KR102015823B1 - 진균독소 생성 균에 대한 억제능이 우수한 바실러스 서틸리스 ebn-yr47 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 바실러스 서틸리스 EBN-YR47(Bacillus subtilis EBN-YR47, 수탁번호 KCTC18663P) 균주 및 이를 포함하는 항진균 조성물을 제공한다.
본 발명의 바실러스 서틸리스 EBN-YR47 균주 및 이를 포함하는 항진균 조성물은 농산물의 생육 기간 및 저장 유통 중에 생성되어 열에 의해서도 제거되지 않는 아플라톡신, 오크라톡신 및 푸모니신의 분해 기술로 유용하게 사용될 수 있다.
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Description
본 발명은 진균독소 생성 균에 대한 억제능이 우수한 균주에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 진균독소 생성 균에 대한 억제능이 우수한 바실러스 서틸리스 EBN-YR47(Bacillus subtilis EBN-YR47) 및 이를 포함하는 항진균 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 중소기업청에서 지원하는 2017년도 산학연협력 기술개발사업(No. C0499289)의 연구수행으로 인한 결과물임을 밝힌다. [This work (Grants No. C0499289) was supported by Business for Cooperative R&D between Industry, Academy, and Research Institute funded Korea Small and Medium Business Administration in 2017.]
진균독소 (mycotoxin, 곰팡이독소)는 작물의 수확 전후 또는 이동 및 보관 중에 식품과 사료에 생기는 사상성 균류의 2차 대사산물이다. 푸사리움 (Fusarium), 아스퍼질러스 (Aspergillus) 및 페니실리움 (Penicillium)이 아플라톡신 (aflatoxin), 푸모니신 (fumonisin) 그리고 오크라톡신 (ochratoxin)과 같은 진균독소들을 생성하며 세계 농산물의 약 25%가 이들로부터 영향을 받는다 (Food and Agricultural Organization, 1997). 그 중 아플라톡신 (AF)은 보통 아스퍼질러스 플라버스 (Aspergillus flavus)와 아스퍼질러스 파라시티쿠스 (Aspergillus parasiticus)에서 발생하고 쌀, 땅콩, 옥수수 등과 같은 작물에 주로 오염된다. AF는 1962년 10만 마리가 넘는 칠면조가 대량 폐사 (터키 X 질병)하면서 처음으로 분리되어 특성이 조사되었고, 이는 A. flavus로 오염된 땅콩을 섭취한 것이 원인이었다. 아플라톡신은 IARC (International Agency for Research on Cancer)에 의해 Class 1 인간 발암 물질로 평가되었고 (Binder, 2007), 확인된 18종류 중 주요한 종류로 B1, B2, G1 및 G2 등이 있다. 특히, 아플라톡신 B1 (AFB1)은 가장 독성이 강하며 간독성, 발암성, 돌연변이성, 면역 억제성 등 인간과 가축에게 매우 해롭다 (Hussein & Brasel, 2001). AFB1은 다이퓨란쿠마린 (difurancoumarin) 유도체이며, 80-121℃의 일반적인 식품 가공 온도 범위에서도 열에 안정하기 때문에 완전히 제거되지 않는다는 한계가 있다 (Kabak, 2009). 따라서 가축과 인간에게 노출되는 것을 방지하기 위해, AFs에 의한 오염은 전 세계적으로 허용 기준에 대한 규제가 있다 (Wu & Guclu, 2012).
