ES2397441T5 - Secuencias polinucleotídicas y polipeptídicas implicadas en el proceso de remodelación ósea - Google Patents

Secuencias polinucleotídicas y polipeptídicas implicadas en el proceso de remodelación ósea Download PDF

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Description

DESCRIPCIÓN
Secuencias polinucleotídicas y polipeptídicas implicadas en el proceso de remodelación ósea
Campo de la invención
La invención se refiere, en parte, a polinucleótidos genéticos únicos y recién identificados que intervienen en el proceso de la remodelación ósea; variantes y derivados de los polinucleótidos y los correspondientes polipéptidos; usos de los polinucleótidos, polipéptidos, variantes y derivados; procedimientos y composiciones para la mejora de los síntomas ocasionados por trastornos de remodelación ósea, que incluyen pero sin limitarse a ellos, osteoporosis, osteopenia, osteomalacia, hiperparatiroidismo, hipotiroidismo, hipertiroidismo, hipogonadismo, tirotoxicosis, mastocitosis sistémica, hipofosfatasia adulta, hipercorticalismo, osteogénesis imperfecta, enfermedad de Paget, enfermedad/síndrome de Cushing, síndrome de Turner, enfermedad de Gaucher, síndrome de Ehlers-Danlos, síndrome de Marfan, síndrome de Menkes, síndrome de Fanconi, mieloma múltiple, hipercalciemia, hipocalciemia, artritis, periodontitis, raquitismo (que incluye el raquitismo hipofosfatémico ligado al cromosoma X, y el dependiente de vitamina D de tipos I y II), fibrogénesis imperfecta ósea, trastornos osteoescleróticos tal como picnodisostosis y daño ocasionado por procesos inflamatorios mediados por macrófagos.
En particular, esta invención se refiere a perfiles de expresión de polinucleótidos en osteoclastos activos, el aislamiento y la identificación de polinucleótidos, polipéptidos, variantes y derivados implicados en la actividad de los osteoclastos, validación de los polinucleótidos identificados para ver si son posiblemente dianas terapéuticas, y uso de los polinucleótidos, polipéptidos, variantes y derivados para la mejora de estados patológicos y propósitos de investigación, así como para el diagnóstico de estados patológicos o para la predisposición a padecerlos.
Antecedentes de la invención
El hueso es un tejido conjuntivo dinámico comprendido por poblaciones de células que realizan funciones diferentes necesarias para mantener la integridad estructural, mecánica y bioquímica del hueso y la homeostasis mineral del cuerpo humano. Los principales tipos de células implicados incluyen los osteoblastos responsables de la formación de hueso y el mantenimiento de la masa ósea, y los osteoclastos responsables de la osteoclasia (resorción ósea). Los osteoblastos y los osteoclastos intervienen en un proceso dinámico denominado remodelación ósea. El desarrollo y la proliferación de estas células a partir de sus progenitores están gobernados por redes de factores de crecimiento y citocinas producidos en el microentorno del hueso, así como por hormonas sistémicas. La remodelación ósea se produce a lo largo de la vida del individuo y es necesaria para el mantenimiento del tejido óseo sano y la homeostasis mineral. El proceso permanece en buena parte en equilibrio y está gobernado por una interacción compleja de hormonas sistémicas, péptidos y proteínas posteriores de las vías de señalización, factores de transcripción locales, citocinas, factores de crecimiento y genes de remodelación de la matriz.
Cualquier interferencia o desequilibrio que surja en el proceso de remodelación ósea puede generar una osteopatía, de manera que los trastornos óseos más frecuentes se caracterizan por una disminución neta en la masa ósea. Una causa importante de esta reducción de la masa ósea es un incremento del número de osteoclastos y/o de su actividad. La más frecuente de estas enfermedades, y quizás la mejor conocida, es la osteoporosis que se produce en particular en las mujeres tras el comienzo de la menopausia. De hecho, la osteoporosis es la causa subyacente más significativa de las fracturas óseas de las mujeres de mediana edad y ancianas. Mientras que se ha insistido mucho en que la falta de estrógenos es un factor de la osteoporosis tras la menopausia, hay muchas pruebas de que la remodelación es un proceso controlado de forma local que tiene lugar en tramos discretos por todo el esqueleto, como describió por primera vez Frost hace unos cuarenta años (Frost H. M. 1964).
Dado que la remodelación ósea tiene lugar en tramos discretos, para el inicio de la osteoclasia y el proceso de remodelación normal pueden ser más importantes que las hormonas sistémicas las hormonas y las enzimas producidas de forma local. Tal control local está mediado por los osteoblastos y los osteoclastos del microentorno en el que operan. Por ejemplo, los osteoclastos se adhieren a la matriz ósea y forman compartimentos independientes entre ellos mismos y la superficie ósea, delimitados por una zona de cierre hermético formada por un anillo de actina que rodea el borde rugoso o en cepillo. Muchas vesículas pequeñas transportan las enzimas hacia la matriz ósea y captan la matriz ósea parcialmente digerida. El microentorno dentro de la zona del cierre hermético es rica en enzimas lisosómicas y muy ácida en comparación con el pH fisiológico normal del cuerpo. La membrana del borde en cepillo también expresa RANK, el receptor de RANKL, y el receptor del factor estimulador de colonias de macrófagos (M-CSF), y ambos son responsables de la diferenciación de los osteoclastos, al igual que el receptor de la calcitonina es capaz de inactivar rápidamente al osteoclasto (Baron, R. 2003).
En una estructura compleja de inhibición y estimulación que todavía no se conoce totalmente, la hormona del crecimiento, el factor 1 de crecimiento insulinoide, los corticoesteroides sexuales, la hormona tiroidea, las hormonas calciótrofas, tales como la PTH y la prostaglandina E2, distintas citocinas, tal como la interleucina-1 p, interleucina 6 y el factor a de la necrosis tumoral, y la 1,25-dihidroxivitamina D (calcitriol) actúan coordinadamente en el proceso de remodelación ósea (Jilka et al., 1992; Poli et al., 1994; Srivastava et al. 1998; de Vemejoul 1996).
Así pues, es razonable que los entornos locales únicos creados por estas células especializadas se deban a la expresión de, o bien secuencias genéticas únicas que no se expresan en otros tejidos, y/o bien variantes de ayuste de polinucleótidos y polipéptidos expresados en otros tejidos. El aislamiento y la identificación de los polinucleótidos, polipéptidos y sus variantes y derivados específicos de la actividad de los osteoclastos permitirán un conocimiento más claro del proceso de remodelación y ofrecerá dianas terapéuticas específicas del tejido para el tratamiento de estados patológicos relacionados con la remodelación ósea.
Muchas enfermedades ligadas a la remodelación ósea se conocen mal, son por lo general intratables o se pueden tratar tan sólo hasta cierto punto. Por ejemplo, la artrosis es difícil de tratar porque no hay cura y el tratamiento se centra en aliviar el dolor e impedir la deformación de la articulación afectada. Los fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE) se utilizan de forma general para aliviar el dolor.
Otro ejemplo es la osteoporosis, en la que los únicos fármacos que en la actualidad la FDA ha autorizado para el uso en los Estados Unidos son los fármacos inhibidores la osteoclasia que impiden la pérdida de hueso. El tratamiento sustitutivo con estrógenos es un ejemplo de fármaco inhibidor de la osteoclasia. Otros incluyen ácido alendrónico (Fosamax, un inhibidor de la osteoclasia de tipo bisfosfonato), ácido risedrónico (Actonel, un inhibidor de la osteoclasia de tipo bisfosfonato), raloxifeno (Evista, un modulador selectivo del receptor de estrógenos [SERM, por su nombre en inglés]), calcitonina (Calxynar, una hormona) y la paratirina/teriparatida (Forteo, una versión sintética de la hormona humana, paratirina, que ayuda a regular el metabolismo del calcio).
Los bisfosfonatos tales como el ácido alendrónico y el ácido risedrónico se fijan permanentemente a la superficie del hueso e interfieren con la actividad de los osteoclastos. Esto permite que los osteoblastos funcionen más rápidos que la velocidad de resorción. Los efectos secundarios más frecuentes son náuseas, dolor abdominal y trastorno de los movimientos peristálticos. Sin embargo, se ha descrito que el ácido alendrónico también provoca irritación e inflamación del esófago y, en algunos casos, úlceras esofágicas. El ácido risedrónico es diferente del alendrónico desde el punto de vista químico y también tiene menos probabilidad de provocar la irritación esofágica. Sin embargo, algunos alimentos, el calcio,los suplementos de hierro, las vitaminas y los minerales, o los antiácidos que contienen calcio, magnesio o aluminio, pueden reducir la absorción del ácido risedrónico, lo que da lugar a una pérdida de la eficacia.
El efecto secundario más frecuente del raloxifeno y otros SERM (tal como el tamoxifeno) son los sofocos. Sin embargo, el raloxifeno y otros tratamientos sustitutivos con hormonas se ha visto que incrementan el riesgo de coágulos de sangre, entre ellos trombosis de vena profunda y embolia pulmonar, enfermedad cardiovascular y cáncer.
La calcitonina no es tan eficaz como los estrógenos y los otros fármacos que inhiben la osteoclasia a la hora de incrementar la densidad ósea ni de fortalecer el hueso. Los efectos secundarios habituales de la calcitonina inyectada o de pulverización nasal son las náuseas y la irritación cutánea. Los pacientes pueden sufrir irritaciones nasales, rinorrea o epistaxis. La calcitonina inyectable puede provocar enrojecimiento de la piel en el sitio de la inyección, exantema e irritación cutánea.
Una situación que demuestra la conexión entre varios trastornos o estados patológicos que afectan la remodelación ósea es la del uso del ácido etidrónico (Didronel) autorizado por primera vez por la FDA para tratar la enfermedad de Paget. La enfermedad de Paget es una osteopatía caracterizada por una remodelación desordenada y acelerada del hueso, que conduce a debilidad ósea y dolor. El Didronel se ha utilizado para indicaciones no autorizadas y en algunos estudios se demostró que incrementa la densidad ósea de las mujeres que sufren osteoporosis tras la menopausia. También se ha encontrado que es eficaz para la prevención de la osteopenia en los pacientes que requieren fármacos esteroideos a largo plazo (tal como prednisona o cortisona). Sin embargo, el uso continuo o en dosis elevadas del Didronel puede ocasionar otra osteopatía llamada osteomalacia. Al igual que la osteoporosis, la osteomalacia puede conducir a la debilitación de los huesos con un incremento del riesgo de fracturas. Debido al problema de la osteomalacia y a que todavía no hay suficientes estudios sobre la reducción en la tasa de fracturas óseas, la FDA de los Estados Unidos no ha autorizado el Didronel para el tratamiento de la osteoporosis.
El tratamiento de la osteoporosis se ha centrado en gran medida en los fármacos inhibidores de la osteoclasia que reducen la tasa de osteopenia, pero los nuevos tratamientos son prometedores al incrementar la densidad mineral ósea en vez de simplemente mantenerla o enlentecer su pérdida. Las primeras estrategias de la osteoporosis consisten en buena parte en fármacos candidatos de nuevas clases terapéuticas, en particular, inhibidores de la catepsina K, osteoprotegerina y calcilíticos, así como nuevos bisfosfonatos. Algunos de ellos son ejemplos en donde los programas de genómica que explotan nuevos fármacos se están desarrollando basándose en un conocimiento más profundo de la biología del hueso y tienen el potencial de cambiar las esperanzas de tratamiento de los trastornos óseos a largo plazo.
Por consiguiente, existe la necesidad de conocer mejor el proceso de remodelación ósea y proporcionar nuevas composiciones que son útiles para el diagnóstico, pronóstico, tratamiento, prevención y evaluación de tratamientos para la remodelación ósea y los trastornos asociados. Se ha desarrollado un procedimiento para analizar los patrones de expresión de polinucleótidos y se ha aplicado para identificar polinucleótidos, polipéptidos, variantes y derivados implicados específicamente en la remodelación ósea.
La presente invención busca satisfacer éstas y otras necesidades.
Compendio de la invención
La presente invención se refiere a una composición farmacéutica que se utiliza en la modulación de la diferenciación de los osteoclastos in vivo, en la prevención de osteopatías o en el tratamiento de osteopatías, que comprende un polipéptido aislado que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:
a) SEQ ID NO. 48,
b) un polipéptido codificado por la SEQ ID NO. 1,
c) un fragmento de uno cualquiera de a) o b) que es capaz de favorecer o inhibir la diferenciación de los osteoclastos, y
d) un análogo de uno cualquiera de a) o b) que es capaz de favorecer o inhibir la diferenciación de los osteoclastos, en donde dicho análogo tiene una similitud de secuencia de al menos el 90 % con el polipéptido de a) o b), y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
La presente invención también se refiere a una composición farmacéutica que se utiliza en la modulación de la diferenciación de los osteoclastos in vivo, en la prevención de osteopatías o en el tratamiento de osteopatías, en donde la composición farmacéutica comprende un polinucleótido aislado seleccionado del grupo que consiste en: a) un polinucleótido que comprende la SEQ ID NO. 1,
b) un polinucleótido que comprende el marco abierto de lectura de los nucleótidos 150 a 1136 de la SEQ ID NO. 1, c) un polinucleótido que comprende una secuencia idéntica a a) al menos al 80 % a lo largo de toda la longitud del polinucleótido,
d) un polinucleótido que comprende una secuencia idéntica a b) al menos al 80 % a lo largo de toda la longitud del polinucleótido,
e) un polinucleótido que comprende una secuencia complementaria a a) al menos al 80 % a lo largo de toda la longitud del polinucleótido, y
f) un polinucleótido que comprende una secuencia complementaria a b) al menos al 90 % a lo largo de toda la longitud del polinucleótido,
y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
La presente invención también se refiere a un polinucleótido aislado seleccionado del grupo que consiste en: a) un polinucleótido que comprende la SEQ ID NO. 1,
b) un polinucleótido que comprende el marco abierto de lectura de los nucleótidos 150 a 1136 de la SEQ ID NO. 1, c) un polinucleótido que comprende una secuencia idéntica a a) al menos al 80 % a lo largo de toda la longitud del polinucleótido,
d) un polinucleótido que comprende una secuencia idéntica a b) al menos al 90 % a lo largo de toda la longitud del polinucleótido,
e) un polinucleótido que comprende un secuencia complementaria a a) al menos al 80 % a lo largo de toda la longitud del polinucleótido, y
f) un polinucleótido que comprende una secuencia complementaria a b) al menos al 90 % a lo largo de toda la longitud del polinucleótido,
para el uso en la modulación de la diferenciación de los osteoclastos in vivo, en la prevención de osteopatías o en el tratamiento de osteopatías.
La presente invención también se refiere a un polipéptido aislado que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:
a) SEQ ID NO. 48,
b) un polipéptido codificado por la SEQ ID NO. 1,
c) un fragmento de uno cualquiera de a) o b) que es capaz de favorecer o inhibir la diferenciación de los osteoclastos, y
d) un análogo de uno cualquiera de a) o b) que es capaz de favorecer o inhibir la diferenciación de los osteoclastos, en donde dicho análogo tiene una similitud de secuencia de al menos el 90 % con el polipéptido de a) o de b), para el uso en la modulación de la diferenciación de los osteoclastos in vivo, en la prevención de osteopatías o en el tratamiento de osteopatías.
La presente invención también se refiere a un compuesto capaz de interferir con la actividad o la expresión de un polipéptido seleccionado entre SEQ ID NO. 48 o un polipéptido codificado por la SEQ ID NO. 1 para el uso en la prevención de osteopatías o en el tratamiento de osteopatías en un individuo que lo necesite, en donde dicho compuesto se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo aislado o purificado o un fragmento fijador de antígeno del mismo capaz de fijarse específicamente a un polipéptido que consiste en SEQ ID NO. 48, y un siRNA o shRNA que inhiben específicamente la expresión de un polipéptido codificado por la SEQ ID NO. 1. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, anticuerpo policlonal, anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado o fragmento fijador de antígeno del mismo. En algunas realizaciones, el fragmento fijador de antígeno es un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2 o un fragmento Fv.
La invención también se refiere al uso de un polinucleótido aislado, polipéptido aislado o compuesto como se define más arriba en la fabricación de un medicamento para la modulación de la diferenciación de los osteoclastos in vivo, para la prevención de osteopatías o para el tratamiento de osteopatías.
La invención también se refiere al uso de al menos un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en: a) un polinucleótido que comprende la SEQ ID NO. 1;
b) un polinucleótido que comprende el marco abierto de lectura de los nucleótidos 150 a 1136 de la SEQ ID NO. 1; c) un polinucleótido que comprende una secuencia idéntica a a) al menos al 80 % a lo largo de toda la longitud del polinucleótido;
d) un polinucleótido que comprende una secuencia idéntica a b) al menos al 90 % a lo largo de toda la longitud del polinucleótido,
e) un polinucleótido que comprende un secuencia complementaria a a) al menos al 80 % a lo largo de toda la longitud del polinucleótido, y
f) un polinucleótido que comprende una secuencia complementaria a b) al menos al 90 % a lo largo de toda la longitud del polinucleótido,
en el diagnóstico in vitro de una osteopatía.
La presente invención también se refiere a un procedimiento para identificar un compuesto inhibidor capaz de alterar la expresión o la actividad de un polipéptido de SEQ ID NO. 48, o un polipéptido codificado por la SEQ ID NO. 1, en donde el procedimiento comprende poner en contacto dicho polipéptido o una célula que expresa dicho polipéptido con un compuesto candidato y medir la expresión o la actividad de dicho polipéptido, por medio de lo cual un compuesto inhibidor adecuado se identifica positivamente por una reducción de la capacidad del polipéptido para favorecer la diferenciación de los osteoclastos. Tal procedimiento puede comprender adicionalmente una etapa de inducción de la diferenciación de los osteoclastos cuando se pone en contacto dicho polipéptido o célula con un compuesto candidato.
En algunas realizaciones de la presente invención, la osteopatía se selecciona del grupo que consiste en osteoporosis, osteopenia, osteomalacia, hiperparatiroidismo, hipertiroidismo, hipogonadismo, tirotoxicosis, mastocitosis sistémica, hipofosfatasia adulta, hipercorticalismo, osteogénesis imperfecta, enfermedad de Paget, enfermedad/síndrome de Cushing, síndrome de Turner, enfermedad de Gaucher, síndrome de Ehlers-Danlos, síndrome de Marfan, síndrome de Menkes, síndrome de Fanconi, mieloma múltiple, hipercalciemia, hipocalciemia, artritis, periodontitis, raquitismo, fibrogénesis imperfecta ósea, trastornos osteoescleróticos y daño ocasionado por procesos inflamatorios mediados por macrófagos.
En la presente memoria se dan a conocer polinucleótidos que comprenden secuencias implicadas en el proceso de la remodelación ósea, el marco abierto de lectura de tales secuencias, secuencias sustancialmente idénticas (p. ej, variantes [p. ej., variante alélica], ortólogos no humanos), secuencias sustancialmente complementarias y fragmentos de una cualquiera de las mismas citadas anteriormente.
La presente invención se refiere a un polipéptido que comprende secuencias que intervienen en el proceso de remodelación ósea, entre ellas, análogos biológicamente activos y fragmentos biológicamente activos de las mismas. La presente invención también se refiere a composiciones que son útiles para el diagnóstico, pronóstico, tratamiento, prevención y/o evaluación de tratamientos para la remodelación ósea y los trastornos asociados.
También se describe en la presente memoria un procedimiento para analizar los patrones de expresión de polinucleótidos, y se aplica en la identificación de polinucleótidos, polipéptidos, variantes y derivados que intervienen específicamente en la remodelación ósea.
La presente descripción se refiere a los perfiles de expresión de polinucleótidos de los osteoclastos, el aislamiento y la identificación de polinucleótidos, sus polipéptidos correspondientes, variantes y derivados que intervienen en la actividad de los osteoclastos, la validación de estos elementos identificados por su potencial como dianas terapéuticas y el uso de dichos polinucleótidos, polipéptidos, variantes y derivados para la mejora de los estados patológicos.
Se dan a conocer en la presente memoria polinucleótidos y/o polipéptidos relacionados que se han aislado e identificado. Más específicamente, se dan a conocer en la presente memoria (aislados o sustancialmente purificados) polinucleótidos que comprenden o consisten en uno cualquiera de SEQ ID NO. 1 a 33, SEQ ID NO. 85 o SEQ ID NO.
86, su secuencia codificante (marco abierto de lectura), secuencia sustancialmente idéntica (p, ej, variantes, ortólogos [p. ej., SEQ ID NO. 35]), secuencias sustancialmente complementarias y polipéptidos relacionados que comprenden una cualquiera de SEQ ID NO. 48-80 y polipéptidos codificados por la s EQ ID NO. 85 o la SEQ ID NO. 86 que se ha demostrado que están inducidos de una forma muy específica en los osteoclastos. También se describen en la presente memoria análogos polipeptídicos, variantes (p. ej., SEQ ID NO. 81) y fragmentos de los mismos.
NSEQ se refiere de forma general a secuencias polinucleotídicas descritas en la presente memoria e incluye, por ejemplo, SEQ ID NO. 1 a 33, SEQ ID NO. 85 o SEQ ID NO. 86, mientras que Ps Eq se refiere de forma general a secuencias polipeptídicas descritas en la presente memoria e incluye, por ejemplo, SEQ ID NO. 48 a 82 y polipéptidos codificados por la SEQ ID NO. 85 o la SEQ ID NO. 86. Por supuesto, se entenderá que NSEQ también abarca secuencias polinucleotídicas que están diseñadas o que proceden de SEQ ID NO. 1 a 33, SEQ ID NO. 85 o SEQ ID NO. 86, por ejemplo, su secuencia codificante, secuencias complementarias, Ejemplos no limitantes de tales secuencias se describen en la presente memoria (p, ej., SEQ ID NO. 42-45).
Tal y como se utiliza en la presente memoria, la terminología «NSEQ» se refiere de forma general a las secuencias polinucleotídicas que comprenden o consisten en una cualquiera de SEQ ID NO. 1 a 33, 85 u 86 (p. ej., una forma aislada) o comprenden o consisten en un fragmento de una cualquiera de SEQ ID NO. 1 a 33, 85 u 86. La terminología «NSEQ» se refiere más en concreto a una secuencia polinucleotídica que comprende o consiste en una porción transcrita de una cualquiera de las SEQ ID NO. 1 a 33, 85 u 86, que puede estar, por ejemplo, libre de porción o porciones sin traducir o intraducibles (a saber, una porción codificante de una cualquiera de las SEQ ID NO. 1 a 33, 85 u 86). La terminología «NSEQ» se refiere adicionalmente a una secuencia sustancialmente idéntica a una cualquiera de las anteriores y más en concreto sustancialmente idéntica a la secuencia polinucleotídica que comprende o consiste en una porción transcrita de una cualquiera de las SEQ ID NO. 1 a 33, 85 u 86, que puede estar, por ejemplo, libre de porción o porciones sin traducir o intraducibles. La terminología «NSEQ» se refiere adicionalmente a una región de la secuencia polinucleotídica de una cualquiera de SEQ ID NO. 1 a 33, 85 u 86 que codifica o que es capaz de codificar un polipéptido. La terminología «NSEQ» también se refiere a una secuencia polinucleotídica capaz de codificar uno cualquiera de los polipéptidos descritos en la presente memoria o un fragmento de polipéptido de uno cualquiera de los anteriores. Finalmente, la terminología «NSEQ» también comprende una secuencia sustancialmente complementaria a una cualquiera de las anteriores.
La terminología «NSEQ inhibidora» por lo general se refiere a una secuencia sustancialmente complementaria a una cualquiera de las SEQ ID NO. 1 a 33, 85 u 86, sustancialmente complementaria a un fragmento de una cualquiera de las SEQ ID NO. 1 a 33, 85 u 86, sustancialmente complementaria a una secuencia sustancialmente idéntica a llas SEQ ID NO. 1 a 33, 85 u 86 y, más en concreto, sustancialmente complementaria a una porción transcrita de una cualquiera de las SEQ ID NO. 1 a 33, 85 u 86 (p, ej., que puede estar sin la porción no traducida o intraducible) y que puede tener una acción atenuadora o incluso inhibidora de la transcripción de un mRNA o de la expresión de un polipéptido codificado por la correspondiente SEQ ID NO. 1 a 33, 85 u 86. La «NSEQ inhibidora» idónea puede tener, por ejemplo y sin limitación, de unos 10 a unos 30 nucleótidos, de unos 10 a unos 25 nucleótidos, o de unos 15 a unos 20 nucleótidos. Tal y como se utiliza en la presente memoria, la terminología «nucleótido» significa desoxirribonucleótido o ribonucleótido. El uso de análogos de nucleótidos también está contemplado en la presente invención.
Los polinucleótidos pueden tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 80 % a aproximadamente el 100 % (p. ej., 80 %, 90 %, 95 %, etc.) con una secuencia polinucleotídica seleccionada del grupo que consiste en los polinucleótidos que comprenden (a) uno cualquiera de SEQ ID NO. 1 a 33 o SEQ ID NO.
85 o SEQ ID NO. 86; (b) un marco abierto de lectura de (a); (c) un complemento completo de (a) o (b); (d) un fragmento de uno cualquiera de (a) a (c).
Tal y como se utiliza en la presente memoria, la terminología «región intraducible» puede incluir, por ejemplo, una región promotora (o porción de la misma), región silenciadora, región potenciadora, etc., de una secuencia polinucleotídica.
Tal y como se utiliza en la presente memoria, «región intraducible» puede incluir, por ejemplo, una porción iniciadora de un secuencia polinucleotídica (cadena arriba de un codón de iniciación, p. ej., AUG), regiones intrónicas, codón de parada y/o región cadena abajo de un codón de parada (incluida la cola de poliA, etc.).
Los complementos de la secuencia polinucleotídica aislada descritos en la presente memoria pueden ser los que, por ejemplo, se hibridan en condiciones de rigor alto a una cualquiera de las secuencias nucleotídicas en (a) o (b).
Las condiciones de rigor alto pueden comprender, por ejemplo, una reacción de hibridación a 65 °C en SSC a 5X, solución de Denhardt a 5X, SDS al 1% y DNA de esperma de salmón desnaturalizado a 100 gg/ml.
De acuerdo con la presente invención, la secuencia polinucleotídica puede utilizarse, por ejemplo, en el tratamiento de enfermedades o trastornos que implican la remodelación ósea.
Los fragmentos de los polinucleótidos pueden utilizarse, por ejemplo, como sondas para determinar la presencia del polinucleótido aislado (o su complemento o fragmentos del mismo) en una muestra, célula, tejido, etc., para propósitos experimentales o para el propósito de diagnóstico de enfermedades o trastornos que implican la remodelación ósea.
También se describe en la presente memoria una combinación que comprende multitud de polinucleótidos (sustancialmente purificados y/o aislados). Los polinucleótidos se pueden coexpresar con uno o más genes conocidos por intervenir en la remodelación ósea. Además, los numerosos polinucleótidos se pueden seleccionar, por ejemplo, del grupo que consiste en un polinucleótido que comprende (a) uno cualquiera de SEQ ID NO. 1 a 33, SEQ ID NO. 85 o SEQ ID NO. 86; (b) un marco abierto de lectura de (a); (c) una secuencia polinucleotídica que comprende o consiste en una porción transcrita de una cualquiera de SEQ ID NO. 1 a 33, 85 u 86 que puede estar, por ejemplo, libre de porción o porciones sin traducir o intraducibles; (d) una secuencia complementaria a una cualquiera de (a) a (c); (e) una secuencia que se hibrida en condiciones de rigor alto a una cualquiera de las secuencias nucleotídicas de (a) a (d); y (f) fragmentos de uno cualquiera de (a) a (e).
También se describe en la presente memoria un polinucleótido que codifica uno cualquiera de los polipéptidos descritos en la presente memoria. El polinucleótido (RNA, DNA, etc.) puede codificar un polipéptido que se puede seleccionar del grupo que consiste en uno cualquiera de SEQ ID NO. 48 a 80, polipéptidos codificados por la SEQ ID NO. 85 u 86, análogos o fragmentos de los mismos (p. ej., fragmentos biológicamente activos, fragmentos inmunológicamente activos, etc.).
También se describe en la presente memoria una molécula aislada de ácido nucleico que comprende los polinucleótidos descritos en la presente memoria, unida operativamente a una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido heterólogo mediante lo cual se codifica un polipéptido de fusión.
También se describe en la presente memoria un polipéptido codificado por un polinucleótido de SEQ ID NO. 1 a 33, SEQ ID NO. 85 o SEQ ID NO. 86 o más en concreto del marco abierto de lectura de una cualquiera de las SEQ ID NO. 1 a 33, SEQ ID NO. 85 o SEQ ID NO. 86, o una porción de las mismas. También se describe en la presente memoria el producto de un gen que se coexpresa con uno o más genes que se sabe que están implicados en la remodelación ósea.
En la presente memoria también se describe una variante alélica aislada que se produce de forma natural, así como variantes sintéticas (p. ej., hechas mediante tecnología de DNA recombinante o mediante síntesis química, etc.), tal como una variante biológicamente activa que puede comprender una o más sustituciones de aminoácidos (en comparación con un polipéptido que se produce de forma natural), tal como una sustitución de aminoácido conservativa o no conservativa.
Además se da a conocer un vector (de mamífero, bacteriano, vírico, etc.) que comprende los polinucleótidos descritos en la presente memoria o fragmentos de los mismos, tal como un vector de expresión. El vector puede comprender adicionalmente una secuencia de ácido nucleico que puede ayudar a la regulación de la expresión del polinucleótido y/o una secuencia nucleotídica que codifica una etiqueta (p. ej., etiqueta de afinidad; HA, GST, His, etc).
En la presente memoria se describe un vector de expresión que puede comprender, por ejemplo, los elementos siguientes unidos operativamente:
a) un promotor de transcripción;
b) un segmento polinucleotídico (que puede comprender un marco abierto de lectura de una cualquiera de las SEQ ID NO. 1 a 33, 85 u 86); y
c) un terminador de transcripción.
También se describe en la presente memoria un vector de expresión que comprende un polinucleótido descrito en la presente memoria, una célula hospedadora transformada con el vector de expresión y un procedimiento para producir un polipéptido de la presente invención.
También se describe en la presente memoria un vector que comprende un polinucleótido o fragmento polinucleotídico. Los vectores que pueden comprender una secuencia sustancialmente complementaria a los polinucleótidos descritos en la presente memoria (p. ej., siRNA, shRNA) están, por lo tanto, abarcados por la presente memoria. El vector puede comprender secuencias que permiten la transcripción del polinucleótido o fragmento polinucleotídico.
Se da a conocer en la presente memoria una célula que puede estar genéticamente modificada para que contenga y/o exprese el polinucleótido (entre ellos, complementos y fragmentos) y/o polipéptidos de la presente invención. La célula puede ser, por ejemplo, una célula de mamífero, una célula de insecto, una célula bacteriana, etc.
Por consiguiente, en la presente memoria se da a conocer una célula hospedadora que puede comprender un vector como el descrito en la presente memoria. La célula puede ser, por ejemplo, una célula de mamífero, una célula de insecto, una bacteria, etc. La célula puede ser capaz de expresar o expresa un polipéptido codificado por el polinucleótido descrito en la presente memoria.
Los procedimientos para producir los polipéptidos abarcados por este documento incluyen, por ejemplo, cultivar la célula en condiciones que permiten la transcripción de un gen o la expresión del polipéptido. El polipéptido se puede recuperar, por ejemplo, del lisado de células o del sobrenadante de las células.
En la presente memoria se describe el uso de al menos un polinucleótido que comprende uno cualquiera de SEQ ID NO. 1 a 33, SEQ ID NO. 85 o SEQ ID NO. 86, su secuencia codificante, secuencias sustancialmente idénticas, secuencias sustancialmente complementarias o fragmentos de las mismas, en una matriz ordenada. La matriz puede utilizarse en un procedimiento para diagnosticar una enfermedad o trastorno de remodelación ósea mediante la hibridación de la matriz con una muestra del paciente en condiciones que permiten la formación de complejos, detectar la formación de los complejos, y comparar la cantidad de complejos formados en la muestra del paciente con la de los estándares para tejidos normales y enfermos, en donde la formación de complejos en la muestra del paciente indica la presencia de una enfermedad o trastorno de remodelación ósea. Por supuesto, el uso de un polinucleótido descrito en la presente memoria en un método de diagnóstico no depende exclusivamente de la consecución de un ensayo específico. La secuencia o secuencias pueden utilizarse en los métodos de diagnóstico utilizados convencionalmente conocidos en la técnica.
También se describe un procedimiento para mejorar los síntomas de la enfermedad o trastorno de remodelación ósea, o para inhibir o retrasar la enfermedad o trastorno óseo, en donde el procedimiento puede comprender: poner en contacto un compuesto capaz de inhibir específicamente la actividad o la expresión de una secuencia polinucleotídica descrita en la presente memoria o un polipéptido descrito en la presente memoria, en los osteoclastos, de tal forma que se puedan mejorar los síntomas de la enfermedad o trastorno de remodelación ósea, o se puede prevenir, retrasar o disminuir la enfermedad o trastorno.
También se describe un procedimiento para mejorar los síntomas de la enfermedad o trastorno de remodelación ósea, o para inhibir o retrasar la enfermedad o trastorno óseo, en donde el procedimiento puede comprender: poner en contacto un compuesto capaz de favorecer específicamente la actividad o la expresión de una secuencia polinucleotídica descrita en la presente memoria o un polipéptido descrito en la presente memoria, en los osteoclastos, de tal forma que se pueden mejorar los síntomas de la enfermedad o trastorno de remodelación ósea, o se puede prevenir, retrasar o disminuir la enfermedad o trastorno.
También se describe un procedimiento para tratar una afección en un mamífero, que se caracteriza por la falta, o la necesidad, de crecimiento o reemplazo del hueso y/o un nivel indeseable de osteoclasia, en donde dicho procedimiento puede comprender la administración, a un sujeto mamífero que necesita tal tratamiento, de una cantidad eficaz de un compuesto adecuado que se describe en la presente memoria.
También se describe un procedimiento para utilizar una secuencia polinucleotídica descrita en la presente memoria, un polipéptido descrito en la presente memoria en una matriz, y para el uso de la matriz en un procedimiento para diagnosticar una enfermedad o trastorno de remodelación ósea mediante la hibridación de la matriz con una muestra del paciente en condiciones que permiten la formación de complejos, detección de los complejos formados, y la comparación de la cantidad de complejos formados en la muestra del paciente con la de los estándares para tejidos normales y enfermos, en donde la formación de complejos en la muestra del paciente puede indicar la presencia de una enfermedad o trastorno de remodelación ósea.
La secuencia polinucleotídica descrita en la presente memoria se puede utilizar para la genoterapia de células somáticas o para la genoterapia de células madre.
También se describe en la presente memoria una composición farmacéutica que comprende un polinucleótido descrito en la presente memoria o un polipéptido codificado por el polinucleótido seleccionado o porción del mismo, y un vehículo farmacéutico adecuado.
También se describen en la presente memoria productos, composiciones, procedimientos y métodos que comprenden un polinucleótido descrito en la presente memoria, un polipéptido codificado por los polinucleótidos, una porción de los mismos, sus variantes o derivados, para la investigación y para propósitos biológicos, clínicos y terapéuticos.
Las NSEQ y PSEQ pueden utilizarse en el diagnóstico, pronóstico, tratamiento, prevención, y selección y evaluación de tratamientos de enfermedades y trastornos que implican la remodelación ósea, que incluyen pero sin limitarse a ellas, osteoporosis, osteopenia, osteomalacia, hiperparatiroidismo, hipertiroidismo, hipogonadismo, tirotoxicosis, mastocitosis sistémica, hipofosfatasia adulta, hipercorticalismo, osteogénesis imperfecta, enfermedad de Paget, enfermedad/síndrome de Cushing, síndrome de Turner, enfermedad de Gaucher, síndrome de Ehlers-Danlos, síndrome de Marfan, síndrome de Menkes, síndrome de Fanconi, mieloma múltiple, hipercalciemia, hipocalciemia, artritis, periodontitis, raquitismo (incluido el raquitismo hipofosfatémico ligado al cromosoma X, y el dependiente de vitamina D de tipos I y II), fibrogénesis imperfecta ósea, trastornos osteoescleróticos tal como picnodisostosis, y daño ocasionado por procesos inflamatorios mediados por macrófagos.
Uso de NSEQ como una herramienta de escrutinio
Los polinucleótidos obtenidos en la presente memoria se pueden utilizar para detectar y aislar productos de expresión, por ejemplo, mRNA, los DNA complementarios (cDNA) y las proteínas procedentes de la NSEQ u homólogas a ella. En un ejemplo, la expresión de los mRNA homólogos a las NSEQ de la presente invención se puede detectar, por ejemplo, mediante análisis de hibridación, transcripción inversa y métodos de amplificación de ácidos nucleicos in vitro. Tales procedimientos permiten la detección de los mRNA en muchos tipos de tejidos o en diferentes etapas de desarrollo. Los ácidos nucleicos en cuestión que se expresan de una manera específica de tejido o de una manera específica de la etapa de desarrollo son útiles como marcadores específicos de tejido o para definir la etapa de desarrollo de una muestra de células o tejidos que pueden definir un estado patológico concreto. Un experto en la técnica puede adaptar fácilmente las NSEQ para estos propósitos.
