CN109557306B - 一种赭曲霉毒素a降解酶及其应用和检测赭曲霉毒素a的免疫层析试纸条 - Google Patents

一种赭曲霉毒素a降解酶及其应用和检测赭曲霉毒素a的免疫层析试纸条 Download PDF

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Abstract

本发明涉及免疫检测技术领域，公开了一种赭曲霉毒素A降解酶及其应用和检测赭曲霉毒素A的免疫层析试纸条。本发明所述赭曲霉毒素A降解酶具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。本发明利用所述赭曲霉毒素A降解酶特异性结合赭曲霉毒素A的特性制作胶体金免疫层析试纸条，与赭曲霉毒素A具有更高的亲和力，灵敏度高；具有更强的特异性，与其他毒素无交叉；且受体可以体外原核表达，与抗体相比较具有产量高，周期短，成本低的优势，且整个过程可控；免疫层析试纸条检测赭曲霉毒素A时无需任何其他试剂，加入处理后的样品液后，5‑10min即可获得结果，大大提高效率，可实现赭曲霉毒素A的现场快速检测。

Description

一种赭曲霉毒素A降解酶及其应用和检测赭曲霉毒素A的免疫 层析试纸条
技术领域
本发明涉及免疫检测技术领域，具体涉及一种赭曲霉毒素A降解酶及其应用和检测赭曲霉毒素A的免疫层析试纸条。
背景技术
据调查发现，全球40％以上的粮食作物在储存和运输过程中受霉菌的影响，且霉菌在代谢过程中产生毒素。真菌毒素是产毒真菌产生的一类次生代谢产物，主要包括黄曲霉毒素、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、伏马毒素、赭曲霉毒素和T-2毒素等。其中赭曲霉毒素是继黄曲霉毒素后又一种重要的污染食品的真菌毒素。赭曲霉毒素由赭曲霉和纯绿青霉产生，包括结构类似的一类化合物，其中以赭曲霉毒素A的分布最广，毒性最大，国际癌症机构已将其定为B类致癌物。目前报道的赭曲霉毒素主要存在于小麦、玉米、大米、饲料等中。
目前对赭曲霉毒素A检测方法主要有酶联免疫吸附法、免疫亲和柱和荧光分光光度法及高效液相色谱法相结合、高效液相色谱和串联质谱法相结合等，虽然这些方法检测数据准确，分辨率高等，但是它们操作步骤繁琐，耗时较长，对实验人员技术要求高，且仪器价格昂贵，不适合现场快速检测，因此急需开发快速高效、特异准备、操作简便的赭曲霉毒素A的检测方法。
胶体金免疫层析法是近年来出现的一种操作简单快速、成本低廉，便于现场操作的检测方法。胶体金免疫层析法利用抗原抗体特异性识别进行检测，但是抗体制作成本高，周期长，批间差异大，不利于产品的制作。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种赭曲霉毒素A降解酶，使其能够特异性结合赭曲霉毒素A，并可应用于赭曲霉毒素A的免疫检测中；
本发明的另外一个目的在于提供一种基于上述赭曲霉毒素A降解酶的检测赭曲霉毒素A的免疫层析试纸条，使得所述试纸条能够检测赭曲霉毒素A，并具备较高的特异性和灵敏度，检测效率高，制备工艺简单。
为了实现上述发明目的，本发明提供了如下技术方案：
一种赭曲霉毒素A降解酶，具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
本发明所提供的赭曲霉毒素A降解酶可以与赭曲霉毒素A特异结合，基于这种特性采用类似Elisa方法中的竞争法原理，让赭曲霉毒素A-胶体金标记物和待测样品中的赭曲霉毒素A竞争结合所述赭曲霉毒素A降解酶，以此实现检测赭曲霉毒素A的目的。
基于此，本发明提供了所述赭曲霉毒素A降解酶在检测赭曲霉毒素A和/或制备检测赭曲霉毒素A的免疫检测产品中的应用。
在本发明具体实施方式中，所述免疫检测产品为免疫层析试纸条，更具体地为免疫层析胶体金试纸条。
依据上述应用，本发明提供了一种检测赭曲霉毒素A的免疫层析试纸条，包括赭曲霉毒素A降解酶-胶体金标记物、IgG-胶体金标记物和试纸条；所述试纸条上的检测线包被有赭曲霉毒素A，所述质控线包被有抗IgG抗体；所述赭曲霉毒素A降解酶具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
