ES2354390T3

ES2354390T3 - Procedimientos de uso del receptor gpr119 para identificar compuestos útiles para aumentar la masa ósea en un individuo.

Info

Publication number: ES2354390T3
Application number: ES07755238T
Authority: ES
Inventors: Zhi-Liang Chu; James N. Leonard
Original assignee: Arena Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Arena Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2006-04-11
Filing date: 2007-04-10
Publication date: 2011-03-14
Anticipated expiration: 2027-04-10
Also published as: HK1117911A1; ATE487940T1; RS51745B; US20100203577A1; NZ571110A; EP1971862A2; JP2009533055A; DK1971862T3; SG10201404220TA; GT200800207A; EP2402750A1; PL1971862T3; US8580526B2; JP4521838B2; WO2007120689A3; CN103323606A; AU2007238805A1; JP2009254375A; UA97479C2; MX2008013120A

Abstract

Uso de un receptor acoplado con proteína G para identificar secretagogos de GIP en un procedimiento in vitro que comprende las etapas de: (a) poner en contacto un compuesto de ensayo con una célula hospedadora o con la membrana de una célula hospedadora que comprende dicho receptor acoplado con proteína G, en el que el receptor acoplado con proteína G comprende una secuencia aminoacídica seleccionada del grupo constituido por: (i) los aminoácidos 1-335 de la SEQ ID NO: 2; (ii) los aminoácidos 2-335 de la SEQ ID NO: 2; (iii) la secuencia aminoacídica de un receptor acoplado con proteína G codificado por un polinucleótido que es amplificable por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en una muestra de ADN humano usando los cebadores específicos de la SEQ ID NO: 3 y la SEQ ID NO: 4; (iv) la secuencia aminoacídica de un receptor acoplado con proteína G codificado por un polinucleótido que hibrida en condiciones de alto rigor con el complemento de la SEQ ID NO: 1; (v) la secuencia aminoacídica de un receptor acoplado con proteína G que tiene al menos un 80% de identidad con la SEQ ID NO: 2; (vi) la secuencia aminoacídica de una versión constitutivamente activa de un receptor acoplado con proteína G que tiene la SEQ ID NO: 2; y (vii) un fragmento biológicamente activo de (i) o (ii), en el que dicho fragmento biológicamente activo es capaz de unirse a (2-fluoro-4-metanosulfonil-fenil)-{6-[4-(3- isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-1-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina; y (b) determinar la capacidad del compuesto de ensayo de estimular la funcionalidad del receptor; en el que la capacidad del compuesto de ensayo de estimular la funcionalidad del receptor es indicativa de que el compuesto de ensayo es un secretagogo de GIP.

Description

CAMPO DE LA INVENCIÓN

: [0001] La presente invención se refiere a procedimientos de uso del receptor GPR119 para identificar secretagogos de GIP que pueden ser útiles para aumentar la masa ósea en un individuo. Los agonistas del receptor GPR119 son útiles como 5 agentes terapéuticos para tratar o prevenir una afección caracterizada por una baja masa ósea, tal como osteoporosis, y para aumentar la masa ósea en un individuo. Los agonistas del receptor GPR119 promueven la formación ósea en un individuo.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

: [0002] Se pretende que la siguiente discusión facilite la comprensión de la 10 invención, pero no se pretende ni admite que sea técnica anterior a la invención.

A. Osteoporosis

: [0003] La osteoporosis es una enfermedad incapacitante caracterizada por la pérdida de masa ósea y el deterioro microarquitectónico de la estructura esquelética, que conduce a una resistencia ósea comprometida, que predispone al paciente a un 15 riesgo aumentado de fracturas por fragilidad. La osteoporosis afecta a más de 75 millones de persones en Europa, Japón y los Estados Unidos, y causa más de 2,3 millones de fracturas solo en Europa y los Estados Unidos. En los Estados Unidos, la osteoporosis afecta al menos a un 25% de las mujeres blancas postmenopáusicas, y la proporción aumenta a un 70% en mujeres mayores de 80 años. Una de cada tres 20 mujeres mayores de 50 años tendrá una fractura osteoporótica que causa una carga social y financiera considerable a la sociedad. La enfermedad no está limitada a mujeres; los hombres ancianos pueden estar también afectados. Para 2050, se proyecta que la incidencia mundial de fractura de cadera en hombres aumentará un 310% y un 240% en mujeres. El riesgo de por vida combinado de presentación clínica de fracturas 25 de cadera, antebrazo y vertebral es aproximadamente de un 40%, equivalente al riesgo de enfermedad cardiovascular. Por lo tanto, las fracturas osteoporóticas causan una mortalidad, morbilidad y coste económico sustanciales. Con una población que envejece, el número de fracturas osteoporóticas y sus costes se duplicarán al menos en los próximos 50 años a menos que se desarrollen estrategias preventivas eficaces 30 (véanse, por ejemplo, Atik y col, Clin. Orthop. Relat. Res. (2006) 443: 19-24; Raisz, J. Clin. Invest. (2005) 115: 3318-3325 y la Serie de informes técnicos 921 de la Organización Mundial de la Salud (2003), “Prevención y gestión de la osteoporosis”).

B. Polipéptido insulinotrópico dependiente de glucosa (GIP)

: [0004] El polipéptido insulinotrópico dependiente de glucosa (GIP, también conocido como polipéptido inhibidor gástrico) es una hormona incretina peptídica de 42 aminoácidos que se libera de células K endocrinas duodenales después de la ingestión de comida. La cantidad de GIP liberada depende en gran medida de la cantidad de glucosa consumida. Se ha mostrado que el GIP estimula la secreción de 5 insulina dependiente de glucosa en células beta pancreáticas. El GIP media sus acciones a través de un receptor acoplado con proteína G específico, a saber GIPR.

: [0005] Ya que el GIP contiene una alanina en posición 2, es un excelente sustrato para la dipeptidilpeptidasa 4 (DPP-IV), una enzima que regula la degradación de GIP. Convierte rápidamente GIP(1-42) completo en GIP(3-42) bioinactivo al cabo de 10 minutos desde la secreción de células K intestinales. Se ha mostrado que la inhibición de DPP-IV aumenta la bioactividad de GIP (véanse, por ejemplo, Drucker, Cell. Metab. (2006) 3: 153-165; McIntosh y col., Regul. Pept. (2005) 128: 159-165; Deacon, Regul. Pept. (2005) 128:117-124 y Ahren y col., Endocrinology (2005) 146: 2055-2059.) El análisis de GIP bioactivo completo, por ejemplo en sangre, puede llevarse a 15 cabo usando ensayos específicos N-terminales (véase, por ejemplo, Deacon y col., J. Clin. Endocrinol. Metab. (2000)

85: 3575-3581).

: [0006] Recientemente, se ha mostrado que el GIP promueve la formación ósea. Se ha mostrado que el GIP activa receptores osteoblásticos, dando como resultado 20 aumentos de la síntesis de colágeno de tipo I y de la actividad fosfatasa alcalina, ambas asociadas con la formación ósea. Se ha mostrado que el GIP inhibe la actividad osteoclástica y la diferenciación in vitro. Se ha mostrado que la administración de GIP previene la pérdida ósea debida a ovariectomía. Los ratones con inactivación génica del receptor de GIP (GIPR) evidencian un tamaño óseo reducido, menor masa ósea, 25 microarquitectura ósea y propiedades bioquímicas alteradas y parámetros alterados de recambio óseo, especialmente en la formación ósea (véanse, por ejemplo, Zhong y col., Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. (2007) 292: E543-E548; Bollag y col., Endocrinology (2000) 141: 1228-1235; Bollag y col., Mol. Cell. Endocrinol. (2001) 177: 35-41; Xie y col., Bone (2005) 37: 759-769 y Tsukiyama y col., Mol. Endocrinol. 30 (2006) 20: 1644-165 I.)

: [0007] Se ha reconocido la utilidad del GIP para mantener o aumentar la densidad o formación ósea por la Oficina de Patentes y Marcas de los Estados Unidos mediante la expedición de la patente de EE.UU. nº 6.410.508 para el tratamiento de la

: mineralización ósea reducida mediante la administración del péptido GIP. Sin embargo, los agonistas del péptido GIP actuales padecen de falta de biodisponibilidad oral, lo que afecta negativamente al cumplimento del paciente. Es un enfoque alternativo atractivo desarrollar una composición activa por vía oral para aumentar el nivel endógeno de actividad de GIP. 5

C. GPR119

: [0008] El GPR119 es un receptor acoplado con proteína G (GPR119; por ejemplo, GPR119 humano, nº de acceso a GenBank® AAP72125 y alelos del mismo, por ejemplo, GPR119 de ratón, nº de acceso a GenBank® AY288423 y alelos del mismo). La activación de GPR119 como por un agonista conduce a la elevación del nivel de 10 AMPc intracelular, coherentemente con que el GPR119 esté acoplado con Gs. En la bibliografía de patentes, el GPR119 se ha designado como RUP3 (por ejemplo, documento WO 00/31258); el GPR119 se ha designado también como receptor insulinotrópico dependiente de glucosa (GDIR).

D. Receptores acoplados con proteína G 15

: [0009] Aunque existen una serie de clases de receptores en seres humanos, la más abundante y terapéuticamente relevante de lejos es la representada por la clase de receptor acoplado con proteína G (GPCR). Se estima que hay unos 30.000-40.000 genes en el genoma humano, y de estos, aproximadamente un 2% se estima que codifican GPCR. 20

: [0010] Los GPCR representan un área importante para el desarrollo de productos farmacéuticos. Los fármacos activos en GPCR tienen beneficios terapéuticos dentro de un amplio espectro de enfermedades humanas tan diversas como dolor, disfunción cognitiva, hipertensión, úlceras pépticas, rinitis y asma. De los aproximadamente 500 fármacos comercializados clínicamente, más de un 30% son moduladores de la función 25 de GPCR. Estos fármacos ejercen su función en aproximadamente 30 GPCR bien caracterizados (véase, por ejemplo, Wise y col., Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. (2004) 44: 43-66).

: [0011] Los GPCR comparten un motivo estructural común, al tener siete secuencias de entre 22 y 24 aminoácidos hidrófobos que forman siete hélices alfa, cada 30 una de las cuales se extiende por la membrana (cada extensión se identifica por un número, concretamente, transmembrana 1 (TM-1), transmembrana 2 (TM-2), etc.). Las hélices transmembrana se unen por cadenas de aminoácidos entre transmembrana 2 y transmembrana 3, transmembrana 4 y transmembrana 5 y transmembrana 6 y

: transmembrana 7 en el exterior, o lado “extracelular” de la membrana celular (estas se designan como regiones “extracelulares” 1, 2 y 3 (EC-1, EC-2 y EC-3), respectivamente). Las hélices transmembrana se unen también por cadenas de aminoácidos entre transmembrana 1 y transmembrana 2, transmembrana 3 y transmembrana 4 y transmembrana 5 y transmembrana 6 en el interior, o lado 5 “intracelular” de la membrana celular (estas se designan como regiones “intracelulares” 1, 2 y 3 (IC-1, IC-2 e IC-3), respectivamente). El extremo carboxilo (“C”) del receptor se encuentra en el espacio intracelular en la célula, y el extremo amino (“N”) del receptor se encuentra en el espacio extracelular fuera de la célula.

: [0012] Por lo general, cuando un ligado se une al receptor (a menudo designado 10 como “activación del receptor”), hay un cambio en la conformación del receptor que facilita el acoplamiento entre la región intracelular y una “proteína G” intracelular. Se ha notificado que los GPCR son “promiscuos” con respecto a las proteínas G, concretamente que un GPCR puede interaccionar con más de una proteína G. Véase Kenakin, Life Sciences (1988) 43: 1095-1101. Aunque existen otras proteínas G, 15 actualmente Gq, Gs, Gi, Gz y Go son las proteínas G que se han identificado. El acoplamiento de GPCR activado por ligando con la proteína G inicia un proceso de cascada de señalización (designado como “transducción de señal”). En condiciones normales, la transducción de señal da como resultado en última instancia la activación celular o inhibición celular. Aunque no se desea ligarse a teoría alguna, se cree que el 20 bucle IC-3 así como el extremo carboxilo del receptor interaccionan con la proteína G.

: [0013] Hay también proteínas G promiscuas, que parecen acoplar varias clases de GPCR con la ruta de fosfolipasa C, tales como G15 o G16 (Offermanns y Simon, J. Biol. Chem. (1995) 270: 15175-80), o proteínas G quiméricas diseñadas para acoplar un gran número de diferentes GPCR con la misma ruta, por ejemplo, de fosfolipasa C 25 (Milligan y Rees, Trends in Pharmaceutical Sciences (1999) 20:118-24).

: [0014] En condiciones fisiológicas, existen GPCR en la membrana celular en equilibrio entre dos conformaciones diferentes: un estado “inactivo” y un estado “activo”. Un receptor en un estado inactivo es incapaz de ligarse a la ruta de transducción de la señalización intracelular para iniciar la transducción de señal que 30 conduce a una respuesta biológica. Cambiar la conformación del receptor al estado activo permite el ligamiento con la ruta de transducción (a través de la proteína G) y produce una respuesta biológica.

: [0015] Un receptor puede estabilizarse en estado activo mediante un ligando o

: compuesto tal como un fármaco. Los descubrimientos recientes incluyendo, pero no exclusivamente limitado a, las modificaciones de la secuencia aminoacídica del receptor, proporcionan medios distintos de ligandos o fármacos para promover y estabilizar el receptor en la conformación de estado activo. Estos medios estabilizan eficazmente el receptor en un estado activo simulando el efecto de una unión de 5 ligando al receptor. La estabilización mediante dicho medio independiente de ligando se denomina “activación constitutiva de receptor”.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

: [0016] La presente invención se refiere al descubrimiento inesperado por el solicitante de que la administración de un agonista de GPR119 a un individuo, tal 10 como mediante administración oral, puede actuar en el receptor GPR119 aumentando el nivel de GIP en el individuo. La presente invención caracteriza procedimientos relacionados con GPR119 para identificar secretagogos de GIP. Un agonista de GPR119 es útil para promover (por ejemplo aumentar) la formación ósea en un individuo. En ciertas realizaciones, el individuo es un ser humano. 15

: [0017] La secuencia nucleotídica que codifica el polipéptido de GPR119 humano se da en la SEQ ID NO: 1. La secuencia aminoacídica de dicho polipéptido GPR119 humano codificado se da en la SEQ ID NO: 2.

: [0018] En un primer aspecto, la invención caracteriza el uso de un receptor acoplado con proteína G para identificar secretagogos de GIP en un procedimiento in 20 vitro que comprende las etapas de:

(a) poner en contacto un compuesto de ensayo con una célula hospedadora o con la membrana de una célula hospedadora que comprende un receptor acoplado con proteína G, en el que el receptor acoplado con proteína G comprende una secuencia aminoacídica seleccionada del grupo constituido por: 25

(i) los aminoácidos 1-335 de la SEQ ID NO: 2;

(ii) los aminoácidos 2-335 de la SEQ ID NO: 2;

(iii) la secuencia aminoacídica de un receptor acoplado con proteína G codificado por un polinucleótido que es amplificable por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en una muestra de ADN humano usando los cebadores específicos 30 de la SEQ ID NO: 3 y la SEQ ID NO: 4;

(iv) la secuencia aminoacídica de un receptor acoplado con proteína G codificado por un polinucleótido que hibrida en condiciones de alto rigor con el complemento de la SEQ ID NO: 1;

(v) la secuencia aminoacídica de un receptor acoplado con proteína G que tiene al menos un 80% de identidad con la SEQ ID NO: 2;

(vi) la secuencia aminoacídica de una versión constitutivamente activa de un receptor acoplado con proteína G que tiene la SEQ ID NO: 2; y

(vii) un fragmento biológicamente activo de (i) o (ii), en el que dicho fragmento 5 biológicamente activo es capaz de unirse al compuesto A; y

(b) determinar la capacidad del compuesto de ensayo de estimular la funcionalidad del receptor acoplado con proteína G;

en el que la capacidad del compuesto de ensayo de estimular la funcionalidad del receptor acoplado con proteína G es indicativa de que el compuesto de ensayo es 10 un secretagogo de GIP.

: [0019] En ciertas realizaciones, el receptor acoplado con proteína G comprende la secuencia aminoacídica de un receptor acoplado con proteína G que tiene al menos un 80% de identidad con la SEQ ID NO: 2.

: [0020] En ciertas realizaciones, el receptor acoplado con proteína G comprende la 15 secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 2.

: [0021] En ciertas realizaciones, la variante de la SEQ ID NO: 2 es un alelo de la SEQ ID NO: 2.

: [0022] En ciertas realizaciones, la variante de la SEQ ID NO: 2 es un ortólogo de la SEQ ID NO: 2. En ciertas realizaciones, la variante de la SEQ ID NO: 2 es un 20 ortólogo de mamífero de la SEQ ID NO: 2.

: [0023] En ciertas realizaciones, el receptor acoplado con proteína G es recombinante.

: [0024] En ciertas realizaciones, el procedimiento comprende identificar un agonista del receptor. 25

: [0025] En ciertas realizaciones, el procedimiento comprende identificar un agonista parcial del receptor.

: [0026] La invención caracteriza adicionalmente el uso de un GPCR en un procedimiento in vitro para identificar secretagogos de GIP, que comprende las etapas (a) y (b) de este primer aspecto, y comprende adicionalmente: 30

(c) sintetizar opcionalmente un compuesto que estimula la funcionalidad del receptor en la etapa (b);

(d) poner en contacto un compuesto que estimula la funcionalidad del receptor en la etapa (b) in vitro con una célula enteroendocrina de vertebrado o una célula capaz

de secretar GIP; y

(e) determinar si el compuesto estimula la secreción de GIP de la célula enteroendocrina de vertebrado o de la célula capaz de secretar GIP;

en el que la capacidad del compuesto de ensayo de estimular la secreción de GIP de la célula enteroendocrina de vertebrado o de la célula capaz de secretar GIP es 5 indicativa de que el compuesto de ensayo es un secretagogo de GIP.

: [0027] En ciertas realizaciones, la célula enteroendocrina de vertebrado es una célula enteroendocrina de mamífero. En ciertas realizaciones, la célula enteroendocrina es una célula K. En ciertas realizaciones, la célula enteroendocrina comprende tejido derivado de una región rica en células K del intestino delgado. En ciertas realizaciones, 10 la célula enteroendocrina comprende tejido de duodeno o yeyuno (véase, por ejemplo, Sondhi et al., Pharmacogenomics J. (2006) 6: 131-140). En ciertas realizaciones, la célula enteroendocrina es una línea celular enteroendocrina. En ciertas realizaciones, la célula capaz de secretar GIP es una célula recombinante modificada por ingeniería genética para ser capaz de secretar GIP. 15

: [0028] La invención caracteriza adicionalmente el uso de un GPCR en un procedimiento in vitro para identificar secretagogos de GIP, que comprende las etapas (a) y (b) de este primer aspecto, y comprende adicionalmente:

(c) sintetizar opcionalmente un compuesto que estimula la funcionalidad del receptor en la etapa (b); 20

(d) determinar si el compuesto aumenta el nivel de GIP en un vertebrado midiendo el nivel de GIP en una muestra obtenida a partir de un vertebrado al que se ha administrado previamente un compuesto que estimula la funcionalidad del receptor en la etapa (b),

en el que la capacidad del compuesto de ensayo de aumentar el nivel de GIP en 25 el vertebrado es indicativa de que el compuesto de ensayo es un secretagogo de GIP.

: [0029] En ciertas realizaciones, el nivel de GIP es la concentración de GIP total en sangre o plasma. En ciertas realizaciones, el nivel de GIP es la concentración de GIP bioactivo en sangre o plasma.

: [0030] En ciertas realizaciones, el vertebrado es un mamífero. En ciertas 30 realizaciones, el vertebrado es un vertebrado no humano. En ciertas realizaciones, el vertebrado es un mamífero no humano. En ciertas realizaciones, el mamífero es un mamífero no humano.

: [0031] La invención caracteriza adicionalmente el uso de un GPCR en un

: procedimiento in vitro para identificar secretagogos de GIP, que comprende las etapas (a) y (b) de este primer aspecto, y comprende adicionalmente:

(d) proporcionar opcionalmente un compuesto que estimula la funcionalidad 5 del receptor en la etapa (b);

(e) poner en contacto un compuesto que estimula la funcionalidad del receptor en la etapa (b) in vitro con una célula enteroendocrina de vertebrado o con una célula capaz de secretar GIP; y

(f) determinar si el compuesto estimula la secreción de GIP de la célula 10 enteroendocrina de vertebrado o de la célula capaz de secretar GIP;

en el que la capacidad del compuesto de ensayo de estimular la secreción de GIP de la célula enteroendocrina de vertebrado o de la célula capaz de secretar GIP es indicativa de que el compuesto de ensayo es un secretagogo de GIP. En ciertas realizaciones, la célula enteroendocrina de vertebrado es una célula enteroendocrina de 15 mamífero. En ciertas realizaciones, la célula enteroendocrina es una célula K. En ciertas realizaciones, la célula enteroendocrina comprende tejido derivado del intestino delgado. En ciertas realizaciones, la célula enteroendocrina comprende tejido derivado de una región rica en células K del intestino delgado. En ciertas realizaciones, la célula enteroendocrina comprende tejido de duodeno o yeyuno (véase, por ejemplo, Sondhi y 20 col., Pharmacogenomics J. (2006) 6: 131-140). En ciertas realizaciones, la célula enteroendocrina es una línea celular enteroendocrina. En ciertas realizaciones, la célula capaz de secretar GIP es una célula recombinante modificada por ingeniería genética para ser capaz de secretar GIP.

: [0032] La invención caracteriza adicionalmente el uso de un GPCR en un 25 procedimiento in vitro para identificar secretagogos de GIP, que comprende las etapas (a) y (b) de este primer aspecto, y comprende adicionalmente:

(d) proporcionar opcionalmente un compuesto que estimula la funcionalidad 30 del receptor en la etapa (b);

(e) determinar si el compuesto aumenta el nivel de GIP en un vertebrado midiendo el nivel de GIP en una muestra obtenida de un vertebrado al que se ha administrado previamente un compuesto que estimula la funcionalidad del receptor en

la etapa (b);

en el que la capacidad del compuesto de ensayo de aumentar el nivel de GIP en el vertebrado es indicativa de que el compuesto de ensayo es un secretagogo de GIP.

: [0033] En ciertas realizaciones, el nivel de GIP es la concentración de GIP total en sangre o plasma. En ciertas realizaciones, el nivel de GIP es la concentración de GIP 5 bioactivo en sangre o plasma.

: [0034] En ciertas realizaciones, el vertebrado es un mamífero. En ciertas realizaciones, el vertebrado es un vertebrado no humano. En ciertas realizaciones, el vertebrado es un mamífero no humano. En ciertas realizaciones, el mamífero es un mamífero no humano. 10

: [0035] En ciertas realizaciones, el secretagogo de GIP identificado es un agonista del receptor. En algunas realizaciones, el agonista es un agonista parcial.

: [0036] En ciertas realizaciones, el receptor acoplado con proteína G está acoplado con una proteína G. En ciertas realizaciones, la activación del receptor acoplado con proteína G aumenta el nivel de AMPc intracelular. En ciertas realizaciones, la proteína 15 G es Gs.

: [0037] En ciertas realizaciones, la muestra de ADN humano es ADN genómico humano.

: [0038] En algunas realizaciones, la reacción en cadena de la polimerasa es reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (PCR-TI). Las técnicas 20 de PCR-TI son bien conocidas por el experto. En ciertas realizaciones, la muestra de ADN humano es ADNc humano. En ciertas realizaciones, el ADNc es de un tejido humano que expresa GPR119. En algunas realizaciones, el tejido humano que expresa GPR119 es páncreas o islote pancreático. En ciertas realizaciones, el ADNc es de un tipo celular humano que expresa GPR119. En algunas realizaciones, el ADNc es de 25 una célula beta pancreática. En algunas realizaciones, el ADNc es de una línea celular pancreática.

: [0039] En ciertas realizaciones, el receptor acoplado con proteína G codificado por el polinucleótido que es amplificable por reacción en cadena de la polimerasa es la SEQ ID NO: 2 o un alelo de la misma. En ciertas realizaciones, el receptor acoplado 30 con proteína G codificado por un polinucleótido que es amplificable por reacción en cadena de la polimerasa es un alelo de la SEQ ID NO: 2. En ciertas realizaciones, el receptor acoplado con proteína G codificado por un polinucleótido que es amplificable por reacción en cadena de la polimerasa se une específicamente a (2-fluoro-4-

: metanosulfonilfenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)piperidin-1-il]-5-nitropirimidin-4-il}amina. En ciertas realizaciones, el receptor acoplado con proteína G codificado por un polinucleótido que es amplificable por reacción en cadena de la polimerasa es un receptor para el que la (2-fluoro-4-metanosulfonilfenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]-oxadiazol-5-il)piperidin-1-il]-5-nitropirimidin-4-il}amina es un 5 agonista. En algunas realizaciones, el receptor acoplado con proteína G codificado por un polinucleótido que es amplificable por reacción en cadena de la polimerasa exhibe un nivel detectable de actividad constitutiva. En algunas realizaciones, la actividad constitutiva es aumentar el nivel de AMPc intracelular. En algunas realizaciones, la actividad constitutiva es causar que las células melanofóricas experimenten dispersión 10 de pigmento.

: [0040] En ciertas realizaciones, las condiciones de hibridación rigurosas comprenden hibridación a 42ºC en una disolución que comprende 50% de formamida, 5xSSC (1xSSC = NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato de sodio 50 mM (pH 7,6), 5x disolución de Denhardt, 10% de sulfato de dextrano y ADN de esperma 15 de salmón desnaturalizado por cizallamiento 20 µg/ml, seguido de lavado a 65ºC con una disolución que comprende 0,1xSSC. Las técnicas de hibridación son bien conocidas por el experto en la técnica.

: [0041] En ciertas realizaciones, el GPCR codificado por un polinucleótido que hibrida en condiciones de alto rigor con el complemento de la SEQ ID NO: 1 es la 20 SEQ ID NO: 2 o un alelo de la misma. En ciertas realizaciones, el GPCR codificado por un polinucleótido que hibrida en condiciones de alto rigor con el complemento de la SEQ ID NO: 1 es un alelo de la SEQ ID NO: 2. En ciertas realizaciones, el GPCR codificado por un polinucleótido que hibrida en condiciones de alto rigor con el complemento de la SEQ ID NO: 1 es un ortólogo de la SEQ ID NO: 2. En ciertas 25 realizaciones, el GPCR codificado por un polinucleótido que hibrida en condiciones de alto rigor con el complemento de la SEQ ID NO: 1 se une específicamente a (2-fluoro-4-metanosulfonilfenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)piperidin-1-il]-5-nitropirimidin-4-il}amina. En ciertas realizaciones, el GPCR codificado por un polinucleótido que hibrida en condiciones de alto rigor con el complemento de la SEQ 30 ID NO: 1 es un receptor para el que la (2-fluoro-4-metanosulfonilfenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)piperidin-1-il]-5-nitropirimidin-4-il}amina es un agonista. En algunas realizaciones, el GPCR codificado por un polinucleótido que hibrida en condiciones de alto rigor con el complemento de la SEQ ID NO: 1 exhibe

: un nivel detectable de actividad constitutiva. En algunas realizaciones, la actividad constitutiva es aumentar el nivel de AMPc intracelular. En algunas realizaciones, la actividad constitutiva es causar que las células melanofóricas experimenten dispersión de pigmento.

: [0042] En ciertas realizaciones, la variante de la SEQ ID NO: 2 se une 5 específicamente a (2-fluoro-4-metanosulfonilfenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)piperidin-1-il]-5-nitropirimidin-4-il}amina. En ciertas realizaciones, la variante de la SEQ ID NO: 2 es un receptor para el que la (2-fluoro-4-metanosulfonilfenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)piperidin-1-il]-5-nitropirimidin-4-il}amina es un agonista. En algunas realizaciones, la variante de la 10 SEQ ID NO: 2 exhibe un nivel detectable de actividad constitutiva. En algunas realizaciones, la actividad constitutiva es aumentar el nivel de AMPc intracelular. En algunas realizaciones, la actividad constitutiva es causar que las células melanofóricas experimenten dispersión de pigmento.

: [0043] En algunas realizaciones, el receptor acoplado con proteína G es parte de 15 una proteína de fusión que comprende una proteína G. Las técnicas para preparar una construcción de fusión GPCR:G son bien conocidas por el experto (véase, por ejemplo, la solicitud internacional WO 02/42461).

: [0044] En ciertas realizaciones, la célula hospedadora comprende un vector de expresión, comprendiendo dicho vector de expresión un polinucleótido que codifica el 20 receptor acoplado con proteína G. En algunas realizaciones, el vector de expresión es pCMV. Se depositó este vector en la American Type Culture Collection (ATCC) el 13 de octubre de 1988 (10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, EE.UU.) bajo las condiciones del Tratado de Budapest sobre el reconocimiento internacional del depósito de microorganismos a los fines del procedimiento en materia de patentes. Se 25 ensayó el ADN por la ATCC y se determinó que era viable. La ATCC ha asignado el siguiente número de depósito al pCMV: ATCC nº 203351. Resultarán fácilmente evidentes para los expertos en la técnica otros vectores de expresión adecuados, y están disponibles comercialmente una amplia variedad de vectores de expresión (por ejemplo, de Clontech, Palo Alto, CA; Stratagene, La Jolla, CA e Invitrogen, Carlsbad, 30 CA).

: [0045] En algunas realizaciones, la célula hospedadora es una célula de vertebrado. En algunas realizaciones, la célula hospedadora es una célula de mamífero. En algunas realizaciones, la célula hospedadora de mamífero se selecciona del grupo

: constituido por una célula 293, una célula 293T, una célula CHO, una célula MCB3901 y una célula COS-7. En algunas realizaciones, la célula hospedadora es una célula de levadura. En algunas realizaciones, la célula hospedadora es una célula melanofórica. Resultarán fácilmente evidentes para los expertos en la técnica otras células hospedadoras adecuadas, y están disponibles una amplia variedad de líneas 5 celulares en la American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209.

: [0046] En ciertas realizaciones, dicha determinación es coherente con que el receptor acoplado con proteína G sea un receptor acoplado con Gs.

: [0047] En algunas realizaciones, dicha determinación es coherente con que el 10 receptor acoplado con proteína G se acople a través de una proteína G promiscua, tal como Gα15 o Gα16, con la ruta de fosfolipasa C. Las proteínas G promiscuas son bien conocidas por el experto en la técnica (véase, por ejemplo, Offermanns y col., J. Biol. Chem. (1995) 270: 15175-15180). En algunas realizaciones, dicha determinación es coherente con que el receptor acoplado con proteína G se acople a través de una 15 proteína G quimérica, por ejemplo, con la ruta de fosfolipasa C. Las proteínas G quiméricas son bien conocidas por el experto en la técnica (véase, por ejemplo, Milligan y col., Trends in Pharmaceutical Sciences (1999) 20: 118-124 y el documento WO 02/42461).

: [0048] En algunas realizaciones, dicha determinación es mediante la medida del 20 nivel de un segundo mensajero.

: [0049] En algunas realizaciones, dicha determinación es mediante la medida del nivel de un segundo mensajero seleccionado del grupo constituido por AMP cíclico (AMPc), GMP cíclico (GMPc), 1,4,5-trifosfato de inositol (IP3), diacilglicerol (DAG), actividad MAP cinasa, actividad MAPK/ERK cinasa cinasa 1 (MEKK1) y Ca2+. En 25 algunas realizaciones preferidas, el segundo mensajero es AMPc. En ciertas realizaciones, se aumenta el nivel de AMPc intracelular.

: [0050] En ciertas realizaciones, dicha determinación se lleva a cabo usando membrana que comprende el receptor acoplado con proteína G.

: [0051] En ciertas realizaciones, dicha determinación es mediante el uso de un 30 ensayo de melanóforo. En ciertas realizaciones, aumenta el nivel de dispersión de pigmento.

: [0052] En ciertas realizaciones, dicha determinación es mediante un ensayo indicador. En algunas realizaciones, dicho ensayo indicador es el ensayo indicador

: CRE-Luc.

: [0053] En algunas realizaciones, dicha determinación es mediante la medida de una actividad mediada por el aumento del nivel de AMPc intracelular.

: [0054] En algunas realizaciones, dicha determinación es mediante un ensayo indicador CRE-Luc. En ciertas realizaciones, aumenta el nivel de actividad luciferasa. 5

: [0055] En algunas realizaciones, dicha determinación es mediante la medida de la unión de GTPγS a membrana que comprende el receptor acoplado con proteína G. En ciertas realizaciones, dicho GTPγS está marcado con [35S]. En ciertas realizaciones, aumenta dicha unión de GTPγS a membrana que comprende el GPCR.

: [0056] En algunas realizaciones, el compuesto de ensayo es una molécula 10 pequeña. En algunas realizaciones, el compuesto de ensayo es una molécula pequeña, con la condición de que la molécula pequeña no sea un polipéptido. En algunas realizaciones, el compuesto de ensayo es una molécula pequeña, con la condición de que la molécula pequeña no sea un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, el compuesto de ensayo es una molécula pequeña, 15 con la condición de que la molécula pequeña no sea un lípido. En algunas realizaciones, el compuesto de ensayo es una molécula pequeña, con la condición de que la molécula pequeña no sea un polipéptido ni un lípido. En algunas realizaciones, el compuesto de ensayo es un polipéptido. En algunas realizaciones, el compuesto de ensayo es un polipéptido, con la condición de que el polipéptido no sea un anticuerpo 20 ni un fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, el compuesto de ensayo es un lípido. En algunas realizaciones, el compuesto de ensayo no es un anticuerpo ni un fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, el compuesto de ensayo es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo. 25

: [0057] En algunas realizaciones, el procedimiento comprende adicionalmente la etapa de determinar opcionalmente la estructura del secretagogo de GIP, el compuesto útil para tratar o prevenir una afección caracterizada por una baja masa ósea o el compuesto útil para aumentar la masa ósea en un individuo.

: [0058] En algunas realizaciones, el procedimiento comprende adicionalmente la 30 etapa de proporcionar opcionalmente el nombre o estructura del secretagogo de GIP, el compuesto útil para tratar o prevenir una afección caracterizada por una baja masa ósea o el compuesto útil para aumentar la masa ósea en un individuo.

: [0059] En algunas realizaciones, dicho procedimiento comprende adicionalmente

: la etapa de producir o sintetizar opcionalmente el secretagogo de GIP, el compuesto útil para tratar o prevenir una afección caracterizada por una baja masa ósea o el compuesto útil para aumentar la masa ósea en un individuo.

: [0060] En algunas realizaciones, dicho procedimiento comprende adicionalmente la etapa de formular el secretagogo de GIP, el compuesto útil para tratar o prevenir una 5 afección caracterizada por una baja masa ósea o el compuesto útil para aumentar la masa ósea en un individuo, en una composición farmacéutica.

: [0061] En un segundo aspecto, la invención caracteriza un procedimiento para identificar secretagogos de GIP, que comprende las etapas de:

(a) poner en contacto un compuesto in vitro con una célula enteroendocrina de 10 vertebrado o con una célula capaz de secretar GIP, habiéndose identificado dicho compuesto mediante un procedimiento según el primer aspecto; y

(b) determinar si el compuesto estimula la secreción de GIP de la célula enteroendocrina de vertebrado o de la célula capaz de secretar GIP;

en el que al capacidad del compuesto de ensayo de estimular la secreción de 15 GIP de la célula enteroendocrina de vertebrado o de la célula capaz de secretar GIP es indicativa adicional de que el compuesto de ensayo es un secretagogo de GIP.

: [0062] En ciertas realizaciones, la célula enteroendocrina de vertebrado es una célula enteroendocrina de mamífero. En ciertas realizaciones, la célula enteroendocrina es una célula K. En ciertas realizaciones, la célula enteroendocrina comprende tejido 20 derivado de intestino delgado. En ciertas realizaciones, la célula enteroendocrina comprende tejido derivado de una región rica en células K del intestino delgado. En ciertas realizaciones, la célula enteroendocrina comprende tejido de duodeno o yeyuno (véase, por ejemplo, Sondhi y col., Pharmacogenomics J. (2006) 6: 131-140). En ciertas realizaciones, la célula enteroendocrina es una línea celular enteroendocrina. En 25 ciertas realizaciones, la célula capaz de secretar GIP es una célula recombinante modificada por ingeniería genética para ser capaz de secretar GIP.

: [0063] La invención caracteriza adicionalmente un procedimiento para identificar secretagogos de GIP, que comprende las etapas:

(a) determinar si un compuesto aumenta el nivel de GIP en un vertebrado 30 midiendo el nivel de GIP en una muestra obtenida de un vertebrado al que se ha administrado anteriormente un compuesto, habiéndose identificado dicho compuesto mediante un procedimiento según el primer aspecto;

en el que la capacidad del compuesto de ensayo de aumentar el nivel de GIP en

el vertebrado es indicativa adicional de que el compuesto de ensayo es un secretagogo de GIP.

: [0064] En ciertas realizaciones, el nivel de GIP es la concentración de GIP total en sangre o plasma. En ciertas realizaciones, el nivel de GIP es la concentración de GIP bioactivo en sangre o plasma. 5

: [0065] En ciertas realizaciones, el vertebrado es un mamífero. En ciertas realizaciones, el vertebrado es un vertebrado no humano. En ciertas realizaciones, el vertebrado es un mamífero no humano. En ciertas realizaciones, el mamífero es un mamífero no humano.

