila por la O-RS e inserta un aminoácido en un producto de traducción codificado por el gen marcador positivo, en respuesta a al menos uno de los codones selectores. En otra realización, la concentración del agente de selección se varía. Los O-ARNt recombinantes producidos por los métodos se incluyen en la presente invención.

5 Como se ha descrito anteriormente para generar O-RS, la rigurosidad de las etapas de selección puede variarse. Además, también se pueden usar otros procedimientos de selección/cribado, que se describen en este documento, tales como FACS, presentación en células y fagos.

Codones selectores

Los codones selectores de la presente invención expanden el marco de codones genéticos de la maquinaria biosintética de proteínas. Por ejemplo, un codón selector incluye, por ejemplo, un codón de tres bases único, un codón sin sentido, tal como un codón de parada, por ejemplo, un codón ámbar, o un codón ópalo, un codón no

15 natural, un codón de cuatro bases (o más), o similares. Pueden introducirse varios codones selectores en un gen deseado, por ejemplo, uno o más, dos o más, más de tres, etc. Adicionalmente, se apreciará que de este modo pueden incorporarse múltiples aminoácidos no naturales diferentes (o similares o idénticos) de forma precisa en aminoácidos (es decir, a través del uso de los múltiples codones selectores).

Los 64 codones genéticos codifican 20 aminoácidos y 3 codones de parada. Como solamente se necesita un codón de parada para la terminación de la traducción, los otros dos en principio pueden usarse para codificar aminoácidos no proteicos. El codón de parada ámbar, UAG, se ha usado satisfactoriamente en el sistema biosintético in vitro y en ovocitos de Xenopus para dirigir la incorporación de aminoácidos no naturales. Entre los 3 codones de parada, UAG es el codón de parado menos usado en Escherichia coli. Algunas cepas de Escherichia coli contienen ARNt

25 supresores naturales, que reconocen UAG e insertan un aminoácido natural en respuesta a UAG. Además, estos ARNt supresores ámbar se han usado ampliamente en mutagénesis convencional de proteínas. Diferentes especies usan de forma preferente diferentes codones para sus aminoácidos naturales, utilizándose opcionalmente dicha capacidad de preferencia en el diseño/elección de los codones selectores en este documento.

Aunque se analiza con referencia a aminoácidos no naturales en este documento, se apreciará que puede usarse una estrategia similar para incorporar un aminoácido natural en respuesta a un codón selector particular. Es decir, puede modificar una sintetasa para que cargue un aminoácido natural en un ARNt ortogonal que reconoce un codón selector de un modo similar a la carga de un aminoácido no natural como se describe en todo este documento.

35 En una realización, los métodos implican el uso de un codón selector que es un codón de parada para la incorporación de aminoácidos no naturales in vivo. Por ejemplo, se genera un O-ARNt que reconoce el con parada, por ejemplo, UAG, y se aminoacila por una O-RS con un aminoácido no natural deseado. Este O-ARNt no se reconoce por las aminoacil ARNt sintetasas de origen natural. Puede usarse mutagénesis dirigida al sitio convencional para introducir el codón de parada, por ejemplo, TAG, en el sitio de interés en el gen de la proteína. Véase, por ejemplo, Sayers, J. R., Schmidt, W. Eckstein, F. 5', 3' Exonuclease in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis. Nucleic Acids Res, 791-802 (1988). Cuando la O-RS, el O-ARNt y el gen mutante se combinan in vivo, el aminoácido no natural se incorpora en respuesta al codón UAG para dar una proteína que contiene el aminoácido no natural en la posición especificada.

45 La incorporación de aminoácidos no naturales in vivo puede hacerse sin perturbación significativa del hospedador, por ejemplo, Escherichia coli. Por ejemplo, como la eficacia de supresión para el codón UAG depende de la competición entre el O-ARNt, por ejemplo, el ARNt supresor ámbar, y el factor de liberación 1 (RF1) (que se une al codón UAG e inicia la liberación del péptido creciente del ribosoma), la eficacia de supresión puede modularse por, por ejemplo, aumento del nivel de expresión de O-ARNt, por ejemplo, el ARNt supresor, o el uso de una cepa RF1 deficiente. Adicionalmente, la eficacia de supresión y la captación del aminoácido no natural realizando mutagénesis aleatoria en un organismo o en una parte del genoma de un organismo y realizando la selección apropiada usando, por ejemplo, uno de los sistemas indicados descritos en este documento.

Los aminoácidos no naturales también pueden codificarse con codones raros. Por ejemplo, cuando la concentración

55 de arginina en una reacción de síntesis de proteína in vitro se reduce, el codón raro de arginina, AGG, ha demostrado ser eficaz para la inserción de Ala por un ARNt sintético acilado con alanina. Véase, por ejemplo, C. H. Ma, W. Kudlicki, O. W. Odom, G. Kramer y B. Hardesty, Biochemistry, 32:7939 (1993). En este caso, el ARNt sintético compite con el ARNtArg de origen natural, que existe como especie minoritaria en Escherichia coli. Algunos organismos no usan todos los codones de triplete. Un codón no asignado AGA en Micrococcus luteus se ha utilizado para la inserción de aminoácidos en un extracto de transcripción/traducción in vitro. Véase, por ejemplo, A. K. Kowal y J. S. Oliver, Nucl. Acid. Res., 25:4685 (1997). Los componentes de la presente invención pueden generarse para usar estos codones raros in vivo.

Los codones selectores también comprenden codones de cuatro o más bases, tales como, cuatro, cinco, seis o más.

65 Ejemplos de codones de cuatro bases incluyen, por ejemplo, AGGA, CUAG, UAGA, CCCU y similares. Ejemplos de codones de cinco bases incluyen, por ejemplo, AGGAC, CCCCU, CCCUC, CUAGA, CUACU, UAGGC y similares.

Por ejemplo, en presencia de los O-ARNt mutados, por ejemplo, un ARNt supresor especial de desplazamiento de fase, con bucles anticodón, por ejemplo, de al menos 8-10 nt, el codón de cuatro o más bases se lee como un único aminoácido. En otras realizaciones, los bucles anticodón pueden descodificar, por ejemplo, al menos un codón de cuatro bases, al menos un codón de cinco bases, o al menos un codón de seis bases o más. Como existen 256

5 posibles codones de cuatro bases, pueden codificarse múltiples aminoácidos no naturales en la misma célula usando el codón de cuatro o más bases. Véase también, J. Christopher Anderson et al., Exploring the Limits of Codon and Anticodon Size, Chemistry and Biology, Vol. 9, 237-244 (2002); Thomas J. Magliery, Expanding the Genetic Code: Selection of Efficient Suppressors of Four-base Codons and Identification of "Shifty" Four-base Codons with a Library Approach in Escherichia coli, J. Mol. Biol. 307:755-769 (2001).

Los métodos de la presente invención incluyen el uso de codones ampliados basados en supresión de desplazamiento de fase. Codones de cuatro o más bases pueden insertar, por ejemplo, uno o múltiples aminoácidos no naturales en la misma proteína. Por ejemplo, se han usado codones de cuatro bases para incorporar aminoácidos no naturales en proteínas usando métodos biosintéticos in vitro. Véase, por ejemplo, C. H. Ma, W. 15 Kudlicki, O. W. Odom, G. Kramer y B. Hardesty, Biochemistry, 1993, 32, 7939 (1993); y, T. Hohsaka, D. Kajihara, Y. Ashizuka, H. Murakami y M. Sisido, J. Am. Chem. Soc., 121:34 (1999). Se usaron CGGG y AGGU para incorporar simultáneamente 2-naftilalanina y un derivado NBD de lisina en estreptavidina in vitro con dos ARNt supresores de desplazamiento de fase acilados químicamente. Véase, por ejemplo, T. Hohsaka, Y. Ashizuka, H. Sasaki, H. Murakami y M. Sisido, J. Am. Chem. Soc., 121:12194 (1999). En un estudio in vivo, Moore et al. examinaron la capacidad de derivados de ARNtLeu con anticodones NCUA de suprimir codones UAGN (N puede ser U, A, G, o C), y descubrieron que el cuádruplo UAGA puede descodificarse por un ARNtLeu con un anticodón UCUA con una eficacia del 13 al 26 % con poca descodificación en la fase 0 o -1. Véase, B. Moore, B. C. Persson, C. C. Nelson, R.

F. Gesteland y J. F. Atkins, J. Mol. Biol., 298:195 (2000). En una realización, pueden usarse codones ampliados

basados en codones raros o codones sin sentido en la presente invención, que pueden reducir la lectura de 25 mutaciones con cambio de sentido y la supresión de desplazamiento de fase en sitios indeseados.

También puede usarse un sistema de derivación de traducción para incorporar un aminoácido no natural en un polipéptido deseado. En un sistema de derivación de traducción, se inserta una gran secuencia en un gen pero no se traduce en proteína. La secuencia contiene una estructura que sirve como indicio para introducir el ribosoma para saltar sobre la secuencia y reiniciar la traducción cadena abajo de la inserción.

Como alternativa, o en combinación con otros métodos descritos anteriormente para incorporar un aminoácido no natural en un polipéptido, puede usarse un sistema de trans-traducción. Este sistema implica una molécula llamada ARNtm presente en Escherichia coli. Esta molécula de ARN está estructuralmente relacionada con un alanil ARNt y

35 se aminoacila por la alanil sintetasa. La diferencia entre el ARNtm y el ARNt es que el bucle anticodón está remplazado por una secuencia grande especial. Esta secuencia permite que el ribosoma reinicie la traducción sobre secuencias que se han estancado usando una fase de lectura abierta codificada dentro del ARNtm como molde. En la presente invención, puede generarse un ARNtm ortogonal que se aminoacila preferentemente con una sintetasa ortogonal y se carga con un aminoácido no natural. Transcribiendo un gen mediante el sistema, el ribosoma se detiene en un sitio específico; el aminoácido no natural se introduce en ese sitio, y la traducción se reinicia usando la secuencia codificada dentro del ARNtm ortogonal.

Los codones selectores también incluyen opcionalmente pares de bases no naturales. Estos pares de bases no naturales expanden adicionalmente el alfabeto genético existente. Un par de bases adicional aumenta la cantidad de

45 codones de triplete de 64 a 125. Las propiedades de las terceras pares de bases incluyen apareamiento de bases estable y selectivo, incorporación enzimática eficaz en el ADN con alta fidelidad por una polimerasa, y la eficaz extensión de cebador continuada después de la síntesis del par de bases no naturales naciente. Descripciones de pares de bases no naturales que pueden adaptarse para métodos y composiciones incluyen, por ejemplo, Hirao, et al., An unnatural base pair for incorporating amino acid analogues into protein, Nature Biotechnology, 20:177-182 (2002). A continuación se enumeran otras publicaciones.

Para uso in vivo, el nucleósido no natural es permeable en membrana y se fosforila para formar el correspondiente trifosfato. Además, la información genética aumentada es estable y no se destruye por las enzimas celulares. Los esfuerzos previos de Benner y otros aprovecharon los patrones de enlaces de hidrógeno que son diferentes de 55 aquellos en los pares canónicos de Watson-Crick, siendo el ejemplo más notable de ellos el par iso-C:iso-G. véase, por ejemplo, C. Switzer, S. E. Moroney y S. A. Benner, J. Am. Chem. Soc., 111:8322 (1989); y, J. A. Piccirilli, T. Krauch, S. E. Moroney y S. A. Benner, Nature, 1990, 343:33 (1990); y E. T. Kool, Curr. Opin. Chem. Biol., 4:602 (2000). Estas bases en general aparean mal en algún grado con bases naturales y no pueden replicarse enzimáticamente. Kool y sus colaboradores demostraron que las interacciones de empaquetamiento hidrófobo entre bases pueden remplazar los enlaces de hidrógeno para dirigir la formación de pares de bases. Véase, E. T. Kool, Curr. Opin. Chem. Biol., 4:602 (2000); y, K. M. Guckian y E. T. Kool, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 36, 2825 (1998). En un esfuerzo por desarrollar un par de bases no natural que satisfaga todos los requisitos anteriores, Schultz, Romesberg y sus colaboradores han sintetizado sistemáticamente y estudiado una serie de bases hidrófobas no naturales. Se encuentra que el auto-par PICS:PICS, que se muestra en la Figura 10, es más estable que los pares 65 de bases naturales, y puede incorporarse de forma eficaz en el ADN por el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I de Escherichia coli (KF). Véase, por ejemplo, L. McMinn, A. K. Ogawa, Y. Q. Wu, J. Q. Liu, P. G. Schultz y F. E.

Romesberg, J. Am. Chem. Soc., 121:11586 (1999); y, A. K. Ogawa, Y. Q. Wu, D. L. McMinn, J. Q. Liu, P. G. Schultz y F. E. Romesberg, J. Am. Chem. Soc., 122:3274 (2000). Puede sintetizarse un auto-par 3MN:3MN por KF con eficacia y selectividad suficiente para su función biológica. Véase, por ejemplo, A. K. Ogawa, Y. Q. Wu, M. Berger, P.

G. Schultz y F. E. Romesberg, J. Am. Chem. Soc., 122:8803 (2000). Sin embargo, ambas bases actúan como

5 terminador de cadena para replicación adicional. Recientemente se ha desarrollado un ADN polimerasa mutante que puede usarse para replicar el auto-par PICS. Además, puede replicarse un auto-par 7AI usando una combinación de KF y la pol ∃ polimerasa. Véase, por ejemplo, E. J. L. Tae, Y. Q. Wu, G. Xia, P. G. Schultz y F. E. Romesberg, J. Am. Chem. Soc., 123:7439 (2001). También se ha desarrollado un nuevo par de metalobase, Dipic:Py, que forma un par estable tras la unión de Cu(II). Véase, E. Meggers, P. L. Holland, W. B. Tolman, F. E. Romesberg y P. G. Schultz, J. Am. Chem. Soc., 122:10714 (2000). Como los codones ampliados y los codones no naturales son intrínsecamente ortogonales a los codones naturales, los métodos de la presente invención pueden aprovechar esta propiedad para generar ARNt ortogonales para ellos.

Pares de ARNt ortogonal y aminoacil ARNt sintetasa ortogonal

15 Un par ortogonal está compuesto por un O-ARNt, por ejemplo, un ARNt supresor, un ARNt de desplazamiento de fase, o similares, y una O-RS. El O-ARNt no se acila por las sintetasas endógenas y es capaz de descodificar un codón selector, como se ha descrito anteriormente. La O-RS reconoce el O-ARNt, por ejemplo, con un bucle anticodón extendido, y preferentemente aminoacila el O-ARNt con un aminoácido no natural. Los métodos para generar pares ortogonales junto con composiciones de pares ortogonales se incluyen en la presente invención. El desarrollo de múltiples pares ortogonales de ARNt/sintetasa puede permitir la incorporación simultánea de múltiples aminoácidos no naturales usando diferentes codones en el mismo polipéptido/proteína.

En la presente invención, los métodos y composiciones relacionadas relativas se refieren a la generación de pares

25 ortogonales (O-ARNt/O-RS) que pueden incorporar un aminoácido no natural en una proteína in vivo. Por ejemplo, las composiciones de O-ARNt de la presente invención pueden comprender una aminoacil ARNt sintetasa ortogonal (O-RS). En una realización, el O-ARNt y la O-RS pueden ser complementarias, por ejemplo, un par ortogonal de ORNt/O-RS. Ejemplos de pares incluyen un par de muARNt-Tyr-mutTyrRS, tal como un par muARNtTyr-SS12TyrRS, un par muARNtLeu-mutLeuRS, un par muARNtThr-mutThrRS, un par muARNtGlu-mutGluRS, o similares. En una realización, un par ortogonal de la presente invención comprende las propiedades deseadas del par ortogonal de ARNt-aminoacil ARNt sintetasa y es diferente a muARNtGln-mutGlnRS derivado de Escherichia coli, un muARNtAsp-mutAspRS derivado de levadura o un muARNtPheCUA-mutfenlalaninaRS de levadura, donde estos pares no poseen las propiedades de los pares de la presente invención.

35 El O-ARNt y la O-RS pueden obtenerse por mutación de un ARNt y/o RS de origen natural procedentes de una diversidad de organismos, que se describen en fuentes y hospedadores. En una realización, el O-ARNt u la O-RS se obtienen de al menos un organismo. En otra realización, el O-ARNt se obtiene por mutación de un ARNt de origen natural o de origen natural mutado de un primer organismo y la O-RS se obtiene por mutación de una RS de origen natural o de origen natural mutada de un segundo organismo.

Los métodos para generar pares específicos de O-ARNt/O-RS también se proporcionan en la presente invención. Estos métodos resuelven los problemas analizados a continuación por las otras estrategias que se intentaron para generar pares ortogonales de ARNt/RS. Específicamente, los métodos de la presente invención incluyen: (a) generar una biblioteca de ARNt mutantes derivados de al menos un ARNt de un primer organismo; (b) seleccionar 45 negativamente la biblioteca para ARNt mutantes que se aminoacilen por una aminoacil ARNt sintetasa (RS) de un segundo organismo en ausencia de una RS del primer organismo, proporcionando de este modo una reserva de ARNt mutantes; (c) seleccionar la reserva de ARNt mutantes para miembros que se aminoacilen por una RS ortogonal (O-RS) introducida, proporcionando de este modo al menos un O-ARNt recombinante. El al menos un O-ARNt recombinante reconoce un codón selector y no se reconoce de forma eficaz por la RS del segundo organismo y se aminoacila preferentemente por la O-RS. El método también incluye: (d) generar una biblioteca de RS mutantes derivadas de al menos una aminoacil ARNt sintetasa (RS) de un tercer organismo; € seleccionar la biblioteca de RS mutantes para miembros que aminoacilen preferentemente el al menos un O-ARNt recombinante en presencia de un aminoácido no natural y un aminoácido natural, proporcionando de este modo una reserva de RS mutantes activas; y, (f) seleccionar negativamente la reserva para RS mutantes activas que aminoacilen preferentemente el al menos

55 un O-ARNt recombinante en ausencia del aminoácido no natural, proporcionando de este modo el al menos un par específico de O-ARNt/O-RS, donde el al menos par específico de O-ARNt/O-RS comprende al menos una O-RS recombinante que es específica para el aminoácido no natural y el al menos un O-ARNt recombinante. También se incluyen los pares producidos por los métodos de la presente invención.

Previamente, se intentó la generación de un par ortogonal de ARNt/sintetasa de un par existente de ARNt/sintetasa de Escherichia coli. El método implica eliminar la afinidad del ARNt hacia su sintetasa afín mutando nucleótidos en la superficie de contacto ARNt-sintetasa conservando al mismo tiempo su ortogonalidad a otra sintetasas y su capacidad de funcionar en traducción. Usando la sintetasa de tipo silvestre afín como molde de partida, entonces se desarrolla una sintetasa mutante que reconoce de forma única el ARNt ortogonal modificado por ingeniería. 65 Basándose en el análisis de la estructura cristalina de rayos-X de la glutamil-ARNt sintetasa (GlnRS) de Escherichia coli en complejo con el ARNtGln2, se identificaron tres sitios ("prominencias") en ARNtGln2 que hace contactos

específicos con GlnRS. Véase, por ejemplo, D. R. Liu, T. J. Magliery y P. G. Schultz, Chem. Biol., 4:685 (1997); y, D.

R. Liu, T. J. Magliery, M. Pastrnak y P. G. Schultz, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 94:10092 (1997). Estos sitios se mutaron en el ARNt, y se generaron ARNt supresores mutantes que contenían todas las posibles combinaciones de prominencias 1, 2, y 3 y se ensayaron individualmente por aminoacilación in vitro con GlnRS y supresión in vitro de mutantes ámbar de la corismato mutasa. Un ARNt mutante (O-ARNt) que albergaba las tres mutaciones de prominencia demostró ser ortogonal a todas las sintetasas endógenas de E. coli y competente en traducción. A continuación, se usaron múltiples rondas de reorganización del ADN junto con mutagénesis dirigida por oligonucleótido para generar bibliotecas de GlnRS mutantes. Estas enzimas mutantes se seleccionaron por su capacidad de acilar el O-ARNt in vivo usando la cepa BT235 de Escherichia coli. Solamente si una GlnRS mutante carga el O-ARNt con glutamina podrá suprimirse el codón ámbar genómico en lacZ, posibilitando que las células BT235 crezcan en medio mínimo de lactosa. Se purificaron varias sintetasas mutantes que sobrevivieron a cada ronda de selección y se ensayaron in vitro. La proporción de acilación del ARNtGln de tipo silvestre (wt) a acilación del O-ARNt por la sintetasa mutante disminuyó significativamente tras múltiples rondas de selección. Sin embargo, no se ha desarrollado ninguna GlnRS mutante de Escherichia coli que cargue el O-ARNt de forma más eficaz que el O-ARNtGln2 de Escherichia coli de tipo silvestre. El mejor mutante se desarrolló después de siete rondas de reorganización del ADN y selección, y acila el O-ARNt en solamente una novena parte que la tasa del ARNtGln wt. Sin embargo, estos experimentos no lograron producir una sintetasa candidata con las propiedades deseadas, por ejemplo, una sintetasa que no acile ningún ARNt wt, ya que la mala acilación de un ARNt wt con un aminoácido no natural podría provocar un fenotipo letal. Además, las mutaciones dentro del ARNt interaccionan de modos complicados, no aditivos con respecto tanto a la aminoacilación como a la traducción. Véase, D. R. Liu, T. J. Magliery y P. G. Schultz, Chem. Biol., 14:685 (1997). Por tanto, normalmente se usan métodos alternativos para proporcionar un par funcional con las propiedades deseadas.

Una segunda estrategia para generar un par ortogonal de ARNt/sintetasa implica importar un par de ARNt/sintetasa de otro organismo en Escherichia coli. Las propiedades de la sintetasa heteróloga candidata incluyen, por ejemplo, que no cargue ningún ARNt de Escherichia coli, y las propiedades del ARNt heterólogo candidato incluyen, por ejemplo, que no se acile por ninguna sintetasa de Escherichia coli. Además, el ARNt supresor derivado del ARNt heterólogo es ortogonal a todas las sintetasas de Escherichia coli. Schimmel et al. informaron de que GlnRS de Escherichia coli (EcGlnRS) no acila el ARNtGln de Saccharomyces cerevisiae (EcGlnRS carece de un dominio de unión a ARN N-terminal poseído por la GlnRS de Saccharomyces cerevisiae (ScGlnRS)). Véase, E. F. Whelihan y P. Schimmel, EMBO J., 16:2968 (1997). El ARNtGln supresor ámbar de Saccharomyces cerevisiae (ScARNtGlnCUA) después se analizó para determinar si tampoco es un sustrato para EcGlnRS. Los ensayos de aminoacilación in vitro mostraron que éste es el caso; y los estudios de supresión in vitro demostraron que el ScARNtGlnCUA es competente en traducción. Véase, por ejemplo, D. R. Liu y P. G. Schultz, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96:4780 (1999). Se demostró adicionalmente que ScGlnRS no acila ningún ARNt de Escherichia coli, solamente el ScARNtGlnCUA in vitro. El grado al cual la ScGlnRS es capaz de aminoacilar el ScARNtGlnCUA en Escherichia coli también se evaluó usando un ensayo de complementación in vivo. Se introdujo una mutación sin sentido ámbar en un sitio permisivo en el gen de la ∃-lactamasa. La supresión de la mutación por un ARNt supresor ámbar debe producir ∃-lactamasa de longitud completa y conferir resistencia a ampicilina a la célula. Cuando se expresa solamente ScARNtGlnCUA, las células muestran un CI50 de 20 %g/ml de ampicilina, lo que indica casi ausencia de acilación por sintetasas endógenas de Escherichia coli; cuando ScARNtGlnCUA se co-expresa con ScGlnRS, las células adquieren un CI50 de aproximadamente 500 %g/ml de ampicilina, lo que demuestra que la ScGlnRS acila el ScARNtGlnCUA de forma eficaz en Escherichia coli. Véase, D. R. Liu y P. G. Schultz, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96:4780 (1999). El ARNtGlnCUA/GlnRS de Saccharomyces cerevisiae es ortogonal a Escherichia coli.

Esta estrategia se aplicó posteriormente a un sistema de ARNtAsp/AspRs. Se sabe que el ARNtAsp de Saccharomyces cerevisiae es ortogonal a sintetasas de Escherichia coli. Véase, por ejemplo, B. P. Doctor y J. A. Mudd, J. Biol. Chem., 238:3677 (1963); y, Y. Kwok y J. T. Wong, Can. J. Biochem., 58:213 (1980). Se demostró que un ARNt supresor ámbar derivado del mismo (ScARNtAspCUA) también es ortogonal en Escherichia coli usando el ensayo de ∃-lactamasa in vivo descrito anteriormente. Sin embargo, el anticodón de ARNtAsp es un elemento de reconocimiento crítico de AspRS, véase, por ejemplo, R. Giege, C. Florentz, D. Kern, J. Gangloff, G. Eriani y D. Moras, Biochimie, 78:605 (1996), y la mutación del anticodón en CUA provoca una pérdida de afinidad del supresor por AspRS. Se ha demostrado que un mutante AspRS E93K Escherichia coli reconoce el ARNtAspCUA supresor ámbar de Escherichia coli en aproximadamente un orden de magnitud mejor que la AspRS wt. Véase, por ejemplo,

F. Martin, 'Thesis', Universite Louis Pasteur, Strasbourg, Francia, 1995. Se especuló que la introducción de la mutación referida en AspRS de Saccharomyces cerevisiae (E188K) podría restaurar su afinidad por el ScARNtAspCUA. Se determinó que el mutante de AspRS de Saccharomyces cerevisiae (E188K) no acila los ARNt de Escherichia coli, pero carga el ScARNtAspCUA con eficacia moderada como se muestra por experimentos de aminoacilación in vitro. Véase, por ejemplo, M. Pastrnak, T. J. Magliery y P. G. Schultz, Helv. Chim. Acta, 83:2277 (2000). Aunque el ScARNtAspCUA/ScAspRS(E 188K) puede servir como otro par ortogonal en Escherichia coli, posee actividad débil.

