ES2440482T3

ES2440482T3 - Conjugados de PSMA-anticuerpo-fármaco

Info

Publication number: ES2440482T3
Application number: ES06785283.0T
Authority: ES
Inventors: Dangshe Ma; Paul J. Maddon; William C. Olson; Svetlana O. Doronina; Brian E. Toki; Peter D. Senter
Original assignee: PSMA Development Co LLC
Current assignee: PSMA Development Co LLC
Priority date: 2005-06-20
Filing date: 2006-06-20
Publication date: 2014-01-29
Anticipated expiration: 2026-06-20
Also published as: AU2006262231A1; KR20140084242A; WO2007002222A2; CN103127523A; HK1116697A1; CA2612762A1; JP2013100314A; JP2008546792A; US20070160617A1; CA2612762C; JP2015187117A; EP1912677A2; US20210023094A1; WO2007002222A3; CN101287498A; JP6063747B2; KR20080031296A; EP1912677B1; AU2006262231B2; DK1912677T3

Abstract

Un conjugado anticuerpo-fármaco, que comprende: un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une un antígeno prostático específico demembrana (PSMA), conjugado a monometilauristatina norefedrina o monomentilauristatina fenilalanina, en dondeel conjugado anticuerpo-fármaco tiene una selectividad por células PC3 a células C4-2 o LNCaP de al menos 250,y 3 ó 4 moléculas de monometilauristatina norefedrina o monomentilauristatina fenilalanina están conjugadas alanticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo.

Description

Conjugados de PSMA-anticuerpo-fármaco

Campo de la invención

Esta invención se refiere, en general, a conjugados anticuerpo-fármaco (ADCs – siglas en inglés). En particular, la invención se refiere a ADCs que comprenden un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a un antígeno prostático específico de membrana (PSMA – siglas en inglés) y está conjugado a monometilauristatin norefredina (MMAE – siglas en inglés) o monometilauristatin fenilalanina (MMAF – siglas en inglés). El conjugado anticuerpo-fármaco tiene una selectividad por células PC-3™ a células C4-2 o LNCaP™ de al menos 250. La invención también se refiere, en parte, a composiciones de los ADCs. Los métodos proporcionados incluyen, por ejemplo, métodos para tratar una enfermedad mediada por PSMA.

Antecedentes de la invención

El cáncer de próstata es el cáncer más común y la segunda causa destacada de fallecimientos por cáncer en el hombre en los Estados Unidos de América (Jemal A, et al., CA Cancer J Clin 2005; 55:10-30). El cáncer de próstata localizado es tratado típicamente con cirugía o radiación, y la enfermedad recurrente puede ser controlada temporalmente con la ablación de andrógenos (Klein EA, et al., Urol Clin North Am 2003; 30:315-30). Sin embargo, casi todos los carcinomas de próstata se convierten finalmente en hormona-refractarios y progresan entonces rápidamente (Denmeade SR, et al., Nat Rev Cancer 2002; 2:389-96). El cáncer de próstata hormona-refractario o andrógeno-independiente ha demostrado ser ampliamente resistente a una quimioterapia convencional. Con la excepción de un cuidado paliativo, la única quimioterapia aprobada es docetaxel en combinación con prednisona, que ofrece un beneficio de supervivencia modesto (2,4 meses) (Gulley J. et al., Am J Ther. 2004; 351: 1513-20; Petrylak DP, et al., New Engl J Med 2004; 351:1513-20). Se necesitan nuevas terapias molecularmente dirigidas.

Sumario de la invención

La invención proporcionada en esta memoria se refiere a ADCs que exhiben una selectividad particularmente elevada. En un aspecto de la invención, se proporciona un conjugado anticuerpo-fármaco que comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a PSMA y está conjugado a monometilauristatin norefredina o monometilauristatin fenilalanina, en donde el conjugado anticuerpo-fármaco tiene una selectividad por células PC-3™ a células C4-2 o LNCaP™ de al menos 250, y 3 ó 4 moléculas de monometilauristatin norefedrina o monometilauristatin fenilalanina están conjugadas al anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo. En una realización, la selectividad es al menos 500, 1000, 2500, 6000 ó 13.000. En otra realización, la selectividad es 1567, 6286 ó 13.636.

Se proporcionan en esta memoria ejemplos de anticuerpos que se pueden utilizar en las composiciones y los métodos de la invención, en algunas realizaciones. En otra realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PSMA. Todavía en otra realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a un dominio extracelular de PSMA. En una realización adicional, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a un epítopo conformacional de PSMA.

En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (i) inhibe competitivamente la unión específica de un segundo anticuerpo a su epítopo diana en PSMA, o (ii) se une a un epítopo en PSMA definido por un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en PSMA 3.7, PSMA 3.8, PSMA 3.9, PSMA 3.11, PSMA 5.4, PSMA 7.1, PSMA 7.3, PSMA 10.3, PSMA 1.8.3, PSMA A3.1.3, PSMA A3.3.1, Abgenix 4.248.2, Abgenix 4.360,3, Abgenix 4.7.1, Abgenix 4.4.1, Abgenix 4.177.3, Abgenix 4.16.1, Abgenix 4.22.3, Abgenix 4.28.3, Abgenix 4.40.2, Abgenix 4.48.3, Abgenix 4.49.1, Abgenix 4.209.3, Abgenix 4.219.3, Abgenix 4.288.1, Abgenix 4.333.1, Abgenix 4.54.1, Abgenix 4.153.1, Abgenix 4.232.3, Abgenix 4.292.3, Abgenix 4.304.1, Abgenix 4.78.1 y Abgenix

4.152.1. En otras realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a un epítopo en PSMA definido por un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en anticuerpos que comprenden (a) una cadena pesada codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende una región o regiones codificadoras de una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en secuencias de nucleótidos recogidas como SEQ ID NOs: 2-7, y (b) una cadena ligera codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende una región o regiones codificadoras de una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en

secuencias de nucleotídos recogidas como SEQ ID NOs: 8-13.

En algunas realizaciones, el segundo anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en PSMA 3.7, PSMA 3.8, PSMA 3.9, PSMA 3.11, PSMA 5.4, PSMA 7.1, PSMA 7.3, PSMA 10.3, PSMA 1.8.3, PSMA A3.1.3, PSMA A3.3.1, 5 Abgenix 4.248.2, Abgenix 4.360,3, Abgenix 4.7.1, Abgenix 4.4.1, Abgenix 4.177.3, Abgenix 4.16.1, Abgenix 4.22.3, Abgenix 4.28.3, Abgenix 4.40.2, Abgenix 4.48.3, Abgenix 4.49.1, Abgenix 4.209.3, Abgenix 4.219.3, Abgenix 4.288.1, Abgenix 4.333.1, Abgenix 4.54.1, Abgenix 4.153.1, Abgenix 4.232.3, Abgenix 4.292.3, Abgenix 4.304.1, Abgenix 4.78.1 y Abgenix 4.152.1 y anticuerpos que comprenden (a) una cadena pesada codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende una región o regiones codificadoras de una secuencia de nucleótidos

10 seleccionada del grupo que consiste en secuencias de nucleótidos recogidas como SEQ ID NOs: 2-7, y (b) una cadena ligera codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende una región o regiones codificadoras de una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en secuencias de nucleotídos recogidas como SEQ ID NOs: 8-13.

15 En otras realizaciones, el segundo anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en AB-PG1-XG1-006, AB-PG1XG1-026 y anticuerpos que comprenden (a) una cadena pesada codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende una región o regiones codificadoras de una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en secuencias de nucleótidos recogidas como SEQ ID NOs: 2 y 3, y (b) una cadena ligera codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende una región o regiones codificadoras de una secuencia de

20 nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en secuencias de nucleótidos recogidas como SEQ ID NOs: 8 y 9. En una realización, el segundo anticuerpo comprende (a) una cadena pesada codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende una región o regiones codificadoras de una secuencia de nucleótidos recogida como SEQ ID NO: 2, y (b) una cadena ligera codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende una región o regiones codificadoras de una secuencia de nucleótidos recogida como SEQ ID NO: 8. En una realización

25 adicional, el segundo anticuerpo comprende (a) una cadena pesada codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende una región o regiones codificadoras de una secuencia de nucleótidos recogida como SEQ ID NO: 3, y (b) una cadena ligera codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende una región o regiones codificadoras de una secuencia de nucleótidos recogida como SEQ ID NO: 9.

30 En algunas realizaciones, el anticuerpo del conjugado anticuerpo-fármaco es un anticuerpo codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos 90% idéntica a una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en AB-PG1-XG1-006, AB-PG1-XG1-026 y anticuerpos que comprenden (a) una cadena pesada codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende una región o regiones codificadoras de una secuencia de nucleótidos seleccionada del

35 grupo que consiste en secuencias de nucleótidos recogidas como SEQ ID NOs: 2 y 3, y (b) una cadena ligera codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende una región o regiones codificadoras de una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en secuencias de nucleótidos recogidas como SEQ ID NOs: 8 y 9. En una realización, el anticuerpo es codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos 95% idéntica. En otra realización el anticuerpo es codificado por

40 una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos 97% idéntica. Todavía en otra realización, el anticuerpo es codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos 98% idéntica. En una realización adicional, el anticuerpo es codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos 99% idéntica.

45 En otras realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de los conjugados anticuerpofármaco proporcionados en esta memoria es AB-PG1-XG1-006, AB-PG1-XG1-026 o un fragmento de unión a antígeno del mismo. Todavía en otras realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se selecciona del grupo que consiste en anticuerpos que comprenden (a) una cadena pesada codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende una región o regiones codificadoras de una secuencia de nucleótidos

50 seleccionada del grupo que consiste en secuencias de nucleótidos recogidas como SEQ ID NOs: 2 y 3, y (b) una cadena ligera codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende una región o regiones codificadoras de una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en secuencias de nucleótidos recogidas como SEQ ID NOs: 8 y 9, y fragmentos de unión a antígeno de los mismos. En una realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende (a) una cadena pesada codificada por una molécula de ácido

55 nucleico que comprende una región o regiones codificadoras de una secuencia de nucleótidos recogida como SEQ ID NO: 2, y (b) una cadena ligera codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende una región o regiones codificadoras de una secuencia de nucleótidos recogida como SEQ ID NO: 8, y fragmentos de unión a antígeno de los mismos. En otra realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende

(a) una cadena pesada codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende una región o regiones 60 codificadoras de una secuencia de nucleótidos recogida como SEQ ID NO: 3, y (b) una cadena ligera codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende una región o regiones codificadoras de una secuencia de nucleótidos recogida como SEQ ID NO: 9, y fragmentos de unión a antígeno de los mismos.

En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo es IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 5 IgM, IgA1, IgA2, IgAsec, IgD, IgE o tiene un dominio constante y/o variable de inmunoglobulina de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgAsec, IgD o IgE.

En realizaciones adicionales, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. Todavía en otras realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado. Todavía en otras realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo humano.

10 Todavía en otras realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo recombinante. En realizaciones adicionales, el anticuerpo es un anticuerpo quimérico. Todavía en realizaciones adicionales, el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico o multiespecífico. Todavía en otras realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo de cadena sencilla.

En otras realizaciones. el fragmento de unión a antígeno es un fragmento Fab, un fragmento F(ab’)2 o un

15 fragmento Fv. Todavía en otras realizaciones, el fragmento de unión a antígeno es un fragmento que contiene CDR3.

En algunas realizaciones, la monometilauristatin norefredina (MMAE) o monometilauristatin fenilalanina (MMAF) está conjugada al anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo con un compuesto de la fórmula 20 (Fórmula 1) –An-Ym-Zm-Xn-Wn-, en donde A es una unidad acilo carboxílica, Y es un aminoácido; Z es un aminoácido; X y W son cada uno un espaciador auto-inmolativo; n es un número entero de 0 ó 1; y m es un número entero de 0 ó 1, 2, 3, 4, 5 ó 6. En algunas realizaciones, el conjugado de la presente invención se representa por la fórmula (Fórmula 2): L-{An-Ym-Zm-Xn-Wn-D}p, en donde L es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a PSMA, D es MMAE o MMAF y p es un número entero de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8.

25 El resto de los componentes de los conjugados son como se definen inmediatamente antes.

En una realización, la unidad carboxílica “An” está enlazada al anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo a través de un átomo de azufre derivado del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo:

En una realización, A es

en que q es 1-10. Por lo tanto, en una realización, el conjugado de Fórmula 2 es:

en donde L, Y, Z, X, W, D, n, m, q y p son como se definen previamente.

En otra realización, A es 4-(N-succinimidometil)ciclohexano-1-carbonilo, m-succinimidobenzoílo, 4-(psuccinimidofenil)-butirilo, 4-(2-acetamido)benzoílo, 3-tiopropionilo, 4-(1-tioetil)-benzoílo, 6-(3-tiopropionilamido)hexanoílo o maleimida- caproílo. En una realización adicional, A es maleimida-caproilo.

5 En otra realización, Y es alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina, triptófano o prolina. Todavía en otra realización, Y es valina. En una realización adicional, Z es lisina, lisina protegida con acetilo o formilo, arginina, arginina protegida con tosilo o grupos nitro, histidina, ornitina, ornitina protegida con acetilo o formilo, o citrulina. Todavía en una realización adicional, Z es citrulina. En una realización, Ym-Zm es valina-citrulina. En otra

10 realización, Ym-Zm es una secuencia de proteínas que es selectivamente escindible por una proteasa.

En una realización adicional, X es un compuesto que tiene la fórmula

15 en que T es O, N o S. En otra realización, X es un compuesto que tiene la fórmula -HN-R1-COT, en que R1 es

en que T es O, N o S, R2 es H o alquilo C1-C5. En una realización, X es p-aminobencilcarbamoiloxi. En otra realización, X es alcohol p-aminobencílico. En una realización adicional, X es carbamato de p-aminobencilo. 20 Todavía en otra realización adicional, X es p-aminobenciloxicarbonilo. En otra realización, X es ácido γaminobutírico, ácido α,α-dimetil-γ-aminobutírico o ácido β,β-dimetil-γ-aminobutírico.

En algunas realizaciones, W es

en que T es O, S o N.

En otras realizaciones, m y n son 0.

30 En una realización, el conjugado anticuerpo-fármaco es AB-PG1-XG1-006-maleimida caproil-valina-citrulina-paminobenciloxicarbonil-monometilauristatin norefredina. En otra realización, el conjugado anticuerpo-fármaco es AB-PG1-XG1-006-maleimida caproil-valina-citrulina-p-aminobenciloxicarbonil-monometilauristatin fenilalanina. En una realización adicional, el conjugado anticuerpo-fármaco es AB-PG1-XG1-006-maleimida-caproilmonometilauristatin fenilalanina. En otra realización, el conjugado anticuerpo-fármaco es AB-PG1-XG1-026

35 maleimida-caproil-valina-citrulina-p-aminobenciloxicarbonil-monometilauristatin norefedrina. Todavía en otra

realización, el conjugado anticuerpo-fármaco es AB-PG1-XG1-026-maleimida-caproil-valina-citrulina-paminobenciloxicarbonil-monometilauristatin fenilalanina. En una realización adicional, el conjugado anticuerpofármaco es AB-PG1-XG1-026-maleimida-caproil- monometilauristatin fenilalanina. En otra realización, el conjugado anticuerpo-fármaco es un anticuerpo de unión a PSMA o fragmento de unión a antígeno del mismo conjugado al compuesto tal como se muestra en Fig. 6A, Fig. 6B o Fig. 6C.

En algunas realizaciones, el conjugado anticuerpo-fármaco se une a células vivas. En una realización la célula es una célula tumoral. En otra realización, la célula tumoral es una célula de tumor de próstata. En una realización adicional, la célula tumoral es una célula de la neovasculatura de un tumor no prostático. En otras realizaciones, el conjugado anticuerpo-fármaco no requiere la lisis de las células para unirse a PSMA. Todavía en otras realizaciones, el conjugado anticuerpo-fármaco conduce a una paralización del ciclo celular. Todavía en realizaciones adicionales, el conjugado anticuerpo-fármaco inhibe el crecimiento de células que expresan PSMA. En una realización el conjugado anticuerpo-fármaco media en el exterminio de células específico de células que expresan PSMA con una CI50 menor que 1X10-10 M. En otra realización, la CI50 es menor que 1X10-11 M. Todavía en otra realización, la CI50 es menor que 1X10-12 M. En una realización adicional, el conjugado anticuerpo-fármaco media en el exterminio de células específico de células que expresan PSMA con una CI50 de 11 a 208 X10-12 M. Todavía en una realización adicional, el conjugado anticuerpo-fármaco media en el exterminio de células específico de células que expresan PSMA con una CI50 de 42 a 208 X10-12 M. Todavía en una realización adicional, el conjugado anticuerpo-fármaco media en el exterminio de células específico de células que expresan PSMA con una CI50 de 60 a 208 X10-12 M. En otra realización, el conjugado anticuerpo-fármaco media en el exterminio de células específico de células que expresan PSMA con una CI50 de 65 a 208 X10-12 M. En una realización, el conjugado anticuerpo-fármaco media en el exterminio de células específico de células que expresan PSMA con una CI50 de 11X10-12 M. En otra realización, el conjugado anticuerpo-fármaco media en el exterminio de células específico de células que expresan PSMA con una CI50 de 42X10-12 M. Todavía en otra realización, el conjugado anticuerpo-fármaco media en el exterminio de células específico de células que expresan PSMA con una CI50 de 60X10-12 M. En una realización adicional, el conjugado anticuerpo-fármaco media en el exterminio de células específico de células que expresan PSMA con una CI50 de 83X10-12 M.

En otra realización, el conjugado anticuerpo-fármaco, cuando se administra a ratones con un régimen de q4d x 6 a una dosis de 6 mg/kg resulta en una tasa de curación de al menos 20%, 30%, 40% o 50%. En una realización, la tasa de curación es de 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o más. En una realización, los ratones son aquellos que son un modelo de cáncer de próstata humano andrógeno-independiente. En otra realización, los ratones son ratones inmunológicamente deficientes a los que se les han injertado intramuscularmente células C4-2 en la pata trasera izquierda. En una realización adicional, los ratones son los proporcionados en los Ejemplos.

En algunas realizaciones, el conjugado anticuerpo-fármaco está unido a un marcador. En otras realizaciones, el marcador es un marcador fluorescente, un marcador enzimático, un marcador radiactivo, un marcador activo de resonancia magnética nuclear, un marcador luminiscente o un marcador cromóforo.

En algunas realizaciones, el conjugado anticuerpo-fármaco está envasado en forma liofilizada. En otras realizaciones, el conjugado anticuerpo-fármaco está envasado en un medio acuoso. En realizaciones adicionales, el conjugado anticuerpo-fármaco está en una forma estéril.

También se proporcionan en esta memoria composiciones que comprenden uno o más conjugados anticuerpofármaco. En algunas realizaciones, la composición comprende dos o más conjugados anticuerpo-fármaco diferentes. En otras realizaciones, se proporciona una composición que comprende uno o más conjugados anticuerpo-fármaco y uno o más anticuerpos anti-PSMA no conjugados.

En algunas realizaciones, la composición comprende, además, un vehículo, excipiente o estabilizador farmacéuticamente aceptable. En otras realizaciones, la composición comprende, además, un agente antitumoral, un agente inmunoestimulador, un inmunomodulador, un corticosteroide o una combinación de los mismos. En una realización, el agente antitumoral es un agente citotóxico, un agente que actúa sobre la neovasculatura del tumor o una combinación de los mismos. En otra realización el agente antitumoral es docetaxel. Todavía en otra realización, el inmunomodulador es una citoquina, quimioquina, adyuvante o una combinación de los mismos. Todavía en otra realización, el agente inmunoestimulante es interleuquina-2, α-interferón, γ-interferón, factor α de necrosis tumoral, oligonucleótidos inmunoestimuladores o una combinación de los mismos. En una realización adicional, el corticosteroide es prednisona o hidrocortisona. En todavía una realización adicional, la composición comprende prednisona y docetaxel.

Los conjugados anticuerpo-fármaco y composiciones de la invención se pueden utilizar en una diversidad de

métodos. En una realización, el conjugado anticuerpo-fármaco es para uso en un método para inhibir el crecimiento de una célula que expresa PSMA, que comprende poner en contacto la célula que expresa PSMA con una cantidad de un conjugado anticuerpo-fármaco eficaz para inhibir el crecimiento de la célula que expresa PSMA. En otra realización, el conjugado anticuerpo-fármaco es para uso en un método para efectuar la 5 paralización del ciclo celular en una célula que expresa PSMA, que comprende poner en contacto la célula que expresa PSMA con una cantidad de un conjugado anticuerpo-fármaco eficaz para conducir a una paralización del ciclo celular en la célula que expresa PSMA. Todavía en otra realización, el conjugado anticuerpo-fármaco es para uso en un método para tratar una enfermedad mediada por PSMA, que comprende administrar a un sujeto que tiene una enfermedad mediada por PSMA una cantidad de un conjugado anticuerpo-fármaco eficaz para tratar la

10 enfermedad mediada por PSMA. En una realización adicional, el conjugado anticuerpo-fármaco es para uso en un método para inhibir el crecimiento de un tumor, que comprende poner en contacto células que expresan PSMA de la neovasculatura del tumor con una cantidad de un conjugado anticuerpo-fármaco eficaz para inhibir el crecimiento del tumor.

15 En una realización, la enfermedad mediada por PSMA es cáncer. En otra realización, el cáncer es un cáncer de próstata. Todavía en otra realización, el cáncer es un cáncer no prostático. En algunas realizaciones, el cáncer no prostático es cáncer de vejiga, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón, cáncer de riñón, sarcoma, cáncer de mama, cáncer de cerebro, carcinoma neuroendocrino, cáncer de colon, cáncer testicular o melanoma.

