PT1912677E - Conjugados de anticorpos contra psma-fármaco - Google Patents

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PT1912677E
PT1912677E PT67852830T PT06785283T PT1912677E PT 1912677 E PT1912677 E PT 1912677E PT 67852830 T PT67852830 T PT 67852830T PT 06785283 T PT06785283 T PT 06785283T PT 1912677 E PT1912677 E PT 1912677E
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PT
Portugal
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psma
drug conjugate
antigen
cell
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PT67852830T
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William C Olson
Paul J Maddon
Peter D Senter
Dangshe Ma
Svetlana O Doronina
Brian E Toki
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Psma Dev Company L L C
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Description

1
DESCRIÇÃO "CONJUGADOS DE ANTICORPOS CONTRA PSMA-FÁRMACO"
Campo da Invenção
Esta invenção refere-se, em geral, a conjugados anticorpo-fármaco (ADCs). Em particular, a invenção refere-se a ADCs que compreendem um anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio que se liga ao antigénio de membrana especifico da próstata (PSMA) e está conjugado com monometilauristatina norefedrina (MMAE) ou monometilauristatina fenilalanina (MMAF). 0 conjugado anticorpo-fármaco tem uma seletividade para as células PC-3™ relativamente às células C4-2 ou LNCaP™ de pelo menos 250. A invenção refere-se também, em parte, a composições do ADCs. Os métodos proporcionados incluem, por exemplo, métodos de tratamento de uma doença mediada por PSMA.
Antecedentes da Invenção O cancro da próstata é a malignidade mais comum e a segunda principal causa de morte por cancro em homens nos Estados Unidos (Jemal A, et al., CA Câncer J Clin 2005;55:10-30). O cancro da próstata localizado é tipicamente tratado com cirurgia ou radiação, e a doença recorrente pode ser controlada temporariamente com ablação de androgénios (Klein EA, et al., Urol Clin North Am 2003;30:315-30). No entanto, a maior parte de todos os carcinomas da próstata tornam-se eventualmente refratários a hormonas e, em seguida, progridem rapidamente (Denmeade SR, et al., Nat Rev Câncer 2002;2:389-96). 0 cancro da próstata refratário a hormonas ou independente de androgénios tem provado ser muito resistente a quimioterapia convencional. À exceção 2 dos cuidados paliativos, a única quimioterapia aprovada é o docetaxel em associação com prednisona, a qual oferece um beneficio de sobrevivência modesto (2,4 meses) (Gulley J, et al., Am J Ther. 2004; 351:1513-20; Petrilak DP, et al., New Engl J Med 2 0 04; 351:1513-2 0). São necessárias novas terapias direcionadas molecularmente.
Sumário da Invenção A invenção aqui proporcionada refere-se a ADCs que exibem seletividade particularmente alta. Num aspeto da invenção é proporcionado um conjugado anticorpo-fármaco que compreende um anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio que se liga a PSMA e está conjugado com monometilauristatina norefedrina ou monometilauristatina fenilalanina, em que o conjugado anticorpo-fármaco tem uma seletividade para as células PC-3™ relativamente às células C4-2 ou LNCaP™ de pelo menos 250, e 3 ou 4 moléculas de monometilauristatina norefedrina ou monometilauristatina fenilalanina estão conjugadas no anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio. Numa forma de realização, a seletividade é, pelo menos, de 500, 1000, 2500, 6000 ou 13 000. Noutra forma de realização, a seletividade é de 1567, 6286 ou 13 636.
Nalgumas formas de realização são aqui proporcionados exemplos de anticorpos que podem ser utilizados nas composições e métodos da invenção. Noutra forma de realização, o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio é um anticorpo monoclonal ou seu fragmento de ligação a antigénio que liga especificamente PSMA. Ainda noutra forma de realização, o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio é um anticorpo monoclonal ou seu fragmento de ligação a antigénio que liga especificamente um domínio extracelular de PSMA. Numa outra forma de 3 realização, o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio é um anticorpo monoclonal ou seu fragmento de ligação a antigénio que se liga especificamente a um epitopo conformacional de PSMA.
Nalgumas formas de realização, o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio (i) inibe competitivamente a ligação especifica de um segundo anticorpo ao seu epitopo alvo no PSMA, ou (ii) liga-se a um epitopo no PSMA definido por um anticorpo selecionado do grupo consistindo de PSMA 3.7, PSMA 3.8, PSMA 3.9, PSMA 3.11, PSMA 5.4, PSMA 7.1, PSMA 7.3, PSMA 10.3, PSMA 1.8.3, PSMA A3.1.3, PSMA A3.3.1, Abgenix 4.248.2, Abgenix 4.360.3, Abgenix 4.7.1, Abgenix 4.4.1, Abgenix 4.177.3, Abgenix 4.16.1, Abgenix 4.22.3, Abgenix 4.28.3, Abgenix 4.40.2, Abgenix 4.48.3, Abgenix 4.49.1, Abgenix 4.209.3, Abgenix 4.219.3, Abgenix 4.288.1, Abgenix 4.333.1, Abgenix 4.54.1, Abgenix 4.153.1, Abgenix 4.232.3, Abgenix 4.292.3, Abgenix 4.304.1, Abgenix 4.78.1 e Abgenix 4.152.1. Noutras formas de realização, o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio liga-se a um epitopo no PSMA definido por um anticorpo selecionado do grupo consistindo de anticorpos compreendendo (a) uma cadeia pesada codificada por uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma região ou regiões de codificação de uma sequência de nucleótidos selecionada do grupo consistindo das sequências de nucleótidos definidas como SEQ ID NOs: 2-7, e (b) uma cadeia leve codificada por uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma região ou regiões de codificação de uma sequência de nucleótidos selecionada do
grupo consistindo das como SEQ ID NOs: 8-13. sequências de nucleótidos definidas Nalgumas formas de realização, 0 segundo anticorpo é selecionado do grupo consistindo de PSMA 3.7, PSMA 3.8, PSMA 3.9, PSMA 3.11, PSMA 5.4, PSMA 7.1, PSMA 7.3, PSMA 4 10.3, PSMA 1.8.3, PSMA A3.1.3, PSMA A3.3.1, Abgenix 4.248.2, Abgenix 4.360.3, Abgenix 4.7.1, Abgenix 4.4.1, Abgenix 4.177.3, Abgenix 4.16.1, Abgenix 4.22.3, Abgenix 4.28.3, Abgenix 4.40.2, Abgenix 4.48.3, Abgenix 4.49.1, Abgenix 4.209.3, Abgenix 4.219.3, Abgenix 4.288.1, Abgenix 4.333.1, Abgenix 4.54.1, Abgenix 4.153.1, Abgenix 4.232.3, Abgenix 4.292.3, Abgenix 4.304.1, Abgenix 4.78.1, Abgenix 4.152.1 e anticorpos compreendendo (a) uma cadeia pesada codificada por uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma região ou regiões de codificação de uma sequência de nucleótidos selecionada do grupo consistindo das sequências de nucleótidos definidas como SEQ ID NOs: 2-7, e (b) uma cadeia leve codificada por uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma região ou regiões de codificação de uma sequência de nucleótidos selecionada do grupo consistindo das sequências de nucleótidos definidas como SEQ ID NOs: 8-13.
Noutras formas de realização, o segundo anticorpo é selecionado do grupo consistindo de AB-PG1-XG1-006, AB-PG1-XG1-026 e anticorpos compreendendo (a) uma cadeia pesada codificada por uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma região ou regiões de codificação de uma sequência de nucleótidos selecionada do grupo consistindo das sequências de nucleótidos definidas como SEQ ID NOs: 2 e 3, e (b) uma cadeia leve codificada por uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma região ou regiões de codificação de uma sequência de nucleótidos selecionada do grupo consistindo das sequências de nucleótidos definidas como SEQ ID NOs: 8 e 9. Numa forma de realização, o segundo anticorpo compreende (a) uma cadeia pesada codificada por uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma região ou regiões de codificação de uma sequência de nucleótidos definida como SEQ ID NO: 2, e (b) uma cadeia leve codificada por uma molécula de ácido nucleico compreendendo 5 uma região ou regiões de codificação de uma sequência de nucleótidos definida como SEQ ID NO: 8. Numa outra forma de realização, o segundo anticorpo compreende (a) uma cadeia pesada codificada por uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma região ou regiões de codificação de uma sequência de nucleótidos definida como SEQ ID NO: 3, e (b) uma cadeia leve codificada por uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma região ou regiões de codificação de uma sequência de nucleótidos definida como SEQ ID NO: 9.
Nalgumas formas de realização, o anticorpo do conjugado anticorpo-fármaco é um anticorpo codificado por uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleótidos que é pelo menos 90% idêntica a uma sequência de nucleótidos que codifica um anticorpo selecionado do grupo consistindo de AB-PG1-XG1-006, AB-PG1-XG1-026 e anticorpos compreendendo (a) uma cadeia pesada codificada por uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma região ou regiões de codificação de uma sequência de nucleótidos selecionada do grupo consistindo das sequências de nucleótidos definidas como SEQ ID NOs: 2 e 3, e (b) uma cadeia leve codificada por uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma região ou regiões de codificação de uma sequência de nucleótidos selecionada do grupo consistindo das sequências de nucleótidos definidas como SEQ ID NOs: 8 e 9. Numa forma de realização, o anticorpo é codificado por uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleótidos que é pelo menos 95% idêntica. Noutra forma de realização, o anticorpo é codificado por uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleótidos que é pelo menos 97% idêntica. Ainda noutra forma de realização, o anticorpo é codificado por uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleótidos que é pelo menos 98% idêntica. Numa outra forma de realização, o anticorpo é codificado por uma molécula de 6 ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleótidos que é pelo menos 99% idêntica.
Noutras formas de realização, o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio dos conjugados anticorpo-fármaco aqui proporcionados é AB-PG1-XG1-006, AB-PG1-XG1-026 ou um seu fragmento de ligação a antigénio. Ainda noutras formas de realização, o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio é selecionado do grupo consistindo de anticorpos compreendendo (a) uma cadeia pesada codificada por uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma região ou regiões de codificação de uma sequência de nucleótidos selecionada do grupo consistindo das sequências de nucleótidos definidas como SEQ ID NOs: 2 e 3, e (b) uma cadeia leve codificada por uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma região ou regiões de codificação de uma sequência de nucleótidos selecionada do grupo consistindo das sequências de nucleótidos definidas como SEQ ID NOs: 8 e 9, e seus fragmentos de ligação a antigénio. Numa forma de realização, o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio compreende (a) uma cadeia pesada codificada por uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma região ou regiões de codificação de uma sequência de nucleótidos definida como SEQ ID NO: 2, e (b) uma cadeia leve codificada por uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma região ou regiões de codificação de uma sequência de nucleótidos definida como SEQ ID NO: 8, e seus fragmentos de ligação a antigénio. Noutra forma de realização, o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio compreende (a) uma cadeia pesada codificada por uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma região ou regiões de codificação de uma sequência de nucleótidos definida como SEQ ID NO: 3, e (b) uma cadeia leve codificada por uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma região ou regiões de codificação de uma sequência de 7 nucleótidos definida como SEQ ID NO: 9, e seus fragmentos de ligação a antigénio.
Nalgumas formas de realização, o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio é IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgAl, IgA2, IgAsec, IgD, IgE ou tem o dominio constante e/ou variável de imunoglobulina de IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgAl, IgA2, IgAsec, IgD ou IgE.
Noutras formas de realização, o anticorpo é um anticorpo monoclonal. Ainda noutras formas de realização, o anticorpo é um anticorpo humanizado. Ainda noutras formas de realização, o anticorpo é um anticorpo humano. Ainda noutras formas de realização, o anticorpo é um anticorpo recombinante. Noutras formas de realização, o anticorpo é um anticorpo quimérico. Ainda noutras formas de realização, o anticorpo é um anticorpo biespecífico ou multiespecifico. Ainda noutras formas de realização, o anticorpo é um anticorpo de cadeia simples.
Noutras formas de realização, o fragmento de ligação a antigénio é um fragmento Fab, um fragmento F(ab')2 ou um fragmento Fv. Ainda noutras formas de realização, o fragmento de ligação a antigénio é um fragmento contendo CDR3.
Nalgumas formas de realização, a monometilauristatina norefedrina (MMAE) ou monometilauristatina fenilalanina (MMAF) está conjugada com o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio com um composto da fórmula (Fórmula 1) -An-Ym-Zm-Xn-Wn-, em que A é uma unidade de acilo carboxilico; Y é um aminoácido; Z é um aminoácido; X e W são, cada, um espaçador auto-imolador; n é um número inteiro de 0 ou 1; e m é um número inteiro de 0 ou 1, 2, 3, 8 4, 5 ou 6. Nalgumas formas de realização, o conjugado da presente invenção é representado pela fórmula (Fórmula 2): L-{An-Ym-Zm-Xn-Wn-D}p em que L é um anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio que liga PSMA, D é MMAE ou MMAF e p é um número inteiro de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8. As restantes componentes do conjugado são como definidas imediatamente acima.
Numa forma de realização, a unidade carboxilica "An" está ligada ao anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio através de um átomo de enxofre proveniente do anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio:
L-S
Numa forma de realização, A é
O em que q é 1-10. Por conseguinte, numa forma de realização, o conjugado de Fórmula 2 é: L-S.
,0
N-(CHj^CO--Zm-Xn Wn D
O 9 em que L, Y, Z, X, W, D, n, m, q e p são como anteriormente definidos.
Noutra forma de realização, A é 4-(N- succinimidometil)ciclo-hexano-l-carbonilo, m- succinimidobenzoilo, 4-(p-succinimidofenil)-butirilo, 4-(2-acetamido)benzoilo, 3-tiopropionilo, 4-(1-tioetil)- benzoilo, 6-(3-tiopropionilamido)-hexanoilo ou maleimido-caproilo. Numa outra forma de realização, A é maleimido-caproilo.
Noutra forma de realização, Y é alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina, triptofano ou prolina. Ainda noutra forma de realização, Y é valina. Numa outra forma de realização, Z é lisina, lisina protegida com acetilo ou formilo, arginina, arginina protegida com grupos tosilo ou nitro, histidina, ornitina, ornitina protegida com acetilo ou formilo, ou citrulina. Ainda numa outra forma de realização, Z é citrulina. Numa forma de realização Ym-Zm é valina-citrulina. Noutra forma de realização, Ym-Zm é uma sequência proteica que pode ser dissociada seletivamente por uma protease.
Numa outra forma de realização; X é um composto possuindo a fórmula
em que T é 0, N ou S. Noutra forma de realização, X é um composto possuindo a fórmula -HN-R1-C0T em que R1 é alquilo 10 C1-C5, T é Ο, Ν ou S. Numa outra forma de realização, X é um composto possuindo a fórmula
-N' H SCOOR2 em que T é O, N, ou S, R2 é H ou alquilo C1-C5. Numa forma de realização, X é p-aminobenzilcarbamoiloxilo. Noutra forma de realização, X é álcool p-aminobenzilico. Numa outra forma de realização, X é p-aminobenzilcarbamato. Ainda numa outra forma de realização, X é p-aminobenziloxicarbonilo. Noutra forma de realização, X é ácido γ-aminobutirico; ácido a,a-dimetil-y-aminobutirico ou ácido β,β-dimetil-γ-aminobutirico.
Nalgumas formas de realização, W é
em que T é 0, S ou N.
Noutras formas de realização, m e n são 0.
Numa forma de realização, o conjugado anticorpo-fármaco é AB-PG1-XG1-0 0 6-maleimido-caproil-valina-citrulina-p-aminobenziloxicarbonil-monometilauristatina norefedrina. Noutra forma de realização, o conjugado anticorpo-fármaco é AB-PG1-XG1-0 0 6-maleimido-caproil-valina-citrulina-p- 11 aminobenziloxicarbonil-monometilauristatina fenilalanina. Numa outra forma de realização, o conjugado anticorpo-fármaco é AB-PGl-XGl-006-maleimido-caproil- monometilauristatina fenilalanina. Noutra forma de realização, o conjugado anticorpo-fármaco é AB-PG1-XG1-026-maleimido-caproil-valina-citrulina-p- aminobenziloxicarbonil-monometilauristatina norefedrina. Ainda noutra forma de realização, o conjugado anticorpo-fármaco é AB-PG1-XG1-026-maleimido-caproil-valina- citrulina-p-aminobenziloxicarbonil-monometilauristatina fenilalanina. Numa outra forma de realização, o conjugado anticorpo-fármaco é AB-PGl-XGl-026-maleimido-caproil- monometilauristatina fenilalanina. Noutra forma de realização, o conjugado anticorpo-fármaco é um anticorpo de ligação a PSMA ou seu fragmento de ligação a antigénio conjugado com o composto como se mostra na Figura 6A, Figura 6B ou Figura 6C.
Nalgumas formas de realização, o conjugado anticorpo-fármaco liga células vivas. Numa forma de realização, a célula é uma célula tumoral. Noutra forma de realização, a célula tumoral é uma célula tumoral da próstata. Numa outra forma de realização, a célula tumoral é uma célula da neovasculatura de um tumor não prostático. Noutras formas de realização, o conjugado anticorpo-fármaco não requer lise celular para ligar o PSMA. Ainda noutras formas de realização, o conjugado anticorpo-fármaco leva à paragem do ciclo celular. Ainda noutras formas de realização, o conjugado anticorpo-fármaco inibe o crescimento de células que expressam PSMA. Numa forma de realização, o conjugado anticorpo-fármaco medeia a morte celular especifica de células que expressam PSMA com uma IC50 inferior a lxlO”10M. Noutra forma de realização, a IC50 é inferior a lxlO_11M. Ainda noutra forma de realização, a IC50 é inferior a _ 12 12 1x10 M. Numa outra forma de realização, o conjugado anticorpo-fármaco medeia a morte celular especifica de células que expressam PSMA com uma IC50 de 11 a 208 xlO”12M. Ainda numa outra forma de realização, o conjugado anticorpo-fármaco medeia a morte celular especifica de células que expressam PSMA com uma IC50 de 42 a 208 xlO~12M. Ainda numa outra forma de realização, o conjugado anticorpo-fármaco medeia a morte celular especifica de células que expressam PSMA com uma IC50 de 60 a 208 xlO“12M. Noutra forma de realização, o conjugado anticorpo-fármaco medeia a morte celular especifica de células que expressam PSMA com uma IC50 de 65 a 208 xl0”12M. Numa forma de realização, o conjugado anticorpo-fármaco medeia a morte celular específica de células que expressam PSMA com uma IC50 de 11 x10”12M. Noutra forma de realização, o conjugado anticorpo-fármaco medeia a morte celular especifica de células que expressam PSMA com uma IC50 de 42 xlO~12M. Ainda noutra forma de realização, o conjugado anticorpo-fármaco medeia a morte celular específica de células que expressam PSMA com uma IC50 de 60 x10~12M. Numa outra forma de realização, o conjugado anticorpo-fármaco medeia a morte celular específica de células que expressam PSMA com uma IC50 de 83 x10-12M.
Noutra forma de realização, o conjugado anticorpo-fármaco, quando administrado a ratos com um regimen de q4d x 6 a uma dose de 6 mg/kg efetua uma taxa de cura de pelo menos 20%, 30%, 40% ou 50%. Numa forma de realização, a taxa de cura é de 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou mais. Numa forma de realização, os ratos são aqueles que são um modelo de cancro da próstata humano independente de androgénios. Noutra forma de realização, os ratos são ratos glabros enxertados com células C4-2 por via intramuscular na pata 13 posterior esquerda. Numa outra forma de realização, os ratos são aqueles como proporcionados nos Exemplos.
Nalgumas formas de realização, o conjugado anticorpo-fármaco é ligado a uma etiqueta. Noutras formas de realização, a etiqueta é uma etiqueta fluorescente, uma etiqueta enzimática, uma etiqueta radioativa, uma etiqueta ativa em ressonância magnética nuclear, uma etiqueta luminescente ou uma etiqueta cromófora.
Nalgumas formas de realização, o conjugado anticorpo-fármaco é embalado na forma liofilizada. Noutras formas de realização, o conjugado anticorpo-fármaco é embalado num meio aquoso. Noutras formas de realização, o conjugado anticorpo-fármaco está numa forma estéril. São também aqui proporcionadas composições compreendendo um ou mais conjugados anticorpo-fármaco. Nalgumas formas de realização, a composição compreende dois ou mais conjugados anticorpo-fármaco diferentes. Noutras formas de realização, é proporcionada uma composição compreendendo um ou mais conjugados anticorpo-fármaco e um ou mais anticorpos anti-PSMA não conjugados.
Nalgumas formas de realização, a composição compreende ainda um veiculo, excipiente ou estabilizante farmaceuticamente aceitável. Noutras formas de realização, a composição compreende ainda um agente antitumoral, um agente imunoestimulador, um imunomodulador, um corticosteroide ou uma associação dos mesmos. Numa forma de realização, o agente antitumoral é um agente citotóxico, um agente que atua na neovasculatura do tumor ou uma associação dos mesmos. Noutra forma de realização, o agente antitumoral é docetaxel. Ainda noutra forma de realização, 14 o imunomodulador é uma citocina, quimiocina, adjuvante ou uma associação dos mesmos. Ainda noutra forma de realização, o agente imunoestimulador é interleucina-2, interferão cx, interferão γ, fator de necrose tumoral-a, oligonucleótidos imunoestimuladores ou uma associação dos mesmos. Numa outra forma de realização, o corticosteroide é prednisona ou hidrocortisona. Ainda numa outra forma de realização, a composição compreende prednisona e docetaxel.
Os conjugados anticorpo-fármaco e composições da invenção podem ser utilizados numa variedade de métodos. Numa forma de realização, o conjugado anticorpo-fármaco é para ser utilizado num método de inibição do crescimento de um célula que expressa PSMA compreendendo pôr em contacto a célula que expressa PSMA com uma quantidade de um conjugado anticorpo-fármaco eficaz para inibir o crescimento da célula que expressa PSMA. Noutra forma de realização, o conjugado anticorpo-fármaco é para ser utilizado num método para efetuar a paragem do ciclo celular numa célula que expressa PSMA compreendendo pôr em contacto a célula que expressa PSMA com uma quantidade de um conjugado anticorpo-fármaco eficaz para levar à paragem do ciclo celular na célula que expressa PSMA. Ainda noutra forma de realização, o conjugado anticorpo-fármaco é para ser utilizado num método de tratamento de uma doença mediada por PSMA compreendendo administrar a um indivíduo possuindo uma doença mediada por PSMA uma quantidade de um conjugado anticorpo-fármaco eficaz para tratar a doença mediada por PSMA. Numa outra forma de realização, o conjugado anticorpo-fármaco é para ser utilizado num método para inibir o crescimento de um tumor compreendendo pôr em contacto células que expressam PSMA da neovasculatura do tumor com uma quantidade de um conjugado anticorpo-fármaco eficaz para inibir o crescimento do tumor. 15
Numa forma de realização, a doença mediada por PSMA é cancro. Noutra forma de realização, o cancro é um cancro da próstata. Ainda noutra forma de realização, o cancro é um cancro não prostático. Nalgumas formas de realização, o cancro não prostático é cancro da bexiga, cancro pancreático, cancro do pulmão, cancro do rim, sarcoma, cancro da mama, cancro do cérebro, carcinoma neuroendócrino, cancro do cólon, cancro testicular ou melanoma.
Nalgumas formas de realização, o método compreende ainda coadministrar outro agente terapêutico para tratar a doença mediada por PSMA. Noutras formas de realização, o método compreende ainda pôr em contacto as células que expressam PSMA com outro agente terapêutico. Nalgumas formas de realização, o outro agente terapêutico é para ser administrado antes, durante ou após a administração do conjugado anticorpo-fármaco. Numa forma de realização, o outro agente terapêutico é um agente antitumoral, um agente imunoestimulador, um imunomodulador, um corticosteroide ou uma associação dos mesmos. Noutra forma de realização, o agente antitumoral é um agente citotóxico, um agente que atua na neovasculatura do tumor ou uma associação dos mesmos. Ainda noutra forma de realização, o agente antitumoral é docetaxel. Ainda noutra forma de realização, o imunomodulador é uma citocina, quimiocinas, adjuvante ou uma associação dos mesmos. Ainda noutra forma de realização, o agente imunoestimulador é interleucina-2, interferão a, interferão γ, fator de necrose tumoral-a, oligonucleótidos imunoestimuladores ou uma associação dos mesmos. Numa outra forma de realização, o corticosteroide é prednisona ou hidrocortisona. Numa forma de realização, o agente terapêutico é uma vacina. Noutra forma de realização, a vacina imuniza o indivíduo contra PSMA. 16
Noutra forma de realização, o método compreende ainda administrar ainda outro agente terapêutico. Numa forma de realização, o ainda outro agente terapêutico é prednisona. Por conseguinte, numa forma de realização são administrados ambos docetaxel e prednisona. A célula que expressa PSMA é, nalgumas formas de realização, um célula tumoral da próstata ou uma célula da neovasculatura de um tumor não prostático. Nalgumas formas de realização, a célula que expressa PSMA é uma célula dependente de androgénios ou uma célula independente de androgénios.
Cada uma das limitações da invenção pode abranger várias formas de realização da invenção. Por conseguinte, antecipa-se que cada uma das limitações da invenção envolvendo qualquer elemento ou associações de elementos pode ser incluida em cada aspeto da invenção.
