JPH0491100A - 新規糖タンパク質及びその製造方法 - Google Patents
新規糖タンパク質及びその製造方法Info
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- JPH0491100A JPH0491100A JP20750190A JP20750190A JPH0491100A JP H0491100 A JPH0491100 A JP H0491100A JP 20750190 A JP20750190 A JP 20750190A JP 20750190 A JP20750190 A JP 20750190A JP H0491100 A JPH0491100 A JP H0491100A
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Landscapes
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- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
[産業上の利用分野]
本発明は、接着因子、増殖因子、リンホカイン。
サイトカインおよび、それらのレセプター等を含む、い
わゆる糖ペプチド、Mタンパク質およびその製造方法に
関する。
わゆる糖ペプチド、Mタンパク質およびその製造方法に
関する。
近年、生体由来の生理活性を有する糖タンパク質を、医
薬品や診断薬あるいは医療用具等として利用する試みが
なされている。これらの糖タンパク譬は、該タンパク質
を有する組織からの抽出のほか、該糖タンパク質を産生
ずる細胞の大量培養、あるいは、該糖タンパク質の遺伝
子を単離後遺伝子操作による組み換え型糖タンパク質の
大量生産などにより生産される。得られた糖タンパク質
は、そのタンパク質部分のアミノ酸配列およびアミノ酸
組成により分類され、特徴づけられてきた。しかし最近
、糖タンパク質の生理活性(機能)発現上、該糖タンパ
ク質のI!鎖が重要な役割を担っていることが徐々に明
らかになってきた。それらは、たとえばタンパク質の安
定化や、レセプターや標的細胞に対する認識としてのシ
グナル作用、細胞内輸送におけるシグナル作用等である
。さらに最近では、ヒト型糖鎖構造、マウス型糖鎖構造
等、種に特異的な糖鎖構造の存在も一部で明らかになり
(例えばGa1ili [1,etal、 Proc、
Natl、 Acad。
薬品や診断薬あるいは医療用具等として利用する試みが
なされている。これらの糖タンパク譬は、該タンパク質
を有する組織からの抽出のほか、該糖タンパク質を産生
ずる細胞の大量培養、あるいは、該糖タンパク質の遺伝
子を単離後遺伝子操作による組み換え型糖タンパク質の
大量生産などにより生産される。得られた糖タンパク質
は、そのタンパク質部分のアミノ酸配列およびアミノ酸
組成により分類され、特徴づけられてきた。しかし最近
、糖タンパク質の生理活性(機能)発現上、該糖タンパ
ク質のI!鎖が重要な役割を担っていることが徐々に明
らかになってきた。それらは、たとえばタンパク質の安
定化や、レセプターや標的細胞に対する認識としてのシ
グナル作用、細胞内輸送におけるシグナル作用等である
。さらに最近では、ヒト型糖鎖構造、マウス型糖鎖構造
等、種に特異的な糖鎖構造の存在も一部で明らかになり
(例えばGa1ili [1,etal、 Proc、
Natl、 Acad。
Sci、 USA 84.1369 (1987)
) 、抗原性の問題も大きくとりあげられるようになっ
てきた。現在では、医薬品としての申請時に、糖鎖構造
を厳密に規定しなければならず、このように糖タンパク
質を、医薬品や診断薬、あるいは医療用具等に利用する
ためには、その糖鎖構造に着目して目的や用途になかっ
た構造に規定する必要が生じている。
) 、抗原性の問題も大きくとりあげられるようになっ
てきた。現在では、医薬品としての申請時に、糖鎖構造
を厳密に規定しなければならず、このように糖タンパク
質を、医薬品や診断薬、あるいは医療用具等に利用する
ためには、その糖鎖構造に着目して目的や用途になかっ
た構造に規定する必要が生じている。
(特開平1−02100.特開平1−02199゜Co
nradt H,S、 etal、 TIGG、 」■
ル168 (1990))〔発明が解決しようとする課
題] 以上、指摘したように、糖タンパク質を医薬品や診断薬
、あるいは医療用具等に利用する際には、該垢タンパク
質のIJ!鎖構造を、該糖タンパク質の利用目的、利用