20 En algunas realizaciones, el método comprende, además, co-administrar otro agente terapéutico para tratar la enfermedad mediada por PSMA. En otras realizaciones, el método comprende, además, poner en contacto células que expresan PSMA con otro agente terapéutico. En algunas realizaciones, el otro agente terapéutico se ha de administrar antes, durante o después de la administración del conjugado anticuerpo-fármaco. En una realización, el otro agente terapéutico es un agente antitumoral, un agente inmunoestimulador, un inmunomodulador, un

25 corticosteroide o una combinación de los mismos. En otra realización, el agente antitumoral es un agente citotóxico, un agente que actúa sobre la neovasculatura del tumor o una combinación de los mismos. Todavía en otra realización el agente antitumoral es docetaxel. Todavía en otra realización, el inmunomodulador es una citoquina, quimioquina, adyuvante o una combinación de los mismos. Todavía en otra realización, el agente inmunoestimulante es interleuquina-2, α-interferón, γ-interferón, factor α de necrosis tumoral, oligonucleótidos

30 inmunoestimuladores o una combinación de los mismos. En una realización adicional, el corticosteroide es prednisona o hidrocortisona. En una realización, el agente terapéutico es una vacuna. En otra realización, la vacuna inmuniza al sujeto frente a PSMA. En otra realización, el método comprende, además, administrar todavía otro agente terapéutico. En una realización, el todavía otro agente terapéutico es prednisona. Por lo tanto, en una realización se administran tanto docetaxel como predinisona.

35 La célula que expresa PSMA es, en algunas realizaciones, una célula de tumor prostático o una célula de la neovasculatura de un tumor no protático. En algunas realizaciones, la célula que expresa PSMA es una célula andrógeno-dependiente o una célula andrógeno-independiente.

40 Cada una de las limitaciones de la invención puede comprender diversas realizaciones de la invención. Por lo tanto, se anticipa que cada una de las limitaciones de la invención que impliquen a cualquier elemento o combinaciones de elementos puede estar incluida en cada uno de los aspectos de la invención.

Breve Descripción de las Figuras

45 La Fig. 1 es una gráfica que muestra el porcentaje de internalización y la unión total de PSMA Acm marcado con 111In en células C4-2. Células C4-2 se incubaron con Acm marcado con 111In a 37ºC, 5% de CO2. En los instantes designados, las células se lavaron para separar el Acm no unido, y Acm unido a la superficie se separó por arrastre utilizando tampón de bajo pH. La radiactividad (recuentos por minuto (RPM)) del material eluido de bajo

50 pH y el sedimento de las células se recontó por separado utilizando un contador gamma. El porcentaje de internalización (Fig. 1A) se calculó como el RPM de sedimento de células/(RPM de sedimento de células + RPM de material eluido de bajo pH) x 100. La unión total (Fig. 1B) representa el RPM del sedimento de células más el RPM del material eluido de bajo pH.

55 La Fig. 2 es una gráfica que muestra la unión de PSMA Acm y ADC a células 3T3™-PSMA. Células 3T3™-PSMA se incubaron con concentraciones crecientes del PSMA Acm (cuadrados en negro), PSMA ADC (cuadrados en blanco) o ADC control de isotipo (triángulos abiertos). Las células se incubaron en hielo durante 1 h y se lavaron para separar el Acm o ADC no unido. Después, las células se incubaron con IgG-FITC anti-humana de cabra, se lavaron de nuevo y se examinaron mediante citometría de flujo. Las intensidades de fluorescencia media (MFIs) se

60 representan como una función de la concentración de Acm o ADC.

La Fig. 3 es una gráfica que muestra la citotoxicidad in vitro del PSMA ADC y ADC control sobre líneas de células de cáncer de próstata PSMA-positivas y PSMA-negativas. Células C4-2 PSMA-positivas (Fig. 3A) y células PC-3™ PSMA-negativas (Fig. 3B) en microplacas de 96 pocillos se expusieron a ADCs a diversas concentraciones. Al

5 cabo de 96 horas, se sometió a ensayo la supervivencia de células en cultivos tratados y no tratados utilizando azul de Alamar.

La Fig. 4 es una gráfica que muestra la supervivencia según Kaplan-Meier y los niveles de PSA en suero en un estudio de xenoinjerto. A ratones inmunológicamente deficientes se les implantaron por vía intramuscular células 10 C4-2, asignadas aleatoriamente a grupos de tratamiento (6 ratones por grupo) de acuerdo con el PSA del suero el día 17 y luego se trataron q4d x 3 con PSMA ADC o vehículo. La Fig. 4A muestra la supervivencia de animales tratados con 0 (control vehículo, línea de trazos discontinuos), 2 mg/kg (línea continua fina) y 10 mg/kg de PSMA ADC. La Fig. 4B proporciona los valores de PSA medios a lo largo de 30 días en ratones tratados con 0 (columnas en negro), 2 mg/kg (columnas a rayas) y 10 mg/kg (columnas en blanco) de PSMA ADC. Los datos para el día 30

15 para el grupo control incluyen las evaluaciones el día 27 para dos ratones que no sobrevivieron los 30 días.

La Fig. 5 muestra las curvas de supervivencia según Kaplan-Meier de animales tratados en otro estudio de xenoinjerto. A ratones inmunológicamente deficientes se les implantaron por vía intramuscular células C4-2, asignadas aleatoriamente a grupos de tratamiento (5 ratones por grupo) de acuerdo con el PSA del suero el día 14

20 y luego fueron tratados q4d x 6 con PSMA ADC y controles. Los ratones fueron tratados con 0 (control vehículo, círculos en negro), 6 mg/kg de PSMA Acm no modificado (triángulos en negro), 6 mg/kg de ADC control (triángulos en blanco), 3 mg/kg de PSMA ADC (cuadrados en blanco) y 6 mg/kg de PSMA ADC (cuadrados en negro).

La Fig. 6 muestra las estructuras químicas de tres enlazadores de fármacos diferentes. La Fig. 6A proporciona la

25 estructura de vcMMAE (maleimidocaproil-valina-citrulina-p-aminobenzoiloxicarbonil-monometilauristatina E). La Fig. 6B proporciona la estructura de vcMMAF (maleimidocaproil-valina-citrulina-p-aminobenzoiloxicarbonilmonometilauristatina F). La Fig. 6C proporciona la estructura de mcMMAF (maleimidocaproil-monometilauristatina F).

30 La Fig. 7 demuestra la citotoxicidad in vitro de PSMA ADCs (vcMMAE (Fig. 7A), vcMMAF (Fig. 7B), mcMMAF (Fig. 7C)) sobre líneas de células de cáncer de próstata PSMA-positivas (C4-2) y PSMA-negativas (PC-3™). Las células en microplacas de 96 pocillos se expusieron a ADCs a diversas concentraciones. Al cabo de 4 días, la supervivencia de células en cultivos tratados y no tratados se sometió a ensayo utilizando azul de Alamar.

35 La Fig. 8 ilustra los efectos de PSMA ADC sobre el ciclo celular. En cada uno de los paneles, el pico de la izquierda corresponde a la fase G1 y el pico de la derecha a la fase G2/M. El porcentaje de células en G2/M aumentó acusadamente tras el tratamiento con el PSMA ADC, consistente con una paralización en la división celular que se produce después de la síntesis de ADN. El PSMA ADC no afectaba al ciclo de células 3T3™ parentales.

40 La Fig. 9 muestra los resultados de una comparación de PSMA ADCs vcMMAE frente a vcMMAF.

Descripción Detallada de la Invención

45 La presente invención se refiere, en parte, al sorprendente descubrimiento de que ADCs que comprenden un anticuerpo de unión a PSMA o fragmento de unión a antígeno del mismo, conjugados a MMAE (a la que se alude también en esta memoria como monometilauristatina E y monometilauristatina norefedrina) o MMAF (a la que se alude también en esta memoria como monometilauristatina F y monometilauristatina fenilalanina) son particularmente útiles para exterminar células que expresan PSMA. Los ADCs tienen una selectividad por células

50 PC-3™ a células C4-2 o LNCaP™ de al menos 250, y 3 ó 4 moléculas de monometilauristatin norefedrina o monometilauristatin fenilalanina están conjugadas al anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, los ADCs exhiben determinados niveles de exterminio de células (de células que expresan PSMA), p. ej. valores CI50 que son o están próximos a concentraciones picomolares. En otras realizaciones, los ADCs resultan en una tasa de curación de al menos 20%, 30%, 40% o 50% en ratones tratados con el ADC, con

55 un régimen de q4d x 6 a una dosis de 6 mg/kg. Por lo tanto, se proporcionan composiciones y métodos de utilizar estos ADCs. En algunas realizaciones, los ratones son los previstos en los Ejemplos. En una realización, los ratones son aquellos que son un modelo de cáncer de próstata humano andrógeno-independiente. En otra realización, los ratones son ratones inmunológicamente deficientes a los que se les han injertado intramuscularmente células C4-2 en la pata trasera izquierda.

Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígenos de los mismos de los ADCs son cualquier anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a PSMA. En una realización, el anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo se une específicamente a PSMA (p. ej., se une específicamente a un dominio extracelular de PSMA, específicamente se une a un epítopo conformacional de PSMA, etc.) y puede inhibir 5 competitivamente la unión especifica de un segundo anticuerpo a su epítopo diana en PSMA, en donde el segundo anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en PSMA 3.7, PSMA 3.8, PSMA 3.9, PSMA 3.11, PSMA 5.4, PSMA 7.1, PSMA 7.3, PSMA 10.3, PSMA 1.8.3, PSMA A3.1.3, PSMA A3.3.1, Abgenix 4.248.2, Abgenix 4.360,3, Abgenix 4.7.1, Abgenix 4.4.1, Abgenix 4.177.3, Abgenix 4.16.1, Abgenix 4.22.3, Abgenix 4.28.3, Abgenix 4.40.2, Abgenix 4.48.3, Abgenix 4.49.1, Abgenix 4.209.3, Abgenix 4.219.3, Abgenix 4.288.1, Abgenix 4.333.1, Abgenix 10 4.54.1, Abgenix 4.153.1, Abgenix 4.232.3, Abgenix 4.292.3, Abgenix 4.304.1, Abgenix 4.78.1 y Abgenix 4.152.1 y anticuerpos que comprenden (a) una cadena pesada codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende una región o regiones codificadoras de una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en secuencias de nucleótidos recogidas como SEQ ID NOs: 2-7, y (b) una cadena ligera codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende una región o regiones codificadoras de una secuencia de 15 nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en secuencias de nucleotídos recogidas como SEQ ID NOs: 8-13. Por lo tanto, el segundo anticuerpo incluye cualquiera de los anticuerpos producidos por hibridomas o codificados por plásmidos mostrados a continuación en la Tabla 1. Estos hibridomas y plásmidos fueron depositados de acuerdo con y satisfaciendo los requisitos del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a los Fines del Procedimiento en materia de Patentes con la American Type Culture 20 Collection (“ATCC”) como Autoridad de Depósito Internacional y a los que se les dio las Designaciones de Depósito de Patente mostradas anteriormente y en la Tabla 1.

Tabla 1

Anticuerpo: Hibridoma/Plásmido Designación del Depósito de Patente Fecha de Depósito

PSMA 3.7
PSMA 3.7: PTA-3257 5 de abril de 2001

PSMA 3.9
PSMA 3.9: PTA-3258 5 de abril de 2001

PSMA 3.11
PSMA 3.11: PTA-3269 10 de abril de 2001

PSMA 5.4
PSMA 5.4: PTA-3268 10 de abril de 2001

PSMA 7.1
PSMA 7.1: PTA-3292 18 de abril de 2001

PSMA 7.3
PSMA 7.3: PTA-3293 18 de abril de 2001

PSMA 10.3: PSMA 10.3 PSMA 10.3 HC en pcADN (SEQ ID NO: 7) PSMA 10.3 kappa en pcADN (SEQ ID NO: 13) PTA-3347 PTA-4413 PTA-4414 1 de mayo de 2001 29 de mayo de 2002 29 de mayo de 2002

PSMA 1.8.3
PSMA 1.8.3: PTA-3906 5 diciembre de 2001

PSMA A3.1.3
PSMA A3.1.3: PTA-3904 5 diciembre de 2001

PSMA A3.3.1
PSMA A3.3.1: PTA-3905 5 diciembre de 2001

Abgenix 4.248.2
Abgenix 4.248.2: PTA-4427 4 de junio de 2002

Abgenix 4.360.3
Abgenix 4.360.3: PTA-4428 4 de junio de 2002

Abgenix 4.7.1
Abgenix 4.7.1: PTA-4429 4 de junio de 2002

Abgenix 4.4.1
Abgenix 4.4.1: PTA-4556 18 de julio de 2002

Abgenix 4.177.3
Abgenix 4.177.3: PTA-4557 18 de julio de 2002

Abgenix 4.16.1
Abgenix 4.16.1: PTA-4357 16 de mayo de 2002

Abgenix 4.22.3
Abgenix 4.22.3: PTA-4358 16 de mayo de 2002

Abgenix 4.28.3
Abgenix 4.28.3: PTA-4359 16 de mayo de 2002

Abgenix 4.40.2
Abgenix 4.40.2: PTA-4360 16 de mayo de 2002

Abgenix 4.48.3
Abgenix 4.48.3: PTA-4361 16 de mayo de 2002

Abgenix 4.49.1
Abgenix 4.49.1: PTA-4362 16 de mayo de 2002

Abgenix 4.209.3
Abgenix 4.209.3: PTA-4365 16 de mayo de 2002

Abgenix 4.219.3
Abgenix 4.219.3: PTA-4366 16 de mayo de 2002

Abgenix 4.288.1
Abgenix 4.288.1: PTA-4367 16 de mayo de 2002

Abgenix 4.333.1
Abgenix 4.333.1: PTA-4368 16 de mayo de 2002

Abgenix 4.54.1
Abgenix 4.54.1: PTA-4363 16 de mayo de 2002

Abgenix 4.153.1
Abgenix 4.153.1: PTA-4388 23 de mayo de 2002

Abgenix 4.232.3
Abgenix 4.232.3: PTA-4389 23 de mayo de 2002

Abgenix 4.292.3
Abgenix 4.292.3: PTA-4390 23 de mayo de 2002

Abgenix 4.304.1
Abgenix 4.304.1: PTA-4391 23 de mayo de 2002

AB-PG1-XG1-006: Cadena pesada de ABPG1-XG1-006 (SEQ ID NO: 2) Cadena ligera de AB-PG1XG1-006 (SEQ ID NO: 8) PTA-4403 PTA-4404 29 de mayo de 2002

AB-PG1-XG1-026: Cadena pesada de ABPG1-XG1-026 (SEQ ID NO: 3) Cadena ligera de AB-PG1XG1-026 (SEQ ID NO: 9) PTA-4405 PTA-4406 29 de mayo de 2002

AB-PG1-XG1-051: Cadena pesada de ABPG1-XG1-051 (SEQ ID NO: 4) Cadena ligera de AB-PG1XG1-051 (SEQ ID NO: 10) PTA-4407 PTA-4408 29 de mayo de 2002

AB-PG1-XG1-069: Cadena pesada de ABPG1-XG1-069 (SEQ ID NO: 5) Cadena ligera de AB-PG1XG1-069 (SEQ ID NO: 11) PTA-4409 PTA-4410 29 de mayo de 2002

AB-PG1-XG1-077: Cadena pesada de ABPG1-XG1-077 (SEQ ID NO: 6) Cadena ligera de AB-PG1XG1-077 (SEQ ID NO: 12) PTA-4411 PTA-4412 29 de mayo de 2002

Para determinar la inhibición competitiva, se puede emplear una diversidad de ensayos conocidos por el experto ordinario en la técnica. Por ejemplo, se pueden utilizar ensayos de competición cruzada para determinar si un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo inhibe de forma competitiva la unión a PSMA por parte de

5 otro anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo. Estos ensayos incluyen métodos basados en células que emplean la citometría de flujo o el análisis de unión en fase sólida. También se pueden utilizar otros ensayos que evalúan la capacidad de anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos para competir de forma cruzada por moléculas de PSMA que no están expresadas sobre la superficie de células, en fase sólida o en fase de disolución.

10 En algunas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígenos de los mismos inhiben competitivamente la unión específica de un segundo anticuerpo a su epítopo diana en PSMA en al menos aproximadamente un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 99%. La inhibición se puede evaluar a diversas relaciones molares o relaciones másicas; por ejemplo, se pueden realizar experimentos de

15 unión competitiva con un exceso molar de 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 7 veces, 10 veces o más de un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo frente a un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo.

En otra realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une específicamente a un epítopo

20 en PSMA definido por un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en PSMA 3.7, PSMA 3.8, PSMA 3.9, PSMA 3.11, PSMA 5.4, PSMA 7.1, PSMA 7.3, PSMA 10.3, PSMA 1.8.3, PSMA A3.1.3, PSMA A3.3.1, 4.248.2, 4.360.3, 4.7.1, 4.4.1, 4.1773, 4.16.1, 4.22.3, 4.28.3, 4.40.2, 4.48.3, 4.49.1, 4.209.3, 4.219.3, 4.288.1, 4.333.1, 4.54.1, 4.153.1, 4.232.3, 4.292.3, 4.304.1, 4.78.1 y 4.152.1. PSMA 3.7, PSMA 3.8, PSMA 3.9, PSMA 3.11, PSMA 5.4, PSMA 7.1, PSMA 7.3, PSMA 10.3, PSMA 1.8.3, PSMA A3.1.3, PSMA A3.3.1, Abgenix 4.248.2, Abgenix

25 4.360,3, Abgenix 4.7.1, Abgenix 4.4.1, Abgenix 4.177.3, Abgenix 4.16.1, Abgenix 4.22.3, Abgenix 4.28.3, Abgenix 4.40.2, Abgenix 4.48.3, Abgenix 4.49.1, Abgenix 4.209.3, Abgenix 4.219.3, Abgenix 4.288.1, Abgenix 4.333.1, Abgenix 4.54.1, Abgenix 4.153.1, Abgenix 4.232.3, Abgenix 4.292.3, Abgenix 4.304.1, Abgenix 4.78.1 y Abgenix 4.152.1, y anticuerpos que comprenden (a) una cadena pesada codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende una región o regiones codificadoras de una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que

30 consiste en secuencias de nucleótidos recogidas como SEQ ID NOs: 2-7, y (b) una cadena ligera codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende una región o regiones codificadoras de una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en secuencias de nucleótidos recogidas como SEQ ID NOs: 8-13. Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los ADCs incluyen, por lo tanto, los que se unen

específicamente a un epítopo en PSMA definidos por los anticuerpos producidos por los hibridomas o codificados por los plásmidos proporcionados antes en la Tabla 1.

Para determinar el epítopo se pueden utilizar métodos de representación en mapa de epítopos convencionales conocidos en la técnica. Por ejemplo, se pueden utilizar fragmentos (péptidos) de antígeno PSMA (p. ej. péptidos sintéticos) que unen el anticuerpo para determinar si un anticuerpo candidato o fragmento de unión a antígeno del mismo se une al mismo epítopo. Para epítopos lineales se sintetizan péptidos solapantes de una longitud definida

(p. ej. 8 o más aminoácidos). Los péptidos se pueden compensar en 1 aminoácido, de modo que se prepara una serie de péptidos que cubren cada 8 fragmentos de aminoácido de la secuencia de proteínas de PSMA. Se pueden preparar un menor número de péptidos utilizando mayores compensaciones, p. ej. de 2 ó 3 aminoácidos. Además, se pueden sintetizar péptidos mayores (p. ej. 9-, 10- u 11-meros). La unión de péptidos a anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno se puede determinar utilizando metodologías convencionales que incluyen ensayos de resonancia de plasmón superficial (BIACORE) y ELISA. Para el examen de epítopos conformacionales, se pueden utilizar fragmentos de PSMA mayores. Se han descrito y se pueden utilizar otros métodos que utilizan la espectrometría de masas para definir epítopos conformacionales (véase, p. ej., Baerga-Ortiz et al, Protein Science 11:1300-1308, 2002 y referencias citadas en el mismo). Todavía otros métodos para la determinación de epítopos se proporcionan en trabajos de referencia de laboratorio convencionales tales como Unidad 6.8 (“Phage Display Selection and Analysis of B-cell Epitopes”) y Unidad 9.8 (“Identification of Antigenic Determinants Using Synthetic Peptide Combinatorial Libraries”) de Current Protocols in Immunology, Coligan et al., comps., John Wiley & Sons. Los epítopos se pueden confirmar introduciendo mutaciones o deleciones puntuales en un epítopo conocido, y luego sometiendo a ensayo la unión con uno o más anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno para determinar qué mutaciones reducen la unión de los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno.

En realizaciones particulares, los anticuerpos de los ADCs o de los que se derivan los fragmentos de unión a antígeno de los ADCs son los producidos por hibridomas a los que se alude en esta memoria como PSMA 3.7, PSMA 3.8, PSMA 3.9, PSMA 3.11, PSMA 5.4, PSMA 7.1, PSMA 7.3, PSMA 10.3, PSMA 1.8.3, PSMA A3.1.3, PSMA A3.3.1, Abgenix 4.248.2, Abgenix 4.360,3, Abgenix 4.7.1, Abgenix 4.4.1, Abgenix 4.177.3, Abgenix 4.16.1, Abgenix 4.22.3, Abgenix 4.28.3, Abgenix 4.40.2, Abgenix 4.48.3, Abgenix 4.49.1, Abgenix 4.209.3, Abgenix 4.219.3, Abgenix 4.288.1, Abgenix 4.333.1, Abgenix 4.54.1, Abgenix 4.153.1, Abgenix 4.232.3, Abgenix 4.292.3, Abgenix 4.304.1, Abgenix 4.78.1 y Abgenix 4.152.1, respectivamente. En otras realizaciones, los anticuerpos son los codificados por los plásmidos mostrados en la Tabla 1. Todavía en otras realizaciones particulares, los anticuerpos son los que comprenden una cadena pesada codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificadoras de una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en secuencias de nucleótidos recogidas como SEQ ID NOs: 2-7, y una cadena ligera codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificadoras de una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en secuencias de nucleótidos recogidas como SEQ ID NOs: 8-13.