其中，所述赭曲霉毒素A降解酶-胶体金标记物和IgG-胶体金标记物在实际使用时需将两者混合使用，两者工作时的体积比为1:1；故两者可组成混合试剂，也可分开单独成一种试剂；
所述试纸条具备一般免疫层析试纸条的结构，在本发明具体实施方式中，所述试纸条包括样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫，三者顺次搭接在基板上，硝酸纤维素膜上标记有检测线和质控线，示意图参见图1；所述基板优选为PVC基板，所述样品垫优选为吸油纸；所述吸水垫优选为吸水纸。
在本发明具体实施方式中，所述IgG为小鼠IgG，所述抗IgG抗体为羊抗鼠IgG。
本发明所述免疫层析试纸条经测试，灵敏度在5ng/mL；此外，同时检测赭曲霉毒素A、黄曲霉毒素M1、T-2毒素、伏马毒素、玉米赤霉烯酮和黄曲霉毒素B1，所述免疫层析试纸条只有赭曲霉毒素A检测线出现消线，为阳性，说明本发明所述免疫层析试纸条对赭曲霉毒素A具有较高的特异性。基于此，本发明提供了所述免疫层析试纸条在检测赭曲霉毒素A中的应用。
同时，本发明提供了所述免疫层析试纸条的制备方法，包括：
制备胶体金颗粒，然后分别用权利要求1所述赭曲霉毒素A降解酶和IgG与胶体金颗粒偶联，获得赭曲霉毒素A降解酶-胶体金标记物以及IgG-胶体金标记物；
将赭曲霉毒素A包被在硝酸纤维素膜上作为检测线，将抗IgG抗体包被在硝酸纤维素膜上作为质控线；
将样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫顺次搭接在背板上组装成试纸条。
其中，所述胶体金颗粒用柠檬酸三钠还原剂将氯金酸还原制成40nm胶体金颗粒的方法制备获得；然后制备的40nm胶体金颗粒2mL调节pH至8.0，加入3μg赭曲霉毒素A降解酶，然后快速混匀3D旋转仪上混匀30min，然后加入终浓度1％BSA 3D旋转混合仪上混匀30min，12000rpm离心10min，用硼酸盐缓冲液0.1mL重悬，得到稳定的赭曲霉毒素A降解酶-胶体金标记物；
将上述步骤中的赭曲霉毒素A降解酶替换为IgG，即可得到IgG-胶体金标记物；
在本发明具体实施方式中，所述检测线包被有赭曲霉毒素A-BSA偶联物。具体为，将赭曲霉毒素A-BSA偶联物用0.01M PBS稀释至2mg/ml，利用胶体金喷金划膜仪在硝酸纤维素膜上划线作为检测线，将抗IgG抗体用0.01M PBS稀释至1mg/ml利用胶体金喷金划膜仪在硝酸纤维素膜上划线作为质控线，37℃烘箱烘干，获得硝酸纤维素膜。所述赭曲霉毒素A-BSA偶联物采用NHS法制备。
由以上技术方案可知，本发明利用所述赭曲霉毒素A降解酶特异性结合赭曲霉毒素A的特性制作胶体金免疫层析试纸条，与赭曲霉毒素A具有更高的亲和力，灵敏度高；具有更强的特异性，与其他毒素无交叉；且受体可以体外原核表达，与抗体相比较具有产量高，周期短，成本低的优势，且整个过程可控；免疫层析试纸条检测赭曲霉毒素A时无需任何其他试剂，加入处理后的样品液后，5-10min即可获得结果，大大提高效率，可实现赭曲霉毒素A的现场快速检测。
附图说明
图1所示为本发明所述免疫层析试纸条中试纸条的结构示意图；1表示基板，2表示样品垫，3表示硝酸纤维素膜，4表示吸水垫，5表示检测线，6为质控线；
图2所示为不同样品采用本发明所述免疫层析试纸条检测的显色结果；其中，1-8依次为0ng/mL、0.5ng/mL、1ng/ml、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、1μg/mL赭曲霉毒素A标准品溶液显色结果，9-15依次为1μg/ml的赭曲霉毒素A、黄曲霉毒素M1、T-2毒素、伏马毒素、玉米赤霉烯酮、黄曲霉毒素B1的溶液和PBS空白对照。
具体实施方式
本发明公开了一种赭曲霉毒素A降解酶及其应用和检测赭曲霉毒素A的免疫层析试纸条，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述赭曲霉毒素A降解酶及其应用和免疫层析试纸条已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述赭曲霉毒素A降解酶及其应用和免疫层析试纸条进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