Breve Descrição das Figuras A Figura 1 é um gráfico que mostra a percentagem de interiorização e ligação total de mAb contra PSMA marcado com inIn nas células C4-2. As células C4-2 foram incubadas com mAb marcado com mIn a 37 °C, 5% de CO2. Nas alturas designadas, as células foram lavadas para remover mAb não ligado e o mAb ligado na superfície foi retirado utilizando tampão a pH baixo. A radioatividade (contagens por minuto (CPM)) do eluato de pH baixo e o sedimento celular foram contados separadamente utilizando uma contador gama. A percentagem de interiorização (Figura IA) foi calculada como a CPM do sedimento celular/(CPM do sedimento celular + CPM do eluato de pH baixo) x 100. A ligação total (Figura 17 1Β) representa as CPM do sedimento celular mais as CPM do eluato de pH baixo. A Figura 2 é um gráfico que mostra a ligação do mAb contra PSMA e ADC a células 3T3™-PSMA. As células 3T3™-PSMA foram incubadas com concentrações crescentes do mAb contra PSMA (quadrados a cheio), ADC contra PSMA (quadrados abertos) ou ADC de controlo de isotipo (triângulos abertos). As células foram incubadas sobre gelo durante lh e lavadas para remover o mAb ou ADC não ligado. As células foram em seguida incubadas com IgG anti-humana de cabra-FITC, lavadas novamente e examinadas por citometria de fluxo. As intensidades de fluorescência médias (MFIs) são representadas graficamente como uma função da concentração de mAb ou ADC. A Figura 3 é um gráfico que mostra a citotoxicidade in vitro do ADC contra PSMA e ADC de controlo sobre linhas de células de cancro da próstata positivas para PSMA e negativas para PSMA. Células C4-2 positivas para PSMA (Figura 3A) e células PC-3™ negativas para PSMA (Figura 3B) em microplacas de 96 poços foram expostas a ADCs a várias concentrações. Após 96 horas, a sobrevivência celular em culturas tratadas e não tratadas foram analisadas utilizando Azul de Alamar. A Figura 4 é um gráfico que mostra a sobrevivência de Kaplan-Meier e niveis de PSA no soro num estudo de xenoenxerto. Ratos glabros foram implantados por via intramuscular com células C4-2, distribuídos aleatoriamente por grupos de tratamento (6 ratos por grupo) de acordo com o PSA no soro no dia 17 e, em seguida, tratados q4d x 3 com ADC contra PSMA ou veiculo. A Figura 4A mostra a sobrevivência de animais tratados com 0 (controlo de 18 veículo, linha a tracejado), 2 mg/kg (linha sólida fina) e 10 mg/kg de ADC contra PSMA. A Figura 4B proporciona os valores de PSA médios ao longo de 30 dias em ratos tratados com 0 (colunas a cheio), 2 mg/kg (colunas listradas) e 10 mg/kg (colunas abertas) de ADC contra PSMA. Os dados do dia 30 para o grupo de controlo incluem avaliações do dia 27 para dois ratos que não sobreviveram 30 dias. A Figura 5 mostra as curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier de animais tratados noutro estudo de xenoenxerto. Ratos glabros foram implantadas por via intramuscular com células C4-2, distribuídos aleatoriamente por grupos de tratamento (5 ratos por grupo) de acordo com o PSA no soro no dia 14 e, em seguida, tratados q4d x 6 com ADC contra PSMA e controlos. Os ratos foram tratados com 0 (controlo de veículo, círculos a cheio), 6 mg/kg de mAb contra PSMA não modificado (triângulos a cheio), 6 mg/kg de ADC de controlo (triângulos abertos), 3 mg/kg de ADC contra PSMA (quadrados abertos) e 6 mg/kg de ADC contra PSMA (quadrados a cheio). A Figura 6 mostra as estruturas químicas de três unidades de ligação de fármaco diferentes. A Figura 6A proporciona a estrutura de vcMMAE (maleimidocaproil-valina-citrulina-p-aminobenziloxicarbonil-monometilauristatina E). A Figura 6B proporciona a estrutura de vcMMAF (maleimidocaproil-valina-citrulina-p-aminobenziloxicarbonil-monometilauristatina F). A Figura 6C proporciona a estrutura de mcMMAF (maleimidocaproil-monometilauristatina F). A Figura 7 demonstra a citotoxicidade in vitro dos ADCs contra PSMA (vcMMAE (Figura 7A), vcMMAF (Figura 7B), mcMMAF (Figura 7C) ) em linhas de células de cancro da próstata positivas para PSMA (C4-2) e negativas para PSMA (PC-3™) . 19
As células em microplacas de 96 poços foram expostas a ADCs a várias concentrações. Após 4 dias, a sobrevivência celular em culturas tratadas e não tratadas foi analisada utilizando Azul de Alamar. A Figura 8 ilustra os efeitos do ADC contra PSMA no ciclo celular. Em cada painel, o pico da esquerda corresponde à fase Gi e o pico da direita à fase G2/M. A percentagem de células em G2/M aumentou acentuadamente após tratamento com o ADC contra PSMA, coerente com uma paragem na divisão celular que ocorre após a sintese de ADN. 0 ADC contra PSMA não afetou o ciclo das células 3T3™ parentais. A Figura 9 mostra os resultados de uma comparação de ADCs contra PSMA, vcMMAE v. vcMMAF.
Descrição Detalhada da Invenção A presente invenção refere-se, em parte, à descoberta surpreendente de que os ADCs compreendendo um anticorpo de ligação a PSMA ou seu fragmento de ligação a antigénio conjugado com MMAE (aqui também referido como monometilauristatina E e monometilauristatina norefedrina) ou MMAF (aqui também referido como monometilauristatina F e monometilauristatina fenilalanina) são particularmente úteis para matar células que expressam PSMA. Os ADCs têm uma seletividade para as células PC-3™ relativamente às células C4-2 ou LNCaP™ de pelo menos 250, e 3 ou 4 moléculas de monometilauristatina norefedrina ou monometilauristatina fenilalanina estão conjugadas com o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio. Nalgumas formas de realização, os ADCs exibem certos níveis de morte celular (de células que expressam PSMA), por exemplo, valores de IC50 que são ou estão próximos de concentrações 20 picomolares. Noutras formas de realização, os ADCs efetuam uma taxa de cura de pelo menos 20%, 30%, 40% ou 50% em ratos tratados com o ADC com um regímen de q4d x 6 a uma dose de 6 mg/kg. Por conseguinte, são proporcionadas composições e métodos de utilização destes ADCs. Nalgumas formas de realização, os ratos são aqueles como proporcionados nos Exemplos. Numa forma de realização, os ratos são aqueles que são um modelo de cancro da próstata humano independente de androgénios. Noutra forma de realização, os ratos são ratos glabros enxertados com células C4-2 por via intramuscular na pata posterior esquerda.
Os anticorpos ou seus fragmentos de ligação a antigénio dos ADCs são qualquer anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio que liga o PSMA. Numa forma de realização, o anticorpo ou um seu fragmento de ligação a antigénio liga especificamente o PSMA (por exemplo, liga especificamente um domínio extracelular de PSMA, liga especificamente um epítopo conformacional de PSMA, etc.) e pode inibir competitivamente a ligação específica de um segundo anticorpo ao seu epítopo alvo no PSMA, em que o segundo anticorpo é selecionado do grupo consistindo de PSMA 3.7, PSMA 3.8, PSMA 3.9, PSMA 3.11, PSMA 5.4, PSMA 7.1, PSMA 7.3, PSMA 10.3, PSMA 1.8.3, PSMA A3.1.3, PSMA A3.3.1, Abgenix 4.248.2, Abgenix 4.360.3, Abgenix 4.7.1, Abgenix 4.4.1, Abgenix 4.177.3, Abgenix 4.16.1, Abgenix 4.22.3, Abgenix 4.28.3, Abgenix 4.40.2, Abgenix 4.48.3, Abgenix 4.49.1, Abgenix 4.209.3, Abgenix 4.219.3, Abgenix 4.288.1, Abgenix 4.333.1, Abgenix 4.54.1, Abgenix 4.153.1, Abgenix 4.232.3, Abgenix 4.292.3, Abgenix 4.304.1, Abgenix 4.78.1, Abgenix 4.152.1 e anticorpos compreendendo (a) uma cadeia pesada codificada por uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma região ou regiões de codificação de uma sequência de nucleótidos selecionada do grupo consistindo 21 das sequências de nucleótidos definidas como SEQ ID NOs: 2-7, e (b) uma cadeia leve codificada por uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma região ou regiões de codificação de uma sequência de nucleótidos selecionada do grupo consistindo das sequências de nucleótidos definidas como SEQ ID NOs: 8-13. Por conseguinte, o segundo anticorpo inclui qualquer um dos anticorpos produzidos pelos hibridomas ou codificados pelos plasmideos mostrados abaixo no Quadro 1. Estes hibridomas e plasmideos foram depositados de acordo e satisfazendo os requisitos do Tratado de Budapeste sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de Microrganismos para os Fins de Procedimento de Patente junto do American Type Culture Collection ("ATCC") como uma Autoridade Depositária Internacional e dando as Designações de Depósito de Patente mostradas acima e no Quadro 1.
Quadro 1
Anticorpo Hibridoma/Plasmideo Designação de Depósito de Patente Data de Depósito PSMA 3.7 PSMA 3.7 PTA-3257 5 de abril de 2001 PSMA 3.9 PSMA 3.9 PTA-3258 5 de abril de 2001 PSMA 3.11 PSMA 3.11 PTA-3269 10 de abril de 2001 PSMA 5.4 PSMA 5.4 PTA-32 68 10 de abril de 2001 PSMA 7.1 PSMA 7.1 PTA-32 92 18 de abril de 2001 PSMA 7.3 PSMA 7.3 PTA-32 93 18 de abril de 2001 22
Anticorpo Hibridoma/Plasmideo Designação de Depósito de Patente Data de Depósito PSMA 10.3 PSMA 10.3 PTA-3347 1 de maio de 2001 PSMA 10.3 HC em ADNpc (SEQ ID NO: 7) PTA-4413 2 9 de maio de 2002 PSMA 10.3 Kappa em ADNpc (SEQ ID NO: 13) PTA-4414 2 9 de maio de 2002 PSMA 1.8.3 PSMA 1.8.3 PTA-3906 5 de dezembro de 2001 PSMA A3.1.3 PSMA A3.1.3 PTA-3904 5 de dezembro de 2001 PSMA A3.3.1 PSMA A3.3.1 PTA-3905 5 de dezembro de 2001 Abgenix 4.248.2 Abgenix 4.248.2 PTA-4427 4 de junho de 2002 Abgenix 4.360.3 Abgenix 4.360.3 PTA-4428 4 de junho de 2002 Abgenix 4.7.1 Abgenix 4.7.1 PTA-442 9 4 de junho de 2002 Abgenix 4.4.1 Abgenix 4.4.1 PTA-4556 18 de julho de 2002 Abgenix 4.177.3 Abgenix 4.177.3 PTA-4557 18 de julho de 2002 Abgenix 4.16.1 Abgenix 4.16.1 PTA-4357 16 de maio de 2002 Abgenix 4.22.3 Abgenix 4.22.3 PTA-4358 16 de maio de 2002 Abgenix 4.28.3 Abgenix 4.28.3 PTA-4359 16 de maio de 2002 23
Anticorpo Hibridoma/Plasmideo Designação de Depósito de Patente Data de Depósito Abgenix 4.40.2 Abgenix 4.40.2 PTA-4360 16 de maio de 2002 Abgenix 4.48.3 Abgenix 4.48.3 PTA-4361 16 de maio de 2002 Abgenix 4.49.1 Abgenix 4.49.1 PTA-4362 16 de maio de 2002 Abgenix 4.209.3 Abgenix 4.209.3 PTA-4365 16 de maio de 2002 Abgenix 4.219.3 Abgenix 4.219.3 PTA-4366 16 de maio de 2002 Abgenix 4.288.1 Abgenix 4.288.1 PTA-4367 16 de maio de 2002 Abgenix 4.333.1 Abgenix 4.333.1 PTA-4368 16 de maio de 2002 Abgenix 4.54.1 Abgenix 4.54.1 PTA-4363 16 de maio de 2002 Abgenix 4.153.1 Abgenix 4.153.1 PTA-4388 2 3 de maio de 2002 Abgenix 4.232.3 Abgenix 4.232.3 PTA-438 9 2 3 de maio de 2002 Abgenix 4.292.3 Abgenix 4.292.3 PTA-4390 2 3 de maio de 2002 Abgenix 4.304.1 Abgenix 4.304.1 PTA-4391 2 3 de maio de 2002 AB-PG1- XG1-006 Cadeia Pesada de AB-PG1-XG1-006 (SEQ ID NO: 2) Cadeia Leve de AB-PG1-XG1-006 (SEQ ID NO: 8) PTA-4403 PTA-4404 2 9 de maio de 2002
Anticorpo Hibridoma/Plasmídeo Designação de Depósito de Patente Data de Depósito AB-PG1- XG1-026 Cadeia Pesada de AB-PG1-XG1-026 (SEQ ID NO: 3) Cadeia Leve de AB-PG1-XG1-026 (SEQ ID NO: 9) PTA-4405 PTA-4406 2 9 de maio de 2002 AB-PG1- XG1-051 Cadeia Pesada de AB-PG1-XG1-051 (SEQ ID NO: 4) Cadeia Leve de AB-PG1-XG1-051 (SEQ ID NO: 10) PTA-4407 PTA-4408 2 9 de maio de 2002 AB-PG1- XG1-069 Cadeia Pesada de AB-PG1-XG1-069 (SEQ ID NO: 5) Cadeia Leve de AB-PGl-XG1-069 (SEQ ID NO: 11) PTA-4409 PTA-4410 2 9 de maio de 2002 AB-PG1- XG1-077 Cadeia Pesada de AB-PG1-XG1-077 (SEQ ID NO: 6) Cadeia Leve de AB-PGl-XG1-077 (SEQ ID NO: 12) PTA-4411 PTA-4412 2 9 de maio de 2002
Para determinar a inibição competitiva pode ser utilizada uma variedade de ensaios conhecidos de um técnico médio na matéria. Por exemplo, podem ser utilizados ensaios de competição cruzada para determinar de um anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio inibe competitivamente a ligação ao PSMA por outro anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio. Estes incluem métodos baseados em células utilizando citometria de fluxo ou análise de ligação em fase sólida. Podem ser também utilizados outros ensaios que avaliam a aptidão de anticorpos ou seus fragmentos de ligação a antigénio para competir de maneira cruzada para moléculas de PSMA que não são expressadas na superfície de células, em fase sólida ou em solução. 25
Nalgumas formas de realização, os anticorpos ou seus fragmentos de ligação a antigénio inibem competitivamente a ligação especifica de um segundo anticorpo ao seu epítopo alvo no PSMA em pelo menos cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 99%. A inibição pode ser avaliada em várias proporções molares ou proporções em massa; por exemplo, as experiências de ligação competitiva podem ser realizadas com um excesso molar de 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 7 vezes, 10 vezes ou mais de um primeiro anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio em relação a um segundo anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio.
Noutra forma de realização o anticorpo ou um seu fragmento de ligação a antigénio liga-se especificamente a um epítopo no PSMA definido por um anticorpo selecionado do grupo consistindo de PSMA 3.7, PSMA 3.8, PSMA 3.9, PSMA 3.11, PSMA 5.4, PSMA 7.1, PSMA 7.3, PSMA 10.3, PSMA 1.8.3, PSMA A3.1.3, PSMA A3.3.1, 4.248.2, 4.360.3, 4.7.1, 4.4.1, 4.177.3, 4.16.1, 4.22.3, 4.28.3, 4.40.2, 4.48.3, 4.49.1, 4.209.3, 4.219.3, 4.288.1, 4.333.1, 4.54.1, 4.153.1,
4.232.3, 4.292.3, 4.304.1, 4.78.1 e 4.152.1. PSMA 3.7, PSMA 3.8, PSMA 3.9, PSMA 3.11, PSMA 5.4, PSMA 7.1, PSMA 7.3, PSMA 10.3, PSMA 1.8.3, PSMA A3.1.3, PSMA A3.3.1, Abgenix 4.248.2, Abgenix 4.360.3, Abgenix 4.7.1, Abgenix 4.4.1, Abgenix 4.177.3, Abgenix 4.16.1, Abgenix 4.22.3, Abgenix 4.28.3, Abgenix 4.40.2, Abgenix 4.48.3, Abgenix 4.49.1,
Abgenix 4.209.3, Abgenix 4.219.3, Abgenix 4.288.1, Abgenix 4.333.1, Abgenix 4.54.1, Abgenix 4.153.1, Abgenix 4.232.3, Abgenix 4.292.3, Abgenix 4.304.1, Abgenix 4.78.1, Abgenix 4.152.1 e anticorpos compreendendo (a) uma cadeia pesada codificada por uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma região ou regiões de codificação de uma sequência de nucleótidos selecionada do grupo consistindo das sequências de nucleótidos definidas como SEQ ID NOs: 2-7, e (b) uma 26 cadeia leve codificada por uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma região ou regiões de codificação de uma sequência de nucleótidos selecionada do grupo consistindo das sequências de nucleótidos definidas como SEQ ID NOs: 8-13. Por conseguinte, os anticorpos ou fragmentos de ligação a antigénio dos ADCs incluem aqueles que se ligam especificamente a um epítopo no PSMA definido pelos anticorpos produzidos pelos hibridomas ou codificados pelos plasmideos proporcionados acima no Quadro 1.
Para determinar o epítopo, pode utilizar-se métodos correntes de mapeamento de epítopo conhecidos na técnica. Por exemplo, pode utilizar-se fragmentos (péptidos) do antigénio PSMA (por exemplo, péptidos sintéticos) que ligam o anticorpo para determinar se um anticorpo candidato ou seu fragmento de ligação a antigénio liga o mesmo epítopo. Para epítopos lineares são sintetizados péptidos sobrepostos de um comprimento definido (por exemplo, 8 ou mais aminoácidos). Os péptidos podem estar desviados de 1 aminoácido, de tal forma que é preparada uma série de péptidos que abrange todos os fragmentos de 8 aminoácidos da sequência proteica do PSMA. Podem ser preparados menos péptidos utilizando desvios maiores, por exemplo, 2 ou 3 aminoácidos. Além disso, podem ser sintetizados péptidos mais compridos (por exemplo, 9-, 10- ou 11-meros). A ligação de péptidos a anticorpos ou fragmentos de ligação a antigénio pode ser determinada utilizando metodologias correntes incluindo ressonância plasmónica superficial (BIACORE) e ensaios ELISA. Para o exame de epítopos conformacionais podem ser utilizados fragmentos maiores de PSMA. Outros métodos que utilizam a espetrometria de massa para definir epítopos conformacionais foram descritos e podem ser utilizados (ver, por exemplo, Baerga-Ortiz et al., Protein Science 11:1300-1308, 2002 e referências ali 27 citadas). Ainda outros métodos para a determinação de epitopo são proporcionados em trabalhos de referência de laboratório, tal como a Unidade 6.8 ("Phage Display Selection and Analysis of B-cell Epitopes") e Unidade 9.8 ("Identification of Antigenic Determinants Using Synthetic Peptide Combinatorial Libraries") do Current Protocols in Immunology, Coligan et al., eds., John Wiley & Sons. Os epitopos podem ser confirmados introduzindo mutações pontuais ou supressões num epitopo conhecido e testando, em seguida, a ligação com um ou mais anticorpos ou fragmentos de ligação a antigénio para determinar gue mutações reduzem a ligação dos anticorpos ou fragmentos de ligação a antigénio.
Em formas de realização particulares, os anticorpos dos ADCs, ou a partir dos quais são derivados os fragmentos de ligação a antigénio dos ADCs, são aqueles produzidos pelos hibridomas aqui referidos como PSMA 3.7, PSMA 3.8, PSMA 3.9, PSMA 3.11, PSMA 5.4, PSMA 7.1, PSMA 7.3, PSMA 10.3, PSMA 1.8.3, PSMA A3.1.3, PSMA A3.3.1, Abgenix 4.248.2, Abgenix 4.360.3, Abgenix 4.7.1, Abgenix 4.4.1, Abgenix 4.177.3, Abgenix 4.16.1, Abgenix 4.22.3, Abgenix 4.28.3, Abgenix 4.40.2, Abgenix 4.48.3, Abgenix 4.49.1, Abgenix 4.209.3, Abgenix 4.219.3, Abgenix 4.288.1, Abgenix 4.333.1,
Abgenix 4.54.1, Abgenix 4.153.1, Abgenix 4.232.3, Abgenix 4.292.3, Abgenix 4.304.1, Abgenix 4.78.1 e Abgenix 4.152.1, respetivamente. Noutras formas de realização, os anticorpos são aqueles codificados pelos plasmideos mostrados no Quadro 1. Ainda noutras formas de realização particulares, os anticorpos são aqueles que compreendem uma cadeia pesada codificada por uma molécula de ácido nucleico compreendendo a região ou regiões de codificação da cadeia pesada de uma sequência de nucleótidos selecionada do grupo consistindo das sequências de nucleótidos definidas como SEQ ID NOs: 2-7, e uma cadeia leve codificada por uma molécula de ácido 28 nucleico compreendendo a região ou regiões de codificação da cadeia leve de uma sequência de nucleótidos selecionada do grupo consistindo das sequências de nucleótidos definidas como SEQ ID NOs: 8-13.
Como aqui utilizados, os nomes dos hibridomas ou plasmídeos depositados podem ser utilizados indistintamente com os nomes dos anticorpos. Será evidente para um técnico médio na matéria quando o nome se destina a referir o anticorpo ou quando se refere aos plasmídeos ou hibridomas que codificam ou produzem os anticorpos, respetivamente. Adicionalmente, os nomes dos anticorpos podem ser uma forma abreviada do nome mostrado no Quadro 1. Por exemplo, o anticorpo AB-PG1-XG1-006 pode ser referido como AB-PG1-XG1-006, PG1-XG1-006, Xl-006, 006, etc. Noutro exemplo, o nome do anticorpo PSMA 4.232.3 pode ser referido como PSMA 4.232.1, 4.232.3, 4.232.1, 4.232, etc. Pretende-se que todas as variações no nome do anticorpo referem-se ao mesmo anticorpo e não a um diferente.
Os anticorpos dos ADCs, ou a partir dos quais são derivados os fragmentos de ligação a antigénio dos ADCs, incluem aqueles codificados por conjuntos particulares de sequências das cadeias pesadas e leves. Numa forma de realização, o anticorpo (AB-PG1-XG1-006) é codificado por uma molécula de ácido nucleico que compreende uma região ou regiões de codificação das sequências de ácido nucleico definidas como SEQ ID NOs: 2 e 8. Noutra forma de realização, o anticorpo (AB-PG1-XG1-026) é codificado por uma molécula de ácido nucleico que compreende uma região ou regiões de codificação das sequências de ácido nucleico definidas como SEQ ID NOs: 3 e 9. Ainda noutra forma de realização, o anticorpo (AB-PG1-XG1-051) é codificado por uma molécula de ácido nucleico que compreende uma região ou regiões de codificação das sequências de ácido nucleico 29 definidas como SEQ ID NOs: 4 e 10. Ainda noutra forma de realização, o anticorpo (AB-PG1-XG1-069) é codificado por uma molécula de ácido nucleico que compreende uma região ou regiões de codificação das sequências de ácido nucleico definidas como SEQ ID NOs: 5 e 11. Noutra forma de realização, o anticorpo (AB-PG1-XG1-077) é codificado por uma molécula de ácido nucleico que compreende uma região ou regiões de codificação das sequências de ácido nucleico definidas como SEQ ID NOs: 6 e 12. Ainda noutra forma de realização, o anticorpo (PSMA 10.3) é codificado por uma molécula de ácido nucleico que compreende uma região ou regiões de codificação das sequências de ácido nucleico definidas como SEQ ID NOs: 7 e 13. Noutras formas de realização, os anticorpos dos ADCs, ou a partir dos quais são derivados os fragmentos de ligação a antigénio dos ADCs, incluem uma região variável da cadeia pesada codificada por uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma região ou regiões de codificação de uma sequência de nucleótidos selecionada do grupo consistindo das sequências de nucleótidos definidas como SEQ ID NOs: 14, 18, 22, 26 e 30, e uma região variável da cadeia leve codificada por uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma região ou regiões de codificação de uma sequência de nucleótidos selecionada do grupo consistindo das sequências de nucleótidos definidas como SEQ ID NOs: 16, 20, 24, 28 e 32. Numa forma de realização, o anticorpo (AB-PG1-XG1-006) inclui uma sequência variável de imunoglobulina codificada por moléculas de ácido nucleico que compreendem uma região ou regiões de codificação das sequências de ácido nucleico definidas como SEQ ID NOs: 14 e 16. Do mesmo modo, o anticorpo pode ser um que inclui uma sequência variável de imunoglobulina que compreende as sequências de aminoácidos definidas como SEQ ID NOs: 15 e 17. Noutra forma de realização, o anticorpo (AB-PG1-XG1-026) inclui uma sequência variável de imunoglobulina codificada por 30 moléculas de ácido nucleico compreendendo uma região ou regiões de codificação das sequências de nucleótidos definidas como SEQ ID NOs: 18 e 20 ou inclui uma sequência variável de imunoglobulina que compreende as sequências de aminoácidos definidas como SEQ ID NOs 19 e 21. Ainda noutra forma de realização, o anticorpo (AB-PG1-XG1-051) inclui uma sequência variável de imunoglobulina codificada pelas moléculas de ácido nucleico compreendendo uma região ou regiões de codificação das sequências de nucleótidos definidas como SEQ ID NOs: 22 e 24 ou inclui uma sequência variável de imunoglobulina que compreende as sequências de aminoácidos definidas como SEQ ID NOs: 23 e 25. Ainda noutra forma de realização, o anticorpo (AB-PG1-XG1-069) inclui uma sequência variável de imunoglobulina codificada pelas moléculas de ácido nucleico compreendendo uma região ou regiões de codificação das sequências de nucleótidos definidas como SEQ ID NOs: 26 e 28 ou inclui uma sequência variável de imunoglobulina que compreende as sequências de aminoácidos definidas como SEQ ID NOs: 27 e 29. Noutra forma de realização, o anticorpo (AB-PG1-XG1-077) inclui uma sequência variável de imunoglobulina codificada pelas moléculas de ácido nucleico compreendendo uma região ou regiões de codificação das sequências de nucleótidos definidas como SEQ ID NOs: 30 e 32 ou inclui uma sequência variável de imunoglobulina que compreende as sequências de aminoácidos definidas como SEQ ID NOs: 31 e 33. Noutras formas de realização, o anticorpo inclui uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo das sequências de aminoácidos definidas como: SEQ ID NOs: 15, 19, 23, 27 e 31, e uma região variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo das sequências de aminoácidos definidas como: SEQ ID NOs: 17, 21, 25, 29 e 33. 31
Como aqui utilizado, uma "região de codificação" refere-se a uma região de uma sequência de nucleótidos que codifica uma sequência polipeptidica. A sua utilização aqui é coerente com o significado reconhecido, conhecido na técnica.
Em certas formas de realização, os anticorpos dos ADCs, ou a partir dos quais são derivados os fragmentos de ligação a antigénio dos ADCs, são aqueles que são codificados por moléculas de ácido nucleico que são altamente homólogas aos ácidos nucleicos anteriores. Nalgumas formas de realização, a molécula de ácido nucleico homóloga pode compreender uma sequência de nucleótidos que é pelo menos cerca de 90% idêntica à sequência de nucleótidos aqui proporcionada. Noutras formas de realização, a sequência de nucleótidos é pelo menos cerca de 95% idêntica, pelo menos cerca de 97% idêntica, pelo menos cerca de 98% idêntica, ou pelo menos cerca de 99% idêntica a uma sequência de nucleótidos aqui proporcionada. A homologia pode ser calculada utilizando várias, ferramentas de software publicamente disponiveis bem conhecidas para um técnico médio na matéria. As ferramentas ilustrativas incluem o sistema BLAST disponível a partir do sítio da internet do National Center for Biotechnology Information (NCBI) do National Institutes of Health.
Um método de identificação de sequências de nucleótidos altamente homólogas é através de hibridização de ácido nucleico. Assim, a invenção inclui também anticorpos possuindo as propriedades de ligação de PSMA e outras propriedades funcionais aqui descritas, as quais são codificadas por moléculas de ácido nucleico que hibridizam sob condições de estringência alta às moléculas de ácido nucleico anteriores. A identificação de sequências relacionadas pode ser também conseguida utilizando a reação 32 em cadeia da polimerase (PCR) e outras técnicas de amplificação adequadas para clonar sequências de ácido nucleico relacionadas. Podem ser selecionados iniciadores de PCR para amplificar porções de uma sequência de ácido nucleico de interesse, tal como uma CDR. 0 termo "condições de estringência alta", como aqui utilizado, refere-se a parâmetros com os quais a técnica é familiar. Os parâmetros de hibridização de ácidos nucleicos podem ser encontrados em referências que compilam esses métodos, por exemplo Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds., Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989, ou Current Protocolos in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., New York. Um exemplo de condições de estringência alta é a hibridização a 65°C em tampão de hibridização (SSC 3,5X, 0,02% de Ficoll, 0,02% de polivinilpirrolidona, 0,02% de Albumina de Soro Bovino, NaH2P04(pH7) 2,5mM, 0,5% de SDS, EDTA 2mM) . SSC é cloreto de sódio 0,15M/citrato de sódio 0,015M, pH7; SDS é dodecilsulfato de sódio; e EDTA é ácido etilenodiaminotetracético. Após hibridização, uma membrana para a qual é transferido o ácido nucleico é lavada, por exemplo, em SSC 2X à temperatura ambiente e, em seguida, a SSC 0,1 - 0,5X/SDS 0,1X a temperaturas até 68°C.
