ES2438495T3

ES2438495T3 - Compuestos para exterminar células cancerosas que expresan PSMA, resistentes a taxano

Info

Publication number: ES2438495T3
Application number: ES09789284.8T
Authority: ES
Inventors: Dangshe Ma; William C. Olson; Stephen Morris; Robert Israel
Original assignee: PSMA Development Co LLC
Current assignee: PSMA Development Co LLC
Priority date: 2008-09-08
Filing date: 2009-09-08
Publication date: 2014-01-17
Anticipated expiration: 2029-09-08
Also published as: WO2010027513A2; EP2326350A2; EP2727606A2; WO2010027513A3; HK1159474A1; PL2326350T3; US9242012B2; EP2326350B1; EP2727606A3; PT2326350E; DK2326350T3; US20110250216A1

Abstract

Un método in vitro para exterminar células cancerosas que expresan PSMA, resistentes a taxano, quecomprende: poner en contacto las células cancerosas que expresan PSMA, resistentes a taxano, con un conjugado deanticuerpo-fármaco en una cantidad eficaz para exterminar las células cancerosas que expresan PSMA,resistentes a taxano, en el que el conjugado de anticuerpo-fármaco comprende un anticuerpo monoclonal osu fragmento de unión a antígeno que se une específicamente al antígeno de membrana específico de lapróstata (PSMA) conjugado con monometilauristatin norefedrina o monometilauristatin fenilalanina, y en elque la secuencia de PSMA es la secuencia expuesta en SEC ID NO: 1.

Description

Compuestos para exterminar células cancerosas que expresan PSMA, resistentes a taxano

Solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica el beneficio bajo 35 U.S.C. § 119 de la solicitud provisional de los Estados Unidos de América 61/095.300, presentada el 8 de septiembre de 2008, y la solicitud provisional de los Estados Unidos de América 61/205.395, presentada el 20 de enero de 2009.

Antecedentes de la invención

El cáncer de próstata es la neoplasia más habitual y la segunda causa principal de muerte por cáncer en hombres en los Estados Unidos de América (Jemal A, et al., CA Cancer J Clin 2005; 55:10-30). El cáncer de próstata localizado se trata típicamente con cirugía o radiación, y la enfermedad recurrente se puede controlar temporalmente con ablación de andrógenos (Klein EA, et al., Urol Clin North Am 2003; 30:315-30). Sin embargo, casi todos los carcinomas de próstata se hacen eventualmente refractarios a hormonas, y después progresan rápidamente (Denmeade SR, et al., Nat Rev Cancer 2002;2:389-96). Se ha demostrado que el cáncer de próstata refractario a hormonas o dependiente de andrógenos es muy resistente a la quimioterapia convencional. Con la excepción de cuidados paliativos, la única quimioterapia aprobada es docetaxel en combinación con prednisona, que ofrece un beneficio de supervivencia modesto (2,4 meses) (Gulley J, et al., Am J Ther. 2004; 351:1513-20; Petrylak DP, et al., New Engl J Med 2004; 351:1513-20).

M. D GALSKY ET AL: JOURNAL OF CLINICAL ONCOLOGY, AMERICAN SOCIETY OF CLINICAL ONCOLOGY, vol. 26, nº 13, 2008 (2008-05-01) describen los resultados de un ensayo clínico llevado a cabo sobre el inmunoconjugado MLN2704 en pacientes con cáncer de próstata metastásico progresivo resistente a la castración. MLN2704 comprende J591, un anticuerpo monoclonal desinmunizado dirigido hacia un dominio externo de PSMA, y el fármaco análogo de maytansina maytansoide-1 (DM1).

Sumario de la invención

La presente invención se refiere, al menos en parte, al descubrimiento sorprendente de que conjugados de anticuerpo-fármaco (ADCs) que comprenden un anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno que se une específicamente a PSMA, conjugado con un derivado de dolastatina 10, en particular auristatinas tales como MMAE (también denominada aquí como monometilauristatina E o monometilauristatin norefedrina) o MMAF (también denominada aquí como monometilauristatina F o monometilauristatin fenilalanina), se pueden usar para exterminar células cancerosas que expresan PSMA, resistentes a taxano, y para tratar cáncer que expresa PSMA, resistente a taxano, descrito aquí; por lo tanto, son métodos para exterminar células cancerosas que expresan PSMA, resistentes a taxano. También se describen aquí métodos para tratar un sujeto con un cáncer que expresa PSMA, resistente a taxano. En una realización de estos últimos métodos, los métodos implican En una realización de los últimos métodos, los métodos implican exterminar células cancerosas que expresan PSMA, resistentes a taxano. En otra realización de los últimos métodos, los métodos implican retrasar o inhibir la progresión del cáncer. En todavía otra realización de los últimos métodos, los métodos implican incrementar la supervivencia del sujeto en comparación con la supervivencia media de los sujetos que no se han tratado con ADC de PSMA y que tienen cáncer de próstata metastásico progresivo, resistente a la castración, que ha progresado después de una terapia previa con taxano. En todavía otra realización de los últimos métodos, los métodos implican hacer disminuir un nivel circulante de células tumorales circulantes (CTCs), en comparación con un nivel de línea base. En una realización adicional de los últimos métodos, los métodos implican hacer disminuir o estabilizar un nivel sérico de PSA, en comparación con un nivel de línea base de PSA.

Por lo tanto, en un aspecto, se describe un método para exterminar células cancerosas que expresan PSMA, resistentes a taxano, que comprende poner en contacto las células cancerosas que expresan PSMA, resistentes a taxano, con un conjugado de anticuerpo-fármaco en una cantidad eficaz para exterminar las células cancerosas que expresan PSMA, resistentes a taxano, en el que el conjugado de anticuerpo-fármaco comprende un anticuerpo monoclonal o su fragmento de unión a antígeno que se une específicamente al antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA) conjugado con monometilauristatin norefedrina o monometilauristatin fenilalanina, y en el que la secuencia de PSMA es la secuencia expuesta en SEC ID NO: 1.

En otro aspecto, también se describe un método para tratar un sujeto que tiene un cáncer que expresa PSMA, resistente a taxano, que comprende administrar al sujeto que tiene un cáncer que expresa PSMA, resistente a taxano, un conjugado de anticuerpo-fármaco en una cantidad eficaz para tratar el cáncer que expresa PSMA, resistente a taxano, en el que el conjugado de anticuerpo-fármaco comprende un anticuerpo monoclonal o su fragmento de unión a antígeno que se une específicamente al antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA) conjugado con monometilauristatin norefedrina o monometilauristatin fenilalanina, y en el que la secuencia de PSMA es la secuencia expuesta en SEC ID NO: 1. En una realización, el método implica exterminar células cancerosas que expresan PSMA, resistentes a taxano. En otra realización, el método implica retrasar o inhibir la progresión del cáncer. En todavía otra realización, el método implica incrementar la supervivencia del sujeto en comparación con la supervivencia media de sujetos que no han sido tratados con el ADC de PSMA y que tienen

cáncer de próstata metastásico progresivo, resistente a la castración, que ha progresado tras una terapia previa con taxano. En todavía otra realización, el método implica hacer disminuir un nivel circulante de células tumorales circulantes (CTCs) en comparación con un nivel de línea base. En una realización adicional, el método implica hacer disminuir o estabilizar un nivel sérico de PSA en comparación con un nivel de línea base de PSA.

En todavía otro aspecto, también se proporciona un método para tratar un sujeto que tiene cáncer de próstata metastásico progresivo, resistente a la castración, que ha progresado tras una terapia previa con taxano, que comprende administrar una cantidad eficaz de un conjugado de anticuerpo-fármaco, en el que el conjugado de anticuerpo-fármaco comprende un anticuerpo monoclonal o su fragmento de unión a antígeno que se une específicamente a antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA) conjugado a monometilauristatin norefedrina o monometilauristatin fenilalanina, y en el que la secuencia de PSMA es la secuencia expuesta en SEC ID NO: 1. En una realización, el conjugado de anticuerpo-fármaco de PSMA (también denominado aquí como “ADC de PSMA” o “ADC”) consiste esencialmente en un anticuerpo monoclonal humano contra PSMA conjugado a monometilaurastatin norefedrina (MMAE) vía un ligador de valina-citrulina. En una realización, el método implica exterminar células cancerosas que expresan PSMA, resistentes a taxano. En otra realización, el método implica retrasar o inhibir la progresión del cáncer. En todavía otra realización, el método implica incrementar la supervivencia del sujeto en comparación con la supervivencia media de los sujetos que no se han tratado con el ADC de PSMA y que tienen cáncer de próstata metastásico progresivo, resistente a la castración, que ha progresado tras una terapia previa con taxano. En todavía otra realización, el método implica hacer disminuir un nivel circulante de células tumorales circulantes (CTCs) en comparación con un nivel de línea base. En una realización adicional, el método implica hacer disminuir o estabilizar un nivel sérico de PSA en comparación con un nivel de línea base de PSA.

En una realización de los métodos proporcionados, la cantidad eficaz del ADC es suficiente para 1) retrasar o inhibir la progresión del cáncer, 2) incrementar la supervivencia del sujeto en comparación con la supervivencia media de sujetos que no han sido tratados con ADC de PSMA y que tienen cáncer de próstata metastásico progresivo, resistente a la castración, que ha progresado tras una terapia previa con taxano, 3) disminuir un nivel circulante de células tumorales circulantes (CTCs) en comparación con un nivel de línea base y/o 4) disminuir o estabilizar un nivel sérico de antígeno específico de la próstata (PSA) en comparación con un nivel de línea base de PSA.

En una realización, el exterminio de las células cancerosas que expresan PSMA, resistentes a taxano, o el retraso o inhibición de la progresión del cáncer se demuestra mediante cambios en la imagen radiográfica en la carga tumoral en comparación con una imagen radiográfica inicial en el sujeto antes de la administración del ADC de PSMA. En una realización, el cambio en la imagen radiográfica es un cambio de al menos 10%. En otra realización, el cambio en la imagen radiográfica es un cambio de al menos 20%. En todavía otra realización, el cambio en la imagen radiográfica es un cambio de al menos 30%. En todavía otra realización, el cambio en la imagen radiográfica es un cambio de al menos 40%. En una realización adicional, el cambio en la imagen radiográfica es un cambio de al menos 50%. En todavía una realización adicional, el cambio en la imagen radiográfica es un cambio de al menos 60%.

En otra realización de los métodos proporcionados, el exterminio de las células cancerosas que expresan PSMA, resistentes a taxano, o el retraso o inhibición de la progresión del cáncer se demuestra mediante un cambio en al menos un biomarcador para metástasis ósea y metabolismo óseo, en comparación con un valor de línea base antes de la administración del ADC de PSMA. En una realización, el biomarcador es N-telopéptido, fosfatasa alcalina ósea, osteocalcina, calcitonina, calcio, piridinolina o desoxipiridinolina.

En todavía otra realización de los métodos proporcionados, el tratamiento con el ADC de PSMA da como resultado una mayor supervivencia para el sujeto, en el que la supervivencia aumenta en comparación con el tiempo medio de supervivencia de sujetos con cáncer que expresa PSMA, resistente a taxano, no tratado con ADC de PSMA. En una realización, la supervivencia en el sujeto aumenta en cuatro semanas. En otra realización, la supervivencia en el sujeto aumenta en seis semanas. En todavía otra realización, la supervivencia en el sujeto aumenta en dos meses. En todavía otra realización, la supervivencia en el sujeto aumenta en cuatro meses. En una realización adicional, la supervivencia en el sujeto aumenta en seis meses. En otra realización, la supervivencia en el sujeto aumenta en ocho meses. En todavía otra realización, la supervivencia en el sujeto aumenta en diez meses. En todavía otra realización, la supervivencia en el sujeto aumenta en doce meses. En todavía otra realización, la supervivencia en el sujeto aumenta en catorce meses.

En todavía otra realización de los métodos proporcionados, el tratamiento con el ADC de PSMA da como resultado una mejora en la calidad de vida del sujeto en comparación con la calidad de vida del sujeto antes del tratamiento con el ADC de PSMA.

En una realización adicional de los métodos proporcionados, las células cancerosas que expresan PSMA, resistentes a taxano, son resistentes a docetaxel o paclitaxel. En todavía una realización adicional de los métodos proporcionados, el cáncer que expresa PSMA, resistente a taxano, es resistente a docetaxel o paclitaxel.

En otra realización de los métodos proporcionados, las células cancerosas que expresan PSMA, resistentes a taxano, son células de cáncer de próstata o células de cáncer no de próstata. En una realización, las células de cáncer no de próstata son células de cáncer de vejiga, células de cáncer pancreático, células de cáncer hepático,

células de cáncer de pulmón, células de cáncer de riñón, células de sarcoma, células de cáncer de mama, células de cáncer de cerebro, células de carcinoma neuroendocrino, células de cáncer de colon, células de cáncer testicular

o células de melanoma.

En todavía otra realización de los métodos proporcionados, el cáncer que expresa PSMA, resistente a taxano, es cáncer de próstata o cáncer no de próstata. En una realización, el cáncer no de próstata es cáncer de vejiga, cáncer pancreático, cáncer hepático, cáncer de pulmón, cáncer de riñón, sarcoma, cáncer de mama, cáncer de cerebro, carcinoma neuroendocrino, cáncer de colon, cáncer testicular o melanoma.

En una realización adicional de los métodos proporcionados, las células cancerosas que expresan PSMA, resistentes a taxano, son de un tumor. En todavía una realización adicional de los métodos proporcionados, el cáncer que expresa PSMA, resistente a taxano, es un tumor. En una realización, el volumen del tumor es al menos 100 mm3 antes del inicio del método que usa ADC de PSMA. En otra realización, el volumen del tumor es al menos 200 mm3. En todavía otra realización, el volumen del tumor es al menos 300 mm3. En una realización adicional, el volumen del tumor es al menos 400 mm3. En todavía una realización adicional, el volumen del tumor es al menos 500 mm3. En todavía otra realización, el volumen del tumor es al menos 600 mm3. En aún otra realización, el volumen del tumor es al menos 700 mm3. En una realización adicional, el volumen del tumor es al menos 800 mm3. En todavía una realización adicional, el volumen del tumor es al menos 900 mm3. En otra realización, el volumen del tumor es al menos 1000 mm3. En todavía otra realización, el volumen del tumor es al menos 1200 mm3. En todavía otra realización, el volumen del tumor es al menos 1400 mm3. En aún una realización adicional, el volumen del tumor es al menos 1600 mm3.

En otra realización de los métodos proporcionados, el tratamiento o contacto con el ADC de PSMA da como resultado una reducción del volumen tumoral en al menos 10% en comparación con el volumen tumoral antes del tratamiento o contacto con el ADC de PSMA. En todavía otra realización, el volumen del tumor se reduce en al menos 20%. En aún otra realización, el volumen del tumor se reduce en al menos 30%. En una realización adicional, el volumen del tumor se reduce en al menos 40%. En todavía una realización adicional, el volumen del tumor se reduce en al menos 50%. En aún una realización adicional, el volumen del tumor se reduce en al menos 60%. En otra realización, el volumen del tumor se reduce en al menos 70%. En todavía otra realización, el volumen del tumor se reduce en al menos 80%. En todavía otra realización, el volumen del tumor se reduce en al menos 90%. En una realización adicional, el volumen del tumor se reduce en al menos 95%. En aún una realización adicional, el tumor se erradica.

En una realización, el tumor tiene una longitud de al menos 5 mm antes del inicio del método que usa ADC de PSMA. En otra realización, el tumor tiene una longitud de al menos 6 mm. En todavía otra realización, el tumor tiene una longitud de al menos 7 mm. En todavía otra realización, el tumor tiene una longitud de al menos 8 mm. En otra realización, el tumor tiene una longitud de al menos 9 mm. En todavía otra realización, el tumor tiene una longitud de al menos 10 mm. En todavía otra realización, el tumor tiene una longitud de al menos 11 mm. En una realización adicional, el tumor tiene una longitud de al menos 12 mm. En todavía una realización adicional, el tumor tiene una longitud de al menos 13 mm. En todavía una realización adicional, el tumor tiene una longitud de al menos 14 mm. En otra realización, el tumor tiene una longitud de al menos 15 mm. En todavía otra realización, el tumor tiene una longitud de al menos 16 mm. En todavía otra realización, el tumor tiene una longitud de al menos 17 mm. En una realización adicional, el tumor tiene una longitud de al menos 18 mm. En aún una realización adicional, el tumor tiene una longitud de al menos 19 mm. En todavía una realización adicional, el tumor tiene una longitud de al menos 20 mm. En otra realización, el tumor tiene una longitud de al menos 21 mm. En todavía otra realización, el tumor tiene una longitud de al menos 22 mm. En todavía otra realización, el tumor tiene una longitud de al menos 23 mm. En una realización adicional, el tumor tiene una longitud de al menos 24 mm. En todavía una realización adicional, el tumor tiene una longitud de al menos 25 mm. En aún una realización adicional, el tumor tiene una longitud de al menos 30 mm.

En otra realización de los métodos proporcionados, el tratamiento o contacto con el ADC de PSMA da como resultado una reducción de la longitud del tumor en al menos 10% en comparación con la longitud del tumor antes del tratamiento o contacto con el ADC de PSMA. En todavía otra realización, la longitud del tumor se reduce en al menos 20%. En todavía otra realización, la longitud del tumor se reduce en al menos 30%. En una realización adicional, la longitud del tumor se reduce en al menos 40%. En todavía una realización adicional, la longitud del tumor se reduce en al menos 50%. En aún una realización adicional, la longitud del tumor se reduce en al menos 60%. En otra realización, la longitud del tumor se reduce en al menos 70%. En todavía otra realización, la longitud del tumor se reduce en al menos 80%. En todavía otra realización, la longitud del tumor se reduce en al menos 90%. En una realización adicional, la longitud del tumor se reduce en al menos 95%. En aún una realización adicional, la longitud del tumor se reduce en al menos 99%.

En una realización adicional de los métodos proporcionados, la administración del ADC de PSMA a un sujeto da como resultado la ganancia de peso corporal en el sujeto (en comparación con el peso del sujeto antes de la administración del ADC de PSMA al sujeto). La ganancia en el peso corporal puede resultar de una única administración del ADC de PSMA o de un curso de tratamiento con el ADC de PSMA (es decir, más de una administración). En una realización, la ganancia es al menos una ganancia de 5% de peso corporal. En otra realización, la ganancia es al menos una ganancia de 10%. En todavía otra realización, la ganancia es al menos una

ganancia de 15%. En todavía una realización adicional, la ganancia es al menos una ganancia de 20%. En todavía otra realización, la ganancia es al menos una ganancia de 25%. En una realización adicional, la ganancia es al menos una ganancia de 30%. En otra realización, la ganancia es una ganancia de 5% en peso corporal. En otra realización, la ganancia es una ganancia de 10%. En todavía otra realización, la ganancia es una ganancia de 15%. En todavía una realización adicional, la ganancia es una ganancia de 20%. En todavía otra realización, la ganancia a una ganancia de 25%. En una realización adicional, la ganancia es una ganancia de 30%.

En una realización de los métodos proporcionados, las células cancerosas que expresan PSMA, resistentes a taxano, son de una metástasis. En otra realización de los métodos proporcionados, el cáncer que expresa PSMA, resistente a taxano, es metastásico.

En otra realización de los métodos proporcionados, el anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno se conjuga a al menos 2 moléculas de monometilauristatin norefedrina o monometilauristatin fenilalanina. En todavía otra realización de los métodos proporcionados, el anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno se conjuga a al menos 3 moléculas de monometilauristatin norefedrina o monometilauristatin fenilalanina. En todavía otra realización de los métodos proporcionados, el anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno se conjuga a al menos 4 moléculas de monometilauristatin norefedrina o monometilauristatin fenilalanina.

En una realización adicional de los métodos proporcionados, la monometilauristatin norefedrina o monometilauristatin fenilalanina se conjuga al anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno con un compuesto de la fórmula -An-Ym-Zm-Xn-Wn-en la que, A es una unidad de acilo carboxílico; Y es un aminoácido; Z es un aminoácido; X y W son cada uno un espaciador autoinmolativo; n es un número entero de 0 a 1; y m es un número entero de0 ó1, 2, 3, 4, 5ó 6.

En una realización, A es

en la que q es 1-10. En otra realización, A es 4-(N-succinimidometil)ciclohexano-1-carbonilo, m-succinimidobenzoílo, 4-(p-succinimidofenil)-butirilo, 4-(2-acetamido)benzoílo, 3-tiopropionilo, 4-(1-tioetil)-benzoílo, 6-(3-tiopropionilamido)hexanoílo o maleimida caproílo. En todavía otra realización, A es maleimida caproílo.

En otra realización, Y es alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina, triptófano o prolina. En todavía otra realización, Y es valina.

En una realización adicional, Z es lisina, lisina protegida con acetilo o formilo, arginina, arginina protegida con grupos tosilo o nitro, histidina, o nitina, o nitina protegida con acetilo o formilo, o citrulina. En aún una realización adicional, Z es citrulina.

En una realización, Ym-Zm es valina-citrulina. En otra realización, Ym-Zm es una secuencia proteínica que es escindible selectivamente por una proteasa.

En todavía otra realización, X es un compuesto que tiene la fórmula

en la que T es O, N, o S. En todavía otra realización, X es un compuesto que tiene la fórmula -HN-R1-COT, en la que R1 es alquilo de C1-C5, T es O, N o S. En una realización adicional, X es un compuesto que tiene la fórmula

en la que T es O, N, o S, R2 es H o alquilo de C1-C5. En aún una realización adicional, X es paminobencilcarbamoiloxi. En todavía una realización adicional, X es alcohol p-aminobencílico. En otra realización, X es carbamato de p-aminobencilo. En todavía otra realización, X es p-aminobenciloxicarbonilo. En todavía otra realización, X es ácido !-aminobutírico; ácido ∀,∀-dimetil !-aminobutírico o ácido #,#-dimetil !-aminobutírico.

En una realización, W es

o

10 enlaqueTesO, SoN.

En otra realización, m y n son 0.

En todavía otra realización de los métodos proporcionados, el conjugado de anticuerpo-fármaco es AB-PG1-XG1006-maleimida caproil-valina-citrulina-p-aminobenciloxicarbonil-monometilauristatin norefedrina. En otra realización de los métodos proporcionados, el conjugado de anticuerpo-fármaco es carbamato de AB-PG1-XG1-006-maleimida 15 caproil-valina-citrulina-p-aminobencilo-monometilauristatin norefedrina. En todavía otra realización, el conjugado de anticuerpo-fármaco es AB-PG1-XG1-006-maleimida caproil-valina-citrulina-p-aminobenciloxicarbonilmonometilauristatin fenilalanina. En otra realización, el conjugado de anticuerpo-fármaco es carbamato de AB-PG1XG1-006-maleimida caproil-valina-citrulina-p-aminobencilo-monometilauristatin fenilalanina. En una realización adicional, el conjugado de anticuerpo-fármaco es AB-PG1-XG1-006-maleimida caproil-monometilauristatin 20 fenilalanina. En todavía una realización adicional, el conjugado de anticuerpo-fármaco es AB-PG1-XG1-026maleimida caproil-valina-citrulina-p-aminobenciloxicarbonil-monometilauristatin norefedrina. En otra realización, el conjugado de anticuerpo-fármaco es carbamato de AB-PG1-XG1-026-maleimida caproil-valina-citrulina-paminobencilo-monometilauristatin norefedrina. En aún una realización adicional, el conjugado de anticuerpo-fármaco es AB-PG1-XG1-026-maleimida caproil-valina-citrulina-p-aminobenciloxicarbonil-monometilauristatin fenilalanina. En

25 aún una realización adicional, el conjugado de anticuerpo-fármaco es carbamato de AB-PG1-XG1-026-maleimida caproil-valina-citrulina-p-aminobencilo-monometilauristatin fenilalanina. En otra realización, el conjugado de anticuerpo-fármaco es AB-PG1-XG1-026-maleimida caproil-monometilauristatin fenilalanina.

En una realización de los métodos proporcionados, el anticuerpo monoclonal o su fragmento de unión a antígeno se une específicamente a un dominio extracelular de PSMA. En otra realización, el anticuerpo monoclonal o su 30 fragmento de unión a antígeno se une específicamente a un epítopo conformacional de PSMA. En todavía otra realización, el anticuerpo monoclonal o su fragmento de unión a antígeno se une a células vivas. En una realización

adicional, el anticuerpo monoclonal o su fragmento de unión a antígeno no requiere la lisis celular para unirse a PSMA. En todavía una realización adicional, el anticuerpo monoclonal o su fragmento de unión a antígeno se une a células de la neovasculatura de un tumor.