Un enfoque similar implica el uso de una sintetasa heteróloga como sintetasa ortogonal pero un ARNt iniciador mutante del mismo organismo o un organismo relacionado como ARNt ortogonal. RajBhandary y sus colabores descubrieron que un mutante ámbar del ARNtfMet iniciador humano se acila por GlnRS de Escherichia coli y actúa

como supresor ámbar en células de levadura solamente cuando se co-expresa la EcGlnRS. Véase, A. K. Kowal, C. Kohrer y U. L. RajBhandary, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98:2268 (2001). Este par por tanto representa un par ortogonal para su uso en levadura. Además, se descubrió que un mutante ámbar de ARNtfMet iniciador de Escherichia coli es inactivo hacia cualquier sintetasa de Escherichia coli. Se seleccionó una TyrRS de levadura mutante que carga este ARNt mutante, produciendo un par ortogonal en Escherichia coli. Véase, A. K. Kowal, et al, (2001), supra.

Los pares ARNtTyr/TyrRS procariotas y eucariotas tienen diferencias significativas: los elementos de identidad del ARNtTyr procariota incluye un largo brazo variable en contraste con el brazo corto en el ARNtTyr eucariota. Además, el ARNtTyr eucariota contiene un elemento de reconocimiento positivo C1:G72 mientras que el ARNtTyr procariota no tiene dicho par de bases consenso. Estudios in vitro también han demostrado que el ARNtTyr de Saccharomyces cerevisiae y H. sapiens no pueden aminoacilarse por sintetasas bacterianas, ni sus TyrRS aminoacilan ARNt bacterianos. Véase, por ejemplo, K. Wakasugi, C. L. Quinn, N. Tao y P. Schimmel, EMBO J., 17:297 (1998); y, T. A. Kleeman, D. Wei, K. L. Simpson y E. A. First, J. Biol. Chem., 272:14420 (1997). Pero, a pesar de todas estas características prometedoras para la ortogonalidad, los ensayos de complementación de ∃-lactamasa in vivo demostraron que el ARNtTyrCUA supresor ámbar derivado tanto de Saccharomyces cerevisiae como de H. sapiens no son ortogonales en Escherichia coli. Véase, por ejemplo, L. Wang, T. J. Magliery, D. R. Liu y P. G. Schultz, J. Am. Chem. Soc., 122:5010 (2000). La susceptibilidad del ARNt supresor a acilación por sintetasas de Escherichia coli se debe al cambio de un único nucleótido en el anticodón (G34 a C34).

Usando los métodos de la presente invención, se desarrollan los pares y componentes de pares deseados anteriores para generar pares ortogonales de ARNt/sintetasa que poseen características deseadas, por ejemplo, que pueden aminoacilar preferentemente un O-ARNt con un aminoácido no natural.

Organismos fuente y hospedadores

El par ortogonal de ARNt-RS, por ejemplo, derivado de al menos un primer organismo o al menos dos organismos, que pueden ser iguales o diferentes, puede usarse en una diversidad de organismos, por ejemplo, un segundo organismo. El primero y el segundo organismos de los métodos de la presente invención pueden ser iguales o diferentes. En una realización, el primer organismo es un organismo procariota, por ejemplo, Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium, Escherichia coli, A. fulgidus, Halobacterium, P. furiosus, P. horikoshii, A. pernix, T. thennophilus, o similares. Como alternativa, el primer organismo es un organismo eucariota, por ejemplo, plantas (por ejemplo, plantas complejas tales como monocotiledóneas, o dicotiledóneas), algas, protistas, hongos (por ejemplo, levaduras, etc.), animales (por ejemplo, mamíferos, insectos, artrópodos, etc.),

o similares. En otra realización, el segundo organismo es un organismo procariota, Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium; Escherichia coli, A. fulgidus, Halobacterium, P. furiosus, P. horikoshii, A. pernix, T. thermophilus, o similares. Como alternativa, el segundo organismo puede ser un organismo eucariota, por ejemplo, plantas, hongos, animales, o similares.

Como se ha descrito anteriormente, los componentes individuales de un par pueden obtenerse del mismo organismo

o diferentes organismos. Por ejemplo, el ARNt puede obtenerse de un organismo procariota, por ejemplo, una arqueobacteria, tal como Methanococcus jannaschii y Halobacterium NRC-1 o una eubacteria, tal como Escherichia coli, mientras que la sintetasa puede obtenerse del mismo organismo procariota u otro, tal como, Methanococcus jannaschii, Archaeoglobus fulgidus, Methanobacterium thermoautotrophicum, P. furiosus, P. horikoshii, A. pernix, T. thermophilus, Halobacterium, Escherichia coli o similares. También pueden usarse fuentes eucariotas, por ejemplo, plantas (por ejemplo, plantas completas tales como monocotiledóneas, o dicotiledóneas), algas, protistas, hongos (por ejemplo, levaduras, etc.), animales (por ejemplo, mamíferos, insectos, artrópodos, etc.), o similares.

Los métodos para seleccionar un par ortogonal de ARNt-ARNt sintetasa para su uso en un sistema de traducción in vivo de un segundo organismo también se incluyen en la presente invención. Los métodos incluyen: introducir un gen marcador, un ARNt y una aminoacil-ARNt sintetasa (RS) aislados o derivados de un primer organismo en una primera serie de células del segundo organismo; introducir el gen marcador y el ARNt en una serie duplicada de células del segundo organismo; y, seleccionar las células supervivientes en la primera serie que no lograron sobrevivir en la serie duplicada de células, donde la primera serie y la serie duplicada de células se cultivan en presencia de un agente de selección, y donde las células supervivientes comprenden el par ortogonal de ARNt-ARNt sintetasa para su uso en el sistema de traducción in vivo del segundo organismo. En una realización, la comparación y la selección incluyen un ensayo de complementación in vivo. En otra realización, se varía la concentración del agente de selección.

Por ejemplo, puede elegirse un par de ARNt/ARNt sintetasa basándose en el lugar donde se hallan los elementos de identidad, que son sitios de reconocimiento del ARNt para la sintetasa. Por ejemplo, se elige un par de ARNt/ARNt sintetasa cuando los elementos de identidad están fuera del anticodón, por ejemplo, el par de ARNtTyr/TyrRS de la arqueobacteria Methanococcus jannaschii. Esta TyrRS está perdiendo la mayor parte del dominio no conservado de unión para el bucle anticodón de su ARNtTyr, pero puede discriminar un ARNt con C1:G72 de uno con G1:C72. Además, la TyrRS de Methanococcus jannaschii (MjTyrRS) aminoacila el ARNt en bruto de Saccharomyces cerevisiae pero no el de Escherichia coli. Véase, por ejemplo, B. A. Steer y P. Schimmel, J. Biol. Chem., 274:35601

(1999). Usando un ensayo de complementación in vivo con un vector de expresión que contiene un gen indicador, por ejemplo, el gen de la ∃-lactamasa, con al menos un codón selector, las células que expresan el ARNtTyrCUA de Methanococcus jannaschii (Mj ARNtTyrCUA) solo sobreviven a una CI50 de 55 %g/ml de ampicilina; las células que coexpresan Mj ARNtTyrCUA con su TyrRS sobreviven a una CI50 de 1220 %g/ml de ampicilina. Aunque Mj 5 ARNtTyrCUA es menos ortogonal en Escherichia coli que el ScARNt-GlnCUA (CI50 20 %g/ml), la MjTyrRS tiene mayor actividad de aminoacilación hacia su ARNt supresor ámbar afín. Véase, por ejemplo, L. Wang, T. J. Magliery,

D. R. Liu y P. G. Schultz, J. Am. Chem. Soc., 122:5010 (2000). Como resultado, se identifica Methanococcus jannaschii /TyrRS como un par ortogonal en Escherichia coli y puede seleccionarse para su uso en un sistema de traducción in vivo.

Aminoácidos no naturales

Puede usarse una amplia diversidad de aminoácidos no naturales en los métodos de la invención. El aminoácido no natural puede elegirse basándose en características deseadas del aminoácido no natural, por ejemplo, función del

15 aminoácido no natural, tal como modificación de las propiedades biológicas de la proteína tales como toxicidad, biodistribución, o semi-vida, propiedades estructurales, propiedades espectroscópicas, propiedades químicas y/o fotoquímicas, propiedades catalíticas, capacidad de reaccionar con otras moléculas (de forma covalente o no covalente), o similares.

20 Como se usa en este documento un "aminoácido no natural" se refiere a cualquier aminoácido, aminoácido modificado, o análogo de aminoácido diferente a selenocisteína y los siguientes veinte alfa-aminoácidos codificados genéticamente: alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptófano, tirosina, valina. La estructura genérica de un alfa-aminoácido se ilustra por la Fórmula I:

Un aminoácido no natural normalmente es cualquier estructura que tiene Fórmula I donde el grupo R es cualquier sustituyente diferente al usado en los veinte aminoácidos naturales. Véase, por ejemplo, cualquier texto de 30 bioquímica tal como Biochemistry de L. Stryer, 3ª ed. 1988, Freeman and Company, Nueva York, para las estructuras de los veinte aminoácidos naturales. Obsérvese que los aminoácidos no naturales de la presente invención pueden ser compuestos de origen natural diferentes a los veinte alfa-aminoácidos anteriores. Como los aminoácidos no naturales de la invención normalmente difieren de los aminoácidos naturales en la cadena lateral solamente, los aminoácidos no naturales forman enlaces amida con otros aminoácidos, por ejemplo, naturales o no 35 naturales, del mismo modo en que se forman en proteínas de origen natural. Sin embargo, los aminoácidos no naturales tienen grupos de cadena lateral que los distinguen de los aminoácidos naturales. Por ejemplo, R en la Fórmula I opcionalmente comprende un grupo alquilo, arilo, acilo, ceto, azido, hidroxilo, hidrazina, ciano, halo, hidrazida, alquenilo, alquinilo, éter, tiol, seleno, sulfonilo, borato, boronato, fosfo, fosfono, fosfina, heterocíclico, enona, imina, aldehído, éster, tioácido, hidroxilamina, amino, o similares o cualquier combinación de los mismos. 40 Otros aminoácidos no naturales de interés incluyen, aunque sin limitación, aminoácidos que comprenden un agente de reticulación fotoactivable, aminoácidos marcados con espín marcado, aminoácidos fluorescentes, aminoácidos de unión a metales, aminoácidos que contienen metales, aminoácidos radiactivos, aminoácidos con nuevos grupos funcionales, aminoácidos que interaccionan de forma covalente o no covalente con otras moléculas, aminoácidos fotoenjaulados y/o fotoisomerizables, aminoácidos que comprenden biotina o un análogo de biotina, aminoácidos 45 glucosilados tales como una serina sustituida con azúcar, otros aminoácidos modificados con carbohidrato, aminoácidos que contienen ceto, aminoácidos que comprenden polietilenglicol o poliéter, aminoácidos sustituidos con átomo pesado, aminoácidos escindibles químicamente y/o fotoescindibles, aminoácidos con cadenas laterales alargadas en comparación con aminoácidos naturales, por ejemplo, poliéteres o hidrocarburos de cadena larga, por ejemplo, mayores de aproximadamente 5 o más de aproximadamente 10 carbonos, aminoácidos que contienen

50 azúcares unidos en carbono, aminoácidos redox-activos, aminoácidos que contienen aminotioácidos, y aminoácidos que comprenden uno o más restos tóxicos.

Además de los aminoácidos no naturales que contienen nuevas cadenas laterales, los aminoácidos no naturales también comprenden opcionalmente estructuras centrales modificadas, por ejemplo, como se ilustra por las 55 estructuras de Fórmula II y III:

donde Z normalmente comprende OH, NH2, SH, NH-R', o S-R'; X e Y, que pueden ser iguales o diferentes, normalmente comprenden S u O, y R y R', que opcionalmente son iguales o diferentes, normalmente se seleccionan entre la misma lista de constituyentes para el grupo R descrita anteriormente para los aminoácidos no naturales que tienen Fórmula I así como hidrógeno. Por ejemplo, los aminoácidos no naturales de la invención opcionalmente comprenden sustituciones en el grupo amino o carboxilo como se ilustra por las Fórmulas II y III. Los aminoácidos no naturales de este tipo incluyen, aunque sin limitación, #-hidroxi ácidos, #-tioácidos, #-aminotiocarboxilatos, por ejemplo, con cadenas laterales correspondientes a los veinte aminoácidos naturales comunes o cadenas laterales no naturales. Además, las sustituciones en el #-carbono opcionalmente incluyen aminoácidos L, D, o #-#disustituidos tales como D-glutamato, D-alanina, D-metil-O-tirosina, ácido aminobutírico, y similares. Otras alternativas estructurales incluyen aminoácidos cíclicos, tales como análogos de prolina así como análogos de prolina con anillo de 3, 4, 6, 7, 8, y 9 miembros, ∃ y ∋ aminoácidos tales como ∃-alanina sustituida y ácido ∋-amino butírico.

Por ejemplo, muchos aminoácidos no naturales se basan en aminoácidos naturales, tales como tirosina, glutamina, fenilalanina, y similares. Los análogos de tirosina incluyen tirosinas para-sustituidas, tirosinas orto-sustituidas, y tirosinas meta sustituidas, donde la tirosina sustituida comprende un grupo acetilo, un grupo benzoilo, un grupo amino, una hidrazina, una hidroxiamina, un grupo tiol, un grupo carboxi, un grupo isopropilo, un grupo metilo, un hidrocarburo de cadena lineal o ramificada C6 -C20, un hidrocarburo saturado o insaturado, un grupo O-metilo, un grupo poliéter, un grupo nitro, o similares. Además, también se contemplan anillos arilo sustituidos de forma múltiple. Los análogos de glutamina de la invención incluyen, aunque sin limitación, derivados #-hidroxi, derivados ∋sustituidos, derivados cíclicos, y derivados de glutamina sustituidos con amida. Análogos ejemplares de fenilalanina incluyen, aunque sin limitación, fenilalaninas meta-sustituidas, donde el sustituyente comprende un grupo hidroxi, un grupo metoxi, un grupo metilo, un grupo alilo, un grupo acetilo, o similares. Ejemplos específicos de aminoácidos no naturales incluyen, aunque sin limitación, O-metil-L-tirosina, una L-3-(2-naftil)alanina, una 3-metil-fenilalanina, una O4-alil-L-tirosina, una 4-propil-L-tirosina, una tri-O-acetil-GlcNAcp-serina, una L-Dopa, una fenilalanina fluorada, una isopropil-L-fenilalanina, un p-azido-L-fenilalanina, una p-acil-L-fenilalanina, una p-benzoil-L-fenilalanina, una Lfosfoserina, una fosfonoserina, una fosfonotirosina, una p-yodo-fenilalanina, una p-bromofenilalanina, una p-aminoL-fenilalanina, y una isopropil-L-fenilalanina, y similares. Se proporcionan las estructuras de una diversidad de aminoácidos no naturales no limitantes en las figuras, por ejemplo, Figuras 29, 30, y 31.

Normalmente, los aminoácidos no naturales de la invención se seleccionan o diseñan para proporcionar características adicionales no disponibles en los veinte aminoácidos naturales. Por ejemplo, se diseñan opcionalmente o seleccionan aminoácidos no naturales para modificar las propiedades biológicas de una proteína, por ejemplo, en que se incorporan. Por ejemplo, se modifican opcionalmente las siguientes propiedades por inclusión de un aminoácido no natural en una proteína: toxicidad, biodistribución, solubilidad, estabilidad, por ejemplo, térmica, hidrolítica, oxidativa, resistencia a degradación enzimática, y similares, facilidad de purificación y procesamiento, propiedades estructurales, propiedades espectroscópicas, propiedades químicas y/o fotoquímicas, actividad catalítica, potencial redox, semi-vida, capacidad de reaccionar con otras moléculas, por ejemplo, deforma covalente o no covalente, y similares.

Se describen detalles adicionales respecto a aminoácidos no naturales en la solicitud correspondiente, "In vivo Incorporation of Unnatural Amino Acids", número de expediente del mandatario 54-000120PC/US, presentada el 19 de abril de 2002.

Uso de ARNt mutante y O-RS y pares de O-ARNt/O-RS

Las composiciones de la presente invención y composiciones preparadas por los métodos de la presente invención opcionalmente están en una célula. Los pares de O-ARNt/O-RS o componentes individuales de la presente invención entonces pueden usarse en una maquinaria de traducción de un sistema hospedador, lo que provoca que se incorpore un aminoácido no natural en una proteína. La correspondiente solicitud de patente "In vivo Incorporation of Unnatural Amino Acids", número de expediente del mandatario 54-000120PC/US de Schultz, et al. describe este proceso. Por ejemplo, cuando se introduce un par de O-ARNt/O-RS en un hospedador, po0r ejemplo, Escherichia coli, el par conduce a la incorporación in vivo de un aminoácido no natural, por ejemplo, un aminoácido sintético, tal como O-metil-L-tirosina, que puede añadirse de forma exógena al medio de cultivo, en una proteína, por ejemplo, dihidrofolato reductasa o una proteína terapéutica tal como EPO, es respuesta a un codón selector, por ejemplo, un codón sin sentido ámbar. Opcionalmente, las composiciones de la presente invención pueden esta en un sistema de traducción in vitro, o en uno o más sistemas in vivo.

Variantes de secuencia de ácido nucleico y polipéptido

Como se ha descrito anteriormente y se describe a continuación, la invención proporciona secuencias polinucleotídicas de ácido nucleico y secuencias polipeptídicas de aminoácidos, por ejemplo, O-ARNt y O-RS y, por ejemplo, composiciones y métodos que comprenden dichas secuencias. Ejemplos de dichas secuencias, por ejemplo, O-ARNt y O-RS se describen en este documento. Sin embargo, un especialista en la técnica apreciará que la invención no está limitada a esas secuencias descritas en este documento. Un especialista en la técnica apreciará que la presente invención también proporciona muchas secuencias relacionadas y no relacionadas con las funciones descritas en este documento, por ejemplo, que codifican un O-ARNt o una O-RS.

Un especialista en la técnica también apreciará que se incluyen en la invención muchas variantes de las secuencias descritas. Por ejemplo, se incluyen en la invención variaciones conservativas de las secuencias descritas que producen una secuencia funcionalmente idéntica. Variantes de las secuencias polinucleotídicas de ácido nucleico, donde las variantes hibridan con al menos una secuencia descrita, se consideran incluidas en la invención. También se incluyen en la invención subsecuencias únicas de las secuencias descritas en este documento, determinadas por, por ejemplo, técnicas convencionales de comparación de secuencias.

Variaciones conservativas

Debido a la degeneración del código genético, las "sustituciones silenciosas" (es decir, sustituciones en una secuencia de ácido nucleico que no provocan una alteración en un polipéptido codificado) son una característica implícita de todas las secuencias de ácido nucleico que codifican un aminoácido. Asimismo, las "sustituciones conservativas de aminoácidos", en uno o unos pocos aminoácidos en una secuencia de aminoácidos sustituidos con diferentes aminoácidos con propiedades muy similares, también se identifican fácilmente como muy similares a una construcción descrita. Dichas variaciones conservativas de cada secuencia descrita son una característica de la presente invención.

"Variaciones conservativas" de una secuencia de ácido nucleico particular se refiere a aquellos ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas o, cuando el ácido nucleico no codifica una secuencia de aminoácidos, a secuencias esencialmente idénticas, véase la siguiente Tabla 1. Un especialista en la técnica reconocerá que sustituciones, deleciones o adicionales individuales que alteran, añaden o delecionan un aminoácido individual o un pequeño porcentaje de aminoácidos (normalmente menos del 5 %, más normalmente menos del 4 %, 2 % o 1 %) en una secuencia codificada son "variaciones modificadas de forma conservativa" donde las alteraciones provocan la deleción de un aminoácido, la adición de un aminoácido, o la sustitución de un aminoácido con un aminoácido químicamente similar. Por tanto, las "variaciones conservativas" de una secuencia polipeptídica enumerada de la presente invención incluyen sustituciones de un pequeño porcentaje, normalmente menos del 5 %, más normalmente menos del 2 % o el 1 %, de los aminoácidos de la secuencia polipeptídica, con un aminoácido seleccionado de forma conservativa del mismo grupo de sustitución conservativa. Finalmente, la adición de secuencias que no alteran la actividad codificada de una molécula de ácido nucleico, tal como la adición de una secuencia no funcional, es una variación conservativa del ácido nucleico básico.

Tabla 1--Grupos de sustitución conservativa 5

1

Alanina (A) Serina (S) Treonina (T)

2

Ácido aspártico(D) Ácido glutámico (E)

3

Asparagina (N) Glutamina (Q)

4

Arginina (R) Lisina (K)

5

Isoleucina (I) Leucina (L) Metionina (M) Valina (V)

6

Fenilalanina (F) Tirosina (Y) Triptófano (W)

Hibridación de ácidos nucleicos

Puede usarse hibridación comparativa para identificar ácidos nucleicos de la invención, incluyendo variaciones conservativas de ácidos nucleicos de la invención, y este método de hibridación comparativa es un método preferido para distinguir ácidos nucleicos de la invención. Además, los ácidos nucleicos diana que hibridan con los ácidos nucleicos representados por la SEC ID Nº 1-3 o la SEC ID Nº 4-34 (véase, Tabla 5) en condiciones de rigurosidad elevada, ultra-elevada y ultra-ultra elevada son una característica de la invención. Ejemplos de dichos ácidos nucleicos incluyen aquellos con una o unas pocas sustituciones silenciosas o conservativas de ácido nucleico en comparación con una secuencia de ácido nucleico dada.

Se dice que un ácido nucleico de ensayo hibrida específicamente con un ácido nucleico sonda cuando hibrida al menos ½ tan bien a la sonda como a la diana complementaria perfectamente apareada, es decir, con una proporción de señal a ruido al menos ½ tan elevada como la hibridación de la sonda a la diana en condiciones en que la sonda perfectamente apareada se une a la diana complementaria perfectamente apareada con una proporción de señal a ruido que es al menos aproximadamente 5x-10x tan elevada como la observada para la hibridación a cualquiera de los ácidos nucleicos diana no apareados.

Los ácidos nucleicos "hibridan" cuando se asocian, normalmente en solución. Los ácidos nucleicos hibridan debido a una diversidad de fuerzas físico-químicas bien caracterizadas, tales como enlaces de hidrógeno, exclusión de disolvente, apilamiento de bases y similares. Se encuentra una guía extensiva para la hibridación de ácidos nucleicos en Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes parte I capítulo 2, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays," (Elsevier, Nueva York), así como en Ausubel, infra. Hames y Higgins (1995) Gene Probes 1 IRL Press en Oxford University Press, Oxford, Inglaterra (Hames y Higgins 1) y Hames y Higgins (1995) Gene Probes 2 IRL Press en Oxford University Press, Oxford, Inglaterra (Hames y Higgins 2) proporcionan detalles sobre la síntesis, marcaje, detección y cuantificación de ADN y ARN, incluyendo oligonucleótidos.

Un ejemplo de condiciones rigurosas de hibridación para la hibridación de ácidos nucleicos complementarios que tienen más de 100 restos complementarios en un filtro en una transferencia de Southern o northern es formalina al 50 % con 1 mg de heparina a 42 ºC, realizándose la hibridación durante una noche. Un ejemplo de condiciones rigurosas de lavado es un lavado con SSC 0,2x a 65 ºC durante 15 minutos (véase, Sambrook, infra para una descripción del tampón SSC). A menudo el lavado de alta rigurosidad está precedido por un lavado de baja rigurosidad para retirar la señal de fondo de la sonda. Un ejemplo de lavado de baja rigurosidad es SSC 2x a 40 ºC durante 15 minutos. En general, una proporción de señal a ruido de 5x (o mayor) que la observada para una sonda no relacionada en el ensayo de hibridación particular indica detección de una hibridación específica.

Las "condiciones rigurosas de lavado de hibridación" en el contexto de experimentos de hibridación de ácidos nucleicos tales como hibridaciones de Southern y northern son dependientes de la secuencia, y son diferentes en diferentes parámetros ambientales. Se encuentra una guía extensiva para la hibridación de ácidos nucleicos en Tijssen (1993), supra. y en Hames y Higgins, 1 y 2. Las condiciones rigurosas de hibridación y lavado pueden determinarse fácilmente de forma empírica para cualquier ácido nucleico de ensayo. Por ejemplo, en la determinación de las condiciones altamente rigurosas de hibridación y lavado, las condiciones de hibridación y lavado se aumentan gradualmente (por ejemplo, aumentando la temperatura, disminuyendo la concentración salina, aumentando la concentración de detergente y/o aumentando la concentración de disolventes orgánicos tales como formalina en la hibridación o el lavado), hasta que se cumple una serie seleccionada de criterios. Por ejemplo, las condiciones de hibridación y lavado se aumentan gradualmente hasta que una sonda se une a una diana complementaria perfectamente apareada con una proporción de señal a ruido que es al menos 5x tan elevada como la observada para la hibridación de la sonda a una diana no apareada.