AFs 오염을 조절하기 위한 방법은 독소 생성 A. flavus의 생장을 저해하거나 오염된 식품과 사료에 이미 생성된 AFs를 무독화하는 것이다 (Rao et al., 2017). 대부분의 물리화학적 방법은 제품의 영양적 손실, 품질 저하 그리고 고가의 장비로 인한 높은 비용과 같이 많은 한계가 있다 (Basappa & Shantha, 1996). 미생물 또는 항균물질을 이용한 생물학적 방법은 식품 및 사료에서 독소생성 진균의 생장 억제를 통해 AFs의 오염가능성을 줄이거나 없애는데 효율적이고 구체적이며 환경 친화적이다 (Wu et al., 2009). 이제까지 다양한 진균에 대한 저해 연구가 있었으나 특히 독소생성 진균의 억제에 대해서는 연구가 많지 않았으며 산업에서의 활용성이 아주 크지 않았기 때문에, 더 안전하고 효율적인 독소생성 진균의 억제가 필요하다 (Hassan & Bullerman (2008).
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본 발명의 발명자들은 진균독소 생성 균의 생장을 억제하여 독소 생성 자체를 원천적으로 차단시킬 수 있는 기술에 대하여 연구하던 중, 신규한 바실러스 서틸리스 균주가 진균독소 생성 균의 생장을 거의 완전히 억제함으로써 진균독소 오염을 원천적으로 차단시킬 수 있다는 것을 발견하였다.
따라서, 본 발명은 신규한 바실러스 서틸리스 균주 및 이를 포함하는 항진균 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 측면에 따라, 진균독소 생성 균의 생장을 억제하는 균주 바실러스 서틸리스 EBN-YR47(Bacillus subtilis EBN-YR47, 수탁번호 KCTC18663P)이 제공된다.
일 구현예에서, 상기 진균독소 생성 균은 아플라톡신을 생성하는 아스퍼질러스 플라버스(Aspergillus flavus); 오크라톡신을 생성하는 아스퍼질러스 아와모리(Aspergillus awamori), 아스퍼질러스 프레시니(Aspergillus fresenii) 및 아스퍼질러스 알루타세우스(Aspergillus alutaceus); 푸모니신을 생성하는 푸사리움 푸지쿠로이(Fsarium fugikuroi), 푸사리움 프롤리페라툼(Fusarium proliferatum) 및 푸사리움 버티실로이드(Fusarium verticilloides)를 포함하는 진균독소 생성 진균으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 생장은 진균독소 생성 균의 생장, 이의 포자 생성 및 포자 발아일 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따라, 상기 바실러스 서틸리스 EBN-YR47 균주 또는 그 배양 상등액을 포함하는, 진균독소 생성 균에 대한 항진균 조성물이 제공된다.
본 발명에 의해, 바실러스 서틸리스 EBN-YR47(Bacillus subtilis EBN-YR47, 수탁번호 KCTC18663P)이 아플라톡신을 생성하는 진균인 아스퍼질러스 플라버스 (KACC 44986, 45068, 45146) 세 균주에 대해서 균사 생장을 완전히 저해하였고, 81.16, 69.67 및 82.09%로 포자 발아를 억제하였고, 아스퍼질러스 플라버스의 균사 생장을 최대 76% 저해하였고, 세 종의 아스퍼질러스 플라버스의 포자 생성을 모두 96% 이상 저해하였으며, 배양 2일 차에 아스퍼질러스 플라버스 생장을 완전히 저해하였고, 배양 120시간에서 99% 이상으로 AFB1 생성을 감소시켜 우수한 항진균 활성을 나타낸다는 것이 밝혀졌다. 또한, 바실러스 서틸리스 EBN-YR47 균주는 오크라톡신을 생성하는 아스퍼질러스 아와모리(Aspergillus awamori), 아스퍼질러스 프레시니(Aspergillus fresenii) 및 아스퍼질러스 알루타세우스(Aspergillus alutaceus); 푸모니신을 생성하는 푸사리움 푸지쿠로이(Fsarium fugikuroi), 푸사리움 프롤리페라툼(Fusarium proliferatum) 및 푸사리움 버티실로이드(Fusarium verticilloides)에 대하여도 66% 이상의 생장 저해, 80% 이상의 포자 생성 저해, 61% 이상의 포자 발아 저해능을 나타낸다는 것이 밝혀졌다.
