JP5652206B2 - 宿主、形質転換体およびその製造方法、ならびにo−グリコシド型糖鎖含有異種蛋白質の製造方法 - Google Patents
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Description
一方、S.ポンベについてはO−グリコシド型糖鎖の伸長に関与する遺伝子は特定されていなかった。
以上のことから、S.ポンベを用いて特定のO−グリコシド型糖鎖を有する異種蛋白質を製造する方法が望まれている。
さらに、本発明では、前記形質転換体を用いたO−グリコシド型糖鎖含有異種蛋白質の製造方法を提供することを目的とする。
本発明の形質転換体は、omh1遺伝子が欠失または失活したS.ポンベを宿主とし、異種蛋白質をコードする遺伝子を含む。
また、本発明の形質転換体は、さらに、前記異種蛋白質をコードする遺伝子の5’末端に結合した前記シゾサッカロミセス・ポンベ内で機能する分泌シグナルをコードする遺伝子を含むことが好ましい。
さらに、本発明の形質転換体は、前記異種蛋白質に対応する野生型蛋白質が、O−グリコシド型糖鎖を有している蛋白質であることが好ましい。
また、本発明の形質転換体の製造方法は、前記異種蛋白質をコードする遺伝子の5’末端側にシゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)内で機能する分泌シグナルをコードする遺伝子を有することが好ましい。
さらに、本発明の形質転換体の製造方法は、前記異種蛋白質に対応する野生型蛋白質がO−グリコシド型糖鎖を有している異種蛋白質であることが好ましい。
また、本発明のO−グリコシド型糖鎖含有異種蛋白質の製造方法では、産生されるO−グリコシド型糖鎖を有する異種蛋白質の糖鎖が、当該異種蛋白質に対応する野生型異種蛋白質の糖鎖の有無や糖鎖構造にかかわりなく、O−Man−Galなるジサッカライド構造を有することが好ましい。
さらに、本発明のO−グリコシド型糖鎖含有異種蛋白質の製造方法では、形質転換体を培養した培養液からO−グリコシド型糖鎖を有する異種蛋白質を取得することが好ましい。
本発明のS.ポンベを宿主とした形質転換体によれば、糖鎖構造をO−Man−Galなるジサッカライド構造に制御したO−グリコシド型糖鎖を有する異種蛋白質を得ることができる。
また、本発明の形質転換体の製造方法によれば、糖鎖構造をO−Man−Galなるジサッカライド構造に制御したO−グリコシド型糖鎖を有する異種蛋白質が得られる形質転換体を製造することができる。
また、本発明によれば、前記形質転換体を用いて、糖鎖構造をO−Man−Galなるジサッカライド構造に制御したO−グリコシド型糖鎖含有異種蛋白質を製造することができる。
本発明において「異種蛋白質」とは、宿主であるS.ポンベが本来産生しない(野生型のS.ポンベが、その蛋白質をコードする遺伝子を有しない)蛋白質を意味する。異種蛋白質は、産業的価値に優れる点から、ヒトや他の哺乳動物が産生する蛋白質であることが好ましい。「異種蛋白質の対応する野生型蛋白質」とは、異種蛋白質を産生する生物(S.ポンベ以外の生物)の細胞が産生する蛋白質をいう。本発明の形質転換体が産生する異種蛋白質は、この野生型蛋白質と糖鎖が異なっていてもよい。本発明の形質転換体が産生する異種蛋白質は、O−Man−Galなるジサッカライド構造の糖鎖を有するO−グリコシド型糖鎖含有異種蛋白質であり、O−Man−Galなるジサッカライド構造以外のO−グリコシド型糖鎖を実質的に有しない異種蛋白質である。
異種蛋白質遺伝子としては、O−グリコシド型糖鎖の構造がO−Man−Gal(酸素原子にマンノース、ガラクトースの順に糖が結合した糖鎖構造)に制御されたO−グリコシド型糖鎖含有異種蛋白質が安定して得られやすい点から、野生型の蛋白質がO−グリコシド型糖鎖を有している蛋白質(糖蛋白質)をコードする遺伝子であることが好ましい。このような異種蛋白質としては、例えば、S.ポンベが産生しないキチナーゼ、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)などが挙げられる。