: [0066] En algunas realizaciones, el compuesto de ensayo es una molécula 10 pequeña. En algunas realizaciones, el compuesto de ensayo es una molécula pequeña, con la condición de que la molécula pequeña no sea un polipéptido. En algunas realizaciones, el compuesto de ensayo es una molécula pequeña, con la condición de que la molécula pequeña no sea un anticuerpo un fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, el compuesto de ensayo es una molécula pequeña, 15 con la condición de que la molécula pequeña no sea un lípido. En algunas realizaciones, el compuesto de ensayo es una molécula pequeña, con la condición de que la molécula pequeña no sea un polipéptido ni un lípido. En algunas realizaciones, el compuesto de ensayo es un polipéptido. En algunas realizaciones, el compuesto de ensayo es un polipéptido, con la condición de que el polipéptido no sea un anticuerpo o 20 fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, el compuesto de ensayo es un lípido. En algunas realizaciones, el compuesto de ensayo no es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, el compuesto de ensayo es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

: [0067] En un tercer aspecto, la invención caracteriza un procedimiento para 25 identificar secretagogos de GIP que comprende las etapas de:

(a) poner en contacto un agonista de GPR119 in vitro con una célula enteroendocrina de vertebrado o con una célula capaz de secretar GIP; y

(b) determinar si el agonista de GPR119 estimula la secreción de GIP de la célula enteroendocrina de vertebrado o de la célula capaz de secretar GIP; 30

en el que la capacidad del agonista de GPR119 de estimular la secreción de GIP de la célula enteroendocrina de vertebrado o de la célula capaz se secretar GIP es indicativa de que el agonista de GPR119 es un secretagogo de GIP.

: [0068] En ciertas realizaciones, la célula enteroendocrina de vertebrado es una

: célula enteroendocrina de mamífero. En ciertas realizaciones, la célula enteroendocrina es una célula K. En ciertas realizaciones, la célula enteroendocrina comprende tejido derivado del intestino delgado. En ciertas realizaciones, la célula enteroendocrina comprende tejido derivado de una región rica en células K del intestino delgado. En ciertas realizaciones, la célula enteroendocrina comprende tejido de duodeno o yeyuno 5 (véase, por ejemplo, Sondhi et al., Pharmacogenomics J. (2006) 6: 131-140). En ciertas realizaciones, la célula enteroendocrina es una línea celular enteroendocrina. En ciertas realizaciones, la célula capaz de secretar GIP es una célula recombinante modificada por ingeniería genética para ser capaz de secretar GIP.

: [0069] La invención caracteriza adicionalmente un procedimiento para identificar 10 secretagogos de GIP que comprende las etapas de:

determinar si el agonista de GPR119 aumenta el nivel de GIP en el vertebrado midiendo el nivel de GIP en una muestra obtenida de un vertebrado al que se ha administrado anteriormente un agonista de GPR119, en el que la capacidad del agonista de GPR119 de aumentar el nivel de GIP en el vertebrado es indicativa de que 15 el agonista de GPR119 es un secretagogo de GIP.

: [0070] En ciertas realizaciones, el nivel de GIP es la concentración de GIP total en sangre o plasma. En ciertas realizaciones, el nivel de GIP es la concentración de GIP bioactivo en sangre o plasma.

: [0071] En ciertas realizaciones, el vertebrado es un mamífero. En ciertas 20 realizaciones, el vertebrado es un vertebrado no humano. En ciertas realizaciones, el vertebrado es un mamífero no humano. En ciertas realizaciones, el mamífero es un mamífero no humano.

: [0072] En ciertas realizaciones, el agonista de GPR119 es un agonista de un GPR119 endógeno. 25

: [0073] En ciertas realizaciones, el agonista de GPR119 es un agonista de GPR119 humano.

: [0074] En ciertas realizaciones, el agonista de GPR119 es un agonista parcial de GPR119.

: [0075] En ciertas realizaciones, el agonista de GPR119 es un agonista selectivo de 30 GPR119.

: [0076] En ciertas realizaciones, el agonista de GPR119 es una molécula pequeña. En algunas realizaciones, la molécula pequeña no es un polipéptido. En algunas realizaciones, la molécula pequeña no es un anticuerpo ni un fragmento de unión a

: antígeno del mismo. En algunas realizaciones, la molécula pequeña no es un lípido. En algunas realizaciones, la molécula pequeña no es un polipéptido ni un lípido.

: [0077] En ciertas realizaciones, el agonista de GPR119 está oralmente disponible.

: [0078] En ciertas realizaciones, el agonista de GPR119 tiene un valor de CE50 menor de aproximadamente 10 µM, menor de aproximadamente 1 µM, menor de 5 aproximadamente 100 nM, menor de aproximadamente 75 nM, menor de aproximadamente 50 nM, menor de aproximadamente 25 nM, menor de aproximadamente 15 nM, menor de aproximadamente 10 nM, menor de aproximadamente 5 nM, menor de aproximadamente 4 nM, menor de aproximadamente 3 nM, menor de aproximadamente 2 nM o menor de 10 aproximadamente 1 nM. En ciertas realizaciones, el agonista de GPR119 tiene un valor de CE50 menor de aproximadamente 10 µM, menor de aproximadamente 1 µM, menor de aproximadamente 100 mM, menor de aproximadamente 75 nM, menor de aproximadamente 50 nM, menor de aproximadamente 25 nM, menor de aproximadamente 15 nM, menor de aproximadamente 10 nM, menor de 15 aproximadamente 5 nM, menor de aproximadamente 4 nM, menor de aproximadamente 3 nM, menor de aproximadamente 2 nM o menor de aproximadamente 1 nM, teniendo el GPR119 la SEQ ID NO: 2. En ciertas realizaciones, el agonista de GPR119 tiene un valor de CE50 menor de aproximadamente 10 µM, menor de aproximadamente 1 µM, menor de 20 aproximadamente 100 nM, menor de aproximadamente 75 nM, menor de aproximadamente 50 nM, menor de aproximadamente 25 nM, menor de aproximadamente 15 nM, menor de aproximadamente 10 nM, menor de aproximadamente 5 nM, menor de aproximadamente 4 nM, menor de aproximadamente 3 nM, menor de aproximadamente 2 nM o menor de 25 aproximadamente 1 nM, teniendo el GPR119 humano la SEQ ID NO: 2 en el ensayo de adenilato ciclasa (se proporciona un ensayo ejemplar de adenilato ciclasa en el Ejemplo 7 y en el Ejemplo 8, a continuación). En ciertas realizaciones, el agonista de GPR119 tiene un valor de CE50 menor de aproximadamente 10 µM, menor de aproximadamente 1 µM, menor de aproximadamente 100 nM, menor de 30 aproximadamente 75 nM, menor de aproximadamente 50 nM, menor de aproximadamente 25 nM, menor de aproximadamente 15 nM, menor de aproximadamente 10 nM, menor de aproximadamente 5 nM, menor de aproximadamente 4 nM, menor de aproximadamente 3 nM, menor de

: aproximadamente 2 nM o menor de aproximadamente 1 nM, teniendo el GPR119 humano la SEQ ID NO: 2 en el ensayo de melanóforo (el ensayo de melanóforo se proporciona en el Ejemplo 9 a continuación).

: [0079] Se dan a conocer agonistas ejemplares de GPR119, por ejemplo, en la solicitud internacional nº PCT/US2004/001267 (publicada como WO 04/065380); la 5 solicitud internacional nº PCT/US2004/005555 (publicada como WO 04/076413); la solicitud internacional nº PCT/US2004/022327 (publicada como WO 05/007647); la solicitud internacional nº PCT/US2004/022417 (publicada como WO 05/007658); la solicitud internacional nº PCT/US2005/019318 (publicada como WO 2005/121121); la solicitud internacional nº PCT/GB2004/050046 (publicada como WO 2005/061489); 10 la solicitud internacional nº PCT/US06/00567 (publicada como WO 2006/083491); la solicitud internacional nº PCT/GB2005/050264 (publicada como WO 2006/067531); la solicitud internacional nº PCT/GB2005/050265 (publicada como WO 2006/067532); la solicitud internacional nº PCT/GB2005/050266 (publicada como WO 2006/070208); la solicitud internacional nº PCT/JP02/09350 (publicada como WO 15 03/026661); la solicitud internacional nº PCT/JP2005/018412 (publicada como WO 06/040966); la solicitud internacional nº PCT/JP2005/019000 (publicada como WO 2006/043490); la solicitud internacional nº PCT/GB2006/050176 (publicada como WO 2007/003960); la solicitud internacional nº PCT/GB2006/050177 (publicada como WO 2007/003961); la solicitud internacional nº PCT/GB2006/050178 20 (publicada como WO 2007/003962); la solicitud internacional nº PCT/GB2006/050182 (publicada como WO 2007/003964) y la solicitud internacional nº PCT/JP02/09350 (publicada como WO 03/026661).

: [0080] En ciertas realizaciones, el procedimiento comprende proporcionar el agonista de GPR119. 25

: [0081] En ciertas realizaciones, el agonista de GPR119 es identificable mediante un procedimiento según el primer aspecto.

: [0082] En ciertas realizaciones, el procedimiento comprende llevar a cabo un procedimiento según el primer aspecto para identificar al agonista de GPR119.

: [0083] En ciertas realizaciones, el procedimiento comprende haber identificado al 30 agonista de GPR119 mediante un procedimiento según el primer aspecto.

: [0084] En un cuarto aspecto, la invención caracteriza un uso de un GPCR en un procedimiento in vitro para identificar secretagogos de GIP que comprende las etapas de:

(a) poner en contacto un receptor acoplado con proteína G con un ligando conocido opcionalmente marcado del receptor en presencia o ausencia de un compuesto de ensayo, en el que el receptor acoplado con proteína G comprende una secuencia aminoacídica seleccionada del grupo constituido por:

(i) los aminoácidos 1-335 de la SEQ ID NO: 2; 5

(ii) los aminoácidos 2-335 de la SEQ ID NO: 2;

(iii) la secuencia aminoacídica del receptor acoplado con proteína G codificado por un polinucleótido que es amplificable por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en una muestra de ADN humano usando los cebadores específicos de la SEQ ID NO:3 y la SEQ ID NO:4; 10

(iv) la secuencia aminoacídica de un receptor acoplado con proteína G codificado por un polinucleótido que hibrida en condiciones de alto rigor con el complemento de la SEQ ID NO:1;

(v) la secuencia aminoacídica de un receptor acoplado con proteína G que tiene al menos un 80% de identidad con la SEQ ID NO: 2; 15

(vii) un fragmento biológicamente activo de (i) o (ii), en el que dicho fragmento biológicamente activo es capaz de unirse al compuesto A;

(b) detectar el complejo entre dicho ligando conocido y dicho receptor; y 20

(c) determinar si se forma menos de dicho complejo en presencia del compuesto de ensayo que en ausencia del compuesto de ensayo;

en el que dicha determinación es indicativa de que el compuesto de ensayo es un secretagogo de GIP.

: [0085] En ciertas realizaciones, el receptor acoplado con proteína G comprende la 25 secuencia aminoacídica de un receptor acoplado con proteína G que tiene al menos un 80% de identidad con la SEQ ID NO: 2.

: [0086] En ciertas realizaciones, el receptor comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 2.

: [0087] En ciertas realizaciones, la variante de la SEQ ID NO: 2 es un alelo de la 30 SEQ ID NO: 2.

: [0088] En ciertas realizaciones, la variante de la SEQ ID NO: 2 es un ortólogo de la SEQ ID NO: 2. En ciertas realizaciones, la variante de la SEQ ID NO: 2 es un ortólogo de mamífero de la SEQ ID NO: 2.

: [0089] En ciertas realizaciones, el receptor acoplado con proteína G es recombinante.

: [0090] En ciertas realizaciones, el ligando conocido es un ligando o agonista de un receptor GPR119 endógeno de vertebrado, mamífero o ser humano. En ciertas realizaciones, el ligando conocido es un agonista conocido de un receptor GPR119 5 endógeno de vertebrado, mamífero o ser humano. En ciertas realizaciones, el ligando conocido es un ligando o agonista de un receptor GPR119 endógeno humano. En ciertas realizaciones, el ligando conocido es idéntico a un compuesto dado a conocer, por ejemplo, en la solicitud internacional nº PCT/US2004/001267 (publicada como WO 04/065380); la solicitud internacional nº PCT/US2004/005555 (publicada como 10 WO 04/076413); la solicitud internacional nº PCT/US2004/022327 (publicada como WO 05/007647); la solicitud internacional nº PCT/US2004/022417 (publicada como WO 05/007658); la solicitud internacional nº PCT/US2005/019318 (publicada como WO 2005/121121); la solicitud internacional nº PCT/GB2004/050046 (publicada como WO 2005/061489); la solicitud internacional nº PCT/US06/00567 (publicada 15 como WO 2006/083491); la solicitud internacional nº PCT/GB2005/050264 (publicada como WO 2006/067531); la solicitud internacional nº PCT/GB2005/050265 (publicada como WO 2006/067532); la solicitud internacional nº PCT/GB2005/050266 (publicada como WO 2006/070208); la solicitud internacional nº PCT/JP02/09350 (publicada como WO 03/026661); la solicitud 20 internacional nº PCT/JP2005/018412 (publicada como WO 06/040966); la solicitud internacional nº PCT/JP2005/019000 (publicada como WO 2006/043490); la solicitud internacional nº PCT/GB2006/050176 (publicada como WO 2007/003960); la solicitud internacional nº PCT/GB2006/050177 (publicada como WO 2007/003961); la solicitud internacional nº PCT/GB2006/050178 (publicada como WO 25 2007/003962); la solicitud internacional nº PCT/GB2006/050182 (publicada como WO 2007/003964) o la solicitud internacional nº PCT/JP02/09350 (publicada como WO 03/026661). En ciertas realizaciones, el ligando conocido es (2-fluoro-4-metano-sulfonilfenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)piperidin-1-il]-5-nitropirimidin-4-il}amina. En ciertas realizaciones, el ligando conocido es un ligando endógeno de un 30 receptor GPR119 endógeno de vertebrado, mamífero o ser humano.

: [0091] En ciertas realizaciones, el ligando conocido opcionalmente marcado es un ligando conocido marcado. En ciertas realizaciones, el ligando conocido marcado es un ligando conocido radiomarcado. Las técnicas para el radiomarcaje de un compuesto,

: tales como para marcar un ligando conocido de un receptor acoplado con proteína G de la invención, son bien conocidas por el experto. Véase, por ejemplo, la solicitud internacional WO 04/065380. Véase también, por ejemplo, el Ejemplo 11 a continuación.

: [0092] Las técnicas para detectar el complejo entre un receptor acoplado con 5 proteína G y un compuesto conocido por ser un ligando del receptor acoplado con proteína G son bien conocidas por el experto. Véase, por ejemplo, la solicitud internacional WO 04/065380. Véase también, por ejemplo, el Ejemplo 12 a continuación.

: [0093] La invención caracteriza adicionalmente el uso de un GPCR en un 10 procedimiento in vitro para identificar secretagogos de GIP, que comprende las etapas (a) a (c) de este cuarto aspecto, y comprende adicionalmente:

(d) sintetizar opcionalmente un compuesto en presencia del cual se forma menos de dicho complejo en la etapa (c);

(e) poner en contacto un compuesto en presencia del cual se forma menos de 15 dicho compuesto en la etapa (c) in vitro con una célula enteroendocrina de vertebrado o con una célula capaz de secretar GIP; y

(f) determinar si el compuesto estimula la secreción de GIP de la célula enteroendocrina de vertebrado o de la célula capaz de secretar GIP;

en el que la capacidad del compuesto de ensayo de estimular la secreción de 20 GIP de la célula enteroendocrina de vertebrado o de la célula capaz de secretar GIP es indicativa de que el compuesto de ensayo es un secretagogo de GIP. En ciertas realizaciones, la célula enteroendocrina de vertebrado es una célula enteroendocrina de mamífero. En ciertas realizaciones, la célula enteroendocrina es una célula K. En ciertas realizaciones, la célula enteroendocrina comprende tejido derivado del intestino 25 delgado. En ciertas realizaciones, la célula enteroendocrina comprende tejido derivado de una región rica en células K del intestino delgado. En ciertas realizaciones, la célula enteroendocrina comprende tejido de duodeno o yeyuno (véase, por ejemplo, Sondhi y col., Pharmacogenomics J. (2006) 6: 131-140). En ciertas realizaciones, la célula enteroendocrina es una línea celular enteroendocrina. En ciertas realizaciones, la célula 30 capaz de secretar GIP es una célula recombinante modificada por ingeniería genética para ser capaz de secretar GIP.

: [0094] La invención caracteriza adicionalmente el uso de un GPCR en un procedimiento in vitro para identificar secretagogos de GIP, que comprende las etapas

: (a) a (c) de este cuarto aspecto, y comprende adicionalmente:

(e) determinar si un compuesto de ensayo aumenta el nivel de GIP en un vertebrado midiendo el nivel de GIP en una muestra obtenida de un vertebrado al que 5 se ha administrado previamente un compuesto en presencia del cual se forma menos de dicho complejo en la etapa (c);

en el que la capacidad del compuesto de ensayo de aumentar el nivel de GIP en el vertebrado es indicativa de que el compuesto es un secretagogo de GIP. En ciertas realizaciones, el vertebrado es un mamífero. En ciertas realizaciones, el vertebrado es 10 un vertebrado no humano. En ciertas realizaciones, el vertebrado es un mamífero no humano. En ciertas realizaciones, el mamífero es un mamífero no humano.

: [0095] La invención caracteriza adicionalmente un procedimiento para identificar secretagogos de GIP, que comprende las etapas (a) a (c) de este cuarto aspecto, y comprende adicionalmente: 15

(d) sintetizar opcionalmente un compuesto en presencia del cual se forma menos de dicho complejo según la etapa (c);

(e) proporcionar opcionalmente un compuesto en presencia del cual se forma menos de dicho complejo según la etapa (c)

(f) poner en contacto un compuesto en presencia del cual se forma menos de 20 dicho compuesto según la etapa (c) in vitro con una célula enteroendocrina de vertebrado o con una célula capaz de secretar GIP; y

(g) determinar si el compuesto estimula la secreción de GIP de la célula enteroendocrina de vertebrado o de la célula capaz de secretar GIP;

en el que la capacidad del compuesto de ensayo de estimular la secreción de 25 GIP de la célula enteroendocrina de vertebrado o de la célula capaz de secretar GIP es indicativa de que el compuesto de ensayo es un secretagogo de GIP. En ciertas realizaciones, la célula enteroendocrina de vertebrado es una célula enteroendocrina de mamífero. En ciertas realizaciones, la célula enteroendocrina es una célula K. En ciertas realizaciones, la célula enteroendocrina comprende tejido derivado del intestino 30 delgado. En ciertas realizaciones, la célula enteroendocrina comprende tejido derivado de una región rica en células K del intestino delgado. En ciertas realizaciones, la célula enteroendocrina comprende tejido de duodeno o yeyuno (véase, por ejemplo, Sondhi y col., Pharmacogenomics J. (2006) 6: 131-140). En ciertas realizaciones, la célula

enteroendocrina es una línea celular enteroendocrina. En ciertas realizaciones, la célula capaz de secretar GIP es una célula recombinante modificada por ingeniería genética para ser capaz de secretar GIP.

: [0096] La invención caracteriza adicionalmente un procedimiento para identificar secretagogos de GIP, compuestos útiles para prevenir o tratar una afección 5 caracterizada por una baja masa ósea o compuestos útiles para aumentar la masa ósea en un individuo, que comprende las etapas (a) a (c) de este cuarto aspecto, y comprende adicionalmente:

(d) sintetizar opcionalmente un compuesto en presencia del cual se forma menos de dicho complejo según la etapa (c); 10

(e) proporcionar opcionalmente un compuesto en presencia del cual se forma menos de dicho complejo según la etapa (c);

(f) determinar si el compuesto aumenta el nivel de GIP en un vertebrado midiendo el nivel de GIP en una muestra obtenida de un vertebrado al que se ha administrado previamente un compuesto en presencia del cual se forma menos de 15 dicho complejo en la etapa (c);

en el que la capacidad del compuesto de ensayo de aumentar el nivel de GIP en el vertebrado es indicativa de que el compuesto de ensayo es un secretagogo de GIP. En ciertas realizaciones, el vertebrado es un mamífero. En ciertas realizaciones, el vertebrado es un vertebrado no humano. En ciertas realizaciones, el vertebrado es un 20 mamífero no humano. En ciertas realizaciones, el mamífero es un mamífero no humano.

: [0097] En ciertas realizaciones, la muestra de ADN humano es ADN genómico humano.

: [0098] En algunas realizaciones, la reacción en cadena de la polimerasa es 25 reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (PCR-TI). Las técnicas de PCR-TI son bien conocidas por el experto. En ciertas realizaciones, la muestra de ADN humano es ADNc humano. En ciertas realizaciones, el ADNc es de un tejido humano que expresa GPR119. En algunas realizaciones, el tejido humano que expresa GPR119 es páncreas o islote pancreático. En ciertas realizaciones, el ADNc es de un 30 tipo celular humano que expresa GPR119. En ciertas realizaciones, el ADNc es de una célula beta pancreática. En ciertas realizaciones, el ADNc es de una línea celular pancreática.

: [0099] En algunas realizaciones, el receptor acoplado con proteína G codificado

: por un polinucleótido que es amplificable por reacción en cadena de la polimerasa es la SEQ ID NO: 2 o un alelo de la misma. En ciertas realizaciones, el receptor acoplado con proteína G codificado por un polinucleótido que es amplificable por reacción en cadena de la polimerasa es un alelo de la SEQ ID NO: 2. En ciertas realizaciones, el receptor acoplado con proteína G codificado por un polinucleótido que es amplificable 5 por reacción en cadena de la polimerasa se une específicamente a (2-fluoro-4-metanosulfonilfenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)piperidin-1-il]-5-nitropirimidin-4-il}amina. En ciertas realizaciones, el receptor acoplado con proteína G codificado por un polinucleótido que es amplificable por reacción en cadena de la polimerasa es un receptor para el que la (2-fluoro-4-metanosulfonilfenil)-{6-[4-(3-10 isopropil-[1,2,4]-oxadiazol-5-il)piperidin-1-il]-5-nitropirimidin-4-il}amina es un agonista. En algunas realizaciones, el receptor acoplado con proteína G codificado por un polinucleótido que es amplificable por reacción en cadena de la polimerasa exhibe un nivel detectable de actividad constitutiva. En algunas realizaciones, la actividad constitutiva es aumentar el nivel de AMPc intracelular. En algunas realizaciones, la 15 actividad constitutiva es causar que las células melanofóricas experimenten dispersión de pigmento.

: [0100] En ciertas realizaciones, las condiciones de hibridación rigurosas comprenden hibridación a 42ºC en una disolución que comprende 50% de formamida, 5xSSC (1xSSC = NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato de sodio 50 mM 20 (pH 7,6), 5x disolución de Denhardt, 10% de sulfato de dextrano y ADN de esperma de salmón desnaturalizado por cizallamiento 20 µg/ml, seguido de lavado a 65ºC con una disolución que comprende 0,1xSSC. Las técnicas de hibridación son bien conocidas por el experto.

: [0101] En ciertas realizaciones, el GPCR codificado por un polinucleótido que 25 hibrida en condiciones de alto rigor con el complemento de la SEQ ID NO: 1 es la SEQ ID NO: 2 o un alelo de la misma. En ciertas realizaciones, el GPCR codificado por un polinucleótido que hibrida en condiciones de alto rigor con el complemento de la SEQ ID NO: 1 es un alelo de la SEQ ID NO: 2. En ciertas realizaciones, el GPCR codificado por un polinucleótido que hibrida en condiciones de alto rigor con el 30 complemento de la SEQ ID NO: 1 es un ortólogo de la SEQ ID NO: 2. En ciertas realizaciones, el GPCR codificado por un polinucleótido que hibrida en condiciones de alto rigor con el complemento de la SEQ ID NO: 1 se une específicamente a (2-fluoro-4-metanosulfonilfenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)piperidin-1-il]-5-

: nitropirimidin-4-il}amina. En ciertas realizaciones, el GPCR codificado por un polinucleótido que hibrida en condiciones de alto rigor con el complemento de la SEQ ID NO: 1 es un receptor para el que la (2-fluoro-4-metanosulfonilfenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)piperidin-1-il]-5-nitropirimidin-4-il}amina es un agonista. En algunas realizaciones, el GPCR codificado por un polinucleótido que 5 hibrida en condiciones de alto rigor con el complemento de la SEQ ID NO: 1 exhibe un nivel detectable de actividad constitutiva. En algunas realizaciones, la actividad constitutiva es aumentar el nivel de AMPc intracelular. En algunas realizaciones, la actividad constitutiva es causar que células melanofóricas experimenten dispersión de pigmento. 10

: [0102] En ciertas realizaciones, la variante de la SEQ ID NO: 2 se une específicamente a (2-fluoro-4-metanosulfonilfenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)piperidin-1-il]-5-nitropirimidin-4-il}amina. En ciertas realizaciones, la variante de la SEQ ID NO: 2 es un receptor para el que la (2-fluoro-4-metanosulfonilfenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)piperidin-1-il]-5-15 nitropirimidin-4-il}amina es un agonista. En algunas realizaciones, la variante de la SEQ ID NO: 2 exhibe un nivel detectable de actividad constitutiva. En algunas realizaciones, la actividad constitutiva es aumentar el nivel de AMPc intracelular. En algunas realizaciones, la actividad constitutiva es causar que células melanofóricas experimenten dispersión de pigmento. 20

: [0103] En algunas realizaciones, el receptor acoplado con proteína G es parte de una proteína de fusión que comprende una proteína G. Las técnicas para preparar una construcción de fusión GPCR-G son bien conocidas por el experto (véase, por ejemplo, la solicitud internacional WO 02/42461).

: [0104] En ciertas realizaciones, dicha determinación se lleva a cabo usando una 25 célula hospedadora que comprende el receptor acoplado con proteína G. En ciertas realizaciones, la célula hospedadora comprende un vector de expresión, comprendiendo dicho vector de expresión un polinucleótido que codifica el GPRC. En algunas realizaciones, el vector de expresión es pCMV. Este vector se depositó en la American Type Culture Collection (ATCC) el 13 de octubre de 1988 (10801 30 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, EE.UU.) bajo las condiciones del Tratado de Budapest sobre el reconocimiento internacional del depósito de microorganismos a los fines del procedimiento en materia de patentes. Se ensayó el ADN por la ATCC y se determinó que era viable. La ATCC ha asignado el siguiente

: número de depósito al pCMV: ATCC nº 203351. Resultarán fácilmente evidentes para los expertos en la técnica otros vectores de expresión adecuados, y están disponibles comercialmente una amplia variedad de vectores de expresión (por ejemplo, de Clontech, Palo Alto, CA; Stratagene, La Jolla, CA e Invitrogen, Carlsbad, CA).

: [0105] En algunas realizaciones, la célula hospedadora es una célula de 5 vertebrado. En algunas realizaciones, la célula hospedadora es una célula de mamífero. En algunas realizaciones, la célula hospedadora de mamífero se selecciona del grupo constituido por una célula 293, una célula 293T, una célula CHO, una célula MCB3901 y una célula COS-7. En algunas realizaciones, la célula hospedadora es una célula de levadura. En algunas realizaciones, la célula hospedadora es una célula 10 melanofórica. Resultarán fácilmente evidentes otras células hospedadoras adecuadas para los expertos en la técnica, y están disponibles una amplia variedad de líneas celulares en la American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209.

: [0106] En ciertas realizaciones, se lleva a cabo dicha determinación usando 15 membrana que comprende el receptor acoplado con proteína G.

: [0107] En algunas realizaciones, el compuesto de ensayo es una molécula pequeña. En algunas realizaciones, el compuesto de ensayo es una molécula pequeña, con la condición de que la molécula pequeña no sea un polipéptido. En algunas realizaciones, el compuesto de ensayo es una molécula pequeña, con la condición de 20 que la molécula pequeña no sea un anticuerpo ni fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, el compuesto de ensayo es una molécula pequeña, con la condición de que la molécula pequeña no sea un lípido. En algunas realizaciones, el compuesto de ensayo es una molécula pequeña, con la condición de que la molécula pequeña no sea un polipéptido ni un lípido. En algunas realizaciones, 25 el compuesto de ensayo es un polipéptido. En algunas realizaciones, el compuesto de ensayo es un polipéptido, con la condición de que el polipéptido no sea un anticuerpo ni un fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, el compuesto de ensayo es un lípido. En algunas realizaciones, el compuesto de ensayo no es un anticuerpo ni un fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas 30 realizaciones, el compuesto de ensayo es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

: [0108] En algunas realizaciones, el procedimiento comprende adicionalmente la etapa de determinar opcionalmente la estructura del secretagogo de GIP, el compuesto

: útil para tratar o prevenir una afección caracterizada por una baja masa ósea, o el compuesto útil para aumentar la masa ósea en un individuo.

: [0109] En algunas realizaciones, el procedimiento comprende adicionalmente la etapa de proporcionar opcionalmente el nombre o estructura del secretagogo de GIP, el compuesto útil para tratar o prevenir una afección caracterizada por una baja masa 5 ósea, o el compuesto útil para aumentar la masa ósea en un individuo.

: [0110] En algunas realizaciones, dicho procedimiento comprende adicionalmente la etapa de producir o sintetizar opcionalmente el secretagogo de GIP, el compuesto útil para tratar o prevenir una afección caracterizada por una baja masa ósea, o el compuesto útil para aumentar la masa ósea en un individuo. 10

: [0111] En algunas realizaciones, dicho procedimiento comprende adicionalmente la etapa de formular el secretagogo de GIP, el compuesto útil para tratar o prevenir una afección caracterizada por una baja masa ósea, o el compuesto útil para aumentar la masa ósea en un individuo, en una composición farmacéutica.

: [0112] En un aspecto adicional, la invención caracteriza un procedimiento para 15 identificar secretagogos de GIP que comprende las etapas de:

(a) poner en contacto un compuesto que estimula la funcionalidad de un receptor acoplado con proteína G, en el que dicho receptor acoplado con proteína G comprende una secuencia aminoacídica seleccionada del grupo constituido por:

(i) los aminoácidos 1-335 de la SEQ ID NO: 2; 20

(ii) los aminoácidos 2-335 de la SEQ ID NO: 2;

(iii) la secuencia aminoacídica de un receptor acoplado con proteína G codificado por un polinucleótido que es amplificable por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en una muestra de ADN humano usando los cebadores específicos de la SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4; 25

(v) la secuencia aminoacídica de un receptor acoplado con proteína G que tiene al menos un 80% de identidad con la SEQ ID NO: 2; 30

in vitro con una célula enteroendocrina de vertebrado o con una célula capaz de secretar GIP, habiéndose determinado o identificado dicho compuesto mediante un procedimiento según el primer aspecto; y

(b) determinar si el compuesto estimula la secreción de GIP de la célula enteroendocrina de vertebrado o de la célula capaz de secretar GIP; 5

en el que la capacidad del compuesto de ensayo de estimular la secreción de GIP de una célula enteroendocrina de vertebrado o de la célula capaz de secretar GIP es indicativa adicional de que el compuesto de ensayo es un secretagogo de GIP.

: [0113] En ciertas realizaciones, el receptor acoplado con proteína G comprende la secuencia aminoacídica de un receptor acoplado con proteína G que tiene al menos un 10 80% de identidad con la SEQ ID NO: 2.

: [0114] En ciertas realizaciones, el receptor comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 2.

: [0115] En ciertas realizaciones, la variante de la SEQ ID NO: 2 es un alelo de la SEQ ID NO: 2. 15

: [0116] En ciertas realizaciones, la variante de la SEQ ID NO: 2 es un ortólogo de la SEQ ID NO: 2. En ciertas realizaciones, la variante de la SEQ ID NO: 2 es un ortólogo de mamífero de la SEQ ID NO: 2.

: [0117] En ciertas realizaciones, el receptor acoplado con proteína G es recombinante. 20

: [0118] En ciertas realizaciones, la célula enteroendocrina de vertebrado es una célula enteroendocrina de mamífero. En ciertas realizaciones, la célula enteroendocrina es una célula K. En ciertas realizaciones, la célula enteroendocrina comprende tejido derivado del intestino delgado. En ciertas realizaciones, la célula enteroendocrina comprende tejido derivado de una región rica en células K del intestino delgado. En 25 ciertas realizaciones, la célula enteroendocrina comprende tejido de duodeno o yeyuno (véase, por ejemplo, Sondhi et al., Pharmacogenomics J. (2006) 6: 131-140). En ciertas realizaciones, la célula enteroendocrina es una línea celular enteroendocrina. En ciertas realizaciones, la célula capaz de secretar GIP es una célula pancreática. Véase, por ejemplo, Xie y col., Bone 2007 en los referente a la expresión pancreática de GIP. 30 En ciertas realizaciones, la célula capaz de secretar GIP es una célula recombinante modificada por ingeniería genética para ser capaz de secretar GIP.

: [0119] La invención caracteriza adicionalmente un procedimiento para identificar secretagogos de GIP que comprende las etapas de:

(a) determinar si un compuesto aumenta el nivel de GIP en un vertebrado midiendo el nivel de GIP en una muestra obtenida de un vertebrado al que se ha administrado previamente un compuesto que estimula la funcionalidad de un receptor acoplado con proteína G, en el que dicho receptor acoplado con proteína G comprende una secuencia aminoacídica seleccionada del grupo constituido por: 5

(i) los aminoácidos 1-335 de la SEQ ID NO: 2;

(ii) los aminoácidos 2-335 de la SEQ ID NO: 2;

(iii) la secuencia aminoacídica de un receptor acoplado con proteína G codificado por un polinucleótido que es amplificable por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en una muestra de ADN humano usando los cebadores específicos 10 de la SEQ ID NO: 3 y la SEQ ID NO: 4;

(v) la secuencia aminoacídica de un receptor acoplado con proteína G que tiene 15 al menos un 80% de identidad con la SEQ ID NO: 2;

(vii) un fragmento biológicamente activo de (i) o (ii), en el que dicho fragmento biológicamente activo es capaz de unirse al compuesto A, habiéndose determinado o 20 identificado dicho compuesto mediante un procedimiento según el primer aspecto;

en el que la capacidad del compuesto de ensayo de aumentar el nivel de GIP en el vertebrado es indicativa adicional de que el compuesto de ensayo es un secretagogo de GIP.

: [0120] En ciertas realizaciones, el receptor acoplado con proteína G comprende la 25 secuencia aminoacídica de un receptor acoplado con proteína G que tiene al menos aproximadamente un 80% de identidad con la SEQ ID NO: 2.

: [0121] En ciertas realizaciones, el receptor comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 2.

: [0122] En ciertas realizaciones, la variante de la SEQ ID NO: 2 es un alelo de la 30 SEQ ID NO: 2.

: [0123] En ciertas realizaciones, la variante de la SEQ ID NO: 2 es un ortólogo de la SEQ ID NO: 2. En ciertas realizaciones, la variante de la SEQ ID NO: 2 es un ortólogo de mamífero de la SEQ ID NO: 2.

: [0124] En ciertas realizaciones, el receptor acoplado con proteína G es recombinante.

: [0125] En ciertas realizaciones, el nivel de GIP es la concentración de GIP total en sangre o plasma o suero. En ciertas realizaciones, el nivel de GIP es la concentración de GIP bioactivo en sangre o plasma o suero. 5

: [0126] En ciertas realizaciones, el vertebrado es un mamífero. En ciertas realizaciones, el vertebrado es un vertebrado no humano. En ciertas realizaciones, el vertebrado es un mamífero no humano. En ciertas realizaciones, el mamífero es un mamífero no humano.

: [0127] En ciertas realizaciones, la muestra de ADN humano es ADN genómico 10 humano.

: [0128] En algunas realizaciones, la reacción en cadena de la polimerasa es reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (PCR-TI). Las técnicas de PCR-TI son bien conocidas por el experto. En ciertas realizaciones, la muestra de ADN humano es ADNc humano. En ciertas realizaciones, el ADNc es de un tejido 15 humano que expresa GPR119. En algunas realizaciones, el tejido humano que expresa GPR119 es páncreas o islote pancreático. En ciertas realizaciones, al ADNc es de un tipo celular humano que expresa GPR119. En algunas realizaciones, el ADNc es de una célula beta pancreática. En ciertas realizaciones, el ADNc es de una línea celular pancreática. 20

: [0129] En ciertas realizaciones, el receptor acoplado con proteína G codificado por un polinucleótido que es amplificable por reacción en cadena de la polimerasa es la SEQ ID NO: 2 o un alelo de la misma. En ciertas realizaciones, el receptor acoplado con proteína G codificado por un polinucleótido que es amplificable por reacción en cadena de la polimerasa es un alelo de la SEQ ID NO: 2. En ciertas realizaciones, el 25 receptor acoplado con proteína G codificado por un polinucleótido que es amplificable por reacción en cadena de la polimerasa se une específicamente a (2-fluoro-4-metanosulfonilfenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)piperidin-1-il]-5-nitropirimidin-4-il}amina. En ciertas realizaciones, el receptor acoplado con proteína G codificado por un polinucleótido que es amplificable por reacción en cadena de la 30 polimerasa es un receptor para el que la (2-fluoro-4-metanosulfonilfenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]-oxadiazol-5-il)piperidin-1-il]-5-nitropirimidin-4-il}amina es un agonista. En algunas realizaciones, el receptor acoplado con proteína G codificado por un polinucleótido que es amplificable por reacción en cadena de la polimerasa exhibe

: [0130] En ciertas realizaciones, las condiciones de hibridación rigurosas (por 5 ejemplo, condiciones de alto rigor) comprenden hibridación a 42ºC en una disolución que comprende 50% de formamida, 5xSSC (1xSSC = NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato de sodio 50mM (pH 7,6), 5x disolución de Denhardt, 10% de sulfato de dextrano y ADN de esperma de salmón desnaturalizado por cizallamiento 20 µg/ml, seguido de lavado a 65ºC con una disolución que comprende 0,1xSSC. Las técnicas de 10 hibridación son bien conocidas por el experto.

