ES2345876T3

ES2345876T3 - Particulas de replicones de alfavirus quimericos.

Info

Publication number: ES2345876T3
Application number: ES02731350T
Authority: ES
Inventors: John Polo; Sylvia Perri; Kent Thudium
Original assignee: NOVARTIS VACCINES and DIAGNOSTIC; Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Current assignee: NOVARTIS VACCINES and DIAGNOSTIC; Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 2001-05-31
Filing date: 2002-04-11
Publication date: 2010-10-05
Anticipated expiration: 2022-04-11
Also published as: US8158418B2; EP2305299B1; EP2332573A1; EP1399183B1; ES2624854T3; US7531180B2; EP1399183A2; US20030148262A1; JP4608210B2; JP2010254711A; EP2305299A1; WO2002099035A2; EP1399183A4; DE60236864D1; WO2002099035A3; JP5268196B2; AU2002303330B2; CA2448066A1; ATE472335T1; JP2005515755A

Abstract

Una partícula de alfavirus quimérico que comprende ARN que codifica una o más proteínas no estructurales derivadas de un primer alfavirus y una señal de empaquetamiento derivada de un segundo alfavirus diferente de dicho primer alfavirus, en la que dicha señal de empaquetamiento está insertada en un sitio seleccionado del grupo constituido por la unión de nsP3 con nsP4, en el extremo 3' del marco de lectura abierto de nsP4, y una eliminación en un gen de proteína no estructural; una proteína de la cápside derivada de dicho segundo alfavirus; y una proteína de la envoltura derivada de un alfavirus diferente de dicho primer alfavirus, en la que dicho ARN comprende además una secuencia de ácido nucleico heteróloga que codifica un agente terapéutico o un inmunógeno.

Description

Partículas de replicones de alfavirus quiméricos.

Campo técnico

La presente invención se refiere a partículas de alfavirus quiméricos. Los alfavirus quiméricos de la presente invención son útiles en la administración ex vivo e in vivo de genes heterólogos que tienen aplicaciones terapéuticas o profilácticas.

Antecedentes

Los alfavirus comprenden un conjunto de virus transmitidos por artrópodos, relacionados genética, estructural y serológicamente de la familia Togaviridae. Dentro del género Alphavirus se han clasificado veintiséis virus y subtipos de virus conocidos, que incluyen el Virus Sindbis, el Virus de Semliki Forest, el Virus de Ross River y el Virus de la Encefalitis Equina Venezolana.

El Virus Sindbis es el miembro prototípico del género Alphavirus de la familia Togaviridae. Su estrategia de replicación ha sido bien caracterizada en una variedad de células cultivadas y sirve como modelo de otros alfavirus. En síntesis, el genoma del Virus Sindbis (como el de otros alfavirus) es una molécula de ARN de sentido positivo monocatenario de aproximadamente 12 kb con casquete y poliadenilada, y contenida en una cubierta proteica, la cápside, codificada por el virus. La nucleocápside se rodea además de una envoltura lipídica, derivada del huésped, dentro de la que hay insertadas dos glucoproteínas específicas virales, la E1 y E2, que están ancladas por una cola citoplasmática con la nucleocápside. Ciertos alfavirus (p. ej., SFV) mantienen también una proteína adicional, la E3, que es un producto de la escisión de la proteína precursora de E2, la PE2.

Tras la adsorción de las partículas virales hacia las células diana, la penetración y el descubrimiento de la nucleocápside para liberar el ARN genómico viral en el citoplasma, se genera el proceso replicativo a través de cuatro proteínas no estructurales (nsP) alfavirales, traducidas de los dos tercios 5' del genoma viral. A su vez, la síntesis de un ARN de cadena negativa de longitud completa proporciona un molde para la síntesis de más ARN genómico de cadena positiva y un ARN subgenómico 26S expresado de manera abundante, iniciada internamente en el promotor de la región de unión. Las proteínas estructurales alfavirales se traducen del ARN 26S subgenómico, que representa el tercio 3' del genoma, y como las nsP, se procesan después de la traducción en las proteínas individuales.

Se están desarrollando varios miembros del género Alphavirus como vectores de expresión "replicones" para su uso como vacunas y compuestos terapéuticos. Los vectores replicones se pueden utilizar en varios formatos, incluyendo ADN, ARN y partículas de replicones recombinantes. Tales vectores replicones han sido obtenidos de alfavirus que incluyen, por ejemplo, el Virus Sindbis (Xiong et al. (1989), Science 243:1188-1191; Dubensky et al., (1996) J. Virol. 70:508-519; Hariharan et al. (1998), J. Virol. 72:950-958; Polo et al. (1999) PNAS 96:4598-4603), el Virus de Semliki Forest (Liljestrom (1991), Bio/Technology 9:1356-1361; Berglund et al. (1998) Nat. Biotech. 16:562-565) y el Virus de la Encefalitis Equina Venezolana (Pushko et al. (1997) Virology 239:389-401). Actualmente, hay una extensa biobliografía que demuestra la eficacia de los vectores replicones de alfavirus para aplicaciones tales como vacunas (véase, por ejemplo, Dubensky et al., ibid; Berglund et al., ibid; Hariharan et al., ibid, Pushko et al., ibid; Polo et al., ibid; Davis et al., (2000) J. Virol. 74:371-378; Schlesinger y Dubensky (1999) Curr. Open. Biotechnol. 10:434-439; Berglund et al. (1999) Vaccine 17:497-507). En términos generales, partícula de "replicón" se refiere a una partícula viral que contiene un ácido nucleico auto-replicante. La propia partícula de replicón se considera generalmente incompetente o defectuosa para la replicación. Es decir, que no se producirá una progenie de partículas de replicones cuando una célula es infectada con una partícula de replicón. A través de los años, han surgido varios términos que se usan como sinónimos para describir las partículas de replicones. Estos términos incluyen partícula viral recombinante, partícula de alfavirus recombinante, partícula de replicón de alfavirus y partícula de replicón. Sin embargo, como se usan en la presente memoria, todos estos términos se refieren a una unidad de tipo virión que contiene un vector replicón de ARN derivado de un virus, específicamente, un vector replicón de ARN alfaviral. Además, se puede hacer re-
ferencia colectivamente a estos términos como vectores, constructos de vectores o vectores de administración de genes.

Actualmente, se están desarrollando varios alfavirus como sistemas de administración de genes para vacunas y otras aplicaciones terapéuticas. Aunque son generalmente bastante similares en cuanto a sus características globales (p. ej., la estructura, la replicación), cada alfavirus puede presentar alguna propiedad particular (p. ej., unión a receptores, sensibilidad al interferón y perfil patológico) que sea única. Para aprovechar las propiedades más deseables de cada virus, se ha desarrollado un enfoque de partículas de replicones quiméricos. Específicamente, una partícula de replicón de alfavirus quimérico puede tener ARN derivado de un virus y uno o más componentes estructurales derivados de un virus diferente. Los componentes virales derivan generalmente de virus estrechamente relacionados; sin embargo, es posible la existencia de partículas de virus quiméricos procedentes de familias de virus divergentes.

Se había demostrado con anterioridad que es posible generar partículas de replicones de alfavirus quiméricos en las que el vector de ARN derive de un primer alfavirus y que las proteínas estructurales de la "cubierta" (p. ej., glucoproteínas de la envoltura) deriven de un segundo alfavirus (véase, por ejemplo, la solicitud de patente estadounidense con número de serie 09/236.140; véanse también, las patentes 5.789.245; 5.842.723; 5.789.245; 5.842.723 y 6.015.694; así como los documentos WO 95/07994, WO 97/38087 y WO 99/18226). Sin embargo, aunque las estrategias descritas anteriormente fueron satisfactorias para elaborar varias quimeras alfavirales, tales partículas quiméricas no se producen siempre con rendimientos comercialmente viables, quizás debido a las interacciones menos eficientes entre el ARN viral y las proteínas estructurales, que dan como resultado una menor productividad.

De este modo, siguen siendo necesarias composiciones que comprendan y procedimientos para elaborar y usar partículas de replicones quiméricos y replicones, por ejemplo, para su uso como vehículos de administración de genes que tengan un tropismo celular y tisular alterado y/o una antigenicidad superficial frente a las proteínas estructurales.

Resumen

La presente invención incluye composiciones que comprenden alfavirus quiméricos y partículas de replicones de alfavirus quiméricos, así como procedimientos para crear estas partículas.

La presente invención proporciona una partícula de alfavirus quimérico que comprende:

ARN que codifica una o más proteínas no estructurales derivadas de un primer alfavirus y una señal de empaquetamiento derivada de un segundo alfavirus diferente de dicho primer alfavirus, en la que dicha partícula de empaquetamiento está insertada en un sitio seleccionado del grupo constituido por la unión de nsP3 con nsP4, en el extremo 3' del marco de lectura abierto de nsP4, y una eliminación en un gen de proteína no estructural;

una proteína de la cápside derivada de dicho segundo alfavirus; y

una proteína de la envoltura derivada de un alfavirus diferente de dicho primer alfavirus,

en la que dicho ARN comprende además una secuencia de ácido nucleico heteróloga que codifica una agente terapéutico o un inmunógeno.

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La invención proporciona también una composición farmacéutica que comprende una partícula de alfavirus de la invención en combinación con un vehículo, diluyente o receptor farmacéuticamente aceptable.

La invención proporciona también una partícula de alfavirus según la invención que expresa uno o más antígenos derivados de al menos un agente patógeno, para su uso en la estimulación de una respuesta inmune en un animal de sangre caliente.

La invención también proporciona un procedimiento para producir partículas de replicones de alfavirus que comprende introducir en una célula huésped:

(a): un ARN replicón de alfavirus que codifica una o más proteínas no estructurales de un primer alfavirus, una señal de empaquetamiento derivada de un segundo alfavirus diferente de dicho primer alfavirus y una o más secuencias heterólogas que codifican un agente terapéutico o inmunógeno, en el que dicha señal de empaquetamiento está insertada en un sitio seleccionado del grupo constituido por la unión de nsP3 y nsP4, en el extremo 3' del marco de lectura abierto de nsP4 y una eliminación en un gen de proteína no estructural; y

(b): al menos un ARN auxiliar defectuoso separado que codifica una o varias proteínas estructurales ausentes del ARN replicón, en el que al menos una de dichas proteínas estructurales es una proteína de la cápside derivada de dicho segundo alfavirus y al menos una de dichas proteínas estructurales es una proteína de la envoltura derivada de una alfavirus diferente de dicho primer alfavirus, en el que se producen las partículas de replicones de alfavirus.

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También se revelan en la presente memoria partículas de alfavirus quiméricos que comprenden ARN derivado de uno o más alfavirus; y proteínas estructurales en las que al menos una de dichas proteínas estructurales deriva de dos o más alfavirus. Es posible que el ARN derive de un primer alfavirus y que las proteínas estructurales comprendan (a) una proteína de la cápside híbrida que tenga (i) un dominio de unión a ARN derivado de dicho primer alfavirus y (ii) un dominio de interacción con glucoproteínas de la envoltura derivado de un segundo alfavirus; y (b) una glucoproteína de la envoltura de dicho segundo alfavirus. Alternativamente, es posible que el ARN derive de un primer alfavirus y que las proteínas estructurales comprendan (a) una proteína de la cápside derivada de un primer alfavirus; y (b) una glucoproteína de la envoltura que tenga (i) una parte de cola citoplasmática y (ii) una parte restante, en la que la parte de cola citoplasmática derive de dicho primer alfavirus y la parte restante derive de un segundo alfavirus. El ácido nucleico puede derivar de un primer virus que esté contenido en una cápside viral derivada del mismo virus, pero que tenga componentes de glucoproteínas de la envoltura de un segundo virus. En otra alternativa más, las partículas quiméricas pueden comprender proteínas de la cápside híbridas y proteínas de la envoltura híbridas. Además, comúnmente, las proteínas híbridas contienen al menos un dominio funcional derivado de un primer alfavirus, mientras que la parte restante de la proteína deriva de uno o más alfavirus adicionales (p. ej., componentes de glucoproteínas de la envoltura derivados del primer virus, del segundo virus o de una combinación de dos o más virus). La parte restante puede incluir del 25% al 100% (o cualquier valor intermedio) de secuencias derivadas de diferentes alfavirus.

Por lo tanto, las partículas de replicones de alfavirus modificados (o quiméricos) reveladas en la presente memoria incluyen, pero no se limitan a, partículas de replicones compuestas por un ácido nucleico derivado de uno o más alfavirus (proporcionado por el vector replicón) que está contenido en al menos un elemento estructural (proteína de la cápside y/o de la envoltura) derivado de dos o más alfavirus (p. ej., proporcionados por auxiliares defectuosos u otros casetes de expresión de genes de proteínas estructurales). Por ejemplo, las partículas quiméricas comprenden ARN de un primer alfavirus, una proteína de la cápside híbrida con un dominio de unión a ARN del primer alfavirus y un dominio de interacción con glucoproteínas de la envoltura de un segundo alfavirus, y una glucoproteína de la envoltura del segundo alfavirus. Alternativamente, las partículas de la presente invención pueden comprender ARN de un primer alfavirus, una proteína de la cápside del primer alfavirus y una glucoproteína de la envoltura que tiene una cola citoplasmática del primer alfavirus con la parte restante de la glucoproteína de la envoltura derivada de un segundo virus. En otra alternativa más, las partículas de alfavirus quiméricos comprenden ARN de un primer alfavirus, ARN que tiene una señal de empaquetamiento de un segundo alfavirus insertada, por ejemplo, en una región de genes de proteínas no estructurales que está eliminada, y una proteína de la cápside y una glucoproteína de la envoltura del segundo alfavirus.

También se revelan en la presente memoria partículas de alfavirus quiméricos que comprenden (a) ARN que codifica una o más proteínas no estructurales derivadas de un primer alfavirus y una señal de empaquetamiento derivada de un segundo alfavirus diferente de dicho primer alfavirus (p. ej., una señal de empaquetamiento insertada en un sitio seleccionado del grupo constituido por la unión de nsP3 y nsP4, tras el marco de lectura abierto de nsP4, y una eliminación en un gen de proteína no estructural); (b) una proteína de la cápside derivada de dicho segundo alfavirus; y (c) una proteína de la envoltura derivada de un alfavirus diferente de dicho primer alfavirus. La proteína de la envoltura puede estar derivada del segundo alfavirus.

En cualquiera de las partículas quiméricas descritas en la presente memoria, el ARN puede comprender, en el sentido de 5' a 3', (i) una secuencia 5' necesaria para la amplificación mediada por proteínas no estructurales; (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica proteínas no estructurales alfavirales; (iii) un medio para expresar un ácido nucleico heterólogo (p. ej., un promotor de la región de unión viral); (iv) la secuencia de ácido nucleico heteróloga (p. ej., un inmunógeno); (v) una secuencia 3' necesaria para la amplificación mediada por proteínas no estructurales y (vi) un tracto poliadenilado. La secuencia de ácido nucleico heteróloga puede sustituir un gen de proteína estructural alfaviral. Además, en cualquiera de las alternativas descritas en la presente memoria, las quimeras pueden estar compuestas por secuencias derivadas del Virus Sindbis (SIN) y el Virus de la Encefalitis Equina Venezolana (VEE), en las que, por ejemplo, el primer alfavirus sea VEE y el segundo alfavirus sea SIN o en las que el primer alfavirus sea VEE y el segundo sea SIN.

También se revela en la presente memoria un ARN replicón de alfavirus que comprende una secuencia 5' necesaria para la amplificación mediada por proteínas no estructurales, secuencias que codifican proteínas no estructurales alfavirales biológicamente activas, un promotor subgenómico alfaviral, una secuencia heteróloga no alfaviral y una secuencia 3' necesaria para la amplificación mediada por proteínas no estructurales, en el que la secuencia que codifica al menos una de dichas proteínas no estructurales deriva de un alfavirus de un nivel de bioseguridad 3 (BSL-3) y en el que las secuencias de dicho ARN replicón presentan una identidad secuencial con al menos un tercio, pero no con más de dos tercios, de un genoma de un alfavirus BSL-3. Se pueden incluir copias de ADNc de estos replicones como secuencias de vectores de ácidos nucleicos en un vector del sistema eucariota de iniciación de vectores en capas (ELVIS), por ejemplo, un vector de ELVIS que comprende un promotor 5' que es capaz de iniciar en una célula eucariota la síntesis del ARN a partir de ADNc, y una secuencia de vector de ácido nucleico que es capaz de dirigir su propia replicación y de expresar una secuencia heteróloga. El alfavirus BSL-3 puede ser, por ejemplo, el Virus de la Encefalitis Equina Venezolana (VEE).

En cualquiera de las partículas y los replicones quiméricos descritos en la presente memoria, el ARN puede comprender además una secuencia de ácido nucleico heteróloga, por ejemplo, un agente terapéutico o un inmunógeno (antígeno). La secuencia de ácido nucleico heteróloga puede sustituir a las secuencias que codifican proteínas estructurales. Además, la secuencia de nucleótidos heteróloga puede codificar, por ejemplo, un antígeno de polipéptido derivado de un patógeno (p. ej., un agente infeccioso, tal como virus, bacteria, hongo o parásito). El antígeno puede derivar de un Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH) (p. ej., gag, gp120, gp140, gp160, pol, rev, tat y nef), un Virus de la Hepatitis C (VHC) (p. ej., C, E1, E2, NS3, NS4 y NS5), un Virus de la Gripe (p. ej., HA, NA, NP, M), un Paramixovirus, tal como el Virus Paragripal, el Virus Sincitial Respiratorio o el Virus del Sarampión (p. ej., NP, M, F, HN, H), un Virus del Herpes (p. ej., glucoproteína B, glucoproteína D), un Filovirus, tal como el Virus de Marburg o el Virus Ébola (p. ej., NP, GP), un Buniavirus, tal como el Virus Hantaan o el Virus de la Fiebre de Rift Valley (p. ej., G1, G2, N) o un Flavivirus, tal como el Virus de la Encefalitis Transmitida por Garrapata o Virus West Nile (p. ej., C, prM, E, NS1, NS3, NS5). En cualquiera de las composiciones o de los procedimientos descritos en la presente memoria, el ARN puede comprender además una señal de empaquetamiento de un segundo alfavirus insertada en una región no esencial eliminada de un gen de proteína no estructural 3 (gen de nsP3).

También se revelan en la presente memoria procedimientos para preparar (producir) partículas de replicones de alfavirus. Las partículas se pueden preparar introduciendo cualquiera de los ARN replicones y auxiliares defectuosos descritos en la presente memoria en una célula huésped adecuada en condiciones que permitan la formación de las partículas. En cualquiera de los procedimientos descritos en la presente memoria, los ARN auxiliares defectuosos pueden incluir proteínas estructurales quiméricas y/o híbridas (o secuencias que codifiquen estas proteínas quiméricas/híbridas) según lo descrito en la presente memoria. Por ejemplo, el procedimiento puede comprender introducir en una célula huésped: (a) un ARN replicón de alfavirus derivado de uno o más alfavirus que contenga además una o más secuencias heterólogas; y (b) al menos un ARN auxiliar defectuoso separado que codifique una o varias proteínas estructurales ausentes del ARN del replicón, en el que al menos una de dichas proteínas estructurales deriva de dos o más alfavirus, en el que se producen las partículas de replicones de alfavirus. El ARN replicón puede derivar de uno o más alfavirus y las proteínas estructurales pueden incluir una o más proteínas híbridas, por ejemplo, una proteína de la cápside híbrida que tenga un dominio de unión a ARN derivado de un primer alfavirus y un dominio de interacción con glucoproteínas de la envoltura derivado de un segundo alfavirus; y/o una proteína de la envoltura híbrida que tenga una parte de cola citoplasmática y una parte restante, en la que la parte de la cola citoplasmática deriva de un primer alfavirus y la parte restante de dicha glucoproteína de la envoltura deriva de uno o más alfavirus diferentes del primero.

También se revela en la presente memoria un procedimiento para producir partículas de replicones de alfavirus que comprende introducir en una célula huésped (a) un ARN replicón de alfavirus que codifique una o más proteínas no estructurales de un primer alfavirus, una señal de empaquetamiento derivada de un segundo alfavirus (p. ej., insertada en un sitio seleccionado entre del grupo constituido por la unión de nsP3 con nsP4, tras el marco de lectura abierto de nsP4 y una eliminación de un gen de proteína no estructural) y una o más secuencias heterólogas; y (b) al menos un ARN auxiliar defectuoso separado que codifique una o varias proteínas estructurales ausentes del ARN del replicón, en el que al menos una de dichas proteínas estructurales es una proteína de la cápside derivada de dicho segundo alfavirus y al menos una de dichas proteínas estructurales es una proteína de la envoltura derivada de un alfavirus diferente de dicho primer alfavirus.

También se revelan en la presente memoria líneas celulares de empaquetamiento de alfavirus que comprenden uno o más casetes de expresión de proteínas estructurales que comprenden secuencias que codifican una o más proteínas estructurales, en las que al menos una de dichas proteínas estructurales deriva de dos o más alfavirus. Uno o más casetes de expresión de proteínas estructurales pueden comprender copias de ADNc de un ARN auxiliar defectuoso y, opcionalmente, un promotor subgenómico alfaviral. Además, en cualquiera de estas alternativas, el ARN auxiliar defectuoso puede dirigir la expresión de la(s) proteína(s) estructural(es).

También se revelan en la presente memoria procedimientos para producir partículas de replicones de virus usando las líneas celulares de empaquetamiento. Comúnmente, los procedimientos comprenden introducir, en cualquiera de las líneas celulares de empaquetamiento de alfavirus descritas en la presente memoria, cualquiera de los ARN replicones de alfavirus descritos en la presente memoria, en los que se produce la partícula de alfavirus que comprende una o más secuencias de ARN heterólogas. De este modo, el ARN puede incluir una inserción de señal de empaquetamiento derivada de diferentes alfavirus. Alternativamente, la célula de empaquetamiento puede comprender tres moléculas de ARN separadas, por ejemplo, una primera molécula de ARN auxiliar defectuoso que codifica una o varias proteínas estructurales de la cápside viral, una segunda molécula de ARN auxiliar defectuoso que codifica una o más glucoproteínas estructurales de la envoltura viral y un tercer vector de ARN del replicón que comprende genes que codifican proteínas replicasas no estructurales y un gen heterólogo de interés sustituido por proteínas estructurales virales, en la que al menos una de las moléculas de ARN incluye secuencias derivadas de dos o más alfavirus. Se pueden hacer modificaciones a una o más de las moléculas de ácido nucleico separadas introducidas en la célula (p. ej., célula de empaquetamiento) a efectos de generar partículas de replicones de alfavirus quiméricos. Por ejemplo, se puede preparar un primer ARN auxiliar defectuoso que tenga un gen que codifique una proteína de la cápside híbrida según lo descrito en la presente memoria. La proteína de la cápside híbrida puede tener un dominio de unión a ARN derivado de un primer alfavirus y un dominio de interacción con glucoproteínas de un segundo alfavirus. Un segundo ARN auxiliar defectuoso puede tener un gen o genes que codifiquen una o varias glucoproteínas de la envoltura de un segundo alfavirus, mientras que el ARN del vector replicón deriva de un primer alfavirus. Alternativamente, un constructo de vector replicón de ARN puede derivar de un primer alfavirus que tenga una señal de empaquetamiento de un segundo alfavirus insertada, por ejemplo, en una región de gen de proteína no estructural que está eliminada. El primer y segundo ARN auxiliar defectuoso tienen genes que codifican la proteína de la cápside o las proteínas de la envoltura del segundo alfavirus. Alternativamente, se puede elaborar una partícula de replicón de alfavirus quimérico usando un primer ARN auxiliar defectuoso que codifique una proteína de la cápside (derivada de un primer alfavirus que sea el mismo que el virus del que se obtiene el vector replicón) y un segundo ARN auxiliar defectuoso que tenga un gen que codifique una glucoproteína de la envoltura híbrida que tenga un fragmento de la cola citoplasmática del mismo alfavirus que la proteína de la cápside del primer ARN auxiliar y un "ectodominio" expuesto en la superficie de la glucoproteína derivada de un segundo alfavirus. El fragmento de la cola interactúa con la proteína de la cápside y una partícula de replicón quimérico que tiene ARN y una cápside derivados de un primer virus, y se genera una envoltura derivada fundamentalmente de un segundo virus.