また、本発明の形質転換体では、野生型がO−グリコシド型糖鎖を有さない異種蛋白質であっても、N末端に分泌シグナルを融合させることにより、発現した異種蛋白質を小胞体やゴルジ体へ輸送することができるため、アミノ酸配列や、その蛋白質の二次構造や三時構造によっては、O−グリコシド型糖鎖を有する異種蛋白質を得ることができる。野生型においてN末端に分泌シグナルを有さない蛋白質の場合は、適当な分泌シグナルをコードするDNA配列を備えたキメラ配列としてもよい。
宿主として用いるS.ポンベは、シゾサッカロミセス属に属する酵母であり、他の酵母に比べて特に耐酸性に優れており、細胞周期や染色体の構造、RNAスプライシング等が動物細胞のものにより類似し、産生される蛋白質の翻訳後修飾も動物細胞のそれに近いと考えられる微生物である。本発明の宿主であるS.ポンベは、omh1遺伝子を欠失または失活させた染色体を有する変異型である。この変異型のS.ポンベは、上記特徴を維持しており、また、この宿主に異種蛋白質遺伝子を導入して得られる形質転換体も上記特徴を維持している。
O−グリコシド型糖鎖の合成は、シゾサッカロミセス・セレビシエ(S.セレビシエ)の場合と同様、PMT遺伝子ファミリーから発現されるO−マンノシルトランスフェラーゼにより開始される。この遺伝子は酵母から多細胞生物まで高度に保存されており、S.ポンベにおいてもPMT遺伝子ファミリーがコードするO−マンノシルトランスフェラーゼにより、蛋白質中のセリン残基やトレオニン残基にマンノースが付加される。
図1に、S.セレビシエのKTR遺伝子ファミリーのKre2遺伝子、Ktr1遺伝子、Ktr3遺伝子と、omh1遺伝子〜omh6遺伝子によりコードされるそれぞれの蛋白質のアミノ酸配列の比較を示す。
また、Kre2pにおいて前記供与体および受容体に結合して活性部位となるアミノ酸配列(YNLCHFWSNFEI、図1下線部)も、omh1p〜omh6pにおいて高度に保存されていることからも、omh1p〜omh6pはKre2pと同様の機構で糖鎖伸長を行うと考えられる。
これは、omh1遺伝子がコードするomh1p(α1,2−マンノシルトランスフェラーゼ)が、蛋白質に結合した1つ目のマンノースに対し、2つめのマンノースを結合させる反応に寄与しているためであると考えられる。すなわち、omh1遺伝子を欠失または失活させることにより、1つ目のマンノースに2つ目のマンノースを結合させることができなくなるため、ガラクトシルトランスフェラーゼにより1つ目のマンノースにガラクトースが結合すると考えられる。
本発明の形質転換体は、上記本発明のomh1遺伝子を欠失または失活した宿主に異種蛋白質遺伝子を導入することにより得られる。異種蛋白質遺伝子は、目的異種蛋白質をコードする部分以外に分泌シグナルをコードする部分を有していてもよい。この分泌シグナルをコードする部分は、異種蛋白質を産生する生物(S.ポンベ以外)の細胞において機能する分泌シグナルをコードする部分であり、その細胞内でN末端に分泌シグナルを有する蛋白質が発現した後、細胞内で分泌シグナル部分が削除され、その後、細胞から分泌シグナルを有していない異種蛋白質が分泌される。異種蛋白質遺伝子が分泌シグナルをコードする部分を有している場合は、その分泌シグナルは、上記本発明の宿主においても機能する必要がある。その分泌シグナルが上記本発明の宿主において機能しない場合は、その機能しない分泌シグナルの代わりに、上記宿主において機能する分泌シグナルを使用することが好ましい。
上記本発明の宿主において機能する分泌シグナルとしては、S.ポンベが有する分泌シグナルが好ましい。このS.ポンベが有する分泌シグナルをコードする遺伝子を異種蛋白質遺伝子の5’末端側に結合させることにより、異種蛋白質のN末端側にこの分泌シグナルが結合した蛋白質が発現し、次いで上記本発明の宿主内で、この分泌シグナルが削除される。S.ポンベ内で機能する分泌シグナル遺伝子としては、国際公開第96/23890号パンフレット記載の分泌シグナル遺伝子が好ましい。特に、この文献記載の分泌シグナルP3をコードする遺伝子を使用することが好ましい。
本発明におけるプロモーターとしては、例えば、特開平5−15380号公報、特開平7−163373号公報、および特開平10−234375号公報に記載されている動物細胞ウイルス由来のプロモーターが挙げられ、CMVプロモーター、SV40プロモーターが好ましい。そのほか、特開平11−192094号公報、国際公開第2007/26617号パンフレットなどに記載のS.ポンベ内で機能しうるプロモーターとして知られている種々のプロモーターを使用できる。