Los expertos en la técnica también reconocerán que las NSEQ, y sus productos de expresión tales como ácidos nucleicos de cDNA y DNA genómico, pueden utilizarse para preparar secuencias oligonucleotídicas cortas. Por ejemplo, los oligonucleótidos que tienen de diez a doce nucleótidos o más se pueden preparar para que se hibriden específicamente a las NSEQ y los cDNA presentes, y permiten la detección, identificación y aislamiento de secuencias de ácido nucleico únicas por hibridación. Las secuencias de, por ejemplo, al menos 15 a 20 nucleótidos, pueden utilizarse y seleccionarse en regiones que carecen de homología con otras secuencias conocidas. Las secuencias de 20 o más nucleótidos que carecen de tal homología muestran un incremento de la especificidad por la secuencia diana. Las condiciones de hibridación útiles para sondas y cebadores son determinables fácilmente por los expertos en la técnica. Las condiciones de hibridación rigurosas abarcadas por esta memoria son las que pueden permitir la hibridación de ácidos nucleicos que tienen una homología de más del 90%, pero que pueden impedir la hibridación de los ácidos nucleicos cuya homología está por debajo del 70%. La especificidad de una sonda puede determinarse averiguando si está diseñada de una región única, de una región reguladora o de un motivo conservado. Tanto la especificidad de la sonda como el rigor de la hibridación diagnóstica o de las reacciones de amplificación (máxima, alta, intermedia o baja) se pueden determinar en función de si la sonda identifica exactamente las secuencias complementarias, las variantes alélicas o las secuencias relacionadas. Las sondas diseñadas para detectar las secuencias relacionadas pueden tener una identidad de secuencia de al menos el 50% con uno cualquiera de los polinucleótidos seleccionados.
Se debe entender en la presente memoria que las NSEQ (secuencias sustancialmente idénticas y fragmentos de las mismas) pueden hibridarse a una secuencia sustancialmente complementaria encontrada en una muestra problema. Adicionalmente, una secuencia sustancialmente complementaria a la NSEQ puede fijarse a la NSEQ encontrada en una muestra problema.
Además, una sonda puede marcarse mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica, por ejemplo, mediante la incorporación de nucleótidos unidos a una «molécula indicadora». Una «molécula indicadora», tal y como se utiliza en la presente memoria, puede ser una molécula que proporciona una señal identificable por medios analíticos que permite la detección de una sonda hibridada. La detección puede ser cualitativa o cuantitativa. Las moléculas indicadoras utilizadas con más frecuencia incluyen fluoróforos, enzimas, biotina, moléculas quimioluminiscentes, moléculas bioluminiscentes, digoxigenina, avidina, estreptavidina o radioisótopos. Las enzimas utilizadas con más frecuencia incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, glucosa oxidasa y pgalactosidasa, entre otras. Las enzimas pueden estar conjugadas con avidina o estreptavidina para utilizarlas con una sonda biotinilada. De igual forma, las sondas pueden estar conjugadas con avidina o estreptavidina para utilizarlas con una enzima biotinilada. La incorporación de una molécula indicadora en una sonda de DNA puede ser mediante cualquier procedimiento conocido por el experto en la técnica, por ejemplo, traslado de mella, extensión de cebador, cebado aleatorio con oligonucleótidos, mediante la marcación en el extremo 3' o 5' o mediante otros medios. Además, las sondas de hibridación incluyen la clonación de secuencias de ácido nucleico en vectores para la producción de sondas de mRNA. Tales vectores se conocen en la técnica, están disponibles en el mercado y pueden utilizarse para sintetizar sondas de RNA in vitro. Las secuencias polinucleotídicas marcadas pueden utilizarse en análisis de tipo Southern o Northern, transferencia puntiforme u otras tecnologías a base de membranas; en tecnologías de PCR; y en micromatrices que utilizan muestras de sujetos para detectar cualquier alteración de la expresión. Los oligonucleótidos útiles como sondas para escrutar muestras mediante ensayos de hibridación o como cebadores para la amplificación se pueden envasar en forma de kits. Tales kits pueden contener las sondas o cebadores en una cantidad previamente medida o determinada, así como otros reactivos y material envasados convenientemente que son necesarios para el protocolo concreto de hibridación o de amplificación. En otra realización, la invención comporta un polipéptido sustancialmente purificado codificado por los polinucleótidos de NSEQ, análogos polipeptídicos o fragmentos polipeptídicos de los mismos. Los polipéptidos, bien en una forma premadura, madura o fusionada, se pueden aislar a partir de células lisadas, o a partir del medio de cultivo, y purificarse lo necesario para usarlo tal y como se diseñó. El experto en la técnica puede purificar con facilidad estas proteínas, polipéptidos y péptidos mediante cualquier procedimiento disponible. Por ejemplo, la purificación se puede llevar a cabo mediante fraccionamiento con sales, cromatografía de exclusión por tamaños, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de fase inversa, cromatografía de afinidad y similares.
Uso de la NSEQ para el desarrollo de un sistema de expresión
Para expresar un polipéptido biológicamente activo, la NSEQ o los derivados de la misma se pueden introducir en un vector de expresión, a saber, un vector que contiene los elementos para el control transcripcional y traduccional de la secuencia codificante insertada en un hospedador concreto. Estos elementos pueden incluir secuencias reguladoras, tales como potenciadores, promotores constitutivos e inducibles, y regiones sin traducir en 5' y 3'. Los procedimientos que son bien conocidos por los expertos en la técnica pueden utilizarse para construir tales vectores de expresión. Estos procedimientos incluyen técnicas de DNA recombinante in vitro, técnicas sintéticas y recombinación genética in vivo.
Para expresar la NSEQ se pueden utilizar numerosos sistemas de vector de expresión/células hospedadoras conocidos por los expertos en la técnica. Estos incluyen, pero sin limitarse a ellos, microorganismos tales como bacterias transformadas con vectores de expresión de DNA en bacteriófagos recombinantes, en plásmidos o en cósmidos; levadura transformada con vectores de expresión de levadura; sistemas de células de insecto infectados con vectores de baculovirus; sistemas de células vegetales transformados con vectores de expresión víricos o bacterianos; o sistemas de células de animales. Para la producción a largo plazo de proteínas recombinantes en los sistemas de mamíferos, puede efectuarse la expresión estable en las líneas celulares. Por ejemplo, la NSEQ se puede introducir por transformación en las líneas celulares mediante vectores de expresión que pueden contener orígenes de replicación víricos y/o elementos de expresión endógena y un gen marcador de selección o de visibilidad en el mismo vector o en otro distinto. La descripción no estará limitada por el vector o la célula hospedadora empleada.
En general, las células hospedadoras que contienen la NSEQ y que expresan un polipéptido codificado por la NSEQ, o una porción del mismo, se pueden identificar mediante muchos procedimientos conocidos por los expertos en la técnica. Estos procedimientos incluyen, pero sin limitarse a ellos, hibridaciones de DNA-DNA o DNA-RNA, amplificación por PCR, y bioensayo de proteínas o técnicas de inmunoensayo que incluyen tecnologías basadas en membranas, en soluciones o en chip para detectar y/o cuantificar secuencias de ácido nucleico o de aminoácidos. Se conocen bien en la técnica los métodos inmunitarios para detectar y medir la expresión de los polipéptidos con anticuerpos monoclonales o policlonales específicos. Ejemplos de tales técnicas incluyen inmunoensayos enzimáticos (ELISA), radioinmunoensayos (RIA) y clasificación de células activadas con fluorescencia (FACS). Los expertos en la técnica pueden adaptar con facilidad estas metodologías a la presente invención.
En la presente memoria se describe un bioensayo para evaluar compuestos que sean antagonistas en potencia del polipéptido descrito en la presente memoria, pudiendo comprender el bioensayo:
a) el cultivo de células problema en un medio de cultivo que contiene concentraciones crecientes de al menos un compuesto cuya capacidad para inhibir la acción de un polipéptido descrito en la presente memoria se pretende determinar, en donde las células problema pueden contener una secuencia polinucleotídica descrita en la presente memoria (por ejemplo, en una forma que mejora la actividad de transcripción por transactivación respecto al polinucleótido de tipo silvestre, y que comprende un elemento de respuesta unido operativamente a un gen indicador); y después
b) la monitorización del nivel de expresión del producto del gen indicador en las células como reflejo de la concentración del posible compuesto antagonista en el medio de cultivo, con lo que se indica la capacidad del posible compuesto antagonista para inhibir la activación del polipéptido codificado por la secuencia polinucleotídica descrita en la presente memoria.
También se describe en la presente memoria un bioensayo para evaluar compuestos que sean posibles agonistas para un polipéptido codificado por la secuencia polinucleotídica descrita en la presente memoria, pudiendo comprender el bioensayo:
a) el cultivo de las células problema en un medio de cultivo que contiene concentraciones crecientes de al menos un compuesto cuya capacidad para favorecer la acción del polipéptido codificado por la secuencia polinucleotídica descrita en la presente memoria se pretende determinar, en donde las células problema pueden contener una secuencia polinucleotídica descrita en la presente memoria (por ejemplo, en una forma que mejora la actividad de transcripción por transactivación respecto al polinucleótido de tipo silvestre, y que comprende un elemento de respuesta unido operativamente a un gen indicador); y después
b) la monitorización del nivel de expresión del producto del gen indicador en las células como reflejo de la concentración del posible compuesto agonista en el medio de cultivo, con lo cual se indica la capacidad del posible compuesto agonista para favorecer la activación de un polipéptido codificado por la secuencia polinucleotídica descrita en la presente memoria.
Las células hospedadoras transformadas con la NSEQ se pueden cultivar en condiciones que permitan la expresión y recuperación del polipéptido a partir del cultivo celular. El polipéptido producido por una célula transgénica puede ser secretado por la célula o quedar retenido dentro de ella según la secuencia y/o el vector utilizados. Como conocerán los expertos en la técnica, los vectores de expresión que contienen la NSEQ pueden diseñarse para que contengan secuencias señal que dirigen la secreción del polipéptido a través de una membrana de una célula procariota o eucariota. Debido a la degeneración inherente del código genético, otras secuencias de DNA que codifican sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos o una funcionalmente equivalente pueden ser producidas y utilizadas para expresar el polipéptido codificado por la NSEQ. Las secuencias nucleotídicas descritas en la presente memoria se pueden modificar genéticamente con los procedimientos conocidos de forma general en la técnica para alterar las secuencias nucleotídicas para numerosos propósitos, que incluyen, a título nominativo y no exclusivo, la modificación de la clonación, procesamiento y/o expresión del producto génico. El barajado del DNA mediante fragmentación aleatoria y el reensamblaje por PCR de los fragmentos génicos y oligonucleótidos sintéticos puede utilizarse para construir secuencias nucleotídicas. Por ejemplo, la mutagénesis específica de sitio mediante oligonucleótidos se puede utilizar para introducir mutaciones que crean nuevos sitios de restricción, alterar los patrones de glucosilación, cambiar la preferencia de los codones, producir variantes de ayuste, etcétera.
Además, se puede elegir una cepa de célula hospedadora por su capacidad para modular la expresión de las secuencias insertadas o para procesar el polipéptido expresado en la forma deseada. Tales modificaciones del polipéptido incluyen, a título nominativo y no exclusivo, acetilación, carboxilación, glucosilación, fosforilación, lipidación y acilación. El procesamiento postraduccional, que escinde una forma «prepro» del polipéptido, también puede utilizarse para especificar la destinación, el plegamiento y/o la actividad de las proteínas. En el mercado y en la American Type Culture Collection (ATCC) se pueden conseguir diferentes células hospedadoras (p. ej., CHO, HeLa, MDCK, HEK293 y W138) que tienen una maquinaria celular específica y mecanismos característicos para actividades postraduccionales y se pueden elegir para asegurarse la modificación y el procesamiento correctos del polipéptido expresado.
Los expertos en la técnica apreciarán fácilmente que las secuencias de ácido nucleico naturales, modificadas o recombinantes pueden estar ligadas a una secuencia heteróloga que da lugar a la traducción de un polipéptido de fusión que contiene restos de polipéptido heterólogo en cualquiera de los sistemas hospedadores antes mencionados. Tales restos de polipéptido heterólogo pueden facilitar la purificación de los polipéptidos de fusión con las matrices de afinidad disponibles en el mercado. Tales restos incluyen, a título nominativo y no exclusivo, glutatión S-transferasa (GST), proteína fijadora de maltosa, tiorredoxina, péptido fijador de calmodulina, 6-His (His), FLAG, cmyc, hemaglutinina (HA) y epítopos de anticuerpos monoclonales.
También se describe en la presente memoria un polinucleótido aislado que puede comprender una secuencia nucleotídica que codifica una proteína de fusión, en donde la proteína de fusión puede comprender un compañero de fusión fusionado a un fragmento peptídico de una proteína codificada por la secuencia polinucleotídica descrita en la presente memoria, o un polipéptido de una variante alélica que se produce de forma natural codificado por la misma. Los expertos en la técnica reconocerán fácilmente que las secuencias de ácido nucleico y polipeptídicas pueden sintetizarse, por completo o en parte parte, mediante procedimientos químicos o enzimáticos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la síntesis peptídica puede realizarse con diferentes técnicas en fase sólida y máquinas tales como el sintetizador de péptidos ABI 431A (PE Biosystems), que puede utilizarse para automatizar la síntesis. Si se desea, la secuencia de aminoácidos puede alterarse durante la síntesis y/o combinarse con secuencias de otras proteínas para producir una proteína variante.
Uso de la NSEQ como una herramienta de escrutinio para diagnóstico
El experto en la técnica reconocerá con facilidad que la NSEQ puede utilizarse para propósitos diagnósticos en la determinación de la ausencia, presencia o expresión alterada (a saber, incremento o disminución en comparación con lo normal) del gen. Los polinucleótidos pueden tener una longitud de al menos 10 nucleótidos o una longitud de al menos 12 nucleótidos o una longitud de al menos 15 nucleótidos hasta cualquier longitud deseada, y pueden comprender moléculas de DNA y RNA complementarias, ácidos nucleicos ramificados, y/o ácidos peptidonucleicos (PNA). En una alternativa, los polinucleótidos pueden utilizarse para detectar y cuantificar la expresión génica en muestras cuya expresión de NSEQ se correlaciona con la enfermedad. En otra alternativa, la NSEQ puede utilizarse para detectar los polimorfismos genéticos asociados a una enfermedad. Estos polimorfismos pueden detectarse en el cDNA transcrito.
En la presente memoria se da a conocer el uso de al menos un polinucleótido que comprende la NSEQ (p. ej., un marco abierto de lectura de la NSEQ, una secuencia sustancialmente complementaria, una secuencia sustancialmente idéntica, y fragmentos de la misma) en una matriz y el uso de tal matriz en un procedimiento diagnóstico para una enfermedad o trastorno de remodelación ósea mediante la hibridación de la matriz con una muestra del paciente en condiciones que permiten la formación de complejos, detectar la formación de complejos y comparar la cantidad de complejos formados en la muestra del paciente con la de los estándares para tejidos normales y enfermos, en donde la formación de complejos en la muestra del paciente indica la presencia de una enfermedad o trastorno de remodelación ósea.
También se da a conocer en la presente memoria uno o más kits compartimentados para la detección de estados patológicos de osteoclasia. Un primer kit puede tener un receptáculo que contiene al menos una sonda aislada. Tal sonda puede ser un fragmento de ácido nucleico que está presente/ausente en el DNA genómico de las células normales, pero que está ausente/presente en el DNA genómico de las células afectadas. Tal sonda puede ser específica de un sitio de DNA que está normalmente activo/inactivo, pero que puede estar inactivo/activo en determinados tipos de células. De igual forma, tal sonda puede ser específica de un sitio de DNA que puede expresarse anormalmente en determinados tipos de células. Finalmente, tal sonda puede identificar una mutación específica en el DNA. Mediante específica de un sitio de DNA se quiere decir que la sonda puede ser capaz de hibridarse a la secuencia de DNA que está mutada, o que puede ser capaz de hibridarse a secuencias de DNA adyacentes a las secuencias de DNA mutadas. Las sondas proporcionadas en los kits presentes pueden tener una molécula indicadora unida covalentemente. Los expertos en la técnica serán capaces de preparar las sondas y moléculas indicadoras con facilidad tal y como está descrito más arriba.
Uso de la NSEQ como un tratamiento
El experto en la técnica apreciará fácilmente que los sistemas de expresión y ensayos explicados más arriba también pueden utilizarse para evaluar la eficacia de un régimen de tratamiento terapéutico determinado, en estudios con animales, en ensayos clínicos, o para monitorizar el tratamiento de un paciente. Una vez que se establece la presencia de la enfermedad y se inicia un protocolo de tratamiento, se pueden repetir los ensayos de hibridación o amplificación con regularidad para determinar si el nivel de expresión en el paciente comienza a aproximarse al nivel observado en un sujeto sano. Los resultados obtenidos de ensayos sucesivos pueden utilizarse para mostrar la eficacia del tratamiento a lo largo de un tiempo que oscila de varios días a muchos años.
Aún en otro aspecto de la invención, una NSEQ, una porción de la misma, o su complemento, se puede utilizar terapéuticamente con el objeto de expresar mRNA y polipéptido, o al contrario, para bloquear la transcripción o traducción del mRNA. Los vectores de expresión se pueden construir con elementos de retrovirus, adenovirus, virus del herpes o virus de la vacuna, o plásmidos bacterianos, y similares. Estos vectores pueden utilizarse para administrar las secuencias nucleotídicas a un órgano, tejido o población de células diana particulares. Los procedimientos bien conocidos por los expertos en la técnica pueden utilizarse para construir vectores para expresar las secuencias de ácido nucleico o sus complementos.
Alternativamente, la NSEQ, una porción de la misma, o su complemento, pueden utilizarse para la genoterapia con células somáticas o con células madre. Los vectores pueden introducirse in vivo, in vitro y ex vivo. Para el tratamiento ex vivo, los vectores se introducen en las células madre tomadas del sujeto, y las células transgénicas resultantes se propagan clonalmente para el trasplante autólogo de vuelta al mismo sujeto. El suministro de la NSEQ mediante transfección, inyecciones de liposomas o polímeros aminopolicatiónicos se puede conseguir mediante los procedimientos que se conocen bien en la técnica. Adicionalmente, la expresión endógena de la NSEQ se puede inactivar mediante procedimientos de recombinación homóloga que insertan una secuencia génica inactiva en la región codificante u otra región diana de la NSEQ.
Según el objetivo específico a conseguir, los vectores que contienen la NSEQ pueden introducirse en una célula o tejido para expresar un polipéptido ausente o para reemplazar un polipéptido que no funciona. Por supuesto, cuando se desea expresar la PSEQ en una célula o tejido, se puede utilizar una NSEQ capaz de codificar tal PSEQ para ese propósito o se puede administrar directamente la PSEQ a dicha célula o tejido.
Por otra parte, cuando se desea atenuar o inhibir la expresión de la PSEQ, se puede utilizar una NSEQ (p. ej., una NSEQ inhibidora) que es sustancialmente complementaria a al menos una porción de una NSEQ capaz de codificar tal PSEQ.
La expresión de una NSEQ inhibidora se puede realizar mediante la clonación de la NSEQ inhibidora en un vector y la introducción del vector en una célula para disminuir la expresión de un polipéptido codificado por la NSEQ diana. Los vectores que contienen la NSEQ (p. ej., incluida la NSEQ inhibidora) se pueden transformar en una célula o tejido para expresar un polipéptido ausente o para reemplazar un polipéptido que no funciona. De igual forma, un vector construido para que exprese el complemento de la NSEQ se puede introducir por transformación en una célula para disminuir la sobreexpresión de un polipéptido codificado por los polinucleótidos de la NSEQ, o una porción de la misma. Las secuencias antisentido o complementarias pueden consistir en un oligonucleótido procedente del sitio de inicio de la transcripción; se prefieren los nucleótidos entre las posiciones aproximadamente -10 y 10 desde el ATG. De igual forma, la inhibición puede conseguirse con la metodología de apareamiento de bases en triple hélice. El apareamiento de la triple hélice es útil porque provoca la inhibición de la capacidad de la doble hélice para abrirse lo suficiente para que se fijen las polimerasas, los factores de transcripción o las moléculas reguladoras. Se han escrito en la bibliografía los avances terapéuticos recientes que utilizan el DNA triple (véase, p. ej., Gee et al., 1994).
Las ribozimas, moléculas de RNA con actividad enzimática, también pueden utilizarse para catalizar la escisión del mRNA y disminuir la cantidad de determinados mRNA, tales como los que comprenden las secuencias polinucleotídicas de la invención. Las ribozimas pueden escindir el mRNA en sitios de escisión específicos. Alternativamente, las ribozimas pueden escindir los mRNA en posiciones dictadas por las regiones flanqueantes que forman pares de bases complementarias con el mRNA diana. La construcción y la producción de las ribozimas se conoce bien en la técnica.
Las moléculas de RNA se pueden modificar para incrementar la estabilidad intracelular y la semivida. Las modificaciones posibles incluyen, a titulo nominativo y no exclusivo, la adición de secuencias flanqueantes en los extremos en 5' y/o 3' de la molécula, o el uso de fosforotioato o 2' O-metilo en vez de enlaces fosfodiéster dentro del esqueleto de la molécula. Alternativamente, se pueden añadir bases no tradicionales tales como inosina, queosina y wibutosina, así como acetil-, metil-, tio- y formas modificadas de forma parecida, de adenina, citidina, guanina, timina y uridina que las endonucleasas endógenas no reconocen con facilidad.
Además de los ingredientes activos, una composición farmacéutica puede contener vehículos farmacéuticamente aceptables que comprenden excipientes y auxiliares que facilitan el procesamiento de los compuestos activos en la preparaciones que se pueden utilizar farmacéuticamente.
Para cualquier compuesto, la dosis terapéuticamente eficaz se puede estimar inicialmente tanto mediante ensayos de cultivo de células como mediante modelos de animales tales como ratones, ratas, conejos, perros o cerdos. Un modelo de animal también puede utilizarse para determinar el intervalo de concentración y la vía de administración. A continuación, tal información puede utilizarse para determinar las dosis útiles y las vías para la administración en los humanos. Estas técnicas las conoce bien el experto en la técnica y una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a la cantidad de ingrediente activo que mejora los síntomas o la afección. La eficacia y la toxicidad terapéuticas se pueden determinar mediante procedimientos farmacéuticos estándares en cultivos de células o con animales experimentales, tales como mediante el cálculo y la comparación estadística de la DE50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la población) y la DL50 (la dosis letal para el 50% de la población). Cualquiera de las composiciones terapéuticas descritas más arriba se puede aplicar a cualquier sujeto que necesite tal tratamiento, que incluye pero sin limitarse a ellos, mamíferos tales como perros, gatos, vacas, caballos, conejos, monos y, lo más preferiblemente, humanos.
Las composiciones farmacéuticas utilizadas en esta invención se pueden administrar por muchas vías, que incluyen pero sin limitarse a ellas, oral, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intramedular, intratecal, intraventricular, transdérmica, subcutánea, intraperitoneal, intranasal, enteral, tópica, sublingual o rectal.
La terminología «Tratamiento» para los propósitos de esta descripción se refiere tanto al tratamiento terapéutico como a las medidas profilácticas o preventivas, en donde el objetivo es prevenir o retrasar (aliviar) el trastorno o la afección patológicos de interés. Los que necesitan tratamiento incluye a quienes ya padecen el trastorno así como a los propensos a padecer el trastorno o a los que hay que prevenir del trastorno.
Uso de la NSEQ en la investigación general
En la presente memoria se dan a conocer productos, composiciones, procedimientos y métodos que utilizan la NSEQ, su marco abierto de lectura o un polipéptido codificado por los polinucleótidos de la NSEQ o su marco abierto de lectura, o una porción del mismo, sus variantes, análogos, derivados y fragmentos para propósitos de investigación, biológicos, clínicos y terapéuticos. Por ejemplo, para identificar variantes de ayuste, mutaciones y polimorfismos.
La NSEQ se puede extender con una secuencia nucleotídica parcial y mediante diferentes procedimientos basados en la PCR conocidos en la técnica para detectar secuencias cadena arriba tal como los promotores y otros elementos reguladores. Adicionalmente, se puede utilizar un kit XL-PCR (PE Bioystems, Foster City, Calif.), cebadores anidados, y genotecas de cDNA disponibles en el mercado (Life Technologies, Rokville Md.) o genotecas genómicas (Clontech, Palo Alto, Calif.) para extender la secuencia.
Los polinucleótidos pueden también utilizarse como dianas en una micromatriz. La micromatriz se puede utilizar para monitorizar los patrones de expresión de una gran cantidad de genes simultáneamente y para identificar las variantes de ayuste, las mutaciones y los polimorfismos. La información procedente de los análisis de los patrones de expresión se puede utilizar para determinar la función génica, para conocer la base genética de una enfermedad, para diagnosticar una enfermedad, y para desarrollar y monitorizar las actividades de los fármacos terapéuticos utilizados para tratar la enfermedad. Las micromatrices también pueden utilizarse para detectar la diversidad genética, polimorfismos de un sólo nucleótido que pueden caracterizar una población concreta, a nivel genómico. Aún en otro ejemplo, los polinucleótidos se pueden utilizar para generar sondas de hibridación útiles para mapear la secuencia genómica que aparece de forma natural. La hibridación fluorescente in situ (FISH, por su nombre en inglés) se puede correlacionar con otras técnicas de mapeo físico del cromosoma y datos del mapeo genético. También se describe en la presente memoria un procedimiento para identificar representativamente una secuencia expresada diferencialmente de forma endógena implicada en la diferenciación de los osteoclastos. La secuencia se puede, por ejemplo, expresar diferencialmente en una célula de osteoclasto diferenciada en comparación con una célula precursora de osteoclasto sin diferenciar.
El procedimiento descrito en la presente memoria puede comprender:
a) proporcionar por separado el RNA mensajero total de la célula de osteoclasto humano diferenciado (maduro o intermedio), en donde el RNA mensajero total puede comprender, por ejemplo, al menos una secuencia expresada diferenciadamente de forma endógena,
b) generar cDNA monocatenario de cada RNA mensajero de la célula de osteoclasto humano diferenciado y (p. ej., aleatoriamente) etiquetar el extremo 3' del cDNA monocatenario con una secuencia promotora para la RNA polimerasa y una primera etiqueta de secuencia;
c) generar cDNA monocatenario de cada RNA mensajero de la célula precursora de osteoclasto humano sin diferenciar y (p. ej., aleatoriamente) etiquetar el extremo 3' del cDNA monocatenario con una secuencia promotora para la RNA polimerasa y una segunda etiqueta de secuencia;
d) generar por separado DNA parcial o completamente bicatenario etiquetado en 5' de cada uno de b) y c), en donde el DNA bicatenario etiquetado en 5' puede, por lo tanto, comprender en una dirección de 5' a 3' un promotor bicatenario para la RNA polimerasa, una primera o segunda etiqueta de secuencia y una secuencia expresada de forma endógena,
e) amplificar linealmente por separado un primer y un segundo RNA sentido etiquetado de cada uno de d) con una enzima RNA polimerasa (que se puede seleccionar basándose en el promotor utilizado para etiquetar),
f) generar un primer o segundo DNA etiquetado y monocatenario que es complementario a uno de e),
g) hibridar el primer o segundo DNA etiquetado monocatenario y complementario de f) con el otro RNA sentido amplificado linealmente de e),
h) recuperar el RNA sin hibridar con la ayuda de la primera o segunda etiqueta de secuencia (por ejemplo, mediante PCR o hibridación); y
i) identificar (determinar) la secuencia nucleotídica del RNA sin hibridar.
Las etapas b) y/o c) pueden comprender la generación de una única copia de un cDNA monocatenario.
El procedimiento puede además comprender la etapa de determinar comparativamente la presencia de la secuencia identificada de forma endógena y expresada diferencialmente en una célula de osteoclasto diferenciado respecto a una célula precursora de osteoclasto sin diferenciar.
Por consiguiente, se puede seleccionar una secuencia que está sustancialmente ausente (p. ej., totalmente ausente o presente en una cantidad muy baja) de uno de la célula de osteoclasto diferenciado o una célula precursora de osteoclasto sin diferenciar, y presente en la otra célula de osteoclasto diferenciado o una célula precursora de osteoclasto sin diferenciar.
Así pues, la secuencia seleccionada puede ser un regulador positivo de la diferenciación de los osteoclastos y, por lo tanto, puede representar una diana atractiva que se puede utilizar ventajosamente para favorecer la osteoclasia o alternativamente tal diana se puede inhibir para disminuir o impedir la osteoclasia.
Alternativamente, la secuencia seleccionada con el procedimiento anterior puede ser un regulador negativo de la diferenciación de los osteoclastos y puede, por consiguiente, representar una diana atractiva que se puede inducir ventajosamente (p. ej., a nivel de transcripción, traducción, actividad, etc.) o proporcionar a una célula para disminuir o impedir la osteoclasia. De igual forma, tal regulador negativo puede, tras su inhibición, servir de diana para favorecer la osteoclasia.
La secuencia puede, además, seleccionarse basándose en una expresión reducida o sustancialmente ausente en otro tejido normal, por lo que representa una secuencia candidata implicada específicamente en la diferenciación de los osteoclastos y la remodelación ósea.
El procedimiento puede también comprender además una etapa para determinar la secuencia completa de la secuencia nucleotídica y puede también comprender determinar la secuencia codificante de la secuencia nucleotídica. También se describe en la presente memoria la secuencia (polinucleótido y polipéptido) aislada endógenamente y expresada diferencialmente que se identifica con el procedimiento descrito en la presente memoria.
También se describe en la presente memoria un polinucleótido que puede comprender la secuencia polinucleotídica identificada, un polinucleótido que puede comprender el marco abierto de lectura de la secuencia polinucleotídica identificada, un polinucleótido que puede comprender una secuencia nucleotídica sustancialmente idéntica al polinucleótido identificado por el procedimiento descrito en la presente memoria, un polinucleótido que puede comprender una secuencia nucleotídica sustancialmente complementaria al polinucleótido identificado por el procedimiento descrito en la presente memoria, fragmentos y variantes de ayuste del mismo, siempre y cuando la secuencia no consista en o comprenda la SEQ ID NO. 34.
La secuencia expresada diferencialmente y aislada endógenamente descrita en la presente memoria puede ser una molécula de RNA completa o parcial.
La molécula de DNA aislada capaz de transcribirse en la molécula de RNA descrita en la presente memoria también está abarcada por este documento, así como los vectores (entre ellos, los vectores de expresión) que comprenden tal molécula de DNA o RNA.
También se describen en la presente memoria genotecas que comprenden al menos una secuencia expresada diferencialmente y aislada endógenamente que se identifica con la presente memoria [p. ej., DNA o RNA parcial o completo, secuencias sustancialmente idénticas o secuencias sustancialmente complementarias (p. ej., sondas) y fragmentos de los mismos (p. ej., oligonucleótidos)].
La secuencia expresada diferencialmente y aislada endógenamente descrita en la presente memoria se puede seleccionar, por ejemplo, del grupo que consiste en un polinucleótido que puede consistir en o comprender: a) una cualquiera de SEQ ID NO. 1 a 33, SEQ ID NO. 85 o SEQ ID NO. 86,
b) el marco abierto de lectura de una cualquiera de SEQ ID NO. 1 a 33, SEQ ID NO. 85 o SEQ ID NO. 86, c) un polinucleótido que puede comprender una secuencia nucleotídica sustancialmente idéntica a a) o b), y; d) un polinucleótido que puede comprender una secuencia nucleotídica sustancialmente complementaria a una cualquiera de a) a c),
e) fragmentos de una cualquiera de a) a d).
También se describe en la presente memoria un polipéptido que puede ser codificado por la secuencia expresada diferencialmente y aislada endógenamente descrita en la presente memoria.
También se describe en la presente memoria un polinucleótido capaz de codificar un polipéptido descrito en la presente memoria. Debido a la degeneración del código genético, se debe comprender en la presente memoria que muchas secuencias polinucleotídicas pueden codificar la misma secuencia polipeptídica y, por lo tanto, están abarcadas por la presente memoria.
Los polipéptidos de ejemplo pueden comprender una secuencia seleccionada del grupo que consiste en una cualquiera de SEQ ID No .48 a 80, un polipéptido codificado por la SEQ ID NO. 85 o la SeQ ID NO. 86.
También se describe en la presente memoria una secuencia polinucleotídica de ortólogo no humano aislada (implicada en la remodelación ósea), el marco abierto de lectura del ortólogo no humano, secuencias sustancialmente idénticas, secuencias sustancialmente complementarias, fragmentos y variantes de ayuste de las mismas.
También se describe en la presente memoria un polipéptido aislado codificado por el polinucleótido de ortólogo no humano, así como análogos biológicamente activos y fragmentos biológicamente activos de los mismos.
Las realizaciones de ejemplo de polinucleótidos de ortólogos no humanos (p. ej., ratón) abarcados por este documento incluyen, por ejemplo, la SEQ ID NO. 35.
Las realizaciones de ejemplo de polipéptido aislado codificado por algunos ortólogos no humanos identificados en la presente memoria incluyen, por ejemplo, un polipéptido tal como la SEQ ID NO. 82.
También se describe en la presente memoria un polinucleótido aislado que se puede expresar diferencialmente en la célula de osteoclasto diferenciado en comparación con la célula precursora de osteoclasto humano sin diferenciar. El polinucleótido aislado puede comprender un miembro seleccionado del grupo que consiste en:
a) un polinucleótido que puede comprender una cualquiera de SEQ ID NO. 1 a SEQ ID NO. 33, SEQ ID NO. 85 o SEQ ID NO. 86.
b) un polinucleótido que puede comprender el marco abierto de lectura de una cualquiera de SEQ ID NO. 1 a SEQ ID NO. 33, SEQ ID NO. 85 o SEQ ID NO. 86;
c) un polinucleótido que puede comprender una porción transcrita o que se puede transcribir de una cualquiera de SEQ ID NO. 1 a SEQ ID NO. 33, SEQ ID NO. 85 o SEQ ID NO. 86, que puede estar, por ejemplo, libre de porción o porciones sin traducir o intraducibles;
d) un polinucleótido que puede comprender una porción traducida o traducible de una cualquiera de SEQ ID NO. 1 a SEQ ID NO. 33, SEQ ID NO. 85 o SEQ ID NO. 86 (p. ej., porción codificante),
e) un polinucleótido que puede comprender una secuencia sustancialmente idéntica (p. ej., una identidad de aproximadamente el 50 al 100 %, o aproximadamente del 60 al 100 % o aproximadamente del 70 al 100 % o aproximadamente del 80 al 100 % o aproximadamente del 85, 90, 95 al 100 % a lo largo de toda la secuencia o de la porción de las secuencias) a a), b), c) o d),
f) un polinucleótido que puede comprender una secuencia sustancialmente complementaria (p. ej., complementaria de aproximadamente el 50 al 100 %, o aproximadamente del 60 al 100 % o aproximadamente del 70 al 100% o aproximadamente del 80 al 100% o aproximadamente del 85, 90, 95 al 100% a lo largo de toda la secuencia o de la porción de las secuencias) a a), b), c) o d); y
g) un fragmento de uno cualquiera de a) a f).
h) que incluye polinucleótidos que consisten en lo anterior.
Los fragmentos polinucleotídicos de ejemplo de los enumerados más arriba comprenden polinucleótidos de al menos 10 ácidos nucleicos que pueden ser sustancialmente complementarios a la secuencia de nucleótidos de una cualquiera de las SEQ ID No .1 a 33, SEQ ID NO. 85 o SEQ ID NO. 86, por ejemplo, fragmentos seleccionados del grupo que consiste en una cualquiera de las SEQ ID NO. 42 a 45.
También se describe en la presente memoria un polinucleótido aislado implicado en la diferenciación de los osteoclastos, en donde el polinucleótido aislado puede seleccionarse, por ejemplo, del grupo que consiste en: a) un polinucleótido que comprende una cualquiera de SEQ ID NO. 1 a 33, SEQ ID NO. 85 o SEQ ID NO. 86, b) un polinucleótido que comprende el marco abierto de lectura de una cualquiera de SEQ ID NO. 1 a 33, SEQ ID NO. 85 o SEQ ID NO. 86,
c) un polinucleótido que puede comprender una porción transcrita o que se puede transcribir de una cualquiera de SEQ ID NO. 1 a SEQ ID NO. 33, SEQ ID NO. 85 o SEQ ID NO. 86, que puede estar, por ejemplo, libre de porción o porciones sin traducir o intraducibles;
d) un polinucleótido que puede comprender una porción traducida o traducible de una cualquiera de SEQ ID NO. 1 a SEQ ID NO. 33, SEQ ID NO. 85 o SEQ ID NO. 86 (p. ej., porción codificante),
e) un polinucleótido sustancialmente idéntico a a), b), c) o d); y
f) una secuencia de al menos 10 ácidos nucleicos que puede ser sustancialmente complementaria a la secuencia de ácido nucleico de una cualquiera de SEQ ID NO. 1 a 33, SEQ ID NO. 85 o SEQ ID NO. 86 o más en particular de a), b), c) o d).
De acuerdo con la presente invención, el polinucleótido aislado puede ser capaz de favorecer la diferenciación de los osteoclastos (p. ej., en un mamífero o en una célula de mamífero del mismo), esto es, puede ser un regulador positivo de la diferenciación de los osteoclastos.
En concordancia adicional con la presente invención, el polinucleótido aislado puede ser capaz de inhibir, prevenir o disminuir la diferenciación de los osteoclastos (p. ej., en un mamífero o en una célula de mamífero del mismo), esto es, puede ser un regulador negativo de la diferenciación de los osteoclastos.
Aún en otro aspecto, la presente invención se refiere a un polinucleótido aislado que puede ser capaz de inhibir la diferenciación de los osteoclastos (p. ej., en un mamífero o en una célula de mamífero del mismo). El polinucleótido puede seleccionarse, por ejemplo, del grupo que consiste en polinucleótidos que pueden comprender una secuencia de al menos 10 ácidos nucleicos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos de una cualquiera de las NSEQ descritas en la presente memoria.
Los polinucleótidos adecuados incluyen, por ejemplo, un polinucleótido que tiene o comprende los que se seleccionan del grupo que consiste en SEQ ID NO. 42 a 45.