Las condiciones "muy rigurosas" se seleccionan para que sean iguales al punto de fusión térmica (Tm) para una sonda particular. La Tm es la temperatura (a fuerza iónica y pH definidos) a la que el 50 % de la secuencia de ensayo hibrida con una sonda perfectamente apareada. Para los fines de la presente invención, generalmente, las condiciones de hibridación y lavado "altamente rigurosas" se seleccionan para que sean aproximadamente 5 ºC inferiores a la Tm para la secuencia específica a una fuerza iónica y pH definidos.

Las condiciones de hibridación y lavado "de rigurosidad ultra elevada" son aquellas en que la rigurosidad de las condiciones de hibridación y lavado se aumentan hasta que la proporción de señal a ruido para la unión de la sonda al ácido nucleico diana complementario perfectamente apareado es al menos 10x tan elevada como la observada para la hibridación de cualquiera de los ácidos nucleicos diana no apareados. Un ácido nucleico diana que hibrida con una sonda en dichas condiciones, con una proporción de señal a ruido de al menos ½ la del ácido nucleico diana complementario perfectamente apareado se dice que se une a la sonda en condiciones de rigurosidad ultraelevada.

Asimismo, pueden determinarse niveles incluso mayores de rigurosidad aumentando gradualmente las condiciones de hibridación y/o lavado del ensayo de hibridación relevante. Por ejemplo, aquellos en que la rigurosidad de las condiciones de hibridación y lavado se aumentan hasta que la proporción de señal a ruido para la unión de la sonda al ácido nucleico diana complementario perfectamente apareado es al menos 10X, 20X, 50X, 100X, o 500X o más tan elevada como la observada para la hibridación de cualquiera de los ácidos nucleicos diana no apareados. Un ácido nucleico diana que hibrida con una sonda en dichas condiciones, con una proporción de señal a ruido de al menos ½ la del ácido nucleico diana complementario perfectamente apareado se dice que se une a la sonda en

5 condiciones de rigurosidad ultra-ultra-elevadas.

Los ácidos nucleicos que no hibridan entre sí en condiciones rigurosas aún son sustancialmente idénticos si los polipéptidos que codifican son sustancialmente idénticos. Esto sucede, por ejemplo, cuando se crea una copia de un ácido nucleico usando la máxima degeneración de codones permitida por el código genético.

Subsecuencias únicas

En un aspecto, la invención proporciona un ácido nucleico que comprende una subsecuencia única en un ácido nucleico seleccionado entre las secuencias de O-ARNt y O-RS descritas en este documento, por ejemplo, la SEC ID

15 Nº 1-3 o la SEC ID Nº 4-34 (véase, la Tabla 5). La subsecuencia única es única en comparación con un ácido nucleico correspondiente a cualquier secuencia previamente conocida de ácido nucleico de O-ARNt u O-RS, por ejemplo, las encontradas en Genbank. La alineación puede realizarse usando, por ejemplo, BLAST configurado a parámetros por defecto. Cualquier subsecuencia única es útil, por ejemplo, como sonda para identificar los ácidos nucleicos de la invención.

Asimismo, la invención incluye un polipéptido que comprende una subsecuencia única en un polipéptido seleccionado entre las secuencias de O-RS descritas en este documento, por ejemplo, las SEC ID Nº 35-66 (véase, la Tabla 5). Aquí, la subsecuencia única es única en comparación con un polipéptido correspondiente a cualquier secuencia polipeptídica conocida.

25 La invención también proporciona ácidos nucleicos diana que hibridan en condiciones rigurosas con un oligonucleótido codificante único que codifica una subsecuencia única en un polipéptido seleccionado entre las secuencias de O-RS donde la subsecuencia única es única en comparación con un polipéptido correspondiente a cualquiera de los polipéptidos de control. Las secuencias únicas se determinan como se ha indicado anteriormente.

Comparación, identidad y homología de secuencia

Las expresiones "idéntica" o porcentaje de "identidad", en el contexto de dos o más secuencias de ácido nucleico o polipeptídicas, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje

35 especificado de restos aminoacídicos o nucleótidos que con iguales, cuando se comparan y alinean para la máxima correspondencia, medida usando uno de los algoritmos de comparación de secuencias descritos a continuación (u otros algoritmos disponibles para los especialistas en la técnica) o por inspección visual.

La expresión "sustancialmente idéntica", en el contexto de dos ácidos nucleicos o polipéptidos (por ejemplo, ADN que codifican un O-ARNt o O-RS, o la secuencia de aminoácidos de una O-RS) se refiere a dos o más secuencias o subsecuencias que tienen al menos aproximadamente un 60 %, preferiblemente un 80 %, más preferiblemente un 90-95 % de identidad de nucleótidos o restos aminoacídicos, cuando se comparan y alinean para la máxima correspondencia, medida usando un algoritmo de comparación de secuencia o por inspección visual. Dichas secuencias "sustancialmente idénticas" se consideran normalmente "homólogas", sin referencia a la ascendencia

45 real. Preferiblemente, existe "identidad sustancial" sobre una región de las secuencias que es de al menos aproximadamente 50 restos de longitud, más preferiblemente sobre una región que es de al menos aproximadamente 100 restos, y mucho más preferiblemente las secuencias son sustancialmente idénticas sobre al menos aproximadamente 150 restos, o sobre la longitud completa de las dos secuencias a comparar.

Para la comparación de secuencias y la determinación de homología, normalmente una secuencia actúa como secuencias de referencia con la que se comparan secuencias de ensayo. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias, se introducen las secuencias de ensayo y referencia en un ordenador, se designan las coordenadas de subsecuencia, si fuera necesario, y se designan los parámetros del programa del algoritmo de secuencias. El algoritmo de comparación de secuencias entonces calcula el porcentaje de identidad de secuencia

55 para la secuencia o secuencias de ensayo relativa a la secuencia de referencia, basándose en los parámetros designados del programa.

Puede realizarse una alineación óptima de secuencias para la comparación, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), mediante la búsqueda con el método similitud de Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), mediante implementaciones computerizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), o por inspección visual (véase en líneas generales, Ausubel et al., infra).

65 Un ejemplo de un algoritmo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y similitud de secuencia es el algoritmo BLAST, que se describe en Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990). El software

para realizar análisis BLAST está disponible al público a través del National Center for Biotechnology Information (www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo implica identificar primero pares de secuencias con alta valoración (HSP) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia de consulta, que aparean o satisfacen algún valor T con umbral de valor positivo cuando se alienan con una palabra de la misma longitud en una secuencia de la base de datos. T se refiere al umbral del valor de la palabra vecina (Altschul et al., supra). Estos aciertos iniciales de la palabra vecina actúan como semillas para inicial búsquedas para hallar HSP más largos que los contengan. Los aciertos de palabra entonces se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia hasta todo lo que pueda aumentarse el valor cumulativo de alineación. Los valores cumulativos se calculan usando, para secuencias de nucleótidos, los parámetros M (valor de recompensa para un par de restos que aparean; siempre > 0) y N (valor de penalización para restos que desaparean; siempre < 0). Para secuencias de aminoácidos, se usa una matriz de valores para calcular el valor cumulativo. La extensión de los aciertos de palabra en cada dirección se detiene cuando: el valor cumulativo de alineación desciende en la cantidad X desde su máximo valor conseguido; el valor cumulativo llega a cero o por debajo, debido a la acumulación de una o más alineación de restos con valoración negativa; o se alcanza el final de cualquier secuencia. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T, y X determinan la sensibilidad y velocidad de la alineación. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) usa como defectos una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, un punto límite de 100, M=5, N=-4, y una comparación de ambas hebras. Para secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP usa como defectos una longitud de palabra (W) de 3, una expectativa (E) de 10, y la matriz de valores BLOSUM62 (véase, Henikoff y Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915).

Además de calcular el porcentaje de identidad de secuencia, el algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (véase, por ejemplo, Karlin y Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)). Una medida de la similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad mediante la cual sucedería un apareamiento entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos por casualidad. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico de ensayo con el ácido nucleico de referencia es menor de aproximadamente 0,1, más preferiblemente menor de aproximadamente 0,01, y mucho más preferiblemente menor de aproximadamente 0,001.

Definición de polipéptidos por inmunorreactividad

Como los polipéptidos de la invención proporcionan una diversidad de nuevas secuencias polipeptídicas (por ejemplo, que comprenden aminoácidos no naturales en el caso de proteínas sintetizadas en los sistemas de traducción en este documento o, por ejemplo, en el caso de las nuevas sintetasas en este documento, nuevas secuencias de aminoácidos convencionales), los polipéptidos también proporcionan nuevas características estructurales que pueden reconocerse, por ejemplo, en ensayos inmunológicos. La generación de antisueros que se unen específicamente a los polipéptidos de la invención, así como los polipéptidos que se unen mediante dichos antisueros, son una característica de la invención.

Por ejemplo, la invención incluye proteínas sintetasa que se unen específicamente a o que son específicamente inmunorreactivas con un anticuerpo o antisuero generado contra un inmunógeno que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre una o más de las SEC ID Nº 35-66 (véase, la Tabla 5). Para eliminar la reactividad cruzada con otros homólogos, el anticuerpo o antisuero se sustrae con sintetasas disponibles, tales como la tirosil sintetasa (TyrRS) de Methanococcus jannaschii (M. jannaschii) de tipo silvestre, por ejemplo, los polipéptidos de "control". Cuando la tirosil sintetasa (TyrRS) de Methanococcus jannaschii (M. jannaschii) de tipo silvestre corresponde con un ácido nucleico, se genera un polipéptido codificado por el ácido nucleico y se usa para fines de sustracción en anticuerpos/antisueros.

En un formato típico, el inmunoensayo usa un antisuero policlonal que se creó contra uno o más polipéptidos que comprenden una o más de las secuencias correspondientes a una o más de las SEC ID Nº 35-66 (véase, la Tabla 5)

o una subsecuencia sustancial de las mismas (es decir, al menos aproximadamente el 30 % de la secuencia de longitud completa proporcionada). La serie de inmunógenos polipeptídicos potenciales derivados de la SEC ID Nº 35-66 (véase, la Tabla 5) se menciona colectivamente a continuación como "los polipéptidos inmunogénicos". El antisuero resultante se selecciona opcionalmente para que tenga baja reactividad cruzada contra los homólogos de sintetasa de control y se elimina cualquier reactividad cruzada de este tipo, por ejemplo, por inmunoabsorción, con uno o más de los homólogos de sintetasa de control, antes del uso del antisuero policlonal en el inmunoensayo.

Para producir antisueros para su uso en un inmunoensayo, se produce uno o más de los polipéptidos inmunogénicos y se purifica como se describe en este documento. Por ejemplo, la proteína recombinante puede producirse en una célula recombinante. Se inmuniza una cepa endogámica de ratones (usada en este ensayo porque los resultados son más reproducibles debido a la identidad genética virtual de los ratones) con la proteína o proteínas inmunogénicas en combinación con un adyuvante convencional, tal como adyuvante de Freund, y un protocolo convencional de inmunización de ratones (véase, por ejemplo, Harlow y Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, Nueva York, para una descripción convencional de la generación de anticuerpos, formatos de inmunoensayo y condiciones que pueden usarse para determinar la inmunorreactividad específica. También se encuentran referencias adicionales y un análisis de los anticuerpos en

este documento y pueden aplicarse aquí para definir polipéptidos por inmunorreactividad). Como alternativa, se conjuga uno o más polipéptidos sintéticos o recombinantes derivados de las secuencias descritas en este documento con una proteína vehículo y se usa como inmunógeno.

Los sueros policlonales se recogen y titulan frente al polipéptido inmunogénico en un inmunoensayo, por ejemplo, un inmunoensayo en fase sólida con una o más de las proteínas inmunogénicas inmovilizadas en un soporte sólido. Se seleccionan antisueros policlonales con un título de 106 o mayor, se combinan y se sustraen con los polipéptidos sintetasa de control para producir antisueros policlonales titulados combinados sustraídos.

Los antisueros policlonales titulados combinados sustraídos se ensayan para la reactividad cruzada frente a los homólogos de control en un inmunoensayo comparativo. En este ensayo comparativo, se determinan condiciones de unión discriminatorias para los antisueros policlonales titulados sustraídos que provocan una proporción de señal a ruido al menos aproximadamente 5-10 veces mayor para la unión de los antisueros policlonales titulados a la sintetasa inmunogénica en comparación con la unión a los homólogos de sintetasa de control. Es decir, la rigurosidad de la reacción de unión se ajusta mediante la adición de competidores no específicos tales como albúmina o leches en polvo desnatada, y/o ajustando las condiciones salines, la temperatura, y/o similares. Estas condiciones de unión se usan en ensayos posteriores para determinar si un polipéptido de ensayo (un polipéptido que se está comparando con los polipéptidos inmunogénicos y/o los polipéptidos de control) se une específicamente por los antisueros policlonales sustraídos combinados. En particular, polipéptidos de ensayo que muestran una proporción de señal a ruido al menos 2-5x mayor que los homólogos de sintetasa de control en condiciones discriminatorias de unión, y al menos aproximadamente ½ la proporción de señal a ruido en comparación con el polipéptido o polipéptidos inmunogénicos, comparten similitud estructural sustancial con el polipéptido inmunogénico en comparación con sintetasas conocidas y son, por lo tanto, un polipéptido de la invención.

En otro ejemplo, se usan inmunoensayos en el formato de unión competitiva para la detección de un polipéptido de ensayo. Por ejemplo, como se ha indicado, los anticuerpos de reacción cruzada se retiran de la mezcla de antisueros combinados por inmunoabsorción con los polipéptidos de control. El polipéptido o polipéptidos inmunogénicos entonces se inmovilizan en un soporte sólido que se expone a los antisueros combinados sustraídos. Se añaden las proteínas de ensayo al ensayo para que compitan por la unión a los antisueros sustraídos combinados. La capacidad de la proteína o proteínas de ensayo de competir por la unión a los antisueros sustraídos combinados en comparación con la proteína o proteínas inmovilizadas se compara con la capacidad del polipéptido

o polipéptidos inmunogénicos añadidos al ensayo de competir por la unión (los polipéptidos inmunogénicos compiten de forma eficaz con los polipéptidos inmunogénicos inmovilizados por la unión a los antisueros combinados). El porcentaje de reactividad cruzada para las proteínas de ensayo se calcula usando cálculos convencionales.

En un ensayo paralelo, se determina opcionalmente la capacidad de las proteínas de control de competir por la unión a los antisueros sustraídos combinados en comparación con la capacidad del polipéptido o polipéptidos inmunogénicos de competir por la unión a los antisueros. De nuevo, el porcentaje de reactividad cruzada para los polipéptidos de control se calcula usando cálculos convencionales. Cuando el porcentaje de reactividad cruzada es al menos 5-10x tan elevado para los polipéptidos de ensayo en comparación con los polipéptidos de control y o cuando la unión de los polipéptidos de ensayo está aproximadamente en el intervalo de la unión de los polipéptidos inmunogénicos, se dice que los polipéptidos de ensayo se unen específicamente a los antisueros sustraídos combinados.

En general, los antisueros inmunoabsorbidos y combinados pueden usarse en un inmunoensayo de unión competitiva como se describe en este documento para comparar cualquier polipéptido de ensayo con el polipéptido

o polipéptidos inmunogénicos y/o de control. Para hacer esta comparación, los polipéptidos inmunogénicos, de ensayo y de control se ensayan cada uno a un amplio intervalo de concentraciones y se determina la cantidad de cada polipéptido necesaria para inhibir el 50 % de la unión de los antisueros sustraídos a, por ejemplo, una proteína inmovilizada de control, ensayo o inmunogénica usando técnicas convencionales. Si la cantidad del polipéptido de ensayo necesaria para la unión en el ensayo competitivo es menor de dos veces la cantidad del polipéptido inmunogénico que se necesita, entonces se dice que el polipéptido de ensayo se une específicamente a un anticuerpo generado contra la proteína inmunogénica, siempre que la cantidad sea al menos aproximadamente 510x tan elevada como para el polipéptido de control.

Como determinación adicional de la especificidad, los antisueros combinados se inmunoabsorben completamente de forma opcional con el polipéptido o polipéptidos inmunogénicos (en lugar de los polipéptidos de control) hasta que sea detectable poca o ninguna unión del antisuero combinado sustraído con polipéptido inmunogénico resultante al polipéptido o polipéptidos inmunogénicos usados en la inmunoabsorción. Este antisuero completamente inmunoabsorbido entonces se ensaya para su reactividad con el polipéptido de ensayo. Si se observa poca o ninguna reactividad (es decir, no más de 2x la proporción de señal a ruido observada para la unión del antisuero completamente inmunoabsorbido al polipéptido inmunogénico), entonces el polipéptido de ensayo está unido específicamente por el antisuero creado por la proteína inmunogénica.

Técnicas generales

Los textos generales que describen técnicas de biología molecular, que son aplicables a la presente invención, tales como clonación, mutación, cultivo celular y similares, incluyen Berger y Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volumen 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger); Sambrook et al., Molecular Cloning -A Laboratory Manual (3ª Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, 2000 ("Sambrook") y Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, una empresa conjunta entre Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc., (suplementado hasta 2002) ("Ausubel")). Estos textos describen la mutagénesis, el uso de vectores, promotores y muchos otros tópicos relevantes relacionados con, por ejemplo, la generación de ARNt ortogonales, sintetasas ortogonales, y pares de los mismos.

Se usan diversos tipos de mutagénesis en la presente invención, por ejemplo, para producir nuevas sintetasas o ARNt. Incluyen, aunque sin limitación, mutagénesis dirigida al sitio, mutagénesis puntual aleatoria, recombinación homóloga (reorganización del ADN), mutagénesis usando moldes que contienen uracilo, mutagénesis dirigida por oligonucleótidos, mutagénesis con ADN modificado con fosforotioato, mutagénesis usando ADN dúplex con huecos

o similares. Métodos adecuados adicionales incluyen reparación de desapareamientos puntuales, mutagénesis usando cepas hospedadoras deficientes en reparación, selección por restricción y purificación por restricción, mutagénesis por deleción, mutagénesis por síntesis génica total, reparación de roturas de la doble hebra, y similares. También se incluye en la presente invención la mutagénesis, por ejemplo, que implica construcciones quiméricas. En una realización, la mutagénesis puede guiarse mediante la información conocida de la molécula de origen natural o la molécula de origen natural alterada o mutada, por ejemplo, secuencia, comparaciones de secuencia, propiedades físicas, estructura cristalina o similares.

Los textos anteriores y ejemplos encontrados en este documento describen estos procedimientos así como las siguientes publicaciones y referencias citadas en: Sieber, et al., Nature Biotechnology, 19:456-460 (2001); Ling et al., Approaches to DNA mutagenesis: an oveview, Anal Biochem. 254(2): 157-178 (1997); Dale et al., Oligonucleotidedirected random mutagenesis using the phosphorotioate method, Methods Mol. Biol. 57:369-374 (1996); I. A. Lorimer, I. Pastan, Nucleic Acids Res. 23, 3067-8 (1995); W. P. C. Stemmer, Nature 370, 389-91 (1994); Arnold, Protein engineering for unusual environments, Current Opinion in Biotechnology 4:450-455 (1993); Bass et al., Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities, Science 242:240-245 (1988); Fritz et al., Oligonucleotidedirected construction of mutations: a gapped duplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro, Nucl. Acids Res. 16: 6987-6999 (1988); Kramer et al., Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations, Nucl. Acids Res. 16: 7207 (1988); Sakamar y Khorana, Total synthesis and expression of a gene for the a-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein (transducin), Nucl. Acids Res. 14: 6361-6372 (1988); Sayers et al., Y-T Exonucleases in phosphorotioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucl. Acids Res. 16:791-802 (1988); Sayers et al., Strand specific cleavage of phosphorotioate-containing DNA by reaction with restriction endanucleases in the presence of ethidium bromide, (1988) Nucl. Acids Res. 16: 803-814; Carter, Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using M13 vectors, Methods in Enzymol. 154: 382-403 (1987); Kramer y Fritz Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA, Methods in Enzymol. 154:350-367 (1987); Kunkel, The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis, in Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein, F. y Lilley, D.M.J. eds., Springer Verlag, Berlín)) (1987); Kunkel et al., Rapid and deficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Methods in Enzymol. 154, 367-382 (1987); Zoller y Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis: a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA template, Methods in Enzymol. 154:329-350 (1987); Carter, Site-directed mutagenesis, Biochem. J. 237:1-7 (1986); Eghtedarzadeh y Henikoff, Use of oligonucleotides to generate large deletions, Nucl. Acids Res. 14: 5115 (1986); Mandecki, Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:7177-7181 (1986); Nakamaye y Eckstein, Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage by phosphorotioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucl. Acids Res. 14: 9679-9698 (1986); Wells et al., Inzportance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin, Phil. Trans. R. Soc. Lond. A 317: 415-423 (1986); Botstein y Shortle, Strategies and applications of in vitro mutagenesis, Science 229: 1193-1201(1985); Carter et al., Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors, Nucl. Acids Res. 13: 4431-4443 (1985); Grundström et al., Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale 'shot-gun' gene synthesis, Nucl. Acids Res. 13: 3305-3316 (1985); Kunkel, Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492 (1985); Smith, In vitro mutagenesis, Ann. Rev. Genet. 19:423-462(1985); Taylor et al., The use of phosphorotioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA, Nucl. Acids Res. 13: 8749-8764 (1985); Taylor et al., The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations at high frequency using phosphorotioate-modified DNA, Nucl. Acids Res. 13: 8765-8787 (1985); Wells et al., Cassette mutagenesis: an efficient, method for generation of multiple mutations at defined sites, Gene 34:315-323 (1985); Kramer et al., The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction, Nucl. Acids Res.

12: 9441-9456 (1984); Kramer et al., Point Mismatch Repair, Cell 38:879-887 (1984); Nambiar et al., Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein, Science 223: 1299-1301 (1984); Zoller y Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned in M13 vectors, Methods in Enzymol. 100:468-500 (1983); y Zoller y Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectors: an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment, Nucleic Acids Res. 10:6487-6500 (1982).

Pueden hallarse detalles adicionales sobre muchos de los métodos anteriores en Methods in Enzymology Volumen 154, que también describe controles útiles para resolver problemas con diversos métodos de mutagénesis.

Los oligonucleótidos, por ejemplo, para su uso en mutagénesis de la presente invención, por ejemplo, mutación de bibliotecas de sintetasas, o alteración de ARNt, se sintetizan normalmente de forma química de acuerdo con el método de fosforamidita triéster en fase sólida descrito por Beaucage y Caruthers, Tetrahedron Letts. 22(20):18591862, (1981) por ejemplo, usando un sintetizador automatizado, como se describe en Needham-VanDevanter et al., Nucleic Acids Res., 12:6159-6168 (1984).

Además, puede solicitarse esencialmente cualquier ácido nucleico personalizado o convencional de cualquiera de una diversidad de fuentes comerciales, tales como The Midland Certified Reagent Company ([email protected]), The Great American Gene Company (www.genco.com), ExpressGen Inc. (www.expressgen.com), Operon Technologies Inc. (Alameda, CA) y muchas otras.

La presente invención también se refiere a células hospedadoras y organismos para la incorporación in vivo de un aminoácido no natural mediante pares ortogonales de ARNt/RS. Las células hospedadoras se modifican por ingeniería genética (por ejemplo, se transforman, transducen o transfectan) con los vectores de esta invención, que pueden ser, por ejemplo, un vector de clonación o un vector de expresión. El vector puede estar, por ejemplo, en forma de un plásmido, una bacteria, un virus, un polinucleótido desnudo, o un polinucleótido conjugado. Los vectores se introducen en células y/o microorganismos por métodos convencionales incluyendo electroporación (From et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 5824 (1985), infección por vectores virales, penetración balística de alta velocidad mediante partículas pequeñas con el ácido nucleico dentro de la matriz de perlas o partículas pequeñas, o sobre la superficie (Klein et al., Nature 327, 70-73 (1987)). Berger, Sambrook, y Ausubel proporcionan una diversidad de métodos apropiados de transformación.

Las células hospedadoras modificadas por ingeniería pueden cultivarse en medios nutrientes convencionales modificados según lo apropiado para actividades tales como, por ejemplo, etapas de selección, activación de promotores o selección de transformantes. Estas células pueden cultivarse opcionalmente en organismos transgénicos.

Otras referencias útiles, por ejemplo para el aislamiento y cultivo de células (por ejemplo, para el posterior aislamiento del ácido nucleico) incluyen Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, tercera edición, Wiley-Liss, Nueva York y las referencias citadas en el mismo; Payne et al. (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. Nueva York, NY; Gamborg y Phillips (eds.) (1995) Plant Cell. Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg Nueva York) y Atlas y Parks (eds.) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, FL.

