ES2351875T3 - Utilización de inhibidores de las lisil oxidasas para el cultivo celular y la ingeniería tisular. - Google Patents
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Abstract
Utilización de inhibidores directos de lisil-oxidasas (LO) seleccionados entre: las aminas primarias que reaccionan con el grupo carbonilo del sitio activo de las LO, y más particularmente las que proporcionan, después de una unión al carbonilo, un producto estabilizado por resonancia, tales como las aminas primarias siguientes: - la etilendiamina, - los aminonitrilos, tales como el β-aminopropionitrilo (βAPN) o la 2-nitroetilamina, - las haloaminas insaturadas o saturadas, tales como la 2-bromoetilamina, la 2-cloroetilamina, la 2-trifluoroetilamina, la 3-bromopropilamina, las p-halobencilaminas, y los compuestos halogenados insaturados, - la selenohomocisteína lactona. como inhibidores de la desdiferenciación de las células en cultivo in vitro, con vistas al mantenimiento constante del fenotipo de dichas células en el marco de la realización de un procedimiento de cultivo in vitro de estas últimas, y durante la totalidad del tiempo de cultivo, para la preparación de células diferenciadas cuyo fenotipo es idéntico, o para la preparación de una matriz celular constituida por células diferenciadas que conservan el mismo fenotipo y cultivadas en presencia de dichos inhibidores, y del medio extracelular segregado por dichas células y que une estas últimas en la matriz.
Description
Utilización de inhibidores de las lisil oxidasas
para el celular y la ingeniería tisular.
La presente invención tiene por objeto la
utilización de inhibidores de las lisil-oxidasas en
el marco de la realización de procedimientos de cultivo in
vitro de células susceptibles de ser utilizadas en terapia
tisular, o celular, o en farmacología experimental.
Las lisil-oxidasas son unas
amina-oxidasas que inducen la reticulación de los
colágenos y de la elastina catalizando la desaminación oxidativa de
residuos lisilos e hidroxilisilos en
\alpha-aminoadipic-S-semialdehídos
correspondientes (para revisión, Smith-Mango &
Kagan, Matrix Biology 1998, 16: 387): RCH_{2}NH_{2} + O_{2} +
H_{2}O \rightarrow RCHO + NH_{3} + H_{2}O_{2}. Los
residuos aldehídos formados sufrirán una serie de condensaciones
espontáneas con otras funciones aldehídos o aminas no modificadas
próximas, conduciendo a unas uniones intra e
inter-moleculares. Estas condensaciones son el
origen de los puentes intra e intermoleculares de los colágenos y
de la elastina. Entre los inhibidores directos de la actividad LO,
que actúan en el sitio activo de la enzima, el \betaAPN es el
utilizado más corrientemente (para revisión, H.M. Kagan Acta Tropica
77 (2000) 147-152).
La reticulación dependiente de las LO de los
colágenos y de elastina es un parámetro esencial de la formación de
los tejidos y de los implantes neosintetizados in vitro: la
ausencia de reticulación no permite la constitución de tejidos
resistentes, demasiada reticulación (o una reticulación química
inapropiada) provoca una rigidez demasiado grande y una retracción
de los tejidos.
La presente invención resulta de la demostración
por los inventores del hecho de que la adición de un inhibidor
específico de las LO a unos condrocitos, células específicas del
cartílago, permite anular la desdiferenciación de estas células. En
efecto, el problema principal de la formación de implantes de
cartílago por los condrocitos es que éstos se desdiferencian, y
pierden su potencial para fabricar colágeno de cartílago (colágenos
de tipo cartílago: II, IX, XI y X). Sin este inhibidor, los
condrocitos desdiferenciados sintetizan unos tipos de colágenos
anormales en el cartílago sano (I, III). La adición temporal del
inhibidor de LO tiene por lo tanto un efecto importante y
reversible en la formación del cartílago, cuyas propiedades físicas
específicas están relacionadas con la presencia de los colágenos que
lo
constituyen.
constituyen.
Se sabe que el cultivo en gel de alginato
permite evitar la desdiferenciación de los condrocitos y que la
adición de \beta-aminopropionitrilo (\betaAPN)
aumenta la síntesis global del colágeno y reduce su reticulación.
(B. Beekman et al., Experimental Cell Research 1997,
237(1): 135-141). No se ha demostrado ningún
efecto directo del \betaAPN sobre la diferenciación de las
células y la ausencia de estudio detallado de los
sub-tipos de colágeno no permite excluir la
presencia minoritaria de colágeno I. Otros estudios han mostrado que
la aplicación de \betaAPN sobre un explante de cartílago ya
formado reducía su reticulación y concluyen en el interés de no
utilizar ningún \betaAPN sobre un explante de cartílago para la
reparación tisular. (Ahsan T et al., Journal of Orthopedic
Research 1999, 17(6): 850-857).
Además, los inventores han demostrado asimismo
que la adición del mismo inhibidor de las LO durante la constitución
de un modelo de piel reconstruida se traduce asimismo por un efecto
sobre el fenotipo de las células. Los componentes celulares del
modelo ensayado de piel reconstruida son unos fibroblastos y unos
queratinocitos. Los fibroblastos sintetizan en particular los
colágenos fibrilares (tipo I y III) y la elastina de la dermis,
mientras que los queratinocitos se diferencian porque forman todas
las capas de la epidermis hasta la capa córnea que asegura la
función de barrera. En presencia del inhibidor de LO, se modifican
las propiedades de la piel reconstruida. Se observa que la ausencia
de reticulación de los colágenos permite una mejor colonización del
soporte esponja por los fibroblastos y un aumento de la formación de
la matriz extracelular, así como una disminución in vitro de
la retracción de la piel reconstruida. Por otra parte, se observa
una mejor organización de la epidermis, con una capa granulosa muy
bien formada. La adición temporal de inhibidor de las LO tiene por
lo tanto un efecto positivo en la gestión de la formación y de la
organización de la piel reconstruida facilitando la preparación en
gran cantidad de este material.
A partir de biopsias de cartílago, y en
presencia de inhibidores de LO, los inventores han demostrado que
resulta posible multiplicar unos condrocitos sobre un soporte
plástico en 2 dimensiones en presencia de suero del donante según
las condiciones clásicas, obteniendo al mismo tiempo la producción
de una matriz extracelular libre de cualquier colágeno anormal,
incluso después de 2 semanas de cultivo, y a pesar de una
solubilización aumentada de los colágenos sintetizados en el medio
de cultivo (figura 1, 2). Dicha matriz ve disminuir su fluidez a lo
largo del tiempo de cultivo: se selecciona el tiempo de cultivo
óptimo en función de la cantidad de matriz producida y de fluidez
buscada. Resulta inútil entonces recurrir al uso de soportes
exógenos de los que, ulteriormente, el rechazo o la resorción
defectuosa eventuales anularían las propiedades favorables ya
obtenidas.
En ausencia del inhibidor tipo de la actividad
LO, el \betaAPN, la matriz extracelular está muy empobrecida en
colágenos de tipo cartílago, y mayoritariamente constituida por
colágenos de tipo I así como, para una pequeña parte, por colágeno
de tipo III, es decir, por colágenos que no participan en la
elaboración del cartílago. Además, la matriz presenta una ausencia
de fluidez incompatible con el recurso eventual a unas inyecciones
mediante jeringuilla.
La expresión de varias isoformas de lisil
oxidasa (LOX y LOL1 por lo menos) por los condrocitos es manifiesta,
pero no se modifica por el tratamiento mediante \betaAPN (figura
3) que inhibe sólo la actividad de la enzima (tabla I).