Tal como se utiliza en esta memoria, los nombres de los hibridomas o plásmidos depositados se pueden utilizar indistintamente con los nombres de los anticuerpos. Resultará claro para un experto ordinario en la técnica cuando el nombre pretende aludir al anticuerpo o cuando alude a los plásmidos o hibridomas que codifican o producen los anticuerpos, respectivamente. Adicionalmente, los nombres de anticuerpos pueden ser una forma abreviada del nombre mostrado en la Tabla 1. Por ejemplo, al anticuerpo AB-PG1-XG1-006 se le puede aludir como AB-PG1XG1-006, PG1-XG1-006, XG1-006, 006, etc. En otro ejemplo, al nombre de anticuerpo PSMA 4.232.3 se le puede aludir como PSMA 4.232.1, 4.232.3, 4.232.1, 4.232, etc. Se pretende que todas las variaciones en el nombre del anticuerpo aludan al mismo anticuerpo y no a uno diferente.

Los anticuerpos de los ADCs o de los que se derivan los fragmentos de unión a antígeno de los ADCs incluyen los codificados por conjuntos particulares de secuencias de cadenas pesadas y ligeras. En una realización, el anticuerpo (AB-PG1-XG1-006) es codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende una región o regiones codificadoras de las secuencias de ácidos nucleicos recogidas como SEQ ID NOs: 2 y 8. En otra realización, el anticuerpo (AB-PG1-XG1-026) es codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende una región o regiones codificadoras de las secuencias de ácidos nucleicos recogidas como SEQ ID NOs: 3 y 9. Todavía en una realización, el anticuerpo (AB-PG1-XG1-051) es codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende una región o regiones codificadoras de las secuencias de ácidos nucleicos recogidas como SEQ ID NOs: 4 y 10. Todavía en otra realización, el anticuerpo (AB-PG1-XG1-069) es codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende una región o regiones codificadoras de las secuencias de ácidos nucleicos recogidas como SEQ ID NOs: 5 y 11. En otra realización, el anticuerpo (AB-PG1-XG1-077) es codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende una región o regiones codificadoras de las secuencias de ácidos nucleicos recogidas como SEQ ID NOs: 6 y 12. Todavía en otra realización, el anticuerpo (PSMA 10.3) es codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende una región o regiones codificadoras de las

secuencias de ácidos nucleicos recogidas como SEQ ID NOs: 7 y 13. En otras realizaciones, los anticuerpos de los ADCs o de los que se derivan los fragmentos de unión a antígeno de los ADCs incluyen una región variable de cadena pesada codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende una región o regiones codificadoras de una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en secuencias de nucleótidos recogidas como SEQ ID NOs: 14, 18, 22, 26 y 30, y una región variable de cadena ligera codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende una región o regiones codificadoras de una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en secuencias de nucleótidos recogidas como SEQ ID NOs: 16, 20, 24, 28 y 32. En una realización, el anticuerpo (AB-PG1-XG1-006) incluye una secuencia variable de inmunoglobulina codificada por moléculas de ácidos nucleicos que comprenden una región o regiones codificadoras de las secuencias de ácidos nucleicos recogidas como SEQ ID NOs: 14 y 16. De igual manera, el anticuerpo puede ser uno que incluya una secuencia variable de inmunoglobulina que comprende las secuencias de aminoácidos recogidas como SEQ ID NOs: 15 y 17. En otra realización, el anticuerpo (AB-PG1-XG1-026) incluye una secuencia variable de inmunoglobulina codificada por moléculas de ácidos nucleicos que comprenden una región o regiones codificadoras de la secuencias de nucleótidos recogidas como SEQ ID NOs: 18 y 20, o incluye una secuencia variable de inmunoglobulina que comprende las secuencias de aminoácidos recogidas como SEQ ID NOs: 19 y

21. Todavía en otra realización, el anticuerpo (AB-PG1-XG1-051) incluye una secuencia variable de inmunoglobulina codificada por las moléculas de ácidos nucleicos que comprenden una región o regiones codificadoras de secuencias de nucleótidos recogidas como SEQ ID NOs: 22 y 24, o incluye una secuencia variable de inmunoglobulina que comprende las secuencias de aminoácidos recogidas como SEQ ID NOs: 23 y

25. Todavía en otra realización, el anticuerpo (AB-PG1-XG1-069) incluye una secuencia variable de inmunoglobulina codificada por las moléculas de ácidos nucleicos que comprenden una región o regiones codificadoras de secuencias de nucleótidos recogidas como SEQ ID NOs: 26 y 28 o incluye una secuencia variable de inmunoglobulina que comprende las secuencias de aminoácidos recogidas como SEQ ID NOs: 27 y 29. En otra realización, el anticuerpo (AB-PG1-XG1-077) incluye una secuencia variable de inmunoglobulina codificada por las moléculas de ácidos nucleicos que comprenden una región o regiones codificadoras de secuencias de nucleótidos recogidas como SEQ ID NOs: 30 y 32 o incluye una secuencia variable de inmunoglobulina que comprende las secuencias de aminoácidos recogidas como SEQ ID NOs: 31 y 33. En otras realizaciones, el anticuerpo incluye una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en secuencias de aminoácidos recogidas como SEQ ID NOs: 15, 19, 23, 27 y 31, y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en secuencias de aminoácidos recogidas como SEQ ID NOs: 17, 21, 25, 29 y 33.

Tal como se utiliza en esta memoria, una “región codificadora” se refiere a una región de una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de polipéptidos. Su uso en esta memoria es consistente con el significado reconocido, conocido en la técnica.

En determinadas realizaciones, los anticuerpos de los ADCs o de los que se derivan los fragmentos de unión a antígeno de los ADCs, son los que son codificados por moléculas de ácidos nucleicos que son altamente homólogas a los ácidos nucleicos que anteceden. La molécula de ácido nucleico homóloga, en algunas realizaciones, puede comprender una secuencia de nucleótidos que es al menos aproximadamente 90% idéntica a la secuencia de nucleótidos proporcionada en esta memoria. En otras realizaciones, la secuencia de nucleótidos es al menos aproximadamente 95% idéntica, al menos aproximadamente 97% idéntica, al menos aproximadamente 98% idéntica o al menos aproximadamente 99% idéntica a una secuencia de nucleótidos proporcionada en esta memoria. La homología se puede calcular utilizando diversas herramientas de software, públicamente disponibles y bien conocidas para un experto ordinario en la técnica. Herramientas ilustrativas incluyen el sistema BLAST disponible de la página web del National Center for Biotechnology Information (NCBI) en el National Institutes of Health.

Un método para identificar secuencias de nucleótidos altamente homólogas es a través de la hibridación del ácido nucleico. Así, la invención incluye también anticuerpos que tienen las propiedades de unión a PSMA y otras propiedades funcionales descritas en esta memoria, que son codificados por moléculas de ácidos nucleicos que se hibridan bajo condiciones de alta rigurosidad a las moléculas de ácidos nucleicos que anteceden. La identificación de secuencias relacionadas también se puede conseguir utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR – siglas en inglés) y otras técnicas de amplificación adecuadas para clonar secuencias de ácidos nucleicos relacionadas. Cebadores de PCR se pueden seleccionar para amplificar partes de una secuencia de ácidos nucleicos de interés tal como una CDR (siglas inglesas de región determinante de la complementariedad).

La expresión “condiciones de alta rigurosidad”, tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a parámetros con los que es familiar la técnica. Parámetros de hibridación de ácidos nucleicos se pueden encontrar en referencias que recopilan métodos de este tipo, p. ej. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., comps.,

Segunda Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989, o Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel, et al., comps., John Wiley & Sons, Inc., Nueva York. Un ejemplo de condiciones de alta rigurosidad es la hibridación a 65ºC en tampón de hibridación (3,5X SSC, Ficoll al 0,02%, polivinilpirrolidona al 0,02%, albúmina de suero bovino al 0,02%, NaH2PO4 2,5 mM (pH 7), SDS al 0,5%, EDTA 2 mM). SSC es cloruro de sodio 0,15 M/citrato de sodio 0,015 M, pH 7; SDS es dodecilsulfato de sodio; y EDTA es ácido etilendiaminotetraacético. Después de la hibridación, una membrana a la cual se transfiere el ácido nucleico, se lava, por ejemplo, en 2X SSC a la temperatura ambiente y luego a 0,1-0,5X SSC/0,1X SDS a temperaturas de hasta 68ºC.

Tal como se utiliza en esta memoria, el término “anticuerpo” se refiere a una glicoproteína que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) inter-conectadas por enlaces disulfuro. Cada una de las cadenas pesadas está constituida por una región variable de la cadena pesada (abreviada en esta memoria como HCVR o VH) y una región constante de la cadena pesada. La región constante de la cadena pesada está constituida por tres dominios, CH1, CH2y CH3. Cada una de las cadenas ligeras está constituida por una región variable de la cadena ligera (abreviada en esta memoria como LCVR o VL) y una región constante de la cadena ligera. La región constante de la cadena ligera está constituida por un dominio, CL. Las regiones VH y VL se pueden subdividir adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR – siglas en inglés). Cada una de VH y VL está constituida por tres CDRs y cuatro FRs, dispuestos desde el extremo amino al extremo carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras contienen un dominio de unión que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar en la unión de la inmunoglobulina a tejidos o factores hospedadores, incluidas diversas células del sistema inmune (p. ej., células efectoras) y el primer componente (C1q) del sistema de complemento clásico.

La expresión “fragmento de unión a antígeno” de un anticuerpo, tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a una o más partes de un anticuerpo que conservan la capacidad de unirse específicamente a un antígeno (es decir, PSMA). Se ha demostrado que la función de unión a antígeno de un anticuerpo puede realizarse por fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Ejemplos de fragmentos de unión abarcados dentro de la expresión “fragmento de unión a antígeno” de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL , VH , VH y CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab’)2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados por un puente disulfuro en la región de bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546) que consiste en un dominio VH; y (vi) una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada. Las CDRs y, en particular, las regiones CDR3 y, más particularmente, la CDR3 de cadena pesada contribuyen en la especificidad del anticuerpo. Debido a que estas regiones CDR y, en particular, la región CDR3 confieren especificidad al antígeno en el anticuerpo, estas regiones se pueden incorporar en otros anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno para conferir la especificidad del antígeno idéntica sobre ese anticuerpo o péptido. Además de ello, a pesar de que los dos dominios del fragmento Fv, V y VH, son codificados por genes separados, éstos se pueden unir, utilizando métodos recombinantes, por parte de un enlazador sintético que les permite producirles como una cadena de proteínas sencilla en la que las regiones VL y VH se aparean para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena sencilla (scFv); véase, p. ej., Bird et al. (1988) Science 242:423-426; y Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Anticuerpos de cadena sencilla de este tipo también pretenden quedar abarcados dentro de la expresión “fragmento de unión a antígeno” de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpo se obtienen utilizando procesos convencionales tales como procesos de fragmentación proteolítica tal como se describe en J. Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, págs. 98-118 (N.Y. Academic Press 1983), así como por otras técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Los fragmentos son rastreados en cuanto a su utilidad de la misma manera que lo son los anticuerpos intactos.

Los anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos de los ADCs, están en algunas realizaciones, aislados. “Aislados”, tal como se utiliza en esta memoria, pretende aludir a un anticuerpo (o fragmento de unión a antígeno del mismo) que está esencialmente exento de otros anticuerpos (o fragmentos de unión a antígeno) con diferentes especificidades antigénicas (p. ej., un anticuerpo aislado que se une específicamente a PSMA está esencialmente exento de anticuerpos que se unen específicamente a antígenos que no sean PSMA). Un anticuerpo aislado que se une específicamente a un epítopo, isoforma o variante de PSMA puede, sin embargo, tener reactividad cruzada con otros antígenos relacionados, p. ej., de otras especies (p. ej., homólogos de especies de PSMA). Además de ello, un anticuerpo aislado (o fragmento de unión a antígeno del mismo) puede estar esencialmente exento de otro material celular y/o productos químicos. Tal como se utiliza en esta memoria, “unión específica” se refiere a la unión del anticuerpo a un antígeno predeterminado, en este caso PSMA. Típicamente, el

anticuerpo se une con una afinidad que es al menos dos veces mayor que su afinidad por unirse a un antígeno no específico (p. ej., BSA, caseína), que es un antígeno distinto de PSMA, una isoforma o variante de PSMA o un antígeno estrechamente relacionado.

Los anticuerpos abarcan diversos isotipos de anticuerpos tales como IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgAsec, IgD, IgE. Tal como se utiliza en esta memoria, “isotipo” se refiere a la clase de anticuerpos (p. ej., IgM o IgG1) que es codificada por genes de la región constante de la cadena pesada. Los anticuerpos pueden ser de longitud completa o pueden incluir sólo un fragmento de unión a antígeno tal como el dominio constante y/o variable de anticuerpo de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgAsec, IgD o IgE, o podrían consistir en un fragmento Fab, un fragmento F(ab’)2 y un fragmento Fv.

Los anticuerpos de los ADCs, o de los que se derivan los fragmentos de unión a antígeno de los ADCs son, en algunas realizaciones, monoclonales. Los anticuerpos se pueden producir por una diversidad de técnicas bien conocidas en la técnica. La producción de anticuerpos monoclonales puede efectuarse mediante técnicas que son bien conocidas en la técnica. La expresión “anticuerpo monoclonal”, tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a un preparado de moléculas de anticuerpo de una composición molecular sencilla. Un anticuerpo monoclonal exhibe una especificidad de unión sencilla y una afinidad por un epítopo particular. El procedimiento de la producción de anticuerpos monoclonales implica obtener células somáticas inmunes con el potencial de producir un anticuerpo, en particular linfocitos B, que han sido previamente inmunizados con el antígeno de interés, ya sea in vivo o in vitro y que sean adecuados para la fusión con una línea de mieloma de células B.

Linfocitos de mamíferos se inmunizan típicamente mediante inmunización in vivo del animal (p. ej., un ratón) con la proteína o polipéptido deseado. Inmunizaciones de este tipo se repiten según sea necesario a intervalos de hasta varias semanas para obtener un título suficiente de anticuerpos. Una vez inmunizados, los animales pueden utilizarse como una fuente de linfocitos productores de anticuerpos. Después del último refuerzo con antígenos, los animales son sacrificados y se les separan células del bazo. Linfocitos de ratón proporcionan un elevado porcentaje de fusiones estables con las líneas de mieloma de ratón descritas en esta memoria. Por ejemplo, del ratón BALB/c. Sin embargo, también se pueden utilizar como hospedadores para preparar células productoras de anticuerpos otras razas de ratones, conejos, hámsteres, ovejas y ranas. Véase; Goding (en Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 2ª ed., págs. 60-61, Orlando, Fla., Academic Press, 1986). En particular, se pueden utilizar razas de ratones que tengan genes de inmunoglobulina humana insertados en el genoma (y que no puedan producir inmunoglobulinas de ratón). Ejemplos incluyen las razas de ratón HuMAb producidas por Medarex/GenPharm International, y las cepas XenoMouse producidas por Abgenix. Ratones de este tipo producen moléculas de inmunoglobulina totalmente humanas en respuesta a la inmunización. En algunas realizaciones, por lo tanto, los ADCs comprenden un anticuerpo monoclonal totalmente humano o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a PSMA.

Preferentemente, se fusionan aquellas células productoras de anticuerpos que se encuentren en la fase de división del plasmablasto. Células somáticas se pueden obtener a partir de los nódulos linfáticos, bazos y sangre periférica de animales estimulados con antígenos, y las células linfáticas de elección dependen en gran medida de su utilidad empírica en el sistema de fusión particular. Los linfocitos secretores de anticuerpos se fusionan luego con células de mieloma de células B (de ratón) o células transformadas que son capaces de replicarse indefinidamente en cultivos celulares, produciendo con ello una línea de células inmortal, secretora de inmunoglobulina. Se cultivan las células fusionadas resultantes, o hibridomas, y las colonias resultantes se rastrean en cuanto a la producción de los anticuerpos monoclonales deseados. Colonias que producen este tipo de anticuerpos se clonan y se hacen crecer in vivo o in vitro para producir grandes cantidades de anticuerpos. Una descripción de la base teórica y de la metodología práctica de fusión de este tipo de células se recoge en Kohler y Milstein, Nature 256:495 (1975).

Alternativamente, células somáticas humanas capaces de producir anticuerpos, específicamente linfocitos B, son adecuadas para la fusión con líneas de células de mieloma. Aún cuando pueden utilizarse linfocitos B procedentes de bazos, amígdalas o nódulos linfáticos biopsiados de un individuo, también se pueden utilizar los linfocitos B de la sangre periférica más fácilmente accesibles. Los linfocitos pueden derivarse de pacientes con carcinomas de próstata diagnosticados u otro cáncer que exprese PSMA. Además, células B humanas pueden ser directamente inmortalizadas por el virus Epstein-Barr (Cole et al., 1995, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., págs. 77-96). A pesar de que se pueden utilizar procesos de hibridación de células somáticas, en principio se pueden emplear otras técnicas para producir anticuerpos monoclonales tales como la transformación viral u oncogénica de linfocitos B.

Líneas de células de mieloma adecuadas para uso en procesos de fusión productores de hibridoma pueden ser no productoras de anticuerpos, tener una elevada eficacia de fusión y deficiencias enzimáticas que las hacen incapaces de desarrollarse en determinados medios selectivos que sustentan el desarrollo de los hibridomas deseados. Ejemplos de líneas de células de mieloma de este tipo que se pueden utilizar para la producción de líneas de células fusionadas incluyen P3-X63/Ag8, X63-Ag8.653, NS1/1. Ag 4.1, Sp2/0-Ag14, FO, NSO/U, MPC11, MPC11-X45-GTG 1.7, S194/5XX0 Bul, todas derivadas de ratones; R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F y 4B210

5 derivadas de ratas y U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2, UC729-6, todas ellas derivadas de seres humanos (Goding, en Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 2ª ed., págs. 65-66, Orlando, Fla., Academic Press, 1986; Campbell, en Monoclonal Antibody Technology, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology Vol. 13, Burden y Von Knippenberg, comps. págs. 75-83, Amsterdam, Elseview, 1984).

10 La fusión con células de mieloma de mamíferos u otros participantes en la fusión capaces de replicarse indefinidamente en cultivos celulares se efectúa por técnicas convencionales y bien conocidas, por ejemplo utilizando polietilenglicol (“PEG”) u otros agentes de fusión (véase Milstein y Kohler, Eur. J. Immunol. 6:511 (1976).

En otras realizaciones, los anticuerpos de los ADCs o de los que se derivan los fragmentos de unión a antígeno de

15 los ADCs, son anticuerpos recombinantes. La expresión “anticuerpo recombinante”, tal como se utiliza en esta memoria, pretende incluir anticuerpos que se preparan, expresan, crean o aíslan por medios recombinantes tales como anticuerpos aislados de un animal (p. ej. un ratón) que es transgénico para otros genes de inmunoglobulina de las especies, anticuerpos expresados utilizando un vector de expresión recombinante transfectado en una célula hospedadora, anticuerpos aislados de un banco de anticuerpos recombinantes y combinatorios, o anticuerpos

20 preparados, expresados, creados o aislados por cualesquiera otros medios que implican el corte y empalme de secuencias de genes de inmunoglobulina a otras secuencias de ADN.

Todavía en otras realizaciones, los anticuerpos son anticuerpos quiméricos o humanizados. Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión “anticuerpo quimérico” se refiere a un anticuerpo que combina las regiones variables o 25 hipervariables murinas con la región constante humana o las regiones de marco constantes y variables. Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión “anticuerpo humanizado” se refiere a un anticuerpo que conserva sólo las CDRs de unión a antígenos procedentes del anticuerpo parental en asociación con regiones de marco humanas (véase Waldmann, 1991, Science 252:1657). Se espera que anticuerpos quiméricos o humanizados de este tipo que conservan la especificidad de unión del anticuerpo murino tengan una inmunogenicidad reducida cuando se

30 administran in vivo para aplicaciones de acuerdo con la invención.

De acuerdo con una realización alternativa, los anticuerpos monoclonales de la presente invención se pueden modificar en forma de un anticuerpo biespecífico o un anticuerpo multiespecífico. La expresión “anticuerpo biespecífico” pretende incluir cualquier agente, p. ej. una proteína, péptido o complejo de proteínas o péptidos, que 35 tenga dos especificidades de unión diferentes que se unan a o interactúen con (a) un antígeno de la superficie de la célula y (b) un receptor Fc en la superficie de una célula efectora. La expresión “anticuerpo multiespecífico” pretende incluir cualquier agente, p. ej. una proteína, péptido o complejo de proteínas o péptidos que tenga más de dos especificidades de unión diferentes que se unan a o interactúen con (a) un antígeno de la superficie de la célula y (b) un receptor Fc en la superficie de una célula efectora y (c) al menos otro componente. Por 40 consiguiente, los anticuerpos incluyen, pero no se limitan a anticuerpos biespecíficos, triespecíficos, tetraespecíficos y otros anticuerpos multiespecíficos que están dirigidos a PSMA y a receptores Fc en células efectoras. La expresión “anticuerpos biespecíficos” incluye además diacuerpos. Los diacuerpos son anticuerpos bivalentes, biespecíficos, en los que los dominios VH y VL se expresan en una cadena polipeptídica sencilla, pero utilizando un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la

45 misma cadena, forzando con ello a los dominios a emparejarse con dominios complementarios de otra cadena y creando dos sitios de unión a antígenos (véase, p. ej., Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448; Poijak, R.J., et al. (1994) Structure 2:1121-1123).