Los polinucleótidos adecuados pueden ser los que pueden ser capaces de inhibir la diferenciación de los osteoclastos que ha sido inducida por un inductor de la diferenciación de los osteoclastos, tal como los recogidos en la presente memoria.
De acuerdo con la presente invención, el polinucleótido puede ser, por ejemplo, una molécula de RNA, una molécula de DNA, incluidas las que son parciales o completas, monocatenarias o bicatenarias, híbridos, etc.
También se describe en la presente memoria un vector (p. ej., un vector de expresión) que comprende el polinucleótido de la presente invención.
También se describe en la presente memoria una genoteca de secuencias polinucleotídicas que se puede expresar diferencialmente en una célula de osteoclasto diferenciado en comparación con una célula precursora de osteoclasto sin diferenciar. La genoteca puede comprender, por ejemplo, al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste en:
a) un polinucleótido que puede comprender una cualquiera de SEQ ID NO. 1 a 33, SEQ ID NO. 85 o SEQ ID NO. 86, b) un polinucleótido que puede comprender el marco abierto de lectura de una cualquiera de SEQ ID NO. 1 a 33, SEQ ID NO. 85 o SEQ ID NO. 86,
c) un polinucleótido que puede comprender una porción transcrita o que se puede transcribir de una cualquiera de SEQ ID NO. 1 a SEQ ID NO. 33, SEQ ID NO. 85 o SEQ ID NO. 86, que puede estar, por ejemplo, libre de porción o porciones sin traducir o intraducibles;
d) un polinucleótido que puede comprender una porción traducida o traducible de una cualquiera de SEQ ID NO. 1 a SEQ ID NO. 33, SEQ ID NO. 85 o SEQ ID NO. 86 (p. ej., porción codificante),
e) un polinucleótido que puede comprender una secuencia sustancialmente idéntica (p. ej., una identidad de aproximadamente el 50 al 100 %, o aproximadamente del 60 al 100 % o aproximadamente del 70 al 100 % o aproximadamente del 80 al 100 % o aproximadamente del 85, 90, 95 al 100 % a lo largo de toda la secuencia o de la porción de las secuencias) a a), b), c) o d);
f) un polinucleótido que puede comprender una secuencia sustancialmente complementaria (p. ej., complementaria de aproximadamente el 50 al 100 %, o aproximadamente del 60 al 100 % o aproximadamente del 70 al 100 % o aproximadamente del 80 al 100 % o aproximadamente del 85, 90, 95 al 100 % a lo largo de toda la secuencia o de la porción de las secuencias) a a), b), c) o d); y
g) un fragmento de una cualquiera de a) a d).
También se describe en la presente memoria una genoteca de expresión que puede comprender una genoteca de polinucleótidos descrita en la presente memoria. Cada polinucleótido puede estar contenido dentro de un vector de expresión.
Las matrices y kits que comprenden una genoteca de las secuencias polinucleotídicas (que comprenden al menos un polinucleótido tal como secuencias complementarias) descritas en la presente memoria también están abarcadas por el presente documento.
También se da a conocer en la presente memoria una composición farmacéutica para inhibir la diferenciación de los osteoclastos (osteoclasia y enfermedades o trastornos relacionados con la osteoclasia), en donde la composición farmacéutica puede comprender, por ejemplo:
a) un polinucleótido aislado como se define en la presente memoria (p, ej., capaz de inhibir la diferenciación de los osteoclastos); y
b) un vehículo farmacéuticamente aceptable.
También se describe en la presente memoria un procedimiento para inhibir la diferenciación de los osteoclastos (p, ej., para inhibir la osteoclasia o para mejorar la osteoclasia) en un mamífero (individuo) que lo necesita (o en una célula de mamífero), en donde el procedimiento puede comprender la administración de un polinucleótido aislado (p. ej., capaz de inhibir la diferenciación de los osteoclastos) o de una composición farmacéutica adecuada que comprende tal polinucleótido adecuado.
De acuerdo con la presente invención, el mamífero que lo necesita puede padecer, por ejemplo y sin limitación, una afección seleccionada del grupo que consiste en osteoporosis, osteopenia, osteomalacia, hiperparatiroidismo, hipertiroidismo, hipogonadismo, tirotoxicosis, mastocitosis sistémica, hipofosfatasia adulta, hipercorticalismo, osteogénesis imperfecta, enfermedad de Paget, enfermedad/síndrome de Cushing, síndrome de Turner, enfermedad de Gaucher, síndrome de Ehlers-Danlos, síndrome de Marfan, síndrome de Menkes, síndrome de Fanconi, mieloma múltiple, hipercalciemia, hipocalciemia, artritis, periodontitis, raquitismo (incluido el raquitismo dependiente de la vitamina D de tipos I y II, y el hipofosfatémico ligado al cromosoma X), fibrogénesis imperfecta ósea, trastornos osteoescleróticos tal como picnodisostosis y daño ocasionado por procesos inflamatorios mediados por macrófagos, etc.
En otro aspecto, la presente invención se refiere al uso de un polinucleótido aislado (p. ej., capaz de inhibir la diferenciación de los osteoclastos) para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad osteoclásica.
La presente invención, en otro aspecto de la misma, da a conocer una composición farmacéutica para favorecer la diferenciación de los osteoclastos en un mamífero que lo necesita. La composición farmacéutica puede comprender, por ejemplo:
a. un polinucleótido aislado (p, ej., capaz de favorecer la diferenciación de los osteoclastos); y
b. un vehículo farmacéuticamente aceptable.
También se describe en la presente memoria un procedimiento para favorecer la diferenciación de los osteoclastos en un mamífero que lo necesita (o en una célula de mamífero), en donde el procedimiento puede comprender, por ejemplo, la administración de un polinucleótido aislado (p. ej., capaz de favorecer la diferenciación de los osteoclastos) o una composición farmacéutica adecuada como la descrita más arriba.
La presente invención se refiere adicionalmente al uso de un polinucleótido aislado (p. ej., capaz de favorecer la diferenciación de los osteoclastos) para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad asociada a una osteoclasia insuficiente (p. ej., hiperostosis) o un excesivo crecimiento del hueso.
También se describe en la presente memoria el uso de al menos un polinucleótido que se puede seleccionar del grupo que consiste en:
a) un polinucleótido que comprende una cualquiera de SEQ ID NO. 1 a 33, SEQ ID NO. 85 o SEQ ID NO. 86, b) un polinucleótido que comprende el marco abierto de lectura de una cualquiera de SEQ ID NO. 1 a 33, SEQ ID NO. 85 o SEQ ID NO. 86,
c) un polinucleótido que puede comprender una porción transcrita o que se puede transcribir de una cualquiera de SEQ ID NO. 1 a SEQ ID NO. 33, SEQ ID NO. 85 o SEQ ID NO. 86, que puede estar, por ejemplo, libre de la porción o porciones sin traducir o intraducibles;
d) un polinucleótido que puede comprender una porción traducida o traducible de una cualquiera de SEQ ID NO. 1 a SEQ ID NO. 33, SEQ ID NO. 85 o SEQ ID NO. 86 (p. ej., porción codificante),
e) un polinucleótido que comprende una secuencia sustancialmente idéntica (p. ej., una identidad de aproximadamente el 50 al 100 %, o aproximadamente del 60 al 100 % o aproximadamente del 70 al 100 % o aproximadamente del 80 al 100 % o aproximadamente del 85, 90, 95 al 100 % a lo largo de toda la secuencia o de la porción de las secuencias) a a), b), c) o d);
f) un polinucleótido que comprende una secuencia sustancialmente complementaria (p. ej., una complementariedad de aproximadamente el 50 al 100 %, o aproximadamente del 60 al 100 % o aproximadamente del 70 al 100 % o aproximadamente del 80 al 100 % o aproximadamente del 85, 90, 95 al 100 % a lo largo de toda la secuencia o de la porción de las secuencias) a a), b), c) o d);
g) un fragmento de una cualquiera de a) a f); y
h) una genoteca que comprende una cualquiera de a) a g)
en el diagnóstico de una afección relacionada con la remodelación ósea (una osteopatía).
También se describen en la presente memoria kits para el diagnóstico de una afección relacionada con la remodelación ósea. El kit puede comprender un polinucleótido como se describe en la presente memoria.
También se describe en la presente memoria un polipéptido aislado (secuencia polipeptídica) implicado en la diferenciación de los osteoclastos (en un mamífero o en una célula de mamífero del mismo). El polipéptido puede comprender (o consistir en) una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:
a) una cualquiera de SEQ ID NO. 48 a 80,
b) un polipéptido que puede estar codificado y/o está codificado por una cualquiera de SEQ ID NO. 1 a 33, SEQ ID NO. 85 o s Eq ID No .86 (su porción codificante),
c) un fragmento biológicamente activo de uno cualquiera de a) o b),
d) un análogo biológicamente activo de uno cualquiera de a) o b).
De acuerdo con la presente invención, el análogo biológicamente activo puede comprender, por ejemplo, al menos una sustitución de aminoácido (conservativa o no conservativa) en comparación con la secuencia original. De acuerdo con la presente invención, el análogo puede comprender, por ejemplo, al menos una sustitución, deleción o inserción de aminoácido en su secuencia de aminoácidos.
La sustitución puede ser conservativa o no conservativa. El análogo polipeptídico puede ser un análogo biológicamente activo o un análogo inmunógeno que puede comprender, por ejemplo, al menos una sustitución de aminoácidos (conservativa o no conservativa), por ejemplo, 1 a 5, 1 a 10, 1 a 15, 1 a 20, 1 a 50, etc. (incluido cualquier número entre ellos) en comparación con la secuencia original. Un análogo inmunógeno puede comprender, por ejemplo, al menos una sustitución de aminoácido en comparación con la secuencia original y puede aún ser fijado por un anticuerpo específico contra la secuencia original.
De acuerdo con la presente invención, un fragmento polipeptídico puede comprender, por ejemplo, al menos 6 aminoácidos consecutivos, al menos 8 aminoácidos consecutivos o más, de una secuencia de aminoácidos descrita en la presente memoria.
También se describe en la presente memoria una composición farmacéutica que puede comprender, por ejemplo, un polipéptido como se describe en la presente memoria y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En la presente memoria se dan a conocer procedimientos para modular la diferenciación de los osteoclastos en un mamífero que lo necesita (o en una célula de mamífero), en donde dichos procedimientos pueden comprender la administración de un polipéptido aislado (p. ej., capaz de favorecer la diferenciación de los osteoclastos) o una composición farmacéutica adecuada descrita en la presente memoria.
En otros aspectos, la presente invención se refiere al uso de un polipéptido aislado (p. ej., capaz de favorecer la diferenciación de los osteoclastos) para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad asociada a una osteoclasia insuficiente.
Los procedimientos para mejorar la osteoclasia en un individuo que los necesita también están abarcados por este documento, en donde dicho procedimiento puede comprender, por ejemplo, la administración de un polipéptido aislado (p. ej, capaz de inhibir la diferenciación de los osteoclastos) o de composiciones farmacéuticas adecuadas que pueden comprender tal polipéptido.
De acuerdo con la presente invención, el mamífero puede padecer, por ejemplo, una afección seleccionada del grupo que consiste en osteoporosis, osteopenia, osteomalacia, hiperparatiroidismo, hipertiroidismo, hipogonadismo, tirotoxicosis, mastocitosis sistémica, hipofosfatasia adulta, hipercorticalismo, osteogénesis imperfecta, enfermedad de Paget, enfermedad/síndrome de Cushing, síndrome de Turner, enfermedad de Gaucher, síndrome de Ehlers-Danlos, síndrome de Marfan, síndrome de Menkes, síndrome de Fanconi, mieloma múltiple, hipercalciemia, hipocalciemia, artritis, periodontitis, raquitismo (incluido el raquitismo dependiente de vitamina D de tipos I y II, y el hipofosfatémico ligado al cromosoma X), fibrogénesis imperfecta ósea, trastornos osteoescleróticos tales como picnodisostosis y el daño ocasionado por procesos inflamatorios mediados por macrófagos, etc.
Aún en otro aspecto, la presente invención se refiere al uso de un polipéptido capaz de inhibir la diferenciación de los osteoclastos en la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad de osteoclasia en un individuo que lo necesita.
También se describe en la presente memoria un compuesto y el uso de un compuesto capaz de inhibir (p. ej., en una célula precursora de osteoclasto) la actividad o expresión de un polipéptido que se puede seleccionar, por ejemplo, del grupo que consiste en SEQ ID NO. 48 a 80 o un polipéptido codificado por la SEQ ID NO. 85 o por la SEQ ID NO. 86, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de una osteopatía en un individuo que lo necesita. También se describe en la presente memoria un procedimiento para diagnosticar una afección relacionada con un trastorno o enfermedad osteoclásica en un individuo que lo necesita. El procedimiento puede comprender, por ejemplo, cuantificar un polinucleótido descrito en la presente memoria, tal como, por ejemplo, un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en los que comprenden o consisten en (a) SEQ ID NO. 1 a 33, SEQ ID NO. 85 o SEQ ID NO. 86, (b) un polinucleótido que puede comprender el marco abierto de lectura de SEQ ID NO. 1 a 33, SEQ ID NO. 85 o SEQ ID NO. 86, (c) un polinucleótido que puede comprender una porción transcrita o que se puede transcribir de una cualquiera de las s Eq ID NO. 1 a SEQ ID NO. 33, SEQ ID NO. 85 o SEQ ID NO. 86, (d) un polinucleótido que puede comprender una porción traducida o traducible de una cualquiera de SEQ ID NO. 1 a SEQ ID No .33, SEQ ID NO. 85 o SEQ ID NO. 86, (e) secuencias sustancialmente idénticas a una cualquiera de (a) a (d); (f) secuencias sustancialmente complementarias a una cualquiera de (a) a (e), o una secuencia polipeptídica que se puede seleccionar, por ejemplo, del grupo que consiste en s Eq ID NO. 48 a 80 o un polipéptido codificado por SEQ ID NO. 85 o SEQ ID nO. 86, y análogos de los mismos en una muestra del individuo en comparación con un valor estándar o normal.
También se describe en la presente memoria un ensayo y procedimiento para identificar un gen y/o proteína implicado en la remodelación ósea. El ensayo y procedimiento puede comprender silenciar un gen endógeno de una célula de osteoclasto y suministrar la célula con un gen (o proteína) candidato. Un gen (o proteína) candidato implicado positivamente en la remodelación ósea se puede identificar por su capacidad para complementar el gen endógeno silenciado. Por ejemplo, un gen candidato implicado en la diferenciación de los osteoclastos proporcionado a una célula en la cual se ha silenciado un gen endógeno puede permitir que la célula se diferencie en presencia de un inductor tal como, por ejemplo, RANKL.
También se describe en la presente memoria una célula que expresa una forma exógena de uno cualquiera de los polipéptidos (que incluyen variantes, análogos, etc.) o de los polinucleótidos de la presente invención (que incluyen secuencias sustancialmente idénticas, secuencias sustancialmente complementarias, fragmentos, variantes, ortólogos, etc.).
La célula puede ser, por ejemplo, un osteocito. La célula puede ser un osteoclasto (en cualquier nivel de diferenciación). Tal y como se utiliza en la presente memoria, la terminología «forma exógena» se tiene que entender en la presente memoria como una forma que no se expresa de forma natural en la célula en cuestión.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un anticuerpo (p. ej, anticuerpo aislado), o fragmento de fijación al antígeno del mismo, que puede fijarse específicamente a una proteína o polipéptido descrito en la presente memoria. El anticuerpo puede ser, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo generado mediante las tecnologías de DNA recombinante. El anticuerpo se puede originar, por ejemplo, de ratón, de rata o de cualquier otro mamífero.
El anticuerpo también puede ser un anticuerpo humano que se puede obtener, por ejemplo, de un mamífero no humano transgénico capaz de expresar los genes de Ig humana. El anticuerpo también puede ser un anticuerpo humanizado que puede comprender, por ejemplo, una o más regiones determinantes de complementariedad de origen no humano. También puede comprender un resto de superficie de un anticuerpo humano y/o regiones marco de un anticuerpo humano. El anticuerpo puede ser también un anticuerpo quimérico que puede comprender, por ejemplo, dominios variables de un anticuerpo no humano y dominios constantes de un anticuerpo humano.
Los anticuerpos adecuados pueden también incluir, por ejemplo, un fragmento fijador de antígeno, un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2 y un fragmento Fv; o un anticuerpo de cadena única que comprende un fragmento fijador de antígeno (p. ej., un Fv monocatenario).
El anticuerpo puede mutarse y seleccionarse basándose en un incremento de la afinidad y/o de la especificidad para uno de un polipéptido descrito en la presente memoria y/o basado en una reducción de la inmunogenia en un hospedador deseado.
El anticuerpo puede comprender adicionalmente un marcador detectable unido a éste.
En la presente memoria se describe un procedimiento para producir anticuerpos capaces de fijarse a uno de un polipéptido, fragmentos polipeptídicos o análogos polipeptídicos descritos en la presente memoria, pudiendo comprender el procedimiento:
a) inmunizar un mamífero (p. ej, ratón, un mamífero transgénico capaz de producir Ig humana, etc.) con una cantidad adecuada de una PSEQ descrita en la presente memoria que incluye, por ejemplo, un fragmento polipeptídico que comprende al menos 6 aminoácidos consecutivos de una PSEQ;
b) recoger el suero de un mamífero; y
c) aislar los anticuerpos específicos contra el polipéptido que hay en el suero del mamífero.
El procedimiento puede además comprender la etapa de administrar una segunda dosis al animal.
También se describe en la presente memoria un procedimiento para producir un hibridoma que secreta un anticuerpo que se fija a un polipéptido descrito en la presente memoria, pudiendo comprender el procedimiento: a) inmunizar un mamífero (p. ej., ratón, un mamífero transgénico capaz de producir Ig humana, etc.) con una cantidad adecuada de una PSEQ del mismo;
b) obtener linfocitos del animal inmunizado obtenido de (a);
c) fusionar los linfocitos con una célula inmortalizada para producir células híbridas; y
d) seleccionar las células híbridas que producen anticuerpos que se fijan específicamente a una PSEQ del mismo. También se describe en la presente memoria un procedimiento para producir un anticuerpo que se fija a uno del polipéptido descrito en la presente memoria, pudiendo comprender el procedimiento:
a) sintetizar una colección de anticuerpos (fragmento fijador del antígeno) en fagos o ribosomas;
b) escrutar repetidamente la colección contra una muestra poniendo en contacto el fago o los ribosomas con una composición que comprende un polipéptido o fragmento polipeptídico descrito en la presente memoria;
c) aislar el fago que se fija al polipéptido o fragmento polipeptídico; y
d) obtener un anticuerpo del fago o de los ribosomas.
El anticuerpo descrito en la presente memoria puede obtenerse así, por ejemplo, a partir de una genoteca (p. ej., genoteca en bacteriófagos) que se puede preparar, por ejemplo, mediante
a) extracción de las células que son responsables de la producción de anticuerpos en un mamífero hospedador; b) aislamiento del RNA de las células de (a);
c) retrotranscripción del mRNA para producir cDNA;
d) amplificación del cDNA con un cebador (específico de anticuerpo); y
e) inserción del cDNA de (d) en un vector para visualización en fagos o casete de visualización en ribosomas de tal forma que los anticuerpos se expresan en el fago o en los ribosomas.
El animal hospedador se puede inmunizar con el polipéptido y/o un fragmento polipeptídico y/o análogo descrito en la presente memoria para inducir una respuesta inmunitaria antes de extraer las células que son responsables de la producción de los anticuerpos.
En la presente memoria se describe un kit para ensayar específicamente un polipéptido descrito en la presente memoria, en donde el kit puede comprender, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo capaz de fijarse específicamente al polipéptido descrito en la presente memoria.
La presente invención contempla adicionalmente anticuerpos que pueden fijarse a la PSEQ. Los anticuerpos adecuados pueden fijarse a regiones antigénicas o epítopos únicos en los polipéptidos, o una porción de los mismos. Los epítopos y las regiones antigénicas útiles para generar anticuerpos se pueden hallar en el interior de las proteínas, polipéptidos o péptidos mediante los procedimientos disponibles para el experto en la técnica. Por ejemplo, se pueden identificar secuencias peptídicas únicas y cortas en las proteínas y polipéptidos que tienen poca o ninguna homología con secuencias de aminoácidos conocidas. Preferiblemente, la región de una proteína seleccionada para que actúe como un epítopo o antígeno peptídicos no es completamente hidrófoba; las regiones hidrófilas son preferibles porque estas regiones probablemente constituyen epítopos de superficie en vez de regiones internas de las proteínas y de los polipéptidos. Estos epítopos de la superficie se detectan más fácilmente en las muestras en las que se analizó la presencia de las proteínas y los polipéptidos. Tales anticuerpos pueden incluir, pero sin limitarse a ellos, anticuerpos policlonales, monoclonales, quiméricos y de una sola cadena, fragmentos Fab y fragmentos producidos mediante una genoteca de expresión de Fab. La producción de anticuerpos la conoce bien el experto en la técnica.
Los péptidos pueden fabricarse mediante cualquier procedimiento conocido por el experto en la técnica, por ejemplo, con el uso de los procedimientos de síntesis química o traducción in vitro. Los péptidos cortos que proporcionan un epítopo antigénico, pero que por sí mismos son demasiado pequeños para inducir una respuesta inmunitaria, pueden conjugarse a un vehículo adecuado. Los vehículos adecuados y los métodos de conexión se conocen bien en la técnica. Los vehículos adecuados son típicamente macromoléculas grandes tales como proteínas, polisacáridos y polímeros de aminoácidos. Los ejemplos incluyen seroalbúminas, hemocianina de lapa gigante (Megathura crenulata), ovalbúmina, polilisina y similares. El experto en la técnica puede utilizar los procedimientos disponibles y los reactivos de acoplamiento para conectar el epítopo peptídico deseado a tal vehículo. Por ejemplo, se pueden utilizar reactivos de acoplamiento para formar puentes disulfuro o enlaces tioéter desde el vehículo al péptido de interés. Si el péptido carece de un grupo disulfuro, se puede proporcionar uno mediante la adición de un resto de cisteína. Alternativamente, el acoplamiento se puede llevar a cabo mediante la activación de grupos carboxilo.
El tamaño mínimo de los péptidos útiles para obtener anticuerpos específicos de antígeno puede variar ampliamente. El tamaño mínimo debe ser suficiente para proporcionar un epítopo antigénico que es específico de la proteína o del polipéptido. El tamaño máximo no es crítico a menos que se desee obtener anticuerpos contra un epítopo concreto. Por ejemplo, un polipéptido grande puede comprender varios epítopos, un epítopo que es particularmente útil y un segundo epítopo que es inmunodominante. Típicamente, los péptidos antigénicos seleccionados entre las presentes proteínas y polipéptidos oscilarán de 5 a aproximadamente 100 aminoácidos de longitud. Sin embargo, más típicamente, tal péptido antigénico tendrá un máximo de unos 50 aminoácidos de longitud y preferiblemente un máximo de unos 30 aminoácidos. Normalmente suele ser deseable seleccionar una secuencia de unos 6, 8, 10, 12 o 15 aminoácidos, hasta unos 20 o 25 aminoácidos.
Las secuencias de aminoácidos que comprenden epítopos útiles pueden identificarse de una serie de maneras. Por ejemplo, la preparación de una serie de péptidos cortos que en conjunto extienden la secuencia de la proteína completa se puede utilizar para escrutar la secuencia de la proteína completa. El experto en la técnica puede analizar sistemáticamente en unos pocos polipéptidos grandes la presencia de un epítopo que muestra una reactividad deseada y también analizar progresivamente los fragmentos que se solapan y más pequeños para identificar un epítopo preferible con la especificidad y la reactividad deseadas.
Los polipéptidos y péptidos antigénicos son útiles para producir anticuerpos monoclonales y policlonales. Se pueden generar anticuerpos contra un polipéptido codificado por los polinucleótidos de NSEQ, análogos polipeptídicos o porciones de los mismos mediante los procedimientos que se conocen bien en la técnica. Tales anticuerpos pueden incluir, pero sin limitarse a ellos, anticuerpos policlonales, monoclonales, quiméricos y de una sola cadena, fragmentos Fab y fragmentos producidos por una genoteca de expresión de Fab. Los anticuerpos neutralizantes, tales como los que inhiben la formación de dímeros, se prefieren especialmente para el uso terapéutico. Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse mediante cualquier técnica que garantice la producción de moléculas de anticuerpo mediante el cultivo continuo de líneas celulares. Estas incluyen, pero sin limitarse a ellas, técnicas de los hibridomas, el hibridoma de linfocitos B humanos y el EBV-hibridoma. Además, se pueden utilizar técnicas desarrolladas para la producción de anticuerpos quiméricos. Alternativamente, se pueden emplear las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de una sola cadena. También se pueden generar Fab que pueden contener sitios de fijación específicos para un polipéptido codificado por los polinucleótidos de NSEQ, o una porción de la misma. Se pueden utilizar varios inmunoensayos para identificar anticuerpos que tienen la especificidad deseada. Se conocen bien en la técnica muchos protocolos para ensayos inmunorradiométricos o de fijación competitiva que utilizan bien anticuerpos monoclonales o policlonales con especificidades establecidas.
Para obtener anticuerpos policlonales, un animal determinado se puede inmunizar con una proteína o con un polipéptido. El suero del animal se puede recoger y tratar de acuerdo con los procedimientos conocidos. Luego, los anticuerpos policlonales contra la proteína o contra el polipéptido de interés se pueden purificar mediante cromatografía de afinidad. Las técnicas para producir antisueros policlonales se conocen bien en la técnica.
Los anticuerpos monoclonales (Acm) se pueden generar mediante uno de los muchos procedimientos disponibles para el experto en la técnica, por ejemplo, mediante la fusión de las células productoras del anticuerpo con células inmortalizadas, mediante lo cual se construye un hibridoma. La metodología general para la fusión de los linfocitos B productores de anticuerpo a una línea celular inmortal se encuentra bien dentro del campo de acción de un experto en la técnica. Otro ejemplo es la generación de Acm a partir del mRNA extraído de la médula ósea y de los esplenocitos de animales inmunizados mediante la tecnología de genotecas combinatorias de anticuerpos.
Un inconveniente de los Acm procedentes de animales o de líneas celulares derivadas es que, aunque se pueden administrar a un paciente para propósitos diagnósticos o terapéuticos, a menudo son reconocidos como antígenos extraños por el sistema inmunitario y resultan inapropiados para el uso continuado. Los anticuerpos que no son reconocidos como antígenos extraños por el sistema inmunitario humano tienen un potencial mayor para el diagnóstico y el tratamiento. Los procedimientos para generar anticuerpos humanos y humanizados se conocen bien ahora en la técnica.
Se pueden construir anticuerpos quiméricos en los cuales las regiones de un Acm no humano están reemplazadas por sus homólogos humanos. Un anticuerpo quimérico preferible es uno que tiene secuencias de aminoácidos que comprenden una o más regiones determinantes de complementariedad (CDR, por su nombre en inglés) de un Acm no humano que se fija a un polipéptido codificado por los polinucleótidos de NSEQ, o una porción de los mismos, injertada en regiones marco (FW, por su nombre en inglés) humanas. Los procedimientos para fabricar tales anticuerpos se conocen bien en la técnica. Los restos de aminoácidos que corresponden a las CDR y las FW los conoce el experto en la técnica.
Se han desarrollado multitud de procedimientos para preservar o mejorar la afinidad por el antígeno que presentan los anticuerpos que comprenden las CDR injertadas. Una manera es incluir en el anticuerpo quimérico los restos del marco foráneo que influyen en la conformación de la regiones CDR. Una segunda manera es injertar las CDR foráneas en los dominios variables humanos con la homología más próxima a la región variable foránea. Así pues, el injerto de una o más CDR humanas en un anticuerpo humano también puede implicar la sustitución de los restos aminoacídicos que son adyacentes a una secuencia de CDR particular o que no son contiguos a la secuencia de la CDR, sino que están empaquetados contra la CDR en la estructura global del dominio variable del anticuerpo y que afectan la conformación de la CDR. Por lo tanto, los anticuerpos humanizados incluyen los anticuerpos humanos que comprenden una o más CDR no humanas, así como tales anticuerpos en los que se han realizado otras sustituciones o reemplazos para conservar o mejorar las características fijadoras.
Los anticuerpos quiméricos también incluyen anticuerpos que se han humanizado mediante el reemplazo de los restos expuestos en la superficie que hacen que el Acm parezca humano. Dado que el empaquetamiento interno de los restos aminoacídicos en la vecindad del sitio de fijación al antígeno permanece inalterado, se preserva la afinidad. La sustitución de los restos expuestos en la superficie de un polipéptido codificado por los polinucleótidos del anticuerpo contra la NSEQ (o una porción de la misma) de acuerdo con la invención para el propósito de la humanización no significa la sustitución de los restos de la CDR o de los restos adyacentes que influyen en la afinidad por un polipéptido codificado por los nucleótidos de NSEQ, o una porción de la misma.
Los anticuerpos quiméricos también pueden incluir anticuerpos en los que algunos o todos los dominios constantes no humanos han sido reemplazados por el equivalente en los humanos. Esta estrategia tiene la ventaja de que el sitio de fijación al antígeno permanece intacto. Sin embargo, pueden estar presentes cantidades significativas de secuencias no humanas, en donde los dominios variables proceden completamente de anticuerpos no humanos. Los anticuerpos descritos en la presente memoria incluyen anticuerpos humanos (p. ej., humanizados) que son anticuerpos que consisten esencialmente en secuencias humanas. Los anticuerpos humanos se pueden obtener de genotecas de visualización en fagos, en donde las combinaciones de los dominios variables humanos de las cadenas ligera y pesada se visualizan sobre la superficie de fagos filamentosos. Las combinaciones de los dominios variables se visualizan típicamente en el fago filamentoso en forma de Fab o de scFv. La genoteca se puede escrutar para detectar las combinaciones de dominios variables que tienen las características de fijación al antígeno deseadas que aparecen en los fagos. Las combinaciones de dominios variables preferibles se caracterizan por una elevada afinidad por un polipéptido codificado por los polinucleótidos de NSEQ, o una porción de la misma. Las combinaciones de dominios variables preferibles también se pueden caracterizar por una elevada especificidad por un polipéptido codificado por los polinucleótidos de NSEQ, o una porción de la misma, y por una escasa reactividad cruzada con otros antígenos relacionados. Al escrutar con repertorios muy grandes de fragmentos de anticuerpos, (2 a 10 x 1010) se puede aislar una buena diversidad de Acm de elevada afinidad, y se espera que muchos tengan una afinidad de orden subnanomolar por un polipéptido codificado por los polinucleótidos de NSEQ, o una porción de la misma.
Alternativamente, se pueden obtener anticuerpos humanos a partir de animales transgénicos en los que se han introducido segmentos del gen de Ig humana sin reorganizar y en los que se han inactivado los genes de Ig de ratón endógenos. Los animales transgénicos preferibles contienen fragmentos del gen de Ig contiguos muy grandes que tienen un tamaño superior a 1 Mb, pero los Acm específicos contra el polipéptido humano de moderada afinidad se pueden generar de animales transgénicos que contienen locus génicos más pequeños. Animales transgénicos capaces de expresar sólo los genes de Ig humana se pueden utilizar también para generar antisuero policlonal que comprende anticuerpos sólo de origen animal.
Los anticuerpos descritos en la presente memoria pueden incluir aquéllos para los cuales se han mejorado la características de fijación mediante la mutación directa o mediante métodos de maduración de la afinidad. La afinidad y la especificidad se pueden modificar o mejorar mediante la mutación de las CDR y mediante el escrutinio de los sitios de fijación al antígeno que tienen las características deseadas. Las CDR se pueden mutar de muchos modos. Una manera es aleatorizar cada resto o combinaciones de restos de tal forma que en una población de sitios fijadores de antígeno por lo demás idénticos, los veinte aminoácidos se pueden encontrar en posiciones concretas. Alternativamente, se pueden inducir mutaciones a lo largo de un margen de restos de CDR mediante métodos de PCR propensos al error. Los vectores de visualización en fagos que contienen el gen de la región variable de las cadenas ligera y pesada se pueden propagar en cepas mutadoras de E. coli. Estos métodos de mutagénesis son ilustrativos de los muchos procedimientos conocidos por el experto en la técnica.
Los anticuerpos descritos en la presente memoria pueden incluir anticuerpos completos anti-polipéptido, así como fragmentos de anticuerpo y derivados que comprenden un sitio de fijación por un polipéptido codificado por los polinucleótidos de NSEQ, o una porción de los mismos. Los derivados son macromoléculas que comprenden un sitio de fijación unido a un dominio funcional. Los dominios funcionales pueden incluir, pero sin limitarse a ellos, dominios de señalización, toxinas, enzimas y citocinas.
Los anticuerpos obtenidos por los medios descritos en la presente memoria pueden ser útiles para detectar proteínas, variantes y polipéptidos derivados en los tejidos específicos o en los líquidos corporales. Además, la detección de fragmentos proteicos o proteínas expresados de forma aberrante es una prueba de un estado patológico. Por ejemplo, la expresión de los polipéptidos presentes codificados por los polinucleótidos de la NSEQ, o una porción de la misma, puede indicar que la proteína se están expresando a un ritmo inadecuado o en una etapa del desarrollo inadecuada. Por consiguiente, los presentes anticuerpos pueden ser útiles para detectar enfermedades asociadas a la expresión de la proteína de las NSEQ descritas en la presente memoria.
Se conocen bien en la técnica una serie de protocolos para medir los polipéptidos, entre ellos ELISA, RIA y FACS, y proporcionan una base para diagnosticar los niveles de expresión anómalos o alterados. Los valores estándares para la expresión polipeptídica se establecen mediante la combinación de muestras tomadas de sujetos sanos, preferiblemente humanos, con anticuerpos contra el polipéptido en condiciones para la formación de complejos. La cantidad de complejo formado se puede cuantificar mediante distintos procedimientos, tales como medios fotométricos. La cantidad de polipéptido expresado en las muestras de la enfermedad se puede comparar con los valores estándares. La desviación entre los valores estándares y el problema podría establecer los parámetros para diagnosticar o monitorizar una enfermedad.
El diseño de los inmunoensayos está sujeto a una gran cantidad de variaciones y se conocen muchos de ellos en la técnica. Los inmunoensayos pueden utilizar un reactivo de anticuerpo monoclonal o policlonal que se dirige contra un epítopo del antígeno a ensayar. Alternativamente, puede utilizarse una combinación de anticuerpos monoclonales y policlonales que se dirigen contra más de un epítopo. Los protocolos se pueden basar, por ejemplo, en la competición, donde se pueden utilizar ensayos competitivos de escrutinio de fármacos en los que los anticuerpos neutralizantes capaces de fijarse al polipéptido codificado por los polinucleótidos de NSEQ, o una porción de la misma, compiten específicamente con un compuesto problema por la fijación al polipéptido. Alternativamente se pueden utilizar reacciones directas entre el anticuerpo y el antígeno o ensayos de tipo sándwich, y los protocolos pueden, por ejemplo, servirse de soportes sólidos o de inmunoprecipitación. Además, para facilitar la detección, los anticuerpos pueden estar marcados con una molécula indicadora. También se conocen los ensayos que amplifican la señal de un reactivo fijado. Los ejemplos incluyen inmunoensayos que utilizan avidina y biotina o que utilizan anticuerpos marcados con enzimas o conjugados de antígenos, tal como los ensayos por ELISA.
Los kits adecuados para el inmunodiagnóstico y que contienen los reactivos marcadores apropiados incluyen los anticuerpos dirigidos contra los epítopos o regiones antigénicas de la proteína en polipéptidos, envasados apropiadamente con los reactivos restantes y los materiales necesarios para la realización del ensayo, así como un conjunto adecuado de instrucciones para el ensayo.
También se da a conocer en la presente memoria un kit para ensayar específicamente un polipéptido descrito en la presente memoria, en donde el kit puede comprender, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo capaz de fijarse específicamente al polipéptido descrito en la presente memoria.
El kit puede ser un kit de diagnóstico, que puede comprender:
a) uno o más anticuerpos descritos en la presente memoria; y
b) un reactivo de detección que puede comprender un grupo indicador.
Los anticuerpos pueden estar inmovilizados sobre un soporte sólido. El reactivo de detección puede comprender, por ejemplo, una antiinmunoglobulina, proteína G, proteína A o lectina, etc. El grupo indicador se puede seleccionar, sin limitación, del grupo que consiste en radioisótopos, grupos fluorescentes, grupos luminiscentes, enzimas, biotina y partículas colorantes.
También se describe en la presente memoria un procedimiento para identificar un compuesto inhibidor (que inhibe, antagonista) que puede ser capaz de perturbar la función (actividad) o expresión de un polipéptido descrito en la presente memoria, tal como, por ejemplo, los que se pueden seleccionar del grupo que consiste en SEQ ID NO. 48 a 80 o un polipéptido codificado por la SEQ ID NO. 85 o por la SEQ ID NO. 86, y análogos de las mismas. El procedimiento puede comprender poner en contacto el polipéptido o una célula que expresa el polipéptido con un compuesto candidato y medir la función (actividad) o la expresión del polipéptido. Una reducción en la función o de la actividad del polipéptido (en comparación con la ausencia del compuesto candidato) puede identificar positivamente un compuesto inhibidor idóneo.
La falta de función o actividad se puede relacionar con una reducción de la capacidad del polipéptido para favorecer la diferenciación de los osteoclastos, tal como la diferenciación de los osteoclastos inducida por un inductor descrito en la presente memoria o conocido en la técnica.
La célula puede, de forma no natural (endógenamente), expresar (el polipéptido puede no expresarse sustancialmente en una célula) el polipéptido o análogo o, alternativamente, se puede reprimir la expresión de un análogo del polipéptido expresado de forma natural.