También se revela en la presente memoria un procedimiento para producir partículas de replicones de alfavirus que comprende introducir en una célula permisible (a) cualquiera de los ARN replicones de alfavirus descritos en la presente memoria que comprenden elementos de control y secuencias codificantes de polipéptidos que codifican (i) proteínas no estructurales de alfavirus biológicamente activos y (ii) una proteína heteróloga, y (b) uno o más ARN auxiliares defectuosos que comprenden elementos de control y secuencias codificantes de polipéptidos que codifican al menos una proteína estructural de alfavirus, en los que los elementos de control pueden comprender, en sentido de 5' a 3', una secuencia 5' necesaria para la amplificación mediada por proteínas no estructurales, un medio para expresar las secuencias codificantes de polipéptidos y una secuencia 3' necesaria para la amplificación mediada por proteínas no estructurales, y en los que además uno o más de dichos elementos de control de los replicones de ARN son diferentes de dichos elementos de control de ARN auxiliar defectuoso; e incubar dicha célula en condiciones adecuadas durante un tiempo suficiente para permitir la producción de partículas de replicones. El ARN del replicón y dicho(s) ARN auxiliar(es) defectuoso(s) pueden comprender además una NTR de 5' subgenómica. En otras alternativas, la NTR de 5' subgenómica del ARN del replicón es diferente de la NTR de 5' subgenómica del ARN auxiliar defectuoso; la secuencia 5' necesaria para la amplificación mediada por proteínas no estructurales del ARN del replicón es diferente de la secuencia 5' necesaria para la amplificación mediada por proteínas no estructurales del ARN auxiliar defectuoso; la secuencia 3' necesaria para la amplificación mediada por proteínas no estructurales del ARN del replicón es diferente de la secuencia 3' necesaria para la amplificación mediada por proteínas no estructurales del ARN auxiliar defectuoso; y/o el medio para expresar dichas secuencias codificantes de polipéptidos del ARN del replicón es diferente del medio para expresar dichas secuencias codificantes de polipéptidos del ARN auxiliar defectuoso.

También se revelan en la presente memoria procedimientos para estimular una respuesta inmune en un animal de sangre caliente que comprenden la etapa de administrar a un animal de sangre caliente una preparación de partículas de replicones de alfavirus según la presente invención que expresan uno o más antígenos derivados de al menos un agente patógeno. El antígeno puede derivar de una célula tumoral. Alternativamente, el antígeno puede derivar de un agente infeccioso (p. ej., virus, bacteria, hongo o parásito). Preferiblemente, el antígeno deriva de un Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH) (p. ej., gag, gp120, gp140, gp160, pol, rev, tat y nef), un Virus de la Hepatitis C (VHC) (p. ej., C, E1, E2, NS3, NS4 y NS5), un Virus de la Gripe (p. ej., HA, NA, NP, M), un Paramixovirus, tal como el Virus Paragripal o el Virus Sincitial Respiratorio o el Virus del Sarampión (p. ej., NP, M, F, HN, H), un Virus del Herpes (p. ej., glucoproteína B, glucoproteína D), un Filovirus, tales como el Virus de Marburg o el Virus Ébola (p. ej., NP, GP), un Buniavirus, tal como el Virus Hantaan o el Virus de la Fiebre de Rift Valley (p. ej., G1, G2, N) o un Flavivirus, tal como el Virus de la Encefalitis Transmitida por Garrapata o el Virus West Nile (p. ej., C, prM, E, NS1, NS3, NS5). Cualquiera de los procedimientos descritos en la presente memoria puede comprender además la etapa de administrar una linfocina, quimiocina y/o citocina (p. ej., IL-2, IL-10, IL-12, gamma interferón, GM-CSF, M-CSF, SLC, MIP3\alpha y MIP3\beta). La linfocina, la quimiocina y/o la citocina se pueden administrar como un polipéptido o pueden ser codificadas por un polinucleótido (p. ej., en el mismo replicón o en un replicón diferente que codifique el o los antígenos). Alternativamente, se puede usar una partícula de replicón según lo revelado en la presente memoria que codifique una linfocina, quimiocina y/o citocina para estimular una respuesta inmune.

De este modo, en cualquiera de las composiciones y de los procedimientos descritos en la presente memoria, las secuencias derivan de al menos dos alfavirus, por ejemplo, del Virus de la Encefalitis Equina Venezolana (VEE) y del Virus Sindbis (SIN).

También se revelan en la presente memoria procedimientos para producir partículas de replicones de alfavirus y reducir la probabilidad de generar virus competentes para la replicación (p. ej., virus de tipo natural) durante la producción de dichas partículas, que comprenden introducir en una célula permisible un ARN del replicón de alfavirus y uno o más ARN auxiliares defectuosos que codifiquen al menos una proteína estructural de alfavirus, e incubar dicha célula en condiciones adecuadas durante un tiempo suficiente para permitir la producción de partículas de replicones, en la que dicho ARN del replicón comprende una secuencia 5' necesaria para la amplificación mediada por proteínas no estructurales, secuencias que, cuando se expresan, codifican proteínas no estructurales de alfavirus biológicamente activas, un medio para expresar una o más secuencias heterólogas, una secuencia heteróloga que es un gen que codifica una proteína, siendo dicho gen el gen próximo a 3' del replicón, una secuencia 3' necesaria para la amplificación mediada por proteínas no estructurales, un tracto poliadenilado y, opcionalmente, una NTR de 5' subgenómica; y en la que dicho ARN auxiliar defectuoso comprende una secuencia 5' necesaria para la amplificación mediada por proteínas no estructurales, un medio para expresar una o más proteínas estructurales de alfavirus, un gen que codifica una proteína estructural de alfavirus, siendo dicho gen el gen próximo a 3' del auxiliar defectuoso, una secuencia 3' necesaria para la amplificación mediada por proteínas no estructurales, un tracto poliadenilado y, opcionalmente, una NTR de 5' subgenómica; y en la que dicho ARN del replicón difiere de al menos un ARN auxiliar defectuoso en al menos un elemento seleccionado del grupo constituido por una secuencia 5' necesaria para la amplificación mediada por proteínas no estructurales, un medio para expresar un gen próximo a 3', una NTR de 5' subgenómica y una secuencia 3' necesaria para la amplificación mediada por proteínas no estructurales.

Breve descripción de las figuras

La Fig. 1 representa fragmentos de la síntesis de genes del Virus de la Encefalitis Equina Venezolana (VEE) y sitios de restricción usados para ensamblar un replicón de VEE.

La Fig. 2 representa la síntesis basada en oligonucleótidos del fragmento 2 de la nsP del VEE. (SEC ID N.º 51 y SEC ID N.º 52).

La Fig. 3 representa fragmentos de la síntesis de genes de VEE y sitios de restricción usados para ensamblar genes de proteínas estructurales.

La Fig 4 representa una proteína de la cápside híbrida para la producción eficiente de partículas de los alfavirus quiméricos Virus Sindbis (SIN)/VEE.

La Fig 5 representa una glucoproteína E2 híbrida para la producción eficiente de partículas de los alfavirus quiméricos SIN/VEE.

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La Fig. 6 representa replicones de VEE con una señal de empaquetamiento de SIN heteróloga para el empaquetamiento eficiente usando proteínas estructurales de SIN.

La Fig. 7 representa la inserción de la señal de empaquetamiento de SIN en nsP4/promotor de la región de unión truncada (como la usada en la quimera 1A realizada según las enseñanzas de la presente invención).

La Fig. 8 representa la inserción de la señal de empaquetamiento de SIN en nsP4/promotor de la región de unión no truncada (como la usada en la quimera 1B realizada según las enseñanzas de la presente invención).

La Fig. 9 representa la inserción de la quimera número 2 de empaquetamiento de SN/VEE de la señal de empaquetamiento de SIN en una eliminación de un gen de proteína no estructural (nsP3) de VEE.

La Fig. 10 representa la inserción de la quimera número 3 de empaquetamiento de SIN/VEE de la señal de empaquetamiento de SIN en el terminal carboxilo de nsP3 de VEE.

La Fig. 11 representa la modificación de los terminales de nsP3/nsP4 para la señal de empaquetamiento de SIN.

La Fig. 12 es una gráfica que muestra la inmunogenicidad de quimeras de partículas de replicones de alfavirus que expresan un antígeno del VIH.

Descripción detallada de la invención

La práctica de la presente invención empleará, a no ser que se indique lo contrario, procedimientos convencionales de Química, Bioquímica, Biología Molecular, Inmunología y Farmacología pertenecientes al ámbito de la técnica. Tales técnicas se explican de manera completa en la bibliografía. Véase, p. ej., "Rentington's Pharmaceutical Sciences", XVIII Edición (Easton, Pensilvania: Mack Publishing Company, 1990); "Methods In Enzymology" (S. Colowick y N. Kaplan, eds., Academic Press, Inc.); y "Handbook of Experimental Immunology", Vol. I-IV (D. M. Weir y C. C. Blackwell, eds., 1986, Blackwell Scientific Publications); Sambrook, et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (II Edición, 1989); "Handbook of Surface and Colloidal Chemistry" (Birdi, K. S. ed., CRC Press, 1997); "Short Protocols in Molecular Biology", IV Edición (Ausubel et al. eds., 1999, John Wiley & Sons); "Molecular Biology Techniques: An Intensive Laboratory Course", (Ream et al., eds., 1998, Academic Press); PCR (Introduction to Biotechniques Series), II Edición (Newton & Graham eds., 1997, Springer Verlag); Peters y Dalrymple, "Fields Virology" (II Edición), Fields et al. (eds.), B. N. Raven Press, Nueva York, NY.

Como se usan en esta memoria y en las reivindicaciones anexas, las formas singulares "un", "uno", "una", "el" y "la" incluyen los referentes en plural, a no ser que el contenido dicte claramente lo contrario. De este modo, por ejemplo, la referencia a "una partícula" incluye una mezcla de dos o más de tales partículas.

Antes de exponer la invención, se presentan las definiciones de ciertos términos que se usarán en lo sucesivo.

Una molécula de "ácido nucleico" puede incluir, pero sin limitarse a, secuencias procariotas, ARNm eucariota u otro ARN, ADNc de ARNm eucariota u otro ARN, secuencias de ADN genómico de ADN eucariota (p. ej., de mamífero) e incluso secuencias de ADN sintético. El término también engloba secuencias que incluyen cualquiera de los análogos de bases conocidos de ADN y ARN, e incluye modificaciones tales como eliminaciones, adiciones y sustituciones (generalmente, conservadoras en la naturaleza) de la secuencia nativa. Estas modificaciones pueden ser deliberadas, como a través de mutagénesis de un sitio específico, o pueden ser accidentales. Las modificaciones de los polinucleótidos pueden tener cualquier número de efectos, incluyendo, por ejemplo, facilitar la expresión del producto polipeptídico en una célula huésped.

Los términos "polipéptido" y "proteína" se refieren a un polímero de residuos de aminoácido, y no se limitan a una longitud mínima del producto. De este modo, los péptidos, oligopéptidos, dímeros, multímeros y similares están incluidos en la definición. Quedan englobadas por la definición tanto las proteínas de longitud completa como los fragmentos de las mismas. Los términos también incluyen modificaciones posteriores a la expresión del polipéptido, por ejemplo, la glicosilación, acetilación, fosforilación, y similares. Además, a efectos de la presente invención, un "polipéptido" se refiere a una proteína que incluye modificaciones tales como eliminaciones, adiciones y sustituciones (en general, conservadoras en la naturaleza) en la secuencia nativa, siempre y cuando la proteína mantenga la actividad deseada. Estas modificaciones pueden ser deliberadas, como a través de mutagénesis de un sitio específico, o pueden ser accidentales, tal como a través de mutaciones de los huéspedes que producen las proteínas o los errores debidos a la amplificación por PCR. Además, se pueden realizar modificaciones que tengan uno o más de los siguientes efectos: reducir la toxicidad; facilitar el procesamiento de células (p. ej., la secreción, la presentación de antígenos etc.); y facilitar la presentación a células B y/o células T.

"Ligado/a operativamente" se refiere a una disposición de elementos en la que los componentes así descritos están configurados para que realicen su función habitual. De este modo, un promotor dado ligado operativamente a una secuencia codificante es capaz de efectuar la expresión de la secuencia codificante cuando estén presentes las enzimas apropiadas. No es necesario que el promotor esté contiguo a la secuencia codificante, siempre y cuando funcione para dirigir la expresión de la misma. De este modo, por ejemplo, pueden estar presentes secuencias no traducidas aunque transcritas intermedias entre la secuencia promotora y la secuencia codificante, y que la secuencia promotora siga siendo considerada como que está "ligada operativamente" a la secuencia codificante.

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Las técnicas para determinar la "similitud" entre secuencias de aminoácidos son conocidas en la materia. En general, "similitud" significa la comparación exacta de aminoácido a aminoácido de dos o más polipéptidos en el lugar apropiado, en la que los aminoácidos son idénticos o poseen propiedades químicas y/o físicas similares, tales como la carga o la hidrofobicidad. Luego se puede determinar el denominado "porcentaje de similitud" entre las secuencias de polipéptidos comparadas. Las técnicas para determinar la identidad de las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos también son ampliamente conocidas en la materia, e incluyen determinar la secuencia de nucleótidos del ARNm para ese gen (habitualmente, a través de un ADNc intermedio) y determinar la secuencia de aminoácidos codificada de ese modo, y comparar ésta con una segunda secuencia de aminoácidos. En general, "identidad" se refiere a una correspondencia exacta de nucleótido a nucleótido o de aminoácido a aminoácido de dos polinucleótidos o dos secuencias de polipéptido, respectivamente.

Es posible comparar dos o más secuencias de polinucleótidos determinando su "porcentaje de identidad". Asimismo, es posible comparar dos o más secuencias de aminoácidos determinando su "porcentaje de identidad". En general, el porcentaje de identidad de dos secuencias, bien secuencias de ácidos nucleicos o de péptidos, se describe como el número de coincidencias exactas entre dos secuencias alineadas, dividido entre la longitud de la secuencia más corta y multiplicado por 100. El algoritmo de homologías locales de Smith y Waterman, "Advances in Applied Mathematics", 2: 482-489 (1981), proporciona un alineamiento aproximado para las secuencias de ácidos nucleicos. El uso de este algoritmo se puede extender a secuencias peptídicas usando la matriz de puntuación desarrollada por Dayhoff, "Atlas of Protein Sequences and Structure", M. O. Dayhoff ed., 5 supl. 3: 353-358, Fundación de Investigación Biomédica Nacional, Washington, D. C., EE.UU., y normalizado por Gribskov, Nucl. Acids Res. 14 (6): 6745-6763 (1986). El grupo Genetics Computer Group (Madison, WI), en su aplicación de la herramienta BestFit, proporciona una implementación de este algoritmo para secuencias de ácidos nucleicos y péptidos. En el manual del programa del paquete de análisis de secuencias de Wisconsin, Versión 8 (1995) (disponible en Genetics Computer Group, Madison, WI), se describen los parámetros por defecto para este procedimiento. Hay otros programas igualmente adecuados para calcular el porcentaje de identidad o de similitud entre secuencias que se conocen en general en la técnica.

Por ejemplo, es posible determinar el porcentaje de identidad de una determinada secuencia de nucleótidos con una secuencia de referencia usando el algoritmo de homologías de Smith y Waterman con una tabla de puntuación por defecto y una penalización por huecos de seis posiciones de nucleótidos. Otro procedimiento para establecer el porcentaje de identidad en el contexto de la presente invención consiste en usar el paquete de programas MPSRCH, cuyos derechos están registrados por la Universidad de Edimburgo, desarrollado por John F. Collins y Shane S. Sturrok, y distribuido por IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA). Con este conjunto de paquetes, se puede emplear el algoritmo de Smith-Waterman, en el que se usan los parámetros por defecto para la tabla de puntuación (por ejemplo, penalización por apertura de hueco de 12, penalización por extensión de hueco de uno y un hueco de seis). De los datos generados, el valor "coincidencia" refleja la "identidad secuencial". Hay otros programas adecuados para calcular el porcentaje de identidad o de similitud entre secuencias que se conocen en general en la técnica, tales como el programa de alineamiento BLAST, que también se puede usar con los parámetros por defecto. Por ejemplo, se pueden usar el BLASTN y el BLASTP con los siguientes parámetros por defecto: código genético = estándar; filtro = ninguno;
cadena = ambas; corte = 60; esperado = 10; Matriz = BLOSUM62; Descripciones = 50 secuencias; ordenado por = HIGH SCORE; Bases de datos = no redundantes, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS translations + Swiss protein + Spupdate + PIR. En la siguiente dirección de Internet, se puede encontrar información de estos programas: http://www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST.

Cualquier experto en la técnica puede determinar fácilmente los parámetros de búsqueda apropiados para usarlos para una secuencia dada en los programas anteriores. Por ejemplo, los parámetros de búsqueda pueden variar en base al tamaño de la secuencia en cuestión. De este modo, por ejemplo, una realización representativa de la presente invención incluiría un polinucleótido aislado que tendría X nucleótidos, en el que (i) los X nucleótidos contiguos tendrían al menos aproximadamente un 50% de identidad con los nucleótidos contiguos Y derivados de cualquiera de las secuencias descritas en la presente memoria; (ii) X sería igual a Y; y (iii) X sería mayor o igual a 6 nucleótidos y hasta 5.000 nucleótidos, preferiblemente mayor o igual a 8 nucleótidos y hasta 5.000 nucleótidos, más preferiblemente, 10-12 nucleótidos y hasta 5.000 nucleótidos, e incluso más preferiblemente, 15-20 nucleótidos, hasta el número de nucleótidos presente en las secuencias de longitud completa descritas en la presente memoria (p. ej., véase el listado de secuencias y las reivindicaciones), incluyendo todos los valores enteros pertenecientes a los intervalos anteriormente descritos.

Se considera que dos fragmentos de ácido nucleico "se hibridan selectivamente" según lo descrito en la presente memoria. El grado de identidad secuencial entre dos moléculas de ácido nucleico afecta a la eficacia y a la fuerza de las hibridaciones entre tales moléculas. Una secuencia de ácido nucleico parcialmente idéntica inhibirá, al menos parcialmente, la hibridación de una secuencia completamente idéntica con una molécula diana. La inhibición de la hibridación de la secuencia completamente idéntica se puede analizar usando análisis de hibridación que son ampliamente conocidos en la técnica (p. ej., transferencia Southern, transferencia Northern, hibridación en solución, o similares, véase Sambrook, et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Segunda edición, (1989) Cold Spring Harbor, N. Y.). Tales análisis se pueden realizar usando grados variables de selectividad, por ejemplo, usando condiciones que varían de un carácter restrictivo bajo a alto. Si se emplean condiciones poco restrictivas, la ausencia de unión inespecífica se puede analizar usando una sonda secundaria que carezca incluso de un grado parcial de identidad secuencial (por ejemplo, una sonda que tenga menos del aproximadamente 30% de identidad secuencial con la molécula diana), de modo que, en ausencia de uniones inespecíficas, la sonda secundaria no se hibridará con la diana.

Cuando se utiliza un sistema de detección basado en la hibridación, se elige una sonda de ácido nucleico que sea complementaria a la secuencia de ácido nucleico diana, y luego mediante la selección de las condiciones apropiadas, "se hibridan selectivamente" la sonda y la secuencia diana o se unen entre sí para formar una molécula híbrida. Una molécula de ácido nucleico que es capaz de hibridarse selectivamente a una secuencia diana en condiciones "moderadamente restrictivas" se hibrida, comúnmente, en condiciones que permiten la detección de una secuencia de ácido nucleico diana de una longitud de al menos aproximadamente 10-14 nucleótidos que tiene una identidad secuencial del al menos aproximadamente 70% con la secuencia de la sonda de ácido nucleico seleccionada. Comúnmente, las condiciones de hibridación restrictivas permiten la detección de secuencias de ácido nucleico dianas de una longitud de al menos aproximadamente 10-14 nucleótidos que tienen una identidad secuencial del al menos aproximadamente 90-95% con la secuencia de la sonda de ácido nucleico seleccionada. Las condiciones de hibridación útiles para la hibridación de sonda/diana en la que la sonda y la diana tienen un grado específico de identidad secuencial se pueden determinar como se sabe en la técnica (véase, por ejemplo, "Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach", editores B. D. Hames y S. J. Higgins, (1985) Oxford; Washington, DC; IRL Press).

Con respecto a las condiciones restrictivas de hibridación, es ampliamente sabido en la técnica que se pueden emplear numerosas condiciones equivalentes para establecer un carácter restrictivo determinado variando, por ejemplo, los siguientes factores: la longitud y la naturaleza de la secuencia de la sonda y de la secuencia diana, la composición de las bases de las diversas secuencias, las concentraciones de las sales y de otros componentes de la solución de hibridación, la presencia o la ausencia de agentes de bloqueo en las soluciones de hibridación (p. ej., formamida, sulfato de dextrano y polietilenglicol), la temperatura de la reacción de hibridación y los parámetros temporales, así como, las condiciones de lavado variables. La selección de un determinado conjunto de condiciones de hibridación se realiza siguiendo procedimientos estándar en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook, et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Segunda edición, (1989) Cold Spring Harbor, N. Y.).

La expresión "derivado/a de" se usa para identificar el origen alfaviral de la molécula (p. ej., polinucleótido, polipéptido). Un primer polinucleótido "deriva de" un segundo polinucleótido si tiene la misma o sustancialmente la misma secuencia de pares de bases que una región del segundo polinucleótido, su ADNc, complementos del mismo, o si presenta una identidad secuencial según lo descrito anteriormente. Por ende, una secuencia o un polinucleótido de alfavirus "deriva de" un determinado alfavirus (p. ej., especie) si tiene (i) la misma o sustancialmente la misma secuencia que la secuencia del alfavirus o (ii) presenta una identidad secuencial con polipéptidos de ese alfavirus según lo descrito anteriormente.

Un primer polipéptido "deriva de" un segundo polipéptido si (i) está codificado por un primer polinucleótido derivado de un segundo polinucleótido o (ii) presenta una identidad secuencial con los segundos polipéptidos según lo descrito anteriormente. Por lo tanto, un polipéptido (una proteína) de alfavirus "deriva de" un determinado alfavirus si (i) está codificado por un marco de lectura abierto de un polinucleótido de ese alfavirus (polinucleótido alfaviral) o (ii) presenta una identidad secuencial, según lo descrito anteriormente, con polipéptidos de ese alfavirus.

Las moléculas tanto de polinucleótido como de polipéptido pueden estar físicamente derivadas del alfavirus, o producidas recombinante o sintéticamente, por ejemplo, en base a secuencias conocidas.

Los "elementos de control" comunes incluyen, pero no se limitan a, promotores de la transcripción, elementos potenciadores de la transcripción, señales de terminación de la transcripción, secuencias de poliadenilación (ubicadas en 3' con respecto al codón de terminación de la traducción), secuencias para la optimización de la iniciación de la traducción (ubicadas en 5' con respecto a la secuencia codificante), secuencias de terminación de la traducción, la secuencia 5' necesaria para la amplificación mediada por proteínas no estructurales, la secuencia 3' para la amplificación mediada por proteínas no estructurales y medios para expresar una o más secuencias heterólogas (p. ej., promotor de la región de unión subgenómica), véase, p. ej., McCaughan et al. (1995) PNAS, EE.UU., 92: 5431-5435; Kochetov et al (1998) FEBS Letts. 440: 351-355.

"Vector replicón de ARN de alfavirus", "vector replicón de ARN", "vector replicón" o "replicón" se refiere a una molécula de ARN que es capaz de dirigir su propia amplificación o auto-replicación in vivo dentro de una célula diana. Para dirigir su propia amplificación, la molécula de ARN debería codificar la(s) polimerasa(s) necesaria(s) para catalizar la amplificación del ARN (p. ej., las proteínas no estructurales de alfavirus nsP1, nsP2, nsP3, nsP4) y también debería contener secuencias de ARN de cis necesarias para la replicación que sean reconocidas y utilizadas por la(s) polimerasa(s) codificada(s). Un vector replicón de ARN de alfavirus debería contener los siguientes elementos ordenados: secuencias virales o celulares 5' necesarias para la amplificación mediada por proteínas no estructurales (que también se pueden denominar CSE 5' o secuencia de replicación 5' para cis o secuencias virales 5' necesarias en cis para la replicación o secuencia 5' que es capaz de iniciar la transcripción de un alfavirus), secuencias que, cuando se expresan, codifican proteínas no estructurales de alfavirus biológicamente activas (p. ej., nsP1, nsP2, nsP3, nsP4), y secuencias virales y celulares 3' necesarias para la amplificación mediada por proteínas no estructurales (que también se pueden denominar CSE 3' o secuencias virales 3' necesarias en cis para la replicación o una secuencia de reconocimiento de ARN polimerasa de alfavirus). El vector replicón de ARN de alfavirus debería contener un medio para expresar una o más secuencia heterólogas, tal como, por ejemplo, un IRES o un promotor subgenómico viral (p. ej., alfaviral) (p. ej., un promotor de la región de unión) que pudiera, en ciertas realizaciones, ser modificado para aumentar o reducir la transcripción viral del fragmento subgenómico o para disminuir la homología con casetes de expresión de auxiliares defectuosos o proteínas estructurales, y una o más secuencias heterólogas que se vayan a expresar. Un replicón también puede contener secuencias adicionales, por ejemplo, una o más secuencias heterólogas que codifiquen uno o más polipéptidos (p. ej., un gen codificante de una proteína o un gen próximo a 3') y/o un tracto poliadenilado.