En otra realización de los métodos proporcionados, el anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno inhibe competitivamente la unión específica de un segundo anticuerpo a su epítopo diana en PSMA, en el que el segundo anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en PSMA 3.7, PSMA 3.8, PSMA 3.9, PSMA 3.11, PSMA 5.4, PSMA 7.1, PSMA 7.3, PSMA 10.3, PSMA 1.8.3, PSMA A3.1.3, PSMA A3.3.1, Abgenix 4.248.2, Abgenix 4.360.3, Abgenix 4.7.1, Abgenix 4.4.1, Abgenix 4.177.3, Abgenix 4.16.1, Abgenix 4.22.3, Abgenix 4.28.3, Abgenix 4.40.2, Abgenix 4.48.3, Abgenix 4.49.1, Abgenix 4.209.3, Abgenix 4.219.3, Abgenix 4.288.1, Abgenix 4.333.1, Abgenix 4.54.1, Abgenix 4.153.1, Abgenix 4.232.3, Abgenix 4.292.3, Abgenix 4.304.1, Abgenix 4.78.1, Abgenix 4.152.1 y anticuerpos que comprenden (a) una cadena pesada codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificantes de una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en secuencias nucleotídicas expuestas como SEC ID NOs: 2-7, y (b) una cadena ligera codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificantes de una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en secuencias nucleotídicas expuestas como SEC ID NOs: 8-13, o (c) una región variable de cadena pesada codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificantes de una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en secuencias nucleotídicas expuestas como SEC ID NOs: 14, 18, 22, 26 y 30, y d) una región variable de cadena ligera codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificantes de una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en secuencias nucleotídicas expuestas como SEC ID NOs: 16, 20, 24, 28 y 32.

En todavía otra realización de los métodos proporcionados, el anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno se une a un epítopo en PSMA definido por un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en PSMA 3.7, PSMA 3.8, PSMA 3.9, PSMA 3.11, PSMA 5.4, PSMA 7.1, PSMA 7.3, PSMA 10.3, PSMA 1.8.3, PSMA A3.1.3, PSMA A3.3.1, Abgenix 4.248.2, Abgenix 4.360.3, Abgenix 4.7.1, Abgenix 4.4.1, Abgenix 4.177.3, Abgenix 4.16.1, Abgenix 4.22.3, Abgenix 4.28.3, Abgenix 4.40.2, Abgenix 4.48.3, Abgenix 4.49.1, Abgenix 4.209.3, Abgenix 4.219.3, Abgenix 4.288.1, Abgenix 4.333.1, Abgenix 4.54.1, Abgenix 4.153.1, Abgenix 4.232.3, Abgenix 4.292.3, Abgenix 4.304.1, Abgenix 4.78.1, Abgenix 4.152.1 y anticuerpos que comprenden (a) una cadena pesada codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificantes de una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en secuencias nucleotídicas expuestas como SEC ID NOs: 2-7, y (b) una cadena ligera codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificantes de una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en secuencias nucleotídicas expuestas como SEC ID NOs: 8-13, o

(c) una región variable de cadena pesada codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificantes de una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en secuencias nucleotídicas expuestas como SEC ID NOs: 14, 18, 22, 26 y 30, y d) una región variable de cadena ligera codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificantes de una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en secuencias nucleotídicas expuestas como SEC ID NOs: 16, 20, 24, 28 y 32.

En una realización, el segundo anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en AB-PG1-XG1-006, AB-PG1XG1-026 y anticuerpos que comprenden (a) una cadena pesada codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificantes de una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en secuencias nucleotídicas expuestas como SEC ID NOs: 2 y 3, y (b) una cadena ligera codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificantes de una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en secuencias nucleotídicas expuestas como SEC ID NOs: 8 y 9, o (c) una región variable de cadena pesada codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificantes de una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en secuencias nucleotídicas expuestas como SEC ID NOs: 14 y 18, y d) una región variable de cadena ligera codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificantes de una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en secuencias nucleotídicas expuestas como SEC ID NOs: 16 y 20. En otra realización, el segundo anticuerpo comprende (a) una cadena pesada codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificantes de una secuencia nucleotídica expuesta como SEC ID NO: 2, y (b) una cadena ligera codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificantes de una secuencia nucleotídica expuesta como SEC ID NO: 8, o (c) una región variable de cadena pesada codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificantes de una secuencia nucleotídica expuesta como SEC ID NO: 14, y d) una región variable de cadena ligera codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificantes de una secuencia nucleotídica expuesta como SEC ID NO: 16. En todavía otra realización, el segundo anticuerpo comprende (a) una cadena pesada codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificantes de una secuencia nucleotídica expuesta como SEC ID NO: 3, y (b) una cadena ligera codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificantes de una secuencia nucleotídica expuesta como SEC ID NO: 9, o (c) una región variable de cadena pesada codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificantes de la secuencia nucleotídica expuesta como SEC ID NO: 18, y d) una región variable de cadena ligera codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificantes de la secuencia nucleotídica expuesta como SEC ID NO: 20.

En una realización adicional de los métodos proporcionados, el anticuerpo es codificado por una molécula de ácido

nucleico que comprende una secuencia nucleotídica que es al menos 90% idéntica a una secuencia nucleotídica que codifica un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en: AB-PG1-XG1-006, AB-PG1-XG1-026 y anticuerpos que comprenden (a) una cadena pesada codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificantes de una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en secuencias nucleotídicas expuestas como SEC ID NOs: 2 y 3, y (b) una cadena ligera codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificantes de una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en secuencias nucleotídicas expuestas como SEC ID NOs: 8 y 9, o (c) una región variable de cadena pesada codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificantes de una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en secuencias nucleotídicas expuestas como SEC ID NOs: 14 y 18, y d) una región variable de cadena ligera codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificantes de una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en secuencias nucleotídicas expuestas como SEC ID NOs: 16 y 20. En otra realización, el anticuerpo es codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica que es al menos 95% idéntica. En todavía otra realización, el anticuerpo es codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica que es al menos 97% idéntica. En todavía otra realización, el anticuerpo es codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica que es al menos 98% idéntica. En una realización adicional, el anticuerpo es codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica que es al menos 99% idéntica.

En otra realización de los métodos proporcionados, el anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno se selecciona del grupo que consiste en anticuerpos que comprenden (a) una cadena pesada codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificantes de una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en secuencias nucleotídicas expuestas como SEC ID NOs: 2 y 3, y (b) una cadena ligera codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificantes de una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en secuencias nucleotídicas expuestas como SEC ID NOs: 8 y 9, o

(c) una región variable de cadena pesada codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificantes de una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en secuencias nucleotídicas expuestas como SEC ID NOs: 14 y 18, y d) una región variable de cadena ligera codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificantes de una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en secuencias nucleotídicas expuestas como SEC ID NOs: 16 y 20, y sus fragmentos de unión a antígeno. En todavía otra realización, el anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno comprende (a) una cadena pesada codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificantes de una secuencia nucleotídica expuesta como SEC ID NO: 2, y (b) una cadena ligera codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificantes de una secuencia nucleotídica expuesta como SEC ID NO: 8, o (c) una región variable de cadena pesada codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificantes de una secuencia nucleotídica expuesta como SEC ID NO: 14, y d) una región variable de cadena ligera codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificantes de una secuencia nucleotídica expuesta como SEC ID NO: 16, y sus fragmentos de unión a antígeno. En todavía otra realización, el anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno comprende (a) una cadena pesada codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificantes de una secuencia nucleotídica expuesta como SEC ID NO: 3, y (b) una cadena ligera codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificantes de una secuencia nucleotídica expuesta como SEC ID NO: 9, o (c) una región variable de cadena pesada codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificantes de la secuencia nucleotídica expuesta como SEC ID NO: 18, y d) una región variable de cadena ligera codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificantes de la secuencia nucleotídica expuesta como SEC ID NO: 20, y sus fragmentos de unión a antígeno.

En todavía una realización adicional de los métodos proporcionados, el anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno es AB-PG1-XG1-006, AB-PG1-XG1-026 o un fragmento de unión a antígeno de los mismos.

En todavía una realización adicional de los métodos proporcionados, el anticuerpo humano es una IgG1 que comprende (a) una cadena pesada codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificantes de una secuencia nucleotídica expuesta como SEC ID NO: 2, y (b) una cadena ligera codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificantes de una secuencia nucleotídica expuesta como SEC ID NO: 8.

En un aspecto adicional, se proporciona un conjugado de anticuerpo-fármaco que comprende un anticuerpo, o su fragmento de unión a antígeno, que se une específicamente a PSMA, conjugado a un derivado de dolastatina 10, para uso en un método para tratar un cáncer que expresa PSMA, resistente a taxano. Preferiblemente, dicho método implica exterminar células cancerosas que expresan PSMA, resistentes a taxano. En otra realización, el método implica retrasar o inhibir la progresión del cáncer. En todavía otra realización, el método implica incrementar la supervivencia del sujeto en comparación con la supervivencia media de sujetos que no han sido tratados con el ADC de PSMA y que tienen cáncer de próstata metastásico progresivo, resistente a la castración, que ha progresado tras una terapia previa con taxano. En todavía otra realización, el método implica hacer disminuir un nivel circulante de células tumorales circulantes (CTCs) en comparación con un nivel de línea base. En una realización adicional, el método implica hacer disminuir o estabilizar un nivel sérico de PSA en comparación con un nivel de línea base de

PSA. También se prefiere que las células cancerosas que expresan PSMA, resistentes a taxano, se exterminen mediante el conjugado. Preferiblemente, el PSMA tiene la secuencia expuesta en SEC ID NO: 1. Preferiblemente, el conjugado es para tratar cáncer de próstata metastásico progresivo, resistente a la castración, que ha progresado tras una terapia previa con taxano. El derivado de dolastatina 10 puede ser una auristatina, y es preferiblemente MMAE (también denominada aquí como monometilauristatina E o monometilauristatin norefedrina) o MMAF (también denominada aquí como monometilauristatina F o monometilauristatin fenilalanina). En realizaciones preferidas de este aspecto adicional, el conjugado puede tener cualquiera de las características del conjugado empleado en otros aspectos de la invención definidos aquí. Además, el método implicado en este aspecto adicional, puede implicar la administración de una cantidad eficaz del conjugado, como se define con referencia a otros aspectos definidos aquí. También puede tener cualquiera de las características de cualquiera de los métodos para tratar un sujeto que se describen aquí.

Breve descripción de las figuras

La Fig. 1 presenta un esquema que muestra la localización subcelular de PSMA en próstata normal frente al cáncer de próstata. PSMA es una glucoproteína transmembránica de tipo II, de 750 restos, que está muy expresada en células de cáncer de próstata y tiene expresión limitada en tejidos no prostáticos normales. En la próstata normal, PSMA se expresa predominantemente como una variante de ayuste citoplásmica (PSM’), que es retenida en el citoplasma. En cáncer de próstata, PSMA se expresa como un homodímero asociado no covalentemente, anclado a la membrana.

La Fig. 2 presenta un esquema de un número de opciones de tratamiento de cáncer de próstata. La quimioterapia aprobada, docetaxel (Taxotere) en combinación con prednisona, para el cáncer de próstata avanzado proporciona un incremento modesto en la supervivencia (2-3 meses), con efectos secundarios significativos.

La Fig. 3 presenta un esquema que muestra la terapia dirigida por el conjugado de anticuerpo-fármaco (ADC).

La Fig. 4 proporciona las estructuras químicas de tres ejemplos de ligadores farmacéuticos que se pueden conjugar a un anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno que se une específicamente a PSMA y forma un conjugado de anticuerpo-fármaco.

La Fig. 5 demuestra la citotoxicidad potente y específica de ADC de PSMA para células de cáncer de próstata que expresan PSMA. Células positivas a PSMA y negativas a PSMA se expusieron a ADC de PSMA en microplacas de 96 pocillos a diversas concentraciones. Después de 96 horas, se evaluó la supervivencia celular en porcentaje (en comparación con células en el medio), usando Alamar Blue fluorescente.

La Fig. 6 presenta una tabla que demuestra la citotoxicidad potente y específica de ADC de PSMA contra células de cáncer de próstata que expresan PSMA.

La Fig. 7 muestra el volumen tumoral a lo largo del tiempo en ratones atímicos tratados con ADC de PSMA frente a un control. Los ratones atímicos que poseen tumores de cáncer de próstata humano se distribuyeron al azar en el día 11 en dos grupos, control con vehículo PBS (diamantes en negrita, n = 15, 108,9 mm3)y ADC de PSMA (triángulos en negrita, n = 15, 108,7 mm3), según el volumen tumoral. Los animales recibieron inyecciones intravenosas de PBS o de ADC de PSMA a 6 mg/kg en los días 12, 15, 18, 22, 25 y 29. El volumen tumoral medio se representó gráficamente para el grupo de control de vehículo PBS hasta que el primer animal se sacrificó en el día 33 debido a la limitación del tamaño tumoral (>2000 mm3).

La Fig. 8 muestra el efecto del tratamiento con ADC de PSMA sobre el volumen tumoral con un tratamiento con ADC de PSMA inicial y con un segundo tratamiento con ADC de PSMA. Se hicieron crecer nuevamente tumores de cuatro ratones del grupo de tratamiento con ADC de PSMA, y se trataron con ADC de PSMA a la misma dosis de 6 mg/kg. ADC de PSMA redujo eficazmente el volumen tumoral hasta < 100 mm3 desde un gran tumor de 894 mm3. Las líneas punteadas indican el tratamiento inicial con ADC de PSMA (6 dosis, dos veces por semana), y las líneas continuas muestran el segundo tratamiento con ADC de PSMA (13 dosificaciones semanales).

La Fig. 9 demuestra los efectos en ratones atímicos que tienen un tamaño tumoral de ∃500 mm3 y que se trataron con 12 dosis de docetaxel administrado intraperitonealmente (IP) a 12 mg/kg semanalmente como se indica por las líneas discontinuas. El tumor respondió inicialmente a docetaxel, y después reapareció. Partiendo en el día 100 con un volumen tumoral de 800 mm3, se administró intravenosamente (IV) ADC de PSMA a 6 mg/kg durante 12 dosis adicionales semanalmente (líneas continuas). ADC de PSMA redujo el volumen tumoral desde 800 mm3 hasta 50 mm3.

La Fig. 10 muestra un esquema de distribución al azar para el ensayo de la eficacia de ADC de PSMA tras el fallo del tratamiento con docetaxel. En la primera distribución al azar, a los animales se les asignó al grupo de control de vehículo o al grupo de tratamiento con docetaxel. Si el volumen tumoral superó 400 mm3 en el grupo tratado con docetaxel, los animales se distribuyeron al azar (la segunda distribución al azar) a una

relación 1:1 en dos subgrupos: tratamiento continuado con docetaxel o tratamiento con ADC de PSMA. Los volúmenes tumorales de los animales se midieron a lo largo del tiempo.

La Fig. 11 muestra el volumen tumoral a lo largo del tiempo en ratones atímicos tratados con docetaxel frente al control. Los ratones atímicos que poseen tumores de cáncer de próstata humano se distribuyeron al azar en el día 14 según el volumen tumoral en dos grupos, control de vehículo (diamantes en negro, n = 10) y docetaxel (círculos negros, n = 50). Los animales recibieron inyecciones intravenosas de PBS o de docetaxel a 2 mg/kg/IV semanalmente. El volumen tumoral medio de los dos grupos se representó gráficamente hasta que se inició la segunda distribución al azar. El tratamiento con docetaxel redujo el crecimiento tumoral en comparación con el control en al menos hacia el día 21 (p = 0,025) y posterior.

La Fig. 12 muestra la comparación del volumen tumoral en dos subgrupos tras el fracaso del tratamiento inicial con docetaxel: (1) tratamiento continuado con docetaxel, triángulo negro, (2) tratamiento con ADC de PSMA, 6 mg/kg, cuadrados negros. Puesto que los ratones se asignaron a diferentes grupos en tiempos diferentes, el tiempo de tratamiento (días tras la segunda distribución al azar) se alineó al día 0 (inicio de ADC de PSMA o continuación de docetaxel tras la segunda distribución al azar).

La Fig. 13 muestra un esquema del diseño de un estudio in vivo.

La Fig. 14 muestra el volumen tumoral de cada animal. Cuando el volumen tumoral de un animal en el grupo tratado con docetaxel superó 400 mm3, el animal se distribuyó al azar en una relación 1:1 en dos subgrupos: 1) cambiado a tratamiento con ADC de PSMA a 6 mg/kg/IV semanalmente (cuadrados negros: media: 515 ± 103 mm3, intervalo 410-727 mm3), y 2) tratamiento continuado con docetaxel a 2 mg/kg (triángulos negros, media: 495 ± 80 mm3, intervalo: 401-650 mm3). Se muestra el tamaño tumoral de cada animal y el tiempo de la distribución al azar. Los volúmenes tumorales en la segunda distribución al azar no fueron significativamente diferentes entre los dos grupos (p = 0,518, prueba de la t).

La Fig. 15 muestra el tamaño tumoral para cada animal individual en dos grupos tras la segunda distribución al azar. Los volúmenes tumorales de los animales con tratamiento con ADC de PSMA (panel A) y con tratamiento continuado con docetaxel (panel B) se representaron gráficamente como una función del tiempo tras la segunda distribución al azar (día 0). Los tumores se encogieron cuando se inició el tratamiento con ADC de PSMA (panel A). Sin embargo, incluso con el tratamiento continuado con docetaxel, los tumores continuaron creciendo excepto en un animal (panel B).

La Fig. 16 muestra una comparación de los volúmenes tumorales medios en animales que reciben tratamiento con ADC de PSMA (cuadrados negros) y en animales que reciben tratamiento continuado con docetaxel (cuadrados negros). El volumen tumoral medio se comparó como una función del tiempo tras la segunda distribución al azar (día 0). Los tamaños tumorales de los dos grupos fueron significativamente diferentes (p < 0,007).

La Fig. 17 muestra una comparación de la supervivencia de los animales a lo largo del tiempo tras la segunda distribución al azar para animales que reciben el tratamiento con ADC de PSMA (línea continua) y animales que reciben tratamiento continuado con docetaxel (línea discontinua). En el día 157 tras la segunda distribución al azar, todos los 18 animales en el grupo de tratamiento con ADC de PSMA todavía estaban vivos. Sin embargo, 16 de 18 animales en el grupo de tratamiento continuado con docetaxel se sacrificaron debido a sus grandes tumores (> 2.000 mm3), con una supervivencia media de 45 días. ADC de PSMA aumentó significativamente la supervivencia global (p < 0,0001).

La Fig. 18 muestra una comparación de los pesos corporales medios tras la segunda distribución al azar en animales que reciben tratamiento con ADC de PSMA (cuadrados negros) y animales que reciben tratamiento continuado con docetaxel (triángulos negros). Globalmente, los animales ganaron peso en el grupo de tratamiento con ADC de PSMA, mientras que los animales perdieron peso en el grupo de tratamiento continuado con docetaxel. El cambio en el peso corporal fue significativamente diferente (p < 0,001) entre estos dos grupos.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere, en parte, al hallazgo sorprendente de que conjugados de anticuerpo-fármaco (ADCs) que comprenden un anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno que se une específicamente a PSMA, conjugado a un derivado de dolastatina 10, en particular auristatinas tales como MMAE (también denominada aquí como monometilauristatina E o monometilauristatin norefedrina) o MMAF (también denominada aquí como monometilauristatina F o monometilauristatin fenilalanina), se pueden usar para exterminar células cancerosas que expresan PSMA, resistentes a taxano. Como se describe posteriormente más abajo, se encontró inesperadamente que células cancerosas que expresan PSMA, que se habían hecho resistentes a los efectos de un agente anticanceroso que actúa destruyendo la red microtubular en células, fueron sensibles a los efectos de un segundo agente anticanceroso que también selecciona como diana a los microtúbulos. Específicamente descrita aquí, la auristatina, MMAE, un inhibidor potente de tubulina, en forma de un conjugado de anticuerpo-fármaco, cuando se suministra a tumores de próstata que expresan PSMA que se habían hecho resistentes a docetaxel, fue capaz de

exterminar células cancerosas resistentes a docetaxel de manera que se disminuyó significativamente el volumen tumoral.

Como se usa aquí, “células cancerosas que expresan PSMA” pretende referirse a células cancerosas que expresan PSMA (por ejemplo, PSMA humano). PSMA es una glucoproteína de membrana de tipo II de 100 kD expresada en tejidos de próstata (Horoszewicz et al., 1987, Anticancer Res. 7:927-935; patente U.S. nº 5.162.504). PSMA se caracterizó como una proteína transmembránica de tipo II que tiene identidad de secuencia con el receptor de transferrina (Israeli et al., 1994, Cancer Res. 54:1807-1811) y con actividad de NAALADasa (Carter et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:749-753). De forma más importante, PSMA se expresa en cantidades crecientes en cáncer de próstata, y también se detectan niveles elevados de PSMA en los sueros de estos pacientes (Horoszewicz et al., 1987; Rochon et al., 1994, Prostate 25:219-223; Murphy et al., 1995, Prostate 26:164-168; y Murphy et al., 1995, Anticancer Res. 15:1473-1479). La expresión de PSMA en próstata cancerosa es aproximadamente 10 veces mayor que aquella en próstata normal. La expresión en próstata normal es aproximadamente 10 veces mayor que aquella en el cerebro, y es 50 a 100 veces mayor que aquella del hígado o riñón. En la mayoría de tejidos normales, no se observa expresión de PSMA. La expresión de PSMA aumenta con la progresión de la enfermedad, haciéndose la más elevada en enfermedad metastásica, refractaria a hormonas. Además, PSMA se expresa también abundantemente en la neovasculatura de una variedad de tumores no prostáticos, incluyendo tumores de vejiga, mama, colon, páncreas, sarcoma, melanoma, renal, hígado, pulmón (por ejemplo, carcinoma de pulmón no microcítico), y riñón, pero no en la vasculatura normal. Por lo tanto, las células cancerosas que expresan PSMA incluyen, por ejemplo, células de cáncer de próstata así como células endoteliales de la neovasculatura de un número de cánceres no prostáticos.

“Células cancerosas resistentes a taxano” se refiere a células cancerosas de un cáncer que se ha tratado con un taxano pero que se ha hecho resistente al tratamiento con el taxano (es decir, el tratamiento posterior con el taxano no ralentizaría o detendría la progresión del cáncer, y/o ya no proporcionaría un beneficio significativo a un sujeto con el cáncer). Un “sujeto con un cáncer resistente a taxano” es aquel que ha recibido tratamiento previo con un taxano pero ya no experimenta un beneficio significativo del tratamiento posterior con el taxano (por ejemplo, ya no experimenta una reducción significativa en el número de células cancerosas, en el volumen tumoral, en la longitud del tumor, en el número de metástasis y/o en otros marcadores de la progresión de la enfermedad, y/o ya no experimenta una mejora en la calidad de vida y/o aumento de la supervivencia en comparación con el tiempo de supervivencia esperado sin tratamiento adicional con el taxano).

Por lo tanto, en una realización, el ADC de PSMA se administra a un sujeto con cáncer de próstata progresivo, metastásico, refractario a hormonas, resistente a taxano tras la quimioterapia previa con taxano. En otra realización, tal sujeto es un ser humano.

Como se usa aquí, “taxanos” son agentes contra el cáncer que interfieren con o interrumpen la estabilidad, formación y/o función de los microtúbulos. Tales agentes incluyen paclitaxel y docetaxel así como sus derivados, en los que los derivados funcionan contra los microtúbulos mediante el mismo modo de acción que los taxanos de los que derivan.

El ADC puede comprender un anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno conjugado a la auristatina MMAE o MMAF. Las auristatinas son moléculas pentapeptídicas sintéticas que están estructuralmente relacionadas con dolastatina 10, un producto natural derivado de un animal marino. MMAE y otras auristatinas actúan inhibiendo la polimerización de tubulinas, evitando de ese modo la formación del husillo mitótico. Cuando el ciclo celular se detiene, se dispara la muerte celular apoptótica. En algunas realizaciones, el anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno se puede conjugar a MMAE o a MMAF con un compuesto de la siguiente fórmula: (Fórmula 1): -An-Ym-Zm-Xn-Wn-, en la que A es una unidad de acilo carboxílico; Y es un aminoácido; Z es un aminoácido; X y W son cada uno un espaciador autoinmolativo; n es un número entero de 0 a 1; y m es un número entero de 0 ó 1, 2, 3,4, 5 ó 6. En algunas realizaciones, el ADC está representado por la fórmula (Fórmula 2): L-{An-Ym-Zm-Xn-Wn-D}p, en la que L es un anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno que se une a PSMA, D es MMAE o MMAF, y p es un número entero de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8. Los otros componentes son como se describe anteriormente. En una realización, la unidad carboxílica “An” está enlazada al anticuerpo o fragmento de unión a antígeno vía un átomo de azufre derivado del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno:

En una realización, A es en la que q es 1-10. Por lo tanto, en una realización, el conjugado es:

en el que L, Y, Z, X, W, D, n, m, q y p son como se definen previamente.