Están disponibles varios métodos bien conocidos para introducir ácidos nucleicos diana en células bacterianas, cualquiera de los cuales puede usarse en la presente invención. Éstos incluyen: fusión de las células receptoras con protoplastos bacterianos que contienen el ADN, electroporación, bombardeo con proyectiles, e infección con vectores virales, etc. Pueden usarse células bacterianas para amplificar la cantidad de plásmidos que contienen construcciones de ADN de esta invención. Las bacterias se cultivan hasta fase log y los plásmidos dentro de las bacterias pueden aislarse mediante una diversidad de métodos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook). Además, está disponible una multitud de kits en el mercado para la purificación de plásmidos desde bacterias (véase, por ejemplo, EasyPrep™, FlexiPrep™, ambos de Pharmacia Biotech; StrataClean™, de Stratagene; y, QIAprep™ de Qiagen). Los plásmidos aislados y purificados después se manipulan adicionalmente para producir otros plásmidos, se usan para transfectar células o se incorporan en vectores relacionados para infectar organismos. Los vectores típicos contienen terminadores de la transcripción y la traducción, secuencias de inicio de la transcripción y la traducción, y promotores útiles para la regulación de la expresión del ácido nucleico diana particular. Los vectores opcionalmente comprenden casetes genéricos de expresión que contienen al menos una secuencia terminadora independiente, secuencias que permiten la replicación del casete en eucariotas, o procariotas, o ambos (por ejemplo, vectores lanzadera) y marcadores de selección para sistemas tanto procariotas como eucariotas. Los vectores son adecuados para la replicación e integración en procariotas, eucariotas, o preferiblemente ambos. Véase, Giliman y Smith, Gene 8:81 (1979); Roberts, et al., Nature, 328:731 (1987); Schneider, B., et al., Protein Expr. Purif. 6435:10 (1995); Ausubel, Sambrook, Berger (todos supra). Se proporciona un catálogo de bacterias y bacteriófagos útil para clonación, por ejemplo, por la ATCC, por ejemplo, The ATCC Catalogue of Bacteria and Bacteriophage (1992) Gherna et al. (eds.) publicado por la ATCC. También se encuentran procedimientos básicos adicionales para secuenciación, clonación y otros aspectos de biología molecular y consideraciones teóricas subyacentes en Watson et al. (1992) Recombinant DNA Segunda Edición Scientific American Books, NY.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar; pero no limitar la invención reivindicada.

Ejemplo 1-Mejora de la ortogonalidad de un ARNt de Methanococcus jannaschii

A causa de la naturaleza compleja de las interacciones ARNt-sintetasa que son necesarias para conseguir un elevado grado de fidelidad en la traducción de proteínas, el diseño racional de pares ortogonales de ARNt-sintetasa 5 es difícil. Este ejemplo describe métodos que explota el mal reconocimiento cruzado de algunos pares interespecie de ARNt-sintetasa, acoplado con una posterior evolución in vivo del ARNt con ortogonalidad potenciada. Véase también, L. Wang y P. G. Schultz, Chem. Biol., 8:883 (2001). Específicamente, se generó una biblioteca de ARNt supresores ámbar derivados del ARNtTyr de Methanococcus jannaschii. Los ARNtTyrCUA que son sustratos de aminoacil-ARNt sintetasas endógenas de Escherichia coli se delecionaron de la reserva por selección negativa basada en la supresión de mutaciones sin sentido ámbar en el gen de la barnasa. Los restantes ARNtTyrCUA se seleccionaron entonces por su capacidad de suprimir codones sin sentido ámbar en el gen de la ∃-lactamasa en presencia de la tirosil-ARNt sintetasa (TyrRS) afín de Methanococcus jannaschii. Se seleccionaron cuatro ARNt supresores mutantes que eran peores sustratos para sintetasas de Escherichia coli que para ARNtTyrCUA de Methanococcus jannaschii, pero aún pueden cargarse de forma eficaz por TyrRS de Methanococcus jannaschii. El

15 ARNtTyrCUA supresor mutante junto con la TyrRS de Methanococcus jannaschii proporcionan un par ortogonal útil de ARNt-sintetasa para la incorporación in vivo de aminoácidos no naturales en proteínas.

El ARNtTyr de Methanococcus jannaschii, una arqueobacteria, tiene diferentes elementos de identidad a los de ARNtTyr de Escherichia coli. En particular, el ARNtTyr de Escherichia coli tiene un par G1C72 en el tronco aceptor mientras que el ARNtTyr de Methanococcus jannaschii tiene un par C1G72. Un ARNt supresor ámbar derivado del ARNtTyr de Methanococcus jannaschii demostró no aminoacilarse de forma eficaz por las sintetasas de Escherichia coli, pero funciona de forma eficaz en la traducción de proteínas en Escherichia coli. Véase, por ejemplo, L. Wang,

T.J. Magliery, D. R. Liu, P. G. Schultz, A new functional suppressor tRNA/aminoacyl-tRNA synthetase pair for the in vivo incorporation of unnatural amino acids in proteins, J. Am. Chem. Soc. 122:5010-5011 (2000). Además, la TyrRS

25 de Methanococcus jannaschii, que tiene solamente un dominio minimalista de unión al bucle anticodón, no aminoacila ARNt de Escherichia coli, pero aún aminoacila de forma eficaz su propio ARNtTyrCUA supresor. Véase, por ejemplo, B. A. Steer, P. Schimmel, Major anticodon-binding region missing from an archae-bacterial tRNA synthetase, J. Biol. Chem. 274 (1999) 35601-35606; y, Wang et al., (2000), supra.

Para ensayar la ortogonalidad de este ARNt supresor en Escherichia coli, se introdujo un codón ámbar en un sitio permisivo (Ala184) en el gen de la ∃-lactamasa. Véase, por ejemplo, D. R. Liu, P. G. Schultz, Progress toward the evolution of an organism with an expanded genetic code, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:4780-4785 (1999). Aquellos ARNt que pueden cargarse por sintetasas de Escherichia coli suprimirán el codón ámbar y permitirán que las células vivan en presencia de ampicilina. El ARNtTyrCUA de Methanococcus jannaschii suprime el codón ámbar en el gen

35 de la ∃-lactamasa con un valor CI50 de 56 %g/ml de ampicilina. Véase Wang et al., (2000), supra. En contraste, el ARNtGlnCUA ortogonal derivado del ARNtGln2 de Saccharomyces cerevisiae tiene una CI50 de 21 %g/ml de ampicilina cuando se ensaya en el mismo ensayo. Véase Liu y Schultz, (1999), supra. La CI50 para Escherichia coli en ausencia de cualquier ARNt supresor es de 10 %g/ml de ampicilina. Este resultado demuestra que el ARNtTyrCUA de Methanococcus jannaschii es un mejor sustrato para sintetasas de Escherichia coli que el ARNtGlnCUA. Por consiguiente, si el ARNtTyrCUA de Methanococcus jannaschii se usa in vivo para suministrar aminoácidos no naturales a proteínas en Escherichia coli, también puede cargarse mal con aminoácidos natural por sintetasas de Escherichia coli, conduciendo a una incorporación heterogénea de aminoácidos.

La mejora de la ortogonalidad del ARNtTyrCUA de Methanococcus jannaschii se consiguió mediante la introducción

45 de 'determinantes de reconocimiento negativo' para evitar el reconocimiento por sintetasas endógenas de Escherichia coli. Estas mutaciones deberían interferir fuertemente en la interacción del ARNt con su TyrRS afín de Methanococcus jannaschii o el ribosoma. Como la TyrRS de Methanococcus jannaschii carece de la mayor parte del dominio de unión al anticodón, véase por ejemplo, B. A. Steer, P. Schimmel, Major anticodon-binding region missing from an archaebacterial tRNS synthetase, J. Biol. Chem. 274:35601-35606 (1999), se espera que mutaciones introducidas en el bucle anticodón del ARNt tenga un efecto mínimo sobre el reconocimiento de la TyrRS. Se construyó una biblioteca de bucles anticodón con cuatro nucleótidos aleatorizados. Véase la Figura 9. Dadas las diversas combinaciones y localizaciones de elementos de identidad para diversos ARNt de Escherichia coli, mutaciones en posiciones adicionales pueden aumentar la probabilidad de hallar un ARNt mutante con las propiedades deseadas. Por tanto, también se construyó una segunda biblioteca que contenía mutaciones en

55 posiciones no conservadas en todos los bucles del ARNt (biblioteca de todos los bucles). Véase la Figura 9. Los nucleótidos conservados no se aleatorizaron para mantener las interacciones terciarias que estabilizan la estructura con forma en 'L' del ARNt. Véase, por ejemplo, G. Dirheimer, G. Keith, P. Dumas, E. Westhof, Primary, secondary, and tertiary structures of tRNA, en: D. Soll, U. L. RajBhandary (eds.), tRNA Structure, Biosynthesis, and Function, ASM Press, Washington, DC, 1995, pág. 93-126; y, R. Giege, M. Sissler, C. Florentz, Universal rules and idiosyncratic features in tRNA identity, Nucleic Acids Res. 26:5017-5035 (1998). Los nucleótidos del tronco tampoco se mutaron ya que la sustitución de uno de estos nucleótidos requiere una mutación compensatoria. Se aleatorizaron los 11 nucleótidos (C16, C17, U17a, U20, C32, G37, A38, U45, U47, A59, y U60). Véase la Figura 9. El tamaño teórico de esta biblioteca es de aproximadamente 4,19X106, y se construyó una biblioteca con un tamaño de aproximadamente 1,93X108 unidades formadoras de colonias para asegurar la cobertura completa de la

65 biblioteca mutante.

Los métodos usaron una cepa de Escherichia coli, por ejemplo, DH10B, que se obtuvo de Gibco/BRL. Los plásmidos de expresión del ARNt supresor se obtuvieron de una plásmido, por ejemplo, pAC123. Véase, por ejemplo, D. R. Liu,

T. J. Magliery, M. Pastrnak, P. G. Schultz, Engineering a tRNA and aminoacyl-tRNA synthetase for the site-specific incorporation of unnatural amino acids in proteins in vivo, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:10091-10097 (1997). Los

5 plásmidos para selecciones negativas se obtuvieron de plásmidos, por ejemplo, pBATS, pYsupA38B2 y pYsupA38B3 como se describe a continuación. Véase, por ejemplo, K. Gabriel, W.H. McClain, A set of plasmids constitutively producing different RNA levels in Escherichia coli, J. Mol. Biol. 290 (1999) 385-389; y, Liu y Shultz, (1999), supra.

Para seleccionar un miembro de la biblioteca de ARNt de Methanococcus jannaschii con ortogonalidad potenciada, se usó una combinación de selecciones negativas y positivas en ausencia y presencia de la sintetasa afín. Véase la Figura 8. En la selección negativa, se introduce uno o más codones selectores, por ejemplo, sin sentido ámbar, en un gen marcador negativo, por ejemplo, un gen tóxico, en por ejemplo, una posición no esencial. Cuando un miembro de la biblioteca de ARNt supresores mutados, por ejemplo, se aminoacila por sintetasas endógenas (por

15 ejemplo, Escherichia coli) (es decir no es ortogonal a las sintetasas de Escherichia coli), el codón selector se suprime y el producto génico tóxico producido conduce a muerte celular. Solamente las células que albergan ARNt ortogonales o ARNt no funcionales pueden sobrevivir. Todos los supervivientes se someten entonces a una selección positiva en que se coloca un codón selector, por ejemplo, un codón ámbar, en un marcador de selección positiva, por ejemplo, gen de resistencia a fármaco en, por ejemplo, una posición no esencial. Los ARNt después se seleccionan por su capacidad de aminoacilarse por la sintetasa afín coexpresada y de insertar un aminoácido en respuesta a este codón ámbar. Las células que albergan ARNt no funcionales, o ARNt que no pueden reconocerse por la sintetasa de interés, serán sensibles a antibiótico. Por lo tanto, solamente los ARNt que (1) no son sustratos para sintetasas endógenas de Escherichia coli; (2) pueden aminoacilarse por la sintetasa de interés; (3) son funcionales en traducción sobrevivirán a ambas selecciones.

25 Se eligió una selección negativa que aprovecha la toxicidad de la barnasa cuando se produce en Escherichia coli en ausencia de su inhibidor natural barstar. Véase, por ejemplo, R.W. Hartley, Barnase and barstar. Expression of its cloned inhibitor permits expression of a cloned ribonuclease, J. Mol. Biol. 202:913-915 (1988). Se introdujeron codones ámbar en posiciones no esenciales en el gen de la barnasa basándose en el análisis de la estructura tridimensional de la barnasa. Véase, por ejemplo, Liu y Schultz, (1999), supra. A causa de la extrema autotoxicidad de la barnasa, se colocó un origen pSC101 de bajo número de copias en el plásmido que expresa la barnasa. Además, se ensayaron diferentes cantidades de codones ámbar para modular la rigurosidad de la selección. Se usó el plásmido pSCB2 para expresar una barnasa mutante con dos codones de parada ámbar en Gln2 y Asp44; el plásmido pSCB3 contenía un codón de parada ámbar adicional en Gly65.

35 Para la selección negativa, se generó un fragmento de PCR que contenía el gen de la ∃-lactamasa y el origen pSC101 a partir de pBATS usando los siguientes oligonucleótidos: LW115, 5'-ATGCATGCTGCATTAATGAATCGGCCAACG-3'; LW116, 5'-TCCCCGCGGAGGTGGCACTTTTCGGGG-3'. El ADN que codifica la barnasa que contiene dos (restos Gln2 y Asp44) o tres (restos Gln2, Asp44 y Gly65) codones ámbar se obtuvo de pYsupA38B2 y pYsupA38B3, respectivamente, por digestión con SacII y SphI. El ligamiento de los fragmentos anteriores produjo los plásmidos pSCB2 y pSCB3. La expresión de la barnasa estaba bajo inducción por arabinosa. Se construyeron genes que codifican diferentes ARNt supresores para expresión in vivo a partir de dos oligonucleótidos sintéticos solapantes (Operon, Alameda, CA, EEUU) mediante extensión con Klenow y se insertaron entre los sitios EcoRI y PstI de pAC123 para generar pAC-YYGI y pAC-JY, respectivamente, colocando la

45 transcripción bajo el control del promotor lpp y el terminador rmC. pAC-Cm es el plásmido de control sin ningún ARNt. Para optimizar las condiciones de selección negativa, se transformaron células DH10B competentes que albergaban pSCB2 o pSCB3 por electroporación con pAC-Cm, pAC-YYG1, y pAC-JY, por separado. Se picaron

colonias individuales y se cultivaron en 2xYT con cloranfenicol (Cm, 34 %g/ml) y ampicilina (Amp, 100 %g/ml). Los cultivos celulares cultivados durante una noche se lavaron dos veces con medio mínimo que contenía glicerol al 1 % y leucina 0,3 mM (GMML), y se resuspendieron en GMML con Cm y Amp hasta una DO600 de 0,1. Después de recuperación a 30 ºC durante 10 min., en un cultivo (serie 1) se añadió 20 mM de arabinosa para inducir la expresión de barnasa; no se añadió arabinosa al segundo cultivo (serie 2). En diferentes momentos puntuales, se diluyó una pequeña cantidad de cultivo celular y se sembró en agar 2xYT con Cm y Amp para medir la densidad celular. Para selecciones negativas de las bibliotecas de ARNt supresores, los plásmidos pAC que contenía la biblioteca se

55 introdujeron por transformación en células DH10B que albergaban pSCB2. Las células se inactivaron mediante la adición de medio SOC y se recuperaron a 30 ºC durante 1 hora, después se lavaron con tampón fosfato y GMML, y se cultivaron en 11 GMML. Después de recuperación a 30 ºC durante 30 min., se añadieron Cm, Amp, y arabinosa 20 mM. Después de 36 horas, las células se sedimentaron y se aislaron los plásmidos pAC y se purificaron por electroforesis en gel de agarosa.

Para optimizar las condiciones de selección, se usaron dos ARNt supresores que se sabe que se reconocen mal por las sintetasas de Escherichia coli. Un ARNtTyr supresor mutante derivado de Saccharomyces cerevisiae (sc-ARNtTyrCUA, expresado en pAC-YYG1) suprime el codón ámbar (Ala184TAG) en el gen de la ∃-lactamasa, produciendo un valor de CI50 de 12 %g/ml de ampicilina para células de Escherichia coli; y el ARNtTyr supresor

65 derivado de Methanococcus jannaschii (mj-ARNtTyrCUA, expresado en pAC-JY) produce una CI50 de 56 %g/ml de

ampicilina para células hospedadoras. Véase, por ejemplo, Wang et al., (2000), supra. En comparación, el ARNtGlnCUA supresor derivado del ARNtGln2 de Saccharomyces cerevisiae tiene una CI50 de 21 %g/ml de ampicilina cuando se ensaya en el mismo ensayo, y se ha demostrado que es ortogonal a las sintetasas de Escherichia coli in vitro e in vivo. Véase, por ejemplo, Liu y Schultz, (1999), supra. Por lo tanto, una selección negativa que elimina células que expresan mj-ARNtTyrCUA, pero permite el crecimiento de células que expresan sc-ARNtTyrCUA elimina ARNt supresores no ortogonales. Las células se cultivan en medio mínimo líquido que contiene glicerol al 1 % y leucina 0,3 mM (GMML) con antibióticos apropiados para mantener el plásmido pSCB2 y el plásmido pAC. Se añadió arabinosa a una serie de células (serie 1) para inducir la expresión de la barnasa, mientras que en la serie 2 no se añadió arabinosa. La fracción de células que sobrevivió a la selección se determinó mediante la proporción de densidades celulares en la serie 1 relativas a la serie 2. Véase la Figura 11: las células que albergaban el plásmido de control pAC-Cm (sin ARNt supresor) y el plásmido pAC-YYG1 sobrevivieron, mientras que las células que albergaban el plásmido pAC-JY en gran parte murieron. Cuando se usó el plásmido pSCB3, las células que albergaban el plásmido pAC-JY comenzaron a crecer en 24 horas. Por lo tanto, la selección negativa se realizó usando pSCB2, que codifica el gen de la barnasa que contiene dos codones ámbar en las condiciones anteriores para la selección de la biblioteca.

Para la selección positiva, se construyó un plásmido, por ejemplo, pBLAM-JYRS insertando el gen de TyrRS de Methanococcus jannaschii de pBSA50 entre los sitios NdeI y PstI de pBLAM-YQRS usando los oligonucleótidos LW104, 5'-GGAATTCCATTAGGACGAATTTGAAATG-3'; y LW105, 5'-AAACTGCAGTTATAATCTCTTTCTAATTGGCTC-3'. Véase, por ejemplo, Steer, et al., (1999), supra; y, Liu y Schultz, (1999), supra. Para optimizar las condiciones de selección positiva, se transformaron células DH10B competentes que albergaban pBLAM-JYRS con pAC-Cm, pAC-YYG1, y pAC-JY, por separado. Se picaron colonias individuales y se cultivaron en 2xYT con Cm y tetraciclina (Tet, 40 %g/ml). En selecciones en líquido, se diluyeron cultivos celulares de una noche en 2xYT con Cm y Tet a una DD600 inicial de 0,1. Se añadieron diversas concentraciones de Amp, y se controló el crecimiento celular por DO600. En selecciones en placa, se sembraron aproximadamente 103 a 105 células en dos series de placas de agar 2xYT que contenían Cm y Tet, una serie de las cuales contenía 500 %g/ml de Amp. Para selecciones que implicaban la biblioteca de ARNt mutantes, se introdujeron por transformación los plásmidos pAC aislados de las células de la selección negativa en células DH10B competentes que albergaban pBLAM-JYRS. Las células se recuperaron a 37 ºC durante 45 minutos, y se sembraron aproximadamente 105 en cada placa de agar 2xYT que contenía Cm, Tet y 500 %g/ml de Amp. Después de 24 horas, se picaron colonias y se volvieron a cultivar en 6 ml de 2xYT que contenía Cm, Tet y 200 %g/ml de Amp. Se aisló el ADN y se purificó el plásmido pAC por electroforesis en gel de agarosa.

La selección positiva se basa en la supresión de un codón de parada ámbar introducido en la posición Ala184 en el gen de la ∃-lactamasa TEM-1. El plásmido pBLAM-JYRS codifica el gen de la tirosil-ARNt sintetasa de Methanococcus jannaschii y una ∃-lactamasa con una mutación ámbar en Ala184. Los plásmidos pAC aislados de células que sobrevivieron a la selección negativa se introdujeron por cotransformación con pBLAM-JYRS en células de Escherichia coli DH10B. Las células que albergan ARNt no funcionales o ARNt que son malos sustratos para la sintetasa de Methanococcus jannaschii mueren; aquellas con ARNt que pueden cargarse por la sintetasa sobreviven. Para ensayar la viabilidad de la selección positiva, se ensayaron dos ARNt supresores modelo en presencia de TyrRS de Methanococcus jannaschii. El sc-ARNtTyrCUA tiene un par de bases G1:C72 y no se carga de forma eficaz por TyrRS de Methanococcus jannaschii. Cuando se coexpresan en células con el mutante de la ∃lactamasa Ala184ámbar, las células sobrevivían hasta una CI50 de 18 %g/ml de ampicilina. En contraste, las células que contenían el ARNtTyrCUA de Methanococcus jannaschii y la TyrRS afín sobreviven hasta una CI50 de 1220 %g/ml de ampicilina. Véase, por ejemplo, Wang, et al., (2000), supra. El modelo de selección positiva se intentó primero en medio líquido 2xYT. Se muestra el crecimiento de células que albergan pBLAM-JYRS y diferentes plásmidos pAC en medio líquido 2xYT con diversas concentraciones de ampicilina en la Figura 12, Panel A. Las células transformadas con el mj-ARNtTyrCUA crecían a una velocidad más rápida y a concentraciones mayores de ampicilina. Si las células se cultivaban durante más de 24 horas, las células transformadas con pAC-Cm o pAC-YYG1 también crecían hasta saturación. Por lo tanto, la selección positiva se realizó en placas con densidades celulares iniciales entre 103 y 105 por placa. Véase la Figura 12, Panel B. La proporción de supervivencia (cantidad de colonias en placas con ampicilina relativa a placas sin ampicilina) no cambiaba significativamente con diferentes densidades celulares iniciales, y era estable durante el tiempo de crecimiento. La selección positiva en placas de ampicilina provocó un crecimiento preferencial de células con mj-ARNtTyrCUA expresado. Por lo tanto, para la selección de bibliotecas, la selección positiva se realizó en placas en lugar de en medio líquido.

La biblioteca de ARNt mutantes se generó usando las secuencias de los dos oligonucleótidos solapantes usados para construir la biblioteca de bucles anticodón (la secuencia del ARNt subrayada): LW125, 5'-GGAATTC-3'; LW126, 5'-AAAACTGCAG-3' (donde N es equimolar de A, C, T o G). Las secuencias de los oligonucleótidos para la biblioteca de todos los bucles son: LW145, 5'-GGAATTC-3' y LW146, 5'-AAAACTGCAG-3'. Estos genes se insertaron en pAC123 de forma similar a como se ha descrito anteriormente para producir las bibliotecas de ARNt.

Las selecciones negativa y positiva se realizaron en tándem como se ha descrito anteriormente sobre ambas bibliotecas de bucle anticodón y de todos los bucles. Los ARNt supresores seleccionados se aislaron y volvieron a introducir por transformación en Escherichia coli DH10B que albergaba pBLAM para ensayar la ortogonalidad del ARNt a las sintetasas de Escherichia coli. Los ARNt después se volvieron a introducir por transformación en Escherichia coli que albergaba pBLAM-JYRS para ensayar con cuánta eficacia se cargaba el ARNt por TyrRS de Methanococcus jannaschii. La secuenciación de los clones resultantes de una ronda de selección negativa y positiva de la biblioteca del bucle anticodón reveló que se aislaron tres ARNt independientes. Véase la Figura 13. Cuando se

5 introducían por contransformación con pBLAM, todos tenían valores de CI50 inferiores al ARNtTyrCUA precursor de Methanococcus jannaschii, lo que indica que son sustratos peores para las sintetasas de Escherichia coli.

El mutante AA2 también tenía afinidad muy elevada por TyrRS de Methanococcus jannaschii. Aunque este ARNt mutante podía mantenerse de forma estable en Escherichia coli, ralentizó la velocidad de crecimiento de las células por razones desconocidas. Este efecto probablemente condujo a la aparición de los mutantes AA3 y AA4, que tenían ambos una mutación fuera de la región de aleatorización. Las células que albergaban AA3 o AA4 crecían normalmente. No obstante, AA3 y AA4 eran sustratos relativamente malos para la TyrRS de Methanococcus jannaschii.