"Partícula de alfavirus recombinante", "partícula de replicón de alfavirus" y "partícula de replicón" se refieren a una unidad de tipo virión que contiene un vector replicón de ARN de alfavirus. Generalmente, la partícula de alfavirus recombinante comprende una o más proteínas estructurales de alfavirus, una envoltura lipídica y un vector replicón de ARN. Preferiblemente, la partícula de alfavirus recombinante contiene una estructura de nucleocápside que está contenida dentro de una bicapa lipídica derivada de una célula huésped, tal como una membrana plasmática, en la que se encuentran embebidas una o más glucoproteínas de la envoltura alfaviral (p. ej., E2, E1). La partícula también puede contener otros componentes (p. ej., elementos de dirección, tales como biotina, otras proteínas estructurales virales, o partes de las mismas, envolturas híbridas u otros ligandos de unión a receptores) que dirijan el tropismo de la partícula de la que fue derivado el alfavirus. Generalmente, la interacción entre el ARN y la(s) proteína(s) estructural(es) de alfavirus necesarias para formar eficazmente una partícula de replicón o una nucleocápside puede ser una interacción ARN-proteína entre una proteína de la cápside y una señal de empaquetamiento (o secuencia de empaquetamiento) contenida en el ARN.

"Línea celular de empaquetamiento de alfavirus" se refiere a una célula que contiene uno o más casetes de expresión de proteínas estructurales de alfavirus y que produce partículas de alfavirus recombinantes (partículas de replicón) tras la introducción de un vector replicón de ARN de alfavirus, un sistema eucariota de iniciación de vectores en capas o una partícula de alfavirus recombinante. La célula parental puede ser de origen mamífero o no mamífero. En realizaciones preferidas, la línea celular de empaquetamiento se transforma establemente con el o los casetes de expresión de proteínas estructurales.

"ARN auxiliar defectuoso" se refiere a una molécula de ARN que es capaz de ser amplificada y de expresar una o más proteínas estructurales de alfavirus en una célula eucariota, cuando la célula también contiene proteínas "replicasas" no estructurales alfavirales funcionales. Las proteínas no estructurales de alfavirus pueden ser expresadas en la célula por un vector replicón de ARN de alfavirus u otros medios. Para permitir la amplificación y la expresión de proteínas estructurales mediadas por proteínas no estructurales de alfavirus, la molécula de ARN auxiliar defectuoso debería contener las secuencias de ARN con extremo 5' y extremo 3' necesarias para la amplificación que sean reconocidas y utilizadas por las proteínas no estructurales, así como los medios para expresar una o más proteínas estructurales de alfavirus. Por lo tanto, un ARN auxiliar defectuoso de alfavirus debería contener los siguientes elementos ordenados: secuencias virales o celulares 5' necesarias para la amplificación del ARN mediada por proteínas no estructurales de alfavirus (también denominadas CSE 5' o secuencia de replicación 5' para cis o secuencias virales 5' necesarias en cis para la replicación o secuencia 5' que es capaz de iniciar la transcripción de un alfavirus), un medio para expresar una o más proteínas estructurales alfavirales, secuencia(s) de genes que, cuando se expresan, codifican una o más proteínas estructurales de alfavirus (p. ej., C, E2, E1), secuencias virales o celulares 3' necesarias para la amplificación por proteínas no estructurales de alfavirus (también denominadas CSE 3' o secuencias virales 3' necesarias en cis para la replicación o una secuencia de reconocimiento de ARN polimerasa de alfavirus), y preferiblemente, un tracto poliadenilado. Generalmente, el ARN auxiliar defectuoso no debería codificar ni expresar en su totalidad las cuatro proteínas no estructurales de alfavirus (nsP1, nsP2, nsP3, nsP4), pero puede codificar o expresar un subconjunto de estas proteínas o partes de las mismas, o contener secuencia(s) derivada(s) de uno o más genes de proteínas no estructurales, pero que por la naturaleza de su inclusión en el auxiliar defectuoso no expresen proteínas no estructurales ni partes de las mismas. Como medio para expresar proteína(s) estructural(es) de alfavirus, el ARN auxiliar defectuoso puede contener un promotor subgenómico viral (p. ej., alfaviral) que pueda, en ciertas realizaciones, ser modificado para modular la transcripción del fragmento subgenómico o para disminuir la homología con ARN replicón, o alternativamente, algún otro medio para efectuar la expresión de la proteína estructural de alfavirus (p. ej., sitio interno de entrada al ribosoma, elemento de translectura ribosómica). Preferiblemente, un gen de proteína estructural de alfavirus es el gen próximo a 3' del auxiliar defectuoso. Además, también es preferible que el ARN auxiliar defectuoso no contenga secuencias que faciliten interacciones de ARN-proteína con la(s) proteína(s) estructural(es) de alfavirus y el empaquetamiento en nucleocápsides, partículas de tipo virión o partículas de replicones de alfavirus. Un ARN auxiliar defectuoso es una realización específica de un casete de expresión de proteínas estructurales de alfavirus.

El "sistema eucariota de iniciación de vectores en capas" se refiere a un ensamblaje que es capaz de dirigir la expresión de una secuencia o de un gen de interés. El sistema eucariota de iniciación de vectores en capas debería contener un promotor 5' que sea capaz de iniciar in vivo (i. e., dentro de una célula eucariota) la síntesis de ARN a partir de ADNc, y una secuencia de vector de ácido nucleico (p. ej., un vector viral) que sea capaz de dirigir su propia replicación en una célula eucariota y también de expresar una secuencia heteróloga. Preferiblemente, la secuencia de vector de ácido nucleico es una secuencia derivada de un alfavirus y está compuesta por secuencias virales o celulares 5' necesarias para la amplificación mediada por proteínas no estructurales (también denominadas CSE 5' o secuencia de replicación 5' para cis o secuencias virales 5' necesarias en cis para la replicación o secuencia 5' que es capaz de iniciar la transcripción de un alfavirus), así como secuencias que, cuando se expresan, codifican proteínas no estructurales de alfavirus biológicamente activas (p. ej., nsP1, nsP2, nsP3, nsP4), y secuencias virales o celulares 3' necesarias para la amplificación mediada por proteínas no estructurales (también denominadas CSE 3' o secuencias virales 3' necesarias en cis para la replicación o una secuencia de reconocimiento de ARN polimerasa de alfavirus). Además, la secuencia del vector puede incluir un medio para expresar una o más secuencia heterólogas, tal como, por ejemplo, un promotor subgenómico viral (p. ej., alfaviral) (p. ej., un promotor de la región de unión) que pudiera, en ciertas realizaciones, ser modificado para aumentar o reducir la transcripción viral del fragmento subgenómico o para disminuir la homología con casetes de expresión de auxiliares defectuosos o proteínas estructurales, y una o más secuencias heterólogas que se vayan a expresar. Preferiblemente, la(s) secuencia(s) heteróloga(s) comprende(n) un gen que codifica una proteína, y dicho gen es el gen próximo a 3' de la secuencia del vector. El sistema eucariota de iniciación de vectores en capas también puede contener una secuencia de poliadenilación, secuencias de reconocimiento de cortes y empalmes, secuencia de procesamiento de ribozimas catalíticas, una señal de exportación nuclear y una secuencia de terminación de la transcripción. En ciertas realizaciones, es posible regular la síntesis in vivo de la secuencia del vector de ácido nucleico a partir de ADNc mediante el uso de un promotor inducible o la expresión subgenómica puede ser inducible a través del uso de reguladores de la traducción o proteínas no estructurales modificadas.

Como se usan en la presente memoria, las expresiones "partícula de alfavirus quimérico" y "partícula de replicón de alfavirus quimérico" se refieren a una quimera o a una partícula quimérica tal como un virus, una partícula de tipo viral, modificada específicamente o diseñada genéticamente para que contenga un ácido nucleico derivado de un alfavirus distinto del alfavirus del que se obtuvo la glucoproteína bien de la cápside y/o de la envoltura (p. ej., de un virus diferente). En tal partícula, el ácido nucleico derivado de un alfavirus es una molécula de ARN que comprende una de cualquier número de diferentes longitudes, incluyendo, pero no limitándose a, la longitud del genoma (que codifica proteínas no estructurales y estructurales) y la longitud del replicón (eliminada de una o más proteínas estructurales). Por ejemplo, y sin pretender que sea una limitación, las partículas de replicones quiméricos elaboradas según las enseñanzas de la presente invención incluyen ARN replicón del Virus Sindbis (SIN) en una cápside que tiene un dominio de unión al ARN del Virus Sindbis y un dominio de interacción con las glucoproteínas de la envoltura del Virus de la Encefalitis Equina Venezolana (VEE), rodeado por la envoltura de las glucoproteínas del VEE.

La expresión "gen próximo a 3'" se refiere a una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que está contenida en un vector replicón, un sistema eucariota de iniciación de vectores en capas, ARN auxiliar defectuoso o un casete de expresión de proteínas estructurales, y que se ubica en una posición específica con respecto a otro elemento. La posición de este gen próximo a 3' se debería determinar con respecto a la secuencia 3' necesaria para la amplificación mediada por proteínas no estructurales (definida anteriormente), en la que el gen próximo a 3' es la secuencia 5' que codifica a la proteína (secuencia arriba) de, e inmediatamente anterior a, este elemento. El gen próximo a 3' es generalmente una secuencia heteróloga (p. ej., un gen que codifica a un antígeno) cuando se refiere a un vector replicón o a un sistema eucariota de iniciación de vectores en capas o, alternativamente, en general es un gen de proteína estructural (p. ej., C, E2, E1 de alfavirus) cuando se refiere a un ARN auxiliar defectuoso o un casete de expresión proteínas estructurales.

La expresión "secuencias virales o celulares 5' necesarias para la amplificación mediada por proteínas no estructurales" o "secuencias 5' necesarias para la amplificación mediada por proteínas no estructurales" se refiere a un elemento funcional que proporciona un sitio de reconocimiento en el que un virus o un vector derivado de un virus sintetiza un ARN de cadena positiva. Por lo tanto, es el complemento de la secuencia real contenida en el virus o en el vector que corresponde al extremo 3' de la copia de ARN de cadena negativa que está unida por el complejo de proteínas replicasas no estructurales y, posiblemente, factores de la célula huésped adicionales a partir de los cuales se inicia la transcripción del ARN de cadena positiva. Para esta función, se puede utilizar una amplia variedad de secuencias. Por ejemplo, la secuencia puede incluir la región no traducida (NTR) del extremo 5' alfaviral y otras secuencias adyacentes, tales como, por ejemplo, secuencias por los nucleótidos 210, 250, 300, 350, 400 ó 450. Alternativamente, se pueden utilizar secuencias no alfavirales u otras secuencias como este elemento, mientras se mantenga una capacidad funcional similar, por ejemplo, en el caso de SIN, los nucleótidos 10-75 para la asparagina del ARNt (Schlesinger et al., patente estadounidense n.º: 5.091.309). La expresión se usa indistintamente con las expresiones CSE 5' o secuencias virales 5' necesarias en cis para la replicación o secuencia 5' que es capaz de iniciar la transcripción de un alfavirus.

La expresión "promotor subgenómico viral" se refiere a una secuencia de origen viral que, junto con la una o varias polimerasas virales o celulares necesarias y otros factores, permite la transcripción de una molécula de ARN de una longitud menor a la del genoma. Para un promotor subgenómico de alfavirus (alfaviral) o un promotor de la región de unión subgenómica de alfavirus (alfaviral), esta secuencia se obtiene generalmente de la región entre los marcos de lectura abiertos de proteínas no estructurales y estructurales (ORF), y controla normalmente la transcripción del ARNm subgenómico. Comúnmente, el promotor subgenómico de alfavirus consta de una secuencia nuclear que proporciona la mayoría de la actividad asociada al promotor, así como regiones flanqueantes (p. ej., promotor extendido o nativo) que aumentan en mayor medida la actividad asociada al promotor. Por ejemplo, en el caso del prototipo de alfavirus, el Virus Sindbis, el promotor de la región de unión subgenómica normal comienza, comúnmente, aproximadamente en el número de nucleótido 7.579 y continúa al menos hasta el número de nucleótido 7.612 (y posiblemente más allá del mismo). Se cree que, como mínimo, los nucleótidos 7.579 a 7.602 sirven como la secuencia nuclear necesaria para la transcripción del fragmento subgenómico.

Las expresiones "secuencias virales o celulares 3' necesarias para la amplificación mediada por proteínas no estructurales" o "secuencias 3' necesarias para la amplificación mediada por proteínas no estructurales" se usan indistintamente con las expresiones CSE 3' o secuencias de replicación 3' en cis o secuencias virales 3' necesarias en cis para la replicación o una secuencia de reconocimiento de ARN polimerasa de alfavirus. Esta secuencia es un elemento funcional que proporciona un sitio de reconocimiento en el que el virus o el vector derivado del virus comienza la replicación (amplificación) mediante la síntesis de la cadena de ARN negativa. Se puede utilizar una amplia variedad de secuencias para esta función. Por ejemplo, la secuencia puede incluir una región no traducida (NTR) del extremo 3' alfaviral completa, tal como, por ejemplo, con SIN, que incluiría los nucleótidos 11.647 a 11.703 o una región truncada de la NTR de 3', que sigue manteniendo su función como una secuencia de reconocimiento (p. ej., los nucleótidos 11.684 a 11.703). Otros ejemplos de secuencias que se pueden utilizar en este contexto incluyen, pero no se limitan a, secuencias no alfavirales u otras secuencias que mantienen una capacidad funcional similar para permitir la iniciación de la síntesis de ARN de cadena negativa (p. ej., las secuencias descritas en George et al., (2000) J. Virol. 74: 9776-9785).

Un "antígeno" se refiere a una molécula que contiene uno o más epítopos (bien lineales, configuracionales o ambos) que estimularán el sistema inmune de un huésped para provocar una respuesta específica de un antígeno humoral y/o celular. La expresión se usa indistintamente con el término "inmunógeno". Normalmente, un epítopo incluirá entre aproximadamente 3-15, en general, aproximadamente 5-15 aminoácidos. Un epítopo de células B es de aproximadamente 5 aminoácidos, pero puede ser tan pequeño como de 3-4 aminoácidos. Un epítopo de células T, tal como un epítopo de CTL, incluirá al menos aproximadamente 7-9 aminoácidos, y un epítopo de células T auxiliares, al menos aproximadamente 12-20 aminoácidos. Normalmente, un epítopo incluirá entre aproximadamente 7 y 15 aminoácidos, tal como 9, 10, 12 ó 15 aminoácidos. El término "antígeno" denota tanto antígenos subunitarios (i. e., antígenos que están separados y diferenciados de un organismo entero con el que el antígeno se encuentra asociado en la naturaleza), como bacterias, virus, hongos, parásitos u otros microbios muertos, atenuados o desactivados, así como antígenos tumorales, incluyendo dominios extracelulares de receptores de la superficie celular y partes intracelulares que pueden contener epítopos de células T. Los anticuerpos tales como anticuerpos anti-idiotípicos, o fragmentos de los mismos, y mimotopos de péptidos sintéticos, que pueden imitar a un antígeno o a un determinante antigénico, también están englobados por la definición de antígeno como se usa en la presente memoria. De manera similar, también se incluyen en la definición de antígeno de la presente memoria un oligonucleótido o un polinucleótido que expresa un antígeno o un determinante antigénico in vivo, tal como en aplicaciones de terapias génicas e inmunización de ADN.

Los epítopos de una proteína dada se pueden identificar usando cualquier número de técnicas de mapeado de epítopos ampliamente conocidas en la materia. Véase, p. ej., "Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology", Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996), Humana Press, Totowa, New Jersey. Por ejemplo, se pueden determinar epítopos lineales, p. ej., sintetizando simultáneamente grandes números de péptidos sobre soportes sólidos, péptidos que corresponden a partes de la molécula de proteína, y haciendo reaccionar los péptidos con anticuerpos mientras que los péptidos todavía están unidos a los soportes. Tales técnicas son conocidas en la materia y se describen en, p. ej., la patente estadounidense n.º 4.708.871; Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci., EE.UU., 81:3998-4002; Geysen et al. (1986) Molec. Immunol 23: 709-715, todas incorporadas en la presente memoria por referencia en su totalidad.

De manera similar, los epítopos configuracionales se identifican fácilmente determinando la configuración espacial de los aminoácidos, tal como, p. ej., mediante cristalografía de rayos X y resonancia magnética nuclear. Véase, p. ej.: "Epitope Mapping Protocols", Sutra.

A efectos de la presente invención, los antígenos se pueden obtener de tumores y/o cualquiera de los varios virus, bacterias, parásitos y hongos conocidos, según lo descrito de manera más completa a continuación. El término también se refiere a cualquiera de los diversos antígenos tumorales y a cualquier otro antígeno para el que se desee una respuesta inmune. Además, a efectos de la presente invención, un "antígeno" se refiere a una proteína que incluye modificaciones tales como eliminaciones, adiciones y sustituciones (en general, conservadoras en la naturaleza) en la secuencia nativa, siempre y cuando la proteína mantenga la capacidad de provocar una respuesta inmunológica según lo definido en la presente memoria. Estas modificaciones pueden ser deliberadas, como a través de mutagénesis de un sitio específico, o pueden ser accidentales, tal como a través de mutaciones de los huéspedes que producen los antígenos.

Una "respuesta inmunológica" hacia un antígeno o una composición es el desarrollo en un sujeto de una respuesta inmune humoral y/o celular hacia un antígeno presente en la composición de interés. A efectos de la presente invención, una "respuesta inmune humoral" se refiere a una respuesta inmune mediada por moléculas de anticuerpo, incluyendo moléculas secretoras (IgA) o de IgG, mientras que una "respuesta inmune celular" es la mediada por linfocitos T y/u otros glóbulos blancos. Un aspecto importante de la inmunidad celular implica una respuesta específica de un antígeno por parte de células T citolíticas ("CTL"). Las CTL tienen especificidad por los antígenos peptídicos que están presentes en asociación con proteínas codificadas por el complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) y expresadas en las superficies de las células. Las CTL ayudan a inducir y promover la destrucción de microbios intracelulares o la lisis de células infectadas con tales microbios. Otro aspecto de la inmunidad celular implica una respuesta específica de un antígeno por parte de células T auxiliares. Las células T auxiliares actúan para ayudar a estimular la función y se dirigen a la actividad de células efectoras inespecíficas frente a células que presentan antígenos peptídicos en asociación con moléculas del MHC en su superficie. Una "respuesta inmune celular" también se refiere a la producción de citocinas, quimiocinas y otras moléculas tales producidas por células T activadas y/o otros glóbulos blancos, incluyendo aquéllos derivados de células T CD4+ y CD8+. Además, es posible inducir una respuesta a la quimiocina mediante diversos glóbulos blancos y células endoteliales como respuesta a un antígeno administrado.

Una composición o una vacuna que provoca una respuesta inmune celular puede servir para sensibilizar a un sujeto vertebrado mediante la presentación de un antígeno en asociación con moléculas del MHC en la superficie de la célula. La respuesta inmune mediada por una célula se dirige a, o cerca de, células que presentan el antígeno en su superficie. Además, se pueden generar linfocitos T específicos de un antígeno para permitir la futura protección de un huésped inmunizado.

Es posible determinar la capacidad de un determinado antígeno para estimular una respuesta inmunológica mediada por células mediante una serie de análisis, tales como mediante análisis de linfoproliferación (activación de linfocitos), análisis de células citotóxicas CTL o mediante el análisis de linfocitos T específicos del antígeno en un sujeto sensibilizado. Tales análisis son ampliamente conocidos en la técnica. Véase, p. ej., Erickson et al., J. Immunol. (1993) 151: 4189-4199; Doe et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24: 2369-2376. Los procedimientos recientes para medir la respuesta inmune mediada por células incluyen la medición de citocinas intracelulares o de la secreción de citocinas por poblaciones de células T (p. ej., mediante la técnica ELISPOT) o mediante la medición de células T específicas de un epítopo (p. ej., mediante la técnica de tetrámeros) (revisada por McMichael, A. J., y O'Callaghan, C. A., J. Exp. Med. 187 (9): 1367-1371, 1998; Mcheyzer-Williams, M. G., et al, Immunol. Rev. 150: 5-21, 1996; Lalvani, A., et al, J. Exp. Med. 186: 859-865,1997).

Por lo tanto, una respuesta inmunológica, como se usa en la presente memoria, puede ser la que estimula a las CTL y/o la producción o activación de células T auxiliares. También se puede estimular la producción de quimiocinas y/o citocinas. El antígeno de interés también puede provocar una respuesta inmune mediada por anticuerpos. Por consiguiente, una respuesta inmunológica puede incluir uno o más de los siguientes efectos: la producción de anticuerpos (p. ej., IgA o IgG) por células B; y/o la activación de células T supresoras, citotóxicas o auxiliares y/o células T \gamma\delta dirigidas específicamente a un antígeno o antígenos presentes en la composición o la vacuna de interés. Estas respuestas pueden servir para neutralizar la infectividad y/o mediar la citotoxicidad celular dependiente de complementos de anticuerpos o de anticuerpos (ADCC) para proporcionar protección frente a un huésped inmunizado. Tales respuestas se pueden determinar usando inmunoanálisis y análisis de neutralización estándar ampliamente conocidos en la técnica.

Una "composición inmunogénica" es una composición que comprende una molécula antigénica (o una secuencia de nucleótidos que codifica una molécula antigénica), en la que la administración de la composición al sujeto da como resultado el desarrollo en el sujeto de una respuesta inmune humoral y/o celular y/o mucosal hacia la molécula antigénica de interés. La composición inmunogénica se puede introducir directamente en un sujeto receptor, tal como mediante inyección, inhalación, administración oral o intranasal, o mediante cualquier otra vía de administración parenteral o mucosal (p. ej., intra-rectal o intra-vaginal).

"Vacuna subunitaria" pretende significar una composición de vacuna que incluye uno o más antígenos seleccionados, pero no todos los antígenos, derivados de o homólogos a un antígeno de un patógeno de interés, tales como un virus, una bacteria, un parásito o un hongo. Tal composición está sustancialmente libre de células patógenas intactas o partículas patógenas o el lisado de tales células o partículas. De este modo, es posible preparar una "vacuna subunitaria" a partir de polipéptidos inmunogénicos al menos parcialmente purificados (preferiblemente, sustancialmente purificados) del patógeno o análogos del mismo. El procedimiento de obtención de un antígeno incluido en la vacuna subunitaria puede incluir, por tanto, técnicas de purificación estándar, producción recombinante o producción
sintética.

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1.0. Introducción

Se están desarrollando varios miembros del género Alphavirus como sistemas de administración de genes para vacunas y otras aplicaciones terapéuticas (Schlesinger y Dubensky, Curr. Opin. Biotechnol., 10: 434-9 1999). La configuración de "replicón" más común de los constructos de vectores de alfavirus, según lo descrito más detalladamente con anterioridad y en los documentos US 5789245, 5843723, 5814482 y 6015694, y el documento WO 00/61772, comprende una secuencia 5' que inicia la transcripción del ARN alfavirual, una secuencia de nucleótidos que codifica proteínas no estructurales alfavirales, un promotor de la región de unión subgenómica viral que dirige la expresión de una secuencia de ácido nucleico heteróloga adyacente, una secuencia de reconocimiento de la ARN polimerasa y, preferiblemente, un tracto poliadenilado. También se conoce en la técnica otra terminología para definir los mismos elementos.

Habitualmente, para las aplicaciones de vacuna y terapéuticas in vivo, primero se empaqueta el vector replicón de ARN de alfavirus o el ARN del replicón en una partícula de tipo viral que comprende las proteínas estructurales alfavirales (p. ej., la proteína de la cápside y las glucoproteínas de la envoltura). Debido a su configuración, los vectores replicones no expresan estas proteínas estructurales de alfavirus necesarias para empaquetarse en partículas de replicones alfavirales recombinantes. Por lo tanto, para generar partículas de replicones, las proteínas estructurales se deben proporcionar en trans. El empaquetamiento se puede realizar mediante una variedad de procedimientos, incluyendo enfoques transitorios, tales como la co-transfección del replicón y ARN auxiliar(es) defectuoso(s) transcritos in vitro (Liljestrom, Bio/Technology 9: 1356-1361, 1991; Bredenbeek et al., J. Virol. 67: 6439-6446, 1993; Frolov et al., J. Virol. 71: 2819-2829, 1997; Pushko et al., Virology 239: 389-401, 1997; patentes estadounidenses 5.789.245 y 5.842.723) o constructos de replicones y auxiliares defectuosos basados en ADN plasmídico (Dubensky et al., J. Virol. 70: 508-519, 1996), así como la introducción de replicones de alfavirus en líneas celulares de empaquetamiento estable (PCL) (Polo et al., PNAS 96: 4598-4603,1999; patentes estadounidenses 5.789.245; 5.842.723; 6.015.694; WO 9738087 y WO 9918226).