以下就本发明所提供的一种赭曲霉毒素A降解酶及其应用和检测赭曲霉毒素A的免疫层析试纸条做进一步说明。
实施例1：本发明所述赭曲霉毒素A降解酶的获得
(1)通过基因合成得到赭曲霉毒素A降解酶序列，以合成的序列为模板设计引物并进行基因扩增，使得到的基因两端引入NdeI/XhoI酶切位点，引物序列如下：
上游引物：GGGAATTCCATATGGTCCGCAGACTGGCAT；
下游引物：CCGCTCGAGTTACGCAAAAGGATTCTTGCT；
扩增程序如下：94℃预变性1min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸90s，30个循环，72℃延伸5min，扩增后的基因产物通过PCR产物回收试剂盒进行回收。
(2)回收的PCR产物和原核表达载体pET分别用NdeI/XhoI 37℃进行双酶切2h，酶切后跑1％琼脂糖凝胶电泳，然后用胶回收试剂盒进行回收；将回收的目的片段和pET28a载体用T4连接酶室温连接1h，将连接产物全量转化至DH5α感受态细胞，并涂布到含有硫酸卡那霉素的LB平板上37℃倒置过夜培养；挑取单克隆菌落培养，通过菌液PCR进行初步鉴定，挑取阳性菌液提取质粒进行DNA测序鉴定，通过测序结果比对，与所需DNA完全一致。
(3)将测序正确的重组质粒转化至大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)，37℃倒置过夜培养，挑取单克隆培养并诱导蛋白表达，通过SDS-PAGE胶挑选高表达量的单克隆菌株保存甘油菌，将甘油菌以1:1000的比例接种至50mL含有50μg/mL Kan的LB液体培养基中，37℃210rpm过夜培养，然后加入到含有50μg/mL Kan的1L LB液体培养基中扩大培养，37℃210rpm培养至OD600到0.6，加入终浓度1mM IPTG 20℃195rpm过夜诱导表达，6000rpm10min离心收集菌体，收集的菌体用50mM Hepes 500mM NaCl 5mM咪唑pH7.4重悬，冻存备用。
(4)将菌悬液加入蛋白酶抑制剂，冰浴下超声破碎并18000rpm 4℃30min离心去除沉淀，上清过滤后通过镍柱进行亲和纯化，收集纯化的目的蛋白，通过SDS-PAGE胶检测纯化蛋白的纯度，将纯度大于90％的目的蛋白脱盐浓缩后冻存于液氮中备用。
实施例2：本发明所述免疫层析试纸条的制备
1、赭曲霉毒素A-BSA偶联物的制备
取0.5mg赭曲霉毒素A溶解于500μL四氢呋喃中，加入1mgNHS和1.5mgDCC，室温避光反应24h，10000rpm离心15min并弃沉淀。上清干燥后将残留物溶于200μL DMSO中，即得到活化产物。将活化产物缓慢滴加到BSA溶液中，室温避光剧烈震荡反应4h，反应产物用PBS透析72h，收集备用。
2、制备胶体金颗粒
用柠檬酸三钠还原剂将氯金酸还原制成40nm胶体金颗粒；
3、配套试剂的制备
(1)赭曲霉毒素A降解酶-胶体金标记物的制备
取制备的40nm胶体金颗粒2mL调节pH至8.0，加入3μg赭曲霉毒素A降解酶，然后快速混匀3D旋转仪上混匀30min，然后加入终浓度1％BSA 3D旋转混合仪上混匀30min，12000rpm离心10min，用硼酸盐缓冲液0.1ml重悬，得到稳定的赭曲霉毒素A降解酶-胶体金标记物；
(2)小鼠IgG-胶体金标记物的制备
将步骤(1)中的赭曲霉毒素A降解酶替换为小鼠IgG，即可得到小鼠IgG-胶体金标记物；
(3)配套试剂的制备
将步骤(1)和步骤(2)中制备的赭曲霉毒素A降解酶-胶体金标记物和小鼠IgG-胶体金标记物按体积1:1混合后，即得到配套试剂。
4、硝酸纤维素膜的制备以及试纸条的组装
将赭曲霉毒素A-BSA偶联物用0.01M PBS稀释至2mg/mL，利用胶体金喷金划膜仪在硝酸纤维素膜上划线作为检测线，将羊抗鼠IgG用0.01M PBS稀释至1mg/mL利用胶体金喷金划膜仪在硝酸纤维素膜上划线作为质控线，37℃烘箱烘干。
将样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫顺次固定在PVC板上组装成试纸条。用切条机切成3mm宽的试纸条，4℃冷藏备用。
实施例3：本发明所述免疫层析试纸条的灵敏度和特异性检测
1、灵敏性检测