5 En otra realización, A es 4-(N-succinimidometil)ciclohexano-1-carbonilo, m-succinimidobenzoílo, 4-(psuccinimidofenil)-butirilo, 4-(2-acetamido)benzoílo, 3-tiopropionilo, 4-(1-tioetil)-benzoílo, 6-(3-tiopropionilamido)hexanoílo o maleimida caproílo. En una realización adicional, A es maleimida caproílo. Los ejemplos representativos de diversas unidades de acilo carboxílico y métodos para su síntesis y unión se describen en la patente US nº

6.214.345.

10 En otra realización, Y es alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina, triptófano o prolina. En todavía otra realización, Y es valina. En una realización adicional, Z es lisina, lisina protegida con acetilo o formilo, arginina, arginina protegida con grupos tosilo o nitro, histidina, o nitina, o nitina protegida con acetilo o formilo, o citrulina. En todavía una realización adicional, Z es citrulina. En una realización, Ym-Zm es valina-citrulina. En otra realización, Ym-Zm es una secuencia proteínica que es escindible selectivamente por una proteasa.

15 En una realización adicional, X es un compuesto que tiene la fórmula

en la que T es O, N, o S. En otra realización, X es un compuesto que tiene la fórmula -HN-R1-COT en la que R1 es alquilo de C1-C5, T es O, N o S. En una realización adicional, X es un compuesto que tiene la fórmula

en la que T es O, N, o S, R2 es H o alquilo de C1-C5. En una realización, X es p-aminobencilcarbamoiloxi. En otra realización, X es alcohol p-aminobencílico. En una realización adicional, X es carbamato de p-aminobencilo. En aún

una realización adicional, X es p-aminobenciloxicarbonilo. En otra realización, X es ácido !-aminobutírico; ácido ∀,∀dimetil !-aminobutírico o ácido #,#-dimetil !-aminobutírico.

En algunas realizaciones, W es

en la que T es O, So N.

En una realización, el compuesto de Fórmula 1 es maleimidocaproílo. Maleimidocaproílo se ha usado para la conjugación de dos auristatinas específicas a un mAb anti-CD30 (AC10) (Doronina, Svetlana et al. “Novel Linkers for Monoclonal Antibody-Mediated Delivery of Anticancer Agents”, AACR, Anaheim, CA, Abstract No. 1421, 16-20 de abril de 2005). Maleimidocaproílo reacciona con grupos tiol para formar un tioéter.

MMAE o MMAF se pueden conjugar a un anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno usando métodos conocidos por los expertos normales en la técnica (por ejemplo., véase, Niemeyer, CM, Bioconjugation Protocols, Strategies and Methods, Humana Press, 2004) o como se describen aquí. En algunas realizaciones, más de una molécula de MMAE o MMAF se conjuga al anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno. En otras realizaciones, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 moléculas de MMAE o MMAF se conjugan al anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno. En todavía otras realizaciones, al menos 2, 3, 4 ó 5 moléculas de MMAE o MMAF se conjugan al anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno. En realizaciones adicionales, 2, 3, 4 ó 5 moléculas de MMAE o MMAF se conjugan al anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno.

Los anticuerpos o sus fragmentos de unión a antígeno de los ADCs son cualquier anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno que se une específicamente a PSMA. En una realización, el anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno se une específicamente a PSMA (por ejemplo, se une específicamente a un dominio extracelular de PSMA, se une específicamente a un epítopo conformacional de PSMA, etc.), y puede inhibir competitivamente la unión específica de un segundo anticuerpo a su epítopo diana en PSMA, en el que el segundo anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en PSMA 3.7, PSMA 3.8, PSMA 3.9, PSMA 3.11, PSMA 5.4, PSMA 7.1, PSMA 7.3, PSMA 10.3, PSMA 1.8.3, PSMA A3.1.3, PSMA A3.3.1, Abgenix 4.248.2, Abgenix 4.360.3, Abgenix 4.7.1, Abgenix 4.4.1, Abgenix 4.177.3, Abgenix 4.16.1, Abgenix 4.22.3, Abgenix 4.28.3, Abgenix 4.40.2, Abgenix 4.48.3, Abgenix 4.49.1, Abgenix 4.209.3, Abgenix 4.219.3, Abgenix 4.288.1, Abgenix 4.333.1, Abgenix 4.54.1, Abgenix 4.153.1, Abgenix 4.232.3, Abgenix 4.292.3, Abgenix 4.304.1, Abgenix 4.78.1, Abgenix 4.152.1 y anticuerpos que comprenden (a) una cadena pesada codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificantes de una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en secuencias nucleotídicas expuestas como SEC ID NOs: 2-7, y (b) una cadena ligera codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificantes de una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en secuencias nucleotídicas expuestas como SEC ID NOs: 8-13. Por lo tanto, el segundo anticuerpo, incluye cualquiera de los anticuerpos producidos por los hibridomas o codificados por los plásmidos mostrados más abajo en la Tabla 1. Estos hibridomas y plásmidos se depositaron según, y en satisfacción de, los requisitos del Tratado de Budapest en el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para los Fines de Procedimiento de Patentes en la American Type Culture Collection (“ATCC”) como una Autoridad de Depósito Internacional y se les dio las Designaciones de Depósito de Patente mostradas anteriormente y en la Tabla 1.

Tabla 1

Anticuerpo: Hibridoma/Plásmido Designación de Depósito de Patente Fecha de presentación

PSMA 3.7
PSMA 3.7: PTA-3257 5 de abril de 2001

PSMA 3.9
PSMA 3.9: PTA-3258 5 de abril de 2001

PSMA 3.11
PSMA 3.11: PTA-3269 10 de abril de 2001

PSMA 5.4
PSMA 5.4: PTA-3268 10 de abril de 2001

PSMA 7.1
PSMA 7.1: PTA-3292 18 de abril de 2001

PSMA 7.3
PSMA 7.3: PTA-3293 18 de abril de 2001

PSMA 10.3: PSMA 10.3 PSMA 10.3 HC en pcDNA (SEC ID NO: 7) PSMA 10.3 Kappa en pcDNA (SEC ID NO: 13) PTA-3347 PTA-4413 PTA-4414 1 de mayo de 2001 29 de mayo de 2002 29 de mayo de 2002

PSMA 1.8.3
PSMA 1.8.3: PTA-3906 5 de diciembre de 2001

PSMA A3.1.3
PSMA A3.1.3: PTA-3904 5 de diciembre de 2001

PSMA A3.3.1
PSMA A3.3.1: PTA-3905 5 de diciembre de 2001

Abgenix 4.248.2
Abgenix 4.248.2: PTA-4427 4 de junio de 2002

Abgenix 4.360.3
Abgenix 4.360.3: PTA-4428 4 de junio de 2002

Abgenix 4.7.1
Abgenix 4.7.1: PTA-4429 4 de junio de 2002

Abgenix 4.4.1
Abgenix 4.4.1: PTA-4556 18 de julio de 2002

Abgenix 4.177.3
Abgenix 4.177.3: PTA-4557 18 de julio de 2002

Abgenix 4.16.1
Abgenix 4.16.1: PTA-4357 16 de mayo de 2002

Abgenix 4.22.3
Abgenix 4.22.3: PTA-4358 16 de mayo de 2002

Abgenix 4.28.3
Abgenix 4.28.3: PTA-4359 16 de mayo de 2002

Abgenix 4.40.2
Abgenix 4.40.2: PTA-4360 16 de mayo de 2002

Abgenix 4.48.3
Abgenix 4.48.3: PTA-4361 16 de mayo de 2002

Abgenix 4.49.1
Abgenix 4.49.1: PTA-4362 16 de mayo de 2002

Abgenix 4.209.3
Abgenix 4.209.3: PTA-4365 16 de mayo de 2002

Abgenix 4.219.3
Abgenix 4.219.3: PTA-4366 16 de mayo de 2002

Abgenix 4.288.1
Abgenix 4.288.1: PTA-4367 16 de mayo de 2002

Abgenix 4.333.1
Abgenix 4.333.1: PTA-4368 16 de mayo de 2002

Abgenix 4.54.1
Abgenix 4.54.1: PTA-4363 16 de mayo de 2002

Abgenix 4.153.1
Abgenix 4.153.1: PTA-4388 23 de mayo de 2002

Abgenix 4.232.3
Abgenix 4.232.3: PTA-4389 23 de mayo de 2002

Abgenix 4.292.3
Abgenix 4.292.3: PTA-4390 23 de mayo de 2002

Abgenix 4.304.1
Abgenix 4.304.1: PTA-4391 23 de mayo de 2002

AB-PG1-XG1-006: AB-PG1-XG1-006 cadena pesada (SEC ID NO: 2) AB-PG1-XG1-006 cadena ligera (SEC ID NO: 8) PTA-4403 PTA-4404 29 de mayo de 2002

AB-PG1-XG1-026: AB-PG1-XG1-026 cadena pesada (SEC ID NO: 3) PTA-4405 29 de mayo de 2002

AB-PG1-XG1-026 cadena ligera (SEC ID NO: 9): PTA-4406

AB-PG1-XG1-051: AB-PG1-XG1-051 cadena pesada (SEC ID NO: 4) AB-PG1-XG1-051 cadena ligera (SEC ID NO: 10) PTA-4407 PTA-4408 29 de mayo de 2002

AB-PG1-XG1-069: AB-PG1-XG1-069 cadena pesada (SEC ID NO: 5) AB-PG1-XG1-069 cadena ligera (SEC ID NO: 11) PTA-4409 PTA-4410 29 de mayo de 2002

AB-PG1-XG1-077: AB-PG1-XG1-077 cadena pesada (SEC ID NO: 6) AB-PG1-XG1-077 cadena ligera (SEC ID NO: 12) PTA-4411 PTA-4412 29 de mayo de 2002

Para determinar la inhibición competitiva, se puede emplear una variedad de ensayos conocidos por un experto normal en la técnica. Por ejemplo, se pueden usar ensayos de competición cruzada para determinar si un anticuerpo

o su fragmento de unión a antígeno inhibe competitivamente la unión a PSMA por otro anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno. Estos incluyen métodos a base de células que emplean citometría de flujo o análisis de unión en fase sólida. También se pueden usar otros ensayos que evalúan la capacidad de los anticuerpos o sus fragmentos de unión a antígeno para competir de forma cruzada por las moléculas de PSMA que no están expresadas en la superficie de las células, en fase sólida o en fase de disolución.

En algunas realizaciones, los anticuerpos o sus fragmentos de unión a antígeno inhiben competitivamente la unión específica de un segundo anticuerpo a su epítopo diana en PSMA en al menos alrededor de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, o 99%. La inhibición se puede evaluar a diversas relaciones molares o relaciones másicas; por ejemplo, los experimentos de unión competitiva se pueden llevar a cabo con un exceso molar 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 7 veces, 10 veces o más de un primer anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno sobre un segundo anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno.

En otra realización el anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno se une específicamente a un epítopo en PSMA definido por un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en PSMA 3.7, PSMA 3.8, PSMA 3.9, PSMA 3.11, PSMA 5.4, PSMA 7.1, PSMA 7.3, PSMA 10.3, PSMA 1.8.3, PSMA A3.1.3, PSMA A3.3.1, 4.248.2, 4.360.3, 4.7.1, 4.4.1, 4.177.3, 4.16.1, 4.22.3, 4.28.3, 4.40.2, 4.48.3, 4.49.1, 4.209.3, 4.219.3, 4.288.1, 4.333.1, 4.54.1, 4.153.1, 4.232.3, 4.292.3, 4.304.1, 4.78.1, y 4.152.1, PSMA 3.7, PSMA 3.8, PSMA 3.9, PSMA 3.11, PSMA 5.4, PSMA 7.1, PSMA 7.3, PSMA 10.3, PSMA 1.8.3, PSMA A3.1.3, PSMA A3.3.1, Abgenix 4.248.2, Abgenix 4.360.3, Abgenix 4.7.1, Abgenix 4.4.1, Abgenix 4.177.3, Abgenix 4.16.1, Abgenix 4.22.3, Abgenix 4.28.3, Abgenix 4.40.2, Abgenix 4.48.3, Abgenix 4.49.1, Abgenix 4.209.3, Abgenix 4.219.3, Abgenix 4.288.1, Abgenix 4.333.1, Abgenix 4.54.1, Abgenix 4.153.1, Abgenix 4.232.3, Abgenix 4.292.3, Abgenix 4.304.1, Abgenix 4.78.1, Abgenix 4.152.1 y anticuerpos que comprenden (a) una cadena pesada codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificantes de una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en secuencias nucleotídicas expuestas como SEC ID NOs: 2-7, y (b) una cadena ligera codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificantes de una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en secuencias nucleotídicas expuestas como SEC ID NOs: 8-13. Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los ADCs, por lo tanto, incluyen aquellos que se unen específicamente a un epítopo en PSMA definido por los anticuerpos producidos por los hibridomas o codificados por los plásmidos proporcionados anteriormente en la Tabla 1.

Para determinar el epítopo, se pueden usar métodos de cartografiado de epítopos estándar conocidos en la técnica. Por ejemplo, se pueden usar fragmentos (péptidos) del antígeno PSMA (por ejemplo, péptidos sintéticos) que se unen al anticuerpo para determinar si un anticuerpo candidato o su fragmento de unión a antígeno se une al mismo epítopo. Para epítopos lineales, se sintetizan péptidos solapantes de una longitud definida (por ejemplo, 8 o más aminoácidos). Los péptidos pueden estar separados por 1 aminoácido, de manera que se prepara una serie de péptidos que cubren cada fragmento de 8 aminoácidos de la secuencia proteica de PSMA. Se pueden preparar unos pocos péptidos usando separaciones más grandes, por ejemplo 2 ó 3 aminoácidos. Además, se pueden sintetizar péptidos más largos (por ejemplo 9-, 10-u 11-meros). La unión de los péptidos a los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno se puede determinar usando metodologías estándar, incluyendo ensayos de resonancia de

plasmones de superficie (BIACORE) y ELISA. Para el examen de epítopos conformacionales, se pueden usar fragmentos de PSMA más grandes. Se han descrito y se pueden usar otros métodos que usan espectrometría de masas para definir epítopos conformacionales (véase, por ejemplo, Baerga-Ortiz et al., Protein Science 11:13001308, 2002 y referencias citadas allí). Todavía otros métodos para la determinación de los epítopos se proporcionan en trabajos de referencia de laboratorio estándar, tales como Unidad 6.8 (“Phage Display Selection and Analysis of B-cell Epitopes”) y Unidad 9.8 (“Identification of Antigenic Determinants Using Synthetic Peptide Combinatorial Libraries”) de Current Protocols in Immunology, Coligan et al., eds., John Wiley & Sons. Los epítopos se pueden confirmar introduciendo mutaciones de punto o supresiones en un epítopo conocido, y ensayando entonces la unión con uno o más anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno para determinar qué mutaciones reducen la unión de los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno.

En realizaciones particulares, los anticuerpos de los ADCs, o a partir de los cuales se derivan los fragmentos de unión a antígeno de los ADCs, son aquellos producidos por hibridomas denominados aquí como PSMA 3.7, PSMA 3.8, PSMA 3.9, PSMA 3.11, PSMA 5.4, PSMA 7.1, PSMA 7.3, PSMA 10.3, PSMA 1.8.3, PSMA A3.1.3, PSMA A3.3.1, Abgenix 4.248.2, Abgenix 4.360.3, Abgenix 4.7.1, Abgenix 4.4.1, Abgenix 4.177.3, Abgenix 4.16.1, Abgenix 4.22.3, Abgenix 4.28.3, Abgenix 4.40.2, Abgenix 4.48.3, Abgenix 4.49.1, Abgenix 4.209.3, Abgenix 4.219.3, Abgenix 4.288.1, Abgenix 4.333.1, Abgenix 4.54.1, Abgenix 4.153.1, Abgenix 4.232.3, Abgenix 4.292.3, Abgenix 4.304.1, Abgenix 4.78.1, y Abgenix 4.152.1, respectivamente. En otras realizaciones, los anticuerpos son aquellos codificados por los plásmidos enumerados en la Tabla 1. En todavía otras realizaciones, los anticuerpos son aquellos que comprenden una cadena pesada codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificantes de la cadena pesada de una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en las secuencias nucleotídicas expuestas como SEC ID NOs: 2-7, y una cadena ligera codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificantes de la cadena ligera de una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en secuencias nucleotídicas expuestas como SEC ID NOs: 8-13.

Como se usa aquí, los nombres de los hibridomas o plásmidos depositados se pueden usar de forma intercambiable con los nombres de los anticuerpos. Será claro para el experto normal en la técnica cuándo el nombre pretende referirse al anticuerpo o cuándo se refiere a los plásmidos o hibridomas que codifican o producen los anticuerpos, respectivamente. Adicionalmente, los nombres de los anticuerpos pueden ser una forma abreviada del nombre mostrado en la Tabla 1. Por ejemplo, el anticuerpo AB-PG1-XG1-006 se puede denominar AB-PG1-XG1-006, PG1XG1-006, XG1-006, 006, etc. En otro ejemplo, el nombre del anticuerpo PSMA 4.232.3 se puede denominar PSMA 4.232.3, 4.232.1, 4.232, etc. Se pretende que todas las variaciones en el nombre del anticuerpo se refieran al mismo anticuerpo y no a uno diferente.

Los anticuerpos de los ADCs, o a partir de los cuales se derivan los fragmentos de unión a antígeno de los ADCs, incluyen aquellos codificados por conjuntos particulares de secuencias de cadena pesada y ligera. En una realización, el anticuerpo (AB-PG1-XG1-006) es codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificantes de las secuencias de ácido nucleico expuestas como SEC ID NOs: 2 y 8. En otra realización, el anticuerpo (AB-PG1-XG1-026) es codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificantes de las secuencias de ácido nucleico expuestas como SEC ID NOs: 3 y 9. En todavía otra realización, el anticuerpo (AB-PG1-XG1-051) es codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificantes de las secuencias de ácido nucleico expuestas como SEC ID NOs: 4 y 10. En todavía otra realización, el anticuerpo (AB-PG1-XG1-069) es codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificantes de las secuencias de ácido nucleico expuestas como SEC ID NOs: 5 y

11.: En otra realización, el anticuerpo (AB-PG1-XG1-077) es codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificantes de las secuencias de ácido nucleico expuestas como SEC ID NOs: 6 y

12.: En todavía otra realización, el anticuerpo (PSMA 10.3) es codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificantes de las secuencias de ácido nucleico expuestas como SEC ID NOs: 7 y

13.: En otras realizaciones, los anticuerpos de los ADCs, o a partir de los cuales se derivan los fragmentos de unión a antígeno de los ADCs, incluyen una región variable de cadena pesada codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificantes de una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en secuencias nucleotídicas expuestas como SEC ID NOs: 14, 18, 22, 26 y 30, y una región variable de cadena ligera codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificantes de una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en secuencias nucleotídicas expuestas como SEC ID NOs: 16, 20, 24, 28 y 32. En una realización, el anticuerpo (AB-PG1-XG1-006) incluye una secuencia variable inmunoglobulínica codificada por moléculas ácido nucleico que comprenden la región o regiones codificantes de las secuencias de ácido nucleico expuestas como SEC ID NOs: 14 y 16. De forma similar, el anticuerpo puede ser uno que incluye una secuencia variable inmunoglobulínica que comprende las secuencias de aminoácido expuestas como SEC ID NOs: 15 y 17. En otra realización, el anticuerpo (AB-PG1-XG1-026) incluye una secuencia variable inmunoglobulínica codificada por moléculas de ácido nucleico que comprenden la región o regiones codificantes de secuencias nucleotídicas expuestas como SEC ID NOs: 18 y 20 o incluye una secuencia variable inmunoglobulínica que comprende las secuencias de aminoácido expuestas como SEC ID NOs 19 y 21. En todavía otra realización, el anticuerpo (AB-PG1-XG1 -051) incluye una secuencia variable inmunoglobulínica codificada por las moléculas de ácido nucleico que comprenden la región o regiones codificantes de secuencias nucleotídicas expuestas como SEC ID NOs: 22 y 24 o incluye una secuencia variable inmunoglobulínica que comprende las secuencias de aminoácido expuestas como SEC ID NOs: 23 y 25. En todavía otra realización, el anticuerpo (AB-PG1-XG1-069) incluye una

secuencia variable inmunoglobulínica codificada por las moléculas de ácido nucleico que comprenden la región o regiones codificantes de secuencias nucleotídicas expuestas como SEC ID NOs: 26 y 28 o incluye una secuencia variable inmunoglobulínica que comprende las secuencias de aminoácido expuestas como SEC ID NOs: 27 y 29. En otra realización, el anticuerpo (AB-PG1-XG1-077) incluye una secuencia variable inmunoglobulínica codificada por las moléculas de ácido nucleico que comprenden la región o regiones codificantes de secuencias nucleotídicas expuestas como SEC ID NOs: 30 y 32 o incluye una secuencia variable inmunoglobulínica que comprende las secuencias de aminoácido expuestas como SEC ID NOs: 31 y 33. En otras realizaciones, el anticuerpo incluye una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en secuencias de aminoácido expuestas como: SEC ID NOs: 15, 19, 23, 27 y 31, y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en secuencias de aminoácido expuestas como: SEC ID NOs: 17, 21, 25, 29 y 33.

Como se usa aquí, una “región codificante” se refiere a una región de una secuencia nucleotídica que codifica una secuencia polipeptídica. Su uso aquí es consistente con el significado reconocido conocido en la técnica.

En ciertas realizaciones, los anticuerpos de los ADCs, o a partir de los que derivan los fragmentos de unión a antígeno de los ADCs, son aquellos que son codificados por moléculas de ácido nucleico que son muy homólogas a los ácidos nucleicos anteriores. La molécula de ácido nucleico homóloga puede comprender, en algunas realizaciones, una secuencia nucleotídica que es al menos alrededor de 90% idéntica a la secuencia nucleotídica proporcionada aquí. En otras realizaciones, la secuencia nucleotídica es al menos alrededor de 95% idéntica, al menos alrededor de 97% idéntica, al menos alrededor de 98% idéntica, o al menos alrededor de 99% idéntica a una secuencia nucleotídica proporcionada aquí. La homología se puede calcular usando diversas herramientas de software públicamente disponibles, bien conocidas por el experto normal en la técnica. Las herramientas ejemplares incluyen el sistema BLAST disponible de la página web del National Center for Biotechnology Information (NCBI) en los National Institutes of Health.

Otro método para identificar secuencias nucleotídicas muy homólogas es vía hibridación de ácidos nucleicos. De este modo, los anticuerpos de los ADCs, o a partir de los que se derivan los fragmentos de unión a antígeno de los ADCs, incluyen anticuerpos que tienen una propiedad de unión a PSMA y/u otras propiedades funcionales descritas aquí, que son codificados por moléculas de ácido nucleico que se hibridan en condiciones muy restrictivas a las moléculas de ácido nucleico anteriores. La identificación de secuencias relacionadas también se puede lograr usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y otras técnicas de amplificación adecuadas para clonar secuencias de ácidos nucleicos relacionadas. Los cebadores de la PCR se pueden seleccionar para amplificar porciones de una secuencia de ácido nucleico de interés, tal como una CDR.

La expresión “condiciones de restricción elevada”, como se usa aquí, se refiere a parámetros con los que está familiarizada la técnica. Los parámetros de hibridación de ácidos nucleicos se pueden encontrar en referencias que compilan tales métodos, por ejemplo Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds., Segunda Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989, o Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., Nueva York. Un ejemplo de condiciones de restricción elevada es la hibridación a 65ºC en tampón de hibridación (3,5X SSC, 0,02% de Ficoll, 0,02% de polivinilpirrolidona, 0,02% de seroalbúmina bovina, 2,5 mM de NaH2PO4 (pH 7), 0,5% de SDS, 2 mM de EDTA). SSC es 0,15 M de cloruro de sodio/0,015 M de citrato de sodio, pH 7; SDS es dodecilsulfato de sodio; y EDTA es ácido etilendiaminotetraacético. Tras la hibridación, una membrana sobre la que se transfiere el ácido nucleico se lava, por ejemplo, en 2X SSC a temperatura ambiente, y después a 0,1-0,5X SSC/0,1X SDS a temperaturas de hasta 68ºC.