La adición de \betaAPN, utilizado a diferentes
concentraciones (entre 50 y 200 \mug/ml), permite la formación de
pieles reconstruidas humanas cuya retracción puede ser disminuida
in vitro. Además, el \betaAPN a 50 \mug/ml mejora la
colonización de la esponja por los fibroblastos y la extensión de la
síntesis de la matriz extracelular. Mejora asimismo la organización
de la epidermis, con una capa granulosa muy bien formada que genera
una capa córnea muy estructurada. Este efecto sobre la
diferenciación de la epidermis y la disminución de la retracción
reducen la formación de hojas que se sueltan y pueden facilitar la
preparación de piel reconstruida (figura 4).
La utilización de inhibidores de la actividad LO
se puede aplicar a cualquier cultivo de células con el fin de
obtener cualquier implante tisular, puesto que los colágenos y las
LO son unos constituyentes y unos participantes ubiquitarios de
todos los tejidos animales. Sin embargo, las condiciones de los
cultivos pueden variar en función de los tipos celulares usados y de
los sustratos diana.
La invención tiene por objeto la utilización de
inhibidores directos o indirectos de las
lisil-oxidasas (LO), como inhibidores de la
desdiferenciación de las células en cultivo in vitro, con
vistas al mantenimiento casi constante del fenotipo de dichas
células en el marco de la realización de procedimientos de cultivo
in vitro de estas últimas, y durante casi la totalidad del
tiempo de cultivo.
Con este fin, la invención tiene muy
particularmente por objeto la utilización de inhibidores mencionados
anteriormente para la preparación de células diferenciadas cuyo
fenotipo está preservado.
La invención se refiere más particularmente
todavía a la utilización de inhibidores mencionados anteriormente
para la preparación de una matriz celular, constituida por células
diferenciadas cultivadas en presencia de dichos inhibidores, y del
medio extracelular condicionado por dichas células y en contacto con
dicha matriz, siendo dicha matriz celular susceptible de poder ser
utilizada como tejidos o implantes tisulares.
La invención tiene asimismo por objeto la
utilización mencionada anteriormente, de inhibidores de las LO
seleccionadas de entre:
- las aminas primarias que reaccionan con el grupo carbonilo del sitio activo de las LO, y más particularmente las que proporcionan, después de una unión al carbonilo, un producto estabilizado mediante resonancia, tales como las aminas primarias siguientes:
- -
- la etilendiamina,
- -
- los aminonitrilos, tales como el \beta-aminopropionitrilo (\beta-APN), o la 2-nitroetilamina,
- -
- las haloaminas insaturadas o saturadas, tales como la 2-bromoetilamina, la 2-cloroetilamina, la 2-trifluoroetilamina, la 3-bromopropilamina, las p-halobencilaminas,
- -
- la selenohomocisteína lactona.
La invención tiene más particularmente por
objeto la utilización del \beta-APN con los fines
mencionados anteriormente.
La invención se refiere asimismo a la
utilización de inhibidores de LO tales como se han definido
anteriormente, para la realización de procedimientos de cultivo
in vitro de cualquier célula de origen humano o animal,
siendo dichas células mantenidas a un fenotipo de diferenciación
constante, y seleccionadas en particular de entre los condrocitos
de los cartílagos, las células de la córnea, las células de la piel
(tales como los fibroblastos de la dermis, y los queratinocitos de
la epidermis), las células endoteliales de los vasos, los
osteoblastos de los huesos, los hepatocitos, las células renales,
las células musculares, y las células cepas o pluripotentes.
La invención tiene asimismo por objeto la
utilización de inhibidores de LO tales como se han definido
anteriormente, para la realización de procedimientos de cultivo
in vitro de células, con vistas a obtener unas células
susceptibles de ser utilizadas en terapia celular, o en farmacología
experimental, en particular en el marco del cribado de
medicamentos.
La invención se refiere asimismo a la
utilización de inhibidores de LO tales como se han definido
anteriormente, para la realización de procedimientos de cultivo
in vitro de células con vistas a obtener unos tejidos, tales
como piel o cartílago, siendo dichos tejidos susceptibles de ser
utilizados como injertos o implantes en terapia tisular, o en
farmacología experimental, en particular en el marco del cribado de
medicamentos.
La invención tiene asimismo por objeto cualquier
medio de cultivo celular caracterizado porque contiene uno o varios
inhibidores de LO tales como se han definido anteriormente.
La invención se refiere asimismo a un
procedimiento de cultivo in vitro de células tales como se
han definido anteriormente, durante el cual el fenotipo de dichas
células se mantiene en un estado idéntico a aquél en el que se
encontraban inicialmente dichas células durante su cultivo,
comprendiendo dicho procedimiento el cultivo de dichas células en
un medio apropiado que contiene uno o varios inhibidores de LO tales
como se han definido anteriormente.
La invención tiene más particularmente por
objeto un procedimiento de mantenimiento constante del fenotipo de
células diferenciadas en cultivo en un estado próximo o idéntico al
que se encontraban dichas células durante su cultivo, caracterizado
porque comprende el cultivo de dichas células en un medio apropiado
que contiene uno o varios inhibidores de LO tales como se han
definido anteriormente.
La invención tiene asimismo por objeto un
procedimiento de preparación de células diferenciadas al fenotipo
idéntico, o de implantes celulares constituidos por dichas células,
caracterizado porque comprende:
- -
- realizar un procedimiento de cultivo in vitro de células tal como se ha definido anteriormente,
- -
- llegado el caso, una o varias etapas de lavado de las células en cultivo con la ayuda de una disolución tampón apropiada, con el fin de eliminar la totalidad o parte del o de los inhibidores de LO utilizados,
- -
- llegado el caso, una etapa de digestión enzimática de la materia extracelular susceptible de formarse, con la ayuda de enzimas apropiadas,
- -
- llegado el caso, una etapa de recuperación de las células cultivadas.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención se refiere asimismo a un
procedimiento de preparación in vitro de una matriz celular
tal como se ha definido anteriormente, susceptible de poder ser
utilizada como tejidos o implantes tisulares, constituidos por
células diferenciadas, caracterizado porque comprende:
- -
- realizar un procedimiento de cultivo in vitro de células tal como se ha definido anteriormente, hasta la formación de una matriz celular tal como se ha definido anteriormente, suficiente para constituir una trama tisular,
- -
- llegado el caso, una o varias etapas de lavado de la matriz celular en cultivo con la ayuda de una disolución tampón apropiada, con el fin de eliminar la totalidad o parte del o de los inhibidores de LO utilizados,
- -
- llegado el caso, una etapa de recuperación de la matriz celular tal como se ha definido anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención tiene más particularmente por
objeto un procedimiento de preparación in vitro de tejidos o
de implantes tisulares tal como se ha definido anteriormente,
aplicado a la neosíntesis de implantes de cartílago cuando dicho
procedimiento se efectúa a partir de condrocitos, o a la preparación
de sustitutos cutáneos cuando dicho procedimiento se efectúa a
partir de fibroblastos y/o de queratinocitos.
La invención se refiere asimismo a un
procedimiento de cribado de moléculas de interés farmacológico, en
particular de medicamentos, caracterizado porque comprende:
- -
- realizar un procedimiento de cultivo in vitro de células tal como se ha definido anteriormente, llegado el caso hasta la formación de una matriz celular suficiente para constituir una trama tisular,
- -
- llegado el caso, una o varias etapas de lavado de la matriz celular en cultivo con la ayuda de una disolución tampón apropiada, con el fin de eliminar la totalidad o parte del o de los inhibidores de LO utilizados,
- -
- una etapa de puesta en presencia de la molécula ensayada con las células o tejidos obtenidos durante las etapas anteriores,
- -
- detectar el eventual efecto de dicha molécula sobre las células o los tejidos mencionados anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención tiene asimismo por objeto las
células diferenciadas al fenotipo mantenido, o implantes celulares
constituidos por dichas células, tales como se han definido
anteriormente, caracterizadas porque contienen unos inhibidores de
LO tales como se han definido anteriormente, llegado el caso en el
estado de trazas.