: [0131] En ciertas realizaciones, el GPCR codificado por un polinucleótido que hibrida en condiciones de alto rigor con el complemento de la SEQ ID NO: 1 es la SEQ ID NO: 2 o un alelo de la misma. En ciertas realizaciones, el GPCR codificado por un polinucleótido que hibrida en condiciones de alto rigor con el complemento de 15 la SEQ ID NO: 1 es un alelo de la SEQ ID NO: 2. En ciertas realizaciones, el GPCR codificado por un polinucleótido que hibrida en condiciones de alto rigor con el complemento de la SEQ ID NO: 1 es un ortólogo de la SEQ ID NO: 2. En ciertas realizaciones, el GPCR codificado por un polinucleótido que hibrida en condiciones de alto rigor con el complemento de la SEQ ID NO: 1 se une específicamente a (2-fluoro-20 4-metanosulfonilfenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)piperidin-1-il]-5-nitropirimidin-4-il}amina. En ciertas realizaciones, el GPCR codificado por un polinucleótido que hibrida en condiciones de alto rigor con el complemento de la SEQ ID NO: 1 es un receptor para el que la (2-fluoro-4-metanosulfonilfenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)piperidin-1-il]-5-nitropirimidin-4-il}amina es un 25 agonista. En algunas realizaciones, el GPCR codificado por un polinucleótido que hibrida en condiciones de alto rigor con el complemento de la SEQ ID NO: 1 exhibe un nivel detectable de actividad constitutiva. En algunas realizaciones, la actividad constitutiva es aumentar el nivel de AMPc intracelular. En algunas realizaciones, la actividad constitutiva es causar que células melanofóricas experimenten dispersión de 30 pigmento.

: [0132] En ciertas realizaciones, la variante de la SEQ ID NO: 2 se une específicamente a (2-fluoro-4-metanosulfonilfenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)piperidin-1-il]-5-nitropirimidin-4-il}amina. En ciertas

: realizaciones, la variante de la SEQ ID NO: 2 es un receptor para el que la (2-fluoro-4-metanosulfonilfenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)piperidin-1-il]-5-nitropirimidin-4-il}amina es un agonista. En algunas realizaciones, la variante de la SEQ ID NO: 2 exhibe un nivel detectable de actividad constitutiva. En algunas realizaciones, la actividad constitutiva es aumentar el nivel de AMPc intracelular. En 5 algunas realizaciones, la actividad constitutiva es causar que células melanofóricas experimenten dispersión de pigmento.

: [0133] En algunas realizaciones, el receptor acoplado con proteína G es parte de una proteína de fusión que comprende una proteína G. Las técnicas para preparar una construcción de GPCR:G son bien conocidas por el experto (véase, por ejemplo, la 10 solicitud internacional WO 02/42461).

: [0134] En algunas realizaciones, el compuesto que estimula la funcionalidad de un receptor acoplado con proteína G es una molécula pequeña. En algunas realizaciones, el compuesto que estimula la funcionalidad de un receptor acoplado con proteína G es una molécula pequeña, con la condición de que la molécula pequeña no sea un 15 polipéptido. En algunas realizaciones, el compuesto que estimula la funcionalidad de un receptor acoplado con proteína G es una molécula pequeña, con la condición de que la molécula pequeña no sea un anticuerpo ni un fragmento de unión a antígeno de mismo. En algunas realizaciones, el compuesto que estimula la funcionalidad de un receptor acoplado con proteína G es una molécula pequeña, con la condición de que la 20 molécula pequeña no sea un lípido. En algunas realizaciones, el compuesto que estimula la funcionalidad de un receptor acoplado con proteína G es una molécula pequeña, con la condición de que la molécula pequeña no sea un polipéptido ni un lípido. En algunas realizaciones, el compuesto que estimula la funcionalidad de un receptor acoplado con proteína G es un polipéptido. En algunas realizaciones, el 25 compuesto que estimula la funcionalidad de un receptor acoplado con proteína G es un polipéptido, con la condición de que el polipéptido no sea un anticuerpo ni un fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, el compuesto que estimula la funcionalidad de un receptor acoplado con proteína G es un lípido. En algunas realizaciones, el compuesto que estimula la funcionalidad de un receptor 30 acoplado con proteína G no es un anticuerpo ni un fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, el compuesto que estimula la funcionalidad de un receptor acoplado con proteína G es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

: [0135] En algunas realizaciones, el procedimiento comprende adicionalmente la etapa de determinar opcionalmente la estructura del secretagogo de GIP, el compuesto útil para tratar o prevenir una afección caracterizada por una baja masa ósea, o el compuesto usado para aumentar la masa ósea en un individuo.

: [0136] En algunas realizaciones, el procedimiento comprende adicionalmente la 5 etapa de proporcionar opcionalmente el nombre o estructura del secretagogo de GIP, el compuesto útil para tratar o prevenir una afección caracterizada por una baja masa ósea o el compuesto útil para aumentar la masa ósea en un individuo.

: [0137] En algunas realizaciones, dicho procedimiento comprende adicionalmente la etapa de producir o sintetizar opcionalmente el secretagogo de GIP, el compuesto 10 útil para tratar o prevenir una afección caracterizada por una baja masa ósea o el compuesto útil para aumentar la masa ósea en un individuo.

: [0138] En algunas realizaciones, dicho procedimiento comprende adicionalmente la etapa de formular el secretagogo de GIP, el compuesto útil para tratar o prevenir una afección caracterizada por una baja masa ósea o el compuesto útil para aumentar la 15 masa ósea en un individuo, como un producto farmacéutico.

: [0139] En algunas realizaciones, dicho procedimiento comprende adicionalmente la etapa de formular el secretagogo de GIP, el compuesto útil para tratar o prevenir una afección caracterizada por una baja masa ósea o el compuesto útil para aumentar la masa ósea en un individuo, en una composición farmacéutica. 20

: [0140] En un aspecto adicional, la invención caracteriza un procedimiento para identificar secretagogos de GIP, que comprende las etapas de:

(a) poner en contacto un compuesto en presencia del cual se forma menos de un complejo entre un receptor acoplado con proteína G y un ligando conocido opcionalmente marcado del receptor que en ausencia del compuesto, en el que el 25 receptor acoplado con proteína G comprende una secuencia aminoacídica seleccionada del grupo constituido por:

(i) los aminoácidos 1-335 de la SEQ ID NO: 2;

(ii) los aminoácidos 2-335 de la SEQ ID NO: 2;

(iii) la secuencia aminoacídica de un receptor acoplado con proteína G 30 codificado por un polinucleótido que es amplificable por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en una muestra de ADN humano usando los cebadores específicos de la SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:4;

(iv) la secuencia aminoacídica de un receptor acoplado con proteína G

codificado por un polinucleótido que hibrida en condiciones de alto rigor con el complemento de la SEQ ID NO:1;

(v) la secuencia aminoacídica de un receptor acoplado con proteína G que tiene al menos aproximadamente un 80% de identidad con la SEQ ID NO: 2;

(vi) la secuencia aminoacídica de una versión constitutivamente activa de un 5 receptor acoplado con proteína G que tiene la SEQ ID NO: 2; y

(vii) un fragmento biológicamente activo de una cualquiera de (i) o (ii), en el que el fragmento biológicamente activo es capaz de unirse al compuesto A;

in vitro con una célula enteroendocrina de vertebrado o con una célula capaz de secretar GIP, habiéndose determinado o identificado dicho compuesto mediante un 10 procedimiento según el cuarto aspecto; y

en el que la capacidad del compuesto de ensayo de estimular la secreción de GIP de la célula enteroendocrina de vertebrado o de la célula capaz de secretar GIP es 15 indicativa adicional de que el compuesto de ensayo es un secretagogo de GIP.

: [0141] En ciertas realizaciones, el receptor acoplado con proteína G comprende la secuencia aminoacídica de un receptor acoplado con proteína G que tiene al menos aproximadamente un 80% de identidad con la SEQ ID NO: 2.

: [0142] En ciertas realizaciones, el receptor comprende la secuencia aminoacídica 20 de la SEQ ID NO: 2.

: [0143] En ciertas realizaciones, la variante de la SEQ ID NO: 2 es un alelo de la SEQ ID NO: 2.

: [0144] En ciertas realizaciones, la variante de la SEQ ID NO: 2 es un ortólogo de la SEQ ID NO: 2. En ciertas realizaciones, la variante de la SEQ ID NO: 2 es un 25 ortólogo de mamífero de la SEQ ID NO: 2.

: [0145] En ciertas realizaciones, el receptor acoplado con proteína G es recombinante.

: [0146] En ciertas realizaciones, la célula enteroendocrina de vertebrado es una célula enteroendocrina de mamífero. En ciertas realizaciones, la célula enteroendocrina 30 es una célula K. En ciertas realizaciones, la célula enteroendocrina comprende tejido derivado del intestino delgado. En ciertas realizaciones, la célula enteroendocrina comprende tejido derivado de una región rica en células K del intestino delgado. En ciertas realizaciones, la célula enteroendocrina comprende tejido de duodeno o yeyuno

: (véase, por ejemplo, Sondhi y col., Pharmacogenomics J. (2006) 6: 131-140). En ciertas realizaciones, la célula enteroendocrina es una línea celular enteroendocrina. En ciertas realizaciones, la célula capaz de secretar GIP es una célula pancreática. Véase, por ejemplo, Xie y col., Bone 2007 en lo referente a la expresión pancreática de GIP. En ciertas realizaciones, la célula capaz de secretar GIP es una célula recombinante 5 modificada por ingeniería genética para ser capaz de secretar GIP.

: [0147] La invención caracteriza adicionalmente un procedimiento para identificar secretagogos de GIP, que comprende las etapas de:

(a) determinar si un compuesto aumenta el nivel de GIP en un vertebrado midiendo el nivel de GIP en una muestra obtenida de un vertebrado al que se ha 10 administrado previamente un compuesto, en el que en presencia de dicho compuesto se forma menos de un complejo entre un receptor acoplado con proteína G y un ligando conocido opcionalmente marcado del receptor que en ausencia del compuesto, en el que dicho receptor acoplado con proteína G comprende una secuencia aminoacídica seleccionada del grupo constituido por: 15

(i) los aminoácidos 1-335 de la SEQ ID NO: 2;

(ii) los aminoácidos 2-335 de la SEQ ID NO: 2;

(iii) la secuencia aminoacídica de un receptor acoplado con proteína G codificado por un polinucleótido que es amplificable por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en una muestra de ADN humano usando los cebadores específicos 20 de la SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4;

(v) la secuencia aminoacídica de un receptor acoplado con proteína G que tiene 25 al menos un 80% de identidad con la SEQ ID NO: 2;

(vii) un fragmento biológicamente activo de (i) o (ii), en el que dicho fragmento biológicamente activo es capaz de unirse al compuesto A, habiéndose determinado o 30 identificado dicho compuesto mediante un procedimiento según el cuarto aspecto;

: [0148] En ciertas realizaciones, el vertebrado es un mamífero. En ciertas realizaciones, el vertebrado es un vertebrado no humano. En ciertas realizaciones, el vertebrado es un mamífero no humano. En ciertas realizaciones, el mamífero es un mamífero no humano.

: [0149] En ciertas realizaciones, la muestra de ADN humano es ADN genómico 5 humano.

: [0150] En algunas realizaciones, la reacción en cadena de la polimerasa es reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (PCR-TI). Las técnicas de PCR-TI son bien conocidas por el experto. En ciertas realizaciones, la muestra de ADN humano es ADNc humano. En ciertas realizaciones, el ADNc es de un tejido 10 humano que expresa GPR119. En algunas realizaciones, el tejido humano que expresa GPR119 es páncreas o islote pancreático. En ciertas realizaciones, el ADNc es de un tipo celular humano que expresa GPR119. En algunas realizaciones, el ADNc es de una célula beta pancreática. En algunas realizaciones, el ADNc es de una línea celular pancreática. 15

: [0151] En ciertas realizaciones, el receptor acoplado con proteína G codificado por el polinucleótido que es amplificable por reacción en cadena de la polimerasa es la SEQ ID NO: 2 o un alelo de la misma. En ciertas realizaciones, el receptor acoplado con proteína G codificado por un polinucleótido que es amplificable por reacción en cadena de la polimerasa es un alelo de la SEQ ID NO: 2. En ciertas realizaciones, el 20 receptor acoplado con proteína G codificado por un polinucleótido que es amplificable por reacción en cadena de la polimerasa se une específicamente a (2-fluoro-4-metanosulfonilfenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)piperidin-1-il]-5-nitropirimidin-4-il}amina. En ciertas realizaciones, el receptor acoplado con proteína G codificado por un polinucleótido que es amplificable por reacción en cadena de la 25 polimerasa es un receptor para el que la (2-fluoro-4-metanosulfonilfenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]-oxadiazol-5-il)piperidin-1-il]-5-nitropirimidin-4-il}amina es un agonista. En algunas realizaciones, el receptor acoplado con proteína G codificado por un polinucleótido que es amplificable por reacción en cadena de la polimerasa exhibe un nivel detectable de actividad constitutiva. En algunas realizaciones, la actividad 30 constitutiva es aumentar el nivel de AMPc intracelular. En algunas realizaciones, la actividad constitutiva es causar que las células melanofóricas experimenten dispersión de pigmento.

: [0152] En ciertas realizaciones, las condiciones de hibridación rigurosas (por

: ejemplo condiciones de alto rigor) comprenden hibridación a 42ºC en una disolución que comprende 50% de formamida, 5xSSC (1xSSC = NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato de sodio 50mM (pH 7,6), 5x disolución de Denhardt, 10% de sulfato de dextrano y ADN de esperma de salmón desnaturalizado por cizallamiento 20 µg/ml, seguido de lavado a 65ºC con una disolución que comprende 0,1xSSC. Las técnicas de 5 hibridación son bien conocidas por el experto en la técnica.

: [0153] En ciertas realizaciones, el GPCR codificado por un polinucleótido que hibrida en condiciones de alto rigor con el complemento de la SEQ ID NO: 1 es la SEQ ID NO: 2 o un alelo de la misma. En ciertas realizaciones, el GPCR codificado por un polinucleótido que hibrida en condiciones de alto rigor con el complemento de 10 la SEQ ID NO: 1 es un alelo de la SEQ ID NO: 2. En ciertas realizaciones, el GPCR codificado por un polinucleótido que hibrida en condiciones de alto rigor con el complemento de la SEQ ID NO: 1 es un ortólogo de la SEQ ID NO: 2. En ciertas realizaciones, el GPCR codificado por un polinucleótido que hibrida en condiciones de alto rigor con el complemento de la SEQ ID NO: 1 se une específicamente a (2-fluoro-15 4-metanosulfonilfenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)piperidin-1-il]-5-nitropirimidin-4-il}amina. En ciertas realizaciones, el GPCR codificado por un polinucleótido que hibrida en condiciones de alto rigor con el complemento de la SEQ ID NO: 1 es un receptor para el que la (2-fluoro-4-metanosulfonilfenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)piperidin-1-il]-5-nitropirimidin-4-il}amina es un 20 agonista. En algunas realizaciones, el GPCR codificado por un polinucleótido que hibrida en condiciones de alto rigor con el complemento de la SEQ ID NO: 1 exhibe un nivel detectable de actividad constitutiva. En algunas realizaciones, la actividad constitutiva es aumentar el nivel de AMPc intracelular. En algunas realizaciones, la actividad constitutiva es causar que las células melanofóricas experimenten dispersión 25 de pigmento.

: [0154] En ciertas realizaciones, la variante de la SEQ ID NO: 2 se une específicamente a (2-fluoro-4-metanosulfonilfenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)piperidin-1-il]-5-nitropirimidin-4-il}amina. En ciertas realizaciones, la variante de la SEQ ID NO: 2 es un receptor para el que la (2-fluoro-4-30 metanosulfonilfenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)piperidin-1-il]-5-nitropirimidin-4-il}amina es un agonista. En algunas realizaciones, la variante de la SEQ ID NO: 2 exhibe un nivel detectable de actividad constitutiva. En algunas realizaciones, la actividad constitutiva es aumentar el nivel de AMPc intracelular. En

: algunas realizaciones, la actividad constitutiva es causar que las células melanofóricas experimenten dispersión de pigmento.

: [0155] En algunas realizaciones, el receptor acoplado con proteína G es parte de una proteína de fusión que comprende una proteína G. Las técnicas para preparar una construcción de fusión GPCR:G son bien conocidas por el experto (véase, por ejemplo, 5 la solicitud internacional WO 02/42461).

: [0156] En algunas realizaciones, el compuesto en cuya presencia se forma menos de un complejo entre un receptor acoplado con proteína G y un ligando conocido opcionalmente marcado del receptor que en ausencia del compuesto es una molécula pequeña. En algunas realizaciones, el compuesto en cuya presencia se forma menos de 10 un complejo entre un receptor acoplado con proteína G y un ligando conocido opcionalmente marcado del receptor que en ausencia del compuesto es una molécula pequeña, con la condición de que la molécula pequeña no sea un polipéptido. En algunas realizaciones, el compuesto en cuya presencia se forma menos de un complejo entre un receptor acoplado con proteína G y un ligando conocido opcionalmente 15 marcado del receptor que en ausencia del compuesto es una molécula pequeña, con la condición de que la molécula pequeña no sea un anticuerpo ni un fragmento de unión a antígeno de mismo. En algunas realizaciones, el compuesto en cuya presencia se forma menos de un complejo entre un receptor acoplado con proteína G y un ligando conocido opcionalmente marcado del receptor que en ausencia del compuesto es una 20 molécula pequeña, con la condición de que la molécula pequeña no sea un lípido. En algunas realizaciones, el compuesto en cuya presencia se forma menos de un complejo entre un receptor acoplado con proteína G y un ligando conocido opcionalmente marcado del receptor que en ausencia del compuesto es una molécula pequeña, con la condición de que la molécula pequeña no sea un polipéptido ni un lípido. En algunas 25 realizaciones, el compuesto en cuya presencia se forma menos de un complejo entre un receptor acoplado con proteína G y un ligando conocido opcionalmente marcado del receptor que en ausencia del compuesto es un polipéptido. En algunas realizaciones, el compuesto en cuya presencia se forma menos de un complejo entre un receptor acoplado con proteína G y un ligando conocido opcionalmente marcado del receptor 30 que en ausencia del compuesto es un polipéptido, con la condición de que el polipéptido no sea un anticuerpo ni un fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, el compuesto en cuya presencia se forma menos de un complejo entre un receptor acoplado con proteína G y un ligando conocido opcionalmente

: marcado del receptor que en ausencia del compuesto es un lípido. En algunas realizaciones, el compuesto en cuya presencia se forma menos de un complejo entre un receptor acoplado con proteína G y un ligando conocido opcionalmente marcado del receptor que en ausencia del compuesto no es un anticuerpo ni un fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, el compuesto en cuya presencia se 5 forma menos de un complejo entre un receptor acoplado con proteína G y un ligando conocido opcionalmente marcado del receptor que en ausencia del compuesto es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

: [0157] En ciertas realizaciones, el ligando conocido es un ligado o agonista de un receptor GPR119 endógeno de vertebrado, mamífero o ser humano. En ciertas 10 realizaciones, el ligando conocido es un agonista conocido de un receptor GPR119 endógeno de vertebrado, mamífero o ser humano. En ciertas realizaciones, el ligando conocido es un ligando o agonista de un receptor GPR119 endógeno de vertebrado, mamífero o ser humano. En ciertas realizaciones, el ligando conocido es idéntico a un compuesto dado a conocer, por ejemplo, en la solicitud internacional nº 15 PCT/US2004/001267 (publicada como WO 04/065380); la solicitud internacional nº PCT/US2004/005555 (publicada como WO 04/076413); la solicitud internacional nº PCT/US2004/022327 (publicada como WO 05/007647); la solicitud internacional nº PCT/US2004/022417 (publicada como WO 05/007658); la solicitud internacional nº PCT/US2005/019318 (publicada como WO 2005/121121); la solicitud internacional nº 20 PCT/GB2004/050046 (publicada como WO 2005/061489); la solicitud internacional nº PCT/US06/00567 (publicada como WO 2006/083491); la solicitud internacional nº PCT/GB2005/050264 (publicada como WO 2006/067531); la solicitud internacional nº PCT/GB2005/050265 (publicada como WO 2006/067532); la solicitud internacional nº PCT/GB2005/050266 (publicada como WO 2006/070208); la 25 solicitud internacional nº PCT/JP02/09350 (publicada como WO 03/026661); la solicitud internacional nº PCT/JP2005/018412 (publicada como WO 06/040966); la solicitud internacional nº PCT/JP2005/019000 (publicada como WO 2006/043490); la solicitud internacional nº PCT/GB2006/050176 (publicada como WO 2007/003960); la solicitud internacional nº PCT/GB2006/050177 (publicada como WO 30 2007/003961); la solicitud internacional nº PCT/GB2006/050178 (publicada como WO 2007/003962); la solicitud internacional nº PCT/GB2006/050182 (publicada como WO 2007/003964) o la solicitud internacional nº PCT/JP02/09350 (publicada como WO 03/026661). En ciertas realizaciones, el ligando conocido es (2-fluoro-4-

: metanosulfonilfenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)piperidin-1-il]-5-nitropirimidin-4-il}amina. En ciertas realizaciones, el ligando conocido es un ligando endógeno de un receptor GPR119 endógeno de vertebrado, mamífero o ser humano.

: [0158] En ciertas realizaciones, el ligando conocido opcionalmente marcado es un ligando conocido marcado. En ciertas realizaciones, el ligando conocido marcado es un 5 ligando conocido radiomarcado. Las técnicas para el radiomarcaje de un compuesto, tales como para marcar un ligando conocido de un receptor acoplado con proteína G de la invención, son bien conocidas por el experto. Véase, por ejemplo, la solicitud internacional WO 04/065380. Véase también, por ejemplo, el Ejemplo 11 a continuación. 10

: [0159] Las técnicas para detectar el complejo entre un receptor acoplado con proteína G y un compuesto conocido por ser un ligando del receptor acoplado con proteína G son bien conocidas por el experto. Véase, por ejemplo, la solicitud internacional WO 04/065380. Véase también, por ejemplo, el Ejemplo 12 a continuación. 15

: [0160] En algunas realizaciones, el procedimiento comprende adicionalmente la etapa de determinar opcionalmente la estructura del secretagogo de GIP, el compuesto útil para tratar o prevenir una afección caracterizada por una baja masa ósea, o el compuesto útil para aumentar la masa ósea en un individuo.

: [0161] En algunas realizaciones, el procedimiento comprende adicionalmente la 20 etapa de proporcionar opcionalmente el nombre o estructura del secretagogo de GIP, el compuesto útil para tratar o prevenir una afección caracterizada por una baja masa ósea, o el compuesto útil para aumentar la masa ósea en un individuo.

: [0162] En algunas realizaciones, dicho procedimiento comprende adicionalmente la etapa de producir o sintetizar opcionalmente el secretagogo de GIP, el compuesto 25 útil para tratar o prevenir una afección caracterizada por una baja masa ósea o el compuesto útil para aumentar la masa ósea en un individuo.

: [0163] En algunas realizaciones, dicho procedimiento comprende adicionalmente la etapa de formular el secretagogo de GIP, el compuesto útil para tratar o prevenir una afección caracterizada por una baja masa ósea o el compuesto útil para aumentar la 30 masa ósea en un individuo, como producto farmacéutico.

: [0164] En algunas realizaciones, dicho procedimiento comprende adicionalmente la etapa de formular el secretagogo de GIP, el compuesto útil para tratar o prevenir una afección caracterizada por una baja masa ósea o el compuesto útil para aumentar la

: masa ósea en un individuo, en una composición farmacéutica.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

: [0165] La invención se ilustra con relación a las figuras adjuntas a la misma, en las que:

La FIG. 1 muestra un análisis farmacodinámico del efecto de la administración 5 de agonista de GPR119 sobre el nivel de GIP en sangre en ratones no genomanipulados. A. Análisis temporal llevado a cabo usando el compuesto 1 como agonista de GPR119. B. Análisis temporal llevado a cabo usando el compuesto 3 como agonista de GPR119. C. Análisis de título de dosis llevado a cabo usando el compuesto 3 como agonista de GPR119. 10

La FIG. 2 muestra el efecto de la administración de agonista de GPR119 sobre el nivel de GIP en sangre en ratones deficientes de GPR119 (por inactivación génica) en comparación con ratones no genomanipulados. A. Se llevó a cabo la comparación usando el compuesto 1 como agonista de GPR119. B. Se llevó a cabo la comparación usando el compuesto 2 como agonista de GPR119. 15

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

: [0166] La presente invención caracteriza procedimientos de uso del receptor GPR119 para identificar secretagogos de GIP, que pueden ser útiles para aumentar la masa ósea en un individuo. Los agonistas del receptor GPR119 son útiles como agentes terapéuticos para tratar o prevenir una afección caracterizada por una baja 20 masa ósea, tal como osteoporosis, y para aumentar la masa ósea en un individuo. La presente invención está basada, al menos en parte, en el sorprendente descubrimiento por el solicitante de que la administración de un agonista de GPR119 a un individuo, tal como mediante administración oral, puede actuar en el receptor GPR119, aumentando el nivel de GIP en el individuo. 25

: [0167] El término “ligando”, como se usa en la presente memoria, significará una molécula (por ejemplo, el compuesto de ensayo) que se une específicamente a un polipéptido tal como GPR119. Un ligando puede ser, por ejemplo, un polipéptido, un lípido, una molécula pequeña o anticuerpo. El compuesto 1 es un ligando ejemplar del polipéptido receptor GPR119 (véase la Tabla A, que expone la estructura química y el 30 nombre químico del compuesto 1). El compuesto 1 es idéntico a un compuesto dado a conocer en la solicitud de patente internacional nº PCT/US2004/001267 (publicada como WO 2004/065380). La (2-fluoro-4-metanosulfonilfenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]-oxadiazol-5-il)piperidin-1-il]-5-nitropirimidin-4-il}amina (véase la Tabla A) es

: un ligando ejemplar del polipéptido receptor GPR119. El compuesto 2 es un ligando ejemplar del polipéptido receptor GPR119. El compuesto 2 es idéntico a un compuesto dado a conocer en la solicitud de patente internacional nº PCT/US2004/022417 (publicada como WO 2005/007658). El compuesto 3 es un ligando ejemplar del polipéptido receptor GPR119. El compuesto 3 es idéntico a un compuesto dado a 5 conocer en la solicitud de patente internacional nº PCT/US2004/022327 (publicada como WO 2005/007647). Un ligando endógeno es un ligando que es un ligando endógeno natural de un polipéptido nativo, tal como GPR119. Un ligando puede ser un “antagonista”, “agonista parcial” o “agonista inverso” o similar.

10

TABLA A

: (2-Fluoro-4-metanosulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)piperidin-1-il]-5-nitropirimidin-4-il}amina

: [0168] El término “agonista”, como se usa en la presente memoria, significará un agente (por ejemplo, ligando o compuesto de ensayo) que, en virtud de la unión a un GPCR, activa el GPCR de modo que desencadena una respuesta intracelular mediada por el GPCR. 5

: [0169] La expresión “agonista parcial”, como se usa en la presente memoria, significará un agente (por ejemplo, ligando o compuesto de ensayo) que, en virtud de la unión a un GPCR, activa el GPCR de modo que se desencadena una respuesta mediada por el GPCR, aunque en una menor extensión o grado que un agonista completo. 10

: [0170] El término “antagonista” significará un agente (por ejemplo, ligando o compuesto de ensayo) que se une, y preferiblemente que se une competitivamente, a un GPCR en aproximadamente el mismo sitio que un agonista o agonista parcial, pero que no activa una respuesta intracelular iniciada por la forma activa del GPCR, y puede inhibir así la respuesta intracelular por un agonista o agonista parcial. Un 15 antagonista típicamente no reduce la respuesta intracelular de valor de referencia en ausencia de agonista o agonista parcial.

: [0171] La expresión “agonista inverso” significará un agente (por ejemplo, ligando o compuesto de ensayo) que se une a un GPCR y que inhibe la respuesta intracelular de referencia iniciada por la forma activa del receptor por debajo del nivel 20 basal normal que se observa en ausencia de un agonista o agonista parcial.

: [0172] La expresión “agonista de GPR119”, como se usa en la presente memoria, designa un compuesto que se une al receptor GPR119 y actúa como agonista. El compuesto 1 es un agonista ejemplar de GPR119 (véase la Tabla A, que expone la estructura química y el nombre químico del compuesto 1). El compuesto 1 es idéntico al compuesto dado a conocer en la solicitud de patente internacional nº 5 PCT/US2004/001267 (publicada como WO 2004/065380). La (2-fluoro-4-metanosulfonilfenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]-oxadiazol-5-il)piperidin-1-il]-5-nitropirimidin-4-il}amina es un agonista ejemplar de GPR119. El compuesto 2 es un agonista ejemplar de GPR119. El compuesto 2 es idéntico a un compuesto dado a conocer en la solicitud de patente internacional nº PCT/US2004/022417 (publicada 10 como WO 2005/007658). El compuesto 3 es un agonista ejemplar de GPR119. El compuesto 3 es idéntico a un compuesto dado a conocer en la solicitud de patente internacional nº PCT/US2004/022327 (publicada como WO 2005/007647).

: [0173] La expresión “agonista selectivo de GPR119”, como se usa en la presente memoria, designa un agonista de GPR119 que tiene selectividad por el receptor 15 GPR119 frente a uno o más receptores relacionados, tales como receptor factor de liberación de corticotropina 1 (CRF-1). El compuesto 1 es un agonista selectivo ejemplar de GPR119 (véase la Tabla A, que expone la estructura química y nombre químico del compuesto 1). El compuesto 1 es idéntico a un compuesto dado a conocer en la solicitud de patente internacional nº PCT/US2004/001267 (publicada como WO 20 2004/065380). La (2-fluoro-4-metanosulfonilfenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)piperidin-1-il]-5-nitropirimidin-4-il}amina es un agonista selectivo ejemplar de GPR119. El compuesto 2 es un agonista selectivo ejemplar de GPR119. El compuesto 2 es idéntico a un compuesto dado a conocer en la solicitud de patente internacional nº PCT/US2004/022417 (publicada como WO2005/007658). El 25 compuesto 3 es un agonista selectivo ejemplar de GPR119. El compuesto 3 es idéntico a un compuesto dado a conocer en la solicitud de patente internacional nº PCT/US2004/022327 (publicada como WO 2005/007647).

: [0174] La expresión “secretagogo de GIP” significará un agente (por ejemplo, ligando o compuesto de ensayo) que promueve la secreción de GIP en una célula, por 30 ejemplo una célula enteroendocrina, o que aumenta el nivel de GIP total, por ejemplo el nivel de GIP total en sangre o plasma, tras la administración a un individuo tal como un vertebrado o un mamífero. En ciertas realizaciones, un secretagogo de GIP es un compuesto adecuado para aumentar el nivel de GIP total en un individuo, por ejemplo,

: el nivel de GIP total en sangre o plasma.

: [0175] El término “individuo”, como se usa en la presente memoria, designa un vertebrado, incluyendo pero sin limitación peces (tales como peces criados comercialmente, peces domésticos, etc.), anfibios (tales como ranas, sapos, anfibios domésticos, etc.), reptiles (tales como serpientes, lagartos, tortugas, reptiles 5 domésticos, etc.), aves (tales como pollos, pavos, aves domésticas, etc.) y mamíferos (tales como ratones, ratas, hámsteres, conejos, cerdos, perros, gatos, caballos, vacas, ovejas, cabras, primates no humanos, mamíferos no humanos, mamíferos no humanos domésticos, seres humanos, etc.). En ciertas realizaciones, el individuo es un pez. En ciertas realizaciones, el individuo es un anfibio. En ciertas realizaciones, el individuo 10 es un reptil. En ciertas realizaciones, el individuo es un ave. En ciertas realizaciones, el individuo es un pavo. Durante los últimos 25 años, la presión selectiva comercial de pavos con mayor masa muscular de pechuga ha planteado exigencias crecientes a la integridad esquelética. La masa muscular de pechuga aumentada, sin embargo, no ha estado acompañada por cambios compensatorios en el esqueleto, con el resultado de 15 que la industria del pavo ha experimentado un aumento de problemas en las patas. Se ha notificado la fractura de huesos largos en pavos macho adultos jóvenes. (Véase, por ejemplo, Crespo y col., Poult. Sci. (2000) 79: 602-608). En ciertas realizaciones, el individuo es un mamífero. En ciertas realizaciones, el individuo es un ratón, una rata, un hámster, un conejo, un cerdo, un perro, un gato, un caballo, una vaca, una oveja, 20 una cabra, un primate no humano o un ser humano (que pueden incluirse en realizaciones de la invención individualmente o en cualquier combinación). En ciertas realizaciones, el individuo es un caballo. Los caballos de competición, que son caballos implicados en actividades tales como carreras, domas y otros eventos competitivos, son susceptibles de fractura ósea. En ciertas realizaciones, el individuo 25 es un perro o un gato. En ciertas realizaciones, el individuo es un animal de compañía para seres humanos (tal como un perro, un gato, etc.), un animal de granja (tal como una vaca, una oveja, una cabra, un cerdo, un pollo, etc.), un animal para deportes (tal como un caballo, un perro, etc.), una bestia de carga (tal como una mula, un camello, etc.) o un animal exótico (tal como un animal que se encuentra en un zoológico, etc.), 30 que pueden incluirse en realizaciones de la invención individualmente o en cualquier combinación. En ciertas realizaciones, el individuo es un mamífero no humano. En ciertas realizaciones, el individuo es un primate no humano (tal como un mono Rhesus, un chimpancé, etc.). En ciertas realizaciones, el individuo es un ser humano.

: [0176] La expresión “necesitado de prevención o tratamiento”, como se usa en la presente memoria, designa el juicio formulado por un cuidador (por ejemplo, médico, enfermera o enfermera practicante en el caso de seres humanos; veterinario en el caso de vertebrados no humanos, y en una realización particular mamíferos no humanos) de que un individuo requiere o se beneficiará del tratamiento. 5

: [0177] La expresión “cantidad terapéuticamente eficaz” o “dosis terapéuticamente eficaz”, como se usa en la presente memoria, designa la cantidad de compuesto activo o agente farmacéutico que desencadena la respuesta biológica o médica en un tejido, sistema, animal, individuo o ser humano que se está buscando por un investigador, veterinario, doctor u otro facultativo, que incluye uno o más de los siguientes: 10

(1) prevenir la enfermedad; por ejemplo, prevenir una enfermedad, afección o trastorno en un individuo que puede estar predispuesto hacia la enfermedad, afección o trastorno pero que no experimenta o exhibe todavía la patología o sintomatología de la enfermedad,

(2) inhibir la enfermedad; por ejemplo, inhibir una enfermedad, afección o 15 trastorno en un individuo que está experimentando o exhibiendo la patología o sintomatología de la enfermedad, afección o trastorno (concretamente, detener el desarrollo adicional de la patología y/o sintomatología), y

(3) mejorar la enfermedad; por ejemplo, mejorar una enfermedad, afección o trastorno en un individuo que está experimentando o exhibiendo la patología o 20 sintomatología de la enfermedad, afección o trastorno (concretamente, revertir la patología y/o sintomatología).

: [0178] La expresión “eficacia terapéutica”, como se usa en la presente memoria, designa el desencadenamiento de la respuesta biológica o médica en un tejido, sistema, animal o ser humano que se está buscando por un investigador, veterinario, doctor u 25 otro facultativo, que incluye uno o más de los siguientes:

(1) prevenir la enfermedad; por ejemplo, prevenir una enfermedad, afección o trastorno en un individuo que puede estar predispuesto hacia la enfermedad, afección o trastorno pero que no experimenta o exhibe todavía la patología o sintomatología de la enfermedad, 30

(2) inhibir la enfermedad; por ejemplo, inhibir una enfermedad, afección o trastorno en un individuo que está experimentando o exhibiendo la patología o sintomatología de la enfermedad, afección o trastorno (concretamente, detener el desarrollo adicional de la patología y/o sintomatología), y

(3) mejorar la enfermedad; por ejemplo, mejorar una enfermedad, afección o trastorno en un individuo que está experimentando o exhibiendo la patología o sintomatología de la enfermedad, afección o trastorno (concretamente, revertir la patología y/o sintomatología).

: [0179] La expresión “cantidad que es eficaz para prevenir” designa aquella 5 cantidad de fármaco que prevendrá o reducirá el riesgo de aparición del evento biológico o médico que se busca prevenir. En muchos casos, la cantidad que es eficaz para prevenir es la misma que la cantidad terapéuticamente eficaz.

: [0180] El término “composición” significará un material que comprende al menos un componente. 10

: [0181] La expresión “ingrediente activo” significará cualquier componente que proporcione actividad farmacológica u otro efecto directo sobre el diagnóstico, cura, mitigación, tratamiento o prevención de la enfermedad.

: [0182] La expresión “composición farmacéutica” significará una composición que comprende al menos un ingrediente activo con el que la composición es susceptible de 15 investigación y tratamiento en un mamífero.

: [0183] Por “farmacéuticamente aceptable” se indica que el portador, vehículo, diluyente, excipientes y/o sales deben ser compatibles con los demás ingredientes de la formulación, y no dañinos para el receptor de la misma.

: [0184] La expresión “forma de dosificación” significará la forma física en que se 20 produce y dispensa un fármaco, tal como un comprimido, cápsula o inyectable.

: [0185] Por “hueso” se entiende el tejido conectivo calcificado poroso semirrígido denso que forma la porción mayoritaria del esqueleto de la mayoría de vertebrados, que comprende una matriz orgánica densa y un componente mineral inorgánico. El hueso es cualquiera de las numerosas estructuras anatómicamente distintas que 25 constituyen el esqueleto de un vertebrado.

: [0186] Las expresiones “masa ósea” y “densidad mineral ósea (DMO)” se usan intercambiablemente en la presente memoria. La DMO en seres humanos se mide habitualmente mediante una técnica radiográfica estándar, la absorciometría de rayos X de energía dual (DXA). De las muchas técnicas desarrolladas para evaluar la DMO, 30 la DXA es la más desarrollada técnicamente y la más ampliamente validada biológicamente. La tecnología de DXA, con software adaptado adecuadamente, puede usarse también para evaluar fiablemente la DMO en estudios animales. La DXA se usa en el diagnóstico de la osteoporosis, el pronóstico (predicción de fractura), el control

: del historial natural del trastorno y la evaluación de la respuesta al tratamiento.