Como se usa aquí, el término “anticuerpo” se refiere a una glucoproteína que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas mediante enlaces de disulfuro. Cada cadena pesada comprende una región variable de cadena pesada (abreviada aquí como HCVR o VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada comprende tres dominios CH1, CH2yCH3. Cada cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera (abreviada aquí como LCVR o VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera comprende un dominio, CL. Las regiones VH yVL se pueden subdividir adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), entremezcladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones del marco (FR). Cada VH yVL está compuesta de tres CDRs y cuatro frecuencias, dispuestas desde el término amino hacia el término carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de unión que interacciona con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar la unión de la inmunoglobulina a tejidos o factores del hospedante, incluyendo diversas células del sistema inmunitario (por ejemplo, células efectoras) y el primer componente (C1q) del sistema del complemento clásico.

La expresión “fragmento de unión a antígeno” de un anticuerpo, como se usa aquí, se refiere a una o más porciones de un anticuerpo que retienen la capacidad para unirse específicamente a un antígeno (es decir, PSMA). Se ha mostrado que la función de unión a antígeno de un anticuerpo se puede realizar mediante fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Los ejemplos de fragmentos de unión englobados en la expresión “fragmento de unión a antígeno” de un anticuerpo incluyen: (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL yCH1; (ii) un fragmento F(ab’)2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab

enlazados mediante un puente de disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios VL yVH de un único brazo de un anticuerpo; (v) un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546) que consiste en un dominio VH; y (vi) una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada. Las CDRs, y en particular las regiones CDR3, y más particularmente la CDR3 de cadena pesada, contribuyen a la especificidad del anticuerpo. Debido a que estas regiones CDR, y en particular la región CDR3, confieren especificidad a antígeno en el anticuerpo, estas regiones se pueden incorporar en otros anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno para conferir la especificidad a antígeno idéntica sobre aquel anticuerpo o péptido. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, V y VH, están codificados por genes distintos, se pueden unir, usando métodos recombinantes, mediante un ligador sintético que permite que se obtengan como una única cadena proteica en la que las regiones VL yVH se emparejan para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv monocatenario (scFv); véanse, por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; y Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad Sci. USA 85:5879-5883). Tales anticuerpos monocatenarios también pretenden estar englobados dentro de la expresión “fragmento de unión a antígeno” de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpo se obtienen usando procedimientos convencionales, tales como procedimientos de fragmentación proteolítica, como se describen en J. Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, p. 98118 (N.Y. Academic Press 1983), así como mediante otras técnicas conocidas por aquellos con pericia en la técnica. Los fragmentos se seleccionan en busca de la utilidad de la misma manera como se hace con los anticuerpos intactos.

Los anticuerpos, o sus fragmentos de unión a antígeno, de los ADCs están, en algunas realizaciones, aislados. “Aislados”, como se usa aquí, pretende referirse a un anticuerpo (o su fragmento de unión a antígeno) que está sustancialmente libre de otros anticuerpos (o fragmentos de unión a antígeno) que tienen especificidades antigénicas diferentes (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se une específicamente a PSMA está sustancialmente libre de anticuerpos que se unen específicamente a antígenos no relacionados con PSMA). Un anticuerpo aislado que se une específicamente a un epítopo, isoforma o variante de PSMA puede, sin embargo, tener reactividad cruzada con otros antígenos relacionados, por ejemplo de otras especies (por ejemplo, homólogos de especies de PSMA). Por ejemplo, se han encontrado homólogos de PSMA en otras especies, tales como el cerdo (número de acceso de GenBank 077564 (aminoácido) y rata (números de acceso de GenBank U75973 (mRNA) y AAC53423 (aminoácido)). En algunas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno proporcionados aquí se unen específicamente tanto a PSMA humano como a un homólogo de PSMA procedente de otra especie. En otras realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno se unen específicamente a PSMA humano pero no reaccionan de forma cruzada con homólogos de PSMA procedentes de otras especies.

Además, un anticuerpo aislado (o su fragmento de unión a antígeno) puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o sustancias químicas. La expresión “sustancialmente puro” significa que un anticuerpo (o su fragmento de unión a antígeno) está esencialmente libre de otras sustancias con las que se pueden encontrar en la naturaleza o sistemas in vivo en un grado práctico y apropiado para su uso pretendido. Los anticuerpos o sus fragmentos de unión a antígeno sustancialmente puros se pueden producir mediante técnicas bien conocidas en la técnica. Debido a que un anticuerpo aislado (o su fragmento de unión a antígeno) se puede mezclar con un vehículo farmacéuticamente aceptable en una preparación farmacéutica, el anticuerpo (o su fragmento de unión a antígeno) puede comprender solamente un pequeño porcentaje en peso de la preparación. El anticuerpo (o su fragmento de unión a antígeno) está no obstante aislado, por cuanto se ha separado de las sustancias con las que puede estar asociado en sistemas vivos, es decir, aislado de otras proteínas.

Como se usa aquí, “unión específica” se refiere a la unión de un anticuerpo a un antígeno predeterminado, en este caso PSMA (por ejemplo, PSMA humano). Típicamente, el anticuerpo se une con una afinidad que es al menos dos veces mayor que su afinidad para la unión a un antígeno no específico (por ejemplo, BSA, caseína), que es un antígeno distinto de PSMA, una isoforma o variante de PSMA, o un antígeno estrechamente relacionado.

El anticuerpo engloba diversos isotipos de anticuerpo, tales como IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgAsec, IgD, IgE. Como se usa aquí, “isotipo” se refiere a la clase de anticuerpo (por ejemplo, IgM o IgG1) que es codificada por genes de la región constante de la cadena pesada. Los anticuerpos pueden ser de longitud completa, o pueden incluir sólo un fragmento de unión a antígeno tal como el dominio constante y/o variable del anticuerpo de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgAsec, IgD o IgE, o podría consistir en un fragmento Fab, un fragmento F(ab’)2, y un fragmento Fv.

Los anticuerpos de los ADCs, o a partir de los que derivan los fragmentos de unión a antígeno de los ADCS, son, en algunas realizaciones, monoclonales. Los anticuerpos se pueden producir mediante una variedad de técnicas bien conocidas en la técnica. La producción de anticuerpos monoclonales se puede efectuar mediante técnicas que son bien conocidas en la técnica. La expresión “anticuerpo monoclonal”, como se usa aquí, se refiere a una preparación de moléculas de anticuerpo de una composición molecular única. Un anticuerpo monoclonal presenta una única especificidad y afinidad de unión por un epítopo particular. El proceso de producción de anticuerpos monoclonales implica obtener células somáticas inmunitarias con el potencial para producir anticuerpo, en particular linfocitos B, que se han inmunizado previamente con el antígeno de interés ya sea in vivo o in vitro y que son adecuados para la fusión con una estirpe de mieloma de células B.

Los linfocitos de mamífero típicamente se inmunizan mediante inmunización in vivo del animal (por ejemplo, un

ratón) con la proteína o polipéptido deseado. Tales inmunizaciones se repiten según sea necesario a intervalos de hasta varias semanas para obtener un título suficiente de anticuerpos. Una vez inmunizados, los animales se pueden usar como una fuente de linfocitos productores de anticuerpos. Tras la última revacunación de antígeno, los animales se sacrifican y se retiran las células del bazo. Los linfocitos de ratón dan un mayor porcentaje de fusiones estables con las estirpes de mieloma de ratón descritas aquí. Por ejemplo, de los ratones BALB/c. Sin embargo, otras razas de ratón, conejo, hámster, ovejas y rana también se pueden usar como hospedantes para preparar células productoras de anticuerpos. Véase Goding (en Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 2ª ed., p. 6061, Orlando, Fla., Academic Press, 1986). En particular, se pueden usar razas de ratón que tienen genes de inmunoglobulinas humanas insertados en el genoma (y que no pueden producir inmunoglobulinas de ratón). Los ejemplos incluyen las razas de ratón HuMAb producidas por Medarex/GenPharm International, y las razas XenoMouse producidas por Abgenix. Tales ratones producen moléculas inmunoglobulínicas completamente humanas en respuesta a la inmunización. En algunas realizaciones, por lo tanto, los ADCs comprenden un anticuerpo monoclonal completamente humano o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a PSMA.

Aquellas células productoras de anticuerpos que están en la etapa de plasmablasto en división se fusionan preferentemente. Las células somáticas se pueden obtener a partir de los ganglios linfáticos, bazos y sangre periférica de animales sensibilizados con el antígeno, y las células linfáticas de elección dependen en gran medida de su utilidad empírica en el sistema de fusión particular. Los linfocitos que segregan anticuerpos se fusionan entonces con células de mieloma de células B (de ratón) o células transformadas, que son capaces de replicarse indefinidamente en cultivo celular, produciendo de ese modo una estirpe celular inmortal que segrega inmunoglobulina. Las células fusionadas resultantes, o hibridomas, se cultivan, y las colonias resultantes se seleccionan en busca de la producción de los anticuerpos monoclonales deseados. Las colonias productoras de tales anticuerpos se clonan, y se hacen crecer in vivo o in vitro para producir grandes cantidades de anticuerpo. En Kohler y Milstein, Nature 256:495 (1975), se expone una descripción de la base teórica y metodología práctica de la fusión.

Como alternativa, las células somáticas humanas capaces de producir anticuerpo, específicamente linfocitos B, son adecuadas para la fusión con estirpes celulares de mieloma. Aunque se pueden usar linfocitos B de bazos, amígdalas o ganglios linfáticos de un individuo a los que se les ha realizado una biopsia, también se pueden usar linfocitos B de sangre periférica más fácilmente accesibles. Los linfocitos pueden derivar de pacientes con carcinomas de próstata diagnosticados u otro cáncer que expresa PSMA. Además, las células B humanas se pueden inmortalizar directamente mediante el virus de Epstein-Barr (Cole et al., 1995, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., p. 77-96). En principio, aunque se pueden usar procedimientos de hibridación de células somáticas, se pueden emplear otras técnicas para producir anticuerpos monoclonales, tales como la transformación vírica u oncogénica de linfocitos B.

Las estirpes celulares de mieloma adecuadas para uso en procedimientos de fusión productores de hibridomas pueden ser no productoras de anticuerpos, pueden tener una elevada eficiencia de fusión, y deficiencias enzimáticas que las hacen incapaces de crecer en ciertos medios selectivos que apoyan el crecimiento de los hibridomas deseados. Los ejemplos de tales estirpes celulares de mieloma que se pueden usar para la producción de estirpes celulares fusionadas incluyen P3-X63/Ag8, X63-Ag8.653, NS1/1.Ag 4.1, Sp2/0-Ag14, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7, S194/5XX0 Bul, todas derivadas de ratones; R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F y 4B210 derivadas de ratas, y U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2, UC729-6, todas derivadas de seres humanos (Goding, en Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 2ª ed., p. 65-66, Orlando, Fla., Academic Press, 1986; Campbell, en Monoclonal Antibody Technology, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology Vol. 13, Burden andVon Knippenberg, eds. p. 75-83, Ámsterdam, Elseview, 1984).

La fusión con células de mieloma de mamífero u otras parejas de fusión capaces de replicarse indefinidamente en el cultivo celular se efectúa mediante técnicas estándar y bien conocidas, por ejemplo usando polietilenglicol (“PEG”) u otros agentes de fusión (véase Milstein y Kohler, Eur. J. Immunol. 6:511 (1976).

En otras realizaciones, los anticuerpos de los ADCs, o a partir de los que derivan los fragmentos de unión a antígeno de los ADCs, son anticuerpos recombinantes. La expresión “anticuerpo recombinante”, como se usa aquí, pretende incluir anticuerpos que se preparan, expresan, crean o aíslan por medios recombinantes, tales como anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico para genes de inmunoglobulinas de otras especies, anticuerpos expresados usando un vector de expresión recombinante transfectado en una célula hospedante, anticuerpos aislados de una librería combinatoria recombinante de anticuerpos, o anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implique el ayuste de secuencias génicas de inmunoglobulinas a otras secuencias de ADN.

En todavía otras realizaciones, los anticuerpos son anticuerpos quiméricos o humanizados. Como se usa aquí, la expresión “anticuerpo quimérico” se refiere a un anticuerpo que combina las regiones variables o hipervariables murinas con la región constante humana o regiones de armazón constantes y variables. Como se usa aquí, la expresión “anticuerpo humanizado” se refiere a un anticuerpo que retiene sólo las CDRs de unión a antígeno del anticuerpo progenitor en asociación con regiones de armazón humanas (véase Waldmann, 1991, Science 252:1657). Se espera que tales anticuerpos quiméricos o humanizados que retienen la especificidad de unión del anticuerpo murino tengan inmunogenicidad reducida cuando se administran in vivo como se proporciona aquí.

Según una realización alternativa, los anticuerpos monoclonales de los ADCs pueden estar en forma de un anticuerpo biespecífico o un anticuerpo multiespecífico. La expresión “anticuerpo biespecífico” pretende incluir cualquier agente, por ejemplo una proteína, péptido, o complejo proteico o peptídico, que tiene dos especificidades de unión diferentes que se une a o interacciona con (a) un antígeno de la superficie celular y (b) un receptor de Fc sobre la superficie de una célula efectora. La expresión “anticuerpo multiespecífico” pretende incluir cualquier agente, por ejemplo una proteína, péptido, o complejo proteico o peptídico, que tiene más de dos especificidades de unión diferentes que se une a o interacciona con (a) un antígeno de la superficie celular, (b) un receptor de Fc sobre la superficie de una célula efectora, y (c) al menos algún otro componente. En consecuencia, los anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos biespecíficos, triespecíficos, tetraespecíficos, y otros anticuerpos multiespecíficos que están dirigidos a PSMA o a receptores de Fc en células efectoras. La expresión “anticuerpos biespecíficos” incluye además dianticuerpos. Los dianticuerpos son anticuerpos biespecíficos, bivalentes, en los que los dominios VH y VL se expresan en una única cadena polipeptídica, pero que usan un ligador que es tan corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, forzando de ese modo a que los dominios se emparejen con los dominios complementarios de otra cadena y creando dos sitios de unión a antígeno (véanse, por ejemplo, Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poijak, R.J., et al. (1994) Structure 2:1121-1123).

Un anticuerpo biespecífico puede estar formado de una región de unión a antígeno específica para PSMA y una región de unión a antígeno específica para una célula efectora que tiene actividad tumoricida o inhibidora de tumores. Las dos regiones de unión a antígeno del anticuerpo biespecífico están enlazadas químicamente o se pueden expresar mediante una célula manipulada genéticamente mediante ingeniería para producir el anticuerpo biespecífico. (Véase generalmente Fanger et al., 1995 Drug News & Perspec. 8(3):133-137). Las células efectoras adecuadas que tienen actividad tumoricida incluyen, pero no se limitan a, células T citotóxicas (principalmente células CD8+), células asesinas naturales, etc. Una cantidad eficaz de un anticuerpo biespecífico se puede administrar a un sujeto con cáncer, y el anticuerpo biespecífico extermina y/o inhibe la proliferación de las células cancerosas tras la localización en sitios de tumores primarios o metastásicos que poseen PSMA.

En ciertas realizaciones, los anticuerpos de los ADCs, o a partir de los que derivan los fragmentos de unión a antígeno de los ADCs, son anticuerpos humanos. La expresión “anticuerpo humano”, como se usa aquí, pretende incluir anticuerpos que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias inmunoglobulínicas de la estirpe de células germinales humanas. Los anticuerpos humanos pueden incluir restos de aminoácidos no codificados por secuencias inmunoglobulínicas de la estirpe de células germinales humanas (por ejemplo, mutaciones introducidas mediante mutagénesis al azar o específica del sitio in vitro, o mediante mutación somática in vivo). Sin embargo, la expresión “anticuerpo humano”, como se usa aquí, no pretende incluir anticuerpos en los que las secuencias de CDR derivadas de la estirpe de células germinales de otra especie mamífera, tal como un ratón, se han injertado en secuencias de armazón humanas (denominados aquí como “anticuerpos humanizados”). Los anticuerpos humanos dirigidos contra PSMA se pueden generar usando ratones transgénicos que poseen partes del sistema inmunitario humano en vez del sistema del ratón. Algunos ejemplos de los cuales se describen aquí en otra parte.

Los anticuerpos monoclonales completamente humanos también se pueden preparar inmunizando ratones transgénicos para grandes porciones de los loci de las cadenas pesada y ligera inmunoglobulínicas humanas. Véanse, por ejemplo, las patentes U.S. 5.591.669, 5.598.369, 5.545.806, 5.545.807, 6.150.584, y referencias citadas allí. Estos animales se han modificado genéticamente de manera que hay una supresión funcional en la producción de anticuerpos endógenos (por ejemplo, murinos). Los animales se modifican además para contener todo o una porción del locus del gen inmunoglobulínico de la estirpe de células germinales humano, de manera que la inmunización de estos animales da como resultado la producción de anticuerpos completamente humanos frente al antígeno de interés. Tras la inmunización de estos ratones (por ejemplo, XenoMouse (Abgenix), ratones HuMAb (Medarex/GenPharm)), los anticuerpos monoclonales se pueden preparar según técnicas de hibridoma estándar. Estos anticuerpos monoclonales tienen secuencias de aminoácidos de inmunoglobulinas humanas, y por lo tanto no provocarán respuestas de anticuerpos humanos anti-ratón (HAMA) cuando se administren a seres humanos. En general, pero sin pretender ser limitantes, los ratones tienen 6-16 semanas con la primera inmunización. Por ejemplo, para inmunizar los ratones intraperitonealmente (IP), se puede usar una preparación purificada o enriquecida de antígeno PSMA (por ejemplo, PSMA recombinante o células que expresan PSMA), aunque también son posibles otras rutas de inmunización conocidas por una persona de pericia normal en la técnica. El antígeno PSMA se puede inyectar en combinación con un adyuvante, tal como adyuvante de Freund completo, y, en algunas realizaciones, la inyección inicial es seguida de inmunizaciones de recuerdo con antígeno en un adyuvante, tal como adyuvante incompleto de Freund. La respuesta inmunitaria se puede monitorizar durante el protocolo de inmunización con muestras de plasma obtenidas, por ejemplo, de sangrados retroorbitales. El plasma se puede seleccionar mediante ELISA, y los ratones con suficientes títulos de inmunoglobulina humana anti-PSMA se pueden usar para fusiones. Los ratones se pueden revacunar intraperitonealmente con antígeno 3 días antes del sacrificio y de la eliminación del bazo.

El anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno de los ADCs se puede seleccionar, en algunas realizaciones, en busca de la capacidad para unirse a células vivas que expresan PSMA. A fin de demostrar la unión a células vivas que expresan PSMA, se puede usar citometría de flujo. Por ejemplo, estirpes celulares que expresan PSMA (que se hacen crecer en condiciones de crecimiento estándar) o células de cáncer de próstata que expresan PSMA se

pueden mezclar con diversas concentraciones de anticuerpos monoclonales en PBS que contiene 0,1% de Tween 80 y 20% de suero de ratón, y se pueden incubar a 37ºC durante 1 hora. Tras el lavado, las células se pueden hacer reaccionar con anticuerpo secundario anti-IgG humana marcado con fluoresceína (si se usaron anticuerpos humanos anti-PSMA) en las mismas condiciones que la tinción con anticuerpos primarios. Las muestras se pueden analizar mediante un instrumento clasificador de células activado por fluorescencia (FACS), usando propiedades de dispersión de la luz y laterales para reunir células individuales. Se puede usar un ensayo alternativo que usa microscopía de fluorescencia (además de o en lugar del ensayo de citometría de flujo). Las células se pueden teñir y examinar mediante microscopía de fluorescencia. Este método permite la visualización de células individuales, pero puede tener sensibilidad reducida, dependiendo de la densidad del antígeno. Se concluye que los ADCs, en algunas realizaciones, se unen a células vivas. Los ADCs, en algunas realizaciones, no requieren por lo tanto la lisis celular para unirse a PSMA.

En algunas realizaciones, los anticuerpos pueden promover la citolisis de células que expresan PSMA. La citolisis se puede mediar por el complemento, o puede estar mediada por células efectoras. En una realización, la citolisis se lleva a cabo en un organismo vivo, tal como un mamífero, y la célula viva es una célula tumoral. Los ejemplos de tumores que se pueden seleccionar como dianas con los anticuerpos o sus fragmentos de unión a antígeno incluyen cualquier tumor que exprese PSMA (esto incluye tumores con neovasculatura que expresa PSMA), tal como tumores de próstata, de vejiga, de mama, de páncreas, de hígado, de pulmón (por ejemplo, carcinoma de pulmón no microcítico), de colon y de riñón, así como melanomas y sarcomas. En una realización, la célula tumoral es una célula tumoral de próstata.

El ensayo de la actividad citolítica in vitro mediante ensayo de liberación de cromo puede proporcionar un cribado inicial antes del ensayo de los modelos in vivo. Este ensayo se puede llevar a cabo usando ensayos estándar de liberación del cromo. De forma breve, células polimorfonucleares (PMN), u otras células efectoras, procedentes de donantes sanos se pueden purificar mediante centrifugación por densidad Ficoll Hypaque, seguido de la lisis de eritrocitos contaminantes. Las PMNs lavadas se pueden suspender en RPMI suplementado con 10% de suero fetal de ternera inactivado por calor, y se pueden mezclar con células que expresan PSMA marcadas con 51Cr, a diversas relaciones de células efectoras a células tumorales (células efectoras:células tumorales). Las IgGs anti-PSMA purificadas se pueden añadir entonces a diversas concentraciones. La IgG irrelevante se puede usar como un control negativo. Los ensayos se pueden llevar a cabo durante 0-120 minutos a 37ºC. Las muestras se pueden evaluar para citolisis midiendo la liberación de 51Cr en el sobrenadante del cultivo. Los anticuerpos monoclonales anti-PSMA y/o los ADCs se pueden ensayar también en combinaciones entre sí para determinar si la citolisis es potenciada con múltiples anticuerpos monoclonales y/o ADCs. Los anticuerpos que se unen a PSMA y/o ADCs también se pueden ensayar en un modelo in vivo (por ejemplo, en ratones) para determinar su eficacia mediante la citolisis y exterminando células cancerosas que expresan PSMA, por ejemplo células de tumor prostático.

Los anticuerpos de los ADCs, o a partir de los que derivan los fragmentos de unión a antígeno de los ADCs, se pueden seleccionar, por ejemplo, basándose en los siguientes criterios, que no pretenden ser exclusivos:

1) unión a células vivas que expresan PSMA;

2) elevada afinidad de unión a PSMA;

3) unión a un único epítopo en PSMA (es decir, un epítopo no reconocido por un anticuerpo previamente producido);

4) opsonización de células que expresan PSMA;

5) mediación de la inhibición del crecimiento, fagocitosis y/o exterminio de células que expresan PSMA en presencia de células efectoras;

6) modulación (inhibición o potenciación) de las actividades de NAALADasa, folato hidrolasa, dipeptidil peptidasa IV y/o !-glutamil hidrolasa;

7) inhibición del crecimiento, detención del ciclo celular y/o citotoxicidad en ausencia de células efectoras;

8) internalización de PSMA;

9) unión a un epítopo conformacional en PSMA;

10) reactividad cruzada mínima con células o tejidos que no expresan PSMA; y

11) unión preferente a formas dímeras de PSMA en vez de a formas monómeras de PSMA.

Los anticuerpos de los ADCs, o a partir de los que derivan los fragmentos de unión a antígeno de los ADCs, pueden satisfacer uno o más, y posiblemente todos, estos criterios.

En una realización, el anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno se une a un epítopo conformacional, tal como un epítopo conformacional en el dominio extracelular de PSMA. Para determinar si un anticuerpo anti-PSMA o su

fragmento de unión a antígeno se une a epítopos conformacionales, cada anticuerpo se puede evaluar en ensayos usando proteína nativa (por ejemplo, inmunoprecipitación no desnaturalizante, análisis de citometría de flujo de la unión a la superficie celular) y proteína desnaturalizada (por ejemplo, transferencia Western, inmunoprecipitación de proteínas desnaturalizadas). Una comparación de los resultados indicará si el anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno se une a un epítopo conformacional. Los anticuerpos o sus fragmentos de unión a antígeno que se unen a proteína nativa pero no a proteína desnaturalizada son, en algunas realizaciones, aquellos que se unen a epítopos conformacionales. Se concluye que los ADCs, en algunas realizaciones, se unen a epítopos conformacionales de PSMA.

En otra realización, el anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno se une a un epítopo específico de dímero en PSMA (es decir, un epítopo conformacional, específico de dímero, único para la estructura cuaternaria de PSMA dímero). Generalmente, los anticuerpos o sus fragmentos de unión a antígeno que se unen a un epítopo específico de dímero se unen preferentemente al dímero de PSMA en vez de al monómero de PSMA. Para determinar si un anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno se une preferentemente (es decir, selectiva y/o específicamente) a un dímero de PSMA, el anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno se puede evaluar en ensayos (por ejemplo, inmunoprecipitación seguida de transferencia Western) usando proteína de PSMA dímera nativa y proteína de PSMA monómera disociada. Una comparación de los resultados indicará si el anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno se une preferentemente al dímero. En algunas realizaciones, los anticuerpos o sus fragmentos de unión a antígeno se unen al dímero de PSMA pero no a la proteína de PSMA monómera. Se concluye que los ADCs, en algunas realizaciones, se unen a un epítopo específico de dímero en PSMA.