Por ejemplo, un procedimiento adecuado para escrutar un inhibidor de SEQ ID NO. 1 puede comprender la represión de la expresión del ortólogo de ratón de SEQ ID NO. 35 en una célula de osteoclasto de ratón y evaluar la diferenciación de la célula de osteoclasto que comprende la SEQ IND n.° 1 en presencia o ausencia de un inhibidor candidato y, por ejemplo, un inductor de la diferenciación de los osteoclastos (p. ej., RANKL).
También se describe en la presente memoria un procedimiento para identificar un compuesto inhibidor (que inhibe, antagonista) capaz de perturbar la función (actividad) o la expresión de un polipéptido tal como, por ejemplo, SEQ ID NO. 1 o SEQ ID NO. 2. El procedimiento puede comprender, por ejemplo, poner en contacto el polipéptido (aislado) o una célula que expresa el polipéptido con un compuesto candidato y medir la función (actividad) o la expresión del polipéptido. Una reducción en la función o de la actividad del polipéptido (en comparación con la ausencia del compuesto candidato) puede, por lo tanto, identificar un compuesto inhibidor adecuado.
De acuerdo con la presente invención, la función o actividad perturbada puede estar asociada, por ejemplo, a una reducción de la capacidad del polipéptido para inhibir o favorecer la diferenciación de los osteoclastos.
La célula utilizada para llevar a cabo el análisis de escrutinio puede expresar de forma no natural (endógenamente) el polipéptido o análogos o, alternativamente, se puede reprimir la expresión de un análogo del polipéptido expresado de forma natural.
También se describe en la presente memoria un procedimiento para identificar un regulador positivo o negativo de la diferenciación de los osteoclastos. El procedimiento puede comprender, por ejemplo, realizar un efecto paralizante como el descrito en la presente memoria. El procedimiento puede comprender más en particular a) proporcionar una célula de osteoclasto con un compuesto (p. ej., siRNA) capaz de inhibir específicamente una secuencia diana (p. ej., un polinucleótido o polipéptido como el descrito en la presente memoria), b) inducir la diferenciación (p. ej., con un inductor tal como, por ejemplo, RANKL) y c) determinar el nivel de diferenciación de la célula de osteoclasto (p. ej., medir el número de células diferenciadas, su velocidad de diferenciación, marcador específico de la diferenciación, etc.).
Tras la inhibición de un regulador positivo, el nivel de diferenciación de los osteoclastos aparecerá bajo. Tras la inhibición de un regulador negativo, el nivel de diferenciación de los osteoclastos aparecerá elevado.
Otro procedimiento para identificar un regulador positivo o negativo de la diferenciación de los osteoclastos es a) proporcionar una célula con una de las secuencias diana descritas en la presente memoria (polipéptido o polinucleótido capaz de expresar un polipéptido) b) inducir la diferenciación (p. ej., con un inductor tal como, por ejemplo, RANKL) y c) determinar el nivel de diferenciación de las células de osteoclastos (p. ej., medir el número de células diferenciadas, su velocidad de diferenciación, marcador específico de diferenciación, etc.).
Una célula dada a conocer con un regulador positivo de la diferenciación de los osteoclastos puede incrementar su nivel de diferenciación. Una célula proporcionada con una regulador negativo de la diferenciación de los osteoclastos puede disminuir su nivel de diferenciación.
También se describe en la presente memoria un procedimiento para identificar un compuesto capaz de interferir con la diferenciación de los osteoclastos, en donde el procedimiento puede comprender poner en contacto una célula que incluye una secuencia polinucleotídica no endógena que comprende una cualquiera de SEQ ID NO. 1 a 33, 85 u 86 (una porción codificante) y cuantificar (p. ej, el número de) osteoclastos diferenciados. Una reducción de la diferenciación de los osteoclastos en presencia del compuesto en comparación con la ausencia del compuesto puede ser indicativa de un antagonista de la diferenciación de los osteoclastos, mientras que un incremento de la diferenciación de los osteoclastos en presencia del compuesto en comparación con la ausencia del compuesto puede ser indicativa de un agonista de la diferenciación de los osteoclastos.
La célula puede también comprender una forma endógena de un polinucleótido.
Tal y como se utiliza en la presente memoria, la terminología «endógena» significa una sustancia que se origina de forma natural dentro de un organismo, tejido o célula. La terminología «polinucleótido endógeno» se refiere a una forma cromosómica de un polinucleótido o versión de RNA (hnRNA, mRNA) producida por una forma cromosómica del polinucleótido. La terminología «polipéptido endógeno» se refiere a la forma de la proteína codificada por un «polinucleótido endógeno».
Tal y como se utiliza en la presente memoria, la terminología «no endógeno» o «exógeno» se utiliza en oposición a «endógeno» en que la sustancia se proporciona de una fuente externa, aunque se puede introducir dentro de la célula. La terminología «polinucleótido no endógeno» se refiere a un polinucleótido sintético introducido dentro de la célula e incluye, por ejemplo y sin limitación, un vector que comprende una secuencia de interés, un mRNA sintético, un oligonucleótido que comprende una NSEQ, etc. La terminología «polipéptido no endógeno» se refiere a la forma de la proteína codificada por un «polinucleótido no endógeno».
También se describe en la presente memoria un procedimiento para identificar un compuesto capaz de interferir con la diferenciación de los osteoclastos, en donde el procedimiento puede comprender poner en contacto una célula que incluye en su interior una secuencia polipeptídica no endógena que comprende una cualquiera de SEQ ID NO.
48 a 80, y cuantificar (p. ej., el número de) osteoclastos diferenciados. Una reducción de la diferenciación de los osteoclastos en presencia del compuesto en comparación con la ausencia del compuesto puede ser indicativa de un antagonista de la diferenciación de los osteoclastos, mientras que un incremento de la diferenciación de los osteoclastos en presencia del compuesto en comparación con la ausencia del compuesto puede ser indicativa de un agonista de la diferenciación de los osteoclastos.
Tal y como se utiliza en la presente memoria, la terminología «identidad de secuencia» se refiere a nucleótidos (consecutivos) de una secuencia nucleotídica con referencia a una secuencia nucleotídica original. La identidad se puede comparar a lo largo de una región o sobre la secuencia total de una secuencia de ácido nucleico.
Así pues, la «identidad» se puede comparar, por ejemplo, a lo largo de una región de 3, 4, 5, 10, 19, 20 nucleótidos o más (y cualquier número entre ellos). Se tiene que entender en la presente memoria que entre ácidos nucleicos idénticos se pueden encontrar huecos de nucleótidos no idénticos. Por ejemplo, un polinucleótido puede tener una identidad del 100% con otro polinucleótido sobre una porción del mismo. Sin embargo, cuando se compara toda la secuencia de ambos polinucleótidos, los dos polinucleótidos pueden tener un 50% de su secuencia global (total) idéntica entre sí.
Quedan abarcados por el presente documento los polinucleótidos descritos en la presente memoria o la porción de los mismos que tienen una identidad de secuencia de aproximadamente el 50 a aproximadamente el 100 %, o de aproximadamente el 60 a aproximadamente el 100 %, o de aproximadamente el 70 a aproximadamente el 100 %, o de aproximadamente el 80 a aproximadamente el 100 %, o de aproximadamente el 85 %, aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 95 % a aproximadamente el 100 %, con un polinucleótido original. Los expertos en la técnica saben que un polinucleótido que tiene una identidad de aproximadamente el 50 % a aproximadamente el 100% puede funcionar (p. ej., hibridarse a una secuencia sustancialmente complementaria) de una manera similar a un polinucleótido original y, por lo tanto, puede utilizarse en lugar de un polinucleótido original. Por ejemplo un polinucleótido (una secuencia de ácido nucleico) puede comprender o tener de aproximadamente el 50 al 100 % de identidad con un polinucleótido original sobre una región definida y todavía puede funcionar con la misma eficacia o suficiencia.
El porcentaje de identidad puede determinarse, por ejemplo, con un algoritmo GAP, BESTFIT o FASTA de la versión 7.0 del Wisconsin Genetics Software Package, con el uso de las ponderaciones de los huecos por defecto.
Tal y como se utiliza en la presente memoria, la terminología «complementariedad de secuencia» se refiere a los nucleótidos (consecutivos) de una secuencia nucleotídica que son complementarios a una secuencia nucleotídica de referencia (original). La complementariedad se puede comparar sobre una región o sobre toda la secuencia de una secuencia de ácido nucleico.
Los polinucleótidos descritos en la presente memoria o una porción de los mismos que tienen una complementariedad de secuencia de aproximadamente el 50 a aproximadamente el 100 %, o de aproximadamente el 60 a aproximadamente el 100 %, o de aproximadamente el 70 a aproximadamente el 100 %, o de aproximadamente el 80 % a aproximadamente el 100 %, o de aproximadamente el 85%, aproximadamente el 90 %, de aproximadamente el 95 % a aproximadamente el 100 % con un polinucleótido original están, por lo tanto, englobados por este documento. Los expertos en la técnica saben que un polinucleótido que tiene una complementariedad de aproximadamente el 50 % a aproximadamente el 100 % con una secuencia original puede alinearse lo suficiente a esa secuencia para llevar a cabo la presente invención (p. ej., inhibir la expresión del polinucleótido original).
Se debe entendender en la presente memoria que un «análogo» es una molécula que tiene una actividad biológica y una estructura química similares a la de un polipéptido descrito en la presente memoria. Un «análogo» puede tener una similitud de secuencia con la de una secuencia original o una porción de una secuencia original y también puede tener una modificación de su estructura como las explicadas en la presente memoria. Por ejemplo, un «análogo» puede tener una similitud de secuencia de al menos el 90 % con una secuencia original o una porción de una secuencia original. Un «análogo» también puede tener, por ejemplo; al menos el 70 % o incluso el 50 % de similitud de secuencia (o menos, a saber, al menos el 40 %) con una secuencia original o una porción de una secuencia original.
De igual forma, un «análogo» referido a un polipéptido puede tener, por ejemplo, al menos el 50 % de similitud de secuencia con una secuencia original con una combinación de una o varias modificaciones en un esqueleto o cadena lateral de un aminoácido, o una adición de un grupo u otra molécula, etc.
«Polinucleótido» se refiere de forma general a cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, que puede ser RNA o DNA sin modificar, o RNA o DNA modificado. «Polinucleótidos» incluye, sin limitación, DNA monocatenario y bicatenario, DNA que es una mezcla de regiones monocatenarias y bicatenarias, RNA monocatenario y bicatenario y RNA que es una mezcla de regiones monocatenarias y bicatenarias, moléculas híbridas que comprenden DNA y RNA que pueden ser monocatenarias o, más típicamente, bicatenarias, o una mezcla de regiones monocatenarias y bicatenarias. Además, «polinucleótido» se refiere a regiones tricatenarias que comprenden RNA o DNA o tanto RNA como DNA. La terminología polinucleótido también incluye DNA o RNA que contienen una o más bases modificadas y DNA o RNA con esqueletos modificados que les dan estabilidad o por otras razones. Las bases «modificadas» incluyen, por ejemplo, bases tritiladas y bases inusuales tales como inosina. Se pueden efectuar numerosas modificaciones al DNA y al RNA; así pues, «polinucleótido» abarca formas modificadas química, enzimática o metabólicamente de polinucleótidos como se encuentran de forma típica en la naturaleza, así como las formas químicas de DNA y RNA características de virus y células. «Polinucleótido» incluye, pero sin limitarse a ellas, moléculas lineales y cerradas por los extremos. «Polinucleótido» también engloba polinucleótidos relativamente cortos, a menudo denominados oligonucleótidos.
«Polipéptidos» se refiere a cualquier péptido o proteína que comprende dos o más aminoácidos unidos entre sí mediante enlaces peptídicos o enlaces peptídicos modificados (a saber, isoésteres peptídicos). «Polipéptido» se refiere tanto a cadenas cortas, que se suelen denominar péptidos, oligopéptidos u oligómeros, como a cadenas más largas que se suelen denominar proteínas. Tal y como se describe más arriba, los polipéptidos pueden contener aminoácidos diferentes de los 20 aminoácidos proteinogénicos.
Tal y como se utiliza en la presente memoria, la terminología «análogo polipeptídico» se refiere a mutantes, variantes, quimeras, fusiones, deleciones, adiciones y cualquier otro tipo de modificación hecha respecto a un polipéptido dado.
Tal y como se utiliza en la presente memoria, la terminología «biológicamente activo» se refiere a una variante o fragmento que conserva alguna o toda la actividad biológica del polipéptido natural, a saber, que es capaz de favorecer o inhibir la diferenciación de los osteoclastos. Los polipéptidos o fragmentos de la presente invención también pueden incluir polipéptidos o fragmentos «inmunológicamente activos». Los «polipéptidos o fragmentos inmunológicamente activos» pueden ser útiles para los propósitos de inmunización (p. ej, para generar anticuerpos).
Así pues, los polipéptidos biológicamente activos en forma de los polipéptidos originales, fragmentos (modificados o no), análogos (modificados o no), derivados (modificados o no), homólogos (modificados o no) de los polipéptidos descritos en la presente memoria están englobados por la presente invención.
Por consiguiente, estará englobado por la presente memoria cualquier polipéptido que tenga una modificación en comparación con un polipéptido original que no destruya significativamente una actividad biológica deseada. Se sabe bien en la técnica que se pueden efectuar una serie de modificaciones a los polipéptidos de la presente invención sin afectar perjudicialmente su actividad biológica. Estas modificaciones pueden, por otra parte, mantener o incrementar la actividad biológica del polipéptido original, o pueden optimizar una o más de la particularidades (p, ej, estabilidad, biodisponibilidad, etc.) de los polipéptidos de la presente invención que, en algún caso, podría ser deseable. Los polipéptidos de la presente invención pueden comprender, por ejemplo, los que contienen secuencias de aminoácidos modificadas bien mediante procesos naturales, tal como el procesamiento postraduccional, o bien mediante técnicas de modificación química que se conocen bien en la técnica. Las modificaciones se pueden producir en cualquier posición de un polipéptido, que incluyen el esqueleto del polipéptido, las cadenas laterales de los aminoácidos y los extremos amino y carboxilo. Se apreciará que el mismo tipo de modificación puede estar presente en la misma o diferente magnitud en varios sitios del polipéptido dado. De igual forma, un polipéptido dado puede contener muchos tipos de modificaciones. Se debe entender en la presente memoria que una modificación de los polipéptidos descritos en la presente memoria estará englobada por la presente invención siempre que la actividad biológica sea similar a la del polipéptido original (madre).
Tal y como se explicó más arriba, la modificación del polipéptido puede comprender, por ejemplo, la inserción (por ejemplo, adición), deleción y sustitución (a saber, reemplazo) de aminoácidos, bien conservativa o no conservativa (p. ej., aminoácidos D, desaminoácidos) en la secuencia polipeptídica, en donde tales cambios no alteran sustancialmente la actividad biológica global del polipéptido.
Ejemplos de sustituciones pueden ser las que son conservativas (a saber, cuando un resto se reemplaza por otro del mismo tipo general o grupo) o, cuando se desee, no conservativas (a saber, cuando un resto se reemplaza por un aminoácido de otro tipo). Además, un aminoácido que no se produce de forma natural puede sustituir a un aminoácido que se produce de forma natural (a saber, sustitución conservativa de aminoácido que no se produce en la naturaleza o una sustitución no conservativa de aminoácido que no se produce en la naturaleza).
Como se sabe, los aminoácidos que se producen de forma natural se pueden subclasificar en ácidos, básicos, neutros y polares, o neutros y apolares. Además, tres de los aminoácidos codificados son aromáticos. Puede resultar útil que los polipéptidos codificados que difieren del polipéptido determinado de la presente invención contengan sustituciones de codones para los aminoácidos, que son del mismo tipo o grupo que el aminoácido a reemplazar. Así pues, en algunos casos, los aminoácidos básicos Lys, Arg e His pueden ser intercambiables; los aminoácidos ácidos Asp y Glu puede ser intercambiables; los aminoácidos polares neutros Ser, Thr, Cys, Gln y Asn pueden ser intercambiables; los aminoácidos alifáticos apolares Gly, Ala, Val, Ile y Leu son intercambiables, pero debido a su tamaño, Gly y Ala tienen una relación más cercana, y Val, Ile y Leu tienen otra relación cercana entre sí, y los aminoácidos aromáticos Phe, Trp y Tyr pueden ser intercambiables.
Se debe notar además que si los polipéptidos se construyen sintéticamente, también se pueden realizar sustituciones con los aminoácidos que no están codificados de forma natural en el DNA (aminoácido que no se produce de forma natural o aminoácido no natural).
Un aminoácido que no se produce de forma natural se debe entender en la presente memoria que es un aminoácido que no se produce de forma natural o que no se encuentra en un mamífero. Un aminoácido que no se produce de forma natural comprende un aminoácido D, un aminoácido que tiene un grupo acetilaminometil conectado a un átomo de azufre de una cisteína, un aminoácido pegilado, etc. La inclusión de un aminoácido que no se produce de forma natural en una secuencia polipeptídica definida, por lo tanto, generará un derivado del polipéptido original. Los aminoácidos (restos) que no se producen de forma natural incluyen también los aminoácidos w de la fórmula NH2(CH2)nCOOH, en la que n es 2-6, aminoácidos apolares neutros, tales como sarcosina, t-butilalanina, tbutilglicina, N-metilisoleucina, norleucina, etc. La fenilglicina puede sustituir a Trp, Tyr o Phe; la citrulina y el sulfóxido de metionina son apolares neutros, el ácido cisteico es ácido y la ornitina es básica. La prolina se puede sustituir por hidroxiprolina y conservar las propiedades que confiere la conformación.
Se sabe en la técnica que se pueden generar análogos mediante mutagénesis sustitutiva y que conserven la misma actividad biológica de los polipéptidos de la presente invención. Estos análogos tienen al menos un resto de aminoácido en la molécula de la proteína retirada y un resto diferente insertado en su lugar. Por ejemplo, un sitio de interés para la mutagénesis sustitutiva puede incluir, pero sin limitarse a ellos, sitios identificados como los centro(s) activo(s), o sitio(s) inmunitario(s). Otros sitios de interés pueden ser aquéllos, por ejemplo, en los que determinados restos obtenidos de diferentes especies son idénticos. Estas posiciones pueden ser importantes para la actividad biológica. En la tabla A se muestran los ejemplos de sustituciones identificadas como «sustituciones conservativas». Si tales sustituciones dan lugar a un cambio no deseado, entonces se introducen otro tipo de sustituciones, denominadas «sustituciones ejemplares» en la tabla A, o como se describe adicionalmente en la presente memoria en referencia a las clases de aminoácidos, y se escrutan los productos.
En algunos casos puede resultar interesante modificar la actividad biológica de un polipéptido mediante la sustitución, inserción o deleción de aminoácidos. Por ejemplo, la modificación de un polipéptido puede dar lugar a un incremento de la actividad biológica del polipéptido, puede modular su toxicidad, puede dar lugar a cambios de la biodisponibilidad o de la estabilidad, o puede modular su actividad inmunitaria o identidad inmunitaria. Las modificaciones sustanciales de la función o de la identidad inmunitaria se llevan a cabo mediante la selección de sustituciones cuyo efecto difiere significativamente a la hora de mantener (a) la estructura del esqueleto del polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación en hoja o en hélice, (b) la carga o la hidrofobia de la molécula en el sitio diana, o (c) el volumen de la cadena literal. Los restos que aparecen de forma natural se dividen en grupos basándose en las propiedades comunes de la cadena lateral:
(1) hidrófobos: norleucina, metionina (Met), alanina (Ala), valina (Val), leucina (Leu), isoleucina (Ile)
(2) hidrófilos neutros: cisteína (Cys), serina (Ser), treonina (Thr)
(3) ácidos: ácido aspártico (Asp), ácido glutámico (Glu)
(4) básicos: asparragina (Asn), glutamina (Gln), histidina (His), lisina (Lys), arginina (Arg)
(5) restos que influyen en la orientación de la cadena: glicina (Gly), prolina (Pro); y aromáticos: triptófano (Trp), tirosina (Tyr), fenilalanina (Phe).
Las sustituciones no conservativas conllevarán el intercambio de un miembro de una estas clases por otro.
TABLA A. Sustitución ejemplar de los aminoácidos
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Se tiene que entender en la presente memoria que si se mencionan un «intervalo» o «grupo» de sustancias (p. ej, aminoácidos), «sustituyentes» o similares, o si se mencionan otros tipos de una característica determinada (p. ej, temperatura, presión, estructura química, tiempo, etc.), la presente invención se refiere a todos y cada uno de los miembros específicos, y a cualquier combinación de subintervalos o subgrupos de ellos, y explícitamente los incorpora en la presente memoria. Así pues, cualquier intervalo o grupo especificado se debe entender como un modo abreviado de referirse a todos y cada uno de los miembros de un intervalo o grupo individualmente, así como a todos y cada uno de los posibles subintervalos o subgrupos englobados en éstos; y de igual forma con respecto a cualquier subintervalo o subgrupos en éstos. Así pues, por ejemplo, respecto a un porcentaje (%) de identidad de aproximadamente el 80 al 100 %, se debe entender que en la presente memoria se incorpora específicamente el % de todos y cada uno de los individuos, así como el subintervalo, tal como por ejemplo 80 %, 81 %, 84,78 %, 93 %, 99 %, etc.; y de igual forma con respecto a otros parámetros tales como concentraciones, elementos, etc.
Se describe en la presente memoria un polinucleótido aislado para el uso en el tratamiento y/o diagnóstico de una osteopatía y/o para el uso en la modulación de la diferenciación de los osteoclastos, en donde el polinucleótido se expresa diferencialmente en las células de osteoclasto diferenciadas en comparación con las células precursoras de osteoclasto sin diferenciar. El polinucleótido aislado puede comprender un miembro seleccionado entre a) un polinucleótido que comprende una cualquiera de SEQ ID NO. 1 a SEQ ID NO. 33, 85 u 86; b) un polinucleótido que comprende el marco abierto de lectura de una cualquiera de SEQ ID NO. 1 a SEQ ID NO. 33, 85 u 86; c) un polinucleótido que comprende una porción que se puede transcribir de una cualquiera de SEQ ID NO. 1 a SEQ ID NO. 33, 85 u 86; d) un polinucleótido que comprende una porción que se puede traducir de una cualquiera de SEQ ID NO. 1 a SEQ ID NO. 33, 85 u 86; e) un polinucleótido que comprende una secuencia sustancialmente idéntica a una cualquiera de a) a d), f) un polinucleótido que comprende una secuencia sustancialmente complementaria a una cualquiera de a) a e), y/o g) un fragmento de una cualquiera de a) a f).
También se describe en la presente memoria una secuencia polipeptídica aislada para el uso en el tratamiento y/o el diagnóstico de una osteopatía y/o para el uso en la modulación de la diferenciación de los osteoclastos, en donde el polipéptido se expresa diferencialmente en la célula de osteoclasto diferenciada en comparación con la célula precursora de osteoclasto sin diferenciar. El polipéptido aislado puede comprender una secuencia seleccionada entre a) una cualquiera de SEQ ID NO. 48 a 80, b) un polipéptido codificado por una cualquiera de SEQ ID NO. 1 a 33, SEQ ID NO. 85 u 86, c) un fragmento biológicamente activo de una cualquiera de a) o b), y/o d) un análogo biológicamente activo de una cualquiera de a) o b).
También se describe en la presente memoria un anticuerpo aislado y/o purificado, en donde dicho anticuerpo puede ser capaz de fijarse específicamente a un polipéptido que comprende una secuencia polipeptídica codificada por una cualquiera de SEQ ID NO. 85 u 86 y/o un fragmento de al menos 6 aminoácidos de dicho polipéptido. También queda abarcado por la presente invención una célula de hibridoma que puede producir un anticuerpo capaz de fijarse específicamente a un polipéptido codificado por SEQ ID NO. 85 u 86 y/o un fragmento de al menos 6 aminoácidos de dicho polipéptido. También está englobado por la presente memoria el uso de un polipéptido aislado que puede comprender una secuencia seleccionada entre a) una cualquiera de SEQ ID NO. 48 a 80, b) un polipéptido codificado por una cualquiera de SEQ ID NO. 1 a 33, s Eq ID NO. 85 u 86, c) un fragmento biológicamente activo de una cualquiera de a) o b), y/o d) un análogo biológicamente activo de una cualquiera de a) o b) para detectar un anticuerpo que se fija específicamente al polipéptido.
También se describe en la presente memoria un inmunoensayo para la detección de anticuerpos que se fijan específicamente a al menos una secuencia polipeptídica aislada que se expresa diferencialmente en las células de osteoclasto diferenciadas en comparación con las células precursoras de osteoclasto sin diferenciar que puede comprender una secuencia seleccionada entre a) una cualquiera de SEQ ID n° 48 a 80, b) un polipéptido codificado por una cualquiera de SEQ ID NO. 1 a 33, SEQ ID NO. 85 u 86, c) un fragmento biológicamente activo de una cualquiera de a) o b), y/o d) un análogo biológicamente activo de una cualquiera de a) o b) y/o un análogo biológicamente activo que puede comprender al menos una sustitución de aminoácido en tal secuencia. El inmunoensayo puede comprender las etapas de: a) poner en contacto una muestra de una muestra de líquido biológico de un mamífero con el polipéptido y/o b) detectar la formación del complejo inmunitario entre el polipéptido y los anticuerpos en dicha muestra.
También se describe en la presente memoria un procedimiento para prevenir una osteopatía en un mamífero que lo necesita. El procedimiento puede comprender la administración a dicho mamífero de un polinucleótido aislado descrito en la presente memoria y/o una composición farmacéutica que puede comprender un polinucleótido descrito en la presente memoria.
También se describe en la presente memoria un procedimiento para tratar una osteopatía en un individuo que lo necesita. El procedimiento puede comprender la administración de un compuesto capaz de interferir con la actividad y/o la expresión de un polipéptido descrito en la presente memoria, por ejemplo, cualquier polipéptido que consiste en SEq ID NO.48 a 80 y/o un polipéptido codificado por una cualquiera de s Eq ID No .1 a 33, SEQ ID NO. 85 y/u 86.
También se describe en la presente memoria un anticuerpo aislado y/o purificado. Un anticuerpo descrito en la presente memoria puede ser capaz de fijarse específicamente a un polipéptido codificado por una cualquiera de SEQ ID NO. 85, 86 y/o un fragmento de al menos 6 aminoácidos de dichos polipéptidos. También se encuentra abarcada por la presente memoria una composición que puede comprender tal anticuerpo. También se describe en la presente memoria un procedimiento para fabricar un anticuerpo. Tal procedimiento puede comprender inmunizar un animal no humano con un fragmento inmunógeno de un polipéptido codificado por, por ejemplo, la SEQ ID NO.
85 u 86 y/o un fragmento de al menos 6 aminoácidos de dicho polipéptido. También se encuentra descrita en la presente memoria una genoteca de secuencias polinucleotídicas que se pueden expresar diferencialmente en una célula de osteoclasto diferenciada en comparación con una célula precursora de osteoclasto sin diferenciar. La genoteca puede comprender una cualquiera de SEQ ID NO. 85 y/o SEQ ID NO. 86 y/o al menos un miembro seleccionado entre a) un polinucleótido que comprende una cualquiera de SEQ ID NO. 1 a SEQ ID NO. 33, b) un polinucleótido que comprende el marco abierto de lectura de una cualquiera de SEQ ID NO. 1 a SEQ ID NO. 33, c) un polinucleótido que comprende una porción que se puede transcribir de una cualquiera de SEQ ID NO. 1 a SEQ ID NO. 33, d) un polinucleótido que comprende una porción que se puede traducir de una cualquiera de SEQ ID NO. 1 a SEQ ID NO. 33, e) un polinucleótido que comprende una secuencia sustancialmente idéntica a una cualquiera de a) a d); f) un polinucleótido que comprende una secuencia sustancialmente complementaria a una cualquiera de a) a e), y/o g) un fragmento de una cualquiera de a) a f).
También se describe en la presente memoria un procedimiento para modular la diferenciación de los osteoclastos en un individuo que lo necesita. El procedimiento puede comprender administrar un compuesto capaz de interferir con la actividad y/o la expresión de un polipéptido tal como la SEQ ID NO. 48 a 80 y/o un polipéptido codificado por una cualquiera de SEQ iD NO. 1 a 33, SeQ iD NO. 85 u 86.
También se describe en la presente memoria una composición farmacéutica para modular la diferenciación de los osteoclastos. La composición farmacéutica puede comprender un polinucleótido aislado tal como a) un polinucleótido que comprende una cualquiera de SEQ ID NO. 1 a SEQ ID NO. 33, 85 u 86, b) un polinucleótido que comprende el marco abierto de lectura de una cualquiera de SEQ ID NO. 1 a SEQ ID NO. 33, 85 u 86, c) un polinucleótido que comprende una porción que se puede transcribir de una cualquiera de SEQ ID NO. 1 a SEQ ID NO. 33, 85 u 86, d) un polinucleótido que comprende una porción traducible de una cualquiera de SEQ ID NO. 1 a SEQ ID NO. 33, 85 u 86, e) un polinucleótido que comprende una secuencia sustancialmente idéntica a una cualquiera de a) a d), f) un polinucleótido que comprende una secuencia sustancialmente complementaria a una cualquiera de a) a e), y/o g) un fragmento de una cualquiera de a) a f), y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
También se describe en la presente memoria una molécula de siRNA y/o shRNA que puede disminuir la expresión de un polinucleótido tal como a) un polinucleótido que comprende una cualquiera de SEQ ID NO. 1 a SEQ ID NO.
33, 85 u 86, b) un polinucleótido que comprende el marco abierto de lectura de una cualquiera de SEQ ID NO. 1 a SEQ ID NO. 33, 85 u 86, c) un polinucleótido que comprende una porción que se puede transcribir de una cualquiera de SEQ ID NO. 1 a SEQ ID NO. 33, 85 u 86, d) un polinucleótido que comprende una porción traducible de una cualquiera de SEQ ID NO. 1 a SEQ ID NO. 33, 85 u 86, e) un polinucleótido que comprende una secuencia sustancialmente idéntica a una cualquiera de a) a d), f) un polinucleótido que comprende una secuencia sustancialmente complementaria a una cualquiera de a) a e), y/o g) un fragmento de una cualquiera de a) a f).
En particular se debe entender en la presente memoria que los procedimientos de la presente invención incluyen todas y cada una de las etapas individuales descritas por éstos, así como las definidas como que incluyen decididamente determinadas etapas o que excluyen determinadas etapas o una combinación de ambas; por ejemplo, una definición de exclusión para un procedimiento de la presente invención puede leerse como sigue: «siempre y cuando dicho polipéptido no comprenda o no consista en la SEQ ID NO. 34 o el marco abierto de lectura de SEQ ID NO. 34» o «siempre y cuando dicho polipéptido no comprenda o no consista en la SEQ ID NO. 82» o «siempre y cuando dicho fragmento polinucleotídico o dicho fragmento polipeptídico tenga una longitud de menos de X unidades (p. ej., nucleótidos o aminoácidos) o de más de X unidades (p. ej., nucleótidos o aminoácidos)».
Otros objetos, características, ventajas y aspectos de la presente invención serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la descripción que viene a continuación. Sin embargo, se debe entender que la descripción y los ejemplos específicos que vienen a continuación, aunque indican realizaciones preferibles de la invención, se ofrecen sólo con fines ilustrativos.
Breve descripción de los dibujos
En los dibujos adjuntos:
Para cada una de las figuras 1 a 34 y 38 a 39 se prepararon macromatrices mediante la amplificación de RNA con RAMP de células precursoras humanas (A-F 1) y de osteoclastos diferenciados intermedios (A-F 2-3) y maduros de cuatro donantes humanos (A-F 4) y 30 tejidos humanos normales diferentes [glándula suprarrenal (A5), hígado (B5), pulmón (C5), ovario (D5), músculo esquelético (E5), corazón (F5), cuello de útero (G5), tiroides (H5), mama (A6), placenta (B6), corteza suprarrenal (C6), riñón (D6), vena cava (E6), trompa de Falopio (F6), páncreas (G6), testículo (H6), yeyuno (A7), aorta (B7), esófago (C7), próstata (D7), estómago (E7), bazo (F7), íleon (G7), tráquea (A8), cerebro (B8), colon (C8), timo (D8), intestino delgado (E8), vejiga (F8) y duodeno (G8)]. El clon de DNA bicatenario de STAR que representa las correspondientes SEQ ID NO. se marcó con 32P y se hibridó con la macromatriz. La reacción de marcación de la sonda se enriqueció también con una secuencia de DNA bicatenario de Arabidopsis, que se hibrida a su propia secuencia (M) depositada en la macromatriz para que sirva de control para la reacción de marcación. La cuantificación de la señal de hibridación en cada punto se realizó con un Phosphorimager STORM 820 y el programa informático ImageQuant TL (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Como nivel basal se utilizó un valor de log2 que representa el promedio de las señales para los precursores (A-F 1) y se sustrajo del valor de log2 obtenido para cada una de las muestras restantes con el objeto de determinar su abundancia relativa en comparación con los precursores, y se representó en un gráfico de barras (panel derecho).