: [0187] La expresión “baja masa ósea”, como se usa en la presente memoria, designa cualquier bajada o reducción de la densidad mineral ósea (DMO) en un individuo, e incluye tanto osteoporosis como osteopenia como se definen en las propuestas de la Organización Mundial de la Salud (OMS). La OMS ha definido 5 normal como un valor de DMO dentro de una desviación estándar de la media de referencia de un adulto joven (puntuación de T ≥-1). La OMS ha definido osteopenia como un valor de DMO mayor de 1 desviación estándar por debajo de la media de un adulto joven, pero menor de 2,5 desviaciones estándar por debajo de este valor (puntuación de T < -1 y > -2,5). La OMS ha caracterizado la osteoporosis como una 10 forma más grave de osteopenia, y la ha definido por un valor de DMO de 2,5 desviaciones estándar o más por debajo de la media de un adulto joven (puntuación de T ≤-2,5). (Véase, por ejemplo, la Serie de informes técnicos 921 de la Organización Mundial de la Salud (2003), “Prevención y gestión de la osteoporosis”, cuya divulgación se incorpora a la presente memoria como referencia en su totalidad). Más 15 comúnmente, la osteopenia se define como una puntuación de T menor de -1 y mayor de -2, y osteoporosis se define como una puntuación de T menor o igual a -2. En ciertas realizaciones de la presente invención, la puntuación de T se mide en la cadera por DXA.

: [0188] El término “osteoporosis”, como se usa en la presente memoria, se define 20 como un valor de DMO dos desviaciones estándar o más por debajo de la media de referencia de un adulto joven (puntuación de T ≤ -2) o designa un diagnóstico realizado por un cuidador (por ejemplo, médico, enfermera, enfermera practicante en el caso de seres humanos; veterinario en el caso de vertebrados no humanos).

: [0189] La osteoporosis puede clasificarse como primaria o secundaria. (Véase, por 25 ejemplo, la Serie de informes técnicos 921 de la Organización Mundial de la Salud (2003), “Prevención y gestión de la osteoporosis”). Como se usa en la presente memoria, el término "osteoporosis" comprende osteoporosis primaria y osteoporosis secundaria. En ciertas realizaciones, la osteoporosis es osteoporosis primaria. En ciertas realizaciones, la osteoporosis es osteoporosis secundaria. 30

: [0190] “Osteoporosis primaria”, como se usa en la presente memoria, está asociada a menopausia (natural, prematura o quirúrgica), envejecimiento o ambos. Se entenderá que, en la presente invención, osteoporosis primaria asociada a la menopausia (natural, prematura o quirúrgica), osteoporosis primaria asociada al

: envejecimiento y osteoporosis primaria asociada a la menopausia y al envejecimiento pueden incluirse en las realizaciones individualmente o en cualquier combinación.

: [0191] “Osteoporosis secundaria”, como se usa en la presente memoria, designa osteoporosis que no está asociada con la menopausia o el envejecimiento, sino con afecciones médicas o con el uso de medicaciones o fármacos. Está asociado con un 5 riesgo aumentado de osteoporosis un hospedador de afecciones médicas incluyendo, pero sin limitación, trastornos endocrinos y metabólicos y enfermedades malignas, y el uso de ciertas medicaciones y fármacos, cuyos ejemplos son bien conocidos por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, la Serie de informes técnicos de la Organización Mundial de la Salud (2003), “Prevención y gestión de osteoporosis”; 10 “Williams Textbook of Endocrinology”, 10ª edición; cuya divulgación se incorpora a la presente memoria como referencia en su totalidad). La osteoporosis secundaria puede estar asociada también con la inmovilización. Puede hacerse un diagnóstico de osteoporosis secundaria por una afección médica, el uso de una medicación o fármaco o la inmovilización, por un cuidador (por ejemplo, médico, enfermera, enfermera 15 practicante en el caso de seres humanos; veterinario en el caso de vertebrados no humanos).

: [0192] Por “fractura ósea” se entiende una fractura, rotura o fisura completa o incompleta de un hueso. El diagnóstico de fracturas depende normalmente del examen clínico y los hallazgos radiológicos. En la invención, fracturas óseas incluye, pero sin 20 limitación, fracturas traumáticas, fracturas a largo plazo y fracturas patológicas.

: [0193] “Fractura traumática”, como se usa en la presente memoria, designará una fractura inmediata que implica un traumatismo supraliminal con un grado de violencia local que supera la elasticidad normal del hueso. Puede estar acompañada por lesión simultánea de los tejidos blandos y muy a menudo de la piel. Una fractura traumática 25 puede ser cerrada (el tejido blando adyacente puede estar lesionado, pero las partes blandas de cobertura están conservadas en gran medida). Una fractura traumática puede ser abierta (los extremos rotos del hueso están sueltos por una lesión de tejido blando extensa, de modo que los patógenos del exterior pueden entrar directamente en la herida). 30

: [0194] “Fractura a largo plazo”, como se usa en la presente memoria, designará una fractura crónica, fractura por fatiga, fractura por estrés o fractura espontánea de tipo I.

: [0195] “Fractura patológica”, como se usa en la presente memoria, designará una

: fractura espontánea de tipo II. Una fractura patológica surge espontáneamente, sin un traumatismo adecuado que dé cuenta de ella. El hueso puede haberse dañado previamente por una enfermedad sistémica (por ejemplo, osteoporosis, osteodistrofia u osteítis deformante de Paget) o por una lesión ósea local (por ejemplo, metástasis, radioosteonecrosis, o tumor óseo). Véase Adler, Claus-Peter, “BONE DISEASES”, p. 5 114 (Springer-Verlag, Alemania 2000).

: [0196] Las fracturas incluyen también, pero sin limitación, fractura de torsión oblicua, fractura transversal, fractura conminuta, fractura por compresión, fracturas de costillas, fractura por deformación progresiva y cuello femoral fracturado (Adler, Claus-Peter, “BONE DISEASES”, Springer-Verlag, Alemania (2000)). 10

: [0197] Como se usa en la presente memoria, la expresión “afección caracterizada por una baja masa ósea” incluye, pero sin limitación, osteopenia, osteoporosis, artritis reumatoide, osteoartritis, enfermedad periodontal, pérdida ósea alveolar, pérdida ósea por osteotomía, pérdida ósea idiopática en la infancia, curvatura de la columna y pérdida de altura. En ciertas realizaciones, la osteoporosis es osteoporosis primaria. En 15 ciertas realizaciones, la osteoporosis es osteoporosis secundaria. En ciertas realizaciones, la osteoporosis secundaria está asociada a una afección médica. En ciertas realizaciones, la osteoporosis secundaria está asociada al uso de una medicación o fármaco. En ciertas realizaciones, la osteoporosis secundaria está asociada a la inmovilización. Las afecciones caracterizadas por una baja masa ósea incluyen 20 también, pero sin limitación, enfermedad de Paget, pérdida ósea debida a cáncer metastásico y lesiones osteolíticas tales como las causadas por enfermedad neoplásica, radioterapia o quimioterapia. Las afecciones caracterizadas por una baja masa ósea incluyen también, pero sin limitación, complicaciones a largo plazo de la osteoporosis tales como curvatura de la columna, pérdida de altura y cirugía protésica. Debe 25 entenderse que, en la presente invención, las afecciones caracterizadas por una baja masa ósea pueden incluirse en las realizaciones individualmente o en cualquier combinación (véanse, por ejemplo, la Serie de informes técnicos de la Organización Mundial de la Salud 921 (2003), “Prevención y gestión de osteoporosis”; “Williams Textbook of Endocrinology”, 10ª edición, Larsen y col., Eds. (2002), W.B. Saunders 30 Company y “Endocrinology and Metabolism”, 4ª edición, Felig y col., Eds. (2001), McGraw-Hill Book Company; cuyas divulgaciones están incorporadas a la presente memoria como referencia en su totalidad).

: [0198] Como se usa en la presente memoria, “enfermedad ósea” designa un

: trastorno o afección referente a la anormalidad del hueso. Las enfermedades óseas que pueden tratarse según la invención, aumentando la masa ósea o el crecimiento óseo, incluyen, pero sin limitación, osteopenia, osteoporosis, artritis reumatoide, osteoartritis, enfermedad periodontal, pérdida ósea alveolar, pérdida ósea por osteotomía, pérdida ósea idiopática en la infancia, curvatura de la columna y pérdida 5 de peso. En ciertas realizaciones, la osteoporosis es osteoporosis primaria. En ciertas realizaciones, la osteoporosis es osteoporosis secundaria. En ciertas realizaciones, la osteoporosis secundaria está asociada a una afección médica. En ciertas realizaciones, la osteoporosis secundaria está asociada al uso de una medicación o fármaco. En ciertas realizaciones, la osteoporosis secundaria está asociada a la inmovilización. Las 10 enfermedades óseas que pueden tratarse según la invención, aumentando la masa ósea o el crecimiento óseo, incluyen también, pero sin limitación, enfermedad de Paget y pérdida ósea debida a cáncer metastásico. Los trastornos óseos destructivos que pueden tratarse según la invención, aumentando la masa ósea o el crecimiento óseo, incluyen, pero sin limitación, osteoporosis, osteoartritis y lesiones osteolíticas tales 15 como las causadas por enfermedad neoplásica, radioterapia o quimioterapia. Se entenderá que, en la presente invención, los trastornos óseos que pueden tratarse según la invención aumentando la masa ósea o el crecimiento óseo pueden incluirse en las realizaciones individualmente o en cualquier combinación (véanse, por ejemplo, la Serie de informes técnicos de la Organización Mundial de la Salud 921 (2003), 20 “Prevención y gestión de osteoporosis”; “Williams Textbook of Endocrinology”, 10ª edición, Larsen y col., Eds. (2002), W.B. Saunders Company y “Endocrinology and Metabolism”, 4ª edición, Felig y col., Eds. (2001), McGraw-Hill Book Company; cuyas divulgaciones están incorporadas a la presente memoria como referencia en su totalidad). 25

: [0199] La presente invención se refiere también a otras afecciones que extraen beneficios del tratamiento según la invención, aumentando la masa ósea o el crecimiento óseo, incluyendo, pero sin limitación curación ósea potenciada después de reconstrucción facial, reconstrucción maxilar, reconstrucción mandibular, enfermedad periodontal o extracción de dientes, extensión de huesos largos potenciada, 30 recrecimiento protésico potenciado y sinostosis ósea aumentada.

: [0200] El término “endógeno” significará un material que produce naturalmente un individuo (por ejemplo, y sin limitación, un ser humano). En contraposición, “no endógeno” significará que no lo produce naturalmente un individuo (por ejemplo, y sin

: limitación, un ser humano).

: [0201] La expresión “fragmento biológicamente activo” de un receptor acoplado con proteína G significará un fragmento del GPCR que tiene funciones estructurales y bioquímicas de un GPCR de origen natural. En ciertas realizaciones, el fragmento biológicamente activo se acopla con una proteína G. En ciertas realizaciones, el 5 fragmento biológicamente activo se une a un ligando conocido del GPCR.

: [0202] El término “cebador” se usa en la presente memoria para designar una secuencia nucleotídica específica que es complementaria de una secuencia nucleotídica diana y se usa para hibridar con la secuencia nucleotídica diana. Un cebador sirve como punto de iniciación para la polimerización nucleotídica catalizada por ADN 10 polimerasa, ARN polimerasa o transcriptasa inversa.

: [0203] La expresión “vector de expresión” significará una secuencia de ADN que es necesaria para la transcripción de ADN clonado y la traducción del ARNm transcrito en una célula hospedadora recombinante apropiada para el vector de expresión. Un vector de expresión construido apropiadamente debería contener un 15 origen de replicación para replicación autónoma en células hospedadoras, marcadores detectables, un número limitado de sitios de enzima de restricción, el potencial de un alto número de copias y promotores activos. El ADN clonado para transcribir se liga operativamente con un promotor activo constitutiva o condicionalmente en el vector de expresión. 20

: [0204] La expresión “célula hospedadora” significará una célula capaz de tener un vector incorporado a la misma. En el presente contexto, el vector contendrá típicamente ácido nucleico que codifica un GPCR o proteína de fusión de GPCR en conexión operativa con una secuencia promotora adecuada para permitir que ocurra la expresión del GPCR o de la proteína de fusión de GPCR. En una realización particular, 25 la célula hospedadora es una célula hospedadora eucariótica. En ciertas realizaciones, la célula hospedadora eucariótica es una célula hospedadora de mamífero. En ciertas realizaciones, la célula hospedadora eucariótica es una célula hospedadora de levadura. En ciertas realizaciones, la célula hospedadora eucariótica es una célula hospedadora melonofórica. 30

: [0205] El término “contacto” o la expresión “poner en contacto” significará juntar al menos dos restos.

: [0206] Los términos “modular” o “modificar” se usarán para designar un aumento o reducción de la cantidad, calidad o efecto de una actividad, función o molécula

: particular. A modo de ilustración y no de limitación, los agonistas, agonistas parciales, agonistas inversos y antagonistas de un receptor acoplado con proteína G son moduladores del receptor.

: [0207] La expresión o “molécula pequeña” se usará para indicar un compuesto un compuesto que tiene un peso molecular menor de aproximadamente 10.000 g/mol, 5 incluyendo un péptido, peptidomimético, aminoácido, análogo aminoacídico, polinucleótido, análogo polinucleotídico, nucleótido, análogo nucleotídico, compuesto orgánico o compuesto inorgánico (concretamente, incluyendo un compuesto hetero-orgánico o compuesto organometálico) y sales, ésteres y otras formas farmacéuticamente aceptables de los mismos. En ciertas realizaciones, las moléculas 10 pequeñas son compuestos orgánicos o inorgánicos que tienen un peso molecular menor de aproximadamente 5.000 g/mol. En ciertas realizaciones, las moléculas pequeñas son compuestos orgánicos o inorgánicos que tienen un peso molecular menor de aproximadamente 1.000 g/mol. En ciertas realizaciones, las moléculas pequeñas son compuestos orgánicos o inorgánicos que tienen un peso molecular menor de 15 aproximadamente 800 g/mol. En ciertas realizaciones, las moléculas pequeñas son compuestos orgánicos o inorgánicos que tienen un peso molecular menor de aproximadamente 600 g/mol. En ciertas realizaciones, las moléculas pequeñas son compuestos orgánicos o inorgánicos que tienen un peso molecular menor de aproximadamente 500 g/mol. 20

: [0208] Las abreviaturas de aminoácidos usadas en la presente memoria se exhiben en la Tabla B:

TABLA B

ALANINA: ALA A

ARGININA: ARG R

ASPARAGINA: ASN N

ÁCIDO ASPÁRTICO: ASP D

CISTEÍNA: CYS C

ÁCIDO GLUTÁMICO: GLU E

GLUTAMINA: GLN Q

GLICINA: GLY G

HISTIDINA: HIS H

ISOLEUCINA: ILE I

LEUCINA: LEU L

LISINA: LYS K

METIONINA: MET M

FENILALANINA: PHE F

PROLINA: PRO P

SERINA: SER S

TREONINA: THR T

TRIPTÓFANO: TRP W

TIROSINA: TYR Y

VALINA: VAL V

: [0209] El término “polipéptido” designará un polímero de aminoácidos sin referencia a la longitud del polímero. Por tanto, los péptidos, oligopéptidos y proteínas están incluidos en la definición de polipéptido. Este término no especifica ni excluye tampoco modificaciones postexpresionales de polipéptidos. Por ejemplo, los polipéptidos que incluyen la unión covalente de grupos glucosilo, grupos acetilo, 5 grupos fosfato, grupos lipídicos y similares están comprendidos expresamente por el término polipéptido.

: [0210] El término “polinucleótido” designará una secuencia de ARN, ADN o híbrida ARN/ADN de más de un nucleótido en forma monocatenaria o dúplex. Los polinucleótidos de la invención pueden prepararse mediante cualquier procedimiento 10 conocido, incluyendo generación sintética, recombinante, ex vivo o una combinación de las mismas, así como utilizando cualquier procedimiento de purificación conocido en la técnica.

: [0211] El término “anticuerpo” se entiende en la presente memoria que comprende anticuerpo monoclonal y anticuerpo policlonal. 15

: [0212] La expresión “segundo mensajero” significará una respuesta intracelular producida como resultado de la activación de receptor. Un segundo mensajero puede incluir, por ejemplo, 1,4,5-trifosfato de inositol (IP3), diacilglicerol (DAG), AMP cíclico (AMPc), GMP cíclico (GMPc), actividad MAP cinasa, actividad MAPK/ERK cinasa cinasa 1 (MEKK1) y Ca2+. La respuesta de segundo mensajero puede medirse 20 para la determinación de la activación de receptor.

: [0213] La expresión “funcionalidad de receptor” designará la operación normal de un receptor para recibir un estímulo y moderar un efecto en una célula incluyendo,

: pero sin limitación, regular la transcripción génica, regular el flujo de entrada o salida de iones, efectuar una reacción catalítica y/o modular la actividad mediante proteínas G, tal como desencadenar una respuesta de segundo mensajero.

: [0214] El término “estimular” o “estimulación”, con relación al término “respuesta” o “funcionalidad del receptor”, significará que la respuesta o funcionalidad 5 del receptor aumenta en presencia de un compuesto en contraposición con en ausencia del compuesto.

: [0215] El término “inhibir” o “inhibición”, con relación al término “respuesta” o “funcionalidad del receptor”, significará que la respuesta o funcionalidad del receptor se reduce o previene en presencia de un compuesto en contraposición con en ausencia 10 del compuesto.

: [0216] La expresión “eficacia del compuesto” significará una medida de la capacidad del compuesto de inhibir o estimular la funcionalidad del receptor, en contraposición con la afinidad de unión al receptor.

: [0217] La expresión “compuesto de ensayo”, usado intercambiablemente en la 15 presente memoria con “compuesto candidato”, significará una molécula (por ejemplo, y sin limitación, un compuesto químico) que es susceptible de una técnica de cribado.

: [0218] La expresión “constitutivamente activo” con relación a un receptor acoplado con proteína G significará que el receptor acoplado con proteína G exhibe actividad independiente de agonista. 20

: [0219] La expresión “identificación directa” o “identificado directamente” con relación a la frase “compuesto de ensayo”, significará el cribado de un compuesto frente a un receptor acoplado con proteína G en ausencia de un ligando conocido (por ejemplo, un agonista conocido) del receptor acoplado con proteína G.

: [0220] Cuando se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor 25 intermedio, hasta un décimo del límite mínimo a menos que el contexto indique claramente otra cosa, entre el límite superior e inferior de ese intervalo y en cualquier otro valor expresado o intermedio en ese intervalo expresado, está comprendido en la invención. Los límites superior e inferior de estos intervalos menores pueden incluirse independientemente en los intervalos menores, y están también comprendidos en la 30 invención, sujetos a cualquier límite excluido específicamente en el intervalo expresado. Cuando el intervalo expresado incluye uno o ambos límites, los intervalos que excluyen uno o ambos de estos límites incluidos están también incluidos en la invención.

A. Introducción

: [0221] El orden de las siguientes secciones se expone por eficacia de presentación y no se pretende, ni debería considerarse, como limitación de la divulgación o las reivindicaciones que siguen.

B. Expresión de receptor 5

1. Polipéptidos de GPCR de interés

: [0222] Un GPCR de la invención puede comprender una secuencia aminoacídica seleccionada del grupo constituido por:

(a) los aminoácidos 1-335 de la SEQ ID NO: 2;

(b) los aminoácidos 2-335 de la SEQ ID NO: 2; 10

(c) la secuencia aminoacídica de un receptor acoplado con proteína G codificado por un polinucleótido que es amplificable por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en una muestra de ADN humano usando los cebadores específicos de la SEQ ID NO: 3 y la SEQ ID NO: 4;

(d) la secuencia aminoacídica de un receptor acoplado con proteína G 15 codificado por un polinucleótido que hibrida en condiciones de alto rigor con el complemento de la SEQ ID NO: 1;

(e) la secuencia aminoacídica de un receptor acoplado con proteína G que tiene al menos aproximadamente un 80% de identidad con la SEQ ID NO: 2;

(f) la secuencia aminoacídica de una versión constitutivamente activa de un 20 receptor acoplado con proteína G que tiene la SEQ ID NO: 2; y

(g) un fragmento biológicamente activo de uno cualquiera de (a) o (b), en el que dicho fragmento biológicamente activo es capaz de unirse al compuesto A.

En ciertas realizaciones, un GPCR de la invención comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 2. 25

: [0223] En ciertas realizaciones, el receptor acoplado con proteína G codificado por un polinucleótido que es amplificable por reacción en cadena de la polimerasa es un receptor acoplado con proteína G endógeno. En algunas realizaciones, el receptor acoplado con proteína G codificado por un polinucleótido que es amplificable por reacción en cadena de la polimerasa y que es un receptor acoplado con proteína G 30 endógeno es un receptor acoplado con proteína G de mamífero. En algunas realizaciones, el receptor acoplado con proteína G codificado por un polinucleótido que es amplificable por reacción en cadena de la polimerasa y que es un receptor acoplado con proteína G endógeno es un receptor GPR119 de mamífero. En ciertas

: realizaciones, el receptor acoplado con proteína G codificado por el polinucleótido que es amplificable por reacción en cadena de la polimerasa es la SEQ ID NO: 2 o un alelo del mismo. En ciertas realizaciones, el receptor acoplado con proteína G codificado por el polinucleótido que es amplificable por reacción en cadena de la polimerasa es un alelo de la SEQ ID NO: 2. En ciertas realizaciones, el receptor acoplado con proteína 5 G codificado por el polinucleótido que es amplificable por reacción en cadena de la polimerasa se une específicamente al compuesto 1 (véase la Tabla 1, que expone la estructura química y nombre químico del compuesto 1). En ciertas realizaciones, el receptor acoplado con proteína G codificado por el polinucleótido que es amplificable por reacción en cadena de la polimerasa se une específicamente a (2-fluoro-4-10 metanosulfonilfenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)piperidin-1-il]-5-nitropirimidin-4-il}amina. En ciertas realizaciones, el receptor acoplado con proteína G codificado por el polinucleótido que es amplificable por reacción en cadena de la polimerasa se une específicamente a (2-fluoro-4-metanosulfonilfenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)piperidin-1-il]-5-nitropirimidin-4-il}amina con un valor 15 de CI50 en el ensayo de unión a receptor, según el Ejemplo 12 a continuación, de menos de aproximadamente 50 µM, de menos de aproximadamente 25 µM, de menos de aproximadamente 10 µM, de menos de aproximadamente 5 µM, de menos de aproximadamente 1 µM, de menos de aproximadamente 500 nM, de menos de aproximadamente 100 nM o de menos de aproximadamente 50 nM. En ciertas 20 realizaciones, el receptor acoplado con proteína G codificado por el polinucleótido que es amplificable por reacción en cadena de la polimerasa se une específicamente a (2-fluoro-4-metanosulfonilfenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)piperidin-1-il]-5-nitropirimidin-4-il}amina con un valor de CI50 en el ensayo de unión a receptor, según el Ejemplo 12 a continuación, de menos de aproximadamente 10 µM, de menos 25 de aproximadamente 5 µM, de menos de aproximadamente 1 µM, de menos de aproximadamente 500 nM, de menos de aproximadamente 100 nM o de menos de aproximadamente 50 nM. En ciertas realizaciones, el receptor acoplado con proteína G codificado por el polinucleótido que es amplificable por reacción en cadena de la polimerasa es un receptor para el que la (2-fluoro-4-metanosulfonilfenil)-{6-[4-(3-30 isopropil-[1,2,4]-oxadiazol-5-il)piperidin-1-il]-5-nitropirimidin-4-il}amina es un agonista que tiene un valor de CE50 en dicho receptor, en el ensayo de adenilato ciclasa en célula entera según el Ejemplo 8 a continuación, de menos de aproximadamente 5 µM, de menos de aproximadamente 1 µM, de menos de aproximadamente 100 nM, de

: menos de aproximadamente 50 nM, de menos de aproximadamente 25 nM, de menos de aproximadamente 10 nM, de menos de aproximadamente 5 nM o de menos de aproximadamente 1 nM. En ciertas realizaciones, el receptor acoplado con proteína G codificado por el polinucleótido que es amplificable por reacción en cadena de la polimerasa es un receptor para el que la (2-fluoro-4-metanosulfonilfenil)-{6-[4-(3-5 isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)piperidin-1-il]-5-nitropirimidin-4-il}amina es un agonista que tiene un valor de CE50 en dicho receptor, en el ensayo de adenilato ciclasa en célula entera según el Ejemplo 8 a continuación, de menos de aproximadamente 100 nM, de menos de aproximadamente 50 nM, de menos de aproximadamente 25 nM, de menos de aproximadamente 10 nM, de menos de aproximadamente 5 nM o de 10 menos de aproximadamente 1 nM. En algunas realizaciones, el receptor acoplado con proteína G codificado por el polinucleótido que es amplificable por reacción en cadena de la polimerasa exhibe un nivel detectable de actividad constitutiva. En algunas realizaciones, la actividad constitutiva es aumentar el nivel de AMPc intracelular. En algunas realizaciones, la actividad constitutiva es causar que las células melanofóricas 15 experimenten dispersión de pigmento.

: [0224] En algunas realizaciones, el ADN humano es ADN genómico.

: [0225] En algunas realizaciones, la reacción en cadena de la polimerasa es reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (PCR-TI). Las técnicas de PCR-TI son bien conocidas por el experto. En algunas realizaciones, el ADN 20 humano ADNc humano derivado de un tejido o tipo celular que expresa GPR119. En algunas realizaciones, el tejido humano que expresa GPR119 es páncreas o islote pancreático. En ciertas realizaciones, el ADNc es de un tipo celular humano que expresa GPR119. En algunas realizaciones, el ADNc es de una línea de células beta pancreáticas. En algunas realizaciones, el GPCR de la invención es recombinante. En 25 algunas realizaciones, el GPCR recombinante es GPR119 humano recombinante.

: [0226] En ciertas realizaciones, un GPCR que puede usarse en los procedimientos en cuestión exhibe un nivel detectable de actividad constitutiva.

: [0227] En algunas realizaciones, un GPCR de la invención es endógeno. En algunas realizaciones, un GPCR de la invención es un GPR119 de mamífero. En 30 algunas realizaciones, un GPCR de la invención que es endógeno es un GPR119 de mamífero.

: [0228] A modo de ilustración y no de limitación, la deleción de un resto de metionina N-terminal se prevé que proporcione un fragmento biológicamente activo

: que puede usarse en la invención en cuestión. En ciertas realizaciones, un fragmento biológicamente activo de la invención es un fragmento fusionado opcionalmente en su extremo N con un péptido que comprende un resto de metionina N-terminal y un marcador epitópico HA (de hemaglutinina del virus de la gripe) que se une específicamente al compuesto 1. En ciertas realizaciones, un fragmento biológicamente 5 activo de la invención es un fragmento opcionalmente fusionado en su extremo N con un péptido que comprende un resto de metionina N-terminal y un marcador epitópico HA (de hemaglutinina del virus de la gripe) que se une específicamente a (2-fluoro-4-metanosulfonilfenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)piperidin-1-il]-5-nitropirimidin-4-il}amina. En ciertas realizaciones, un fragmento biológicamente 10 activo de la invención es un fragmento opcionalmente fusionado en su extremo N con un péptido que comprende un resto de metionina N-terminal y un marcador epitópico HA (de hemaglutinina del virus de la gripe) que se une específicamente a (2-fluoro-4-metanosulfonilfenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)piperidin-1-il]-5-nitropirimidin-4-il}amina con un valor de CI50, en el ensayo de unión a receptor según 15 el Ejemplo 12 a continuación, de menos de aproximadamente 50 µM, de menos de aproximadamente 25 µM, de menos de aproximadamente 10 µM, de menos de aproximadamente 5 µM, de menos de aproximadamente 1 µM, de menos de aproximadamente 500 nM, de menos de aproximadamente 100 nM o de menos de aproximadamente 50 nM. En ciertas realizaciones, un fragmento biológicamente activo 20 de la invención es un fragmento fusionado opcionalmente en su extremo N con un péptido que comprende un resto de metionina N-terminal y un marcador epitópico HA que se une específicamente a (2-fluoro-4-metanosulfonilfenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]-oxadiazol-5-il)piperidin-1-il]-5-nitropirimidin-4-il}amina con un valor de CI50, en el ensayo de unión a receptor según el Ejemplo 12 a continuación, de menos de 25 aproximadamente 10 µM, de menos de aproximadamente 5 µM, de menos de aproximadamente 1 µM, de menos de aproximadamente 500 nM, de menos de aproximadamente 100 nM, o de menos de aproximadamente 50 nM. En ciertas realizaciones, el fragmento biológicamente activo de la invención es un fragmento fusionado opcionalmente en su extremo N con un péptido que comprende un resto de 30 metionina N-terminal y un marcador epitópico HA que para el que la (2-fluoro-4-metanosulfonilfenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)piperidin-1-il]-5-nitropirimidin-4-il}amina es un agonista que tiene un valor de CE50 en dicho fragmento opcionalmente fusionado en su extremo N con dicho péptido, en el ensayo

: de adenilato ciclasa en célula entera según el Ejemplo 8 a continuación, de menos de aproximadamente 5 µM, de menos de aproximadamente 1 µM, de menos de aproximadamente 100 nM, de menos de aproximadamente 50 nM, de menos de aproximadamente 25 nM, de menos de aproximadamente 10 nM, de menos de aproximadamente 5 nM o de menos de aproximadamente 1 nM. En ciertas 5 realizaciones, el fragmento biológicamente activo de la invención es un fragmento fusionado opcionalmente en su extremo N con un péptido que comprende un resto de metionina N-terminal y un marcador epitópico HA para el que la (2-fluoro-4-metanosulfonilfenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]-oxadiazol-5-il)piperidin-1-il]-5-nitropirimidin-4-il}amina es un agonista que tiene un valor de CE50 en dicho 10 fragmento opcionalmente fusionado en su extremo N con dicho péptido, en el ensayo de adenilato ciclasa en célula entera según el Ejemplo 8 a continuación, de menos de aproximadamente 100 nM, de menos de aproximadamente 50 nM, de menos de aproximadamente 25 nM, de menos de aproximadamente 10 nM, de menos de aproximadamente 5 nM o de menos de aproximadamente 1 nM. En algunas 15 realizaciones, el fragmento biológicamente activo de la invención es un fragmento fusionado opcionalmente en su extremo N con un péptido que comprende un resto de metionina N-terminal y un marcador epitópico HA que exhibe un nivel detectable de actividad constitutiva. En algunas realizaciones, la actividad constitutiva es aumentar el nivel de AMPc intracelular. En algunas realizaciones, la actividad constitutiva es 20 causar que las células melanofóricas experimenten dispersión de pigmento. En ciertas realizaciones, el fragmento se fusiona en su extremo N-terminal con un péptido constituido esencialmente por un residuo de metionina N-terminal y un marcador epitópico HA. Las técnicas para fusionar un péptido que comprende o consiste esencialmente en un residuo de metionina N-terminal y un marcador epitópico HA con 25 el extremo N de un fragmento polipeptídico son bien conocidas en la técnica y pueden obtenerse comercialmente (por ejemplo, Clontech, Mountain View, CA).

: [0229] Se prevé que una variante alélica de GPR119 humano de la SEQ ID NO: 2 esté dentro del alcance de la invención. Se prevé que el GPR119 humano esté dentro del alcance de la invención. 30

: [0230] Se prevé que una variante que es un ortólogo de vertebrado del GPR119 humano de la SEQ ID NO: 2 esté dentro del alcance de la invención. Se prevé que una variante que es un ortólogo de mamífero del GPR119 humano de la SEQ ID NO: 2 esté dentro del alcance de la invención. A modo de ilustración y no de limitación, se

: prevé que el GPR119 de ratón (por ejemplo, nº de acceso a GenBank® AY288423), GPR119 de rata (nº de acceso a GenBank® AAN95195), GPR119 de hámster, GPR119 de perro y GPR119 de primate no humano estén dentro del alcance de la invención.

: [0231] Se prevé que una variante de la SEQ ID NO: 2 que tiene al menos 5 aproximadamente un 80%, al menos aproximadamente un 85%, al menos aproximadamente un 90%, al menos aproximadamente un 95%, al menos aproximadamente un 96%, al menos aproximadamente un 97%, al menos aproximadamente un 98% o al menos aproximadamente un 99% de identidad con la SEQ ID NO: 2 esté dentro del alcance de la invención. En ciertas realizaciones, la 10 variante de la SEQ ID NO: 2 que tiene al menos aproximadamente un 80%, al menos aproximadamente un 85%, al menos aproximadamente un 90%, al menos aproximadamente un 95%, al menos aproximadamente un 96%, al menos aproximadamente un 97%, al menos aproximadamente un 98% o al menos aproximadamente un 99% de identidad con la SEQ ID NO: 2 es un GPCR. En algunas 15 realizaciones, la variante de la SEQ ID NO: 2 es un GPCR endógeno. En algunas realizaciones, la variante de la SEQ ID NO: 2 es un GPCR no endógeno. En algunas realizaciones, la variante de la SEQ ID NO: 2 que es un GPCR endógeno es un GPCR de mamífero. En ciertas realizaciones, la variante de la SEQ ID NO: 2 se une específicamente al compuesto 1. En ciertas realizaciones, la variante de la SEQ ID NO: 20 2 se une específicamente a (2-fluoro-4-metanosulfonilfenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)piperidin-1-il]-5-nitropirimidin-4-il}amina. En ciertas realizaciones, la variante de la SEQ ID NO: 2 se une específicamente a (2-fluoro-4-metanosulfonilfenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)piperidin-1-il]-5-nitropirimidin-4-il}amina con un valor de CI50, en el ensayo de unión a receptor según 25 el Ejemplo 12 a continuación, de menos de aproximadamente 50 µM, de menos de aproximadamente 25 µM, de menos de aproximadamente 10 µM, de menos de aproximadamente 5 µM, de menos de aproximadamente 1 µM, de menos de aproximadamente 500 nM, de menos de aproximadamente 100 nM o de menos de aproximadamente 50 nM. En ciertas realizaciones, la variante de la SEQ ID NO: 2 se 30 une específicamente a (2-fluoro-4-metanosulfonilfenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)piperidin-1-il]-5-nitropirimidin-4-il}amina con un valor de CI50, en el ensayo de unión a receptor según el Ejemplo 12 a continuación, de menos de aproximadamente 10 µM, de menos de aproximadamente 5 µM, de menos de

: aproximadamente 1 µM, de menos de aproximadamente 500 nM, de menos de aproximadamente 100 nM, o de menos de aproximadamente 50 nM. En ciertas realizaciones, la variante de la SEQ ID NO: 2 es un receptor para el que la (2-fluoro-4-metanosulfonilfenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)piperidin-1-il]-5-nitropirimidin-4-il}amina es un agonista que tiene un valor de CE50 en dicho receptor, 5 en el ensayo de adenilato ciclasa en célula entera según el Ejemplo 8 a continuación, de menos de aproximadamente 5 µM, de menos de aproximadamente 1 µM, de menos de aproximadamente 100 nM, de menos de aproximadamente 50 nM, de menos de aproximadamente 25 nM, de menos de aproximadamente 10 nM, de menos de aproximadamente 5 nM o de menos de aproximadamente 1 nM. En ciertas 10 realizaciones, la variante de la SEQ ID NO: 2 es un receptor para el que la (2-fluoro-4-metanosulfonilfenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)piperidin-1-il]-5-nitropirimidin-4-il}amina es un agonista que tiene un valor de CE50 en dicho receptor, en el ensayo de adenilato ciclasa en célula entera según el Ejemplo 8 a continuación, de menos de aproximadamente 100 nM, de menos de aproximadamente 50 nM, de 15 menos de aproximadamente 25 nM, de menos de aproximadamente 10 nM, de menos de aproximadamente 5 nM o de menos de aproximadamente 1 nM. En algunas realizaciones, la variante de la SEQ ID NO: 2 exhibe un nivel detectable de actividad constitutiva. En algunas realizaciones, la actividad constitutiva es aumentar el nivel de AMPc intracelular. En algunas realizaciones, la actividad constitutiva es causar que las 20 células melanofóricas experimenten dispersión de pigmento. El porcentaje de identidad puede determinarse convencionalmente usando programas informáticos conocidos.