Los ADCs proporcionados incluyen aquellos que se unen selectivamente a multímeros de PSMA. Como se usa aquí, particularmente con respecto a la unión de multímeros de PSMA por los ADCs, “se une selectivamente” significa que un anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno de los ADCs se une preferentemente a un multímero de la proteína de PSMA (por ejemplo, con mayor avidez, mayor afinidad de unión) en vez de a un monómero de la proteína de PSMA. En algunas realizaciones, los ADCs de la invención se unen a un multímero de la proteína de PSMA con una avidez y/o afinidad de unión que es 1,1 veces, 1,2 veces, 1,3 veces, 1,4 veces, 1,5 veces, 1,6 veces, 1,7 veces, 1,8 veces, 1,9 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 7 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 70 veces, 100 veces, 200 veces, 300 veces, 500 veces, 1000 veces o más que la exhibida por el ADC para un monómero de la proteína de PSMA. En algunas realizaciones, el ADC se puede unir selectivamente a un multímero de la proteína de PSMA, y no a un monómero de la proteína de PSMA, es decir, se une exclusivamente a un multímero de la proteína de PSMA. En algunas realizaciones, el ADC se une selectivamente a un dímero de la proteína de PSMA.

Un multímero de la proteína de PSMA, como se usa aquí, es un complejo proteico de al menos dos proteínas de PSMA o sus fragmentos. Los multímeros de la proteína de PSMA pueden estar compuestos de diversas combinaciones de proteínas de PSMA de longitud completa (por ejemplo, SEC ID NO: 1), PSMA soluble recombinante (rsPSMA, por ejemplo, aminoácidos 44-750 de SEC ID NO: 1) y fragmentos de los anteriores que forman multímeros (es decir, que retienen el dominio proteico requerido para formar dímeros y/o multímeros de mayor orden de PSMA). En algunas realizaciones, al menos una de las proteínas de PSMA que forma el multímero es un polipéptido de PSMA recombinante soluble (rsPSMA). Los multímeros de una proteína de PSMA pueden ser dímeros, tales como los formados a partir de proteína de PSMA recombinante soluble. En una realización, el dímero es un homodímero de rsPSMA. Se cree que los multímeros de la proteína de PSMA citados aquí asumen una conformación nativa, y pueden tener tal conformación. Las proteínas de PSMA, en ciertas realizaciones, están unidas juntas de forma no covalente para formar el multímero de la proteína de PSMA. Se ha descubierto que la proteína de PSMA se asocia de forma no covalente para formar dímeros en condiciones no desnaturalizantes. Los multímeros de la proteína de PSMA pueden retener las actividades de PSMA. La actividad de PSMA puede ser una actividad enzimática, tal como actividad de folato hidrolasa, actividad de NAALADasa, actividad de dipeptidil peptidasa IV o actividad de !-glutamil hidrolasa. Los métodos para ensayar la actividad de PSMA de los multímeros son bien conocidos en la técnica (revisado por O’Keefe et al. en: Prostate Cancer: Biology, Genetics, and the New Therapeutics, L.W.K. Chung, W.B. Isaacs y J.W. Simons (eds.) Humana Press, Totowa, NJ, 2000, p. 307-326).

El anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno de los ADCs se puede unir a y se puede internalizar con PSMA expresado en células. El mecanismo mediante el cual el anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno se internaliza con PSMA no es crítico para la práctica de los métodos proporcionados aquí. Por ejemplo, el anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno puede inducir internalización de PSMA. Como alternativa, la internalización del anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno puede ser el resultado de internalización normal del PSMA. Se concluye que el ADC se puede internalizar con PSMA expresado en células.

Los anticuerpos o sus fragmentos de unión a antígeno, y por lo tanto los ADCs, se pueden unir específicamente, en algunas realizaciones, a PSMA de la superficie celular y/o a rsPSMA con afinidad subnanomolar. Las afinidades de unión pueden ser alrededor de 1 X 10-9 M o menos, alrededor de 1 X 10-10 M, o alrededor de 1 X 10-11 M o menos. En una realización, la afinidad de unión es menor que alrededor de 5 X 10-10 M.

Los anticuerpos o sus fragmentos de unión a antígeno pueden modular, en algunas realizaciones, al menos una actividad enzimática de PSMA. La actividad se puede seleccionar del grupo que consiste en actividad de dipeptidasa ácida enlazada en ∀ N-acetilada (NAALADasa), actividad de folato hidrolasa, actividad de dipeptidil peptidasa IV,

actividad de !-glutamil hidrolasa, y sus combinaciones, in vitro o in vivo. La modulación puede ser potenciación o inhibición de al menos una actividad enzimática de PSMA.

Los niveles tisulares de la actividad de NAALADasa se pueden determinar solubilizando en detergente y homogeneizando tejidos, peletizando el material insoluble mediante centrifugación, y midiendo la actividad de NAALADasa en el sobrenadante que queda. Igualmente, la actividad de NAALADasa en fluidos corporales se puede medir peletizando en primer lugar el material celular mediante centrifugación y llevando a cabo un ensayo enzimático típico para actividad de NAALADasa en el sobrenadante. Los ensayos enzimáticos de NAALADasa se han descrito por Frieden, 1959, J. Biol, Chem., 234:2891. En este ensayo, el producto de reacción de la enzima NAALADasa es ácido glutámico. Éste deriva de la escisión de N-acetilaspartilglutamato catalizada por enzimas para producir ácido N-acetilaspártico y ácido glutámico. El ácido glutámico, en una etapa que requiere NAD(P)+, produce 2-oxoglutarato más NAD(P)H en una reacción catalizada por glutamato deshidrogenasa. El transcurso de la reacción se puede medir fácil y convenientemente mediante el cambio de absorbancia a 340 nm debido a la conversión de NAD(P)+ en NAD(P)H.

La actividad de folato hidrolasa de PSMA se puede medir realizando ensayos enzimáticos como se describe por Heston y otros (por ejemplo, Clin. Cancer Res. 2(9): 1445-51,1996; Urology 49(3A Suppl):104-12,1997). Las folato hidrolasas tales como PSMA eliminan los glutamatos enlazados mediante gamma a partir de folatos poliglutamados. La actividad de folato hidrolasa se puede medir usando sustratos tales como metotrexato tri-gamma glutamato (MTXGlu3), metotrexato di-gamma glutamato (MTXGlu2) o pteroilpentaglutamato (PteGlu5), por ejemplo usando electroforesis capilar (véase Clin. Cancer Res. 2(9):1445-51, 1996). Las incubaciones en el tiempo de PSMA con sustratos poliglutamados se puede seguir mediante separación y detección de los productos de la hidrólisis.

Como se menciona anteriormente, se ha encontrado sorprendentemente que los ADCs proporcionados exterminan células cancerosas que expresan PSMA, resistentes a taxano, y se pueden usar para tratar cáncer que expresa PSMA, resistente a taxano. Por lo tanto, se proporcionan métodos en los que se administra un ADC a un sujeto con un cáncer que expresa PSMA, resistente a taxano. Las células cancerosas del cáncer que expresa PSMA, resistente a taxano, en algunas realizaciones, pueden ser células de un tumor (por ejemplo, tumor maligno primario) o células de una o más metástasis.

En algunas realizaciones, los métodos proporcionados dan como resultado el retraso o la inhibición de la progresión del cáncer en el sujeto. Como se usa aquí, “retraso o inhibición de la progresión del cáncer” pretende referirse a cualquier ralentización o detención de la progresión del cáncer en el sujeto. Una ralentización o detención de la progresión del cáncer incluye una reducción o estabilización en el número de células cancerosas, el número de tumores, y/o el número de metástasis en un sujeto. Una ralentización o detención también pretende incluir una reducción o estabilización en el tamaño (por ejemplo, longitud o volumen) de tumores y/o tamaño de las metástasis en un sujeto. Los métodos para evaluar la progresión de cáncer en un sujeto serán manifiestos para una persona de pericia normal en la técnica. Además, en algunas realizaciones, el retraso o inhibición de la progresión del cáncer se puede demostrar mediante un cambio en al menos un biomarcador para metástasis ósea o metabolismo óseo en comparación con un valor de línea base antes del tratamiento con el ADC en el sujeto. En algunas realizaciones, el biomarcador es N-telopéptido, fosfatasa alcalina ósea, osteocalcina, calcitonina, calcio, piridinilina o desoxipiridinolina. En realizaciones adicionales, el retraso o inhibición de la progresión del cáncer se demuestra mediante cambios en la imagen radiográfica en la carga tumoral en comparación con una imagen radiográfica de línea base en el sujeto antes del tratamiento con ADC. Los métodos para evaluar cambios radiográficos incluyen, por ejemplo, barrido óseo, barrido con tomografía axial computerizada (CT), y formación de imágenes mediante resonancia magnética (MRI). Otros métodos serán bien conocidos por los expertos normales en la técnica. En algunas realizaciones, el retraso o la inhibición de la progresión se evidencia por un cambio en la imagen radiográfica de al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50% o 60% o más.

El tratamiento con los ADCs proporcionados también puede dar como resultado el incremento en la supervivencia de los sujetos con un cáncer que expresa PSMA, resistente a taxano. En algunas realizaciones, la supervivencia de tal sujeto aumenta en 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 24, 28 o 32 semanas o más, en comparación con la supervivencia media de los sujetos con el cáncer que expresa PSMA, resistente a taxano, a los que no se les administra el ADC. En otras realizaciones, la supervivencia aumenta 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 24, 28 o 32 semanas o más, en comparación con el tiempo de supervivencia esperado para el sujeto antes del tratamiento con el ADC. En otras realizaciones de cualquiera de las anteriores, la supervivencia del sujeto aumenta en 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 o 24 meses o más según cualquier comparación. En una realización, el sujeto tratado con un ADC es aquel que tiene cáncer de próstata metastásico progresivo, resistente a la castración, que ha progresado tras una terapia previa con taxano, y el incremento en la supervivencia del sujeto es como se compara con la supervivencia media de los sujetos que tienen cáncer de próstata metastásico progresivo, resistente a la castración, que ha progresado tras la terapia previa con taxano, y no ha sido tratado con el ADC. En otra realización, el sujeto tratado con un ADC es aquel que tiene cáncer de próstata metastásico progresivo, resistente a la castración, que ha progresado tras la terapia previa con taxano, y el incremento en la supervivencia del sujeto es como se compara con el tiempo de supervivencia esperado para el sujeto antes del tratamiento con el ADC.

En otras realizaciones, el tratamiento con un ADC como se proporciona da como resultado un incremento en la calidad de vida para el sujeto en comparación con la calidad de vida experimentada por el sujeto antes del

tratamiento con el ADC. Como se usa aquí, “un incremento en la calidad de vida” se refiere a cualquier mejora en el confort del sujeto, nivel de energía y/o capacidad para funcionar en una actividad como resultado de la administración de un ADC como se proporciona aquí.

En todavía otras realizaciones, el tratamiento con un ADC puede dar como resultado una disminución en el nivel circulante de células tumorales circulantes (CTCs), en comparación con un nivel de línea base. En otras realizaciones, el tratamiento con un ADC puede dar como resultado una disminución o estabilización (ningún incremento o disminución significativo) en un nivel sérico de antígeno específico de la próstata (PSA) en comparación con un nivel de línea base de PSA. Los métodos para evaluar el nivel circulante de CTCs o el nivel sérico de PSA son bien conocidos por aquellos de pericia normal en la técnica.

También fue sorprendente descubrir que en sujetos con un cáncer que expresa PSMA, resistente a taxano, se puede lograr una reducción en el volumen tumoral incluso para tumores muy grandes con la administración de un ADC. Por lo tanto, en algunas realizaciones, el sujeto tiene un tumor con un volumen tumoral que es al menos 100 mm3, 200 mm3, 300 mm3, 400 mm3, 500 mm3, 600 mm3, 700 mm3, 800 mm3, 900 mm3, 1000 mm3, 1100 mm3, 1200 mm3, 1300 mm3, 1400 mm3, 1500 mm3, 1600 mm3, 1700 mm3, 1800 mm3, 1900 mm3 o 2000 mm3. En algunas realizaciones, el sujeto tiene un volumen tumoral que es mayor que 700 mm3. En otras realizaciones, el sujeto tiene un tumor con una longitud de al menos 5 mm, 6 mm, 7 mm, 8 mm, 9 mm, 10 mm, 11 mm, 12 mm, 13 mm, 14 mm, 15 mm, 16 mm, 17 mm, 18 mm, 19 mm, 20 mm, 21 mm, 22 mm, 23 mm, 24 mm, 25 mm o 30 mm o más. En otras realizaciones, el volumen o longitud tumoral se reducen en al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97% o 99% como resultado del tratamiento con un ADC como se proporciona aquí. En una realización adicional, el tumor se erradica. Las técnicas para determinar la presencia de un tumor y para medir su tamaño son bien conocidas por aquellos de pericia normal en la técnica.

Los ADCs se pueden usar en diversos métodos in vitro e in vivo para efectuar los puntos finales terapéuticos mencionados anteriormente. Los métodos proporcionados se pueden usar para exterminar células cancerosas que expresan PSMA, resistentes a taxano, in vitro o in vivo. También se proporcionan métodos para tratar cualquier cáncer que expresa PSMA, resistente a taxano. Tal cáncer es, por ejemplo, cáncer de próstata. Tal cáncer también puede ser, por ejemplo, un cáncer en el que se expresa PSMA en las células de la neovasculatura tumoral. Una lista ejemplar de tales cánceres se proporciona aquí en otra parte.

En algunas realizaciones, dos o más ADCs diferentes se usan en combinación. En otra realización, uno o más anticuerpos anti-PSMA no conjugados, o sus fragmentos de unión a antígeno, se pueden combinar con uno o más ADCs en una sola terapia para lograr el efecto terapéutico deseado. Como ilustración, un anticuerpo anti-PSMA no conjugado que media el exterminio altamente eficaz de células diana en presencia de células efectoras, y/o que inhibe el crecimiento de células que expresan PSMA, se puede usar con uno o más ADCs. En aún otra realización, los ADCs se pueden combinar con uno o más agentes antitumorales adicionales, tales como corticosteroides, tales como prednisona o hidrocortisona; agentes inmunoestimulantes; inmunomoduladores, o cualquier combinación de los mismos.

Los agentes antitumorales incluyen agentes citotóxicos, agentes quimioterapéuticos y agentes que actúan sobre la neovasculatura tumoral. Los agentes citotóxicos incluyen radionúclidos citotóxicos, toxinas químicas y toxinas proteicas. El radionúclido citotóxico o isótopo radioterapéutico puede ser un isótopo que emite partículas alfa, tal como 225Ac, 211At, 212Bi, 213Bi, 212Pb, 224Ra o 223Ra. Como alternativa, el radionúclido citotóxico puede ser un isótopo que emite partículas beta, tales como 186Rh, 188Rh, 177Lu, 90Y, 131I, 67Cu, 64Cu, 153Sm o 166Ho. Además, el radionúclido citotóxico puede emitir electrones Auger y electrones de baja energía, e incluye los isótopos 125I, 123I o 77Br.

Las toxinas químicas o agentes quimioterapéuticos adecuados incluyen miembros de la familia de moléculas de enodiínos, tales como calicheamicina y esperamicina. Las toxinas químicas también se pueden escoger del grupo que consiste en metotrexato, doxorrubicina, melfalán, clorambucilo, ARA-C, vindesina, mitomicina C, cis-platino, etopósido, bleomicina y 5-fluorouracilo. Otros agentes antineoplásicos incluyen dolastatinas (patentes U.S. nos

6.034.065 y 6.239.104) y sus derivados. Las dolastatinas y sus derivados incluyen dolastatina 10 (dolavalina-valinadolaisoleuina-dolaproína-dolafenina) y los derivados auristatina PHE (dolavalina-valina-dolaisoleuina-dolaproínafenilalanina-éster metílico) (Pettit, G.R. et al., Anticancer Drug Des. 13(4):243-277, 1998; Woyke, T. et al., Antimicrob. Agents Chemother. 45(12):3580-3584, 2001), y aurastatina E y similares. Las toxinas también incluyen lectinas venenosas, toxinas vegetales tales como ricina, abrina, modeccina, botulina y toxinas de la difteria. Otros agentes quimioterapéuticos son conocidos por los expertos en la técnica.

Los agentes que actúan sobre la vasculatura tumoral incluyen agentes de unión a tubulina tales como combrestatina A4 (Griggs et al., Lancet Oncol. 2:82, 2001), angiostatina y endostatina (revisado en Rosen, Oncologist 5:20, 2000) y proteína 10 inducible por interferón (patente U.S. nº 5.994.292). También se contempla un número de otros agentes antiangiogénicos, e incluyen: 2ME2, angiostatina, angiozima, anti-VEGF RhuMAb, apra (CT-2584), avicina, benefina, BMS275291, carboxiamidotriazol, CC4047, CC5013, CC7085, CDC801, CGP-41251 (PKC 412), CM101, profármaco de combretastatina A-4, EMD 121974, endostatina, flavopiridol, genisteína (GCP), extracto de té verde, IM-862, ImmTher, interferón alfa, interleucina-12, Iressa (ZD1839), Marimastat, Metastat (Col-3), Neovastat, octreotida, paclitaxel, penicilamina, fotofrina, fotopoint, PI-88, prinomastat (AG-3340), PTK787 (ZK22584), RO317453,

solimastat, esqualamina, SU 101, SU 5416, SU-6668, suradista (FCE 26644), suramin (metaret), tetratiomolibdato, talidomida, TNP-470 y vitaxina. Agentes antiangiogénicos adicionales se describen por Kerbel, J. Clin. Oncol. 19(18s):45s-51s, 2001.

Los ADCs se pueden administrar con uno o más agentes inmunoestimulantes para inducir o potenciar una respuesta inmunitaria, tales como IL-2 y oligonucleótidos inmunoestimulantes (por ejemplo, aquellos que contienen los motivos de CpG). Los agentes inmunoestimulantes pueden estimular, en algunas realizaciones, brazos específicos del sistema inmunitario, tales como células asesinas naturales (NK) que median la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). Los agentes inmunoestimulantes incluyen interleucina-2, ∀-interferón, !-interferón, factor alfa de necrosis tumoral (TNF∀), oligonucleótidos inmunoestimulantes, o una combinación de los mismos. Los inmunomoduladores incluyen citocinas, quimiocinas, adyuvantes, o una combinación de los mismos. Las quimiocinas útiles incrementando las respuestas inmunitarias incluyen, pero no se limitan a, SLC, ELC, MIP3∀, MIP3#, IP-10, MIG, y sus combinaciones.

El otro agente terapéutico también puede ser una vacuna. En algunas realizaciones, la vacuna inmuniza a un sujeto frente a PSMA. Tales vacunas, en algunas realizaciones, incluyen antígeno, tales como dímeros de PSMA, con, opcionalmente, uno o más adyuvantes para inducir o potenciar una respuesta inmunitaria. Un adyuvante es una sustancia que potencia la respuesta inmunitaria. Se conocen bien en la técnica adyuvantes de muchos tipos. Los ejemplos específicos de adyuvantes incluyen monofosforil lípido A (MPL, SmithKline Beecham); saponinas que incluyen QS21 (SmithKline Beecham); oligonucleótidos inmunoestimulantes (por ejemplo, oligonucleótidos CpG descritos por Kreig et al., Nature 374:546-9, 1995); adyuvante incompleto de Freund; adyuvante completo de Freund; montanida; vitamina E y diversas emulsiones de agua en aceite preparadas a partir de aceites vegetales tales como escualeno y/o tocoferol, Quil A, Ribi Detox, CRL-1005, L-121, y sus combinaciones. También se contemplan formulaciones, tales como las descritas en la Solicitud U.S. Serie nº 10/976352, para uso como vacunas en los métodos proporcionados aquí.

Las vacunas pueden incluir, en algunas realizaciones, uno o más de los multímeros de la proteína de PSMA aislados descritos aquí, tales como el dímero de la proteína de PSMA. En algunas realizaciones, una composición de multímeros de la proteína de PSMA contiene al menos alrededor de 10% de multímero de la proteína de PSMA (de la cantidad total de proteína de PSMA en la composición). En otras realizaciones, la composición de multímeros de la proteína de PSMA contiene al menos alrededor de 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% o 99,5% de multímero de la proteína de PSMA. En una realización, la composición de multímeros de la proteína de PSMA contiene multímero de la proteína de PSMA sustancialmente puro, sin sustancialmente ningún monómero de la proteína de PSMA. Se entiende que la lista de porcentajes específicos incluye como referencia todos los porcentajes no nombrados entre los porcentajes citados.

Las citocinas también se pueden usar en protocolos de vacunación como resultado de sus propiedades reguladoras de linfocitos. Muchas citocinas útiles para tales fines serán conocidos por una persona de pericia normal en la técnica, incluyendo interleucina-2 (IL-2); IL-4; IL-5; IL-12, que se ha demostrado que potencian los efectos protectores de las vacunas (véase, por ejemplo Science 268:1432-1434, 1995); GM-CSF; IL-15; IL-18; sus combinaciones, y similares. De este modo, las citocinas se pueden administrar conjuntamente con antígeno, quimiocinas y/o adyuvantes para incrementar una respuesta inmunitaria.

Los otros agentes terapéuticos se pueden usar en los métodos proporcionados en forma no conjugada o en forma conjugada, tal como conjugados a un anticuerpo anti-PSMA o su fragmento de unión a antígeno. El acoplamiento de una o más moléculas de toxina al anticuerpo anti-PSMA o a su fragmento de unión a antígeno puede incluir muchos mecanismos químicos, por ejemplo unión covalente, unión de afinidad, intercalación, unión de coordinación y complejación.

La unión covalente se puede lograr mediante condensación directa de cadenas laterales existentes o mediante la incorporación de moléculas formadoras de puentes externas. Muchos agentes bivalentes o polivalentes son útiles en el acoplamiento de moléculas proteicas a otras proteínas, péptidos o funciones amínicas, etc. Por ejemplo, la bibliografía está repleta de agentes de acoplamiento tales como carbodiimidas, diisocianatos, glutaraldehído, diazobencenos, y hexametilendiaminas. Esta lista no pretende ser exhaustiva de los diversos agentes de acoplamiento conocidos en la técnica, sino más bien es ejemplar de los agentes de acoplamiento más habituales.

En algunas realizaciones, se contempla que se pueda desear derivatizar en primer lugar el anticuerpo, y después añadir el agente terapéutico al producto derivatizado. Los agentes de reticulación adecuados para uso de esta manera incluyen, por ejemplo, SPDP (N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato), y SMPT, 4-succinimidil-oxicarbonilmetil-(2-piridilditio)tolueno.

Además, las toxinas proteicas se pueden fusionar al anticuerpo anti-PSMA o a su fragmento de unión a antígeno mediante métodos genéricos para formar una proteína de fusión inmunotoxínica híbrida. Las proteínas de fusión pueden incluir secuencias peptídicas adicionales, tales como espaciadores peptídicos que unen operativamente, por ejemplo, el anticuerpo anti-PSMA y la toxina, en tanto que tales secuencias adicionales no afecten apreciablemente a la selección de dianas o a las actividades toxínicas de la proteína de fusión. Las proteínas se pueden unir mediante un ligador o espaciador peptídico, tal como un péptido espaciador de glicina-serina, o una bisagra

peptídica, como es bien conocido en la técnica. De este modo, por ejemplo, el término C de un anticuerpo anti-PSMA o su fragmento de unión a antígeno se puede fusionar al término N de la molécula de la toxina proteica para formar una inmunotoxina que retiene las propiedades de unión del anticuerpo anti-PSMA. Otros montajes de fusión serán conocidos por un experto de pericia normal en la técnica. Para expresar la inmunotoxina de fusión, se inserta el ácido nucleico que codifica la proteína de fusión en un vector de expresión según métodos estándar, para la expresión estable de la proteína de fusión, tal como en células de mamífero, tales como células CHO. La proteína de fusión se puede aislar y purificar de las células o del sobrenadante de cultivo usando metodología estándar, tal como una columna de afinidad de PSMA.

Los radionúclidos se acoplan típicamente a un anticuerpo o a su fragmento de unión a antígeno mediante quelación. Por ejemplo, en el caso de radionúclidos metálicos, habitualmente se usa un quelador bifuncional para enlazar el isótopo al anticuerpo o a otra proteína de interés. Típicamente, el quelador se une en primer lugar al anticuerpo, y el conjugado de quelador-anticuerpo se pone en contacto con el radioisótopo metálico. Para este fin, se han desarrollado distintos queladores bifuncionales, incluyendo la serie de aminoácidos de ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA) descrita en las patentes U.S. 5.124.471, 5.286.850 y 5.434.287. Como otro ejemplo, los agentes quelantes bifuncionales a base de ácido hidroxámico se describen en la patente U.S.