対象に合わせ、きめ細かく管理対応する必要が生じてき
た。しかしながら、現在でも尚、糖鎖構造の解析にはか
なりの時間と労力がかかり、そのため学問的にも、まし
てや工業的に糖タンパク質を生産することには、大きな
障壁となっている。そこで、糖タンパク質本来の生理活
性は保持したまま、種特異性や、抗原性の少ない新規な
糖タンパク質を提供するにはどうすればよいか、かかる
問題点を分析し、鋭意検討した結果、そのような新規糖
タンパク質を見出すことに成功し、本発明に到達した。
nradt H,S、 etal、 TIGG、 」■
ル168 (1990))〔発明が解決しようとする課
題] 以上、指摘したように、糖タンパク質を医薬品や診断薬
、あるいは医療用具等に利用する際には、該垢タンパク
質のIJ!鎖構造を、該糖タンパク質の利用目的、利用
対象に合わせ、きめ細かく管理対応する必要が生じてき
た。しかしながら、現在でも尚、糖鎖構造の解析にはか
なりの時間と労力がかかり、そのため学問的にも、まし
てや工業的に糖タンパク質を生産することには、大きな
障壁となっている。そこで、糖タンパク質本来の生理活
性は保持したまま、種特異性や、抗原性の少ない新規な
糖タンパク質を提供するにはどうすればよいか、かかる
問題点を分析し、鋭意検討した結果、そのような新規糖
タンパク質を見出すことに成功し、本発明に到達した。
すなわち、本発明は、糖タンパク質本来の生理活性は保
持したまま、種特異性や、抗原性の少ない新規糖タンパ
ク質およびその製造方法を提供することを目的とするも
のである。
持したまま、種特異性や、抗原性の少ない新規糖タンパ
ク質およびその製造方法を提供することを目的とするも
のである。
このような目的を達成するための本発明の構成は、以下
の技術的手段からなる。
の技術的手段からなる。
(1)糖鎖に高マンノース型構造またはマンノースコア
構造を存することを特徴とする糖タンパク質。
構造を存することを特徴とする糖タンパク質。
(2)高マンノース型構造またはマンノースコア構造が
、(Man)n−GlcNAc−GlcNAc−Ans
(但し、n、 = 9〜1)であることを特徴とす
る上記(1)記載の糖タンパク質。
、(Man)n−GlcNAc−GlcNAc−Ans
(但し、n、 = 9〜1)であることを特徴とす
る上記(1)記載の糖タンパク質。
(3)糖タンパク質が、接着因子、増殖因子、リンホカ
イン サイド力インまたはそれらのレセプターであるこ
とを特徴とする上記(1)記載の糖タンパク質。
イン サイド力インまたはそれらのレセプターであるこ
とを特徴とする上記(1)記載の糖タンパク質。
(4)レセプターが、上皮増殖因子レセプター(EGF
レセプター)であることを特徴とする上記(3)記載の
糖タンパク質。
レセプター)であることを特徴とする上記(3)記載の
糖タンパク質。
(5)真核細胞に糖タンパク質の遺伝子を組み込み形質
発現させることを特徴とする糖鎖に高マンノース型構造
を有する糖タンパク質の製造方法。
発現させることを特徴とする糖鎖に高マンノース型構造
を有する糖タンパク質の製造方法。
(6)高マンノース型の1!鎖を有する糖タンパク質を
α−マンノシダーゼにてトリミングすることを特徴とす
る生理活性型媚タンパク質の製造方法。
α−マンノシダーゼにてトリミングすることを特徴とす
る生理活性型媚タンパク質の製造方法。
本発明でいう糖鎖構造は、具体的には、高マンノース型
構造の(Man)q−GlcNAc−GlcNAc−A
nsから、マンノースがとれたマンノースコア構造のM
an−GlcNAc−GlcNAc−Ansまでの全て
を含む。
構造の(Man)q−GlcNAc−GlcNAc−A
nsから、マンノースがとれたマンノースコア構造のM
an−GlcNAc−GlcNAc−Ansまでの全て
を含む。
本発明でいう糖タンパク質とは、接着因子、増殖因子、
リンホカイン、サイド力インおよび、それらのレセプタ
ー等を含み、特に限定されるものではない。人工的にタ
ンパク部分を設計された人工糖タンパク質の系について
も適用される。
リンホカイン、サイド力インおよび、それらのレセプタ
ー等を含み、特に限定されるものではない。人工的にタ
ンパク部分を設計された人工糖タンパク質の系について
も適用される。
また、いわゆる0配糖体の構造については、ここでは問
わない。
わない。
糖タンパク質の生産は、−a的に遺伝子操作によって適
当な真核細胞に該糖タンパク質の遺伝子を組み込み強制
発現させることによって得られる。
当な真核細胞に該糖タンパク質の遺伝子を組み込み強制