La invención se refiere asimismo a las matrices
celulares o a los tejidos o a los implantes tisulares a base de
células tales como se han definido anteriormente, caracterizados
porque contienen unos inhibidores de LO tales como se han definido
anteriormente, llegado el caso en el estado de trazas.
La invención tiene más particularmente por
objeto las células o los implantes celulares, o las matrices
celulares o los tejidos o implantes tisulares mencionados
anteriormente, tales como los obtenidos mediante la realización de
un procedimiento tal como se ha definido anteriormente.
La invención se refiere asimismo a los implantes
de cartílago que comprenden una matriz extracelular esencialmente
libre de colágenos normalmente ausentes del cartílago sano (a saber,
los colágenos I y III), y que comprende la totalidad de los
colágenos específicos del cartílago (a saber, los colágenos II, IX,
XI, y llegado el caso X).
La invención tiene más particularmente por
objeto los implantes de cartílago mencionados anteriormente,
caracterizados porque contienen unos inhibidores de LO tales como se
han definido anteriormente, llegado el caso en el estado de
trazas.
La invención tiene aún más particularmente por
objeto los implantes de cartílago mencionados anteriormente, tales
como los obtenidos mediante la realización de un procedimiento tal
como se ha definido anteriormente.
La invención se refiere asimismo a los implantes
de condrocitos, cuyo fenotipo inicial, de tipo cartílago, ha sido
mantenido durante la fase preliminar de multiplicación celular in
vitro.
La invención tiene asimismo por objeto los
implantes tisulares mencionados anteriormente que corresponden a
unos implantes de piel reconstituida, o sustitutos cutáneos, tales
como los obtenidos mediante la realización de un procedimiento según
la reivindicación 11 efectuado a partir de fibroblastos y/o de
queratinocitos.
La invención se pondrá más claramente de
manifiesto a partir de la descripción siguiente de las utilizaciones
posibles de los inhibidores de LO.
La fabricación de implantes tisulares en
ingeniería tisular debe superar en general un obstáculo principal:
evitar producir un tejido anormal que presente unas propiedades
físico-químicas incompatibles con el uso previsto.
El cultivo de las células in vitro con vistas a su
multiplicación y a su producción de una matriz extracelular se
acompaña desafortunadamente de una alteración de su fenotipo
bioquímico que es más o menos profundo según el tipo de cultivo de
células.
El cultivo de condrocitos ha estado hasta ahora,
desde este punto de vista, acompañado siempre de esta alteración
fenotípica. Las soluciones propuestas hasta ahora para los cultivos
de condrocitos han consistido en añadir (o suprimir a veces) unos
factores solubles al cultivo (hormonas, vitaminas, factores
celulares esencialmente), ya sea ésta efectuada sobre soporte
plástico plano o en un soporte en tres dimensiones de diversas
naturalezas (esponjas de colágenos más o menos reticuladas asociadas
a diversos constituyentes, cerámicas, etc.).
La producción de piel reconstruida está basada
en la interacción de fibroblastos y de queratinocitos dispuestos en
unas condiciones particulares. Las intervenciones que permiten
mejorar esta producción son limitadas y están mal definidas,
frecuentemente sobre una base empírica. Varios nutrientes resultan
así indispensables y han sido añadidos a las condiciones de cultivo.
El tratamiento con \betaAPN presenta la singularidad de dirigirse
a los dos tipos celulares.
El método de la presente invención se aplica a
cualquier tipo de cultivo en ingeniería tisular. Consiste en actuar
sobre el estado físico de la matriz extracelular sintetizada por las
células en cultivo con el fin de modular las señales que ésta envía
a las células, a través de diversos receptores celulares, y regular
así el estado de diferenciación de las células aisladas a partir de
biopsias.
La inhibición de la LO (en particular por el
\betaAPN) ha sido hasta ahora utilizada en el marco de
procedimientos de producción de colágenos, para inhibir la
reticulación de los colágenos por las células y mejorar así las
condiciones de su solubilización. Dicho inhibidor es, por esta
razón, reconocido clásicamente por alterar la matriz extracelular y
ha sido hasta ahora utilizado sólo en tres circunstancias:
- -
- la producción de colágenos no reticulados fácilmente extraíbles,
- -
- el estudio fundamental del mecanismo de acción de la LO,
- -
- contribuir a inhibir los puentes excesivos de los colágenos en ciertas patologías fibrosantes.
\vskip1.000000\baselineskip
Aparte de estos tres campos, la inhibición de la
actividad LO ha aparecido hasta ahora como una molestia, no como una
ventaja.
Las principales ventajas de la presente
invención son las siguientes.
El \betaAPN, el inhibidor tipo de la actividad
LO, es un amino-nitrilo. Este compuesto, muy
económico, no ha sido hasta ahora utilizado para mantener el
fenotipo de las células en cultivo. No tóxico a las dosis usadas
para las células en cultivo, su acción puede sin embargo alcanzar
otras células en el seno de un organismo: por ello, no se puede
utilizar sin riesgo con fines terapéuticos, obligatoriamente
determinados. Su eliminación de los cultivos antes de su utilización
como implante es fácil mediante lavados sucesivos para agotar el
cultivo en \betaAPN. Los demás inhibidores específicos de la
actividad LO podrían ser comparados útilmente en cuanto a su nivel
de tolerancia in vivo en dicho modelo.
La eficacia del \betaAPN a la concentración
habitual de 50 \mug/ml ha sido total después de 2 semanas de
cultivo en el que, en su ausencia, la desdiferenciación de los
condrocitos se había vuelto máxima. Esta concentración se puede
utilizar para el tratamiento de las pieles reconstruidas.
\newpage
La parada del tratamiento mediante el \betaAPN
permite entonces restaurar la actividad de las LO que son segregadas
en continuo (incluso más expresadas en presencia de \betaAPN) por
las células y presentan una duración de actividad limitada en el
tiempo. Aunque la inhibición de las LO por el \betaAPN sea
irreversible, la eliminación del \betaAPN, mediante lavados y
parada del tratamiento, permite restaurar in vitro en el
momento elegido la actividad de esta enzima. La reticulación deseada
de las fibrillas de colágenos y de elastina, sustratos de las LO,
puede así ser programada.
El método de la presente invención se aplica a
cualquier tipo de cultivo en ingeniería tisular, es decir:
- -
- cualquier tipo de soporte: desde el más simple tal como el soporte plástico de las cajas de cultivo, hasta el más sofisticado tal como ciertos modelos de cultivo en tres dimensiones,
- -
- cualquier tipo de células con vistas a implantes tisulares diversos (cartílago, hueso, córnea, vasos sanguíneos, etc.). El tratamiento descrito se puede utilizar para dos tipos de implantaciones:
- a)
- suspensión de condrocitos multiplicados in vitro. Además, el tratamiento previo del cultivo por el \betaAPN mejora el rendimiento de aislamiento de las células viables por tripsinación.
- b)
- Matriz cartilaginosa rica en condrocitos y de viscosidad definida.
\vskip1.000000\baselineskip
En el caso de cartílagos articulares lesionados
o necrosados localmente (cadera en particular), puede ser deseable
recurrir a unas inyecciones de una matriz rica en condrocitos no
desdiferenciados. La fluidez del tapiz celular depende de la
duración del cultivo y puede por lo tanto ser fácilmente elegida por
el cirujano en función de las necesidades. Esta ventaja se puede
generalizar evidentemente a cualquier otra situación encontrada en
ingeniería tisular.