5.756.825. Otro ejemplo es el agente quelante denominado p-SCN-Bz-HEHA (ácido 1,4,7,10,13,16hexaazaciclooctadecano-N,N’,N”,N”’,N””,N””’-hexaacético) (Deal et al., J. Med. Chem. 42:2988, 1999), que es un quelador eficaz de radiometales tales como 225Ac. Aún otro ejemplo es DOTA (ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano N,N’,N”,N”’-tetraacético), que es un agente quelante bifuncional (véase McDevitt et al., Science 294:1537-1540, 2001) que se puede usar en un método de dos etapas para el marcaje seguido de la conjugación.

Otros agentes terapéuticos también incluyen virus selectivos para la replicación. Los virus competentes para la replicación, tales como el mutante dl1520 de adenovirus que selecciona la ruta de p53, ONYX-015, extermina selectivamente a células tumorales (Biederer, C. et al., J. Mol. Med. 80(3):163-175, 2002). En algunas realizaciones, este virus se puede conjugar a anticuerpos anti-PSMA o a sus fragmentos de unión a antígeno.

Los métodos proporcionados pueden comprender además el uso de otras modalidades de tratamiento terapéutico. Tales otros tratamientos incluyen cirugía, radiación, criocirugía, termoterapia, tratamiento hormonal, quimioterapia, vacunas y otras inmunoterapias.

Los ADCs de la invención, tal como a través de su anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno, se pueden enlazar a un marcador. Los marcadores incluyen, por ejemplo, marcadores fluorescentes, marcadores enzimáticos, marcadores radioactivos, marcadores activos de resonancia magnética nuclear, marcadores luminiscentes o marcadores cromóforos.

Las composiciones proporcionadas pueden incluir un vehículo, excipiente o estabilizante fisiológica o farmacéuticamente aceptable, mezclado con el ADC. En algunas realizaciones, cuando una composición comprende dos o más ADCs diferentes, cada uno de los anticuerpos o sus fragmentos de unión a antígeno de los ADCs se une a un epítopo conformacional diferente de PSMA.

Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar en terapia de combinación, es decir, se pueden combinar con otros agentes. Por ejemplo, la terapia de combinación puede incluir un ADC con al menos un agente antitumoral, inmunomodulador, agente inmunoestimulante u otra terapia convencional. El otro agente se puede conjugar a o se puede formar como una molécula de fusión recombinante con un anticuerpo anti-PSMA o su fragmento de unión a antígeno para dirigir directamente el agente hacia células que expresan PSMA. En otra realización, el otro agente terapéutico puede estar no conjugado. Los agentes terapéuticos adicionales se pueden administrar o se pueden poner en contacto con células que expresan PSMA a través de la coadministración. “Coadministrar”, como se usa aquí, se refiere a administrar simultáneamente dos o más agentes terapéuticos como una mezcla en una única composición, o secuencialmente, y suficientemente próxima en el tiempo de manera que los compuestos pueden ejercer un efecto aditivo o incluso sinérgico. En todavía otras realizaciones, un agente terapéutico adicional se puede administrar antes, durante o después de la administración de uno o más ADCs o sus composiciones.

Como se usa aquí, “vehículo farmacéuticamente aceptable” o “vehículo fisiológicamente aceptable” incluye cualquiera y todas las sales, disolventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y agentes que retrasan la absorción, y similares, que son fisiológicamente compatibles. En algunas realizaciones, el vehículo es adecuado para la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, espinal o epidérmica (por ejemplo, mediante inyección o infusión). Dependiendo de la vía de administración, el compuesto activo se puede revestir en un material para proteger el compuesto de la acción de ácidos y otras condiciones naturales que pueden inactivar el compuesto.

Cuando se administran, las composiciones farmacéuticas se aplican en cantidades farmacéuticamente aceptables y en composiciones farmacéuticamente aceptables. La expresión “farmacéuticamente aceptable” significa un material no tóxico que no interfiere con la eficacia de la actividad biológica de los ingredientes activos. Tales preparaciones pueden contener de forma habitual sales, agentes tamponantes, conservantes, vehículos compatibles, y opcionalmente otros agentes terapéuticos, tales como agentes potenciadores inmunitarios suplementarios que

incluyen adyuvantes, quimiocinas y citocinas. Cuando se usan en medicina, las sales deberían ser farmacéuticamente aceptables, pero las sales no farmacéuticamente aceptables se pueden usar convenientemente para preparar sus sales farmacéuticamente aceptables, y no se excluyen del alcance de la invención.

Una sal retiene la actividad biológica deseada del compuesto progenitor, y no imparte efectos toxicológicos indeseados (véase, por ejemplo, Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66: 1-19). Los ejemplos de tales sales incluyen sales de adición de ácidos y sales de adición de bases. Las sales de adición de ácidos incluyen las derivadas de ácidos inorgánicos no tóxicos, tales como clorhídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bromhídrico, yodhídrico, fosforoso y similar, así como ácidos orgánicos no tóxicos tales como ácido mono- y dicarboxílicos alifáticos, ácidos alcanoicos sustituidos con fenilo, ácidos hidroxialcanoicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfónicos alifáticos y aromáticos, y similares. Las sales de adición de bases incluyen aquellas derivadas de metales alcalinotérreos, tales como sodio, potasio, magnesio, calcio y similar, así como de aminas orgánicas no tóxicas, tales como N,N’-dibenciletilendiamina, N-metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilendiamina, procaína y similares.

Un ADC se puede combinar, si se desea, con un vehículo farmacéuticamente aceptable. La expresión “vehículo farmacéuticamente aceptable”, como se usa aquí, significa una o más cargas sólidas o líquidas compatibles, diluyentes o sustancias encapsulantes, que son adecuados para la administración a un ser humano. El término “vehículo” representa un ingrediente orgánico o inorgánico, natural o sintético, con el que se combina el ingrediente activo para facilitar la aplicación. Los componentes de las composiciones farmacéuticas también son capaces de ser comezclados de manera tal que no hay interacción que alterase sustancialmente la eficacia farmacéutica deseada.

Las composiciones farmacéuticas pueden contener agentes tamponantes adecuados, incluyendo: ácido acético en una sal; ácido cítrico en una sal; ácido bórico en una sal; y ácido fosfórico en una sal.

Las composiciones farmacéuticas también pueden contener, opcionalmente, conservantes adecuados, tales como: cloruro de benzalconio; clorobutanol; y parabenos.

Las composiciones farmacéuticas pueden estar presentes convenientemente en forma de dosis unitaria, y se pueden preparar mediante cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica de farmacia. Todos los métodos incluyen la etapa de asociar el agente activo con un vehículo que constituye uno o más ingredientes accesorios. En general, las composiciones se preparan asociando uniforme e íntimamente el compuesto activo con un vehículo líquido, un vehículo sólido finamente dividido, o ambos, y después, si es necesario, conformando el producto.

Las composiciones adecuadas para la administración parenteral comprenden convenientemente una preparación estéril acuosa o no acuosa de los compuestos, que es, en algunas realizaciones, isotónica con la sangre del receptor. Esta preparación se puede formular según métodos conocidos usando agentes dispersantes o humectantes y agentes de suspensión adecuados. La preparación inyectable estéril también puede ser una disolución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o disolvente no tóxico parenteralmente aceptable, por ejemplo como una disolución en 1,3-butanodiol. Entre los vehículos y disolventes aceptables que se pueden emplear están el agua, disolución de Ringer, y disolución isotónica de cloruro de sodio. Además, convencionalmente se emplean como disolvente o medio de suspensión aceites fijos estériles. Para este fin, se puede emplear cualquier aceite fijo blando, incluyendo mono-o diglicéridos sintéticos. Además, los ácidos grasos tales como ácido oleico se pueden usar en la preparación de inyectables. Las formulaciones de vehículos adecuadas para la administración oral, subcutánea, intravenosa, intramuscular, etc., se pueden encontrar en Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA.

Los compuestos activos se pueden preparar con vehículos que protegerán el compuesto frente a la liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes, parches transdérmicos, y sistemas de suministro microencapsulados. Se pueden usar polímeros biodegradables, biocompatibles, tales como etilenoacetato de vinilo, polianhídridos, poliácido glicólico, colágeno, poliortoésteres, y poliácido láctico. Muchos métodos para la preparación de tales formulaciones están patentados o se conocen generalmente por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1978.

Las sustancias terapéuticas de la invención se pueden administrar mediante cualquier vía convencional, incluyendo inyección o mediante infusión gradual a lo largo del tiempo (por ejemplo, el ADC en disolución salina infundida durante 90 minutos). La administración puede ser, por ejemplo, oral, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intracavidad, intratumoral, o transdérmica. Cuando se usan terapéuticamente compuestos que contienen anticuerpos, las vías de administración incluyen la intravenosa y mediante aerosol pulmonar. Las técnicas para preparar sistemas de suministro de aerosol que contienen anticuerpos son bien conocidas por los expertos en la técnica. Generalmente, tales sistemas deberían utilizar componentes que no alterarán significativamente las propiedades biológicas de los anticuerpos, tales como la capacidad de unión al paratopo (véase, por ejemplo, Sciarra y Cutie, “Aerosols”, en Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18ª edición, 1990, p. 1694-1712). Los expertos en la técnica pueden determinar fácilmente los diversos parámetros y condiciones para producir aerosoles de anticuerpos sin recurrir a experimentación innecesaria.

Las composiciones de la invención se administran en cantidades eficaces. Una “cantidad eficaz” es aquella cantidad de cualquiera de los ADCs proporcionados aquí que solos, o junto con dosis adicionales y/u otros agentes terapéuticos, produce la respuesta deseada. Esto puede implicar cualquiera de los puntos finales terapéuticos mencionados aquí. En una realización, esto implica solamente ralentizar la progresión de la enfermedad temporalmente, aunque en algunas realizaciones implica detener la progresión de la enfermedad permanentemente. En otras realizaciones, implica erradicar la enfermedad completamente. El punto final terapéutico deseado se puede monitorizar mediante métodos habituales conocidos por aquellos de pericia normal en la técnica. Una cantidad que es eficaz puede ser la cantidad de un ADC solo que produce el punto final terapéutico deseado. Una cantidad que es eficaz es también una cantidad de un ADC en combinación con otro agente que produce el resultado deseado.

Tales cantidades dependerán, por supuesto, del cáncer particular que se esté tratando, de la gravedad del cáncer, de los parámetros del paciente individual, incluyendo la edad, estado físico, tamaño y peso, la duración del tratamiento, la naturaleza de la terapia concurrente (si la hay), la vía específica de administración, y factores similares dentro del conocimiento y experiencia del practicante de la salud. Estos factores son bien conocidos por aquellos de pericia normal en la técnica, y se pueden abordar con experimentación no más allá de la habitual. Generalmente se prefiere que se use una dosis máxima de los componentes individuales o sus combinaciones, esto es, la dosis segura más elevada según el juicio del médico. Se entenderá por los expertos de pericia normal en la técnica, sin embargo, que un paciente puede insistir en una dosis menor o dosis tolerable por razones médicas, razones psicológicas o por virtualmente cualesquiera otras razones.

Las composiciones farmacéuticas usadas en los métodos pueden ser estériles, y contienen una cantidad eficaz de un ADC, solo o en combinación con otro agente, para producir la respuesta deseada en una unidad de peso o volumen adecuada para la administración a un paciente. La respuesta se puede medir, por ejemplo, determinando los efectos fisiológicos de la composición de ADC, tal como una reducción en el volumen tumoral, una reducción en el tamaño o número de metástasis, un incremento en la supervivencia, una mejora en la calidad de vida y/o una reducción de los síntomas del cáncer, etc. Otros ensayos serán conocidos por aquel de pericia normal en la técnica, y se pueden emplear para medir el nivel de la respuesta.

Las dosis de los ADCs administradas a un sujeto se pueden escoger según diferentes parámetros, en particular según el modo de administración usado y el estado del sujeto. Otros factores incluyen el período de tratamiento deseado. En el caso de que una respuesta en un sujeto sea insuficiente a las dosis iniciales aplicadas, se pueden emplear mayores dosis (o dosis eficazmente mayores mediante una vía de suministro diferente, más localizada) hasta el grado en que lo permita la tolerancia del paciente.

En general, las dosis pueden oscilar desde alrededor de 10 %g/kg hasta alrededor de 100.000 %g/kg. En algunas realizaciones, las dosis pueden oscilar desde alrededor de 0,1 mg/kg hasta alrededor de 20 mg/kg. En todavía otras realizaciones, las dosis oscilan desde alrededor de 0,1 mg/kg hasta 5 mg/kg, 0,1 mg/kg hasta 10 mg/kg o 0,1 mg/kg hasta 15 mg/kg. En todavía otras realizaciones, las dosis oscilan desde alrededor de 1 mg/kg hasta 5 mg/kg, 5 mg/kg hasta 10 mg/kg, 10 mg/kg hasta 15 mg/kg o 15 mg/kg hasta 20 mg/kg. En realizaciones adicionales, la dosis es alrededor de 0,1 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, 7 mg/kg, 10 mg/kg, 12 mg/kg, 15 mg/kg, 17 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg o 30 mg/kg. En una realización adicional, la dosis es alrededor de 0,4 mg/kg, 0,7 mg/kg. 1,1 mg/kg, 1,8 mg/kg, 2,4 mg/kg, 2,9 mg/kg, 3,0 mg/kg, 3,5 mg/kg o 4,0 mg/kg. En una realización adicional, la dosis es alrededor de 0,6 mg/kg, 0,9 mg/kg, 1,2 mg/kg o 1,5 mg/kg. En otra realización, la dosis es alrededor de 1 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg o 6 mg/kg. Basándose en la composición, la dosis se puede suministrar de forma continua, tal como mediante bomba continua, o a intervalos periódicos. En algunas realizaciones, cuando el ADC se administra intravenosamente, la dosis está entre 0,1 y 20 mg/kg, o cualquier valor entre ellos. Los intervalos de tiempo deseados de múltiples dosis de una composición particular se pueden determinar sin experimentación innecesaria mediante un experto en la técnica. Otros protocolos para la administración de las composiciones proporcionadas serán conocidos por aquel de pericia normal en la técnica, en los que la cantidad de dosis, el programa de administración, el sitio o sitios de administración, el modo de administración, y similar, varían a partir de lo anterior. En algunas realizaciones, a los sujetos se les administra el ADC con un régimen de dosis de q4d x 3 o q4d x 6. En una realización, la dosis se administra intravenosamente. En otra realización, el régimen de dosis es una dosis intravenosa individual.

La administración de un ADC o de una composición que comprende un ADC a mamíferos distintos de seres humanos, por ejemplo, para fines de ensayo o fines terapéuticos veterinarios, etc., se lleva a cabo en sustancialmente las mismas condiciones como se describe anteriormente.

Las composiciones de la presente invención tienen utilidades terapéuticas in vitro e in vivo. Por ejemplo, estas moléculas se pueden administrar a células en cultivo, por ejemplo in vitro o ex vivo, o en un sujeto, por ejemplo in vivo, para tratar una variedad de cánceres como se proporciona aquí. Como se usa aquí, el término “sujeto” pretende incluir seres humanos y animales no humanos. Los animales no humanos incluyen, por ejemplo, perros, gatos, caballos, vacas, cerdos, ratones y ratas. Los sujetos incluyen un paciente humano que tiene un cáncer que expresa PSMA, resistente a taxano. El sujeto, en una realización, tiene cáncer de próstata metastásico progresivo, resistente a la castración, que se ha tratado con taxano pero que ha progresado. En otra realización, el sujeto es aquel que satisface los criterios de entrada como se definen en los Ejemplos más abajo (por ejemplo, Ejemplos 5, 7 y 9).

El uso de los métodos proporcionados tiene un número de beneficios. Puesto que los ADCs se dirigen preferentemente hacia PSMA, por ejemplo en células de cáncer de próstata, se puede prescindir de otro tejido. Como resultado, el tratamiento con tales agentes biológicos es más seguro, particularmente para pacientes más ancianos. Se espera que el tratamiento según la presente invención sea particularmente eficaz, en algunas realizaciones, debido a que puede dirigir niveles elevados de ADCs a la médula ósea y a los ganglios linfáticos, donde pueden predominar las metástasis de cáncer, tales como metástasis de cáncer de próstata. El tratamiento según la presente invención se puede monitorizar eficazmente con parámetros clínicos tales como antígeno específico de la próstata sérico y/o rasgos patológicos de un cáncer de paciente, incluyendo etapa, puntuación de Gleason, invasión extracapsular, seminal, vesicular o perineural, márgenes positivos, ganglios linfáticos implicados, etc. Como alternativa, estos parámetros se pueden usar para indicar cuándo tal tratamiento se debería emplear.

Las composiciones para uso en los métodos proporcionados aquí pueden estar en forma liofilizada, o se pueden proporcionar en un medio acuoso.

La presente invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes Ejemplos.

Ejemplos

Ejemplo 1: Citotoxicidad potente y específica para células de cáncer de próstata que expresan PSMA

Células positivas a PSMA y negativas a PSMA se expusieron a ADC de PSMA en microplacas de 96 pocillos a diversas concentraciones. Después de 96 horas, se evaluó el porcentaje de supervivencia celular (en comparación con células en medio) usando Alamar Blue fluorescente (Fig. 5).

La Fig. 6 presenta una tabla que muestra citotoxicidad a estirpes celulares de cáncer de próstata que expresan PSMA tras la exposición a ADC de PSMA.

Ejemplo 2: ADC de PSMA es eficaz para tratar tumores grandes y para tratar tumores resistentes a docetaxel

Se evaluó la eficacia terapéutica in vivo de ADC de PSMA en un modelo de xenoinjerto subcutáneo de cáncer de próstata humano. Se implantaron subcutáneamente a ratones atímicos machos, de 6-8 semanas, obtenidos de Charles River Laboratories, Inc. (Wilmington, MA), 5 millones de células C4-2 (proporcionadas por Warren D.W. Heston de The Cleveland Clinic, Cleveland, OH). C4-2 es una estirpe celular de cáncer de próstata humana independiente de andrógenos. En el día 11, se midió el tamaño tumoral de cada ratón, en longitud y anchura en milímetros, usando un calibre (Mitutoyo, Aurora, IL). El volumen tumoral se calculó usando la siguiente fórmula:

Volumen (mm3) = [(Longitud) x (Anchura)2]/2

Los animales con un volumen tumoral entre 80-140 mm3 se distribuyeron al azar según el volumen tumoral en dos grupos para el tratamiento con tampón de PBS (control de vehículo, n = 15) o ADC de PSMA (n = 15). El tamaño tumoral medio fue 108,9 y 108,7 mm3, con un valor p de 0,452 (prueba de la t de Student) para los grupos de PBS y de ADC de PSMA, respectivamente, en la distribución al azar. Todos los animales recibieron entonces inyecciones intravenosas de PBS o de ADC de PSMA (Progenics, Tarrytown, NY, lote toxicológico P10306) a 6 mg/kg en la vena de la cola en un volumen de 0,1 ml en el día 12 al 29, dos veces por semana durante tres semanas. Los tamaños tumorales se midieron dos veces por semana o semanalmente durante 100 días tras la implantación del tumor, y el volumen tumoral medio para los dos grupos se representó gráficamente a lo largo del tiempo tras la implantación del tumor (Fig. 7).

Se observó reducción del tamaño tumoral en los animales tratados con ADC de PSMA. El primer animal se sacrificó en el día 33 en el grupo de control de vehículo debido al gran tamaño del tumor (>2000 mm3); el tamaño tumoral medio para el grupo de vehículo y para el grupo tratado con ADC de PSMA fueron 925,7 mm3 y 92,5 mm3 (p = 0,00005, prueba de la t de Student), respectivamente. El experimento se siguió durante 100 días, y todos los ratones se sacrificaron excepto 4 animales en el grupo tratado con ADC de PSMA.

Entre los 15 animales en el grupo tratado con ADC de PSMA con un tamaño tumoral medio de 72,5 mm3 en el día 75 como se muestra en la Fig. 7, hubo 4 ratones (ratón #8, 11, 12 y 14) con tumores que comenzaron a crecer en el día 75 (Fig. 8). En el día 99, el tamaño tumoral medio fue 688,7 mm3 (893,8, 445,3, 666,7, 749,0 mm3) para los 4 ratones. Los animales se trataron nuevamente con ADC de PSMA a 6 mg/kg a partir del día 99, una vez a la semana durante 13 semanas. La Fig. 8 muestra el volumen tumoral a lo largo de 180 días para los 4 ratones. Las líneas discontinuas indican el tratamiento inicial con ADC de PSMA, y las líneas continuas indican el segundo tratamiento con ADC de PSMA. La reducción del tamaño tumoral se observó inmediatamente en los 4 ratones después del segundo tratamiento con ADC de PSMA, y el volumen tumoral continuó contrayéndose mientras se seguía dosificando. En el día 180, el volumen tumoral se redujo a <100 mm3, con un volumen medio de 50 mm3.

Estos resultados muestran que ADC de PSMA es eficaz para tratar tumores de tamaño grande (∃900 mm3), y también se puede usar para tratar tumores recidivantes usando el mismo nivel de dosis de un tratamiento inicial con ADC de PSMA.

Un ratón que no se incluyó en el experimento de ADC de PSMA descrito anteriormente tuvo un tamaño tumoral de ∃500 mm3 en el día 21. Se le dieron 12 dosis de docetaxel, IP, a 12 mg/kg semanalmente. Como se muestra en la Fig. 3 y en la Tabla 2, el animal respondió inicialmente al tratamiento con docetaxel, el volumen tumoral se redujo hasta ∃300 mm3 en el día 60, pero después progresó hasta ∃800 mm3 en el día 100. El tratamiento de docetaxel se

5 detuvo, y se administró IV ADC de PSMA a 6 mg/kg durante 12 dosis adicionales, semanalmente. El volumen tumoral se redujo drásticamente de 800 mm3 a ∃50 mm3 en el día 180 cuando se administró ADC de PSMA. ADC de PSMA puede tratar tumores en los el tratamiento de docetaxel fracasó.

Tabla 2. Medida del tumor a lo largo del tiempo en un animal tratado con 12 dosis de 12 mg/kg de docetaxel seguido de 12 dosis de 6 mg/kg de ADC de PSMA. El tumor respondió inicialmente al tratamiento con docetaxel, y después 10 recayó. El tratamiento se cambió a ADC de PSMA, y entonces se observó una reducción significativa del volumen tumoral.

Días tras la implantación del tumor: Tumor

Longitud (mm): Anchura (mm) Volumen (mm3)

21: 12,22 9,22 519,4

26: 13,07 9,27 561,6

28: 12,61 9,11 523,3

39: 12,06 9,14 503,7

47: 10,89 7,80 331,3

49: 11,17 7,67 328,6

56: 11,10 8,26 378,7

61: 11,16 7,44 308,9

63: 10,59 7,84 325,5

67: 11,67 7,46 324,7

70: 12,48 8,12 411,4

77: 13,30 9,77 634,8

84: 13,77 10,39 743,3

91: 14,09 10,08 715,8

95: 14,70 10,30 779,8

99: 14,51 10,67 826,0

103: 13,62 10,40 736,6

106: 14,13 10,14 726,4

110: 12,70 8,42 450,2

113: 9,61 7,96 304,5

119: 8,78 6,77 201,2

126: 8,67 6,33 173,7

134: 7,12 6,46 148,6

141: 6,20 5,70 100,7

148: 6,46 5,32 91,4

154: 5,65 4,78 64,5

162: 5,60 4,30 51,8

Días tras la implantación del tumor: Tumor

Longitud (mm): Anchura (mm) Volumen (mm3)

167: 5,70 4,00 45,6

173: 5,50 3,80 39,7

180: 5,60 4,15 48,2

Ejemplo 3: ADC de PSMA es eficaz para tratar tumores en animales en los que el tratamiento de docetaxel fracasó

Se diseñó un experimento (Fig. 10) para evaluar la eficacia de ADC de PSMA tras el fracaso del tratamiento con docetaxel. A ratones atímicos machos, 6-8 semanas, obtenidos de Charles River Laboratories, Inc., se les implantó subcutáneamente 5 millones de células C4-2. En el día 14, los animales que tienen un volumen tumoral entre 100200 mm3 se distribuyeron al azar (distribución al azar #1) en dos brazos de tratamiento: (1) control de vehículo (tampón de PBS, n = 10); (2) docetaxel a 2 mg/kg/IV semanalmente (n = 50) según el volumen tumoral. El volumen tumoral medio fue 138,0 y 138,1 mm3 para los grupos de control de vehículo y de tratamiento con docetaxel, respectivamente, en el momento de la distribución al azar.