Las metodologías de empaquetamiento en trans permiten la modificación de uno o más genes de proteínas estructurales (por ejemplo, para incorporar secuencias de variantes alfavirales, tales como mutantes atenuados, US 5.789.245; 5.842.723; 6.015.694), seguida de la posterior incorporación de la proteína estructural modificada en las partículas de replicones finales. Además, tal empaquetamiento permite la modificación global de partículas de replicones de alfavirus mediante el empaquetamiento de un constructo de vector o un replicón de ARN de un primer alfavirus usando proteínas estructurales de un segundo alfavirus diferente del constructo de vector (WO 95/07994; Polo et al., 1999, ibid; Gardner et al., J. Virol., 74: 11849-11857, 2000). Este enfoque proporciona un mecanismo para aprovechar las propiedades deseables de múltiples alfavirus en una sola partícula de replicón. Por ejemplo, aunque todos los alfavirus son, en general, bastante similares en cuanto a sus mecanismos globales de replicación y a la estructura viriónica, los diversos miembros del género Alphavirus pueden presentar algunas diferencias únicas en sus propiedades biológicas in vivo (p. ej., tropismo para células linfoides, sensibilidad al interferón, perfil patológico). Además, hay una serie de alfavirus que se clasifican como organismos de nivel de bioseguridad 3 (BSL-3), que es una cuestión relativa a las instalaciones para la producción (p. ej., la fabricación) de partículas y un posible uso humano, mientras que otros se clasifican como de nivel de bioseguridad 2 (BSL-2). Las quimeras de partículas de replicones de alfavirus proporcionan un mecanismo para incluir determinadas propiedades de un alfavirus de nivel BSL-3 en una partícula de replicón derivada de un virus de nivel BSL-2. Se pueden incorporar, por ejemplo, elementos del Virus de la Encefalitis Equina Venezolana (VEE) linfotrópico BSL-3 en un virus BSL-2 linfotrópico no natural (p. ej., el Virus Sindbis).

Sin embargo, hasta la fecha, se ha obtenido un éxito limitado en la producción eficaz y rutinaria de preparaciones de alto título de partículas de alfavirus quiméricos comercialmente aceptables. Tales partículas de alfavirus quiméricos son deseables por varias razones, que incluyen tropismos o especificidad tisular específicos, antigenicidad superficial alterada y reconocimiento alterado por el huésped. A este respecto, el sistema inmune de un animal generalmente reconoce los antígenos superficiales virales, tales como las glucoproteínas de la envoltura, y dirige respuestas celulares y humorales específicas frente a ellos mucho antes de que los antígenos virales internos, tales como las proteínas de la cápside, sean expuestos al sistema inmune. Por consiguiente, si un receptor de partículas de replicones tiene anticuerpos pre-existentes dirigidos contra los antígenos superficiales del vector (un huésped sensibilizado), la partícula de replicón puede ser atacada y destruida antes de que pueda enviar su carga útil terapéutica al tejido diana. Dado que muchas de las partículas de replicones más satisfactorias se obtienen de virus infecciosos naturales, es probable que al menos algún posible receptor de partículas de replicones haya sido expuesto anteriormente a, y haya desarrollado respuestas inmunes contra, antígenos superficiales que sean comunes entre la partícula de replicón y el virus infeccioso natural. La probabilidad de una respuesta inmune negativa también aumenta tras múltiples administraciones. Por lo tanto, para reducir o eliminar esta posibilidad, se pueden crear partículas de replicones de administración de genes posteriores usando partículas de replicones quiméricos, de modo que no sea necesario que el receptor vea las mismas proteínas estructurales múltiples veces.

En la presente memoria, se describen partículas de alfavirus quiméricos que presentan interacciones estructurales eficaces. Por ende, la presente invención proporciona composiciones y procedimientos para construir y obtener partículas de alfavirus quiméricos recombinantes con eficacias significativamente mayores de empaquetamiento/producción, por ejemplo, usando quimeras de SIN/VEE.

Las ventajas de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, (i) proporcionar partículas de alfavirus quiméricos a niveles comercialmente viables; (ii) la capacidad de reducir la probabilidad de que se produzcan hechos no deseables, por ejemplo, la recombinación y/o el empaquetamiento de genes estructurales; (iii) proporcionar vehículos de administración de genes con tropismos tisulares y celulares específicos (p. ej., administración de antígenos a una célula de presentación de antígenos, tal como una célula dendrítica).

Las enseñanzas proporcionadas en la presente memoria permiten al experto en la técnica construir partículas de alfavirus quiméricos derivadas de una amplia variedad de diferentes alfavirus, particularmente, cuando las secuencias de tales alfavirus ya han sido publicadas. Usando estas composiciones quiméricas, también se pueden diseñar sistemas eucariotas de iniciación de vectores en capas (ELVIS). Mediante la optimización de los niveles de empaquetamiento como se revela en la presente memoria, se pueden producir partículas de replicones quiméricos para su uso en las diversas aplicaciones incluyendo en aplicaciones de vacunas y terapéuticas.

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2.0.0. Partículas y replicones de alfavirus

Como se indica anteriormente, las partículas quiméricas según lo descrito en la presente memoria incluyen comúnmente una o más secuencias de polinucleótidos (p. ej., ARN). Cuando se encuentran en partículas, estos polinucleótidos están rodeados por (e interactúan con) una o más proteínas estructurales. Los ejemplos no restrictivos de secuencias de polinucleótidos y proteínas estructurales que se pueden usar en la práctica de la invención se describen en la presente memoria.

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2.1.0. Componentes nucleotídicos

Las partículas, los vectores y los replicones descritos en la presente memoria incluyen comúnmente una variedad de secuencias de ácidos nucleicos, secuencias tanto codificantes como no codificantes. Será evidente que las composiciones quiméricas descritas en la presente memoria comprenden generalmente menos de un genoma de alfavirus completo (p. ej., contienen menos de todas las secuencias codificantes y/o no codificantes contenidas en un genoma de un alfavirus).

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Además, cabe destacar que, para ilustrar en la presente memoria los diversos elementos útiles en la presente invención, se considera que las secuencias de alfavirus de un virus heterólogo derivan de un alfavirus diferente del alfavirus que es el origen de las proteínas no estructurales usadas en el replicón que se va a empaquetar, independientemente de si el elemento que está siendo utilizado está en el replicón o en el ARN auxiliar defectuoso (p. ej., durante la producción de partículas, cuando están presentes ambos).

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2.1.1. Composiciones polinucleotídicos no codificantes

Las partículas y los replicones quiméricos descritos en la presente memoria contienen comúnmente secuencias que codifican polipéptidos (p. ej., estructurales o no estructurales), así como secuencias no codificantes, tales como elementos de control. Los ejemplos no restrictivos de secuencias no codificantes incluyen secuencias 5' necesarias para la amplificación mediada por proteínas no estructurales, un medio para expresar un gen próximo a 3', región no traducida del extremo 5' de ARNm subgenómico (NTR 5' subgenómica) y secuencias 3' necesarias para la amplificación mediada por proteínas no estructurales (patentes estadounidenses 5.843.723; 6.015.694; 5.814.482; publicaciones vía PCT WO 97/38087; WO 00/61772). A partir de las enseñanzas de la presente memoria, será evidente que es posible incluir una, más de una o todas las secuencias descritas en la presente memoria en las partículas, los vectores y/o los replicones descritos en la presente memoria y que, además, es posible modificar o manipular de otro modo esa una o más de estas secuencias según las enseñanzas de la presente memoria.

Por lo tanto, los polinucleótidos descritos en la presente memoria incluyen comúnmente una secuencia 5' necesaria para la amplificación mediada por proteínas no estructurales. Los ejemplos no restrictivos de secuencias 5' adecuadas incluyen elementos de control tales como el extremo 5' del alfavirus nativo de un virus homólogo, el extremo 5' del alfavirus nativo de un virus heterólogo, el extremo 5' del alfavirus DI no nativo de un virus homólogo, el extremo 5' del alfavirus DI no nativo de un virus heterólogo, la secuencia viral no derivada de un alfavirus (p. ej., togavirus, virus vegetal), secuencia derivada de ARN celular (p. ej., elemento de ARNt) (p. ej., Monroe et al., PNAS 80:3279-3283, 1983), mutaciones/eliminaciones de cualquiera de las secuencias anteriores para reducir la homología (véase, p. ej., Niesters et al., J. Virol. 64: 4162-4168, 1990; Niesters et al., J. Virol. 64: 1639-1647, 1990) y/o secuencia 5' mínima en auxiliares (hasta aprox. 200, 250, 300, 350, 400 nucleótidos).

Las secuencias de polinucleótidos también incluyen generalmente un medio para expresar un gen próximo a 3' (p. ej., una secuencia heteróloga, una secuencia que codifica un polipéptido). Los ejemplos no restrictivos de tales medios incluyen elementos de control, tales como promotores y similares, por ejemplo, un promotor subgenómico de alfavirus nativo de un virus homólogo, un promotor subgenómico de alfavirus nativo de un virus heterólogo, un promotor subgenómico de alfavirus nuclear (homólogo o heterólogo), secuencias mínimas secuencia arriba o secuencia abajo del promotor subgenómico nuclear, mutaciones/eliminaciones/adiciones del promotor subgenómico nuclear o nativo, un promotor subgenómico compatible no derivado de un alfavirus (p. ej., un virus vegetal), un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) y/o un elemento de translectura ribosómico (p. ej. BiP).

Las regiones no traducidas del extremo 5' de ARNm subgenómico adecuadas (NTR 5' subgenómicas) incluyen, pero no se limitan a, una NTR 5' subgenómica alfaviral nativa de un virus homólogo, una NTR 5' subgenómica alfaviral nativa de un virus heterólogo, una NTR 5' viral no derivada de un alfavirus (p. ej., virus vegetal), una NTR 5' derivada de un gen celular (p. ej., \beta-globina) y/o secuencias que contienen mutaciones, eliminaciones y/o adiciones en la NTR 5' subgenómica alfaviral nativa.

Los ejemplos no restrictivos de secuencias 3' adecuadas necesarias para la amplificación mediada por proteínas no estructurales incluyen elementos de control tales como un extremo 3' de alfavirus nativo de un virus homólogo, un extremo 3' de alfavirus nativo de un virus heterólogo, un extremo 3' de alfavirus DI no nativo de un virus homólogo, un extremo 3' de alfavirus DI no nativo de un virus heterólogo, una secuencia viral no derivada de un alfavirus (p. ej., togavirus, virus vegetal), una secuencia derivada de ARN celular, secuencias que contienen mutaciones, eliminaciones o adiciones de las secuencias anteriores para reducir la homología (véase, p. ej., Kuhn et al. (1990) J. Virol. 64: 1465-1476), secuencia mínima en auxiliares hasta aprox. (20, 30, 50, 100, 200 nucleótidos) y/o secuencias CSE alfavirales de 3' reparadas por la célula. También se puede incorporar una secuencia de poliadenilación, por ejemplo, en las secuencias del extremo 3'. Véase p. ej., George et al. (2000) J. Virol. 74: 9776-9785).

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2.1.2. Secuencias codificantes

Las composiciones descritas en la presente memoria también pueden incluir una o más secuencias que codifiquen diversos polipéptidos alfavirales, por ejemplo, uno o más polipéptidos alfavirales no estructurales (nsP1, nsP2, nsP3, nsP4) o estructurales (p. ej., cápside, envoltura).

Según lo descrito en Strauss et al., (1984), supra, un genoma del SIN de tipo natural es de una longitud de 11.703 nucleótidos, excluyendo el casquete 5' y el tracto poli(A) 3' terminal. Detrás del casquete 5' terminal hay 59 nucleótidos del ácido nucleico no traducido de 5' seguidos por un marco de lectura de 7.539 nucleótidos que codifica los polipéptidos no estructurales y que está abierto a excepción de un solo codón de terminación ópalo. Tras 48 bases no traducidas ubicadas en la región de unión que separa las secuencias codificantes de proteínas no estructurales y estructurales, hay un marco de lectura abierto de una longitud de 3.735 nucleótidos que codifica las proteínas estructurales. Finalmente, la región no traducida de 3' es de una longitud de 322 nucleótidos. Las proteínas no estructurales se traducen del ARN genómico en dos precursores poliproteicos. El primero incluye nsP1, nsP2 y nsP3, tiene una longitud de 1.896 aminoácidos y acaba en un codón ópalo en la posición 1.897. La cuarta proteína no estructural, la nsP4, se produce cuando la translectura del codón ópalo produce un segundo precursor poliproteico de longitud de 2.513 aminoácidos, que luego es escindido después de la traducción.

Los límites aproximados que definen los genes de las proteínas no estructurales de los genomas de los tres alfavirus representativos y usados comúnmente, SIN, SFV y VEE, son los siguientes.

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Un genoma de alfavirus de tipo natural también incluye secuencias que codifican proteínas estructurales. En el SIN, las proteínas estructurales se traducen de un mensaje subgenómico que comienza en el nucleótido 7.598, es de una longitud de 4.106 nucleótidos (excluyendo el tracto poli(A)) y es co-terminal con el extremo 3' del ARN genómico. Como las proteínas no estructurales, las proteínas estructurales también se traducen en un precursor poliproteico que es escindido para producir una proteína de la nucleocápside y dos glucoproteínas integrales de la membrana, así como dos péptidos pequeños no presentes en el virión maduro. De este modo, los replicones, las partículas y los vectores de la presente invención pueden incluir secuencias derivadas de una o más secuencias codificantes de uno o más
alfavirus.

Además de proporcionar secuencias derivadas de regiones codificantes de alfavirus, la presente invención también proporciona vectores replicones de alfavirus que contienen secuencias que codifican proteínas alfavirales modificadas, por ejemplo, proteínas no estructurales modificadas para reducir su propensión a transferirse entre cadenas (p. ej., recombinación) entre el ARN del replicón y el ARN auxiliar defectuoso, o entre dos ARN auxiliares defectuosos, durante la síntesis de ARN de cadena positiva, la síntesis de ARN de cadena negativa o ambas. Tales modificaciones pueden incluir, pero no se limitan a, mutaciones, eliminaciones o adiciones de nucleótidos, o sustituciones de secuencias, en su totalidad o en parte, tal como, por ejemplo, usando una proteína no estructural híbrida que comprenda secuencias de un alfavirus y otro virus (p. ej., alfavirus, togavirus, virus vegetal).

Por lo tanto, hay una variedad de modificaciones en las secuencias que se contemplan dentro de la presente invención. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, hay una o más eliminaciones en secuencias que codifican uno o varios genes de proteínas no estructurales. Tales eliminaciones pueden ser en la proteína no estructural (nsP) 1, 2, 3 ó 4, así como combinaciones de eliminaciones de más de un gen de nsP. Por ejemplo, y sin pretender que sea a modo restrictivo, una eliminación puede englobar al menos las secuencias de nucleótidos que codifican los residuos de aminoácido de nsP1 de VEE 101-120, 450-470, 460-480, 470-490 ó 480-500, numerados en relación con la secuencia en Kinney et al., (1989) Virology 170: 19-30, así como regiones menores incluidas en cualquiera de los anteriores.

En otra realización, una eliminación puede englobar al menos las secuencias que codifican los residuos de aminoácido de nsP2 de VEE 9-29, 613-633, 650-670 ó 740-760, así como regiones menores incluidas en cualquiera de las anteriores. En otra realización, una eliminación puede englobar al menos las secuencias que codifican los residuos de aminoácido de nsP3 de VEE 340-370, 350-380, 360-390, 370-400, 380-410, 390-420, 400-430, 410-440, 420-450, 430-460, 440-470, 450-480, 460-490, 470-500, 480-510, 490-520, 500-530 ó 488-522, así como regiones menores incluidas en cualquiera de las anteriores. En otra realización, una eliminación puede englobar al menos las secuencias que codifican los residuos de aminoácido de nsP4 de VEE 8-28 ó 552-570, así como regiones menores incluidas en cualquiera de las anteriores. Cabe destacar que aunque los intervalos de aminoácidos anteriores se ilustran usando VEE como ejemplo, se pueden utilizar tipos similares de eliminaciones en otros alfavirus.

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Generalmente, aunque la numeración de los aminoácidos es algo diferente entre los alfavirus, fundamentalmente debido a ligeras diferencias en las longitudes de las poliproteínas, los alineamientos entre las secuencias de diferentes alfavirus proporcionan un medio para identificar regiones similares en otros alfavirus (véase el alineamiento representativo en Kinney et al. (1989) Virology 170: 19-30). Preferiblemente, las eliminaciones de genes de proteínas no estructurales de la presente invención están confinadas a una región o a un tramo de aminoácidos considerado como no conservado entre los múltiples alfavirus. Además, las regiones conservadas también pueden ser objeto de eliminación.

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2.2. Proteínas estructurales de alfavirus

Las proteínas estructurales que rodean (y, en algunos casos, interactúan con) el o los componentes de los replicones de alfavirus o de los polinucleótidos vectoriales pueden incluir proteínas tanto de la cápside como de la envoltura. En la mayoría de los casos, el o los componentes de los polinucleótidos están rodeados por la o las proteínas de la cápside, formando las nucleocápsides. A su vez, la proteína de la nucleocápside está rodeada por una envoltura lipídica que contiene la o las proteínas de la envoltura. Debería entenderse que aunque es preferible tener proteínas tanto de la cápside como de la envoltura, no es necesario tener ambas.

Las proteínas de la cápside y las proteínas de la envoltura de alfavirus se describen de manera general en Strauss et al. (1994) Microbiol. Rev., 58: 491-562. La proteína de la cápside es la proteína N-terminal de la poliproteína estructural del alfavirus y, tras el procesamiento desde la poliproteína, interactúa con el ARN alfaviral y otros monómeros de las proteínas de la cápside para formar estructuras de nucleocápside.

Las glucoproteínas de la envoltura de alfavirus (p. ej., E2, E1) sobresalen de la partícula envuelta como "púas" superficiales que están implicadas funcionalmente en la unión a receptores y la entrada en la célula diana.

Una o ambas de estas proteínas estructurales (o regiones de las mismas) pueden incluir una o más modificaciones con respecto al tipo natural. Las proteínas estructurales "híbridas" (p. ej., las proteínas que contienen secuencias derivadas de dos o más alfavirus) también encuentran un uso en la práctica de la presente invención. Las proteínas híbridas pueden incluir una o más regiones derivadas de diferentes alfavirus. Estas regiones pueden estar contiguas o no contiguas. Preferiblemente, una región particular de la proteína estructural (p. ej., una región funcional tal como la parte de la cola citoplasmática de la proteína de la envoltura o el dominio de unión a ARN de la proteína de la cápside) deriva de un primer alfavirus. Cualquier cantidad de las secuencias "restantes" de la proteína (p. ej., cualquier secuencia fuera de la región designada) puede derivar de uno o más alfavirus que sean diferentes del primero. Es preferible que entre aproximadamente el 25% y el 100% (o cualquier porcentaje intermedio) de la parte "restante" derive de un alfavirus diferente, más preferiblemente, entre aproximadamente el 35% y el 100% (o cualquier porcentaje intermedio), incluso más preferiblemente, entre aproximadamente el 50% y el 100% (o cualquier porcentaje intermedio). Las secuencias derivadas de uno o más alfavirus diferentes del híbrido pueden estar contiguas o no contiguas. En otras palabras, las secuencias derivadas de un alfavirus pueden estar separadas por las secuencias de uno o más alfavirus diferentes.

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2.3. Replicón de alfavirus de nivel de bioseguridad 3 modificado

Las composiciones y los procedimientos descritos en la presente memoria también permiten la modificación de vectores replicones o sistemas eucariotas de iniciación de vectores en capas derivados de alfavirus BSL-3 (p. ej., VEE), de modo que puedan ser utilizados a un nivel de clasificación inferior (p. ej., BSL-2 o BSL-1) reduciendo la secuencia de nucleótidos derivada del alfavirus BSL-3 parental a más de un tercio, pero a menos de dos tercios de la longitud del genoma.

Por lo tanto, se pueden usar vectores, partículas o ELVIS de replicones quiméricos que incluyan una secuencia de ARN replicón de alfavirus que comprenda una secuencia 5' necesaria para la amplificación mediada por proteínas no estructurales, secuencias que codifiquen proteínas no estructurales alfavirales biológicamente activas, un promotor subgenómico alfaviral, una secuencia heteróloga no alfaviral, una secuencia 3' necesaria para la amplificación mediada por proteínas no estructurales y, opcionalmente, un tracto poliadenilado, en los que la secuencia que codifica al menos una de dichas proteínas no estructurales derive de un alfavirus BSL-3, pero en los que el ARN replicón contenga secuencias derivadas de dicho alfavirus de bioseguridad 3 que comprendan en total menos de dos tercios de la longitud del genoma del alfavirus de nivel de bioseguridad 3 parental.

Por ende, las secuencias de replicones según lo descrito en la presente memoria presentan no más del 66,67% de identidad secuencial con un alfavirus BSL-3 en toda la secuencia. En otras palabras, puede haber muchas regiones individuales de identidad secuencial en comparación con un genoma BSL-3, pero que la homología global o el porcentaje de identidad con la longitud total del genoma de un BSL-3 no sea mayor del 66,67% ni menor del 33,33%. Preferiblemente, las secuencias de replicones derivadas de dicho alfavirus de nivel de bioseguridad 3 comprenden entre el 40% y dos tercios de la longitud del genoma del alfavirus de nivel de bioseguridad 3 parental. Más preferiblemente, las secuencias de replicones derivadas de dicho alfavirus de nivel de bioseguridad 3 comprenden entre el 50% y dos tercios de la longitud del genoma del alfavirus de nivel de bioseguridad 3 parental. Incluso más preferiblemente, las secuencias de replicones derivadas de dicho alfavirus de nivel de bioseguridad 3 comprenden entre el 55% y dos tercios de la longitud del genoma del alfavirus de nivel de bioseguridad 3 parental. Lo más preferible es que las secuencias de replicones derivadas de dicho alfavirus de nivel de bioseguridad 3 comprendan entre el 60% y dos tercios de la longitud del genoma del alfavirus de nivel de bioseguridad 3 parental.

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Como se usa en la presente memoria, se considera que las definiciones de nivel de bioseguridad (p. ej., de nivel de bioseguridad 2, 3, 4) son las de la publicación del HHS "Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories", del Departamento estadounidense de Sanidad y Servicios Sociales (Servicio de Salud Pública, Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades, Institutos Nacionales de Salud), cuyos pasajes pertenecientes a tales clasificaciones se incorporan a continuación.

Las prácticas, el equipamiento de seguridad, y el diseño y la construcción de las instalaciones de nivel de bioseguridad 1 son los apropiados para laboratorios de enseñanza y preparación universitaria y secundaria, y para otros laboratorios en los que se trabaja con cepas definidas y caracterizadas de microorganismos viables de las que se sabe que no provocan sistemáticamente enfermedades en la salud de los seres humanos adultos. Bacillus subtilis, Naegleria grubri, el Virus de la Hepatitis Canina infecciosa y organismos exentos según las directrices del ADN recombinante del NIH son representativos de los microorganismos que cumplen estos criterios. Muchos agentes que no están asociados habitualmente con procesos patológicos en seres humanos son, sin embargo, patógenos oportunistas y pueden provocar la infección en individuos jóvenes, ancianos e inmunodeficientes o inmunoinhibidos. Las cepas de vacunas que hayan sufrido múltiples pasos in vivo no se deberían considerar avirulentas simplemente porque sean cepas de vacunas. El nivel de bioseguridad 1 representa un nivel básico de contención que se basa en las prácticas microbiológicas están-
dar sin la utilización de barreras primarias ni secundarias especiales distintas de un lavabo para lavarse las manos.