Los tapices celulares así obtenidos después de
un tiempo dado de contacto con un inhibidor de LO pueden servir
asimismo de soporte de estudio en
farmaco-toxicología.
\vskip1.000000\baselineskip
- a)
- El modelo experimental de cultivo de condrocitos es el del cultivo sobre plástico en dos dimensiones de condrocitos embrionarios de pollo. El estado embrionario de las células permite un alto nivel de síntesis de los colágenos, al contrario de los condrocitos adultos. El esternón de pollo del que proceden los condrocitos permite obtener dos sub-poblaciones puras de condrocitos capaces o no de hipertrofiarse ulteriormente (respectivamente, los condrocitos de la parte craneal o caudal del esternón). Las biopsias de cartílago bovino o humano no permiten esta distinción. Los resultados descritos distinguen siempre la sub-población de los condrocitos estudiados.
Los cultivos con antibióticos
L-glutamina 4 mM y 25 \mug/ml de ascorbato (factor
necesario para la estabilidad de las unidades en triple hélice de
colágenos segregados) continúan durante 2 semanas en presencia o en
ausencia de 10% de suero, sustituido eventualmente por la insulina
100 ng/ml, y de 50 \mug/ml de \betaAPN. La ausencia de suero
necesita la adición de agentes protectores (1 mM de cisteína y 1 mM
de piruvato). Un día antes de las extracciones, se añaden 10 \muCi
de 14C Prolina a los cultivos cuyos tapices o medios serán
pepsinados a continuación (0,2 mg de pepsina/ml/pH 4/24 horas) y
sometidos al análisis electroforético (SDS PAGE en gradiente de 4,5
a 15% de acrilamida) y después fluorográfico. Los fluorogramas
revelarán entonces las únicas bandas proteínicas
pepsino-resistentes, esencialmente los colágenos y
unas lipocalinas (proteínas de transporte lipídico). La posición
conocida de estas bandas permite señalar la desdiferenciación de las
células por la aparición de la cadena \alpha2I del colágeno I
asociada al descenso de síntesis de los colágenos de tipo
cartílago.
La actividad lisil-oxidasa ha
sido dosificada a 300.000 dpm de elastina marcada sobre la lisina,
sustrato de la enzima (Shackelton y Hulmes, Anal. Biochem. (1990)
185: 359-362). La determinación de la presencia de
lisil-oxidasas en los cultivos de condrocitos se
lleva a cabo según los métodos habituales de inmunodecoración de los
soportes en lo que han sido transferidas las bandas separadas de las
proteínas extraídas a partir de los medios de cultivo o de los
tapices celulares correspondientes.
- b)
- Los cultivos de condrocitos humanos normales proceden de cartílagos extraídos durante intervenciones de prótesis de cadera o de ligamentoplastia, y después son sometidos a una digestión enzimática. Estas biopsias de cartílago son consideradas como res nullus.
Los condrocitos extraídos del burlete
cotiloidiano han sido utilizados para el cultivo en dos dimensiones
sobre plástico en presencia de \betaAPN: se han comparado los
cultivos obtenidos después de la digestión enzimática de los
cartílagos en presencia o en ausencia de hialuronidasa (figuras 4 y
5).
Los condrocitos obtenidos después de la
ligamentoplastia han sido utilizados para el cultivo en tres
dimensiones en esponja de
colágeno-GAG-quitosano (Collombel
et al. 1987)* en presencia o en ausencia de \betaAPN
(figuras 7 y 8).
*Collombel C., Damour O., Gagneu C., Poinsignon
F., Echinard C., Marichy J.: Peau artificielle et son procédé de
fabrication. Patente de invención francesa nº
87-08752 (15 de junio de 1987), patente de invención
europea nº 88-420194.8 (14 de junio de 1988).
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento que permite la formación de la
piel reconstruida es el descrito en la patente francesa 87 08252 del
15 de junio de 1987.
El soporte del modelo de piel reconstruida está
constituido por un sustrato dérmico (SD) a base de
colágeno-glicosaminoglicano reticulado por quitosano
según la técnica publicada por Duplan-Perrat et
al. (J Invest Dermatol 2000 114:365). Unos fibroblastos son
inoculados en el interior del SD para obtener una dermis
equivalente. La piel reconstruida (PR) se obtiene mediante la
inoculación de los queratinocitos después de 15 días (D15) de
cultivo en dermis equivalente. Los fibroblastos dérmicos se obtienen
a partir de explantes de prepucios humanos después de la separación
dermo-epidérmica y se cultivan en monocapa en medio
DMEM (Sigma) suplementado con 10% de suero de ternera fetal, de
L-glutamina 4 mM, de EGF (Austral Biologic) a 10
ng/ml, de penicilina a 100 Ul/ml, de gentamicina a 100 \mug/ml y
de amfotericina B a 1 \mug/ml. Los queratinocitos proceden de una
extracción de biopsia de piel humana después de la separación
dermo-epidérmica por tripsinación. Las células se
inoculan sobre unas capas nutricias (fibroblastos irradiados) y
cultivadas en DMEM y HAM F12 al 30% suplementado con suero de
ternera fetal al 10%, de EGF a 10 ng/ml, de hidrocortisona a 1,6
ng/ml, de umulina a 0,12 Ul/ml, de coleratoxina a 0,1 nM, de
triiodotironina a 0,2 \muM, de adenina a 24 \mug/ml, de
L-glutamina a 4 mM, de penicilina a 100 Ul/ml, de
gentamicina a 100 \mug/ml y de amfotericina B a 1 \mug/ml.
Una mezcla a base de colágeno bovino de tipo I y
III (72%), de glicosaminoglicano (8%) reticulado por quitosano (20%)
se vierte en unas placas de 6 pocillos. Los sustratos dérmicos así
obtenidos se congelan después a -80ºC y se liofilizan. Los
fibroblastos se inoculan en el sustrato dérmico rehidratado y
esterilizado a razón de 250.000 células por cm^{2}. Unos
queratinocitos se inoculan después de 15 días (D15) con una densidad
de 200.000 a 250.000 células/cm^{2}. Las pieles reconstruidas se
cultivan durante 8 días de manera sumergida, en el medio descrito
anteriormente suplementado con 50 \mug/ml de vitamina C. Las
pieles reconstruidas son elevadas a continuación a la interfaz
aire-líquido utilizando un medio de cultivo
simplificado a base de DMEM, suplementado con suero de ternera
fetal, de EGF, de hidrocortisona, de umulina, de
L-glutamina, de penicilina, de gentamicina, y de
amfotericina B, y de ácido ascórbico, a las concentraciones
descritas anteriormente. Las pieles reconstruidas se cultivan hasta
el día 60. Se realizan unas extracciones el D30 y el D60 para los
diferentes análisis.
\vskip1.000000\baselineskip
El \betaAPN (50 \mug/ml) se añade a partir
de la inoculación al medio de cultivo renovado cada 2 días y
suministrado a los cultivos de condrocitos así como a los de
fibroblastos y después de queratinocitos durante la formación de la
piel reconstruida. La concentración de 50 \mug/ml no es tóxica
para las células y no afecta sustancialmente a la multiplicación
celular. Unas concentraciones más elevadas de 200 \mug/ml parecen
tener poco efecto sobre la viabilidad y la multiplicación de los
fibroblastos y de los queratinocitos en cultivos aislados.
\vskip1.000000\baselineskip
Unos anticuerpos específicos de diversas enzimas
de la familia lisil-oxidasa han permitido
identificar por primera vez estas diferentes isoformas en los
condrocitos, tanto mediante inmuno-decoración
después de la separación electroforética como mediante
inmuno-marcaje de tapices celulares observado con el
microscopio de fluorescencia. Una actividad
lisil-oxidasa específica ha sido, asimismo por
primera vez, demostrada en los medios de cultivo de los condrocitos
(tabla I).