15 Se seleccionaron cuatro ARNt independientes de dos rondas de selecciones negativas y positivas usando la biblioteca de todos los bucles. Véase la Figura 13. Todos eran sustratos peores para la sintetasa de Escherichia coli que el ARNtTyrCUA precursor de Methanococcus jannaschii, aunque aún se cargaban de forma eficaz por la TyrRS de Methanococcus jannaschii como se muestra por el ensayo de ∃-lactamasa in vivo. Véase la Tabla 2. El valor de CI50 para las células que expresaban el mejor mutante, J17, fue de 12 %g/ml de ampicilina, que es incluso inferior que el de las células con el ARNtGlnCUA ortogonal derivado de Saccharomyces cerevisiae expresado (21 %g/ml de ampicilina). Cuando J17 se coexpresaba con la TyrRS de Methanococcus jannaschii, las células sobrevivían hasta un valor de CI50 de 436 %g/ml de ampicilina, proporcionando una ventana de selección (proporción del valor de CI50

con TyrRS al valor de CI50 sin TyrRS) de factor 35. Además, la expresión de todos estos ARNt mutantes no afectó al crecimiento de las células de Escherichia coli. 25 Tabla 2. Ensayo de ∃-lactamasa in vivo de ARNt supresores seleccionados ARNt supresor CI50 (%g/ml de ampicilina)

Coexpresado con pBLAM Coexpresado con pBLAM-JYRS mj-ARNtTyrCUA 56 1220 Sin ARNtTyrCUA 10 10 ARNt mutantes seleccionados de la biblioteca de bucles anticodón AA2 22 1420 AA3 10 110 AA4 12 135

35 ARNt mutantes seleccionados de la biblioteca de todos los bucles

ARNt mutantes que sobreviven a ambas selecciones

J15 30 845 J17 12 436 J18 20 632 J22 14 459

ARNt mutantes que sobreviven a la selección negativa solamente

N11 11 16 N129 18 N13 10 12

45N16 9 9

Se usó el plásmido pBLAM para expresar el gen de la ∃-lactamasa con un codón ámbar en Ala184; el plásmido pBLAM-JYRS expresaba el mutante ámbar y la TyrRS de Methanococcus jannaschii. Los ARNt supresores se codificaron en el plásmido pAC y se introdujeron por cotransformación con pBLAM o pBLAM-JYRS en el ensayo.

Para confirmar las propiedades de los ARNt supresores seleccionados, se ensayaron en otro ensayo in vivo basado en la supresión de un codón ámbar en el gen de la cloranfenicol acetiltransferasa (CAT). En contraste con la ∃lactamasa que se secreta en el periplasma, la CAT se localiza en el citoplasma. Además, la ampicilina es bactericida mientras que el cloranfenicol es bacteriostático. Como se muestra en la siguiente Tabla 3, los ARNt supresores 55 seleccionados también eran ortogonales en el ensayo de CAT, lo que indica su idoneidad para selecciones con CAT.

Tabla 3. Ensato de cloranfenicol acetiltransferasa in vivo de ARNt supresores seleccionados ARNt supresor CI50 (%g/ml de cloranfenicol)

pYC solamente pYC+pBK-JYRS mj-ARNtTyrCUA 27 308 Sin ARNtTyrCUA 3 3 J15 11 297 J17 4 240 J18 6 284

65J22 5 271 Los plásmidos pYC codificaban el gen de la cloranfenicol acetiltransferasa con un codón ámbar en Asp112 y diferentes ARNt supresores enumerados en la columna de la izquierda de la tabla. Se usó pBK-JYRS para expresar la TyrRS de Methanococcus jannaschii.

5 El ensayo de complementación in vivo que se basa en la supresión de un codón ámbar en el gen de la ∃-lactamasa se realizó como se ha descrito. Véase, por ejemplo, Liu y Schultz, (1999), supra; y, Wang, et al., (2000), supra. En el ensayo de cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), se sustituyó un codón ámbar en Asp112 en el gen CAT de pACYC184 para producir pACMD112TAG. Véase, por ejemplo, M. Pastrnak, T.J. Magliery, P. G. Schultz, A new orthogonal suppressor tRNA aminoacyl-tRNA synthetase pair for evolving an organisms with an expanded genetic code, Helv. Chim. Acta 83:2277-2286 (2000). Los genes que codifican los ARNt supresores bajo el control del promotor lpp y el terminador rrnC se escindieron de los plásmidos pAC con NcoI y AvaI, y se insertaron en el pACMD112TAG pre-digerido para producir los plásmidos pYC-JY, pYC-J15, pYC-J17, pYC-J18, y pYC-J22, respectivamente. El plásmido pBK-JYRS, un derivado de pBR322, se usó para expresar la TyrRS de Methanococcus jannaschii bajo el control del promotor y terminador de GlnRS de Escherichia coli. La supervivencia

15 de las células de Escherichia coli DH10B transformadas con el plásmido pYC solamente o cotransformadas con pYC y pBK-JYRS se tituló frente a un amplio intervalo de concentraciones de cloranfenicol añadidas al medio de cultivo, y los valores de CI50 se interpolaron de las curvas.

Por comparación, se picaron aleatoriamente cuatro colonias que pasaron la selección negativa solamente, y se ensayaron los ARNt usando el ensayo de complementación in vivo. Todos ellos tenían valores de CI50 muy bajos cuando se transformaban con pBLAM, lo que indica que la selección negativa funcionaba bien. Véase la Tabla 2. Los valores de CI50 también eran bajos cuando se cotransformaban con pBLAM-JYRS, revelando que la selección positiva funciona eliminando los ARNt que no pueden cargarse por la TyrRS de Methanococcus jannaschii.

25 El análisis de las secuencias de ADN de los ARNt seleccionados produjo un patrón característico de sustituciones de nucleótidos. Véase la Figura 13. Los ARNt que pasaban tanto la selección negativa como la positiva tenían todos C32 y T60 inalterados, mientras que G37 estaba mutado en A, y T17a estaba mutado en A o G. Algunos cambios semi-conservados incluían la mutación de A38 en C o A; la mutación de T45 en T o A; la mutación de T47 en G o T. Otras mutaciones no tenían un patrón común obvio. También se secuenciaron veinte (20) ARNt que pasaron la selección negativa solamente, cuatro de los cuales se muestran en la Figura 13, y se descubrió que todos carecían de al menos una de las mutaciones comunes enumeradas anteriormente.

Los nucleótidos preferidos en los ARNt supresores mutantes seleccionados pueden desempeñar las siguientes tareas: (i) pueden funcionar como determinantes negativos para el reconocimiento por las sintetasas de Escherichia 35 coli; (ii) pueden ser elementos de identidad para la aminoacilación por TyrRS de Methanococcus jannaschii; o (iii) también pueden optimizar la interacción del ARNt con la maquinaria de traducción de Escherichia coli para aumentar la eficacia de supresión del ARNt. Es digno de mención que la mutación G37A se encontró en los ARNt seleccionados tanto de la biblioteca de bucles anticodón como de la de todos los bucles. Esta mutación es coherente con estudios previos que demostraron que adenina en la posición 37 potencia la eficacia de supresión ámbar. Véase, por ejemplo, M. Yarus, Translational efficiency of transfer RNA's: Use of an expanded anticodon, Science 218:646-652 (1982); D. Bradley, J.V. Park, L. Soll, tRNA2Gln Su+2 mutants that increase amber suppression, J. Bacteriol. 145:704-712 (1981); y, L. G. Kleina, J. Masson, J. Normanly, J. Abelson, J.H. Miller, Construction of Escherichia coli ARNt supresor amber genes. II. Synthesis of additional tRNA genes and improvement of suppressor efficiency, J. Mol. Biol. 213:705-717 (1990). Fechter et al. informaron recientemente de que la identidad completa 45 establecida para el ARNtTyr de Methanococcus jannaschii es de seis nucleótidos (C1G72, A73, y el anticodón G34U35A36). Véase, P. Fechter, J. Rudinger-Thirion, M. Tukalo, R. Giegé, Major tyrosine identity determinants in Methanococcus jannaschii and Saccharomyces cerevisiae tRNATyr are conserved but expressed differently, Eur. J. Biochem. 268:761-767 (2001). La presencia de C32 y T60 en todos los supresores mutantes seleccionados, por lo tanto, no es necesaria para el reconocimiento por TyrRS de Methanococcus jannaschii. Todos los ARNt de Escherichia coli tienen T en la posición 60 excepto cuatro ARNt que tienen C. Véase, M. Sprinzl, C. Horn, M. Brown,

A. Loudovitch, S. Steinberg, Compilation of tRNA sequences and sequences of tRNA genes, Nucleic Acids Res. 26:148-153 (1998). Basándose en la estructura cristalina del ARNtPhe de levadura, el nucleótido 60 no interacciona con otros nucleótidos. Véase J. L. Sussman, S. R. Holbrook, R. W. Warrant, G. M. Church, S.H. Kim, Crystal structure of yeast phenylalanine transfer RNA.1. Crystallographic refinement, J. Mol. Biol. 123:607-630 (1978). Por

55 tanto, T60 puede mantener la forma de bucle TC para la interacción productiva con la maquinaria de traducción de Escherichia coli. El cambio de la estructura del bucle TC puede afectar a la fidelidad de traducción, ya que la inserción de un nucleótido entre T60 y el C61 conservado posibilita que un ARNt de glicina cambie la fase de lectura. Véase, D. J. O'Mahony, B.H. Hims, S. Thompson, E.J. Murgola, J.F. Atkins, Glycine tRNA mutants with normal anticodon loop size cause 1 frameshifting, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:7979-7983 (1989). El papel de C32 no es obvio -la posición 32 en el ARNt de Escherichia coli incluye T, C, y A, y dos ARNtTyr de Escherichia coli tienen C32. En cuanto a la posición 17a, solamente ARNtThr tiene una A en esta posición.

Todos los ARNt supresores seleccionados son peores sustratos para las sintetasas de Escherichia coli con relación al ARNtTyrCUA de Methanococcus jannaschii, lo que provoca una menor carga errónea cuando se introduce en 65 Escherichia coli. Estos ARNt también pueden mantenerse de forma estable en Escherichia coli sin efectos adversos sobre el crecimiento de células hospedadoras. Además, aún pueden cargarse de forma eficaz por la TyrRS de

Methanococcus jannaschii. Todas estas propiedades hacen del ARNt supresor mutante junto con la TyrRS de Methanococcus jannaschii un par ortogonal robusto de ARNt-sintetasa para la incorporación selectiva de aminoácidos no naturales en proteínas in vivo. El ARNt supresor mutante J17 y una TyrRS mutante diseñada por ingeniería se han usado para suministrar O-metil-L-tirosina en respuesta a un codón TAG con una fidelidad que

5 rivaliza con la de los 20 aminoácidos comunes. Véase, L. Wang, A. Brock, B. Herberich, P. G. Schultz, Expanding the genetic code of Escherichia coli, Science, 292:498-500 (2001).

Ejemplo 2-Mutación de TyrRS de modo que cargue el muARNt Tyr/CUA con un aminoácido no natural, Ometil-L-tirosina

Se ha generado un par único de ARN de transferencia (ARNt)-aminoacil ARNt sintetasa que expande la cantidad de aminoácidos codificados genéticamente en Escherichia coli. Cuando se introduce en Escherichia coli, este par conduce a la incorporación in vivo del aminoácido sintético O-metil-L-tirosina, añadido de forma exógena al medio de cultivo, en la proteína en respuesta a un codón sin sentido ámbar. La fidelidad de traducción es mayor del 99 %,

15 determinada por análisis de dihidrofolato reductasa que contiene el aminoácido no natural. Este enfoque proporciona un método general para aumentar el repertorio genético de células vivas para que incluyan una diversidad de aminoácidos con nuevas propiedades estructurales, químicas y físicas no halladas en los veinte aminoácidos comunes.

Puede generarse un par ortogonal de ARNt/sintetasa en Escherichia coli importando un par de un organismo diferente, si la aminoacilación de especie cruzada es ineficaz y, opcionalmente, el bucle anticodón no es un determinante clave del reconocimiento de la sintetasa. Uno de estos pares candidatos es el par de tirosil ARNt/sintetasa de Methanococcus jannaschii (Methanococcus jannaschii), una arqueobacteria cuyos elementos de identidad de ARNtTyr difieren de aquellos de ARNtTyr de Escherichia coli (en particular, el primer par de bases del

25 tronco aceptor es GC en Escherichia coli y CG en Methanococcus jannaschii), y cuya tirosil sintetasa (TyrRS) tiene un dominio de unión al bucle anticodón minimalista. Véase, por ejemplo, B. A. Steer, y P. Schimmel, J. Biol. Chem. 274:35601-6 (1999). Además, la TyrRS de Methanococcus jannaschii no tiene un mecanismo de edición, Véase, por ejemplo, Jakubowski y Goldman, Microbiol. Rev., 56:412 (1992), y por lo tanto no debe corregir un aminoácido no natural ligado al ARNt. La TyrRS de Methanococcus jannaschii aminoacila de forma eficaz un ARNt supresor ámbar derivado de su ARNtTyr afín, véase, por ejemplo, Wang, et al., (2000 J. Am. Chem. Soc., supra., pero no aminoacila el ARNt de Escherichia coli, véase, por ejemplo, Steer y Schimmel, (1999), supra. Además, el ARNtTyrCUA de Methanococcus jannaschii es un mal sustrato para las sintetasas de Escherichia coli pero funciona de forma eficaz en la traducción de proteínas en Escherichia coli. Véase, por ejemplo, Wang, et al., (2000 J. Am. Chem. Soc., supra.)

35 Para reducir adicionalmente el reconocimiento del ARNt ortogonal, el ARNtTyrCUA de Methanococcus jannaschii, por las sintetasas de Escherichia coli, se mutaron aleatoriamente once nucleótidos del ARNt que no interaccionan directamente con la TyrRS de Methanococcus jannaschii (C16, C17, U17a, U20, C32, G37, A38, U45, U47, A59 y U60) para generar una biblioteca de ARNt supresores. Esta biblioteca de ARNt se pasó a través de una selección negativa (por ejemplo, supresión de mutaciones ámbar en un gen indicador tóxico, por ejemplo, el gen de la barnasa), que elimina los ARNt que se aminoacilan por las sintetasas de Escherichia coli, y después una selección positiva para los ARNt que se aminoacilan de forma eficaz por TyrRS de Methanococcus jannaschii (por ejemplo, la supresión de mutaciones ámbar en un gen indicador, por ejemplo, el gen de la ∃-lactamasa).

45 La naturaleza ortogonal del ARNt supresor resultante se ensayó mediante un ensayo de complementación in vivo, que se basa en la supresión de un codón de parada ámbar en una posición no esencial (por ejemplo, Ala184) de un gen indicador en un vector, por ejemplo, el gen de la ∃-lactamasa TEM-1 portado en el plásmido pBLAM. La aminoacilación de un ARNt supresor transformado por cualquier sintetasa endógena de Escherichia coli provoca el crecimiento celular en presencia de ampicilina. Escherichia coli transformada con el ARNtTyrCUA de Methanococcus jannaschii y la construcción indicadora, pBLAM, sobrevive en 55 %g/ml de ampicilina. Cuando se expresaba el mejor ARNt supresor mutante (mARNtTyrCUA) seleccionado de la biblioteca, las células sobrevivían en solamente 12 %g/ml de ampicilina; se obtienen valores similares en ausencia de cualquier ARNt supresor. El ARNt supresor mutante contenía las siguientes sustituciones de nucleótidos: C17A, U17aG, U20C, G37A, y U47G. Cuando la TyrRS de Methanococcus jannaschii se coexpresa con este mARNtTyrCUA, las células sobreviven en 440 %g/ml de ampicilina.

55 Por tanto, el mARNtTyrCUA es un peor sustrato para las sintetasas endógenas que el ARNtTyrCUA de Methanococcus jannaschii pero aún se aminoacila de forma eficaz por la TyrRS de Methanococcus jannaschii.

Para alterar la especificidad de aminoácido de la TyrRS ortogonal de modo que cargue el ARNtTyrCUA con un aminoácido no natural deseado, se generó una biblioteca de TyrRS mutantes y se exploró. Basándose en la estructura cristalina de la TyrRS homóloga de Bacillus stearothermophilus, véase, por ejemplo, P. Brick, T. N. Bhat,

D. M. Blow, J. Mol. Biol., 208:83 (1988), se mutaron cinco restos (Tyr32, Glu107, Asp158, Ile159 y Leu162) en el sitio activo de TyrRS de Methanococcus jannaschii que están dentro de los 6,5 Å de la posición para del anillo arilo de la tirosina unida. Véase, la Figura 14. Estos restos se mutaron todos inicialmente en alanina, y se usó la Ala5 TyrRS inactiva resultante como molde para mutagénesis aleatoria por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con

65 oligonucleótidos dopados.

Por ejemplo, se expresó el gen de la TyrRS bajo el control del promotor y el terminador de GlnRS de Escherichia coli en el plásmido pBK-JYRS, un plásmido derivado de pBR322 con resistencia a kanamicina. Se sustituyeron los restos Tyr32, Glu107, Asp158, Ile159 y Leu162 con Ala por mutagénesis dirigida al sitio para proporcionar el plásmido pBK-JYA5. Se usaron ocho (8) oligonucleótidos con NNK (N=A + T + G + C y K= G + T, y M= C + A), por ejemplo, los oligonucleótidos

LW157 5' -GGAATTCCATATGGACGAATTTGAAATG-3', LW164 5'-GTATTTTACCACTTGGTTCAAAACCTATMN NAGCAGATTTTTCATCTTTTTTTCATCTTTTTTTAAAAC-3', LW159 5' -TAGGTTTTGAACCAAGTGGTAAAATAC-3', LW165 5'-CATTCAGTGTATAATCCTTATCAAGCTGGAAMNNACTTCCATAAACATATTTTGCCTTTAAC-3', LW161 5' -TCCAGCTTGATAAGGATTATACACTGAATG-3', LW167 5' -CATCCCTCCAACTGCAACATCAACGCCMNNA TAATGMNNMNNATTAACCTGCATTATTGGATAGATAAC-3', LW163 5'-GCGTTGATGTTGCAGTTGGAGGGATG-3', y LW105 5' -AAACTGCAGTTATAATCTCTTTCTAATTGGCTC-3' (Operon, CA)

en los sitios de mutación para amplificación por PCR de la Ala5 TyrRS mutante (pBK-JYA5) y se ligaron de nuevo en el pBK-JYA5 digerido con NdeI-PstI para producir la biblioteca de TyrRS. Los vectores ligados se introdujeron por transformación en células competentes de Escherichia coli DH10B para producir una biblioteca de 1,6 X 109 unidades formadoras de colonias (cfu). Se secuenciaron los genes de TyrRS de 40 colonias picadas aleatoriamente para confirmar que no había una desviación base en la posiciones NNK aleatorizadas y ninguna otra mutación inesperada. La biblioteca se amplificó por maxiprep, y se usó ADN súper-enrollado para transformar la cepa de selección pYC-J17.

Después se aplicó una selección positiva a la biblioteca de TyrRS ortogonales mutadas que se basa en la supresión de un codón de parada ámbar en una posición no esencial (por ejemplo, Asp112) en el gen de la cloranfenicol acetiltransferasa (CAT). Véase, por ejemplo, M. Pastrnak, T.J. Magliery, P. G. Schultz, Helv. Chim. Acta, 83:2277 (2000). Las células transformadas con la biblioteca de TyrRS mutantes y el gen del mARNtTyrCUA se cultivaron en medio que contenía el aminoácido no natural y se seleccionaron para su supervivencia en presencia de diversas concentraciones de cloranfenicol. Si una TyrRS mutante carga el mARNtTyrCUA ortogonal con cualquier aminoácido, ya sea natural o no natural, la célula produce CAT y sobrevive. Las células supervivientes después se cultivan en presencia de cloranfenicol y en ausencia del aminoácido no natural. Aquellas células que no sobrevivieron, por ejemplo, que codificaban TyrRS mutantes que cagaban el mARNtTyrCUA ortogonal con un aminoácido no natural, se aislaron de una réplica en placa suplementada con el aminoácido no natural. Los genes de las TyrRS mutantes se aislaron de estas células, se recombinaron in vitro por reorganización del ADN, y se introdujeron por transformación de nuevo en Escherichia coli para rondas adicionales de selección con concentraciones crecientes de cloranfenicol.

Se usó un análogo de tirosina con el grupo para hidroxilo sustituido con el grupo metoxi en la selección. Opcionalmente, también pueden usarse otros análogos de tirosina en la selección, por ejemplo, análogos de tirosina con diferentes grupos funcionales en la posición para del anillo arilo (acetilo, amino, carboxilo, isopropilo, metilo, Ometilo y nitro, etc.). Por ejemplo, el gen que codifica el mARNtTyrCUA se expresó en células de Escherichia coli DH10B bajo el control del promotor Ipp y el terminador rrnC en el plásmido pYC-J17, un derivado de pACYC184 que también codifica el mutante Asp112 TAG de CAT. El ADN súper-enrollado que codifica la biblioteca de TyrRS se introdujo por transformación en células de Escherichia coli DH10B competentes que contenían pYC-J17 para producir una biblioteca de un tamaño mayor que 3 X 109 cfu, asegurando una cobertura completa de la biblioteca original. Las células después se sembraron en placas de medio mínimo que contenían glicerol al 1 % y leucina 0,3 mM (GMML) con 17 %g/ml de tetraciclina (Tet), 25 %g/ml de kanamicina (Kan), 50 %g/ml de cloranfenicol (Cm), y aminoácido no natural 1 mM. Después de incubación a 37 ºC durante 44 horas, las colonias en las placas abastecidas con O-metil-L-tirosina se combinaron, se aislaron los plásmidos y se volvieron a introducir por transformación en células de Escherichia coli DH10B competentes que contenían pYC-J17, y las células transformadas se seleccionaron positivamente en 50 %g/ml de Cm. Se picaron individualmente colonias (96) de la placa, se diluyeron en 100 %l de medio líquido GMML, y se sembraron en estrías en dos series de placas Kan/Tet GMML con diversas concentraciones de Cm. No se añadió O-metil-L-tirosina a la serie de placas 1 y la concentración de Cm se varió de 10-25 %g/ml; la serie de placas 2 contenía O-metil-L-tirosina 1 mM y 50 %g/ml de Cm. Las réplicas de colonias que no crecían en 15 %g/ml de Cm en la serie de placas 1 se picaron de la serie de placas 2. Los plásmidos que contenían el gen de la TyrRS se purificaron y recombinaron in vitro por reorganización del ADN usando el protocolo de Stemmer con la excepción de Mn2+ 10 mM en lugar de Mg2+ en la reacción de fragmentación. Véase, W. P. C. Stemmer, Nature 370, 389-91 (1994); y, I. A. Lorimer, I. Pastan, Nucleic Acids Res. 23, 3067-8 (1995). La biblioteca después se religó en el vector pBK-JYA5 predigerido para producir una biblioteca de TyrRS de segunda generación con un tamaño típico de 8 X 108 a 3 X 109 cfu. Se secuenciaron treinta miembros seleccionados aleatoriamente de la biblioteca. La tasa mutagénica introducida por la reorganización del ADN fue del 0,35 %. Esta biblioteca se transformó en la cepa de selección para la siguiente ronda de selección seguida de reorganización. La concentración de Cm en la selección positiva y en la serie de placas 2 se elevó hasta 80 %g/ml para la segunda ronda y 120 %g/ml para la tercera ronda; la concentración de Cm en la serie de placas 1 no se cambió. Después de tres rondas de reorganización del ADN, las colonias comenzaron a crecer en 20 -25 %g/ml de Cm en la serie de placas 1, lo que indica que los mutantes de TyrRS estaban aceptando aminoácidos naturales como sustratos. Por lo tanto, se caracterizó en detalle el mejor clon seleccionado después de dos rondas de

reorganización del ADN.

Se realizaron dos rondas de selección y la reorganización del ADN y se desarrolló un clon cuya supervivencia en cloranfenicol era dependiente de la adición de O-metil-L-tirosina 1 mM al medio de cultivo. En ausencia de O-metil-L5 tirosina, las células que albergaban la TyrRS mutante no eran viables en placas de medio mínimo que contenían glicerol al 1 %, leucina 0,3 mM (GMML), y 15 %g/ml de cloranfenicol. Las células fueron capaces de crecer en placas GMML con 125 %g/ml de cloranfenicol en presencia de O-metil-L-tirosina 1 mM. Se obtuvieron resultados similares en GMML líquido. Como control, las células con el mARNtTyrCUA y la Ala5 TyrRS inactiva no sobrevivieron a la concentración más baja de cloranfenicol usada, en presencia o ausencia de O-metil-L-tirosina 1 mM. Véase la

10 Figura 14. La adición de O-metil-L-tirosina 1 mM por si misma no afecta significativamente a la tasa de crecimiento de Escherichia coli.

El análisis de la secuencia de la TyrRS mutante que carga el mARNtTyrCUA con O-metil-L-tirosina reveló las siguientes mutaciones: Tyr32(Gln32, Asp158(Ala158, Glu107(Thr107, y Leu162(Pro162. Véase la Figura 14. 15 Basándose en la estructura cristalina de rayos X de la TyrRS homóloga de B. stearothermophilus, la pérdida de la red de enlaces de hidrógeno entre Tyr32, Asp158 y el sustrato tirosina puede desfavorecer la unión de tirosina a la TyrRS mutante. De hecho, la mutación de Asp176 (que corresponde a Asp158 en Methanococcus jannaschii) de la TyrRS de B. stearothermophilus produce enzima inactiva. Véase, por ejemplo, G.D.P. Gray, H.W. Duckworth, A. R. Femst, FEBS Lett. 318:167 (1993). Al mismo tiempo, las mutaciones Asp158(Ala158 y Leu162(Pro162 crean un

20 bolsillo hidrófobo que permite que el grupo metilo de O-metil-L-tirosina se extienda adicionalmente en la cavidad de unión del sustrato. Otros restos catalíticos importantes en el sitio activo, que se unen a la ribosa o el grupo fosfato del adenilato, no se cambiaron después de dos rondas de reorganización del ADN.