Como aqui utilizado, o termo "anticorpo" refere-se a uma glicoproteina compreendendo pelo menos duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interligadas por ligações dissulfureto. A cada cadeia pesada é constituída por uma região variável da cadeia pesada (aqui abreviada como HCVR ou VH) e uma região constante da cadeia pesada. A região constante da cadeia pesada é constituída por três domínios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve é constituída por uma região variável da cadeia leve (aqui abreviada como LCVR ou 33 VL) e uma região constante da cadeia leve. A região constante da cadeia leve é constituída por um dominio, CL. As regiões VH e VL podem ser ainda subdivididas em regiões de hipervariabilidade, designadas regiões determinantes de complementaridade (CDR), intercaladas com regiões que são mais conservadas, designadas regiões estruturais (FR). Cada VH e VL é constituída por três CDRs e quatro FRs, organizadas a partir da extremidade amino-terminal para a extremidade carboxi-terminal pela seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As regiões variáveis das cadeias pesada e leve contêm um domínio de ligação que interage com um antigénio. As regiões constantes dos anticorpos podem mediar a ligação da imunoglobulina a tecidos ou fatores do hospedeiro, incluindo várias células do sistema imunitário (por exemplo, células efetoras) e a primeira componente (Clq) do sistema de complemento clássico. 0 termo "fragmento de ligação a antigénio" de um anticorpo como aqui utilizado refere-se a uma ou mais porções de um anticorpo que retém a aptidão para ligar-se especificamente a um antigénio (isto é, PSMA). Foi demonstrado que a função de ligação a antigénio de um anticorpo pode ser realizada por fragmentos de um anticorpo inteiro. Os exemplos de fragmentos de ligação abrangidos dentro do termo "fragmento de ligação a antigénio" de um anticorpo incluem (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente consistindo dos domínios VL, VH, CL e CH1; (ii) um fragmento F(ab')2/ um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados por um ponte dissulfureto na região charneira; (iii) um fragmento Fd consistindo dos domínios VH e CHI; (iv) um fragmento Fv consistindo dos domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo, (v) um fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546) que consiste de um domínio VH; e (vi) uma região determinante de complementaridade 34 (CDR) isolada. Os CDRs e, em particular, as regiões CDR3, e mais particularmente a CDR3 da cadeia pesada contribuem para a especificidade do anticorpo. Uma vez que estas regiões CDR e, em particular, a região CDR3 confere especificidade do anticorpo para o antigénio estas regiões podem ser incorporadas noutros anticorpos ou fragmentos de ligação a antigénio para conferir uma especificidade para o antigénio idêntica à desse anticorpo ou péptido. Além disso, embora os dois dominios do fragmento Fv, V e VH, sejam codificadas por genes separados, eles podem ser unidos, utilizando métodos recombinantes, por uma unidade de ligação sintética que permite prepará-los como uma única cadeia de proteína na qual as regiões VL e VH emparelham para formar moléculas monovalentes (conhecidas como Fv de cadeia simples (scFv); ver, por exemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; e Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 85:5879-5883). Tais anticorpos de cadeia simples destinam-se também a estar incluídos dentro do termo "fragmento de ligação a antigénio" de um anticorpo. Estes fragmentos de anticorpo são obtidos utilizando procedimentos convencionais, tais como procedimentos de fragmentação proteolítica, como descrito em J. Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, pp 98-118 (N.Y. Academic Press 1983), bem como outras técnicas conhecidas dos especialistas na técnica. Os fragmentos são rastreados quanto à utilidade do mesmo modo que os anticorpos intactos.
Nalgumas formas de realização, os anticorpos, ou seus fragmentos de ligação a antigénio, dos ADCs são isolados. "Isolado", como aqui utilizado, destina-se a referir um anticorpo (ou seu fragmento de ligação a antigénio), o qual está substancialmente isento de outros anticorpos (ou fragmentos de ligação a antigénio) possuindo especificidades para antigénico diferentes (por exemplo, um 35 anticorpo isolado que se liga especificamente a PSMA está substancialmente isento de anticorpos que ligam especificamente antigénios diferentes do PSMA). Um anticorpo isolado que se liga especificamente a um epítopo, isoforma ou variante de PSMA pode ter, contudo, reatividade cruzada para outros antigénios relacionados, por exemplo, de outra espécie (por exemplo, homólogos de espécie do PSMA). Além do mais, um anticorpo isolado (ou seu fragmento de ligação a antigénio) pode estar substancialmente isento de outro celular material e/ou substâncias quimicas. Como aqui utilizada, "ligação especifica" refere-se à ligação do anticorpo a um antigénio predeterminado, neste caso PSMA. Tipicamente, o anticorpo liga com uma afinidade que é pelo menos duas vezes maior do que a sua afinidade para ligar-se a um antigénio não especifico (por exemplo, BSA, caseína), o qual é um antigénio diferente de PSMA, uma isoforma ou variante de PSMA, ou um antigénio estreitamente relacionado.
Os anticorpos abrangem vários isotipos de anticorpo, tais como IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgAl, IgA2, IgAsec, IgD, IgE. Como aqui utilizado, "isotipo" refere-se à classe de anticorpo (por exemplo, IgM ou IgGl) que é codificada por genes da região constante da cadeia pesada. Os anticorpos podem ser inteiros ou podem incluir apenas um fragmento de ligação a antigénio tal como o domínio constante e/ou variável do anticorpo de IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgAl, IgA2, IgAsec, IgD ou IgE ou poderiam consistir de um fragmento Fab, um fragmento F(ab')2 e um fragmento Fv.
Nalgumas formas de realização, os anticorpos dos ADCs, ou a partir dos quais são derivados os fragmentos de ligação a antigénio dos ADCs, são monoclonais. Os anticorpos podem ser produzidos por uma variedade de técnicas bem conhecidas na técnica. A produção de anticorpos monoclonais pode ser 36 efetuado por técnicas que são bem conhecidas na matéria. 0 termo "anticorpo monoclonal", como aqui utilizado, refere-se a uma preparação de moléculas de anticorpo de composição molecular única. Um anticorpo monoclonal exibe uma especificidade e afinidade de ligação únicas para um epitopo particular. 0 processo de produção do anticorpo monoclonal envolve a obtenção de células somáticas imunes com o potencial para produzir anticorpos, em particular linfócitos B, os quais foram previamente imunizados com o antigénio de interesse in vivo ou in vitro e que são adequadas para fusão com uma linha de mieloma de células B.
Os linfócitos mamíferos são tipicamente imunizados por imunização in vivo do animal (por exemplo, um rato) com a proteina ou polipéptido desejado. Tais imunizações são repetidas, consoante necessário, em intervalos de até várias semanas para obter um titulo de anticorpos suficiente. Uma vez imunizados, os animais podem ser utilizados como uma fonte de linfócitos produtores de anticorpos. Após o último reforço de antigénio, os animais são sacrificados e as células do baço retiradas. Os linfócitos de rato dão uma maior percentagem de fusões estáveis com as linhas de mieloma de rato aqui descritas. Por exemplo, do rato BALB/c. No entanto, podem ser também utilizados outras estirpes de rato, coelhos, hamsters, ovelhas e rãs como hospedeiros para preparar células produtoras de anticorpos. Ver; Goding (in Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, 2d ed., pp. 60-61, Orlando, Fia., Academic Press, 1986). Em particular, podem ser utilizados estirpes de rato que têm genes da imunoglobulina humana inseridos no genoma (e os quais não podem produzir imunoglobulinas de rato). Os exemplos incluem as estirpes de rato HuMAb produzidas por Medarex/GenPharm International, e as estirpes XenoMouse produzidas por Abgenix. Tais ratos produzem moléculas de 37 imunoglobulina completamente humanas em resposta à imunização. Por conseguinte, nalgumas formas de realização, os ADCs compreendem um anticorpo monoclonal totalmente humano ou um seu fragmento de ligação a antigénio que liga o PSMA.
As células produtoras de anticorpos que se encontram na fase de plasmablasto da divisão fundem preferencialmente. As células somáticas podem ser obtidas a partir dos gânglios linfáticos, baços e sangue periférico de animais condicionados com antigénios, e as células linfáticas de eleição dependem, em grande medida, da sua utilidade empirica no sistema de fusão particular. Os linfócitos secretores de anticorpo são em seguida fundidos com células de mieloma de células B (de rato) ou células transformadas, as quais são capazes de se replicar indefinidamente em cultura de células, produzindo, desse modo, uma linha de células imortal, secretora de imunoglobulina. As células fundidas resultantes, ou hibridomas, são cultivadas e as colónias resultantes rastreadas quanto à produção dos anticorpos monoclonais desejados. As colónias que produzem tais anticorpos são clonadas e cultivadas in vivo ou in vitro para produzir grandes quantidades de anticorpo. Uma descrição da base teórica e metodologia prática de fusão de tais células é definida em Kohler e Milstein, Nature 256:495 (1975).
Alternativamente, as células somáticas humanas capazes de produzir anticorpos, especificamente linfócitos B, são adequadas para fusão com linhas de células de mieloma. Embora possam ser utilizados linfócitos B de baços, amigdalas ou gânglios linfáticos de biopsia de um individuo, podem ser também utilizados os linfócitos B do sangue periférico mais facilmente acessíveis. Os linfócitos podem ser provenientes de doentes com carcinomas da 38 próstata diagnosticados ou outros cancros que expressam PSMA. Além disso, as células B humanas podem ser diretamente imortalizadas pelo virus Epstein-Barr (Cole et ai., 1995, Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96). Embora possam ser utilizados procedimentos de hibridização de células somáticas, em principio, podem ser usadas outras técnicas para produzir anticorpos monoclonais tal como a transformação virai ou oncogénica de linfócitos B.
As linhas de células de mieloma adequadas para serem utilizadas em procedimentos de fusão para produção de hibridomas podem ser não produtoras de anticorpo, terem alta eficiência de fusão e deficiências de enzimas que as tornam incapazes de crescer em certos meios seletivos que suportam o crescimento dos hibridomas desejados. Os exemplos de tais linhas de células de mieloma que podem ser utilizadas para a produção de linhas de células fundidas incluem P3-X63/Ag8, X63-Ag8,653, NSl/l.Ag 4.1, Sp2/0-Agl4, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7, S194/5XX0 Bul, todas derivadas de ratos; R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F e 4B210 derivadas de ratazanas e U-266, GM1500-GRG2, LICR-L0N-HMy2, UC729-6, todas derivadas de humanos (Goding, in Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, 2d ed., pp. 65-66, Orlando, Fia., Academic Press, 1986; Campbell, in Monoclonal Antibody Technology, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology Vol. 13, Burden e Von Knippenberg, eds. pp. 75-83, Amsterdam, Elsevier, 1984). A fusão com células de mieloma mamifero ou outros parceiros de fusão capazes de se replicar indefinidamente em cultura de células é efetuada por técnicas correntes e bem conhecidas, por exemplo, utilizando polietileno glicol ("PEG") ou outros agentes de fusão (ver Milstein e Kohler, Eur: J. Immunol. 6:511 (1976)). 39
Noutras formas de realização, os anticorpos dos ADCs, ou a partir dos quais são derivados os fragmentos de ligação a antigénio dos ADCs, são anticorpos recombinantes. 0 termo "anticorpo recombinante", como aqui utilizado, pretende incluir anticorpos que são preparados, expressos, criados ou isolados por meios recombinantes, tais como anticorpos isolados a partir de um animal (por exemplo, um rato) que é transgénico para os genes de imunoglobulina de outra espécie, anticorpos expressos utilizando um vetor de expressão recombinante transfetado numa célula hospedeira, anticorpos isolados de um biblioteca de anticorpos combinatórios, recombinantes, ou anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados por qualquer outro meio que envolve excisão-união de sequências de genes de imunoglobulina com outras sequências de ADN.
Ainda noutras formas de realização, os anticorpos são anticorpos quiméricos ou humanizados. Como aqui utilizado, o termo "anticorpo quimérico" refere-se a um anticorpo, que combina as regiões variáveis ou hipervariáveis murideas com a região constante humana ou regiões estruturais constantes e variáveis. Como aqui utilizado, o termo "anticorpo humanizado" refere-se a um anticorpo que retém apenas as CDRs de ligação a antigénio do anticorpo parental em associação com regiões estruturais humanas (ver, Waldmann, 1991, Science 252:1657). Espera-se que tais anticorpos quiméricos ou humanizados que retêm a especificidade de ligação do anticorpo murideo possuam imunogenicidade reduzida quando administrados in vivo nas aplicações de acordo com a invenção.
De acordo com uma forma de realização alternativa, os anticorpos monoclonais da presente invenção podem ser modificados para estar na forma de um anticorpo biespecifico, ou um anticorpo multiespecifico. 0 termo 40 "anticorpo biespecífico" pretende incluir qualquer agente, por exemplo, uma proteína, péptido, ou complexo de proteína ou péptido, que tem duas especificidades de ligação diferentes que se ligam ou interagem com (a) um antigénio da superfície celular e (b) um recetor de Fc na superfície de uma célula efetora. 0 termo "anticorpo multiespecífico" pretende incluir qualquer agente, por exemplo, uma proteína, péptido, ou complexo de proteína ou péptido, que tem mais do que duas especificidades de ligação diferentes que se ligam ou interagem com (a) um antigénio da superfície celular, (b) um recetor de Fc na superfície de uma célula efetora e (c) pelo menos uma outra componente. Por conseguinte, os anticorpos incluem, mas não se limitam a, anticorpos biespecíficos, triespecíficos, tetraespecíficos e outros multiespecíficos que são dirigidos a PSMA e aos recetores de Fc em células efetoras. O termo "anticorpos biespecíficos" inclui ainda diacorpos. Os diacorpos são anticorpos bivalentes, biespecíficos nos quais os domínios VH e VL são expressos numa única cadeia polipeptídica, mas utilizando uma unidade de ligação que é demasiado curta para permitir o emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia, forçando, desse modo, os domínios a emparelhar com domínios complementares de outra cadeia e a criar dois sítios de ligação de antigénio (ver por exemplo, Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad Sei. EUA 90:6444-6448; Poijak, R.J., et al. (1994) Structure 2:1121-1123).
Um anticorpo biespecífico pode ser constituído por uma região de ligação a antigénio específica para PSMA e uma região de ligação a antigénio específica para uma célula efetora que tem atividade tumoricida ou inibidora de tumores. As duas regiões de ligação a antigénio do anticorpo biespecífico são quimicamente ligadas ou podem ser expressas por uma célula geneticamente manipulada para 41 produzir o anticorpo biespecifico. (ver geralmente, Fanger et al., 1995 Drug News & Perspec. 8(3):133-137). As células efetoras adequadas possuindo atividade tumoricida incluem mas não estão limitadas a células T citotóxicas (principalmente células CD8 + ) , células assassinas naturais, etc. Uma quantidade eficaz de um anticorpo biespecífico de acordo com a invenção pode ser administrada a um indivíduo com cancro e o anticorpo biespecífico mata e/ou inibe a proliferação das células cancerosas depois de se localizar em sítios de tumores primários ou metastáticos portadores de PSMA.
Em certas formas de realização, os anticorpos dos ADCs, ou a partir dos quais são derivados os fragmentos de ligação a antigénio dos ADCs, são anticorpos humanos. 0 termo "anticorpo humano", como aqui utilizado, pretende incluir anticorpos possuindo regiões variáveis e constantes provenientes de sequências de imunoglobulina da linha germinal humana. Os anticorpos humanos da invenção podem incluir resíduos de aminoácido não codificados pelas sequências de imunoglobulina da linha germinal humana (por exemplo, mutações introduzidas por mutagénese aleatória ou específica de locus in vitro ou por mutação somática in vivo) . No entanto, o termo "anticorpo humano", como aqui utilizado, não pretende incluir anticorpos nos quais sequências de CDR derivadas da linha germinal de outra espécie de mamífero, tal como um rato, foram enxertadas em sequências estruturais humanas (aqui referidos como "anticorpos humanizados") . Os anticorpos humanos dirigidos contra PSMA podem ser gerados utilizando ratos transgénicos que têm partes do sistema imunitário humano em vez do sistema do rato. Alguns exemplos dos quais foram descritos acima. 42
Os anticorpos monoclonais totalmente humanos podem ser também preparados imunizando ratos transgénico com grandes porções de loci das cadeias pesada e leve de imunoglobulina humana. Ver, por exemplo, patentes U.S. 5,591,669, 5,598,369, 5,545,806, 5,545,807, 6,150,584, e referências ali citadas. Estes animais foram geneticamente modificados de forma a existir uma supressão funcional da produção de anticorpos endógenos (por exemplo, murideos) . Os animais são adicionalmente modificados para conter a totalidade ou uma porção do locus do gene de imunoglobulina da linha germinal humana de tal forma que a imunização destes animais resulta na produção de anticorpos totalmente humanos para o antigénio de interesse. Após imunização destes ratos (por exemplo, ratos XenoMouse (Abgenix), HuMAb (Medarex/GenPharm)), anticorpos monoclonais são preparados de acordo com a tecnologia de hibridoma corrente. Estes anticorpos monoclonais têm sequências de aminoácidos de imunoglobulina humana e, por conseguinte, não provocarão respostas de anticorpo humano anti-rato (HAMA) quando administrados em humanos. Em geral, mas não pretendendo ser limitativo, os ratos têm 6-16 semanas de idade na altura da primeira imunização. Por exemplo, é utilizada uma preparação de antigénio PSMA purificado ou enriquecido (por exemplo, PSMA recombinante ou células que expressam PSMA) para imunizar os ratos por via intraperitoneal (IP), embora possam ser também utilizadas outras vias de imunização conhecidas de um técnico médio na matéria. O antigénio PSMA é injetado em associação com um adjuvante, tal como adjuvante completo de Freund, e, em algumas formas de realização, a injeção inicial é seguida de imunizações de reforço com antigénio num adjuvante, tal como adjuvante incompleto de Freund. A resposta imunológica é seguida ao longo do protocolo de imunização com amostras de plasma obtidas, por exemplo, por sangramento retroorbital. O plasma é analisado por ELISA e os ratos com títulos 43 suficientes de imunoglobulina humana anti-PSMA são utilizados para fusões. Os ratos são reforçados por via intravenosa com antigénio 3 dias antes do sacrifício e remoção do baço.
Nalgumas formas de realização, o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio dos ADCs pode ser selecionado em relação à aptidão para ligar células vivas que expressam PSMA. A fim de demonstram a ligação a células vivas que expressam PSMA pode ser utilizada citometria de fluxo. Por exemplo, as linhas de células que expressam PSMA (cultivadas em condições de crescimento padrão) ou células de cancro da próstata que expressam PSMA são misturadas com
várias concentrações de anticorpos monoclonais em PBS contendo 0,1% de Tween 80 e 20% de soro de rato, e incubadas a 37°C durante 1 hora. Depois de lavar, as células são feitas reagir com anticorpo secundário anti- IgG humana marcado com fluoresceína (se forem utilizados anticorpos anti-PSMA humanos) nas mesmas condições que a revelação com anticorpo primário. As amostras podem ser analisadas através de um instrumento separador de células ativadas por fluorescência (FACS) utilizando propriedades óticas e de dispersão lateral para selecionar células únicas. Pode utilizar-se um ensaio alternativo utilizando microscopia de fluorescência (além ou em vez do) ensaio de citometria de fluxo. As células podem ser reveladas e examinadas por microscopia de fluorescência. Este método permite visualizar células particulares, mas pode ter uma menor sensibilidade dependendo da densidade do antigénio. Concluiu-se que, nalgumas formas de realização, os ADCs ligam células vivas. Portanto, nalgumas formas de realização, os ADCs não requerem lise celular para ligar o PSMA. 44
Nalgumas formas de realização, os anticorpos podem promover a citólise de células que expressam PSMA. A citólise pode ser mediada por complemento ou pode ser mediada por células efetoras. Numa forma de realização, a citólise é realizada num organismo vivo, tal como um mamifero, e a célula viva é uma célula tumoral. Os exemplos de tumores que podem ser visados com os anticorpos ou seus fragmentos de ligação a antigénio incluem qualquer tumor que expressa PSMA (isto inclui tumores com neovasculatura que expressam PSMA), tais como próstata, bexiga, pâncreas, pulmão, cólon, rim, melanomas e sarcomas. Numa forma de realização, a célula tumoral é uma célula de cancro da próstata. A avaliação da atividade citolitica in vitro pelo ensaio de libertação de crómio pode proporcionar uma seleção inicial antes da avaliação em modelos in vivo. Esta avaliação pode ser realizada utilizando ensaios padrão de libertação de crómio. Resumidamente, as células polimorfonucleares (PMN), ou outras células efetoras, de dadores saudáveis podem ser purificadas por centrifugação de densidade Ficoll Hypaque, seguida de lise dos eritrócitos contaminantes. As PMNs lavadas podem ser suspensas em RPMI suplementado com 10% de soro fetal de vitelo inativado termicamente e misturadas com células que expressam PSMA marcadas com 51Cr, a várias proporções de células efetoras em relação às células tumorais (células efetoras:células tumorais). Podem ser depois adicionadas IgGs anti-PSMA purificadas a várias concentrações. Uma IgG irrelevante pode ser utilizada como um controlo negativo. Os ensaios podem ser realizados durante 0-120 minutos a 37°C. As amostras podem ser analisadas quanto à citólise medindo a libertação de 51Cr para o sobrenadante da cultura. Os anticorpos monoclonais anti-PSMA e/ou ADCs podem ser também testados em associações uns com os outros para determinar se a citólise 45 é melhorada com anticorpos monoclonais e/ou ADCs múltiplos. Os anticorpos que se ligam a PSMA e/ou ADCs podem ser também testados num modelo in vivo (por exemplo, em ratos) para determinar a sua eficácia na mediação da citólise e morte de células que expressam PSMA, por exemplo, células tumorais.
Os anticorpos dos ADCs, ou a partir dos quais são derivados os fragmentos de ligação a antigénio dos ADCs, podem ser selecionados, por exemplo, com base nos seguintes critérios, os quais não pretendem ser exclusivos: 1) ligação a células vivas que expressam PSMA; 2) alta afinidade de ligação a PSMA; 3) ligação a um único epitopo no PSMA (isto é, um epítopo não reconhecido por um anticorpo anteriormente produzido); 4) opsonização de células que expressam PSMA; 5) mediação da inibição do crescimento, fagocitose e/ou morte de células que expressam PSMA na presença de células efetoras; 6) modulação (inibição ou melhoria) das atividades de NAALADase, folato-hidrolase, dipeptidil-peptidase IV e/ou γ-glutamil-hidrolase; 7) inibição do crescimento, paragem do ciclo celular e/ou citotoxicidade na ausência de células efetoras; 8) interiorização de PSMA; 9) ligação a um epitopo conformacional no PSMA; 10) reatividade cruzada mínima com células ou tecidos que não expressam PSMA; e 11) ligação preferencial a formas diméricas de PSMA em vez de formas monoméricas de PSMA.
Os anticorpos podem satisfazer um ou mais, e possivelmente todos, estes critérios. 46
Numa forma de realização, o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio liga-se a um epitopo conformacional, tal como um epitopo conformacional no domínio extracelular do PSMA. Para determinar se um anticorpo anti-PSMA ou seu fragmento de ligação a antigénio liga-se a epítopos conformacionais, cada anticorpo pode ser testado em ensaios utilizando proteína nativa (por exemplo, imunoprecipitação não desnaturante, análise por citometria de fluxo da ligação na superfície celular) e proteína desnaturada (por exemplo, transferência de Western, imunoprecipitação de proteínas desnaturadas). Uma comparação dos resultados indicará se o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio liga um epitopo conformacional. Os anticorpos ou seus fragmentos de ligação a antigénio que se ligam a proteína nativa mas não a proteína desnaturada são, nalgumas formas de realização, aqueles que ligam os epítopos conformacionais. Concluiu-se que, nalgumas formas de realização, os ADCs ligam epítopos conformacionais de PSMA.
Noutra forma de realização, o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio liga-se a um epitopo específico para dímeros no PSMA. Em geral, os anticorpos ou seus fragmentos de ligação a antigénio que se ligam a um epitopo específico para dímeros ligam preferencialmente o dímero de PSMA em vez do monómero de PSMA. Para determinar se um anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio liga-se preferencialmente (isto é, seletiva e/ou especificamente) a um dímero de PSMA, o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio pode ser testado em ensaios (por exemplo, imunoprecipitação seguida de transferência de Western) utilizando proteína de PSMA dimérica nativa e proteína de PSMA monomérica dissociada. Uma comparação dos resultados indicará se o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio se liga preferencialmente ao dímero. Nalgumas 47 formas de realização, os anticorpos ou seus fragmentos de ligação a antigénio ligam-se ao dimero de PSMA mas não à proteína de PSMA monomérica. Concluiu-se que, nalgumas formas de realização, os ADCs ligam-se a um epítopo específico para dímeros no PSMA.
Por conseguinte, a invenção inclui também ADCs que ligam seletivamente multímeros de PSMA. Como aqui utilizado, particularmente em relação à ligação de multímeros de PSMA pelos ADCs, "liga seletivamente" significa que um anticorpo liga-se preferencialmente a um multímero da proteína de PSMA (por exemplo, com maior avidez, maior afinidade de ligação) em vez de um monómero da proteína de PSMA. Nalgumas formas de realização, os ADCs da invenção ligam-se a um multímero da proteína de PSMA com uma avidez e/ou afinidade de ligação que é 1,1 vezes, 1,2 vezes, 1,3 vezes, 1,4 vezes, 1,5 vezes, 1,6 vezes, 1,7 vezes, 1,8 vezes, 1,9 vezes, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 7 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes, 70 vezes, 100 vezes, 200 vezes, 300 vezes, 500 vezes, 1000 vezes ou mais do que a apresentada pelo ADC para um monómero da proteína de PSMA. Nalgumas formas de realização, o ADC pode ligar seletivamente um multímero da proteína de PSMA e não um monómero da proteína de PSMA, isto é, liga-se exclusivamente a um multímero da proteína de PSMA. Nalgumas formas de realização, o ADC liga seletivamente um dimero da proteína de PSMA.