따라서, 본 발명의 바실러스 서틸리스 EBN-YR47 균주 및 이를 포함하는 항진균 조성물은 농산물의 생육 기간 및 저장 유통 중에 생성되어 열에 의해서도 제거되지 않는 아플라톡신, 오크라톡신 및 푸모니신의 분해 기술로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 아가 스팟 어세이 (120 시간, 30 ℃)에서 A. flavus KACC 44986 (A), KACC 45068 (B) 및 KACC 45146 (C)에 대하여 YR47에 의한 생장저해 구역(zone)이 나타난 사진이다.
도 2는 PDA에서 YR47로 처리된 A. flavus KACC 44986 (A), KACC 45068 (B) 및 KACC 45146 (C)의 콜로니가 나타난 사진이다.
도 3은 YR47로 동시접종된 15% YES배지에서 A. flavus KACC 44986 (A, B), 45068 (C, D) 및 45146 (E, F)의 성장 (A, C 및 E) 및 AFB1 생성 (B, D 및 F)을 나타낸 그래프이다 (대조군: ◇, YR47 접종군: △).
도 2는 PDA에서 YR47로 처리된 A. flavus KACC 44986 (A), KACC 45068 (B) 및 KACC 45146 (C)의 콜로니가 나타난 사진이다.
도 3은 YR47로 동시접종된 15% YES배지에서 A. flavus KACC 44986 (A, B), 45068 (C, D) 및 45146 (E, F)의 성장 (A, C 및 E) 및 AFB1 생성 (B, D 및 F)을 나타낸 그래프이다 (대조군: ◇, YR47 접종군: △).
본 발명은 진균독소 생성 균의 생장을 억제하는 균주 바실러스 서틸리스 EBN-YR47(Bacillus subtilis EBN-YR47, 수탁번호 KCTC18663P)을 제공한다.
본 발명의 바실러스 서틸리스 EBN-YR47 균주는 다양한 토양 시료로부터 아가 스팟 어세이를 이용하여 선별되었으며, 16S rRNA 염기서열 분석을 통해 바실러스 서틸리스 EBN-YR47(Bacillus subtilis EBN-YR47, 본 명세서에서 'YR47'로도 지칭됨)로 명명되었다.
일 구현예에서, 상기 진균독소 생성 균은 아플라톡신을 생성하는 아스퍼질러스 플라버스(Aspergillus flavus); 오크라톡신을 생성하는 아스퍼질러스 아와모리(Aspergillus awamori), 아스퍼질러스 프레시니(Aspergillus fresenii) 및 아스퍼질러스 알루타세우스(Aspergillus alutaceus); 푸모니신을 생성하는 푸사리움 푸지쿠로이(Fsarium fugikuroi), 푸사리움 프롤리페라툼(Fusarium proliferatum) 및 푸사리움 버티실로이드(Fusarium verticilloides)를 포함하는 진균독소 생성 진균으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
본 발명의 실시예에서는 본 발명의 YR47 균주가 아플라톡신을 생성하는 아스퍼질러스 플라버스 (KACC 44986, 45068, 45146) 세 균주에 대해서 균사 생장을 완전히 저해하고(도 1 참조), 81.16, 69.67 및 82.09%로 포자 발아를 억제하고, 아스퍼질러스 플라버스의 균사 생장을 최대 76% 저해하고(도 2 참조), 세 종의 아스퍼질러스 플라버스의 포자 생성을 모두 96% 이상 저해하는 것이 확인되었다. 또한, 본 발명의 YR47 균주는 배양 2일 차에 아스퍼질러스 플라버스 생장을 완전히 저해하고, 배양 120시간에서 99% 이상으로 AFB1 생성을 감소시켜 우수한 항진균 활성을 나타내는 것이 확인되었다(도 3 참조).
본 발명은 또한, 상기 바실러스 서틸리스 EBN-YR47 균주 또는 그 배양 상등액을 포함하는, 진균독소 생성 균에 대한 항진균 조성물을 제공한다. 상기 진균독소 생성 균은 상기 기재한 바와 같다.