La cinética de formación de adenilato de O-metil-L-tirosina y tirosina con adenosina trifosfato (ATP) catalizada por la

25 TyrRS mutante se analizó in vitro usando un ensayo de intercambio de pirofosfato a 37 ºC. Por ejemplo, el gen de la TyrRS mutante con seis histidinas en su extremo C-terminal se clonó en el plásmido pQE-60 (Qiagen, CA) para generar el plásmido pQE-mJYRS. La proteína se purificó por cromatografía de afinidad a metales inmovilizados de acuerdo con el protocolo del fabricante (Qiagen, CA). El intercambio de pirofosfato (PPi) se realizó a 37 ºC en una mezcla de reacción que contenía TrisHCl 100 mM (pH 7,5), KF 10 mM, MgCl2 5 mM, ATP 2 mM, NaPPi 2 mM, 0,1

30 mg/ml de albúmina sérica bovina, aproximadamente 0,01 %Ci/%l de [32P] NaPPi, y diversas concentraciones de tirosina u O-metil-L-tirosina. Las reacciones se iniciaron Las reacciones se iniciaron con la adición de la TyrRS mutante purificada, y se recogieron periódicamente alícuotas y se inactivaron con NaPPi 0,2 M, ácido perclórico al 7 %, y carbón activado al 2 %. El carbón se filtró y se lavó con NaPPi 10 mM (pH 2), después se midió por recuento de centelleo para determinar los niveles de 32P en ATP adsorbido en carbono. Los valores de kcat y Km se calcularon por

35 ajuste directo de la ecuación de Michaelis-Menten usando análisis de regresión no lineal.

La constante de Michaelis (Km) para tirosina (5833 +/-902 %M) se aproximadamente 13 veces mayor que para Ometil-L-tirosina (443 +/-93 %M), y la constante de velocidad catalítica (kcat) para tirosina (1,8 +/-0,2 x 10-3 s-1) es ocho veces menor que para O-metil-L-tirosina (14 +/-1 X 10-3 s-1). Por tanto, el valor de kcat/Km de la TyrRS mutante

40 para O-metil-L-tirosina es aproximadamente 100 veces mayor que para tirosina. La concentración fisiológica de tirosina en Escherichia coli es aproximadamente 80 %M, que está muy por debajo del valor de Km (5833 %M) de la TyrRS mutante para tirosina. Presumiblemente, la concentración de O-metil-L-tirosina en células es comparable o mayor que la Km (443 %M).

45 Este ejemplo muestra que es posible mejorar la maquinaria biosintética de proteínas de Escherichia coli para acomodar aminoácidos codificados genéticamente adicionales. La capacidad de introducir nuevos aminoácidos en proteínas directamente en células vivas proporciona nuevas herramientas para estudios de función proteica y celular y puede conducir a la generación de proteínas con propiedades potenciadas en comparación con una proteína de origen natural. Los métodos descritos aquí pueden aplicarse a otros aminoácidos con nuevas propiedades

50 espectroscópicas, químicas, estructurales o similares. El ribosoma de Escherichia coli ha demostrado ser capaz de incorporar aminoácidos con una amplia gama de cadenas laterales en proteínas usando síntesis de proteínas in vitro. Véase, por ejemplo, C. J. Noren, S. J. Anthony-Cahill, M. C. Griffith, P. G. Schultz, Science 244,182-8 (1989). Pares ortogonales de ARNt/sintetasa adicionales, véase, por ejemplo, D. R. Liu, P. G. Schultz, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 4780-5 (1999); y, A. K. Kowal, C. Kohrer, U.L., RajBhandary, Proc. Natl. Acad. Sci, U.S.A., 98:2268 (2001),

55 así como codones de cuatro bases, véase, por ejemplo, T. J. Magliery, J. C. Anderson, P. G. Schultz, J. Mol. Biol.

307:755 (2001); y, B. Moore, B. C. Persson, C. C. Nelson, R. F. Gesteland, J. F. Atkins, J. Mol. Biol., 298:195 (2000), y otros codones selectores descritos en este documento, pueden expandir adicionalmente la cantidad de alcance de los aminoácidos que pueden incorporarse. También pueden generarse pares ortogonales para células eucariotas mediante los métodos proporcionados en este documento.

60 Véase también la solicitud de patente correspondiente "In vivo Incorporation of Unnatural Amino Acids" número de expediente del mandatario 54-000120PC/US que se incorpora en este documento por referencia. Esta solicitud describe un ejemplo de la generación de un mutante con O-metil-L-tirosina de dihidrofolato reductasa (DHFR) usando el sistema descrito anteriormente.

Ejemplo 3-Mutación de TyrRS de modo que cargue el muARNt Tyr/CUA con un aminoácido no natural, L-3(2-Naftil) alanina

Este ejemplo proporciona otro par ortogonal que puede usarse para incorporar un segundo aminoácido no natural, L3-(2-Naftil)alanina en proteínas en un organismo, por ejemplo, Escherichia coli. Un ejemplo de los métodos usados para generar el par ortogonal que incorpora el aminoácido no natural en proteínas se describe a continuación. Pueden encontrarse más detalles que describen la incorporación del aminoácido no natural en una proteína en la solicitud de patente correspondiente "In vivo incorporation of unnatural amino acid" número de expediente del mandatario 54-000120PC/US incorporada en este documento por referencia.

Se seleccionaron un codón de parada ámbar y su correspondiente ARNt supresor ámbar ortogonal, mu ARNtTyrCUA, para codificar un aminoácido no natural. Como se ha descrito anteriormente, y según Wang y Schultz, Chem. Biol. 8:883-890 (2001). La tirosil-ARNt sintetasa (TyrRS) de Methanococcus jannaschii se usó como punto de partida para la generación de una sintetasa ortogonal con especificidad por aminoácido no natural. Esta TyrRS no aminoacila ningún ARNt endógeno de Escherichia coli, véase, por ejemplo, Steer y Schimmel, J. Biol. Chem., 274:35601-35606 (1999), pero aminoacila el ARNtTyrCUA con tirosina. Véase, por ejemplo, Wang, Magliery, Liu, Schultz, J. Am. Chem. Soc., 122:5010-5011 (2000). Se eligió L-3-(2-naftil)-alanina para este estudio ya que representa una perturbación estructural significativa de la tirosina y puede tener nuevas propiedades de empaquetamiento. Para cambiar la especificidad de aminoácido de la TyrRS de modo que cargue el mu ARNtTyrCUA con L-3-(2-naftil)-alanina y no cualquiera de los 20 aminoácidos comunes, se generó una biblioteca de mutantes de TyrRS de Methanococcus jannaschii y se exploró. Basándose en el análisis de la estructura cristalina de la TyrRS homóloga de Bacillus stearothermophilus, véase, Brick, Bhat, Blow, J. Mol. Biol., 208:83-98 (1989), se mutaron cinco restos (Tyr32, Asp158, Ile159, Leu159, y Ala167) en el sitio activo de TyrRS de Methanococcus jannaschii que están dentro de los 7 Å de la posición para del anillo arilo de tirosina. Véase la Figura 15. No se seleccionaron sintetasas específicas para L-3-(2naftil)alanina de la biblioteca de TyrRS mutantes presentada en Wang, Brock, Herberich, Schultz, Science, 292:498500 (2001). Para reducir la contaminación con sintetasa de tipo silvestre en la siguiente selección, estos restos (excepto Ala167) primero se mutaron todos en alanina. El gen resultante de Ala5 TyrRS inactiva se usó como mol de para mutagénesis aleatoria por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con oligonucleótidos que albergan mutaciones aleatorias en los sitios correspondientes.

La biblioteca de TyrRS mutantes primero se pasó a través de una selección positiva basada en la supresión de un codón de parada ámbar en una posición no esencial (Asp112) en el gen de la cloranfenicol acetiltransferasa (CAT). Las células transformadas con la biblioteca de TyrRS mutantes y el gen del mu ARNtTyrCUA se cultivaron en medio mínimo que contenía L-3-(2-naftil)-alanina 1 mM y 80 %g/ml de cloranfenicol. Las células pueden sobrevivir solamente si la TyrRS mutante aminoacila el mu ARNtTyrCUA con aminoácidos naturales o L-3-(2-naftil)-alanina. Las células supervivientes entonces se cultivaron en presencia de cloranfenicol y ausencia del aminoácido no natural. Aquellas células que no sobrevivieron deben codificar una TyrRS mutante que carga el mu ARNtTyrCUA con L-3-(2naftil)-alanina, y se picaron de una réplica en placa abastecida con el aminoácido no natural. Después de tres rondas de selección positiva seguidas de una selección negativa, se caracterizaron cuatro TyrRS usando un ensayo in vivo basado en la supresión del codón Asp112TAG en el gen de la CAT.

Tabla 4 Ensayo in vivo de cloranfenicol acetiltransferasa de TyrRS mutantes.a TyrRS mutante CI50 (%g/ml de cloranfenicol) Sin L-3-(2-naftil)-Ala L-3-(2-naftil)-Ala añadida Sin TyrRS 4 4 TyrRS de tipo silvestre 240 240

Después de selección

S1-TyrRS

30 120

S1-TyrRS

30 120

S1-TyrRS

25 110

S1-TyrRS

35 100

Después de reorganización del ADN

SS12-TyrRS 9 150 a Se usó un plásmido pYC-J17 para expresar el gen de mu ARNtTyrCUA y el gen de la cloranfenicol acetiltransferasa con un codón de parada ámbar en Asp112. Se usó un plásmido pBK para expresar TyrRS, y se introdujo por cotransformación con pYC-J17 en Escherichia coli DH10B. La supervivencia celular en placas GMML se tituló en presencia de diferentes concentraciones de cloranfenicol.

En ausencia de L-3-(2-naftil)-alanina, las células que expresaban la TyrRS seleccionada y el mu ARNtTyrCUA

sobrevivían en 25 a 35 %g/ml de cloranfenicol en placas de medio mínimo que contenían glicerol al 1 % y leucina 0,3 mM (placa GMML); en presencia de L-3-(2-naftil)-alanina, las células sobrevivían en 100 a 120 %g/ml de cloranfenicol en placas GMML. En comparación con el valor de CI50 en ausencia de cualquier TyrRS (4 %g/ml de cloranfenicol), estos resultados indican que las TyrRS seleccionadas aceptan L-3-(2-naftil)-alanina, pero también cargan aún aminoácidos naturales en alguna medida. Véase la Tabla 4 anterior.

Para reducir adicionalmente la actividad de la TyrRS mutante hacia los aminoácidos naturales, se realizó una ronda de reorganización del ADN usando los cuatro genes mutantes anteriores como moldes. La biblioteca resultante de TyrRS mutantes se pasó a través de dos rondas adicionales de selecciones positivas y exploraciones negativas. Se desarrolló una TyrRS mutante (SS 12-TyrRS), cuya actividad por aminoácidos naturales estaba enormemente

reducida (CI50=9 %g/ml de cloranfenicol) mientras que su actividad hacia L-3-(2-naftil)-alanina estaba potenciada (CI50=150 %g/ml de cloranfenicol). Véase la Tabla 4.

La SS12-TyrRS desarrollada tiene las siguientes mutaciones: Tyr32(Leu32, Asp158(Pro158, Ile159(Ala159, Leu162(Gln162, y Ala167(Val167. Véase la Figura 15. Basándose en la estructura cristalina de la TyrRS homóloga de

B. stearothermophilus, las mutaciones de Tyr32(Leu32 y Asp158(Pro158 pueden provocar la pérdida de enlaces de hidrógeno entre Tyr32, Asp158, y el sustrato nativo tirosina, desfavoreciendo de este modo la unión de tirosina a SS12-TyrRS. La mayoría de los restos se mutan en aminoácidos con cadenas laterales hidrófobas, que se espera que favorezcan la unión de L-3-(2-naftil)-alanina. La estructura cristalina de la TyrRS de tipo silvestre de Methanococcus jannaschii y la SS12-TyrRS desarrollada puede determinarse por métodos disponibles.

El par de mu ARNtTyrCUA/SS 12-TyrRS fue capaz de insertar selectivamente L-3-(2-naftil)-alanina en proteínas en respuesta al codón ámbar con fidelidad que rivaliza con la de los aminoácidos naturales basándose en los ejemplos de crecimiento celular, expresión de proteínas y espectrometría de masas descritos en este documento y en la solicitud correspondiente "In vivo incorporation of unnatural amino acids" número de expediente del mandatario 54000120PC/US. Véase también, Wang, Brock, y Schultz, Adding L-3-(2-Naphthyl) alanine to the genetic code of E. coli, J. Am. Chem Soc., (2002) 124(9):1836-7. Este resultado, que implica un aminoácido que es estructuralmente distinto de tirosina, confirma que los métodos descritos en este documento se pueden generalizar a una diversidad de aminoácidos no naturales.

Ejemplo 4-Mutación de TyrRS de modo que cargue el muARNt Tyr/CUA y cribado para la TyrRS mutada con las propiedades deseadas por otros métodos, por ejemplo, FACS y presentación en fagos y selección

También pueden seleccionarse pares ortogonales usando genes y proteínas indicadoras como se ha descrito anteriormente, junto con cribado FACS in vivo, detección de anticuerpos, presentación en fagos in vitro y selección,

o similares. Véase, Wang y Schultz, Expanding the genetic code, Chem. Commun., 1:1-11 (2002).

Por ejemplo, se ha desarrollado una selección general basada en clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) con, por ejemplo, proteína fluorescente verde (GFP) como indicador, para seleccionar sintetasas. Véase la Figura 16, Panel A, y Panel B. La actividad sintetasa se indica por supresión del codón selector, por ejemplo, un codón de parada ámbar (TAG) dentro de la ARN polimerasa T7, que dirige la expresión de GFP. Véase, por ejemplo, la Figura 26 para otro ejemplo de métodos de selección/cribado de la invención. Solamente cuando los codones ámbar se suprimen las células pueden producir ARN polimerasa T7 funcional y expresar GFP, volviendo a las células fluorescente. En la selección positiva, se recogen las células fluorescentes que codifican sintetasas activas que cargan el ARNt ortogonal con aminoácidos naturales o no naturales. Las células seleccionadas después se diluyen y cultivan en ausencia del aminoácido no natural, y después se clasifican por FACS para células sin fluorescencia, por ejemplo, que expresan sintetasas con especificidades por aminoácidos no naturales solamente. La Figura 17, Panel A, Panel B Panel C y Panel D ilustra la supresión de un codón selector, por ejemplo, un codón ámbar, usando glutamina sintetasa. Ajustando el umbral de recogida de la intensidad de fluorescencia, puede controlarse convenientemente la rigurosidad de la selección tanto positiva como negativa.

También se ha desarrollado una selección positiva directa para un aminoácido no natural particular que explota la alta afinidad de un anticuerpo monoclonal por un aminoácido no natural presentado en una superficie de fago. Véase la Figura 18. Véase, M. Pastmak y P. G. Schultz, Bioorg. Med. Chem., 9:2373 (2001). Por ejemplo, se fusiona un péptido C3 con una mutación ámbar al extremo N-terminal de la proteína de envuelta pIII del fago VSCM13, de modo que la producción del fago requiera la supresión del codón de parada ámbar. Las células que albergan un fagómido que expresa un ARNt supresor ortogonal y una biblioteca de sintetasas se infectan con el fago C3TAG. Una sintetasa activa provoca la supresión de C3TAG y la presentación de su aminoácido afín en la superficie del fago. La reserva de fagos después se incuba con anticuerpos monoclonales inmovilizados dirigidos contra el aminoácido no natural para aislar solamente aquellos fagos que portan la sintetasa específica para el aminoácido no natural. En una selección simulada, se enriquecieron los fagos que presentaban Asp sobre un factor 300 a partir de una reserva de fagos que presentaban Asn usando anticuerpos creados contra el epítopo que contenía Asp.

También pueden usarse varios métodos de selección in vitro. En uno de estos métodos, se presenta una biblioteca de sintetasas mutantes en el fago, y las partículas de fago se seleccionan frente a análogos de aminoalquil adenilato inmovilizados del intermedio aminoacil adenilato. Véase la Figura 19. Por ejemplo, se fusionó la TyrRS de Methanococcus jannaschii a la proteína de envuelta pIII del fago M13. Este fago se enriqueció 1000 veces sobre un fago de control que presentaba un anticuerpo no relacionado tras selección frente al análogo de aminoalquil adenilato de tirosil adenilato. Dado que solamente del 0,1 al 1 % de la población de partida de fagos de TyrRS presenta la proteína TyrRS, el factor de enriquecimiento real puede ser tan elevado como de 105 a 106.

Ejemplo 5-Generación de un par de leucil-ARNt sintetasa de arqueobacteria

Se identificó una leucil-ARNt sintetasa de una arqueobacteria, Methanobacterium thermoautotrophicum, que puede aminoacilar ARNt supresores ámbar y de desplazamiento de fase derivados del leucil ARNt de arqueobacteria, pero no aminoacila ningún ARNt nativo para Escherichia coli. Usando una estrategia de selección descrita en la presente invención, se identificaron sustratos de ARNt muy activos que se cargan selectivamente por la sintetasa. Pueden generarse bibliotecas mutantes de sintetasas y seleccionares para que sean capaces de cargar selectivamente aminoácidos no naturales.

Se construyeron genes indicadores de ∃-lactamasa con codones ámbar y ARNt supresores derivados de cinco diferentes leucil ARNt de arqueobacteria para los cuales se remplazó el anticodón con un anticodón CUA para fabricar un ARNt supresor ámbar. Se clonaron siete diferentes leucil ARNt sintetasas y se cotransformaron con construcciones indicadoras. Tres sintetasas dieron niveles mayores de supervivencia en ampicilina en presencia de la sintetasa que los controles que carecían de sintetasa, y estos sistemas se examinaron adicionalmente. Véase, la

Figura 20.

La siguiente etapa implicó la determinación de una sintetasa que carga el ARNt supresor sin interaccionar con el ARNt hospedador. Los dos sistemas elegidos, Methanobacterium thermoautotrophicum y Methanococcus jannaschii se expresaron, y se realizó la aminoacilación in vitro sobre ARNt purificados de Halobacterium como control positivo, y para el ARNt total de Escherichia coli. Se descubrió que la sintetasa de Methanococcus jannaschii era capaz de cargar de forma eficaz el ARNt de Escherichia coli, pero la sintetasa de Methanobacterium thermoautotrophicum era específica hacia el ARNt de Halobacterium.

Se hicieron mejoras adicionales para aumentar la eficacia del sistema de supresión. El sitio A37 del bucle anticodón era una G37 en las leucil ARNt sintetasas. Esta mutación ha demostrado ser un determinante negativo contra la aminoacilación por sintetasas no afines en diversas células eucariotas y Halobacterium, y también un determinante positivo para la aminoacilación en levadura, pero no en Halobacterium. A37 también demostró ser un requisito clave para una supresión eficaz. El bucle anticodón se mutagenizó aleatoriamente y se seleccionó para una supresión más eficaz. La mutación de G37 en A, provocó una supresión más eficaz, que podría suprimir concentraciones 20 veces mayores de ampicilina en comparación con la versión no mutada. Véase, la Figura 21.

Para mejorar el ARNt de modo que se cargue de forma preferente por otras sintetasas en Escherichia coli, se mutagenizó aleatoriamente el tronco aceptor del ARNt. Se usó una selección positiva/negativa para identificar ARNt que no se cargaran en ausencia de RS de Methanobacterium thermoautotrophicum.

Entre los ARNt mutados seleccionados observados, todos conservaban la base discriminadora, A73, que ha demostrado, en todos los sistemas previos, ser un determinante positivo crítico para la aminoacilación de leucilo. También se conservaba el par de bases C3:G70 entre todos los aciertos que tenían ortogonalidad mejorada. El mejor ARNt mutante observado deba una disminución de 3 veces en la aminoacilación sin sintetasa y realmente un aumento en la supresión en presencia de RS de Methanobacterium thermoautotrophicum.

También se prepararon variantes que podían suprimir codones de cuatro bases en lugar de, por ejemplo, codones de tres bases. Los codones de cuatro bases ofrecen la posibilidad de descodificar cuatro bases del código genético de una vez, por lo que podrían codificarse 256 elementos en lugar de 3 de una vez, donde solamente pueden codificarse 64 aminoácidos. La dificultad con el uso de codones de cuatro bases es que requieren la expansión del bucle anticodón para el ARNt, una perturbación que la mayoría de los sistemas es poco probable que acepten. Sin embargo, se identificó un supresor AGGA de primera generación para el sistema de leucilo. Éste se generó mutagenizando aleatoriamente el bucle anticodón con 8 bases y realizando selección con un sistema indicador AGGA-∃-lactamasa. Véase la Figura 22.

El mecanismo de edición de la sintetasa también se mutó para eliminar la función de edición. El sistema de leucilo, como otras varias sintetasas tiene (al menos) dos sitios activos. Un sitio realiza la activación del aminoácido con ATP para formar un aminoacil adenilato unido a la enzima en complejo con la sintetasa, y después transfiere el aminoácido al extremo 3' del ARNt. Un segundo sitio, sin embargo, es capaz de hidrolizar el aminoácido del ARNt si no es leucina. Se sabe que el sistema de leucina realiza esta función de edición post-transferencia para metionina e isoleucina, y opcionalmente hace esto para aminoácidos no naturales también.

Inicialmente, se delecionó el dominio de edición. El dominio de edición se remplazó con una biblioteca de 6 aminoácidos aleatorios en tándem. Se usó una selección positiva, que se basó en la supresión de un codón de parada en ∃-lactamasa. Se obtuvieron muchas sintetasas funcionales, pero tras intentar purificar las sintetasas, no pudo detectarse material en ningún caso, y todas estas sintetasas presentaban un fenotipo sensible a temperatura que sugiere que la deleción del dominio de edición producía una proteína menos estable.

A continuación, se hicieron mutaciones puntuales en el dominio de edición. El núcleo catalítico del dominio de edición está bien conservado entre especies e incluso para diferentes aminoácidos, al menos para la familia de aminoácidos de cadena ramificada. Varios de estos sitios conservados se han mutado previamente, por ejemplo una mutación T(P, y se descubrió que eliminaba la función de edición. Se construyeron mutantes de RS de Methanobacterium thermoautotrophicum que eran similares a varios mutantes conocidos, y también se creó una biblioteca NNK de de 20 miembros derivada de T214. Las proteínas se expresaron y examinaron in vitro para la aminoacilación con leucina y metionina. Ninguna de las mutaciones identificadas previamente se podía transferir a

5 nuestro sistema, pero se identificó una mutación deseable de la biblioteca T214. Se identificaron dos mutantes que eran capaces de cargar con leucina, T214S y T214Q. De estas mutaciones, solamente T214Q era capaz de cargar metionina. El mutante T214S aparentemente retiene la capacidad de editar metionina mientras que el mutante Gln ha perdido esta función.

Entonces se diseñó una biblioteca basada en la estructura cristalina que se ha resuelto para la leucil sintetasa de Thermus thermophilus. La cadena lateral de leucina del inhibidor de adenosina análogo de leucina aminoalquil adenilato se unió en el sitio activo. Se remplazaron seis sitios que rodean el bolsillo de unión a la cadena lateral de leucina con aminoácidos aleatorizados para crear una biblioteca más grande. Las sintetasas de esta biblioteca entonces pueden seleccionarse, por ejemplo, realizando selecciones de doble criba positivas/negativas, para

15 identificar sintetasas capaces de cargar aminoácidos no naturales de forma selectiva.

Ejemplo 6-Identificación de ARNt que suprimen de forma eficaz codones de cuatro bases

Se usó un enfoque combinatorio para identificar ARNt mutados que suprimían de forma eficaz codones de cuatro bases. Véase, T. J. Magliery, J. C. Anderson y P. G. Schultz, J. Mol. Biol., 307:755 (2001). Se construyó una biblioteca indicadora en que un codón de serina en el gen de la ∃-lactamasa estaba remplazado por cuatro nucleótidos aleatorios. Después se generó una biblioteca supresora de ARNt mutados, por ejemplo, ARNt supresores, que constaba de derivados de Escherichia coli con el bucle anticodón (7 nt) remplazado con ocho o nueve nucleótidos aleatorios. Cuando se cruzan estas dos bibliotecas, un ARNt supresor apropiado de

25 desplazamiento de fase que descodifica la secuencia de cuatro bases como un único codón provoca la traducción de la ∃-lactamasa de longitud completa, haciendo a las células resistentes a ampicilina. La supervivencia a concentraciones mayores de ampicilina indica que el ARNt correspondiente tiene mayor eficacia de supresión para el codón de cuatro bases. Usando esta selección, se identificaron cuatro codones de cuadruplete AGGA, CUAG, UAGA, y CCCU y sus ARNt supresores afines que descodifican solamente el codón canónico de cuatro bases con eficacias cercanas a las de los supresores de codones naturales de triplete. También se ha seleccionado nuevos supresores de codones de cinco y seis bases usando esta estrategia. Véase, Anderson, Magliery, Schultz, Exploring the Limits of Codon and Anticodon Size, Chemistry & Biology, 9:237-244 (2002). Estos codones extendidos, algunos de los cuales están recién identificados, pueden ser útiles para la incorporación de múltiples aminoácidos no naturales in vitro y para mutagénesis in vivo de proteínas.