Las prácticas, el equipamiento, y el diseño y la construcción de las instalaciones de nivel de bioseguridad 2 son aplicables a laboratorios clínicos, de diagnóstico, de enseñanza y otros laboratorios en los que se trabaja con el espectro amplio de agentes autóctonos de un riesgo moderado que están presentes en la comunidad y asociados con la enfermedad humana de gravedad variable. Con buenas técnicas de Microbiología, estos agentes se pueden usar de manera segura en actividades realizadas en una superficie de trabajo abierta, siempre y cuando el potencial para producir salpicaduras o aerosoles sea bajo. El Virus de la Hepatitis B, el VIH, las salmonelas y la especie Toxoplasma son representativos de los microorganismos asignados a este nivel de contención. El nivel de bioseguridad 2 es apropiado cuando se trabaja con cualquier sangre, fluidos corporales, tejidos o líneas celulares fundamentalmente humanas derivados de seres humanos en los que la presencia de un agente infeccioso puede ser desconocida. (El personal de laboratorio que trabaja con materiales derivados de seres humanos debería consultar el estándar de patógenos transmitidos por sangre de la OSHA para conocer las precauciones necesarias específicas). Los principales peligros para el personal que trabaja con estos agentes se refieren a exposiciones accidentales percutáneas o de las membranas de las mucosas, o ingestión de materiales infecciosos. Se deberían adoptar medidas de precaución extremas con las agujas o los instrumentos afilados contaminados. Incluso aunque se sabe que los organismos manipulados habitualmente a un nivel de bioseguridad 2 no son transmisibles por aerosoles, los procedimientos con aerosoles o con una posibilidad alta de producir salpicaduras que puedan aumentar el riesgo de tal exposición para el personal deben realizarse en equipamiento de contención primaria o en dispositivos tales como un BSC o copas de centrifugación de seguridad. Se deberían usar otras barreras primarias según proceda, tal como escudos contra salpicaduras, protección del rostro, batas y guantes. Debe haber barreras secundarias tales como lavabos para lavarse las manos e instalaciones de descontaminación de residuos para reducir la posible contaminación medioambiental.

Las prácticas, el equipamiento de seguridad, y el diseño y la construcción de las instalaciones de nivel de bioseguridad 3 son aplicables a instalaciones clínicas, de diagnóstico, de enseñanza, de investigación o de producción en las que se trabaja con agentes autóctonos y exóticos con un potencial de transmisión respiratoria y que pueden provocar una infección grave y potencialmente letal. Mycobacterium tuberculosis, el Virus de la Encefalitis de St. Luis y Coxiella burnetii son representativos de los microorganismos asignados a este nivel. Los principales peligros para el personal que trabaja con estos agentes se refieren a la auto-inoculación, la ingestión y la exposición a aerosoles infecciosos. A un nivel de bioseguridad 3, se pone un mayor énfasis en las barreras primarias y secundarias para proteger al personal de áreas contiguas, a la comunidad y al medio ambiente de la exposición a aerosoles potencialmente infecciosos. Por ejemplo, todas las manipulaciones realizadas en laboratorio deberían hacerse en un BSC u otro equipamiento cerrado, tal como una cámara de generación de aerosoles estanca a los gases. Las barreras secundarias para este nivel incluyen el acceso controlado al laboratorio y las necesidades de ventilación para minimizar la liberación de aerosoles infecciosos del laboratorio.

Los ejemplos no restrictivos de alfavirus BSL-3 que se pueden usar en la práctica de la presente invención incluyen el Virus Cabassou, el Virus Kyzylagach, el Virus Tonate, el Virus Babanki, el Virus de la Encefalitis Equina Venezolana (excluyendo la cepa de la vacuna TC-83), el Virus Getah, el Virus Chikungunya, el Virus Middelburg, el Virus Sagiyama, el Virus Everglades, el Virus Mayaro y el Virus Mucambo.

Las prácticas, el equipamiento de seguridad, y el diseño y la construcción de las instalaciones de nivel de bioseguridad 4 son aplicables al trabajo con agentes peligrosos y exóticos que suponen a los individuos un alto riesgo de enfermedad peligrosa para la vida que se pueda transmitir por aerosoles o para la que no haya disponible vacuna ni terapia. Los agentes con una relación antigénica cercana o idéntica a los agentes de nivel de bioseguridad 4 también deberían ser manejados a este nivel. Cuando se obtienen suficientes datos, el trabajo con estos agentes puede continuar a este nivel o a un nivel inferior. Los virus tales como el Virus Marburg o el Virus de la Fiebre Hemorrágica Congo-Crimeana se manipulan a un nivel de bioseguridad 4. Los principales peligros para el personal que trabaja con estos agentes de nivel de bioseguridad 4 son la exposición respiratoria a aerosoles infecciosos, la exposición de las membranas de las mucosas o de heridas cutáneas a gotas infecciosas y la auto-inoculación. Todas las manipulaciones de los materiales de diagnóstico, los aislados y los animales infectados de manera natural o experimental potencialmente infecciosos suponen un alto riesgo de exposición e infección para el personal de laboratorio, la comunidad y el medio ambiente. El aislamiento completo del personal de laboratorio de los materiales infecciosos en aerosol se realiza fundamentalmente trabajando en un BSC de clase III o un equipo de cuerpo entero de presión positiva y con suministro de aire. La propia instalación de nivel de bioseguridad 4 es generalmente un edificio separado o una zona completamente aislada con necesidades de ventilación especializadas y complejas, y sistemas de tratamiento de residuos para evitar la liberación de agentes viables al medio ambiente.

Como se utiliza en el ámbito de la presente invención, la creación de un replicón que contiene más de un tercio, pero menos de dos tercios de la longitud del genoma original de la secuencia de cualquiera de los virus BSL-3 (denominado virus parental) se puede realizar en una variedad de modos. Por ejemplo, se pueden eliminar regiones contiguas o no contiguas del virus parental. Alternativamente, se pueden utilizar regiones contiguas o no contiguas del virus parental. Alternativamente, se pueden escindir regiones del virus parental y ligarlas en una estructura de BSL-2 o BSL-1.

En ciertas realizaciones, los extremos 5' y/o 3' de los alfavirus (secuencias necesarias para la amplificación mediada por proteínas no estructurales) se reducen a la secuencia de nucleótidos mínima necesaria para mantener una función suficiente en el contexto de un replicón para la expresión de secuencias heterólogas, o alternativamente, se sustituyen por una secuencia no alfaviral capaz de realizar la misma función. En otras realizaciones, se pueden eliminar uno o más genes de proteínas no estructurales alfavirales de regiones específicas que no están bien conservadas entre los alfavirus (p. ej., la región no conservada de nsP3) o de otro lugar. Alternativamente, la región del promotor subgenómico alfaviral o la región NTR 5' subgenómica puede contener eliminaciones. En otras realizaciones más, se pueden eliminar uno o más genes de proteínas estructurales, así como combinaciones de cualquiera de los anteriores.

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3.0. Procedimientos para producir partículas de replicones quiméricos

Las partículas de replicones de alfavirus quiméricos según la presente invención se pueden producir usando una variedad de procedimientos publicados. Tales procedimientos incluyen, por ejemplo, los enfoques de empaquetamiento transitorio, tales como la co-transfección de ARN replicón o de ARN auxiliar defectuoso transcritos in vitro (Liljestrom, Bio/Technology 9:1356-1361, 1991; Bredenbeek et al., J. Virol. 67:6439-6446, 1993; Frolov et al., J. Virol. 71:2819-2829, 1997; Pushko et al., Virology 239:389-401, 1997; patentes estadounidenses 5.789.245 y 5.842.723) o constructos de replicones y auxiliares defectuosos basados en ADN plasmídico (Dubensky et al., J. Virol. 70:508-519, 1996), así como la introducción de replicones alfavirales en líneas celulares de empaquetamiento estable (PCL) (Polo et al., PNAS 96: 4598-4603, 1999; patentes estadounidenses 5.789.245; 5.842.723; 6.015.694; WO 97/38087, WO 99/18226, WO 00/61772 y WO 00/39318).

En realizaciones preferidas, se utilizan líneas celulares de empaquetamiento de alfavirus estable para la producción de partículas de replicones. Las PCL se pueden transfectar con ARN del replicón transcrito in vitro, transfectar con replicón basado en ADN plasmídico (p. ej., un vector de ELVIS) o infectar con un cultivo patrón de partículas de replicones, y luego incubar en condiciones y durante un tiempo suficiente para producir partículas de replicones empaquetadas de título elevado en el sobrenadante del cultivo. En realizaciones particularmente preferidas, se utilizan PCL en un procedimiento de dos etapas, en el que como una primera etapa, se produce un cultivo patrón de partículas de replicones transfectando la PCL con un replicón basado en ADN plasmídico. Entonces se produce un cultivo mucho mayor de partículas de replicones en la segunda etapa, infectando un cultivo recién preparado de la PCL con el cultivo patrón. Esta infección se puede realizar usando diversas multiplicidades de infección (MdI), incluyendo una MdI = 0,01; 0,05; 0,1; 0,5; 1,0; 3; 5 ó 10. Preferiblemente, la infección se realiza a una MdI baja (p. ej., de menos de 1). Las partículas de replicones a títulos incluso > 10^{8} unidades infecciosas (UI/ml) se pueden cosechar en el tiempo a partir de PCL infectada con el cultivo patrón. Además, se pueden pasar las partículas de replicones posteriormente a cultivos incluso mayores de PCL naïve mediante una infección de multiplicidad baja repetida, dando como resultado preparaciones a escala comercial con el mismo título elevado. Lo más importante es que, mediante el uso de una PCL de la configuración de genes estructurales "cortados y empalmados", estos cultivos de partículas de replicones se pueden producir libres de RCV contaminante detectable.

Como se describe anteriormente, es posible generar una producción a gran escala de partículas de replicones de alfavirus usando un biorreactor. Preferiblemente, el biorreactor es un biorreactor de componentes externos, que es un sistema de biorreactor modular integrado para el control del cultivo en masa, del crecimiento y de los procesos de las células unidas al sustrato. La unión y la propagación de células (p. ej., células de empaquetamiento de alfavirus) tiene lugar en un recipiente o en una cámara con superficies tratadas con cultivo tisular, y las células están con medios recién preparados para una mayor productividad celular. El control y los ajustes se realizan para los parámetros tales como los gases, la temperatura, el pH, la glucosa, etc., y el vector crudo se recoge usando una bomba de perfusión. Comúnmente, los componentes individuales de un Biorreactor Externo separan los módulos externos que están conectados (i. e., mediante entubación). Los componentes externos pueden ser bombas, reservorios, oxigenadores, módulos de cultivo y otras partes no estándar. Un ejemplo representativo de un biorreactor de componentes externos es el sistema CellCube® (Corning, Inc.).

Además de usar el biorreactor de componentes externos descrito en la presente memoria, también se puede usar un biorreactor de tanque de agitación más tradicional, en ciertos casos, para la producción de partículas de replicones de alfavirus. En un biorreactor de tanque de agitación, las células de empaquetamiento de alfavirus pueden estar sueltas de cualquier matriz (i. e., flotando en suspensión) o estar unidas a una matriz (p. ej., polidiscos, micro o macro-vehículos, perlas). Alternativamente, se puede usar un sistema de cultivo de fibra hueca.

Tras la cosecha, los sobrenadantes del cultivo crudo que contienen las partículas de replicones de alfavirus quiméricos se pueden aclarar pasando la cosecha a través de un filtro (p. ej., de un tamaño de poro 0,2uM, 0,45uM, 0,65uM, 0,8uM). Opcionalmente, se pueden someter los sobrenadantes crudos a una centrifugación de baja velocidad antes de la filtración para eliminar los residuos celulares de gran tamaño. En una realización, se añade una endonucleasa (p. ej., Benzonasa, Sigma n.º E8263) a la preparación de las partículas de replicones de alfavirus antes o después de una etapa de purificación cromatográfica al ácido nucleico exógeno digerido. Además, se puede concentrar la preparación antes de la purificación usando uno de los procedimientos ampliamente conocidos (p. ej., la filtración de flujo tangencial).

Las partículas de replicones de alfavirus crudas o aclaradas se pueden concentrar y purificar mediante técnicas cromatográficas (p. ej., cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión por tamaños, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad). Se pueden realizar consecutivamente dos o más de tales procedimientos de purificación. En realizaciones preferidas, se realiza al menos una etapa de cromatografía de intercambio iónico y se utiliza una resina de intercambio iónico, tal como una resina de intercambio iónico con tentáculos y, al menos, una etapa de cromatografía de exclusión por tamaños. En síntesis, las partículas de replicones de alfavirus aclaradas filtradas se pueden cargar en una columna que contenga una matriz o una resina de intercambio iónico cargada (p. ej., intercambio catiónico o aniónico). La matriz o la resina puede constar de una variedad de sustancias, incluyendo, pero no limitándose a, agarosa entrecruzada, poliestireno entrecruzado, estireno entrecruzado, resina de poliéter hidrófila, resina acrílica y resina basada en metacrilato. El componente de intercambiador iónico puede comprender, pero sin limitarse a, un intercambiador catiónico seleccionado de la lista que consta de intercambiador catiónico de sulfopropilo, un intercambiador catiónico de carboximetilo, un intercambiador de ácido sulfónico, un intercambiador catiónico de metilsulfonato y un intercambiador de SO3^{-}. En otras realizaciones, el componente de intercambiador iónico puede comprender, pero sin limitarse a, un intercambiador aniónico seleccionado de la lista que consta de DEAE, TMAE y DMAE. Lo más preferible es que la cromatografía de intercambio iónico se realice usando un intercambiador catiónico de tentáculos, en el que la resina de intercambio iónico sea una resina basada en metacrilato con un intercambiador catiónico de SO3^{-} (p. ej., SO3^{-} de EDM Fractogel®).

Las partículas de replicones quiméricos se pueden unir a la resina de intercambio iónico tras lo que se realiza uno o más lavados con tampón que contiene una sal (p. ej., NaCl 250 mM o menor). Entonces se pueden eluir las partículas de replicones de la columna en forma purificada usando un tampón con una concentración elevada de sales. En realizaciones preferidas, la concentración salina es al menos 300 mM, 350 mM, 400 mM, 450 mM o 500 mM. La elución se puede controlar preferiblemente mediante un espectrofotómetro a 280 nm, pero también mediante un análisis de valoración de replicones, un análisis de transferencia de la expresión (TOE) o un análisis de gel proteico con la posterior tinción con Coomassie o transferencia Western.

Posteriormente, se puede intercambiar el tampón de elución de mayor salinidad por un tampón más deseable, por ejemplo, mediante la dilución en una solución acuosa apropiada o pasando el eluido que contiene partículas por una columna de exclusión molecular. Además, el uso de una columna de exclusión por tamaños moleculares también puede proporcionar, en ciertos casos, una mayor purificación. Por ejemplo, en una realización, se puede usar una cromatografía en Sephacryl S-500 o S-400 (Pharmacia) tanto como intercambio del tampón, como para purificar más las fracciones que contienen las partículas de replicones eluidas de una columna de intercambio iónico. Usando esta resina en particular, las partículas de replicones son generalmente eluidas en el antiguo volumen hueco y muestran una mejoría en el nivel de pureza, pues algunos de los contaminantes tienen menor peso molecular y se conservan en la columna durante más tiempo. Sin embargo, también se podrían usar resinas alternativas de diferentes composiciones, así como la exclusión por tamaños, que podrían producir resultados similares o mejores. Es estas estrategias, se podrían incorporar resinas de mayor tamaño, tales como Sephacryl S-1000 que permitirían a las partículas de replicones entrar en la matriz y así permanecer durante más tiempo, permitiendo el fraccionamiento.

Los procedimientos descritos en la presente memoria son procedimientos distintos ampliamente utilizados en los que los ARN auxiliares defectuosos y el vector replicón contienen genes derivados del mismo virus, permitiendo así que el proceso de ensamblaje de las partículas de replicones tenga lugar de manera natural y dé como resultado una partícula de replicón que tenga un replicón empaquetamiento en una cápside y una o varias proteínas de la envoltura virales derivadas del mismo virus que aportó los genes de proteínas no estructurales. Por consiguiente, en tales procedimientos, la señal de empaquetamiento (también conocida como secuencias de empaquetamiento), el dominio de unión a ARN, el dominio de interacción con glucoproteínas y las glucoproteínas de la envoltura son todos del mismo virus.

Por el contrario, los procedimientos descritos en la presente memoria implican una producción satisfactoria y eficiente de las partículas de replicones de alfavirus de secuencias derivadas de dos o más alfavirus. Según lo descrito en la presente memoria, las partículas se producen más eficazmente y tienen, además, otras ventajas.

También se proporcionan procedimientos para empaquetar ARN replicones de alfavirus en partículas de replicones (producir partículas de replicones) y reducir la probabilidad de generar virus competentes en la replicación (p. ej., virus de tipo natural) durante el empaquetamiento, que comprenden introducir en una célula permisible un ARN replicón de alfavirus que codifique proteínas no estructurales alfavirales biológicamente activas y un polipéptido heterólogo, junto con uno o más ARN auxiliares defectuosos que codifiquen al menos una proteína estructural de alfavirus, e incubar dicha célula en condiciones adecuadas durante un tiempo suficiente para permitir la producción de las partículas de replicones. En estas realizaciones, tanto el ARN del replicón como el ARN auxiliar defectuoso incluyen elementos de control, particularmente, una secuencia 5' necesaria para la amplificación mediada por proteínas no estructurales, un medio para expresar las secuencias que codifican el polipéptido (la(s) secuencia(s) que codifica(n) el polipéptido también se denominan el gen próximo a 3'), por ejemplo, un promotor que conduce la expresión de (1) la proteína heteróloga del replicón y (2) las proteínas estructurales del ARN auxiliar defectuoso, una secuencia 3' necesaria para la amplificación mediada por proteínas no estructurales, un tracto poliadenilado y, opcionalmente, una RTN 5' subgenómica. Además, a diferencia de los procedimientos conocidos, uno o más de estos elementos de control son diferentes (p. ej., la secuencia es diferente) como entre el ARN del replicón y el ARN del auxiliar defectuoso. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, la secuencia 5' necesaria para la amplificación mediada por proteínas no estructurales es diferente como entre el replicón y el ARN auxiliar. En otras realizaciones, el medio para expresar las secuencias que codifican el polipéptido y/o la secuencia 3' necesaria para la amplificación mediada por proteínas no estructurales es diferente como entre el replicón y el ARN auxiliar.

Cualquier experto en la técnica entenderá fácilmente que la introducción de ARN replicón en células permisivas se puede realizar mediante una variedad de medios, tales como, por ejemplo, la transfección o la electroporación del ARN (p. ej., ARN transcrito in vitro), la transcripción del ARN de la célula a partir de ADN (p. ej., sistema eucariota de iniciación de vectores en capas) o la administración mediante partículas virales o de tipo viral (p. ej., partículas de replicones), y la introducción de ARN auxiliar defectuoso en células permisivas también se puede realizar mediante una variedad de modos, tales como, por ejemplo, la transfección o la electroporación de ARN (p. ej., ARN transcrito in vitro) o la transcripción de ARN de la célula a partir de ADN (p. ej., casete de expresión de proteínas estructurales).

Además, también se pueden realizar modificaciones para reducir las secuencias homólogas a nivel de la estructura del ADN, tal como, por ejemplo, en un sistema eucariota de iniciación de vectores en capas o un casete de expresión de proteínas estructurales usado para la derivación de células de empaquetamiento. Tales modificaciones incluyen, pero no se limitan a, promotores eucariotas alternativos, secuencias de poliadenilación, marcadores de la resistencia a antibióticos, orígenes bacterianos de replicación y otras secuencias de estructuras no funcionales.

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4.0 Composiciones farmacéuticas

La presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden cualquiera de las partículas de replicones de alfavirus, vectores y/o replicones descritos en la presente memoria en combinación con un vehículo, diluyente o receptor farmacéuticamente aceptable. En ciertas realizaciones preferidas, se añade una cantidad suficiente de tampón de formulación a las partículas de replicones purificadas para formar una suspensión acuosa. En realizaciones preferidas, el tampón de formulación comprende un sacárido y un componente de tamponamiento en agua, y también puede contener uno o más aminoácidos o un aditivo estructural de alto peso molecular. El tampón de formulación se añade en una cantidad suficiente como para alcanzar la concentración final deseada de los constituyentes y diluir mínimamente las partículas de replicones. Entonces se puede almacenar la suspensión acuosa, preferiblemente, a -70ºC, o secar de inmediato.

La suspensión acuosa se puede secar mediante liofilización o evaporación a temperatura ambiente. En síntesis, la liofilización implica las etapas de enfriar la suspensión acuosa por debajo de la temperatura de transición al estado gaseoso o por debajo de la temperatura del punto eutéctico de la suspensión acuosa, y eliminar el agua de la suspensión enfriada mediante sublimación para formar una partícula de replicón liofilizada. En una realización, se colocan alícuotas del virus recombinante formulado en una cámara refrigerada de Edwards (unidad RC3S de la estantería 3) unida a un liofilizador (Supermodulyo 12K). Se usa un procedimiento de liofilización de múltiples etapas según lo descrito por Phillips et al. ("Cryobiology", 18: 414, 1981) para liofilizar las partículas de replicones formuladas, preferiblemente, de una temperatura de -40ºC a -45ºC. La composición resultante contiene menos del 10% de agua en peso de las partículas de replicones liofilizadas. Una vez liofilizadas, las partículas de replicones son estables y se pueden almacenar a -20ºC a 25ºC, según lo tratado más detalladamente a continuación. En el procedimiento evaporativo, se elimina el agua de la suspensión acuosa a temperatura ambiente por evaporación. En una realización, el agua se elimina mediante un procedimiento de atomización, en el que la suspensión acuosa es enviada a un flujo de gas precalentado, lo que habitualmente da como resultado la evaporación rápida del agua de las pequeñas gotas de la suspensión. Una vez deshidratado, el virus recombinante es estable y se puede almacenar a 20ºC a 25ºC.

Las soluciones acuosas usadas para la formulación comprenden preferiblemente un sacárido, un componente de tamponamiento y agua. La solución también puede incluir uno o más aminoácidos y un aditivo estructural de alto peso molecular. Esta combinación de componentes actúa para conservar la actividad de las partículas de replicones tras la congelación y también la liofilización o el secado a través de la evaporación. Aunque un sacárido preferido es la lactosa, se pueden usar otros sacáridos, tales como sacarosa, manitol, glucosa, trehalosa, inositol, fructosa, maltosa o galactosa. Una concentración particularmente preferida de lactosa es del 3%-4% en peso.

El aditivo estructural de alto peso molecular ayuda a la prevención de la agregación de partículas durante la congelación y proporciona un soporte estructural en el estado liofilizado o seco. En el contexto de la presente invención, se considera que los aditivos estructurales son de "alto peso molecular" si son de un PM de más de 5.000. Un aditivo estructural de alto peso molecular preferido es la albúmina de suero humano. Sin embargo, se pueden usar también otras sustancias, tales como hidroxietilcelulosa, hidroximetilocelulosa, dextrano, celulosa, gelatina o povidona. Una concentración particularmente preferida de albúmina de suero humano es del 0,1% en peso.

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El componente de tamponamiento actúa para tamponar la solución manteniendo un pH relativamente constante. Se puede usar una variedad de tampones en función del intervalo de pH deseado, preferiblemente, entre 7,0 y 7,8. Los tampones adecuados incluyen tampón de fosfato y tampón de citrato. Además, es preferible que la solución acuosa contenga una sal neutra que se use para ajustar las partículas de replicones formuladas finales hasta una concentración salina iso-osmótica apropiada. Las sales neutras adecuadas incluyen cloruro de sodio, cloruro de potasio o cloruro de magnesio. Una sal preferida es el cloruro de sodio. Las partículas de replicones liofilizadas o deshidratadas de la presente invención pueden se pueden reconstituir usando una variedad de sustancias, pero se reconstituyen preferiblemente usando agua. En ciertos casos, también se pueden usar soluciones de sales diluidas que llevan la formulación final a la isotonicidad.

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5.0 Aplicaciones

Las partículas de alfavirus quiméricos se pueden usar para administrar una amplia variedad de secuencias de nucleótidos que incluyen, por ejemplo, secuencias que codifican linfocinas o citocinas (p. ej., IL-2, IL-12, GM-CSF), enzimas conversoras de profármacos (p. ej., HSV-TK, VZV-TK), antígenos que estimulan una respuesta inmune (p. ej., VIH, VHC, antígenos tumorales), moléculas terapéuticas tales como factores de crecimiento o reguladores (p. ej., VEGF, FGF, PDGF, BMP), proteínas que ayudan a o inhiben una respuesta inmune, así como ribozimas y secuencias antisentido. Las secuencias de nucleótidos anteriores incluyen a las que se hace referencia anteriormente (p. ej., en los documento U.S. 6.015.686; WO 9738087 y WO 9918226), y se pueden obtener de depósitos, se pueden clonar fácilmente a partir de ARN celular o de otro ARN usando las secuencias publicadas, o se pueden sintetizar, por ejemplo, en un sintetizador de ADN de Applied Biosystems Inc. (p. ej., sintetizador de ADN APB modelo 392 (Foster City, CA)).