Um multímero da proteína de PSMA, como aqui utilizado, é uma complexo proteico de pelo menos duas proteínas de PSMA ou fragmentos das mesmas. Os multímeros da proteína de PSMA podem ser constituídos por vários associações de proteínas de PSMA inteiras (por exemplo, SEQ ID NO: 1), PSMA recombinante solúvel (rsPSMA, por exemplo, aminoácidos 44-750 da SEQ ID NO: 1) e fragmentos dos anteriores que formam 48 multímeros (isto é, que retêm o domínio proteico necessário para formar dímeros e/ou multímeros de ordem superior de PSMA). Nalgumas formas de realização, pelo menos uma das proteínas de PSMA que formam o multímero é um polipéptido de PSMA recombinante, solúvel (rsPSMA). Os multímeros da proteína de PSMA podem ser dímeros, tais como aqueles que se formam a partir da proteína de PSMA recombinante solúvel. Numa forma de realização, o dímero é um homodímero rsPSMA. Julga-se que os multímeros da proteína de PSMA aqui referidos assumem uma conformação nativa e podem ter uma tal conformação. Em certas formas de realização, as proteínas de PSMA não são covalentemente ligadas em conjunto para formar o multímero da proteína de PSMA. Por exemplo, constatou-se que a proteína de PSMA se associa de maneira não covalente para formar dímeros sob condições não desnaturantes. Os multímeros da proteína de PSMA podem reter as atividades do PSMA. A atividade do PSMA pode ser uma atividade enzimática, tal como atividade de folato-hidrolase, atividade de NAALADase, atividade de dipeptidil-peptidase IV ou atividade de γ-glutamil-hidrolase. Os métodos para testar a atividade de multímeros de PSMA são bem conhecidos na técnica (revistos por 0'Keefe et al. in: Prostate Câncer: Biology, Genetics, and the New Therapeutics, L.W.K. Chung, W.B. Isaacs e J.W. Simons (eds.) Humana Press, Totowa, NJ, 2000, pp. 307-326). O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio dos ADCs pode ligar e é interiorizado com PSMA expresso nas células. O mecanismo através do qual o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio é interiorizado com o PSMA não é crítico para a prática da presente invenção. Por exemplo, o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio pode induzir a interiorização de PSMA. Alternativamente, a interiorização do anticorpo ou seu 49 fragmento de ligação a antigénio pode ser o resultado da interiorização de rotina do PSMA. Concluiu-se que o ADC pode ser interiorizado com o PSMA expresso nas células.
Os anticorpos ou seus fragmentos de ligação a antigénio e, por conseguinte, os ADCs da invenção podem ligar especificamente PSMA e/ou rsPSMA na superfície celular com afinidade sub-nanomolar. As afinidades de ligação podem ser de cerca de 1 x 10“9M ou menos, cerca de 1 x 10_1°M ou menos ou cerca de 1 x 10_1M ou menos. Numa forma de realização particular, a afinidade de ligação é inferior a cerca de 5 x 10_1°M.
Nalgumas formas de realização, os anticorpos ou seus fragmentos de ligação a antigénio podem modular pelo menos uma atividade enzimática de PSMA. A atividade pode ser selecionada do grupo consistindo de atividade dipeptidase ácida ligada a a, N-acetilada (NAALADase), folato-hidrolase, dipeptidil-dipeptidase IV, γ-glutamil-hidrolase e associações das mesmas in vitro ou in vivo. A modulação pode ser a melhoria ou inibição de pelo menos uma atividade enzimática de PSMA.
Os níveis de NAALADase nos tecidos podem ser determinados homogeneizando os tecidos solubilizados com detergente, sedimentando o material insolúvel por centrifugação e medindo a atividade de NAALADase no sobrenadante remanescente. Do mesmo modo, a atividade de NAALADase nos líquidos corporais pode ser também medida sedimentando, em primeiro lugar, o material celular por centrifugação e realizando um ensaio enzimático típico em relação à atividade NAALADase no sobrenadante. Os ensaios enzimáticos para a NAALADase foram descritos por Frieden, 1959, J. Biol, Chem., 234:2891. Neste ensaio, o produto da reação da 50 enzima NAALADase é o ácido glutâmico. Este resulta da dissociação catalisada pela enzima do N-acetilaspartilglutamato para produzir ácido N-acetilaspártico e ácido glutâmico. O ácido glutâmico, num passo que requer NAD(P)+, produz 2-oxoglutarato mais NAD(P)H numa reação catalisada por glutamato-desidrogenase. 0 progresso da reação pode ser fácil e convenientemente medido pela alteração na absorvância a 340 nm devido à conversão de NAD(P)+ em NAD(P)H. A atividade folato-hidrolase de PSMA pode ser medida realizando ensaios enzimáticos como descritos por Heston e outros (por exemplo, Clin. Câncer Res. 2(9):1445-51, 1996; Urology 49(3A Suppl) :104-12,1997) . As folato-hidrolases, tal como o PSMA, removem os glutamatos ligados em gama a partir de folatos poliglutamados. A atividade folato-hidrolase pode ser medida utilizando substratos tais como tri-gama-glutamato de metotrexato (MTXGlu3), di-gama-glutamato de metotrexato (MTXGlu2) ou pentaglutamato de pteroilo (PteGlu5) , por exemplo utilizando eletroforese capilar (ver Clin. Câncer Res. 2(9):1445-51, 1996). As incubações reguladas de PSMA com substratos poliglutamados são seguidas da separação e deteção dos produtos de hidrólise.
Um ADC da invenção compreende um anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio conjugado com MMAE ou MMAF. Nalgumas formas de realização, o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio pode ser conjugado com MMAE ou MMAF com um composto da fórmula seguinte (Fórmula 1) : -An-Ym-Zm-Xn_ Wn-, em que A é uma unidade de acilo carboxílico; Y é um aminoácido; Z é um aminoácido; X e W são, cada, um espaçador auto-imolador; n é um número inteiro de 0 ou 1; e m é um número inteiro de 0 ou 1, 2, 3, 4, 5 ou 6. Nalgumas formas de realização, um conjugado da presente invenção é 51 representado pela fórmula (Fórmula 2) : L- {An-Ym-Zm-Xn-Wn-D}p em que L é um anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio que liga o PSMA, D é MMAE ou MMAF e p é um número inteiro de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8. As outras componentes são como descritas acima. Numa forma de realização, a unidade carboxilica "An" está ligada ao anticorpo ou fragmento de ligação a antigénio através de um átomo de enxofre proveniente do anticorpo ou fragmento de ligação a antigénio: 51
P
Numa forma de realização, A é
D
N-(CHs)qCO
O em que q é 1-10. Por conseguinte, numa forma de realização o conjugado é: P L--S.
P ‘N-(CH2)qCO- Ym Zm X„ Wn d! em que L, Y, Z, X, W, D, n, m, q e P são como anteriormente definidos. 52
Noutra forma de realização, A é 4-(N-succinimidometil)ciclo-hexano-l-carbonilo, m-succinimidobenzoílo, 4-(p-succinimidofenil)-butirilo, 4 —(2 — acetamido)benzoílo, 3-tiopropionilo, 4-(1-tioetil)-benzoílo, 6-(3-tiopropionilamido)-hexanoílo ou maleimido-caproílo. Numa outra forma de realização, A é maleimido-caproílo. Os exemplos representativos de várias unidades de acilo carboxílico e métodos para a sua síntese e ligação são descritos na Patente US n° 6,214,345, cujos conteúdos são aqui incorporados na totalidade por referência.
Noutra forma de realização, Y é alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina, triptofano ou prolina. Ainda noutra forma de realização, Y é valina. Numa outra forma de realização, Z é lisina, lisina protegida com acetilo ou formilo, arginina, arginina protegida com grupos tosilo ou nitro, histidina, ornitina, ornitina protegida com acetilo ou formilo, ou citrulina. Ainda numa outra forma de realização, Z é citrulina. Numa forma de realização Ym-Zm é valina-citrulina. Noutra forma de realização, Ym-Zm é uma sequência proteica que pode ser dissociada seletivamente por uma protease.
Numa outra forma de realização, X é um composto possuindo a fórmula
-NH
53 em que T é 0, N ou S. Noutra forma de realização, X é um composto possuindo a fórmula -HN-R1-C0T em que R1 é alquilo C1-C5, T é 0, N ou S. Numa outra forma de realização, X é um composto possuindo a fórmula 53
COOR2 em que T é 0, N, ou S, R2 é H ou alquilo C1-C5. Numa forma de realização, X é p-aminobenzilcarbamoiloxilo. Noutra forma de realização, X é álcool p-aminobenzílico. Numa outra forma de realização, X é p-aminobenzilcarbamato. Ainda numa outra forma de realização, X é p-aminobenziloxicarbonilo. Noutra forma de realização, X é ácido γ-aminobutírico; ácido a,a-dimetil-y-aminobutírico ou ácido β,β-dimetil-y-aminobutirico.
Nalgumas formas de realização, W é
em que T é 0, S ou N.
Numa forma de realização, o composto de Fórmula 1 é maleimidocaproílo. 0 maleimidocaproilo tem sido utilizado para a conjugação de duas auristatinas específicas a um mAb anti-CD30 (AC10) (Doronina, Svetlana et al. "Novel Linkers for Monoclonal Antibody-Mediated Delivery of Anticancer 54
Agents", AACR, Anaheim, CA, Resumo n° 1421, 16-20 de Abril de 2005) . O maleimidocaproílo reage com grupos tiol para formar um tioéter. A MMAE ou MMAF pode ser conjugada com um anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio utilizando métodos conhecidos dos técnicos médios na matéria (por exemplo, Ver, Niemeyer, CM, Bioconjugation Protocols, Strategies and Methods, Humana Press, 2004) ou como aqui descritos. São conjugadas 3 ou 4 moléculas de MMAE ou MMAF com o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio.
Determinou-se que os ADCs da invenção têm niveis particularmente altos de seletividade quando a morte de células que não expressam PSMA é comparada com a morte de células que expressam PSMA. Por conseguinte, os ADCs têm uma seletividade para as células PC-3™ relativamente às células C4-2 ou células LNCaP™ de pelo menos 250. Em formas de realização, a seletividade é, pelo menos, de 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700 , 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500 , 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2250, 2500, 2750, 3000, 3500 , 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500 , 9000, 9500, 10000 , 11000, 12000, 13000, 14000, 15000, 17500, 20000 ou mais. Nalgumas formas de realização, a seletividade é entre 250-500, 500-750, 750-1000, 1000-2000, 2000-5000, 5000-10000, 10000-15000 ou 15000-20000. "Seletividade", como aqui definida, refere-se à razão de valores de IC50 de um ADC para células PC-3™ (células que não expressam PSMA) relativamente a células C4-2 ou células LNCaP™ (células que expressam PSMA).
Determinou-se também que os ADCs da invenção medeiam, nalgumas formas de realização, a morte de células específicas que expressam PSMA a concentrações muito baixas, tal como em concentrações picomolares ou próximas. 55
Nalgumas formas de realização, os ADCs exibem IC50s a concentrações inferiores a cerca de 1 x 10”10M, inferiores a cerca de 1 x 10_11M ou inferiores a cerca de 1 x 10~12M. Numa forma de realização particular é conseguida uma IC50 a uma concentração inferior a cerca de 1,5 x 10_11M. Noutra forma de realização, os ADCs proporcionados exibem IC50S entre 10-210, 40-210, 60-210 ou 65-210 pM. Ainda noutra forma de realização, os ADCs proporcionados exibem IC50S de cerca de 10, 40, 60 ou 80 pM. Ainda noutra forma de realização, os ADCs proporcionados exibem IC50S de cerca de 11, 42, 60 ou 83 pM.
Determinou-se também que, nalgumas formas de realização, os ADCs têm uma taxa de cura em ratos de pelo menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 95%. Noutras formas de realização, a taxa de cura em ratos é de cerca de 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 95%. Ainda noutras formas de realização, a taxa de cura é 20-40%, 40-60% ou 60-80%. Como aqui utilizado, "taxa de cura" refere-se ao número de ratos que continuam vivos após cerca de 500 dias do inicio de um período de estudo, sem qualquer evidência de um tumor e sem níveis de PSA mensuráveis, dividido pelo número de ratos no início do período de estudo. Para avaliar a taxa de cura, os ratos são administrados com 6 mg/kg de ADC com um regímen de q4d x 6. Nalgumas formas de realização, o número de ratos no início do estudo é, pelo menos, de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 17, 20, 25, 30 ou mais ratos. Outros detalhes sobre um exemplo de um estudo desse tipo são proporcionados aqui abaixo nos Exemplos. Numa forma de realização, os ratos são aqueles que são um modelo do cancro da próstata humano independente de androgénios. Noutra forma de realização, os ratos são ratos glabros enxertados com células C4-2 por via intramuscular na pata posterior esquerda. As técnicas para determinar a presença 56 de um tumor e para medir os níveis de PSA são bem conhecidos dos técnicos médios na matéria. A ligação dos ADCs da invenção a células vivas que expressam PSMA pode inibir o crescimento de células que expressam PSMA, resultar na paragem do ciclo celular (por exemplo, paragem G2/M), promover a apoptose das células que expressam PSMA, etc. Como aqui utilizado, "resultar na paragem do ciclo celular" refere-se a um aumento do número de células na fase G2/M devido à administração de um ADC. Nalgumas formas de realização, os ADCs podem efetuar a apoptose. Noutras formas de realização, os ADCs resultam tanto na paragem do ciclo celular como na apoptose subsequente. Por conseguinte, os ADCs da invenção podem ser utilizados em vários métodos in vitro e in vivo para realizar estes possíveis objetivos finais. Em particular, os ADCs da invenção podem ser utilizados em métodos de tratamento de doença mediada por PSMA.
Como aqui utilizada, uma "doença mediada por PSMA" é qualquer doença em que o PSMA é ocasionador ou um sintoma da doença. As doenças mediadas por PSMA incluem também doenças ou distúrbios nos quais existe expressão aberrante (por exemplo, sobreexpressão) de PSMA. 0 PSMA é uma glicoproteína de membrana de Tipo II de 100 kD expressa nos tecidos da próstata (Horoszewicz et al., 1987, Anticancer
Res. 7:927-935; Patente U.S. n° 5,162,504). 0 PSMA foi caracterizado como uma proteína transmembranar de tipo II possuindo identidade de sequência com o recetor de transferrina (Israeli et al., 1994, Câncer Res. 54:1807- 1811) e com atividade NAALADase (Cárter et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sei: U.S.A. 93:749-753). Mais, é importante dizer que o PSMA é expresso em quantidades aumentadas no cancro da próstata e níveis elevados de PSMA são também 57 detetáveis nos soros destes doentes (Horoszewicz et al., 1987; Rochon et al., 1994, Prostate 25:219-223; Murphy et al., 1995, Prostate 26:164-168; e Murphy et al., 1995, Anticancer Res. 15:1473-1479). Por conseguinte, um distúrbio mediado por PSMA é, por exemplo, o cancro da próstata. A expressão de PSMA aumenta com a progressão da doença, tornando-se muito elevada na doença metastática, refratária a hormonas para a qual não existe presentemente qualquer terapia. Além disso, dados que chamam a atenção indicam que o PSMA é também abundantemente expresso na neovasculatura de uma variedade de outros tumores importantes, incluindo células tumorais da bexiga, pâncreas, sarcoma, melanoma, pulmão e rim, mas não na vasculatura normal. Por conseguinte, as doenças mediadas por PSMA incluem cancros nos quais o PSMA é expresso nas células do tumor ou na neovasculatura do tumor.
Por conseguinte, são proporcionadas composições que podem ser utilizadas para tratar qualquer distúrbio mediado por PSMA. Por exemplo, os ADCs podem ser utilizados para inibir a neovascularização de um tumor. Noutro exemplo, os ADCs contra PSMA podem ser utilizados para matar células tumorais. Nalgumas formas de realização, dois ou mais ADCs diferentes são utilizados em associação. Noutra forma de realização, um ou mais anticorpos anti-PSMA não conjugados ou seus fragmentos de ligação a antigénio podem ser combinados com um ou mais ADCs numa única terapia para conseguir um efeito terapêutico desejado. Como uma ilustração, um anticorpo anti-PSMA não conjugado que medeia a morte altamente eficaz de células alvo na presença de células efetoras e/ou que inibe o crescimento de células que expressam PSMA pode ser utilizado com um ou mais ADCs. Ainda noutra forma de realização, os ADCs podem ser combinados com um ou mais agentes terapêuticos adicionais. Tais agentes terapêuticos incluem agentes antitumorais, 58 tais como docetaxel; corticosteroides, tais como prednisona ou hidrocortisona; agentes imunoestimuladores; imunomoduladores; ou alguma associação dos mesmos.
Os agentes antitumorais incluem agentes citotóxicos, agentes quimioterapêuticos e agentes que atuam na neovasculatura do tumor. Os agentes citotóxicos incluem radionuclideos citotóxicos, toxinas quimicas e toxinas proteicas. 0 radionuclideo citotóxico ou isótopo radioterapêutico pode ser um isótopo emissor alfa tal como 225Ac, 211At, 212Bi, 213Bi, 212Pb, 224Ra ou 223Ra.
Alternativamente, o radionuclideo citotóxico pode ser um isótopo emissor beta tal como 186Rh, 188Rh, 177Lu, 90Y, 1311, 67Cu, 64Cu, 153Sm ou 166Ho. Além disso, o radionuclideo citotóxico pode emitir Auger e eletrões de baixa energia e 1 oc 19R 77 incluem os isotopos I, I ou Br.
As toxinas quimicas ou agentes quimioterapêuticos adequados incluem membros da família enediina de moléculas, tais como caliqueamicina e esperamicina. As toxinas químicas pode ser também retiradas do grupo consistindo de metotrexato, doxorrubicina, melfalano, clorambucil, ARA-C, vindesina, mitomicina C, cis-platina, etoposido, bleomicina e 5-fluorouracilo. Outros agentes antineoplásicos incluem dolastatinas (Patentes U.S. n° 6,034,065 e 6,239,104) e seus derivados. As dolastatinas e seus derivados incluem dolastatina 10 (dolavalina-valina-dolaisoleuina-dolaproina-dolafenina) e os derivados de auristatina PHE (dolavalina-valina-dolaisoleuina-dolaproina-fenilalanina-éster metílico) (Pettit, G.R. et al., Anticancer Drug Des. 13(4):243-277, 1998; Woilce, T. et al., Antimicrob. Agents
Chemother. 45(12):3580-3584, 2001), e aurastatina E e semelhantes. As toxinas incluem também lectinas venenosas, toxinas vegetais tais como ricina, abrina, modecina, botulina e toxinas da difteria. Outros agentes 59 quimioterapêuticos são conhecidos dos especialistas na técnica.
Os agentes que atuam na vasculatura do tumor incluem agente de ligação de tubulina tais como combrestatina A4 (Griggs et al., Lancet Oncol. 2:82, 200 1), angiostatina e endostatina (revisto em Rosen, Oncologist 5:20, 2000) e proteína indutível por interferão 10 (Patente U.S. n° 5,994,292). Um número de outros agentes antiangiogénicos é também considerado e inclui: 2ME2, Angiostatina, Angiozima, RhuMAb Anti-VEGF, Apra (CT-2584), Avicina, Benefina, BMS275291, Carboxiamidotriazole, CC4047, CC5013, CC7085, CDC801, CGP-41251 (PKC 412), CM101, Pró-fármaco de Combretastatina A-4, EMD 121974, Endostatina, Flavopiridol, Genisteína (GCP), Extrato de Chá Verde, IM-862, ImmTher,
Interferão Marimastat, Paclitaxel, Prinomastat Solimastat, Suradista alfa, Interleucina-12, Iressa (ZD1839), Metastat (Col-3), Neovastat, Octreótido, Penicilamina, Fotofrina, Photopoint, PI-88, (AG-3340), PTK787 (ZK22584), R0317453,
Esqualamina, SU 101, SU 5416, SU-6668, (FCE 26644), Suramina (Metaret),
Tetratiomolibdato, Talidomida, TNP-470 e Vitaxina. Outros agentes antiangiogénicos são descritos por Kerbel, J. Clin. Oncol. 19 (18s) :45s-51s, 2001.
Os ADCs podem ser administrados com um ou mais agentes imunoestimuladores para induzir ou melhorar uma resposta imunológica, tais como IL-2 e oligonucleótidos imunoestimuladores (por exemplo, aqueles que contêm motivos CpG). Nalgumas formas de realização, os agentes imunoestimuladores podem estimular ramos específicos do sistema imunitário, tal como as células assassinas naturais (NK) que medeiam a citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC). Os agentes imunoestimuladores incluem 60 interleucina-2, interferão cx, interferão γ, fator de necrose tumoral alfa (TNFcx), oligonucleótidos imunoestimuladores ou uma associação dos mesmos. Os imunomoduladores incluem citocinas, quimiocinas, adjuvantes ou uma associação dos mesmos. As quimiocinas úteis para aumentar as respostas imunológicas incluem mas não estão limitadas a SLC, ELC, ΜΙΡ3α, ΜΙΡ3β, IP-10, MIG e associações dos mesmos. O outro agente terapêutico pode ser também uma vacina. Nalgumas formas de realização, a vacina imuniza um indivíduo contra PSMA. Nalgumas formas de realização, essas vacinas incluem antigénios, tais como dímeros de PSMA, opcionalmente com um ou mais adjuvantes para induzir ou melhorar uma resposta imunológica. Um adjuvante é uma substância que potência a resposta imunológica. Na técnica são bem conhecidos adjuvantes de muitos tipos. Os exemplos específicos de adjuvantes incluem monofosforil-lípido A (MPL, SmithKline Beecham); saponinas incluindo QS21 (SmithKline Beecham); oligonucleótidos imunoestimuladores (por exemplo, oligonucleótidos de CpG descritos por Kreig et ai., Nature 374:546-9, 1995); adjuvante incompleto de Freund; adjuvante completo de Freund; montanida; vitamina E e várias emulsões de água em óleo preparadas a partir de óleos biodegradáveis tais como esqualeno e/ou tocoferol, Quil A, Ribi Detox, CRL-1005, L-121 e associações dos mesmos. As formulações, tais como aquelas descritas no Pedido U.S. com o n° de Série 10/976352, são também consideradas para serem utilizadas como vacinas nos métodos aqui proporcionados.
Nalgumas formas de realização, as vacinas podem incluir um ou mais dos multímeros da proteína de PSMA isolados aqui descritos, tal como o dímero da proteína de PSMA. Nalgumas 61 formas de realização, uma composição de multimero da proteina de PSMA contém pelo menos cerca de 10% de multimero da proteina de PSMA (da quantidade total de proteina de PSMA na composição). Noutras formas de realização, a composição de multimero da proteina de PSMA contém pelo menos cerca de 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% ou 99,5% de multimero da proteina de PSMA. Numa forma de realização, a composição de multimero da proteina de PSMA contém multimero da proteina de PSMA substancialmente puro, com essencialmente nenhum monómero da proteina de PSMA. Entende-se que a lista de percentagens especificas inclui, por inferência, todas as percentagens não designadas entre as percentagens especificadas.
As citocinas podem ser também utilizadas em protocolos de vacinação em consequência das suas propriedades reguladoras de linfócitos. Muitas citocinas úteis para esses fins são conhecidas de um técnico médio na matéria, incluindo interleucina-2 (IL-2); IL-4; IL-5; IL-12, as quais se demonstrou que melhoram os efeitos protetores das vacinas (ver, por exemplo, Science 268: 1432-1434, 1995); GM-CSF; IL-15; IL-18; associações dos mesmos, e semelhantes. Assim, as citocinas podem ser administradas em conjunto com antigénio, quimiocinas e/ou adjuvantes para aumentar uma resposta imunológica.
Os outros agentes terapêuticos podem estar presentes nas composições da invenção na forma não conjugada ou na forma conjugada, tal como conjugada com um anticorpo anti-PSMA ou seu fragmento de ligação a antigénio. O acoplamento de uma ou mais moléculas de toxina ao anticorpo anti-PSMA ou seu fragmento de ligação a antigénio pode incluir muitos mecanismos químicos, por exemplo ligação covalente, ligação 62 por afinidade, intercalação, ligação coordenada e complexação. A ligação covalente pode ser conseguida por condensação direta de cadeias laterais existentes ou pela incorporação e moléculas de ligação em ponte externas. Muitos agentes bivalentes ou polivalentes são úteis no acoplamento de moléculas de proteina a outras proteínas, péptidos ou funções amina, etc. Por exemplo, a literatura está repleta de agentes de acoplamento tais como carbodiimidas, diisocianatos, glutaraldeido, diazobenzenos e hexametilenodiaminas. Esta lista não pretende ser exaustiva dos vários agentes de acoplamento conhecidos na técnica mas, pelo contrário, é ilustrativa dos agentes de acoplamento mais comuns.
Nalgumas formas de realização, é considerado que se pode desejar primeiro derivatizar o anticorpo e, em seguida, ligar o agente terapêutico ao produto derivatizado. Os agentes de reticulação adequados para serem utilizados neste modo incluem, por exemplo, SPDP (N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato) e SMPT, 4-succinimidil-oxicarbonil-metil-(2-piridilditio)tolueno.
Além disso, as toxinas proteicas podem ser fundidas com o anticorpo anti-PSMA ou seu fragmento de ligação a antigénio por métodos genéticos para formar um proteina de fusão de imunotoxina híbrida. As proteínas de fusão podem incluir sequências peptídicas adicionais, tais como espaçadores peptídicos que ligam operacionalmente, por exemplo, o anticorpo anti-PSMA e a toxina, desde que essas sequências adicionais não afetem consideravelmente as atividades de direcionamento ou de toxina da proteína de fusão. As proteínas podem estar ligadas por uma unidade de ligação ou espaçador peptídico, tal como um péptido espaçador de 63 glicina-serina ou uma charneira peptídica, como é bem conhecido na técnica. Assim, por exemplo, a extremidade C-terminal de um anticorpo anti-PSMA ou seu fragmento de ligação a antigénio pode ser fundida com a extremidade N-terminal da molécula de toxina proteica para formar uma imunotoxina que retém as propriedades de ligação do anticorpo anti-PSMA. Outros arranjos de fusão serão conhecidos de um técnico médio na matéria. Para expressar a imunotoxina de fusão, o ácido nucleico que codifica a proteína de fusão é inserido num vetor de expressão de acordo com métodos correntes, para expressão estável da proteína de fusão, tal como em células de mamífero, tais como células CHO. A proteína de fusão pode ser isolada e purificada das células ou sobrenadante da cultura utilizando metodologia corrente, tal como uma coluna de afinidade para PSMA.
Os radionuclídeos são tipicamente acoplados a um anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio por quelação. Por exemplo, no caso de radionuclídeos metálicos, é geralmente utilizado um quelante bifuncional para ligar o isótopo ao anticorpo ou outra proteína de interesse. Tipicamente, o quelante é inicialmente ligado ao anticorpo e o conjugado quelante-anticorpo é posto em contacto com o radioisótopo metálico. Um número de quelantes bifuncionais foram desenvolvidos para este efeito, incluindo a série de aminoácidos do ácido dietilenotriaminapentaacético (DTPA) descrito nas patentes U.S. 5,124,471, 5,285,850 e 5,434,287. Como outro exemplo, agentes quelantes bifuncionais baseados em ácido hidroxâmico são descritos na patente U.S. 5,756,825. Outro exemplo é o agente quelante designado p-SCN-Bz-HEHA (ácido 1,4,7,10,13,16-hexaazaciclo-octadecano-N,N',N",N"',N"",N""'-hexaacético) (Deal et al., J. Med. Chem. 42:2988, 1999), o qual é um quelante eficaz de radiometais tais como 225Ac. Ainda outro exemplo é o DOTA 64 (ácido l,4,7,10-tetraazaciclododecano-N,N',N",N"'-tetraacético), o qual é um agente quelante bifuncional (ver McDevitt et al., Science 294:1537-1540, 2001) que pode ser utilizado num método de dois passos para marcação seguida de conjugação.
Outros agentes terapêuticos incluem também virus seletivos para replicação. Os virus competentes para replicação tal como o mutante dll520 do adenovirus que visa a via p53, ONYX-015, mata seletivamente células tumorais (Biederer, C. et al., J. Mol. Med. 80(3):163-175, 2002). Nalgumas formas de realização, o virus pode ser conjugado a anticorpos contra PSMA ou seus fragmentos de ligação a antigénio.