본 발명은 또한, 상기 바실러스 서틸리스 EBN-YR47 균주 또는 그 배양 상등액을 포함하는 진균독소 생성 억제용 조성물을 제공한다.
일 구현예에서, 상기 진균독소는 아플라톡신, 오크라톡신 및 푸모니신으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 항진균 조성물을 방제 대상물에 접촉시키는 단계를 포함하는 진균독소 생성 균의 방제방법을 제공한다. 상기 진균독소 생성 균은 상기 기재한 바와 같다.
일 구현예에서, 상기 방제 대상물은 농작물, 식품 및 사료로 이루어진 군에서 선택되는 하나일 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 진균독소 생성 억제용 조성물을 억제 대상물에 접촉시키는 단계를 포함하는, 진균독소 생성의 억제 방법을 제공한다.
일 구현예에서, 상기 진균독소는 아플라톡신, 오크라톡신 및 푸모니신으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있으며, 상기 억제 대상물은 농작물, 식품 및 사료로 이루어진 군에서 선택되는 하나일 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 제한되는 것은 아니다.
<실시예>
Ⅰ. 재료 및 방법
1. 균주의 분리 및 동정
진균독소 분해 및 독소 생성 진균의 생장 저해 세균을 분리하기 위해 식물 근권 토양을 주로 하여 다양한 지역에서 시료를 채취하였다 (춘천, 강릉, 속초, 평창, 인천, 양평, 여주 등). 채취한 시료는 50 ml 코니칼 튜브(conical tube)에 0.85% (w/v) NaCl 용액과 1:1 비율로 함께 담아 추출 교반기(extraction shaker, Recipro shaker RS-1, Jeio Tech Co.)로 300 spm (stroke per minute)으로 30분간 진탕하였다. 현탁액은 102배 까지 희석하였고, 선행문헌 [Guan et al. (2008)]을 참고로 하여 쿠마린을 유일 탄소원으로 하는 쿠마린 한천(coumarin agar, CA; coumarin 1 g, KH2PO4 0.25 g, NH4NO3 1 g, CaCl2 0.25 g, MgSO4 ·7H2O 0.25 g, FeSO4 1.0 mg, agar 15 g, 1 L 증류수)배지 및 영양 한천(nutrient agar, NA; yeast extract 3 g, peptone 5 g, glucose 6 g, NaCl 10 g, agar 15 g, 1 L 증류수, pH 7.0)배지에 현탁액을 200 μl씩 첨가하여 도말하였다. 그리고 콜로니가 보일 때까지 최대 7일 동안 37℃에서 배양하였다. 단일 콜로니는 새로운 CA에 3회까지 계대 배양하고 최종적으로 순수 분리한 균주들은 영양 한천 (NA) 평판 배지에 획선 배양하여 4℃에서 보관하였다.
분리한 균주들 중 진균 생장 저해 활성이 우수했던 균주는 ㈜ 마크로젠에 16S rDNA 염기서열 분석을 의뢰하였다. 분석된 염기서열 결과는 National Center for Biotechnology Information (NCBI) 등록 균주들과 상동성을 비교하여 동정하였다. 추가적으로 API kit (50CH와 20E)(Biomerieux, France)를 이용한 생리생화학적 테스트를 통해 종 수준까지 동정하였다.
2. 진균독소 생성 균에 대한
항진균능
및 생장 저해
진균은 국립농업과학원 미생물은행 (Korean Agricultural Culture Collection: KACC)으로부터 아플라톡신을 생성하는 A. flavus KACC 44986, 45068, 45146 세 균주를 분양받아 포테이토 덱스트로오스 한천 (potato dextrose agar, PDA; potato dextrose broth 28 g, agar 15 g, 1 L 증류수) 배지에 30℃에서 7일간 배양 후 이용하였다. 모든 실험에서의 A. flavus 포자 현탁액은 PDA배지에 배양한 진균 포자를 회수한 후 0.05% (v/v) 트윈 80 (Tween 80)에 현탁하여 혈구계(hemocytometer)로 106 spores/ml로 계수하여 이용하였다.