抗生物質耐性遺伝子を有するベクターを用いた場合には、その抗生物質を含有する培地を用いることにより形質転換体を選択することができる。抗生物質耐性遺伝子としては、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子が挙げられる。また、栄養要求性マーカーとしては、例えば、オロチジンリン酸デカルボキシラーゼ遺伝子(ura4遺伝子)や、イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子(leu1遺伝子)が挙げられる。
栄養要求性マーカーを用いる場合は、例えば、ura4遺伝子を欠失または失活させてウラシル要求性としたS.ポンベを宿主とし、ura4遺伝子を有する前記ベクターにより形質転換した後、ウラシル要求性が消失したものを選択することにより、ベクターが組み込まれた形質転換体を得ることができる。
本発明のO−グリコシド型糖鎖含有異種蛋白質の製造方法は、本発明の形質転換体を培養し、該形質転換体により産生されるO−グリコシド型糖鎖を有する異種蛋白質を取得する方法である。
培養液には、公知の酵母培養培地を用いることができ、S.ポンベが資化しうる炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、S.ポンベの培養を効率良く行えるものであればよい。
培養液としては、天然培地を用いてもよく、合成培地を用いてもよい。
窒素源としては、例えば、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム等の無機酸のアンモニウム塩、ペプトン、肉エキス、酵母エキスが挙げられる。中でも、硫酸アンモニウムまたは酵母エキスが好ましい。
無機塩類としては、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウムが挙げられる。中でも、リン酸マグネシウムが好ましい。
また、培養液にはプロテオリピドが含まれていてもよい。
また、培養温度は、16〜37℃であることが好ましく、25〜32℃がより好ましい。また、培養時間は適宜決定することができる。
また、培養は、回分培養であってもよく、連続培養であってもよい。
連続培養は、例えば、一定時間培養した培養液からO−グリコシド型糖鎖含有異種蛋白質を取得するとともに培養上清を回収し、該培養上清に再び培養液を加えて培養することを繰り返して連続的に培養する方法が挙げられる。連続培養を行うことにより、O−グリコシド型糖鎖含有異種蛋白質の生産性がより向上する。
培養液からのO−グリコシド型糖鎖含有異種蛋白質の取得は、公知の蛋白質精製方法を用いることができる。
[例1]クローニングおよびomh遺伝子の破壊
選択マーカーとしてura4を用い、omh1遺伝子〜omh6遺伝子の破壊を行った。
表1に示すセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーを用い、野生型S.ポンベのゲノムDNAから、omh1遺伝子、omh2遺伝子、omh3遺伝子の一部または全部をそれぞれ含む3つのDNA断片(1.3kb、1.6kb、1.25kb)を増幅し、サブクローニングを行った。ベクターには、pGEM−T EasyベクターおよびpGEM−Tベクター(Promega)を用いた。
次に、破壊されたomh1遺伝子をそれぞれ有するベクターを直線状にしたDNA断片を用い、ウラシル合成能が欠損したS.ポンベのARC039株(一倍体)を形質転換し、ウラシル選択培地により選択することで、破壊されたomh1遺伝子を有するomh1変異株を得た。破壊されたomh2遺伝子を有するomh2変異株、および破壊されたomh3遺伝子を有するomh3変異株も同様の方法で構築した。所望のomh1変異株、omh2変異株、omh3変異株が得られていることの確認は、サザンブロット法およびPCRにより行った。