As composições proporcionadas na presente invenção podem ser utilizadas em conjunto com outras modalidades de tratamento terapêutico. Esses outros tratamentos incluem cirurgia, radiação, criocirurgia, termoterapia, tratamento hormonal, quimioterapia, vacinas e outras imunoterapias.
Os ADCs da invenção podem ser ligados a uma etiqueta, tal como através do seu anticorpo ou do seu fragmento de ligação a antigénio. As etiquetas incluem, por exemplo, etiquetas fluorescentes, etiquetas enzimáticas, etiquetas radioativas, etiquetas ativa em ressonância magnética nuclear, etiquetas luminescentes ou etiquetas cromóforas.
As composições proporcionadas podem incluir um veículo, excipiente ou estabilizante fisiologicamente ou farmaceuticamente aceitável misturado com o ADC. Nalgumas formas de realização, quando uma composição compreende dois ou mais ADCs diferentes, cada um dos anticorpos ou seus fragmentos de ligação a antigénio dos ADCs liga-se a um epítopo conformacional distinto do PSMA. 65
Como aqui utilizada, "célula alvo" deve significar qualquer célula indesejável num indivíduo (por exemplo, um humano ou animal) que pode ser visada por um ADC da invenção. Nalgumas formas de realização, a célula alvo é uma célula que expressa ou que sobreexpressa PSMA. As células que expressam PSMA ou as células expressoras de PSMA, incluem tipicamente células tumorais, tais como células tumorais da próstata, bexiga, pâncreas, pulmão, rim, cólon, bem como células de melanoma e de sarcoma.
As composições farmacêuticas da invenção podem ser administradas em terapia de associação, isto é, combinadas com outros agentes. Por exemplo, a terapia de associação pode incluir uma composição da presente invenção com pelo menos um agente antitumoral, imunomodulador, agente imunoestimulador ou outra terapia convencional. 0 outro agente pode estar conjugado ou ser preparado como uma molécula de fusão recombinante com um anticorpo contra PSMA ou seu fragmento de ligação a antigénio para coordenar o direcionamento do agente para células que expressam PSMA. Noutra forma de realização, o outro agente terapêutico pode não estar conjugado. Os agentes terapêuticos adicionais podem ser administrados ou posto em contacto com as células que expressam PSMA através de coadministração. "Coadministração," como aqui utilizada, refere-se à administração de dois ou mais agentes terapêuticos simultaneamente como uma mistura numa única composição, ou sequencialmente, e suficientemente próximos no tempo para que os compostos possam exercer um efeito aditivo ou até mesmo sinérgico. Ainda noutras formas de realização, um agente terapêutico adicional pode ser administrado antes, durante ou após a administração de um ou mais ADCs ou composições dos mesmos. 66
Como aqui utilizado, "veiculo farmaceuticamente aceitável" ou "veiculo fisiologicamente aceitável" inclui quaisquer e todos os sais, solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotónicos e de retardamento da absorção, e semelhantes que são compatíveis fisiologicamente. Nalgumas formas de realização, o veículo é adequado para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, parentérica, espinal ou epidérmica (por exemplo, por injeção ou infusão). Dependendo da via de administração, o composto ativo pode ser revestido num material para proteger o composto da ação de ácidos e outras condições naturais que possam inativar o composto.
Quando administradas, as preparações farmacêuticas da invenção são aplicadas em quantidades farmaceuticamente aceitáveis e em composições farmaceuticamente aceitáveis. 0 termo "farmaceuticamente aceitável" significa um material não tóxico que não interfere com a eficácia da atividade biológica dos ingredientes ativos. Tais preparações podem conter rotineiramente sais, agentes tampão, conservantes, veículos compatíveis e, opcionalmente, outros agentes terapêuticos, tais como agentes de potenciação imune suplementares incluindo adjuvantes, quimiocinas e citocinas. Quando utilizados em medicina, os sais devem ser farmaceuticamente aceitáveis, mas os sais não farmaceuticamente aceitáveis podem ser convenientemente utilizados para preparar os sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos e não são excluídos do âmbito da invenção.
Um sal retém a atividade biológica desejada do composto parental e não confere quaisquer efeitos toxicológicos indesejados (ver por exemplo, Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sei. 66: 1-19). Os exemplos desses sais incluem sais 67 de adição de ácido e sais de adição de base. Os sais de adição de ácido incluem aqueles derivados de ácidos inorgânicos não tóxicos, tais como cloridrico, nitrico, fosfórico, sulfúrico, bromidrico, iodidrico, fosforoso e semelhantes, bem como de ácidos orgânicos não tóxicos tais como ácidos mono- e dicarboxilicos alifáticos, ácidos alcanóicos substituidos com fenilo, ácidos hidroxi-alcanóicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfónicos alifáticos e aromáticos, e semelhantes. Os sais de adição de base incluem aqueles derivados de metais alcalino-terrosos, tais como sódio, potássio, magnésio, cálcio e semelhantes, bem como de aminas orgânicas não tóxicas, tais como N,N'-dibenziletilenodiamina, N-metilglucamina, cloroprocaina, colina, dietanolamina, etilenodiamina, procaina e semelhantes.
Se desejado, um ADC pode ser combinado com um veiculo farmaceuticamente aceitável. 0 termo "veiculo farmaceuticamente aceitável" como aqui utilizado significa um ou mais enchimentos sólidos ou líquidos, diluentes ou substâncias de encapsulação compatíveis que são adequadas para administração num humano. 0 termo "veículo" denota um ingrediente orgânico ou inorgânico, natural ou sintético, com o qual o ingrediente ativo é combinado para facilitar a aplicação. As componentes das composições farmacêuticas podem ser também co-misturadas de uma maneira que não exista qualquer interação que prejudique substancialmente a eficácia farmacêutica desejada.
As composições farmacêuticas podem conter agentes tampão adequados, incluindo: ácido acético num sal; ácido cítrico num sal; ácido bórico num sal; e ácido fosfórico num sal. 68
As composições farmacêuticas podem também conter, opcionalmente, conservantes adequados, tais como: cloreto de benzalcónio; clorobutanol; parabenos e timerosal.
As composições farmacêuticas podem ser convenientemente apresentadas na forma de dosagem unitária e podem ser preparadas por qualquer um dos métodos bem conhecidos na técnica de farmácia. Todos os métodos incluem o passo de colocar o agente ativo em associação com um veiculo que constitui um ou mais ingredientes auxiliares. Em geral, as composições são preparadas colocando, uniforme e infimamente, o composto ativo em associação com um veiculo liquido, um veiculo sólido finamente dividido, ou ambos, e em seguida, se for necessário, moldando o produto.
As composições adequadas para administração parentérica compreendem convenientemente uma preparação aquosa ou não aquosa estéril dos compostos, a qual é, nalgumas formas de realização, isotónica com o sangue do destinatário. Esta preparação pode ser formulada de acordo com métodos conhecidos utilizando dispersantes ou humectantes e agentes de suspensão adequados. A preparação injetável estéril pode ser também uma solução ou suspensão injetável estéril num diluente ou solvente não tóxico, aceitável por via parentérica, por exemplo, como uma solução em 1,3-butano-diol. Entre os veiculos e solventes aceitáveis que podem ser utilizados encontram-se a água, solução de Ringer e solução isotónica de cloreto de sódio. Além disso, os óleos fixos, estéreis são convencionalmente utilizados como um solvente ou meio de suspensão. Para este efeito, pode utilizar-se qualquer óleo fixo suave incluindo mono- ou di-glicéridos sintéticos. Além disso, os ácidos gordos, tais como o ácido oleico, podem ser utilizados na preparação de injetáveis. As formulações transportadoras adequadas para administração oral, subcutânea, intravenosa, intramuscular, 69 etc. podem ser encontradas em Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA.
Os compostos ativos podem ser preparados com veículos que protegerão o composto contra libertação rápida, tal como uma formulação de libertação controlada, incluindo implantes, adesivos transdérmicos e sistemas de administração microencapsulados. Podem ser utilizados polímeros biocompatíveis, biodegradáveis, tais como acetato de etileno vinilo, polianidridos, ácido poliglicólico, colagénio, poliortoésteres e poli(ácido láctico). Muitos métodos para a preparação destas formulações encontram-se patenteados ou são geralmente conhecidos dos especialistas na técnica. Ver, por exemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Mareei Dekker, Inc., New York, 1978. A terapêutica da invenção pode ser administrada por qualquer via convencional, incluindo injeção ou por infusão gradual ao longo do tempo. A administração pode ser, por exemplo, oral, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intracavidade, intratumoral ou transdérmica. Quando são utilizados terapeuticamente compostos contendo anticorpos, as vias de administração incluem a intravenosa e por aerossol pulmonar. As técnicas para preparar sistemas de administração de aerossol contendo anticorpos são bem conhecidos dos especialistas na técnica. Em geral, tais sistemas utilizam componentes que não prejudicam significativamente as propriedades biológicas dos anticorpos, tal como a capacidade de ligação ao paratopo (ver, por exemplo, Sciarra e Cutie, "Aerosols," em Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, 1990, pp. 1694-1712). Os especialistas na técnica podem determinar facilmente os vários parâmetros e condições para 70 produzir aerossoles de anticorpo sem recorrer a experimentação excessiva.
As composições da invenção são administradas em quantidades eficazes. Uma "quantidade eficaz" é a quantidade de qualquer um dos ADCs aqui proporcionados que sozinha, ou em conjunto com outras doses e/ou outros agentes terapêuticos, produz a resposta desejada, por exemplo, trata uma doença mediada por PSMA num indivíduo. Isto pode envolver apenas abrandar temporariamente a progressão da doença, embora, nalgumas formas de realização, envolva parar permanentemente a progressão da doença. Isto pode ser seguido por métodos de rotina. A resposta desejada para tratamento da doença ou condição pode ser também atrasar o início ou mesmo prevenir o início da doença ou condição. Uma quantidade que é eficaz pode ser a quantidade de um ADC sozinho que produz o resultado terapêutico desejado. Uma quantidade que é eficaz é também a quantidade de um ADC em associação com outro agente que produz o resultado desej ado.
Evidentemente, tais quantidades dependerão da doença mediada por PSMA particular a ser tratada, da gravidade da condição, dos parâmetros individuais do doente incluindo idade, condição física, tamanho e peso, a duração do tratamento, a natureza da terapia simultânea (se é que alguma), a via de administração específica e fatores semelhantes dentro do conhecimento e perícia do praticante na área da saúde. Estes fatores são bem conhecidos dos técnicos médios na matéria e podem ser abordados com experimentação meramente de rotina. É geralmente preferido que seja utilizada uma dose máxima das componentes individuais ou associações das mesmas a serem utilizadas, isto é, a dose segura mais elevada de acordo com um parecer médico idóneo. No entanto, os técnicos médios na matéria 71 compreenderão que um doente pode permanecer numa dose menor ou dose tolerável por razões médicas, razões psicológicas ou, virtualmente, por quaisquer outras razões.
As composições farmacêuticas utilizadas nos métodos anteriores são preferencialmente estéreis e contêm uma quantidade eficaz de um ADC, sozinho ou em associação com outro agente, para produzir a resposta desejada numa unidade de peso ou volume adequada para administração a um doente. A resposta pode ser medida, por exemplo, determinando os efeitos fisiológicos da composição de ADC, tal como a regressão de um tumor ou diminuição dos sintomas da doença. Outro ensaios serão conhecidos de um técnico médio na matéria e podem ser utilizados para medir o nivel da resposta.
As doses de ADCs administradas a um indivíduo podem ser escolhidas de acordo com diferentes parâmetros, em particular de acordo com o modo de administração utilizado e o estado do indivíduo. Outros fatores incluem o período de tratamento desejado. Na eventualidade de uma resposta num indivíduo ser insuficiente às doses iniciais aplicadas, podem ser utilizadas doses mais altas (ou doses eficazmente mais altas por uma via de administração diferente, mais localizada) na medida em que a tolerância do doente o permita.
Em geral, as doses podem variar desde cerca de 10 yg/kg até cerca de 100 000 yg/kg. Nalgumas formas de realização, as doses podem variar desde cerca de 0,1 mg/kg até cerca de 20 mg/kg. Ainda noutras formas de realização, as doses variam desde cerca de 0,1 mg/kg até 5 mg/kg, 0,1 mg/kg até 10 mg/kg ou 0,1 mg/kg até 15 mg/kg. Ainda noutras formas de realização, as doses variam desde cerca de 1 mg/kg até 5 mg/kg, 5 mg/kg até 10 mg/kg, 10 mg/kg até 15 mg/kg ou 72 15 mg/kg até 20 mg/kg. Noutras formas de realização, a dose é de cerca de 0,1 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, 7 mg/kg, 10 mg/kg, 12 mg/kg, 15 mg/kg, 17 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg ou 30 mg/kg. Noutra forma de realização, a dose é de cerca de 1 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg ou 6 mg/kg. Com base na composição, a dose pode ser administrada continuamente, tal como através de uma bomba continua, ou em intervalos periódicos. Nalgumas formas de realização, quando o ADC é administrado por via intravenosa, a dose é entre 0,1 e 20 mg/kg ou qualquer valor entre estes. Os intervalos de tempo desejados de doses múltiplas de uma composição particular pode ser determinados sem experimentação excessiva por um especialista na técnica. Outros protocolos para a administração das composições proporcionadas serão conhecidos de um técnico médio na matéria, nos quais a quantidade de dose, plano de administração, sitios de administração, modo de administração e semelhantes serão diferentes dos anteriores. Nalgumas formas de realização, os individuos são administrados com o ADC com uma regímen de dosagem de q4d x 3 ou q4d x 6. Numa forma de realização, a dose é administrada por via intravenosa. Noutra forma de realização, o regímen de dosagem é uma única dose intravenosa. A administração das composições de ADC a mamíferos diferentes de humanos, por exemplo para fins de avaliação ou fins terapêuticos veterinários, é realizada essencialmente nas mesmas condições como descritas acima.
As composições da presente invenção são úteis para diagnóstico e terapêutica in vitro e in vivo. Por exemplo, estas moléculas podem ser administradas a células em cultura, por exemplo in vitro ou ex vivo, ou num indivíduo, 73 por exemplo, in vivo, para tratar, prevenir ou diagnosticar uma variedade de doenças mediadas por PSMA. Como aqui utilizado, o termo "indivíduo" pretende incluir animais humanos e não humanos. Os indivíduos incluem um doente humano possuindo um distúrbio caracterizado pela expressão, tipicamente expressão aberrante (por exemplo, sobreexpressão) de PSMA, tais distúrbios são incluídos na definição de "doença mediada por PSMA".
As composições aqui proporcionadas podem ser utilizadas na terapia in vivo de cancro. Os ADCs podem ser utilizados para inibir a proliferação de células ou tecidos malignos, após administração e localização dos conjugados. Nalgumas formas de realização, as composições proporcionadas podem incluir anticorpos anti-PSMA que podem mediar a destruição do tumor por fixação de complemento ou citotoxicidade celular dependente de anticorpo. Alternativamente, as composições podem conter um agente terapêutico adicional para originar efeitos terapêuticos sinérgicos (Baslya e Mendelsohn, 1994 Breast Câncer Res. and Treatment 29:127-138) .
Nalgumas formas de realização, as composições da invenção podem ser também administradas em conjunto com complemento e/ou anticorpos anti-PSMA não conjugados. Por conseguinte, encontram-se no âmbito da invenção as composições compreendendo ADC e soro ou complemento. Estas composições são vantajosas pelo facto do complemento estar localizado em estreita proximidade com os anticorpos humanos ou seus fragmentos de ligação a antigénio. Alternativamente, os ADCs, anticorpos ou seus fragmentos de ligação a antigénio e/ou complemento ou soro podem ser administrados separadamente. 74 A utilização dos ADCs da presente invenção tem um número de vantagens. Uma vez que os ADCs visam preferencialmente o PSMA, por exemplo, em células de cancro da próstata, os outros tecidos podem ser poupados. Como uma consequência, o tratamento com tais agentes biológicos é mais seguro, particularmente para doentes mais idosos. Nalgumas formas de realização, prevê-se que o tratamento com os ADCs de acordo com a presente invenção seja particularmente eficaz, porque ele pode dirigir niveis altos de ADCs para a medula óssea e gânglios linfáticos onde podem predominar metástases de cancro, tais como metástases de cancro da próstata. 0 tratamento com ADCs de acordo com a presente invenção pode ser eficazmente seguido com parâmetros clínicos tais como o antigénio específico da próstata no soro e/ou as características patológicas do cancro de um doente, incluindo fase, pontuação Gleason, invasão extracapsular, seminal, vesicular ou perineural, margens positivas, gânglios linfáticos envolvidos, etc. Alternativamente, estes parâmetros podem ser utilizados para indicar quando deve ser utilizado um tratamento desse tipo.
Estão também no âmbito da invenção os kits compreendendo as composições, por exemplo, um ou mais ADCs da invenção e instruções de utilização. Os kits podem conter ainda pelo menos um reagente adicional, tal como complemento, um agente quimioterapêutico, um corticosteroide, ou um ou mais anticorpos que ligam PSMA. Outros kits podem incluir também multímeros de PSMA. Noutra forma de realização, um kit pode compreender um veículo a ser compartimentado para receber em confinamento restrito um ou mais meios recipientes ou série de meios recipientes tais como tubos de ensaio, frascos, balões, frascos, seringas ou semelhantes. Um primeiro dos referidos meios recipientes ou série de meios recipientes pode conter um ou mais anticorpos anti-PSMA ou 75 seus fragmentos de ligação a antigénio. Nalgumas formas de realização, um segundo meio recipiente ou série de meios recipientes pode conter MMAE ou MMAF ou o composto de Fórmula 1 conjugado com MMAE ou MMAF. Nalgumas formas de realização, um terceiro meio recipiente ou série de meios recipientes contêm um composto de Fórmula 1. Pode ser preparados kits para serem utilizados num método de localização do tumor e terapia in vivo contendo os ADCs. As componentes dos kits podem ser embaladas em meio aquoso ou na forma liofilizada. As componentes dos conjugados ADC podem ser fornecidas na forma completamente conjugada, na forma de intermediários ou como unidades separadas a serem conjugadas pelo utilizador do kit.
Como aqui utilizado em relação a polipéptidos, proteínas ou seus fragmentos, "isolado" significa separado do seu ambiente nativo e presente em quantidade suficiente para permitir a sua identificação ou utilização. Isolado, quando se refere a uma proteina ou polipéptido, significa, por exemplo: (i) produzido seletivamente por clonagem de expressão ou (ii) purificado por cromatografia ou eletroforese. As proteínas ou os polipéptidos isolados podem ser, mas não precisam de ser, substancialmente puros. 0 termo "substancialmente puro" significa que as proteínas ou polipéptidos estão essencialmente livres de outras substâncias com as quais podem ser encontrados na natureza ou em sistemas in vivo, numa extensão prática e apropriada para a sua utilização pretendida. Os polipéptidos substancialmente puros podem ser produzidos por técnicas bem conhecidas na matéria. Uma vez que uma proteína isolada pode ser misturada com um veículo farmaceuticamente aceitável numa preparação farmacêutica, a proteína pode compreender apenas uma pequena percentagem em peso da preparação. Não obstante, a proteína está isolada na medida 76 em que foi separada das substâncias com as quais pode estar associada em sistemas vivos, isto é, isolada de outras proteínas.
As composições aqui proporcionadas pode estar na forma liofilizada ou ser proporcionadas em meio aquoso. A presente invenção é ainda ilustrada pelos seguintes Exemplos.
Exemplos
Exemplo 1: Atividade Antitumoral Potente de um Conjugado de Auristatina, Completamente Humano
Anticorpo Monoclonal para o Antigénio de Membrana Especifico da Próstata
Materiais e Métodos
Linhas de Células e Anticorpos
As LNCaP™ (CRL-1740), P03™ (CRL-1435) e 3T3™ (CRL-2752) foram obtidas de American Type Culture Collection (Rockville, MD) . A linha de células C4-2, uma sublinha de células de LNCaP™, foi obtida de The Cleveland Clinic Foundation (Cleveland, OH). Uma linha de células 3T3™-PSMA foi obtida de Memorial Sloan-Kettering Câncer Center (New York, NY). As LNCaP™, C4-2 e PC-3™ foram cultivadas em RPMI 1640 (Life Technologies, Gaithersburg, MD) , e as 3T3™ e 3T3™-PSMA foram cultivadas em DMEM (Life Technologies). Os meios de cultura foram suplementados com 10% de soro fetal bovino (Hyclone, Logan, UT), L-glutamina, penicilina e estreptomicina (Life Technologies). Foi determinado que as 77 células C4-2, LNCaP™ e 3T3™-PSMA expressam PSMA a níveis de aproximadamente 2 x 105, 6 x 105 e >1 x 106 cópias/célula, respetivamente, de acordo com métodos publicados (Ma D, ei al., Leukemia 2 0 02;16:60-6.)· A C4-2 é um subclone independente de androgénio das células LNCaP™ dependentes de androgénio. A PC-3™ é uma linha de células indiferenciadas de cancro da próstata que não expressa PSMA. Os mAbs contra PSMA (AB-PG1-XG1-006 (PTA-4403 e PTA-4404) e Abgenix 4.40.2 (PTA-4360)) foram produzidos como descrito anteriormente no Pedido de Patente U.S. n° 10/395,894 e Schulke N et al., PNAS EUA, 2003; 100:12590-5, cada um dos quais é aqui incorporado por referência na sua totalidade. O Abgenix 4.40.2 foi utilizado como um controlo. Um mAb contra PSMA completamente humano (IgGl,x) foi gerado em ratos transgénicos para o lócus do gene da imunoglobulina humana (XenoMice™, Abgenix, Inc., Fremont, CA) após imunização com PSMA solúvel recombinante e células LNCaP como anteriormente descritas (Schulke N et al., PNAS EUA, 2003; 100 :12590-5) .
Interiorização de PSMA
Os mAbs foram modificados com quelatos bifuncionais de ácido ciclo-hexil-dietilenotriaminopentaacético (CHX-DTPA) obtidos do National Câncer Institute (Bethesda, MD) , e marcados com ιηΙη (PerkinElmer, Boston, MA) como anteriormente descrito (Ma D, et al., Leukemia 2002,-16:60-6; Nikula TK, et al., J Nucl. Med 1999;40:166-76). Foi determinado que o mAb marcado com ιηΙη era >90% imunorreactivo incubando com o conjugado radioativo com um excesso de células 3T3™-PSMA e medindo a fração ligada de acordo com métodos publicados (Ma D, et al., Leukemia 2002;16:60-6; Nikula TK, et al., J Nucl.Med 1999,-40:166-7 6) . Para análise da interiorização, mAb marcado com i:L1In 78 foi incubado com 2 x 105 células C4-2 a 37°C em 5% de C02. Em pontos sequenciais no tempo, o mAb não ligado foi removido por lavagem em PBS e o mAb na superfície da célula foi eluido utilizando tampão a pH baixo (pH 2,4, glicina/NaCl) . 0 eluato de pH baixo foi contado separadamente do sedimento celular e a percentagem de interiorização foi calculada como anteriormente descrito (McDevitt MR, et al., Câncer Res 2 0 0 0; 60:6095-100).
Preparação de Conjugados Anticorpo-Fármaco (DTNB) (Pierce A síntese e conceção das unidades de ligação e a conjugação da unidade de ligação ao fármaco citotóxico foram realizadas como descrito na Patente U.S. n° 6,884,889 e Patente U.S. n° 6,214,345, cada uma das quais é aqui incorporada por referência na sua totalidade. A conjugação de mAbs com maleimidocaproílo (mc)-valina (Vai)-citrulina (Cit)-monometilauristatina E (MMAE) foi realizada como descrito (Doronina SO, et al., Nat. Biotechnology. 2003; 21:778-84) . O mAb contra PSMA e a IgGl humana de controlo de isotipo (Calbiochem, San Diego, CA) em PBS contendo borato 50 mM, pH 8,0, foram tratados com ditiotreitol (DTT) (10 mM final) a 37°C durante 30 min. As concentrações da reação final foram 7,5 mL - 8,0 mL, 1 mL de borato de sódio 0,5 M, pH 8 e NaCl 0,5 Μ, 1 mL de DTT 100 mM e 0,5 mL ou 0 mL, respetivamente, de PBS. Esta solução foi incubada a 40°C durante lh e o anticorpo purificado por uma coluna de filtração em gel. A coluna foi equilibrada com DTPA 10 mM em PBS a 10 mL/min, carregada com 10,0 mL da mistura de redução de anticorpo e eluída a 8 mL/min em tampão de PBS/DTPA. A concentração de anticorpo-cisteína-tióis produzidos foi determinada titulando com 5,5'-ditio-bis-(ácido 2-nitrobenzóico) 79
Chemical Co., Rockford, ILO). Um produto químico equivalente pode ser obtido de Sigma (St. Louis, MO). 0 mAb Abgenix 4.40.2 completamente reduzido (22,6 mL de mAb 7,8 μΜ, cisteína-tiol 75,6 μΜ) foi parcialmente reoxidado com 35,43 pL de DTNB 10 mM e o mAb AB-PG1-XG1-006 completamente reduzido (25,1 mL de mAb 11,2 μΜ, cisteína-tiol 95,8 μΜ) foi parcialmente reoxidado com 56,27 pL de DTNB10 mM. A cor da solução ficou imediatamente amarela. O fármaco mc-Val-Cit-para-aminobenzilcarbamato-MMAE (vcMMAE) foi então conjugado com os mAbs parcialmente reoxidados como se segue: os mAbs foram primeiro arrefecidos até 0°C. A vcMMAE (5 equivalentes molares por anticorpo: 89,7 e 140,6 pL, respetivamente, de uma solução-mãe de vcMMAE 10 mM) foi dissolvida em 5 mL de acetonitrilo, em seguida adicionada à solução de anticorpo enquanto se agitava cuidadosamente em vórtex. As misturas reacionais foram incubadas sobre gelo. Não foi observada qualquer alteração adicional de cor. As misturas reacionais foram desativadas com 20 equivalentes molares de cisteína/fármaco. 0 conjugado foi purificado utilizando uma coluna de filtração de gel a 4°C e eluída com PBS a 8,0 mL/min. Determinou-se que os ADCs tinham > 98% de mAb monomérico contendo 3,0-3,5 fármacos por mAb utilizando métodos publicados (Doronina SO, et al., Nat Biotechnol. 2003;21:778-84).
Alternativamente, a conjugação de mAbs com maleimidocaproílo (mc)-valina (Vai)-citrulina (Cit)-monometilauristatina E (MMAE) foi realizada como descrito (Doronina SO, et al., Nat. Biotechnology. 2003;21:778-84). O mAb contra PSMA e a IgGl humana de controlo de isotipo (Calbiochem, San Diego, CA) em PBS contendo borato 50 mM, pH 8,0, foram tratados com ditiotreitol (DTT) (10 mM final) 80 a 37 °C durante 30 min. Os mAbs foram trocados para PBS contendo DTPA 1 mM (Aldrich, Milwaukee, WI) por passagem através de uma coluna Sephadex G-25 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) . As soluções de mAb foram geladas a 4°C e combinadas com o derivado de fármaco de maleimido em CH3CN frio. Após 1 hora, as reações foram desativadas com cisterna em excesso, e os conjugados foram concentrados e trocados para tampão de PBS. Determinou-se que os ADCs têm > 98% de mAb monomérico contendo 3,0-3,5 fármacos por mAb utilizando métodos publicados (Doronina SO, et al., Nat Biotechnol. 2003;21:778-84).