取1mg/ml的赭曲霉毒素A标准品，用PBS溶液配置成0ng/mL、0.5ng/mL、1ng/ml、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、1μg/mL标准品溶液，分别用实施例2制备的免疫层析试纸条进行检测。
结果如图2显示，随着赭曲霉毒素A浓度的增加，检测线颜色逐渐变弱，该试纸条检测消线浓度为5ng/ml。
2、特异性检测
配置浓度为1μg/ml的赭曲霉毒素A、黄曲霉毒素M1、T-2毒素、伏马毒素、玉米赤霉烯酮、黄曲霉毒素B1的溶液和PBS空白对照，分别用实施例2制备的免疫层析试纸条进行检测。
结果如图2显示，只有赭曲霉毒素A检测线出现消线，为阳性，说明该免疫层析试纸条对赭曲霉毒素A具有特异性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中粮集团有限公司；中粮营养健康研究院有限公司；中粮生物科技（北京）有限公司
<120> 一种赭曲霉毒素A降解酶及其应用和检测赭曲霉毒素A的免疫层析试纸条
<130> MP1830171
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 478
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Val Arg Arg Leu Ala Ser Ala Thr Pro Pro Thr Gln Ser Pro Ser
1 5 10 15
Leu Ala Met Tyr Thr Ala Arg Pro Asn Ser Val Ser Met Asn Ile His
20 25 30
Pro Arg Pro Leu Val Leu Ala Thr Ala Thr Asp Glu Ala Lys Ile Thr
35 40 45
Thr Ile Tyr Ala Asp Leu Leu Ile Pro Gly Ala Gly Glu Leu Leu Arg
50 55 60
Asn Ala Ala Leu Val Ile Ser Asp Lys Val Ile Ala Phe Val Gly Pro
65 70 75 80
Gln Ala Asp Ile Pro Lys Lys Tyr Leu Arg Ser Thr Gln Ser Ser His
85 90 95
His Val Pro Val Leu Met Pro Gly Leu Trp Asp Cys His Met His Phe
100 105 110
Ser Gly Asp Asp Asp Tyr Tyr Ser Asp Tyr Thr Ala Gly Leu Ala Thr
115 120 125
His Pro Ala Ser Ser Gly Ala Arg Leu Ala Arg Gly Cys Trp Glu Gly
130 135 140
Leu Gln Ala Gly Tyr Thr Ser Tyr Arg Asp Leu Ala Gly Tyr Gly Cys
145 150 155 160
Glu Val Ala Lys Ala Ile Asp Asp Gly Thr Ile Val Gly Pro Asn Val
165 170 175
Tyr Ser Ser Gly Ala Ala Ile Ser Gln Thr Ala Gly His Gly Asp Ile
180 185 190
Phe Ala Leu Pro Ala Gly Glu Val Leu Gly Asn Tyr Gly Val Thr Asn
195 200 205
Pro Arg Pro Gly Tyr Trp Gly Ala Gly Gln Leu Cys Ile Ala Asp Gly
210 215 220
Leu Glu Glu Val Arg Arg Ala Val Arg Leu Gln Ile Arg Arg Gly Ala
225 230 235 240
Lys Val Ile Lys Val Met Gly Ser Gly Gly Val Met Ser Arg Asp Asp
245 250 255
Asn Pro Asn Phe Ala Gln Phe Ser Pro Glu Glu Leu Lys Leu Met Val