또한, 오크라톡신을 생성하는 아스퍼질러스 아와모리(Aspergillus awamori), 아스퍼질러스 프레시니(Aspergillus fresenii) 및 아스퍼질러스 알루타세우스(Aspergillus alutaceus); 푸모니신을 생성하는 푸사리움 푸지쿠로이(Fsarium fugikuroi), 푸사리움 프롤리페라툼(Fusarium proliferatum) 및 푸사리움 버티실로이드(Fusarium verticilloides)에 대하여 동일한 방법으로 진균 생장, 포자 생성 및 포자 발아에 대한 억제능 시험을 수행하였다.
1) 아가
스팟
어세이 (Agar spot assay)
진균 생장 저해 세균을 선별하기 위해 선행문헌 [Hassan & Bullerman (2008), Sangmanee et al. (2014)]의 방법을 수정하여 아가 스팟 어세이를 수행하였으며, 진균과 세균이 잘 자랄 수 있는 각각의 두 가지 배지 (PDA, NA배지)를 서로 겹쳐서 이용하였다. 우선 NB배지에 배양 (37℃, 48시간, 150 rpm)한 균 배양액 (107 CFU/ml) 5 μl를 NA배지 표면에 2개의 스팟 (spot)을 각각 점적하여 37℃에서 48시간 동안 배양하였다. A. flavus 세 균주의 포자 현탁액은 묽은 PDA (0.8% agar)배지에 최종 포자가 105 spores/ml가 되도록 각각 현탁하여 균이 자란 NA배지 위에 PDA배지 10 ml를 덮어 굳혀주었다. 평판배지는 30℃에서 120시간 동안 배양하며 24시간 주기로 진균이 자라지 않은 억제 직경(mm)을 측정하였다. 대조군은 균을 배양하지 않은 NA배지를 이용하였다.
2) 포자 발아 억제
포자 발아 억제 실험은 선행문헌 [Veras et al. (2016)]의 방법을 이용하여 수행하였다. 효모 추출물 자당 [yeast extract sucrose (YES; 2% yeast extract, 20% sucrose, 1 L 증류수, pH 6.5)]배지 800 μl와 균 현탁액 (107 CFU/ml) 100 μl가 담긴 마이크로튜브 [microtube (1.5 ml)]에 A. flavus 포자 현탁액 100 μl를 각각 첨가하였다. 대조군은 균 현탁액 대신 0.85% NaCl를 사용하였다. 포자 현탁액을 배양한 (25℃, 24시간) 후, 광학현미경으로 포자의 직경과 동일하거나 더 길게 발아한 포자와 발아하지 않은 포자를 구분하여 임의의 총 100개의 포자를 계수하여 포자 발아 억제를 계산하였다.
3) 균사 생장 및 포자 생성 억제
균사 생장 및 포자 생성 억제는 선행문헌 [Veras et al. (2016)]의 방법을 이용하여 수행하였다. 배양액을 원심분리 (4500 g, 4℃, 20분)하여 인산염 완충액에 2회 세척 후 같은 용액에 재현탁하였다. 균 현탁액을 107 CFU/ml로 맞춰 15 ml PDA배지와 최종 농도가 106 CFU/ml가 되도록 함께 섞어 페트리 디쉬 [petri dish (80mm 직경)]에 부어 굳혀주었다. 멸균한 페이퍼 디스크 [paper disc (5mm 직경)]를 한천 표면 중앙에 얹고 세 종의 진균 포자 현탁액 10 μl를 각각 디스크 위에 점적하였다. 대조군으로 균을 넣지 않은 PDA배지를 이용하였다. 모든 플레이트는 25℃에서 10일 동안 배양하여 24시간 주기로 진균이 자란 직경을 측정하였다. 진균 콜로니의 직경은 디스크 중심에서 직각의 두 방향으로 측정하고 (mm) 그 값의 평균으로 계산하였다. 그리고 대조군과 균주 처리구에 대한 균사 생장 억제 정도를 하기 수식 1을 이용하여 계산하였다.