Los anticuerpos anti-LO han
permitido asimismo detectar estas isoformas en la piel reconstruida.
Unos resultados han demostrado una fuerte expresión de las LOX
(figura 4), LOXL1 y LOXL2 a nivel de la dermis, de la epidermis y de
la unión dermo-epidérmica. La observación de una
expresión de estas isoformas de LO en unos queratinocitos es muy
original a este nivel, en el que no existe síntesis ni de colágeno
ni de elastina.
\vskip1.000000\baselineskip
En presencia de suero, con el que los índices de
multiplicación y de síntesis proteicas son óptimos, los condrocitos
estudiados se desdiferencian claramente después de la primera semana
de cultivo, de acuerdo con los datos de la bibliografía. La adición
de \betaAPN durante todo el cultivo suprime cualquier
desdiferenciación, tal como lo atestigua la ausencia de la cadena
colagénica \alpha2I en los fluorogramas. Asimismo, el \betaAPN
suprime asimismo las alteraciones morfológicas observadas por otra
parte a partir de los primeros días en los cultivos no tratados en
los que son bien visibles unas células de forma fibroblástica.
En ausencia de suero, los condrocitos se
adhieren bien sobre el soporte plástico pero se extienden muy
difícilmente, incluso nada para los condrocitos caudales. La
presencia de un anabolizante de los condrocitos, como la insulina,
aumenta un poco los índices de síntesis, no inducen ninguna
desdiferenciación bioquímica con o sin \betaAPN, pero dejan
aparecer una alteración morfológica en ausencia de \betaAPN
(figura 1).
La presencia de suero en el medio de cultivo es
sin embargo deseable para obtener un índice elevado de
multiplicación y de síntesis, permitiendo el \betaAPN suprimir la
alteración del fenotipo bioquímico y morfológico.
Los cultivos de condrocitos así tratados pero
estudiados entre el 2º y el 3º día han mostrado la presencia de
colágenos normales tanto en el tapiz celular como en el medio de
cultivo. Sin embargo, el \betaAPN ha permitido la aparición normal
de colágeno X por los condrocitos hipertróficos: el descenso de esta
síntesis, en ausencia de \betaAPN, se conoce porque precede a la
síntesis de colágeno I, marcador de desdiferenciación (figura 2).
Estos colágenos, de cualquier tipo de cartílago, parecerían por lo
tanto adquirir bien, bajo el efecto de puentes dependientes de LO,
una estructura que contribuiría progresivamente al envío de señales
a los condrocitos, origen de la alteración del fenotipo bioquímico
en cultivo in vitro.
Quedaba por demostrar el origen de esta
inhibición de desdiferenciación por el \betaAPN. Los cultivos en
presencia de \betaAPN no modifican para nada la síntesis y la
secreción de estas LO (figura 3). El \betaAPN actúa por lo tanto
bien sólo en la actividad amina-oxidasa de la
enzima, y no sobre su secreción.
\vskip1.000000\baselineskip
El modo de extracción de las células mediante
digestión enzimática del cartílago permite demostrar unas
sub-poblaciones diferentes de condrocitos en el seno
de una misma biopsia de cartílago. Es el caso de los condrocitos
superficiales y profundos del cotilo del cartílago femoral después
de la adición de hialuronidasa en el medio de extracción. En la
inoculación, estas dos poblaciones de células producen bien colágeno
II, pero no colágeno I. Solos, los condrocitos profundos serán
después capaces en presencia de \betaAPN de conservar su
morfología y su fenotipo durante las dos semanas siguientes en las
que se multiplican produciendo una matriz extracelular de tipo
cartilaginoso, desprovista de colágeno I.
Por lo tanto, resulta necesario utilizar con
fines de ingeniería tisular unas zonas de cartílago cuyas
poblaciones de condrocitos sensibles al \betaAPN han sido
correctamente aisladas.
Sin embargo, unos condrocitos humanos
desdiferenciados al final del tiempo de cultivo necesario para su
multiplicación en cultivo sobre plástico, pueden ser,
ventajosamente, cultivados en tres dimensiones 3D en presencia de
\betaAPN. El cultivo en 3D puede no bastar, por sí solo, para
asegurar un retorno al fenotipo cartílago perdido durante el cultivo
en 2 dimensiones en presencia de suero, tal como se ha descrito para
unos cultivos 3D en agarosa. Efectivamente, la inmunofluorescencia
en triple marcaje del colágeno I, colágeno II y agrecano, sobre unos
cortes obtenidos a partir de cultivos tridimensionales de
condrocitos en esponja ha permitido demostrar el efecto favorable
del \betaAPN sobre la preservación del fenotipo cartílago de los
condrocitos después de tres meses de cultivo:
- una extensión de la zona de depósito de colágeno II en la esponja y un claro aumento de la intensidad de marcaje del colágeno II y del agrecano (marcadores del cartílago) asociada a una fuerte disminución de la del colágeno I debidas al \betaAPN.
\vskip1.000000\baselineskip
Es necesario asegurarse de la eficacia del
tratamiento destinado a eliminar el \betaAPN del cultivo de
células antes de su utilización como implante tisular autólogo. Esta
operación responde a dos exigencias:
- 1ª
- - restablecer una actividad lisil-oxidasa normal en el seno del cartílago implantado durante una reparación.
- 2ª
- - eliminar el riesgo, hipotético pero no demostrado, de un eventual rechazo perjudicial del \betaAPN sobre las células del paciente.
\vskip1.000000\baselineskip
Las modificaciones, observadas por primera vez,
bajo el efecto de la inhibición por el \betaAPN de la actividad
lisil-oxidasa, en los puentes entre cadenas de
colágeno IX resultan muy precoces (preceden a la aparición de
colágeno I marcador de desdiferenciación) e irreversibles, (como muy
tarde, en los 6 días siguientes a la eliminación del \betaAPN)
(figura 9). Se ha demostrado así que unos lavados repetidos del
tapiz celular por PBS previamente a la utilización del medio de
cultivo sin \betaAPN son suficientes para eliminar cualquier traza
de \betaAPN activo.
Por otra parte, se ha verificado que una
inoculación a alta densidad retarda bien la aparición de la
desdiferenciación en cultivo 2D.
\vskip1.000000\baselineskip
La numeración celular muestra que el \betaAPN
presenta un efecto inhibidor sobre la proliferación de los
fibroblastos y de los queratinocitos sólo para unas dosis
relativamente fuertes. En efecto, el número de estas células ha
disminuido aproximadamente 50% con respecto al control cuando se
cultivan en presencia de 600 \mug/ml de \betaAPN. Sin embargo, a
la concentración de 200 \mug/ml, la proliferación de los
fibroblastos ha aumentado ligeramente, mientras que la de los
queratinocitos ha disminuido aproximadamente 10%. Por el contrario,
no se observa ningún efecto tóxico del \betaAPN sobre los
fibroblastos y los queratinocitos en confluencia hasta 800
\mug/ml. Los resultados del ensayo de viabilidad con MTT confirman
los de la numeración celular. En conclusión, estos resultados
indican que el \betaAPN, a unas concentraciones elevadas
(superiores a 500 \mug/ml), presenta un efecto inhibidor sobre la
proliferación de los fibroblastos y de los queratinocitos. Se debe
subrayar que el \betaAPN a 200 \mug/ml puede generar
eventualmente un aumento de la actividad celular (proliferación y
viabilidad) sobre los fibroblastos inoculados a baja densidad, y
sobre los fibroblastos y los queratinocitos inoculados a fuerte
densidad.
\vskip1.000000\baselineskip
Un efecto importante del \betaAPN para los
injertos sería la reducción posible de la retracción inducida por la
reticulación de los colágenos (figura 10).