Ejemplo 7-Generación de una ARNt-sintetasa ortogonal para p-aminofenilalanina

Para generar un par ortogonal de sintetasa para p-aminofenilalanina (pAF), se usó el par de la tirosil-ARNt sintetasa (TyrRS) de Methanococcus jannaschii y el ARNt supresor ámbar de tirosina mutante (TyrCUA muARNt) como punto de partida. Véase, Wang, L., Magliery, T. J., Liu, D. R. y Schultz, P. G. A new functional suppressor tRNA/aminoacyltRNA synthetase pair-for the in vivo incorporation of unnatural amino acids in proteins. J. Am. Chem. Soc. 122: 5010-5011 (2000); y, Wang, L. y Schultz, P. G. Chem. and Biol. 8:883 (2001). La sintetasa específica para pAF (pAFRS) se generó modificando la especificidad de aminoácido de la TyrRS de Methanococcus jannaschii para aceptar pAF y no cualquiera de los veinte aminoácidos comunes. Se usó una combinación de selecciones positivas

45 y exploraciones negativas para identificar la enzima pAFRS de una biblioteca de TyrRS variantes 12 conteniendo aminoácidos aleatorios en cinco posiciones (Tyr32, Glu107, Asp158, Ile159, y Leu162). Véase, Wang, L., Brock, A., Herberich, B. y Schultz, P. G. Expanding the genetic code of Escherichia coli. Science 292:498-500 (2001). Se usó un único plásmido indicador tanto para la selección como para el cribado. Por ejemplo, el plásmido indicador es pREP(2)/YC-JYCUA, que contiene los genes para CAT, ARN polimerasa T7, GFP, y TyrCUA muARNt, y un marcador de selección para resistencia a Tet. El gen de CAT contiene una sustitución del codón TAG en la posición D112. El gen de la ARN polimerasa T7 contiene un péptido líder N-terminal de siete aminoácidos y sustituciones TAG en M1 y Q107.

La selección positiva se basa en la supresión de un codón TAG en una posición permisiva dentro del gen de la

55 cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) por pAF o un aminoácido endógeno. Véase, por ejemplo, Wang et al. (2001), supra; y, Pastrnak, M., Magliery, T. J. y Schultz, P. G. A new Orthogonal suppressor tRNAlaminoacyl-tRNA synthetases pair for evolving an organism with an expanded genetic code. Helvetica Chemica Acta 83:2277 (2000). Las células que contenían la biblioteca de TyrRS y el plásmido indicador se cultivaron en cultivo líquido que contenía pAF y se seleccionaron para la supervivencia en presencia de cloranfenicol (Cm). Por ejemplo, para la selección

positiva, las células se cultivaron en medio mínimo GMML que contenía 35 %g/ml de Kn, 25 %g/ml de Tet, 75 %g/ml de Cm, y pAF 1 mM (Sigma).

La selección negativa se basa en la incapacidad de suprimir en ausencia de pAF dos codones de parada TAG en posiciones permisivas dentro del gen de la ARN polimerasa T7. La expresión de ARN polimerasa T7 de longitud 65 completa dirige la expresión de la proteína fluorescente verde (GFP). Las células de la selección positiva se

cultivaron en ausencia de pAF y Cm, y después se exploraron usando clasificación celular activada con

fluorescencia (FACS) para la ausencia de fluorescencia. Por ejemplo, para la selección negativa, las células se cultivaron en medio GMML que contenía 35 %g/ml de Kn, 25 %g/ml de Tet, y arabinosa al 0,002 %. La FACS se realizó usando un clasificador celular BDIS FACVantage TSO con un láser de iones Coherent Enterprise II. La longitud de onda de excitación fue de 351 nm y la emisión se detectó usando un filtro paso-banda de 575/25 nm. Las células recogidas se diluyeron en al menos 10 volúmenes de LB, que contenía Tet y Kn, y se cultivaron hasta saturación.

La pAFRS deseada se identificó después de dos rondas de selección positiva en medio líquido, una ronda de cribado negativa, otra ronda de selección positiva en medio líquido, y una ronda de selección positiva en placas. La enzima pAFRS contiene cinco mutaciones relativas a la TyrRS de tipo silvestre (Y32T, E107T, D158P, I159L, y L162A). En ausencia de pAF, la CI50 de células que expresan la pAFRS seleccionada y el plásmido indicador fue de

10 %g/ml de Cm en placas de medio mínimo GMML. La CI50 fue de 120 %g/ml de Cm con pAF 1 mM. Por tanto, pAF está suprimiendo de forma selectiva el codón UAG.

Ejemplo 8 -Desarrollo de una aminoacil-ARNt sintetasa usando clasificación celular activada porfluorescencia

Se usó un sistema de selección basado en FACS para desarrollar rápidamente tres variantes de sintetasa altamente selectivas que aceptaban análogos de tirosina amino, isopropilo, o alilo. El sistema incluía un plásmido indicador polivalente usado para la aplicación de presión de selección tanto positiva como negativa y para la evaluación fácil y cuantitativa de la actividad sintetasa. Un marcador de cloranfenicol acetil transferasa (CAT) permitió la selección positiva para la actividad de la tirosil-ARNt sintetasa (TyrRS) de M. jannaschii. Un sistema indicador de polimerasa T7/GFP permitió la evaluación de la actividad sintetasa dentro de células cultivadas tanto en presencia como en ausencia de un aminoácido no natural. Se usó clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) para explorar frente a variantes de sintetasa que aceptan aminoácidos naturales, mientras que los análisis visuales y fluorimétricos fueron para evaluar la actividad sintetasa de forma cualitativa y cuantitativa, respectivamente.

Diseño de un sistema indicador de fluorescencia amplificable. Los esfuerzos por desarrollar un sistema de selección versátil para la evaluación de la actividad sintetasa en células vivas inicialmente surgieron de un deseado por un mayor grado de control sobre la presión selectiva aplicada a poblaciones de variantes de sintetasa, especialmente presión de selección negativa. Como el sistema era para usar en evaluar las actividades de grandes cantidades de variantes de sintetasa, se buscó un indicador que fuera susceptible a cribado de alto rendimiento. Además, se deseaba un indicador que permitiera una fácil evaluación cualitativa y cuantitativa de la actividad sintetasa. Para cumplir estos requisitos, se diseñó un cribado basad en fluorescencia. El sistema se basaba en la producción dependiente de sintetasa de GFPuv, una variante de la proteína fluorescente verde que se ha optimizado para su expresión en E. coli (véase, Crameri, A., Whitehorn, E. A., Tate, E. y Stemmer, W. P., Nature Biotechnol. 1996, 14, 315-319). Este fluoróforo es susceptible a su uso en FACS y fluorimetría, así como a inspección visual en placas y en cultivo líquido. El sistema se diseñó de modo que la supresión dependiente de sintetasa de los codones selectores, por ejemplo, codones sin sentido ámbar provocara la producción de una señal de fluorescencia. Para maximizar la sensibilidad del indicador, se hizo amplificable colocando los codones ámbar dentro del gen de la ARN polimerasa T7, que se diseñó para dirigir la expresión del gen indicador de GFPuv en analogía con otros sistemas indicadores intracelulares amplificables (véase, Lorincz, M., Roederer, M., Diwu, Z., Herzenberg, L. A., Nolan, G. P. Cytometry, 1996, 24, 321-329; y Zlokarnik, G., Negulescu, P. A., Knapp, T. E., Mere, L., Burres, N., Feng, L., Whitney, M., Roemer, K. y Tsien, R. Y., Science, 1998, 279, 84-88). El gen de la ARN polimerasa T7 se colocó bajo el control del promotor de arabinosa para permitir una fácil optimización de la producción del transcrito de ARN para la ARN polimerasa T7 que contiene el codón ámbar.

Optimización del sistema indicador de ARN polimerasa T7/GFPuv. Se diseñó un plásmido indicador de cantidad media de copias, pREP, para que expresara variantes de ARN polimerasa T7 que contienen ámbar bajo el control del promotor de arabinosa y el gen de GFPuv bajo el control del promotor T7 (Figura 17a). Se insertó una serie de doce variantes de ARN polimerasa T7, diseñadas para optimizar la potenciación de la fluorescencia dependiente de sintetasa (Figura 17b), en pREP para crear plásmidos pREP(1-12). Todas las variantes contenían una secuencia líder N-terminal de siete aminoácidos (MTMITVH) y 1-3 codones de parada ámbar (TAG). Las variantes 1-3 contenían uno, dos, y tres codones de parada ámbar, respectivamente, sustituidos en la metionina original en la posición uno (M1), justo cadena abajo de la secuencia líder. Las variantes 4-9 contenían un codón ámbar sustituido en D10, R96, Q107, A159, Q169, o Q232, respectivamente, que se predijo que estarían localizadas en regiones de bucle de la estructura (véase, Jeruzalmi, D. y Steitz, T. A., EMBO J., 1998, 17, 4101-4113). Las variantes 10-12 contenían codones de parada ámbar sustituidos en las posiciones M1 y Q107, A159, o Q232, respectivamente. Las construcciones plasmídicas se evaluaron por fluorimetría y citometría de flujo de células vivas para potenciación de la fluorescencia usando un plásmido compatible que contenía la glutaminil-ARNt sintetasa ortogonal y el ARNtCUA para glutamina de S. cerevisiae. Se descubrió que los plásmidos pREP (1-12) proporcionaban niveles variables de potenciación de fluorescencia dependiente de sintetasa, mostrando la mejor construcción, pREP(10) fluorescencia 220 veces mayor por fluorimetría (Figura 17c) y fluorescencia media 400 veces mayor por citometría (Figura 17d) en células que contenían la sintetasa de tipo silvestre frente a un mutante inactivo. La sustitución de una diversidad

de grupos funcionales en posiciones correspondientes a los codones ámbar dentro de pREP(10) demuestra que la posición 107 dentro de la ARN polimerasa T7 es muy permisiva.

Construcción de un plásmido indicador polivalente. Para construir un plásmido polivalente para usarse tanto para seleccionar como para explorar variantes de una TyrRS de M. jannaschii, se combinó el plásmido pREP(10) con el plásmido pYC-J17 (véase, Wang, L, Brock, A., Herberich, B. y Schultz, P. G., Science, 2001, 292, 498-500) para obtener pREP/YC-JYCUA (Figura 25a). El plásmido pREP/YC-JYCUA se ensayó para su función con un plásmido compatible que expresaba una variante de TyrRS de M. jannaschii (pBK-mJYRS; Wang, L, Brock, A., Herberich, B. y Schultz, P. G., Science, 2001, 292, 498-500) selectiva para la incorporación de O-metil-tirosina (OMY). Las células que contenían pREP/YC-JYCUA y pBK-mJYRS, cultivadas en presencia de OMY, mostraron un valor de CI50 en cloranfenicol (Cm) de 120 %g/%l, idéntico al obtenido usando el plásmido pYC-J17, y una potenciación de fluorescencia de 330 veces para células cultivadas en presencia frente a ausencia de OMY, medida por fluorimetría.

Evolución de la especificidad de sustrato de la tirosil-ARNt sintetasa de M. jannaschii. Los resultados han demostrado que el bolsillo de unión a la cadena lateral de aminoácidos de la TyrRS de M. jannaschii puede desarrollarse para que acomode de forma selectiva grupos químicos diferentes a la cadena lateral fenol de tirosina (véase, Wang, L, Brock, A., Herberich, B. y Schultz, P. G., Science, 2001, 292, 498-500; Wang, L., Brock, A. y Schultz, P. G. J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 1836-1837). Buscamos explorar adicionalmente la generalidad de la acomodación de aminoácidos no naturales por TyrRS de M. jannaschii estimulando a la enzima a aceptar nuevas funcionalidades: p-Isopropil-Fenilalanina (pIF), p-Amino-Fenilalanina (pAF), p-Carboxil-Fenilalanina (pCF), u O-Alil-Tirosina (OAT) (Figura 25b). Se introdujo una biblioteca de variantes de TyrRS de M. jannaschii que contenían aleatorizaciones en las posiciones Y32, E107, D158, 1159, y L162 (Wang, L, Brock, A., Herberich, B. y Schultz, P. G., Science, 2001, 292, 498-500), restos que se cree que forman el bolsillo de unión para la posición para del anillo tirosilo, en células que contenían el plásmido pREP/YC-JYCUA. Estas células, que abarcan una diversidad de biblioteca de ~109, se usaron para comenzar cuatro experimentos de evolución para identificar variantes de sintetasa selectivas para pIF, pAF, pCF, u OAT (Figura 25b). Se realizaron dos ciclos de selección positiva permitiendo que los cultivos celulares crecieran hasta saturación en presencia de Cm y uno de los cuatro aminoácidos no naturales. Se retiraron alícuotas celulares después del segundo ciclo de selección positiva y se usaron para inocular un nuevo cultivo que no contenía aminoácido añadido o Cm, y se permitió que el cultivo creciera de nuevo hasta saturación. En este punto, probablemente las células que emiten fluorescencia contienen variantes de sintetasa que pueden aceptar uno de los 20 aminoácidos naturales. Aproximadamente 108 células de cada línea se sometieron a selección negativa usando FACS para eliminar las variantes de sintetasa que aceptan aminoácido natural. Las células no fluorescentes se recogieron y amplificaron a través de cultivo hasta saturación. Estas células amplificadas se usaron para inocular un nuevo cultivo para un ciclo final de selección positiva en cultivo líquido que contenía aminoácido no natural y Cm. Después del cultivo hasta saturación, cada población de células se sembró en medio que contenía 0, 30, 60, ó 100 %g/ml de Cm y 0 ó 1 mM del aminoácido no natural apropiado.

Identificación y caracterización de variantes de sintetasa desarrolladas. Placas de Cm suplementadas con pIF, pAF, y OAT producían cantidades 10-100 veces mayores de colonias fluorescentes que las placas que no contenían aminoácido añadido. En contraste, las placas para la población pCF produjeron la misma cantidad de colonias fluorescentes con o sin adición de pCF. Las diez colonias fluorescentes más grandes se picaron para cada una de las poblaciones de pIF, pAF, y OAT de placas que contenían aminoácido no natural y se cultivaron hasta saturación en medio líquido con o sin aminoácido no natural añadido. Se hizo una evaluación cualitativa de la producción de fluorescencia visualmente con el uso de una lámpara portátil ultravioleta de larga longitud de onda (Figura 23a).

Se secuenciaron variantes de sintetasa correspondientes a clones que producían diferencias significativas en la fluorescencia. Los diez clones de las poblaciones de pIF y pAF tuvieron secuencias idénticas, mientras que se identificaron tres clones diferentes de la población de OAT. Sucedieron cambios de aminoácidos dentro de los cinco sitios aleatorizados en todos los clones, con la excepción de dos sustituciones adicionales dentro de la variante pIF-ARNt sintetasa (pIF-RS). Se evaluaron cuantitativamente las actividades de los diferentes clones. Se midió la fluorescencia fluorimétricamente para células cultivadas en cultivo líquido en presencia o ausencia de aminoácido no natural (Figura 23b). Las CI50 en Cm se determinaron sembrando las células en placas en concentraciones variables de Cm en presencia o ausencia de aminoácido no natural (Figura 23c).

Se usó un gen de mioglobina que contenía un codón ámbar en la cuarta posición para evaluar la producción de proteína que contenía aminoácido no natural. El gene se expresó en células, usando la variante pIF-RS, pAF-RS, o OMY-RS, respectivamente, en presencia o ausencia de pIF, pAF, u OAT (Figura 23d). Los rendimientos de proteína fueron comparables para las tres variantes, variando de 1-2 miligramos de proteína por litro de cultivo celular que contenía aminoácido no natural. En contraste, la producción de proteína fue casi indetectable en cultivos crecidos en ausencia de aminoácido no natural. Las proteínas se analizaron por espectrometría de masas por electronebulización, dando masas de 18457,40 ± 0,81 (18457,28 esperado) para la proteína que contenía pIF, y 18430,30 ± 0,27 (18430,21 esperado) para la proteína que contenía pAF. Las mediciones de actividad obtenidas usando los análisis de CI50 en Cm, fluorimetría, y expresión de proteínas se correlacionaron bien, sin embargo, la actividad de la pIF-RS parece estar algo subestimada por fluorimetría. En comparación con otros ensayos, la medición de fluorimetría desproporcionadamente baja para la variante pIF-RS, sugiere que la ARN polimerasa T7

puede estar parcialmente desestabilizada tras la incorporación del análogo pIF, a pesar de la aparente permisividad de las posiciones ámbar dentro del indicador (véase, la Figura 17c).

Utilidad del sistema indicador polivalente. El sistema indicador aquí descrito permite el uso de un único plásmido polivalente tanto para la selección positiva como para el cribado negativa, obviando la necesidad de plásmidos lanzadera entre rondas alternas de selección positiva y negativa. Se requirió un total de solamente tres rondas de selección positiva y una ronda de cribado negativa para posibilitar la identificación de variantes de sintetasa que aceptan selectivamente aminoácidos no naturales deseados. Estas características permiten realizar experimentos de evolución en cuestión de días. El sistema de cribado puede usarse para identificar fácilmente variantes activas de sintetasa usando placas de agar que contienen aminoácido no natural y para ensayar individualmente la especificidad de aminoácido de las variantes.

Como se ha descrito anteriormente, el sistema de ARN polimerasa T7/GFP puede usarse para comparar cuantitativamente las actividades de variantes de sintetasa. La disponibilidad de los tres clones OAT-RS aquí descritos y un clon OAT-RS diferente obtenido independientemente de la misma biblioteca usando una selección positiva/negativa basada en CAT y barnasa permite la posibilidad de comparar los dos sistemas diferentes de evolución en términos de variantes de sintetasa resultantes de cada uno. Este análisis revela que los tres clones derivados de selección positiva y cribado negativa muestran niveles ligeramente inferiores de fluorescencia en presencia de OAT, pero niveles de fondo ~10 veces inferiores en ausencia del aminoácido no natural. La potenciación de la fluorescencia para células cultivadas en presencia frente a ausencia del aminoácido no natural es por tanto aproximadamente 6 veces mayor para células que expresan OAT-RS(1) de selección y cribado que para células que expresan el clon de OAT-RS derivado de selección positiva/negativa usando barnasa. Aunque no está claro si este ejemplo es representativo, estos datos sugieren que el sistema de ARN polimerasa T7/GFP puede permitir mayor rigurosidad en la selección frente a variantes de sintetasa que son promiscuas hacia sustratos de aminoácido natural. Sin embargo, se espera que la potenciación de la fluorescencia para células cultivadas en presencia frente a ausencia de un aminoácido no natural represente un límite inferior para la fidelidad de la incorporación de aminoácido no natural, ya que la competición de aminoácidos no naturales por unirse por una variante de sintetasa desarrollada reduciría la unión de aminoácidos naturales. Además, aunque es claramente deseable una alta fidelidad, probablemente existe una compensación entre la fidelidad y la actividad sintetasa global, que puede depender de la aplicación deseada.

Generalidad de la evolución de aminoacil ARNt sintetasa. Los resultados previos y aquellos aquí presentados demuestran que el bolsillo de unión a la cadena lateral del aminoácido de la TyrRS de M. jannaschii es bastante maleable. La enzima puede desarrollarse para que acomode una diversidad de funcionalidades en lugar de la cadena lateral fenol de tirosina y puede hacerse con alta selectividad. En esta aplicación se demostró que la enzima puede desarrollar para que acomode una funcionalidad amina, isopropilo, o alil éter en la posición para del anillo de tirosina, en lugar de hidroxilo. No fue posible identificar una enzima variante que pudiera aceptar el aminoácido no natural pCF. Un segundo intento por desarrollar una sintetasa para que aceptara el aminoácido pCF también fue insatisfactorio. Usando análisis LC/MS, no pudo detectarse pCF tras la toluenización de células de E. coli cultivadas en presencia del aminoácido no natural, lo que sugiere que pCF no se transporta al interior de las células o que se metaboliza tras su entrada.

De los tres experimentos satisfactorios de evolución aquí descritos, solamente la evolución de la OAT-RS provocó la identificación de más de un clon activo. La evolución de la OAT-RS también fue el experimento que produjo la variante más activa de sintetasa. Estos resultados sugieren que algunas especificidades de aminoácido pueden ser más fáciles de seleccionar que otras. Esto podría deberse, en parte, a la dificultad relativa del reconocer de forma selectiva diferentes aminoácidos no naturales en el contexto de los 20 aminoácidos naturales. Puede ser, por ejemplo, que pAF, debido a sus similitudes estructurales y electrónicas con tirosina, sea más difícil de reconocer selectivamente que OAT. Esto explicaría porqué se identificó una mayor cantidad de clones OAT-RS que clones pAF-RS y porqué el clon pAF-RS es menos activo que el mejor clon OAT-RS.

Construcción del plásmido. El plásmido pREP (Figura 17a) se construyó por inserción de un fragmento de PCR solapante BamHI/ApaLI que contenía el gen de la ARN polimerasa T7 cadena arriba de una región de terminación de la transcripción rrnB, seguido de un fragmento de PCR solapante ApaLI/AhdI que contenía el gen araC y la región promotora ara del plásmido pBAD/Myc-His A (Invitrogen; para el control de la transcripción del gen de la ARN polimerasa T7) y el gen de GFPuv (Clontech; cadena arriba de la región terminadora de T7 y cadena abajo del promotor de T7) entre los sitios AhdI/BamHI del plásmido pACYC177 (New England Biolabs). Los plásmidos pREP(1-12) se construyeron por remplazo de un fragmento HpaI/ApaLI de la ARN polimerasa T7 con fragmentos de PCR solapantes que contenían mutaciones ámbar en las posiciones descritas. El plásmido pREP/YC-JYCUA se construyó por ligamiento de un fragmento AfeI/SacII de pREP(10) y un fragmento EarI(romo)/SacII de pYC-J17 (Wang, L, Brock, A., Herberich, B. y Schultz, P. G., Science, 2001, 292, 498-500). La construcción deseada se identificó después de su introducción por transformación en células que contenían el plásmido pQ seleccionando por fluorescencia.

El plásmido pQ se construyó por triple ligamiento de un fragmento de PCR solapante AatII/SalI que contenía la ScQRS cadena abajo de la región promotora de lac y cadena arriba de la región de terminación de QRS de E. coli, un fragmento de PCR solapante SalI/AvaI que contenía el ARNt(CUA)Gln de S. cerevisiae cadena abajo de la región promotora de lpp y cadena arriba de una región de terminación rrnC, y el fragmento AvaI/AatII de pBR322 (New England Biolabs). El plásmido pQD se construyó por remplazo del fragmento pQ entre BamHI y BglII con un fragmento BamHI/BglII de la ScQRS mutante (D291A).

5 El plásmido pBAD/JYAMB-4TAG se construyó por inserción de un fragmento de PCR del mutante S4Amber de mioglobina, que contenía una marca 6His C-terminal, en el plásmido pBAD/YC-JYCUA, un híbrido del plásmido pYC-J17 (Wang, L, Brock, A., Herberich, B. y Schultz, P. G., Science, 2001, 292, 498-500) y pBAD/Myc-His A (Invitrogen) que contenía el gen para MjYARNtCUA, y el promotor de pBAD y las regiones de clonación para la expresión heteróloga de un gen insertado.

Análisis fluorimétricos y citométricos. Se usaron colonias individuales que contenían plásmidos deseados para inocular cultivos GMML de 2 ml que contenían los antibióticos apropiados, arabinosa al 0,002 %, y un aminoácido no natural apropiado, si se desea. Los cultivos se cultivaron hasta saturación y las células (200 %l) se sedimentaron y

15 resuspendieron en 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Las concentraciones celulares se analizaron por absorbancia a 600 nm y los niveles de fluorescencia se midieron a 505 nm con excitación a 396 nm usando un fluorímetro FluoroMax-2. Las células suspendidas en PBS se analizaron citométricamente. Para evaluar la permisividad de las posiciones ámbar dentro del gen de la polimerasa T7 de pREP(10), el plásmido indicador se introdujo por transformación en un panel de cepas supresoras, que se analizaron posteriormente de forma fluorimétrica.