Un anticuerpo biespecífico se puede formar de una región de antígeno específica para PSMA y una región de unión

50 a antígeno específica para una célula efectora que tiene una actividad tumoricida o inhibidora de tumores. Las dos regiones de unión a antígeno del anticuerpo biespecífico están químicamente enlazadas o pueden ser expresadas por una célula tratada genéticamente para producir el anticuerpo biespecífico. (Véase, en general, Fanger et al., 1995, Drug News & Perspec. 8(3): 133-137). Células efectoras adecuadas con actividad tumoricida incluyen, pero no se limitan a células T citotóxicas (principalmente células CD8+), células asesinas naturales, etc. Una cantidad

55 eficaz de anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención puede administrarse a un sujeto con cáncer, y el anticuerpo biespecífico extermina y/o inhibe la proliferación de las células cancerígenas después de la localización en sitios de tumores primarios o metastásicos que portan PSMA.

En determinadas realizaciones, los anticuerpos de los ADCs o de los que se derivan los fragmentos de unión a 60 antígenos de los ADCs son anticuerpos humanos. La expresión “anticuerpo humano”, tal como se utiliza en esta

memoria, pretende incluir anticuerpos con regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana (p. ej., mutaciones introducidas por mutagénesis al azar o específica del sitio in vitro o mediante mutación somática in vivo). Sin embargo, la expresión “anticuerpo humano”, tal como se utiliza en esta memoria, no pretende incluir anticuerpos en los que secuencias de CDR derivadas de la línea germinal de otra especie de mamífero, tal como un ratón, han sido injertadas en secuencias del marco humanas (a las que se alude en esta memoria como “anticuerpos humanizados”). Anticuerpos humanos dirigidos contra PSMA se pueden generar utilizando ratones transgénicos que portan partes del sistema inmune humano más que el sistema de ratón. Algunos ejemplos de los mismos se describieron anteriormente.

Anticuerpos monoclonales totalmente humanos también se pueden preparar inmunizando ratones transgénicos en grandes partes de loci de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina humana. Véanse, p. ej., las patentes de EE.UU. 5.591.669, 5.598.369, 5.545.806, 5.545.807, 6.150.584, y referencias citadas en ellas. Estos animales han sido genéticamente modificados de modo que existe una deleción funcional en la producción de anticuerpos endógenos (p. ej., murinos). Los animales se modifican adicionalmente de modo que contengan la totalidad o una parte del locus del gen de inmunoglobulina de la línea germinal humana, de modo que la inmunización de estos animales resulta en la producción de anticuerpos totalmente humanos contra el antígeno de interés. Después de la inmunización de estos ratones (p. ej., XenoMouse (Abgenix), ratones HuMAb (Medarex/GenPharm)), anticuerpos monoclonales se preparan de acuerdo con la tecnología del hibridoma estándar. Estos anticuerpos monoclonales tienen secuencias de aminoácidos de inmunoglobulina humana y, por lo tanto, no provocarán respuestas de anticuerpo anti-ratón humano (HAMA) cuando se administran a seres humanos. En general, pero no se pretende que sea limitante, los ratones son de una edad de 6-16 semanas tras la primera inmunización. Por ejemplo, se utiliza un preparado purificado o enriquecido de antígeno PSMA (p. ej., PSMA recombinante o células que expresan PSMA) para inmunizar intraperitonealmente (IP) a los ratones, a pesar de que también son posibles otras vías de inmunización conocidas por un experto ordinario en la técnica. El antígeno PSMA se inyecta en combinación con un adyuvante tal como adyuvante completo de Freund y, en algunas realizaciones, la inyección inicial es seguida por inmunizaciones de refuerzo con antígeno en un adyuvante tal como adyuvante incompleto de Freund. La respuesta inmune se vigila a lo largo del transcurso del protocolo de inmunización con muestras de plasma obtenidas, por ejemplo, mediante sangrado retro-orbital. El plasma se rastrea por ELISA y, para las fusiones se utilizan ratones con títulos suficientes de inmunoglobulina humana anti-PSMA. A los ratones se les refuerza por vía intravenosa con antígeno 3 días antes de sacrificarles y de la separación del bazo.

En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de los ADCs se puede seleccionar en cuanto a la capacidad de unirse a células que expresan PSMA vivas. Con el fin de demostrar la unión a células que expresan PSMA vivas se puede utilizar la citometría de flujo. Por ejemplo, líneas de células que expresan PSMA (desarrolladas bajo condiciones de crecimiento convencionales) o células de cáncer de próstata que expresan PSMA se mezclan con diversas concentraciones de anticuerpos monoclonales en PBS que contiene Tween 80 al 0,1% y suero de ratón al 20%, y se incuban a 37ºC durante 1 hora. Después del lavado, las células se hacen reaccionar con anticuerpo secundario de IgG anti-humano marcado con fluoresceína (si se utilizaron anticuerpos anti-PSMA humanos) bajo las mismas condiciones que la tinción del anticuerpo primario. Las muestras se pueden analizar mediante un instrumento clasificador de células activadas por fluorescencia (FACS), utilizando propiedades de dispersión de la luz y laterales para dirigirlas a células individuales. Se puede utilizar un ensayo alternativo que utilice microscopía de fluorescencia (además de o en lugar de) el ensayo de citometría de flujo. Las células se pueden teñir y examinar mediante microscopía de fluorescencia. Este método permite la visualización de células individuales, pero puede tener una sensibilidad disminuida dependiendo de la densidad del antígeno. Se deduce que los ADCs, en algunas realizaciones, se unen a células vivas. Por lo tanto, los ADCs, en algunas realizaciones, no requieren la lisis de la célula para unirse a PSMA.

En algunas realizaciones, los anticuerpos pueden fomentar la citolisis de células que expresan PSMA. La citolisis puede ser mediada por el complemento o puede ser mediada por células efectoras. En una realización, la citolisis se lleva a cabo en un organismo vivo tal como un mamífero, y la célula viva es una célula tumoral. Ejemplos de tumores que pueden ser fijados como objetivo por los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos incluyen cualquier tumor que exprese PSMA (éste incluye tumores con PSMA que expresa la neovasculatura), tal como de próstata, vejiga, páncreas, pulmón, colon, riñón, melanomas y sarcomas. En una realización, la célula tumoral es una célula de cáncer de próstata.

El ensayo de la actividad citolítica in vitro por el ensayo de la liberación de cromo puede proporcionar un rastreo inicial antes del ensayo en modelos in vivo. Este ensayo se puede llevar a cabo utilizando ensayos de liberación de cromo convencionales. En síntesis, células polimorfonucleares (PMN) u otras células efectoras procedentes de

donantes sanos se pueden purificar mediante centrifugación en gradiente de densidad Ficoll-Hypaque, seguido de lisis de eritrocitos contaminantes. PMNs lavadas pueden suspenderse en RPMI suplementado con suero de ternero fetal inactivado por calor al 10% y pueden mezclarse con células marcadas con 51Cr que expresen PSMA, en diversas relaciones de células efectoras a células tumorales (células efectoras: células tumorales). IgGs anti5 PSMA purificadas se pueden luego añadir a diversas concentraciones. IgG irrelevante se puede utilizar como un control negativo. Los ensayos se pueden llevar a cabo durante 0-120 minutos a 37ºC. Las muestras se pueden someter a ensayo para la citolisis, midiendo la liberación de 51Cr en el sobrenadante del cultivo. Anticuerpos monoclonales anti-PSMA y/o ADCs también se pueden someter a ensayo en combinaciones entre sí para determinar si la citolisis es reforzada con anticuerpos monoclonales múltiples y/o ADCs. Anticuerpos que se unen a

10 PSMA y/o ADCs también pueden someterse a ensayo en un modelo in vivo (p. ej., en ratones) para determinar su eficacia en mediar en la citolisis y exterminar células que expresen PSMA, p. ej., células tumorales.

Los anticuerpos de los ADCs o de los que se derivan los fragmentos de unión a antígeno de los ADCs se pueden seleccionar, por ejemplo, en base a los siguientes criterios, que no pretenden ser exclusivos:

15 1) unión a células vivas que expresan PSMA; 2) elevada afinidad de unión a PSMA; 3) unión a un epítopo único en PSMA (es decir, un epítopo no reconocido por un anticuerpo previamente producido); 4) opsonización de células que expresan PSMA;

20 5) mediación de la inhibición del crecimiento, fagocitosis y/o exterminio de células que expresan PSMA en presencia de células efectoras; 6) modulación (inhibición o potenciación) de actividades de NAALADasa, folato hidrolasa, dipetidil peptidasa IV y/o γ-glutamil-hidrolasa; 7) inhibición del crecimiento, paralización del ciclo celular y/o citotoxicidad en ausencia de células

25 efectoras; 8) internalización de PSMA; 9) unión a un epítopo conformacional en PSMA; 10) reactividad cruzada mínima con células o tejidos que no expresan PSMA; y 11) unión preferente a formas diméricas de PSMA más que a formas monoméricas de PSMA.

30 Los anticuerpos pueden cumplir uno o más y, posiblemente, todos estos criterios.

En una realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a un epítopo conformacional tal como un epítopo conformacional dentro del dominio extracelular de PSMA. Para determinar si un anticuerpo 35 anti-PSMA o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a epítopos conformacionales, cada uno de los anticuerpos se pueden someter testar en ensayos utilizando proteína nativa (p. ej., inmunoprecipitación no desnaturalizante, análisis por citometría de flujo de la unión a la superficie de la célula) y proteína desnaturalizada

(p. ej., borrón de transferencia Western, inmunoprecipitación de proteínas desnaturalizadas). Una comparación de los resultados indicará si el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a un epítopo

40 conformacional. Anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen a proteína nativa, pero no a proteína desnaturalizada son, en algunas realizaciones, aquellos que se unen a epítopos conformacionales. Se deduce que los ADCs en algunas realizaciones, se unen a epítopos conformacionales de PSMA.

En otra realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a un epítopo específico de

45 dímeros en PSMA. En general, anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen a un epítopo específico para dímeros se unen preferentemente al PSMA dímero más que al PSMA monómero. Para determinar si un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une preferentemente (es decir., selectiva y/o específicamente) a un PSMA dímero, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se puede someter a ensayos (p. ej., inmunoprecipitación seguida de transferencia Western) utilizando proteína de

50 PSMA dimérico nativa y proteína de PSMA monomérico disociada. Una comparación de los resultados indicará si el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une preferentemente al dímero. En algunas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos se unen al PSMA dímero, pero no a la proteína de PSMA monomérico. Se deduce que los ADCs, en algunas realizaciones, se unen a un epítopo específico para el dímero en PSMA.

55 Por lo tanto, la invención incluye también ADCs que se unen selectivamente a PSMA multímero. Tal como se utiliza en esta memoria, particularmente con respecto a la unión de PSMA multímero por parte de los ADCs, “se une selectivamente” significa que un anticuerpo se une preferentemente a un multímero de proteína de PSMA (p. ej., con mayor avidez, mayor afinidad de unión) que a un monómero de proteína de PSMA. En algunas

60 realizaciones, los ADCs de la invención se unen a un multímero de proteína de PSMA con una avidez y/o afinidad de unión que es 1,1 veces, 1,2 veces, 1,3 veces, 1,4 veces, 1,5 veces, 1,6 veces, 1,7 veces, 1,8 veces, 1,9 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 7 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 70 veces, 100 veces, 200 veces, 300 veces, 500 veces, 1000 veces o más que la exhibida por el ADC para un monómero de proteína de PSMA. El ADC puede, en algunas realizaciones, unirse selectivamente a un multímero de proteína de PSMA y no a

5 un monómero de proteína de PSMA, es decir, exclusivamente se une a un multímero de proteína de PSMA. En algunas realizaciones, el ADC se une selectivamente a un dímero de proteína de PSMA.

Un multímero de proteína de PSMA, tal como se utiliza en esta memoria, es un complejo proteínico de al menos dos proteínas de PSMA o fragmentos de las mismas. Los multímeros de proteína de PSMA pueden estar 10 constituidos por diversas combinaciones de proteínas de PSMA de longitud completa (p. ej., SEQ ID NO: 1), PSMA soluble recombinante (rsPSMA, p. ej., aminoácidos 44-750 de SEQ ID NO: 1) y fragmentos de lo que antecede que forman multímeros (es decir, que conservan el dominio de proteína requerido para formar dímeros y/o multímeros de mayor orden de PSMA). En algunas realizaciones, al menos una de las proteínas de PSMA que forman el multímero es un polipéptido de PSMA recombinante, soluble (rsPSMA). Los multímeros de proteína de PSMA 15 pueden ser dímeros tales como los formados a partir de proteína de PSMA recombinante soluble. En una realización, el dímero es un homodímero de rsPSMA. Se piensa que los multímeros de proteína de PSMA a los que se alude en esta memoria asumen una conformación nativa y pueden tener una conformación de este tipo. Las proteínas de PSMA en determinadas realizaciones están unidas de manera no covalente juntas para formar el multímero de proteína de PSMA. Por ejemplo, se ha descubierto que la proteína de PSMA se asocia de manera no 20 covalente para formar dímeros bajo condiciones no desnaturalizantes. Los multímeros de proteína de PSMA pueden conservar las actividades de PSMA. La actividad de PSMA puede ser una actividad enzimática, tal como una actividad de folato hidrolasa, actividad de NAALADasa, actividad de dipeptidil peptidasa IV o actividad de γglutamil hidrolasa. Métodos para someter a ensayo la actividad de PSMA de multímeros son bien conocidos en la técnica (revisada por O’Keefe et al. en: Prostate Cancer: Biology, Genetics, and the New Therapeutics, L.W.K.

25 Chung, W.B. Isaacs y J.W. Simons (comps.) Humana Press, Totowa, NJ, 2000, págs. 307-326).

El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de los ADCs se puede unir a y es internalizado con PSMA expresado en células. El mecanismo mediante el cual el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se internaliza con PSMA no es crítico para la práctica de la presente invención. Por ejemplo, el anticuerpo o 30 fragmento de unión a antígeno del mismo puede inducir la internalización de PSMA. Alternativamente, la internalización del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede ser el resultado de una internalización rutinaria de PSMA. Se deduce que el ADC puede ser internalizado con PSMA expresado en células.

Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos y, por lo tanto, los ADCs de la invención pueden

35 unirse específicamente a PSMA de la superficie de la célula y/o rsPSMA con afinidad sub-nanomolar. Las afinidades de unión pueden ser de aproximadamente 1 X 10-9 M o menores, aproximadamente 1 X 10-10 M o menores o aproximadamente 1 X 10-11 M o menores. En una realización particular, la afinidad de unión es menor que aproximadamente 5 X 10-10 M.

40 Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígenos de los mismos pueden modular, en algunas realizaciones, al menos una actividad enzimática de PSMA. La actividad se puede seleccionar del grupo que consiste en actividad de dipeptidasa de carácter ácido N-acetilada y α-enlazada (NAALADasa), folato hidrolasa, dipeptidil dipeptidasa IV, γ-glutamil hidrolasa y combinaciones de las mismas in vitro o in vivo. La modulación puede ser una potenciación o inhibición de al menos una actividad enzimática de PSMA.

45 Niveles en tejido de NAALADasa se pueden determinar solubilizando en detergente, tejidos homogeneizantes, sedimentando el material insoluble mediante centrifugación y midiendo la actividad de NAALADasa en el sobrenadante restante. De igual manera, la actividad de NAALADasa en fluidos corporales también se puede medir sedimentando primero el material celular mediante centrifugación y realizando un ensayo enzimático típico para la

50 actividad de NAALADasa en el sobrenadante. Ensayos de enzimas NAALADasa han sido descritos por Frieden, 1959, J. Biol. Chem., 234:2891. En este ensayo, el producto de reacción de la enzima NAALADasa es ácido glutámico. Éste se deriva de la escisión de N-acetilaspartilglutamato catalizada por enzima para proporcionar ácido N-acetilaspártico y ácido glutámico. El ácido glutámico, en una etapa que requiere NAD(P)+, proporciona 2oxoglutarato más NAD(P)H en una reacción catalizada por glutamato deshidrogenasa. El progreso de la reacción

55 puede medirse de manera fácil y conveniente mediante el cambio en la absorbancia a 340 nm debido a la conversión de NAD(P)+ en NAD(P)H.

La actividad de folato hidrolasa de PSMA se puede medir realizando ensayos enzimáticos según se describe por Heston y otros (p. ej., Clin Cancer Res. 2(9):1445-51, 1996; Urology 49 (3A Supl):104-12, 1997). Folato hidrolasas 60 tales como PSMA separan los glutamatos gamma-enlazados de folatos poliglutamatos. La actividad de folato

hidrolasa se puede medir utilizando sustratos tales como metotrexato tri-gamma glutamato (MTXGlu3), metotrexato di-gamma glutamato (MTXGlu2) o pteroilpentaglutamato (PteGlu5), por ejemplo utilizando electroforesis capilar (véase Clin. Cancer Res. 2(9):1445-51, 1996). Incubaciones cronometradas de PSMA con sustratos poliglutamados son seguidas por separación y detección de productos de la hidrólisis.

5 Un ADC de la invención comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo conjugado MMAE o MMAF. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede estar, en algunas realizaciones, conjugado a MMAE o MMAF con un compuesto de la siguiente fórmula (Fórmula 1) –An-Ym-Zm-Xn-Wn-, en donde A es una unidad acilo carboxílica; Y es un aminoácido; Z es un aminoácido; X y W son cada uno un espaciador auto

10 inmolativo; n es un número entero de 0 ó 1; y m es un número entero de 0 ó 1, 2, 3, 4, 5 ó 6. En algunas realizaciones, el conjugado de la presente invención se representa por la fórmula (Fórmula 2): L-{An-Ym-Zm-Xn-WnD}p, en donde L es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a PSMA, D es MMAE o MMAF y p es un número entero de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8. Los otros componentes son como se definen antes. En una realización, la unidad carboxílica “An” está enlazada al anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo

15 a través de un átomo de azufre derivado del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo:

En una realización, A es

en que q es 1-10. Por lo tanto, en una realización, el conjugado es:

en donde L, Y, Z, X, W, D, n, m, q y p son como se definen previamente.

25 En otra realización, A es 4-(N-succinimidometil)ciclohexano-1-carbonilo, m-succinimidobenzoílo, 4-(psuccinimidofenil)-butirilo, 4-(2-acetamido)benzoílo, 3-tiopropionilo, 4-(1-tioetil)-benzoílo, 6-(3-tiopropionilamido)hexanoílo o maleimida- caproílo. En una realización adicional, A es maleimida-caproilo. Ejemplos representativos de diversas unidades de acilo carboxílico y métodos para su síntesis y fiojación se describen en la patente de

30 EE.UU. Nº 6.214.345, cuyo contenido completo se incorpora en esta memoria como referencia.

En otra realización, Y es alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina, triptófano o prolina. Todavía en otra realización, Y es valina. En una realización adicional, Z es lisina, lisina protegida con acetilo o formilo, arginina, arginina protegida con tosilo o grupos nitro, histidina, ornitina, ornitina protegida con acetilo o formilo, o

35 citrulina. Todavía en una realización adicional, Z es citrulina. En una realización, Ym-Zm es valina-citrulina. En otra realización, Ym-Zm es una secuencia de proteínas que es selectivamente escindible por una proteasa.

En una realización adicional, X es un compuesto que tiene la fórmula

en que T es O, N o S. En otra realización, X es un compuesto que tiene la fórmula -HN-R1-COT, en que R1 es 5

en que T es O, N o S, R2 es H o alquilo C1-C5. En una realización, X es p-aminobencilcarbamoiloxi. En otra realización, X es alcohol p-aminobencílico. En una realización adicional, X es carbamato de p-aminobencilo. Todavía en una realización adicional, X es p-aminobenciloxicarbonilo. En otra realización, X es ácido γ

10 aminobutírico; ácido α,α-dimetil-γ-aminobutírico o ácido β,β-dimetil-γ-aminobutírico.

En algunas realizaciones, W es

15 en que T es O, S o N.

En una realización, el compuesto de Fórmula 1 maleimidocaproilo. Maleimidocaproilo ha sido utilizado para la conjugación de dos auristatinas específicas a un Acm anti-CD30 (AC10) (Doronina, Svetlana et al. “Novel Linkers for Monoclonal Antibody-Mediated Delivery of Anticancer Agents”, AACR, Anaheim, CA, Resumen Nº 1421, 16-20

20 de abril de 2005). Maleimidocaproilo reacciona con grupos tiol para formar un tioéter.

MMAE o MMAF se pueden conjugar a un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo utilizando métodos conocidos por los expertos ordinarios en la técnica (p. ej., véase, Niemeyer, CM, Bioconjugation Protocols, Strategies and Methods, Humana Press, 2004) o según se describe en esta memoria. 3 ó 4 moléculas

25 de MMAE o MMAF están conjugadas al anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo.

Se ha encontrado que los ADCs de la invención tienen niveles particularmente elevados de selectividad cuando exterminan a células que no expresan PSMA en comparación con el exterminio de células que expresan PSMA. Por lo tanto, los ADCs tienen una selectividad por células PC-3™ a células C4-2 o células LNCaP™ de al menos 30 250. En realizaciónes, la selectividad es de al menos 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2250, 2500, 2750, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500, 10000, 11000, 12000, 13000, 14000, 15000, 17500, 20000 o más. En algunas realizaciones, la selectividad oscila entre 250-500, 500-750, 750-1000, 1000-2000, 2000-5000, 5000-10000, 10000-15000, o 15000-20000. “Selectividad”, tal como se define en esta memoria, se refiere a la 35 relación de valores CI50 de un ADC en células PC-3™ (células que no expresan PSMA) a células C4-2 o células

LNCaP™ (células que expresan PSMA).

Se ha encontrado también que los ADCs de la invención median, en algunas realizaciones, en el exterminio de células específicas que expresan PSMA a concentraciones muy bajas tales como a o cerca de concentraciones 5 picomolares. En algunas realizaciones, los ADCs exhiben CI50s a concentraciones menores que aproximadamente 1 X 10-10 M, menores que aproximadamente 1 X 10-11 M o menores que aproximadamente 1 X 10-12 M. En una realización particular, se consigue una CI50 a una concentración menor que aproximadamente 1,5 X 10-11 M. En otra realización, los ADCs proporcionados exhiben CI50s entre 10-210, 40-210, 60-210 o 65-210 pM. Todavía en otra realización, los ADCs proporcionados exhiben CI50s de aproximadamente 10, 40, 60 u 80 pM. Todavía en otra

10 realización, los ADCs proporcionados exhiben CI50s entre 11, 42, 60 u 83 pM.