omh4遺伝子の上流側の断片を、XhoIとHindIIIの制限酵素サイトをそれぞれ有するセンスプライマーおよびアンチセンスプライマー(表1)によりPCRで増幅し、下流側の断片を、EcoRIとBamHIの制限酵素サイトをそれぞれ有するセンスプライマーおよびアンチセンスプライマー(表1)によりPCRで増幅した。これらの増幅断片を、それぞれ適した制限酵素により処理した後、pBS loxP−ura4−loxPベクターに挿入し、loxP−ura4−loxPカセットの両側にomh4遺伝子の上流側の断片と下流側の断片がそれぞれ位置するomh4遺伝子破壊用のベクターを得た。また、表1に示すセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーを用い、同様の方法で、omh5遺伝子破壊用のベクターおよびomh6遺伝子破壊用のベクターを得た。
これらのベクターを直線状にしたDNA断片を用い、ウラシル合成能が欠損したS.ポンベのARC039株(一倍体)を形質転換し、ウラシル選択培地により選択することで、それぞれomh4変異株、omh5変異株、omh6変異株を得た。
例1で得られたomh1変異株〜omh6変異株を、YES培地(5ml)にて、30℃および37℃でそれぞれ一晩培養した後、ノマルスキー光学系を搭載した観察装置により、それらの細胞形態を観察した。
また、比較対象として、野生型S.ポンベについても各変異株と同様の培養を行い、細胞形態を観察した。結果を図2(a)〜(g)に示す。図2において、(a)が野生型S.ポンベ、(b)がomh1変異株、(c)がomh2変異株、(d)がomh3変異株、(e)がomh4変異株、(f)がomh5変異株、(g)がomh6変異株における観察結果である。
一方、omh6変異株では、野生型とは異なる表現型を示した。
例2の培養後の各々の培養液を、水によりOD600が0.5(細胞数107個/mlに相当)となるように希釈した。さらに10倍希釈(図3中の10−1、一番左側の列)した後、そのうち7μlをYES培地(寒天培地)にストリークし、30℃(図3(a))、および37℃(図3(c))の条件で3日間培養した。また、同様に、20μg/mlハイグロマイシンB(0.005質量%)を含有するYES培地(5ml)でも30℃でそれぞれ一晩培養した(図3(b))。また、早期に急激な増殖が見られる場合は、更に10倍ずつ希釈していき、同様の条件で培養を行った。図3(a)〜(c)には、各条件において、左側から順にOD600が0.5のものを10倍ずつ希釈(10−1、10−2、10−3、10−4)したものの培養結果を示す。
一方、omh3変異株とomh6変異株では、37℃での培養、およびハイグロマイシンBを含有する培地における培養において生育速度が低下した。
omh1変異株〜omh6変異株における酸性ホスファターゼへの影響を分析することにより、omh1p〜omh6pのN−グリコシド型糖鎖の伸長への影響を調べた。
ARC039株およびomh1変異株〜omh6変異株を、それぞれYES培地(5ml)にて30℃でOD600が1.5となるまで培養した後、遠心分離により1.5×108個の細胞を得て、さらに該細胞をMMP培地(Methods Enzymol,194,795−823(1991)に記載のMM培地を基礎とし、リン酸水素二ナトリウムおよびフタル酸水素カリウムの代わりに14.6mM酢酸ナトリウムを含有する培地。
)の5mlに再懸濁し、30℃で3時間温置することにより酸性ホスファターゼの産生を誘導した。
次いで、得られた細胞を遠心分離して回収し、Tris−HCl緩衝液(62.5mM、pH6.8)にて洗浄した後、氷冷した200μlの溶菌液(62.5mM Tris−HCl、pH6.8、1mM EDTA、2mMフッ化フェニルメチルスルホニル、0.1mMジチオスレイトール、10%(v/v)グリセロール)に懸濁して懸濁液を得た。
その後、ミニビーズビーター8(Mini Bead Beater−8、バイオスペック・プロダクツ社製)を用いて、直径0.5mmのガラスビーズによる前記懸濁液の攪拌(4℃、30秒間)を5度行い、細胞溶解物を得た。細胞溶解物を6%(w/v)ポリアクリルアミドゲル(非変性)にて電気泳動し、活性染色(Yeast,18,903−904(2001)に記載の方法)を行った。結果を図4に示す。レーン1は野生型S.ポンベ、レーン2はomh1変異株、レーン3はomh2変異株、レーン4はomh3変異株、レーン5はomh4変異株、レーン6はomh5変異株、レーン7はomh6変異株における電気泳動の結果である。