Evolución de variantes de aminoacil-ARNt sintetasa. Se introdujeron por transformación variantes de TyrRS de

M. jannaschii aleatorizadas en las posiciones Y32, E107, D158, I159, y L162 (Wang, L, Brock, A., Herberich, B. y Schultz, P. G., Science, 2001, 292, 498-500) en células DH10B de E. coli (Life Technologies) que contenían 25 pREP/YC-JYCUA para generar una biblioteca con una diversidad de ~109. Se permitió que los transformantes se recuperaran en medio SOC durante 60 min. a 37 ºC, y se cultivaron hasta saturación en medio LB. Para comenzar una selección positiva inicial, se usaron 2 ml del cultivo de biblioteca, sedimentados y resuspendidos en medio GMML, para inocular 500 ml de GMML que contenía 25 %g/ml de tetraciclina (Tet), 35 %g/ml de kanamicina (Kn), y pIF, pAF, pCF, u OAY 1 mM. Después de incubación durante 3 horas a 37 ºC, se añadió Cm a una concentración final de 75 %g/ml y las células se cultivaron hasta saturación (-48 horas). Para la segunda selección positiva, se inoculó un cultivo GMML de de 100 ml que contenía Tet, Kn, 75 %g/ml de Cm, y pIF, pAF, pCF, u OAY 1 mM con células de la selección positiva inicial (500 %l) y se cultivaron hasta saturación a 37 ºC (~24-36 horas). En la preparación para la selección negativa, se inoculó un cultivo GMML de 25 ml que contenía Tet, Kn, y arabinosa (Ara) al 0,02 % con células de la segunda selección positiva (100 %l, sedimentadas y resuspendidas en GMML) y se 35 cultivaron hasta saturación a 37 ºC (-24 horas). Las células inducidas con Ara cultivadas en ausencia de aminoácidos no naturales (1 ml) se sedimentaron y resuspendieron en 3 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Las células se clasificaron para la ausencia de expresión de GFPuv usando un clasificador celular BDIS FACVantage TSO con un láser de iones Coherent Enterprise II con excitación a 351 nm y emisiones detectadas usando un filtro paso-banda de 575/25 nm. Las células recogidas se diluyeron en al menos 10 volúmenes de LB, que contenía Tet y Kn, y se cultivaron hasta saturación. Para comenzar la tercera ronda de selección positiva, se sedimentaron 100 %l de células de la selección negativa, se resuspendieron en GMML, y se usaron para inocular 25 ml de GMML que contenía Tet, Kn, y pIF, pAF, pCF, u OAY 1 mM. Después de incubación durante 3 horas a 37 ºC, se añadió Cm a una concentración final de 75 %g/ml y las células se cultivaron hasta saturación (-24 horas). Después de la tercera selección positiva, las células se sembraron en placas de GMML/agar

45 que contenían Tet, Kn, Ara al 0,002 %, 0, 75, o 100 %g/ml de Cm, y pIF, pAF, pCF, u OAY 0 ó 1 mM, y se cultivaron durante 48 horas a 37 ºC.

Expresión y caracterización de proteínas que contienen aminoácido no natural. Se usaron células DH10B cotransformadas con pBAD/JYAMB-4TAG y el plásmido pBK apropiado para inocular un cultivo de inicio de 100 ml de GMML que contenía Kn y Tet, que se cultivó hasta saturación. Se inoculó un cultivo de 500 ml que contenía Kn, Tet, Ara al 0,002 %, FeCl3 5 mM, y el aminoácido no natural deseado (o ninguno) con 50 ml del cultivo de inicio y se cultivó hasta saturación (~18 horas). Los cultivos se sedimentaron, sonicaron, y se aisló la proteína mioglobina de acuerdo con el protocolo del kit de purificación de marca His QiaExpressionist (Qiagen). Las proteínas se analizaron electroforéticamente en un gel de SDS poliacrilamida con gradiente del 12-20 % y por espectrometría de masas por

55 electronebulización.

Ejemplo 9 -Par ortogonal de ARNt/treonil-ARNt sintetasa

Este ejemplo ilustra la generación de un par ortogonal de ARNt/treonil-ARNt sintetasa. La Figura 27 ilustra una treonil-ARNt sintetasa de Thermus thermophilus. Esta sintetasa tiene dos dominios de edición N-terminales, un dominio catalítico y un dominio de unión a anticodón C-terminal (659 aminoácidos). Para generar la sintetasa ortogonal basada en la sintetasa de T. thermophilus, se delecionó el dominio o dominio de edición, N1 o N1 y N2 de la sintetasa para generar una ThrRS N-truncada de T. thermophilus (475 aminoácidos). Esta sintetasa tiene la misma actividad catalítica pero carece de la actividad de corrección. La sintetasa N-truncada se exploró para su actividad. La sintetasa N-truncada no aminoacilaba ARNt de Escherichia coli. Como se descubrió que el ARNtThr de T. thermophilus era un sustrato para la treonil-ARNt sintetasa de Escherichia coli, se mutó el ARNtThr de T. thermophilus para generar un par ortogonal. La Figura 28 ilustra las mutaciones hechas en el ARNt. Específicamente, se mutó C2G71 en A2U71. Experimentos de carga in vitro demuestran que

5 este mutante no es un sustrato para la treonil-ARNt sintetasa de E. coli pero es un buen sustrato para la treonil-ARNt sintetasa de T. thermophilus. También se construyó otro mutante, que incluía las siguientes mutaciones: C2G71 ( A2U71 y G34G35U36 ( C34G35U36 para generar un ARNt supresor ámbar. También se generaron otros ARNt mutantes con bucles anticodón modificados además de C2G7 ( A2U7 para suprimir codones de tres y cuatro bases tales como TGA, ACCA, ACAA, AGGA, CCCT, TAGA, y CTAG. Todos estos ARNt no eran tan buenos sustratos

10 como el ARNtThr de tipo silvestre (con A2U71) pero pueden mejorarse mutando el sitio de unión al anticodón de la treonil-ARNt sintetasa de T. thermophilus.

Ejemplo 10-Secuencias de O-ARNt y O-RS ejemplares.

15 Los O-ARNt ejemplares comprenden un ácido nucleico que comprende una secuencia polinucleotídica seleccionada entre el grupo que consiste en: SEC ID Nº 1-3 y/o una secuencia polinucleotídica complementaria de las mismas. Véase, la Tabla 5, Apéndice 1. Asimismo, las O-RS ejemplares incluyen polipéptidos seleccionados entre el grupo que consiste en: un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEC ID Nº 35-66 y un polipéptido codificado por un ácido nucleico que comprende una secuencia

20 polinucleotídica seleccionada entre el grupo que consiste en: SEC ID Nº 4-34 y una secuencia polinucleotídica complementaria de las mismas.

SEC ID Nº

Apéndice 1: Tabla 5: Secuencias Notas ARNt o RS

1

mARNtTyrCUA de M. jannaschii ARNt

2

HLAD03; un ARNt supresor ámbar optimizado ARNt

3

HL325A; un ARNt supresor de desplazamiento de fase AGGA optimizado ARNt

4

TyrRS mutante (LWJ16) RS

5

p-iPr-PheRS RS

6

p-NH2-PheRS(l) RS

7

p-NH2-PheRS(2) RS

8

p-NH2-PheRS(3a) RS

9

p-NH2-PheRS(3b) RS

10

O-Alil-TyrRS(1) RS

11

O-Alil-TyrRS(3) RS

12

O-Alil-TyrRS(4) RS

13

p-Br-PheRS RS

14

p-Az-PheRS(1) RS

15

p-Az-PheRS(3) RS

16

p-Az-PheRS(5) RS

17

Sintetasas mutantes para incorporar m-acil fenilalanina en proteínas (cetona 3-4) RS

18

Sintetasa mutante para incorporar m-acil fenilalanina en proteínas (cetona 3-7) RS

19

Sintetasa mutante para incorporar m-acil fenilalanina en proteínas (cetona 4-1) RS

20

Sintetasa mutante para incorporar m-acil fenilalanina en proteínas (cetona 5-4) RS

21

Sintetasa mutante para incorporar m-acil fenilalanina en proteínas (cetona 6-8) RS

22

Sintetasa mutante para incorporar m-metoxi fenilalanina en proteínas (OMe 1-6) RS

23

Sintetasa mutante para incorporar m-metoxi fenilalanina en proteínas (OMe 1-8) RS

24

Sintetasa mutante para incorporar m-metoxi fenilalanina en proteínas (OMe 2-7) RS

25

Sintetasa mutante para incorporar m-metoxi fenilalanina en proteínas (OMe 4-1) RS

26

Sintetasa mutante para incorporar m-metoxi fenilalanina en proteínas (OMe 4-8) RS

27

Sintetasa mutante para incorporar p-O-alil tirosina en proteínas (Alilo) RS

28

Aminoacil ARNt sintetasa para la incorporación de pbenzail-L-fenilalanina (p-BpaRS(H6)) RS

29

Aminoacil ARNt sintetasa para la incorporación de pazido-fenilalanina (pAz-PheRS(3)) RS

30

Aminoacil ARNt sintetasa para la incorporación de pazido-fenilalanina (pAz-PheRS(6)) RS

31

Aminoacil ARNt sintetasa para la incorporación de pazido-fenilalanina (pAz-PheRS(20) RS

32

Aminoacil ARNt sintetasa para la incorporación de pazido-fenilalanina (pAz-PheRS(24)) RS

33

Leucil ARNt-sintetasa de Archaeoglobus fulgidus KFLRS) RS

34

Leucil ARNt-sintetasa de Methanobacterium thermoautotrophicum (MtLRS) RS

35

TyrRS mutante (LWJ16) RS

36

TyrRS (SS12) RS

37

p-iPr-PheRS RS

38

p-NH2-PheRS(1) RS

39

p-NHZ-PheRS(2) RS

40

p-NH2-PheRS(3a) RS

41

p-NH2-PheRS(3b) RS

42

O-Alil-TyrRS(1) RS

43

O-Alil-TyrRS(3) RS

44

O-Alil-TyrRS(4) RS

45

p-Br-PheRS RS

46

p-Az-PheRS(1) RS

47

p-Az-PheRS(3) RS

48

p-Az-PheRS(5) RS

49

Sintetasa mutante para incorporar m-acil fenilalanina en proteínas (Cetona 3-4) RS

50

Sintetasa mutante para incorporar m-acil fenilalanina en proteínas (Cetona 3-7) RS

51

Sintetasa mutante para incorporar m-acil fenilalanina en proteínas (Cetona 4-1) RS

52

Sintetasa mutante para incorporar m-acil fenilalanina en proteínas (Cetona 5-4) RS

53

Sintetasa mutante para incorporar m-acil fenilalanina en proteínas (Cetona 6-8) RS

54

Sintetasa mutante para incorporar m-metoxi fenilalanina en proteínas (OMe 1-6) RS

55

Sintetasa mutante para incorporar m-metoxi fenilalanina en proteínas(OMe 1-8) RS

56

Sintetasa mutante para incorporar m-metoxi fenilalanina en proteínas (OMe 2-7) RS

57

Sintetasa mutante para incorporar m-metoxi fenilalanina en proteínas (OMe 4-1) RS

58

Sintetasa mutante para incorporar m-metoxi fenilalanina en proteínas (OMe 4-8) RS

59

Sintetasa mutante para incorporar p-O-alil tirosina en proteínas (Alilo) RS

60

Aminoacil ARNt sintetasa para la incorporación de pbenzoil-L-fenilalanina (p-BpaRS(H6)) RS

61

Aminoacil ARNt sintetasa para la incorporación de pazido-fenilalanina (pAz-PheRS(3)) RS

62

Aminoacil ARNt sintetasa para la incorporación de pazido-fenilalanina (pAz-PheRS(6)) RS

63

Aminoacil ARNt sintetasa para la incorporación de pazido-fenilalanina (pAz-PheRS(20)) RS

64

Aminoacil ARNt sintetasa para la incorporación de pazido-fenilalanina (pAz-PheRS(24)) RS

65

Leucil ARNt-sintetasa de Archaeoglobus fulgidus (AFLRS) RS

66

Leucil ARNt-sintetasa de Methanobacterium thermoautotrophicum (MtLRS) RS

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> The Scripps Research Institute 5

<120> Métodos y composiciones para la producción de pares ortogonales de ARNt-aminoacil-ARNt sintetasa

<130> SJK/FP6628846 10 <140> EP TBC

<141>

<150> EP 02731454.1

<151> 15

<150> PCT/US 02/12635

<151>

<150> US 60/285.030 20 <151>

<150> US 60/355.514

<151>

<160> 108

<170> PatentIn versión 3.1 5 <210> 1

<211> 77

<212> ADN

<213> Methanococcus jannaschii 10 <400> 1

<210> 2 15 <211> 88

<212> ADN

<213> Halobacterium sp. NRC-1

<400> 2 20

<210> 3

<211> 89

<212> ADN

<213> Halobacterium sp. NRC-1

<400> 3

<210> 4

<211> 921

<212>

ADN 35 <213> Methanococcus jannaschii

<400> 4

<210> 5

<211> 917

<212> ADN

<213> Methanococcus jannaschii

<400> 5

<210> 6

<211> 917

<212> ADN

<213> Methanococcus jannaschii

<400> 6

<210> 7

<211> 917

<212>

ADN 15 <213> Methanococcus jannaschii

<400> 7

<210> 8

<211> 917

<212> ADN

<213> Methanococcus jannaschii

<400> 8

<210> 9

<211> 917

<212> ADN

<213> Methanococcus jannaschii

<400> 9

<210> 10

<211> 917

<212> ADN

<213> Methanococcus jannaschii

<400> 10

<210> 11

<211> 917

<212> ADN

<213> Methanococcus jannaschii

<400> 11

<210> 12

<211> 917

<212> ADN

<213> Methanococcus jannaschii

<400> 12

<210> 13

<211> 917

<212>

ADN 15 <213> Methanococcus jannaschii

<400> 13

<210> 14

<211> 917

<212> ADN

<213> Methanococcus jannaschii

<400> 14

<210> 15

<211> 917

<212> ADN

<213> Methanococcus jannaschii

<400> 15

<210> 16

<211> 917

<212> ADN

<213> Methanococcus jannaschii

<400> 16

<210> 17

<211> 921

<212> ADN

<213> Methanococcus jannaschii

<400> 17

<210> 18

<211> 921

<212>

ADN 15 <213> Methanococcus jannaschii

<400> 18

5 <210> 19

<211> 921

<212> ADN

<213> Methanococcus jannaschii

10 <400> 19

<210> 20

<211> 921

<212> ADN

<213> Methanococcus jannaschii

<400> 20

<210> 21

<211> 921

<212> ADN

<213> Methanococcus jannaschii

<400> 21

<210> 22

<211> 921

<212> ADN

<213> Methanococcus jannaschii

<400> 22

<210> 23

<211> 921

<212> ADN

<213> Methanococcus jannaschii

<400> 23

<210> 24

<211> 921

<212> ADN 15 <213> Methanococcus jannaschii

<400> 24

<210> 25

<211> 921

<212> ADN

<213> Methanococcus jannaschii

<400> 25

<210> 26

<211> 921

<212> ADN

<213> Methanococcus jannaschii

<400> 26

<210> 27

<211> 921

<212> ADN

<213> Methanococcus jannaschii

<400> 27

<210> 28

<211> 917

<212> ADN

<213> Methanococcus jannaschii

<400> 28

<210> 29

<211> 917

<212> ADN

<213> Methanococcus jannaschii

<400> 29

<210> 30

<211> 917

<212> ADN

<213> Methanococcus jannaschii

<400> 30

<210> 31

<211> 917

<212> ADN

<213> Methanococcus jannaschii

<400> 31

<210> 32

<211> 917

<212> ADN

<213> Methanococcus jannaschii

<400> 32

<210> 33

<211> 2799

<212> ADN

<213> Archaeoglobus fulgidus

<400> 33

<210> 34

<211> 2814

<212> ADN

<213> Methanobacterium thermoautotrophicum

<400> 34

<210> 35

<211> 306

<212> PRT

<213> Methanococcus jannaschii

<400> 35

<210> 36

<211> 255

<212> PRT

<213> Methanococcus jannaschii

<400> 36

<210> 37

<211> 306

<212> PRT

<213> Methanococcus jannaschii

<400> 37

<210> 38

<211> 306

<212> PRT

<213> Methanococcus jannaschii

<400> 38

<210> 39

<211> 306

<212> PRT

<213> Methanococcus jannaschii

<400> 39

<210> 40

<211> 306

<212> PRT

<213> Methanococcus jannaschii

<400> 40

<210> 41

<211> 306

<212> PRT

<213> Methanococcus jannaschii

<400> 41

<210> 42

<211> 306

<212> PRT

<213> Methanococcus jannaschii

<400> 42

<210> 43

<211> 306

<212> PRT

<213> Methanococcus jannaschii

<400> 43

<210> 44

<211> 306

<212> PRT

<213> Methanococcus jannaschii

<400> 44

<210> 45

<211> 306

<212> PRT

<213> Methanococcus jannaschii

<400> 45

<210> 46

<211> 306

<212> PRT

<213> Methanococcus jannaschii

<400> 46

<210> 47

<211> 306

<212> PRT

<213> Methanococcus jannaschii

<400> 47

<210> 48

<211> 306

<212> PRT

<213> Methanococcus jannaschii

<400> 48

<210> 49

<211> 306

<212> PRT

<213> Methanococcus jannaschii

<400> 49

<210> 50

<211> 306

<212> PRT

<213> Methanococcus jannaschii

<400> 50

<210> 51

<211> 306

<212> PRT

<213> Methanococcus jannaschii

<400> 51

<210> 52

<211> 306

<212> PRT

<213> Methanococcus jannaschii

<400> 52

<210> 53

<211> 306

<212> PRT

<213> Methanococcus jannaschii

<400> 53

<210> 54

<211> 306

<212> PRT

<213> Methanococcus jannaschii

<400> 54

<210> 55

<211> 306

<212> PRT

<213> Methanococcus jannaschii

<400> 55

<210> 56

<211> 306

<212> PRT

<213> Methanococcus jannaschii

<400> 56

<210> 57

<211> 306

<212> PRT

<213> Methanococcus jannaschii

<400> 57

<210> 58

<211> 306

<212> PRT

<213> Methanococcus jannaschii

<400> 58

<210> 59

<211> 306

<212> PRT

<213> Methanococcus jannaschii

<400> 59

<210> 60

<211> 306

<212> PRT

<213> Methanococcus jannaschii

<400> 60

<210> 61

<211> 306

<212> PRT

<213> Methanococcus jannaschii

<400> 61

<210> 62

<211> 306

<212> PRT

<213> Methanococcus jannaschii

<400> 62

<210> 63

<211> 306

<212> PRT

<213> Methanococcus jannaschii

<400> 63

<210> 64

<211> 306

<212> PRT

<213> Methanococcus jannaschii

<400> 64

<210> 65

<211> 932

<212> PRT

<213> Archaeoglobus fulgidus

<400> 65

<210> 66

<211> 937

<212> PRT

<213> Methanobacterium thermoautotrophicum

<400> 66

<210> 67

<211> 30

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota = "Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido sintético."

<400> 67 atgcatgctg cattaatgaa tcggccaacg 30

<210> 68

<211> 27

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota = "Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido sintético."

<400> 68 tccccgcgga ggtggcactt ttcgggg 27

<210> 69

<211> 28

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota = "Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido sintético."

<400> 69 ggaattccat taggacgaat ttgaaatg 28

<210> 70

<211> 33

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota = "Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido sintético."

<400> 70 aaactgcagt tataatctct ttctaattgg ctc 33

<210> 71

<211> 10

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota = "Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido sintético."

<400> 71 aaaactgcag 10

<210> 72

<211> 10

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota = "Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido sintético."

<400> 72 aaaactgcag 10

<210> 73

<211> 28

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota = "Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido sintético."

<400> 73 ggaattccat atggacgaat ttgaaatg 28

<210> 74

<211> 69

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota = "Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido sintético."

<220>

<221> misc_feature

<222> (30)..(31)

<223> N=A+T+G+C

<400> 74

<210> 75

<211> 27

<212> ADN

<213> Artificial

<220> <221> fuente

<223> /nota = "Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido sintético."

<400> 75 taggttttga accaagtggt aaaatac 27

<210> 76

<211 > 62

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota = "Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido sintético."

<220>

<221> misc_feature

<222> (33)..(34)

<223> N=A+T+G+C

<400> 76

<210> 77

<211> 30

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota = "Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido sintético."

<400> 77 tccagcttga taaggattat acactgaatg 30

<210> 78

<211> 69

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota = "Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido sintético."

<220>

<221> misc_feature

<222> (29)..(30)

<223> N=A+T+G+C

<220>

<221> misc_feature

<222> (38)..(39)

<223> N=A+T+G+C

<220>

<221> misc_feature 222> (41)..(42)

<223> N=A+T+G+C

<400> 78

<210> 79

<211> 26

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota = "Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido sintético."

<400> 79 gcgttgatgt tgcagttgga gggatg 26

<210> 80

<211> 4

<212> PRT

<213> Methanococcus jannaschii

<400> 80

<210> 81

<211> 13

<212> PRT

<213> Methanococcus jannaschii

<400> 81

<210> 82

<211> 13

<212> PRT

<213> Methanococcus jannaschii

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(5)

<223> cualquiera

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (8)..(8)

<223> cualquiera

<400> 82

<210> 83

<211> 13

<212> PRT

<213> Methanococcus jannaschii

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(5)

<223> cualquiera

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (8)..(8)

<223> cualquiera

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (13)..(13)

<223> cualquiera

<400> 83

<210> 84

<211> 13

<212> PRT

<213> Methanococcus jannaschii

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> cualquiera

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

<223> cualquiera

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (13)..(13)

<223> cualquiera

<400> 84

<210> 85

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota = "Descripción de la secuencia artificial: secuencia consenso de selección de pentafluorofenilalanina

<400> 85

<210> 86

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<221> fuente

<223> /nota = "Descripción de la secuencia artificial: secuencia consenso de selección de pentafluorofenilalanina

<400> 86

<210> 87 5 <211> 44

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 87 10

<210> 88 15 <211> 39

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 88 20

<210> 89

<211> 39

<212> PRT

<213> Methanococcus jannaschii

<400> 89

<210> 90

<211> 77

<212> ARN

<213> Methanococcus jannaschii

<220>

<221> misc_feature

<222> (33)..(34)

<223> cualquiera

<220>

<221> misc_feature

<222> (38)..(39)

<223> cualquiera

<400> 90

<210> 91

<211> 77

<212> ARN

<213> Methanococcus jannaschii

<220>

<221> misc_feature

<222> (16)..(18)

<223> cualquiera

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(21)

<223> cualquiera

<220>

<221> misc_feature

<222> (33)..(33)

<223> cualquiera

<220>

<221> misc_feature

<222> (38)..(39)

<223> cualquiera

<220>

<221> misc_feature

<222> (46)..(46)

<223> cualquiera

<220>

<221> misc_feature

<222> (48)..(48)

<223> cualquiera

<220>

<221> misc_feature

<222> (60)..(61)

<223> cualquiera

<400> 91 <210> 92

<211> 77

<212> ADN

<213> Methanococcus jannaschii

<400> 92

<210> 93

<211> 77

<212> ADN

<213> Methanococcus jannaschii

<400> 93

<210> 94

<211> 77

<212> ADN

<213> Methanococcus jannaschii

<400> 94

<210> 95

<211> 77

<212> ADN

<213> Methanococcus jannaschii

<400> 95

<210> 96

<211> 77

<212> ADN

<213> Methanococcus jannaschii

<400> 96

<210> 97

<211> 77

<212> ADN

<213> Methanococcus jannaschii

<400> 97

<210> 98

<211> 77

<212> ADN

<213> Methanococcus jannaschii

<400> 98

<210> 99

<211> 77

<212> ADN

<213> Methanococcus jannaschii

<400> 99

<210> 100

<211> 77

<212> ADN

<213> Methanococcus jannaschii

<400> 100

<210> 101

<211> 77

<212> ADN

<213> Methanococcus jannaschii

<400> 101

<210> 102

<211> 77

<212> ADN

<213> Methanococcus jannaschii

<400> 102 <210> 103

<211> 77

<212> ADN

<213> Methanococcus jannaschii

<400> 103

<210> 104

<211> 88

<212> ADN

<213> Halobacterium sp. NRC-1

<400> 104

<210> 105

<211> 89

<212> ADN

<213> Halobacterium sp. NRC-1

<400> 105

<210> 106

<211> 76

<212> ARN

<213> Thermus thermophilus

<400> 106

<210> 107

<211> 76

<212> ARN

<213> Thermus thermophilus

<400> 107

<210> 108

<211> 76

<212> ARN

<213> Thermus thermophilus

<400> 108

Claims (4)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un par de aminoacil ARNt sintetasa y ARNt, que dirige la incorporación de un aminoácido no natural en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido, donde la aminoacil ARNt sintetasa presenta selectividad por el aminoácido no natural en comparación con cualquiera de los veinte aminoácidos comunes, dicho ARNt es específico para un codón de parada ámbar en el ARNm que codifica el polipéptido y la aminoacil ARNt sintetasa aminoacila el ARNt con el aminoácido no natural, donde dicho aminoácido no natural se selecciona entre el grupo que consiste en: para acetil fenilalanina, para amino fenilalanina y para nitro fenilalanina, y donde la aminoacil ARNt sintetasa se puede obtener mediante un método que comprende: crear una biblioteca de aminoacil ARNt sintetasas mutadas de Methanococcus jannaschii; seleccionar positivamente de la biblioteca de aminoacil ARNt sintetasas mutadas de Methanococcus jannaschii miembros que aminoacilen dicho ARNt en presencia de dicho aminoácido no natural y un aminoácido natural, proporcionando de este modo una reserva de aminoacil ARNt sintetasas mutadas activas de Methanococcus jannaschii; seleccionar negativamente de la reserva de aminoacil ARNt sintetasas mutadas activas de Methanococcus jannaschii aminoacil ARNt sintetasas mutantes de Methanococcus jannaschii que aminoacilen dicho ARNt en ausencia del aminoácido no natural; y obtener de este modo la aminoacil ARNt sintetasa que aminoacila preferentemente dicho ARNt con dicho aminoácido no natural.

2. 2.

   El par de aminoacil ARNt sintetasa y ARNt de la reivindicación 1, donde el aminoácido no natural no es un sustrato para otras sintetasas.

3. 3.

   Una célula que comprende el par de aminoacil ARNt sintetasa y ARNt de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2.

4. 4.

   La célula de la reivindicación 3, donde el aminoácido no natural no es un sustrato para sintetasas endógenas de la célula.

   (cribado -)

   (cribado +)