[수식 1]
균사 생장 억제 (%)=[(Dc-Dt)/Dc]100
(Dc는 대조군 평판배지의 진균 콜로니 직경이며, Dt는 처리구 평판배지의 진균 콜로니 직경을 나타낸다.)
10일 후 생장을 모두 끝내고 나면 진균 포자 생산에 대한 균주의 영향을 조사하기 위해 평판배지 내에 자란 포자는 모두 회수하여 0.05% (v/v) 트윈 80 15 ml에 현탁하고 혈구계를 이용하여 계수하였다. 대조군과 처리구의 진균 포자수로부터 포자 생성 억제 정도를 측정하였다.
4) 독소 생성
A. flavus
생장 저해 및 독소 생성 감축
선행문헌 [Karunaratne et al. (1990), Sangmanee et al. (2014)]의 방법을 수정하여 수행하였다. 15% YES (yeast extract 20 g, sucrose 150 g, KH2PO4 1 g, MgSO4 0.5 g, pH 6.2)배지에 최종부피가 50 ml가 되도록 균 배양액 (OD600=1.00±0.05)을 배지의 10%, A. flavus 포자 현탁액 (106 spores/ml)은 배지의 1%로 하여 각각 동시 접종하였다. 대조군은 균 배양액을 첨가하지 않고 포자 현탁액만 첨가하였다. 120시간 동안 배양 (30℃, 200 rpm, 암조건)하고 24시간 주기로 플라스크를 꺼내어 배양액은 와트만 (Whatman) 여과지(No. 1)를 이용하여 멸균수로 세척하며 진균 균사체와 상등액을 분리시켰다. 진균 균사체를 실온에서 완전히 건조시킨 후 무게 (g)를 측정하여 진균 생장 저해 정도를 계산하였다.
상등액에서 A. flavus로부터 생성된 AFB1을 추출하기 위해 상등액에 클로로포름 100 ml씩 첨가하여 추출 교반기로 진탕한 (20분, 300 spm) 후 회수하였다 (2회). 위에서 언급한 AFB1 분석법을 참고하여 추출한 AFB1을 시료 처리하여 HPLC로 분석하였다. 대조군과 처리구의 AFB1 생성이 감축된 정도로부터 독소 생성 감축을 측정하였다.
3. 통계 분석
통계 분석은 SPSS v. 22.0 (IBM SASS statistics 22, USA)를 이용하여 수행하였으며 대조군과 처리구 사이의 유의한 차이는 Student's t-test를 통해 확인하였다. 모든 실험에 대해 p < 0.05 일 때 통계적으로 유의한 차이가 있다고 보았다.
Ⅱ. 결과 및 고찰
1. 균주의 분리 및 동정
다양한 토양 시료로부터 400 여개의 단일 콜로니를 분리하였다. 이 중 균주 배양액에서 아가 스팟 어세이를 통해 진균 생장 억제 활성이 우수했던 균주를 선별하였으며, 16S rRNA 유전자 염기서열을 분석한 결과 표준균주인 Bacillus subtilis Y22와 100%의 상동성을 나타내었으며 추가적으로 API kit (50CH, 20E)를 이용하여 생리생화학적 특성을 조사하여 (표 1 참조), 최종적으로 바실러스 서틸리스 EBN-YR47 (Bacillus subtilis EBN-YR47)로 명명하였다.