Todos los animales recibieron entonces inyecciones intravenosas de PBS o docetaxel (Sigma, St. Louis, MO) a 2 mg/kg vía la vena de la cola en un volumen de 0,1 ml. Los tamaños tumorales se midieron dos veces por semana tras la implantación del tumor, y se representó el volumen tumoral medio para los dos grupos antes de que se iniciase la segunda distribución al azar (Fig. 11). En conjunto, el tratamiento con docetaxel redujo el crecimiento tumoral en comparación con el control.

Cuando el volumen tumoral de un animal en el grupo de tratamiento con docetaxel superó 400 mm3, este animal se distribuyó al azar, a una relación 1:1, en uno de los dos subgrupos de tratamiento: un grupo continuó recibiendo docetaxel a 2 mg/kg, y el segundo grupo se cambió al tratamiento con ADC de PSMA a 6 mg/kg/IV semanalmente. Los animales se distribuyeron al azar en estos dos subgrupos de tratamiento continuamente a lo largo del período de 28 días hasta 70 días tras la implantación del tumor. Al final del día 70, hubo 28 ratones cuyo volumen tumoral había superado 400 mm3, con 14 ratones distribuidos al azar en el subgrupo de tratamiento con ADC de PSMA (volumen tumoral medio de 695 mm3 y 14 ratones distribuidos al azar en el subgrupo de tratamiento con docetaxel continuado (volumen tumoral medio de 642 mm3 con un valor p de 0,28 (prueba de la t de Student)).

El efecto del tratamiento con ADC de PSMA sobre el crecimiento tumoral tras el fracaso de docetaxel se evaluó comparando la reducción tumoral tras la segunda distribución al azar. Los volúmenes tumorales de los animales en los dos subgrupos se representaron gráficamente (Fig. 12). Los resultados muestran que los tumores crecieron continuamente mientras se encontraban en el tratamiento con docetaxel. Sin embargo, el volumen tumoral se redujo significativamente cuando se inició el tratamiento con ADC de PSMA. Por lo tanto, ADC de PSMA es eficaz tratando animales con tumores en los que fracasó el tratamiento con docetaxel.

Ejemplo 4: Diseño de estudio in vivo

El diseño de estudio se muestra en la Fig. 13. A ratones atímicos machos, 6-8 semanas, obtenidos de Charles River Laboratories, Inc., se les implantó subcutáneamente Matrigel en el lado derecho de cada ratón con 5 millones de células C4-2 (estirpe celular de cáncer de próstata humana independiente de andrógeno). En el día 14, se midió el tamaño tumoral en longitud y anchura en mm (milímetro). El volumen se calculó usando la fórmula: volumen (mm3) = [(longitud) x (anchura)2]/2. Los animales se distribuyeron al azar en dos grupos con volumen tumoral similar (aproximadamente 138 mm3): control de vehículo y docetaxel a 2 mg/kg. A los animales se les dosificó semanalmente a través de la vena de la cola.

Cuando el volumen tumoral de un animal en el grupo de tratamiento con docetaxel superó 400 mm3, este animal se distribuyó al azar, a una relación 1:1, en uno de los dos subgrupos de tratamiento: un grupo continuó recibiendo docetaxel a 2 mg/kg semanalmente (n = 18), y el segundo grupo se cambió a tratamiento con ADC de PSMA a 6 mg/kg/IV semanalmente (n = 18). Los ratones cuyos tumores respondieron duraderamente a docetaxel (&400 mm3) continuaron recibiendo docetaxel a 2 mg/kg/IV semanalmente. Los efectos del tratamiento se evaluaron midiendo el volumen tumoral y la supervivencia global. También se midió el peso corporal del animal. Los animales con tamaño tumoral ∋2000 mm3 se sacrificaron.

Los volúmenes tumorales medios fueron 515 ± 103 mm3 y 495 ± 80 mm3 para los grupos de ADC de PSMA y de tratamiento con docetaxel continuado, respectivamente, en la segunda distribución al azar (p = 0,518) (Fig. 14). Al final del experimento, la tasa de supervivencia fue 100% para animales en el grupo de tratamiento con ADC de PSMA (Fig. 17); 94% de estos ratones tuvieron tamaños tumorales <100 mm3 (Fig. 16). Por el contrario, la tasa de supervivencia fue 11% en el grupo de tratamiento con docetaxel continuado. Por lo tanto, el tratamiento con ADC de PSMA contrajo significativamente los tumores e incrementó la supervivencia global de los animales en comparación con el tratamiento continuado con docetaxel (p < 0,0001). ADC de PSMA fue generalmente bien tolerado en el animal (Fig. 18). ADC de PSMA demostró una potente actividad antitumoral frente a tumores de próstata grandes que habían progresado tras el tratamiento con docetaxel. El tratamiento con ADC de PSMA prolongó

5 significativamente la supervivencia.

Ejemplo 5: Un estudio de aumento de escala de fase 1 de ADC de PSMA en sujetos con cáncer de próstata metastásico progresivo, resistente a la castración

Se inició un estudio de fase 1 de aumento de escala de la dosis, de etiqueta abierta de ADC de PSMA IV en sujetos con cáncer de próstata metastásico progresivo, resistente a la castración, que había progresado tras la terapia

10 previa con taxano. Los sujetos recibirán 0,4 mg/kg, 0,7 mg/kg, 1,1 mg/kg, 1,8 mg/kg o 2,9 mg/kg mediante infusión IV durante 90 minutos a velocidad constante de ADC de PSMA en disolución salina (a las semanas 0, 3, 6 y 9). Los sujetos adicionales que satisfagan los criterios de inclusión/exclusión del estudio entrarán en la cohorte de dosis máxima tolerada (MTD) hasta que esté llena por los criterios más abajo. La duración máxima del tratamiento para cada sujeto será de 12 semanas.

15 La toxicidad limitante de la dosis (DLT) se define como cualquier grado de toxicidad ∋ 3 según el National Cancer Institute (NCI) Common Terminology Criteria for Adverse Events (CTCAE, Versión 3.0), así como toxicidad alérgica/inmunológica de grado 2 (excepto fiebre aislada) para la cual no se pueda excluir una relación causal con el fármaco del estudio. En este estudio, DLT se determinará tras la primera dosis de cada cohorte. Se empleará un esquema de aumento de dosis, basado en la DLT. Una vez que se determina una MTD o se observa que la cohorte

20 con dosis más elevada es segura, se tratarán sujetos adicionales. Estos sujetos se escogerán usando los mismos criterios de inclusión/exclusión empleados para el estudio. Si dos o más sujetos en la cohorte de dosis más baja experimentan una DLT, se enrolará una cohorte a 0,2 mg/kg de ADC de PSMA.

Se obtendrán imágenes radiológicas en el cribado y en la semana 12. Se obtendrán muestras de sangre (5 ml) para concentraciones de fármaco antes del inicio de la infusión y a los 90 minutos y 4, 6, 24, 48, 96, 168, 336 y 504 horas 25 tras el inicio de la infusión en las semanas 0 y 6. Las concentraciones séricas del fármaco del estudio (ADC) y anticuerpo total (PSMA-mAb + ADC) se medirán mediante un método de ELISA completamente validado, y las concentraciones séricas de toxina libre (MMAE) se medirán mediante un método de cromatografía de líquidos/espectrometría de masas/espectrometría de masas (LC/MS/MS) completamente validado. La inmunogenicidad se evaluará mediante un método de ELISA completamente validado para los puntos de tiempo del

30 día 1 (predosis) y semana 12.

A todos los sujetos que completaron el estudio de 12 semanas, y que, en opinión del investigador, probablemente se beneficien del tratamiento continuado con ADC de PSMA, se les ofrecerá el enrolamiento en un estudio de extensión.

Diagnóstico y los criterios de inclusión:

35 1. Hombres, edad ∋ 18 años (o edad adulta mínima según se determina por las autoridades normativas locales)

2.: Estado de 0 ó 1 del Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG)

3.: Confirmación histológica de cáncer de próstata

4.: Un diagnóstico de cáncer de próstata metastásico progresivo, resistente a la castración, basado en

40 pruebas de enfermedad metastásica en barrido óseo, barrido mediante CT, o MRI en cualquier momento tras el diagnóstico inicial de cáncer de próstata

5. Terapia previa de carencia de andrógenos que consiste en orquiectomía o agonistas de la hormona liberadora de la hormona luteinizante (LHRH), con o sin un antiandrógeno y un nivel de emasculación de testosterona sérica (< 50 ng/ml)

45 6. Terapia previa con taxano

7. Requisitos de laboratorio:

●: Recuento de glóbulos blancos (WBC) ∋ 3000/mm3

●: Recuento de neutrófilos absoluto (ANC) ∋ 1000/mm3

●: Plaquetas (Plt) ∋ 100.000 mm3

50 ● Hemoglobina (Hgb) ∋ 10 g/dl

● Bilirrubina total & 2,0 mg/dl

●: Alanina transferasa sérica/aspartato transaminasa sérica (ALT/AST) & 2 x el límite superior de normal

●: Creatinina sérica & 2,0 mg/dl y velocidad de filtración glomerular (GFR) calculada de > 60 ml/min.

Criterios de exclusión:

1.: Neoplasia maligna primaria no prostática, excepto para cáncer de piel no melanómico o carcinoma de células transicionales papilares de grado bajo de la vejiga en los cinco años previos

2.: Enfermedad cardíaca clínicamente significativa (Clase III/IV de la New York Heart Association) o enfermedad pulmonar debilitante grave

3.: Terapia de radiación o quimioterapia citotóxica en las cuatro semanas previas

4.: Enfermedad metastásica del sistema nervioso central (SNC) o epidural activa

5.: Una infección que requiera tratamiento con antibióticos en siete días antes del cribado, y/o tratamiento con antibióticos iniciado hasta el momento de la primera dosis

6.: Neuropatía periférica de grado 2 o superior con cualquier asociación con terapia con taxano al comienzo del estudio

7.: Cualquier tratamiento previo con cualquier otra terapia dirigida a PSMA

8.: Los sujetos no pueden haber participado en ningún otro estudio de investigación dentro de los 30 días

9.: Terapia previa con mAbs o proteínas de fusión Ig de investigación o aprobadas

10.: Sujetos con QTc ∋ 500 ms

11.: Peso >225 libras (102,06 kilos)

Ejemplo 6: Diseño de estudio clínico de dos etapas

Un ensayo clínico de aumento de escala, de etiqueta abierta, de fase 1, incluirá hombres con cáncer de próstata progresivo, refractario a hormonas, y que tuvieron terapia previa con fármacos quimioterapéuticos taxánicos. El estudio investigará la duración del beneficio clínico derivado del tratamiento con ADC de PSMA a la vez que también evaluará la seguridad y tolerabilidad de los fármacos bajo investigación. El período inicial de 12 semanas evaluará hasta cinco dosis intravenosas de ADC de PSMA, administradas individualmente a intervalos de tres semanas. El estudio incluirá evaluaciones de farmacodinámica, cambios radiográficos en la carga tumoral, y cambios en los valores de antígeno específico de la próstata (PSA) y de células tumorales circulantes (CTC), en comparación con una línea base.

Tras el período de 12 semanas, a los pacientes se les ofrecerá, a juicio del médico, la opción de continuar el tratamiento durante 39 semanas adicionales con la misma dosis de ADC de PSMA como se administra en su cohorte inicial. Los sujetos cualificados recibirán hasta 13 dosis adicionales de ADC de PSMA a intervalos de tres semanas.

Ejemplo 7: Un estudio de aumento de la dosis de fase 1 de ADC de PSMA en sujetos con cáncer de próstatametastásico progresivo, resistente a la castración

Se inició un estudio de fase 1 de aumento de la dosis, de etiqueta abierta, de ADC de PSMA IV en sujetos con cáncer de próstata metastásico progresivo, resistente a la castración, que había progresado tras terapia previa con taxano. Los sujetos recibieron 0,4 mg/kg; 0,7 mg/kg, 1,1 mg/kg o 1,8 mg/kg o recibirán 2,4 mg/kg, 3,0 mg/kg, 3,5 mg/kg o 4,0 mg/kg mediante infusión IV a velocidad constante de ADC de PSMA en disolución salina administrada a lo largo de aproximadamente 90 minutos (a las semanas 0, 3, 6 y 9). Los sujetos adicionales que satisfacen los criterios de inclusión/exclusión del estudio entrarán en la cohorte de dosis máxima tolerada (MTD) hasta que esté llena por los criterios más abajo. La duración máxima del tratamiento para cada sujeto fue/será 12 semanas.

La toxicidad limitante de la dosis (DLT) se puede definir como cualquier grado de toxicidad ∋ 3 según National Cancer Institute (NCI) Common Terminology Criteria for Adverse Events (CTCAE, Versión 3.0), con la siguiente excepción: un recuento absoluto de neutrófilos (ANC) <500 mm3 determinado ocho días tras la primera infusión de ADC de PSMA. En esta circunstancia, una DLT se puede definir como un recuento de neutrófilos <500 mm3 encontrado tanto en los días 8 y 15 del estudio tras la primera infusión de ADC de PSMA. Una DLT también se puede definir como toxicidad alérgica/inmunológica de grado ∋2 (excepto fiebre aislada) para la que no se puede excluir una relación causal con el fármaco de estudio. En este estudio, DLT se determinó/determinará tras la primera dosis de cada cohorte. Se empleó/empleará un esquema de aumento de escala, basado en la DLT. Una vez que se determina una MTD o la cohorte de dosis más alta es segura, se tratarán sujetos adicionales. Estos sujetos se

escogerán usando los mismos criterios de inclusión/exclusión empleados para el estudio. Si dos o más sujetos en la cohorte de dosis más baja experimentan una DLT, una cohorte se enrolará a 0,2 mg/kg de ADC de PSMA.

La formación de imágenes radiológicas se obtuvo/obtendrá antes de la infusión y en siete días antes de la visita de la semana 12. Se obtuvieron/obtendrán muestras de sangre (5 ml) para las concentraciones de fármaco en los puntos de tiempo designados en las semanas 0, 3, 6, 9 y 12 (en la semana 12, la toma de muestras está en el día 85 ± un día del estudio). En la semana 0, se recogieron/recogen muestras antes del inicio de la infusión, inmediatamente al final de la infusión, y a las cuatro y seis horas tras la infusión. Las muestras recogidas a las 24, 48, 96, 168, 336 y 504 horas tras el inicio de la infusión se pueden recoger en ± dos horas del punto de tiempo designado. A las semanas 3, 6 y 9 sólo se recogieron/recogen muestras de predosis. Las concentraciones séricas de fármaco del estudio (ADC) y de anticuerpo total (PSMA-mAb + ADC) se midieron/medirán mediante un método de ELISA completamente validado, y las concentraciones séricas de toxina libre (MMAE) se midieron/medirán mediante un método de cromatografía de líquidos/espectrometría de masas/espectrometría de masas (LC/MS/MS) completamente validado. La inmunogenicidad se evaluó/evaluará mediante un método de ELISA completamente validado para los puntos de tiempo de día 1 (predosis) y semana 12.

A todos los sujetos que han completado el estudio de 12 semanas, y que, en opinión del investigador, probablemente se beneficiarán del tratamiento continuado con ADC de PSMA, se les ofrecerá enrolarse en un estudio de extensión.

Diagnóstico y los criterios de inclusión:

1.: Hombres, edad ∋ 18 años (o edad adulta mínima según se determina por las autoridades normativas locales)

2.: Estado de 0 ó 1 del Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG)

3.: Confirmación histológica de cáncer de próstata

4.: Un diagnóstico de cáncer de próstata metastásico progresivo, resistente a la castración, basado en pruebas de enfermedad metastásica en barrido óseo, barrido mediante CT, o MRI en cualquier momento tras el diagnóstico inicial de cáncer de próstata

5.: Terapia previa de carencia de andrógenos que consiste en orquiectomía o agonistas de la hormona liberadora de la hormona luteinizante (LHRH), con o sin un antiandrógeno y un nivel de emasculación de testosterona sérica (< 50 ng/ml)

6.: Terapia previa con taxano

7.: Requisitos de laboratorio:

●: Recuento de glóbulos blancos (WBC) ∋ 3000/mm3

●: Recuento de neutrófilos absoluto (ANC) ∋ 1000/mm3

●: Plaquetas (Plt) ∋ 100.000 mm3

●: Hemoglobina (Hgb) ∋ 9,0 g/dl

●: Bilirrubina total & 2,0 mg/dl

●: Alanina transferasa sérica/aspartato transaminasa sérica (ALT/AST) & 2 x el límite superior de normal (ULN)

● Creatinina sérica & 2,0 mg/dl y velocidad de filtración glomerular (GFR) calculada de > 60 ml/min. Criterios de exclusión:

3.: Terapia de radiación o quimioterapia citotóxica en las seis semanas previas

5.: Pruebas de una infección que requiera terapia con antibióticos en curso

7.: Cualquier tratamiento previo con cualquier otra terapia dirigida a PSMA

10.: Sujetos con QTc ∋ 500 ms

11.: Historia de pancreatitis o procedimientos quirúrgicos en el páncreas

12.: Historia de abuso de drogas y/o alcohol

13.: Cualquier estado médico que en opinión del investigador pueda interferir con una participación del sujeto en o con el cumplimiento con el estudio

Ejemplo 8: Diseño de estudio clínico de dos etapas

Un ensayo clínico de aumento de dosis, de etiqueta abierta, de fase 1, incluyó hombres con cáncer de próstata progresivo, refractario a hormonas, y que se sometió a terapia previa con fármacos quimioterapéuticos taxánicos. El estudio investiga la duración del beneficio clínico derivado del tratamiento con ADC de PSMA, y evalúa la seguridad y tolerabilidad del fármaco bajo investigación. Se administró ADC de PSMA a intervalos de tres semanas durante un período de 12 semanas para la evaluación de al menos cuatro dosis intravenosas de ADC de PSMA. El estudio incluye evaluaciones de farmacodinámica, cambios radiográficos en la carga tumoral, y cambios en los valores de antígeno específico de la próstata (PSA) y de células tumorales circulantes (CTC), en comparación con una línea base.

Tras el período de 12 semanas, a los pacientes se les ofrecerá, a juicio del médico, la opción de continuar el tratamiento durante 39 semanas adicionales con la misma dosis de ADC de PSMA según se administra en su cohorte inicial. Los sujetos cualificados recibirán hasta 13 dosis adicionales de ADC de PSMA a intervalos de tres semanas.

Ejemplo 9: Régimen de dosificación y modo de administración de ADC de PSMA

Se inició un estudio de fase 1 de aumento de escala, de etiqueta abierta, de ADC de PSMA administrado IV en sujetos con cáncer de próstata metastásico progresivo, resistente a la castración, que había progresado tras la terapia previa con taxano. Se administrarán infusiones intravenosas (IV) de ADC de PSMA a los sujetos en cuatro ciclos. En las cohortes 1-8, se administrarán infusiones IV de ADC de PSMA una vez al comienzo de un ciclo (duración 3 semanas o Q3W; semanas 1, 4, 7 y 10) durante un total de 4 dosis (4 ciclos) como ocho grupos de tratamiento enrolados progresivamente: 0,4 mg/kg, 0,7 mg/kg, 1,1 mg/kg, 1,8 mg/kg, 2,4 mg/kg, 3,0 mg/kg, 3,5 mg/kg o 4,0 mg/kg. En las cohortes 9-12, se administrarán infusiones IV de ADC de PSMA a sujetos una vez cada semana durante las primeras tres semanas de un ciclo de cuatro semanas durante un total de 12 dosis (4 ciclos o 4QW con una dosis durante la semana 1, 2 y 3 en el ciclo 1; semanas 5, 6 y 7 en el ciclo 2; semanas 9, 10 y 11 en el ciclo 3; y semanas 13, 14 y 15 en el ciclo 4; no se administrarán dosis durante las semanas 4, 8, 12 y 16 en los ciclos 1, 2, 3 y 4, respectivamente) como cuatro grupos de tratamiento enrolados progresivamente: 0,6 mg/kg, 0,9 mg/kg, 1,2 mg/kg y 1,5 mg/kg. Para todos los tratamientos, se administrará ADC de PSMA en disolución salina durante aproximadamente 90 minutos. Los sujetos adicionales que satisfagan los criterios de inclusión/exclusión del estudio entrarán en la MTD para cada régimen de dosificación hasta que esté lleno según los criterios más abajo. La duración máxima del tratamiento para los sujetos en las cohortes 1-8 será 13 semanas, y para los sujetos en las cohortes 9-12, 17 semanas.

La toxicidad limitante de la dosis (DLT) se definirá como cualquier grado de toxicidad ∋ 3 según National Cancer Institute (NCI) Common Terminology Criteria for Adverse Events (CTCAE, Versión 3.0), con la siguiente excepción: un recuento absoluto de neutrófilos (ANC) <500 mm3. Para todas las cohortes, una DLT se definirá como un recuento de neutrófilos <500 mm3 que persiste con la determinación repetida 3 a 7 días tras la administración de ADC de PSMA final dentro del primer ciclo. Para las cohortes 9-12, un ANC <500 mm3 antes de cualquier dosis en el primer ciclo es una DLT. Una DLT también se define como toxicidad alérgica/inmunológica de grado ∋2 (excepto fiebre aislada) para la cual no se puede excluir una relación causal del fármaco bajo estudio. En este estudio, DLT se determinará tras el primer ciclo de cada cohorte. Se empleará un esquema de aumento de dosis, basado en la DLT. Las determinaciones de DLT se producirán como una consideración separada para las cohortes 1-8 y 9-12. Una determinación de la DLT para la cohorte 1-8 no influirá en el enrolamiento en las cohortes 9-12. Una vez que se determina una MTD o la cohorte de dosis más elevada es segura, se tratarán sujetos adicionales. Estos sujetos se escogerán usando los mismos criterios de inclusión/exclusión empleados para el estudio.

Para los sujetos en las cohortes 1-8, se obtendrán imágenes radiológicas antes de la infusión y dentro de los siete días antes de la visita de la semana 13. Se obtendrán muestras de sangre (5 ml) para concentraciones de fármaco

en los puntos de tiempo en las semanas 0, 1, 4, 7, 10 y 13 (en la semana 13, la toma de muestra es en el día 85 ± un día del estudio). En la semana 1, las muestras se recogen antes del inicio de la infusión, inmediatamente al final de la infusión, y a las cuatro y seis horas después de la infusión. Las muestras recogidas a las 24, 48, 96, 168, 336 y 504 horas tras el inicio de la infusión se pueden recoger en ± dos horas del punto de tiempo designado. A las semanas 4, 7 y 10, sólo se recogen muestras de predosis. Para los sujetos en las cohortes 9-12, se obtendrán imágenes radiológicas antes de la primera infusión (semana 1) y dentro de los siete días antes de la visita de la semana 17. Se obtendrán muestras de sangre (5 ml) para concentraciones de fármaco en los puntos de tiempo designados: para la semana 1 (ciclo 1) inmediatamente antes del inicio de la infusión, inmediatamente al final de la infusión, y a las cuatro y a las seis horas después de la infusión. Las muestras recogidas a las 24, 48 y 96 horas después del inicio de la infusión se pueden recoger dentro de ± dos horas del punto de tiempo designado. Las muestras recogidas en las semanas 2, 3 y 5 se recogen antes de la infusión. Las muestras también se han de obtener en la semana 4. Las concentraciones séricas de fármaco del estudio (ADC) y de anticuerpo total (PSMAmAb + ADC) se medirán mediante un método de ELISA completamente validado, y las concentraciones séricas de toxina libre (MMAE) se medirán mediante un método de cromatografía de líquidos/espectrometría de masas/espectrometría de masas (LC/MS/MS) completamente validado. La inmunogenicidad se evaluará mediante un método de ELISA completamente validado para los puntos de tiempo de día 1 (predosis) y semana 13 para las cohortes 1-8, y el día 1 (predosis) y la semana 17 del estudio para las cohortes 9-12.

A todos los sujetos que han completado el estudio de 12 semanas, y que, en opinión del investigador, probablemente se beneficien del tratamiento continuado con ADC de PSMA, se les ofrecerá enrolarse en un estudio de extensión.