発現させることによって得られる。
この際、該真核細胞は、昆虫や酵母等の下等な細胞であ
ることが望ましい。もちろんヒト マウス等のを推動物
の細胞を用いることも可能であるが、生合成過程で該糖
タンパク質が小胞体からゴルジ装置へ輸送された後、高
マンノース型構造からハイブリッド型、コンプレックス
型のIJi鎖へ修飾(成熟化)が起こるため、ゴルジ装
置内での代謝を調節し、高マンノース型構造のままの形
で取り出す工夫をする必要が生じる。この時、例えば、
ブレフェルデインA(旧sumi Y、 etal、
J、 Biol。
ることが望ましい。もちろんヒト マウス等のを推動物
の細胞を用いることも可能であるが、生合成過程で該糖
タンパク質が小胞体からゴルジ装置へ輸送された後、高
マンノース型構造からハイブリッド型、コンプレックス
型のIJi鎖へ修飾(成熟化)が起こるため、ゴルジ装
置内での代謝を調節し、高マンノース型構造のままの形
で取り出す工夫をする必要が生じる。この時、例えば、
ブレフェルデインA(旧sumi Y、 etal、
J、 Biol。
chem、+ 26L 11398 (1986) )
等の薬剤を用いることで小胞体からゴルジ装置への輸送
を止め、高マンノース型の糖鎖をもつ糖タンパク質を得
ることができる。
等の薬剤を用いることで小胞体からゴルジ装置への輸送
を止め、高マンノース型の糖鎖をもつ糖タンパク質を得
ることができる。
また、動物細胞で高マンノース型構造のIPi類しか付
加することのできない変異株の存在が知られておりそれ
らを利用することも可能である。
加することのできない変異株の存在が知られておりそれ
らを利用することも可能である。
昆虫細胞での生産について簡単に説明する。
例えば、夜蛾科のバキュロウィルスの多角体遺伝子から
開発された、pAc373やpAcYMl等(松浦善治
、実験医学、 8.281 (1990) )に、該垢
タンパク質の遺伝子を組み込み、ウィルスDNAととも
に、s、f、細胞(夜盗蛾由来細胞株)ヘ トランスフ
ェクションする。その後、発現した該糖タンパク質を精
製する。バキュロウィルスDNAは、かなり大きな遺伝
子を組み込むことが可能である。また、このウィルスは
、を椎動物には感染できないため、安全性も高く、おま
けに高発現性がある。また、これらの昆虫細胞で発現さ
せた糖タンパク質の糖鎖は高マンノース型のものである
。
開発された、pAc373やpAcYMl等(松浦善治
、実験医学、 8.281 (1990) )に、該垢
タンパク質の遺伝子を組み込み、ウィルスDNAととも
に、s、f、細胞(夜盗蛾由来細胞株)ヘ トランスフ
ェクションする。その後、発現した該糖タンパク質を精
製する。バキュロウィルスDNAは、かなり大きな遺伝
子を組み込むことが可能である。また、このウィルスは
、を椎動物には感染できないため、安全性も高く、おま
けに高発現性がある。また、これらの昆虫細胞で発現さ
せた糖タンパク質の糖鎖は高マンノース型のものである
。
以上の製造方法では、該媚タンパク質本来の生理活性(
機能)を発現しない場合がある。即ち、高マンノース型
の糖鎖では、該糖タンパク質の生理活性が得られない場
合がある。この場合には、以下のように人為的に糖鎖を
修飾することが有効である。即ち、糖加水分解酵素α−
マンノシダーゼを用い、糖鎖をトリミングする。この処
理だけで、驚くべきことに、糖タンパク質の生理活性(
機能)を人為的に付与することが可能である。
機能)を発現しない場合がある。即ち、高マンノース型
の糖鎖では、該糖タンパク質の生理活性が得られない場
合がある。この場合には、以下のように人為的に糖鎖を
修飾することが有効である。即ち、糖加水分解酵素α−
マンノシダーゼを用い、糖鎖をトリミングする。この処
理だけで、驚くべきことに、糖タンパク質の生理活性(
機能)を人為的に付与することが可能である。
恐らく、高マンノース型から、糖すなわち、マンノース
がトリミングされる途中で、糖タンパク質にとって、2
次的なコンフォメーション変化等の何らかの変化が起き
ているのであろうがその詳細は不明である。
がトリミングされる途中で、糖タンパク質にとって、2
次的なコンフォメーション変化等の何らかの変化が起き
ているのであろうがその詳細は不明である。
本発明の糖タンパク質は、糖鎖のない糖タンパク質より
も安定性が高い。通常、糖タンパク質を注体に投与する
と、血中および肝腎などに移行、分布し、次第に代謝さ
れる。これは、生体内の種々のプロテアーゼによる分解
が考えられるが、本発明の糖タンパク質は、タンパク質