Se ha encontrado también que los ADCs, en algunas realizaciones, resultan en una tasa de curación en ratones de al menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95%. En otras realizaciones, la tasa de curación en ratones es de aproximadamente 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95%. Todavía en otras 15 realizaciones, la tasa de curación es 20-40%, 40-60% o 60-80%. Tal como se utiliza en esta memoria, “tasa de curación” se refiere al número de ratones todavía vivos después de aproximadamente 500 días desde el comienzo del período de estudio, sin evidencia de un tumor y sin niveles de PSA medibles, dividido por el número de ratones al comienzo del período de estudio. Para evaluar la tasa de curación, a los ratones se les administran 6 mg/kg de ADC con un régimen de q4d x 6. En algunas realizaciones, el número de ratones al comienzo del estudio es de al 20 menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 17, 20, 25, 30 o más ratones. Detalles adicionales en relación con un ejemplo de un estudio de este tipo se proporcionan en esta memoria más adelante en los Ejemplos. En una realización, los ratones son aquellos que son un modelo de cáncer de próstata humano andrógeno-independiente. En otra realización, los ratones son ratones inmunológicamente deficientes a los que se ha injertado por vía intramuscular células C4-2 en la pata trasera izquierda. Técnicas para determinar la presencia de un tumor y para medir los

25 niveles de PSA son bien conocidas por los expertos ordinarios en la técnica.

La unión de los ADCs de la invención a células que expresan PSMA vivas puede inhibir el crecimiento de células que expresan PSMA, dando como resultado una paralización del ciclo celular (p. ej., paralización de G2/M), puede fomentar la apoptosis de células que expresan PSMA, etc. Tal como se utiliza en esta memoria, “resultan en una 30 paralización del ciclo celular” se refiere a un aumento en el número de células en la fase G2/M, debido a la administración de un ADC. En algunas realizaciones, los ADCs pueden efectuar una apoptosis. En otras realizaciones, los ADCs resultan tanto en una paralización del ciclo celular como en la subsiguiente apoptosis. Los ADCs de la invención, por lo tanto, se pueden utilizar en diversos métodos in vitro e in vivo para efectuar estos posibles puntos finales. En particular, los ADCs de la invención se pueden utilizar en métodos para tratar

35 enfermedades mediadas por PSMA.

Tal como se utiliza en esta memoria, una “enfermedad mediada por PSMA” es cualquier enfermedad en la que el PSMA es el causante o un síntoma de la enfermedad. Enfermedades mediadas por PSMA incluyen también enfermedades o trastornos en los que existe una aberración (p. ej., sobre-expresión) de PSMA. PSMA es una 40 glicoproteína de la membrana de tipo II de 100 kD, expresada en tejidos de la próstata (Horoszewicz et al., 1987, Anticancer Res. 7:927-935; patente de EE.UU. Nº. 5.162.504). PSMA se caracterizó como una proteína de la transmembrana de tipo II con una identidad de la secuencia con el receptor transferrina (Israeli et al., 1994, Cancer Res. 54: 1807-1811) y con actividad de NAALADasa (Carter et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93:749-753). De manera más importante, PSMA se expresa en cantidades incrementadas en cáncer de próstata, y niveles 45 elevados de PSMA también son detectables en los sueros de estos pacientes (Horoszewicz et al., 1987; Rochon et al., 1994, Prostate 25:219-233; Murphy et al., 1995, Prostate 26: 164-168; y Murphy et al., 1995, Anticancer Res. 15:1473-1479). Por lo tanto, un trastorno mediado por PSMA es, por ejemplo, cáncer de próstata. La expresión de PSMA aumenta con el progreso de la enfermedad, volviéndose el más elevado en una enfermedad metastática hormona-refractaria para la que no existe actualmente terapia. Adicionalmente, datos sugerentes indican que el

50 PSMA es también expresado de manera abundante en la neovasculatura de una diversidad de otros tumores importantes, incluidas células tumorales de vejiga, páncreas, sarcoma o melanoma, pulmón y riñón, pero no en la vasculatura normal. Por lo tanto, enfermedades mediadas por PSMA incluyen cánceres en los que PSMA es expresado en la células del tumor o de la neovasculatura del tumor.

55 Por lo tanto, se proporcionan composiciones que pueden utilizarse para tratar cualquier trastorno mediado por PSMA. Por ejemplo, se pueden utilizar ADCs para inhibir la neovascularización de un tumor. En otro ejemplo, se pueden utilizar ADCs de PSMA para exterminar células tumorales. En algunas realizaciones, dos o más ADCs diferentes se utilizan en combinación. En otra realización, uno o más anticuerpos anti-PSMA no conjugados o fragmentos de unión a antígeno de los mismos se pueden combinar con uno o más ADCs en una terapia única

60 para conseguir un efecto terapéutico deseado. Como ilustración, un anticuerpo anti-PSMA no conjugado que media

en el exterminio altamente eficaz de células diana en presencia de células efectoras y/o que inhibe el crecimiento de células que expresan PSMA se puede utilizar con uno o más ADCs. Todavía en otra realización, los ADCs se pueden combinar con uno o más agentes terapéuticos adicionales. Agentes terapéuticos de este tipo incluyen agentes antitumorales tales como docetaxel; corticosteroides tales como prednisona o hidrocortisona; agentes inmunoestimulantes; inmunomoduladores; o alguna combinación de los mismos.

Agentes antitumorales incluyen agentes citotóxicos, agentes quimioterapéuticos y agentes que actúan sobre la neovasculatura del tumor. Agentes citotóxicos incluyen radionucleidos citotóxicos, toxinas químicas y proteínas toxinas. El radionucleido o isótopo radioterapéutico citotóxico puede ser un isótopo alfa-emisor tal como 225Ac,211At, 212Bi, 213Bi, 212Pb, 224Ra o 223Ra. Alternativamente, el radionucleido citotóxico puede ser un isótopo betaemisor tal como 186Rh, 188Rh, 177Lu, 90Y, 131I, 67Cu, 64Cu, 153Sm o 166Ho. Además, el radionucleido citotóxico puede emitir electrones Auger y de baja energía e incluye los isótopos 125I, 123I o 77Br.

Toxinas químicas o agentes quimioterapéuticos adecuados incluyen miembros de la familia de moléculas enedina, tales como calicheamicina y esperamicina. Toxinas químicas también pueden tomarse del grupo que consiste en metotrexato, doxorubicina, melfalan, clorambucilo, ARA-C, vindesina, mitomicina C, cis-platino, etopósido, bleomicina y 5-fluorouracilo. Otros agentes antineoplásticos incluyen dolastatinas (patentes de EE.UU. Nºs.

6.034.065 y 6.239.104) y derivados de las mismas. Dolastatinas y derivados de las mismas incluyen dolastatina 10 (dolavalina-valina-dolaisoleucina-dolaproina-dolafenina) y los derivados auristatina PHE (dolavalina-valinadolaisoleucina-dolaproina-fenilalanina-éster metílico) (Pettit, G.R. et al., Anticancer Drug Des. 13(4):243-277, 1998; Woyke, T. et al., Antimicrob. Agents Chemother. 45(12):3580-3584, 2001) y aurastatina E y similares. Las toxinas incluyen también lectinas venenosas, toxinas vegetales tales como toxinas ricina, abrina, modecina. botulina y difteria. Otros agentes terapéuticos son conocidos por los expertos en la técnica.

Agentes que actúan sobre la vasculatura del tumor incluyen agentes de unión a tubulina tales como combrestatina A4 (Griggs et al., Lancet Oncol. 2:82, 2001), angiostatina y endostatina (revisado en Rosen, Oncologist 5:20, 2000) y proteína 10 inducible por interferón (patente de EE.UU. Nº. 5.994.292). También están contemplados un cierto número de otros agentes anti-angiogénicos, e incluyen 2ME2, angiostatina, Angiozyme, RhuAcm anti-VEGF, Apra (CT-2584), Avicina, Benefin, BMS275291, carboxiamidotriazol, CC4047, CC5013, CC7085, CDC801, CGP- 41251 (PKC 412), CM101, combretastatina profármaco A-4, EMD 121974, endostatina, flavopiridol, genisteína (GCP), Extracto de té verde, IM-862, ImmTher, Interferón alfa, interleuquina-12, Iressa (ZD1839), Marimastat, Metastat (Col-3), Neovastat, Octreotida, Paclitaxel, Penicilamina, fotofrina, fotopoint, PI-88, Prinomastat (AG-3340), PTK787 (ZK22584), RO317453, Solimastat, escualamina, SU 101, SU 5416, SU-6668, Suradista (FCE 26644), Suramin (Metaret), tetratiomolibdato, talidomida, TNP- 470 y Vitaxina. Agentes anti-angiogénicos adicionales se describen por parte de Kerbel, J. Clin. Oncol. 19 (18s): 45s- 51s, 2001.

Los ADCs se pueden administrar con uno o más agentes inmunoestimulantes para inducir o potenciar una respuesta inmune tal como IL-2 y oligonucleótidos inmunoestimulantes (p. ej., los que contienen motivos CpG). Agentes inmunoestimulantes pueden estimular, en algunas realizaciones, brazos específicos del sistema inmune tales como células asesinas naturales (NK) que median en la citotoxicidad de las células dependiente de anticuerpos (ADCC). Agentes inmunoestimulantes incluyen interleuquina-2, α-interferón, γ-interferón, factor α de necrosis tumoral (TNFα), oligonucleótidos inmunoestimulantes o una combinación de los mismos. Inmunomoduladores incluyen citoquinas, quimoquinas, adyuvantes o una combinación de los mismos. Quimioquinas útiles en el aumento de las respuestas inmunes incluyen, pero no se limitan a SLC, ELC, MIP3α, MIP3β, IP-10, MIG y combinaciones de las mismas.

El otro agente terapéutico también puede ser una vacuna. En algunas realizaciones, la vacuna inmuniza a un sujeto frente a PSMA. Vacunas de este tipo, en algunas realizaciones, incluyen antígenos tales como PSMA dímeros, opcionalmente con uno o más adyuvantes para inducir o potenciar una respuesta inmune. Un adyuvante es una sustancia que potencia la respuesta inmune. Adyuvantes de muchos tipos son bien conocidos en la técnica. Ejemplos específicos de adyuvantes incluyen monofosforil-lípido A (MPL, SmithKline Beecham), saponinas que incluyen QS21 (SmithKline Beecham); oligonucleótidos inmunoestimulantes (p. ej., oligonucleótidos CpG descritos por Kreig et al., Nature 374:546-9, 1995); adyuvante incompleto de Freund; adyuvante completo de Freund; montanida; vitamina E y diversas emulsiones de agua en aceite preparadas a partir de aceites biodegradables tales como escualeno y/o tocoferol, Quil A, Ribi Detox, CRL-1005, L-121 y combinaciones de los mismos. También se contemplan para uso como vacunas en los métodos proporcionados en esta memoria formulaciones tales como las descritas en la solicitud de EE.UU. Nº. de serie 10/976352.

En algunas realizaciones, las vacunas pueden incluir uno o más de las proteínas multiméricas de PSMA aisladas descritas en esta memoria, tal como la proteína dimérica de PSMA. En algunas realizaciones, una composición de

proteínas multiméricas de PSMA contiene al menos aproximadamente 10% de proteínas multiméricas de PSMA (de la cantidad total de proteína de PSMA en la composición). En otras realizaciones, la composición de proteínas multiméricas de PSMA contiene al menos aproximadamente 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% o 99,5% de proteína multimérica de PSMA. En una realización, la composición de proteínas multiméricas de PSMA contiene proteína multimérica de PSMA sustancialmente pura, sustancialmente sin proteína monomérica de PSMA. Se entiende que la lista de porcentajes específicos incluye mediante inferencia la totalidad de los porcentajes no nombrados entre los porcentajes reseñados.

También se pueden utilizar citoquinas en protocolos de vacunación como resultado de sus propiedades reguladoras de linfocitos. Muchas citoquinas útiles para este tipo de fines serán conocidas por un experto ordinario en la técnica, incluidas interleuquina-2 (IL-2); IL-4; IL-5; IL-12, que ha demostrado potenciar los efectos protectores de vacunas (véase, p. ej., Science 268: 1432-1434, 1995); GM-CSF; IL-15; IL-18; combinaciones de las mismas, y similares. Así, las citoquinas se pueden administrar en unión con un antígeno, quimioquinas y/o adyuvantes para aumentar una respuesta inmune.

Los otros agentes terapéuticos que pueden estar presentes en las composiciones de la invención en forma no conjugada o en forma conjugada, tal como conjugada a un anticuerpo anti-PSMA o fragmento de unión a antígeno del mismo. El acoplamiento de una o más moléculas de toxina al anticuerpo anti-PSMA o fragmento de unión a antígeno del mismo pueden incluir muchos mecanismos químicos, por ejemplo una unión covalente, unión de afinidad, intercalación, unión de coordenadas y formación de complejos.

La unión covalente se puede conseguir mediante condensación directa de cadenas laterales existentes o mediante la incorporación de moléculas de puenteo externas. Muchos agentes bivalentes o polivalentes son útiles en el acoplamiento de moléculas de proteínas a otras proteínas, péptidos o funciones amina. Por ejemplo, la bibliografía está repleta de agentes de acoplamiento tales como carbodiimidas, diisocianatos, glutaraldehído, diazobencenos y hexametilendiaminas. Esta lista no pretende ser exhaustiva de los diversos agentes de acoplamiento conocidos en la técnica sino, más bien, es ilustrativa de los agentes de acoplamiento más comunes.

En algunas realizaciones, se contempla que se desee primero derivatizar el anticuerpo y luego fijar el agente terapéutico al producto derivatizado. Agentes reticulantes adecuados para uso de esta manera incluyen, por ejemplo, SPDP (N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato), y SMPT, 4-succinimidil-oxicarbonil-metil-(2piridilditio)tolueno.

Además, proteínas toxinas se pueden fusionar al anticuerpo anti-PSMA o fragmento de unión a antígeno del mismo por métodos genéticos para formar una proteína de fusión de inmunotoxina híbrida. Las proteínas de fusión pueden incluir secuencias peptídicas adicionales tales como espaciadores peptídicos que fijan operativamente, por ejemplo, el anticuerpo anti-PSMA y toxina, siempre que secuencias adicionales de este tipo no afecten de manera apreciable a las actividades de fijación como objetivo o de toxina de la proteína de fusión. Las proteínas se pueden fijar por un enlazador o un espaciador peptídico tal como un péptido espaciador de glicina-serina, o una bisagra de péptido, según se conoce en la técnica. Así, por ejemplo, el extremo C de un anticuerpo anti-PSMA o fragmento de unión a antígeno del mismo se puede fusionar al extremo N de la molécula de proteína toxina para formar una inmunotoxina que conserva las propiedades de unión del anticuerpo anti-PSMA. Otras disposiciones de fusión serán conocidas por un experto ordinario en la técnica. Para expresar la inmunotoxina de fusión, el ácido nucleico que codifica la proteína de fusión se inserta en un vector de expresión de acuerdo con métodos convencionales para la expresión estable de la proteína de fusión tal como en células de mamíferos tales como células CHO. La proteína de fusión se puede aislar y purificar de las células o del sobrenadante del cultivo utilizando una metodología convencional tal como una columna de afinidad de PSMA.

Los radionucleidos se acoplan típicamente a un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo mediante quelación. Por ejemplo, en el caso de radionucleidos metálicos, se utiliza habitualmente un quelante bifuncional para enlazar el isótopo al anticuerpo u otra proteína de interés. Típicamente, el quelante se fija primero al anticuerpo, y el conjugado quelante-anticuerpo se pone en contacto con el radioisótopo metálico. Para este fin se ha desarrollado un cierto número de quelantes bifuncionales, que incluyen las series ácido dietilentriaminapentaacético (DTPA) de aminoácidos descritos en las patentes de EE.UU. 5.124.471, 5.286.850 y

5.434.287. Como otro ejemplo, agentes quelantes bifuncionales basados en ácido hidroxámico se describen en la patente de EE.UU. 5.756.825. Otro ejemplo es el agente quelante denominado p-SCN-Bz-HEHA (ácido 1,4,7,10,13,16-hexaazaciclo-octadecano-N,N’,N”, N”’, N””, N””’-hexaacético) (Deal et al., J. Med. Chem. 42:2988 (1999), que es un quelante eficaz de radiometales tales como 225Ac. Todavía otro ejemplo es DOTA (ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano N,N’,N”,N”’-tetraacético) que es un agente quelante bifuncional (véase McDevitt et al., Science 294:1537-1540, 2001) que se puede utilizar en un método de dos etapas para el marcaje, seguido de

conjugación.

Otros agentes terapéuticos incluyen también virus selectivos de replicación. Virus competentes para la replicación tales como el mutante de adenovirus dl1520 que fija como objetivo la vía p53, ONYX-015, extermina 5 selectivamente células tumorales (Biederer, C. et al., J. Mol. Med. 80(3):163-175, 2002). En algunas realizaciones, el virus puede conjugarse a anticuerpos de PSMA o fragmentos de unión a antígeno de los mismos.

Las composiciones proporcionadas por la presente invención se pueden utilizar en unión con otras modalidades de tratamiento terapéutico. Otros tratamientos de este tipo incluyen cirugía, radiación, criocirugía, termoterapia,

10 tratamiento con hormonas, quimioterapia, vacunas y otras inmunoterapias.

Los ADCs de la invención tales como a través de su anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se pueden enlazar a un marcador. Marcadores incluyen, por ejemplo, marcadores fluorescentes, marcadores enzimáticos, marcadores radiactivos, marcadores activos de resonancia magnética nuclear, marcadores

15 luminiscentes o marcadores cromóforos.

Las composiciones proporcionadas pueden incluir un vehículo, excipiente o estabilizante fisiológica o farmacéuticamente aceptable, mezclado con el ADC. En algunas realizaciones, cuando una composición comprende dos o más ADCs diferentes, cada uno de los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los

20 mismos de los ADCs se une a un epítopo conformacional distinto de PSMA.

Tal como se utiliza en esta memoria, “célula diana” ha de significar cualquier célula indeseable en un sujeto (p. ej., un ser humano o animal) que puede ser fijada como objetivo por un ADC de la invención. En algunas realizaciones, la célula diana es una célula que expresa o sobre-expresa PSMA. Células que expresan PSMA

25 incluyen típicamente células tumorales tales como células tumorales de próstata, vejiga, páncreas, pulmón, riñón, colon, así como células de melanoma y sarcoma.

Composiciones farmacéuticas de la invención se pueden administrar en una terapia de combinación, es decir, combinadas con otros agentes. Por ejemplo, la terapia de combinación puede incluir una composición de la 30 presente invención con al menos un agente antitumoral, inmunomodulador, agente inmunoestimulante u otra terapia convencional. El otro agente se puede conjugar a o formar como una molécula de fusión recombinante con un anticuerpo de PSMA o fragmento de unión a antígeno del mismo para dirigir la fijación como objetivo del agente a células que expresan PSMA. En otra realización, el otro agente terapéutico puede estar no conjugado. Agentes terapéuticos adicionales pueden administrarse o ponerse en contacto con las células que expresan PSMA a través

35 de co-administración. “Co-administrar”, tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a administrar dos o más agentes terapéuticos simultáneamente en forma de una mezcla en una composición sencilla, o secuencialmente, y lo suficientemente próximo en el tiempo, de modo que los compuestos puedan ejercer un efecto aditivo o incluso sinérgico. Todavía en otras realizaciones, se puede administrar un agente terapéutico adicional antes, durante o después de la administración de uno o más ADCs o composiciones de los mismos.

40 Tal como se utiliza en esta memoria, “vehículo farmacéuticamente aceptable” o “vehículo fisiológicamente aceptable” incluye cualquiera y todas las sales, disolventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y de adsorción retardada y similares que sean fisiológicamente compatibles. En algunas realizaciones, el vehículo es adecuado para la administración por vía intravenosa,

45 intramuscular, subcutánea, parenteral, espinal o epidermal (p. ej., mediante inyección o infusión). Dependiendo de la vía de administración, el compuesto activo se puede revestir en un material para proteger al compuesto frente a la acción de los ácidos y otras condiciones naturales que puedan inactivar al compuesto.

Cuando se administran, los preparados farmacéuticos de la invención se aplican en cantidades farmacéuticamente

50 aceptables y en composiciones farmacéuticamente aceptables. La expresión “farmacéuticamente aceptable” significa un material no tóxico que no interfiere con la eficacia de la actividad biológica de los ingredientes activos. Preparados de este tipo pueden contener rutinariamente sales, agentes tampón, conservantes, vehículos compatibles y, opcionalmente, otros agentes terapéuticos tales como agentes potenciadores inmunes suplementarios que incluyen adyuvantes, quimioquinas y citoquinas. Cuando se utilizan en medicina, las sales

55 deberían ser farmacéuticamente aceptables, pero convenientemente se pueden utilizar sales no farmacéuticamente aceptables para preparar sales farmacéuticamente aceptables de las mismas y no se excluyen del alcance de la invención.

Una sal conserva la actividad biológica deseada del compuesto parental y no imparte efectos toxicológicos 60 indeseados algunos (véase, p. ej., Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66: 1-19). Ejemplos de sales de este tipo incluyen sales por adición de ácidos y sales por adición de bases. Sales por adición de ácidos incluyen las derivadas de ácidos inorgánicos no tóxicos tales como clorhídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bromhídrico, yodhídrico, fosforoso y similares, así como de ácidos orgánicos no tóxicos tales como ácidos mono- y dicarboxílicos alifáticos, ácidos alcanoicos fenil-sustituidos, ácidos hidroxi-alcanoicos, ácidos aromáticos, ácidos

5 sulfónicos alifáticos y aromáticos y similares. Sales por adición de bases incluyen las derivadas de metales alcalinotérreos tales como sodio, potasio, magnesio, calcio y similares, así como de aminas orgánicas no tóxicas tales como N,N’-dibenciletilendiamina, N-metilglucamina, cloroprocaina, colina, dietanolamina, etilendiamina, procaina y similares.