[例5]
S.セレビシエのキチナーゼ(Cts1)遺伝子[5’末端側にS.セレビシエの分泌シグナル遺伝子を含有]とS.ポンベのnmt1プロモーターとを有するベクターpREP41−ScCTS1(文献:N. Tanaka et al., Biochem Biophys Res Commun (2005) 330:813-820.参照)を使用してomh1変異株を形質転換(文献:T. Morita and K. Takegawa, Yeast (2004) 21:613-617.、および特開2005-198612号公報参照)した。次いで、ロイシンを含有していないMM培地(5ml)を用いて定常期まで培養し、キチナーゼの発現培地(MM培地を基礎とし、2%(w/v)グルコースの代わりに0.1%(w/vv)グルコースおよび2%(w/v)フルクトースを含有する。)の10mlに移して30℃で3時間温置した。その後、培地の上澄みからキチナーゼを回収し、6%(w/v)ポリアクリルアミドゲルを用いたSDS(Sodium dodecyl sulfate)−PAGE(Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis)にてO−グリコシド型糖鎖の伸長を分析した。
培地からのキチナーゼの回収は、以下に示すように行った。培地にキチンビーズ(20mg、シグマ)を加えた後、4℃で12時間撹拌し、遠心してペレットとした。該ペレットをナトリウム緩衝液(50mMTris−HCl、pH7.5、150mMNaCl)で3回洗浄し、SDSサンプル緩衝液(50μl)で5分間ボイル(boil)することによりキチナーゼを抽出した。ゲルの染色は、Coomassie Brilliant Blue R−250により行った。
野生型S.ポンベ(例6)、omh2変異株〜omh6(例7〜11)変異株について、例5と同様の方法でキチナーゼの分析を行った。また、S.セレビシエ(例12)をYPD培地(10ml)にて30℃で培養し、例5と同様にして6%(w/v)ポリアクリルアミドゲルを用いたSDS−PAGEにてキチナーゼを分離した。結果を図5に示す。レーン1はS.セレビシエ、レーン2は野生型S.ポンベ、レーン3はomh1変異株、レーン4はomh2変異株、レーン5はomh3変異株、レーン6はomh4変異株、レーン7はomh5変異株、レーン8はomh6変異株における電気泳動の結果である。キチナーゼの分子量は、83kDaと175kDaのマーカーを用いて決定した。
[例13]
YES培地によりomh1変異株を30℃で定常期まで培養し、そこから細胞表面のガラクトマンナンを抽出し、凍結乾燥状態のガラクトマンナンを得た(Methods Enzymol,185,440−470(1990)に記載の方法)。次に、凍結乾燥状態のガラクトマンナン2mgを無水ヒドラジン0.2mlとともに60℃で6時間加熱し、ヒドラジンを蒸発させ、カチオン交換樹脂(Dowex50W−x2(H+))に通してナトリウムイオンを除去した。次に、得られたサンプルをピリジルアミノ化剤(20μl)とともに90℃で60分加熱し、還元剤(20μl)を加えて80℃で35分加熱することにより、糖鎖の還元末端に2−アミノピリジンを付加した。余分なピリジルアミノ化剤および還元剤は、フェノール/クロロホルム(体積比は50/50)抽出により除去した。
次に、得られたサンプルについて順相HPLC分析(カラム:Asahipak NH2P−50 column(4.6mm×50mm)、昭和電工社製)を行った。糖鎖の分子サイズは、PA(ピリジルアミノ)ラベルした標準マーカーであるPA化マンノース、PA化マルトース、PA化イソマルトオリゴ糖(タカラバイオ社製)により決定した。
野生型S.ポンベ(例14)およびomh2変異株〜omh6変異株(例15〜19)についても例13と同様にして糖鎖の順相HPLC分析を行った。また、例14では、検出された5つの主要なピークを回収し、ジャック豆αマンノシダーゼやコーヒー豆αガラクトシダーゼによる処理後、それらのピークがどのように変化するかを調べ、それら5つのピークにそれぞれ相当する糖鎖構造を確認した。