La figura 1 es un dibujo de los resultados de hibridación de macromatrices y de la cuantificación de la intensidad de las señales que muestra los datos de expresión diferencial para la SEQ ID NO. 1 humana específica de los osteoclastos del STAR correspondiente. Los resultados de hibridación obtenidos confirman su inducción en todas las muestras de osteoclastos humanos al ser la expresión generalmente más alta en los osteoclastos más maduros (A-F 2-4) que en los precursores (A-F 1) y haber poca o ninguna expresión en todos o la mayor parte de los tejidos normales (A-H 5-6 y A-G 7-8);
La figura 2 es un dibujo de los resultados de hibridación de la macromatriz y de la cuantificación de la intensidad de las señales que muestra los datos de expresión diferencial para la SEQ ID NO. 2 humana específica de los osteoclastos del STAR correspondiente. Los resultados de hibridación obtenidos confirman su inducción en todas las muestras de osteoclastos humanos al ser la expresión generalmente más alta en los osteoclastos más maduros (A-F 2-4) que en los precursores (A-F 1) y haber poca o ninguna expresión en todos o la mayor parte de los tejidos normales (A-H 5-6 y A-G 7-8);
La figura 3 es un dibujo de los resultados de hibridación de macromatrices y de la cuantificación de la intensidad de las señales que muestra los datos de expresión diferencial para la SEQ ID NO. 3 humana específica de los osteoclastos del STAR correspondiente. Los resultados de hibridación obtenidos confirman su inducción en todas las muestras de osteoclastos humanos al ser la expresión generalmente más alta en los osteoclastos más maduros (A-F 2-4) que en los precursores (A-F 1) y haber poca o ninguna expresión en todos o la mayor parte de los tejidos normales (A-H 5-6 y A-G 7-8);
La figura 4 es un dibujo de los resultados de hibridación de macromatrices y de la cuantificación de la intensidad de las señales que muestra los datos de expresión diferencial para la SEQ ID NO. 4 humana específica de los osteoclastos del STAR correspondiente. Los resultados de hibridación obtenidos confirman su inducción en todas las muestras de osteoclastos humanos al ser la expresión generalmente más alta en los osteoclastos más maduros (A-F 2-4) que en los precursores (A-F 1) y haber poca o ninguna expresión en todos o la mayor parte de los tejidos normales (A-H 5-6 y A-G 7-8);
La figura 5 es un dibujo de los resultados de hibridación de macromatrices y de la cuantificación de la intensidad de las señales que muestra los datos de expresión diferencial para la SEQ ID NO. 5 humana específica de los osteoclastos del STAR correspondiente. Los resultados de hibridación obtenidos confirman su inducción en todas las muestras de osteoclastos humanos al ser la expresión generalmente más alta en los osteoclastos más maduros (A-F 2-4) que en los precursores (A-F 1) y haber poca o ninguna expresión en todos o la mayor parte de los tejidos normales (A-H 5-6 y A-G 7-8);
La figura 6 es un dibujo de los resultados de hibridación de macromatrices y de la cuantificación de la intensidad de las señales que muestra los datos de expresión diferencial para la SEQ ID NO. 6 humana específica de los osteoclastos del STAR correspondiente. Los resultados de hibridación obtenidos confirman su inducción en todas las muestras de osteoclastos humanos al ser la expresión generalmente más alta en los osteoclastos más maduros (A-F 2-4) que en los precursores (A-F 1) y haber poca o ninguna expresión en todos o la mayor parte de los tejidos normales (A-H 5-6 y A-G 7-8);
La figura 7 es un dibujo de los resultados de hibridación de macromatrices y de la cuantificación de la intensidad de las señales que muestra los datos de expresión diferencial para la SEQ ID NO. 7 humana específica de los osteoclastos del STAR correspondiente. Los resultados de hibridación obtenidos confirman su inducción en todas las muestras de osteoclastos humanos al ser la expresión generalmente más alta en los osteoclastos más maduros (A-F 2-4) que en los precursores (A-F 1) y haber poca o ninguna expresión en todos o la mayor parte de los tejidos normales (A-H 5-6 y A-G 7-8);
La figura 8 es un dibujo de los resultados de hibridación de macromatrices y de la cuantificación de la intensidad de las señales que muestra los datos de expresión diferencial para la SEQ ID NO. 8 humana específica de los osteoclastos del STAR correspondiente. Los resultados de hibridación obtenidos confirman su inducción en todas las muestras de osteoclastos humanos al ser la expresión generalmente más alta en los osteoclastos más maduros (A-F 2-4) que en los precursores (A-F 1) y haber poca o ninguna expresión en todos o la mayor parte de los tejidos normales (A-H 5-6 y A-G 7-8);
La figura 9 es un dibujo de los resultados de hibridación de macromatrices y de la cuantificación de la intensidad de las señales que muestra los datos de expresión diferencial para la SEQ ID NO. 9 humana específica de los osteoclastos del STAR correspondiente. Los resultados de hibridación obtenidos confirman su inducción en todas las muestras de osteoclastos humanos al ser la expresión generalmente más alta en los osteoclastos más maduros (A-F 2-4) que en los precursores (A-F 1) y haber poca o ninguna expresión en todos o la mayor parte de los tejidos normales (A-H 5-6 y A-G 7-8);
La figura 10 es un dibujo de los resultados de hibridación de macromatrices y de la cuantificación de la intensidad de las señales que muestra los datos de expresión diferencial para la SEQ ID NO. 10 humana específica de los osteoclastos del STAR correspondiente. Los resultados de hibridación obtenidos confirman su inducción en todas las muestras de osteoclastos humanos al ser la expresión generalmente más alta en los osteoclastos más maduros (A-F 2-4) que en los precursores (A-F 1) y haber poca o ninguna expresión en todos o la mayor parte de los tejidos normales (A-H 5-6 y A-G 7-8);
La figura 11 es un dibujo de los resultados de hibridación de macromatrices y de la cuantificación de la intensidad de las señales que muestra los datos de expresión diferencial para la SEQ ID NO. 11 humana específica de los osteoclastos del STAR correspondiente. Los resultados de hibridación obtenidos confirman su inducción en todas las muestras de osteoclastos humanos al ser la expresión generalmente más alta en los osteoclastos más maduros (A-F 2-4) que en los precursores (A-F 1) y haber poca o ninguna expresión en todos o la mayor parte de los tejidos normales (A-H 5-6 y A-G 7-8);
La figura 12 es un dibujo de los resultados de hibridación de macromatrices y de la cuantificación de la intensidad de las señales que muestra los datos de expresión diferencial para la SEQ ID NO. 12 humana específica de los osteoclastos del STAR correspondiente. Los resultados de hibridación obtenidos confirman su inducción en todas las muestras de osteoclastos humanos al ser la expresión generalmente más alta en los osteoclastos más maduros (A-F 2-4) que en los precursores (A-F 1) y haber poca o ninguna expresión en todos o la mayor parte de los tejidos normales (A-H 5-6 y A-G 7-8);
La figura 13 es un dibujo de los resultados de hibridación de macromatrices y de la cuantificación de la intensidad de las señales que muestra los datos de expresión diferencial para la SEQ ID NO. 13 humana específica de los osteoclastos del STAR correspondiente. Los resultados de hibridación obtenidos confirman su inducción en todas las muestras de osteoclastos humanos al ser la expresión generalmente más alta en los osteoclastos más maduros (A-F 2-4) que en los precursores (A-F 1) y haber poca o ninguna expresión en todos o la mayor parte de los tejidos normales (A-H 5-6 y A-G 7-8);
La figura 14 es un dibujo de los resultados de hibridación de macromatrices y de la cuantificación de la intensidad de las señales que muestra los datos de expresión diferencial para la SEQ ID NO. 14 humana específica de los osteoclastos del STAR correspondiente. Los resultados de hibridación obtenidos confirman su inducción en todas las muestras de osteoclastos humanos al ser la expresión generalmente más alta en los osteoclastos más maduros (A-F 2-4) que en los precursores (A-F 1) y haber poca o ninguna expresión en todos o la mayor parte de los tejidos normales (A-H 5-6 y A-G 7-8);
La figura 15 es un dibujo de los resultados de hibridación de macromatrices y de la cuantificación de la intensidad de las señales que muestra los datos de expresión diferencial para la SEQ ID NO. 15 humana específica de los osteoclastos del STAR correspondiente. Los resultados de hibridación obtenidos confirman su inducción en todas las muestras de osteoclastos humanos al ser la expresión generalmente más alta en los osteoclastos más maduros (A-F 2-4) que en los precursores (A-F 1) y haber poca o ninguna expresión en todos o la mayor parte de los tejidos normales (A-H 5-6 y A-G 7-8);
La figura 16 es un dibujo de los resultados de hibridación de macromatrices y de la cuantificación de la intensidad de las señales que muestra los datos de expresión diferencial para la SEQ ID NO. 16 humana específica de los osteoclastos del STAR correspondiente. Los resultados de hibridación obtenidos confirman su inducción en todas las muestras de osteoclastos humanos al ser la expresión generalmente más alta en los osteoclastos más maduros (A-F 2-4) que en los precursores (A-F 1) y haber poca o ninguna expresión en todos o la mayor parte de los tejidos normales (A-H 5-6 y A-G 7-8);
La figura 17 es un dibujo de los resultados de hibridación de macromatrices y de la cuantificación de la intensidad de las señales que muestra los datos de expresión diferencial para la SEQ ID NO. 17 humana específica de los osteoclastos del STAR correspondiente. Los resultados de hibridación obtenidos confirman su inducción en todas las muestras de osteoclastos humanos al ser la expresión generalmente más alta en los osteoclastos más maduros (A-F 2-4) que en los precursores (A-F 1) y haber poca o ninguna expresión en todos o la mayor parte de los tejidos normales (A-H 5-6 y A-G 7-8);
La figura 18 es un dibujo de los resultados de hibridación de macromatrices y de la cuantificación de la intensidad de las señales que muestra los datos de expresión diferencial para la SEQ ID NO. 18 humana específica de los osteoclastos del STAR correspondiente. Los resultados de hibridación obtenidos confirman su inducción en todas las muestras de osteoclastos humanos al ser la expresión generalmente más alta en los osteoclastos más maduros (A-F 2-4) que en los precursores (A-F 1) y haber poca o ninguna expresión en todos o la mayor parte de los tejidos normales (A-H 5-6 y A-G 7-8);
La figura 19 es un dibujo de los resultados de hibridación de macromatrices y de la cuantificación de la intensidad de las señales que muestra los datos de expresión diferencial para la SEQ ID NO. 19 humana específica de los osteoclastos del STAR correspondiente. Los resultados de hibridación obtenidos confirman su inducción en todas las muestras de osteoclastos humanos al ser la expresión generalmente más alta en los osteoclastos más maduros (A-F 2-4) que en los precursores (A-F 1) y haber poca o ninguna expresión en todos o la mayor parte de los tejidos normales (A-H 5-6 y A-G 7-8);
La figura 20 es un dibujo de los resultados de hibridación de macromatrices y de la cuantificación de la intensidad de las señales que muestra los datos de expresión diferencial para la SEQ ID NO. 20 humana específica de los osteoclastos del STAR correspondiente. Los resultados de hibridación obtenidos confirman su inducción en todas las muestras de osteoclastos humanos al ser la expresión generalmente más alta en los osteoclastos más maduros (A-F 2-4) que en los precursores (A-F 1) y haber poca o ninguna expresión en todos o la mayor parte de los tejidos normales (A-H 5-6 y A-G 7-8);
La figura 21 es un dibujo de los resultados de hibridación de macromatrices y de la cuantificación de la intensidad de las señales que muestra los datos de expresión diferencial para la SEQ ID NO. 21 humana específica de los osteoclastos del STAR correspondiente. Los resultados de hibridación obtenidos confirman su inducción en todas las muestras de osteoclastos humanos al ser la expresión generalmente más alta en los osteoclastos más maduros (A-F 2-4) que en los precursores (A-F 1) y haber poca o ninguna expresión en todos o la mayor parte de los tejidos normales (A-H 5-6 y A-G 7-8);
La figura 22 es un dibujo de los resultados de hibridación de macromatrices y de la cuantificación de la intensidad de las señales que muestra los datos de expresión diferencial para la SEQ ID NO. 22 humana específica de los osteoclastos del STAR correspondiente. Los resultados de hibridación obtenidos confirman su inducción en todas las muestras de osteoclastos humanos al ser la expresión generalmente más alta en los osteoclastos más maduros (A-F 2-4) que en los precursores (A-F 1) y haber poca o ninguna expresión en todos o la mayor parte de los tejidos normales (A-H 5-6 y A-G 7-8);
La figura 23 es un dibujo de los resultados de hibridación de macromatrices y de la cuantificación de la intensidad de las señales que muestra los datos de expresión diferencial para la SEQ ID NO. 23 humana específica de los osteoclastos del STAR correspondiente. Los resultados de hibridación obtenidos confirman su inducción en todas las muestras de osteoclastos humanos al ser la expresión generalmente más alta en los osteoclastos más maduros (A-F 2-4) que en los precursores (A-F 1) y haber poca o ninguna expresión en todos o la mayor parte de los tejidos normales (A-H 5-6 y A-G 7-8);
La figura 24 es un dibujo de los resultados de hibridación de macromatrices y de la cuantificación de la intensidad de las señales que muestra los datos de expresión diferencial para la SEQ ID NO. 24 humana específica de los osteoclastos del STAR correspondiente. Los resultados de hibridación obtenidos confirman su inducción en todas las muestras de osteoclastos humanos al ser la expresión generalmente más alta en los osteoclastos más maduros (A-F 2-4) que en los precursores (A-F 1) y haber poca o ninguna expresión en todos o la mayor parte de los tejidos normales (A-H 5-6 y A-G 7-8);
La figura 25 es un dibujo de los resultados de hibridación de macromatrices y de la cuantificación de la intensidad de las señales que muestra los datos de expresión diferencial para la SEQ ID NO. 25 humana específica de los osteoclastos del STAR correspondiente. Los resultados de hibridación obtenidos confirman su inducción en todas las muestras de osteoclastos humanos al ser la expresión generalmente más alta en los osteoclastos más maduros (A-F 2-4) que en los precursores (A-F 1) y haber poca o ninguna expresión en todos o la mayor parte de los tejidos normales (A-H 5-6 y A-G 7-8);
La figura 26 es un dibujo de los resultados de hibridación de macromatrices y de la cuantificación de la intensidad de las señales que muestra los datos de expresión diferencial para la SEQ ID NO. 26 humana específica de los osteoclastos del STAR correspondiente. Los resultados de hibridación obtenidos confirman su inducción en todas las muestras de osteoclastos humanos al ser la expresión generalmente más alta en los osteoclastos más maduros (A-F 2-4) que en los precursores (A-F 1) y haber poca o ninguna expresión en todos o la mayor parte de los tejidos normales (A-H 5-6 y A-G 7-8);
La figura 27 es un dibujo de los resultados de hibridación de macromatrices y de la cuantificación de la intensidad de las señales que muestra los datos de expresión diferencial para la SEQ ID NO. 27 humana específica de los osteoclastos del STAR correspondiente. Los resultados de hibridación obtenidos confirman su inducción en todas las muestras de osteoclastos humanos al ser la expresión generalmente más alta en los osteoclastos más maduros (A-F 2-4) que en los precursores (A-F 1) y haber poca o ninguna expresión en todos o la mayor parte de los tejidos normales (A-H 5-6 y A-G 7-8);
La figura 28 es un dibujo de los resultados de hibridación de macromatrices y de la cuantificación de la intensidad de las señales que muestra los datos de expresión diferencial para la SEQ ID NO. 28 humana específica de los osteoclastos del STAR correspondiente. Los resultados de hibridación obtenidos confirman su inducción en todas las muestras de osteoclastos humanos al ser la expresión generalmente más alta en los osteoclastos más maduros (A-F 2-4) que en los precursores (A-F 1) y haber poca o ninguna expresión en todos o la mayor parte de los tejidos normales (A-H 5-6 y A-G 7-8);
La figura 29 es un dibujo de los resultados de hibridación de macromatrices y de la cuantificación de la intensidad de las señales que muestra los datos de expresión diferencial para la SEQ ID NO. 29 humana específica de los osteoclastos del STAR correspondiente. Los resultados de hibridación obtenidos confirman su inducción en todas las muestras de osteoclastos humanos al ser la expresión generalmente más alta en los osteoclastos más maduros (A-F 2-4) que en los precursores (A-F 1) y haber poca o ninguna expresión en todos o la mayor parte de los tejidos normales (A-H 5-6 y A-G 7-8);
La figura 30 es un dibujo de los resultados de hibridación de macromatrices y de la cuantificación de la intensidad de las señales que muestra los datos de expresión diferencial para la SEQ ID NO. 30 humana específica de los osteoclastos del STAR correspondiente. Los resultados de hibridación obtenidos confirman su inducción en todas las muestras de osteoclastos humanos al ser la expresión generalmente más alta en los osteoclastos más maduros (A-F 2-4) que en los precursores (A-F 1) y haber poca o ninguna expresión en todos o la mayor parte de los tejidos normales (A-H 5-6 y A-G 7-8);
La figura 31 es un dibujo de los resultados de hibridación de macromatrices y de la cuantificación de la intensidad de las señales que muestra los datos de expresión diferencial para la SEQ ID NO. 31 humana específica de los osteoclastos del STAR correspondiente. Los resultados de hibridación obtenidos confirman su inducción en todas las muestras de osteoclastos humanos al ser la expresión generalmente más alta en los osteoclastos más maduros (A-F 2-4) que en los precursores (A-F 1) y haber poca o ninguna expresión en todos o la mayor parte de los tejidos normales (A-H 5-6 y A-G 7-8);
La figura 32 es un dibujo de los resultados de hibridación de macromatrices y de la cuantificación de la intensidad de las señales que muestra los datos de expresión diferencial para la SEQ ID NO. 32 humana específica de los osteoclastos del STAR correspondiente. Los resultados de hibridación obtenidos confirman su inducción en todas las muestras de osteoclastos humanos al ser la expresión generalmente más alta en los osteoclastos más maduros (A-F 2-4) que en los precursores (A-F 1) y haber poca o ninguna expresión en todos o la mayor parte de los tejidos normales (A-H 5-6 y A-G 7-8);
La figura 33 es un dibujo de los resultados de hibridación de macromatrices y de la cuantificación de la intensidad de las señales que muestra los datos de expresión diferencial para la SEQ ID NO. 33 humana específica de los osteoclastos del STAR correspondiente. Los resultados de hibridación obtenidos confirman su inducción en todas las muestras de osteoclastos humanos al ser la expresión generalmente más alta en los osteoclastos más maduros (A-F 2-4) que en los precursores (A-F 1) y haber poca o ninguna expresión en todos o la mayor parte de los tejidos normales (A-H 5-6 y A-G 7-8);
La figura 34 es un dibujo de los resultados de hibridación de macromatrices y de la cuantificación de la intensidad de las señales que muestra los datos de expresión diferencial para la SEQ ID NO. 34 humana específica de los osteoclastos del STAR correspondiente. Los resultados de hibridación obtenidos confirman su inducción en todas las muestras de osteoclastos humanos al ser la expresión generalmente más alta en los osteoclastos más maduros (A-F 2-4) que en los precursores (A-F 1) y haber poca o ninguna expresión en todos o la mayor parte de los tejidos normales (A-H 5-6 y A-G 7-8);
La figura 35 es un dibujo que muestra los efectos bloqueadores de la osteoclastogénesis debidos a la atenuación de la expresión endógena de la SEQ ID NO. 1 (AB0326) y de la SEQ ID NO. 2 (AB0369) mediante el uso de shRNA. Se observó una disminución significativa del número de osteoclastos plurinucleados a partir de células precursoras infectadas con el shRNA de AB0326 (figura 35A; panel inferior) el y shRNA de AB0369 (figura 1B, panel inferior) en comparación con los del shRNA de lacZ (figura 35A y B; paneles superiores). Estos resultados indicaron claramente que la expresión del gen que codifica la SEQ ID NO. 1 (AB0326) y la SEQ ID NO. 2 (AB0369) son necesarios para la diferenciación de los osteoclastos;
La figura 36 es un dibujo que muestra los efectos bloqueadores de la osteoclastogénesis debidos al ortólogo de ratón para AB0326 ( SeQ ID NO. 35) en el modelo RAW 264.7 mediante el uso del shRNA-0326.2 ( SEQ ID NO. 45). La línea celular RAW-0326.2 produjo de forma significativa menos osteoclastos (figura 36, panel inferior) que la línea celular que contiene el shRNA aleatorizado (figura 36, panel superior). Este resultado, junto con el obtenido en las células precursoras de los osteoclastos humanos utilizando el sistema lentivírico de administración de shRNA demuestran que en los humanos y en los ratones se necesita claramente el producto génico AB0326 para la osteoclastogénesis;
La figura 37 es un dibujo que muestra los resultados de un ensayo de complementación funcional para la SEQ ID NO. 1 (AB0326) en las células RAW-0326.2 para escrutar inhibidores de la osteoclastogénesis. Las células RAW-0326.2 transfectadas con el vector pd2 vacío son incapaces de formar osteoclastos en presencia del ligando de RANK (panel central), lo que indica que el shRNA de AB0326 de ratón sigue siendo capaz de silenciar la expresión del gen de AB0326 en estas células. A la inversa, con el cDNA del AB0326 humano (pd2-hAB0326) se rescatan las células transfectadas y, por lo tanto, se diferencian con más eficacia en osteoclastos en respuesta al ligando de RANK (panel derecho). Las células RAW 264.7 de tipo silvestre que contienen el vector vacío (pd2) no tienen alterada la formación de osteoclastos en presencia del ligando de RANK (panel izquierdo), lo que descarta cualquier efecto debido a pd2. Por lo tanto, este ensayo de complementación se puede utilizar para escrutar los inhibidores del polipéptido de AB0326 humano;
La figura 38 es un dibujo de los resultados de hibridación de macromatrices y de la cuantificación de la intensidad de las señales que muestran los datos de expresión diferencial para la SEQ ID NO. 85 humana específica de los osteoclastos del STAR correspondiente. Se prepararon las macromatrices mediante amplificación del RNA con RAMP a partir de las células precursoras humanas (A-F 1) y los osteoclastos diferenciados intermedios y maduros de cuatro donantes humanos (A-F 2-4) y 30 tejidos humanos normales diferentes [glándula suprarrenal, hígado, pulmón, ovario, músculo esquelético, corazón, cuello de útero, tiroides, mama, placenta, corteza suprarrenal, riñón, vena cava, trompa de Falopio, páncreas, testículo, yeyuno, aorta, esófago, próstata, estómago, bazo, íleon, tráquea, cerebro, colon, timo, intestino delgado, vejiga y duodeno (A-H 5-6 y A-G 7-8)]. El clon STAR que representa la SEQ ID NO. 85 se marcó con 32P y se hibridó a la macromatriz. Los resultados de hibridación obtenidos confirman su inducción en todas las muestras de osteoclastos humanos al ser la expresión generalmente más alta en los osteoclastos más maduros (A-F 2-4) que en los precursores (A1-F1) y haber poca o ninguna expresión en todos o la mayor parte de los tejidos normales (A-H 5-6 y A-G 7-8), y;
La figura 39 es un dibujo de los resultados de hibridación de macromatrices y de la cuantificación de la intensidad de las señales que muestran los datos de expresión diferencial para la SEQ ID NO. 86 humana específica de los osteoclastos del STAR correspondiente. Se prepararon las macromatrices por amplificación del RNA con RAMP a partir de células precursoras humanas (A-F 1) y osteoclastos diferenciados intermedios y maduros de cuatro donantes humanos (A-F 2-4) y 30 tejidos humanos normales diferentes [glándula suprarrenal, hígado, pulmón, ovario, músculo esquelético, corazón, cuello de útero, tiroides, mama, placenta, corteza suprarrenal, riñón, vena cava, trompa de Falopio, páncreas, testículo, yeyuno, aorta, esófago, próstata, estómago, bazo, íleon, tráquea, cerebro, colon, timo, intestino delgado, vejiga y duodeno (A-H 5-6 y A-G 7-8)]. El clon STAR que representa la SEQ ID NO. 86 se marcó con 32P y se hibridó a la macromatriz. Los resultados de hibridación obtenidos confirman su inducción en todas las muestras de osteoclastos humanos al ser la expresión generalmente más alta en los osteoclastos más maduros (A-F 2-4) que en los precursores (A1-F1) y haber poca o ninguna expresión en todos o la mayor parte de los tejidos normales (A-H 5-6 y A-G 7-8).
Descripción de las realizaciones ilustrativas
El solicitante empleó una estrategia cuidadosamente planificada para identificar y aislar secuencias genéticas implicadas en la osteoclastogénesis y la remodelación ósea. El proceso implicó las etapas siguientes: 1) preparación de genotecas de cDNA muy representativas a partir del mRNA aislado de precursores y osteoclastos diferenciados intermedios y maduros de origen humano; 2) aislamiento de las secuencias inducidas durante la osteoclastogénesis; 3) identificación y caracterización de secuencias inducidas; 4) selección de secuencias inducidas para la especificidad del tejido; y 5) determinación de los efectos bloquadores de la osteoclastogénesis. Los resultados explicados en esta descripción muestran la ventaja de actuar selectivamente sobre genes de osteoclastos que son específicos de este tipo de células diferenciadas y proporcionar un procedimiento de escrutinio más eficaz para estudiar la base genética de enfermedades y trastornos. Los genes que se sabe que intervienen en otras áreas de la biología se ha demostrado que desempeñan una función crítica en la osteoclastogénesis y en el funcionamiento de los osteoclastos. Los genes que se conocen, pero a los que no se les había asignado una función hasta la presente descripción, también se han aislado y presentan una función crítica en la osteoclastogénesis y en el funcionamiento de los osteoclastos. Finalmente, se han identificado nuevos genes que intervienen en el proceso; sin embargo, el solicitante reserva su descripción hasta que se hayan completado más estudios.
La presente invención se ilustra con más detalle a continuación de una manera no limitante.
A. - Material y métodos
Se utilizaron reactivos disponibles en el mercado que se citan en la presente invención de acuerdo con las instrucciones del proveedor, a menos que se indique de otra manera. A lo largo de la presente descripción se prepararon determinados materiales de partida del siguiente modo:
B. - Preparación de las células diferenciadas en osteoclastos
La línea celular RAW 264.7 (RAW) precursora de osteoclastos y las células precursoras humanas (linfocitos mononucleados de la sangre periférica o progenitores CD34+) se conocen bien en la técnica como modelos humanos y murinos de la osteoclastogénesis. Estos osteoclastos humanos y murinos son, por consiguiente, excelentes fuentes de material para aislar y caracterizar los genes especializados en el funcionamiento de los osteoclastos.
Los osteoclastos primarios humanos se diferenciaron a partir de linfocitos mononucleados de la sangre periférica movilizados por el G-CSF (Cambrex, East Rutherdord, NJ) como describe el proveedor en presencia de M-CSF a 35 ng/ml y de ligando de RANK a 100 ng/ml. Los osteoclastos plurinucleados teñidos con TRAP fueron visibles a los 11­ 14 días. Los osteoclastos también procedían de las células precursoras de osteoclastos humanos (progenitores CD34+) (Cambrex, East Rutherford, NJ) y se cultivaron como describe el proveedor. En el último caso, los osteoclastos se obtuvieron después de 7 días.
Las células RAW se compraron a la American Type Culture Collection y se mantuvieron en DMEM con glucosa alta que contenía suero bovino fetal al 10% y antibióticos. Las células se subcultivaron bisemanalmente un máximo de 10-12 pases. Para los experimentos de diferenciación de los osteoclastos, las células RAW se sedimentaron en placas de 96 pocillos a una densidad de 4 x 103 células/pocillo y se dejaron multiplicar durante 24 horas. La diferenciación se indujo en DMEM con glucosa alta, suero bovino fetal tratado con carbón vegetal al 10% (Hyclone, Logan, UT), SAB al 0,05%, antibióticos, factor estimulador de las colonias de macrófagos (M-CSF) a 10 ng/ml y ligando del receptor activador de NF- k B (RANK) a 100 ng/ml. Las placas se realimentaron el día 3 y los osteoclastos se vieron con claridad el día 4. Típicamente, a las células se les tiñó la fosfatasa ácida resistente a tartrato (TRAP, por su nombre en inglés) el día 4 o 5 a menos que se indicase de otra manera. Para la tinción con TRAP, las células se lavaron con PBS y se fijaron en formaldehído al 10% durante 1 hora. Después de dos lavados con PBS, las células se volvieron ligeramente permeables en Triton X-100 al 0,2% en PBS durante 5 min antes de lavarlas en PBS. La tinción se llevó a cabo a 37 °C durante 20-25 minutos en fosfato de naftol AS-MX al 0,01%, Fast Red Violet al 0,06%, tartrato de sodio a 50 mM, acetato de sodio a 100 mM, pH 5,2. Las células se visualizaron al microscopio.
C. - Procedimiento para aislar el mRNA expresado diferencialmente
Algo clave al descubrimiento de secuencias expresadas diferencialmente que serán únicas para los osteoclastos es el uso de la tecnología STAR patentada por el solicitante (Substractive Transcription-based Amplification of mRNA; patente de los EE.UU. n.° 5712127, Malek et al., registrada el 27 de enero de 1998). En este procedimiento, el mRNA aislado de los osteoclastos intermedios y maduros se utiliza para preparar el «RNA problema» que se hibrida al «DNA sustractor» monocatenario complementario preparado a partir del mRNA de los precursores de osteoclastos y sólo se recupera el «RNA problema» sin hibridar, y se utiliza para crear genotecas de cDNA clonado, denominadas «genotecas sustractivas». Por lo tanto, las «genotecas sustractivas» están enriquecidas en secuencias expresadas diferencialmente que incluyen mRNA nuevos y raros que a menudo no se detectan en el análisis de hibridación de micromatrices. Estos mRNA nuevos y raros se cree que son representativos de importantes dianas génicas para el desarrollo de mejores estrategias diagnósticas y terapéuticas.
Los clones contenidos en las «genotecas sustractivas» se identifican mediante el análisis de la secuencia del DNA y su posible función se evalúa mediante la adquisición de la información disponible en las bases de datos públicas (NCBI y GeneCard). Los clones no redundantes luego se utilizan para preparar micromatrices de DNA, que se utilizan para cuantificar sus patrones de expresión diferencial relativa mediante la hibridación en sondas de cDNA fluorescente. Se pueden utilizar dos clases de sondas de cDNA, las que se generan de transcritos de RNA preparados de las mismas genotecas sustractivas (sondas sustractivas), o bien de mRNA aislado de diferentes muestras de osteoclastos (sondas estándares). El uso de las sondas sustractivas proporciona mayor sensibilidad para detectar las secuencias de mRNA poco abundantes que se preservan y enriquecen mediante STAR. Además, la especificidad de las secuencias expresadas diferencialmente en los osteoclastos se mide mediante la hibridación de sondas radiomarcadas preparadas de cada secuencia seleccionada en macromatrices que contienen RNA de diferentes muestras de osteoclastos y diferentes tejidos humanos normales. Adicionalmente, el análisis de transferencia Northern se realiza para confirmar la presencia de una o más especies de mRNA específico en las muestras de osteoclastos. Después de esto, los cDNA de longitud completa representativos de las especies de mRNA y/o variantes de ayuste se clonan en E. coli DH10B.
Un desafío importante en el perfil de expresión génica es la poca cantidad de RNA disponible para el análisis molecular. La cantidad de RNA aislado de muchas muestras de osteoclastos o especímenes humanos (aspiración con aguja, muestras de microdisección de captura con láser (LCM, por su nombre en inglés) y cultivos de células transfectadas) a menudo es insuficiente para preparar: 1) materiales sustractor y problema convencionales para STAR; 2) sondas de cDNA estándares para el análisis de micromatrices de DNA; 3) macromatrices del RNA para evaluar la especificidad de la expresión, 4) análisis de transferencia Northern y 5) clones de cDNA completos para la posterior validación y caracterización biológicas, etc. Así pues, el solicitante ha desarrollado una tecnología propietaria llamada RAMP (Procedimiento de amplificación del RNA) (solicitud de patente de los EE.UU. n.° 11/000958 publicada con el n.° de patente de los EE.UU. US 2005/0153333A1 el 14 de julio de 2005 y titulada «Selective Terminal Tagging of Nucleic Acids»), que amplifica de forma lineal el mRNA contenido de las muestras de RNA total y produce cantidades del orden de microgramos de RNA amplificado, suficiente para las diferentes aplicaciones analíticas. El RNA producido por RAMP son secuencias de tipo mRNA de longitud completa como resultado del procedimiento propietario para añadir una etiqueta de secuencia terminal a los extremos 3' de las moléculas de cDNA monocatenario, para el uso en la amplificación lineal de la transcripción. Más del 99,5% de las secuencias amplificadas en las reacciones de RAMP muestran una variabilidad de < 2 veces y, por lo tanto, la RAMP proporciona muestras de RNA sin sesgo en cantidad suficiente para permitir el descubrimiento de secuencias de mRNA únicas implicadas en la osteoclastogénesis.
D.- Preparación de una genoteca sustractiva de osteoclastos humanos
Dos células precursoras primarias humanas de dos donantes diferentes (Cambrex, East Rutherford, NJ) y los osteoclastos correspondientes intermedios (día 3 y día 7) y maduros (días 11 a 14) se prepararon como se describe más arriba. El aislamiento del RNA celular seguido de la purificación del mRNA de cada uno se realizó mediante los procedimientos estándares (Qiagen, Mississauga, ON). Siguiendo las enseñanzas de Malek et al. (patente de los EE.UU. n.° 5712127), se utilizaron 2 pg de mRNA poli-A+ de cada muestra para preparar genotecas de cDNA muy representativas (> 2 x 106 UFC) en vectores plasmídicos especializados necesarios para preparar materiales del problema y del sustractor. En cada caso, la primera cadena de cDNA se sintetizó con un cebador de oligo-dTn con nucleótidos de cierre en 3' (p. ej., A, G o C) y que contiene un sitio de reconocimiento para Notl. A continuación se sintetizó la segunda cadena del cDNA de acuerdo con el procedimiento del fabricante para la síntesis de cDNA bicatenario (Invitrogen, Burlington, ON) y el cDNA bicatenario resultante se ligó a los conectores que contenían un sitio de reconocimiento para Ascl (New England Biolabs, Pickering, ON). Luego, los cDNA bicatenarios se digirieron con las enzimas de restricción Ascl y Notl (New England Biolabs, Pickering, ON), se purificaron del exceso de conectores mediante una columna de fraccionamiento del cDNA de Invitrogen (Burlington, ON) como especifica el fabricante y se ligó cada uno en vectores plasmídicos especializados: p14 ( SEQ ID NO. 36) y p17+ ( SEQ ID NO.
37) utilizados para preparar los materiales del problema y del sustractor, respectivamente. A partir de aquí, los cDNA ligados se introdujeron por transformación en E. coli DH10B para dar lugar a las genotecas de cDNA deseadas (RAW 264.7-precursor-p14, RAW 264.7-precursor-p17+, RAW 264.7-osteoclastos-p14 y RAW 264.7-osteoclastosp17+). Se purificó el conjunto de DNA plasmídico de cada genoteca de cDNA y se linealizaron alícuotas de 2 pg de cada uno con la enzima de restricción NotI. Entonces se realizó la transcripción in vitro de las genotecas plasmídicas en p14 y p17+ digeridas con NotI mediante la RNA polimerasa de T7 y la RNA polimerasa de SP6, respectivamente (Ambion, Austin, TX).
Después, para preparar las genotecas del problema y del sustractor con representación del 3', una alícuota de 10 pg de cada uno de los RNA sintetizados in vitro se convirtió en cDNA bicatenario mediante la síntesis de la primera cadena del cDNA como se describe más arriba seguido de la síntesis de la segunda cadena del DNA dirigida por cebadores [cebador OGS 77 para p14 ( SEQ ID NO. 40) y cebador OGS 302 para p17+ ( SEQ ID NO. 41)] mediante la Taq polimerasa Advantage-2 (BD Biosciences Clontech, Mississauga, ON). Las secuencias que corresponden a OGS 77 y OGS 302 se introdujeron en el RNA sintetizado in vitro por medio de los vectores especializados utilizados para preparar las genotecas de cDNA. A continuación se digirieron 6 alícuotas de 1 pg de cada cDNA bicatenario por separado con una de las siguientes enzimas de restricción que reconocen 4 bases RsaI, Sau3A1, MseI, MspI, MinPII y Bsh1236I (MBI Fermentas, Burlington, ON), lo que produce hasta seis posibles fragmentos en 3' para cada una de las especies de RNA contenidas en la genoteca de cDNA. Después de la digestión, las enzimas de restricción se inactivaron con fenol y se agrupó el conjunto de seis reacciones. Entonces, los sitios de las enzimas de restricción se hicieron romos con la DNA polimerasa de T4 y se ligaron a conectores que contenían un sitio de reconocimiento para AscI. Cada muestra de DNA agrupada adaptada con el conector se digirió con las enzimas de restricción AscI y NotI, se desalaron y se ligaron a los vectores plasmídicos especializados p14 y p17 (el vector plasmídico p17 es similar al vector plasmídico p17+, salvo la parte de la secuencia corresponde a SEQ ID NO. 41) y se introdujeron por transformación en E. coli DH10B. Se purificó (Qiagen, Mississauga, ON) el conjunto de DNA plasmídico para cada genoteca de representación de 3' en p14 y p17 y se digirió con la enzima de restricción Notl una alícuota de 2 pg de cada uno, y se transcribió in vitro bien con la RNA polimerasa de T7 o con la RNA polimerasa de SP6 (Ambion, Austin, TX). El RNA de representación de 3' en p14 se utilizó directamente como «RNA problema», mientras que el RNA de representación de 3' en p17 se utilizó para sintetizar el cDNA monocatenario como se describe más arriba, que luego se sirvió como «DNA sustractor». Cada reacción con el «DNA sustractor» se trató con RNasa A y RNasa H para retirar el RNA, se extrajeron con fenol y se desalaron antes de su uso.
Se prepararon las siguientes genotecas de representación de 3':
Problema 1 (donante 1 - osteoclasto intermedio humano a día 3)-3' en p14
Problema 2 (donante 1 - osteoclasto intermedio humano a día 7)-3' en p14
Problema 3 (donante 1 - osteoclasto maduro humano a día 11 )-3' en p14
Problema 4 (donante 2 - osteoclasto intermedio humano a día 3)-3' en p14
Problema 5 (donante 2 - osteoclasto intermedio humano a día 7)-3' en p14
Problema 6 (donante 2 - osteoclasto maduro humano a día 13)-3' en p14
Sustractor 1 (donante 1- precursor humano a día 3)-3' en p17
Sustractor 2 (donante 2 - precursor humano a día 3)-3' en p17
Las muestras del RNA problema se sustrajeron siguiendo las enseñanzas de la patente de los EE.UU. n.° 5712127 con el correspondiente DNA sustractor en una proporción de 1:100 para 1 o 2 rondas siguiendo las enseñanzas de Malek et al. (patente de los EE.UU. n.° 5712127). Adicionalmente se prepararon las reacciones de control que contenían el RNA problema y ningún DNA sustractor, y el RNA problema más el DNA sustractor sin RNasa H. El RNA problema restante en cada reacción después de la sustracción se convirtió en DNA bicatenario, y se retiró un volumen del 5% y se amplificó en una reacción de PCR estándar durante 30 ciclos para propósitos analíticos. El restante 95% que tenía sólo el sustractor más las muestras sustractivas con RNasa H se amplificó 4 ciclos por PCR, se digirió con las enzimas de restricción Ascl y Notl, y se ligó una mitad con el vector plasmídico pCATRMAN ( SEQ ID NO. 38) y la otra mitad con el vector plasmídico p20 ( SEQ ID NO. 39). Los materiales ligados se introdujeron por transformación en E. coli DH10B y los distintos clones contenidos en las genotecas en pCATRMAN se recogieron para analizarlas más (secuenciación e hibridación del DNA), mientras que los clones contenidos en cada genoteca en p20 se agruparon para su uso como sondas sustractivas. Cada genoteca sustractiva clonada y amplificada 4 ciclos contenía entre 25000 y 40000 colonias.
Se prepararon las siguientes genotecas sustractivas clonadas:
SL90: problema 1 (osteoclasto a día 3) menos sustractor 1 (precursor) (1 ronda) en pCATRMAN;
SL91: problema 2 (osteoclasto a día 7) menos sustractor 1 (precursor) (1 ronda) en pCATRMAN;
SL92: problema 3 (osteoclasto a día 11) menos sustractor 1 (precursor) (1 ronda) en pCATRMAN;
SL108: problema 1 (osteoclasto a día 3) menos sustractor 1 (precursor) (2 rondas) en pCATRMAN;
SL109: problema 2 (osteoclasto a día 7) menos sustractor 1 (precursor) (2 rondas) en pCATRMAN;
SL110: problema 3 (osteoclasto a día 11) menos sustractor 1 (precursor) (2 rondas) en pCATRMAN;
SL93: problema 4 (osteoclasto a día 3) menos sustractor 2 (precursor) (1 ronda) en pCATRMAN;
SL94: problema 5 (osteoclasto a día 7) menos sustractor 2 (precursor) (1 ronda) en pCATRMAN;
SL95: problema 6 (osteoclasto a día 13) menos sustractor 2 (precursor) (1 ronda) en pCATRMAN;
SL87: problema 4 (osteoclasto a día 3) menos sustractor 2 (precursor) (2 rondas) en pCATRMAN;
SL88: problema 5 (osteoclasto a día 7) menos sustractor 2 (precursor) (2 rondas) en pCATRMAN;
SL89: problema 6 (osteoclasto a día 11) menos sustractor 2 (precursor) (2 rondas) en pCATRMAN
Una alícuota de 5 pl de los materiales sustractivos amplificados por PCR de 30 ciclos descritos más arriba se visualizaron en un gel de agarosa al 1,5% que contenía bromuro de etidio y luego se transfirieron a una membrana de nilón Hybond N+ (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) para el análisis de transferencia Southern. Mediante el uso de sondas radiomarcadas específicas del gen CTSK (catepsina K: NM_000396.2), que se sabe que está inducido en los osteoclastos, y la GAPDH (gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa; M32599.1), que es un gen de mantenimiento que no se expresa diferencialmente, fue evidente que había sustracción de la GAPDH, pero no de la CTSK. Basándose en estos resultados, se anticipó que la genotecas sustraídas estaban enriquecidas en las secuencias inducidas de expresión diferencial.