10 Un ADC se puede combinar, si se desea, con un vehículo farmacéuticamente aceptable. La expresión “vehículo farmacéuticamente aceptable” tal como se utiliza en esta memoria, significa una o más cargas sólidas o líquidas, diluyentes o sustancias encapsulantes compatibles, que sean adecuados para la administración a un ser humano. El término “vehículo” designa un ingrediente orgánico o inorgánico, natural o sintético, con el que el ingrediente activo se combina para facilitar la aplicación. Los componentes de las composiciones farmacéuticas son también

15 capaces de ser co-mezclados de una manera tal que no exista interacción que perjudique sustancialmente la eficacia farmacéutica deseada.

Las composiciones farmacéuticas pueden contener agentes tampón adecuados, que incluyen: ácido acético en una sal; ácido cítrico en una sal; ácido bórico en una sal; y ácido fosfórico en una sal.

20 Las composiciones farmacéuticas también pueden contener, opcionalmente, conservantes adecuados tales como cloruro de benzalconio; clorobutanol; parabenos y timerosal.

Las composiciones farmacéuticas pueden presentarse convenientemente en forma dosificación unitaria y se

25 pueden preparar por cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica de farmacia. Todos los métodos incluyen la etapa de asociar el agente activo con un vehículo que constituye uno o más ingredientes accesorios. En general, las composiciones se preparan asociando uniforme e íntimamente el compuesto activo con un vehículo líquido, un vehículo sólido finamente dividido, o ambos, y luego, si es necesario, conformando el producto.

30 Composiciones adecuadas para la administración por vía parenteral comprenden un preparado acuoso o no acuoso estéril de los compuestos que, en algunas realizaciones, es isotónico con la sangre del receptor. Este preparado se puede formular de acuerdo con métodos conocidos, utilizando agentes dispersantes o humectantes y agentes de suspensión adecuados. El preparado inyectable estéril también puede ser una disolución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o disolvente no tóxico y parenteralmente aceptable, por ejemplo en forma de una

35 disolución en 1,3-butanodiol. Entre los vehículos y disolventes aceptables que se pueden emplear se encuentran agua, solución de Ringer y disolución isotónica de cloruro de sodio. Además, convencionalmente se emplean aceite fijos estériles como disolvente o medio de suspensión. Para este fin, se puede emplear cualquier mezcla de aceite fijo que incluya mono-o di-glicéridos sintéticos. Además, en la preparación de inyectables se pueden utilizar ácidos grasos tales como ácido oleico. Formulaciones de vehículo adecuadas para la administración por vía oral,

40 subcutánea, intravenosa, intramuscular, etc. se pueden encontrar en Remington’s Pharmaceuticals Sciences, Mack Pulbishing Co., Easton, PA.

Los compuestos activos se pueden preparar con vehículos que protegerán al compuesto frente a una liberación rápida tal como una formulación de liberación controlada, incluidos implantes, parches transdermales y sistemas

45 de administración microencapsulados. Se pueden utilizar polímeros biodegradables y biocompatibles tales como etileno-acetato de vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Muchos métodos para la preparación de formulaciones de este tipo están patentados o son generalmente conocidos por los expertos en la técnica. Véase, p. ej. Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, comp., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1978.

50 Los productos terapéuticos de la invención se pueden administrar por cualquier vía convencional, incluida inyección o mediante infusión gradual a lo largo del tiempo. La administración puede ser, por ejemplo, oral, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intracavidad, intratumoral o transdermal. Cuando se utilizan terapéuticamente compuestos que contienen anticuerpos, vías de administración incluyen la intravenosa y por

55 aerosol pulmonar. Técnicas para preparar sistemas de administración de aerosol que contienen anticuerpos son bien conocidas por los expertos en la técnica. Generalmente, sistemas de este tipo deberían utilizar componentes que no perjudiquen significativamente las propiedades biológicas de los anticuerpos tales como la capacidad de unión al parátopo (véase, por ejemplo, Sciarra y Cutie, “Aerosols” en Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18ª edición, 1990, págs. 1694-1712). Los expertos en la técnica pueden determinar fácilmente los diversos parámetros

60 y condiciones para producir aerosoles de anticuerpo sin recurrir a una experimentación excesiva.

Las composiciones de la invención se administran en cantidades eficaces. Una “cantidad eficaz” es la cantidad de cualquiera de los ADCs proporcionadas en esta memoria que sola, o junto con dosis adicionales y/u otros agentes terapéuticos, produce la respuesta deseada, p. ej., trata una enfermedad mediada por PSMA en un sujeto. Esto puede implicar solamente ralentizar temporalmente el progreso de la enfermedad, a pesar de que en algunas realizaciones implica detener permanentemente el progreso de la enfermedad. Esto se puede vigilar por métodos rutinarios. La respuesta deseada al tratamiento de la enfermedad o estado también puede retardar el brote o incluso prevenir el brote de la enfermedad o estado. Una cantidad que es eficaz puede ser la cantidad de un ADC solo que produce el punto final terapéutico deseado. Una cantidad que es eficaz es también la cantidad de un ADC en combinación con otro agente que produce el resultado deseado.

Cantidades de este tipo dependerán, naturalmente, de la enfermedad mediada por PSMA particular que se esté tratando, la gravedad del estado, los parámetros del paciente individuales incluidas la edad, condición física, altura y peso, la duración del tratamiento, la naturaleza de la terapia concurrente (si existe), la vía específica de administración y factores similares dentro del conocimiento y experiencia del practicante. Estos factores son bien conocidos por los expertos ordinarios en la técnica y pueden acometerse sin más que mediante una experimentación rutinaria. Generalmente, se prefiere utilizar una dosis máxima de los componentes individuales o combinaciones de los mismos, es decir, la dosis más elevada segura, de acuerdo con el juicio médico. Se comprenderá por parte de los expertos ordinarios en la técnica, sin embargo, que un paciente puede insistir en una dosis menor o una dosis tolerable por razones médicas, razones psicológicas o virtualmente por cualesquiera otras razones.

Las composiciones farmacéuticas utilizadas en los métodos que anteceden son preferiblemente estériles y contienen una cantidad eficaz de un ADC, sólo o en combinación con otro agente, para producir la respuesta deseada en una unidad de peso o volumen adecuada para la administración a un paciente. La respuesta, por ejemplo, se puede medir determinando los efectos fisiológicos de la composición de ADC tales como la regresión de un tumor o la disminución de síntomas de la enfermedad. Otros ensayos serán conocidos por un experto ordinario en la técnica y se pueden emplear para medir el nivel de la respuesta.

Las dosis de ADCs administradas a un sujeto se pueden elegir de acuerdo con diferentes parámetros, en particular de acuerdo con el modo de administración utilizado y el estado del sujeto. Otros factores incluyen el período de tratamiento deseado. En el caso de que una respuesta en un sujeto sea insuficiente en las dosis iniciales aplicadas, se pueden emplear dosis mayores (o dosis eficazmente mayores por una vía de suministro diferente y más localizada) en la medida en que lo permita la tolerancia del paciente.

En general, las dosis pueden oscilar entre aproximadamente 10 μg/kg y aproximadamente 100.000 μg/kg. En algunas realizaciones, las dosis pueden oscilar entre aproximadamente 0,1 mg/kg y aproximadamente 20 mg/kg. Todavía en otras realizaciones, las dosis pueden oscilar entre aproximadamente 0,1 mg/kg y 5 mg/kg, 0,1 mg/kg y 10 mg/kg o 0,1 mg/kg y 15 mg/kg. Todavía en otras realizaciones, las dosis oscilan entre aproximadamente 1 mg/kg y 5 mg/kg, 5 mg/kg y 10 mg/kg, 10 mg/kg y 15 mg/kg o 15 mg/kg y 20 mg/kg. En realizaciones adicionales, la dosis es de aproximadamente 0,1 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, 7 mg/kg, 10 mg/kg, 12 mg/kg, 15 mg/kg, 17 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg o 30 mg/kg. En otra realización, la dosis es de aproximadamente 1 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg o 6 mg/kg. Basado en la composición, la dosis se puede administrar de modo continuo tal como mediante una bomba continua, o a intervalos periódicos. En algunas realizaciones, cuando el ADC se administra por vía intravenosa, la dosis oscila entre 0,1 y 20 mg/kg o cualquier valor entremedias. Intervalos de tiempos deseados de múltiples dosis de una composición particular se pueden determinar sin una experimentación excesiva por parte de un experto en la técnica. Otros protocolos para la administración de las composiciones proporcionadas serán conocidas por un experto ordinario en la técnica, en que la cantidad de dosis, el programa de administración, los sitios de administración, el modo de administración y similares varían de lo que antecede. En algunas realizaciones, a los sujetos se les administra el ADC con un régimen de dosis de q4d x 3 o q4d x 6. En una realización, la dosis se administra por vía intravenosa. En otra realización, el régimen de dosis es una dosis intravenosa única.

La administración de composiciones de ADC a mamíferos distintos de seres humanos, p. ej., para fines de ensayo

o fines terapéuticos de veterinaria, se lleva a cabo bajo sustancialmente las mismas condiciones que las arriba descritas.

Las composiciones de la presente invención tienen utilidades diagnósticas y terapéuticas in vitro e in vivo. Por ejemplo, las moléculas se pueden administrar a células de un cultivo, p. ej. in vitro o ex vivo, o en un sujeto, p. ej. in vivo, para tratar, prevenir o diagnosticar una diversidad de enfermedades mediadas por PSMA. Tal como se

utiliza en esta memoria, el término “sujeto” pretende incluir seres humanos y animales no humanos. Sujetos incluyen un paciente humano que tiene un trastorno caracterizado por la expresión, típicamente una expresión aberrante (p. ej., sobre-expresión) de PSMA, trastornos de este tipo están incluidos en la definición “enfermedad mediada por PSMA”.

Las composiciones proporcionadas en esta memoria se pueden utilizar en la terapia in vivo de cáncer. Los ADCs se pueden utilizar para inhibir la proliferación de las células o tejidos malignos después de la administración y localización de los conjugados. Las composiciones proporcionadas pueden incluir anticuerpos anti-PSMA, en algunas realizaciones, que pueden mediar en la destrucción del tumor mediante fijación del complemento o citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos. Alternativamente, las composiciones pueden contener un agente terapéutico adicional que dé como resultado efectos terapéuticos sinérgicos (Baslya y Mendelsohn, 1994, Breast Cancer Res. and Treatment 29: 127-138).

Las composiciones de la invención también se pueden administrar, en algunas realizaciones, junto con anticuerpos anti-PSMA de complemento y/o no conjugados. Por consiguiente, dentro del alcance de la invención se encuentran composiciones que comprenden ADC y suero o complemento. Estas composiciones son ventajosas, debido a que el complemento está situado en estrecha proximidad a los anticuerpos humanos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos. Alternativamente, los ADCs, anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos y/o complemento o suero se pueden administrar por separado.

El uso de los ADCs de la presente invención tiene un cierto número de beneficios. Dado que los ADCs fijan preferentemente como objetivo PSMA, p. ej., en células de cáncer de próstata, se puede reponer otro tejido. Como resultado, el tratamiento con agentes biológicos de este tipo es más seguro, particularmente para pacientes de edad. Se espera que el tratamiento con ADCs de acuerdo con la presente invención sea particularmente eficaz, en algunas realizaciones, debido a que puede dirigir altos niveles de ADCs a la médula ósea y nódulos linfáticos en los que pueden predominar metástasis de cáncer tales como metástasis de cáncer de próstata. El tratamiento con ADCs de acuerdo con la presente invención se puede vigilar eficazmente con parámetros clínicos tales como antígeno prostático específico en suero y/o características patológicas del cáncer de un paciente, incluida fase, puntuación de Gleason, invasión extracapsular, seminal, vesicular o perineural, márgenes positivos, nódulos linfáticos implicados, etc. Alternativamente, estos parámetros se pueden utilizar para indicar cuando debería emplearse un tratamiento de este tipo.

También dentro del alcance de la invención se encuentran kits que comprenden las composiciones, p. ej. uno o más ADCs de la invención e instrucciones para su uso. Los kits pueden contener, además, al menos un reactivo adicional tal como complemento, agente quimioterapéutico, un corticosteroide o uno o más anticuerpos que se unen a PSMA. Otros kits pueden incluir también multímeros de PSMA. En otra realización, un kit puede comprender un soporte que esté repartido en compartimientos para alojar en estrecho confinamiento en su interior uno o más medios de recipiente o series de medios de recipiente tales como tubos de ensayo, viales, matraces, frascos, jeringas o similares. Uno primero de dichos medios de recipiente o serie de medios de recipiente puede contener uno o más anticuerpos anti-PSMA o fragmentos de unión a antígeno de los mismos. Un segundo medio de recipiente o series de medio de recipiente puede, en algunas realizaciones, contener MMAE o MMAF, o el compuesto de Fórmula 1 conjugado a MMAE o MMAF. En algunas realizaciones, un tercer medio de recipiente o series de medio de recipiente contienen un compuesto de Fórmula 1. Se pueden preparar kits para uso en la localización del tumor in vivo y el método de terapia que contiene los ADCs. Los componentes de los kits pueden envasarse en un medio acuoso o en forma liofilizada. Los componentes de los conjugados ADC se pueden suministrar en forma totalmente conjugada, en forma de compuestos intermedios o como restos separados a conjugar por parte del usuario del kit.

Tal como se utiliza en esta memoria con respecto a polipéptidos, proteínas o fragmentos de los mismos, “aislado” significa separado de su entorno nativo y presente en una cantidad suficiente para permitir su identificación o uso. Aislado, cuando se refiere a una proteína o polipéptido significa, por ejemplo. (i) producido selectivamente mediante clonación de expresión o (ii) purificado tal como por cromatografía o electroforesis. Proteínas o polipéptidos aislados pueden pero no necesitan ser sustancialmente puros. La expresión “sustancialmente puros” significa que las proteínas o polipéptidos están esencialmente exentos de otras sustancias con las que se pueden encontrar en la naturaleza o sistemas in vivo en una medida práctica y apropiada para su uso pretendido. Polipéptidos sustancialmente puros se pueden producir por técnicas bien conocidas en la técnica. Dado que una proteína aislada se puede mezclar con un vehículo farmacéuticamente aceptable en un preparado farmacéutico, la proteína puede comprender sólo un pequeño porcentaje en peso del preparado. No obstante, la proteína está aislada, debido a que ha sido separada de las sustancias con las que puede estar asociada en sistemas vivos, es decir, aislada de otras proteínas.

Las composiciones proporcionadas en esta memoria pueden estar en forma liofilizada o pueden ser proporcionadas en un medio acuoso.

5 La presente invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes Ejemplos.

Ejemplos

Ejemplo 1: Potente Actividad Antitumoral de un Anticuerpo Monoclonal Conjugado con Auristatina, 10 Totalmente Humano, contra Antígeno Prostático Específico de Membrana

Materiales y métodos

Líneas de células y anticuerpos

15 LNCaP™ (CRL-1740), PC-3™ (CRL-1435) y 3T3™ (CRL-2752) se obtuvieron de American Type Culture Collection (Rockville, MD). La línea de células C4-2, una sub-línea de células procedente de LNCaP™, se obtuvo de The Cleveland Clinic Foundation (Cleveland, OH). Una línea de células de 3T3™-PSMA se obtuvo de Memorial Sloan-Kettering Cancer Center (Nueva York, NY). LNCaP™, C4-2 y PC-3™ se cultivaron en RPMI 1640 (Life

20 Technologies, Gaithersburg, MD), y 3T3™ y 3T3™-PSMA se cultivaron en DMEM (Life Technologies). Los medios de cultivo se suplementaron con suero de bovino fetal al 10% (Hyclone, Logan, UT), L-glutamina, penicilina y estreptomicina (Life Technologies). Se determinó que células C4-2, LNCaP™ y 3T3™-PSMA expresan PSMA a niveles de aproximadamente 2 x 105, 6 x 105 y > 1 x 106 copias/célula, respectivamente, de acuerdo con los métodos publicados (Ma D, et al., Leukemia 2002; 16:60-6). C4-2 es un sub-clon andrógeno-independiente de

25 células LNCaP™ andrógeno-dependientes. PC-3™ es una línea de células de cáncer de próstata des-diferenciada que no expresa PSMA. PSMA Acms (AB-PG1-XG1-006 (PTA-4403 y PTA 4404) y Abgenix 4.40.2 (PTA-4360)) se produjeron tal como se describe previamente en la solicitud de patente de EE.UU. Nº. 10/395.894 y Schulke N et al., PNAS USA, 2003; 100:12590-5, cada uno de los cuales se incorpora en esta memoria como referencia en su totalidad. Abgenix 4.40.2 se utilizó como control. Un PSMA Acm totalmente humano (IgG1, !) se desarrolló en

30 ratones transgénicos para el locus del gen de inmunoglobulina humana (XenoMice™, Abgenix, Inc., Fremont, CA) después de inmunización con PSMA soluble recombinante y células LNCaP según se ha descrito previamente (Schulke N et al., PNAS USA, 2003; 100:12590-5).

Internalización de PSMA

35 Acms se modificaron con quelatos bifuncionales de ácido ciclohexil-dietilentriaminapentaacético (CHX-DTPA) obtenidos del National Cancer Institute (Bethesda, MD) y se marcaron con 111In (Perkin Elmer, Boston, MA), tal como se describe previamente (Ma D, et al., Leukemia 2002; 16:60-6; Nikula TK, et al., J Nucl. Med 1999; 40:16676). Se determinó que el Acm marcado con 111In era > 90% inmunorreactivo al incubar el radioconjugado con un

40 exceso de células 3T3™-PSMA y medir la fracción unida de acuerdo con métodos publicados (Ma D, et al., Leukemia 2002; 16:60-6; Nikula TK, et al., J Nucl. Med 1999; 40:166-76). Para el análisis de la internalización, el Acm marcado con 111In se incubó con 2 x 105 células C4-2 a 37ºC en 5% de CO2. A instantes secuenciales, el Acm no ligado se separó mediante lavado en PBS y el Acm de la superficie de la célula se eluyó utilizando el tampón de pH bajo (pH 2,4, glicina/NaCl). El material eluido de bajo pH se recontó por separado a partir del sedimento de

45 células, y el porcentaje de internalización se calculó como se describe previamente (McDevitt MR, et al., Cancer Res 2000; 60:6095-100).

Preparación de Conjugados Anticuerpo-Fármaco

50 La síntesis y el diseño de los enlazadores y la conjugación del enlazador al fármaco citotóxico se llevaron a cabo según se describe en la patente de EE.UU. Nº. 6.884.889 y la patente de EE.UU. Nº. 6.214.345, cada una de las cuales se incorpora en esta memoria como referencia en su totalidad. La conjugación de Acms con maleimidocaproil (mc)-valina (Val)-citrulina (Cit)-monometil auristatina E (MMAE) se realizó según se describe (Doronina SO, et al., Nat. Biotechnology. 2003; 21:778-84). PSMA Acm e IgG1 humana control de isotipo

55 (Calbiochem, San Diego, CA) en PBS que contenía borato 50 mM, pH 8,0, se trataron con ditiotreitol (DTT) (10 mM final) a 37ºC durante 30 min. Las concentraciones de la reacción finales eran 7,5 mL – 8,0 ml, 1 mL de borato de sodio 0,5 M pH 8 y NaCl 0,5 M, 1 mL de DTT 100 mM y 0,5 mL o 0 ml, respectivamente, de PBS. Esta disolución se incubó a 40ºC durante 1 h y el anticuerpo se purificó en una columna de filtración en gel. La columna se equilibró con DTPA 10 mM en PBS a razón de 10 mL/min, se cargó con 10,0 mL de mezcla de reducción de

60 anticuerpos y se eluyó a 8 mL/min en tampón PBS/DTPA. La concentración de anticuerpo-cisteína tioles producidos se determinó titulando con 5,5’-ditio-bis-(ácido 2-nitrobenzoico) (DTNB) (Pierce Chemical Co., Rockford, IL). Un producto químico equivalente se puede obtener de Sigma (St. Louis, MO).

El Acm totalmente reducido Abgenix 4.40.2 (22,6 mL de Acm 7,8 μM, cisteína-tiol 75,6 μM) se re-oxidó

5 parcialmente con 35,43 μL de DTNB 10 mM, y el Acm totalmente reducido AB-PG1-XG1-006 (25,1 mL de Acm 11,2 μM, cisteína-tiol 95,8 μM) se re-oxidó parcialmente con 56,27 μL de DTNB 10 mM. El color de la disolución se volvió inmediatamente amarilo.

El fármaco mc-Val-Cit-carbamato de paraaminobencil-MMAE (vcMMAE) se conjugó luego con los Acms

10 parcialmente re-oxidados como sigue: primeramente, los Acms se enfriaron hasta 0ºC. vcMMAE (5 equivalentes molares por anticuerpo: 89,7 y 140,6 μL, respectivamente, de una disolución patrón 10 mM de vcMMAE) se disolvieron en 5 mL de acetonitrilo y luego se añadieron a la disolución de anticuerpos al tiempo que se sometía a vórtice con cuidado. Las mezclas de reacción se incubaron en hielo. No se observó cambio de color adicional alguno. Las mezclas de reacción se enfriaron bruscamente con 20 equivalentes molares de cisteína/fármaco. El

15 conjugado se purificó utilizando una columna de filtración en gel a 4ºC y se eluyó con PBS a razón de 8,0 mL/min. Se determinó que los ADCs tenían > 98% de Acm monomérico que contenía 3,0-3,5 fármacos por Acm, utilizando los métodos publicados (Doronina SO, et al., Nat Biotechnol. 2003; 21: 778-84).