A efectos de la presente invención, se puede usar casi cualquier polipéptido o polinucleótido. Los antígenos se pueden obtener de cualquiera de los varios virus, bacterias, parásitos y hongos conocidos, así como de cualquiera de los diversos antígenos tumorales o de cualquier otro antígeno hacia el que se desee una respuesta inmune. Además, a efectos de la presente invención, un "antígeno" se refiere a una proteína que incluye modificaciones, tales como eliminaciones, adiciones y sustituciones (en general, conservadoras en la naturaleza), en la secuencia nativa, siempre y cuando la proteína mantenga la capacidad de provocar una respuesta inmunológica. Estas modificaciones pueden ser deliberadas, como a través de mutagénesis de un sitio específico, o pueden ser accidentales, tal como a través de mutaciones de los huéspedes que producen los antígenos.

Los antígenos se pueden usar solos o en cualquier combinación. (Véase, p. ej., el documento WO 02/00249 que describe el uso de combinaciones de antígenos bacterianos). Las combinaciones pueden incluir múltiples antígenos del mismo patógeno, de múltiples antígenos de diferentes patógenos o de múltiples antígenos del mismo o de diferentes patógenos. Por lo tanto, se pueden incluir en la misma composición antígenos bacterianos, virales, tumorales y/o de otro tipo o se pueden administrar al mismo sujeto por separado. En general, se prefiere el uso de combinaciones de antígenos para aumentar una respuesta inmune.

Los ejemplos no restrictivos de patógenos bacterianos incluyen difteria (véase, p. ej., el capítulo 3 de "Vaccines", 1998, eds. Plotkin y Mortimer (ISBN 0-7216-1946-0), estafilococos (p. ej., Staphylococcus aureus según lo descrito en Kuroda et al. (2001) Lancet 357: 1225-1240), cólera, tuberculosis, C. tetani, también conocido como tétanos (véase, p. ej., el capítulo 4 de "Vaccines", 1998, eds. Plotkin y Mortimer (ISBN 0-7216-1946-0), estreptococos del grupo A y del grupo B (incluyendo Streptococcus pneumoniae, Streptococcus agalactiae y Streptococcus pyogenes según lo descrito, por ejemplo, en Watson et al. (2000) Pediatr. Infect. Dis. J. 19: 331-332; Rubin et al. (2000) Pediatr. Clin. North Am. 47: 269-284; Jedrzejas et al. (2001) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 65: 187-207; Schuchat (1999) Lancet 353: 51-56; solicitudes de patentes británicas 0026333.5; 0028727.6; 015640.7; Dale et al. (1999) Infect Dis Clin North Am 13: 227-1243; Ferretti et al. (2001) PNAS, EE.UU., 98: 4658-4663), pertussis (véase, p. ej., Gusttafsson et al. (1996) N. Engl. J. Med. 334: 349-355; Rappuoli et al. (1991) TIBTECH 9: 232-238), meningitis, Moraxella catarrhalis (véase, p. ej., McMichael (2000) "Vaccine", 19 Supl. 1: S101-107) y otros estados patógenos, incluyendo, sin limitación, Neisseria meningitides (A, B, C, Y), Neisseria gonorrhoeae (véase, p. ej., WO 99/24578; WO 99/36544 y WO 99/57280), Helicobacter pylori (p. ej., CagA, VacA, NAP, HopX, HopY y/o ureasa según lo descrito, por ejemplo, en WO 93/18150; WO 99/53310; WO 98/04702) y Haemophilus influenza. Hemophilus influenza de tipo B (HIB) (véase, p. ej., Costantino et al. (1999) "Vaccine" 17: 1251-1263), Porphyromonas gingivalis (Ross et al. (2001) "Vaccine" 19: 4135-4132) y combinaciones de los mismos.

Los ejemplos no restrictivos de patógenos virales incluyen meningitis, rinovirus, gripe (Kawaoka et al., "Virology" (1990) 179: 759-767; Webster et al.,"Antigenic variation among type A influenza viruses", p. 127-168. En: P. Palese y D. W. Kingsbury (ed.), "Genetics of influenza viruses". Springer-Verlag, Nueva York), Virus Sincitial Respiratorio (RSV), Virus Paragripal (PIV), y similares. Los antígenos derivados de otros virus también encontrarán un uso en la presente invención, tal como, sin limitación, las proteínas de miembros de las familias Picomaviridae (p. ej. poliovirus, etc., según lo descrito, por ejemplo, en Sutter et al. (2000) Pediatr. Clin. North Am. 47: 287-308; Zimmerman y Spann (1999), Am. Fam. Physician, 59: 113-118; 125-126); Caliciviridae; Togaviridae (p. ej., el Virus de la Rubeola, el Virus Dengue, etc.); la familia Flaviviridae, incluyendo los géneros flavivirus (p. ej., el Virus de la Fiebre Amarilla, el Virus de la Encefalitis Japonesa, serotipos del Virus Dengue, el Virus de la Encefalitis Transmitida por Garrapatas, el Virus West Nile); pestivirus (p. ej., el Virus de la Fiebre Porcina Clásica, el Virus de la Diarrea Viral Bovina, el Virus de la Enfermedad de la Frontera); y hepacivirus (p. ej., hepatitis A, B y C según lo descrito, por ejemplo, en las patentes estadounidenses n.º 4.702.909; 5.011.915; 5.698.390; 6.027.729 y 6.297.048); Parvovirus (p. ej., parvovirus B19); Coronaviridae; Reoviridae; Bimaviridae; Rhabodoviridae (p. ej., Virus de la Rabia, etc., según lo descrito, por ejemplo, en Dressen et al. (1997) "Vaccine", 15 Supl: s2-6; MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 16 de enero de 1998: 47 (1): 12,19); Filoviridae; Paramyxoviridae (e. g., Virus de las Paperas, Virus del Sarampión, Rubeola, Virus Sincitial Respiratorio, etc., según lo descrito en los capítulos 9 a 11 de "Vaccines", 1998, eds. Plotkin y Mortimer (ISBN 0-7216-1946-0); Orthomyxoviridae (p. ej., el Virus de la Gripe de los tipos A, B y C, etc., según lo descrito en el capítulo 19 de "Vaccines", 1998, eds. Plotkin y Mortimer (ISBN 0-7216-1946-0)); Bunyaviridae; Arenaviridae; Retroviradae (p. ej., HTLV-1; HTLV-11; VIH-1 (también conocidos como HTLV-III, LAV, ARV, HTI, R, etc.)), incluyendo, pero sin limitarse a, antígenos de los aislados HIVIIIb, HIVSF2, HIVLAV, HIVI-AL, I-IIVMN); VIH-I CM235, VIH-1 IJS4; VIH-2; Virus de la Inmunodeficiencia Simia (VIS) entre otros. Además, los antígenos también pueden derivar del Virus del Papiloma Humano (VPH) y del Virus de Encefalitis Transmitida por Garrapatas. Véase, p. ej., "Virology", III Edición (W. K. Joklik ed. 1988); "Fundamental Virology", II edición (B. N. Fields y D. M. Knipe, eds, 1991), para una descripción de éstos y de otros virus.

También se pueden usar convenientemente en las técnicas descritas en la presente memoria, antígenos de la familia de virus de la Hepatitis, incluyendo el Virus de la Hepatitis A (VHA) (véase, p. ej., Bell et al. (2000) Pediatr. Infect. Dis. J: 19: 11187-1188; Iwarson (1995) APMIS 103: 321-326), el Virus de la Hepatitis B (VHB) (véase, p. ej., Gerlich et al. (1990) "Vaccine", 8 Supl: S63-68 y 79-80), el Virus de la Hepatitis C (BHC), el Virus de la Hepatitis Delta (VHD), el Virus de la Hepatitis E (VHE) y el Virus de la Hepatitis G (VHG). A modo de ejemplo, se conoce la secuencia genómica viral del VHC, así como los procedimientos para obtener la secuencia. Véanse, p. ej., las publicaciones internacionales n.º WO 89/04669; WO 90/11089; y WO 90/14436. También se incluyen en la invención variantes moleculares de tales polipéptidos, por ejemplo, según lo descrito en PCT/US99/31245; PCT/US99/31273 y PCT/US99/31272.

Los ejemplos no restrictivos de antígenos tumorales incluyen antígenos reconocidos por linfocitos CD8+ (p. ej., antígenos de diferenciación de melanocitos del melanoma tales como MART-1, gp100, tirosinasa, proteína 1 relacionada con la tirosinasa, proteína 2 relacionada con la tirosinasa, receptor de hormonas estimulantes de melanocitos; antígenos mutados tales como beta-catenina, MUM-1, CDK-4, caspasa-8, KIA 0205, HLA-A2-R1701; antígenos del cáncer de testículos tales como MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, MAGE-12, BAGE, GAGE y NY-ESO-1; y antígenos compartidos no mutados sobre-expresados en cáncer, tales como la alfa-fetoproteína, proteína catalítica de la telomerasa, G-250, MUC-1, antígeno carcinoembrionario, p53, Her-2-neu), así como antígenos reconocidos por linfocitos CD4+ (p. ej., gp100, MAGE-1, MAGE-3, tirosinasa, NY-ESO-1, triosafosfato-isomerasa, CDC-27 y LDLR-FUT). Véanse, también, WO 91/02062, la patente estadounidense n.º: 6.015.567, WO 01/08636, WO 96/30514, la patente estadounidense n.º: 5.846.538 y la patente estadounidense n.º: 5.869.445.

En ciertas realizaciones, se pueden usar uno o varios antígenos tumorales. Los antígenos tumorales derivan de componentes celulares mutados o alterados. Tras la alteración, los componentes celulares ya no realizan sus funciones reguladoras y, de ahí que la célula pueda experimentar un crecimiento incontrolado. Los ejemplos representativos de los componentes celulares alterados incluyen ras, p53, Rb, proteína alterada codificada por el gen del tumor de Wilms, ubiquitina, mucina, proteína codificada por los genes DCC, APC y MCC, así como los receptores o las estructuras de tipo receptoras, tales como neu, receptor de la hormona tiroidea, receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), receptor de la insulina, receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF) y receptor del factor estimulante de colonias (CSF). Éstos, así como otros componentes celulares, se describen, por ejemplo en la patente estadounidense n.º: 5.693.522 y las referencias citadas en tal memoria.

También se revelan en la presente memoria procedimientos para administrar estas secuencias heterólogas seleccionadas a un mamífero de sangre caliente (p. ej., un mamífero, tal como un ser humano u otro animal de sangre caliente, tal como caballo, vaca, cerdo, oveja, perro, gato, rata o ratón) para su uso como una vacuna o un compuesto terapéutico, que comprende la etapa de administrar al mamífero partículas de replicones o sistemas eucariotas de iniciación de vectores en capas, según lo descrito en la presente memoria, que sean capaces de expresar la secuencia heteróloga seleccionada. La administración se puede realizar mediante una variedad de vías (p. ej., intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, subcutánea, oral, intraocular, intranasal, rectal o intratumoralmente). Además, las partículas de replicones se pueden administrar bien directamente (i.e., in vivo) o a células que hayan sido extirpadas (ex vivo) y posteriormente devueltas al mamífero de sangre caliente.

Cabe destacar que el procedimiento seleccionado para la producción de las partículas de replicones de alfavirus quiméricos de la presente invención debería usar técnicas conocidas en la materia para minimizar la posibilidad de generar virus competentes en la replicación (RCV) contaminantes. Una de tales estrategias es el uso de auxiliares defectuosos o PCL que contienen casetes de expresión de proteína estructurales "cortados y empalmados" (véanse las patentes estadounidenses 5.789.245; 6.242.259; 6.329.201). En este contexto, los genes de proteínas estructurales de alfavirus se segregan en constructos de expresión separados (p. ej., cápside separada de las glucoproteínas), de modo que la recombinación para regenerar un complemento completo de proteínas estructurales es muy poco probable. La presente invención también proporciona composiciones y procedimientos para reducir aún más la probabilidad de recombinaciones durante la producción de las partículas de replicones de alfavirus, más allá de esos procedimientos convencionales conocidos en la técnica. Por ejemplo, cualquiera de los varios elementos funcionales (p. ej., elementos de control) comúnmente compartidos por el ARN replicón y el ARN auxiliar defectuoso, o compartidos entre múltiples ARN auxiliares defectuosos (también sistemas eucariotas de iniciación de vectores en capas y casetes de expresión de proteínas estructurales) se puede sustituir por elementos alternativos que realicen la misma función. En este caso, la homología entre las moléculas de ARN disminuye o se elimina. Alternativamente, también se puede reducir la probabilidad de que el molde de polimerasa se cambie entre las moléculas de ARN. Se incluyen elementos funcionales representativos compartidos comúnmente por el ARN replicón y el ARN auxiliar defectuoso, o compartidos entre múltiples ARN auxiliares defectuosos, así como algunas alternativas de ambos según lo contemplado por la presente invención, pero no se limitan a los descritos anteriormente en el apartado B anterior.

Los siguientes ejemplos se incluyen para ilustrar de manera más completa la presente invención. Además, estos ejemplos proporcionan realizaciones preferidas de la invención y no pretenden limitar el ámbito de la misma. Cualquier ejemplo que no se refiera específicamente a la invención reivindicada se proporciona a efectos de comparación e ilustración.

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Ejemplos Ejemplo 1 Construcción de un vector replicón derivado del VEE

Para construir los vectores replicones derivados del VEE y los casetes de empaquetamiento auxiliares defectuosos para su uso en la producción de partículas quiméricas, fue necesario sintetizar primero ADN complementario correspondiente a todo el genoma del VEE. En base a la secuencia anteriormente publicada de la cepa del Mono Trinidad de tipo natural del VEE (GeneBank L01442), (en lo sucesivo, TRD del VEE), se sintetizó el genoma completo de 11.447 y se clonó en múltiples fragmentos usando oligonucleótidos solapantes. Se usaron clones de genes de proteínas no estructurales para ensamblar un vector replicón, mientras que los clones de los genes de proteínas estructurales se usaron para ensamblar casetes de empaquetamiento auxiliares defectuosos.

Las secuencias que codifican genes de proteínas no estructurales de la TRD del VEE se analizaron en cuanto a sitios de escisión de restricción únicos adecuados que subdividieran la región en fragmentos de una longitud práctica y que se pudieran usar convenientemente para el ensamblaje final del constructo de vector replicón completo. Como se muestra en la figura 1, se identificó un total de 13 fragmentos intermedios, cuya longitud varió de 334 a 723 nucleótidos. Esta serie de fragmentos se sintetizó usando oligonucleótidos solapantes y técnicas comúnmente empleadas por los expertos en la materia de la Biología Molecular (véase, por ejemplo, a continuación). Se añadieron a los fragmentos terminales n.º 1 y n.º 13 más secuencias necesarias para la construcción final del plásmido que se pudieran usar para la transcripción de los vectores de expresión replicones de ARN in vitro e in vivo. Secuencia arriba, como parte del fragmento 1, se colocó bien promotor del bacteriófago SP6 o promotor del CMV eucariota para permitir la transcripción del ARN replicón. Secuencia abajo, como parte del fragmento 13, se replicó la UTR 3' viral, un tracto de poliadenilación de A40 sintético y la ribozima antigenómica del Virus de la Hepatitis Delta para la generación de ARN terminados de manera auténtica (Dubensky et al., J. Virol. 70: 508-519,1996; Polo, 1999, ibid).

Como un ejemplo detallado de la síntesis de genes para uno de los fragmentos, se generaron cadenas de ADN dúplex completas para el fragmento de replicón n.º 2 a partir de oligonucleótidos sintéticos solapantes, según lo descrito más adelante y mostrados en la Figura 2 (los oligonucleótidos adyacentes se muestran con o sin sombreado para destacar las uniones). En primer lugar, se unió la cadena del dúplex completa a la secuencia de reconocimiento de los sitios de las enzimas de restricción convenientes adecuados para la inserción en los vectores de clonación intermedios. Luego se subdividió cada fragmento en una serie de oligonucleótidos con una longitud media de 60 nucleótidos cada uno y solapantes con aquellos oligonucleótidos de la cadena opuesta en una media de 20 nucleótidos por cada extremo. La síntesis de los oligonucleótidos iniciales fue realizada por proveedores comerciales (p. ej., Integrated DNA Technologies, Coralville, IA; Operon Technologies, Alameda, CA). Se reconstituyeron los oligonucleótidos de cada fragmento según la recomendación del proveedor para producir soluciones 100nM de cada oligo individual. Para ensamblar el fragmento, se mezclaron 100 pmoles de cada oligo en un solo tubo de reacción que contenía tampón de polinucleótido quinasa de T4 (New England Biolabs, Beverly, MA), rATP 1 mM, agua y 10 unidades de enzima polinucleótido quinasa de T4 (New England Biolabs Beverly, MA) en un volumen de reacción final de 500 ul. Se permitió el desarrollo de la reacción de fosforilación durante 30 minutos a 37ºC, tras lo que se complementó la reacción con 10 unidades más de polinucleótido quinasa de T4 y se dejó continuar durante 30 minutos más. Al finalizar la reacción, se calentó el tubo que contenía la mezcla hasta 95ºC durante 5 min en un vaso de precipitados que contenía un gran volumen de agua para desnaturalizar la enzima y cualquier cadena de ADN que ya pudiera estar apareada. Entonces de retiró el vaso de precipitados de la fuente de calor y se dejó enfriar lentamente hasta la temperatura ambiente para que los oligonucleótidos complementarios se aparearan en cadenas de ADN dúplex completas.

Una vez enfriado, se ligaron 0,2 pmoles del material reaccionado con 100 pmoles del ADN del vector lanzadera anteriormente preparado y se transformaron en bacterias competentes según procedimientos estándar. Primero se analizaron los transformantes que surgieron de esta unión en cuanto a la presencia de los sitios enzimáticos de los replicones terminales apropiados, en cuanto al tamaño de los insertos y en cuanto a las pruebas de la duplicación de los insertos. Se eligieron aleatoriamente varios transformantes positivos y se sometieron a una confirmación de las secuencias. Se corrigió cualquier error de secuencia detectado mediante el cambio de fragmentos entre dos o más muestras secuenciadas o mediante mutagénesis dirigida a un sitio específico, y se volvió a confirmar su
autenticidad.

Una vez obtenidos todos los fragmentos, se realizó un ensamblaje final de un vector replicón, similar a los publicados anteriormente con una variedad de alfavirus (Xiong et al., Science 243: 1188-1191, 1989; Dubensky et al., 1996, ibid; Liljestrom et al., Bio/Technol. 9: 1356-1361, 1991; Pushko et al., "Virology" 239: 389-401), troceando cada sub-fragmento junto con su fragmento contiguo a través de la unión por los sitios de escisión de fragmentos terminales seleccionados anteriormente. Una vez ensamblada, se volvió a confirmar la secuencia de todo el replicón de VEE sintético. El constructo del vector de alfavirus basado en el VEE resultante del que se transcribió el ARN replicón in vitro se denominó pVCR.

Además del constructo de vector replicón basado en el promotor SP6, también se construyó un sistema eucariota de iniciación de vectores en capas basado en VEE (ELVIS, véanse los documentos US 5814482 y 6015686), que utilizó un promotor del CMV para lanzar replicones de ARN funcionales desde una célula eucariota. La modificación del plásmido pVCR para su conversión en un vector de ELVIS se realizó como se explica a continuación. Se usó un vector de ELVIS basado en el Virus Sindbis (SIN) existente, el pSINCP, como fuente donante de los componentes estructurales apropiados, incluyendo el promotor del CMV, el gen de resistencia a la Kanamicina y un origen de replicación. Esta estrategia fue posible porque tanto el pSINCP como el pVCR comparten elementos secuenciales idénticos (p. ej., secuencia poli(A) sintética, ribozima del HDV) secuencia debajo de las regiones de genes no estructurales y UTR 3' viral. En el pVCR, la ribozima del HDV está flanqueada por un sitio PmeI único, mientras que en pSINCP, la ribozima está flanqueada por un sitio BclI. Entonces, la fusión de PmeI/BclI sirvió como sitio de unión en 5' entre pSINCP y pVCR. El sitio de unión en 3' fue un sitio BspEI fortuito presente en la nsP1 tanto de SIN como de VEE. Para realizar el cambio estructural, primero se transformó pSINCP en una bacteria huésped menos Dam/Dcm, SCS110 (Stratagene, La Jolla, CA) para obtener ADN escindible por BclI. Se aisló y se volvieron romos los extremos de un fragmento de 1.203 pares de bases que contenía a BGHt en el extremo 5' y un gen Kan R en el extremo 3', por medio de la ADN polimerasa de T4 (New England Biolabs, Beverly, MA) siguiendo procedimientos estándar. Posteriormente, se siguió digiriendo este fragmento con PstI para liberar un fragmento BcII-PstI de 999 pb que fue purificado, que contenía BGHt y 2/3 de 5' del gen Kan R.

El plásmido pSINCP contiene 4 sitios BspEI. Para hacer más exacta la identificación de los fragmentos, se co-digirió el plásmido con NotI, SalI y Eco47III, y se aisló el fragmento de 5.173 pb. Entonces se siguió digiriendo este fragmento con PstI y BspEI, y a partir de éste, se purificó un fragmento PstI-BspEI de 2.730 pb que contenía 1/3 de 3' del gen Kan R, el origen de replicación del plásmido, el promotor pol II del CMV y 420 pb del gen de la nsP1 de Sindbis.

Como origen del extremo 5' y del extremo 3' del replicón VCR, se utilizó un plásmido intermedio temprano, pVCR-DH (véase a continuación). pVCR-DH contiene el fragmento 1, el fragmento 13 y todos los sitios de restricción terminales de los fragmentos intermedios. Como tal, contiene una parte del gen de la nsP1 de la TRD del VEE que incluye el sitio BspEI necesario y todos los rasgos de 3' descritos anteriormente que eran necesarios para el cambio, pero carece de la región no estructural del núcleo del extremo 3' de nsP1 hasta el extremo 5' de nsP4. Se transformó pVCR-DH en células SCS 110 como antes y se digirió con BspEI y PmeI para liberar un fragmento de 1.302 pb que contiene nsP1'-nsP4', UTR de 3', tracto de A40 y ribozima del HDV.

Se realizó una unión tridireccional de los fragmentos BclI (romo)-PstI y PstI-BspEI de pSINCP, y el fragmento BspEI-PmeI de pVCR-DH. El plásmido intermedio resultante fue denominado pVCPdhintSP. Se digirió el plásmido pVCPdhintSP con SacI (cortando 15 pb antes del extremo 3' del promotor del CMV) y BspEI en la unión de las secuencias del Sindbis y VEE de nsP1. Se desfosforiló el fragmento del vector de este digesto y se ligó con producto de la PCR de 326 pb de pVCR-DH proporcionando el terminal 5' que faltaba de nsP1 de la TRD del VEE. Se yuxtapuso el cebador 5' [AAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTATGGGCGGCGCATG] (SEC ID N.º 1] con 15 nucleótidos del terminal 3' del promotor del CMV (hasta el sitio de inicio de la transcripción) hasta la base inicial de la secuencia UTR 5' del VEE. El cebador 3' tenía la secuencia enumerada [gccctgcgtccagctcatctcgaTCTGTCCGGATCTTCCGC]. (SEC ID N.º 2). Este plásmido intermedio se denominó pVCPdhintf. Para completar el constructo, se digirió pVCPdhintf con NotI y HpaI, y se desfosforiló el fragmento vectorial y se ligó con el fragmento HpaI-NotI de pVCR proporcionando las secuencias no estructurales del VEE nucleares que faltaban del pVCPdhintf intermedio. El constructo de ELVIS basado en el VEE final fue denominado pVCP.