La superficie de las pieles reconstruidas
sumergidas tratadas con \betaAPN es superior a la de las PR
sumergidas no tratadas, lo que sugiere una atenuación del fenómeno
de retracción. En efecto, si se consideran los resultados obtenidos
antes de la elevación a la interfaz aire-líquido,
las pieles de control no tratadas presentan una disminución de
superficie de 40% con respecto a su estado original, contra 17% sólo
para las pieles tratadas mediante 500 \mug/ml de \betaAPN.
En el día 35 de cultivo, la superficie de las
pieles reconstruidas de control o tratadas mediante 50 g/ml de
\betaAPN es de 50% con respecto a la superficie de partida,
mientras que las pieles reconstruidas tratadas con 200 y 500
\mug/ml de \betaAPN presentan sólo una disminución de superficie
de 40%. El efecto del \betaAPN observado sobre la superficie de
las pieles reconstruidas después de dos semanas de cultivo en la
interfaz aire-líquido no es esta vez
dosis-dependiente. Se observa una superficie
significativamente superior de las PR tratadas por 200 ó 500
\mug/ml de \betaAPN, con respecto a la del control. Las PR
tratadas por 50 \mug/ml de \betaAPN no muestran ninguna
diferencia significativa de su superficie con respecto al control no
tratado.
La histología de las PR (figura 11) no aparece
cambiada fundamentalmente mediante el tratamiento con \betaAPN a
50 \mug/ml o 200 \mug/ml. Las PR tratadas aparecen constituidas
por una dermis que presenta una matriz extracelular (MEC) rica, y
por una epidermis que presenta las capas basales, espinosas,
granulosas y córneas. Incluso si las PR formadas son más frágiles y
la epidermis más fina, la estructura general clásica de la epidermis
está conservada. La colonización inicial de la esponja por los
fibroblastos está favorecida por la presencia de \betaAPN, lo que
se traduce por una síntesis aumentada de MEC.
En la piel normal y en el presente modelo de
piel reconstruida, los queratinocitos de la capa basal representan
las células cepas. La evolución de su fenotipo concomitante y su
migración hacia las capas externas de la epidermis permitirán la
formación de la capa córnea. Esta capa córnea es indispensable,
debido a que asegura la función de barrera de la piel. Su formación
debe ser controlada sin embargo con el fin de permitir la síntesis
de muestras de piel suficientemente importante. Incluso si la
aportación temporal de \betaAPN parece ralentizar la evolución del
fenotipo inicial de los queratinocitos, la organización general en
capas basales, granulosa, espinosa y córnea se mantiene.
Los análisis inmunohistológicos y
ultraestructurales revelan unas modificaciones significativas de las
PR tratadas. Los constituyentes estructurantes de la MEC que son los
colágenos fibrilares ven modificada su organización en fibras. Las
moléculas de colágeno segregadas se depositan en forma de fibras de
diámetros irregulares, que presentan unas fusiones entre fibras
adyacentes. Se ha mostrado por último mediante la hibridación in
situ que el tratamiento por 50 \mug/ml de \betaAPN se
traducía por un ligero aumento de la detección de los genes LOX y
LOXL, al mismo tiempo en la dermis y en la epidermis.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 1: Efecto de la actividad
lisil-oxidasa sobre la desdiferenciación de
condrocitos después de 2 semanas de cultivo en dos dimensiones sobre
plástico.
Se han inoculado 4 millones de condrocitos de la
parte craneal del esternón de pollo por caja de Petri de 35 mm de
diámetro (P35) en medio DMEM con o sin suero al 10% (sustituido por
insulina 100 ng/ml) con o sin \betaAPN (50 \mug/ml). Los medios
de cultivo con 25 \mug/ml de ascorbato son cambiados cada dos
días. Los colágenos neosintetizados marcados con prolina 14C durante
las últimas 24 horas son aislados después de la pepsinación clásica
de los medios de cultivo acondicionados y después sometidos a SDS
PAGE, sin ninguna condición reductora, y a fluorografía.
Observaciones:
- -
- en presencia de suero, altamente anabolizante, la desdiferenciación bioquímica de los condrocitos (colágeno I segregado, parada de síntesis de colágeno X) está totalmente inhibida bajo la acción del \betaAPN que aumenta la proporción de colágeno X específico de estos condrocitos hipertróficos. Asimismo, el \betaAPN preserva la hipertrofia y la morfología no esparcida características de estos condriomas.
- -
- en ausencia de suero, los condrocitos se adhieren al plástico de las cajas pero no se esparcen. Después de 15 días de cultivo, la ausencia de \betaAPN genera sólo la alteración morfológica, pero el crecimiento celular sigue en su conjunto ralentizado a pesar de la presencia de insulina.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 2: Efecto de la actividad
lisil-oxidasa sobre la desdiferenciación de
condrocitos después de 3 días de cultivo, en presencia de suero, en
dos dimensiones sobre plástico.
El estudio fluorográfico descrito para la figura
1 se ha referido en este caso a los tapices y a los medios de
cultivo pepsinados.
Observaciones:
- Solo la presencia de \betaAPN permite la expresión normal de colágeno X (bandas inferiores de los fluorogramas) por los condrocitos hipertróficos (craneales) identificado en los medios y los tapices celulares. La inhibición de la síntesis de colágeno X se conoce porque precede a la aparición de colágeno I mediante los condrocitos durante la desdiferenciación, que se inicia por lo tanto en los primeros días de cultivo mientras que los colágenos anormales no han sido todavía sintetizados.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 3: Inmunodecoración mediante anticuerpos
anti LOX, LOXL1, de extractos de tapices celulares y de medio de
cultivo de condrocitos sometidos a SDS PAGE y después transferencia
sobre membrana de nitrocelulosa.
El día anterior a las extracciones, el tapiz
celular se lava tres veces mediante un medio sin suero. El medio se
cambia entonces para 24 horas por medio completo sin suero.
En el día 6 ó 14 de cultivo los medios se
extraen y se precipitan clásicamente por TCA al 10% final/4ºC/30
minutos. Los residuos de centrifugación se aclaran con acetona y
después se solubilizan en 50 \mul de tampón de electroforesis. Los
tapices celulares aclarados son lisados durante 2h/a 4ºC (300
\mul/P35) en la mezcla de urea 8M, Nonidet al 0,5%, fosfato de
sodio disódico 16 mM, pH 8 e inhibidor de proteasas. La
concentración de urea se lleva hasta 4M antes de la centrifugación
de la suspensión. Los sobrenadantes se precipitan mediante TCA y
después se tratan como para los medios correspondientes.
Después de la separación por SDS PAGE y
transferencia western, las bandas proteínicas se analizan mediante
inmunodecoración con la ayuda de anticuerpos
anti-LOX y anti-LOXL1 policlonales
de conejo, después de un 2º anticuerpo anti-conejo
marcado con fosfatasa alcalina antes de la revelación con el
reactivo NBT/BCIP (Roche Diagnostic GmbH, Manheim, Alemania).
Observaciones:
- 1)
- la LOX y la LOXL1 son expresadas por los condrocitos cultivados en las condiciones descritas para la dosificación de actividad enzimática. Las lisil-oxidasas acumuladas en los tapices después de 1 a 2 semanas pueden ser demostradas, a la inversa de los medios de cultivo de sólo 24 horas.
- 2
- La presencia de \betaAPN no modifica la expresión de las moléculas de lisil-oxidasas, sólo la actividad enzimática está inhibida, tal como lo muestra la tabla I.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 4: Identificación mediante fluorografía
de los colágenos radiomarcados sintetizados por los condrocitos de
cartílagos cotiloidianos en cultivo 2D sobre plástico. Efectos de la
hialuronidasa añadida al medio de digestión enzimática de los
cartílagos.