Reatividade de ADCs com a Superfície de Células, PSMA A ligação de mAb e de ADC contra PSMA a células 3T3™-PSMA e 3 τ 3™ parentais foi analisada utilizando um citómetro de fluxo FACSCalibur (BD Bioscience, San Diego, CA) . Resumidamente, 2 x 105 células 3T3™-PSMA (ou 3T3™) foram incubadas com diferentes concentrações de mAb ou ADC sobre gelo durante lh. Depois de lavar, a presença de anticorpo ligado foi detetada utilizando IgG anti-humana de cabra-FITC (Caltag Laboratories, Burlingame, CA). Foram examinados em paralelo anticorpo e ADC de controlo de isotipo.
Ensaio de Citotoxicidade In Vitro
Foram adicionadas células positivas para PSMA (C4-2, LNCaP™ ou 3T3™-PSMA) e células negativas para PSMA (PC-3™ ou 3T3™) a microplacas de 96 poços (Falcon, BD Biosciences, San Jose, CA) a 2,5 x 103 células/poço e incubadas de um dia para o outro a 37 °C e 5% de CO2. As células foram em seguida incubadas com ADCs sucessivamente diluidos durante 4 dias. O meio de cultura de células foi substituído por 81 meio fresco contendo Azul de Alamar a 10% (Biosource International, Camarillo, CA) e as células foram incubadas durante 4h. As placas foram em seguida lidas num leitor de fluorescência de placas utilizando um comprimento de onda de excitação de 530 nm e um comprimento de onda de emissão de 590 nm. A sobrevivência celular foi comparada em culturas tratadas e não tratadas, e determinada a concentração de ADC necessária para matar 50% das células (valor de IC50) .
Modelo de Xenoenxerto de Cancro da Próstata Independente de Androgénios
Todos os estudos animais foram realizados de acordo com as diretrizes da Comissão de Tratamento e Utilização de Animais. Ratos glabros machos atimicos (National Câncer Institute, Frederick, MD) com 6-8 semanas de idade foram implantados com uma injeção intramuscular de 5 x 106 células C4-2 misturadas com Matrigel a 50% (Beckon Dickinson Labware, Bedford, MA) na pata posterior esquerda como descrito (McDevitt MR, et ai., Câncer Res 2000;60:6095-100). Aproximadamente 1 dia antes do inicio do tratamento, os animais foram selecionados aleatoriamente de acordo com os níveis de antigénio específico da próstata (PSA) no soro como medidos por ELISA (Medicorp, Montreal, Quebec, Canadá) . Os ADC, mAbs e controlo de veículo foram administrados via injeção na veia da cauda. Na primeira série de experiências, os ratos foram tratados em grupos de 6 com 2 ou 10 mg/kg de ADC contra PSMA ou com controlo de veículo. O tratamento foi iniciado 17 dias após implantação e consistiu de 3 injeções em intervalos de 4 dias (q4d x 3). A segunda série de experiências examinou níveis de dose de 0, 3 ou 6 mg/kg. O tratamento foi iniciado 14 dias após implantação e consistiu de 6 injeções em intervalos de 4 82 dias (q4d x 6) . Os animais foram seguidos quanto ao seu aspeto físico, peso corporal, nível de PSA e tamanho do tumor. As taxas de sobrevivência foram registadas ao longo dos estudos.
Análises Estatísticas
Os efeitos dos tratamentos foram examinados quanto à significância através de testes t (para os níveis de PSA) ou testes de Mantel-Cox (para a sobrevivência dos animais) utilizando análises emparelhadas, bilaterais. Os dados foram considerados significativos quando P < 0,05.
Resultados
Interiorização de mAb contra PSMA em Células de Cancro da Próstata Humano A interiorização foi examinada utilizando mAb contra PSMA marcado com ιηΙη e células C4-2. A ligação total e a percentagem de interiorização ao longo do tempo são ilustradas na Figura 1. Mais de metade do mAb ligado foi interiorizado em menos de 2h (Figura IA) . A ligação total aumentou ao longo do tempo, presumivelmente devido a reciclagem do PSMA (Figura 1B) . Assim, o mAb contra PSMA é prontamente interiorizado em células que expressam PSMA.
Reatividade do ADC contra PSMA com Células que expressam PSMA
Foi utilizada citometria de fluxo para comparar a ligação de mAb e ADC contra PSMA. Os mAb e ADC não modificados apresentaram níveis comparáveis de ligação a 3T3™-PSMA ao longo de uma grande gama de diluições (Figura 2) . Nem a 83 quantidade de ligação máxima nem a concentração necessária para ligação semi-máxima foram consideravelmente afetadas pela conjugação. Não foi observada qualquer ligação significativa do ADC ou anticorpo de controlo de isotipo às células 3T3™-PSMA ou do mAb ou ADC contra PSMA às células 3T3™ parentais.
Potência e Seletividade In vitro do ADC contra PSMA 0 PSMA e os ADCs de controlo foram testados quanto à citotoxicidade in vitro contra linhas de células de cancro da próstata humano e células 3T3™-PSMA. A Figura 3 ilustra as curvas dose-resposta para células C4-2 positivas para PSMA e células PC-3™ negativas para PSMA numa experiência representativa, e os valores de IC50 para as várias linhas de células são listadas no Quadro 2. 0 ADC contra PSMA elimina de forma potente todas as linhas de células positivas para PSMA examinadas a valores de IC50 de 65-210 pM, enquanto estas concentrações não tiveram qualquer efeito nas células negativas para PSMA. Em contraste foram necessárias concentrações quase 1000 vezes superiores para o ADC de controlo, cuja atividade foi independente da expressão de PSMA (Figura 3 e Quadro 2).
Quadro 2: Sumário da citotoxicidade in vitro (valores de IC50 em pM) C4-2 LNCaP™ 3T3™-PSMA ADC contra PSMA 65 ±19 (n = 3) 83 ±21 (n = 2) 208 ±37 (n = 3) ADC de controlo 54,954 (n = 1) 72,444 (n = 1) 154,880 (n = 1) Seletividade* 848 877 744 *Seletividade é igual à razão dos valores de IC50 observados para 0 ADC contra PSMA e 0 ADC de controlo.
Eficácia do ADC contra PSMA num Modelo de Xenoenxerto de Cancro da Próstata Independente de Androgénios 84 A eficácia in vivo do ADC contra PSMA foi avaliado num modelo de cancro da próstata humano independente de androgénios em rato. Ratos glabros foram enxertados com células C4-2 por via intramuscular na pata posterior esquerda. Aproximadamente 14-17 dias mais tarde, os níveis de PSA no soro foram medidos e utilizados para atribuir aleatoriamente os animais a grupos de tratamento. Os animais foram tratados por via intravenosa com o ADC contra PSMA e os animais foram seguidos quanto à carga tumoral, niveis de PSA e outros parâmetros durante 500 dias.
Na primeira experiência, os animais foram tratados q4d x 3 com 0, 2 ou 10 mg/kg de ADC contra PSMA. Os tumores não
tratados cresceram rapidamente e os animais tiveram uma sobrevivência mediana de 32 dias. Em contraste, os grupos tratados com 2 mg/kg e 10 mg/kg de ADC contra PSMA tinham sobrevivências medianas de 58 dias (P = 0,0035) e 94,5 dias (P = 0,0012), respetivamente (Quadro 3, Figura 4A). O tratamento com ADC contra PSMA melhorou significativamente a sobrevivência mediana até 4,5 vezes de uma maneira dependente da dose. Não houve qualquer evidência de toxicidade relacionada com o tratamento.
Os niveis de PSA no soro foram medidos ao longo do tempo por ELISA. A Figura 4B representa a concentração de PSA média em cada grupo aos 17, 23 e 30 dias do estudo. O tratamento com 10 mg/kg reduziu os niveis de PSA >10 vezes de 8,8 ± 11,7 ng/mL no dia 17 para 0,7 ± 0,9 ng/mL no dia 30, enquanto os niveis de PSA no grupo de controlo aumentaram >60 vezes ao longo do mesmo intervalo de tempo. Foi observada uma resposta intermédia a 2 mg/kg de ADC contra PSMA. As diferenças nos niveis de PSA no dia 30 foram significativas para ambos os grupos de doses 2 mg/kg 85 (Ρ = 0, 0048) e 10 mg/kg (P = 0,0006) . Três dos seis animais no grupo de 10 mg/kg tiveram PSA indetetável até ao dia 52 do estudo.
Para alargar estas observações foi realizado um segundo estudo com ADC contra PSMA que incluiu também mAb não modificado e ADC de controlo de isotipo. Após seleção aleatória no dia 14 com um nivel de PSA médio de 2,0 ± 1,1 ng/mL em cada grupo (n = 5), os animais foram tratados com um regimen de q4d x 6. As curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier para cada grupo são representadas na Figura 5. Os animais tratados com controlo de veiculo, 6 mg/kg de mAb contra PSMA não modificado e 6 mg/kg de ADC de controlo tiveram tempos de sobrevivência medianos semelhantes de 29, 31 e 31 dias, respetivamente; e estas diferenças não foram significativas. No entanto, a sobrevivência mediana foi prolongada para 49 dias e 148 dias para animais tratados com 3 mg/kg e 6 mg/kg de ADC contra PSMA, respetivamente (Quadro 3) . 0 tratamento do grupo de ADC contra PSMA com 6 mg/kg melhorou a sobrevivência após seleção aleatória 7,9 vezes relativamente ao grupo de ADC de controlo (P = 0,0018) . No dia 500, 2 dos 5 animais não tinham qualquer evidência de tumor, nem PSA mensurável e foram considerados curados pelo tratamento. Como no primeiro estudo, o tratamento teve um impacto significativa nos niveis de PSA no dia 29 (P = 0, 0068 para os grupos de 6 mg/kg de PSMA e veiculo) . Além do mais, no grupo de 6 mg/kg de ADC contra PSMA, o PSA no soro diminuiu para niveis indetetáveis após o tratamento e permaneceram indetetáveis até ao dia 63 em 4 dos 5 animais. Não houve toxicidade evidente associada à terapia com ADC. O aspeto fisico e a atividade não foram afetados pelo tratamento, e os pesos corporais de animais tratados e de controlo de veiculo não foram significativamente diferentes em qualquer ponto no tempo. 86
Quadro 3: Sumário dos tempos de sobrevivência medianos de animais portadores de tumor C4-2 tratados com ADC contra PSMA
Objeto de ensaio Dose (mg/kg) Sobrevivência mediana (dias) Valor P* Estudo #1 Veículo NA 32 NA ADC contra PSMA 2 58 0,0035 ADC contra PSMA 10 95 0,0010 Estudo #2 Veículo NA 29 NA mAb contra PSMA 6 31 0,1869 ADC de controlo 6 31 0,2970 ADC contra PSMA 3 49 0,0018 ADC contra PSMA 6 148 0,0018 *Em comparação com o grupo de controlo de veículo numa análise de Mantel-Cox bilateral. NA= não aplicável.
Exemplo 2: Avaliação do mAb contra PSMA Conjugado com Três Unidades de Ligação de Fármaco Diferentes
Avaliou-se o mAb contra PSMA quando conjugado com vcMMAE e duas outras unidades de ligação a fármaco, vcMMAF e mcMMAF. As estruturas químicas completas das três unidades de ligação de fármaco diferentes são ilustradas na Figura 6.
Preparação de Três Conjugados de Unidades de Ligação de Fármaco do mAb contra PSMA
As três unidades de ligação de fármaco foram diretamente conjugadas com mAb contra PSMA através de uma ligação tioéter para preparar aproximadamente quatro fármacos por conjugados de anticorpo. A redução parcial dos dissulfuretos intercadeia do mAb ocorreu com um ligeiro excesso de tris (2-carboxietil)fosfina (TCEP) a pH 7,2 e 37°C e a conjugação posterior dos tióis livres com unidades de ligação de fármaco foi quantitativa. Resumidamente, o 87 mAb contra PSMA (10 mg, 67,5 nmol em PBS) foi incubado a 37°C com DTPA 1 mM e 169 nmol de TCEP durante 90 min. Em três pontos no tempo durante a incubação (30, 60 e 90 minutos) foram retiradas alíquotas de 50 yg de mAb e feitas reagir com um excesso de vcMMAE. A análise dos ADCs resultantes por cromatografia de interação hidrófoba permitiu acompanhar o progresso de redução. Os resultados indicaram que o mAb foi rapidamente reduzido nas condições acima, estando essencialmente concluído após 1 hora. Além disso, a extensão da redução resultou numa carga de fármaco média de 5 fármacos/mAb.
Para preparar um ADC carregado 4 vezes com unidades de ligação de fármaco a partir do mAb parcialmente reduzido acima, foram adicionados 0,5 equivalentes de DTNB para reoxidar a população de mAb de novo ao nivel desejado. Em seguida, 3 mg deste material (20,3 nmol) foi feito reagir com 101 nmol de vcMMAE, vcMMAF ou mcMMAF numa solução reacional com 15% de dimetilsulfóxido (DMSO). Esta reação prosseguiu durante 1 hora a 0°C e foi em seguida desativada com um excesso de 20 vezes de N-acetil-cisteína. Os ADCs foram separados do fármaco por reagir e de outras impurezas de molécula pequena por cromatografia de exclusão molecular (SEC) numa coluna PD-10 (Amersham Biosciences/GE Healthcare, Piscataway, NJ) e concentrados com um dispositivo de concentração centrífuga (30 kD MWCO) (Amicon Bioseparations, Millipore Corporation, Bedford, MA).
Um sumário da caracterização de três conjugados de unidades de ligação de fármaco é proporcionado nos Quadros 4-6 para vcMMAE, vcMMAF e mcMMAF, respetivamente. Para cada uma das três unidades de ligação de fármaco, o ADC contém aproximadamente 4 fármacos por mAb, como determinado pela distribuição da carga de cadeia H/L e distribuição de espécie, e <2% de fármaco livre como determinado utilizando 88 HPLC de fase inversa (RP) . Para todos os conjugados, não foram detetados quaisquer agregados por SEC-HPLC. Além disso, os rendimentos de mAb globais foram de 70-80%.
Quadro 4
Certificado de Ensaio do Conjugado 699028A mAb contra PSMA vcMMAE Redução Parcial
Ensaio Método Resultado Concentração de mAb UV 3,3 mg/mL Fármaco/mAb mol/mol Distribuição da Carga de Cadeia H/L (PLRP) Distribuição da Espécie (HIC) 00 Fármaco não Conjuqado % do fármaco total RP-HPLC <0,5 Homoqeneidade do Tamanho SEC-HPLC Não detetado % de Agregado Distribuição da Proporção Molar % do total HIC-HPLC 3,5% de 0 fármacos/Ab 19,4% de 2 fármacos/Ab 39,6% de 4 fármacos/Ab 21,0% de 6 fármacos/Ab 11,7% de 8 fármacos/Ab Anticorpo Desnaturado PLRP-HPLC 31,3% de LO 68,7% de LI 10,7% de HO 40,4% de Hl 25,1% de H2 23,7% de H3 89
Quadro 5
Certificado de Ensaio do Conjugado 699028B mAb contra PSMA vcMMAF Redução Parcial Ensaio Método Resultado Concentração de mAb mg/mL UV 3,1 Fármaco/mAb mol/mol Distribuição da Carga de Cadeia H/L (PLRP) Distribuição da Espécie (HIC) 4,4 Fármaco não Conjuqado % do fármaco total RP-HPLC <0,5 Homoqeneidade do Tamanho % de Agregado SEC-HPLC Não detetado Distribuição da Proporção Molar % do total HIC-HPLC 3,3% de 0 fármacos/Ab 18,5% de 2 fármacos/Ab 39,0% de 4 fármacos/Ab 22,2% de 8 fármacos/Ab 13,5% de 8 fármacos/Ab Anticorpo Desnaturado PLRP-HPLC 29,0% de LO 71,0% de LI 9,9% de HO 40,2% de Hl 24, 9% de H2 25,0% de H3 90
Quadro 6
Certificado de Ensaio do Conjugado 699028C mAb contra PSMA mcMMAF Redução Parcial
Ensaio Método Resultado Concentração de mAb UV 3,7 mg/mL Fármaco/mAb mol/mol Distribuição da Carga de Cadeia H/L (PLRP) Distribuição da Espécie (HIC) 4,4 Fármaco não Conjuqado % do fármaco total RP-HPLC 1,8 Homogeneidade do Tamanho SEC-HPLC Não detetado % de Agregado Distribuição da Proporção Molar % do total HIC-HPLC 3,8% de 0 fármacos/Ab 22,4% de 2 fármacos/Ab 36,3% de 4 fármacos/Ab 23,1% de 6 fármacos/Ab 14,4% de 8 fármacos/Ab Anticorpo Desnaturado PLRP-HPLC 32,7% de LO 67,3% de LI 14,7% de HO 39,6% de Hl 23,8% de H2 21, 9% de H3 91
Potência e Seletividade de Conjugados de mAb contra PSMA em Células de Cancro da Próstata Humano
Foram realizados estudos de citotoxicidade in vitro com linhas de células positivas para PSMA e negativas para PSMA. Resumidamente, foram adicionadas células positivas para PSMA (C4-2, LNCaP™ ou 3T3™-PSMA) e células negativas para PSMA (PC-3™ ou 3T3™) a microplacas de 96 poços a 2,5 x 103 células/poço e incubadas de um dia para o outro a 37°C e 5% de CO2. As células foram em seguida incubadas com ADCs diluidos sucessivamente durante 4 dias e analisados quanto à percentagem de morte de células em comparação com controlos não tratados utilizando Azul de Alamar a 10%. Foi determinada a concentração de ADCs necessária para matar 50% das células (valor de IC50) · A Figura 7 ilustra curvas dose-resposta de conjugados de vcMMAE (Figura 7A) , vcMMAF (Figura 7B) e mcMMAF (Figura 7C) para células C4-2 positivas para PSMA e células PC-3™ negativas para PSMA numa experiência representativa. Um sumário da potência (IC50) e seletividade nas linhas de células C4-2 e PC-3™ é listada no Quadro 7. As IC50S nas células C4-2 que expressam PSMA situaram-se em concentrações picomolares de 11, 42 e 60 para os conjugados de vcMMAF, mcMMAF e vcMMAE, respetivamente. Em contraste, as IC50S em células PC-3™ negativas para PSMA foram superiores a 90 nM, variando desde 94 a 264 nM. Com base na potência de cada conjugado nas PC-3™ e C4-2, calculou-se a seletividade como sendo de 13 636; 6 286 e 1 567 para os conjugados de vcMMAF, mcMMAF e vcMMAE, respetivamente. 0 conjugado de vcMMAF foi o mais potente nas linha de células C4-2 positiva para PSMA e o mcMMAF foi o menos tóxico na linha de células de controlo PC-3™. Em comparação com o conjugado de vcMMAE, houve uma melhoria de 4 vezes e 9 92 vezes na seletividade para os conjugados de mcMMAF e vcMMAF, respetivamente.
Quadro 7: Sumário da potência (valores de IC50 em pM) e seletividade in vitro
Unidade de ligação de fármaco Potência (pM) Seletividade (PC-3/C4-2) Melhoria em relação a vcMMAE C4-2 (n=3) PC-3 (n=2) vcMMAF 11 150 000 13636 9 vezes mcMMAF 42 264 000 6286 4 vezes vcMMAE 60 94 000 1567 -
Mecanismo de Morte Celular pelo Conjugado mAb contra PSMA- Fármaco
Foi realizada uma análise do ciclo celular para determinar o mecanismo de citotoxicidade mediado pelo mAb conjugado com MMAE. Células 3T3™-PSMA ou C4-2 foram cultivadas na presença de ADC contra PSMA 0,2 nM ou mAb contra PSMA não modificado 20 nM. Células não tratadas serviram como uma cultura de controlo. Às 12h, 24h e 48h, as células foram reveladas com iodeto de propidio (PI) para detetar o ADN total e analisadas por citometria de fluxo. Como indicado na Figura 8, as células tratadas com ADC contra PSMA foram paradas na fase G2. Pelas 48h após tratamento, a percentagem de células com um conjunto duplicado de cromossomas foi >50% para as culturas de ADC contra PSMA e 2% para culturas não tratadas. A paragem do ciclo celular requereu a presença de toxina, neste caso MMAE, já que apenas 3% das células tratadas com mAb não modificado estavam na fase G2/M às 48h. Os dados demonstram que o tratamento de células de cancro da próstata com ADCs de MMAF levam a uma paragem G2/M e, em seguida, apoptose das células alvo. 93
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> PSMA DEVELOPMENT COMPANY, L.L.C. MA, Dangshe MADDON, Paul J. OLSON, William C. DORONINA, Svetlana TOKI, Brian SENTER, Peter <120> CONJUGADOS de ANTICORPOS CONTRA PSMA-FÁRMACO <130> P0741.70008W000 <150> US 60 /792,360 <151> 2006- 04-14 <150> US 60 /692,399 <151> 2005- 06-20 <160> 33 <17 0> Patentln versão <210> 1 <211> 750 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 1 94
Met Trp Asn Leu Leu His Glu Thr 1 5 Arg Pro Arg Trp Leu Cys Ala Gly 20 Phe Leu Leu Gly Phe Leu Phe Gly 35 40 Ala Thr Asn Ile Thr Pro Lys His 50 55
Asp Ser Ala Vai Ala Thr Ala Arg 10 15 Ala Leu Vai Leu Ala Gly Gly Phe 25 30 Trp Phe Ile Lys Ser Ser Asn Glu 45 Asn Met Lys Ala Phe Leu Asp Glu 60 95
Leu Lys Glu Asn Ile Lys Lys Phe Leu Tyr Asn Phe Thr Gin Ile 65 70 75 60 Pro His Leu Ala Gly Thr Glu Gin Asn Phe GIa Leu Ala Lys Gin Ile 85 90 95 Gin Ser Gin Trp Lys Glu Phe Gly Leu Asp Ser Val Glu Leu Ala His 100 105 110 Tyr Asp Val Leu Leu Ser Tyr Pro Asn Lys Thr His Pro Asn Tyr Ile 115 120 125 Ser 11« Ile Asn Glu Asp Gly Asn Glu Ile Phe Asn Thr Ser Leu Phe 130 135 140 Glu Pro Pro Pro Pro Gly Tyr Glu Asn Val Ser Asp Ile Val Pro Pro 145 150 155 160 Phe Ser Ala Phe Ser Pro Gin Gly Met Pro Glu Gly Asp Leu Val Tyr 165 170 175 val Asn Tyr Ala Arg Thr Glu Asp Phe Phe Lys Leu Glu Arg Asp Met 180 185 190 Lys Ile Asn Cys Ser Gly Lys Ile Val Ile Άΐά- Arg Tyr Gly Lys val 195 200 205 Phe Arg Gly Asn Lys Val Lys Asn Ala Gin Leu Ala Gly Ala Lys Gly 210 215 220 val Ile Leu Tyr Ser Asp Pro Ala Asp Tyr Phe Ala Pro Gly Val Lys 225 230 235 240 Ser Tyr Pro Asp Gly Trp Asn Leu Pro Gly Gly Gly Val Gin Arg Gly 245 250 255 Asn Ile Leu Asn Leu Asn Gly Ala Gly Asp Pro Leu Thr Pro Gly Tyr 260 265 270 Pro Ala Asn Glu Tyr Ala Tyr Arg Arg Gly Ile Ala Glu Ala Val Gly 275 280 285 Leu Pro Ser Ile Pro Val His Pro Ile Gly Tyr Tyr Asp Ala Gin Lys 290 295 300 96
Leu Leu Glu Lys Met Gly Gly Ser Ala Pro Pro Asp Ser Ser Trp Arg 305 310 315 320
Gly Ser Leu Lys Vai Pro Tyr Asn Vai Gly Pro Gly Phe Thr Gly Asn 325 330 335
Phe Ser Thr Gin Lys Vai Lys Met His lie His Ser Thr Asn Glu Vai 340 345 350
Thr Arg Ile Tyr Asn Vai lie Gly Thr Leu Arg Gly Ala Vai Glu Pro 355 360 365
Asp Arg Tyr Vai Ile Leu Gly Gly His Arg Asp Ser Trp Vai Phe Gly 370 375 380
Gly Ile Asp Pro Gin Ser Gly Ala Ala Vai vai His Glu Ile Vai Arg 385 390 395 400
Ser Phe Gly Thr Leu Lys Lys Glu Gly Trp Arg Pro Arg Arg Thr Ile 405 410 415
Leu Phe Ala Ser Trp Asp Ala Glu Glu Pha Gly Leu Leu Gly Ser Thr 4 20 425 430
Glu Trp Ala Glu Glu Asn Ser Arg Leu Leu Gin Glu Arg Gly Vai Ala 435 440 445
Tyr Ile Asn Ala Asp Ser Ser Ile Glu Gly Asn Tyr Thr Leu Arg Vai 450 455 460
Asp Cys Thr Pro Leu Met Tyr Ser Leu Vai His Asn Leu Thr Lys Glu 465 470 475 480
Leu Lys Ser Pro Asp Glu Gly Phe Glu Gly Lys Ser Leu Tyr Glu Ser 485 490 495
Trp Thr Lys Lys Ser Pro Ser Pro Glu Phe Ser Gly Met Pro Arg Ile 500 505 5io
Ser Lys Leu Gly Ser Gly Asn Asp Phe Glu Vai Phe Phe Gin Arg Leu 515 520 525
Gly Ile Ala Ser Gly Arg Ala Arg Tyr Thr Lys Asn Trp Glu Thr Asn 530 S35 540
Lys Phe Ser Gly Tyr Pro Leu Tyr His Ser Vai Tyr Glu Thr Tyr Glu 97 545 550 555 560
Leu Vai Glu Lys Phe Tyr Asp Pro Met Phe Lys 565 570
Ala Gin Vai Arg Gly Gly Met Vai Phe Glu Leu 580 585
Leu Pro Phe Asp Cys Arg Asp Tyr Ala Vai Vai 595 600
Asp Lys Ile Tyr Ser Ile Ser Met Lys Hls Pro 610 615
Tyr Ser Vai Ser Phe Asp Ser Leu Phe Ser Ala 625 630 635
Glu Ile Ala Ser Lys Phe Ser Glu Arg Leu Gin 645 650
Asn Pro Ile Vai Leu Arg Met Met Asn Asp Glu 660 665
Arg Ala Phe Ile Asp Pro Leu Gly Leu Pro Asp 675 680
His Vai Ile Tyr Ala Pro Ser Ser His Asn Lys 690 695
Phe Pro Gly Ile Tyr Asp Ala Leu Phe Asp Ile 705 710 715
Pro Ser Lys Ala Trp Gly Glu Vai Lys Arg Glrv 725 730
Phe Thr Vai Gin Ala Ala Ala Glu Thr Leu Ser 740 745
Tyr Ala Leu Gin 620 Vai Asp Leu Arg Tyr 700 Glu Ile Glu
His Leu Thr Vai 575
Asn Ser Ile Vai 590
Arg Lys Tyr Ala 605
Glu Met Lys Thr
Lys Asn Phe Thr 640
Phe Asp Lys Ser 655
Met Phe Leu Glu 670
Pro Phe Tyr Arg 685
Ala Gly Glu Ser
Ser Lys Vai Asp 720
Tyr Vai Ala Ala 735