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Ejemplo 2 Construcción de constructos auxiliares defectuosos de alfavirus

Antes de la construcción de los auxiliares defectuosos (DH) de la presente invención para su uso en la generación de elementos de proteínas estructurales híbridas y partículas de alfavirus quiméricos, primero se modificaron los casetes de empaquetamiento auxiliares defectuosos basados en SIN ya existentes (Polo et al., 1999, ibid; Gardner et al., 2000 ibid). Para generar estos nuevos casetes de SIN, se digirió el plásmido SINBV-neo (Perri et al., J Virol. 74: 9802-9807, 2000) con ApaI, se trató con ADN polimerasa de T4 para volver romos los extremos generados por ApaI, y luego se digirió con BglII y BamHI. Se purificó sobre gel el fragmento de 4,5 kb que contenía la estructura del plásmido, el promotor subgenómico del SIN, el extremo 3' del SIN, el tracto poli(A) sintético y la ribozima antigenómica del HDV con un equipo de extracción sobre gel QIAquick, y se ligó a un fragmento de 714 pb que contenía un promotor SP6 y un extremo 5' del ARNt del SIN obtenido del plásmido 47tRNA BBCrrvdel 13 (Frolov et al., J. Virol., 71: 2819-2829, 1997), que había sido digerido previamente con SacI, tratado con ADN polimerasa de T4, digerido con BamHI y purificado sobre gel. Se verificaron mediante análisis de restricción los clones positivos. Este constructo se usó como la base para la inserción por los sitios XhoI-NotI (elimina el inserto Neo existente) de las secuencias de las glucoproteínas y la cápside de alfavirus descritas a continuación. La estructura del casete auxiliar defectuoso del SIN descrita en la presente memoria se denomina tDH.

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Construcción de VCR-DH

Se clonó una región poliligadora en la estructura del vector de SINCR-GFP (Gardner et al., 2000, ibid) como una primera etapa. El poliligador contenía los siguientes sitios de restricción de 5' a 3': ApaI-MluI-HpaI-BglII-Bsu36I-PstI-BsaBI-AvrII-SwaI-AspI-BbvCI-AscI-NotI-PmeI. Para generar el poliligador, se usaron los siguientes oligonucleótidos:

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Los oligonucleótidos PL1F y PL1R, y los oligonucleótidos PL2F y PL2R se mezclaron en dos reacciones separadas, se fosforilaron, se desnaturalizaron y se aparearon lentamente. Entonces se mezclaron las dos reacciones y se ligaron al fragmento de 2,8 kb generado a partir del plásmido SINCR-GFP, que había sido previamente digerido con ApaI y PmeI, y se purificaron sobre gel usando un equipo de extracción sobre gel QIAquick. Se rastrearon los clones en cuanto a la orientación correcta usando los digestos de restricción AlwNI y NotI. Los clones positivos se verificaron mediante un digesto de restricción con cada una de las enzimas presentes en el poliligador. Este constructo fue nombrado estructura de VCR. A continuación, se insertaron el extremo 3' del VEE junto con un tracto de poliadenilación y la ribozima del HDV en la estructura del VCR. Este fragmento se generó usando los siguientes oligonucleótidos sintéticos solapantes.

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Se mezclaron, se fosforilaron, se desnaturalizaron y se aparearon lentamente todas las parejas de oligonucleótidos directos e inversos (p. ej., VEE1F con VEE1R, VEE2F con VEE2R, etc.). Luego se mezclaron las 4 parejas de oligonucleótidos apareados, se ligaron entre sí, se digirieron con las enzimas NotI y PmeI, se purificaron sobre gel usando un equipo de extracción sobre gel QIAquick, y se ligaron a la estructura de VCR que había sido digerida previamente con las mismas enzimas, purificada sobre gel y tratada con fosfatasa alcalina de langostino. Se verificaron los clones positivos para el fragmento mediante secuenciación. Este constructo se denominó VCR-3'drib.

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A continuación, se insertó el extremo 5' del genoma del VEE. Este fragmento se generó usando oligonucleótidos solapantes para cubrir la región del genoma de la cepa del Mono Trinidad del VEE (véase la referencia al GenBank anterior) desde el nucleótido 1 al sitio de restricción HpaI. Los cebadores con el nucleótido 1 del VEE también contenían un sitio MluI secuencia arriba seguido por el promotor SP6 inmediatamente 5' del nucleótido 1 del VEE. Se mezclaron todos los oligonucleótidos en una reacción, se fosforilaron, se desnaturalizaron, se aparearon lentamente y se ligaron. Tras desactivar la ligasa, se digirió el ADN con las enzimas MluI y HpaI, se purificó sobre gel usando el equipo de extracción sobre gel QIAquick y se ligó a VCR-3'drib que había sido digerido previamente con las mismas enzimas de restricción, purificado sobre gel y tratado con fosfatasa alcalina de langostino. Se verificaron los clones positivos para el inserto mediante secuenciación. Este constructo intermedio fue denominado VCR-F1-3'drib.

Finalmente, se clonó la región del VEE que contenía el promotor subgenómico en VCR-F1-3'drib. Esta región (fragmento 13, Figura 1) corresponde a la secuencia entre el sitio de restricción SwaI y el nucleótido 7.561 del genoma de la cepa del Mono Trinidad del VEE. El fragmento se generó usando oligonucleótidos solapantes correspondientes a la secuencia de la cepa del Mono de Trinidad, a excepción del oligonucleótido correspondiente al extremo 3' del fragmento que se modificó para que portara sitios de restricción adicionales (BbvCI) para permitir la inserción posterior de secuencias heterólogas bajo el control del promotor subgenómico. Se mezclaron todos los oligonucleótidos en una reacción, se fosforilaron, se desnaturalizaron, se aparearon lentamente y se ligaron. Tras desactivar la ligasa, se digirió el ADN con las enzimas SwaI y BbvCI, se purificó sobre gel usando el equipo de extracción sobre gel QIAquick y se ligó a la estructura de VCR que había sido digerida previamente con las mismas enzimas de restricción, purificada sobre gel y tratada con fosfatasa alcalina de langostino. Los clones positivos para el inserto se verificaron mediante secuenciación y, posteriormente, se reparó un clon, el VF13-14, eliminando una pequeña inserción y reconfirmando mediante secuenciación. A continuación, se digirió el clon con SwaI-NotI, se purificó sobre gel el fragmento de 600 pb usando el equipo de extracción sobre gel QIAquick y se ligó a VCR-F1-3'drib que había sido digerido previamente con las mismas enzimas de restricción, purificado sobre gel y tratado con fosfatasa alcalina de langostino. Se verificaron los clones positivos para el inserto y el constructo se denominó VCR-VH.

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Construcción de tDH-Vgly, tDH-VE2-120 y tDH-V_{NTR}-glydl160

Los genes de las glucoproteínas de la cepa del Mono Trinidad del VEE se generaron usando oligonucleótidos solapantes que se diseñaron en base a la secuencia publicada del GenBank. Para permitir la expresión desde los casetes de empaquetamiento de vectores apropiados, se añadió un codón ATG en marco con el marco de lectura abierto de los genes de glucoproteínas inmediatamente antes del primer aminoácido de E3, y se añadieron un sitio XhoI y un sitio NotI, respectivamente, en el extremo 5' y 3' de las secuencias de los genes de glucoproteínas. La síntesis de los genes se realizó usando una PCR de solapamiento para generar cinco fragmentos separados que abarcaban toda la secuencia glucoproteica (Figura 3). Se ensamblaron los fragmentos por etapas en un solo fragmento en pGEM usando los sitios de restricción indicados en la Figura 3. Se corrigió una pequeña eliminación de nucleótidos en los sitios KasI mediante mutagénesis dirigida a un sitio específico estándar. Se verificó el clon final mediante secuenciación y se denominó pGEM-Vgly. Entonces se transfirió la secuencia de genes de glucoproteínas de pGEM a tDH usando los sitios XhoI-NotI, y el clon final se denominó tDH-Vgly.

Se construyó de un modo análogo un constructo similar a tDH-Vgly que también contiene la mutación atenuante en el aminoácido 120 de E2 presente en la cepa de la vacuna TC83 del VEE. Se sometió el plásmido pGEM-Vgly a mutagénesis dirigida a un sitio específico estándar y se confirmó la mutación E2-120 mediante secuenciación. Entonces se transfirió la secuencia de glucoproteínas E2-120 del VEE de pGEM a tDH usando los sitios XhoI-NotI, y se confirmó el constructo mediante secuenciación y se designó tDH-VE2-120.

El plásmido tDH-V_{NTR}-glydl160 es un constructo auxiliar defectuoso de tDH (véase lo anterior) que contiene una secuencia de glucoproteínas del SIN de la cepa trópica de células dendríticas humanas descrita anteriormente (Gardner et al., ibid), en la que la NTR 5' subgenómica derivada del SIN y el sitio XhoI sintético se sustituyeron por la siguiente secuencia de la NTR 5' subgenómica del VEE (5'-ACTACGACATAGTCTAGTCCGCCAAG) (SEC ID N.º 53). Se insertó esta secuencia de modo que precediera inmediatamente el codón de iniciación ATC glucoproteico. El constructo también se conoce como tDH-V_{UTR}-glydl160 para reflejar la nomenclatura intercambiable de la región no traducida (NTR) 5' subgenómica, también denominada región sin traducir (UTR).

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Construcción de VCR-DH-Vgly, VCR-DH-VE2-120 y VCR-DH-Sglydl160

Se amplificó la secuencia de los genes de glucoproteínas del VEE entre el ATG y el sitio de restricción NcoI mediante PCR usando los siguientes oligonucleótidos.

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Tras la amplificación por PCR, se digirió el fragmento con BbvCI y NcoI, y se purificó sobre gel usando el equipo de extracción sobre gel QIAquick. Por separado, se preparó la región de glucoproteínas E2-120 del VEE de NcoI a NotI digiriendo pGEM-VE2-120 con estas enzimas, tras lo que se realizó una purificación sobre gel. Se mezclaron dos fragmentos y se ligaron a VCR-DH, que había sido digerido anteriormente con BbvCI y NotI, purificado sobre gel y tratado con fosfatasa alcalina. Se verificaron los clones positivos para el inserto mediante secuenciación y se denominaron VCR-DH-VE2-120. Para obtener VCR-DH-Vgly, se obtuvo el fragmento NcoI-XbaI de pGEM-Vgly y se usó para sustituir el mismo fragmento en VCR-DH-VE2-120.

Se obtuvo una glucoproteína del SIN con el fenotipo DC+ humano de un plásmido auxiliar defectuoso, el
E3ndl160/dlRRV, modificado de Gardner et al., (2000, ibid) (PCT WO 01/81609). Se digirió el plásmido E3ndl160/
dlRRV con XhoI, se trató con fragmento de Klenow para volver los extremos romos y luego se digirió con NotI. Se purificó sobre gel el fragmento de 3 kb usando el equipo de extracción sobre gel QIAquick y se ligó a VCR-DH, que había sido digerido previamente con BbvCI, tratado con fragmento de Klenow, digerido con NotI y tratado con fosfatasa alcalina. Un clon positivo para el inserto fue denominado VCR-DH Sglydl160. De manera similar, se construyó un constructo auxiliar defectuoso que contenía glucoproteínas de la envoltura derivadas de la cepa LP del SIN (Gardner et al, 2000, ibid).

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Construcción de VCR-DH-Vcap, VCR-DH-Scap y tDH-Vcap

Se sintetizó el gen de la cápside del VEE usando oligonucleótidos solapantes, también designados en base a la secuencia publicada del GenBank de la cepa del Mono Trinidad del VEE, con la adición de un sitio XhoI y una secuencia consenso de Kozak adyacente al ATG de la cápside y un sitio NotI en el extremo 3'. Se mezclaron los oligonucleótidos y se usaron para una reacción de amplificación por PCR de 25 ciclos. Se digirió el fragmento generado por PCR con los sitios de restricción XhoI y NotI, se purificó sobre gel y se clonó en el vector PBS-SK+. Se verificaron los clones positivos para el inserto mediante secuenciación. Finalmente, se modificó aún más la secuencia de la cápside para insertar un codón de terminación en su extremo 3' mediante amplificación por PCR en una reacción de 25 ciclos con los siguientes oligonucleótidos.

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Se purificó el producto con un equipo de purificación por PCR QIAquick, se digirió con XhoI y NotI, y se ligó a la estructura del vector tDH que había sido preparado previamente mediante la digestión con XhoI y NotI, purificación sobre gel y tratamiento con fosfatasa alcalina. Se verificaron los clones positivos para el inserto mediante secuenciación, y el constructo se denominó tDH-Vcap.

También se digirió el mismo producto de la PCR con XhoI, se trató con ADN polimerasa de T4 para volver romo el sitio XhoI, se digirió con NotI, se purificó sobre gel y se ligó a VCR-DH, que había sido digerido previamente con BbvCI, tratado con ADN polimerasa de T4 para volver romo el sitio BbvCI, digerido con NotI, purificado sobre gel y tratado con fosfatasa alcalina. Se verificaron los clones positivos para el inserto mediante secuenciación y el constructo se denominó VCR-DH-Vcap.

Se obtuvo la secuencia de la cápside del SIN a partir de un auxiliar defectuoso descrito anteriormente y se purificó sobre gel el fragmento de 800 pb usando el equipo de extracción sobre gel QIAquick, y se ligó a VCR-DH, que había sido digerido previamente con BbvCI, tratado con fragmento de Klenow, digerido con NotI y tratado con fosfatasa alcalina. Un clon positivo para el inserto fue denominado VCR-DH-Scap.

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Ejemplo 3 Generación de las quimeras de partículas de replicones de alfavirus con proteína de la cápside híbrida

En el caso de la proteína de la cápside híbrida que usa elementos obtenidos tanto de SIN como de VEE, se construyó una serie de proteínas de la cápside híbridas que contenían la parte amino-terminal (de unión a ARN) de SIN y la parte carboxi-terminal (de interacción con glucoproteínas) de VEE. También se obtuvieron constructos adicionales con las partes opuestas. El sitio al que se fusionaron tales partes varió en el constructo, siendo esto necesariamente un factor responsable de las diferencias en la longitud global de estas dos proteínas de la cápside, siendo la cápside del SIN de 264 aminoácidos y la cápside del VEE de 275 aminoácidos. En la siguiente tabla, así como en la Figura 4, se indican los sitios de fusión para generar las cápsides híbridas.

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Todos los constructos de las cápsides híbridas se generaron mediante amplificación por PCR de dos fragmentos solapantes, uno codificante del terminal amino de la proteína de la cápside del SIN o del VEE, y el otro codificante del terminal carboxilo de la proteína de la cápside del virus opuesto (VEE o SIN, respectivamente).

Los fragmentos que contienen las secuencias de la cápside del SIN se amplificaron desde un constructo auxiliar defectuoso (Gardner et al., 200 ibid) y los fragmentos que contenían las secuencias de la cápside del VEE se amplificaron desde el constructo VCR-DH-Vcap (anterior). Se usaron los siguientes oligonucleótidos:

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(Continuación)

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(Continuación)

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Los oligonucleótidos enumerados anteriormente se usaron a una concentración 2 \muM con 0,1 \mug de molde de ADN de plásmido apropiado en una reacción PCR de 30 ciclos con la polimerasa de Pfu, según lo sugerido por el proveedor, y con la adición de DMSO al 10%. A continuación, se ilustra el protocolo de amplificación general.

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Se purificaron los fragmentos amplificados del gel de agarosa usando un equipo de extracción sobre gel QIAquick, y luego se usó una alícuota (1/15) de cada fragmento como molde para una segunda amplificación por PCR. Se mezclaron los dos fragmentos como figura a continuación, y se amplificaron con polimerasa de Vent según lo sugerido por el proveedor, con la adición de DMSO al 10%:

: SIN(1-129) + VEE(141-275)

: SIN(1-127) + VEE(139-275)

: SIN(1-116) + VEE(128-275)

: SIN(1-113) + VEE(125-275)

: SIN(1-109) + VEE(121-275)

: VEE(1-141) + SIN(130-264)

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Se realizó un ciclo de amplificación por PCR en las siguientes condiciones:

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Para las fusiones del terminal NH2 del SIN/terminal COOH del VEE, se añadieron los cebadores SINNtF y TRDCtR, que contenían los sitios de restricción de XhoI y NotI, a una concentración 2 \muM, y se realizó la amplificación por PCR completa como figura a continuación:

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Se purificó el producto de la PCR usando un equipo QIAquick, se digirió con XhoI y NotI, se purificó sobre gel de agarosa, según lo descrito anteriormente, y se ligó al plásmido tDH, que también había sido digerido con XhoI y NotI para eliminar el inserto de genes de la cápside existente. Se verificaron mediante secuenciación los clones que contenían los insertos híbridos recién generados, siendo los nuevos constructos auxiliares defectuosos para su uso en la producción de partículas quiméricas denominados tDHS129Vcap, tDHS127Vcap, tDHS116Vcap, tDHS113Vcap y tDHS109Vcap.

De manera similar, para las fusiones del terminal NH2 del VEE/terminal COOH del SIN, se añadieron los cebadores TRDNtF y SINCtR, que contenían los sitios de restricción de XhoI y NotI, a una concentración 2 \muM. Se realizó la amplificación por PCR usando las mismas condiciones de antes. Entonces se digirió este fragmento PCR con XhoI, se volvieron romos sus extremos, se digirió con NotI y se ligó al plásmido VCR-DH-Vcap, que había sido digerido con BbvCI, vuelto romo y digerido con NotI. Se verificaron mediante secuenciación los clones que contenían los insertos, siendo el nuevo constructo auxiliar defectuoso denominado VCR-DH-S129Vcap.

Entonces se analizaron las cápsides quiméricas en cuanto a sus eficacias para el empaquetamiento de replicones con el vector replicón de alfavirus apropiado y el auxiliar defectuoso de glucoproteínas. Específicamente, se analizaron las quimeras con el terminal NH2 derivado del SIN y el terminal COOH derivado del VEE en cuanto a su capacidad para empaquetar replicones del SIN con glucoproteínas del VEE. Esto se realizó como se explica a continuación. Se linealizaron los ADN de plásmido que codificaban las quimeras (tDHS129Vcap, tDHS127Vcap, tDHS116Vcap, tDHS113Vcap y tDHS109Vcap) con el sitio de restricción único PmeI y se usaron para la transcripción in vitro según lo descrito anteriormente (Polo et al., 1999, ibid). Se co-transfectó cada transcripto por electroporación en células BHK junto con ARN auxiliar que expresaba las glucoproteínas del VEE y ARN replicón del SIN que expresaba la GFP, según lo descrito anteriormente (Polo et al., 1999, ibid). Se incubaron las células transfectadas a 34ºC durante 24 h, tras lo que se recogieron los sobrenadantes de los cultivos, se aclararon mediante centrifugación, se diluyeron en serie y se usaron para infectar células BHK-21 naïve durante aproximadamente 14 h. La enumeración de las células positivas en GFP permitió la cuantificación de partículas de vectores de entrada y el cultivo patrón de partículas de vectores. Los datos que figuran a continuación indican que la eficacia del empaquetamiento para una partícula quimérica de SIN/VEE se puede aumentar de manera bastante espectacular, particularmente, con la proteína de la cápside híbrida S113V.

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De manera similar, se co-transfectó cada transcripto quimérico por electroporación en células BHK junto con 1) ARN auxiliar que expresaba las glucoproteínas del VEE con la mutación atenuante de E2-120 tDHVE2-120 y 2) ARN replicón del SIN que expresaba la GFP. Se incubaron las células transfectadas a 34ºC durante 24 h, tras lo que se recogieron los sobrenadantes de los cultivos, se aclararon mediante centrifugación, se diluyeron en serie y se usaron para infectar células BHK-21 naïve durante aproximadamente 14 h. La enumeración de las células positivas en GFP permitió la cuantificación de partículas de vectores de entrada y la determinación del título para el cultivo patrón de vectores replicones. Los siguientes datos confirman que la cápside híbrida puede aumentar de manera espectacular la eficacia de empaquetamiento del replicón del SIN en partículas que contienen las glucoproteínas del VEE.

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Los experimentos similares con el ARN de VCR-GFP, cotransfectado con ARN auxiliares que codifican la cápside híbrida S129Vcap y las glucoproteínas del SIN, produjeron partículas con títulos medios de 1,6 x 10^{7} UI/ml, lo que demostró la capacidad de esta proteína híbrida para empaquetar eficazmente ARN de vector derivado del VEE.

Para maximizar aún más las interacciones entre cápside-ARN y cápside-glucoproteínas, se creó otro constructo, mediante el que se incorporó el gen de la proteína de la cápside híbrida S113V en el genoma de un alfavirus quimérico que comprendía el extremo 5', el extremo 3', el promotor subgenómico y los genes de proteínas no estructurales del SIN, y los genes de las glucoproteínas del VEE.

Para generar tal constructo, se generó un clon de ADNc del SIN de la longitud del genoma inicial del que se puede transcribir ARN infeccioso in vitro mediante el ensamblaje de secuencias de replicones y genes estructurales de la variante del SIN trópica de células dendríticas humanas descrita anteriormente, SINDCchiron (N.º ATCC VR-2643, depositada el 13 de abril de 1999). Se ensamblaron los clones de ADN usados que englobaban todo el genoma del virus SINDCchiron (Gardner et al., ibid; WO 00/61772) usando técnicas de Biología Molecular estándar y procedimientos ampliamente conocidos por los expertos en la materia (Rice et al., J. Virol., 61: 3809-3819,1987; y la patente estadounidense n.º 6015694). El clon del SIN genómico se denominó SINDCSP6gen.

Posteriormente, se sustituyeron las proteínas estructurales del SIN existentes con la cápside híbrida S129Vcapsid y las glucoproteínas del VEE de la siguiente manera. Se generó un fragmento de tDH-S129V que contenía parte de la cápside híbrida mediante amplificación por PCR con los siguientes oligonucleótidos:

S/VcVglR
atatatatggtcactagtgaccattgctcgcagttctccg	(SEC ID N.º 54)

ScAatIIF
gccgacagatcgttcgacgtc	(SEC ID N.º 55)

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Los oligonucleótidos se usaron a una concentración 2 \muM con 0,1 \mug de molde de ADN de plásmido apropiado en una reacción PCR de 30 ciclos con la polimerasa de Pfu según lo sugerido por el proveedor y con la adición de DMSO al 10%. A continuación, se ilustra el protocolo de amplificación general.

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Se purificó sobre gel el fragmento PCR usando el equipo de extracción sobre gel QIAquick. Se obtuvo otro fragmento que contenía el fragmento de glucoproteínas del VEE de tDHVE2-120 mediante la digestión con SpeI y PmeI, y la purificación sobre gel. Se mezclaron los dos fragmentos y se ligaron a un fragmento de 11 kb obtenido del clon SINDCSP6gen mediante la digestión con SpeI y PmeI, la purificación sobre gel y el tratamiento con fosfatasa alcalina de langostino. Se verificaron los clones positivos para los insertos mediante secuenciación, siendo este producto intermedio denominado SrS129VcVg-interm. Para restaurar el extremo 3' auténtico en el clon genómico, se regeneró el fragmento PsiI-PsiI mediante PCR con los siguientes oligonucleótidos.

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PsiIFdlN
5'ATATATATTTATAATTGGCTTGGTGCTGGCTACTATTGTGGCCATGTACGTG
CTGACCAACCAGAAACATAATTGACCGCTACGCCCCAATGATCC-3'	(SEC ID N.º 53)

PsiR
5'-GGCCGAAATCGGCAAAATCCC-3'	(SEC ID N.º 54)

a una concentración 2 \muM con 0,1 \mug de ADN de plásmido de clon infeccioso en una reacción PCR de 30 ciclos con la polimerasa de Vent según lo sugerido por el proveedor y con la adición de DMSO al 10%. A continuación, se ilustra el protocolo de amplificación general.

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Se digirió el fragmento con PsiI, se purificó sobre gel y se ligó a SrS129VcVg-interm que también había sido digerido con PslI, purificado sobre gel y tratado con fosfatasa alcalina de langostino. Se verificaron los clones positivos para el inserto mediante secuenciación y el constructo final se denominó SrS129VcVg.

Para construir un clon de ADNc de longitud completa similar que contuviera la cápside híbrida S113V, se generó un fragmento que contenía parte de las secuencias del SIN secuencia arriba del gen de la cápside y el gen de la cápside codificante de los aa 1-113 usando los siguientes oligonucleótidos

Sic7082F
5'-CACAGTTTTGAATGTTCGTTATCGC-3'	(SEC ID N.º 55)
S113R (véase el anterior)

a una concentración 2 \muM con 0,1 \mug del constructo SINDCSP6gen en una reacción PCR de 30 ciclos con la polimerasa de Pfu, según lo sugerido por el proveedor, y con la adición de DMSO al 10%. A continuación, se ilustra el protocolo de amplificación general.

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Se purificó sobre gel el fragmento usando el equipo de extracción sobre gel QIAquick y se mezcló 1/10 de la reacción con el fragmento VEE(141-275) (véase la construcción de los genes de todas las cápsides híbridas anterior). Se realizó un ciclo de amplificación por PCR en las siguientes condiciones:

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Entonces, se añadieron los oligonucleótidos Sic7082F y TRDCtR a una concentración 2 \muM, y se realizó la amplificación por PCR completa como se explica a continuación:

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Se purificó el producto de la PCR usando el equipo QIAquick, se digirió con BstZ17l y SapI, se purificó sobre gel de agarosa, según lo descrito anteriormente, y se ligó a dos fragmentos generados a partir del plásmido SrS 129VcVg, que también había sido digerido con BstZ17l y SapI para eliminar el inserto del gen de la cápside existente. Se verificaron mediante secuenciación los clones que contenían los insertos híbridos recién generados, siendo el nuevo constructo denominado SIN113CVgly.