2. 독소생성
A. flavus
에 대한 항진균능 및 생장 저해
1) 아가
스팟
어세이
세 개의 독소 생성 진균을 균주 YR47과 함께 고체 배지에 배양하여 120시간동안 24시간 주기마다 관찰한 결과 세 종류의 A. flavus의 균사 생장을 완전히 저해하였다 (도 1 참조). 선행문헌 [Hassan & Bullerman (2008)]에서 평판 내 일부분에 균사 생장을 보이면서 억제 직경 (14.5-23.3 mm)을 보였던 결과와 비교하여 완전히 저해한 YR47 균주가 항진균 활성이 매우 우수하였다.
2) 포자 발아 억제
A. flavus 균주 (KACC 44986, 45068, 45146)의 25 ℃에서의 포자 발아, 균사 생장 및 포자 생성에 대한 YR47 저해 효과를 하기 표 2에 나타내었다.
표 2에 나타난 바와 같이, 대조군에 비하여 YR47 처리구에서 포자 발아가 저해되었다. YES배지에서 A. flavus KACC 44986, 45068 및 45146에 대해 각각 81.16, 69.67 및 82.09%로 포자 발아를 억제하였는데, 이는 선행문헌 [Veras et al. (2016)]이 보고한 Bacillus subtilis가 A. flavus를 75.8% 억제한 결과 보다 더 우수한 것을 알 수 있다.
또한, 오크라톡신을 생성하는 아스퍼질러스 아와모리(Aspergillus awamori), 아스퍼질러스 프레시니(Aspergillus fresenii) 및 아스퍼질러스 알루타세우스(Aspergillus alutaceus); 푸모니신을 생성하는 푸사리움 푸지쿠로이(Fsarium fugikuroi), 푸사리움 프롤리페라툼(Fusarium proliferatum) 및 푸사리움 버티실로이드(Fusarium verticilloides)를 25 ℃, 15% YES배지에서 24시간 동안 배양한 후에 이들에 대한 YR47의 포자 발아 억제(spore germination inhibition, %)를 측정한 결과는 하기 표 3과 같다.
3) 균사 생장 및 포자 생성 억제
대조군의 콜로니 직경과 균주 처리구의 콜로니 직경을 비교하여 균사 생장 저해를 조사하였다. YR47 처리구는 대조군에 비해 균사 생장 속도가 현저히 느렸으며, 배양 5-6일차에서는 균사 콜로니가 더 이상 커지지 않았다 (도 2 참조). YR47 균주는 A. flavus의 균사 생장을 최대 76% 저해하였고 (표 2 참조), 이는 선행문헌 [Veras et al. (2016)]에서 Bacillus sp.이 A. flavus의 생장을 66.70% 저해한 것보다 더 효과적이었다.
YR47 균주는 균사 생장뿐만 아니라 포자 생성에 대해서도 영향을 미쳤다. A. flavus KACC 44986의 포자 수를 16.72×106 spores/ml (대조군)에서 0.63×106 spores/ml (YR47 처리구)까지 감소시켜 가장 우수한 효과를 나타내었다. YR47 균주는 세 종의 A. flavus의 포자 생성을 모두 96% 이상 저해하였으며 (표 2 참조), 선행문헌 [Veras et al. (2016)]에서 독소 생성 A. flavus의 생장을 최대 87.60% 억제한 Bacillus sp.의 효과보다 더 우수하였다.