: [0232] En ciertas realizaciones, un GPCR variante que puede usarse en los procedimientos en cuestión tiene una secuencia aminoacídica que tiene al menos aproximadamente un 80%, al menos aproximadamente un 85%, al menos 25 aproximadamente un 90%, al menos aproximadamente un 95%, al menos aproximadamente un 96%, al menos aproximadamente un 97%, al menos aproximadamente un 98% o al menos aproximadamente un 99% de identidad con la SEQ ID NO: 2. Por un GPCR variante que tiene, por ejemplo, un 95% de “identidad” con la SEQ ID NO: 2, se entiende que la secuencia aminoacídica de la variante es 30 idéntica a los aminoácidos 1-335 de la SEQ ID NO: 2 excepto en que puede incluir hasta 5 alteraciones aminoacídicas por cada 100 aminoácidos de la SEQ ID NO: 2. Por tanto, para obtener por ejemplo una secuencia aminoacídica que tenga al menos un 95% de identidad con la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 2, pueden

: insertarse, eliminarse o sustituirse hasta un 5% (5 de 100) de los restos aminoacídicos en la secuencia por otro aminoácido en comparación con los aminoácidos 1-335 de la SEQ ID NO: 2. Estas alteraciones pueden ocurrir en los extremos amino o carboxilo o en cualquier lugar entre estas posiciones terminales, intercalados separadamente entre los restos de la secuencia o en uno o más grupos contiguos en la secuencia. 5

: [0233] En ciertas realizaciones, un receptor acoplado con proteína G variante que puede usarse en los procedimientos en cuestión es un receptor acoplado con proteína G que tiene una secuencia aminoacídica derivada de la SEQ ID NO: 2 mediante deleción, sustitución y/o adición de uno o varios aminoácidos. En ciertas realizaciones, un receptor acoplado con proteína G variante que puede usarse en los procedimientos en 10 cuestión es un receptor acoplado con proteína G que tiene una secuencia aminoacídica derivada de la SEQ ID NO: 2 mediante no más de 10 sustituciones aminoacídicas conservativas y/o no más de 3 sustituciones aminoacídicas no conservativas en la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 2. En ciertas realizaciones, arginina, lisina e histidina pueden sustituirse conservativamente entre sí; ácido glutámico y ácido 15 aspártico pueden sustituirse conservativamente entre sí; glutamina y asparagina pueden sustituirse conservativamente entre sí; leucina, isoleucina y valina pueden sustituirse conservativamente entre sí; fenilalanina, triptófano y tirosina pueden sustituirse conservativamente entre sí y glicina, alanina, serina, treonina y metionina pueden sustituirse conservativamente entre sí. Las sustituciones aminoacídicas, deleciones 20 aminoacídicas y adiciones aminoacídicas pueden estar en cualquier posición (por ejemplo, el extremo C o N o en posiciones internas). En algunas realizaciones, la variante es un receptor acoplado con proteína G endógeno. En algunas realizaciones, la variante es un receptor acoplado con proteína G endógeno de vertebrado. En algunas realizaciones, la variante es un receptor acoplado con proteína G endógeno de 25 mamífero. En algunas realizaciones, la variante es un receptor acoplado con proteína G endógeno humano. En algunas realizaciones, la variante es un receptor acoplado con proteína G no endógeno. En algunas realizaciones, la variante exhibe un nivel detectable de actividad constitutiva. En algunas realizaciones, la actividad constitutiva es aumentar el nivel de AMPc intracelular. En algunas realizaciones, la actividad 30 constitutiva es causar que células melanofóricas experimenten dispersión de pigmento. En ciertas realizaciones, dicho receptor acoplado con proteína G que tiene una secuencia aminoacídica derivada de la SEQ ID NO: 2 es un receptor acoplado con proteína G para el que el compuesto 1 es un ligando. En ciertas realizaciones, dicho

: receptor acoplado con proteína G que tiene una secuencia aminoacídica derivada de la SEQ ID NO: 2 es un receptor acoplado con proteína G para el que la (2-fluoro-4-metanosulfonilfenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)piperidin-1-il]-5-nitropirimidin-4-il}amina es un ligando que tiene un valor de CI50, en el ensayo de unión a receptor según el Ejemplo 12 a continuación, de menos de aproximadamente 5 50 µM, de menos de aproximadamente 25 µM, de menos de aproximadamente 10 µM, de menos de aproximadamente 5 µM, de menos de aproximadamente 1 µM, de menos de aproximadamente 500 nM, de menos de aproximadamente 100 nM o de menos de aproximadamente 50 nM. En ciertas realizaciones, dicho receptor acoplado con proteína G que tiene una secuencia aminoacídica derivada de la SEQ ID NO: 2 es un 10 receptor acoplado con proteína G para el que el compuesto 1 es un agonista. En ciertas realizaciones, dicho receptor acoplado con proteína G que tiene una secuencia aminoacídica derivada de la SEQ ID NO: 2 es un receptor acoplado con proteína G para el que la (2-fluoro-4-metanosulfonilfenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)piperidin-1-il]-5-nitropirimidin-4-il}amina es un agonista que tiene un valor de 15 CE50, en el ensayo de adenilato ciclasa de célula entera según el Ejemplo 8 a continuación, de menos de aproximadamente 5 µM, de menos de aproximadamente 1 µM, de menos de aproximadamente 100 nM, de menos de aproximadamente 50 nM, de menos de aproximadamente 25 nM, de menos de aproximadamente 10 nM, de menos de aproximadamente 5 nM o de menos de aproximadamente 1 nM. 20

: [0234] Se prevé que una variante de la SEQ ID NO: 2 que es un receptor acoplado con proteína G que comprende al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 75 o al menos 100 aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 2 esté dentro del alcance de la invención. En ciertas realizaciones, la variante de la SEQ ID NO: 2 que comprende al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 75 o al 25 menos 100 aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 2 es un GPCR. En algunas realizaciones, la variante de la SEQ ID NO: 2 es un GPCR endógeno. En algunas realizaciones, la variante de la SEQ ID NO: 2 es un GPCR no endógeno. En algunas realizaciones, la variante de la SEQ ID NO: 2 que es un GPCR endógeno es un GPCR de mamífero. En ciertas realizaciones, la variante de la SEQ ID NO: 2 se une 30 específicamente al compuesto 1. En ciertas realizaciones, la variante de la SEQ ID NO: 2 se une específicamente a (2-fluoro-4-metanosulfonilfenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)piperidin-1-il]-5-nitropirimidin-4-il}amina. En ciertas realizaciones, la variante de la SEQ ID NO: 2 se une específicamente a (2-fluoro-4-

: metanosulfonilfenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]-oxadiazol-5-il)piperidin-1-il]-5-nitropirimidin-4-il}amina con un valor de CI50, en el ensayo de unión a receptor según el Ejemplo 12 a continuación, de menos de aproximadamente 50 µM, de menos de aproximadamente 25 µM, de menos de aproximadamente 10 µM, de menos de aproximadamente 5 µM, de menos de aproximadamente 1 µM, de menos de 5 aproximadamente 500 nM, de menos de aproximadamente 100 nM o de menos de aproximadamente 50 nM. En ciertas realizaciones, la variante de la SEQ ID NO: 2 se une específicamente a (2-fluoro-4-metanosulfonilfenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)piperidin-1-il]-5-nitropirimidin-4-il}amina con un valor de CI50, en el ensayo de unión a receptor según el Ejemplo 12 a continuación, de menos de 10 aproximadamente 10 µM, de menos de aproximadamente 5 µM, de menos de aproximadamente 1 µM, de menos de aproximadamente 500 nM, de menos de aproximadamente 100 nM o de menos de aproximadamente 50 nM. En ciertas realizaciones, la variante de la SEQ ID NO: 2 es un receptor para el que la (2-fluoro-4-metanosulfonilfenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)piperidin-1-il]-5-15 nitropirimidin-4-il}amina es un agonista que tiene un valor de CE50, en el ensayo de adenilato ciclasa de célula entera según el Ejemplo 8 a continuación, de menos de aproximadamente 5 µM, de menos de aproximadamente 1 µM, de menos de aproximadamente 100 nM, de menos de aproximadamente 50 nM, de menos de aproximadamente 25 nM, de menos de aproximadamente 10 nM, de menos de 20 aproximadamente 5 nM o de menos de aproximadamente 1 nM. En ciertas realizaciones, la variante de la SEQ ID NO: 2 es un receptor para el que la (2-fluoro-4-metanosulfonilfenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)piperidin-1-il]-5-nitropirimidin-4-il}amina es un agonista que tiene un valor de CE50, en el ensayo de adenilato ciclasa de célula entera según el Ejemplo 8 a continuación, de menos de 25 aproximadamente 100 nM, de menos de aproximadamente 50 nM, de menos de aproximadamente 25 nM, de menos de aproximadamente 10 nM, de menos de aproximadamente 5 nM o de menos de aproximadamente 1 nM. En algunas realizaciones, la variante de la SEQ ID NO: 2 exhibe un nivel detectable de actividad constitutiva. En algunas realizaciones, la actividad constitutiva es aumentar el nivel de 30 AMPc intracelular. En algunas realizaciones, la actividad constitutiva es causar que las células melanofóricas experimenten dispersión. En algunas realizaciones, el receptor acoplado con proteína G que comprende al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 75 o al menos 100 aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 2

: exhibe un nivel detectable de actividad constitutiva. En algunas realizaciones, la actividad constitutiva es causar que las células melanofóricas experimenten dispersión de pigmento.

: [0235] En algunas realizaciones, un GPCR variante que puede usarse en los procedimientos en cuestión es un GPCR codificado por un polinucleótido que hibrida 5 en condiciones de alto rigor con el complemento de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, el GPCR codificado por un polinucleótido que hibrida en condiciones de alto rigor con el complemento de la SEQ ID NO: 1 es un GPCR endógeno. En algunas realizaciones, el GPCR codificado por un polinucleótido que hibrida en condiciones de alto rigor con el complemento de la SEQ ID NO: 1 es un GPCR no endógeno. En 10 algunas realizaciones, el GPCR codificado por un polinucleótido que hibrida en condiciones de alto rigor con el complemento de la SEQ ID NO: 1 y que es un GPCR endógeno es un GPCR endógeno de mamífero. En ciertas realizaciones, el GPCR codificado por un polinucleótido que hibrida en condiciones de alto rigor con el complemento de la SEQ ID NO: 1 es la SEQ ID NO: 2 o un alelo de la misma. En 15 ciertas realizaciones, el GPCR codificado por un polinucleótido que hibrida en condiciones de alto rigor con el complemento de la SEQ ID NO: 1 es un alelo de la SEQ ID NO: 2. En ciertas realizaciones, el GPCR codificado por un polinucleótido que hibrida en condiciones de alto rigor con el complemento de la SEQ ID NO: 1 es un ortólogo de la SEQ ID NO: 2. En ciertas realizaciones, el GPCR codificado por un 20 polinucleótido que hibrida en condiciones de alto rigor con el complemento de la SEQ ID NO: 1 se une específicamente al compuesto 1. En ciertas realizaciones, el GPCR codificado por un polinucleótido que hibrida en condiciones de alto rigor con el complemento de la SEQ ID NO: 1 se une específicamente a (2-fluoro-4-metanosulfonilfenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)piperidin-1-il]-5-25 nitropirimidin-4-il}amina. En ciertas realizaciones, el GPCR codificado por un polinucleótido que hibrida en condiciones de alto rigor con el complemento de la SEQ ID NO: 1 se une específicamente a (2-fluoro-4-metanosulfonilfenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)piperidin-1-il]-5-nitropirimidin-4-il}amina con un valor de CI50, en el ensayo de unión a receptor según el Ejemplo 12 a continuación, de 30 menos de aproximadamente 50 µM, de menos de aproximadamente 25 µM, de menos de aproximadamente 10 µM, de menos de aproximadamente 5 µM, de menos de aproximadamente 1 µM, de menos de aproximadamente 500 nM, de menos de aproximadamente 100 nM o de menos de aproximadamente 50 nM. En ciertas

: realizaciones, el GPCR codificado por un polinucleótido que hibrida en condiciones de alto rigor con el complemento de la SEQ ID NO: 1 se une específicamente a (2-fluoro-4-metanosulfonilfenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)piperidin-1-il]-5-nitropirimidin-4-il}amina con un valor de CI50, en el ensayo de unión a receptor según el Ejemplo 12 a continuación, de menos de aproximadamente 10 µM, de menos de 5 aproximadamente 5 µM, de menos de aproximadamente 1 µM, de menos de aproximadamente 500 nM, de menos de aproximadamente 100 nM o de menos de aproximadamente 50 nM. En ciertas realizaciones, el GPCR codificado por un polinucleótido que hibrida en condiciones de alto rigor con el complemento de la SEQ ID NO: 1 es un receptor para el que la (2-fluoro-4-metanosulfonilfenil)-{6-[4-(3-10 isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)piperidin-1-il]-5-nitropirimidin-4-il}amina es un agonista que tiene un valor de CE50 en dicho receptor, en el ensayo de adenilato ciclasa de célula entera según el Ejemplo 8 a continuación, de menos de aproximadamente 5 µM, de menos de aproximadamente 1 µM, de menos de aproximadamente 100 nM, de menos de aproximadamente 50 nM, de menos de aproximadamente 25 nM, de menos 15 de aproximadamente 10 nM, de menos de aproximadamente 5 nM o de menos de aproximadamente 1 nM. En ciertas realizaciones, el GPCR codificado por un polinucleótido que hibrida en condiciones de alto rigor con el complemento de la SEQ ID NO: 1 es un receptor para el que la (2-fluoro-4-metanosulfonilfenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)piperidin-1-il]-5-nitropirimidin-4-il}amina es un 20 agonista que tiene un valor de CE50 en dicho receptor, en el ensayo de adenilato ciclasa de célula entera según el Ejemplo 8 a continuación, de menos de aproximadamente 100 nM, de menos de aproximadamente 50 nM, de menos de aproximadamente 25 nM, de menos de aproximadamente 10 nM, de menos de aproximadamente 5 nM o de menos de aproximadamente 1 nM. En algunas realizaciones, el GPCR codificado por 25 un polinucleótido que hibrida en condiciones de alto rigor con el complemento de la SEQ ID NO: 1 exhibe un nivel detectable de actividad constitutiva. En algunas realizaciones, la actividad constitutiva es aumentar el nivel de AMPc intracelular. En algunas realizaciones, la actividad constitutiva es causar que las células melanofóricas experimenten dispersión de pigmento. Las técnicas de hibridación son bien conocidas 30 por el experto. En algunas realizaciones, las condiciones de hibridación rigurosas (por ejemplo condiciones de alto rigor) incluyen hibridación durante una noche a 42ºC en una disolución que comprende 50% de formamida, 5xSSC (1xSSC = NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato de sodio 50 mM (pH 7,6), 5x disolución de Denhardt,

: 10% de sulfato de dextrano y ADN de esperma de salmón desnaturalizado por cizallamiento 20 µg/ml, seguido de lavado del filtro con 0,1xSSC aproximadamente a 65ºC. En algunas realizaciones, las condiciones de hibridación rigurosas (por ejemplo condiciones de alto rigor) incluyen hibridación durante una noche a 42ºC en una disolución que comprende 50% de formamida, 5xSSC (1xSSC = NaCl 150 mM, 5 citrato trisódico 15 mM), fosfato de sodio 50 mM (pH 7,6), 5x disolución de Denhardt, 10% de sulfato de dextrano y ADN de esperma de salmón desnaturalizado por cizallamiento 20 µg/ml, seguido de lavado con 0,1xSSC(0,1% de SDS (dodecilsulfato de sodio) o 0,2xSSC/0,1% de SDS aproximadamente a 50ºC, aproximadamente a 55º, aproximadamente a 60ºC o aproximadamente a 65ºC. En algunas realizaciones, las 10 condiciones de alto rigor comprenden lavado a 65ºC con 0,1xSSC. En algunas realizaciones, dichas condiciones de alto rigor comprenden lavado aproximadamente a 50ºC, aproximadamente a 55ºC, aproximadamente a 60ºC o aproximadamente a 65ºC con 0,1xSSC/0,1% de SDS o con 0,2xSSC/0,1% SDS.

: [0236] En algunas realizaciones, un GPCR que puede usarse en los 15 procedimientos en cuestión es un receptor activado constitutivamente no endógeno que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 2, en la que la leucina en la posición aminoacídica 224 de la SEQ ID NO: 2 está sustituida por un aminoácido distinto de leucina. En algunas realizaciones, el aminoácido distinto de leucina es lisina. En algunas realizaciones, el aminoácido distinto de leucina es alanina. En 20 algunas realizaciones, el aminoácido distinto de leucina es arginina. En algunas realizaciones, el aminoácido distinto de leucina es histidina. En algunas realizaciones, la actividad constitutiva es aumentar el nivel de AMPc intracelular. En algunas realizaciones, la actividad constitutiva es causar que las células melanofóricas experimenten dispersión de pigmento. 25

: [0237] En ciertas realizaciones, un GPCR de la invención comprende una versión activa constitutivamente de un receptor acoplado con proteína G que tiene la SEQ ID NO: 2. En algunas realizaciones, la versión activa constitutivamente del receptor es una versión activa constitutivamente endógena que tiene la SEQ ID NO: 2. En algunas realizaciones, la versión activa constitutivamente del receptor es una versión activa 30 constitutivamente no endógena que tiene una mutación situada en la posición aminoacídica 224 de la SEQ ID NO: 2. En algunas realizaciones, el resto mutado se ha mutado a un resto distinto de leucina. En algunas realizaciones, el resto mutado se ha mutado a un resto de lisina. En algunas realizaciones, el resto mutado se ha mutado a

: un resto de alanina. En algunas realizaciones, el resto mutado se ha mutado a un resto de arginina. En algunas realizaciones, el resto mutado se ha mutado a un resto de histidina. En algunas realizaciones, la actividad constitutiva es aumentar el nivel de AMPc intracelular. En algunas realizaciones, la actividad constitutiva es causar que las células melanofóricas experimenten dispersión de pigmento. 5

: [0238] En ciertas realizaciones, un GPCR de la invención forma parte de una proteína de fusión con una proteína G.

a. Identidad de secuencia

: [0239] En ciertas realizaciones, se evalúa la identidad porcentual usando la Basic Local Alignment Search Tool (“BLAST”), que es bien conocida en la técnica [véanse, 10 por ejemplo, Karlin y Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990) 87: 2264-2268; Altschul y col., J. Mol. Biol. (1990) 215:403-410; Altschul y col., Nature Genetics (1993) 3: 266-272 y Altschul y col., Nucleic Acids Res. (1997) 25: 3389-3402; cuyas divulgaciones se incorporan a la presente memoria como referencia en su totalidad]. El programa BLAST puede usarse con los parámetros por defecto o con parámetros 15 modificados proporcionados por el usuario. Preferiblemente, los parámetros son los parámetros por defecto.

: [0240] En ciertas realizaciones, puede determinarse el procedimiento preferido para determinar la mejor coincidencia global entre una secuencia de consulta (por ejemplo, la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 2) y una secuencia para 20 analizar, designado también como alineamiento de secuencia global, usando el programa informático FASTDB basado en el algoritmo de Brutlag y col. (Comp. App. Biosci. (1990) 6: 237-245; cuya divulgación se incorpora a la presente como referencia en su totalidad). En un alineamiento de secuencia, las secuencias de consulta y para analizar son ambas secuencias aminoacídicas. El resultado de dicho alineamiento de 25 secuencia global es un porcentaje de identidad. Los parámetros preferidos usados en un alineamiento aminoacídico de FASTDB son: matriz= PAM 0, k-tuplo= 2, penalización por desapareamiento= 1, penalización por unión= 20, grupo de aleatorización= 25, longitud= 0, puntuación de corte= 1, tamaño de ventana= longitud de secuencia, penalización por hueco= 5, penalización por tamaño de hueco= 0,05, tamaño de 30 ventana= 247 o la longitud de la secuencia aminoacídica analizada, lo que sea menor. Si la secuencia analizada es más corta que la secuencia de consulta debido a deleciones N- o C-terminales, no debido a deleciones internas, los resultados en porcentaje de identidad deben corregirse manualmente porque el programa FASTDB no da cuenta de

: los truncamientos N- y C-terminales de la secuencia analizada cuando se calcula el porcentaje de identidad global. Para secuencias analizadas truncadas en los extremos N y C, respecto a la secuencia de consulta, se corrige el porcentaje de identidad calculando el número de restos de la secuencia de consulta que son N- y C-terminales de la secuencia analizada que no son coincidentes/están alineados con el 5 correspondiente resto de la secuencia analizada, como porcentaje de las bases totales de la secuencia de consulta. Que un resto sea coincidente/esté alineado, se determina mediante los resultados del alineamiento de secuencia de FASTDB. Se resta entonces este porcentaje del porcentaje de identidad, calculado por el programa FASTDB anterior usando los parámetros especificados, llegando a una puntuación de porcentaje 10 de identidad final. Esta puntuación de porcentaje de identidad final es lo que se usa con los fines de la presente invención. Solo se consideran los restos en los extremos N y C de la secuencia analizada que no son coincidentes/están alineados con la secuencia de consulta con los fines del ajuste manual de la puntuación de porcentaje de identidad. Esto es, solo los restos aminoacídicos de consulta fuera de los restos N- y C-terminales 15 más lejanos de la secuencia analizada.

: [0241] Por ejemplo, se alinea una secuencia analizada de 90 restos aminoacídicos con una secuencia de consulta de 100 residuos para determinar el porcentaje de identidad. Ocurre una deleción en el extremo N de la secuencia analizada y, por lo tanto, el alineamiento de FASTDB no coincide/se alinea con los primeros restos del 20 extremo N. Los 10 restos desapareados representan un 10% de la secuencia (número de restos en los extremos N y C no coincidentes/número total de restos de la secuencia de consulta), así que se resta un 10% de la puntuación de porcentaje de identidad calculado por el programa FASTDB. Si los 90 restos restantes fueran perfectamente coincidentes, el porcentaje de identidad final sería de un 90%. En otro ejemplo, una 25 secuencia analizada de 90 restos se compara con una secuencia de consulta de 100 restos. Esta vez, las deleciones son internas, de modo que no hay restos en los extremos N o C de la secuencia analizada que no sean coincidentes/estén alineados con la consulta. En este caso, el porcentaje de identidad calculado por FASTDB no se corrige manualmente. De nuevo, solo se corrigen manualmente las posiciones de resto 30 fuera de los extremos N- y C-terminales de la secuencia en cuestión, como se muestra en el alineamiento de FASTDB, que no son coincidentes/están alineados con la secuencia de consulta. No se hacen otras correcciones con los fines de la presente invención.

b. Proteínas de fusión

: [0242] En ciertas realizaciones, un polipéptido de interés es una proteína de fusión y puede contener, por ejemplo, un dominio marcador de afinidad o un dominio indicador. Los marcadores de afinidad adecuados incluyen cualquier secuencia aminoacídica que pueda unirse específicamente a otro resto, habitualmente otro 5 polipéptido, lo más habitualmente un anticuerpo. Los marcadores de afinidad adecuados incluyen marcadores epitópicos, por ejemplo, el marcador V5, el marcador FLAG, el marcador HA (de hemaglutinina del virus de la gripe), el marcador myc y similares, como es conocido en la técnica. Los marcadores de afinidad adecuados incluyen también dominios para los que son conocidos sustratos de unión, por ejemplo, 10 marcadores HIS, GST y MBP, como es conocido en la técnica, y dominios de otras proteínas para las que están disponibles parejas de unión específica, por ejemplo, anticuerpos, particularmente anticuerpos monoclonales. Los marcadores de afinidad adecuados incluyen también cualquier dominio de interacción proteína-proteína tal como una región Fc de IgG, que puede unirse y detectarse específicamente usando una 15 pareja de unión adecuada, por ejemplo, el receptor de Fc de IgG. Se contempla expresamente que dicha proteína de fusión puede contener un dominio N-terminal heterólogo (por ejemplo, un marcador epitópico) fusionado en fase con un GPCR en que se ha eliminado su resto de metionina N-terminal o sustituido por un aminoácido alternativo. 20

: [0243] Los dominios indicadores adecuados incluyen cualquier dominio que pueda indicar la presencia de un polipéptido. Aunque se reconoce que puede usarse un marcador de afinidad para indicar la presencia de un polipéptido usando, por ejemplo, un anticuerpo marcado que se una específicamente al marcador, los dominios indicadores emisores de luz son los más habitualmente usados. Los dominios 25 indicadores emisores de luz adecuados incluyen luciferasa (por ejemplo, de luciérnaga, Vargula, Renilla reniformis o Renilla muelleri), o variantes emisoras de luz de la misma. Otros dominios indicadores adecuados incluyen proteínas fluorescentes (por ejemplo, de medusa, corales y otros celenterados como las de especies de Aequoria, Renilla, Ptilosarcus, Stylatula) o variantes emisoras de luz de las mismas. Las 30 variantes emisoras de luz de estas proteínas indicadoras son muy bien conocidas en la técnica y pueden ser más brillantes, más atenuadas o tener diferentes espectros de excitación y/o emisión, en comparación con la proteína indicadora nativa. Por ejemplo, algunas variantes se alteran de tal modo que ya no aparezca verde, y pueden aparecer

: azul, cian, amarilla, roja amarillenta potenciada (denominadas BFP, CFP, YFP eYFP y RFP, respectivamente) o pueden tener otros espectros de emisión, como es conocido en la técnica. Otros dominios indicadores adecuados incluyen dominios que pueden indicar la presencia de un polipéptido mediante un cambio bioquímico o de color, tal como β-galactosidasa, β-glucuronidasa, cloranfenicol acetil transferasa y fosfatasa 5 alcalina embriónica secretada.

: [0244] Es también conocido en la técnica que un marcador de afinidad o dominio indicador puede estar presente en cualquier posición del polipéptido de interés. Sin embargo, en la mayoría de realizaciones, están presentes en el extremo C- o N-terminal de un polipéptido de interés. 10

2. Ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de GPCR de interés

: [0245] Puesto que el código genético y la técnicas recombinantes para manipular ácido nucleico son conocidos, y las secuencias aminoacídicas de polipéptidos de GPCR de interés se han descrito anteriormente, el diseño y producción de ácidos nucleicos que codifican un polipéptido de GPCR de interés están dentro de las 15 habilidades de un experto. En ciertas realizaciones, se usan procedimientos de tecnología de ADN recombinante estándar (Ausubel y col., “Short Protocols in Molecular Biology”, 3ª ed., Wiley & Sons, 1995; Sambrook y col., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2ª edición, (1989) Cold Spring Harbor, N.Y.). Por ejemplo, pueden aislarse secuencias de codificación de GPCR de una colección de 20 secuencias de codificación de GPCR usando uno cualquiera o una combinación de una variedad de procedimientos recombinantes que no necesitan describirse en la presente memoria. La posterior sustitución, deleción y/o adición de nucleótidos en la secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína puede hacerse también usando técnicas de ADN recombinante estándar. Por ejemplo, pueden usarse mutagénesis dirigida a sitio y 25 subclonación para introducir/eliminar/sustituir restos de ácido nucleico en un polinucleótido que codifica un polipéptido de interés. En otras realizaciones, puede usarse PCR. Los ácidos nucleicos que codifican un polipéptido de interés pueden prepararse también mediante síntesis química enteramente a partir de oligonucleótidos (por ejemplo, Cello y col., Science (2002) 297:1016-8). En algunas realizaciones, los 30 codones de los ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de interés están optimizados para expresión en células de una especie particular, particularmente una especie de mamífero, por ejemplo, ratón, rata, hámster, primate no humano o ser humano. En algunas realizaciones, los codones de los ácidos nucleicos que codifican

: polipéptidos de interés están optimizados para expresión en células de una especie particular, particularmente una especie de anfibio.

a. Vectores

: [0246] La solicitud describe adicionalmente vectores (también designados como “construcciones”) que comprenden un ácido nucleico en cuestión. En muchas 5 realizaciones de la invención, las secuencias de ácido nucleico en cuestión se expresarán en un hospedador después de ligarse operativamente las secuencias con una secuencia de control de la expresión incluyendo, por ejemplo, un promotor. Los ácidos nucleicos en cuestión se disponen también típicamente en un vector de expresión que puede replicarse en una célula hospedadora como episoma o como parte integral del 10 ADN cromosómico del hospedador. Normalmente, los vectores de expresión contendrán marcadores de selección, por ejemplo, tetraciclina o neomicina, para permitir la detección de aquellas células transformadas con las secuencias de ADN deseadas (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 4.704.362, que se incorpora a la presente como referencia). Los vectores, incluyendo vectores de casete de expresión 15 individual y dual, son bien conocidos en la técnica (Ausubel y col., “Short Protocols in Molecular Biology”, 3ª ed., Wiley & Sons, 1995; Sambrook y col., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2ª edición, (1989) Cold Spring Harbor, N.Y.). Los vectores adecuados incluyen vectores víricos, plásmidos, cósmidos, cromosomas artificiales (cromosomas artificiales humanos, cromosomas artificiales bacterianos, 20 cromosomas artificiales de levadura, etc.), minicromosomas y similares. Pueden usarse vectores retrovíricos, adenovíricos y víricos adenoasociados.

: [0247] Están disponibles una variedad de vectores de expresión para los expertos en la técnica con los fines de producir un polipéptido de interés en una célula, e incluyen vectores de expresión que están comercialmente disponibles (por ejemplo, en 25 Invitrogen, Carlsbad, CA; Clontech, Mountain View, CA; Stratagene, La Jolla, CA). Los vectores de expresión comercialmente disponibles incluyen, a modo de ejemplo no limitante, vectores basados en el promotor de CMV. Es un vector de expresión adecuado pCMV. El vector de expresión puede ser adenovírico. Puede adquirirse un vector adenovírico ejemplar como AdEasy™ en Qbiogene (Carlsbad, CA) (He TC y 30 col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1998) 95: 2509-2514 y la patente de EE.UU. nº 5.922.576; cuyas divulgaciones se incorporan a la presente como referencia en su totalidad). Otros vectores de expresión adecuados resultarán fácilmente evidentes para los expertos en la técnica. Los ácidos nucleicos en cuestión comprenden habitualmente

: un solo marco abierto de lectura que codifica el polipéptido de interés en cuestión, sin embargo, en ciertas realizaciones, puesto que la célula hospedadora para expresión del polipéptido de interés puede ser una célula eucariótica, por ejemplo una célula de mamífero tal como una célula humana, el marco abierto de lectura puede estar interrumpido por intrones. El ácido nucleico en cuestión es típicamente parte de una 5 unidad transcripcional que puede contener, además del ácido nucleico en cuestión, regiones 3’ y 5’ no traducidas (UTR) que pueden dirigir la estabilidad del ARN, la eficacia de la traducción, etc. El ácido nucleico en cuestión puede ser también parte de un casete de expresión que contiene, además del ácido nucleico en cuestión, un promotor que dirige la transcripción y expresión de un polipéptido de interés y un 10 terminador transcripcional.

: [0248] Los promotores eucarióticos pueden ser cualquier promotor que sea funcional en una célula hospedadora eucariótica, incluyendo promotores víricos y promotores derivados de genes eucarióticos. Los promotores eucarióticos ejemplares incluyen, pero sin limitación, los siguientes: el promotor de la secuencia génica de 15 metalotioneína I de ratón (Hamer y col, J. Mol. Appl. Gen. 1: 273-288, 1982); el promotor TK de herpesvirus (McKnight, Cell 31: 355-365, 1982); el promotor temprano de SV40 (Benoist y col., Nature (London) 290: 304-310, 1981); el promotor de la secuencia del gen gall de levadura (Johnston y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79: 6971-6975, 1982); Silver y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 81: 5951-59SS, 20 1984), el promotor de CMV, el promotor de EF-1, el promotores o promotores sensibles a ecdisona, el promotor sensible a tetraciclina y similares. Los promotores víricos pueden ser de interés particular ya que generalmente son promotores particularmente fuertes. En ciertas realizaciones, se usa un promotor que es un promotor del patógeno diana. Los promotores para uso en la presente invención se 25 seleccionan de tal modo que sean funcionales en el tipo celular (y/o animal) en el que se están introduciendo. En ciertas realizaciones, el promotor es un promotor de CMV.

: [0249] En ciertas realizaciones, un vector en cuestión puede proporcionar también la expresión de un marcador detectable. Los vectores y marcadores detectables adecuados son bien conocidos en la técnica y se discuten en Ausubel y col., (“Short 30 Protocols in Molecular Biology”, 3ª ed., Wiley & Sons, 1995) y Sambrook y col., (“Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 3ª edición, (2001) Cold Spring Harbor, N.Y.). Se han empleado una variedad de genes diferentes como marcadores detectables, y el gen particular empleado en los vectores en cuestión como marcador

: detectable se elige principalmente por razones de conveniencia. Los genes marcadores detectables conocidos incluyen: el gen de timidina cinasa, el gen de dihidrofolato reductasa, el gen de xantina-guanina fosforribosiltransferasa, CAD, el gen de adenosina desaminasa, el gen de asparagina sintetasa, genes de resistencia a antibióticos, por ejemplo, tetr, ampr, Cmr o cat, kanr o neor (genes de aminoglucósido 5 fosfotransferasa), el gen de higromicina B fosfotransferasa y similares. Como se menciona anteriormente, los polipéptidos de interés pueden ser proteínas de fusión que contienen un dominio de afinidad y/o dominio indicador. Los procedimientos para preparar fusiones entre un indicador o marcador y un GPCR, por ejemplo en el extremo C o N del GPCR, están dentro de las habilidades de un experto en la técnica 10 (por ejemplo, McLean y col., Mol. Pharma. Mol. Pharmacol. 1999 56: 1182-91; Ramsay y col., Br. J. Pharmacology, 2001, 315-323) y no se describirán adicionalmente. Se contempla expresamente que dicha proteína de fusión puede contener un dominio N-terminal heterólogo (por ejemplo, un marcador epitópico) fusionado en fase con un GPCR en que se ha eliminado su resto de metionina N-15 terminal o sustituido por un aminoácido alternativo. Se aprecia que un polipéptido de interés puede prepararse en primer lugar a partir de un polipéptido nativo y ligarse operativamente entonces con un indicador/marcador adecuado como se describe anteriormente.

: [0250] Los ácidos nucleicos en cuestión pueden contener también sitios de 20 restricción, sitios de clonación múltiple, sitios de unión a cebador, extremos ligables, sitios de recombinación, etc., habitualmente para facilitar la construcción de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de interés.

b. Células hospedadoras

: [0251] La solicitud describe adicionalmente células hospedadoras que 25 comprenden un vector que comprende un ácido nucleico en cuestión. Las células hospedadoras adecuadas incluyen células procarióticas, por ejemplo bacterianas (por ejemplo E. coli), así como células eucarióticas, por ejemplo, una célula animal (por ejemplo, una célula de insecto, mamífero, pez, anfibio, ave o reptil), una célula vegetal (por ejemplo, una célula de maíz o Arabidopsis) o una célula fúngica (por ejemplo, una 30 célula de S. cerevisiae). En ciertas realizaciones, puede usarse como célula hospedadora cualquier célula adecuada para la expresión de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de interés. Habitualmente, se usa una línea celular hospedadora animal, cuyos ejemplos son los siguientes: células de riñón de mono (células COS),

: células CVI de riñón de mono transformadas por SV40 (COS-7, ATCC CRL 165 1); células de riñón embrionarias humanas (HEK-293 [“293”], Graham y col. J. Gen Virol. 36: 59 (1977)); células HEK-293T [“293T”]; células de riñón de hámster recién nacido (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster chino (CHO, Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77: 4216, (1980); células de hámster dorado sirio 5 MCB3901 (ATCC CRL-9595); células de Sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)); células de riñón de mono (CVI ATCC CCL 70); células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma de cuello de útero humano (HELA, ATCC CCL 2); células de riñón caninas (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata común (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 10 células de pulmón humanas (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humanas (hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL 51); células TRI (Mather y col., Annals N. Y. Acad. Sci. 383: 44-68 (1982)); células NIH/3T3 (ATCC CRL-1658) y células L de ratón (ATCC CCL-1). En ciertas realizaciones, se usan melanóforos. Los melanóforos son células dérmicas que se encuentran en vertebrados 15 inferiores. Se seguirán los materiales y procedimientos relevantes según la divulgación de la patente de EE.UU. nº 5.462.856 y la patente de EE.UU. nº 6.051.386.

: [0252] Resultarán evidentes líneas celulares adicionales para los expertos en la técnica, y están disponibles una amplia variedad de líneas celulares en la American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209. 20

C. Cribado de compuestos candidatos

1. Técnicas de ensayo de cribado de GPCR genérico

: [0253] Cuando un receptor de proteína G se activa, se une a una proteína G (por ejemplo, Gq, Gs, Gi, Gz, Go) y estimula la unión de GTP a la proteína G. La proteína G actúa entonces como GTPasa e hidroliza lentamente el GTP a GDP, con lo que el 25 receptor, en condiciones normales, se desactiva. Sin embargo, los receptores activados continúan intercambiando GDP por GTP. Puede usarse un análogo no hidrolizable de GTP, [35S]GTPγS, para controlar la unión potenciada a membranas que expresan receptores activados. Se ha notificado que el [35S]GTPγS puede usarse para controlar el acoplamiento de proteína G con membranas en ausencia o presencia de ligando. Se 30 ha notificado un ejemplo de este control, entre otros ejemplos bien conocidos y disponibles por los expertos en la técnica, por Traynor y Nahorski en 1995. Es un uso preferido de este sistema de ensayo para el cribado inicial de compuestos candidatos, porque el sistema es aplicable genéricamente a todos los receptores acoplados con

: proteína G independientemente de la proteína G particular que interaccione con el dominio intracelular del receptor.

2. Técnicas de ensayo de cribado de GPCR específico

: [0254] Una vez se identifican los compuestos candidatos usando el ensayo de receptor acoplado con proteína G “genérico” (concretamente, un ensayo para 5 seleccionar compuestos que son agonistas o agonistas inversos), en algunas realizaciones se prefiere un cribado adicional para confirmar que los compuestos han interaccionado en el sitio de receptor. Por ejemplo, un compuesto identificado por el ensayo “genérico” puede no unirse al receptor, sino que puede en lugar de ello simplemente “desacoplar” la proteína G del dominio intracelular. 10

a. Gs, Gz y Gi.

: [0255] La Gs estimula la enzima adenilato ciclasa. La Gi (y Gz y Go), por otro lado, inhiben la adenilato ciclasa. La adenilato ciclasa cataliza la conversión de ATP en AMPc; por tanto, los GPCR activados que se acoplan con proteína Gs están asociados a niveles celulares aumentados de AMPc. Por otro lado, los GPCR activados que se 15 acoplan con proteína Gi (o Gz, Go) están asociados a niveles celulares reducidos de AMPc. Véase, en general, “Indirect Mechanisms of Synaptic Transmisión”, Cap. 8, “From Neuron To Brain” (3ª Ed.) Nichols, J.G. y col. eds. Sinauer Associates, Inc. (1992). Por tanto, pueden utilizarse ensayos que detectan AMPc para determinar si un compuesto candidato es, por ejemplo, un agonista inverso del receptor (concretamente, 20 dicho compuesto reduciría los niveles de AMPc). Pueden utilizarse una variedad de enfoques conocidos en la técnica para medir AMPc; en algunas realizaciones, un enfoque preferido se basa en el uso de anticuerpos anti-AMPc en un formato basado en ELISA. Otro tipo de ensayo que puede utilizarse es un ensayo de sistema indicador por segundo mensajero de célula entera. Los promotores de genes regulan la expresión de 25 las proteínas que codifica un gen particular. El AMP cíclico regula la expresión al promover la unión de una proteína o factor de transcripción de unión a ADN sensible a AMPc (CREB), que se une entonces al promotor en sitios específicos denominados elementos de respuesta de AMPc, y regula la expresión del gen. Pueden construirse sistemas indicadoras que tienen un promotor que contiene múltiples elementos de 30 respuesta de AMPc antes del gen indicador, por ejemplo, β-galactosidasa o luciferasa. Por tanto, un receptor ligado con Gs activado causa la acumulación de AMPc, que activa entonces el gen y la expresión de la proteína indicadora. La proteína indicadora tal como β-galactosidasa o luciferasa puede detectarse entonces usando ensayos

: bioquímicos estándar (Chen y col. 1995).

b. Go y Gq.