Alternativamente, la conjugación de Acms con maleimidocaproil (mc)-valina (Val)-citrulina (Cit)-monometil

20 auristatina E (MMAE) se realizó como se describe (Doronina SO, et al., Nat Biotechnol. 2003; 21:778-84). PSMA Acm e IgG1 humana control de isotipo (Calbiochem, San Diego, CA) en PBS, que contenía borato 50 mM, pH 8,0, se trataron con ditiotreitol (DTT) (10 mmM final) a 37ºC durante 30 min. Los Acms se intercambiaron en PBS que contenía DTPA 1 mM (Aldrich, Milwaukee, WI) mediante el paso a través de una columna Sephadex G-25 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Las disoluciones de Acm se enfriaron rápidamente hasta 4ºC y se

25 combinaron con el derivado de fármaco maleimido en CH3CN frío. Al cabo de una 1 hora, las reacciones se enfriaron bruscamente con cisteína en exceso, y los conjugados se concentraron e intercambiaron en tampón PBS. Se determinó que los ADCs tenían > 98% de Acm monomérico que contenía 3,0-3,5 fármacos por Acm utilizando métodos publicados (Doronina SO, et al., Nat Biotechnol. 2003; 21:778-84).

30 Reactividad de ADCs con PSMA de la Superficie de la Célula

La unión de PSMA Acm y ADC a células 3T3™-PSMA y 3T3™ parentales se analizó utilizando un citómetro de flujo FACSCalibur (BD Bioscience, San Diego, CA). En síntesis, 2 x 105 células 3T3™-PSMA (o 3T3™) se incubaron con diferentes concentraciones de Acm o ADC en hielo durante 1 h. Después del lavado, la presencia de

35 anticuerpos ligados se detectó utilizando IgG-FITC anti-humano de cabra (Caltag Laboratories, Burlingame, CA). En paralelo se examinaron el anticuerpo control de isotipo y ADC.

Ensayo de Citotoxicidad In Vitro

40 Células PSMA-positivas (C4-2, LNCaP™ o 3T3™-PSMA) y células PSMA-negativas (PC-3™ o 3T3™) se añadieron a microplacas de 96 pocillos (Falcon, BD Biosciences, San Jose, CA) a razón de 2,5 x 103 células/pocillo y se incubaron durante una noche a 37ºC y 5% de CO2. Las células se incubaron luego con ADCs diluidos en serie durante 4 días. El medio de cultivo celular se reemplazó por medio reciente que contenía azul de Alamar al 10% (Biosource International, Camarillo, CA), y las células se incubaron durante 4 h. Después, las placas se leyeron en

45 un lector de placas para fluorescencia utilizando una longitud de onda de excitación de 530 nm y una longitud de onda de emisión de 590 nm. La supervivencia de células se comparó en cultivos tratados y no tratados, y se determinó la concentración de ADC requerida para el exterminio del 50% de las células (valor CI50).

Modelo de Xenoinjerto de Cáncer de Próstata Andrógeno-Independiente

50 Todos los estudios con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices del Comité para el Cuidado y Uso de Animales. A ratones inmunológicamente deficientes machos atímicos (National Cancer Institute, Frederick, MD) de 6-8 semanas de edad se les implantaron con una inyección intramuscular de 5 x 106 células C4-2 mezcladas con Matrigel al 50% (Beckon Dickinson Labware, Bedford, MA) en la pata trasera izquierda según se

55 describe (McDevitt MR, et al., Cancer Res 2000; 60:6095-100). Aproximadamente 1 día antes del inicio del tratamiento, los animales fueron repartidos al azar de acuerdo con los niveles de suero de antígeno prostático específico (PSA) según se mide por ELISA (Medicorp, Montreal, Quebec, Canadá). ADC, Acms y control vehículo se administraron a través de inyección en la vena de la cola. En la primera serie de experimentos, los ratones fueron tratados en grupos de 6 con 2 ó 10 mg/kg de PSMA ADC o con control vehículo. El tratamiento se inició 17

60 días después de la implantación y consistía en 3 inyecciones a intervalos de 4 días (q4d x 3). La segunda serie de experimentos examinó los niveles de dosis de 0,3 ó 6 mg/kg. El tratamiento se inició 14 días post-implantación y consistía en 6 inyecciones a intervalos de 4 días (q4d x 6). Los animales fueron vigilados en cuanto a su aspecto físico, peso corporal, nivel de PSA y tamaño del tumor. Las tasas de supervivencia se registraron a lo largo de los estudios.

Análisis Estadísticos

Los efectos del tratamiento se examinaron en cuanto a la significancia a través de ensayos t (para niveles de PSA)

o ensayos de rangos logarítmicos (para la supervivencia de animales) utilizando análisis apareados de dos colas. 10 Los datos eran considerados significativos cuando P < 0,05.

Resultados

Internacionalización de PSMA Acm en Células de Cáncer de Próstata Humano

15 La internalización se examinó utilizando PSMA Acm marcado con 111In y células C4-2. En las Fig. 1 se ilustra la unión total y el porcentaje de internalización a lo largo del tiempo. Más de la mitad del Acm ligado se internalizó en el espacio de 2 h (Fig. 1A). La unión total aumentó a lo largo del tiempo, presumiblemente debido al reciclaje de PSMA (Fig. 1B). Así, el PSMA Acm se internaliza fácilmente en células que expresan PSMA.

Reactividad del PSMA ADC con Células que expresan PSMA

La citometría de flujo se utilizó para comparar la unión de PSMA Acm y ADC. El Acm y ADC no modificados demostraron niveles equiparables de unión a 3T3™-PSMA a lo largo de un amplio intervalo de dilución (Fig. 2). Ni

25 la cantidad máxima de unión ni la concentración requerida para la unión semi-máxima se vio apreciablemente afectada por la conjugación. No se observó unión significativa alguna para el ADC de control de isotipo o anticuerpo en células 3T3™-PSMA o para el PSMA Acm o ADC en células 3T3™ parentales.

Potencia y selectividad in vitro del PSMA ADC

30 PSMA y control ADCs se sometieron a ensayo en cuanto a citotoxicidad in vitro frente a líneas de células de cáncer de próstata humanas y células 3T3™-PSMA. La Fig. 3 ilustra curvas de dosis-respuesta para células C4-2 PSMApositivas y células PC-3™ PSMA-negativas en un experimento representativo, y valores CI50 para las diversas líneas de células se listan en la Tabla 2. El PSMA ADC eliminaba en potencia todas las líneas de células PSMA

35 positivas examinadas, a valores CI50 de 65-210 pM, mientras que estas concentraciones no tenían efecto alguno sobre células PSMA-negativas. En contraposición, se requerían concentraciones aproximadamente 1000 veces mayores para el ADC control, cuya actividad era independiente de la expresión de PSMA (Fig. 3 y Tabla 2).

Tabla 2: Sumario de la citotoxicidad in vitro (valores CI50 en pM)

C4-2: LNCaP™ 3T3™-PSMA

PSMA ADC: 65 ± 19 (n = 3) 83 ± 21 (n = 2) 208 ± 37 (n = 3)

ADC control: 54.954 (n = 1) 72.444 (n = 1) 154.880 (n = 1)

Selectividad*: 848 877 744

*La selectividad iguala a la relación de valores CI50 observados para el PSMA ADC y ADC control

Eficacia del PSMA ADC en un Modelo de Xenoinjerto de Cáncer de Próstata Andrógeno-Independiente

45 La eficacia in vivo del PSMA ADC se evaluó en un modelo de ratón de cáncer de próstata humano andrógenoindependiente. A ratones inmunológicamente deficientes se les injertaron por vía intramuscular células C4-2 en la pata trasera izquierda. Aproximadamente 14-17 días más tarde se midieron los niveles de PSA en el suero y se utilizaron para asignar al azar, animales a grupos de tratamiento. Los animales fueron tratados por vía intravenosa

50 con el PSMA ADC y los animales fueron vigilados en cuanto a la carga del tumor, niveles de PSA y otros parámetros durante un tiempo tan prolongado como de 500 días.

En el primer experimento, los animales fueron tratados q4d x 3 con 0,2 ó 10 mg/kg de PSMA ADC. Los animales que se dejaron sin tratar desarrollaron rápidamente tumores y los animales tenían una supervivencia mediana de 55 32 días. En contraposición, los grupos tratados con 2 mg/kg y 10 mg/kg de PSMA ADC tenían supervivencias medianas de 58 días (P = 0,0035) y 94,5 días (P = 0,0012), respectivamente (Tabla 3, Fig. 4A). El tratamiento con

PSMA ADC mejoró significativamente la supervivencia mediana hasta 4,5 veces de una manera dependiente de la dosis. No existía evidencia de toxicidad relacionada con el tratamiento.

Los niveles de PSA en el suero se midieron a lo largo del tiempo mediante ELISA. La Fig. 4B representa la

5 concentración media de PSA en cada uno de los grupos en los días de estudio 17, 23 y 30. El tratamiento a razón de 10 mg/kg redujo los niveles de PSA > 10 veces desde 8,8 + 11,7 ng/mL el día 17 hasta 0,7 + 0,9 ng/mL el día 30, mientras que niveles de PSA en el grupo control aumentaban > 60 veces a lo largo del mismo período de tiempo. Se observó una respuesta intermedia a 2 mg/kg de PSMA ADC. Las diferencias en los niveles de PSA el día 30 eran significativas tanto para los grupos de dosis de 2 mg/kg (P = 0,0048) como de 10 mg/kg (P = 0,0006).

10 Tres de seis animales en el grupo de 10 mg/kg tenían un PSA no detectable hasta el día 52 del estudio.

Con el fin de ampliar estos hallazgos, se realizó un segundo estudio de PSMA ADC que también incluía Acm no modificado y ADC control de isotipo. Después de la aleatorización el día 14 con un nivel medio de PSA de 2,0 + 1,1 ng/mL en cada uno de los grupos (n = 5), los animales fueron tratados con un régimen de q4d x 6. En la Fig. 5 15 se representan curvas de supervivencia según Kaplan-Meier para cada uno de los grupos. Los animales tratados con control vehículo, 6 mg/kg de PSMA Acm no modificado y 6 mg/kg de ADC control tenían tiempos de supervivencia medianos similares de 29, 31 y 31 días, respectivamente; y estas diferencias no eran significativas. Sin embargo, la supervivencia mediana se amplió hasta 49 días y 148 días para animales tratados con 3 mg/kg y 6 mg/kg de PSMA ADC, respectivamente (Tabla 3). El tratamiento del grupo de PSMA ADC con 6 mg/kg mejoró la 20 supervivencia post-aleatorización 7,9 veces con relación al grupo ADC control (P = 0,0018). El día 500, 2 de 5 animales no tenían evidencia de tumor, no había un PSA mensurable y se consideraron curados mediante el tratamiento. Como en el primer estudio, el tratamiento tenía un impacto significativo sobre los niveles de PSA el día 29 (P = 0,0068 para grupos de 6 mg/kg de PSMA y vehículo). Además de ello, en el grupo de 6 mg/kg de PSMA ADC, el PSA del suero disminuyó hasta niveles no detectables post-tratamiento y permaneció siendo no

25 detectable hasta el día 63 en 4 de 5 animales. No existía una toxicidad evidente asociada con la terapia con ADC. El aspecto físico y la actividad se vieron no afectados por el tratamiento, y los pesos corporales de animales tratados y vehículo-control no eran significativamente diferentes en cualquier instante.

Tabla 3: Sumario de los tiempos de supervivencia medianos de animales portadores de tumores C4-2 30 tratados con PSMA ADC

Artículo de ensayo: Dosis (mg/kg) Supervivencia mediana (días) Valor P*

Estudio nº 1: Vehículo NA 32 NA

PSMA ADC: 2 58 0,0035

PSMA ADC: 10 95 0,0010

Estudio nº 2: Vehículo NA 29 NA

PSMA Acm: 6 31 0,1869

ADC control: 6 31 0,2970

PSMA ADC: 3 49 0,0018

PSMA ADC: 6 148 0,0018

*Comparado con el grupo control vehículo en un análisis de rangos logarítmicos de doble cara. NA = no aplicable

Ejemplo 2: Evaluación de PSMA Acm Conjugado a Tres Fármaco-enlazador Diferentes

35 Se evaluó el PSMA Acm cuando se conjugaba a vcMMAE y a otros dos fármaco-enlazador vcMMAF y mcMMAF. Las estructuras químicas completas de los tres fármaco-enlazador diferentes se ilustran en la Fig. 6.

Preparación de Tres Conjugados de Fármaco-enlazador de PSMA Acm

40 Los tres fármaco-enlazador se conjugaron directamente a PSMA Acm a través de un enlace tioéter para preparar aproximadamente cuatro fármacos por conjugado de anticuerpos. La reducción parcial de los disulfuros de la intercadena del Acm prosiguió con un ligero exceso de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) a pH 7,2 y 37ºC y la subsiguiente conjugación de los tioles libres con fármaco-enlazadores era cuantitativa. En síntesis, el PSMA Acm

45 (10 mg, 67,5 nmol en PBS) se incubó a 37ºC con DTPA 1 mM y 169 nmol de TCEP durante 90 min. A tres instantes durante la incubación (30, 60 y 90 minutos) se separaron partes alícuotas de 50 μg de Acm y se hicieron reaccionar con un exceso de vcMMAE. El análisis de los ADCs resultantes mediante cromatografía por interacción hidrofóbica permitió seguir el progreso de la reducción. Los resultados indicaban que el Acm se reducía rápidamente bajo las condiciones anteriores, completándose esencialmente al cabo de 1 hora. Además de ello, el

50 grado de reducción resultó en una carga media de fármaco de 5 fármacos/Acm.

Para preparar un ADC 4 veces cargado con fármaco-enlazadores procedentes del Acm parcialmente reducido anterior, 0,5 equivalentes de DTNB se añadieron para re-oxidar de nuevo la población de Acm al nivel deseado. Después, 3 mg de este material (20,3 nmol) se hicieron reaccionar con 101 nmol de vcMMAE, vcMMAF o 5 mcMMAF en una disolución de reacción de dimetilsulfóxido (DMSO) al 15%. Esta reacción prosiguió durante 1 hora a 0ºC y luego se enfrió bruscamente con un exceso de 20 veces de N-acetil-cisteina. Los ADCs se separaron del fármaco que no había reaccionado y otras impurezas de moléculas pequeñas mediante cromatografía por exclusión del tamaño (SEC) en una columna PD-10 (Amersham Biosciences/GE Healthcare, Piscataway, NJ) y se concentraron con un dispositivo de concentración centrífugo (30 kD MWCO) (Amicon Bioseparations, Millipore

10 Corporation, Bedford, MA).

Un resumen de la caracterización de tres conjugados fármaco-enlazador se proporciona en las Tablas 4-6 para vcMMAE, vcMMAF y mcMMAF, respectivamente. Para cada uno de los tres fármaco-enlazadores, el ADC contiene aproximadamente 4 fármacos por Acm, según se determina mediante distribución de la carga de cadena H/L y la

15 distribución de la especie, y < 2% de fármaco libre según se determina utilizando HPLC de fase inversa (RP). Para todos los conjugados, no se detectaron agregados mediante SEC-HPLC. Además, los rendimientos globales de Acm eran 70-80%.

Tabla 4

20 Certificado de Ensayo del Conjugado 699028A PSMA Acm vcMMAE Reducción Parcial

Ensayo: Método Resultado

Concentración de Acm mg/mL: UV 3,3

Fármaco/Acm mol/mol: Distribución de la Carga de cadena H/L (PLRP) Distribución de la especie (HIC) 4,3

Fármaco No Conjugado % de fármaco total: RP-HPLC < 0,5

Homogeneidad del Tamaño % de Agregado: SEC-HPLC No detectado

Distribución de la Relación Molar % del total: HIC-HPLC 3,5% 0 fármacos/Ac 19,4% 2 fármacos/Ac 39,6% 4 fármacos/Ac 21,0% 6 fármacos/Ac 11,7% 8 fármacos/Ac

Anticuerpo Desnaturalizado: PLRP-HPLC 31,3% L0 68,7% L1 10,7% H0 40,4% H1 25,1% H2 23,7% H3

Tabla 5 Certificado de Ensayo del Conjugado 699028B PSMA Acm vcMMAF Reducción Parcial

Ensayo: Método Resultado

Concentración de Acm mg/mL: UV 3,1

Fármaco/Acm mol/mol: Distribución de la Carga de cadena H/L (PLRP) Distribución de la especie (HIC) 4,4

Fármaco No Conjugado % de fármaco total: RP-HPLC < 0,5

Homogeneidad del Tamaño % de Agregado: SEC-HPLC No detectado

Distribución de la Relación Molar % del total: HIC-HPLC 3,3% 0 fármacos/Ac 18,5% 2 fármacos/Ac 39,0% 4 fármacos/Ac 22,2% 6 fármacos/Ac 13,5% 8 fármacos/Ac

Anticuerpo Desnaturalizado: PLRP-HPLC 29,0% L0 71,0% L1 9,9% H0 40,2% H1 24,9% H2 25,0% H3

Tabla 6 Certificado de Ensayo del Conjugado 699028C PSMA Acm vcMMAF Reducción Parcial

Ensayo: Método Resultado

Concentración de Acm mg/mL: UV 3,7

Fármaco No Conjugado % de fármaco total: RP-HPLC 1,8

Homogeneidad del Tamaño % de Agregado: SEC-HPLC No detectado

Distribución de la Relación Molar % del total: HIC-HPLC 3,8% 0 fármacos/Ac 22,4% 2 fármacos/Ac 36,3% 4 fármacos/Ac 23,1% 6 fármacos/Ac 14,4% 8 fármacos/Ac

Anticuerpo Desnaturalizado: PLRP-HPLC 32,7% L0 67,3% L1 14,7% H0 39,6% H1 23,8% H2 21,9% H3

Potencia y selectividad de Conjugados de PSMA Acm sobre Células de Cáncer de Próstata Humano 15 Se realizaron estudios de citotoxicidad in vitro con líneas de células PSMA-positivas y PSMA-negativas. En 33

síntesis, células PSMA-positivas (C4-2, LNCaP™ o 3T3™-PSMA) y células PSMA-negativas (PC-3T™ o 3T3™) se añadieron a microplacas de 96 pocillos a razón de 2,5 x 103 células/pocillo y se incubaron durante una noche a 37ºC y 5% de CO2. Después, las células se incubaron con ADCs diluidos en serie durante 4 días y se sometieron a ensayo en cuanto al porcentaje de exterminio de células en comparación con controles no tratados, utilizando azul

5 de Alamar al 10%. Se determinó la concentración de ADCs requerida para el extermino del 50% de las células (valor CI50).

La Fig. 7 ilustra curvas de dosis-respuesta de conjugados de vcMMAE (Fig. 7A), vcMMAF (Fig. 7B) y mcMMAF (Fig. 7C) para células C4-2 PSMA-positivas y células PC-3™ PSMA-negativas en un experimento representativo. 10 En la Tabla 7 se lista un resumen de la potencia (CI50) y selectividad sobre líneas de células C4-2 y PC-3™. La CI50 en células C4-2 que expresan PSMA se encontraba en concentraciones picomolares de 11, 42 y 60 para conjugados de vcMMAF, mcMMAF y vcMMAE, respectivamente. En contraposición, los CI50 en células PC-3™ PSMA-negativas eran mayores que 90 nM, oscilando desde 94 a 264 nM. En base a la potencia de cada uno de los conjugados en PC-3™ y C4-2, se calculó la selectividad que era de 13.636; 6.286 y 1.567 para conjugados

15 vcMMAF, mcMMAF y vcMMAE, respectivamente. El conjugado vcMMAF era el más potente en la línea de células C4-2 PSMA-positiva, y el mcMMAF era el menos tóxico frente a la línea de células control PC-3™. En comparación con el conjugado vcMMAE, existía una mejora de 4 veces y 9 veces en la selectividad para conjugados mcMMAF y vcMMAF, respectivamente.

20 Tabla 7: Sumario de la potencia y selectividad in vitro (valores CI50 en pM)

Fármaco-enlazador: Potencia (pM) Selectividad (PC-3/C4-2) Mejora frente a vcMMAE

C4-2 (n = 3): PC-3 (n = 2)

vcMMAF mcMMAF vcMMAE: 11 42 60 150.000 264.000 94.000 13636 6286 1567 9 veces 4 veces -

Mecanismo del Exterminio de Células por parte de Conjugado PSMA Acm Fármaco

25 Se realizó un análisis del ciclo celular para determinar el mecanismo de la citotoxicidad mediada por MMAE-Acm conjugado. Células 3T3™-PSMA o C4-2 se cultivaron en presencia de PSMA ADC 0,2 nM o PSMA Acm 20 nM no modificado. Las células no tratadas servían como cultivo control. A las 12 h, 24 h y 48 h, las células se tiñeron con yoduro de propidio (PI) para detectar el ADN total y se analizaron mediante citometría de flujo. Tal como se indica

30 en la Fig. 8, las células tratadas con PSMA ADC se paralizaron en la fase G2. Mediante post-tratamiento durante 48 h, el porcentaje de células con un conjunto duplicado de cromosomas era > 50% para los cultivos de PSMA ADC y 2% para cultivos no tratados. La paralización del ciclo celular requería la presencia de la toxina, en este caso MMAE, dado que sólo el 3% de las células tratadas con Acm no modificado se encontraban en la fase G2/M a las 48 h. Los datos demuestran que el tratamiento de células de cáncer de próstata con MMAE ADCs conduce a

35 una paralización en G2/M y luego a la apoptosis de células diana.