Los radiomarcajes de 24 horas con prolina 14C
han sido efectuados en los días 2, 7 y 14 del cultivo en presencia
de suero y \betaAPN (D2, D7 y D14 respectivamente). Los extractos
pepsinados de medio de cultivo y de tapiz celular han sido sometidos
a una electroforesis y después a una fluorografía.
Las zonas superficiales (n^{os} pares) y
profundas (n^{os} impares) del cartílago cotiloidiano han sido
separadas antes de ser sometidas a la digestión enzimática en
presencia o no de hialuronidasa.
\newpage
Observaciones:
- b)
- las dos sub-poblaciones de condrocitos, profunda y superficial, presentan un fenotipo cartílago en el 2º día de cultivo, en el que no sintetizan ningún colágeno I, tanto en el tapiz celular como en el medio.
- c)
- En presencia de hialuronidasa durante la digestión previa del cartílago: la zona profunda continúa sin sintetizar ningún colágeno I, tanto en el 7º día como en el 14º día de cultivo.
\vskip1.000000\baselineskip
Por el contrario, las células de la zona
superficial se desdiferencian produciendo colágeno I de manera
creciente desde el 7º día hasta el 14º día de cultivo. Un colágeno I
neosintetizado está asimismo presente en el tapiz celular. Un
colágeno III se produce tardíamente y en baja proporción en el 14º
día en el medio de cultivo, pero está muy poco retenido en el tapiz
celular, a la inversa del colágeno II.
- d)
- En ausencia de hialuronidasa durante la digestión previa del cartílago: las dos sub-poblaciones de condrocitos que se acaban de definir evolucionan de manera similar durante las dos semanas de cultivo desdiferenciándose.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 5: Morfología de las células de cartílago
cotiloidiano en cultivo 2D sobre plástico.
Las observaciones han sido efectuadas en los
días 7 y 14 de cultivo (D7 y D14) en presencia de suero y \betaAPN
sobre los mismos cultivos utilizados para los radiomarcajes.
Digestiones enzimáticas previas de los
cartílagos en presencia (+) o en ausencia (-) de hialuronidasa.
Observaciones:
- e)
- digestión en presencia de hialuronidasa (+): en el 7º día de cultivo (a, e): las células de la zona profunda presentan una morfología característica de los condrocitos, tal como se puede observar in situ. Por el contrario, las células de la zona superficial, de tipo fibroblastoide, presentan numerosas y delgadas prolongaciones. Estas diferencias se mantienen durante las multiplicaciones sucesivas por lo menos hasta el 14º día de cultivo (c, g),
- f)
- Digestión en ausencia de hialuronidasa (-): las células están incluidas en una matriz extracelular más abundante en la que las diferencias morfológicas entre los dos sub-tipos de células son menos claras (b, f, d y h).
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 6: Estructura del cartílago humano
normal.
Figura 7: Condrocitos humanos normales
cultivados durante 1 mes en 3D bajo agitación en presencia de
\betaAPN.
Cultivos en 3D en unas esponjas de
colágeno-GAG-quitosano, en presencia
de suero y \betaAPN de condrocitos humanos normales. Los
condrocitos han sido previamente multiplicados, y desdiferenciados,
en cultivo 2D sobre plástico.
El análisis histológico muestra en superficie la
presencia de una zona densa espesa de estructura histológica muy
cercana de la del cartílago humano normal (figura 6). Los
condrocitos están rodeados de una matriz extracelular importante que
se han neosintetizado y están alojados en pequeñas lagunas. Más
profundamente, se observa una colonización de la esponja con una
síntesis de matriz muy pobre.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 8: Condrocitos humanos normales
cultivados durante 1 mes en 3D bajo agitación sin \betaAPN.
Las mismas esponjas de
colágeno-GAG-quitosano tratadas en
este caso sin \betaAPN presentan en superficie una zona densa poco
gruesa localizada sobre una superficie limitada de la esponja. Más
profundamente, la colonización y la síntesis de matriz no difieren
de las esponjas tratadas con \betaAPN.
En conclusión, el tratamiento con \betaAPN
parece favorecer el desarrollo de una estructura cercana de la del
cartílago humano normal en superficie.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 9: Reversibilidad de los efectos del
\betaAPN sobre los puentes de las cadenas de colágeno IX producido
en el tapiz celular de condrocitos hipertróficos de pollo
embrionario. Estudio fluorográfico.
\newpage
Unos condrocitos de la parte craneal de esternón
han sido inoculados a fuerte concentración (5 millones de células
por caja de Petri P35) y después han sido sometidos a 24 horas de
radiomarcaje con prolina 14C los días 7, 14 y 24 de cultivo
(respectivamente D7, D14 y D21).
El \betaAPN estaba presente (+) o ausente (-)
durante la duración total del cultivo, o presente sólo durante la
primera semana ((+)).
Observaciones:
- La presencia de dos bandas principales de colágeno IX varía en función de la presencia o no de \betaAPN durante todo el cultivo: la banda A está relacionada con la ausencia de \betaAPN, mientras que la banda B se observa esencialmente en presencia de \betaAPN. La presencia de \betaAPN limitada a la única primera semana proporciona un perfil electroforético después de 2 y 3 semanas de cultivo que es característico de un cultivo sin \betaAPN.
En todos los casos, la síntesis de colágeno X
aumenta con la edad del cultivo, pero la síntesis de colágeno 1 está
ralentizada por la fuerte densidad de inoculación inicial (5
millones de células/P35 en lugar de 1,5).
\vskip1.000000\baselineskip
Conclusiones:
- Se muestra el efecto del \betaAPN sobre los puentes del colágeno IX, precede al de la desdiferenciación caracterizada por la síntesis de colágeno I. Estos resultados muestran:
- b)
- la reversibilidad de los efectos del \betaAPN.
- c)
- La eficacia de la eliminación del \betaAPN del cultivo celular después de los lavados repetidos de los tapices celulares y después la utilización de un medio de cultivo sin \betaAPN.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 10: Análisis inmunohistoquímico de la
piel reconstruida con y sin \betaAPN
1 y 2: coloración de control con hematoxilina
sin el 1^{er} anticuerpo.
3 a 6: inmunodetección de la LOX por un 2º
anticuerpo marcado con peroxidasa en ausencia (1, 3, 5) o en
presencia (2, 4, 6) de \betaAPN.
Las coloraciones de color marrón oscuro marcan
la presencia del antígeno LOX y están ausentes de los cortes de
control.
Después de 35 días de formación, la piel
reconstruida está constituida por una dermis depositada sobre la
esponja de
colágeno-glicosaminoglicano-quitosano,
y por una epidermis formada por los queratinocitos.
A nivel de la dermis, el tratamiento con
\betaAPN permite una colonización más importante de la esponja por
los fibroblastos, lo que se traduce por una síntesis aumentada de
matriz extracelular (1 y 2). La expresión de LOX aparece más
intensa.
A nivel de la epidermis, se vuelve a encontrar
la estratificación general, pero el tratamiento con \betaAPN hace
aparecer una línea granulosa más intensa. La expresión de LOX ha
aumentado asimismo.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 11: Efecto del \betaAPN sobre la
retracción de pieles reconstruidas:
El \beta-APN provoca una
disminución dosis-dependiente y significativa de la
retracción con respecto al control, cuando las pieles están todavía
en cultivo sumergido (en gris). Después de dos semanas en la
interfaz aire-líquido (en blanco), la retracción
sigue disminuida con respecto al control, pero solamente para las
concentraciones de 200 y
500 \mug/ml.
500 \mug/ml.