例13〜19の順相HPLC分析の結果を図6に示す。図6において、(a)は野生型S.ポンベ、(b)はomh1変異株、(c)はomh2変異株、(d)はomh3変異株、(e)はomh4変異株、(f)はomh5変異株、(g)はomh6変異株における順相HPLC分析の結果である。
omh2変異株〜omh6変異株(図6(c)〜(g))における糖鎖は、野生型S.ポンベのもの(図6(a))とほぼ同等であり、変化がなかった。
これらの結果から、omh1変異株では、1つ目のマンノースにα1,2結合で2つ目のマンノースが結合することが抑制されており、omh1遺伝子がO−グリコシド型糖鎖の伸長に重要な役割を果たしていることが示された。
omh1遺伝子を、野生型S.ポンベのゲノムDNAからPCRにより増幅し、制限酵素BglIIおよびNotIの切断部位を導入して、それら制限酵素により処理した後、ベクターpREP41−GFP(pREP41から得たベクターpTN197、Mol Biol Cell,12,3955−3972(2001)に記載)の相当する部位に挿入してクローニングすることにより、C末端にGFP(緑色蛍光蛋白質)が結合したomh1pを発現する遺伝子を有するベクターpREP41−omh1−GFPを得た。また、Yeast,18,745−757(2001)に記載の方法により、RFP(赤色蛍光蛋白質)が結合したGms1p(Gms1遺伝子によりコードされるUDPガラクトース輸送体)を発現する遺伝子を有するベクターpAU−Gms1−RFPを得た。
また、omh1変異株を、pREP41−omh1−GFPまたはpAU−Gms1−RFPで形質転換したものを、ウラシルおよびロイシンを含有しないMM培地により30℃で培養した。その後、回収した細胞(OD600=0.5)を観察した。その結果を図8(a)〜(c)に示す。図8(a)はノマルスキー光学系を搭載した観察装置により観察したもの、図8(b)は蛍光顕微鏡によりpREP41−GFPを観察したもの、図8(c)はpAU−Gms1−RFPを観察したものである。
[例21]
S.セレビジエのキチナーゼ(Cts1)遺伝子とS.ポンベのインベルターゼプロモーターとシグナルペプチドをコードするDNA配列とを有するベクターpFM1−1−ScCts1を使用して、S.ポンベの野生株を形質転換し、ロイシンを含有していないMM培地(ただし、2%(w/v)グルコースの代わりに8%(w/v)グルコースを含有する。)100mlで定常期まで培養し、キチナーゼの発現培地(MM培地を基礎とし、2%(w/v)グルコースの代わりに0.05%(w/v)グルコースおよび3%(v/v)グリセロールを含有する。)の100mlに移して、30℃で12時間震盪培養を行った。その後、培地の上澄みからキチナーゼを回収し、6%(w/v)ポリアクリルアミドゲルを用いたSDS−PAGEにてキチナーゼの精製度を確認した。培地からのキチナーゼの回収は、以下のようにして行った。培地にキチン(400mg、和光純薬社製)を加えた後、4℃で12時間撹拌し、遠心してペレットとした。ペレットをナトリウム緩衝液(50mMTris−HCl、pH7.5、150mMNaCl)で3回洗浄し、SDSサンプル緩衝液(63mMトリス塩酸(pH6.8)、10%(v/v)グリセロール、2%(w/v)SDS、0.002%(w/v)BPB、1ml)で5分間ボイルすることによりキチナーゼを抽出した。ゲルの染色はCoomassie Brilliant Blue R−250により行った。
omh1変異株について、例21と同様の方法でキチナーゼの解析を行った。
例21および22の結果を図9に示す。レーン1は野生株S.ポンベ、レーン2はomh1変異株の結果を示す。
例21においてキチンから抽出したキチナーゼからSDSを除去するために、MilliQ水(超純水)に対して透析を行った後、凍結乾燥を行った。S.ポンベ野生株から1mgの凍結乾燥粉末を得た。
次に、凍結乾燥粉末のキチナーゼ0.3mgをヒドラクラブC−206(Jオイルミルズ社製)を用いてヒドラジン分解を行った。次に、得られた遊離糖鎖サンプルをピリジルアミノ化剤(20μl)とともに90℃で60分加熱し、次いで還元剤(20μl)を加えて、80℃で35分加熱することにより、糖鎖の還元末端に2−アミノピリジンを付加した。余分なピリジルアミノ化剤および還元剤はフェノール/クロロホルム(体積比は50/50)抽出により除去した。