LISTADO DE SECUENCIAS

5 10: <110> <120> PSMA DEVELOPMENT COMPANY, L.L.C. MA, Dangshe MADDON, Paul J. OLSON ; William C. DORONINA. Svetlana TOKI, Brian SENTER, Peter CONJUGADOS DE PSMA-ANTICUERPO –FÁRMACO

<130>: p0741.70008wo00

15: <150> <151> US 60/792.360

20: <150> <151> <160> US 60/692.399 33

<170>: PatentIn versión 3.1

25: <210> <211> <212> <213> 1 750 PRT Homo sapiens

30: <400> 1

5: <210> <211> <212> <213> <220> <223> 2 7570 ADN Secuencia Artificial Plásmido

10: <400> 2

5: <210> <211> <212> <213> <220> <223> 3 7597 ADN Secuencia Artificial Plásmido

10: <400> 3

5: <210> <211> <212> <213> <220> <223> 4 7579 ADN Secuencia Artificial Plásmido

10: <400> 4

<210>: 5

<210>: 13

5: <211> <212> <213> <220> <223> 7558 ADN Secuencia Artificial Plásmido

<400>: 5

5: <210> <211> <212> <213> <220> <223> 6 7576 ADN Secuencia Artificial Plásmido

10: <400> 6

<210>: 7

5: <211> 7561

<212>: ADN

<213>: Secuencia Artificial

<220>

<223>: Plásmido

10

<400>: 7

5: <210> <211> <212> <213> <220> <223> 8 6082 ADN Secuencia Artificial Plásmido

10: <400> 8

<210>: 9

5: <211> 6082

<212>: ADN

<213>: Secuencia Artificial

<220>

<223>: Plásmido

10

<400>: 9

5: <210> <211> <212> <213> <220> <223> 10 6082 ADN Secuencia Artificial Plásmido

10: <400>
10

5: <210> <211> <212> <213> <220> <223> 11 6085 ADN Secuencia Artificial Plásmido

10: <400> 11

5: <210> <211> <212> <213> <220> <223> 12 6097 ADN Secuencia Artificial Plásmido

10: <400> 12

5: <211> <212> <213> <220> <223> 6094 ADN Secuencia Artificial Plásmido

<400>: 13

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Incluye el empalme por clonación BamHI/BglII, péptido señal, región V, parte de la región C y empalme 10 por clonación 3’XbaI/NbeI (pesado) o NheI (ligero)

<400> 14 <210> 16

5: <210> <211> <212> <213> 15 142 PRT Homo sapiens

<400>: 15

<211> 463 15 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Incluye el empalme por clonación BamHI/BglII, péptido señal, región V, parte de la región C y empalme

20 por clonación 3’XbaI/NbeI (pesado) o NheI (ligero)

<400> 16 por clonación 3’XbaI/NbeI (pesado) o NheI (ligero)

5: <210> <211> <212> <213> 17 127 PRT Homo sapiens

<400>: 17

15: <210> <211> <212> <213> <220> 18 508 ADN Secuencia Artificial

<223>: Incluye el empalme por clonación BamHI/BglII, péptido señal, región V, parte de la región C y empalme

<400> 18

5

<210>: 19

<211>: 143

<212>: PRT

<213>: Homo sapiens

10

<400>: 19

<210> 20

<211> 463

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Incluye el empalme por clonación BamHI/BglII, péptido señal, región V, parte de la región C y empalme por clonación 3’XbaI/NbeI (pesado) o NheI (ligero)

<400> 20 <210> 22

15: <210> <211> <212> <213> 21 127 PRT Homo sapiens

<400>: 21

<211> 490 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<400> 22 <212> ADN

15

20: <210> <211> <212> <213> 23 145 PRT Homo sapiens

<400>: 23

<213> Secuencia Artificial

<220>

10 <223> Incluye el empalme por clonación BamHI/BglII, péptido señal, región V, parte de la región C y empalme por clonación 3’XbaI/NbeI (pesado) o NheI (ligero)

<400> 24 <212> ADN

20: <210> <211> <212> <213> 25 127 PRT Homo sapiens

<400>: 25

<213> Secuencia Artificial

<220>

<400> 26

<210> 27

<211> 138

<212> PRT 20 <213> Homo sapiens

<400> 27

<210> 28 5 <211> 466

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<400> 28

15 <210> 29

<211> 128

<212> <213>: PRT Homo sapiens

5: <400> 29

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

15 <223> Incluye el empalme por clonación BamHI/BglII, péptido señal, región V, parte de la región C y empalme por clonación 3’XbaI/NbeI (pesado) o NheI (ligero)

<400> 30

20 <210> 32

5: <210> <211> <212> <213> 31 144 PRT Homo sapiens

<400>: 31

<211> 478 15 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

20 por clonación 3’XbaI/NbeI (pesado) o NheI (ligero)

<400> 32

5: <210> <211> <212> <213> 33 132 PRT Homo sapiens

10: <400> 33

Claims

REIVINDICACIONES

1.- Un conjugado anticuerpo-fármaco, que comprende:

un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une un antígeno prostático específico de membrana (PSMA), conjugado a monometilauristatina norefedrina o monomentilauristatina fenilalanina, en donde el conjugado anticuerpo-fármaco tiene una selectividad por células PC3 a células C4-2 o LNCaP de al menos 250, y 3 ó 4 moléculas de monometilauristatina norefedrina o monomentilauristatina fenilalanina están conjugadas al anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo.
2.- El conjugado anticuerpo-fármaco de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a:

(a)

PSMA;

(b)

un dominio extracelular de PSMA; o

(c)

a un epítopo conformacional de PSMA.
3.- El conjugado anticuerpo-fármaco de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo es codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos 90, 95, 97, 98 ó 99% idéntica a una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en: AB-PG1-XG1006, AB-PGI-XG1-026 y anticuerpos que comprenden:

(a)

una cadena pesada codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificadoras de una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en secuencias de nucleótidos recogidas como SEQ ID NOs: 2 y 3, y

(b)

una cadena ligera codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificadoras de una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en secuencias de nucleótidos recogidas como SEQ ID NOs: 8 y 9, o

(c)

una región variable de la cadena pesada codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificadoras de una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en secuencias de nucleótidos recogidas como SEQ ID NOs: 14 y 18, y

(d)

una región variable de la cadena ligera codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificadoras de una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en secuencias de nucleótidos recogidas como SEQ ID NOs: 16 y 20.
4.- El conjugado anticuerpo-fármaco de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo es AB-PGI-XG1-006, AI3-PGI-XG1-026 o un fragmento de unión a antígeno del mismo.
5.- El conjugado anticuerpo-fármaco de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se selecciona del grupo que consiste en:

(a)

anticuerpos que comprenden una cadena pesada codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificadoras de una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en secuencias de nucleótidos recogidas como SEQ ID NOs: 2 y 3, y una cadena ligera codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificadoras de una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en secuencias de nucleótidos recogidas como SEQ ID NOs: 8 y 9, y

fragmentos de unión a antígeno de los mismos;

(b)

anticuerpos que comprenden una cadena pesada codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificadoras de una secuencia de nucleótidos recogida como SEQ ID NO: 2, y una cadena ligera codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificadoras de una secuencia de nucleótidos recogida como SEQ ID NO: 8, y

fragmentos de unión a antígeno de los mismos; y

(c)

anticuerpos que comprenden una cadena pesada codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificadoras de una secuencia de nucleótidos recogida como SEQ ID NO: 3, y una cadena ligera codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificadoras de una secuencia de nucleótidos recogida como SEQ ID NO: 9, y

fragmentos de unión a antígeno de los mismos; y

(d)

anticuerpos que comprenden una región variable de la cadena pesada codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificadoras de una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en secuencias de nucleótidos recogidas como SEQ ID NOs: 14 y 18, y una región variable de la cadena ligera codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificadoras de una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en secuencias de nucleótidos recogidas como SEQ ID NOs: 16 y 20, y

fragmentos de unión a antígeno de los mismos; y

(e)

anticuerpos que comprenden una región variable de la cadena pesada codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificadoras de una secuencia de nucleótidos recogida como SEQ ID NO: 14, y una región variable de la cadena ligera codificada por una molécula de ácido nucleico que

5 comprende la región o regiones codificadoras de una secuencia de nucleótidos recogida como SEQ ID NO: 16, y fragmentos de unión a antígeno de los mismos; y

(f) anticuerpos que comprenden una región variable de la cadena pesada codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificadoras de una secuencia de nucleótidos recogida como SEQ ID NO: 18, y una región variable de la cadena ligera codificada por una molécula de ácido nucleico que

10 comprende la región o regiones codificadoras de una secuencia de nucleótidos recogida como SEQ ID NO: 20, y fragmentos de unión a antígeno de los mismos.
6.- El conjugado anticuerpo-fármaco de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo es IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgAsec, IgD, IgE o tiene un dominio constante y/o

15 variable de inmunoglobulina de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgAsec, IgD o IgE.
7.- El conjugado anticuerpo-fármaco de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, humanizado, humano, recombinante, quimérico, biespecífico o multiespecífico.

20 8.- El conjugado anticuerpo-fármaco de la reivindicación 1, en donde el fragmento de unión a antígeno es un fragmento Fab, un fragmento F(ab’)2, un fragmento Fv o un fragmento que contiene CDR3.
9.- El conjugado anticuerpo-fármaco de la reivindicación 1, en donde la selectividad por células PC-3 a células C42 o LNCaP es al menos 500, 1000, 2500, 6000 ó 13.000.

25 10.- El conjugado anticuerpo-fármaco de la reivindicación 1, en donde la monometilauristatin norefredina o monometilauristatin fenilalanina está conjugada al anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo con un compuesto de la fórmula:

-An-Ym-Zm-Xn-Wn-, 30 en donde A es una unidad acilo carboxílica; Y es un aminoácido; Z es un aminoácido; X y W son cada uno un espaciador auto-inmolativo; n es un número entero de 0 ó 1; y m es un número entero de 0 ó 1, 2, 3, 4, 5 ó
6.
11.- El conjugado anticuerpo-fármaco de la reivindicación 10, en donde A es 35 (a)

en que q es 1-10,

(b) 4-(N-succinimidometil)ciclohexano-1-carbonilo,

(c)

m-succinimidobenzoilo, 40 (d) 4-(p-succinimidofenil)-butirilo,

(e)

4-(2-acetamido)benzoilo,

(f)

3-tiopropionilo,

(g)

4-(1-tioetil)-benzoilo,

(h)

6-(3-tiopropionilamido)-hexanoilo, o 45 (i) maleimida-caproilo.
12.- El conjugado anticuerpo-fármaco de la reivindicación 10, en donde Y es alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina, triptófano o prolina.

50 13.- El conjugado anticuerpo-fármaco de la reivindicación 10, en donde Z es lisina, lisina protegida con acetilo o formilo, arginina, arginina protegida con tosilo o grupos nitro, histidina, ornitina, ornitina protegida con acetilo o

formilo, o citrulina. 14.- El conjugado anticuerpo-fármaco de la reivindicación 10, en donde Ym-Zm es valina-citrulina.

5 15.- El conjugado anticuerpo-fármaco de la reivindicación 10, en donde Ym-Zm es una secuencia de proteínas que es selectivamente escindible por una proteasa. 16.- El conjugado anticuerpo-fármaco de la reivindicación 10, en donde X es:

(a) un compuesto que tiene la fórmula 10

en que T es O, N o S;

(b) un compuesto que tiene la fórmula

-HN-R1-COT, 15 en que R1 es alquilo C1-C5, T es O, N o S;

(c) un compuesto que tiene la fórmula

en que T es O, N o S, R2 es H o alquilo C1-C5;

(d) p-aminobencilcarbamoiloxi; 20 (e) alcohol p-aminobencílico;

(f)

carbamato de p-aminobencilo;

(g)

p-aminobenciloxicarbonilo; o

(h)

ácido γ-aminobutírico; ácido α,α-dimetil-γ-aminobutírico o ácido β,β-dimetil-γ-aminobutírico.
2517.-El conjugado anticuerpo-fármaco de la reivindicación 10, en donde W es

en que T es O, S o N.

30 18.- El conjugado anticuerpo-fármaco de cualquiera de las reivindicaciones 10-17, en donde m y n son 0.
19.- El conjugado anticuerpo-fármaco de la reivindicación 1, que es AB-PG1-XG1-006-maleimida caproil-valinacitrulina-p-aminobenciloxicarbonil-monometilauristatin norefredina, AB-PG1-XG1-006-maleimida caproil-valinacitrulina-p-aminobenciloxicarbonil-monometilauristatin fenilalanina, AB-PG1-XG1-006-maleimida-caproil35 monometilauristatin fenilalanina, AB-PG1-XG1-006-maleimida-caproil-valina-citrulina-p-carbamato de

aminobencilo-monometilauristatin norefedrina, AB-PG1-XG1-006-maleimida-caproil-valina-citrulina-p-carbamato de aminobencilo-monometilauristatin fenilalanina, AB-PG1-XG1-026-maleimida-caproil-valina-citrulina-paminobenciloxicarbonil-monometilauristatin norefedrina, AB-PG1-XG1-026-maleimida-caproil-valina-citrulina-paminobenciloxicarbonil-monometilauristatin fenilalanina o AB-PG1-XG1-026-maleimida-caproil-monometilauristatin fenilalanina.
20.- El conjugado anticuerpo-fármaco de la reivindicación 1, en donde el conjugado anticuerpo-fármaco une una célula tumoral, preferiblemente una célula de tumor de próstata.
21.- El conjugado anticuerpo-fármaco de la reivindicación 1, en donde el conjugado anticuerpo-fármaco une células endoteliales de la neovasculatura de un tumor, no requiere de una lisis celular para unirse a PSMA, conduce a una paralización del ciclo celular y/o inhibe el crecimiento de células que expresan PSMA.
22.- El conjugado anticuerpo-fármaco de la reivindicación 1, en donde el conjugado anticuerpo-fármaco media en el exterminio de células específico de células que expresan PSMA con una CI50 de:

(a)

menor que 1X10-10 , 1X10-11 1X10-12 M;

(b)

11-, 42-, 60- o -65 -208X10-12 M; o

(c)

11, 42, 60 u 83X10-12 M.
23.- El conjugado anticuerpo-fármaco de la reivindicación 1, en donde el conjugado anticuerpo-fármaco, cuando se administra a ratones con un régimen de q4d x 6 a una dosis de 6 mg/kg resulta una tasa de curación de al menos 20%, 30%, 40% o 50%.
24.- El conjugado anticuerpo-fármaco de la reivindicación 1, unido a un marcador, preferiblemente un marcador fluorescente, un marcador enzimático, un marcador radiactivo, un marcador activo de resonancia magnética nuclear, un marcador luminiscente o un marcador cromóforo.
25.- El conjugado anticuerpo-fármaco de la reivindicación 1, envasado en forma liofilizada o acuosa.
26.- El conjugado anticuerpo-fármaco de la reivindicación 1, en una forma estéril.
27.- Una composición que comprende:

(a)

el conjugado anticuerpo-fármaco de la reivindicación 1 y un vehículo, excipiente o estabilizador farmacéuticamente aceptable; o

(b)

una combinación de dos o más conjugados anticuerpo-fármaco diferentes de acuerdo con la reivindicación 1 y un vehículo, excipiente o estabilizador farmacéuticamente aceptable.
28.- La composición de la reivindicación 27 que comprende, además, un agente antitumoral, un agente inmunoestimulante, un inmunomodulador, corticosteroides o una combinación de los mismos.
29.- La composición de la reivindicación 28, en donde el agente antitumoral es un agente citotóxico, un agente que actúa sobre la neovasculatura del tumor o una combinación de los mismos, preferiblemente docetaxel.
30.- La composición de la reivindicación 28, en donde el inmunomodulador es una citoquina, quimioquina, adyuvante o una combinación de los mismos.
31.- La composición de la reivindicación 28, en donde el agente inmunoestimulante es interleuquina-2, α-interferón, γ-interferón, factor α de necrosis tumoral, un oligonucleótido inmunoestimulante o una combinación de los mismos.
32.- La composición de la reivindicación 28, en donde el corticosteroide es prednisona o hidrocortisona.
33.- Una composición, que comprende:

uno o más conjugados anticuerpo-fármaco de la reivindicación 1, y uno o más anticuerpos anti-PSMA no conjugados.
34.-Un conjugado anticuerpo-fármaco según cualquiera de las reivindicaciones 1-23, para uso en un método para inhibir el crecimiento de una célula que expresa PSMA, en donde el conjugado se ha de poner en contacto con la célula que expresa PSMA.
35.- Un conjugado anticuerpo-fármaco según la reivindicación 34, en donde la célula que expresa PSMA es una célula de tumor de próstata, una célula de la neovasculatura de un tumor no prostático, una célula andrógenodependiente o una célula andrógeno-independiente.
36.- Un conjugado anticuerpo-fármaco según la reivindicación 34, en donde, en dicho método, la célula que expresa PSMA se ha de poner adicionalmente en contacto con un agente antitumoral, un agente inmunoestimulante, un inmunomodulador, corticosteroide o una combinación de los mismos.
37.- Un método ex vivo para inhibir el crecimiento de una célula que expresa PSMA, que comprende poner en contacto la célula que expresa PSMA con una cantidad de un conjugado anticuerpo-fármaco según cualquiera de las reivindicaciones 1-23, eficaz para inhibir el crecimiento de la célula que expresa PSMA.
38.- Un método según la reivindicación 37, en el que la célula que expresa PSMA es una célula de tumor de próstata, una célula de la neovasculatura de un tumor no prostático, una célula andrógeno-dependiente o una célula andrógeno-independiente.
39.- Un método según la reivindicación 37, que comprende, además, poner en contacto la célula que expresa PSMA con un agente antitumoral, un agente inmunoestimulante, un inmunomodulador, corticosteroide o una combinación de los mismos.
40.- Un conjugado anticuerpo-fármaco según cualquiera una de las reivindicaciones 1-23, para uso en un método de efectuar la paralización del ciclo celular en una célula que expresa PSMA, en el que el conjugado se ha de poner en contacto con la célula que expresa PSMA.
41.- Un conjugado anticuerpo-fármaco según cualquiera de las reivindicaciones 1-23, para uso en un método para tratar el cáncer, opcionalmente cáncer de próstata, o un cáncer no prostático, y dicho cáncer no prostático, opcionalmente, es cáncer de vejiga, cáncer pancreático, cáncer de pulmón, cáncer de riñones, sarcoma, cáncer de mama, cáncer de cerebro, carcinoma neuroendocrino, cáncer de colon, cáncer testicular o melanoma.
42.- Un conjugado anticuerpo-fármaco para uso en un método para tratar el cáncer según la reivindicación 41, en donde, en dicho método, otro agente terapéutico se ha de co-administrar para tratar el cáncer, en donde la coadministración se ha de realizar antes, durante o después de la administración del conjugado anticuerpo-fármaco.
43.- Un conjugado anticuerpo-fármaco para uso en un método para tratar el cáncer según la reivindicación 42, en donde el otro agente terapéutico es un agente antitumoral, un agente inmunoestimulante, un inmunomodulador, corticosteroide o una combinación de los mismos.
44.- Un conjugado anticuerpo-fármaco para uso en un método para inhibir el crecimiento de una célula que expresa PSMA según la reivindicación 36, un conjugado anticuerpo-fármaco para uso en un método para tratar el cáncer según la reivindicación 43, o un método según la reivindicación 39, en donde el agente antitumoral es un agente citotóxico, un agente que actúa sobre la neovasculatura del tumor o una combinación de los mismos y, preferiblemente, docetaxel.
45.- Un conjugado anticuerpo-fármaco para uso en un método para inhibir el crecimiento de una célula que expresa PSMA según la reivindicación 36, un conjugado anticuerpo-fármaco para uso en un método para tratar el cáncer según la reivindicación 43, o un método según la reivindicación 39, en donde el inmunomodulador es una citoquina, quimioquina, adyuvante o una combinación de los mismos.
46.- Un conjugado anticuerpo-fármaco para uso en un método para inhibir el crecimiento de una célula que expresa PSMA según la reivindicación 36, un conjugado anticuerpo-fármaco para uso en un método para tratar el cáncer según la reivindicación 43, o un método según la reivindicación 39, en donde el agente inmunoestimulante es interleuquina-2, α-interferón, γ-interferón, factor α de necrosis tumoral, un oligonucleótido inmunoestimulante o una combinación de los mismos.
47.- Un conjugado anticuerpo-fármaco para uso en un método para inhibir el crecimiento de una célula que expresa PSMA según la reivindicación 36, un conjugado anticuerpo-fármaco para uso en un método para tratar el cáncer según la reivindicación 43, o un método según la reivindicación 39, en donde el corticosteroide es prednisona o hidrocortisona.
48.- Un conjugado anticuerpo-fármaco para uso en un método para tratar el cáncer según la reivindicación 42, en donde el agente terapéutico es una vacuna, preferiblemente una vacuna que inmuniza contra PSMA.
49.- Un conjugado anticuerpo-fármaco para uso en un método para inhibir el crecimiento de una célula que expresa PSMA según la reivindicación 44, o un conjugado anticuerpo-fármaco para uso en un método para tratar el cáncer según una cualquiera de las reivindicaciones 42-44, en donde, en dicho método, se ha de administrar

5 todavía otro agente terapeútico, preferiblemente prednisona.
50.- Un conjugado anticuerpo-fármaco según cualquiera de las reivindicaciones 1-23, para uso en un método para inhibir el crecimiento de un tumor, en donde dicho conjugado se ha de poner en contacto con células que expresan PSMA de la neovasculatura del tumor, para inhibir con ello el crecimiento del tumor.

10 51.- Un conjugado anticuerpo-fármaco para uso en un método para inhibir el crecimiento de un tumor según la reivindicación 50, en donde, en dicho método, las células que expresan PSMA se han de poner en contacto, adicionalmente, con un agente antitumoral, un agente inmunoestimulante, un inmunomodulador, corticosteroide o una combinación de los mismos.

15 52.- Un conjugado anticuerpo-fármaco para uso en un método para inhibir el crecimiento de un tumor según la reivindicación 51, en donde:

(a) el agente antitumoral es un agente citotóxico, un agente que actúa sobre la neovasculatura del tumor o

una combinación de los mismos; 20 (b) el inmunomodulador es una citoquina, quimioquina, adyuvante o una combinación de los mismos; y/o

(c) el agente inmunoestimulante es interleuquina-2, α-interferón, γ-interferón, factor α de necrosis tumoral, oligonucleótidos inmunoestimulantes o una combinación de los mismos.

Fig. 2

Fig. 3A

Fig. 3B

Fig. 5