部分の表面をIl! 鎖が被っているため、種々のプロ
テアーゼに対する抵抗性があり、即ち、血中安定性等に
優れる。
も安定性が高い。通常、糖タンパク質を注体に投与する
と、血中および肝腎などに移行、分布し、次第に代謝さ
れる。これは、生体内の種々のプロテアーゼによる分解
が考えられるが、本発明の糖タンパク質は、タンパク質
部分の表面をIl! 鎖が被っているため、種々のプロ
テアーゼに対する抵抗性があり、即ち、血中安定性等に
優れる。
また、肝などに存在する動物レクチンや、アシアロレセ
プター等に対しても、本発明からなる糖タンパク質は、
それらの基質となるガラクトースがないため捕捉される
ことなく、そのため代謝も遅くなり、他の糖タンパク質
と比較しても安定性に優れる。したがって、薬効の持続
性も長くなる利点がある。
プター等に対しても、本発明からなる糖タンパク質は、
それらの基質となるガラクトースがないため捕捉される
ことなく、そのため代謝も遅くなり、他の糖タンパク質
と比較しても安定性に優れる。したがって、薬効の持続
性も長くなる利点がある。
さらに本発明の糖タンパク質は、免疫原性も少なく、し
たがって副作用も少ない利点を合わせ持っている。
たがって副作用も少ない利点を合わせ持っている。
以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する
。
。
実施例1゜
上皮増殖因子レセプター(EGFレセプター)過剰産性
細胞株(NA:ヒト口腔内扁平上皮癌由来)を、ブレフ
ェルデインA存在下で、10%牛脂児血清を含む、メチ
オニン不含ダルヘツコ変法イーグル培地(DMEM)で
37°C130分前培養し、次に、1.85MBq
[35S)メチオニンで、30分間パルスラベルした。
細胞株(NA:ヒト口腔内扁平上皮癌由来)を、ブレフ
ェルデインA存在下で、10%牛脂児血清を含む、メチ
オニン不含ダルヘツコ変法イーグル培地(DMEM)で
37°C130分前培養し、次に、1.85MBq
[35S)メチオニンで、30分間パルスラベルした。
さらに、10%牛脂児血清を含むDMEM中でチエイス
し、細胞をこわしてEGFレセプターを、抗EGFレセ
プター抗体及び、EGFを担持したビーズを用いて親和
性沈澱法により単離した。このとき、抗体ビーズでは、
EGFレセプターは単離されたが、EGFビーズでは、
単離されなかった。EGFレセプターの場合、高マンノ
ース型糖鎖では、生理活性がないことを示す。
し、細胞をこわしてEGFレセプターを、抗EGFレセ
プター抗体及び、EGFを担持したビーズを用いて親和
性沈澱法により単離した。このとき、抗体ビーズでは、
EGFレセプターは単離されたが、EGFビーズでは、
単離されなかった。EGFレセプターの場合、高マンノ
ース型糖鎖では、生理活性がないことを示す。
次に、抗体ビーズで単離したEGFレセプターを、α−
マンノシダーゼで37°C124時間消化し、先と同様
に、抗体ビーズとECFビーズを用いて、親和性沈澱法
によりEGFレセプターを回収した。その結果、抗体ビ
ーズ、EGFビーズともに、EGFレセプターを回収す
ることができた。
マンノシダーゼで37°C124時間消化し、先と同様
に、抗体ビーズとECFビーズを用いて、親和性沈澱法
によりEGFレセプターを回収した。その結果、抗体ビ
ーズ、EGFビーズともに、EGFレセプターを回収す
ることができた。
このことから、マンノースコア構造を有する新規EGF
レセプターは、生理活性を有することがわかった。以上
、EGFレセプターの検出は、電気泳動後、オートラジ
オグラムをとり、分子量140kdから170kdのE
GFレセブクーの領域にバンドが見られることで行った
。
レセプターは、生理活性を有することがわかった。以上
、EGFレセプターの検出は、電気泳動後、オートラジ
オグラムをとり、分子量140kdから170kdのE
GFレセブクーの領域にバンドが見られることで行った
。
比較例1゜
実施例1で、抗体ビーズでしか単離されなかった、高マ
ンノース型糖鎖を有するEGFレセプターを、エンドグ
リコシダーゼHおよび、グリコペプチダーゼFでそれぞ
れ消化させたところ、両者ともに、EGFビーズでは回
収できなかった。
ンノース型糖鎖を有するEGFレセプターを、エンドグ
リコシダーゼHおよび、グリコペプチダーゼFでそれぞ
れ消化させたところ、両者ともに、EGFビーズでは回
収できなかった。
実施例2゜
マウス3T3細胞で、実施例1と同様の実験を行い、回
収されたEGFレセプターをマウスに静脈内投与したが