4) 진균독소 생성
균에 대한 생장 저해
및 독소 생성 감축
15% YES배지에 세균 배양액과 A. flavus 포자 현탁액을 동시 접종하여 배양하였을 때 YR47 균주는 A. flavus KACC 44986, 45068, 45146의 생장과 독소를 감축하는 효과를 보였다 (도 3 및 하기 표 4 참조). A. flavus에 대해 YR47 균주 처리 시 배양 2일 차에 생장을 완전히 저해하며, 독소 생성은 미처리 대조군에 비해 배양 120시간에서 99% 이상으로 AFB1 생성을 감소시켰는데, 특히 5일째 최대 301.54 mg/l의 AFB1을 생성한 A. flavus KACC 44986에서 YR47 균주의 동시 접종 시 0.03 mg/l까지 감소시켰다. 선행연구에서는 YR47 균주는 AFB1에 대한 분해 활성이 낮은 것으로 조사되었으며, 따라서, 이렇게 큰 독소 생성 감소 효과는 주로 진균 생장 저해에 따른 독소 생성 감소로 추정된다. 선행문헌 [Sangmanee et al. (2014)]이 보고한 Lactobacillus plantarum의 다양한 농도의 상등액을 YES배지에 진균과 함께 처리했을 때, 가장 높은 농도(17.6 mg/ml)의 상등액 처리구에서 24시간과 48시간 째 A. flavus의 생장을 완전히 저해한 결과와 비교하여 YR47 균주 효과가 상당히 유사하였으나, 5.87 mg/ml의 상등액에서 A. flavus의 AFB1 생산을 5.81에서 3.42 mg/l로 유의하게 감소한 결과보다는 YR47의 독소생산 저해능이 훨씬 높았다. 이전 연구보다 더 많은 양의 진균독소를 생산하는 진균에 대해서도 우수한 효과를 보였다는 점에서 YR47 균주의 활용성이 높아질 수 있을 것으로 기대된다.
YR47로 동시접종된 15% YES배지에서 A. flavus (KACC 44986, 45068, 45146)의 생장 및 AFB1 생성 결과(30 ℃, 200rpm)를 하기 표 4에 나타내었다.
또한, 오크라톡신을 생성하는 아스퍼질러스 아와모리(Aspergillus awamori), 아스퍼질러스 프레시니(Aspergillus fresenii) 및 아스퍼질러스 알루타세우스(Aspergillus alutaceus); 푸모니신을 생성하는 푸사리움 푸지쿠로이(Fsarium fugikuroi), 푸사리움 프롤리페라툼(Fusarium proliferatum) 및 푸사리움 버티실로이드(Fusarium verticilloides)를 25 ℃에서 10일 동안 배양한 후에 이들에 대한 YR47의 진균 생장(colony radius)과 포자 생성 저해(sporulation inhibition) 활성을 측정하여 하기 표 5에 나타내었다.
3. 결론
본 발명에서는 아플라톡신 B1 생성 진균의 생장저해에 대해 우수한 활성을 지닌 세균 Bacillus subtilis EBN-YR47 균주를 분리하였다. 이 균주는 아플라톡신을 생성하는 여러 A. flavus에 대해 우수한 항진균능을 나타내었으며 진균과 동시 배양 시에 AFB1의 생성을 크게 감축시키는 효과를 나타냈다. 따라서 본 균주가 곡물 등에서 독소생성 진균의 생장을 원천적으로 차단하여 진균독소 오염을 원천적으로 차단할 수 있을 것이며 식품과 사료산업에서 더욱 효과적인 생물학적 방제제로서 이용될 수 있을 것으로 전망된다.
Claims (4)
- 아플라톡신을 생성하는 아스퍼질러스 플라버스(Aspergillus flavus); 오크라톡신을 생성하는 아스퍼질러스 아와모리(Aspergillus awamori), 아스퍼질러스 프레시니(Aspergillus fresenii) 및 아스퍼질러스 알루타세우스(Aspergillus alutaceus); 푸모니신을 생성하는 푸사리움 푸지쿠로이(Fsarium fugikuroi), 푸사리움 프롤리페라툼(Fusarium proliferatum) 및 푸사리움 버티실로이드(Fusarium verticilloides)를 포함하는 진균독소 생성 진균으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 진균독소 생성 균의 생장을 억제하는 바실러스 서틸리스 EBN-YR47(Bacillus subtilis EBN-YR47, 수탁번호 KCTC18663P) 균주.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 생장이 진균독소 생성 균의 생장, 이의 포자 생성 및 포자 발아인 것을 특징으로 하는 균주.
- 제1항 또는 제3항의 바실러스 서틸리스 EBN-YR47 균주 또는 그 배양 상등액을 포함하는, 진균독소 생성 균에 대한 항진균 조성물.
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