: [0256] Gq y Go están asociadas a la activación de la enzima fosfolipasa C, que a su vez hidroliza el fosfolípido PIP2, liberando dos mensajeros intracelulares: diacilglicerol (DAG) y 1,4,5-trifosfato de inositol (IP3). La acumulación aumentada de 5 IP3 está asociada a la activación de receptores asociados con Gq y Go. Véase, en general, “Indirect Mechanisms of Synaptic Transmisión”, Cap. 8, “From Neuron To Brain” (3ª Ed.) Nichols, J.G. y col. eds. Sinauer Associates, Inc. (1992). Pueden utilizarse ensayos que detectan la acumulación de IP3 para determinar si un compuesto candidato es, por ejemplo, un agonista inverso de un receptor asociado con Gq o Go 10 (concretamente, dicho compuesto reduciría los niveles de IP3). Pueden examinarse también los receptores asociados con Gq usando un ensayo indicador API en el que la fosfolipasa C dependiente de Gq causa la activación de genes que contienen elementos de API; por tanto, los receptores asociados con Gq evidenciarán un aumento de la expresión de dicho genes, con lo que los agonistas inversos de los mismos 15 evidenciarán una reducción de dicha expresión y los agonistas evidenciarán un aumento de dicha expresión. Están disponibles ensayos comercialmente disponibles para dicha detección.

3. Proteína de fusión de GPCR

: [0257] El uso de un GCPR endógeno activo constitutivamente o de un GPCR no 20 endógeno activo constitutivamente, para uso en el cribado de compuestos candidatos para la identificación directa de agonistas inversos o agonistas, proporciona un interesante desafío al cribado en el que, por definición, el receptor es activo incluso en ausencia de un ligando endógeno unido al mismo. Por tanto, para diferenciar entre, por ejemplo, el receptor no endógeno en presencia de un compuesto candidato y el 25 receptor no endógeno en ausencia de ese compuesto, con el objetivo de permitir dicha diferenciación para la comprensión de si dicho compuesto puede ser un agonista inverso o agonista o no tiene efecto sobre dicho receptor, en algunas realizaciones se prefiere utilizar un enfoque que pueda potenciar dicha diferenciación. En algunas realizaciones, es un enfoque preferido el uso de una proteína de fusión de GPCR. 30

: [0258] En general, una vez se determina que un GPCR no endógeno se ha activado constitutivamente usando las técnicas de ensayo expuestas anteriormente (así como otras conocidas por el experto en la técnica), es posible determinar la proteína G predominante que se acopla con el GPCR endógeno. El acoplamiento de la proteína G

: con el GPCR proporciona una ruta de señalización que puede valorarse. En algunas realizaciones, se prefiere que el cribado tenga lugar usando un sistema de expresión de mamífero o melanofórico, ya que se espera que dicho sistema tenga proteína G endógena en el mismo. Por tanto, por definición, en dicho sistema el GPCR no endógeno activado constitutivamente señalizará continuamente. En algunas 5 realizaciones, se prefiere que esta señal esté potenciada de tal modo que en presencia de, por ejemplo, un agonista inverso del receptor, sea más probable que sea capaz de diferenciarse más fácilmente, particularmente en el contexto del cribado, entre el receptor cuando está en contacto con el agonista inverso.

: [0259] La proteína de fusión de GPCR se pretende que potencie la eficacia del 10 acoplamiento de la proteína G con el GPCR. La proteína de fusión de GPCR puede preferirse para cribado con un GPCR endógeno activo constitutivamente o un GPCR no endógeno activado constitutivamente porque dicho enfoque aumenta la señal que se genera en dichas técnicas de cribado. Esto es importante para facilitar una relación de “señal a ruido” significativa, dicha relación significativa se prefiere para el cribado de 15 compuestos candidatos como los dados a conocer en la presente memoria.

: [0260] La construcción de una construcción útil para la expresión de una proteína de fusión de GPCR está dentro del alcance de los expertos en la técnica. Los vectores de expresión y sistemas comercialmente disponibles ofrecen una variedad de enfoques que pueden ajustarse a las necesidades particulares del investigador. Los criterios 20 importantes en la construcción de dicha construcción de proteína de fusión de GPCR incluyen, pero sin limitación, que la secuencia del GPCR y la secuencia de la proteína G estén ambas en fase (preferiblemente, la secuencia del GPCR endógeno está en dirección 5’ a la secuencia de la proteína G) y que el codón de “terminación” del GPCR está eliminado o reemplazado de tal modo que, tras la expresión del GPCR, la 25 proteína G puede expresarse también. El GPCR puede estar ligado directamente a la proteína G, o puede haber restos espaciadores entre los dos (preferiblemente no más de aproximadamente 12, aunque este número puede averiguarse fácilmente por un experto en la técnica). Según la conveniencia, se prefiere usar un espaciador. En algunas realizaciones, se prefiere que la proteína G que se acopla con el GPCR no endógeno se 30 identifique antes de la creación de la construcción de proteína de fusión de GPCR. Como se observa anteriormente, los GPCR activados que se acoplan con Gi, Gz y Go se espera que inhiban la formación de AMPc, haciendo un desafío los ensayos basados en estos tipos de GPCR (concretamente, la señal de AMPc se reduce después de la

: activación, haciendo así un desafío la identificación directa de, por ejemplo, agonistas (que reducirían adicionalmente esta señal)). Como se dará a conocer en la presente memoria, se ha averiguado que, para estos tipos de receptores, es posible crear una proteína de fusión de GPCR que no está basada en la proteína G endógena de GPCR, en un esfuerzo por establecer un ensayo basado en ciclasa viable. Por tanto, por 5 ejemplo, puede fusionarse un receptor acoplado con Gi endógeno con una proteína Gs, tal como una construcción de fusión, que, tras la expresión, “regula” o “fuerza” al GPCR endógeno a acoplarse, por ejemplo, con Gs en lugar de con la proteína Gi “natural”, de tal modo que puede establecerse un ensayo basado en ciclasa. Por tanto, para los receptores acoplados con Gi, Gz y Go, en algunas realizaciones se prefiere que 10 cuando se usa una proteína de fusión de GPCR y el ensayo está basado en la detección de actividad adenilato ciclasa, que la construcción de fusión se establezca con Gs (o una proteína G equivalente que estimule la formación de la enzima adenilato ciclasa).

TABLA C

Proteína G: Efecto de la producción de AMPc sobre la activación de GPCR (concretamente, activación constitutiva o unión a agonista) Efecto de la acumulación de IP3 sobre la activación de GPCR (concretamente, activación constitutiva o unión a agonista) Efecto de la producción de AMPc sobre el contacto con un agonista inverso Efecto de la acumulación de IP3 sobre el contacto con un agonista inverso

Gs: Aumenta N/A Reduce N/A

Gi: Reduce N/A Aumenta N/A

Gz: Reduce N/A Aumenta N/A

Go: Reduce Aumenta Aumenta Reduce

Gq: N/A Aumenta N/A Reduce

: [0261] Es igualmente eficaz una construcción de proteína G que utiliza una 15 proteína Gq fusionada con una proteína Gs, Gi, Gz o Go. En algunas realizaciones, puede conseguirse una construcción de fusión preferida con una proteína Gq en la que los primeros seis (6) aminoácidos de la subunidad α de la proteína G (“Gαq”) se eliminan y los últimos cinco (5) aminoácidos en el extremo C de Gαq se reemplazan

: por los correspondientes aminoácidos de Gα de la proteína G de interés. Por ejemplo, una construcción de fusión puede tener una Gq (deleción de 6 aminoácidos) fusionada con una proteína Gi, dando como resultado una “construcción de fusión Gq/Gi”. Esta construcción de fusión forzará al receptor acoplado con Gi endógeno a acoplarse con su proteína G no endógena, Gq, de tal modo que pueda medirse el segundo mensajero, 5 por ejemplo trifosfato de inositol o diacilglicerol, en lugar de la producción de AMPc.

4. Transfección simultánea de un GPCR acoplado con Gi diana con un GPCR acoplado con Gs potenciador de la señal (ensayos basados en AMPc)

: [0262] El receptor acoplado con Gi es conocido por inhibir la adenilato ciclasa y, por lo tanto, reduce el nivel de producción de AMPc, lo que puede hacer un desafío la 10 valoración de los niveles de AMPc. En ciertas realizaciones, puede conseguirse una técnica eficaz para medir la reducción de la producción de AMPc, como indicación de la activación de un receptor que se acopla predominantemente con Gi tras la activación, mediante la transfección simultánea de un potenciador de señal, por ejemplo, un receptor no endógeno activado constitutivamente que se acopla 15 predominantemente con Gs tras la activación (por ejemplo, TSHR-A623I; véase a continuación), con el GPCR ligado a Gi. Como resulta evidente, la activación de un receptor acoplado con Gs puede determinarse basándose en un aumento de la producción de AMPc. La activación de un receptor acoplado con Gi conduce a una reducción de la producción de AMPc. Por tanto, el enfoque de transfección simultánea 20 se pretende que explote ventajosamente estos efectos “opuestos”. Por ejemplo, la transfección simultánea de un receptor acoplado con Gs no endógeno activado constitutivamente (el “potenciador de señal”) con el vector de expresión solo proporciona una señal de AMPc de valor de referencia (concretamente, aunque el receptor acoplado con Gi reducirá los niveles de AMPc, esta “reducción” será respecto 25 al aumento sustancial de los niveles de AMPc establecidos por el potenciador de señal acoplado con Gs activado constitutivamente). Entonces, al transfectar simultáneamente el potenciador de señal con el “receptor diana”, un agonista inverso del receptor diana acoplado con Gi, aumentará la señal de AMPc medida, mientras que un agonista del receptor diana acoplado con Gi reducirá esta señal. 30

: [0263] Los compuestos candidatos que se identifican directamente usando este enfoque deberán valorarse independientemente para asegurar que estos no se orientan al receptor potenciador de señal (esto puede hacerse antes o después del cribado frente a los receptores transfectados simultáneamente).

Composición/formulación y procedimientos de tratamiento

: [0264] Puede formularse un agonista de GPR119 en composiciones farmacéuticas y medicamentos usando técnicas bien conocidas en la técnica. La formulación apropiada depende de la vía de administración elegida. En ciertas realizaciones, dicha administración es a un vertebrado no humano o a un mamífero no humano. 5

: [0265] En lo referente a las terapias, los compuestos pueden administrarse de cualquier modo adecuado. Las vías de administración adecuadas incluyen administración oral, nasal, rectal, transmucosa, transdérmica o intestinal, suministro parenteral, incluyendo inyecciones intramusculares, subcutáneas, intramedulares, así como inyecciones intratecales, intraventriculares directas, intravenosas, 10 intraperitoneales, intranasales, intrapulmonares (inhalada) o intraoculares usando procedimientos conocidos en la técnica. Otras vías de administración adecuadas formulación en aerosol y de absorción prolongada. Se contemplan expresamente las formulaciones de liberación sostenida, particularmente de absorción prolongada, de los medicamentos de la invención. En ciertas realizaciones preferidas, los compuestos se 15 administran por vía oral. Los compuestos pueden constituirse en forma sólida o líquida, tal como comprimidos, cápsulas, polvos, jarabes, elixires y similares, aerosoles, disoluciones estériles, suspensiones o emulsiones y similares. En ciertas realizaciones, el agonista de GPR119 se administra por vía oral.

: [0266] Las formulaciones para administración oral pueden estar en forma de 20 disoluciones y suspensiones acuosas, además de formulaciones sólidas de comprimido y cápsula. Las disoluciones y suspensiones acuosas pueden prepararse a partir de polvos o gránulos estériles. Los compuestos pueden disolverse en agua, polietilenglicol, propilenglicol, etanol, aceite de maíz, aceite de semilla de algodón, aceite de cacahuete, aceite de sésamo, alcohol bencílico, cloruro de sodio y/o diversos 25 tampones. Son bien ampliamente conocidos en la técnica otros coadyuvantes.

: [0267] Las composiciones farmacéuticas del agonista de GPR119 pueden prepararse mediante procedimientos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante procesos de mezclado, disolución, granulación, formación de grageas, levigación, emulsión, encapsulación, atrapamiento, liofilización o secado por 30 pulverización.

: [0268] Las composiciones farmacéuticas pueden formularse de manera convencional usando uno o más portadores fisiológicamente aceptables que comprenden excipientes y auxiliares que facilitan el procesamiento de los compuestos

: activos en preparaciones que pueden usarse farmacéuticamente. Los portadores farmacéuticamente aceptables están disponibles para los expertos en la técnica (véanse, por ejemplo, “Remington: The Science and Practice of Pharmacy”, (Gennaro et al., eds.), 20ª edición, 2000, Lippincott Williams & Wilkins y “Handbook of Pharmaceutical Excipients” (Rowe et al., eds), 4ª edición, 2003, Pharmaceutical Press; 5 cuyas divulgaciones se incorporan a la presente como referencia en su totalidad). La formulación apropiada depende de la vía de administración elegida. El término material “portador” o material “excipiente” significa en la presente memoria cualquier sustancia, no un agente terapéutico en sí, usada como portador y/o diluyente y/o coadyuvante o vehículo para el suministro de un agente terapéutico a un sujeto o 10 añadida a una composición farmacéutica para mejorar sus propiedades de manejo o almacenamiento o para permitir o facilitar la formación de una dosis unitaria de la composición en un artículo discreto tal como una cápsula o comprimido adecuado para administración oral. Los excipientes pueden incluir, a modo de ilustración y no de limitación, diluyentes, disgregantes, agentes aglutinantes, adhesivos, agentes 15 humectantes, polímeros, lubricantes, deslizantes, sustancias añadidas para enmascarar o contrarrestar un sabor u olor desagradable, aromas, tintes, fragancias y sustancias añadidas para mejorar la apariencia de la composición. Los excipientes aceptables incluyen ácido esteárico, estearato de magnesio, óxido de magnesio, sales de sodio y calcio de ácidos fosfórico y sulfúrico, carbonato de magnesio, talco, gelatina, goma 20 arábiga, alginato de sodio, pectina, dextrina, manitol, sorbitol, lactosa, sacarosa, almidones, gelatina, materiales celulósicos tales como ésteres de celulosa de ácidos alcanoicos y ésteres alquílicos de celulosa, cera de bajo punto de fusión, manteca de cacao o polímeros en polvo tales como polivinilpirrolidona, poli(alcohol vinílico) y polietilenglicoles y otros materiales farmacéuticamente aceptables. Los componentes 25 de la composición farmacéutica pueden encapsularse o comprimirse para una administración conveniente.

: [0269] Farmacéuticamente aceptable designa aquellas propiedades y/o sustancias que son aceptables para el paciente desde un punto de vista farmacológico/toxicológico y para el químico farmacéutico fabricante desde un punto de vista físico/químico 30 respecto a composición, formulación, estabilidad, aceptación del paciente y biodisponibilidad.

: [0270] Se proporcionan recubrimientos adecuados a los núcleos de gragea. Con este fin, pueden usarse disoluciones concentradas de azúcar que pueden contener

: opcionalmente goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, gel carbopol, polietilenglicol y/o dióxido de titanio, disoluciones de lacado y disolventes orgánicos o mezclas de disolventes adecuados. Los tintes o pigmentos pueden añadirse a los comprimidos o recubrimientos de gragea para identificación o para caracterizar diferentes combinaciones de dosis de compuesto activo. 5

: [0271] Las composiciones farmacéuticas que pueden usarse por vía oral incluyen cápsulas duras hechas de gelatina, así como cápsulas blandas selladas hechas de gelatina y un plastificante, tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas duras pueden contener los ingredientes activos mezclados con una carga tal como lactosa, un aglutinante tal como almidón y/o un lubricante tal como talco o estearato de magnesio 10 y, opcionalmente, estabilizantes. En cápsulas blandas, los compuestos activos pueden disolverse o suspenderse en líquidos adecuados tales como aceites grasos, parafina líquida, polietilenglicoles líquidos, Cremophor, Capmul, mono-, di- o triglicéridos de cadena media o larga. Pueden añadirse también estabilizantes a estas formulaciones.

: [0272] Adicionalmente, puede suministrarse un agonista de GPR119 usando un 15 sistema de liberación sostenida. Se han establecido diversos materiales de liberación sostenida y son bien conocidos por los expertos en la técnica. Se prefieren particularmente los comprimidos o cápsulas de liberación sostenida. Por ejemplo, puede emplearse un material retardante temporal tal como monoestearato de glicerol o diestearato de glicerilo. La forma de dosificación puede recubrirse también mediante 20 las técnicas descritas en las patentes de EE.UU. nº 4.256.108, 4.166.452 y 4.265.874 para formar comprimidos terapéuticos osmóticos para liberación controlada.

: [0273] Se contempla expresamente que las terapias pueden administrarse o proporcionarse solas o en combinación con uno o más compuestos farmacéutica o fisiológicamente aceptables. Opcionalmente, el otro compuesto farmacéutica o 25 fisiológicamente aceptable no es un agonista de GPR119. Opcionalmente, el otro compuesto farmacéutica o fisiológicamente aceptable es un agente farmacéutico seleccionado del grupo constituido por calcio, vitamina D, estrógeno, tibolona, modulador selectivo de receptor de estrógeno (MSRE, por ejemplo, raloxifeno, tamoxifeno), bifosfonato (por ejemplo, etidronato, alendronato, risedronato), 30 calcitonina, metabolito 1α-hidroxilado de la vitamina D, fluoruro, tiazida, esteroide anabólico, ipriflavona, vitamina K, hormona paratiroidea (PTH), estroncio, estatina, osteoprotererina, agonista selectivo del receptor EP4, agonista selectivo de receptor de cannabinoide de tipo 2 (CB2) e inhibidor de MAP cinasa p38 (véase, por ejemplo, la

: Serie de informes técnicos de la Organización Mundial de la Salud 921 (2003), “Prevención y gestión de osteoporosis”).

: [0274] La presente solicitud describe una composición que comprende o consiste esencialmente en una cantidad de un agonista de GPR119. La presente solicitud describe una composición farmacéutica que comprende o consiste esencialmente en 5 una cantidad de un agonista de GPR119 y al menos un portador farmacéuticamente aceptable. La presente solicitud se refiere también a una forma de dosificación de la composición o de la composición farmacéutica en la que el agonista de GPR119 está en una cantidad suficiente para proporcionar un efecto en el tratamiento o la prevención de una afección caracterizada por una baja masa ósea, tal como 10 osteoporosis y/o en el aumento de la masa ósea en un individuo.

: [0275] La presente solicitud se refiere también a una forma de dosificación de la composición o de la composición farmacéutica en la que el agonista de GPR119 está en una cantidad suficiente para proporcionar un efecto en el aumento del nivel de GIP en un individuo. 15

: [0276] Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso según la presente invención incluyen composiciones en las que los ingredientes activos están contenidos en una cantidad para alcanzar su fin pretendido. En algunas realizaciones, se entiende que una composición farmacéutica es útil para tratar o prevenir una afección caracterizada por una baja masa ósea, tal como osteoporosis, o para aumentar la masa 20 ósea en un individuo. En algunas realizaciones, se entiende que una composición farmacéutica es útil para aumentar el nivel de GIP en un individuo. La determinación de la cantidad de agonista de GPR119 suficiente para alcanzar un fin pretendido está dentro de la capacidad de los expertos en la técnica, especialmente a la vista de la descripción detallada proporcionada en la presente memoria. 25

: [0277] Los datos obtenidos de estudios animales incluyendo, pero sin limitación, estudios que usan ratones, ratas, conejos, cerdos y primates no humanos, pueden usarse en la formulación de una serie de dosificaciones para uso en seres humanos. En general, un experto en la técnica entiende cómo extrapolar in vivo los datos obtenidos en un sistema de modelo animal a otro, tal como uno humano. En algunas 30 circunstancias, estas extrapolaciones pueden basarse meramente en el peso del modelo animal en comparación con otro, tal como un ser humano; en otras circunstancias, estas extrapolaciones no se basan simplemente en pesos, sino que en lugar de ello incorporan una variedad de factores. Los factores representativos incluyen el tipo,

: edad, peso, sexo, dieta y estado médico del paciente, la gravedad de la enfermedad, la vía de administración, consideraciones farmacológicas tales como la actividad, eficacia, perfiles farmacocinéticos y toxicológicos del compuesto particular empleado, si se utiliza un sistema de suministro de fármaco o si se está tratando un estado patológico agudo o crónico o si se realiza la profilaxis o si se administran compuestos 5 activos adicionales además de los compuestos de la presente invención y como parte de una combinación de fármacos. El régimen de dosificación para tratar una afección patológica con los compuestos y/o composiciones descritos en la presente memoria se selecciona según una variedad de factores como se citan anteriormente. Por tanto, el régimen de dosificación real empleado puede variar ampliamente y por lo tanto 10 desviarse del régimen de dosificación preferido, y un experto en la técnica reconocerá que pueden ensayarse una dosificación y un régimen de dosificación fuera de estos intervalos típicos y, cuando sea apropiado, pueden usarse en los procedimientos de esta invención.

: [0278] Es un sistema de modelo animal ejemplar el modelo de pérdida ósea por 15 ovariectomía de rata (OVX). La rata ovariectomizada es un modelo animal preclínico excelente que simula correctamente el importante rasgo clínico del esqueleto humano desprovisto de estrógeno y la respuesta a los agentes terapéuticos. En este modelo, se alcanza la eficacia terapéutica cuando la pérdida ósea asociada a la ovariectomía se previene parcial o completamente (véanse, por ejemplo, Bollag y col., Mol. Cell. 20 Endocrinol. (2001) 177: 35-41 y Jee y col., J. Musculoskel. Neuron. Interact. (2001) 1:193-207.) En ciertas realizaciones, la eficacia terapéutica se alcanza cuando la pérdida ósea asociada a la ovariectomía se previene al menos aproximadamente un 10%, al menos aproximadamente un 20%, al menos aproximadamente un 30%, al menos aproximadamente un 40%, al menos aproximadamente un 50%, al menos 25 aproximadamente un 60%, al menos aproximadamente un 70%, al menos aproximadamente un 75%, al menos aproximadamente un 80%, al menos aproximadamente un 85%, al menos aproximadamente un 90%, al menos aproximadamente un 95% o un 100%.

: [0279] Es un sistema de modelo animal ejemplar adicional el aumento del nivel de 30 GIP en sangre después de la aplicación de glucosa en ratones. En ciertas realizaciones, el nivel de GIP en sangre es el nivel de GIP en plasma. En ciertas realizaciones, el nivel de GIP es un nivel de GIP independiente de glucosa. En ciertas realizaciones, el nivel de GIP es el nivel de GIP dependiente de glucosa. En ciertas realizaciones, el

: GIP es GIP total. En ciertas realizaciones, el GIP total se mide usando un ensayo dirigido al centro o al extremo C. En ciertas realizaciones, el GIP es GIP bioactivo. En ciertas realizaciones, el GIP bioactivo se mide usando un ensayo específico de extremo N. En ciertas realizaciones, el GIP bioactivo tiene actividad para promover la formación ósea. En ciertas realizaciones, se alcanza la eficacia terapéutica cuando el 5 nivel de GIP en sangre aumenta en al menos aproximadamente un 10%, al menos aproximadamente un 25%, al menos aproximadamente un 50%, al menos aproximadamente un 100%, al menos aproximadamente un 150%, al menos aproximadamente un 200%, al menos aproximadamente un 300%, al menos aproximadamente un 400% o al menos aproximadamente un 500%. 10

: [0280] La cantidad e intervalo de dosificación pueden ajustarse para proporcionar el efecto terapéutico pretendido. Se apreciará que la dosificación exacta de agonista de GPR119 variará dependiendo del agonista de GPR119, su potencia, el modo de administración, la edad y peso del paciente y la gravedad de la afección a tratar. La formulación, vía de administración y dosificación exactas pueden elegirse por el 15 facultativo individual a la vista del estado del paciente. A modo de ilustración y no de limitación, la cantidad de agonista de GPR119 puede ser menor de aproximadamente 0,001 mg/kg de peso corporal, menor de aproximadamente 0,005 mg/kg de peso corporal, menor de aproximadamente 0,01 mg/kg de peso corporal, menor de aproximadamente 0,05 mg/kg de peso corporal, menor de aproximadamente 0,1 mg/kg 20 de peso corporal, menor de aproximadamente 0,5 mg/kg de peso corporal, menor de aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal, menor de aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal, menor de aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal, menor de aproximadamente 50 g/kg de peso corporal o menos de aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal. En ciertas realizaciones, la cantidad de agonista de GPR119 puede 25 ser menor de aproximadamente 0,001-100 mg/kg de peso corporal, menor de aproximadamente 0,001-50 mg/kg de peso corporal, menor de aproximadamente 0,001-10 mg/kg de peso corporal, menor de aproximadamente 0,001-5 mg/kg de peso corporal, menor de aproximadamente 0,001-1 mg/kg de peso corporal, menor de aproximadamente 0,001 a 0,5 mg/kg de peso corporal, menor de aproximadamente 30 0,001-0,1 mg/kg de peso corporal, menor de aproximadamente 0,001-0,05 mg/kg de peso corporal, menor de aproximadamente 0,001-0,01 mg/kg de peso corporal o menor de aproximadamente 0,001-0,005 mg/kg de peso corporal.

: [0281] Es un intervalo de dosificación preferido para la cantidad de modulador

: (por ejemplo un agonista de GPR119), que puede administrarse diaria o regularmente para alcanzar los resultados deseados, 0,1-100 mg/kg de masa corporal. Es otro intervalo de dosificación preferido 0,1-30 mg/kg de masa corporal. Es otro intervalo de dosificación preferido 0,1-10 mg/kg de masa corporal. Es otro intervalo de dosificación preferido 0,1-3,0 mg/kg de masa corporal. Por supuesto, estas 5 dosificaciones diarias pueden suministrarse o administrarse en cantidades pequeñas periódicamente durante el transcurso de un día. Se observa que estos intervalos de dosificación son solo intervalos preferidos y no se pretende que sean limitantes de la invención.

: [0282] La cantidad e intervalo de dosificación pueden ajustarse individualmente 10 para proporcionar niveles de agonista de GPR119 en plasma según la presente invención que alcancen el efecto terapéutico pretendido. Los intervalos de dosificación pueden determinarse también usando el valor para un intervalo seleccionado de concentración de agonista de GPR119, de modo que se alcance el efecto terapéutico pretendido. Debe administrarse un agonista de GPR119 usando un régimen que 15 mantenga los niveles en plasma dentro del intervalo seleccionado de concentración de agonista de GPR119 durante un 10-90% del tiempo, preferiblemente un 30-99% del tiempo, y lo más preferiblemente un 50-90% del tiempo. En casos de administración local o captación selectiva, el intervalo de concentración de agonista de GPR119 que proporciona el efecto terapéutico pretendido puede no estar relacionado con la 20 concentración en plasma.

: [0283] La cantidad de composición administrada dependerá, por supuesto, del individuo que se esté tratando, del peso del individuo, de la gravedad de la afección, del modo de administración y del criterio del facultativo que prescribe.

: [0284] Las afecciones caracterizadas por una baja masa ósea incluyen, pero sin 25 limitación, osteopenia, osteoporosis, artritis reumatoide, osteoartritis, enfermedad periodontal, pérdida ósea alveolar, pérdida ósea por osteotomía, pérdida ósea idiopática en la infancia, enfermedad de Paget, pérdida ósea debida a cáncer metastásico, lesiones osteolíticas, curvatura de la columna y pérdida de altura. En ciertas realizaciones, la afección caracterizada por una baja masa ósea es osteoporosis. 30 En ciertas realizaciones, la osteoporosis es osteoporosis primaria. En ciertas realizaciones, la osteoporosis es osteoporosis secundaria. Las afecciones caracterizadas por una baja masa ósea pueden incluir, pero sin limitación, complicaciones a largo plazo de la osteoporosis tales como curvatura de la columna, pérdida de altura y

: cirugía protésica. Se entiende que las afecciones caracterizadas por una baja masa ósea pueden incluirse en las realizaciones individualmente o en cualquier combinación. En ciertas realizaciones, la afección caracterizada por una baja masa ósea es osteoporosis primaria.

: [0285] En ciertas realizaciones, el individuo necesitado de masa ósea aumentada 5 tiene una densidad mineral ósea (DMO) mayor de 1 (puntuación de T < -1), mayor o igual a 1,5 (puntuación de T ≤-1,5), mayor o igual a 2 (puntuación de T ≤ -2) o mayor o igual a 2,5 (puntuación de T ≤-2,5) desviaciones estándar por debajo de la media de referencia de adulto joven. En ciertas realizaciones, el individuo necesitado de masa ósea aumentada está necesitado de tratamiento por fractura ósea. En ciertas 10 realizaciones, el individuo necesitado de tratamiento de una fractura ósea tiene una fractura ósea traumática, una fractura ósea a largo plazo o una fractura ósea osteoporótica. En ciertas realizaciones, el individuo está necesitado de tratamiento por una enfermedad ósea. En ciertas realizaciones, el individuo necesitado de tratamiento por una enfermedad ósea tiene osteopenia, osteoporosis, artritis reumatoide, 15 osteoartritis, enfermedad periodontal, pérdida ósea alveolar, pérdida ósea por osteotomía, pérdida ósea idiopática en la infancia, enfermedad de Paget, pérdida ósea debida a cáncer metastásico, lesiones osteolíticas, curvatura de la columna o pérdida de altura. En ciertas realizaciones, el individuo necesitado de tratamiento por enfermedad ósea tiene osteoporosis. En ciertas realizaciones, la osteoporosis es osteoporosis 20 primaria. En ciertas realizaciones, la osteoporosis es osteoporosis secundaria. Los trastornos óseos destructivos que pueden tratarse según la invención incluyen, pero sin limitación, osteoporosis, osteoartritis y lesiones osteolíticas tales como las causadas por enfermedad neoplásica, radioterapia o quimioterapia. En ciertas realizaciones, la osteoporosis es osteoporosis primaria. En ciertas realizaciones, la osteoporosis es 25 osteoporosis secundaria.

: [0286] Las terapias referentes a un agonista de GPR119 son adicionalmente útiles para potenciar la curación ósea después de reconstrucción facial, reconstrucción maxilar, reconstrucción mandibular, enfermedad periodontal o extracción de dientes, para potenciar la extensión de huesos largos, potenciar el crecimiento protésico o 30 aumentar la sinostosis ósea en un individuo.

: [0287] En ciertas realizaciones, el individuo es un vertebrado. En ciertas realizaciones, el individuo que es un vertebrado es un pez, un anfibio, un reptil, un ave o un mamífero. En ciertas realizaciones, el individuo o vertebrado es un mamífero. En

: ciertas realizaciones, el individuo o vertebrado que es un mamífero es un ratón, una rata, un hámster, un conejo, un cerdo, un perro, un gato, un caballo, una vaca, una oveja, una cabra, un mamífero no humano, un primate no humano o un ser humano. En ciertas realizaciones, el individuo es un ser humano. En ciertas realizaciones, el ser humano es una mujer postmenopáusica o un hombre de más de 50 años. 5

: [0288] Sin elaboraciones adicionales, se cree que un experto en la técnica puede, usando la descripción precedente, practicar la presente invención en su máxima extensión. La descripción detallada anterior se da por claridad de comprensión solo, y no debe entenderse una limitación innecesaria a partir de la misma, ya que las modificaciones dentro del alcance de la invención pueden resultar evidentes para los 10 expertos en la técnica.

: [0289] Esta solicitud reivindica el beneficio de la prioridad de la siguiente solicitud de patente provisional presentada mediante U.S. Express Mail en la Oficina de patentes y marcas de Estados Unidos en la fecha indicada: solicitud de patente provisional de EE.UU. nº 60/791.550, presentada el 11 de abril de 2006. 15

: [0290] A lo largo de esta aplicación, se citan diversas publicaciones, patentes y solicitudes de patente. La citación en la presente memoria por el solicitante de una publicación, patente o solicitud de patente no es una admisión por el solicitante de dicha publicación, patente o solicitud de patente como técnica anterior.

EJEMPLOS 20

: [0291] Sin elaboraciones adicionales, se cree que un experto en la técnica puede, usando la descripción precedente, practicar la presente invención en su máxima extensión. Los siguientes ejemplos detallados han de considerarse como meramente ilustrativos y no limitaciones de la divulgación precedente en modo alguno. Los expertos en la técnica reconocerán rápidamente variaciones apropiadas de los 25 procedimientos.

EJEMPLO 1: ANÁLISIS FARMACODINÁMICO DEL EFECTO DE LA ADMINISTRACIÓN DE UN AGONISTA DE GPR119 SOBRE EL NIVEL DE GIP EN SANGRE EN RATONES NO GENOMANIPULADOS

: [0292] A. Se hicieron ayunar ratones macho C57blk/6 durante 18 horas, y se 30 asignaron aleatoriamente a 14 grupos con n= 6 para cada grupo. Se administró por vía oral a los ratones vehículo (PET; 80% de PEG400, 10% de etanol, 10% de Tween 80) o un agonista de GPR119 según la presente invención (compuesto 1; (2-fluoro-4-metanosulfonilfenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)piperidin-1-il]-5-

: nitropirimidin-4-il}amina) a 20 mg/kg, como se indica en la Figura 1A. 30 minutos después del tratamiento, se suministró por vía oral un bolo de glucosa a 3 g/kg, y se recogió plasma a los 0 (sin bolo de glucosa), 2, 5, 10, 20, 40 y 60 minutos después del bolo de glucosa. Se determinaron los niveles de GIP en plasma usando un kit ELISA de GIP de roedor adquirido en Linco Research Laboratory [ELISA de polipéptido 5 inhibidor gástrico de rata/ratón (total), nº de catálogo EZRMGIP-55K], siguiendo las instrucciones proporcionadas por el fabricante. A partir de los resultados mostrados en la Figura 1A, resulta evidente que la administración del agonista de GPR119 aumentaba tanto el nivel de GIP dependiente de glucosa como independiente de glucosa en la sangre de los ratones. El compuesto 1 estimulaba el GIP en plasma total 10 en los ratones. El compuesto 1 es idéntico a un compuesto dado a conocer en la solicitud de patente internacional nº PCT/US2004/001267 (publicada como WO 2004/065380).

B. Se hicieron ayunar ratones macho C57blk/6 durante 18 horas, y se asignaron aleatoriamente a 14 grupos con n=6 para cada grupo. Se administró por vía oral a los 15 ratones vehículo (20% de hidroxipropil-β-ciclodextrina (HPCD)) o un agonista de GPR119 según la presente invención (compuesto 3) a 10 mg/kg, como se indica en la Figura 1B. 30 minutos después del tratamiento, se suministró por vía oral un bolo de glucosa a 3 g/kg, y se recogió plasma a los 0 (sin bolo de glucosa), 5, 10, 20, 60 y 120 minutos después del bolo de glucosa. Se determinaron los niveles de GIP en plasma 20 usando un kit ELISA de GIP de roedor adquirido en Linco Research Laboratory [ELISA de polipéptido inhibidor gástrico de rata/ratón (total), nº de catálogo EZRMGIP-55K], siguiendo las instrucciones proporcionadas por el fabricante. Se efectuó el análisis estadístico usando el programa Excel. Se calcularon los valores medios de la concentración de GIP basándose en los resultados de 6 ratones de cada 25 grupo y se mostró como media ± DEM. A partir de los resultados mostrados en la Figura 1B, resulta evidente que la administración del agonista de GPR119 aumentaba tanto el nivel de GIP dependiente de glucosa como independiente de glucosa en la sangre de los ratones. El compuesto 3 estimulaba el GIP en plasma total en los ratones. El compuesto 3 es idéntico a un compuesto dado a conocer en la solicitud de 30 patente internacional nº PCT/US2004/022327 (publicada como WO 2005/007647).

C. Se hicieron ayunar ratones macho C57blk/6 durante 18 horas, y se asignaron aleatoriamente a 14 grupos con n=6 para cada grupo. Se administró a los ratones por vía oral vehículo (20% de hidroxipropil-β-ciclodextrina (HPCD)) o un agonista de

GPR119 según la presente invención (compuesto 3) a 1, 3 o 10 mg/kg. 30 minutos después del tratamiento, se suministró por vía oral un bolo de glucosa a 3 g/kg, y se recogió plasma a los 0 (sin bolo de glucosa) o 5 minutos después del bolo de glucosa. Se determinaron los niveles de GIP en plasma usando un kit ELISA de GIP adquirido en Linco Research Laboratory [ELISA de péptido inhibidor gástrico de rata/ratón 5 (total) nº de catálogo EZRMGIP-55K], siguiendo las instrucciones proporcionadas por el fabricante. Se efectuó el análisis estadístico usando el programa Excel. Se calcularon los valores medios de concentración de GIP basándose en los resultados de 6 ratones de cada grupo y se muestran en la Figura 1C. A partir de la Figura 1C, resulta evidente que el agonista de GPR119 (compuesto 3) estimulaba el GIP total en plasma 10 de manera dependiente de la dosis. El compuesto 3 es idéntico a un compuesto dado a conocer en la solicitud de patente internacional nº PCT/US2004/022327 (publicada como WO 2005/007647).