Diagnóstico y los criterios de inclusión:

2.: Estado de 0 ó 1 del Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG)

3.: Confirmación histológica de cáncer de próstata

5.: Terapia previa de carencia de andrógenos que consiste en orquiectomía o agonistas de la hormona liberadora de la hormona luteinizante (LHRH), con o sin un antiandrógeno y un nivel de emasculación de testosterona sérica (< 50 ng/ dl)

6.: Terapia previa con taxano

7.: Requisitos de laboratorio:

●: Recuento de glóbulos blancos (WBC) ∋ 3000/mm3

●: Recuento de neutrófilos absoluto (ANC) ∋ 1000/mm3

●: Plaquetas (Plt) ∋ 100.000 mm3

●: Hemoglobina (Hgb) ∋ 9,0 g/dl

●: Bilirrubina total & 2,0 mg/dl

Criterios de exclusión:

7.: Cualquier tratamiento previo con cualquier otra terapia dirigida a PSMA

5 8. Los sujetos no pueden haber participado en ningún otro estudio de investigación dentro de los 30 días

10.: Sujetos con QTc ∋ 500 ms

11.: Historia de pancreatitis o procedimientos quirúrgicos en el páncreas

12. Historia de abuso de drogas y/o alcohol 10 13. Cualquier estado médico que en opinión del investigador pueda interferir con una participación del sujeto

en o con el cumplimiento con el estudio LISTADO DE SECUENCIAS

<110> MA, Dangshe

<120> MÉTODOS PARA EXTERMINAR CÉLULAS CANCEROSAS QUE EXPRESAN PSMA, RESISTENTES A 15 TAXANO

<130> P0741.70011WO00

<140> 09789284.8

<141 > 08/09/2009

<150> 61/095,300 20 <151> 08/09/2008

<150> 61/205,395

<151 > 20/01/2009

<160> 33

<170> Patentln version 3.1 25 <210> 1

<211> 750

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

<210>2

<211> 7570

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Plásmido <400>2

<210> 3

<211> 7597

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Plásmido

<400> 3

<210> 4

<211> 7579

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Plásmido

<400> 4

<210> 5

<211> 7558

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Plásmido

<400> 5

<210> 6

<211> 7576

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Plásmido

<400> 6

<210> 7

<211> 7561

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Plásmido

<400> 7

<210> 8

<211> 6082

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Plásmido

<400> 8

<210> 9

<211> 6082

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Plásmido

<400> 9

<210> 10

<211> 6082

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Plásmido

<400> 10

<210> 11

<211> 6085

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Plásmido

<400> 11

<210> 12

<211> 6097

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Plásmido

<400> 12

<210> 13

<211> 6094

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Plásmido

<400> 13

<210> 14

<211> 481

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Incluye unión de clonación BamHI/Bg1 II, péptido señal, región V, porción de la región C, y unión de clonación 3’Xbal/Nhel (pesada) o Nhel (ligera)

<400> 14

<210> 15

<211> 142

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 15

<210> 16 <211 >463

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 16

<210> 17

<211> 127

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 17

<210> 18 10 <211 >508

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Incluye unión de clonación BamHI/Bg1 II, péptido señal, región V, porción de la región C, y unión de clonación 15 3’Xbal/Nhel (pesada) o Nhel (ligera)

<400> 18

<210> 19

<211> 143

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 19

<210> 20 <211 >463

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 20

<210> 21

<211> 127

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 21

<210> 22 <211 >490

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 22

<210> 23

<211 > 145

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 23

<210> 24 <211 >463

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 24

<210> 25

<211> 127

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 25

<210> 26 <211 >469

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 10 <220>

<400> 26

<210> 27

<211> 138

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 27

<210> 28 <211 >466

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 28

<210> 29

<211> 128

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 29

<210> 30

<211 >487 10 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

15 <400> 30

<210> 31

<211> 144

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 31

<210> 32

<211 > 478

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 32

<210> 33

<211> 132

<212> PRT

<213> Homo sapiens 10 <400> 33

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Un método in vitro para exterminar células cancerosas que expresan PSMA, resistentes a taxano, que comprende:

poner en contacto las células cancerosas que expresan PSMA, resistentes a taxano, con un conjugado de anticuerpo-fármaco en una cantidad eficaz para exterminar las células cancerosas que expresan PSMA, resistentes a taxano, en el que el conjugado de anticuerpo-fármaco comprende un anticuerpo monoclonal o su fragmento de unión a antígeno que se une específicamente al antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA) conjugado con monometilauristatin norefedrina o monometilauristatin fenilalanina, y en el que la secuencia de PSMA es la secuencia expuesta en SEC ID NO: 1.
2.

Un conjugado de anticuerpo-fármaco para tratar un sujeto que tiene un cáncer que expresa PSMA, resistente a taxano, en el que el conjugado de anticuerpo-fármaco comprende un anticuerpo monoclonal o su fragmento de unión a antígeno que se une específicamente al antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA) conjugado con monometilauristatin norefedrina o monometilauristatin fenilalanina, y en el que la secuencia de PSMA es la secuencia expuesta en SEC ID NO: 1.
3.

Un conjugado de anticuerpo-fármaco como se reivindica en la reivindicación 2, en el que la supervivencia en el sujeto aumenta en comparación con el tiempo medio de supervivencia de sujetos con cáncer que expresa PSMA, resistente a taxano, no tratado con ADC de PSMA, preferiblemente en el que la supervivencia en el sujeto aumenta en:

a) cuatro semanas; b) seis semanas; c) dos meses; d) cuatro meses; e) seis meses; f) ocho meses; g) diez meses; h) doce meses; y/o i) catorce meses.
4.

Un método como se reivindica en la reivindicación 1, en el que las células cancerosas que expresan PSMA, resistentes a taxano, son:

a) resistentes a docetaxel o paclitaxel;

b) células de cáncer de próstata o células de cáncer no de próstata, preferiblemente en el que las células de cáncer no de próstata son células de cáncer de vejiga, células de cáncer pancreático, células de cáncer hepático, células de cáncer de pulmón, células de cáncer de riñón, células de sarcoma, células de cáncer de mama, células de cáncer de cerebro, células de carcinoma neuroendocrino, células de cáncer de colon, células de cáncer testicular o células de melanoma;

c) de un tumor; y/o

d) de una metástasis.
5. Un conjugado de anticuerpo-fármaco como se reivindica en la reivindicación 2 o reivindicación 3, en el que el cáncer que expresa PSMA, resistente a taxano, es:

a) resistente a docetaxel o paclitaxel; b) cáncer de próstata o cáncer no de próstata, preferiblemente en el que el cáncer no de próstata es cáncer de vejiga, cáncer pancreático, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, cáncer de riñón, sarcoma, cáncer de mama, cáncer de cerebro, carcinoma neuroendocrino, cáncer de colon, cáncer testicular o melanoma;

c) un tumor; y/o d) mestastásico.
6.

Un método como se reivindica en la reivindicación 4 o un conjugado de anticuerpo-fármaco como se reivindica en la reivindicación 5, en el que el volumen tumoral es al menos: a) 100 mm3; b) 200 mm3; c) 300 mm3; d) 400 mm3; e) 500 mm3; f) 600 mm3; g) 700 mm3; h) 800 mm3; i) 900 mm3; j) 1000 mm3; k) 1200 mm3;

l) 1400 mm3; y/o m) 1600 mm3.
7.

Un método o un conjugado de anticuerpo-fármaco como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 4-6, en el que el volumen tumoral se reduce en al menos: a) 10%; b) 20%; c) 30%; d) 40%; e) 50%; f) 60%; g) 70%; h) 80%;

i) 90%; y/o j) 95%.
8.

Un método o un conjugado de anticuerpo-fármaco como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que el anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno se conjuga a al menos 2 ó 3 moléculas de monometilauristatin norefedrina o monometilauristatin fenilalanina, y preferiblemente a al menos 4 moléculas de monometilauristatin norefedrina o monometilauristatin fenilalanina.
9.

Un método o un conjugado de anticuerpo-fármaco como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que la monometilauristatin norefedrina o monometilauristatin fenilalanina se conjuga al anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno con un compuesto de la fórmula:

-An-Ym-Zm-Xn-Wnen el que:

A es una unidad de acilo carboxílico;

Y es un aminoácido;

Z es un aminoácido;

X y W son, cada uno, un espaciador autoinmolativo;

n es un número entero de 0 ó 1; y m es un número entero de 0 ó 1, 2, 3, 4, 5 ó 6, y preferiblemente en el que: a) A es i)

5 en la que q es 1-10; o ii) 4-(N-succinimidometil)ciclohexano-1-carbonilo, m-succinimidobenzoílo, 4-(psuccinimidofenil)-butirilo, 4-(2-acetamido)benzoílo, 3-tiopropionilo, 4-(1-tioetil)-benzoílo, 6-(3tiopropionilamido)-hexanoílo o maleimida caproílo; 10 b) Y es alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina, triptófano o prolina; y/o c) Z es lisina, lisina protegida con acetilo o formilo, arginina, arginina protegida con grupos tosilo o nitro, histidina, o nitina, o nitina protegida con acetilo o formilo, o citrulina.
10. Un método o un conjugado de anticuerpo-fármaco como se reivindica en la reivindicación 9, en el que: a) Ym-Zm es: 15 i) valina-citrulina; y/o ii) una secuencia proteínica que es escindible selectivamente por una proteasa; y/o

b) X es: i) un compuesto que tiene la fórmula:

en la que T es O, N, o S, ii) un compuesto que tiene la fórmula:

-HN-R1-COT en la que R1 es alquilo de C1-C5, T es O, N o S; iii) un compuesto que tiene la fórmula:

en la que T es O, N, o S, R2 es H o alquilo de C1-C5; iv) p-aminobencilcarbamoiloxi; v) alcohol p-aminobencílico; vi) carbamato de p-aminobencilo; vii) p-aminobenciloxicarbonilo; o viii) ácido !-aminobutírico; ácido ∀,∀-dimetil !-aminobutírico o ácido #,#-dimetil !-aminobutírico.
11. Un método o un conjugado de anticuerpo-fármaco como se reivindica en la reivindicación 9, en el que W es

en la que T es O, S o N.
12.

Un método o un conjugado de anticuerpo-fármaco como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 9-11, en el que m y n son 0.
13.

Un método o un conjugado de anticuerpo-fármaco como se reivindica en la reivindicación 9, en el que el

conjugado de anticuerpo-fármaco es: a) AB-PG1-XG1-006-maleimida caproil-valina-citrulina-p-aminobenciloxicarbonil-monometilauristatin norefedrina;

b) AB-PG1-XG1-006-maleimida caproil-valina-citrulina-p-aminobencilo carbamato de-monometilauristatin

norefedrina; c) AB-PG1-XG1-006-maleimida caproil-valina-citrulina-p-aminobenciloxicarbonil-monometilauristatin fenilalanina;

d) AB-PG1-XG1-006-maleimida carbamato de caproil-valina-citrulina-p-aminobencilo-monometilauristatin fenilalanina;

e) AB-PG1-XG1-006-maleimida caproil-monometilauristatin fenilalanina; f) AB-PG1-XG1-026-maleimida caproil-valina-citrulina-p-aminobenciloxicarbonil-monometilauristatin norefedrina;

g) AB-PG1-XG1-026-maleimida carbamato de caproil-valina-citrulina-p-aminobencilo-monometilauristatin

norefedrina; h) AB-PG1-XG1-026-maleimida caproil-valina-citrulina-p-aminobenciloxicarbonil-monometilauristatin fenilalanina;

i) AB-PG1-XG1-026-maleimida carbamato de caproil-valina-citrulina-p-aminobencilo-monometilauristatin fenilalanina; o j) AB-PG1-XG1-026-maleimida caproil-monometilauristatin fenilalanina.
14. Un método o un conjugado de anticuerpo-fármaco como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en el que el anticuerpo monoclonal o su fragmento de unión a antígeno:

a) se une específicamente a un dominio extracelular de PSMA; b) se une específicamente a un epítopo conformacional de PSMA;

c) se une a células vivas;

d) no requiere la lisis celular para unirse a PSMA; y/o

e) se une a células de la neovasculatura de un tumor.
15. Un método o conjugado de anticuerpo-fármaco como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en el que el anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno:

I) inhiben competitivamente la unión específica de un segundo anticuerpo a su epítopo diana en PSMA, en el que el segundo anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en PSMA 3.7, PSMA 3.8, PSMA 3.9, PSMA 3.11, PSMA 5.4, PSMA 7.1, PSMA 7.3, PSMA 10.3, PSMA 1.8.3, PSMA A3.1.3, PSMA A3.3.1, Abgenix 4.248.2, Abgenix 4.360.3, Abgenix 4.7.1, Abgenix 4.4.1, Abgenix 4.177.3, Abgenix 4.16.1, Abgenix 4.22.3, Abgenix 4.28.3, Abgenix 4.40.2, Abgenix 4.48.3, Abgenix 4.49.1, Abgenix 4.209.3, Abgenix 4.219.3, Abgenix 4.288.1, Abgenix 4.333.1, Abgenix 4.54.1, Abgenix 4.153.1, Abgenix 4.232.3, Abgenix 4.292.3, Abgenix 4.304.1, Abgenix 4.78.1, Abgenix 4.152.1 y anticuerpos que comprenden:

(a)

una cadena pesada codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificantes de una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en secuencias nucleotídicas expuestas como SEC ID NOs: 2-7, y

(b)

una cadena ligera codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificantes de una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en secuencias nucleotídicas expuestas como SEC ID NOs: 8-13, o

(c)

una región variable de cadena pesada codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificantes de una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en secuencias nucleotídicas expuestas como SEC ID NOs: 14, 18, 22, 26 y 30, y

d) una región variable de cadena ligera codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificantes de una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en secuencias nucleotídicas expuestas como SEC ID NOs: 16, 20, 24, 28 y 32,

preferiblemente en el que el segundo anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en AB-PG1-XG1-006, AB-PG1-XG1-026 y anticuerpos que comprenden:

(a)

una cadena pesada codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región

o regiones codificantes de una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en secuencias nucleotídicas expuestas como SEC ID NOs: 2 y 3, y

(b)

una cadena ligera codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificantes de una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en secuencias nucleotídicas expuestas como SEC ID NOs: 8 y 9, o

(c)

una región variable de cadena pesada codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificantes de una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en secuencias nucleotídicas expuestas como SEC ID NOs: 14 y 18, y

d) una región variable de cadena ligera codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificantes de una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en secuencias nucleotídicas expuestas como SEC ID NOs: 16 y 20,

y más preferiblemente en el que el segundo anticuerpo comprende:

i)

(a)

una cadena pesada codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región

o regiones codificantes de una secuencia nucleotídica expuesta como SEC ID NO: 2, y

(b)

una cadena ligera codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificantes de una secuencia nucleotídica expuesta como SEC ID NO: 8, o

(c)

una región variable de cadena pesada codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificantes de una secuencia nucleotídica expuesta como SEC ID NO: 14, y

d) una región variable de cadena ligera codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificantes de una secuencia nucleotídica expuestas como SEC ID NO: 16; y/o

ii)

(a)

una cadena pesada codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región

o regiones codificantes de una secuencia nucleotídica expuesta como SEC ID NO: 3, y

(b)

una cadena ligera codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificantes de una secuencia nucleotídica expuesta como SEC ID NO: 9, o

(c)

una región variable de cadena pesada codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificantes de la secuencia nucleotídica expuestas como SEC ID NO: 18, y

d) una región variable de cadena ligera codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificantes de la secuencia nucleotídica expuestas como SEC ID NO: 20; y/o

II) se une a un epítopo en PSMA definido por un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en PSMA 3.7, PSMA 3.8, PSMA 3.9, PSMA 3.11, PSMA 5.4, PSMA 7.1, PSMA 7.3, PSMA 10.3, PSMA 1.8.3, PSMA A3.1.3, PSMA A3.3.1, Abgenix 4.248.2, Abgenix 4.360.3, Abgenix 4.7.1, Abgenix 4.4.1, Abgenix 4.177.3, Abgenix 4.16.1, Abgenix 4.22.3, Abgenix 4.28.3, Abgenix 4.40.2, Abgenix 4.48.3, Abgenix 4.49.1, Abgenix 4.209.3, Abgenix 4.219.3, Abgenix 4.288.1, Abgenix 4.333.1, Abgenix 4.54.1, Abgenix 4.153.1, Abgenix 4.232.3, Abgenix 4.292.3, Abgenix 4.304.1, Abgenix 4.78.1, Abgenix 4.152.1 y anticuerpos que comprenden:

(a)

una cadena pesada codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificantes de una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en secuencias nucleotídicas expuestas como SEC ID NOs: 2-7, y

(b)

una cadena ligera codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificantes de una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en secuencias nucleotídicas expuestas como SEC ID NOs: 8-13, o

(c)

una región variable de cadena pesada codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificantes de una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en secuencias nucleotídicas expuestas como SEC ID NOs: 14, 18, 22, 26 y 30, y

d) una región variable de cadena ligera codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificantes de una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en secuencias nucleotídicas expuestas como SEC ID NOs: 16, 20, 24, 28 y 32.
16. Un método o un conjugado de anticuerpo-fármaco como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en el que el anticuerpo es codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica que es al menos 90% idéntica a una secuencia nucleotídica que codifica un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en: AB-PG1-XG1-006, AB-PG1-XG1-026 y anticuerpos que comprenden:

(a)

una cadena pesada codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificantes de una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en secuencias nucleotídicas expuestas como SEC ID NOs: 2 y 3, y

(b)

una cadena ligera codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificantes de una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en secuencias nucleotídicas expuestas como SEC ID NOs: 8 y 9, o

(c)

una región variable de cadena pesada codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificantes de una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en secuencias nucleotídicas expuestas como SEC ID NOs: 14 y 18, y

d) una región variable de cadena ligera codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificantes de una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en secuencias nucleotídicas expuestas como SEC ID NOs: 16 y 20,

preferiblemente en el que el anticuerpo es codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica que es al menos:

i) 95%;

ii) 97%;

iii) 98%; y/o

iv) 99% idéntica.
17. Un método o un conjugado de anticuerpo-fármaco como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en el que el anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno:

I) es AB-PG1-XG1-006, AB-PG1-XG1-026 o su fragmento de unión a antígeno; y/o

II) se selecciona del grupo que consiste en anticuerpos que comprenden:

a) una cadena pesada codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificantes de una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en secuencias nucleotídicas expuestas como SEC ID NOs: 2 y 3, y

b) una cadena ligera codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificantes de una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en secuencias nucleotídicas expuestas como SEC ID NOs: 8 y 9, o

c) una región variable de cadena pesada codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificantes de una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en secuencias nucleotídicas expuestas como SEC ID NOs: 14 y 18, y

d) una región variable de cadena ligera codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificantes de una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en secuencias nucleotídicas expuestas como SEC ID NOs: 16 y 20, y

sus fragmentos de unión a antígeno,

preferiblemente en el que el anticuerpo o su fragmento de unión a antígeno comprende:

i)

(a)

una cadena pesada codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificantes de una secuencia nucleotídica expuesta como SEC ID NO: 2, y

(b)

una cadena ligera codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificantes de una secuencia nucleotídica expuesta como SEC ID NO: 8, o

(c)

una región variable de cadena pesada codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificantes de una secuencia nucleotídica expuesta como SEC ID NO: 14, y

(d)

una región variable de cadena ligera codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificantes de una secuencia nucleotídica expuesta como SEC ID NO: 16, y

sus fragmentos de unión a antígeno; y/o

ii)

(a)

una cadena pesada codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificantes de una secuencia nucleotídica expuesta como SEC ID NO: 3, y

(b)

una cadena ligera codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificantes de una secuencia nucleotídica expuesta como SEC ID NO: 9, o

(c)

una región variable de cadena pesada codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificantes de la secuencia nucleotídica expuesta como SEC ID NO: 18, y

(d)

una región variable de cadena ligera codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificantes de la secuencia nucleotídica expuesta como SEC ID NO: 20, y

sus fragmentos de unión a antígeno.
18.

Un conjugado de fármaco-anticuerpo de antígeno de membrana específico de próstata (ADC de PSMA) para tratar un sujeto que tiene un cáncer de próstata metastásico progresivo, resistente a la castración, que ha progresado tras una terapia previa con taxano, en el que el ADC de PSMA consiste esencialmente en un anticuerpo monoclonal humano contra PSMA conjugado a monometilaurastatin norefedrina (MMAE) vía un ligador de valinacitrulina, y está en una cantidad suficiente para 1) retrasar o inhibir la progresión del cáncer, 2) incrementar la supervivencia del sujeto en comparación con la supervivencia media de sujetos no tratados con el ADC de PSMA y que tienen cáncer de próstata metastásico progresivo, resistente a la castración, que ha progresado tras una terapia previa con taxano, 3) disminuir un nivel circulante de células tumorales circulantes (CTCs) en comparación con un nivel de línea base, o 4) disminuir o estabilizar un nivel sérico de PSA en comparación con un nivel de línea base de PSA.
19.

Un ADC de PSMA como se reivindica en la reivindicación 18, en el que:

i) el taxano es docetaxel;

ii) el anticuerpo humano es una IgG1 que comprende (a) una cadena pesada codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificantes de una secuencia nucleotídica expuesta como SEC ID NO: 2, y (b) una cadena ligera codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificantes de una secuencia nucleotídica expuesta como SEC ID NO: 8;

iii) el retraso o inhibición de la progresión del cáncer se demuestra mediante cambios en la imagen radiográfica en la carga tumoral en comparación con una imagen radiográfica inicial en el sujeto antes de la administración del ADC de PSMA, preferiblemente en el que el cambio en la imagen radiográfica es un cambio de al menos:

a) 10%;

b) 20%;

c) 30%;

d) 40%;

e) 50%; y/o

f) 60%; y/o

iv) el retraso o inhibición de la progresión del cáncer se demuestra mediante un cambio en al menos un biomarcador para metástasis ósea y metabolismo óseo en comparación con un valor de línea base antes de la administración del ADC de PSMA, preferiblemente en el que el biomarcador es N-telopéptido, fosfatasa alcalina ósea, osteocalcina, calcitonina, calcio, piridinolina o desoxipiridinolina.
20.

Un conjugado de anticuerpo-fármaco que comprende un anticuerpo, o su fragmento de unión a antígeno, que se une específicamente a PSMA, conjugado a un derivado de dolastatina 10, para uso en un método para tratar un cáncer que expresa PSMA, resistente a taxano.
21.

Un conjugado de anticuerpo-fármaco como se reivindica en la reivindicación 20, en el que:

a) el método implica exterminar células cancerosas que expresan PSMA, resistentes a taxano, en el que, preferiblemente, las células cancerosas que expresan PSMA, resistentes a taxano, se exterminan mediante el conjugado;

b) el PSMA tiene la secuencia expuesta en SEC ID NO: 1;

c) el cáncer es cáncer de próstata metastásico progresivo, resistente a la castración, que ha progresado tras una terapia previa con taxano;

d) el derivado de dolastatina 10 es una auristatina; y/o

e) la dolastatina es MMAE (monometilauristatina E o monometilauristatin norefedrina) o MMAF (monometilauristatina F o monometilauristatin fenilalanina).

ESTIRPES CELULARES

MFI1 IC50 (nM) POTENCIA (nM)2 SELECTIVIDAD3

POSITIVA A PSMA

C4-2 (PRÓSTATA)

88 ± 50 (n = 2) 0,10 ± 0,01 (n = 3)

0,26 ± 0,20

1,131

LNCaP (PRÓSTATA)

140 (n= 1) 0,20 ± 0,07 (n = 3)

3T3-PSMA (FIBROBLASTO)

314 ± 53 (n = 2) 0,49 + 0,20 (n = 3)

NEGATIVA A PSMA

RAMOS (LINFOCITO B)

10,6 ± 10,4 (n = 2) 46 ± 13 (n = 2)

IMR-90 (FIBROBLASTO

1,9 ± 0,6 (n = 2) 62 ± 55 (n = 3)

PULMONAR)

PC-3 (PRÓSTATA)

6,6 ± 6,1 (n = 2) 74 ± 10 (n = 3)

Hep 3B (HÍGADO)

5,5 (n = 1) 113 ± 87 (n = 3) 299 ± 355 1,131

HeLa (CUELLO UTERINO)

3,3 ± 1,2 (n = 2) 173 ± 61 (n = 3)

MCF7 (MAMA)

2,2 (n = 1) 192 ± 87 (n = 3)

3T3 (FIBROBLASTO)

10,2 ± 8,7 (n = 2) 822 ± 151 (n = 3)

Caco-2 (COLON)

8,4 ± 2,5 (n = 2) 912 (n = 1)

1 INTENSIDAD MEDIA DE FLUORESCENCIA DE LA TINCIÓN DE PSMA MEDIANTE CITOMETRÍA DE FLUJO

2 MEDIA DE IC50s (CONCENTRACIÓN REQUIRIDA PARA EXTERMINAR EL 50% DE LAS CÉLULAS) DE TODAS LAS ESTIRPES CELULARES POSITIVAS A PSMA O NEGATIVAS A PSMA

3 LAS SELECTIVIDAD ES IGUAL A LA RELACIÓN DE POTENCIAS DETERMINADA PARA LAS ESTIRPES CELULARES NEGATIVAS A PSMA O POSITIVAS A PSMA

Fig.6