次に、得られたサンプルについて、順相HPLC分析(カラム:Amide−80 column(4.6mm×75mm)、東ソー社製)を行った。糖鎖の分子サイズは、PAラベルした標準マーカーであるPA化マンノース、PA化マルトース、PA化イソマルトオリゴ糖(タカラバイオ社製)により決定した。
例22においてキチンから抽出したキチナーゼからSDSを除去するために、MilliQ水に対して透析を行った後、凍結乾燥を行った。omh1変異株から0.5mgの凍結乾燥粉末を得た。その後、例23と同様にして、順相HPLC分析を行った。
例23および24の順相HPLC分析の結果を図10に示す。図10において、(a)はS.ポンベ野生株、(b)はomh1変異株の結果を示す。
S.ポンベ野生株(例23)およびomh1変異株(例24)で確認されたジサッカライドのピークの構造を詳細に分析するために、ジサッカライドのピークを分取精製し、逆相HPLC分析(カラム:ODS−80Ts column(4.6mm×150mm)、東ソー社製)を行った。また、分取精製したジサッカライドに対してα−ガラクトシダーゼ(シグマ社製G8507、コーヒー豆由来)による消化、α−マンノシダーゼ(シグマ社製M7257、ジャック豆由来)による消化を行った後に、同様に逆相HPLC分析を行った。
逆相HPLC分析の結果を図11に示す。図11の(a)と(e)は標準糖鎖であるMan−PAとMan−Man−PA(Manα1−2Man−PA)の保持時間を示す。また、図11(b)〜(d)はS.ポンベ野生株の分析結果、図11(f)〜(h)はomh1変異株の分析結果を示しており、図11の(b)および(f)が分取精製後、(c)および(g)がα−ガラクトシダーゼ消化後、(d)および(f)がα−マンノシダーゼ消化後の分析結果である。
これらの結果から、S.ポンベ野生株で発現させたキチナーゼのジサッカライドが主にO−Man−Galからなること、omh1変異株で発現させたキチナーゼの全ての糖鎖がO−Man−Galからなることが示され、異種タンパク質発現時にも、その糖鎖構造が細胞表面のガラクトマンナンと同様の糖鎖構造からなることが示された。
なお、2008年10月1日に出願された日本特許出願2008−256354号、及び2009年5月15日に出願された日本特許出願2009−119280号の明細書、特許請求の範囲、図面及び要約書の全内容をここに引用し、本発明の明細書の開示として、取り入れるものである。
Claims (6)
- omh1遺伝子(SPBC19C7.12c)が欠失または失活したシゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)を宿主とし、異種蛋白質をコードする遺伝子を含み、前記異種蛋白質に対応する野生型蛋白質が、O−グリコシド型糖鎖を有している蛋白質である形質転換体。
- さらに、前記異種蛋白質をコードする遺伝子の5’末端に結合した前記シゾサッカロミセス・ポンベ内で機能する分泌シグナルをコードする遺伝子を含む、請求項1に記載の形質転換体。
- omh1遺伝子(SPBC19C7.12c)が欠失または失活したシゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)を宿主とし、異種蛋白質をコードする遺伝子を前記宿主に組み込み、前記異種蛋白質に対応する野生型蛋白質がO−グリコシド型糖鎖を有している異種蛋白質であることを特徴とする形質転換体の製造方法。
- 前記異種蛋白質をコードする遺伝子の5’末端側にシゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)内で機能する分泌シグナルをコードする遺伝子を有する、請求項3に記載の形質転換体の製造方法。
- 請求項1又は2に記載の形質転換体を培養し、産生されたO−Man−Galなるジサッカライド構造を有するO−グリコシド型糖鎖を有する異種蛋白質を取得することを特徴とするO−グリコシド型糖鎖含有異種蛋白質の製造方法。
- 形質転換体を培養した培養液からO−グリコシド型糖鎖を有する異種蛋白質を取得する、請求項5に記載のO−グリコシド型糖鎖含有異種蛋白質の製造方法。
Priority Applications (1)
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