EJEMPLO 2: EFECTO DE LA ADMINISTRACIÓN DE AGONISTA DE GPR119 SOBRE EL NIVEL DE GIP EN SANGRE EN RATONES 15 DEFICIENTES EN GPR119 (CON INACTIVACIÓN GÉNICA) EN COMPARACIÓN CON RATONES NO GENOMANIPULADOS

: [0293] A. Se hicieron ayunar ratones macho deficientes en GPR119 y compañeros de camada de tipo no genomanipulado durante 18 horas. Se administró a los ratones por vía oral vehículo (PET; 80% de PEG400, 10% de etanol, 10% de Tween 80) o un 20 agonista de GPR119 según la presente invención (Compuesto 1: (2-fluoro-4-metanosulfonilfenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)piperidin-1-il]-5-nitropirimidin-4-il}amina) a 20 mg/kg, como se indica (n=5). 30 minutos después del tratamiento, se recogió sangre (100 µl) por la vena retroorbital del ojo (tiempo 0) seguido de un bolo de glucosa a 3 g/kg (vía oral). 5 minutos después de suministrar la 25 glucosa, se recogió otra muestra de sangre (100 µl) (tiempo 5 minutos). Se recogió plasma después de la centrifugación y se determinaron los niveles de GIP usando un kit ELISA de GIP de roedor adquirido en Linco Research Laboratory [ELISA de polipéptido inhibidor gástrico de rata/ratón (total) nº de catálogo EZRMGIP-55K], siguiendo las instrucciones proporcionadas por el fabricante. A partir de los resultados 30 mostrados en la Figura 2A, resulta evidente que el receptor GPR119 funcional era necesario para que la administración del agonista de GPR119 aumentara el nivel de GIP independiente de glucosa y dependiente de glucosa en la sangre de los ratones. El compuesto 1 estimulaba el GIP total en plasma en los ratones no genomanipulados. El

: compuesto 1 es idéntico a un compuesto dado a conocer en la solicitud de patente internacional nº PCT/US2004/001267 (publicada como WO 2004/065380).

B. Se hicieron ayunar ratones macho deficientes en GPR119 y compañeros de camada no genomanipulados durante 18 horas. Se administró a los ratones por vía oral vehículo (40% de hidroxipropil-β-ciclodextrina (HPCD)) o un agonista de GPR119 5 según la presente invención (compuesto 2) a 30 mg/kg, como se indica (n=5). 30 minutos después del tratamiento, se recogió sangre (100 µl) por la vena retroorbital del ojo (tiempo 0) seguido de un bolo de glucosa a 3 g/kg (vía oral). 5 minutos después de suministrar la glucosa, se recogió otra muestra de sangre (100 µl) (tiempo 5 minutos). Se recogió plasma después de centrifugación y se determinaron los niveles de GIP 10 usando un kit ELISA de GIP de roedor adquirido en Linco Research Laboratory [ELISA de polipéptido inhibidor gástrico (total) de rata/ratón nº de catálogo EZRMGIP-55K], siguiendo las instrucciones proporcionadas por el fabricante. Se calcularon los valores medios de GIP basándose en los resultados de 5 ratones de cada grupo. A partir de los resultados mostrados en la Figura 2B, resulta evidente que el 15 receptor GPR119 funcional era necesario para que el agonista de GPR199 administrado aumentara el nivel independiente de glucosa y el nivel dependiente de glucosa de GIP en la sangre de los ratones. El compuesto 2 estimulaba el GIP total en plasma en los ratones no genomanipulados. El compuesto 2 es idéntico a un compuesto dado a conocer en la solicitud de patente internacional nº 20 PCT/US2004/022417 (publicada como WO2005/007658).

EJEMPLO 3: EFECTO DE LA ADMINISTRACIÓN DE AGONISTA DE GPR119 SOBRE LA MASA ÓSEA DE RATAS OVARIECTOMIZADAS

: [0294] Puede mostrarse que un agonista de GPR119 según la presente invención es eficaz para tratar o prevenir una afección caracterizada por una baja masa ósea, tal 25 como osteoporosis, y/o aumentar la masa ósea en un individuo usando el modelo de rata in vivo ovariectomizada (OVX) descrito a continuación (véase, por ejemplo, Bollag y col., Mol. Cell. Endocrinol. (2001) 177:35-41).

: [0295] Se adquieren 20 ratas Sprague-Dawley hembra OVX vírgenes y 20 ratas no OVX vírgenes (150-175 g) de 8 semanas de edad en Harlan Sprague-Dawley, Inc. 30 (Indianápolis, IN). Se alimentan los animales a voluntad con una dieta de aglomerados comerciales normales, dieta Teklab Rodent (1,46% de calcio) con libre acceso al agua. Se dividen aleatoriamente las ratas en cuatro grupos experimentales de peso coincidente y se seleccionan para recibir por vía oral vehículo o un agonista de

: GPR119 según la presente invención. Se continúa el tratamiento diariamente durante 6 semanas.

1. Control. Se administra vehículo a 10 ratas no OVX por vía oral.

2. Control + tratamiento. Se administra agonista de GPR119 a 10 ratas no OVX por vía oral. 5

3. OVX. Se administra vehículo a 10 ratas OVX por vía oral.

4. OVX + tratamiento. Se administra agonista de GPR119 a 10 ratas OVX por vía oral.

Se pesan diariamente las ratas y se mide la longitud en el valor de referencia y de nuevo a las 6 semanas. Se efectúa una absorciometría de rayos X de energía dual 10 (DXA) usando un Hologic QDR 1000/W (Waltham, MA) en todos los animales antes del inicio del tratamiento y a las 6 semanas, y se analizan los datos usando el software Rat Whole Body versión 5.53. Se determina la densidad mineral ósea (DMO) en la columna.

: [0296] Se determina el cambio porcentual de densidad ósea vertebral después de 6 15 semanas de tratamiento. Se muestra que la administración de un agonista de GPR119 atenúa los efectos negativos de la ovariectomía sobre la densidad ósea vertebral. La atenuación de los efectos negativos de la ovariectomía sobre la densidad ósea vertebral es indicativa de que el tratamiento tiene eficacia en el tratamiento o la prevención de una afección caracterizada por una baja masa ósea, tal como osteoporosis, y/o en el 20 aumento de la masa ósea en un individuo.

EJEMPLO 4: EFECTO DE LA ADMINISTRACIÓN DE AGONISTA DE GPR119 SOBRE LA CURACIÓN DE UNA FRACTURA ÓSEA

: [0297] Puede mostrarse que un agonista de GPR119 según la presente invención es eficaz en el tratamiento de una fractura ósea usando el ensayo in vivo descrito a 25 continuación.

Técnica de fractura

: [0298] Se anestesiaron ratas Sprague-Dawley de 3 meses de edad con ketamina. Se hizo una incisión de 1 cm en la cara anteromedial de la parte proximal de la tibia o fémur derecho. A continuación, se describe la técnica quirúrgica tibial. Se lleva a cabo 30 la incisión hasta el hueso, y se perfora un orificio de 1 mm a 4 mm proximal de la cara distal de la tuberosidad tibial, 2 mm medial de la cresta anterior. Se efectúa la perforación intramedular con un tubo de acero inoxidable de 0,8 mm (carga máxima 36,3 N, rigidez máxima 61,8 N/mm, ensayado en las mismas condiciones que los

: huesos). No se efectúa ensanchamiento del canal medular. Se produce una fractura cerrada estandarizada 2 mm por encima de la articulación tibioperonea mediante doblado de tres puntos usando fórceps ajustables diseñados especialmente con mandíbulas romas. Para minimizar el daño al tejido blando, se tiene cuidado de no desplazar la fractura. Se cierra la piel con suturas de nailon monofilamentoso. Se 5 efectúa la operación en condiciones estériles. Se toman radiografías de todas las fracturas inmediatamente después de perforar, y se excluyen las ratas con fracturas fuera de la zona diafisaria o con perforaciones desplazadas. Se dividen los animales restantes aleatoriamente en los siguientes grupos con 10-12 animales por cada subgrupo por punto temporal para ensayar la curación de fractura. Se administra a las 10 ratas diariamente por vía oral vehículo o un agonista de GPR119. Se usa el agonista de GPR119 a una cantidad entre 0,00 mg/kg de peso corporal y 100 mg/kg de peso corporal. Se continúa el tratamiento durante 10, 20, 40 y 80 días.

: [0299] A los 10, 20, 40 y 80 días, se anestesian 10-12 ratas de cada grupo con ketamina y se sacrifican mediante desangrado. Se retiran ambos huesos tiobioperoneos 15 mediante disección y se extrae todo el tejido blando. Se almacenan huesos de 5-6 ratas por cada grupo en etanol al 70% para análisis histológico y se almacenan huesos de otras 5-6 ratas por cada grupo en disolución de Ringer tamponada (+4ºC, pH 7,4) para efectuar radiografías y ensayo biomecánico.

Análisis histológico 20

: [0300] Los procedimientos para análisis histológico de hueso fracturado se han publicado anteriormente por Mosekilde y Bak (Bone (1993) 14:19-27). Brevemente, se sierra el sitio de fractura 8 mm a cada lado de la línea de fractura, se embebe descalcificado en metacrilato de metilo y se cortan secciones frontales con un microtomo Polycut de Reichert-Jung a 8 µm de grosor. Se usan secciones medias-25 frontales teñidas con Masson-Trichome (incluyendo tibia y peroné) para la visualización de la respuesta celular y de tejido a la curación de fractura con y sin tratamiento. Se usan secciones teñidas con rojo Sirio para demostrar las características de la estructura de callo y para diferenciar entre el hueso reticular y el hueso lamelar en el sitio de fractura. Se efectúan las siguientes medidas: (1) hueco de fractura, medido 30 como la distancia más corta entre los extremos del hueso cortical en la fractura, (2) longitud de callo y diámetro de callo; (3) volumen óseo total de la zona del callo, (4) tejido óseo por zona de tejido dentro de la zona de callo, (5) tejido fibroso en el callo y (6) zona de cartílago en el callo.

Análisis biomecánico

: [0301] Los procedimientos para análisis biomecánico se han publicado anteriormente por Bak y Andreassen (Calcif. Tissue Int. (1989) 45: 292-297). Brevemente, se toman radiografías de todas las fracturas antes del ensayo biomecánico. Se analizan las propiedades mecánicas de las fracturas en curación 5 mediante un procedimiento de doblado destructivo de tres o cuatro puntos. Se determinan carga máxima, rigidez, energía a la carga máxima, deflexión a la carga máxima y tensión máxima.

EJEMPLO 5

CLONACIÓN COMPLETA DE GPR119 HUMANO ENDÓGENO 10

: [0302] Se clonó polinucleótido que codifica GPR119 humano endógeno mediante PCR usando los cebadores específicos de GPR119 5’-GTCCTGCCACTTCGAGACATGG-3’ (SEQ ID NO:3; codificante, ATG como codón de inicio) 5’-GAAACTTCTCTGCCCTTACCGTC-3’ (SEQ ID NO:4; no codificante, 3’ del codón de terminación) y ADN genómico humano como molde. Se 15 usó ADN polimerasa TaqPlus Precision™ (Stratagene) para la amplificación mediante el siguiente ciclo, con la etapa 2 a etapa 4 repetida 35 veces:

94ºC, 3 minutos; 94ºC, 1 minuto; 58ºC, 1 minuto; 72ºC, 2 minutos; 72ºC, 10 minutos.

Se aisló un fragmento de PCR de 1,0 kb del tamaño predicho, se clonó en el 20 vector pCRII-TOPO™ (Invitrogen) y se secuenció completamente usando el kit de ADN secuenasa de T7 (Amersham). Véase la SEQ ID NO: 1 para la secuencia de ácido nucleico y la SEQ ID NO: 2 para la secuencia aminoacídica deducida.

EJEMPLO 6

EXPRESIÓN DE RECEPTOR 25

: [0303] Aunque están disponibles una variedad de células en la técnica para la expresión de receptores acoplados con proteína G, lo más preferido es utilizar células eucarióticas. En ciertas realizaciones, se utilizan células de mamífero o melanóforos. Lo siguiente es ilustrativo; los expertos en la técnica tienen la capacidad de determinar aquellas técnicas que sean preferiblemente beneficiosas para las necesidades del 30 experto. Véase, por ejemplo, el Ejemplo 9 a continuación, en que se refiere a melanóforos.

a. Transfección transitoria

: [0304] El día 1, se siembran 6x106 células 293/disco de 10 cm. El día 2, se

: preparan dos tubos de reacción (las proporciones a seguir para cada tubo son por placa): se prepara el tubo A mezclando 4 µg de ADN (por ejemplo, vector pCMV; vector pCMV con ADNc receptor, etc.) en 0,5 ml de DME exento de suero (Gibco BRL); se prepara el tubo B mezclando 24 µl de lipofectamina (Gibco BRL) en 0,5 ml de DMEM exento de suero. Se mezclan los tubos A y B mediante inversiones (varias 5 veces), seguido de incubación a temperatura ambiente durante 30-45 min. Se designa la mezcla como la “mezcla de transfección”. Se lavan las células 293 sembradas con 1XPBS, seguido de la adición de 5 ml de DMEM exento de suero. Se añade 1 ml de la mezcla de transfección a las células, seguido de incubación durante 4 h a 37ºC/5% d CO2. Se retira la mezcla de transfección por aspiración, seguido de la adición de 10 ml 10 de DMEM/10% de suero fetal bovino. Se incuban las células a 37C/5% de CO2. Después de 48 h de incubación, se recogen las células y se utilizan para análisis.

b. Líneas celulares estables

: [0305] Se siembran aproximadamente 12x106 células 293 en una placa de cultivo de tejido de 15 cm. Se cultivan en medio DME rico en glucosa que contiene un 10% de 15 suero fetal bovino y 1% de piruvato de sodio, L-glutamina y antibióticos. 24 horas después de sembrar las células 293 (o a ~80% de confluencia), se transfectan las células usando 12 µg de ADN (por ejemplo, vector pCMV-neor con ADNc de receptor). Se combinan los 12 µg de ADN con 60 µl de lipofectamina y 2 ml de medio DME rico en glucosa sin suero. Se aspira el suero de las placas y se lavan las células 20 una vez con medio sin suero. Se añaden el ADN, lipofectamina y mezcla de medio a la placa junto con 10 ml de medio sin suero. Después de incubar a 37ºC durante 4 a 5 horas, se aspira el medio y se añaden 25 ml de medio que contiene suero. 24 horas después de la transfección, se aspira el medio de nuevo, y se añade medio reciente sin suero. 48 horas después de la transfección, se aspira el medio y se añade medio con 25 suero que contiene geneticina (fármaco G418) a una concentración final de aproximadamente. Se siembran aproximadamente 12x106 células 293 en una placa de cultivo de tejido de 15 cm. Se cultivan en medio DME rico en glucosa que contiene un 10% de suero fetal bovino y 1% de piruvato de sodio, L-glutamina y antibióticos. 24 horas después de sembrar las células 293 (o a ~80% de confluencia), se transfectan las 30 células usando 12 µg de ADN (por ejemplo, vector pCMV con ADNc de receptor). Se combinan los 12 µg de ADN con 60 µl de lipofectamina y 2 ml de medio DME rico en glucosa sin suero. Se aspira el suero de las placas y se lavan las células una vez con medio sin suero. Se añaden el ADN, lipofectamina y mezcla de medio a la placa junto

: con 10 ml de medio sin suero. Después de incubar a 37ºC durante 4 a 5 horas, se aspira el medio y se añaden 25 ml de medio que contiene suero. 24 horas después de la transfección, se aspira el medio de nuevo, y se añade medio reciente sin suero. 48 horas después de la transfección, se aspira el medio y se añade medio con suero que contiene geneticina (fármaco G418) a una concentración final de 500 µg/ml. Las 5 células transfectadas experimentan ahora la selección de células transfectadas positivamente que contienen el gen de resistencia a G418. Se reemplaza el medio cada 4 a 5 días a medida que ocurre la selección. Durante la selección, se cultivan las células para crear conjuntos estables, o se dividen para una selección clonal estable.

EJEMPLO 7 10

ENSAYOS PARA CRIBAR COMPUESTOS CANDIDATOS COMO, POR EJEMPLO, AGONISTAS DE GPR119

: [0306] Están disponibles una variedad de enfoques para cribar compuestos candidatos como, por ejemplo, agonistas de GPR119. Lo siguiente es ilustrativo: los expertos en la técnica tienen la capacidad de determinar aquellas técnicas que sean 15 preferiblemente beneficiosas para las necesidades del experto. Los ensayos para cribar compuestos como agonistas de receptor acoplado con proteína G son bien conocidos por el experto (véase, por ejemplo, la solicitud internacional WO 02/42461).

1. Ensayos de unión a membrana: ensayo de [35S]GTPγS

: [0307] Cuando un receptor acoplado con proteína G está en estado inactivo, como 20 resultado de unión de ligando o de activación constitutiva, el receptor se acopla con una proteína G y estimula la liberación de GDP y la posterior unión de GTP a la proteína G. La subunidad alfa del complejo de proteína G-receptor actúa como GTPasa e hidroliza lentamente el GTP a GDP, en cuyo punto normalmente se desactiva el receptor. Los receptores activados continúan intercambiando GDP por GTP. Puede 25 utilizarse el análogo de GTP no hidrolizable, [35S]GTPγS, para demostrar la unión potenciada de [35S]GTPγS a membranas que expresan receptores activados. La ventaja de usar la unión de [35S]GTPγS para medir la activación es que: (a) es aplicable genéricamente a todos los receptores acoplados con proteína G; (b) está próximo a la superficie de membrana, haciendo menos probable recoger moléculas que afecten a la 30 cascada intracelular.

: [0308] El ensayo utiliza la capacidad de los receptores acoplados con proteína G de estimular la unión de [35S]GTPγS a membranas que expresan los receptores relevantes. El ensayo es genérico y tiene aplicación en el descubrimiento de fármacos

: en todos los receptores acoplados con proteína G.

Preparación de membrana

: [0309] En algunas realizaciones, las membranas que comprenden un receptor acoplado con proteína G de la invención y para uso en la identificación de compuestos candidatos como, por ejemplo, agonistas del receptor, se preparan preferiblemente 5 como sigue:

a. Materiales

: [0310] El “tampón de raspado de membrana” está compuesto por HEPES 20 mM y EDTA 10 mM, pH 7,4; el "tampón de lavado de membrana” está compuesto por HEPES 20 mM y EDTA 0,1 mM, pH 7,4, el “tampón de unión” está compuesto por 10 HEPES 20 mM, NaCl 100 mM y MgCl2 10 mM, pH 7,4.

b. Procedimiento

: [0311] Se mantendrán todos los materiales en hielo a lo largo del procedimiento. En primer lugar, se aspirarán los medios de una monocapa confluente de células, seguido de aclarado con 10 ml de PBS frío, seguido de aspiración. Después de ello, se 15 añadirán 5 ml de tampón de raspado de membrana a las células raspadas; seguirá a esto la transferencia de extracto celular a tubos de centrífuga de 50 ml (centrifugados a 20.000 rpm durante 17 minutos a 4ºC). Después de ello, se aspirará el sobrenadante y se resuspenderá el sedimento en 30 ml de tampón de lavado de membrana, seguido de centrifugación a 20.000 rpm durante 17 minutos a 4ºC. Se aspirará entonces el 20 sobrenadante y se resuspenderá el sedimento en tampón de unión. Se homogeneizará entonces éste usando un homogeneizador Brinkman Polytron™ (ráfagas de 15-20 segundos hasta que todo el material esté en suspensión). Esto se designa en la presente memoria como “proteína de membrana”.

Ensayo de proteína de Bradford 25

: [0312] Después de la homogeneización, se determinará la concentración de proteína de las membranas usando el ensayo de proteína de Bradford (la proteína puede diluirse aproximadamente a 1,5 mg/ml, tomarse alícuotas y congelarse (-80ºC) para uso posterior; cuando está congelada, el protocolo para uso será el siguiente: el día del ensayo, se descongela la proteína de membrana congelada a temperatura 30 ambiente, seguido de agitación con vórtex y se homogeneiza entonces con un Polytron aproximadamente a 12 x 1.000 rpm durante aproximadamente 5-10 segundos; se observa que, para múltiples preparaciones, el homogeneizador debe limpiarse concienzudamente entre la homogeneización de preparaciones diferentes).

a. Materiales

: [0313] Se utilizarán tampón de unión (como anteriormente), reactivo de tinción de Bradford y patrón de proteína de Bradford siguiendo las instrucciones del fabricante (Biorad, nº de cat. 500-0006).

b. Procedimiento 5

: [0314] Se prepararán tubos por duplicado, uno que incluye la membrana y otro como “blanco” de control. Cada uno contendrá 800 µl de tampón de unión. Después de ello, se añadirán 10 µl de patrón de proteína de Bradford (1 mg/ml) a cada tubo, y se añadirán entonces 10 µl de proteína de membrana a solo un tubo (no el blanco). Después de ello, se añadirán 200 µl de reactivo de tinción de Bradford a cada tubo, 10 seguido de agitación con vórtex de cada uno. Después de cinco (5) minutos, se volverán a agitar con vórtex los tubos y se transferirá el material en los mismos a cubetas. Se leerán entonces las cubetas usando un espectrofotómetro CECIL 3041, a una longitud de onda de 595.

Ensayo de identificación 15

a. Materiales

: [0315] El tampón de GDP consiste en 37,5 ml de tampón de unión y 2 mg de GDP (Sigma, nº de cat. G-7127), seguido de una serie de diluciones en tampón de unión para obtener GDP 0,2 µM (la concentración final de GDP en cada pocillo era GDP 0,1 µM); cada pocillo que comprende un compuesto candidato tiene un volumen final de 20 200 µl constituidos por 100 µl de tampón de GDP (concentración final, GDP 0,1 µM), 50 µl de proteína de membrana en tampón de unión y 50 µl de [35S]GTPγS (0,6 nM) en tampón de unión (2,5 µl de [35S]GTPγS por 10 ml de tampón de unión).

b. Procedimiento

: [0316] Los compuestos candidatos se cribarán preferiblemente usando un formato 25 de placa de 96 pocillos (estos pueden congelarse a -80ºC). Se homogeneizará brevemente la proteína de membrana (o membranas con vector de expresión, excluyendo el GPCR diana, como control) hasta la suspensión. Se determinará entonces la concentración de proteína usando el ensayo de proteína de Bradford expuesto anteriormente. Se diluirá entonces la proteína de membrana (y control) a 0,25 30 mg/ml en tampón de unión (concentración de ensayo final, 12,5 µg/pocillo). Después de ello, se añadieron 100 µl de tampón de GDP a cada pocillo de un Wallac Scintistrip™ (Wallac). Se usará entonces una herramienta de aguja de 5 µl para transferir 5 µl de un compuesto candidato a dicho pocillo (concretamente, 5 µl de

: volumen de ensayo total de 200 µl es una relación de 1:40, de tal modo que la concentración de cribado final del compuesto candidato es de 10 µM). De nuevo, para evitar contaminación, después de cada etapa de transferencia debe aclararse la herramienta de aguja en tres depósitos que comprenden agua (1 vez), etanol (1 vez) y agua (2 veces), el exceso de líquido debe agitarse de la herramienta después de cada 5 aclarado y secarse con papel y toallitas. Después de ello, se añadirán 50 µl de proteína de membrana a cada pocillo (se utilizó también un pocillo de control que comprendía membranas sin el GPCR diana) y se preincubó durante 5-10 minutos a temperatura ambiente. Después de ello, se añadirán 50 µl de [35S]GTPγS (0,6 nM) en tampón de unión a cada pocillo, seguido de incubación en un agitador durante 60 minutos a 10 temperatura ambiente (de nuevo, en este ejemplo las placas se cubrieron con lámina). Se detendrá entonces el ensayo centrifugando las placas a 4000 rpm durante 15 minutos a 22ºC. Se aspirarán entonces las placas con un colector de 8 canales y se sellarán con cubiertas de placas. Se leerán entonces las placas en un Wallac 1450 ajustado a “Prot. Nº 37” (según las instrucciones del fabricante). 15

2. Ensayo de adenilato ciclasa

: [0317] Puede modificarse un kit de adenilato ciclasa Flash Plate™ (New England Nuclear; nº de cat. SMP004A) diseñado para ensayos basados en célula para uso con membranas plasmáticas brutas. Los pocillos de la Flash Plate pueden contener un recubrimiento de centelleo que contiene también un anticuerpo específico que 20 reconoce AMPc. El AMPc generado en los pocillos puede cuantificarse mediante una competición directa por la unión de trazador de AMPc radiactivo con el anticuerpo de AMPc. Lo siguiente sirve como un breve protocolo para la medida de los cambios de los niveles de AMPc en células que expresan los receptores.

: [0318] En ciertas realizaciones, se utiliza un kit de adenilato ciclasa Flash Plate™ 25 modificado (New England Nuclear; nº de cat. SMP004A) para la identificación de compuestos candidatos como, por ejemplo agonistas de GPR119, según el siguiente protocolo.

: [0319] Se recogen las células transfectadas con un receptor acoplado con proteína G de la invención aproximadamente tres días después de la transfección. Se preparan 30 las membranas mediante la homogeneización de células suspendidas en tampón que contiene HEPES 20 mM, pH 7,4 y MgCl2 10 mM. Se efectúa la homogeneización en hielo usando un Brinkman Polytron™ durante aproximadamente 10 segundos. Se centrifuga el homogeneizado resultante a 49.000 x g durante 15 minutos a 4ºC. Se

: resuspende entonces el sedimento resultante en tampón que contiene HEPES 20 mM, pH 7,4 y EDTA 0,1 mM, se homogeneiza durante 10 segundos, seguido de centrifugación a 49.000 x g durante 15 minutos a 4ºC. Se almacena entonces el sedimento resultante a -80ºC hasta su uso. El día del cribado de identificación directa, se descongela lentamente el sedimento de membrana a temperatura ambiente, se 5 resuspende en tampón que contiene HEPES 20 mM, pH 7,4 y MgCl2 10 mM, proporcionando una concentración de proteína final de 0,60 mg/ml (las membranas resuspendidas se disponen en hielo hasta su uso).

: [0320] Se preparan patrones de AMPc y tampón de detección (que comprende 2 µCi de trazador ([125I]-AMPc (100 µl) en 11 ml de tampón de detección)) y se 10 mantienen según las instrucciones del fabricante. Se preparó tampón de ensayo reciente para cribado que contenía HEPES 20 mM, pH 7,4, MgCl2 10 mM, fosfocreatina 20 mM (Sigma), creatina fosfocinasa 0,1 unidades/ml (Sigma), GTP 50 µM (Sigma) y ATP 0,2 mM (Sigma); se almacenó entonces el tampón de ensayo en hielo hasta su utilización. 15

: [0321] Se añaden los compuestos candidatos, preferiblemente, por ejemplo a pocillos de placa de 96 pocillos (3 µl/pocillo; concentración de ensayo final 12 µM), junto con 40 µl de proteína de membrana (30 µg/pocillo) y 50 µl de tampón de ensayo. Se incubó entonces esta mezcla durante 30 minutos a temperatura ambiente con agitación suave. 20

: [0322] Después de la incubación, se añaden 100 µl de tampón de detección a cada pocillo, seguido de incubación durante 2-24 horas. Se realiza entonces un recuento de placas en un lector de placas Wallac MicroBeta™ usando “Prot. Nº 31” (según las instrucciones del fabricante).

3. Ensayo del indicador CRE-Luc 25

: [0323] Se siembran células 293 y 293T en placas de 96 pocillos a una densidad de 2 x 104 células por pocillo y se transfectaron usando el reactivo lipofectamina (BRL) al día siguiente según las instrucciones del fabricante. Se prepara una mezcla de ADN/lípido para cada transfección de 6 pocillos como sigue: se mezclan suavemente 260 ng de ADN de plásmido en 100 µl de DMEM con 2 µl de lípido en 100 µl de 30 DMEM (los 260 ng de ADN de plásmido consisten en 200 ng de un plásmido indicador 8xCRE-Luc, 50 ng de pCMV que comprende un receptor acoplado con proteína G de la invención o pCMV solo, y 10 ng de un plásmido de expresión de GPRS (GPRS en pcDNA3 (Invitrogen)). Se preparó el plásmido indicador 8XCRE-

: Luc como sigue: se obtuvo el vector SRIF-β-gal mediante clonación del promotor de somatostatina de rata (-71/+51) en el sitio BgIV-HindIII del vector pβgal-Basic (Clontech). Se obtuvieron ocho (8) copias de elemento de respuesta de AMPc mediante PCR a partir de un molde de adenovirus AdpCF126CCRE8 [véase Suzuki y col., Hum. Gene Ther. (1996) 7: 1883-1893; cuya divulgación se incorpora a la 5 presente como referencia en su totalidad) y se clonaron en el vector SRIF-β-gal en el sitio Kpn-BgIV, dando como resultado el vector indicador 8xCRE-β-gal. Se generó el plásmido indicador 8xCRE-Luc reemplazando el gen de beta-galactosidasa en el vector indicador 8xCRE-β-gal por el gen de luciferasa obtenido a partir del vector pGL3-basic (Promega) en el sitio HindIII-BamHI. Después de 30 min. de incubación a 10 temperatura ambiente, se diluye la mezcla de ADN/lípido con 400 µl de DMEM y se añaden 100 µl de la mezcla diluida a cada pocillo. Se añaden 100 µl de DMEM con 10% de FCS a cada pocillo después de una incubación de 4 h en un incubador de cultivo celular. Al día siguiente, se cambian las células transfectadas a 200 µl/pocillo de DMEM con 10% de FCS. Ocho (8) horas después, se cambian los pocillos a 100 15 µl/pocillo de DMEM sin rojo fenol, después de un lavado con PBS. Se mide la actividad luciferasa el día siguiente usando el kit de ensayo de gen indicador LucLite™(Packard) siguiendo las instrucciones del fabricante y se lee en un contador de centello y luminiscencia 1450 MicroBeta™ (Wallac).

EJEMPLO 8: ENSAYO DE ADENILATO CICLASA DE CÉLULA ENTERA, 20 POR EJEMPLO; PARA ACTIVIDAD AGONISTA DE GPR119

: [0324] Se realizan las medidas de AMP cíclico con un kit de adenilato ciclasa Flash Plate™ (New England Nuclear) según el protocolo del fabricante. Se siembran células HEK293 en discos de cultivo de tejido de 15 cm a 12x106 células por disco en medio de crecimiento regular (DMEM/10% de FBS). Al día siguiente, se transfectan 25 10 µg de ADN de vector vacío o ADN de plásmido de expresión a células con lipofectamina (Invitrogen, Carlsbad, CA) según el protocolo del fabricante. Después de 24 horas en cultivo, se recogen las células transfectadas en tampón de disociación celular de GIBCO (nº de cat. 13151-014), se sedimentan mediante centrifugación durante 5 minutos a 1.100 rpm y se resuspenden cuidadosamente en un volumen 30 apropiado de tampón de ensayo (50% de 1xPBS y 50% de tampón de estimulación), dando un recuento celular final de 2x106 células/ml. Se preparan los compuestos de ensayo en 50 µl de tampón de ensayo a la concentración de ensayo deseada cuando se indica, y se pipetean a pocillos de la Flash Plate de 96 pocillos. Se añadió entonces la

: suspensión celular preparada anteriormente (50 µl por pocillo). Después de un tiempo de incubación de 60 minutos a temperatura ambiente, se añaden entonces 100 µl de mezcla de detección que contiene el trazador [125I]-AMPc a los pocillos. Se incuban las placas durante 2 horas adicionales, seguido de recuento en un contador de centelleo Wallac MicroBeta. Se extrapolan los valores de AMPc/pocillo a partir de una curva de 5 AMPc patrón que se incluye en cada placa de ensayo.

: [0325] Un aumento del nivel de AMPc en las células HEK293 transfectadas con GPR119 frente a las células HEK293 transfectadas con vector vacío es indicativo de que un compuesto de ensayo es un compuesto que estimula la funcionalidad del receptor GPR119. 10

EJEMPLO 9: ENSAYO MELANOFÓRICO, POR EJEMPLO, PARA LA ACTIVIDAD AGONISTA DE GPR119

: [0326] Se mantienen melanóforos en cultivo como se ha notificado por Potenza y col. [Pigment Cell Research (1992) 5: 372-378] y se transfectan con un vector de expresión que codifica un receptor GPR119 (GPR119, por ejemplo, GPR119 humano, 15 nº de acceso a GenBank® AAP72125 y alelos del mismo) usando electroporación. Después de la electroporación, se siembran las células transfectadas en placas de 96 pocillos para el ensayo. Se dejan crecer entonces las células durante 48 horas tanto para recuperarse del procedimiento de electroporación como para alcanzar los niveles máximos de expresión de receptor. 20

: [0327] El día del ensayo, se reemplaza el medio de crecimiento en las células por tampón exento de suero que contiene melatonina 10 nM. La melatonina actúa mediante un GPCR acoplado con Gi endógeno en los melanóforos reduciendo los niveles de AMPc intracelular. En respuesta a los niveles reducidos de AMPc, los melanóforos translocan su pigmento al centro de la célula. El efecto neto de esto es una reducción 25 significativa de la lectura de absorbancia de la monocapa celular medida a 600-650 nM.

: [0328] Después de 1 hora de incubación en melatonina, el pigmento de las células agrega completamente. En este punto, se recoge una lectura de absorbancia de valor de referencia. Se añaden entonces diluciones en serie de compuestos de ensayo a la placa, 30 y los compuestos que tienen actividad agonista de GPR119 producen aumentos de los niveles de AMPc intracelular. En respuesta a estos niveles de AMPc aumentados, los melanóforos translocan su pigmento de vuelta a la periferia celular. Después de 1 hora, las células estimuladas tienen el pigmento totalmente dispersado. La monocapa celular

: en estado dispersado absorbe mucha más luz en el intervalo de 600-650 nm. El aumento de absorbancia medido en comparación con el valor de referencia permite cuantificar el grado de estimulación del receptor y representar una curva de respuesta a la dosis.

: [0329] Los materiales y procedimientos referentes al ensayo de melanóforos se 5 encuentran en las patentes de EE.UU. nº 5.462.856 y 6.051.386, cuyas divulgaciones se incorporan a la presente como referencia en su totalidad.

: [0330] Un aumento en la dispersión de pigmento en melanóforos transfectados con GPR119 frente a la de melanóforos transfectados con vector vacío es indicativo de que un compuesto de ensayo es un compuesto que estimula la funcionalidad del 10 receptor GPR119.

: [0331] Otros ensayos para identificar un compuesto como un agonista de GPR119 resultarán fácilmente evidentes para el experto en la técnica (véase, por ejemplo, el Ejemplo 7 anterior).

EJEMPLO 10: ENSAYO INDICADOR DE LEVADURA PARA, POR 15 EJEMPLO, ACTIVIDAD AGONISTA DE GPR119

: [0332] Se han descrito anteriormente en la bibliografía ensayos indicadores basados en células de levadura (por ejemplo, véanse Miret y col., J. Biol. Chem. (2002) 277: 6881-6887; Campbell y col., Bioorg. Med. Chem. Lett. (1999) 9: 2413-2418; King y col., Science (1990) 250: 121-123; WO 99/14344; WO 00/12704 y US 20 6.100.042). Brevemente, se han modificado por ingeniería genética células de levadura de tal modo que se ha eliminado la G-alfa de levadura endógena (GPA-1) y reemplazado por quimeras de proteína G construidas usando múltiples técnicas. Adicionalmente, se ha eliminado el GPRC de célula alfa de levadura, Ste3, para permitir una expresión homóloga de un GPCR de mamífero de elección. En la 25 levadura, los elementos de la ruta de transducción de señal de feromonas, que están conservados en células eucarióticas (por ejemplo, la ruta de proteína cinasa activada por mitógeno), regulan la expresión de Fus 1. Al disponer la β-galactosidasa (LacZ) bajo el control del promotor de Fus1 (Fus 1p), se ha desarrollado un sistema mediante con el que la activación de receptor conduce a una lectura enzimática. 30

: [0333] Se transforman las células de levadura mediante una adaptación del procedimiento de acetato de litio descrito por Agatep y col. (Agatep y col., 1998, “Transformation of Saccharomyces cerevisiae by the lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol (LiAc/ss-DNA/PEG) protocol”. “Technical Tips

: Online, Trends Journals”, Elsevier). Brevemente, se cultivan células de levadura durante una noche en placas de triptona de levadura (YT). Se pipetea ADN monocatenario portador (10 µg), 2 µg de cada uno de dos plásmidos indicadores de Fus1p-LacZ (uno con el marcador selectivo URA y otro con TRP), 2 µg de GPR119 (por ejemplo, receptor humano) en vector de expresión de levadura (2 µg de origen de 5 replicación) y un tampón de acetato de litio/polietilenglicol/TE en un tubo Eppendorf. El plásmido de expresión de levadura que contiene el receptor/control sin receptor tiene un marcador LEU. Se inoculan las células de levadura en esta mezcla y la reacción procede a 30ºC durante 60 min. Se someten entonces las células de levadura a choque térmico a 42ºC durante 15 min. Se lavan entonces las células y se extienden 10 sobre placas de selección. Las placas de selección son medio de levadura definido sintéticamente menos LEU, URA y TRP (SD-LUT). Después de incubar a 30ºC durante 2-3 días, se ensayan entonces en el ensayo LacZ las colonias que crecen en las placas de selección.