Vai Ala 750 <210> 2 <211> 7570 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Plasmideo 98 <400> 2 gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtcgactct csgtacaatc tgctctgatg 60 ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt gçaggtcgct gagtagtgcg 120 cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 160 ttagggttag gcgttfctgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240 gattattgac tagttatta.a tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300 tggagttecg cgttacafcaa cttacggtaa atggcccgcc tggetgaccg cccaaegscc 360 accgcccatt gacgtcaata afcgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420 attgacgtea atgggtggac tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480 atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatçgccc gcctggcatt 540 atgccoagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600 tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggc-gtgga tagcggtttg 660 actcacgggg atttccaagt cfcccaeecca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 720 S&cLStl CS3CÇ| ggactttcca aaatgtcgta scaactccgc cccattgacg caaatgggeg 780 gtaggcgtgt acggtgggag gfcctHtstaa gcagagctct ctggctasct agagaaccca 840 ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gctggctaga 300 ggtaccaagc ttggatctca ecatggagtt gggactgcgc tggggcttcc tcgttgctct 360 tttaagaggt gtccagtgtc aggtgcaatt ggtggagtct gggggaggcg tggtccagcc 1020 tgggaggtcç ctgagactct cctgtgcagc gtctggattc gcetfccagta gatatggcat 1080 gcactgggtc cgccaggctc caggcaaggg gctggagtgç gtggcagtta tatggtatga 1140 tggaagtaat aaatactatg cagactccgt gaagggecga. ttcaccatct ccagagacaa 1200 ttccaagaac acgcagtatc tgcsaatgaa cagcctgaga gccgaggaca cggctgtgta 1260 ttactgtgcg agaggcggtg acttcctcta ctactactat tacggtatgg acgtctgggg 1320 ccaagggacc acggfccaccg tctcctcagc ctccaccaag ggcccatcgg tcttccccct 1380 ggcaccefcct agcaagagca cctctgggçg cacagcggcc ctgggctgcc tggtcaagga .1.440 ctacttcccc gaaoeggtga cggtgtcgtg gaactcaggc gocctgacca gcggcgtgca 1500 caccttcccg gctgtcctae agtcctcagg actctactcc ctcagcagcg tggtgacogt 1560 gccctccagc agcttgggca ccc-agaccta catctgcaac gtgaatcaca agcccagcaa 1620 caccaaggtg gaeasgagag ttggtgagag gccagcacag ggagggaggg tgtctgctgg 1680 aagccaggct cagcgctcct gcctggacgc atcccggcta tgcagtccca gtccagggca 1740 99 gcaaggcagg ccccgtctgc ctcttcaccc ggaggcctct gcccgcccca ctoatgctca 1300 gggagagggt cttctggctt tttccccagg ctctgggcag gcacaggcta ggtgccccta 1860 âcccaggceç tgcacacaaa ggggcaggtg ctgggctcag scctgceaag agccatatcc 1920 gggaggaccc tgcccctgac ctaagcccac cccaaaggcc aaactctcca ctccctcagc 1980 tcggacacct tctctcctcc cagattccag taactcccaa tcttctctct gcagagccca 2040 aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagg taagccagcc caggcctcgc 2100 cctccagctc aaggcgggac aggtgcccta gagtagcctg catccaggga caggccccag 2160 ccgggfcgctg acacgtccac ctccatctct tcctcagcac ctgaactcet gggçrggsccg 2220 tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacscectca tgatctcccg gacccctgag 2280 gfccaeatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagacGctg aggtcaagtt caactggtac 2340 gtggaoggcg tggaçgtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 2400 acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 2460 tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagsaaac catctccaaa 2520 gcoaaaggtg ggacccgtgg ggtgcgagçg ccacatggac agaggccggc tcggcccacc 2580 ctctgccctg agagtgaccg ctgtaccaac cactgtccct acagggcagc cccgagaacc 2640 acaggtgtao accctgcccc catcccggga ggagatgacc aagaaccagg tcagcctgac 2700 ctgcctggtc aaaggcttct. atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgçgca 27 60 ge.eggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac. tccgacggct ccttcttcct 2S20 ctatagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc 2880 cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg 2940 taaatgagaa ttcctcgagt ctagagggcc cgtttaaacc egctgatcag cctcgactgt 3000 gcetfcctagt tgccagocat ctgttçtttg cccctccccc gtgccttCCt tgaçcctgga 3060 aggtgacact cocactgtcc tttcctaata aaatgaggaa attgcatcgc attgtctgag 3120 taggtgtcat tctattctgg ggggtggggt ggggcaggac agcaaggggg aggattggga 3180 agacaatagc açgcatgctg gggatgcggt gggctctatg gcttctgagg cggaaagaac 3240 cagctggggc tctagggggt atccccacgc gccctgtagc ggcgcattaa gcgcggcggg 3300 tgtggtggtt acgcgcagcg tgaccgctac acttgceagc gccctagcgc ccgctccttt 3360 egctttcttc GCttcctttc tcgccacgtt cgccggGttt ccGcgtcaag ctctaaateg 34 20 gggcatccct ttagggttcc gatttagtgc tttacggcac ctcgacccca aaaaacttga 3480 fctagggtgat ggttcacgta gtgggccate gccetçatag acggtttttc gccctttgac 3540 gttggagtcc acgttcttta atagtggact cttgttccaa actggaacaa cactcaaccc 3600 100 batctcggtc tattcttfctg atttataagg gattttgggg atttcggcct attggttaaa 3660 aaatgagctg atttaacaaa aatttascgc gaattaattc tgtggsatgt gtgtcagtfca 3720 gggtgtggaa agtccccagg etccccaggc aggcagaagt atgeaaagca tgoatctcaa 3780 ttagtcagca accaggtgtg gaaagtcccc aggctcccca gcaggcagaa gtatgcaaag 3840 catgcatctc aattagtcag caaccatagt cccgccccta actccgccca tcccgcccct 3900 aactccgccc agttccgccc attctccgcc ccatggctga ctaatttttt ttatttatgc 3960 agaggccgag gccgcctctg cctGtgagct attccagaag tagtgaggag gcttttttgg 4020 aggcctaggc ttttgcaaaa agctcccggg agcttgtata tccattttcg gatctgatca 4080 gcacgtgatg aasaagactg aactcaccgc 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tttttgtcaa gaccgacctg tccggtgccc tgaatgaact gcaggacgag gcagcçcggc 3000 tatcgtggct ggccacgacg ggcgttcctt gcgoagctgt gctcgacgtt gtcactgaag 3060 cgggaaggga ctggctgcta ttgggcgaag tgccggggca ggatcUcetç tcatctcacc 3120 ttgctcctgc cgagaaagta tccatcatgg ctgatgcaat gcggcggctg catacgcttg 3180 atccggctac otgcccattc gaccaccaag cgaaacatcg catcgagcga gcacgtactc 3240 ggatggaagc cggtcttgtc gatcaggatg atctggacga agagcatcag gggctcgcgc 3300 cagccgaact gttcgccagg ctcaaggcgc gcatgcccga cggcgaggat ctcgtcgtga 3360 cccatggcga tgcctgcttg ccgaatatca tggtggaaaa tggecgcttt tctggattca 3420 tcgactgtgg ccggctgggt gtggcggacc gctatcagga catagcgttg gctacccgtg 3480 atattgctga agagcttggc ggcgaatggg ctgaccgctt cctcgtgctt tacggtatcg 3540 cegcteccga fctcgcagcgc atcgccttct atcgccttct tgacgagttc ttctgagcgg 3600 gactctgggg ttcgaaatga ccgaccaagc gacgcccaac ctgccatcac gagatttega 3660 ttccaocgcc gecttctatg aaaggttggg cttcggaatc gttttccggg acgccggctg 3720 gatgatcctc cagcgcgggg atctcatgct ggagttcttc çcccacccca acttgtttat 3780 tgcagcttat aatggttaca aataaagcaa tageatcaea aatttcacaa ataaagcatt 3840 tttfctcacfcg cattctagtt gtggtttgtc caaactcatc aatgtatctt atcatgtctg 3900 tataccgtcg acctctagct agagcttggc gtaatcatgg tcatagctgt ttcctgtgtg 3960 aaattgttat ccgctcacaa ttccacacaa catacçagcc ggaagcataa agtgtaaagc 4020 ctggggtgcc taatgagtga gctaactcac attaattgcg ttgcgctcac tgcccgcttt 4 080 ccagtcggga aacotgtcgt gccagctgca ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg 4140 cggtttgcgt attgggcgct cttccgcttc ctcgctcact gactcgctge gctcggtegt 4200 tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat ccacagaatc 4260 141 aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa 4320 aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa 4380 tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaaçatacc aggcgtttcc 4 440 ccctggaagc tccctcgtgc gctctcotgt tccgacoctg ccgcttaccg gatacctgtc 4500 cgcctttctc ccfctcgggaa gcgtggcgct ttctcaatgc tcaogctgta ggtatctcag 4560 ttcggtgtag gtcgfctcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga 4620 ccgctgcgcc ttatceggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagae acgacttatc 4680 gccactgçca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac 4740 agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctaoactaga aggacagtat ttggtatctg 48 00 cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagaçttgçt agctcttgat ccggcaaaca 4860 aaecaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc goagaaaaaa 4920 aggatctcaa gaagatccfct tgatcttttc taeggggtci gacgctcagt ggaacgaaaa 4980 ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt 5040 aaafctaaaaa tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag 5100 ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc tgfcctatttc gttcatccat 5160 agttgcctga ctOcccgtcg tgtagataac fcacgatacgg gagggcttac catctggccc 5220 cagtgctgca atgataccgc gagacccacg ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa 5280 oçagcoagce ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca actttatccg cctccatcca 5340 gtctatfcaat. tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa 5400 cgttgttgcc attgctacag gcatcgtggt gteacgctcg tcgtttggta tggcttcatt 5460 cagctccggt tcccaacgat caaggcgagi Lacatgatcc cccatgttgi gcaaaaaagc 5520 ggttagctcc fctcggtcctc cgatcgfctgt cagaagtaag ttggccgcag tgttatcact 5580 catggttatg gcagcactgc ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc 5640 tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt ctgagsatag tgtatgcggc gsccgagttg 5700 ctcttgcccg gcgtcaatac çggataatac cgcgccacat agcagaactt uaaaagtgct'. 5760 catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc 5820 cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa ctgatottca gcatctttta ctttcaccag 5880 cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccqGa aaaaagggaa taagggcgac 5940 acggaaatgt tgaatactca tactcttcct ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg 6000 ttattgtctc atgagcggat acatatttga afcgtatttag aaaaataaac aaataggggt 6060 tccgcgcaca tttcccogaa aagtgccacc tgacgtc 6097 <210> 13 142
<211> 6094 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Plasmídeo <4 0 0> 13 gacggatcgg gagatctccc gatcocctat gçtcgactot cagtacaaic tgctcfcgatg 60 ccgcatsgfct asgccagtab ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120 ogagca&ciiafc ttaagctaca aeaaggeaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180 ttagggttag gcgttttgcg ctgcttogcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240 gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacgçggtc attagttcat agcccatata 300 tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tgçctgaccg cccaacgacc 360 cacgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt a.acgccaata gggactttca 420 attgacgtca atgggtggac tatttacggt aaaotgccca cttggcagta cateaagtgt 480 atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540 atgcccagta catgacctta igggactttc ctacttggca gcacatctac gtattagtea 600 tcgctafctac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtçga tagcggtttg 660 actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcsa tgggagtttg ttttggcacc 720 aaaatcaacg çgactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatçggcg 780 çtaggcgtgt acggtggçag gtctafcataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca 840 ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gctggetaga 900 aagcttggat ctcaccatgg tgttgcagac ccaggtcttc atttctctgt tactctggat 960 etctggtgcc tacggggsca tcgtgatgac ccagtctcca gactccctgg ctgtgtctct 1020 gggcgagagg gecacoatea actgcaagtc caaccagagt gtcttacaca gctccaacaa 1080 taagaactat ttagcttggt accagcagaa accaggacag cctcctaaat tgctcattta 1140 ttgggoattc ctccgggaat ccggggtccc tgaccgcttc agtggcagcg ggtctgggac 1200 agatttcact ctcaecatca gcaocctgca ggctgaagat gtggcagfctt attactgtca 1260 ccaatattat tctactttat atactttcgg cggagggacc aaggfcagaga tcaaacgaac 1320 ygtggctgca ccatctgtct tcaiettccc gccatctgat gagcagttga aatctggaac 1380 143 tgctagcgtt gtgtgcctgc tgaataactt ctatcccaga gaggccaaag tacagtggaa 1440 ggtggataac gccctccaat cgggtaactc ccaggagagt gtcacagagc aggacagcaa 1500 ggacagcacc tacagcctca gcagcaccct gacgctgagc aaagcagact acgagaaaaa 1560 caaagtctac gcetgcgaag tcacccatca gggcctgagc tcgcccgtca caaagagctt 1620 caacagggga gagtgttagg cggocgctcg agtctagagg gcccgtttaa acccgctgat 1680 cagoctog&c tgtgccfctct agttgccagc catctgfctgt ttgccocfccc cccgtgcctt 1740 octtgaccct ggaaggtgcc actcccactg tcctttccta ataaaatgag gaaatfcgcat 1800 cgcattgtct gagtaggtgt cattctattc tggggggtgg ggtggggcag gacaçcaagg 18 60 gggaggattg ggaagacaat agcaggcatg ctggggatgc ççtgggafcct atggcttctg 1920 aggcggaaag aaccagctgg ggctctaggg ggtatcccoa cgcgccctgt agcggegeat 1980 taagcgcggc gggtgtggtg gttacgcgca gcgtgaccgc tacacttgcc agcgccctag 2040 egcccgctcc tttcgctttc ttcccttcct ttctcgccac gttcgccggc. tttccccgtc 2100 aagctctaaa tcggggcatc cctttagggt tccgatttag tgctttacgç cacctcgacc 2160 ccaaaaaact tgsttagggt gatggttcac gtagtgggcc atcgccctga tagacggttt 2220 ttcgcccttt gacgttggag tccacgttct ttaatagtgg actcfctgttc caaaetggaa 2280 caaeactcaa ccctatctcg gtctattctt ttgatttata agggattttg gggatttcgg 2340 cctattggtt aaaaaatgag ctgafcttaac aaaaatttaa cgcgaattaa ttctgtggaa 2.400 tgtgtgtcag ttagggtgtg gaaagtcccc aggctcccca ggcaggcaga agtatgcaaa 2460 gcatgcatct caattagtca gcaaccaggt gtggaaagtc cccaggct.cc ccagcaggca 2520 gaagtatgca aagcatgcac ctoaattagt cagcaaccat agtccegccc ctaactccgc 2580 ccatcccgcc cetaactccg cccagttccg cccattctcc gccccatggc tgactaattt .2640 tttttattta tgcagaggcc gaggccgcct ctgcctctga gctattccag aagtagtgag 2700 gaggcttttt tggaggccta ggcttttgca asaagetccc gggagcttgt atafcccattt 2760 tcggatctga tcaagaçaca ggatgaggat cgtttcgcat gattgaacaa gatggattgc 2820 acgcaggttc tccggccgct tgggtggaga ggctattegg etatgactgg geacaaeaga 2880 oaatcggctg ctctgatgcc gccgtgttcc ggctgtcagc gcaggggcgc ccggttcttt 2940 ttgtcaagac cgacctgtcc ggtgccctga atgaactgca ggacgaggca gcgcggctat 3000 cgtggctggc cacgacgggc gttccttçcg cagctgtgct cgacgttgkc actgaagcgg 3060 gaagggactg çctgctattg ggcgaagtgc cggggcagga tctcetgtca tctcaccttg 3120 ctcctgccga gaaagtatcc atcatggctg atgcaatgcg gcggctgcat acgcf.tgatc 3180 cggctacetg cccattogac caecasgcça aacatcgcat cgagcgagca cgtactcgga 3240 144 tggaagccgg tcttgtcgat caggatgatc fcggacgaaga gcatcagggg ctcgcgccag 3300 ccgaactgtt cgccaggctc aaggagcgca tgcccgacgg cçaggatotc gtcgtgaccc 3360 atggcgatgc ctgcttgccg aatatcatgg tggaaaatgg ccgcttttct ggattcatcg 3420 actgtggccg gctgggtgtg gcggaccgcfc atcaggacat agcgttggct acccgtgata 3480 ttgctgaaga gcttagcggc gaatgggctg accgcttcct cgtgctttac ggtatcgccg 3540 ctcccgattc gcagcgaatc gcctfcctatc gccttcttga cgagttcttc tgagcgggac 3600 tctggggttc gaaatgaccg accaâQC^s.c gcccaacctg ccatcacgag atttcgattc 3660 caccgccgcc ttctatgaaa ggttgggctt cggaatcgtt ttccgggacg ccggetggat 3720 gatccfcccag cgcggggatc tcatgctgga gttcttcgcc Gaccccaact tgtttattgc 3780 agcttatast ggttacaaat aaagcaatag catcacaaat ttcacaaata aagcattttt 3840 tteactgcat tctagttgtg gtttgtccaa actcatcaat gtatcttatc atgtctgtat 3900 accgtcgacc tctagctaga gottggcgta atcatggtca tagctgtttc ctgtgtgaaa 3960 ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt gbaaagecfcg 4020 gggtgoctaa tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc ccgetttcca 4080 gtcgggaaac ctgtegtgcc agctgcatta atgaatcggc caacgcçcgg ggagaggcgg 4140 tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg 4200 gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg 4260 ggataacgca çgaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accçtsaaaa 4320 ggccgcgttg cuggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg 4380 acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc 4440 tçgaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc 4500 ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcaatgctca cgctgtaggt atctcagttc 4560 çgt.gtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacçaa ccccccgttc agcccgaccg 4620 ctgcgcct-ca tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagaoacg acttatcgcc 4680 actggcagca gceactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga 4740 gttcttgaag tggtggceta acfcacggcta eactagaagg acagtafcttg gtatctgcgc 4800 tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac 4860 caccgctggt agcggtggtt tctttgtttg caagcagGag attacgcgca gaaaaaaagg 4920 atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcaçtgga acgaaaaetc 4980 acgttaaggg attttggfcca tgagattatc aaaaaggatc ttoacctaga tccttttaaa 5040 145 ttaaaastga agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaaattggt ctgacagtta 5100 ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt catcoatagt 5160 tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac gatacgggag ggettacaat ctggccccag 5220 tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc aceggctcca gatttatcag caataaacca 5280 gccagccgga agggcagagc gcagaagtgg tcctgcsact ttatccgcct ccatccagtc 5340 tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcçcca gttaatagtt tgcgcaacgt 5400 tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgte acgctcgtcg tttggtatgg cttcattcag 5460 ctccggttcG caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc atgttgtgca aaaaagcggt 5520 tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg gccgcagtgt tatcactcat 5580 ggttatggca gcáctgcata attctcttac tgtcatgcea tccgtaagat getfcttctgt 5640 gactggtgag tactcaacca acrtcattctg agaatagtgt atgcggcgac cgagttgctc 5700 ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc gccacatagc agaactttaa aagtgctcat 5760 cattggaaaa ogttcthcgg ggçgaaaact ctcaaggata ttaccgctgt tgagatocag 5820 ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg atcttcagca tcttttactt tcaccagcgt 5880 ttctgggtga gcaaaaac gaaggcaaaa tgccgcaa££í aagggaataa gggcgacacg 5940 gaaatgttga ataetcatac tcttccfcttt tcaatattat tgaagcattt atcagggtta 6000 ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc 6060 gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga cgtc 6094
<210> 14 <211> 481 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Inclui a junção de clonagem BamHI/BglII, péptido sinal, região V, porção da região C e junção de clonagem 3'XbaI/NheI (pesada) ou Nhel (leve) <400> 14 146 ggatctcacc atggagttgg gactgcgctg gggcttcctc gttgctcttt taagaggtgt 60 eoagtgtcag gtgcaattgg tggagtctgg gggaggcgtg gtccagcctg ggaggtccct 120 gagactcfccc tgtgcagcgt ctggattcgc ettcagtaga tatggcatgc actgggtcaç 180 ccaggcteca ggcaaggggc tggagtgggt ggoagttata tggtatgatg gaagtaataa 240 ataetatgca gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac 300 gcaçtatctg caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag 360 aggcggtgac ttcctctact actactatta cçgtstggac gtctggggcc aagggaccac 420 ggtcaccgtc tcctcagcct ccaccaaggg cccatcggtc ttccecctgg caccctctag 4S0 c 481
<210> 15 <211> 142 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15
Met Glu leu Gly Leu Arg Trp Gly Phe Leu Vai Ala Leu Leu Arg Gly 1 5 10 15 Vai Gin cys Gin Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Vai Vai Grh 20 25 30 Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe 35 40 45* Ser Arg Tyr Gly Met Bis Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Vai Ala Vai lie Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala 65 70 75 80 Asp Ser Vai lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lvs Asn 85 90 95 Thr Gin Tyr Leu Gin Met Asn Sar Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Αερ Phe Leu Tyr Tyr Tyx Tyr Tyr Gly 115 120 125 Met Asp Vai Trp Gly Gin Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser 130 135 140
<210> 16 <211> 463 <212> ADN 147 <213> Sequência Artificial <220> <223> Inclui junção de clonagem BamHI/BglII, péptido sinal, região V, porção da região C e junção de clonagem 3'XbaI/NheI (pesada) ou Nhel (leve) <400> 16 ggatctcacc atgagggtcc ctgctcagct cctgggactc ctgctgctct ggctcccaga 60 taceagatgt gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga 120 cagagtcacc atcacttgcc gggcgagtca gggcaitagc aattatttag cctggtatca 180 gcagaaaaca gggaaagttc ctaagttcct gatctatgaa geatccaett tgcaatcagg 240 gçtcccatct cggttcagtg gcggtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag 300 Gctgcagcct gaagatgttg caacttatta ctgtcaaaat tataacagtg ceccattcac 360 tttcggccct gggsceaaag tggatatcaa acgaactgtg gctgcaccct ctgtcttcat 420 cttcccgcca tctgatgagc agttgaaatc tçgaactgct age 463
<210> 17 <211> 127 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17
Met Arg Vai Pro Ala Gin Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 Asp Thr Arg Cys Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Sar 20 25 30 Ala Ser Vai ciy Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly 35 40 45 Ile Ser Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Thr Gly Lys Vai Pro 50 55 60 Lys Phe Leu Ile Tyr Glu Ala Ser Thr Leu Gin Ser Gly Vai Pro Ser 65 70 75 80 Arg Bhe Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95 148
Ser Lau Gin Pro Glu Asp Vai Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Asn Tyr Asn 100 105 U0
Ser Ala Pro Phe Thr Phe Glv Pro Giy Thr Lys Vai Asp I.Ie Lys 115 ' 120 ' 125
<210> 18 <211> 508 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Inclui junção de clonagem BamHI/BglII, péptido sinal, região V, porção da região C e junção de clonagem 3'XbaI/NheI (pesada) ou Nhel (leve) <4 0 0> 18 ggatctcacc atggggteaa ccgccatcct caccatggag ttggggctgc gctgggttct 60 cctcgttgot cttttaagag gtgtccagtg tcaggtgcag ctggtggagt ctgggggagg 120 cgtggtccag cctgggaggt occtgagact ctcctgtgea gcgtctggat toaccfctcag 180 taactaigtc atgcsctggg tccgccaggc tccaggcaag gggetggagt gggtggcaat 240 tatatggtat gatggaagta ataaatacta tgcagactcc gtgaagggce gattcaccat 300 ctccagagac aattccaaga acacgctgta tctgoaaatg aacagcctga gagccgagga 360 cacggctgtg tattactgtg cgggtggata taactggaac tacgagtacc actactacgg 420 tatggacgtc tggggoeaag ggaccacggt caccgtctcc tcagcctcea ccaagggccc 480 atcggtcttc eccctggcac cctctagc 508
<210> 19 <211> 143 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 149 149 Met Glu Leu Gly Leu Arg Trp Vai Leu Leu Vai Ala Leu Leu Arg Gly 1 S 10 1 c Vai Gin Cya Gin Vai Gin Leu Vai Glu Ser dy Gly Gly Vai Vai Gin 20 25 30 Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 33 40 45 Ser Asn Tyr Vai Met fíis Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 30 55 60 Glu Trp Vai Ala lie Ils Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala 65 70 75 80 Asp Ser v a 1. Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Θ5 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai 100 105 110 Tvr Tyr Cys Ala Gly Gly Tyr Asn Trp Asn Tyr Glu Tyr HAs Tyr Tyr 115 120 125 Gly Mec Asp Vai Trp Gly Gin Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser 130 135 140
<210> 20 <211> 463 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Inclui junção de clonagem BamHI/BglII, péptido sinal, região V, porção da região C e junção de clonagem 3'XbaI/NheI (pesada) ou Nhel (leve) <400> 20 ggatctcscc atgagggtcc ccgctcagct cctggggcte ctgctgctct gtttcccagg 60 tgccagatgt gacatccaga tgacccagtc tccatcotca ctgtctgcat ctgtaggaga 120 caçagtcacc atcacttgtc gçgcgagtca gggcattacc aattatttag ccfcggtttca 160 gcagaaacca gggaaagccc ctaagtccct tatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg 240 ggtcccatca aagttcagcg gcsgtggatc tgggacagat ttcagtctca ccatcagcag 300 catgcagcct gaagattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt acccgatoac 360 cttcggccaa gggacacgac tggagattaa acgaactgtg gctgcaccat ofcgtcttcat 420 463 cttcccgcca tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcfc age 150
<210> 21 <211> 127 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Met Arg Vai Pro Ala GIn Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Pro 1 5 10 15 Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30 Ale Ser Vai Gly Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly 35 40 45 Ile Thr Asn Tyr Leu Ala Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro 50 55 60 X.ys Ser Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Vai Pro Ser 65 70 75 80 co >1 H Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr lie Ser 85 90 95 Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Asn 100 105 110 Ser Tyr Pro Ile Thr Phe Gly Gin Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 115 120 125
<210> 22 <211> 490 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Inclui junção de clonagem BamHI/BglII, péptido sinal, região V, porção da região C e junção de clonagem 3'XbaI/NheI (pesada) ou Nhel (leve) 151 <400> 22 ggatctcacc atggagttgg gacttagctg ggtthtcctc gttgctcttt taagaggtgfc 60 ccagtgtcag gtccagctgg tggagtctgg gggaggcgtg gtccagcctg ggaggtccct 120 gagactctcc tgtgcagcgt ctggattcac cttcagtagc tatggcatgc actgggtccg 180 ccaggctcca ggaaaggggc tggactgggt çgcaattatt tggcatgatg gaagtaataa 240 atactatgca gactccgtga agggacgatt caacatctcc agagacaatt ccaagaagac 300 gctgtacctg caaatgaaca gtttgaçagc ogsggaeacg gcfcgtgtatt actgtgegag 360 agcttgggcc tabgactacg gtgactatga atactacttc ggtatggacg tctgg.ggcca 420 agggaccacg gtcaccgtct cctcagccte caccaagggc ccatcggtct tccccctggc 480 accctctagc 4 90
<210> 23 <211> 145 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23
Met Glu Leu Gly Leu Ser Trp Vai Phe Leu Vai Al a Leu Leu Ara Gly 1 5 10 is" Vai Gin Cys Gin Vai Gin Leu Var Glu Ser Gly Gly Gly Vai Vai Gin 20 25 30 Pro Glv Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Ser Tyr Gly Met His Trp vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Asp Trp Vai Ala lie Xle Trp His Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala 65 70 75 80 Asp Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Lys 85 90 95 Thr leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Trp Ala Tyr Asp Tyr Gly Asp Tyr Glu Tyr 115 120 125 Tyr Phe Gly Met Asp Vai Trp Gly Gin Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser 130 135 140
Ser 14 5 152
<210> 24 <211> 463 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Inclui junção de clonagem BamHI/BglII, péptido sinal, região V, porção da região C e junção de clonagem 3'XbaI/NheI (pesada) ou Nhel (leve) <400> 24 ggatctcacc atgagggtcc ctgctcagct cctggggctc ctgctgctct gtttcccagg 60 tgccagatgt gacatceaga tgaeccagtc tccatcctca ctgtcfcgcat ctgtaggaga 120 cagagtcacc atcaettgte gggcgagtca gggcattagc cattatttag cctggtttca 180 gcagaaacca gggaaagccc etaagteoct gatctatgct gcafcceagtt tgcaaagtgg 240 ggtcccatca aagttcagcg gcagtggatc tgggacagat ctcactctca ccatcageag 300 cctacagcct gsagattttg caacttatts ctgccaacag tataatagtt tcccgctcac 360 tttcggcgga gggaccaagg tggagatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat 420 cttcccgcea tctgatgagc agttgaaatc tggaactgct age 463
<210> 25 <211> 127 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25
Met: Arg Vai Pro Ala Gin I>au Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Pro 15 10 15
Gly Ala Arg Cys Asp Xle Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30
Ala Ser Vai Gly Asp Arg Vai Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly 35 <30 4 5 lie Ser Hi.s Tyr Leu Ala Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro 50 55 60 153
Lys Ser Leu Xle Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Vai Pro Ser 65 70 75 80
Lys Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Xle Ser 85 90 95
Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Asn 100 105 110
Ser Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai Glu lie Lys 115 120 125
<210> 26 <211> 469 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Inclui junção de clonagem BamHI/BglII, péptido sinal, região V, porção da região C e junção de clonagem 3'XbaI/NheI (pesada) ou Nhel (leve) <400> 26 ggatcccaco atggggtcaa cegtcatcct cgccctcotc ctggctgttc tcoaaggagt 60 ctgtgccgag gtgoagctgg tgcagtetgg agcagaggtg aaaaagcccg gggagtctct 120 gaagatctcc tgtaagggtt ctggatacag ctttaccagt tactggatcg çergggtgcg 180 ocagatgccc gggaaaggcc tggagtggat ggggatcatc taicctggtg actctgatac 240 cagatacagc ccgtcottcc aaggecaggt caccatctca gccgacaagt ccatcagcac 300 cgcctacctg cagtggagca gcctgaaggc ctcggacacc gccatgtatt actgtgcaag 360 acggatggaa gcagctggcc cctttgaeta cfcggggcoag ggaacectgg tcaccgtctc 420 ctcagcetco accaagggoc carcggtctt ccccctggca ccctctagc 469