E. - Identificación de las secuencias y anotación de los clones contenidos en las genotecas sustractivas: Se recogieron aleatoriamente en 60 pl de agua esterilizada 6912 colonias independientes contenidas en las genotecas sustraídas en pCATRMAN (SL87-95 y SL108-110) descritas más arriba mediante el uso de un Qbot (Genetix Inc., Boston, MA). A continuación, 42 pl de cada una se utilizaron en una reacción de PCR estándar de 100 pl que contenía los cebadores oligonucleotídicos OGS 1 y OGS 142 y se amplificaron durante 40 ciclos [94 °C durante 10 minutos, 40x (94 °C durante 40 s, 55 °C durante 30 s y 72 °C durante 2 min) seguido de 72 °C durante 7 min] en placas de microtitulación de 96 pocillos mediante la Taq polimerasa HotStart™ (Qiagen, Mississauga, ON). Las reacciones de PCR completadas se desalaron en placas de filtro de 96 pocillos (Corning) y se recuperaron los amplicones en 100 pl de Tris a 10 mM (pH 8,0). Una alícuota de 5 pl de cada reacción de PCR se visualizó en un gel de agarosa al 1,5% que contenía bromuro de etidio y se seleccionaron sólo las reacciones que contenían un único producto amplificado para analizarles la secuencia del DNA mediante la secuenciación estándar de DNA realizada en un instrumento ABI 3100 (Applied Biosystems, Foster City, CA). A cada secuencia de DNA obtenida se le dio un número de identificación de secuencia y se introdujo en una base de datos para el posterior rastreo y anotación. Cada secuencia se sometió al análisis de BLAST con bases de datos públicas (p. ej., NCBI). Entre estas secuencias no se encontraban los genes de mantenimiento estándares (GAPDH, actina, la mayoría de proteínas ribosómicas, etc.), lo cual era una buena indicación de que la genoteca sustractiva carecía de al menos las secuencias relativamente abundantes que no se expresaban diferencialmente.
Una vez que se completó la secuenciación y anotación de los clones seleccionados, la siguiente etapa implicó la identificación de las secuencias que estaban realmente inducidas en los osteoclastos en comparación con los precursores.
F. - Análisis de hibridación para identificar secuencias inducidas
Los amplicones de PCR que representan las secuencias anotadas de las genotecas en pCATRMAN descritas más arriba se utilizaron para preparar micromatrices de DNA. Se liofilizaron los amplicones de PCR purificados contenidos en 70 pl de las reacciones de PCR preparadas en el apartado anterior y cada uno se reconstituyó en 20 pl de la solución de depósito que comprende SSC a 3X y sarcosil al 0,1%. Entonces se prepararon las micromatrices de DNA de cada amplicón por triplicado sobre soportes CMT-GAP2 (Corning, Corning, NY) mediante el depositador GSM 417 (Affymetrix, Santa Clara, CA).
A continuación, las micromatrices de DNA se hibridaron con sondas de cDNA marcadas con cy3 y cy5 sustractivas o estándares, como recomienda el proveedor (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Las sondas de cDNA estándares se sintetizaron a partir del RNA amplificado con RAMP preparado de las diferentes muestras de osteoclastos humanos y los correspondientes precursores. El experto en la técnica sabe perfectamente que las sondas de cDNA estándares sólo proporcionan una escasa sensibilidad de detección y, en consecuencia, las secuencias poco abundantes contenidas en la sondas de cDNA no se suelen detectar. Así pues, el análisis de hibridación también se realizó con sondas de cDNA sustractivas marcadas con cy3 y cy5 obtenidas de genotecas sustractivas que representan los diferentes materiales problema y sustractor. Estas genotecas sustractivas pueden estar enriquecidas en las secuencias poco abundantes como resultado de seguir las enseñanzas de Malek et al., y por lo tanto, pueden proporcionar una mayor sensibilidad de detección.
Todas las reacciones de hibridación se realizaron mediante el procedimiento de intercambio de fluoróforos como recomienda el proveedor (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) y para el análisis posterior se seleccionaron aproximadamente 500 secuencias inducidas (> 2 veces) de posible expresión diferencial.
G. - Determinación de la especificidad de osteoclasto para las secuencias expresadas diferencialmente que se han identificado:
Las secuencias expresadas diferencialmente identificadas en el apartado F para las diferentes genotecas sustractivas de osteoclastos humanos se comprobó si eran específicas de osteoclasto mediante la hibridación a macromatrices basadas en la membrana de nilón. Las macromatrices se prepararon con el RNA amplificado con RAMP a partir de precursores y osteoclastos (intermedios y maduros) humanos de seis experimentos independientes de 4 donantes diferentes (3 varones y 1 mujer) y 30 tejidos humanos normales (glándula suprarrenal, hígado, pulmón, ovario, músculo esquelético, corazón, cuello, tiroides, mama, placenta, corteza suprarrenal, riñón, vena cava, trompa de Falopio, páncreas, testículo, yeyuno, aorta, esófago, próstata, estómago, bazo, íleon, tráquea, cerebro, colon, timo, intestino delgado, vejiga y duodeno) comprados en el mercado (Ambion, Austin, TX). Debido a la poca cantidad de mRNA disponible para muchas de estas muestras, fue necesario primero amplificar el mRNA mediante la metodología RAMP. Cada muestra de RNA amplificado se reconstituyó a una concentración final de 250 ng/pl en SSC a 3X y sarcosil al 0,1% en una placa de microtitulación de 96 pocillos y se depositó 1 pl sobre membranas de nilón Hybond N+ mediante el aparato MULTIPRINT™ (VP Scientific, San Diego, CA), se secó al aire y se entrecruzó con luz UV. Se radiomarcaron por separado con a-32P-dCTP 400 secuencias diferentes seleccionadas entre L87-95 y SL108-110 mediante el procedimiento de cebado aleatorio recomendado por el proveedor (Amersham, Piscataway, NJ) y se utilizaron como sondas en las macromatrices. Las etapas de hibridación y lavado se realizaron siguiendo los procedimientos estándares bien conocidos por los expertos en la técnica.
De las 500 secuencias ensayadas, aproximadamente el 85% se encontró que estaban inducidas en todas las muestras de RNA de osteoclastos que se utilizaron para preparar las macromatrices. Sin embargo, muchas de estas secuencias se detectaron también con facilidad en la mayoría de los tejidos humanos normales diferentes. Basándose en estos resultados, se eliminaron las secuencias que parecían estar asociadas a la variabilidad experimental y las que se detectaron en muchos de los demás tejidos humanos a un nivel significativamente elevado. En consecuencia, para los estudios de validación biológica sólo se seleccionaron las 35 secuencias que parecían estar inducidas y ser muy específicas de los osteoclastos. En este conjunto de 35 genes se incluyen 4 ( SEQ ID NO. 30-33) en los que se detectó una inducción significativa en los osteoclastos maduros en comparación con la mayoría de los tejidos normales, pero dado que la expresión de estos genes era en conjunto menor en las células precursoras, parecieron aumentar en los tejidos normales después de la cuantificación (figura 30-33, gráfico de barras). Sin embargo, su expresión en los tejidos normales era todavía relativamente más baja que en los osteoclastos maduros. Así pues, estos genes pueden ser todavía reguladores importantes de la osteoclastogénesis y de la osteoclasia y, por lo tanto, se seleccionaron para la validación biológica. Este subconjunto de 35 secuencias no incluía otros genes que ya se habían identificado, tales como CTSK, TRAP, MMP9, CST3 y CKB entre otros, dado que en la bibliografía ya se había descrito previamente que se inducían en los osteoclastos. Los datos de las macromatrices para CST3 ( SEQ ID NO. 34) se incluyen para ejemplificar el patrón de hibridación y la especificidad de un gen que ya se sabe que es un regulador clave del proceso de resorción de los osteoclastos. Un gen (ANKH; SEQ ID NO. 17) se incluyó en el subconjunto de 35 genes aunque estaba descrito previamente en las bases de datos (NCBI-Gene) que su función estaba en la mineralización ósea. Sin embargo, el fenotipo óseo observado como resultado de las mutaciones en el gen ANKH no estaba conectado específicamente a su inducción en los osteoclastos. Así pues, nuestros datos sugieren que la importante función de ANKH puede estar asociada a la actividad de los osteoclastos durante la remodelación ósea.
Las figuras 1 -33, 38 y 39 muestran los patrones de las macromatrices y la cuantificación de la señales de hibridación de los osteoclastos y los tejidos humanos normales respecto a células precursoras para las 35 secuencias seleccionadas para la validación biológica. Entre las 35 secuencias seleccionadas había 24 genes con una anotación funcional, 9 genes sin ninguna anotación funcional y 2 secuencias nuevas (hitos genómicos). La identificación de los productos génicos implicados en la regulación de la diferenciación y del funcionamiento de los osteoclastos ha conducido pues al descubrimiento de nuevas dianas para el desarrollo de nuevos tratamientos específicos de estados patológicos caracterizados por la remodelación ósea anormal. Las secuencias representativas recogidas en la tabla 1 se presentan a continuación y las correspondientes secuencias se ilustran en la tabla 5.
SEQ ID NO. 1:
La SEQ ID NO. 1 (tabla 5) corresponde a un gen previamente identificado que codifica una proteína hipotética, LOC284266 de función desconocida (véase la tabla 1). Hemos demostrado que este gen está notablemente inducido en los osteoclastos intermedios y maduros en comparación con las células precursoras y los otros tejidos humanos normales (figura 1), lo que no se había descrito anteriormente. Por lo tanto, se cree que este gen podría ser necesario para la osteoclastogénesis y/o la remodelación ósea.
SEQ ID NO. 2:
La SEQ ID NO. 2 (tabla 5) corresponde a un gen previamente identificado que codifica un marco abierto de lectura predicho, C6orf82, de función desconocida (véase la tabla 1). Hemos demostrado que este gen está notablemente inducido en los osteoclastos intermedios y maduros en comparación con las células precursoras y los otros tejidos humanos normales (figura 2), lo que no se había descrito anteriormente. Se han identificado hasta ahora al menos 5 variantes de transcripción de este gen que codifican las 3 isoformas proteicas que se habían identificado hasta ahora (NCBI). Por lo tanto, se cree que este gen podría ser necesario para la osteoclastogénesis y/o la remodelación ósea. SEQ ID NO. 3:
La SEQ ID NO. 3 (tabla 5) corresponde a un gen previamente identificado que codifica una proteína hipotética, LOC133308, de función desconocida (véase la tabla 1), pero que puede estar implicado en el proceso de regulación del pH. Hemos demostrado que este gen está notablemente inducido en los osteoclastos intermedios y maduros en comparación con las células precursoras y los otros tejidos humanos normales (figura 3), lo que no se había descrito anteriormente. Por lo tanto, se cree que este gen podría ser necesario para la osteoclastogénesis y/o la remodelación ósea.
SEQ ID NO. 4:
La SEQ ID NO. 4 (tabla 5) corresponde a un gen previamente identificado que codifica una proteína hipotética, LOC116211, de función desconocida (véase la tabla 1). Hemos demostrado que este gen está notablemente inducido en los osteoclastos intermedios y maduros en comparación con las células precursoras y los otros tejidos humanos normales (figura 4), lo que no se había descrito anteriormente. Por lo tanto, está implícito que este gen podría ser necesario para la osteoclastogénesis y/o la remodelación ósea.
SEQ ID NO. 5:
La SEQ ID NO. 5 (tabla 5) corresponde a un gen previamente identificado que codifica una proteína predicha, LOC151194 (similar al antígeno HCA557b asociado al carcinoma hepático), de función desconocida (véase la tabla 1). Hemos demostrado que este gen está notablemente inducido en los osteoclastos intermedios y maduros en comparación con las células precursoras y los otros tejidos humanos normales (figura 5), lo que no se había descrito anteriormente. Por consiguiente, se cree que este gen podría ser necesario para la osteoclastogénesis y/o la remodelación ósea.
SEQ ID NO. 6:
La SEQ ID NO. 6 (tabla 5) corresponde a un gen previamente identificado que codifica una proteína, el ligando 5 de quimiocinas con motivo C-X-C (CXCL5), que es una quimiocina inflamatoria que pertenece a la familia de las quimiocinas CXC (véase la tabla 1). Hemos demostrado que este gen está notablemente inducido en los osteoclastos maduros en comparación con las células precursoras y los otros tejidos humanos normales (figura 6), lo que no se había descrito anteriormente. Por lo tanto, se cree que este gen podría ser necesario para la osteoclastogénesis y/o la remodelación ósea.
SEQ ID NO. 7:
La SEQ ID NO. 7 (tabla 5) corresponde a un gen previamente identificado que codifica una proteína, ATPasa, la proteína accesoria lisosómica 2 transportadora de H+ (ATP6AP2), que está asociada a las adenosina trifosfatasas (ATPasas). Las ATPasas transportadoras de protones tienen funciones fundamentales en la conservación de la energía, en el transporte activo secundario, en la acidificación de los compartimentos intracelulares y en la homeostasis del pH celular (véase la tabla 1). Hemos demostrado que este gen está notablemente inducido en los osteoclastos maduros en comparación con las células precursoras y los otros tejidos humanos normales (figura 7), lo que no se había descrito anteriormente. Por lo tanto, se cree que este gen podría ser necesario para la osteoclastogénesis y/o la remodelación ósea.
SEQ ID NO. 8:
La SEQ ID NO. 8 (tabla 5) corresponde a un gen previamente identificado que codifica una proteína, la la proteína 1 de tipo proteasa 12 específica de ubicuitina (USP12), que está asociada al catabolismo proteico dependiente de la ubicuitina (véase la tabla 1). Hemos demostrado que este gen está notablemente inducido en los osteoclastos intermedios y maduros en comparación con las células precursoras y los otros tejidos humanos normales (figura 8), lo que no se había descrito anteriormente. Por lo tanto, se cree que este gen podría ser necesario para la osteoclastogénesis y/o la remodelación ósea.
SEQ ID NO. 9:
La SEQ ID NO. 9 (tabla 5) corresponde a un gen previamente identificado que codifica una proteína, la isoforma 1 de la enzima E2E de conjugación a la ubicuitina (homóloga de UBC4/5, levadura) (UBE2E1), que está asociada al catabolismo proteico dependiente de la ubicuitina (véase la tabla 1). Hasta ahora se han descrito 2 variantes de transcripción e isoformas de la proteína para este gen. Hemos demostrado que este gen está notablemente inducido en los osteoclastos maduros en comparación con las células precursoras y los otros tejidos humanos normales (figura 9), lo que no se había descrito anteriormente. Por lo tanto, se cree que este gen podría ser necesario para la osteoclastogénesis y/o la remodelación ósea.
SEQ ID NO. 10:
La SEQ ID NO. 10 (tabla 5) corresponde a un gen previamente identificado que codifica una proteína, la proteína de tipo proteína fijadora de emopamilo (EBPL), que puede tener actividad colestenol A-isomerasa (véase tabla 1). Hemos demostrado que este gen está notablemente inducido en los osteoclastos intermedios y maduros en comparación con las células precursoras y los otros tejidos humanos normales (figura 10), lo que no se había descrito anteriormente. Por lo tanto, se cree que este gen podría ser necesario para la osteoclastogénesis y/o la remodelación ósea.
SEQ ID NO. 11
La SEQ ID NO. 11 (tabla 5) corresponde a un gen previamente identificado que codifica una proteína, el factor 1 potenciador de la diferenciación y del desarrollo (DDEF1), que puede estar implicado en la movilidad y en la adhesión celulares (véase la tabla 1). Hemos demostrado que este gen está notablemente inducido en los osteoclastos intermedios y maduros en comparación con las células precursoras y los otros tejidos humanos normales (figura 11), lo que no se había descrito anteriormente. Por consiguiente, se cree que este gen podría ser necesario para la osteoclastogénesis y/o la remodelación ósea.
S E Q ID NO. 12
La SEQ ID NO. 12 (tabla 5) corresponde a un gen previamente identificado que codifica una proteína, el miembro 7 de la familia SLAM (SLAM7), que puede tener actividad receptora y estar implicado en la adhesión celular, pero todavía no está caracterizado completamente (véase la tabla 1). Hemos demostrado que este gen está notablemente inducido en los osteoclastos maduros en comparación con las células precursoras y los otros tejidos humanos normales (figura 12), lo que no se había descrito anteriormente. Por lo tanto, se cree que este gen podría ser necesario para la osteoclastogénesis y/o la remodelación ósea.
SEQ ID NO. 13
La SEQ ID NO. 13 (tabla 5) corresponde a un gen previamente identificado que codifica una proteína, la enzima E2E 3 de conjugación a la ubicuitina (homólogo a UBC4/5, levadura) (UBE2E3), que está asociada al catabolismo proteico dependiente de la ubicuitina (véase la tabla 1). Hasta ahora se han documentado 2 variantes de transcripción, que codifican la misma isoforma de la proteína. Hemos demostrado que este gen está notablemente inducido en los osteoclastos maduros en comparación con las células precursoras y los otros tejidos humanos normales (figura 1), lo que no se había descrito anteriormente. Por lo tanto, se cree que este gen podría ser necesario para la osteoclastogénesis y/o la remodelación ósea.
SEQ ID NO. 14
La SEQ ID NO. 14 (tabla 5) corresponde a un gen previamente identificado que codifica una proteína, galanina (GAL), que está asociada a la actividad de hormona neuropeptídica (véase la tabla 1). Hemos demostrado que este gen está notablemente inducido en los osteoclastos intermedios y maduros en comparación con las células precursoras y los otros tejidos humanos normales excepto para el colon (figura 14), lo que no se había descrito anteriormente. Por lo tanto, se cree que este gen podría ser necesario para la osteoclastogénesis y/o la remodelación ósea.
SEQ ID NO. 15
La SEQ ID NO. 15 (tabla 5) corresponde a un gen previamente identificado que codifica una proteína, el factor n-pac nuclear de tipo citocina (N-PAC), que puede tener actividad oxidorreductasa (véase la tabla 1). Hemos demostrado que este gen está notablemente inducido en los osteoclastos intermedios y maduros en comparación con las células precursoras y los otros tejidos humanos normales (figura 15), lo que no se había descrito anteriormente. Sin embargo, se observó algo de sobreexpresión de este gen, aunque por debajo de la de los osteoclastos maduros, en corazón, trompa de Falopio, bazo y cuello de útero. Por lo tanto, se cree que este gen podría ser necesario para para la osteoclastogénesis y/o la remodelación ósea.
SEQ ID NO. 16
La SEQ ID NO. 16 (tabla 5) corresponde a un gen previamente identificado que codifica una proteína, la integrina a X (antígeno CD11C (p150), polipéptido a) (ITGAX), que está implicada en la adhesión celular y en la fijación de iones (véase la tabla 1). Hemos demostrado que este gen está notablemente inducido en los osteoclastos intermedios y maduros en comparación con las células precursoras y los otros tejidos humanos normales (figura 16), lo que no se había descrito anteriormente. Se observa que este gen presenta una expresión mínima, aunque mucho más baja que en los osteoclastos maduros, en la glándula suprarrenal, pulmón y bazo entre los tejidos normales. Por lo tanto, se cree que este gen podría ser necesario para la osteoclastogénesis y/o la remodelación ósea.
SEQ ID NO. 17:
La SEQ ID NO. 17 (tabla 5) corresponde a un gen previamente identificado que codifica una proteína, homóloga de la anquilosis progresiva (ratón) (ANKH), que está implicada en la regulación de los niveles de pirofosfato, y se sugiere que es un posible mecanismo de regulación de la calcificación del tejido (véase la tabla 1). Hemos demostrado que este gen está notablemente inducido en los osteoclastos intermedios y maduros en comparación con las células precursoras y los otros tejidos humanos normales (figura 17), lo que no se había descrito anteriormente. Sin embargo, se ha descrito que este gen está implicado en la mineralización ósea, pero sin pruebas de su inducción en los osteoclastos (Malkin et al., 2005). Por lo tanto, se cree que este gen podría ser necesario para la osteoclastogénesis y/o la remodelación ósea.
SEQ ID NO. 18:
La SEQ ID NO. 18 (tabla 5) corresponde a un gen previamente identificado que codifica una proteína, ATPasa, V1 subunidad A transportadora de H+ y lisosómica de 70 kDa, que está implicada en un mecanismo rotacional de actividad ATPasa transportadora de hidrógeno (véase la tabla 1). Hemos demostrado que este gen está notablemente inducido en los osteoclastos maduros en comparación con las células precursoras y los otros tejidos humanos normales (figura 18), lo que no se había descrito anteriormente. Por consiguiente, se cree que este gen podría ser necesario para la osteoclastogénesis y/o la remodelación ósea.
S E Q ID NO. 19
La SEQ ID NO. 19 (tabla 5) corresponde a un gen previamente identificado que codifica un marco abierto de lectura que codifica la proteína FLJ10874 (marco abierto de lectura 75 del cromosoma 1), que no tiene una función conocida (véase la tabla 1). Hemos demostrado que este gen está notablemente inducido en los osteoclastos maduros en comparación con las células precursoras y los otros tejidos humanos normales (figura 19), lo que no se había descrito anteriormente. Por consiguiente, se cree que este gen podría ser necesario para la osteoclastogénesis y/o la remodelación ósea.
SEQ ID NO. 20
La SEQ ID NO. 20 (tabla 5) corresponde a un gen previamente identificado que codifica una proteína, la proteína 1 fijadora de la integrina p1 (ITGB1BP1), que tiene una función importante durante la adhesión celular dependiente de integrinas (véase la tabla 1). Se han aislado dos variantes de transcripción e isoformas de la proteína para este gen. Hemos demostrado que este gen está notablemente inducido en los osteoclastos maduros en comparación con las células precursoras y los otros tejidos humanos normales (figura 20), lo que no se había descrito anteriormente. Por lo tanto, se cree que este gen podría ser necesario para la osteoclastogénesis y/o la remodelación ósea.
SEQ ID NO. 21:
La SEQ ID NO. 21 (tabla 5) corresponde a un gen previamente identificado que codifica una proteína, la tipo tiorredoxina 5 (TXNL5), que no tiene una función conocida (véase la tabla 1). Hemos demostrado que este gen está notablemente inducido en los osteoclastos intermedios y maduros en comparación con las células precursoras y los otros tejidos humanos normales con la excepción del esófago (figura 21), lo que no se había descrito anteriormente. Por lo tanto, se cree que este gen podría ser necesario para la osteoclastogénesis y/o la remodelación ósea.
SEQ ID NO. 22
La SEQ ID NO. 22 (tabla 5) corresponde a un gen previamente identificado que codifica una proteína, el miembro E de la familia 4 de las lectinas de tipo C (CLECSF9), que no tiene una función específica conocida (véase la tabla 1). Los miembros de esta familia comparten un plegamiento proteico común y tienen funciones diversas, tal como adhesión celular, señalización intercelular, recambio de glucoproteínas y funciones en la inflamación y la respuesta inmunitaria. Hemos demostrado que este gen está notablemente inducido en los osteoclastos maduros en comparación con las células precursoras y los otros tejidos humanos normales, con la excepción del pulmón y el bazo (figura 22), lo que no se había descrito anteriormente. En este punto, no podemos descartar la hibridación cruzada con miembros de la familia en el pulmón y en el bazo. Por consiguiente, se cree que este gen podría ser necesario para la osteoclastogénesis y/o la remodelación ósea.
SEQ ID NO. 23
La SEQ ID NO. 23 (tabla 5) corresponde a un gen previamente identificado que codifica una proteína, RAB33A, miembro de la familia del oncogén RAS (RAB33A), que tiene actividad GTPasa (véase la tabla 1). Hemos demostrado que este gen está notablemente inducido en los osteoclastos intermedios y maduros en comparación con las células precursoras y los otros tejidos humanos normales con la excepción del cerebro (figura 23), lo que no se había descrito anteriormente. Por consiguiente, se cree que este gen podría ser necesario para la osteoclastogénesis y/o la remodelación ósea.
SEQ ID NO. 24
La SEQ ID NO. 24 (tabla 5) corresponde a un gen previamente identificado que codifica una proteína, el gen 1 de la región crítica del síndrome de Down (DSCR1), que interacciona con la calcineurina A e inhibe las vías de señalización dependientes de la calcineurina, lo que posiblemente afecta al desarrollo del sistema nervioso central (véase la tabla 1). Hay 3 variantes de transcripción e isoformas proteicas aisladas hasta la fecha. Hemos demostrado que este gen está notablemente inducido en los osteoclastos intermedios y maduros en comparación con las células precursoras y los otros tejidos humanos normales (figura 24), lo que no se había descrito anteriormente. Por lo tanto, se cree que este gen podría ser necesario para la osteoclastogénesis y/o la remodelación ósea.
SEQ ID NO. 25
La SEQ ID NO. 25 (tabla 5) corresponde a un gen previamente identificado que codifica una proteína, la proteína Ykt6 (YKT6) del grupo SNARE, que es una de las moléculas SNARE de reconocimiento implicadas en el transporte vesicular entre los compartimentos secretores (véase la tabla 1). Hemos demostrado que este gen está notablemente inducido en los osteoclastos maduros en comparación con las células precursoras y los otros tejidos humanos normales (figura 25), lo que no se había descrito anteriormente. Por consiguiente, se cree que este gen podría ser necesario para la osteoclastogénesis y/o la remodelación ósea.
S E Q ID NO. 26
La SEQ ID NO. 26 (tabla 5) corresponde a un gen previamente identificado que codifica una proteína, la actinina al (ACTN1), que es citoesquelética y está implicada en la fijación y la adhesión de la actina (véase la tabla 1). Hemos demostrado que este gen está notablemente inducido en los osteoclastos intermedios y maduros en comparación con las células precursoras y los otros tejidos humanos normales (figura 26), lo que no se había descrito anteriormente. Por consiguiente, se cree que este gen podría ser necesario para la osteoclastogénesis y/o la remodelación ósea.
SEQ ID NO. 27
La SEQ ID NO. 27 (tabla 5) corresponde a un gen previamente identificado que codifica una proteína, el homólogo X de la peptidasa caseinolítica ClpX (E. coli) (CLPX), que puede estar implicada en el recambio proteico (véase la tabla 1). Hemos demostrado que este gen está notablemente inducido en los osteoclastos intermedios y maduros en comparación con las células precursoras y los otros tejidos humanos normales (figura 27), lo que no se había descrito anteriormente. Por lo tanto, se cree que este gen podría ser necesario para la osteoclastogénesis y/o la remodelación ósea.
SEQ ID NO. 28
La SEQ ID NO. 28 (tabla 5) corresponde a un gen previamente identificado que codifica una proteína, la anhidrasa carbónica II (CA2), que tiene actividad carbonato deshidratasa (véase la tabla 1). La falta de esta enzima está asociada a la osteopetrosis y a la acidosis tubular renal (McMahon et al., 2001) y se ha demostrado que está inducida en los osteoclastos maduros en condiciones de pH ácido inducido (Biskobing y Fan, 2000). Hemos demostrado que este gen está notablemente inducido en los osteoclastos intermedios y maduros en comparación con las células precursoras independientemente de las condiciones de pH ácido inducido y de los otros tejidos humanos normales (figura 28), lo que no se había descrito anteriormente. Sin embargo, también se observó la elevada expresión de este gen en el colon y en el estómago, pero todavía significativamente por debajo del nivel en los osteoclastos maduros. Por consiguiente, se cree que este gen podría ser necesario para la osteoclastogénesis y/o la remodelación ósea.
SEQ ID NO. 29
La SEQ ID NO. 29 (tabla 5) corresponde a un gen previamente identificado que codifica una proteína, la nexina 10 clasificadora (SNX10), cuya función no se ha determinado (véase la tabla 1). Hemos demostrado que este gen está notablemente inducido en los osteoclastos maduros en comparación con las células precursoras y la mayor parte de los tejidos humanos normales (figura 29), lo que no se había descrito anteriormente. Sin embargo, también se observó la elevada expresión de este gen en el hígado, cerebro, pulmón, corteza suprarrenal, riñón y bazo, aunque significativamente por debajo del nivel en los osteoclastos maduros. Por consiguiente, se cree que este gen podría ser necesario para la osteoclastogénesis y/o la remodelación ósea.
SEQ ID NO. 30
La SEQ ID NO. 30 (tabla 5) corresponde a un gen previamente identificado que codifica una proteína, que contiene 3 dominios Tudor (TDRD3), cuya función no se ha determinado, pero que puede estar implicada en la fijación a ácidos nucleicos (véase la tabla 1). Hemos demostrado que este gen está notablemente inducido en los osteoclastos maduros en comparación con las células precursoras y la mayoría de los tejidos humanos normales (figura 30), lo que no se había descrito anteriormente. Sin embargo, se observó expresión de este gen por encima del nivel basal en los tejidos humanos normales debido a que el precursor estaba más bajo de lo normal, aunque todavía estaba significativamente por debajo del nivel en los osteoclastos maduros. Por lo tanto, se mantuvo la selección de este gen. Por consiguiente, se cree que este gen podría ser necesario para la osteoclastogénesis y/o la remodelación ósea.
SEQ ID NO. 31
La SEQ ID NO. 31 (tabla 5) corresponde a un gen previamente identificado que codifica una proteína, la selenoproteína P, plasma, 1 (SEPP1), que se ha implicado en la defensa oxidante en el espacio extracelular y en el transporte de selenio (véase la tabla 1). Este gen codifica una selenoproteína que contiene varias selenocisteínas. La selenocisteína está codificada por el codón UGA que suele ser de parada. Los aminoácidos inusuales están señalados con una «U» en la secuencia de aminoácidos en la SEQ ID NO. 78 (tabla 5) o mediante Xaa en la lista de secuencias. Hemos demostrado que este gen está notablemente inducido en los osteoclastos intermedios y maduros en comparación con las células precursoras y la mayoría de los tejidos humanos normales (figura 31), lo que no se había descrito anteriormente. Sin embargo, se observó la expresión de este gen por encima del nivel basal en los tejidos humanos normales debido a que el nivel del precursor era más bajo de lo normal, pero era todavía significativamente menor que el nivel en los osteoclastos maduros. Por consiguiente, se mantuvo la selección de este gen. Por lo tanto, se cree que este gen podría ser necesario para la osteoclastogénesis y/o la remodelación ósea.
S E Q ID NO. 32
La SEQ ID NO. 32 (tabla 5) corresponde a un gen previamente identificado que codifica una proteína hipotética, KIAA0040, que no tiene ninguna función conocida (véase la tabla 1). Hemos demostrado que este gen está notablemente inducido en los osteoclastos intermedios y maduros en comparación con las células precursoras y la mayoría de los tejidos humanos normales (figura 32), lo que no se había descrito anteriormente. Sin embargo, se observó la expresión de este gen por encima del nivel basal en los tejidos humanos normales debido a que el nivel del precursor era más bajo de lo normal, pero era todavía significativamente menor que el nivel en los osteoclastos maduros. Por consiguiente, se mantuvo la selección de este gen. Por lo tanto, se cree que este gen podría ser necesario para la osteoclastogénesis y/o la remodelación ósea.
SEQ ID NO. 33
La SEQ ID NO. 33 (tabla 5) corresponde a un gen previamente identificado que codifica una proteína, la dipeptidilpeptidasa 4 (CD26, proteína 2 del complejo de la adenosina desaminasa) (DPP4), que es una glucoproteína intrínseca de la membrana y una serina exopeptidasa que escinde los dipéptidos de X-prolina desde el extremo amino de los polipéptidos (véase la tabla 1). Hemos demostrado que este gen está notablemente inducido en los osteoclastos intermedios y maduros en comparación con las células precursoras y la mayoría de los tejidos humanos normales (figura 33), lo que no se había descrito anteriormente. Sin embargo, se observó la expresión de este gen por encima del nivel basal en los tejidos humanos normales, excepto en la placenta, pulmón, ovario, riñón, próstata e intestino delgado, debido a que el nivel del precursor era más bajo de lo normal, pero era todavía significativamente menor que el nivel en los osteoclastos maduros. Por consiguiente, se mantuvo la selección de este gen. Por consiguiente, se cree que este gen podría ser necesario para la osteoclastogénesis y/o la remodelación ósea.
SEQ ID NO. 34:
La SEQ ID NO. 34 (tabla 5) corresponde a un gen previamente identificado que codifica una proteína, la precursora de la cistatina C, y se sabe que miembros de la familia de la cistatina son inhibidores de las cisteína proteasas (véase la tabla 1). Hemos demostrado que este gen está notablemente inducido en los osteoclastos intermedios y maduros en comparación con las células precursoras y los otros tejidos humanos normales (figura 34), lo que no se había descrito anteriormente. Sin embargo, está bien documentado que la cistatina C desempeña una función crítica a la hora de inhibir la osteoclasia debida a los osteoclastos (Brage et al., 2005). Por lo tanto, el perfil de hibridación de este gen es un ejemplo excelente de las secuencias muy inducidas y específicas relacionadas con los osteoclastos.
SEQ ID NO. 85:
La SEQ ID NO. 85 (tabla 5) codifica una proteína desconocida que se encuentra en el cromosoma 1 (clon RP11-344F13), que contiene un gen nuevo (véase la tabla 1). Hemos demostrado que este gen está notablemente inducido en los osteoclastos intermedios y maduros en comparación con las células precursoras y los otros tejidos humanos normales (figura 38), lo que no se había descrito anteriormente. Por consiguiente, se deduce que este gen podría ser necesario para la osteoclastogénesis y/o la remodelación ósea.
SEQ ID NO. 86
La SEQ ID NO. 86 (tabla 5) no codifica ninguna proteína conocida. Se trata de un gen desconocido que coincide con la secuencia de una EST que corresponde a BQ182670 en la base de datos y que se aisló de una muestra de cartílago artrósico (véase la tabla 1). Hemos demostrado que este gen está muy inducido en los osteoclastos intermedios y maduros en comparación con las células precursoras y los otros tejidos humanos normales (figura 39), lo que no se había descrito anteriormente. Por lo tanto, se deduce que este gen podría ser necesario para la osteoclastogénesis y/o la remodelación ósea.
H.- Clonación de los cDNA completos de las secuencias seleccionadas entre los mRNA de osteoclasto: Era necesario obtener secuencias de cDNA completos para realizar estudios funcionales de las proteínas expresadas. Cada vez hay más variantes de ayuste implicadas en las funciones específicas del tejido y, como tal, es importante trabajar con clones de cDNA del sistema en estudio. El solicitante también reconoce que las variantes de ayuste no siempre intervienen en ello. Por lo tanto, la estrategia del solicitante ha sido aislar las secuencias de cDNA completos y relevantes directamente de los osteoclastos para identificar las variantes y su posible función con respecto a la especificidad.
Los clones de cDNA codificantes se aislaron con una estrategia 5'-RACE (Invitrogen, Burlington, ON) y una estrategia estándar específica del gen con dos cebadores de PCR. La estrategia 5'-RACE utilizó el cDNA preparado a partir de RNA de osteoclastos seleccionado por la caperuza y/o RNA de osteoclastos amplificado con RAMP. Para la amplificación con cebadores específicos del gen, se utilizó tanto el cDNA preparado de RNA con RAMP como RNA total. Todos los cDNA se sintetizaron siguiendo los procedimientos de transcripción inversa estándares (Invitrogen, Burlington, ON). Las secuencias de cDNA obtenidas se clonaron en E. coli DH10B y se determinó la secuencia nucleotídica de varios clones. Después, las secuencias de los cDNA de cada conjunto se alinearon y se identificó el o los marcos abiertos de lectura (ORF, por su nombre en inglés) con programas informáticos estándares (p. ej, ORF Finder-NCBI). La tabla 2 muestra la secuencia consenso de los clones de cDNA de la región codificante de SEQ ID NO. 1 ( SEQ ID NO. 83) y SEQ ID NO. 2 ( SEQ ID NO. 84) obtenidos de una muestra de los osteoclastos humanos, que son idénticas a las de las secuencias publicadas que corresponden a los números de acceso NM_213602 y NM_001014433 (NCBI), respectivamente.
I. - Estudios de interferencia por RNA
La interferencia por RNA es un mecanismo de regulación génica recientemente descubierto que implica la disminución, específica de secuencia, de la expresión de un gen al dirigir el mRNA hacia la degradación y, aunque se describió originalmente en las plantas, se ha descubierto en muchos reinos animales, desde los protozoos e invertebrados hasta los eucariotas superiores (revisado en Agrawal et al., 2003). En el contexto fisiológico, el mecanismo de interferencia por RNA lo desencadena la presencia de moléculas de RNA bicatenario que se escinden mediante una proteína de tipo RNasa III activa en las células, denominada Dicer, que libera los siRNA de 21 a 23 pb. El siRNA, de una manera guiada por la homología, forma un complejo con una amalgama de proteínas y RNA denominada RISC (complejo silenciador inducido por RNA) en presencia de mRNA para provocar la degradación, lo que da lugar a la atenuación de la expresión de este mRNA (Agrawal et al., 2003).
Las estrategias actuales para estudiar la función de los genes, tal como los ratones genosuprimidos y los negativos dominantes, a menudo son ineficaces y generalmente caros, y necesitan mucho tiempo. La interferencia por RNA está resultando ser un procedimiento de elección para el análisis de un gran número de genes de una manera rápida y relativamente barata. Aunque la transfección de los siRNA sintéticos es un método eficaz, los efectos a menudo son transitorios en el mejor de los casos (Hannon G. J, 2002). La introducción de plásmidos que expresan RNA ahorquillados pequeños mediante la transfección estable ha resultado satisfactoria al permitir el análisis mediante interferencia por RNA en los estudios a largo plazo (Brummelkamp et al., 2002; Elbashir et al., 2001). Además, los avances más recientes han permitido la expresión de moléculas de siRNA, en forma de RNA ahorquillado pequeño, en células humanas primarias mediante procedimientos que usan virus, tal como lentivirus, para introducirlos (Lee et al., 2004; Rubinson et al., 2003).
J. - Determinación de los efectos bloqueadores de la osteoclastogénesis
Para desarrollar un procedimiento de escrutinio para los genes candidatos humanos, la interferencia por RNA se adaptó para introducir shRNA en las células precursoras de osteoclastos humanos, por lo que se pudo atenuar la expresión de los genes candidatos. Esta estrategia permitiría entonces realizar la diferenciación de los osteoclastos en las células que contienen una menor expresión de estos genes para determinar si son necesarios, o no, en el procedimiento.