\newpage
Dos poblaciones de condrocitos de esternón de
embrión de pollo (hipertróficos en la parte craneal, que sintetizan
el colágeno X, y no hipertróficos en la parte caudal). Inoculación:
4 millones de células/Petri 35 mm (P35).
Cultivo + 25 \mug/ml de ascorbato, + 1 mM de
piruvato, \pm 10% de FCS, \pm 1 mM de cys. El tapiz celular se
lava mediante el medio sin suero + cys 24 horas antes de la recogida
del medio sin suero (1,5 ml). Unas alícuotas de medio de cultivo,
después de 24 horas, son concentradas 10 veces y después sometidas a
la dosificación de la actividad lisil-oxidasa con
diferentes lotes de sustrato elastina tritiada.
\vskip1.000000\baselineskip
Unas actividades lisil-oxidasa
(inhibidas por el \betaAPN y dosificadas por la producción de agua
tritiada) son segregadas en los medios de cultivo. La actividad
específica recogida en los medios es más fuerte el día 7 de cultivo
que el día 13. Siendo la matriz extracelular más rica en sustratos
colagénicos naturales de la actividad lisil-oxidasa
el día 13 de cultivo, retendría por lo tanto la enzima en el tapiz
celular.
Claims (14)
1. Utilización de inhibidores directos de
lisil-oxidasas (LO) seleccionados entre:
- las aminas primarias que reaccionan con el grupo carbonilo del sitio activo de las LO, y más particularmente las que proporcionan, después de una unión al carbonilo, un producto estabilizado por resonancia, tales como las aminas primarias siguientes:
- -
- la etilendiamina,
- -
- los aminonitrilos, tales como el \beta-aminopropionitrilo (\betaAPN) o la 2-nitroetilamina,
- -
- las haloaminas insaturadas o saturadas, tales como la 2-bromoetilamina, la 2-cloroetilamina, la 2-trifluoroetilamina, la 3-bromopropilamina, las p-halobencilaminas, y los compuestos halogenados insaturados,
- -
- la selenohomocisteína lactona.
como inhibidores de la desdiferenciación de las
células en cultivo in vitro, con vistas al mantenimiento
constante del fenotipo de dichas células en el marco de la
realización de un procedimiento de cultivo in vitro de estas
últimas, y durante la totalidad del tiempo de cultivo, para la
preparación de células diferenciadas cuyo fenotipo es idéntico, o
para la preparación de una matriz celular constituida por células
diferenciadas que conservan el mismo fenotipo y cultivadas en
presencia de dichos inhibidores, y del medio extracelular segregado
por dichas células y que une estas últimas en la matriz.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Utilización del \betaAPN como inhibidor de
las LO según la reivindicación 1.
3. Utilización de inhibidores de LO según una de
las reivindicaciones 1 a 2, para la realización de procedimientos de
cultivo in vitro de cualquier célula de origen humano o
animal, en la que dichas células son mantenidas a un fenotipo de
diferenciación constante, y se seleccionan en particular de entre
los condrocitos de los cartílagos, y las células de la córnea, las
células de la piel (tales como los fibroblastos de la dermis, y los
queratinocitos de la epidermis), las células endoteliales de los
vasos, los osteoblastos de los huesos, los hepatocitos, las células
renales, las células musculares, las células cepas o
pluripotentes.
4. Utilización de inhibidores de LO según una de
las reivindicaciones 1 a 3, para la realización de procedimientos de
cultivo in vitro de células.
5. Utilización de inhibidores de LO según una de
las reivindicaciones 1 a 3, para la realización de procedimientos de
cultivo in vitro de células con vistas a obtener unos
tejidos, tales como de la piel o de cartílago.
6. Procedimiento de cultivo in vitro de
células tales como las definidas en la reivindicación 3, durante el
cual el fenotipo de dichas células se mantiene en un estado idéntico
al que se encontraban inicialmente dichas células durante su
cultivo, comprendiendo dicho procedimiento el cultivo de dichas
células en un medio apropiado que contiene uno o varios inhibidores
de LO definidos en una de las reivindicaciones 1 a 2.
7. Procedimiento de preparación de células, o de
implantes celulares, caracterizado porque comprende:
- -
- realizar un procedimiento de cultivo in vitro de células según la reivindicación 6,
- -
- llegado el caso, una o varias etapas de lavado de las células en cultivo con la ayuda de un disolución tampón apropiada, con el fin de eliminar la totalidad o parte del o de los inhibidores de LO utilizados,
- -
- llegado el caso, una etapa de digestión enzimática de la materia extracelular susceptible de formarse, con la ayuda de enzimas apropiadas,
- -
- llegado el caso, una etapa de recuperación de las células cultivadas.
\vskip1.000000\baselineskip
8. Procedimiento de preparación in vitro
de una matriz celular tal como la definida en la reivindicación 1,
susceptible de poder ser utilizada como tejidos o implantes
tisulares, constituidos por células diferenciadas al fenotipo
idéntico, caracterizado porque comprende:
- -
- realizar un procedimiento de cultivo in vitro de células según la reivindicación 6, hasta la formación de una matriz celular tal como se ha definido anteriormente, suficiente para constituir una trama tisular,
- -
- llegado el caso, una o varias etapas de lavado de la matriz celular en cultivo con la ayuda de una disolución tampón apropiada, con el fin de eliminar la totalidad o parte del o de los inhibidores de LO utilizados,
- -
- llegado el caso, una etapa de recuperación de la matriz celular tal como se ha definido anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
9. Procedimiento de preparación in vitro
de tejidos según la reivindicación 8, aplicado a la neosíntesis de
implantes de cartílago cuando dicho procedimiento se efectúa a
partir de condrocitos, o a la preparación de sustitutos cutáneos
cuando dicho procedimiento se efectúa a partir de fibroblastos y/o
de queratinocitos.
10. Procedimiento de cribado de moléculas de
interés farmacológico, en particular de medicamentos,
caracterizado porque comprende:
- -
- realizar un procedimiento de cultivo in vitro de células según la reivindicación 6, llegado el caso hasta la formación de una matriz celular suficiente para constituir una trama tisular,
- -
- llegado el caso, una o varias etapas de lavado de los tejidos en cultivo con la ayuda de una disolución tampón apropiada, con el fin de eliminar la totalidad o parte del o de los inhibidores de LO utilizados,
- -
- una etapa de puesta en presencia de la molécula ensayada con las células o tejidos obtenidos durante las etapas anteriores,
- -
- detectar el eventual efecto de dicha molécula sobre las células o los tejidos mencionados anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
11. Implantes para la terapia celular que
corresponden a unos implantes de suspensiones de condrocitos
diferenciados, cuyo fenotipo inicial de tipo cartílago ha sido
mantenido durante la fase preliminar de multiplicación celular in
vitro, tales como los obtenidos mediante la realización de un
procedimiento según la reivindicación 7.
12. Implantes para la terapia tisular de tipo
cartílago, tales como los obtenidos mediante la realización de un
procedimiento según la reivindicación 8 efectuado a partir de
condrocitos, que comprenden una matriz extracelular exenta de
colágenos normalmente ausentes del cartílago sano (a saber, los
colágenos I y III), y que comprenden la totalidad de los colágenos
específicos del cartílago (a saber, los colágenos II, IX, XI, y
llegado el caso X).
13. Implantes de cartílago según la
reivindicación 12, caracterizados porque contienen unos
inhibidores de LO en el estado de trazas.
14. Implantes de piel reconstituida, o
sustitutos cutáneos, tales como los obtenidos mediante la
realización de un procedimiento según la reivindicación 10 efectuado
a partir de fibroblastos y/o de queratinocitos, habiendo disminuido
la superficie de dichos implantes 40% después de 35 días de cultivo
con respecto a la superficie de partida.
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