: [0334] Para efectuar ensayos enzimáticos fluorimétricos para la β-galactosidasa, 15 se cultivan células de levadura que portan el receptor GPR119 en cuestión durante una noche en medio SD-LUT líquido a una concentración insaturada (concretamente, las células siguen dividiéndose y no han alcanzado todavía la fase estacionaria). Se diluyen en medio reciente a una concentración de ensayo óptima y se añaden 90 µl de células de levadura a placas de poliestireno negras de 96 pocillos (Costar). Se añaden a 20 las placas compuestos de ensayo, disueltos en DMSO y diluidos en una disolución de DMSO al 10% a una concentración 10x, y se disponen las placas a 30ºC durante 4 h. Después de 4 h, se añade el sustrato de β-galactosidasa a cada pocillo. En estos experimentos, se usa di(β-D-galactopiranósido) de fluoresceína (FDG), un sustrato de la enzima que libera fluoresceína, permitiendo una lectura fluorimétrica. Se añaden 20 25 µl por pocillo de FDG 500 µM/2,5% de Triton X 100 (el detergente es necesario para volver permeables las células). Después de incubar las células con el sustrato durante 60 min, se añaden 20 µl por pocillo de carbonato de sodio 1 M para terminar la reacción y potenciar la señal fluorescente. Se leen entonces las placas en un fluorímetro a 485/535 nm. 30

: [0335] Un aumento de la señal fluorescente en células de levadura transformadas con GPR119 frente a la de células de levadura transformadas con vector vacío es indicativo de que un compuesto de ensayo es un compuesto que estimula la funcionalidad del receptor GPR119 (por ejemplo, un compuesto que es un agonista o

: agonista parcial de GPR119). En ciertas realizaciones, los compuestos de la invención dan un aumento de la señal fluorescente por encima del de la señal de fondo (la señal obtenida en presencia de vehículo solo).

EJEMPLO 11: COMPUESTO RADIOMARCADO

: [0336] En ciertas realizaciones, un compuesto conocido por ser un ligando de un 5 receptor acoplado con proteína G de la invención está radiomarcado. Un compuesto radiomarcado como se describe en la presente memoria puede usarse en un ensayo de cribado para identificar/evaluar compuestos. En términos generales, en un compuesto recién sintetizado o identificado (concretamente, un compuesto de ensayo) puede evaluarse su capacidad de reducir la unión del ligando conocido radiomarcado al 10 receptor mediante su capacidad de reducir la formación del complejo entre el ligando conocido radiomarcado y el receptor. Los radionucleidos adecuados que pueden incorporarse a compuestos de la presente invención incluyen, pero sin limitación 3H (también escrito como T), 11C, 14C, 18F, 125I, 82Br, 123I, 124I, 125I, 131I, 75Br, 76Br, 15O, 13N, 35S y 77Br. Los compuestos que incorporan 3H, 14C, 125I, 131I, 35S o 82Br serán 15 generalmente los más útiles.

: [0337] Se entiende que un “compuesto radiomarcado” es un compuesto que ha incorporado al menos un radionucleido. En algunas realizaciones, el radionucleido se selecciona del grupo constituido por 3H, 14C, 125I, 35S y 82Br. En algunas realizaciones, los radionucleidos 3H o 14C. Además, debe entenderse que todos los átomos 20 representados en los compuestos conocidos por ser ligandos de un receptor acoplado con proteína G de la invención pueden ser el isótopo que aparece más comúnmente de dichos átomos o el radioisótopo más escaso o un isótopo no radiactivo.

: [0338] Los procedimientos sintéticos para incorporar radioisótopos a compuestos orgánicos, incluyendo aquellos aplicables a los compuestos conocidos por ser ligandos 25 de un receptor acoplado con proteína G de la invención, son bien conocidos en la técnica e incluyen incorporar niveles de actividad de tritio a moléculas diana, incluyendo: A. Reducción catalítica con tritio gaseoso- este procedimiento proporciona normalmente productos de alta actividad específica y requiere precursores halogenados o insaturados. B. Reducción con borohidruro de sodio (3H)– este procedimiento es 30 bastante económico y requiere precursores que contengan grupos funcionales reducibles tales como aldehídos, cetonas, lactonas, ésteres y similares. C. Reducción con hidruro de litio y aluminio (3H) – Este procedimiento ofrece productos de actividades específicas casi teóricas. Requiere también precursores que contengan

: grupos funcionales reducibles tales como aldehídos, cetonas, lactonas, ésteres y similares. D. Marcaje por exposición a tritio gaseoso- Este procedimiento implica exponer precursores que contienen protones intercambiables a tritio gaseoso en presencia de un catalizador adecuado. E. N-metilación usando yoduro de metilo (3H)– Este procedimiento se emplea habitualmente para preparar productos de O-metilo o N-5 metilo (3H) mediante el tratamiento de precursores adecuados con yoduro de metilo (3H) de alta actividad específica. Este procedimiento permite en general una alta actividad específica tal como de aproximadamente 80-87 Ci/mmol.

: [0339] Los procedimientos sintéticos para incorporar niveles de actividad de 125I a moléculas diana incluyen: A. reacciones de Sandmeyer y similares- Este 10 procedimiento transforma una aril- o heteroarilamina en una sal de diazonio, tal como una sal de tetrafluoroborato, y posteriormente en un compuesto marcado con 125I usando Na125I. Se ha notificado un procedimiento representativo por Zhu, D.-G. y colaboradores en J. Org. Chem. 2002, 67, 943-948. B. Orto-125yodación de fenoles- Este procedimiento permite la incorporación de 125I en la posición orto de un fenol 15 como se ha notificado por Collier, T. L. y colaboradores en J. Labelled Compd. Radiopharm. 1999, 42, S264-S266. C. Intercambio de bromuro de arilo y heteroarilo con 115I- Este procedimiento es generalmente un proceso de dos etapas. La primera etapa es la conversión del bromuro de arilo o heteroarilo en el correspondiente intermedio de trialquilestaño usando, por ejemplo, una reacción catalizada por Pd 20 (concretamente, Pd(Ph3P)4] o mediante un aril- o heteroaril-litio, en presencia de un haluro de trialquilestaño o hexaalquildiestaño [por ejemplo, (CH3)3SnSn(CH3)3). Se ha notificado un procedimiento representativo por Bas, M.-D. y colaboradores en J. Labelled Compd. Radiopharm. 2001, 44, S280-S282.

: [0340] Las técnicas anteriores se pretende que sean ilustrativas y no limitantes. 25 Son bien conocidas por el experto en la técnica otras técnicas para radiomarcar un compuesto conocido por ser un ligando de un receptor acoplado con proteína G de la invención.

EJEMPLO 12: ENSAYO DE UNIÓN A RECEPTOR

: [0341] En un compuesto de ensayo puede evaluarse su capacidad de reducir la 30 formación de complejo entre un compuesto conocido por ser un ligando de un receptor acoplado con proteína G de la invención y el receptor. En ciertas realizaciones, el ligando conocido está radiomarcado. El ligando conocido radiomarcado puede usarse en un ensayo de cribado para identificar/evaluar compuestos. En términos generales,

: en un compuesto recién sintetizado o identificado (concretamente, un compuesto de ensayo), puede evaluarse su capacidad de reducir la unión del ligando conocido radiomarcado al receptor mediante su capacidad de reducir la formación de complejo entre el ligando conocido radiomarcado y el receptor.

: [0342] Un nivel de unión específica del ligando conocido radiomarcado en 5 presencia del compuesto de ensayo menor de un nivel de unión específica del ligando conocido radiomarcado en ausencia del compuesto de ensayo es indicativo de que se forma menos complejo entre dicho ligando conocido radiomarcado y dicho receptor en presencia de un compuesto de ensayo que en ausencia del compuesto de ensayo.

Protocolo de ensayo para detectar un complejo entre un compuesto conocido por 10 ser un ligando de un receptor acoplado con proteína G de la invención y el receptor

A. Preparación del receptor

: [0343] Se transfectan transitoriamente células 293 con 10 µg de vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un receptor acoplado con 15 proteína G de la invención usando 60 µl de lipofectamina (por disco de 15 cm). Se cultivan las células transfectadas transitoriamente en el disco durante 24 horas (75% de confluencia) con un cambio de medio y se retiran con 10 ml/disco de tampón Hepes-EDTA (Hepes 20 mM + EDTA 10 mM, pH 7,4). Se centrifugan entonces las células en una centrífuga Beckman Coulter durante 20 minutos a 17.000 rpm (rotor JA-25.50). 20 Posteriormente, se resuspende el sedimento en Hepes 20 mM + EDTA 1 mM, pH 7,4, se homogeneiza con un homogeneizador Dounce de 50 ml y se centrifuga de nuevo. Después de retirar el sobrenadante, se almacenan los sedimentos a -80ºC hasta que se usan en el ensayo de unión. Cuando se usan en el ensayo, se descongelan las membranas en hielo durante 20 minutos y se añaden entonces 10 ml de tampón de 25 incubación (Hepes 20 mM, MgCl2 1 mM, NaCl 100 mM, pH 7,4). Se agitan con vórtex entonces las membranas para resuspender el sedimento de membrana bruta y se homogeneiza con un homogeneizador Brinkmann PT-3100 Polytron durante 15 segundos a nivel 6. Se determina la concentración de proteína de membrana usando el ensayo de proteína de Bradford BRL. 30

B. Ensayo de unión

: [0344] Para la unión total, se añade un volumen total de 50 µl de membranas apropiadamente diluidas (diluidas en tampón de ensayo que contiene Tris-HCl 50 mM (pH 7,4), MgCl2 10 mM y EDTA 1 mM; 5-50 µg de proteína) a placas de

: microvaloración de polipropieno de 96 pocillos, seguido de la adición de 100 µl de tampón de ensayo y 50 µl de un ligando conocido radiomarcado. Para la unión no específica, se añaden 50 µl de tampón de ensayo en lugar de 100 µl y se añaden 50 µl adicionales de dicho ligando conocido 10 µM que no está radiomarcado antes de 50 µl de dicho ligando conocido radiomarcado. Se incuban entonces las placas a temperatura 5 ambiente durante 60-120 minutos. Se termina la reacción de unión mediante filtración de las placas de ensayo a través de una placa de filtración Microplate Devices GF/C Unifilter con un recolector de placa de 96 pocillos Brandell, seguido de lavado con Tris-HCl 50 mM, pH 7,4 que contiene un 0,9% de NaCl frío. Se sella entonces el fondo de la placa de filtración, se añaden 50 µl de Optiphase Supermix a cada pocillo, 10 se sella la parte superior de las placas y se someten a recuento las placas en un contador de centelleo Trilux MicroBeta. Para determinar si se forma menos del complejo entre dicho ligando conocido radiomarcado en presencia de un compuesto de ensayo, en lugar de añadir 100 µl de tampón de ensayo, se añaden 100 µl de dicho compuesto de ensayo apropiadamente diluido a los pocillos apropiados, seguido de la 15 adición de 50 µl de dicho ligando conocido radiomarcado.

C. Cálculos

: [0345] Se ensayan inicialmente los compuestos de ensayo a 10, 1 y 0,1 µM y entonces a un intervalo de concentraciones elegidas de tal modo que la dosis media cause aproximadamente un 50% de inhibición de la unión del ligando conocido 20 radiomarcado (concretamente CI50). La unión específica en ausencia del compuesto de ensayo (B0) es la diferencia de la unión total (BT) menos la unión no específica (NSB), y de modo similar, la unión específica (en presencia del compuesto de ensayo) (B) es la diferencia de la unión por desplazamiento (BD) menos la unión no específica (NSB). La CI50 se determina a partir de una curva de respuesta a la inhibición, gráfica del 25 logaritmo de logitio del % de B/B0 frente a la concentración de compuesto de ensayo.

: [0346] La Ki se calcula mediante la transformación de Cheng y Prusoff:

)/][1/(50DiKLCIK

en la que [L] es la concentración de ligando conocido radiomarcado usado en el ensayo y KD es la constante de disociación del ligando conocido radiomarcado determinada 30 independientemente en las mismas condiciones de unión.

EJEMPLO 13

EFECTO DEL AGONISTA DE GPR119 SOBRE LA SECRECIÓN DE GIP EN LÍNEA CELULAR ENTEROENDOCRINA O EN CÉLULAS DE TEJIDO

DERIVADO DE UNA REGIÓN RICA EN CÉLULAS K DEL INTESTINO DELGADO

: [0347] Puede mostrarse que un agonista de GPR119 según la presente invención estimula la secreción de GIP en una línea celular enteroendocrina o en células de tejido derivado de una región rica en células K del intestino delgado [por ejemplo, tejido de 5 duodeno o yeyuno, véase, por ejemplo, Sondhi y col. Pharmacogenetics J. (2006) 6: 131-140] usando el ensayo in vitro aquí descrito. Se siembran células enteroendocrinas o células de tejido derivado de una región rica en células K del intestino delgado en placas de 24 pocillos el día 1 en medio de cultivo completo (DMEM/10% de FBS). El día 2, se reemplaza el medio de cultivo por un medio pobre en glucosa 10 (DMEM/glucosa 3 mM/10% de FBS). El día 3, se lavan las células dos veces con 1xPBS. Se estimulan las células lavadas con vehículo o con agonista de GPR119 a diversas concentraciones (por ejemplo, en el intervalo de 1 nM a 20 µM) o con forscolina (1 µM) como control positivo en DMEM exento de suero con glucosa 15 mM durante 1 hora a 37ºC y 5% de CO2 en un incubador de cultivo de tejido. Se 15 recogen entonces los sobrenadantes y se clarifican mediante centrifugación a 500 g y 4ºC durante 5 minutos. Se determina el GIP liberado al sobrenadante mediante ELISA usando reactivos adquiridos en LINCO Research Laboratory [ELISA de polipéptido inhibidor gástrico (total) de rata/ratón, nº de catálogo EZRMGIP-55K], siguiendo las instrucciones proporcionadas por el fabricante. 20

LISTADO DE SECUENCIAS

: [0348]

<110> Arena Pharmaceuticals, Inc.

Chu, Zhi-Liang

Leonard, James 5

<120> PROCEDIMIENTOS DE USO DEL RECEPTOR GPR119 PARA IDENTIFICAR COMPUESTOS ÚTILES PARA AUMENTAR LA MASA ÓSEA EN UN INDIVIDUO

<130> 122.WO1

<150> 60/791.550 10

<151> 11-04-2006

<160> 4

<170> PatentIn version 3.2

<210> 1

<211> 1008 15

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 1

<210> 2 20

<211> 335

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

<210> 3

<211> 22

<212> ADN

<213> Artificial

<220> 5

<223> Cebador

<400> 3

<210> 4

<211> 23 10

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 4 15

REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

Esta lista de referencias citadas por el solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP 5 declina cualquier responsabilidad al respecto.

Documentos de patente citados en la descripción

• WO 03026661 A [0079] [0090] [0158]

• JP 2005018412 W [0079] [0090] [0158]

• WO 06040966 A [0079] [0090] [0158]

• JP 2005019000 W [0079] [0090] [0158]

• WO 2006043490 A [0079] [0090] [0158]

• GB 2006050176 W [0079] [0090] [0158]

• WO 2007003960 A [0079] [0090] [0158]

• GB 2006050177 W [0079] [0090] [0158]

• WO 2007003961 A [0079] [0090] [0158]

• GB 2006050178 W [0079] [0090] [0158]

• WO 2007003962 A [0079] [0090] [0158]

• GB 2006050182 W [0079] [0090] [0158]

• WO 2007003964 A [0079] [0090] [0158]

• WO 2004065380 A [0168] [0173] [0174] [0293] [0294]

• WO 2005007658 A [0168] [0173] [0174] [0294]

• WO 2005007647 A [0168] [0173] [0174] [0293]

• US 4704362 A [0247]

• US 5922576 A [0248]

• US 5462856 A [0252] [0330]

• US 6051386 A [0252] [0330]

• US 4256108 A [0273]

• US 4166452 A [0273]

• US 4265874 A [0273]

• US 79155006 P [0290]

• WO 9914344 A [0333]

• WO 0012704 A [0333]

• US 6100042 A [0333]

• US 60791550 B [0349]

• US 6410508 B [0007] 10

• WO 0031258 A [0008]

• WO 0242461 A [0043] [0047] [0103]

[0133] [0156] [0307]

• US 2004001267 W [0079] [0090] [0158]

[0168] [0173] [0174] [0293] [0294] 15

• WO04065380 A [0079] [0090] [0091]

[0092] [0158] [0159] [0160]

• US 2004005555 W [0079] [0090] [0158]

• WO 04076413 A [0079] [0090] [0158]

• US 2004022327 W [0079] [0090] [0158] 20

[0168] [0173] [0174] [0293]

• WO 05007647 A [0079] [0090] [0158]

• US 2004022417 W [0079] [0090] [0158]

[0168] [0173] [0174] [0294]

• WO 05007658 A [0079] [0090] [0158] 25

• US 2005019318 W [0079] [0090] [0158]

• WO 2005121121 A [0079] [0090] [0158]

• GB 2004050046 W [0079] [0090] [0158]

• WO 2005061489 A [0079] [0090] [0158]

• US 0600567 W [0079] [0090] [0158] 30

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Uso de un receptor acoplado con proteína G para identificar secretagogos de GIP en un procedimiento in vitro que comprende las etapas de:

(a) poner en contacto un compuesto de ensayo con una célula hospedadora o 5 con la membrana de una célula hospedadora que comprende dicho receptor acoplado con proteína G, en el que el receptor acoplado con proteína G comprende una secuencia aminoacídica seleccionada del grupo constituido por:

(i) los aminoácidos 1-335 de la SEQ ID NO: 2;

(ii) los aminoácidos 2-335 de la SEQ ID NO: 2; 10

(iii) la secuencia aminoacídica de un receptor acoplado con proteína G codificado por un polinucleótido que es amplificable por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en una muestra de ADN humano usando los cebadores específicos de la SEQ ID NO: 3 y la SEQ ID NO: 4;

(iv) la secuencia aminoacídica de un receptor acoplado con proteína G 15 codificado por un polinucleótido que hibrida en condiciones de alto rigor con el complemento de la SEQ ID NO: 1;

(v) la secuencia aminoacídica de un receptor acoplado con proteína G que tiene al menos un 80% de identidad con la SEQ ID NO: 2;

(vi) la secuencia aminoacídica de una versión constitutivamente activa de un 20 receptor acoplado con proteína G que tiene la SEQ ID NO: 2; y

(vii) un fragmento biológicamente activo de (i) o (ii), en el que dicho fragmento biológicamente activo es capaz de unirse a (2-fluoro-4-metanosulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-1-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina; y

(b) determinar la capacidad del compuesto de ensayo de estimular la 25 funcionalidad del receptor;

en el que la capacidad del compuesto de ensayo de estimular la funcionalidad del receptor es indicativa de que el compuesto de ensayo es un secretagogo de GIP.
2. Uso según la reivindicación 1, que comprende adicionalmente:

(c) poner en contacto un compuesto que estimula la funcionalidad del receptor 30 en la etapa (b) in vitro con una célula enteroendocrina de vertebrado o una célula capaz de secretar GIP; y

(d) determinar si el compuesto estimula la secreción de GIP de la célula enteroendocrina de vertebrado o la célula capaz de secretar GIP;

en el que la capacidad del compuesto de ensayo de estimular la secreción de GIP de la célula enteroendocrina o célula capaz de secretar GIP es indicativa de que el compuesto de ensayo es un secretagogo de GIP.
3. Uso según la reivindicación 1, que comprende adicionalmente:

(c) determinar si el compuesto aumenta el nivel de GIP en un vertebrado 5 midiendo el nivel de GIP en una muestra obtenida de un vertebrado al que se ha administrado anteriormente un compuesto que estimula la funcionalidad del receptor en la etapa (b);

en el que la capacidad del compuesto de ensayo de aumentar el nivel de GIP en el vertebrado es indicativa de que el compuesto de ensayo es un secretagogo de GIP. 10
4. Uso según la reivindicación 3, en el que el vertebrado es un vertebrado no humano.
5. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el receptor es recombinante.
6. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la célula 15 hospedadora comprende un vector de expresión, comprendiendo dicho vector de expresión un polinucleótido que codifica el receptor acoplado con proteína G.
7. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicha determinación es mediante la medida del nivel de un segundo mensajero.
8. Uso según la reivindicación 7, en el que el segundo mensajero se 20 selecciona del grupo constituido por AMP cíclico (AMPc), GMP cíclico (GMPc), 1,4,5-trifosfato de inositol (IP3), diacilglicerol (DAG), actividad MAP cinasa, actividad MAPK/ERK cinasa cinasa 1 (MEKK1) y Ca2+.
9. Uso según la reivindicación 8, en el que el nivel de AMPc aumenta.
10. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicha 25 determinación es mediante el uso de un ensayo de melanóforo, mediante la medida de la unión de GTPγS a una membrana que comprende dicho GPCR o mediante un ensayo indicador.
11. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que la célula hospedadora es una célula hospedadora de mamífero. 30
12. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que la célula hospedadora es una célula hospedadora de levadura.
13. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que la célula hospedadora es una célula hospedadora melanofórica.
14. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que el compuesto de ensayo es una molécula pequeña que tiene un peso molecular de menos de aproximadamente 5.000 g/mol.
15. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que el receptor comprende la secuencia aminoacídica de un receptor acoplado con proteína G 5 que tiene al menos aproximadamente un 80% de identidad con la SEQ ID NO: 2.
16. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que el receptor comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 2.
17. Un procedimiento para identificar secretagogos de GIP, que comprende las etapas de: 10

(a) poner en contacto un agonista de GPR119 in vitro con una célula enteroendocrina de vertebrado o una célula capaz de secretar GIP; y

(b) determinar si el agonista de GPR119 estimula la secreción de GIP de la célula enteroendocrina de vertebrado o de la célula capaz de secretar GIP;

en el que la capacidad del agonista de GPR119 de estimular la secreción de GIP 15 de la célula enteroendocrina de vertebrado o de la célula capaz de secretar GIP es indicativa de que el agonista es un secretagogo de GIP.
18. Un procedimiento para identificar secretagogos de GIP, que comprende la etapa de:

(a) determinar si un agonista de GPR119 aumenta el nivel de GIP en un 20 vertebrado midiendo el nivel de GIP en una muestra obtenida de un vertebrado al que se ha administrado anteriormente el agonista de GPR119;

en el que la capacidad del agonista de GPR119 de aumentar el nivel de GIP en el vertebrado es indicativa de que el agonista de GPR119 es un secretagogo de GIP.
19. Un procedimiento según la reivindicación 18, en el que el vertebrado es un 25 ser humano.
20. Un procedimiento según la reivindicación 18, en el que el vertebrado es un vertebrado no humano.
21. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20, en el que el agonista de GPR119 es una molécula pequeña que tiene un peso molecular de 30 menos de aproximadamente 5.000 g/mol.
22. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 21, en el que el agonista de FPR119 es un agonista de GPR119 humano.
23. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 22, en el que el agonista de GPR119 es un agonista selectivo de GPR119.
24. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 23, en el que el agonista de GPR119 tiene una CE50 de menos de 10 µM.
25. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 23, en 5 el que el agonista de GPR119 tiene una CE50 de menos de 1 µM.
26. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 23, en el que el agonista de GPR119 tiene una CE50 de menos de 100 nM.
27. Un procedimiento según la reivindicación 17, que comprende antes de la etapa (a) las etapas in vitro adicionales de: 10

(x) poner en contacto un compuesto de ensayo con una célula hospedadora o con membrana de una célula hospedadora que comprende un receptor acoplado con proteína G, en el que el receptor acoplado con proteína G comprende una secuencia aminoacídica seleccionada del grupo constituido por:

(i) los aminoácidos 1-335 de la SEQ ID NO: 2; 15

(ii) los aminoácidos 2-335 de la SEQ ID NO: 2;

(iii) la secuencia aminoacídica de un receptor acoplado con proteína G codificado por un polinucleótido que es amplificable por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en una muestra de ADN humano usando los cebadores específicos de la SEQ ID NO:3 y de la SEQ ID NO:4; 20

(iv) la secuencia aminoacídica de un receptor acoplado con proteína G codificado por un polinucleótido que hibrida en condiciones de alto rigor con el complemento de la SEQ ID NO: 1;

(v) la secuencia aminoacídica de un receptor acoplado con proteína G que tiene al menos aproximadamente un 80% de identidad con la SEQ ID NO: 2; 25

(vi) la secuencia aminoacídica de una versión constitutivamente activa de un receptor acoplado con proteína G que tiene la SEQ ID NO: 2; y

(vii) un fragmento biológicamente activo de (i) o (ii), en el que dicho fragmento biológicamente activo es capaz de unirse a (2-fluoro-4-metanosulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-1-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina; y 30

(y) determinar la capacidad del compuesto de ensayo de estimular la funcionalidad del receptor;

en el que la capacidad del compuesto de ensayo de estimular la funcionalidad del receptor es indicativa de que el compuesto de ensayo es un secretagogo de GIP, y

en el que el agonista de GPR119 de la etapa (a) es un compuesto de ensayo identificado por estimular la funcionalidad del receptor en la etapa (y).
28. Un procedimiento según la reivindicación 18, que comprende antes de la etapa (a) las etapas in vitro adicionales de:

(x) poner en contacto un compuesto de ensayo con una célula hospedadora o 5 con membrana de una célula hospedadora que comprende un receptor acoplado con proteína G, en el que el receptor acoplado con proteína G comprende una secuencia aminoacídica seleccionada del grupo constituido por:

(i) los aminoácidos 1-335 de la SEQ ID NO: 2;

(ii) los aminoácidos 2-335 de la SEQ ID NO: 2; 10

(iii) la secuencia aminoacídica de un receptor acoplado con proteína G codificada por un polinucleótido que es amplificable por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en una muestra de ADN humano usando los cebadores específicos de la SEQ ID NO:3 y de la SEQ ID NO:4;

(iv) la secuencia aminoacídica de un receptor acoplado con proteína G 15 codificado por un polinucleótido que hibrida en condiciones de alto rigor con el complemento de la SEQ ID NO: 1;

(v) la secuencia aminoacídica de un receptor acoplado con proteína G que tiene al menos aproximadamente un 80% de identidad con la SEQ ID NO: 2;

(vi) la secuencia aminoacídica de una versión constitutivamente activa de un 20 receptor acoplado con proteína G que tiene la SEQ ID NO: 2; y

(vii) un fragmento biológicamente activo de (i) o (ii), en el que dicho fragmento biológicamente activo es capaz de unirse a (2-fluoro-4-metanosulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-1-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina; y

(y) determinar la capacidad del compuesto de ensayo de estimular la 25 funcionalidad del receptor;

en el que la capacidad del compuesto de ensayo de estimular la funcionalidad del receptor es indicativa de que el compuesto de ensayo es un secretagogo de GIP, y en el que el agonista de GPR119 de la etapa (a) es un compuesto de ensayo identificado por estimular la funcionalidad del receptor en la etapa (y). 30
29. El procedimiento de la reivindicación 28, en el que el vertebrado es un ser humano.
30. El procedimiento de la reivindicación 28, en el que el vertebrado es un vertebrado no humano.
31. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 30, en el que el receptor es recombinante.
32. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 31, en el que la célula hospedadora comprende un vector de expresión, comprendiendo dicho vector de expresión un polinucleótido que codifica el receptor acoplado con proteína 5 G.
33. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 32, en el que dicha determinación es mediante la medida del nivel de un segundo mensajero.
34. El procedimiento de la reivindicación 33, en el que el segundo mensajero 10 se selecciona del grupo constituido por AMP cíclico (AMPc), GMP cíclico (GMPc), 1,4,5-trifosfato de inositol (IP3), diacilglicerol (DAG), actividad MAP cinasa, actividad MAPK/ERK cinasa cinasa 1 (MEKK1) y Ca2+.
35. El procedimiento de la reivindicación 34, en el que el nivel de AMPc aumenta. 15
36. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 32, en el que dicha determinación es mediante el uso de un ensayo de melanóforo, mediante la medida de la unión de GTPγS a una membrana que comprende dicho GPCR o mediante un ensayo indicador.
37. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 36, en 20 el que la célula hospedadora es una célula hospedadora de mamífero.
38. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 36, en el que la célula hospedadora es una célula hospedadora de levadura.
39. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 36, en el que la célula hospedadora es una célula hospedadora melanofórica. 25
40. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 39, en el que el compuesto de ensayo es una molécula pequeña que tiene un peso molecular de menos de aproximadamente 5.000 g/mol.
41. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 40, en el que el receptor comprende la secuencia aminoacídica de un receptor acoplado con 30 proteína G que tiene al menos aproximadamente un 80% de identidad con la SEQ ID NO: 2.
42. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 41, en el que el receptor comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 2.
43. Uso de un receptor acoplado con proteína G para identificar secretagogos de GIP en un procedimiento in vitro que comprende las etapas de:

(a) poner en contacto un receptor acoplado con proteína G con un ligando conocido opcionalmente marcado del receptor en presencia o ausencia del compuesto de ensayo, en el que el receptor acoplado con proteína G comprende una secuencia 5 aminoacídica seleccionada del grupo constituido por:

(i) los aminoácidos 1-335 de la SEQ ID NO: 2;

(ii) los aminoácidos 2-335 de la SEQ ID NO: 2;

(iii) la secuencia aminoacídica de un receptor acoplado con proteína G codificado por un polinucleótido que es amplificable por reacción en cadena de la 10 polimerasa (PCR) en una muestra de ADN humano usando los cebadores específicos de la SEQ ID NO:3 y de la SEQ ID NO:4;

(iv) la secuencia aminoacídica de un receptor acoplado con proteína G codificado por un polinucleótido que hibrida en condiciones de alto rigor con el complemento de la SEQ ID NO: 1; 15

(v) la secuencia aminoacídica de un receptor acoplado con proteína G que tiene al menos un 80% de identidad con la SEQ ID NO: 2;

(vi) la secuencia aminoacídica de una versión constitutivamente activa de un receptor acoplado con proteína G que tiene la SEQ ID NO: 2; y

(vii) un fragmento biológicamente activo de (i) o (ii), en el que dicho fragmento 20 biológicamente activo es capaz de unirse a (2-fluoro-4-metanosulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-1-il]-5-nitro-pirimidin-4-il}-amina; y

(b) detectar el complejo entre dicho ligando conocido y dicho receptor; y

(c) determinar si se forma menos de dicho complejo en presencia del compuesto de ensayo que en ausencia del compuesto de ensayo; 25

en el que dicha determinación es indicativa de que el compuesto de ensayo es un secretagogo de GIP.
44. Uso según la reivindicación 43, en el que dicho procedimiento comprende adicionalmente

(d) poner en contacto un compuesto en presencia del cual se forma menos de 30 dicho complejo en la etapa (c) in vitro con una célula enteroendocrina de vertebrado o una célula capaz de secretar GIP; y

(e) determinar si el compuesto estimula la secreción de GIP de la célula enteroendocrina de vertebrado o de la célula capaz de secretar GIP;

en el que la capacidad del compuesto de ensayo de estimular la secreción de GIP de la célula enteroendocrina de vertebrado o de la célula capaz de secretar GIP es indicativa de que el compuesto de ensayo es un secretagogo de GIP.
45. Uso según la reivindicación 43, en el que dicho procedimiento comprende adicionalmente 5

(d) determinar si el compuesto aumenta el nivel de GIP en un vertebrado midiendo el nivel de GIP en una muestra obtenida de un vertebrado al que se ha administrado anteriormente un compuesto en presencia del cual se forma menos de dicho complejo en la etapa (c);

en el que la capacidad del compuesto de ensayo de aumentar el nivel de GIP en 10 el vertebrado es indicativa de que el compuesto de ensayo es un secretagogo de GIP.
46. Uso según la reivindicación 45, en el que el vertebrado es un vertebrado no humano.
47. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 43 a 46, en el que el receptor es recombinante. 15
48. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 43 a 47, en el que la célula hospedadora comprende un vector de expresión, comprendiendo dicho vector de expresión un polinucleótido que codifica el receptor acoplado con proteína G.
49. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 43 a 48, en el que el ligando conocido es un agonista de GPR119. 20
50. Uso según la reivindicación 49, en el que el agonista de GPR119 es un agonista de GPR119 humano.
51. Uso según la reivindicación 49 o la reivindicación 50, en el que dicho agonista de GPR119 es un agonista selectivo de GPR119. 25
52. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 49 a 51, en el que el agonista de GPR119 tiene una CE50 menor que un valor seleccionado del grupo constituido por 10 µM, 1 µM y 100 nM.
53. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 49 a 52, en el que el agonista de GPR119 es una molécula pequeña que tiene un peso molecular menor de 30 aproximadamente 5.000 g/mol.
54. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 43 a 53, en el que el compuesto de ensayo es una molécula pequeña que tiene un peso molecular menor de aproximadamente 5.000 g/mol.
55. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 43 a 54, en el que el receptor comprende la secuencia aminoacídica de un receptor acoplado con proteína G que tiene al menos aproximadamente un 80% de identidad con la SEQ ID NO: 2.
56. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 43 a 55, en el que el receptor comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 2. 5
57. Un procedimiento según la reivindicación 17, que comprende antes de la etapa (a) las etapas in vitro adicionales de:

(x) poner en contacto un receptor acoplado con proteína G con un ligando conocido opcionalmente marcado del receptor en presencia o ausencia de un compuesto de ensayo, en el que el receptor acoplado con proteína G comprende una 10 secuencia aminoacídica seleccionada del grupo constituido por:

(i) los aminoácidos 1-335 de la SEQ ID NO: 2;

(ii) los aminoácidos 2-335 de la SEQ ID NO: 2;

(iii) la secuencia aminoacídica de un receptor acoplado con proteína G codificado por un polinucleótido que es amplificable por la reacción en cadena de la 15 polimerasa (PCR) en una muestra de ADN humano usando los cebadores específicos de la SEQ ID NO:3 y de la SEQ ID NO:4;

(iv) la secuencia aminoacídica de un receptor acoplado con proteína G codificado por un polinucleótido que hibrida en condiciones de alto rigor con el complemento de la SEQ ID NO: 1; 20

(v) la secuencia aminoacídica de un receptor acoplado con proteína G que tiene al menos aproximadamente un 80% de identidad con la SEQ ID NO: 2;

(vi) la secuencia aminoacídica de una versión constitutivamente activa de un receptor acoplado con proteína G que tiene la SEQ ID NO: 2; y

(vii) un fragmento biológicamente activo de (i) o (ii), en el que dicho fragmento 25 biológicamente activo es capaz de unirse a (2-fluoro-4-metanosulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-1-il]-5-nitro-primidin-4-il}-amina;

(y) detectar el complejo entre dicho ligando conocido y dicho receptor; y

(z) determinar si se forma menos de dicho complejo en presencia del compuesto de ensayo que en ausencia del compuesto de ensayo; 30

en el que dicha determinación es indicativa de que el compuesto de ensayo es un secretagogo de GIP, y en el que el agonista de GPR119 de la etapa (a) es un compuesto de ensayo que se ha determinado en la etapa (z) que es un compuesto en presencia del cual se forma menos de dicho complejo.
58. Un procedimiento según la reivindicación 18, que comprende antes de la etapa (a) las etapas in vitro adicionales de:

(x) poner en contacto un receptor acoplado con proteína G con un ligando conocido opcionalmente marcado del receptor en presencia o ausencia de un compuesto de ensayo, en el que el receptor acoplado con proteína G comprende una 5 secuencia aminoacídica seleccionada del grupo constituido por:

(i) los aminoácidos 1-335 de la SEQ ID NO: 2;

(ii) los aminoácidos 2-335 de la SEQ ID NO: 2;

(iii) la secuencia aminoacídica de un receptor acoplado con proteína G codificado por un polinucleótido que es amplificable por la reacción en cadena de la 10 polimerasa (PCR) en una muestra de ADN humano usando los cebadores específicos de la SEQ ID NO:3 y de la SEQ ID NO:4;

(iv) la secuencia aminoacídica de un receptor acoplado con proteína G codificado por un polinucleótido que hibrida en condiciones de alto rigor con el complemento de la SEQ ID NO: 1; 15

(v) la secuencia aminoacídica de un receptor acoplado con proteína G que tiene al menos aproximadamente un 80% de identidad con la SEQ ID NO: 2;

(vi) la secuencia aminoacídica de una versión constitutivamente activa de un receptor acoplado con proteína G que tiene la SEQ ID NO: 2; y

(vii) un fragmento biológicamente activo de (i) o (ii), en el que dicho fragmento 20 biológicamente activo es capaz de unirse a (2-fluoro-4-metanosulfonil-fenil)-{6-[4-(3-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)-piperidin-1-il]-5-nitro-primidin-4-il}-amina;

(y) detectar el complejo entre dicho ligando conocido y dicho receptor; y

(z) determinar si se forma menos de dicho complejo en presencia del compuesto de ensayo que en ausencia del compuesto de ensayo; 25

en el que dicha determinación es indicativa de que el compuesto de ensayo es un secretagogo de GIP, y en el que el agonista de GPR119 de la etapa (a) es un compuesto de ensayo que se ha determinado en la etapa (z) que es un compuesto en presencia del cual se forma menos de dicho complejo.
59. Un procedimiento según la reivindicación 58, en el que el vertebrado es un 30 vertebrado no humano.
60. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 57 a 59, en el que el receptor es recombinante.
61. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 57 a 60, en el que la célula hospedadora comprende un vector de expresión, comprendiendo dicho vector de expresión un polinucleótido que codifica el receptor acoplado con proteína G.
62. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 57 a 61, en el 5 que el ligando conocido es un agonista de GPR119.
63. El procedimiento de la reivindicación 62, en el que el agonista de GPR119 es un agonista de GPR119 humano.
64. El procedimiento de la reivindicación 62 o la reivindicación 63, en el que dicho agonista de GPR119 es un agonista selectivo. 10
65. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 62 a 64, en el que el agonista de GPR119 tiene una CE50 menor que un valor seleccionado del grupo constituido por 10 µM, 1 µM y 100 nM.
66. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 62 a 65, en el que el agonista de GPR119 es una molécula pequeña que tiene un peso molecular de 15 menos de aproximadamente 5.000 g/mol.
67. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 57 a 66, en el que el compuesto de ensayo es una molécula pequeña que tiene un peso molecular de menos de aproximadamente 5.000 g/mol.
68. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 57 a 67, en el 20 que el receptor comprende la secuencia aminoacídica de un receptor acoplado con proteína G que tiene al menos aproximadamente un 80% de identidad con la SEQ ID NO: 2.
69. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 57 a 68, en el que el receptor comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 2. 25