Para este fin se utilizó un sistema comercial de suministro de shRNA con lentivirus (Invitrogen, Burlington, ON) para introducir shRNA específicos en las células precursoras de osteoclastos humanos. Las técnicas utilizadas fueron las descritas por el fabricante, a menos que se indique otra cosa. En este ejemplo se presentan los resultados obtenidos para dos de los genes candidatos, s Eq ID NO. 1 (AB0326) y SEQ ID NO. 2 (AB0369) ensayados hasta la fecha. Las proteínas codificadas por ambos genes no tienen una función conocida. Las secuencias de shRNA utilizadas para dirigir específicamente la SEQ ID NO. 1 y la SEQ ID NO. 2 fueron 5'-CAGGCCCAGGAGTCCAATT-3' ( SEQ ID NO. 42) y 5'-TCCCGTCTTTGGGTCAAAA-3' ( SEQ ID NO. 43), respectivamente. Brevemente, en el vector de expresión en lentivirus se clonó una plantilla para la expresión del shRNA y se cotransfectó en las células 293FT con vectores de expresión para las proteínas estructurales del virus. Después de dos días, los sobrenadantes que contenían el lentivirus se recogieron y se conservaron a -80 °C. Los precursores de los osteoclastos humanos que se compraron a Cambrex (East Rutheford, NJ) se sedimentaron en placas de 24 pocillos y se cultivaron en medio completo con el factor estimulador de colonias de macrófagos y se dejó que se adhirieran durante tres días. Después del lavado con PBS, las células se infectaron a una MDI (multiplicidad de infección) de 20 con partículas lentivíricas que contienen un shRNA específico para el gen lacZ bacteriano como control (shRNA de lacZ), o bien con la SEQ ID No .1 (shRNA de AB0326) o la SEQ ID NO. 2 (shRNA de AB0369). Después de 24 horas, las células infectadas se trataron con el mismo medio que contenía el ligando de RANK a 100 ng/ml durante 5 a 8 días para permitir la diferenciación del osteoclasto a partir de las células precursoras. Los osteoclastos maduros se fijaron con formaldehído y se tiñeron para detectar la expresión de TRAP como sigue: las células se lavaron con PBS y se fijaron en formaldehído al 10% durante 1 hora. Después de dos lavados con PBS, las células se permeabilizaron ligeramente en Triton X-100 al 0,2% en PBS durante 5 minutos antes del lavado en PBS. La tinción se llevó a cabo a 37 °C durante 20 a 25 min en fosfato de naftol AS-MX al 0,01%, Fast Red Violet al 0,06%, tartrato de sodio a 50 mM, acetato de sodio a 100 mM, pH 5,2. Las células teñidas se visualizaron con el microscopio óptico y se fotografiaron (aumentos: 40X). Se observó una disminución significativa del número de osteoclastos multinucleados a partir de las células precursoras infectadas con el shRNA de AB0326 (figura 35A, panel inferior) y con el shRNA de AB0369 (figura 35B, panel inferior) en comparación con las que se producen con el shRNA de lacZ (figuras 35A y B, paneles superiores). Por consiguiente, en ambos casos, el shRNA lentivírico correspondiente ( SEQ ID NO. 42 y 43, respectivamente) (tabla 4) perturbó la osteoclastogénesis. Estos resultados indicaban con claridad que la expresión del gen que codifica la SEQ ID NO. 1 (AB0326) y la SEQ ID NO. 2 (AB0369) es necesaria para la diferenciación de los osteoclastos.
Se llevaron a cabo experimentos similares a los descritos más arriba con otras secuencias ( SEQ ID NO. 3 a SEQ ID NO. 33, SEQ ID NO. 85 o SEQ ID NO. 86).
K. - Validación biológica del ortólogo de ratón para AB0326 ( SEQ ID NO. 35) en la osteoclastogénesis con el modelo RAW 264.7
Como un medio para desarrollar un ensayo de escrutinio de fármacos para el descubrimiento de moléculas terapéuticas capaces de atenuar la diferenciación y la actividad de los osteoclastos humanos mediante las dianas identificadas, fue necesario utilizar otro modelo de diferenciación de los osteoclastos. La línea de las células precursoras de osteoclastos RAW 264.7 (RAW) se conoce bien en la técnica como modelo murino de la osteoclastogénesis. Sin embargo, debido a la dificultad para la transfección transitoria de las células RAW, se utilizó la estrategia de transfección estable, donde los shRNA se expresan constitutivamente en las células RAW. Esto permitió llevar a cabo estudios a largo plazo tales como la diferenciación de los osteoclastos en presencia de determinados shRNA identificados por ser específicos de los ortólogos murinos de las dianas humanas.
Las células RAW se compraron a la American Type Culture Collection (Manassass, VA) y se mantuvieron en DMEM con glucosa elevada que contenía suero bovino fetal al 10% y antibióticos. Las células se subcultivaron cada dos semanas hasta un máximo de 10-12 pases. Para los experimentos de diferenciación de osteoclastos, las células RAW se inocularon en placas de 96 pocillos a una densidad de 4 x 103 células/pocillo y se dejaron crecer durante 24 h. La diferenciación se indujo en DMEM con glucosa elevada, suero bovino fetal tratado con carbón vegetal al 10% (obtenido de Hyclone, Logan, UT), SAB al 0,05%, antibióticos, factor estimulador de las colonias de macrófagos (M-CSF) a 10 ng/ml y ligando de RANK a 100 ng/ml. Las placas se realimentaron el día 3 y los osteoclastos fueron claramente visibles al 4.° día. Típicamente, las células se tiñeron para TRAP el día 4 o 5 a menos que se indique de otra manera. Para incorporar los casetes de expresión de shRNA en los cromosomas de las células RAW, se compró el plásmido pSilencer 2.0 ( SEQ ID NO. 47) a Ambion (Austin, TX) y los oligonucleótidos específicos de la secuencia se ligaron como recomienda el fabricante. Se diseñaron dos plásmidos de expresión de shRNA y las secuencias 5 ' -G C G C C G C G G A T C G T C A A C A - 3 ' ( SEQ ID NO. 4 4 ) y 5 ' - A C A C G T G C A C G G C G G C C A A - 3 ' ( SEQ ID NO. 4 5 ) se utilizaron para atenuar la expresión génica del ortólogo de ratón de AB0326 ( SEQ ID NO. 35). En estos experimentos se incluyó también como un control negativo un plásmido suministrado por Ambion que contiene una secuencia de shRNA mezclada sin ninguna homología con ningún gen de mamífero. Las células RAW se inocularon en placas de 6 pocillos a una densidad de 5 x 105 células/pocillo y se transfectaron con 1 pg de cada plásmido utilizando Fugene6 (Roche, Laval, QC) como se describe en el protocolo. Después de la selección de los transfectantes estables en el medio que contiene puromicina a 2 pg/ml, las líneas celulares se expandieron y se les analizó la capacidad de osteoclastogénesis en presencia del ligando de RANK.
Las líneas celulares transfectadas de forma estable se designaron RAW-0326.1, RAW-0326.2 y RAW-ctl. Se inocularon 4000 células/pocillo en placas de 96 pocillos por triplicado y se trataron con el ligando de RANK a 100 ng/ml. Después de 4 días, los osteoclastos se tiñeron para ver la expresión de TRAP y se visualizaron con el microscopio óptico (aumentos de 40X y 100X, como se describe en los paneles izquierdo y derecho, respectivamente).
Los resultados representativos para la línea RAW-0326.2 se muestran en la figura 36. La línea celular RAW-0326.2 produjo significativamente menos osteoclastos (figura 36; panel inferior) que la línea celular que contenía el shRNA aleatorizado (figura 36, panel superior). La línea celular RAW-0326.1 también mostró la atenuación del ortólogo de ratón de AB0326, pero no tan pronunciada (datos sin mostrar). Por lo tanto, al igual que se observó para las SEQ ID NO. 42 y 43, los siRNA para el ortólogo de ratón ( SEQ ID NO. 44 y 45) (tabla 4) perturban el fenotipo de la diferenciación de los osteoclastos en el modelo de ratón también. Estos resultados, unidos a los obtenidos en las células precursoras de los osteoclastos humanos con el sistema de administración de shRNA mediante lentivirus (apartado J), demuestran que en los humanos y en el ratón se necesita claramente el producto génico de AB0326 para la osteoclastogénesis.
L. - Un ensayo de complementación funcional para la SEQ ID NO. 1 (AB0326) en las células RAW 264.6 para escrutar los inhibidores de la osteoclastogénesis
Para establecer un ensayo de escrutinio basado en la SEQ ID NO. 1 (AB0326) para encontrar moléculas pequeñas capaces de atenuar la diferenciación de los osteoclastos, el cDNA que codifica el AB0326 humano se introdujo en la línea celular RAW-0326.2. Así pues, si el AB0326 humano desempeña la misma función que el ortólogo de ratón en las células RAW 264.7, debe restaurar la capacidad de la osteoclastogénesis de la línea celular RAW-0326.2.
Para llevar a cabo esta tarea, la línea celular RAW-0326.2 se transfectó con un vector de expresión para eucariotas que codifica el cDNA de longitud completa del AB0326 humano, denominado pd2-hAB0326. Este vector de expresión (pd2; SEQ ID NO. 47) se modificó a partir de un vector comercial, el pd2-EGFP-N1 (Clontech, Mountain View, CA), en donde el gen de EGFP se reemplazó por la secuencia codificante completa del cDNA del AB0326 humano. La expresión del gen de AB0326 estaba impulsada desde un promotor fuerte del CMV. Se seleccionaron transfectantes estables para el antibiótico G418. Esto dio lugar a una línea celular RAW-0326.2 que expresaba el producto del gen de AB0326 humano en el cual se había silenciado el ortólogo de ratón de AB0326. Como control, las células RAW-0326.2 se transfectaron con el vector vacío pd2, que no debe complementar la actividad de shRNA de AB0326. De igual forma, el vector vacío pd2 se introdujo por transfección en las células RAW 264.7 para servir como un control adicional. Después de la selección de los conjuntos estables de células, se inocularon 4000 células/pocillo en placas de 96 pocillos y se trataron durante 4 días con el ligando de RANK a 100 ng/ml. Tras la fijación con formaldehído, las células se tiñeron para TRAP, un gen marcador específico de los osteoclastos. Tal y
como se muestra en la figura 37, las células RAW-0326.2 transfectadas con el vector vacío pd2 siguen siendo incapaces de formar osteoclastos en presencia del ligando de RANK (panel central), lo que indica que el shRNA del AB0326 de ratón sigue siendo capaz de silenciar la expresión del gen AB0326 en estas células. A la inversa, se rescatan las células transfectadas con AB0326 humano (pd2-hAB0326) y, por lo tanto, se diferencian en osteoclastos en respuesta al ligando de RANK (panel derecho). Las células RAW 264.7 que contienen el vector vacío (pd2) no vieron afectada adversamente la formación de osteoclastos en presencia del ligando de RANK (panel izquierdo). Estos resultados confirman que los ortólogos de ratón y de humano de AB0326 conservan su función en
la diferenciación de los osteoclastos.
Este tipo concreto de ensayo con células puede servir ahora de base para escrutar compuestos capaces de fijarse e
inhibir el funcionamiento del AB0326 humano. A esta línea celular «rescatada» se le podría aplicar una colección de compuestos para identificar moléculas (fármacos de molécula pequeña, péptidos o anticuerpos) capaces de inhibir a AB0326. Cualquier reducción de la diferenciación de los osteoclastos medida como una reducción de la expresión de
TRAP sería indicativa de una disminución de la actividad del AB0326 humano. Este ensayo es aplicable a cualquier gen necesario para la diferenciación de los osteoclastos adecuada en las células RAW. Se puede desarrollar un
ensayo de complementación para cualquier gen humano y utilizarlo como base para el escrutinio de fármacos.
Se están llevando a cabo experimentos similares a los descritos más arriba para otras secuencias ( SEQ ID NO. 3 a
SEQ ID NO. 33 o SEQ ID NO. 85 o SEQ ID NO. 86). Este tipo de ensayo puede utilizarse para escrutar las moléculas capaces de incrementar o disminuir (p. ej., inhibir) la actividad o expresión de la NSEQ o de la PSEQ.
En las NSEQ descritas en la presente memoria, sus procedimientos, composiciones, usos, sus ensayos o demás, el polinucleótido puede estar solo o en grupo (colectivamente), más particularmente puede ser (o puede comprender o consistir en) bien;
Q ID NO.17, Q ID NO.23,
Figure imgf000047_0001
Q ID NO.29,
secuencia sustancialmente idéntica a una porción traducible de SEQ ID NO. 1, de SEQ ID NO. 2, de SEQ ID NO. 3, de SEQ ID NO. 4, de SEQ ID NO. 5, de SEQ ID NO. 6, de SEQ ID NO. 7, de SEQ ID NO. 8, de SEQ ID NO. 9, de
SEQ ID NO. 10, de SEQ ID NO. 11, de SEQ ID NO. 12, de SEQ ID NO. 13, de SEQ ID NO. 14, de SEQ ID NO. 15, de SEQ ID NO. 16, de SEQ ID NO. 17, de SEQ ID NO. 18, de SEQ ID NO. 19, de SEQ ID NO. 20, de SEQ ID NO.
21, de SEQ ID NO. 22, de SEQ ID NO. 23, de SEQ ID NO. 24, de SEQ ID NO. 25, de SEQ ID NO. 26, de SEQ ID
NO. 27, de SEQ ID NO. 28, de SEQ ID NO. 29, de SEQ ID NO. 30, de SEQ ID NO. 31, de SEQ ID NO. 32, de SEQ
ID NO. 33, de SEQ ID NO. 85 o de SEQ ID NO. 86;
una secuencia sustancialmente complementaria a una porción traducible de SEQ ID NO. 1, un fragmento de una
porción que se puede transcribir de SEQ ID NO. 1, de SEQ ID NO. 2, de SEQ ID NO. 3, de SEQ ID NO. 4, de SEQ
ID NO. 5, de SEQ ID NO. 6, de SEQ ID NO. 7, de SEQ ID NO. 8, de SEQ ID NO. 9, de SEQ ID NO. 10, de SEQ ID
NO. 11, de SEQ ID NO. 12, de SEQ ID NO. 13, de SEQ ID NO. 14, de SEQ ID NO. 15, de SEQ ID NO. 16, de SEQ
ID NO. 17, de SEQ ID NO. 18, de SEQ ID NO. 19, de SEQ ID NO. 20, de SEQ ID NO. 21, de SEQ ID NO. 22, de
SEQ ID NO. 23, de SEQ ID NO. 24, de SEQ ID NO. 25, de SEQ ID NO. 26, de SEQ ID NO. 27, de SEQ ID NO. 28, de SEQ ID NO. 29, de SEQ ID NO. 30, de SEQ ID NO. 31, de SEQ ID NO. 32, de SEQ ID NO. 33, de SEQ ID NO.
85 o de SEQ ID NO. 86;
un fragmento de una secuencia sustancialmente idéntica a una porción traducible de SEQ ID NO. 1, de SEQ ID NO.
2, de SEQ ID NO. 3, de SEQ ID NO. 4, de SEQ ID NO. 5, de SEQ ID NO. 6, de SEQ ID NO. 7, de SEQ ID NO. 8, de
SEQ ID NO. 9, de SEQ ID NO. 10, de SEQ ID NO. 11, de SEQ ID NO. 12, de SEQ ID NO. 13, de SEQ ID NO. 14, de
SEQ ID NO. 15, de SEQ ID NO. 16, de SEQ ID NO. 17, de SEQ ID NO. 18, de SEQ ID NO. 19, de SEQ ID NO. 20, de SEQ ID NO. 21, de SEQ ID NO. 22, de SEQ ID NO. 23, de SEQ ID NO. 24, de SEQ ID NO. 25, de SEQ ID NO.
26, de SEQ ID NO. 27, de SEQ ID NO. 28, de SEQ ID NO. 29, de SEQ ID NO. 30, de SEQ ID NO. 31, de SEQ ID
NO. 32, de SEQ ID NO. 33, de SEQ ID NO. 85 o de SEQ ID NO. 86;
un fragmento de una secuencia sustancialmente complementaria a una porción traducible de SEQ ID NO. 1, de SEQ
ID NO. 2, de SEQ ID NO. 3, de SEQ ID NO. 4, de SEQ ID NO. 5, de SEQ ID NO. 6, de SEQ ID NO. 7, de SEQ ID
NO. 8, de SEQ ID NO. 9, de SEQ ID NO. 10, de SEQ ID NO. 11, de SEQ ID NO. 12, de SEQ ID NO. 13, de SEQ ID
NO. 14, de SEQ ID NO. 15, de SEQ ID NO. 16, de SEQ ID NO. 17, de SEQ ID NO. 18, de SEQ ID NO. 19, de SEQ
ID NO. 20, de SEQ ID NO. 21, de SEQ ID NO. 22, de SEQ ID NO. 23, de SEQ ID NO. 24, de SEQ ID NO. 25, de
SEQ ID NO. 26, de SEQ ID NO. 27, de SEQ ID NO. 28, de SEQ ID NO. 29, de SEQ ID NO. 30, de SEQ ID NO. 31, de SEQ ID NO. 32, de SEQ ID NO. 33, de SEQ ID NO. 85 o de SEQ ID NO. 86;
o una genoteca que comprende una cualquiera de las anteriores.
En las PSEQ descritas en la presente memoria, sus procedimientos, composiciones, usos, kits de ensayo u otros, el polipéptido puede estar solo o en grupo (colectivamente), más particularmente puede ser (o puede comprender o consistir en) bien;
SEQ ID NO. 48, SEQ ID NO. 49, SEQ ID NO. 50, SEQ ID NO. 51, SEQ ID NO. 52, SEQ ID NO. 53, SEQ ID NO. 54, SEQ ID NO. 55, SEQ ID NO. 56, SEQ ID NO. 57, SEQ ID NO. 58, SEQ ID NO. 59, SEQ ID NO. 60, SEQ ID NO. 61, SEQ ID NO. 62, SEQ ID NO. 63, SEQ ID NO. 64, SEQ ID NO. 65, SEQ ID NO. 66, SEQ ID NO. 67, SEQ ID NO. 68, SEQ ID NO. 69, SEQ ID NO. 70, SEQ ID NO. 71, SEQ ID NO. 72, SEQ ID NO. 73, SEQ ID NO. 74, SEQ ID NO. 75, SEQ ID NO. 76, SEQ ID NO. 77, SEQ ID NO. 78, SEQ ID NO. 79 o SEQ ID NO. 80;
un fragmento de SEQ ID NO. 48, SEQ ID NO. 49, SEQ ID NO. 50, SEQ ID NO. 51, SEQ ID NO. 52, SEQ ID NO. 53, SEQ ID NO. 54, SEQ ID NO. 55, SEQ ID NO. 56, SEQ ID NO. 57, SEQ ID NO. 58, SEQ ID NO. 59, SEQ ID NO. 60, SEQ ID NO. 61, SEQ ID NO. 62, SEQ ID NO. 63, SEQ ID NO. 64, SEQ ID NO. 65, SEQ ID NO. 66, SEQ ID NO. 67, SEQ ID NO. 68, SEQ ID NO. 69, SEQ ID NO. 70, SEQ ID NO. 71, SEQ ID NO. 72, SEQ ID NO. 73, SEQ ID NO. 74, SEQ ID NO. 75, SEQ ID NO. 76, SEQ ID NO. 77, SEQ ID NO. 78, SEQ ID NO. 79 o SEQ ID NO. 80;
o un análogo biológicamente activo, variante u ortólogo no humano de SEQ ID NO. 48, SEQ ID NO. 49, SEQ ID NO.
50, SEQ ID NO. 51, SEQ ID NO. 52, SEQ ID NO.53, SEQ ID NO.54, SEQ ID NO. 55, SEQ ID NO. 56, SEQ ID NO.
57, SEQ ID NO. 58, SEQ ID NO. 59, SEQ ID NO.60, SEQ ID NO.61, SEQ ID NO. 62, SEQ ID NO. 63, SEQ ID NO.
64, SEQ ID NO. 65, SEQ ID NO. 66, SEQ ID NO.67, SEQ ID NO.68, SEQ ID NO. 69, SEQ ID NO. 70, SEQ ID NO.
71, SEQ ID NO. 72, SEQ ID NO. 73, SEQ ID NO.74, SEQ ID NO.75, SEQ ID NO. 76, SEQ ID NO. 77, SEQ ID NO.
78, SEQ ID NO. 79 o SEQ ID NO. 80.
El experto en la técnica reconocerá fácilmente que los ortólogos para todos los mamíferos se pueden identificar y verificar con técnicas bien establecidas en la técnica, y que esta descripción no se limita de ningún modo a un mamífero. La terminología «mamífero(s)» para los propósitos de esta descripción se refiere a cualquier animal clasificado como mamífero, incluidos humanos, animales domésticos y de granja, y animales en cautividad, para deporte o de compañía, tales como perros, gatos, vacas, caballos, ovejas, cerdos, cabras, conejos, etc. Preferiblemente, el mamífero es humano.
Las secuencias de los experimentos explicados anteriormente son representativas de las NSEQ descritas en la presente memoria. La descripción de las funciones de las NSEQ en la osteoclastogénesis y el funcionamiento de los osteoclastos satisface una necesidad en la técnica para conocer mejor el proceso de remodelación ósea, y proporciona nuevas composiciones que son útiles para el diagnóstico, pronóstico, tratamiento, prevención y evaluación de tratamientos para la remodelación ósea y los trastornos asociados.
El campo de la manipulación genética, de la biología molecular y del desarrollo de dianas farmacéuticas ha avanzado considerablemente en las últimas dos décadas. Resultará fácilmente evidente para los expertos en la técnica que las funciones recién identificadas para las secuencias genéticas y las correspondientes secuencias de proteínas permite que las secuencias, variantes y derivados, se utilicen directa o indirectamente en aplicaciones del mundo real para el desarrollo de herramientas de investigación, herramientas para diagnóstico, terapias y tratamientos para trastornos o estados patológicos en los que intervienen las secuencias genéticas.
Tabla 1: Secuencias expresadas diferencialmente que se han encontrado en los osteoclastos
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Tabla 2: Se muestra la secuencia consenso de SEQ ID NO. 1 y SEQ ID NO. 2 clonadas a partir de una muestra de osteoclastos humanos maduros
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Tabla 3: Lista de ortólogos de ratón para AB0326
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Tabla 4: Lista de otras secuencias de identificación de plásmidos y oligonucleótidos de shRNA
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Referencias
PATENTES:
Patente de los EE.UU. n.° 5712127 Malek et al., 27 de enero de 1998
Patente de los EE.UU. n.° 6498024, Malek et al., 24 de diciembre de 2002
Solicitud de patente de los EE.UU. n.° 11/000958 registrada el 2 de diciembre de 2003, publicada con el número US 2005/0153333 A1 el 14 de julio de 2005 y titulada «Selective Terminal Tagging of Nucleic Acids»
Patente de los EE.UU. n.° 6617434 Duffy, 9 de septiembre de 2003
Patente de los EE.UU. n.° 6451 555 Duffy, 17 de septiembre de 2002
OTRAS REFERENCIAS:
1. Frost H. M., 1964 Dymanics of Bone Remodeling. En: Bone Biodynamics, Little and Brown, Boston, MA, USA pp.315.
2. Baron, R., Anatomy and Biology of Bone Matrix and Cellular Elements, En: Primer on the Metabolic Bone Diseases and Disorders of Mineral Metabolism, 5.a edición 2003, American Society for Bone and Mineral Research, Washington DC, pp.1-8.
3. Jilka, R. L. et al., «lncreased Osteoclast Development After Esgtrogen Loss: Mediation by Interleukin-6», Science 257: 88-91 (1992).
4. Poli, V. et al., «lnterleukin-6 deficient mice are protected from bone loss caused by estrogen depletion», EMBO J 13: 1189-1196 (1994).
5. Srivastava, S. et al.. «Estrogen Blocks M-CSF Gene Expression and Osteoclast Formation by Regulating Phosphorylation of Egr-1 and Its Interaction with Sp-1», J Clin Invest 102: 1850-1859 (1998).
6. de Vernejoul, M. C., «Dynamics of Bone Remodeling: Biochemical and Pathophysiological Basis», Eur J Clin Chem Clin Biochem 34: 729-734 (1996).
7. Netzel-Arnett, S., J. D Hooper, et al. (2003). «Membrane anchored serine proteases: a rapidly expanding group of cell surface proteolytic enzymes with potential roles in cancer». Cancer Metastasis Rev 22(2-3): 237-58. 8. Shan, J., L. Yuan, et al. (2002). «TSP50, a possible protease in human testes, is activated in breast cancer epithelial cells». Cancer Res 62(1): 290-4.
9. Yuan, L., J. Shan, et al. (1999). «Isolation of a novel gene, TSP50, by a hypomethylated DNA fragment in human breast cancer». Cancer Res 59(13): 3215-21.
10. Nishi, T. y M. Forgac (2002). «The vacuolar (H+)-ATPases: nature's most versatile proton pumps». Nat Rev Mol Cell Biol 3(2): 94-103.
11. Nishi, T., S. Kawasaki-Nishi, et al. (2003). «Expression and function of the mouse V-ATPase d subunit isoforms». J Biol Chem 278(47): 46396-402.
12. Morello, R., L. Tonachini, et al. (1999). «cDNA cloning, characterization and chromosome mapping of Crtap encoding the mouse cartilage associated protein». Matrix Biol 18(3): 319-24.
13. Tonachini, L., R. Morello, et al. (1999). «cDNA cloning, characterization and chromosome mapping of the gene encoding human cartilage associated protein (CRTAP)». Cytogenet Cell Genet 87(3-4): 191-4.
14. Kawai, J., A. Shinagawa, et al. (2001). «Functional annotation of a full-length mouse cDNA coIlection». Nature 409(6821): 685-90.
15. Strausberg, R. L., E. A. Feingold, et al. (2002). «Generation and initial analysis of more than 15,000 full-length human and mouse cDNA sequences». Proc Natl Acad Sci USA 99(26): 16899-903.
16. Janssen, E., M. Zhu, et al. (2003). «LAB: a new membrane-associated adaptor molecule in B cell activation». Nat Immunol 4(2): 117-23.
17. Kawaida, R., T. Ohtsuka, et al. (2003). «Jun dimerization protein 2 (JDP2), a member of the AP-1 family of transcription factor, mediates osteoclast differentiation induced by RANKL». J Exp Med 197(8): 1029-35.
18. Agrawal, N., P. V. Dasaradhi, et al. (2003). «RNA interference: biology, mechanism, and applications».
Microbiol Mol Biol Rev 67(4): 657-85.
19. Hannon, G. J. (2002). «RNA interference». Nature 418(6894): 244-51.
20. Brummelkamp, T. R., R. Bernards, et al. (2002). «A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells». Science 296(5567): 550-3.
21. Elbashir, et al. (2001). «Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells». Nature 411 (6836): 494-8.
22. Lee, J. S., Z. Hmama, et al. (2004). «Stable gene silencing in human monocytic cell lines using lentiviraldelivered small interference RNA. Silencing of the p110aIpha isoform of phosphoinositide 3-kinase reveals differential regulation of adherence induced by 1alpha,25-dihydroxycholecalciferol and bacterial lipopolysaccharide». J Biol Chem 279(10): 9379-88.
23. Rubinson, D. A., C. P. Dillon, et al. (2003). «A lentivirus-based system to functionally silence genes in primary mammalian cells, stem cells and transgenic mice by RNA interference». Nat Genet 33(3): 401-6.
24. Boyle, W. J., W. S, Simonet, et al. (2003). «Osteoclast differentiation and activation." Nature 423(6937): 337-42.
25. Gee et al. En: Huber y Carr (1994) Molecular and immunologic Approaches. Futura Publishing Co., Mt. Kisco N.Y., pp. 163-177.
26. Smith, A. N., F. Jouret, et al. (2005). «Vacuolar H+-ATPase d2 subunit: molecular characterization, developmental regulation, and localization to specialized proton pumps in kidney and bone». J Am Soc Nephrol 16(5): 1245-56.
27. Smith, A. N., J. Skaug, et al. (2000). «Mutations in ATP6N1B, encoding a new kidney vacuolar proton pump 116-kD subunit, cause recessive distal renal tubular acidosis with preserved hearing». Nat Genet 26(1): 71-5.
28. Stehberger, P. A., N. Schulz, et al. (2003). «Localization and regulation of the ATP6V0A4 (a4) vacuolar H+-ATPase subunit defective in an inherited form of distal renal tubular acidosis». J Am Soc Nephrol 14(12): 3027-38. 29. Malkin I, Dahm S, Suk A, Kobyliansky E, Toliat M, Ruf N. Livshits G, Nurnberg P. Association of ANKH gene polymorphisms with radiographic hand bone size and geometry in a Chuvasha population Bone. 2005 feb; 36(2): 365-73.
30. McMahon C, Will A, Hu P, Shah G N, Sly W S, Smith O P. Bone marrow transplantation corrects osteopetrosis in the carbonic anhydrase Il deficiency syndrome. Blood 2001 1 de abr; 97(7):1947-50.
31. Biskobing D M, Fan D. Acid pH increases carbonic anhydrase II and calcitonin receptor mRNA expression in mature osteoclasts. Calcif Tissue Int. 2000 ago; 67(2): 178-83.
32. Brage M, Abrahamson M, Lindstrom V, Grubb A, Lerner U H. Different cysteine proteinases involved in bone resorption and osteoclast formation. Calcif Tissue Int. 2005 jun; 76(6): 439-47. Epub 19 de mayo de 2005.

Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. Composición farmacéutica para uso en la modulación de la diferenciación de los osteoclastos in vivo, en la prevención de osteopatías o en el tratamiento de osteopatías que comprende un polipéptido aislado que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:
a) SEQ ID NO. 48,
b) un polipéptido codificado por SEQ ID NO. 1,
c) un fragmento de cualquiera de a) o b) que es capaz de favorecer o inhibir la diferenciación de los osteoclastos, y d) un análogo de cualquiera de a) o b) que es capaz de favorecer o inhibir la diferenciación de los osteoclastos, en donde dicho análogo tiene al menos una similitud de secuencia del 90% con el polipéptido de a) o b),
y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
2. Composición farmacéutica para uso en la modulación de la diferenciación de los osteoclastos in vivo, en la prevención de osteopatías o en el tratamiento de osteopatías, en donde la composición farmacéutica comprende un polinucleótido aislado seleccionado del grupo que consiste en:
a) un polinucleótido que comprende la SEQ ID NO. 1,
b) un polinucleótido que comprende el marco abierto de lectura de los nucleótidos 150 a 1136 de SEQ ID NO. 1, c) un polinucleótido que comprende una secuencia idéntica a a) al menos al 80% a lo largo de toda la longitud del polinucleótido,
d) un polinucleótido que comprende una secuencia idéntica a b) al menos al 90% a lo largo de toda la longitud del polinucleótido,
e) un polinucleótido que comprende una secuencia complementaria a a) al menos al 80% a lo largo de toda la longitud del polinucleótido, y
f) un polinucleótido que comprende una secuencia complementaria a b) al menos al 90% a lo largo de toda la longitud del polinucleótido,
y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
3. Polinucleótido aislado seleccionado del grupo que consiste en:
a) un polinucleótido que comprende la SEQ ID NO. 1,
b) un polinucleótido que comprende el marco abierto de lectura de los nucleótidos 150 a 1136 de SEQ ID NO. 1, c) un polinucleótido que comprende una secuencia idéntica a a) al menos al 80% a lo largo de toda la longitud del polinucleótido,
d) un polinucleótido que comprende una secuencia idéntica a b) al menos al 90% a lo largo de toda la longitud del polinucleótido,
e) un polinucleótido que comprende una secuencia complementaria a a) al menos al 80% a lo largo de toda la longitud del polinucleótido, y
f) un polinucleótido que comprende una secuencia complementaria a b) al menos al 90% a lo largo de toda la longitud del polinucleótido,
para el uso en la modulación de la diferenciación de los osteoclastos in vivo, en la prevención de osteopatías o en el tratamiento de una osteopatía.
4. Polinucleótido aislado para uso en la modulación de la diferenciación de los osteoclastos in vivo, en la prevención de osteopatías o en el tratamiento de una osteopatía de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la osteopatía se selecciona del grupo que consiste en la osteoporosis, osteopenia, osteomalacia, hiperparatiroidismo, hipertiroidismo, hipogonadismo, tirotoxicosis, mastocitosis sistémica, hipofosfatasia adulta, hipercorticalismo, osteogénesis imperfecta, enfermedad de Paget, enfermedad/síndrome de Cushing, síndrome de Turner, enfermedad de Gaucher, síndrome de Ehlers-Danlos, síndrome de Marfan, síndrome de Menkes, síndrome de Fanconi, mieloma múltiple, hipercalciemia, hipocalciemia, artritis, periodontitis, raquitismo, fibrogénesis imperfecta ósea, trastornos osteoescleróticos y daño ocasionado por procesos inflamatorios mediados por macrófagos.
5. Polipéptido aislado que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:
a) SEQ ID NO. 48,
b) un polipéptido codificado por SEQ ID NO. 1,
c) un fragmento de cualquiera de a) o b) que es capaz de favorecer o inhibir la diferenciación de los osteoclastos, y d) un análogo de cualquiera de a) o b) que es capaz de favorecer o inhibir la diferenciación de los osteoclastos, en donde dicho análogo tiene una similitud de secuencia de al menos el 90% con el polipéptido de a) o b), para el uso en la modulación de la diferenciación de los osteoclastos in vivo, en la prevención de osteopatías o en el tratamiento de una osteopatía.
6. Polipéptido aislado para uso en la modulación de la diferenciación de los osteoclastos in vivo, en la prevención de osteopatías o en el tratamiento de una osteopatía de acuerdo con la reivindicación 5, en donde la osteopatía se selecciona del grupo que consiste en osteoporosis, osteopenia, osteomalacia, hiperparatiroidismo, hipertiroidismo, hipogonadismo, tirotoxicosis, mastocitosis sistémica, hipofosfatasia adulta, hipercorticalismo, osteogénesis imperfecta, enfermedad de Paget, enfermedad/síndrome de Cushing, síndrome de Turner, enfermedad de Gaucher, síndrome de Ehlers-Danlos, síndrome de Marfan, síndrome de Menkes, síndrome de Fanconi, mieloma múltiple, hipercalciemia, hipocalciemia, artritis, periodontitis, raquitismo, fibrogénesis imperfecta ósea, trastornos osteoescleróticos y daño ocasionado por procesos inflamatorios mediados por macrófagos.
7. Compuesto capaz de interferir con la actividad o expresión de un polipéptido seleccionado entre la SEQ ID NO.
48 o un polipéptido codificado por la SEQ ID NO. 1 para uso en la prevención de osteopatías o en el tratamiento de una osteopatía en un individuo que lo necesite, en donde dicho compuesto se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo aislado o purificado o un fragmento de fijación a antígeno del mismo capaz de fijarse específicamente a un polipéptido que consiste en SEQ ID NO. 48, y un siRNA o shRNA que inhibe específicamente la expresión de un polipéptido codificado por la SEQ ID NO. 1.
8. Compuesto para uso en la prevención de osteopatías o en el tratamiento de una osteopatía de acuerdo con la reivindicación 7, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, anticuerpo policlonal, anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado o un fragmento de fijación a antígeno del mismo.
9. Compuesto para uso en la prevención de osteopatías o en el tratamiento de una osteopatía de acuerdo con la reivindicación 7, en donde dicho fragmento de fijación a antígeno es un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2 o un fragmento Fv.
10. Compuesto para uso en la prevención de osteopatías o en el tratamiento de una osteopatía de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en donde la osteopatía se selecciona del grupo que consiste en osteoporosis, osteopenia, osteomalacia, hiperparatiroidismo, hipertiroidismo, hipogonadismo, tirotoxicosis, mastocitosis sistémica, hipofosfatasia adulta, hipercorticalismo, osteogénesis imperfecta, enfermedad de Paget, enfermedad/síndrome de Cushing, síndrome de Turner, enfermedad de Gaucher, síndrome de Ehlers-Danlos, síndrome de Marfan, síndrome de Menkes, síndrome de Fanconi, mieloma múltiple, hipercalciemia, hipocalciemia, artritis, periodontitis, raquitismo, fibrogénesis imperfecta ósea, trastornos osteoescleróticos y daño ocasionado por procesos inflamatorios mediados por macrófagos.
11. Uso de un polinucleótido aislado o un polipéptido aislado en una cualquiera de las reivindicaciones 3 o 5 en la fabricación de un medicamento para modular la diferenciación de los osteoclastos in vivo, prevención de osteopatías o tratamiento de osteopatías, o uso de un compuesto como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 7, 8 o 9 en la fabricación de un medicamento para prevenir osteopatías o tratar una osteopatía.
12. El uso según la reivindicación 11, en donde el individuo que necesita el tratamiento es un mamífero, y en donde la osteopatía se selecciona del grupo que consiste en osteoporosis, osteopenia, osteomalacia, hiperparatiroidismo, hipertiroidismo, hipogonadismo, tirotoxicosis, mastocitosis sistémica, hipofosfatasia adulta, hipercorticalismo, osteogénesis imperfecta, enfermedad de Paget, enfermedad/síndrome de Cushing, síndrome de Turner, enfermedad de Gaucher, síndrome de Ehlers-Danlos, síndrome de Marfan, síndrome de Menkes, síndrome de Fanconi, mieloma múltiple, hipercalciemia, hipocalciemia, artritis, periodontitis, raquitismo, fibrogénesis imperfecta ósea, trastornos osteoescleróticos y daño ocasionado por procesos inflamatorios mediados por macrófagos
13. Utilización de al menos un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en:
a) un polinucleótido que comprende la SEQ ID NO. 1;
b) un polinucleótido que comprende el marco abierto de lectura de los nucleótidos 150 a 1136 de la SEQ ID NO. 1; c) un polinucleótido que comprende una secuencia idéntica a a) al menos al 80% a lo largo de toda la longitud del polinucleótido;
d) un polinucleótido que comprende una secuencia idéntica a b) al menos al 90% a lo largo de toda la longitud del polinucleótido,
e) un polinucleótido que comprende una secuencia complementaria a a) al menos al 80% a lo largo de toda la longitud del polinucleótido, y
f) un polinucleótido que comprende una secuencia complementaria a b) al menos al 90% a lo largo de toda la longitud del polinucleótido,
en el diagnóstico in vitro de una osteopatía.