、肝への集中的な分布は見られなかつた。
収されたEGFレセプターをマウスに静脈内投与したが
、肝への集中的な分布は見られなかつた。
本発明の糖タンパク質は、糖鎖構造が単純であり、自己
免疫となるため免疫病原性も低い。このため、糖タンパ
ク質を生産する際の産生細胞のスクリーニングおよびそ
の糖鎖構造の分析、決定等の労力を軽減できる利点があ
る。さらに、アシアロレセプター等での捕捉もないため
、糖タンパク質の安定性が高く、糖タンパク質の安定化
に有用であり、医薬品や診断薬あるいは医療用具等とし
て有用である。
免疫となるため免疫病原性も低い。このため、糖タンパ
ク質を生産する際の産生細胞のスクリーニングおよびそ
の糖鎖構造の分析、決定等の労力を軽減できる利点があ
る。さらに、アシアロレセプター等での捕捉もないため
、糖タンパク質の安定性が高く、糖タンパク質の安定化
に有用であり、医薬品や診断薬あるいは医療用具等とし
て有用である。
Claims (6)
- (1)糖鎖に高マンノース型構造またはマンノースコア
構造を有することを特徴とする糖タンパク質。 - (2)高マンノース型構造またはマンノースコア構造が
、(Man)n−GlcNAc−GlcNAc−Ans
(但し、n=9〜1)であることを特徴とする請求項第
(1)項記載の糖タンパク質。 - (3)糖タンパク質が、接着因子、増殖因子、リンホカ
イン、サイトカインまたはそれらのレセプターであるこ
とを特徴とする請求項第(1)項記載の糖タンパク質。 - (4)レセプターが、上皮増殖因子レセプター(EGF
レセプター)であることを特徴とする請求項第(3)項
記載の糖タンパク質。 - (5)真核細胞に糖タンパク質の遺伝子を組み込み形質
発現させることを特徴とする高マンノース型構造の糖タ
ンパク質の製造方法。 - (6)高マンノース型の糖鎖を有する糖タンパク質をα
−マンノシダーゼにてトリミングすることを特徴とする
生理活性型糖質の製造方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP20750190A JPH0491100A (ja) | 1990-08-07 | 1990-08-07 | 新規糖タンパク質及びその製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP20750190A JPH0491100A (ja) | 1990-08-07 | 1990-08-07 | 新規糖タンパク質及びその製造方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0491100A true JPH0491100A (ja) | 1992-03-24 |
Family
ID=16540764
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP20750190A Pending JPH0491100A (ja) | 1990-08-07 | 1990-08-07 | 新規糖タンパク質及びその製造方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH0491100A (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2005514021A (ja) * | 2001-12-27 | 2005-05-19 | グライコフィ, インコーポレイテッド | 哺乳動物型糖質構造を操作するための方法 |
-
1990
- 1990-08-07 JP JP20750190A patent/JPH0491100A/ja active Pending
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2005514021A (ja) * | 2001-12-27 | 2005-05-19 | グライコフィ, インコーポレイテッド | 哺乳動物型糖質構造を操作するための方法 |
JP2011078431A (ja) * | 2001-12-27 | 2011-04-21 | Glycofi Inc | 哺乳動物型糖質構造を操作するための方法 |
JP4820055B2 (ja) * | 2001-12-27 | 2011-11-24 | グライコフィ, インコーポレイテッド | 哺乳動物型糖質構造を操作するための方法 |
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