260 265 270
Asp Glu Ala Ala Arg Gln Asn Arg Ile Val Ser Ala His Val His Gly
275 280 285
Lys Ala Gly Ile Met Ala Ala Ile His Ala Gly Cys Lys Ser Leu Glu
290 295 300
His Val Ser Tyr Ala Asp Asp Glu Val Tyr Glu Leu Met Lys Glu Lys
305 310 315 320
Gly Val Leu Tyr Val Gly Thr Arg Ala Val Val Glu Leu Leu Leu Ala
325 330 335
Ser Asn Gly Glu Gly Leu Val Lys Glu Ser Trp Ala Lys Val Gln Ala
340 345 350
Leu Ala Asp Ala His Leu Lys Ala Tyr Gln Gly Ala Val Lys Ala Gly
355 360 365
Val Thr Met Ala Leu Gly Thr Asp Thr Ala Pro Gly Gly Pro Thr Thr
370 375 380
Leu Glu Leu Gln Phe Ala Val Glu Lys Gly Gly Met Thr Pro Leu Glu
385 390 395 400
Ala Ile Arg Ala Ala Thr Ala Asn Ala Pro Leu Ser Val Gly Pro Gln
405 410 415
Ala Pro Leu Thr Gly Gln Leu Arg Glu Gly Tyr Glu Ala Asp Val Ile
420 425 430
Ala Leu Glu Glu Asn Pro Leu Asp Asp Ile Lys Val Phe Gln Asp Pro
435 440 445
Lys Val Ile Thr His Val Trp Lys Gly Gly Lys Leu Phe Lys Gly Pro
450 455 460
Gly Val Gly Pro Trp Gly Glu Asp Ser Lys Asn Pro Phe Ala
465 470 475

Claims (7)

1.一种检测赭曲霉毒素A的免疫层析试纸条，其特征在于，包括赭曲霉毒素A降解酶-胶体金标记物、IgG-胶体金标记物和试纸条；所述试纸条上的检测线包被有赭曲霉毒素A，质控线包被有抗IgG抗体；所述赭曲霉毒素A降解酶具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述免疫层析试纸条，其特征在于，所述赭曲霉毒素A降解酶-胶体金标记物和IgG-胶体金标记物的工作时质量比为1:1。
3.根据权利要求1或2所述免疫层析试纸条，其特征在于，所述IgG为小鼠IgG。
4.根据权利要求1所述免疫层析试纸条，其特征在于，所述抗IgG抗体为羊抗鼠IgG。
5.根据权利要求1所述免疫层析试纸条，其特征在于，所述试纸条包括样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫，三者顺次搭接在基板上，硝酸纤维素膜上标记有检测线和质控线。
6.权利要求1~5任意一项所述免疫层析试纸条在检测赭曲霉毒素A中的应用。
7.权利要求1所述免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，包括：
制备胶体金颗粒，然后分别用如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的赭曲霉毒素A降解酶和IgG与胶体金颗粒偶联，获得赭曲霉毒素A降解酶-胶体金标记物以及IgG-胶体金标记物；
将赭曲霉毒素A包被在硝酸纤维素膜上作为检测线，将抗IgG抗体包被在硝酸纤维素膜上作为质控线；
将样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫顺次搭接在背板上组装成试纸条。
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