14. Utilización de acuerdo con la reivindicación 13, en donde la osteopatía se selecciona del grupo que consiste en osteoporosis, osteopenia, osteomalacia, hiperparatiroidismo, hipertiroidismo, hipogonadismo, tirotoxicosis, mastocitosis sistémica, hipofosfatasia adulta, hipercorticalismo, osteogénesis imperfecta, enfermedad de Paget, enfermedad/síndrome de Cushing, síndrome de Turner, enfermedad de Gaucher, síndrome de Ehlers-Danlos, síndrome de Marfan, síndrome de Menkes, síndrome de Fanconi, mieloma múltiple, hipercalciemia, hipocalciemia, artritis, periodontitis, raquitismo, fibrogénesis imperfecta ósea, trastornos osteoescleróticos y daño ocasionado por procesos inflamatorios mediados por macrófagos.
15. Procedimiento para identificar un compuesto inhibidor capaz de afectar la expresión o la función de un polipéptido de SEQ ID NO. 48, o un polipéptido codificado por la SEQ ID NO. 1, en donde el procedimiento comprende poner en contacto dicho polipéptido o una célula que expresa dicho polipéptido con un compuesto candidato y medir la expresión o la función de dicho polipéptido, por medio de lo cual una reducción de la capacidad del polipéptido para favorecer la diferenciación de los osteoclastos identifica positivamente un compuesto inhibidor adecuado.
16. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 15, que además comprende una etapa de inducción de la diferenciación de los osteoclastos cuando se pone en contacto dicho polipéptido o célula con un compuesto candidato.
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Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8168181B2 (en) 2006-02-13 2012-05-01 Alethia Biotherapeutics, Inc. Methods of impairing osteoclast differentiation using antibodies that bind siglec-15
CA2822302A1 (en) 2006-02-13 2007-08-23 Alethia Biotherapeutics Inc. Methods of impairing osteoclast differentiation
KR101534884B1 (ko) * 2007-10-11 2015-07-08 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 파골 세포 관련 단백질 Ｓｉｇｌｅｃ-15 를 표적으로 한 항체
WO2009074644A1 (en) * 2007-12-12 2009-06-18 Dsm Ip Assets B.V. Compositions comprising hydroxytyrosol and chondroitin and use thereof for the treatment, co-treatment or prevention of inflammatory disorders
JP5574600B2 (ja) * 2007-12-17 2014-08-20 日本製薬工業株式会社 吸収性骨疾患の予防・治療剤
EP2376090A4 (en) * 2008-11-21 2012-11-28 David Gladstone Inst SUPPRESSION OF APOE SPALTACTIVITY IN THE TREATMENT OF DISEASES RELATED TO APOE
KR101690340B1 (ko) * 2009-04-09 2016-12-27 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 항 Ｓｉｇｌｅｃ-15 항체
MX2013003828A (es) 2010-10-05 2013-06-28 Daiichi Sankyo Co Ltd Anticuerpo dirigido a la proteina lectina tipo inmunoglobulina de union a acido sialico-15 relacionada con osteoclastos.
KR20150003170A (ko) 2012-03-30 2015-01-08 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 ＣＤＲ 개변 항 Ｓｉｇｌｅｃ-15 항체
CA2868965A1 (en) 2012-03-30 2013-10-03 Daiichi Sankyo Company, Limited Anti-siglec-15 antibody
CA2876517C (en) 2012-07-19 2019-01-08 Matthew Stuible Anti-siglec-15 antibodies
JP2014230493A (ja) * 2013-05-28 2014-12-11 三菱レイヨン株式会社 間葉系幹細胞からの分化状態を識別する遺伝子群及び分化状態の評価方法
DK3515478T3 (da) 2016-09-21 2024-05-21 Nextcure Inc Antistoffer til SIGLEC-15 og fremgangsmåder til anvendelse deraf
CN110913905A (zh) 2017-06-30 2020-03-24 国立大学法人北海道大学 不产生生长障碍的小儿骨质疏松症治疗药
CN114560924B (zh) * 2022-02-21 2023-06-20 华南理工大学 一种促进成骨细胞分化的含硒特立帕肽和融合多肽及其应用

Family Cites Families (220)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6018030A (en) * 1986-11-04 2000-01-25 Protein Polymer Technologies, Inc. Peptides comprising repetitive units of amino acids and DNA sequences encoding the same
US5589458A (en) 1992-11-13 1996-12-31 Thomas Jefferson University Compounds that inhibit T cell proliferation and methods for using the same
US5817303A (en) * 1995-05-05 1998-10-06 Protein Polymer Technologies, Inc. Bonding together tissue with adhesive containing polyfunctional crosslinking agent and protein polymer
US5712127A (en) 1996-04-29 1998-01-27 Genescape Inc. Subtractive amplification
US5871917A (en) 1996-05-31 1999-02-16 North Shore University Hospital Research Corp. Identification of differentially methylated and mutated nucleic acids
US6617434B1 (en) 1996-05-31 2003-09-09 North Shore Long Island Jewish Research Institute Identificiaton of differentially methylated and mutated nucleic acids
US7411051B2 (en) * 1997-03-07 2008-08-12 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies to HDPPA04 polypeptide
US6057098A (en) 1997-04-04 2000-05-02 Biosite Diagnostics, Inc. Polyvalent display libraries
FR2767337B1 (fr) 1997-08-14 2002-07-05 Pasteur Institut Sequences nucleiques de polypeptides exportes de mycobacteri es, vecteurs les comprenant et applications au diagnostic et a la prevention de la tuberculose
JP2002505108A (ja) 1998-03-04 2002-02-19 ジェネンコア インターナショナル インコーポレーテッド プルラナーゼの修飾形態
US6472367B1 (en) 1998-05-05 2002-10-29 Adherex Technologies, Inc. Compounds and methods for modulating OB-cadherin mediated cell adhesion
US7090976B2 (en) * 1999-11-10 2006-08-15 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions comprising Renilla GFP
US7060433B1 (en) * 1999-11-12 2006-06-13 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for screening using diphtheria toxin constructs
US7534579B2 (en) 1998-06-30 2009-05-19 Millennium Pharmaceuticals, Inc. 14273 receptor, a novel G-protein coupled receptor
US7662409B2 (en) * 1998-09-25 2010-02-16 Gel-Del Technologies, Inc. Protein matrix materials, devices and methods of making and using thereof
US7488590B2 (en) * 1998-10-23 2009-02-10 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
US20030104526A1 (en) 1999-03-24 2003-06-05 Qiang Liu Position dependent recognition of GNN nucleotide triplets by zinc fingers
US6943235B1 (en) * 1999-04-12 2005-09-13 Agensys, Inc. Transmembrane protein expressed in prostate cancer
US6942981B1 (en) * 1999-05-14 2005-09-13 Arbor Vita Corporation Method of determining interactions with PDZ-domain polypeptides
US20090175821A1 (en) * 1999-05-17 2009-07-09 Bridon Dominique P Modified therapeutic peptides with extended half-lives in vivo
AU6226100A (en) 1999-07-19 2001-04-24 Epimmune, Inc. Inducing cellular immune responses to hepatitis c virus using peptide and nucleic acid compositions
EP1074617A3 (en) * 1999-07-29 2004-04-21 Research Association for Biotechnology Primers for synthesising full-length cDNA and their use
EP1250434B1 (en) * 2000-01-26 2008-04-16 Agensys, Inc. 84p2a9: a prostate and testis specific protein highly expressed in prostate cancer
US7585839B2 (en) 2000-02-23 2009-09-08 Zealand Pharma A/S Medical uses of intercellular communication facilitating compounds
US7378248B2 (en) 2000-03-06 2008-05-27 Rigel Pharmaceuticals, Inc. In vivo production of cyclic peptides for inhibiting protein-protein interaction
US7358330B2 (en) 2001-03-29 2008-04-15 Biotempt B.V. Immunoregulatory compositions
EP1300418A1 (en) * 2001-10-04 2003-04-09 Erasmus Universiteit Rotterdam Gene regulation by oligopeptides
US6635448B2 (en) * 2000-08-21 2003-10-21 Clonexdevelopment, Inc. Methods and compositions for increasing protein yield from a cell culture
US7358353B2 (en) 2000-08-22 2008-04-15 Agensys, Inc. Nucleic acid and corresponding protein named 158P1D7 useful in the treatment and detection of bladder and other cancers
CA2421271A1 (en) 2000-09-08 2002-03-14 Board Of Regents, The University Of Texas System Human and mouse targeting peptides identified by phage display
US20040082508A1 (en) * 2000-11-08 2004-04-29 Henry Yue Secreted proteins
US7608704B2 (en) 2000-11-08 2009-10-27 Incyte Corporation Secreted proteins
AU2002222747A1 (en) * 2000-12-12 2002-06-24 Angiolab, Inc. Composition comprising melissa leaf extract for anti-angiogenic and matrix metalloproteinase inhibitory activity
US7459539B2 (en) * 2000-12-15 2008-12-02 Agensys, Inc. Antibody that binds zinc transporter protein 108P5H8
US20030133939A1 (en) 2001-01-17 2003-07-17 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US7754208B2 (en) 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
JPWO2002064771A1 (ja) * 2001-02-15 2004-06-17 持田製薬株式会社 活性化白血球に特異的な新規細胞接着分子
EP1379265A4 (en) 2001-03-28 2005-09-14 Helix Biomedix Inc SHORT BIOACTIVE PEPTIDES AND METHODS OF USE
CA2443123A1 (en) 2001-04-10 2002-10-24 Agensys, Inc. Nuleic acids and corresponding proteins useful in the detection and treatment of various cancers
US6967021B2 (en) 2001-04-27 2005-11-22 Trustees Of Tufts College Use of Galectin-3 to promote the re-epithelialization of wounds
ATE389022T1 (de) 2001-05-07 2008-03-15 Ca Nat Research Council Verstärkte herstellung rekombinanter proteine mittels transienter transfektion von in suspension wachsenden säugerzellen
WO2002102432A1 (en) * 2001-06-15 2002-12-27 Johns Hopkins Singapore Pte Ltd Biofunctional fibers
CN103232539B (zh) † 2001-06-26 2015-06-03 安姆根弗里蒙特公司 抗opgl抗体
US7033991B2 (en) 2001-07-16 2006-04-25 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agriculture And Mechanical College Inhibiting furin with polybasic peptides
AU2002367839A1 (en) 2001-07-16 2003-11-17 Hk Pharmaceuticals, Inc. Capture compounds, collections thereof and methods for analyzing the proteome and complex compositions
US20090075377A1 (en) * 2001-08-03 2009-03-19 Arbor Vita Corporation Molecular interactions in cells
US7402664B2 (en) * 2002-09-03 2008-07-22 Genencor International, Inc. Nucleic acids and expression vectors comprising carotenoid binding peptides
JP4120778B2 (ja) * 2001-09-26 2008-07-16 国立大学法人 奈良先端科学技術大学院大学 骨代謝異常疾患マーカー及びその利用
US20050107588A1 (en) * 2001-11-13 2005-05-19 Duggan Brendan M. Receptors and membrane-associated proteins
JP2003210166A (ja) 2001-11-16 2003-07-29 Sanyo Chem Ind Ltd 変温動物由来細胞の細胞接着基材
US20080318871A1 (en) 2001-12-21 2008-12-25 Khan Nisar A Treatment of neurological disorders
US20080242837A1 (en) 2001-12-21 2008-10-02 Khan Nisar A Peptide compositions
US7786084B2 (en) * 2001-12-21 2010-08-31 Biotempt B.V. Treatment of burns
US7501391B2 (en) * 2001-12-21 2009-03-10 Biotempt B.V. Treatment of transplant survival
US20080242618A1 (en) 2001-12-21 2008-10-02 Khan Nisar A Stratification
US20080194489A1 (en) * 2001-12-21 2008-08-14 Khan Nisar A Treatment of iatrogenic disease
US7560433B2 (en) * 2001-12-21 2009-07-14 Biotempt B.V. Treatment of multiple sclerosis (MS)
JP2005525096A (ja) 2002-01-09 2005-08-25 ユニバーシティ オブ ローザンヌ Ｊｎｋシグナル伝達経路の細胞浸透性ペプチドインヒビター
US7514407B2 (en) * 2002-03-04 2009-04-07 Nymox Corporation Spheron component peptides and pharmaceutical compositions
US8298606B2 (en) * 2002-03-08 2012-10-30 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for stabilizing the myocardium
WO2003080671A1 (en) † 2002-03-21 2003-10-02 Komed Co., Ltd. Anti-rank monoclonal antibodies and pharmaceutical composition containing the same
US7193069B2 (en) 2002-03-22 2007-03-20 Research Association For Biotechnology Full-length cDNA
MXPA04009681A (es) † 2002-04-05 2005-01-11 Amgen Inc Anticuerpos humanos neutralizantes anti-ligando de osteoprotegerina como inhibidores selectivos de la ruta del ligando de osteoprotegerina.
US20040102608A1 (en) * 2002-05-13 2004-05-27 Cornell Research Foundation, Inc. Multiblock copolymers having improved mechanical properties
AU2003239531A1 (en) * 2002-05-17 2003-12-02 Montana State University Protein cages for the delivery of medical imaging and therapy
EP1513934B1 (en) 2002-06-06 2011-03-02 Oncotherapy Science, Inc. Genes and polypeptides relating to human colon cancers
CA2491053A1 (en) * 2002-06-28 2004-01-08 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw Use of antibodies against flt-1 for the treatment of osteoporosis
WO2004013172A2 (en) 2002-07-24 2004-02-12 Innogenetics N.V. Fragments of beta-amyloid as targets for vaccination against alzheimer disease
US20060135433A1 (en) * 2002-10-08 2006-06-22 Murray Christopher J Phenolic binding peptides
WO2004041845A2 (en) 2002-11-01 2004-05-21 Trustees Of Tufts College Templated native silk smectic gels
PT2312318E (pt) 2002-12-03 2015-01-14 Univ North Carolina State Ligandos a proteína de prião e métodos de uso
JP2004189848A (ja) 2002-12-10 2004-07-08 Giken:Kk 炭化処理方法および炭化処理システム
CA2513549C (en) 2003-01-16 2009-05-05 Hk Pharmaceuticals, Inc. Capture compounds, collections thereof and methods for analyzing the proteome and complex compositions
JP3906924B2 (ja) 2003-02-28 2007-04-18 独立行政法人農業生物資源研究所 絹タンパクから細胞生育ペプチドの抽出と利用
WO2004085633A1 (en) * 2003-03-24 2004-10-07 The University Of Hong Kong A novel human virus causing severe acute respiratory syndrome (sars) and uses thereof
WO2004085650A1 (en) * 2003-03-24 2004-10-07 The University Of Hong Kong A high-troughput diagnostic assay for the human virus causing severe acute respiratory syndrome (sars)
US7517529B2 (en) * 2003-04-08 2009-04-14 Biotempt B.V. Treatment of type I diabetes
JP4698596B2 (ja) 2003-04-10 2011-06-08 タフツ ユニバーシティー 濃縮された水性シルクフィブロイン溶液およびそれらの使用
EP2357237A1 (en) * 2003-05-14 2011-08-17 Domantis Limited A process for recovering polypeptides that unfold reversibly from a polypeptide repertoire
JP3915983B2 (ja) 2003-05-27 2007-05-16 ゼライス株式会社 プロテアーゼ、このプロテアーゼをコードするｄｎａ、プロテアーゼの製造方法
US7671011B2 (en) * 2003-06-19 2010-03-02 Yeda Research & Development Co. Ltd. Antimicrobial and anticancer lipopeptides
US20050106667A1 (en) * 2003-08-01 2005-05-19 Genentech, Inc Binding polypeptides with restricted diversity sequences
FR2860237B1 (fr) 2003-09-30 2006-03-10 Centre Nat Rech Scient Polypeptide d'interaction comprenant un motif heptapeptidique et un domaine de penetration cellulaire
US20050118625A1 (en) * 2003-10-02 2005-06-02 Mounts William M. Nucleic acid arrays for detecting gene expression associated with human osteoarthritis and human proteases
US20090226374A1 (en) 2003-10-27 2009-09-10 Health Aide, Inc. Anaphylatoxins for detecting clinical conditions
WO2005043163A2 (en) * 2003-11-04 2005-05-12 Roche Diagnostics Gmbh Method for distinguishing who classified aml subtypes
US20050153333A1 (en) * 2003-12-02 2005-07-14 Sooknanan Roy R. Selective terminal tagging of nucleic acids
AT412785B (de) 2003-12-04 2005-07-25 Kungl Andreas J Dr Gag-bindungsproteine
EP1544215A1 (en) 2003-12-17 2005-06-22 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Human anti-idiotypic antibody fragments that mimic HER-2/neu
WO2005063983A1 (en) * 2003-12-29 2005-07-14 Galapagos Genomics N.V. Modulators of bone homeostasis identified in a high-throughput screen
US20090227505A1 (en) 2004-01-07 2009-09-10 Biotempt B.V. Methods and uses for protein breakdown products
EP1756272A2 (en) * 2004-01-09 2007-02-28 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Compounds, pharmaceutical compositions and therapeutic methods of preventing and treating diseases and disorders associated with amyloid fibril formation
WO2005072392A2 (en) * 2004-01-28 2005-08-11 John Hopkins University Methods for making and using molecular switches involving circular permutation
TWI359026B (en) 2004-02-12 2012-03-01 Sankyo Co Pharmaceutical composition for the osteoclast rela
AU2005214382B2 (en) 2004-02-19 2011-08-04 Genentech, Inc. CDR-repaired antibodies
EP1751179A4 (en) 2004-03-01 2009-03-25 Peptera Pharmaceuticals Ltd PEPTIDES DERIVED FROM THE CASEIN AND THEIR THERAPEUTIC USES
WO2005098043A2 (en) * 2004-03-30 2005-10-20 The President And Fellows Of Harvard College Ligand-dependent protein splicing
US7253273B2 (en) * 2004-04-08 2007-08-07 Sangamo Biosciences, Inc. Treatment of neuropathic pain with zinc finger proteins
US7189697B2 (en) 2004-04-13 2007-03-13 Trustees Of Tufts College Compositions and uses of a galectin for treatment of dry eye syndrome
WO2005109158A2 (en) * 2004-05-05 2005-11-17 Massachusetts Institute Of Technology Methods and systems for generating peptides
WO2006010057A2 (en) 2004-07-08 2006-01-26 Amgen Inc. Therapeutic peptides
US20080287309A1 (en) 2004-07-10 2008-11-20 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods for Discovering Antibodies Specific to Cancer Cells and Antibodies Discovered Thereby
AT413946B (de) * 2004-07-13 2006-07-15 Mattner Frank Dr Impfstoff gegen die alzheimer-krankheit
EP2612679A1 (en) 2004-07-29 2013-07-10 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Immunogenic compositions for gram positive bacteria such as streptococcus agalactiae
CA2575622A1 (en) * 2004-08-06 2006-02-09 Sopherion Therapeutics, Inc. Anti-angiogenic peptides and methods of use thereof
JP2006068378A (ja) 2004-09-03 2006-03-16 Terumo Corp 血管内留置物
US7265092B2 (en) * 2004-09-30 2007-09-04 Kai Pharmaceuticals, Inc. Pharmaceutical formulation
CA2583843C (en) * 2004-10-13 2010-09-21 Crucell Holland B.V. Improved adenoviral vectors and uses thereof
CA2583399A1 (en) * 2004-10-14 2006-04-27 Sopherion Therapeutics, Inc. Anti-angiogenic peptides and methods of use thereof
ES2572779T3 (es) * 2004-10-29 2016-06-02 Ratiopharm Gmbh Remodelación y glucopegilación del Factor de Crecimiento de Fibroblastos (FGF)
EP1824976A4 (en) * 2004-11-12 2008-07-09 Univ British Columbia ANTIMICROBIAL PEPTIDES
WO2007046818A2 (en) 2004-11-16 2007-04-26 Board Of Regents, The University Of Texas System Compositions and methods related to synchronous selection of homing peptides for multiple tissues by in vivo phage display
US8022040B2 (en) 2004-11-29 2011-09-20 The Regents Of The University Of California Hydroxyapatite-binding peptides for bone growth and inhibition
WO2006063462A1 (en) † 2004-12-13 2006-06-22 Alethia Biotherapeutics Inc. Polynucleotides and polypeptide sequences involved in the process of bone remodeling
US20060160157A1 (en) * 2005-01-19 2006-07-20 Zuckerman Mathew M Method, compositions and classification for tumor diagnostics and treatment
ES2417133T3 (es) * 2005-02-03 2013-08-06 Antitope Limited Anticuerpos y proteínas humanas
CA2597191C (en) * 2005-02-09 2014-04-01 Helix Biomedix Inc. Antimicrobial hexapeptides
US8551774B2 (en) 2005-03-17 2013-10-08 National Research Council Of Canada Expression vectors containing a truncated epstein barr nuclear antigen 1 lacking the Gly-Gly-Ala domain for enhanced transient gene expression
US9162005B2 (en) 2005-04-25 2015-10-20 Arch Biosurgery, Inc. Compositions for prevention of adhesions and other barrier applications
CA2605931A1 (en) * 2005-04-26 2006-11-02 Karyon-Ctt Ltd Diagnostic and therapeutic agents
AU2006247188A1 (en) 2005-05-18 2006-11-23 Children's Hospital & Research Center At Oakland Methods and compositions for immunizing against chlamydia infection
US7528232B2 (en) * 2005-05-20 2009-05-05 The University Of Kentucky Research Foundation Utility of phylloplanins as antibiotics, selective fungicides and for enhancing microbial resistance in crop plants
US8227573B2 (en) 2005-05-20 2012-07-24 University Of Kentucky Research Foundation Utility of phylloplanins as antibiotics, selective fungicides and for enhancing microbial resistance in plants
WO2007004869A2 (en) * 2005-07-05 2007-01-11 Biotempt B.V. Treatment of tumors
JP4604184B2 (ja) * 2005-07-12 2010-12-22 独立行政法人産業技術総合研究所 新規糖鎖認識蛋白質及びその遺伝子
US20100056457A1 (en) * 2005-08-11 2010-03-04 Barbas Iii Carlos F Zinc Finger Binding Domains for CNN
EP1945656A2 (en) 2005-08-22 2008-07-23 Genencor International, Inc. Nanocomposites of repeat sequence proteins and phyllosilicate clays and their preparation
WO2007027954A2 (en) 2005-08-30 2007-03-08 Children's Hospital & Research Center At Oakland Methods for identifying an epitope of a polypeptide, chlamydial antigenic polypeptides identified thereby, and methods of use thereof
WO2007034490A2 (en) 2005-09-22 2007-03-29 Yeda Research And Development Co. Ltd., At The Weizmann Institute Of Science Diastereomeric peptides for modulating t cell immunity
US8124738B2 (en) 2005-09-26 2012-02-28 Medarex, Inc. Human monoclonal antibodies to CD70
US7846445B2 (en) 2005-09-27 2010-12-07 Amunix Operating, Inc. Methods for production of unstructured recombinant polymers and uses thereof
US20090099031A1 (en) * 2005-09-27 2009-04-16 Stemmer Willem P Genetic package and uses thereof
CA2624081C (en) * 2005-09-29 2014-09-16 Medimmune, Inc. Method of identifying membrane ig specific antibodies and use thereof for targeting immunoglobulin-producing precursor cells
US8058391B2 (en) 2005-10-13 2011-11-15 Biocon Limited Process for the preparation of insulin conjugate IN-105
US7575876B2 (en) 2005-10-27 2009-08-18 The University Of Washington Biomarkers for neurodegenerative disorders
UA96139C2 (uk) 2005-11-08 2011-10-10 Дженентек, Інк. Антитіло до нейропіліну-1 (nrp1)
EP1953542B9 (en) * 2005-11-08 2013-11-13 Tohoku University Method of quantifying membrane protein by using mass spectrometer
US8252338B2 (en) * 2005-11-10 2012-08-28 The Regents Of The University Of California Synthetic LDL as targeted drug delivery vehicle
WO2007062422A2 (en) 2005-11-28 2007-05-31 The Scripps Research Institute Zinc finger binding domains for tnn
GB0524313D0 (en) 2005-11-29 2006-01-04 Imp College Innovations Ltd Particles
US8754033B2 (en) 2005-12-16 2014-06-17 National Cancer Center Peptides for inhibiting transglutaminase
CA2822302A1 (en) 2006-02-13 2007-08-23 Alethia Biotherapeutics Inc. Methods of impairing osteoclast differentiation
US8168181B2 (en) 2006-02-13 2012-05-01 Alethia Biotherapeutics, Inc. Methods of impairing osteoclast differentiation using antibodies that bind siglec-15
EP1986611B1 (en) 2006-02-23 2013-05-01 Danisco US Inc. Repeat sequence protein polymer nanoparticles optionally containing active agents and their preparation
US7501557B1 (en) * 2006-02-28 2009-03-10 University Of Kentucky Research Foundation Method utilizing the tobacco phylloplanin promoter for expression of nucleic acids as gene products directed to aerial surfaces of plants
EP1992220B1 (en) * 2006-02-28 2013-05-22 Japan Science and Technology Agency Plant having reduced lignin and cellulose contents without reducing glucan content, method of producing the same and utilization thereof
JP5167155B2 (ja) 2006-03-09 2013-03-21 ザ ボード オブ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティー オブ テキサス システム ペプチド結合に基づく多数の細胞株のプロファイリングに関連した組成物および方法
CN101405384B (zh) * 2006-03-17 2013-12-04 三洋化成工业株式会社 细胞培养用载体以及制造方法和应用
EP1996609B1 (en) 2006-03-22 2016-08-03 The Scripps Research Institute Method of preparing glycopeptides
US7612178B2 (en) 2006-03-28 2009-11-03 Biogen Idec Ma Inc Anti-IGF-1R antibodies and uses thereof
US9283260B2 (en) 2006-04-21 2016-03-15 Amgen Inc. Lyophilized therapeutic peptibody formulations
US8187833B2 (en) 2006-05-08 2012-05-29 Adaerata Limited Partnership Chimeric PCSK9 proteins, cells comprising same, and assays using same
FR2900826B1 (fr) 2006-05-12 2008-08-15 Soc Extraction Principes Actif Utilisation de peptides en tant que principes actifs amincissants.
WO2007146319A2 (en) 2006-06-13 2007-12-21 Symphony Medical, Inc. Methods and apparatus for using polymer-based beads and hydrogels for cardiac applications
EP2046806A4 (en) 2006-07-05 2009-10-21 Scripps Research Inst CHIMERIC RECOMBINASES WITH ZINC FINGERS OPTIMIZED FOR CATALYSIS BY DIRECT EVOLUTION
JP2010507069A (ja) 2006-07-08 2010-03-04 ユニバーシティー オブ ケンタッキー リサーチ ファンデーション 肺癌診断アッセイ
EP2520935A3 (en) 2006-08-09 2013-02-13 Homestead Clinical Corporation Organ-specific proteins and methods of their use
CL2007002502A1 (es) * 2006-08-31 2008-05-30 Hoffmann La Roche Variantes del factor de crecimiento similar a insulina-1 humano (igf-1) pegilados en lisina; metodo de produccion; proteina de fusion que la comprende; y su uso para tratar la enfermedad de alzheimer.
JP2008094822A (ja) 2006-09-15 2008-04-24 Univ Of Tokyo セルロース結合性ペプチドおよびその製造方法
US8771714B2 (en) * 2006-10-31 2014-07-08 Musc Foundation For Research Development Systems and methods for in vivo measurement of interstitial biological activity, processes and/or compositions
AU2007322252A1 (en) 2006-11-01 2008-05-29 George Mason Intellectual Properties, Inc. Biomarkers for neurological conditions
ITTO20060852A1 (it) * 2006-11-30 2008-06-01 Univ Degli Studi Torino Peptidi metastasi-specifici e loro applicazioni diagnostiche e terapeutiche
JP2010516707A (ja) * 2007-01-19 2010-05-20 カイ ファーマシューティカルズ インコーポレーティッド ペプチド組成物の安定性および送達効率を上昇させるための修飾方法
US9175422B2 (en) * 2007-01-22 2015-11-03 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Polymer-micelle complex as an aid to electrospinning
WO2008093982A1 (en) 2007-01-29 2008-08-07 Procell Therapeutics Inc. Novel macromolecule transduction domains and methods for identification and uses thereof
AR065370A1 (es) 2007-02-16 2009-06-03 Genentech Inc Moduladores de htra1 - pdz y htra3 pdz
US9415084B2 (en) 2007-03-14 2016-08-16 Arch Biosurgery, Inc. Treatment of leaky or damaged tight junctions and enhancing extracellular matrix
US20080299601A1 (en) 2007-03-15 2008-12-04 Invitrogen Corporation Adhering Surfaces
EP2578684B1 (en) 2007-03-19 2016-02-24 National Research Council Of Canada Antagonists of ligands and uses thereof
WO2008116468A2 (en) 2007-03-26 2008-10-02 Dako Denmark A/S Mhc peptide complexes and uses thereof in infectious diseases
JP2008263955A (ja) 2007-03-29 2008-11-06 Sanyo Chem Ind Ltd 無血清培地
US20080306001A1 (en) 2007-04-04 2008-12-11 Anzelika Liik Transcriptional modulation of extracellular matrix (ecm) of dermal fibroblasts
WO2008137122A2 (en) * 2007-05-04 2008-11-13 Shiloh Laoratories, Inc. Inducing premature senescence to stabilize stem cell feeder layer cells
US8097581B2 (en) * 2007-05-10 2012-01-17 Grant Industries Inc. Anti-wrinkle cosmetic composition
US20100093554A1 (en) * 2007-06-01 2010-04-15 Keting Chu Methods for identifying biomarkers, autoantibody signatures, and stratifying subject groups using peptide arrays
EP2009023A1 (en) 2007-06-04 2008-12-31 Rentschler Beteiligungs GmbH Novel peptides and their use for the treatment of edema
JP5328780B2 (ja) * 2007-06-13 2013-10-30 エフ エム シー コーポレーション アルギネート被覆多糖ゲル含有発泡体複合物、その製法および用途
WO2008157299A2 (en) * 2007-06-15 2008-12-24 Wyeth Differential expression profiling analysis of cell culture phenotypes and uses thereof
US20100016215A1 (en) * 2007-06-29 2010-01-21 Avi Biopharma, Inc. Compound and method for treating myotonic dystrophy
ES2694726T3 (es) * 2007-06-29 2018-12-26 Sarepta Therapeutics, Inc. Conjugados peptídicos específicos de tejido y métodos
WO2009008727A2 (en) 2007-07-12 2009-01-15 Prosensa Technologies B.V. Molecules for targeting compounds to various selected organs or tissues
SG183023A1 (en) * 2007-07-16 2012-08-30 Genentech Inc Anti-cd79b antibodies and immunoconjugates and methods of use
US7960336B2 (en) * 2007-08-03 2011-06-14 Pharmain Corporation Composition for long-acting peptide analogs
EP2183963B1 (en) 2007-08-06 2013-09-18 University of Tsukuba Method for producing plant with modified flower morphology
WO2009023125A1 (en) 2007-08-14 2009-02-19 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Neuronostatin and its uses
EP2185701A4 (en) * 2007-08-15 2011-03-02 Amunix Operating Inc COMPOSITIONS AND METHODS FOR ENHANCING THE PRODUCTION OF RECOMBINANT POLYPEPTIDES
EP2192906A4 (en) 2007-08-28 2014-10-29 Fmc Corp DELAYED SELF-GELING ALGINATE SYSTEMS AND USES THEREOF
KR100887266B1 (ko) 2007-09-04 2009-03-06 주식회사 프로셀제약 세포투과성 ｐ１８ 재조합 단백질, 이를 코딩하는폴리뉴클레오티드 및 이를 유효성분으로 함유하는 항암조성물
CN101918556B (zh) 2007-09-04 2013-06-12 株式会社普罗赛尔制药 可穿透细胞的nm23重组蛋白、编码其的多核苷酸以及包含其的抗转移组合物
JP5000439B2 (ja) 2007-09-19 2012-08-15 三洋化成工業株式会社 細胞培養用担体
BRPI0817209A2 (pt) 2007-09-20 2015-03-10 David Gladstone Inst Composições de polipeptídeo de elemento nuclear intercalado longo e métodos de uso das mesmas
EP2197908A2 (en) 2007-09-27 2010-06-23 Dako Denmark A/S Mhc multimers in tuberculosis diagnostics, vaccine and therapeutics
KR101534884B1 (ko) 2007-10-11 2015-07-08 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 파골 세포 관련 단백질 Ｓｉｇｌｅｃ-15 를 표적으로 한 항체
GB0720156D0 (en) 2007-10-15 2007-11-28 Univ Nottingham Trent Breast cancer associated antigen
PL2205623T3 (pl) * 2007-10-29 2016-09-30 Ochronne tetrapeptydy do pielęgnacji skóry
JP6039879B2 (ja) 2007-11-05 2016-12-07 ノルディック・ビオサイエンス・エー／エスＮｏｒｄｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ａ／Ｓ Ｃｖｄリスク評価のための生化学マーカー
US7923253B2 (en) * 2007-11-05 2011-04-12 Battelle Memorial Institute Method for identifying type I diabetes mellitus in humans
KR20100093523A (ko) 2007-11-06 2010-08-25 주식회사 프로셀제약 세포투과성 ｒｕｎｘ３ 재조합 단백질, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 이를 유효성분으로 함유하는 항암 조성물
EP2217614A4 (en) 2007-11-07 2011-12-07 Dynamic Microbials Ltd ANTIMICROBIAL COMPOSITIONS, FORMULATIONS AND APPLICATIONS THEREOF
WO2009061890A1 (en) 2007-11-08 2009-05-14 St. Jude Children's Research Hospital Methods and compositions for the diagnosis, prognosis and treatment of chronic myeloid leukemia and acute lymphoblastic leukemia
JP4932940B2 (ja) 2007-11-12 2012-05-16 セラクローン サイエンシーズ， インコーポレイテッド インフルエンザの治療および診断のための組成物および方法
FR2925501B1 (fr) 2007-12-21 2012-12-14 Vincience Peptide activateur de la synthese des aquaporines et composition cosmetique et/ou pharmaceutique le contenant
FR2925500B1 (fr) 2007-12-21 2011-05-06 Vincience Peptide derive d'une proteine de la famille des aquaporines et composition cosmetique et/ou pharmaceutique le contenant
WO2009090651A2 (en) 2008-01-15 2009-07-23 Technion Research And Development Foundation Ltd. Major histocompatibility complex hla-b2705 ligands useful for therapy and diagnosis
JP5788178B2 (ja) 2008-01-23 2015-09-30 ダナ ファーバー キャンサー インスティテュート インコーポレイテッド ウィルス感染症の治療のための組成物及び方法
EP2250278B1 (en) 2008-02-21 2023-04-05 Burnham Institute for Medical Research Methods and compositions related to peptides and proteins with c-terminal elements
US20090298707A1 (en) 2008-03-18 2009-12-03 The Regents Of The University Of California Sparse matrix system and method for identification of specific ligands or targets
WO2009146179A1 (en) 2008-04-15 2009-12-03 University Of Iowa Research Foundation Zinc finger nuclease for the cftr gene and methods of use thereof
EP2113255A1 (en) 2008-05-02 2009-11-04 f-star Biotechnologische Forschungs- und Entwicklungsges.m.b.H. Cytotoxic immunoglobulin
US20090281038A1 (en) 2008-05-09 2009-11-12 University Of Kentucky Research Foundation Phylloplanins Inhibition of Microbial Growth on Organic Materials
WO2009139599A2 (ko) 2008-05-16 2009-11-19 주식회사 프로셀제약 세포투과성 p27 재조합 단백질, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 이를 유효성분으로 함유하는 항암 조성물
CA2728926A1 (en) 2008-07-04 2010-01-07 Basf Plant Science Gmbh Plants having enhanced yield-related traits and a method for making the same by overexpressing a polynucleotide encoding a tfl1-like protein
HUE029341T2 (en) * 2008-09-17 2017-02-28 Xencor Inc IgE-specific antibody
JP5299956B2 (ja) 2008-09-29 2013-09-25 国立大学法人東北大学 質量分析装置を用いた代謝酵素群の一斉タンパク質定量に用いるペプチド
WO2010037395A2 (en) 2008-10-01 2010-04-08 Dako Denmark A/S Mhc multimers in cancer vaccines and immune monitoring
EA028336B1 (ru) 2009-03-05 2017-11-30 МЕДАРЕКС Л.Л.Си. Полностью человеческие антитела, специфические в отношении cadm1
KR101690340B1 (ko) 2009-04-09 2016-12-27 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 항 Ｓｉｇｌｅｃ-15 항체
WO2011136911A2 (en) 2010-04-09 2011-11-03 Aveo Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbb3 antibodies
MX2013003828A (es) 2010-10-05 2013-06-28 Daiichi Sankyo Co Ltd Anticuerpo dirigido a la proteina lectina tipo inmunoglobulina de union a acido sialico-15 relacionada con osteoclastos.
CA2876517C (en) 2012-07-19 2019-01-08 Matthew Stuible Anti-siglec-15 antibodies

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