<210> 27 <211> 138 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 154
Met Gly Ser Thr Vai Ile Leu Ala Leu Leu Leu Ala Vai Leu Gin Gly 1 5 10 15 Vai Cys Ala GIu Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Çlu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phs 35 40 45 Thr Ser Tyr Trp lie Gly Trp Vai Arg Gin Met Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 GIu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser 65 70 75 80 Pro Ser Phe Gin Gly Gin Vai Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile 85 90 95 Thr Ai 3 Tyr teu Gin Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Met Ala Ala Ala Gly Pro Phe Asp Tyr Trp 115 120 125 Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 130 135
<210> 28 <211> 466 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Inclui junção de clonagem BamHI/BglII, péptido sinal, região V, porção da região C e junção de clonagem 3'XbaI/NheI (pesada) ou Nhel (leve) <400> 28 ggatcteacc atgagggtcc ocgctcagct tctcttcctt ctgctactct ggctcccaga 60 taccactgga ggaatagtga tgacgcagtc tecsgccacc ctgtctgtgt ctccagggga 120 aagagccacc ctctcctgea ggaccagtca gagtattggc tggaacttag cctggtacca 180 acagaaacot ggccaggetc ccaggetcct catctatggt gcatctteca ggaccactgg 240 tatcccagcc aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagag ttcactctca ccateagcag 300 cctgcagtct gaagattctg cagtttatta ctgtcagcat tatgataact ggcocatgig 360 çagttttggc caggggaccg agctggagat caaacgaact gtggctgcac catctgtctt 420 catcttcccg ecatctgafcg agcagtfcgaa atctggaact gctagc 466 155 <210> 29 <211> 128 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29
Met Arg Vai Pro Ala Gin Leu Leu Phe Leia Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 Asp Thr Thr Gly Gly Ile Vai Met Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser 20 25 30 Vai Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Thr Ser Gin Ser 35 40 45 lie Gly Trp Asn Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro 50 55 60 Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Thr Thr Gly Ile Pro Ala 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Ser teu Gin Ser Glu Asp Ser Ala Vai Tyr Tyr Cys Gin His Tyr iiSp 100 105 110 Asn Trp Prç Met Cys Ser Phe Gly Gin Gly Thr Glu Leu Glu Ile Lys 115 120 125
<210> 30 <211> 487 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Inclui junção de clonagem BamHI/BglII, péptido sinal, região V, porção da região C e junção de clonagem 3'XbaI/NheI (pesada) ou Nhel (leve) <400> 30 156 ggatcfccacc ccagtçtcaç gagactctcc ccaggctcca atggagtttg gtgcagctgg tgtgcagcct ggcaaggggc ggctgtgctg tggagtctgg otggattcac tggagtgggt gattttcctc gttgctcttt gggaggcgtg gtccagoctg cttcattagc tatggcatgc ggeagtiata tcatatgatg taagaggtgt ggaggtccct actgggtccg gaagtaataa atactatgca gctgtatctg agtattagtg gactccgtga caaatgaaca ggagctttat agggecgatt goctgagagc attattatsa caccatctcc tgaggacacg ctactacggg agagaoaatt gctgtgtatt atggacgtct ecaagaacac aatgtgcgag ggggccaagg gaccacggtc accgtctcct cagcctccac caagggccca tcggtcttcc ccctggeacc ctotagc 60 120 180 240 300 360 420 480 481 <210> 31 <211> 144 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31
Met Glu Phe Gly Leu Cys Trp lie Phe Leu Vai Ala Leu Leu Arg Gly 1 5 10 15 Vai Gin cys Gln Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Vai Val Gin 20 25 30 Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Xle Ser Tyr Gly Met His Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55' 60 Glu Trp Vai Ala Vai Xle Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala 63 70 75 80 Asp Ser Vai Lys Gly Arg Phe 'Thr Xle Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys A! a Arg Vai Leu Vai Giy Ala Leu Tyr Tyr Tyr Asn Tyr 115 120 125 Tyr Gly Met Asp Vai Trp Gly Gin Gly Thr Thr Vai Thr Val Ser Ser 130 135 140
<210> 32 <211> 478 <212> ADN 157 <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Inclui junção de clonagem BamHI/BglIl, péptido sinal, região V, porção da região C e junção de clonagem 3'XbaI/NheI (pesada) ou Nhel (leve) <400> 32 ggafcotcacc atgagggtec ctçctcagct cctggggctg ctaatgctcfc ggatacctgg 60 abccagtgca gatattgtga tgacccagac tccactctct ctgtcogtca cccctggaca 120 çccggcctcc atctcctgca agtctagtca gagcctcctg catagtgatg gaaagacctt 130 tttgtattgg tatctgcaga agccaggcca gcctccacag ctcctgatct atgaggtttc 240 aaaccggttc tctgçagtgc cagataggtt cagtggcagc gggtcaggga cagatttcac 300 actgaaaatc agccgggtgg aggctgagga tgttgggctt tattactgca tgcaaagtat 360 acagcttccg ctcactttcg gcggagggaa caaggtggsg atcaaacgaa ctgtggctgc 420 accatctgtc ttcatcttcc cçccatctga tgagcagttg aaatetggaa ctgciagc 478
<210> 33 <211> 132 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33
Met Arg Vai Pro Ala Gin Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp lie Pro 1 5 10 15 Gly Ser Ser Ala Asp Ile Vai Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Ser 20 25 30 Vai Thr Pro Gly Gin Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser 35 40 45 Leu Lsu His Ser Asp Gly Lys Thr Phe Leu Tyr Trp Tyr Leu Gin Lys 50 55 60 Pro Gly Gin Pro Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Glu Vai Ser Asn Arg Phe 65 70 75 60 Ser Gly Vai Pro -Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 65 90 95 Thr Leu Lys 1 le Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Vai Gly Leu Tyr Tyr 100 105 110 158
Cys Met Gin Sei" Xle Gin Le« Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys 115 120 125
Vai Glu Xle Lys 130
Lisboa, 13 de Dezembro de 2013

Claims (52)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Conjugado anticorpo-fármaco compreendendo: um anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio, que se liga ao antigénio de membrana especifico da próstata (PSMA), conjugado com monometilauristatina norefedrina ou monometilauristatina fenilalanina, em que o conjugado anticorpo-fármaco tem uma seletividade para células PC3 relativamente às células C4-2 ou LNCaP de pelo menos 250, e 3 ou 4 moléculas de monometilauristatina norefedrina ou monometilauristatina fenilalanina estão conjugadas com o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio.
2. Conjugado anticorpo-fármaco da reivindicação 1, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio é um anticorpo monoclonal ou seu fragmento de ligação a antigénio que liga especificamente: (a) PSMA; (b) um domínio extracelular de PSMA; ou (c) um epítopo conformacional de PSMA.
3. Conjugado anticorpo-fármaco da reivindicação 1, em que o anticorpo é codificado por uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleótidos que é pelo menos 90, 95, 97, 98 ou 99% idêntica a uma sequência de nucleótidos que codifica um anticorpo selecionado do grupo consistindo de: AB-PGI-XG1-006, AB-PGI-XG1-026 e anticorpos compreendendo: (a) uma cadeia pesada codificada por uma molécula de ácido nucleico compreendendo a região ou regiões de codificação de uma sequência de nucleótidos selecionada do grupo consistindo das sequências de nucleótidos definidas como SEQ ID NOs: 2 e 3, e 2 (b) uma cadeia leve codificada por uma molécula de ácido nucleico compreendendo a região ou regiões de codificação de uma sequência de nucleótidos selecionada do grupo consistindo das sequências de nucleótidos definidas como SEQ ID NOs: 8 e 9, ou (c) uma região variável da cadeia pesada codificada por uma molécula de ácido nucleico compreendendo a região ou regiões de codificação de uma sequência de nucleótidos selecionada do grupo consistindo das sequências de nucleótidos definidas como SEQ ID NOs: 14 e 18, e (d) uma região variável da cadeia leve codificada por uma molécula de ácido nucleico compreendendo a região ou regiões de codificação de uma sequência de nucleótidos selecionada do grupo consistindo das sequências de nucleótidos definidas como SEQ ID NOs: 16 e 20.
4. Conjugado anticorpo-fármaco da reivindicação 1, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio é AB-PGI-XG1-006, A13-PGI-XG1-026 ou um seu fragmento de ligação a antigénio.
5. Conjugado anticorpo-fármaco da reivindicação 1, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio é selecionado do grupo consistindo de: (a) anticorpos compreendendo uma cadeia pesada codificada por uma molécula de ácido nucleico compreendendo a região ou regiões de codificação de uma sequência de nucleótidos selecionada do grupo consistindo das sequências de nucleótidos definidas como SEQ ID NOs: 2 e 3, e uma cadeia leve codificada por uma molécula de ácido nucleico compreendendo a região ou regiões de codificação de uma sequência de nucleótidos selecionada do grupo consistindo das 3 sequências de nucleótidos definidas como SEQ ID NOs: 8 e 9, e seus fragmentos de ligação a antigénio; (b) anticorpos compreendendo uma cadeia pesada codificada por uma molécula de ácido nucleico compreendendo a região ou regiões de codificação de uma sequência de nucleótidos definida como SEQ ID NO: 2, e uma cadeia leve codificada por uma molécula de ácido nucleico compreendendo a região ou regiões de codificação de uma sequência de nucleótidos definida como SEQ ID NO: 8, e seus fragmentos de ligação a antigénio; e (c) anticorpos compreendendo uma cadeia pesada codificada por uma molécula de ácido nucleico compreendendo a região ou regiões de codificação de uma sequência de nucleótidos definida como SEQ ID NO: 3, e uma cadeia leve codificada por uma molécula de ácido nucleico compreendendo a região ou regiões de codificação de uma sequência de nucleótidos definida como SEQ ID NO: 9, e seus fragmentos de ligação a antigénio; e (d) anticorpos compreendendo uma região variável da cadeia pesada codificada por uma molécula de ácido nucleico compreendendo a região ou regiões de codificação de uma sequência de nucleótidos selecionada do grupo consistindo das sequências de nucleótidos definidas como SEQ ID NOs: 14 e 18, e uma região variável da cadeia leve codificada por uma molécula de ácido nucleico compreendendo a região ou regiões de codificação de uma sequência de nucleótidos selecionada do grupo consistindo das sequências de nucleótidos definidas como SEQ ID NOs: 16 e 20, e seus fragmentos de ligação a antigénio; e (e) anticorpos compreendendo uma região variável da cadeia pesada codificada por uma molécula de ácido 4 nucleico compreendendo a região ou regiões de codificação de uma sequência de nucleótidos definida como SEQ ID NO: 14, e uma região variável da cadeia leve codificada por uma molécula de ácido nucleico compreendendo a região ou regiões de codificação de uma sequência de nucleótidos definida como SEQ ID NO: 16, e seus fragmentos de ligação a antigénio; e (f) anticorpos compreendendo uma região variável da cadeia pesada codificada por uma molécula de ácido nucleico compreendendo a região ou regiões de codificação de uma sequência de nucleótidos definida como SEQ ID NO: 18, e uma região variável da cadeia leve codificada por uma molécula de ácido nucleico compreendendo a região ou regiões de codificação de uma sequência de nucleótidos definida como SEQ ID NO: 2 0, e seus fragmentos de ligação a antigénio.
6. Conjugado anticorpo-fármaco da reivindicação 1, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio é IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgAl, IgA2, IgAsec, IgD, IgE ou tem o dominio constante e/ou variável de imunoglobulina de IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgAl, IgA2, IgAsec, IgD ou IgE.
7. Conjugado anticorpo-fármaco da reivindicação 1, em que o anticorpo é um anticorpo monoclonal, humanizado, humano, recombinante, quimérico, biespecífico ou muitiespecifico.
8. Conjugado anticorpo-fármaco da reivindicação 1, em que o fragmento de ligação a antigénio é um fragmento Fab, um fragmento F(ab')2, um fragmento Fv ou um fragmento contendo CDR3. 5
9. Conjugado anticorpo-fármaco da reivindicação 1, em que a seletividade para células PC-3 relativamente a células C4-2 ou LNCaP é, pelo menos, de 500, 1000, 2500, 6000 ou 13 000.
10. Conjugado anticorpo-fármaco da reivindicação 1, em que a monometilauristatina norefedrina ou monometilauristatina fenilalanina está conjugada com o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio com um composto da fórmula: An Ym Zm Xn Wn em que, A é uma unidade de acilo carboxílico; Y é um aminoácido; Z é um aminoácido; X e W são, cada, um espaçador auto-imolador; n é um número inteiro de 0 ou 1; e m é um número inteiro de 0 ou 1, 2, 3, 4, 5 ou 6.
11. Conjugado anticorpo-fármaco da reivindicação 10, em que A é (a) O I /—(CH2)qC0— L\ em que q é 1-10, (b) 4- (N-succinimidometil)ciclo-hexano-l-carbonilo, (c) m-succinimidobenzoilo, (d) 4-(p-succinimidofenil)-butirilo, (e) 4-(2-acetamido)benzoilo, (f) 3-tiopropionilo, (g) 4-(1-tioetil)-benzoilo, 6 (h) 6-(3-tiopropionilamido)-hexanoílo ou (i) maleimido-caproílo.
12. Conjugado anticorpo-fármaco da reivindicação 10, em que Y é alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina, triptofano ou prolina.
13. Conjugado anticorpo-fármaco da reivindicação 10, em que Z é lisina, lisina protegida com acetilo ou formilo, arginina, arginina protegida com grupos tosilo ou nitro, histidina, ornitina, ornitina protegida com acetilo ou formilo, ou citrulina.
14. Conjugado anticorpo-fármaco da reivindicação 10, em que Ym-Zm é valina-citrulina.
15. Conjugado anticorpo-fármaco da reivindicação 10, em que Ym-Zm é uma sequência proteica que pode ser dissociada seletivamente por uma protease.
16. Conjugado anticorpo-fármaco da reivindicação 10, em que X é: (a) um composto possuindo a fórmula NH
O em que T é O, N ou S; (b) um composto possuindo a fórmula -HN-R1-COT em que R1 é alquilo Ci-C5, T é O, N ou S; 7 (c) um composto possuindo a fórmula 7NH T
COOR2 em que T é 0, N ou S, R2 é H ou alquilo C1-C5; (d) p-aminobenzilcarbamoiloxilo; (e) álcool p-aminobenzílico; (f) p-aminobenzilcarbamato; (g) p-aminobenziloxicarbonilo; ou (h) ácido γ-aminobutírico; ácido a,a-dimetil-γ-aminobutírico ou ácido β,p-dimetil-y-aminobutírico.
17 . Conjugado anticorpo-fármaco da reivindicação 10, em que W é
18. Conjugado anticorpo-fármaco de qualquer uma das reivindicações 10-17, em que m e n são 0.
19. Conjugado anticorpo-fármaco da reivindicação 1, o qual é AB-PG1-XG1-0 0 6-maleimido-caproil-valina-citrulina-p-aminobenziloxicarbonil-monometilauristatina norefedrina, AB-PG 1-XG1-006-maleimido-caproil-valina-citrulina-p-aminobenziloxicarbonil- monometilauristatina fenilalanina, AB-PG1-XG1-006-maleimido-caproil-monometilauristatina fenilalanina, AB-PG1-XG1-0 0 6-maleimido-caproil-valina-citrulina-p-aminobenzilcarbamato-monometilauristatina norefedrina, AB-PGl-XGl-0 0 6-maleimido-caproil-valina-citrulina-p-aminobenzilcarbamato-monometilauristatina fenilalanina, AB-PG1-X1-02 6-maleimido-caproil-valina-citrulina-p-aminobenziloxicarbonil- monometilauristatina norefedrina, AB-PG1-XG1-026-maleimido-caproil-valina-citrulina-p-aminobenziloxicarbonil-monometilauristatina fenilalanina ou AB-PGl-XGl-026-maleimido-caproil-monometilauristatina fenilalanina.
20. Conjugado anticorpo-fármaco da reivindicação 1, em que o conjugado anticorpo-fármaco liga uma célula tumoral, preferencialmente uma célula tumoral da próstata.
21. Conjugado anticorpo-fármaco da reivindicação 1, em que o conjugado anticorpo-fármaco liga células endoteliais da neovasculatura de um tumor, não requer lise celular para ligar PSMA, leva à paragem do ciclo celular e/ou inibe o crescimento de células que expressam PSMA.
22. Conjugado anticorpo-fármaco da reivindicação 1, em que o conjugado anticorpo-fármaco medeia a morte celular especifica de células que expressam PSMA com uma IC50 de: (a) inferior a lx] _0-i° , lxlO-11 ou 1x10'12M; (b) 11- 1 CM 60- ou 65 - 208 x10‘12M; ou (c) 11, 42, 60 ou 83 x10'12M.
23. Conjugado anticorpo-fármaco da reivindicação 1, em que o conjugado anticorpo-fármaco quando administrado a ratos com um regímen de q4d x 6 a uma dose de 6 mg/kg realiza uma taxa de cura de pelo menos 20%, 30%, 40% ou 50%. 9
24. Conjugado anticorpo-fármaco da reivindicação 1, ligado a uma etiqueta, preferencialmente uma etiqueta fluorescente, uma etiqueta enzimática, uma etiqueta radioativa, uma etiqueta ativa em ressonância magnética nuclear, uma etiqueta luminescente ou uma etiqueta cromófora.
25. Conjugado anticorpo-fármaco da reivindicação 1, embalado na forma liofilizada ou aquosa.
26. Conjugado anticorpo-fármaco da reivindicação 1, numa forma estéril.
27. Composição compreendendo: (a) o conjugado anticorpo-fármaco da reivindicação 1 e um veiculo, excipiente ou estabilizante farmaceuticamente aceitável; ou (b) uma associação de dois ou mais conjugados anticorpo-fármaco diferentes de acordo com a reivindicação 1 e um veiculo, excipiente ou estabilizante farmaceuticamente aceitável.
28. Composição da reivindicação 27, compreendendo ainda um agente antitumoral, um agente imunoestimulador, um imunomodulador, corticosteroide ou uma associação dos mesmos.
29. Composição da reivindicação 28, em que o agente antitumoral é um agente citotóxico, um agente que atua na neovasculatura do tumor ou uma associação dos mesmos, preferencialmente docetaxel.
30. Composição da reivindicação 28, em que o imunomodulador é uma citocina, quimiocina, adjuvante ou uma associação dos mesmos. 10
31. Composição da reivindicação 28, em que o agente imunoestimulador é interleucina-2, interferão a, interferão γ, fator de necrose tumoral-α, um oligonucleótido imunoestimulador ou uma associação dos mesmos.
32. Composição da reivindicação 28, em que o corticosteroide é prednisona ou hidrocortisona.
33. Composição compreendendo: um ou mais conjugados anticorpo-fármaco da reivindicação 1 e um ou mais anticorpos anti-PSMA não conjugados.
34. Conjugado anticorpo-fármaco como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1-23, para ser utilizado num método de inibição do crescimento de uma célula que expressa PSMA, em que o conjugado é para ser posto em contacto com a célula que expressa PSMA.
35. Conjugado anticorpo-fármaco como reivindicado na reivindicação 34, em que a célula que expressa PSMA é uma célula tumoral da próstata, uma célula da neovasculatura de um tumor não prostático, um célula dependente de androgénios ou um célula independente de androgénios.
36. Conjugado anticorpo-fármaco como reivindicado na reivindicação 34 em que, no referido método, a célula que expressa PSMA é ainda posta em contacto com um agente antitumoral, um agente imunoestimulador, um imunomodulador, corticosteroide ou uma associação dos mesmos. 11
37. Método ex vivo para inibir o crescimento de uma célula que expressa PSMA compreendendo pôr em contacto a célula que expressa PSMA com uma quantidade de um conjugado anticorpo-fármaco como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1-23, eficaz para inibir o crescimento da célula que expressa PSMA.
38. Método como reivindicado na reivindicação 37, em que a célula que expressa PSMA é uma célula tumoral da próstata, uma célula da neovasculatura de um tumor não prostático, uma célula dependente de androgénios ou uma célula independente de androgénios.
39. Método como reivindicado na reivindicação 37, compreendendo ainda pôr a célula que expressa PSMA em contacto com um agente antitumoral, um agente imunoestimulador, um imunomodulador, corticosteroide, ou uma associação dos mesmos.
40. Conjugado anticorpo-fármaco como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1-23, para ser utilizado num método de efetua a paragem do ciclo celular numa célula que expressa PSMA, em que o conjugado é para ser posto em contacto com a célula que expressa PSMA.
41. Conjugado anticorpo-fármaco como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1-23, para ser utilizado num método de tratamento de cancro, opcionalmente cancro da próstata ou um cancro não prostático, e o referido cancro não prostático é, opcionalmente, cancro da bexiga, cancro pancreático, cancro do pulmão, cancro do rim, sarcoma, cancro da mama, cancro do cérebro, carcinoma neuroendócrino, cancro do cólon, cancro testicular ou melanoma. 12
42. Conjugado anticorpo-fármaco para ser utilizado num método de tratamento de cancro como reivindicado na reivindicação 41, em que, no referido método, é coadministrado outro agente terapêutico para tratar o cancro, em que a coadministração é para ser antes, durante ou após a administração do conjugado anticorpo-fármaco.
43. Conjugado anticorpo-fármaco para ser utilizado num método de tratamento de cancro como reivindicado na reivindicação 42, em que o outro agente terapêutico é um agente antitumoral, um agente imunoestimulador, um imunomodulador, corticosteroide ou uma associação dos mesmos.
44. Conjugado anticorpo-fármaco para ser utilizado num método de inibição do crescimento de um célula que expressa PSMA como reivindicado na reivindicação 36, conjugado anticorpo-fármaco para ser utilizado num método de tratamento de cancro como reivindicado na reivindicação 43 ou método como reivindicado na reivindicação 39, em que o agente antitumoral é um agente citotóxico, um agente que atua na neovasculatura do tumor ou uma associação dos mesmos, e, preferencialmente, docetaxel.
45. Conjugado anticorpo-fármaco para ser utilizado num método de inibição do crescimento de um célula que expressa PSMA como reivindicado na reivindicação 36, conjugado anticorpo-fármaco para ser utilizado num método de tratamento de cancro como reivindicado na reivindicação 43 ou método como reivindicado na reivindicação 39, em que o imunomodulador é uma citocina, quimiocina, adjuvante ou uma associação dos mesmos. 13
46. Conjugado anticorpo-fármaco para ser utilizado num método de inibição do crescimento de um célula que expressa PSMA como reivindicado na reivindicação 36, conj ugado anticorpo-fármaco para ser utilizado num método de tratamento de cancro como reivindicado na reivindicação 43 ou método como reivindicado na reivindicação 39, em que o agente imunoestimulador é interleucina-2, interferão a, interferão γ, fator de necrose tumoral-α, um oligonucleótido imunoestimulador ou uma associação dos mesmos.
47. Conjugado anticorpo-fármaco para ser utilizado num método de inibição do crescimento de um célula que expressa PSMA como reivindicado na reivindicação 36, conjugado anticorpo-fármaco para ser utilizado num método de tratamento de cancro como reivindicado na reivindicação 43 ou método como reivindicado na reivindicação 39, em que o corticosteroide é prednisona ou hidrocortisona.
48. Conjugado anticorpo-fármaco para ser utilizado num método de tratamento de cancro como reivindicado na reivindicação 42, em que o agente terapêutico é uma vacina, preferencialmente uma vacina que imuniza contra o PSMA.
49. Conjugado anticorpo-fármaco para ser utilizado num método de inibição do crescimento de um célula que expressa PSMA como reivindicado na reivindicação 44 ou conjugado anticorpo-fármaco para ser utilizado num método de tratamento de cancro como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 42-44, em que, no referido método é ainda administrado outro agente terapêutico, preferencialmente prednisona. 14
50. Conjugado anticorpo-fármaco como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1-23, para ser utilizado num método de inibição do crescimento de um tumor, em que o referido conjugado é posto em contacto com células que expressam PSMA da neovasculatura do tumor, para inibir desse modo o crescimento do tumor.
51. Conjugado anticorpo-fármaco para ser utilizado num método de inibição do crescimento de um tumor como reivindicado na reivindicação 50 em que, no referido método, as células que expressam PSMA são ainda postas em contacto com um agente antitumoral, um agente imunoestimulador, um imunomodulador, corticosteroide ou uma associação dos mesmos.
52. Conjugado anticorpo-fármaco para ser utilizado num método de inibição do crescimento de um tumor como reivindicado na reivindicação 51, em que: (a) o agente antitumoral é um agente citotóxico, um agente que atua na neovasculatura do tumor ou uma associação dos mesmos; (b) o imunomodulador é uma citocina, quimiocina, adjuvante ou uma associação dos mesmos; e/ou (c) o agente imunoestimulador é interleucina-2, interferão a, interferão γ, fator de necrose tumoral-oí, oligonucleótidos imunoestimuladores ou uma associação dos mesmos. Lisboa, 13 de Dezembro de 2013
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