Para generar el virus, se linealizó el constructo SIN113CVgly con PmeI, se transcribió in vitro usando polimerasa de SP6 y el ARN transfectado en células BHK. Se recogió la progenie del virus y se pasó a las células, de manera que el título infeccioso aumentó hasta niveles que se aproximaron a 10^{9} UFP/ml. Entonces se usó un cultivo patrón purificado sin placa de este virus SIN quimérico, denominado virus SIN113CVgly (depositado en la ATCC al 31 de mayo de 2001, PTA-3417) como la fuente de ARN para la clonación y la secuenciación mediante técnicas estándar de Biología Molecular (p. ej., aquellas descritas anteriormente) para identificar más determinantes genéticos que proporcionaran este alto nivel de empaquetamiento de las partículas quiméricas. Los determinantes genéticos individuales se vuelven a incorporar fácilmente en los constructos de replicón y de empaquetamiento auxiliar defectuoso de la presente invención usando las enseñanzas proporcionadas en la presente memoria.

Se entiende que un cultivo patrón purificado sin placa del virus SIN quimérico depositado con un número de ATCC puede contener numerosos genotipos y fenotipos no revelados específicamente en la presente memoria que se consideran parte de la presente invención. Los expertos habituales en la técnica podrían aislar fácilmente fenotipos y/o genotipos individuales usando técnicas de purificación de placas y secuenciar el SIN quimérico aislado usando procedimientos conocidos por los expertos habituales en la técnica y revelados en la presente memoria.

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Ejemplo 4 Generación de las quimeras de partículas de replicones de alfavirus con glucoproteínas híbridas

En el caso de una glucoproteína de la envoltura híbrida que usa elementos obtenidos tanto de SIN como de VEE, se construyeron glucoproteínas E2 híbridas que contenían la cola citoplasmática (p. ej., parte de unión a la cápside) del SIN, y las partes de la transmembrana y el ectodominio del VEE. También se pueden obtener constructos adicionales con las partes opuestas. En algunas realizaciones, también puede ser deseable incluir híbridos para las glucoproteínas tanto E2 como E1, e incluir híbridos que engloben el dominio transmembrana.

Para demostrar una mayor eficacia del empaquetamiento de las partículas quiméricas usando tales híbridos de glucoproteína, se construyó una glucoproteína derivada del VEE modificada, en la que la cola de E2 estaba sustituida por la cola citoplasmática de E2 derivada del SIN. La fusión se hizo en el residuo de cisteína conservado (el residuo de aminoácido 390, E2 tanto del VEE como del SIN) que está en el límite entre el dominio transmembrana y la cola citoplasmática (Figura 5). El constructo quimérico se generó mediante la amplificación por PCR de dos fragmentos solapantes, uno de los cuales incluían parte de la secuencia de la glucoproteína E2 del VEE secuencia arriba de la cola citoplasmática y parte de la cola citoplasmática de E2 del SIN. El segundo fragmento incluía parte de la cola citoplasmática de E2 del SIN y la proteína 6K del VEE.

El primer fragmento se amplificó del constructo VCR-DH-Vgly usando los siguientes oligonucleótidos:

VE2F:

5'-atatatcaggggactccatcaccatgg-3'

(SEC ID N.º 35)

(los nt. 7-27 son complementarios a la glucoproteína del VEE e incluyen el sitio de NcoI)

\newpage

VSGE2R:

5'-gggattacggcgtttggggccagggcgtatggcgtcaggcactcacggcgcgctttgcaaaacagccaggtagacgc-3'

\hskip0.9cm

(SEC ID N.º 36)

\vskip1.000000\baselineskip

\quad: (los nt. 1-56 son la secuencia de la cola citoplasmática de E2 del SIN y los nt. 57-77 son complementarios a la secuencia de glucoproteína del VEE)

\vskip1.000000\baselineskip

El segundo fragmento se amplificó a partir del mismo plásmido usando los siguientes cebadores:

VSGE3F:

5'gccccaaacgccgtaatcccaacttcgctggcactcttgtgctgcgttaggtcggccaatgctgagaccacctggg agtcctt g-3'

\hskip0.2cm

(SEC ID N.º 37)

\vskip1.000000\baselineskip

\quad: (los nt. 1-63 corresponden a parte de la secuencia de la cola citoplasmática de E2 del SIN y los nt. 64-84 son complementarios a las glucoproteínas del VEE)

\vskip1.000000\baselineskip

VEE3'-1R:

5'-ccaatcgccgcgagttctatgtaagcagcttgccaattgctgctgtatgc-3'

\hskip5.5cm

(SEC ID N.º 38)

(complementaria a VCR-DH-Vgly secuencia abajo del marco de lectura abierto glucoproteico).

\vskip1.000000\baselineskip

Los oligonucleótidos enumerados anteriormente se usaron a una concentración 2 \muM con 0,1 \mug de molde de ADN de plásmido VCR-DH-Vgly en una reacción PCR de 30 ciclos con la polimerasa de Pfu, según lo sugerido por el proveedor, con la adición de DMSO al 10%. A continuación, se muestra el protocolo de amplificación.

\vskip1.000000\baselineskip

21

\vskip1.000000\baselineskip

Se purificaron los dos fragmentos amplificados del gel de agarosa usando un equipo de extracción sobre gel QIAquick, y luego se usó una alícuota (1/10) de cada fragmento como moldes para una segunda amplificación por PCR. Se mezclaron los dos fragmentos con polimerasa de Pfu, según lo sugerido por el proveedor, con la adición de DMSO al 10%. Se realizó un ciclo de amplificación por PCR:

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22

\newpage

Entonces, se añadieron los cebadores VE2NtF y VEE3'-1R a una concentración 2 \muM, y se realizó la amplificación por PCR completa como se explica a continuación:

23

Se purificó el producto de la PCR usando un equipo QIAquick, se digirió con NcoI y NotI, se purificó sobre gel de agarosa, según lo descrito anteriormente, y se ligó al plásmido tDH-Vgly, que también había sido digerido con NcoI y NotI, y purificado sobre gel de agarosa. Se verificaron mediante secuenciación los clones que contenían los insertos, siendo el constructo denominado Tdh-VglySE2tail.

Para demostrar el mayor empaquetamiento de las partículas generadas con tal quimera glucoproteica, se linealizó ADN del plásmido tDH-VglySE2tail con una sola enzima de restricción PmeI y ARN transcrito in vitro. Se cotransfectó el ARN junto con el ARN replicón de SINCR-GFP y el ARN auxiliar defectuoso codificante de la proteína de la cápside del SIN. Se incubaron las células transfectadas a 34ºC durante 24 h, tras lo que se recogió el sobrenadante del cultivo, se aclaró mediante centrifugación, se diluyó en serie y se usó para infectar células BHK-21 naïve durante aproximadamente 14 h. Usando el análisis de la citometría de flujo, se determinaron los títulos de las partículas, y se muestran como 2 x 10^{3} UI/ml. Este resultado demostró que tiene lugar cierta interacción de baja eficacia entre la quimera glucoproteica y la cápside del SIN.

Para aumentar aún más la eficacia del empaquetamiento de las partículas quiméricas con una glucoproteína híbrida, se generaron más constructos. El alineamiento de las colas citoplasmáticas del VEE y del SIN (Figura 5) muestra las diferencias en 10 residuos, cuatro de los cuales son cambios conservadores. Lo interesante es que los residuos de las posiciones 394 y 395 están cargados en la glucoproteína del SIN, mientras que son hidrófobos en el VEE. Tal diferencia podría afectar a la funcionalidad de E2. Se usó una mutagénesis dirigida a un sitio específico usando un procedimiento de amplificación por PCR para cambiar los dos residuos del constructo tDH-VglySE2tail como figura a continuación:

24

25

Los constructos mutagenizados se verificaron mediante secuenciación. Para cuantificar el empaquetamiento realizado por estos nuevos híbridos de glucoproteína, se linealizaron los ADN plasmídicos con una sola enzima de restricción PmeI y se transcribieron in vitro. Entonces se cotransfectó cada ARN mutante junto con el ARN replicón de SINCR-GFP y el ARN auxiliar defectuoso codificante de la cápside del SIN. Se incubaron las células transfectadas a 34ºC durante 24 h, tras lo que se recogió el sobrenadante del cultivo, se aclaró mediante centrifugación, se diluyó en serie y se usó para infectar células BHK-21 naïve durante aproximadamente 14 h para analizar su título. Usando un análisis de citometría de flujo, se determinaron los títulos de las partículas, y se observó que la eficacia de empaquetamiento había aumentado aproximadamente 7 veces con M1.

Alternativamente, y de manera similar al enfoque de la cápside, fue posible sustituir la quimera de la cola del SIN VEEglyco-E2 en un clon de ADNc de alfavirus de longitud completa del que se puede obtener virus infeccioso y usar el genoma del virus quimérico para seleccionar las variantes de partículas quiméricas surgidas de manera natural con una mayor eficacia de empaquetamiento. Un fenotipo de placa de gran tamaño puede indicar un virus de título elevado. Esta quimera infecciosa se construyó como se explica a continuación. Se generó un fragmento que contenía en su mayor parte la secuencia de la cápside del SIN mediante PCR para tener unos cuantos nucleótidos añadidos a su extremo 3' correspondientes a la secuencia glucoproteica del VEE y que contenía el sitio de restricción de SpeI. Se amplificó este fragmento desde un constructo de clon infeccioso del SIN trópico de CD humanas (Gardner et al., ibid) con los siguientes cebadores:

ScAatIIF:	5'-gccgacagatcgttcgacgtc-3'	(SEC ID N.º 45)

ScVglR:	5'-atatatatggtcactagtgaccactcttctgtcccttccg-3'	(SEC ID N.º 46)

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Se usaron estos oligonucleótidos a una concentración 2 \muM con 0,1 \mug de molde de ADN de plásmido en una reacción PCR de 30 ciclos con polimerasa de Pfu, según lo sugerido por el proveedor con la adición de DMSO al 10%. A continuación, se muestra el protocolo de la amplificación.

26

Se limpió el fragmento amplificado (450 pb) usando un equipo de purificación por PCR QIAquick, se digirió con AatII y SpeI, se purificó usando el equipo de extracción sobre gel QIAquick. Se generó un fragmento (3,4 kb) que contenía la glucoproteína del VEE-cola de E2 del SIN y la UTR 3' del SIN mediante digestión por restricción desde tDH-VE2Stail usando las enzimas SpeI-PmeI y la purificación sobre gel con el equipo de extracción sobre gel QIAquick. Se mezclaron este fragmento y el fragmento de la PCR, y se ligaron juntos al ADN plasmídico del clon infeccioso que había sido digerido con AatII y PmeI, tratado con fosfatasa alcalina de langostino y purificado sobre gel. Los clones positivos para el inserto se verificaron por secuenciación. Finalmente, para recuperar el extremo 3' del clon de longitud completa auténtico, se regeneró el fragmento PslI-PslI según lo descrito para SrS129VcVg, siendo el nuevo constructo denominado SrcVgSE2t.

Se linealizó SrcVgSE2t con una sola enzima de restricción PmeI y se transcribió in vitro. Se transfectó el ARN a células BHK. Se incubaron las células transfectadas a 37ºC durante 24 h, tras lo que se recogió el sobrenadante del cultivo, se aclaró por centrifugación y se usó para infectar células BHK-21 naïve. Aproximadamente 24 h después de la infección, se recogió el sobrenadante, se aclaró mediante centrifugación y se usó para volver a infectar células BHK-21 naïve. A las 24 h de la infección, se observaron una cuantas placas virales, entonces se recogió el sobrenadante, se aclaró y se usó para infectar dos matraces de BHK naïve. Se recogieron las células de un matraz a las 16 h de la infección y se extrajo el ARN total usando Trizol (Gibco-BRL). Se dejó que continuara la infección en el otro matraz durante otras 8 horas y se observaron importantes efectos citopáticos en las células, lo que indicó la producción de grandes cantidades de virus.

El ARN total extraído de las células infectadas se usó para amplificar y clonar secuencias de la cápside y de glucoproteínas usando RT-PCR. La transcripción inversa fue cebada bien con poli(dT) o con el cebador específico

VglyR:

5'-atatatatgcggccgctcaattatgtttctggttggtcag-3'

(SEC ID N.º 47).

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Entonces se usó el ADNc para la amplificación por PCR de la secuencia de la cápside con los cebadores SINNtF, que contenía un sitio XhoI, y SINCtR, que contenía un sitio NotI, y de la secuencia de glucoproteínas con los cebadores VglyR, que contenía un sitio NotI, y

VglyF:

5'-atatatctcgagccgccagccatgtcactagtgaccac-3'

(SEC ID N.º 48)

que contenía un sitio XhoI. Se limpiaron ambos fragmentos usando un equipo de purificación por PCR QIAquick, se digirieron con XhoI y NotI, se purificaron sobre gel usando el equipo de extracción sobre gel QIAquik y se ligaron por separado a tDH, que había sido previamente digerido con XhoI y NotI, purificado sobre gel y tratado con fosfatasa alcalina de langostino. Se secuenciaron diez clones para el fragmento de la cápside para identificar la(s) posible(s) mutación(es) adaptativa(s). Sin embargo, no se encontraron mutaciones en la región de la cápside, lo que indica que bien tales mutaciones sólo se pueden producir en las secuencias de las glucoproteínas o que, como el ARN procedía de placas no purificadas, los 10 clones no representaban toda la población adaptada.

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La repetición del mismo análisis en el ARN derivado de 5 placas virales individuales siguió sin conducir a la identificación de mutaciones adaptativas en la cápside. La secuencia glucoproteica de una placa (P3) reveló la presencia de dos cambios de aminoácido en las posiciones 380 (Val a Gly) y 391 (Lys a Arg). Lo interesante es que el aminoácido 380 está conservado entre Sindbis y al menos tres cepas del VEE (TRD, MAC10 y 6119) y el aminoácido 391, que es el primer residuo de la cola citoplasmática, es Lys en las secuencias glucoproteicas del SIN y MAC10 y 6119, pero es Arg en la cepa TRD. Esto podría indicar que la ubicación de estos residuos desempeña un papel en la correcta configuración de la transmembrana-cola citoplasmática, lo que podría estabilizar las interacciones entre la glucoproteínas y la cápside, y que además podría ser explotado como parte de la presente invención.

Para probar si esta mutación doble podría aumentar la eficacia de empaquetamiento, se cambió un fragmento de 98 pb (NcoI-MfeI) que contenía ambas mutaciones a tDH-VglySE2tail, generando tDH-VglySE2tail-P3. Luego se linealizó el ADN del plásmido tDH-VlySE2tail-P3 con una sola enzima de restricción PmeI y ARN transcrito in vitro. Se co-transfectó el ARN junto con el ARN replicón de SINCR-GFP y el ARN auxiliar defectuoso codificante de la proteína de la cápside del SIN. Se incubaron las células transfectadas a 34ºC durante 24 h, tras lo que se recogió el sobrenadante del cultivo, se aclaró por centrifugación, se diluyó en serie y se usó para infectar células BHK-21 naïve durante aproximadamente 14 h. Usando un análisis de citometría de flujo, se determinaron los títulos de las partículas y la eficacia de empaquetamiento aumentó 50 veces con respecto a VglySE2tail. Además, en el contexto de una glucoproteína del VEE híbrida que contiene SE2tail y la mutación atenuante E2-120 del VEE (VE2-120/SE2tail), las mutaciones P3 aumentaron la eficacia de empaquetamiento en 200 veces.

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Ejemplo 5 Generación de quimeras de partículas de replicones de alfavirus con una señal de empaquetamiento híbrida

Para generar un sistema de empaquetamiento muy eficiente para un replicón del VEE en proteínas estructurales del Virus Sindbis, se insertó la señal de empaquetamiento de ARN ampliamente definida del SIN en diversos puntos de un replicón del VEE. Para esta tarea, se insertó por separado la señal de empaquetamiento del núcleo de 132 nucleótidos (nt.) en cada uno de tres sitios diferentes (Figura 6) del replicón VEE-TRD construido en el Ejemplo 1. Se generaron cuatro replicones quiméricos. Quimera-1A y Quimera-1B fueron los nombres dados a los constructos, en los que la señal de empaquetamiento del SIN estaba insertada en el extremo 3' del gen de la nsP4 de VEE-TRD, justo antes del codón de terminación de nsP4. El replicón de la Quimera-2 contiene la señal de empaquetamiento del SIN en marco, en el terminal C de nsP3, sustituyendo al nivel nucleotídico un segmento de 102 pb de nsP3. Finalmente, el replicón de la Quimera-3 resultó de la inserción de la señal de empaquetamiento del SIN en el extremo de nsP3, justo antes del codón de terminación de nsP3.

\newpage

Los inventores también contemplan que las enseñanzas de la presente memoria proporcionan una oportunidad única para modificar replicones y sistemas eucariotas de iniciación de vectores en capas derivados de cualquier alfavirus BSL-3 (p. ej, el VEE), de modo que se puedan tratar como constructos BSL-2 o BSL-1 reduciendo la secuencia de nucleótidos derivada del virus parental a menos de dos tercios de la longitud del genoma.

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A) Quimera 1A, 1B

Una complicación de la construcción de estas quimeras es el hecho de que el promotor subgenómico de todos los alfavirus se solapa con aproximadamente los 100 últimos nucleótidos de nsP4. Para colocar la señal de empaquetamiento del SIN en el extremo de nsP4 a la vez que se mantiene un promotor subgenómico funcional en el vector replicón para conducir la expresión del gen heterólogo, fue necesario alterar el uso de los codones de los últimos 80 nt. de nsP4 (secuencia arriba de la secuencia del SIN insertada) para eliminar su capacidad para unirse al complejo replicasa. Simultáneamente, se reconstituyó la región del promotor subgenómico del VEE secuencia abajo del codón de terminación de nsP4 duplicando la secuencia nativa de una parte del extremo 3' de nsP4 hasta que formara parte de la secuencia de reconocimiento del promotor subgenómico. La Quimera 1A y 1B se diferencian en la longitud de la secuencia de nsP4 reconstituida que se volvió a añadir para regenerar el promotor subgenómico funcional: hasta - 80 para la QUIMERA-1A (Figura 7), hasta -98 para la QUIMERA-1B (Figura 8).

La Quimera 1A y 1B se prepararon mediante la escisión de pVCR-DH, un constructo intermedio de la fase de re-ensamblaje de la construcción de pVCR descrita (anteriormente), con MscI y AscI. Se insertó en este vector cualquiera de los dos oligonucleótidos sintéticos tripartitos que codificaban, según lo descrito anteriormente, los últimos 80 pb más o menos de nsP4 con el uso de codones no nativo, seguido de la señal de empaquetamiento del SIN (en marco) y el codón de terminación de nsP4, seguidos de los 80 ó 98 pb terminales duplicados de la secuencia de nsP4 nativa. Los oligonucleótidos se diseñaron para proporcionar cadenas dúplex completas sintéticas que se trataron de la misma manera descrita anteriormente para la síntesis de replicones. Los clones verificados mediante secuenciación de esta unión se digirieron con MscI y AscI, y se sustituyó el fragmento de oligo que portaba la señal de empaquetamiento del SIN en el fragmento vectorial de pVCR, digerido de una manera similar. Los constructos finales resultantes de cada uno se denominaron pVCR/QUIMERA-1A y pVCR/QUIMERA-1B. Para evaluar la funcionalidad de estos constructos, se clonó el gen GFP en cada uno usando los sitios BbvCI y NotI únicos secuencia abajo del promotor subgenómico, siendo los constructos denominados VCR-Chim1A-GFP y VCR- Chim1B-GFP, respectivamente.

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B) Quimera 2

La Quimera 2 se preparó mediante la escisión del ensamblaje intermedio del replicón del VEE, pCMVkm2-(XhoI/CelII elim.)-VEE 9/10, del ejemplo 1, codificante de una parte de nsP3 y nsP4 del VEE unido por los sitios MamI y BlnI del replicón. La escisión de XhoI de este vector elimina un segmento de 102 pb de la nsP3 del VEE. En este vector escindido, se insertó un producto de la PCR que constaba de la señal de empaquetamiento del SIN flanqueada por los sitios XhoI en marco terminales (Figura 9). El molde para esta amplificación fue pSINCP, y se usó la ADN polimerasa de Pfu con los siguientes cebadores de oligonucleótido.

5'Pr:	5'-ATATCTCGAGAGGGATCACGGGAGAAAC-3'	(SEC ID N.º 49)

3'Pr:	5'-AGAGGAGCTCAAATACCACCGGCCCTAC-3'	(SEC ID N.º 50)

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Se validaron los clones resultantes en cuanto a la secuencia y la orientación. Se digirió un clon positivo con MamI-BlnI para generar un fragmento usado para sustituir el segmento de MamI-BlnI nativo de pVCR. El plásmido resultante se denominó pVCR/CHIMERA-2. Se clonó el gen GFP en este vector según lo descrito anteriormente para pVCR/CHIMERA-1A,-1B, generando VCR-Chim2-GFP. Debería tenerse en cuenta que la región de la eliminación de nsP3 se seleccionó en base a los sitios de las endonucleasas de restricción convenientes del constructo de ADN plasmídico. La presente invención también contempla eliminaciones adicionales que eliminen regiones más grandes de nsP3, y cualquier experto en la técnica las puede realizar fácilmente.

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C) Quimera-3

Se preparó la Quimera-3 mediante la modificación de un fragmento de replicón del ejemplo 1, el pCR2-9057b, que contenía una parte de los fragmentos 9 + 10 de replicón codificantes de la región de unión de nsP3 y nsP4 del VEE. La inserción del sitio de empaquetamiento del SIN se realizó mediante PCR de solapamiento usando la ADN polimerasa de Pfu y dos conjuntos de cebadores que amplificaron dos productos a través de la unión en pCR2-9057b y que añadieron las colas de las secuencias de señal de empaquetamiento del SIN a los productos resultantes. De manera similar, se amplificó la señal de empaquetamiento del SIN desde pSINCP con cebadores que unieron las colas de las secuencias de nsP3 y nsP4, respectivamente, a los extremos 5' y 3' del producto. Para más información sobre la estrategia que incluye secuencias de cebadores, véanse las Figuras 10 y 11. Se diluyeron los tres productos de la PCR, se mezclaron, se desnaturalizaron, se volvieron a aparear y se extendieron con la ADN polimerasa de Pfu para crear un molde de solapamiento quimérico para la amplificación utilizando los cebadores 5' y 3' de nsP3 y nsP4. Se digirió este producto con XbaI y MluI, y se clonó en un vector de clonación intermedio digerido de manera similar, el pCMVkm2 (zur Megede, J Virol. 74: 2628, 2000). Para situar la quimera en el contexto de pVCR, se digirió pCMVkm2/CHIMERA-3 intermedio con MamI (5') y SacI (3'), y se co-ligó con un fragmento SacI-BlnI de pVCR (nt. 5620-6016 de pVCR) en el fragmento de vector MamI/BlnI de pVCR. El constructo resultante se denominó pVCR/CHIMERA-3. Se clonó el gen GFP en este vector según lo descrito anteriormente para pVCR/CHIMERA-1A,-1B, generando VCR-Chim3-GFP.

Para analizar la capacidad de estos constructos para ser empaquetados por las proteínas estructurales del Sindbis, se linealizaron los plásmidos VCR-Chim1A-GFP, VCR-Chim1b-GFP, VCR-Chim2-GFP y VCR-Chim3-GFP con una sola enzima de restricción PmeI y ARN transcrito in vitro. Se co-transfectó el ARN junto con los ARN auxiliares defectuosos codificantes de la cápside y de las glucoproteínas del SIN de los constructos VCR-DH-Sglydl160 y VCR- DH-Scap, también linealizados con PmeI. Se incubaron las células transfectadas a 37ºC durante 24 h, tras lo que se recogieron los sobrenadantes de los cultivos, se aclararon por centrifugación, se diluyeron en serie y se usaron para infectar células BHK-21 naïve durante aproximadamente 14 h. Usando un análisis de citometría de flujo, se determinaron los títulos de las partículas. Los resultados que figuran a continuación demostraron que las proteínas estructurales del SIN podían empaquetar eficazmente tres quimeras. La Quimera 1A no expresaba a GFP, y no se determinó si esto se debía a un defecto de la transcripción subgenómica o de la replicación del ARN.

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27

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Construcción de la Quimera 2.1

Para seguir reduciendo la cantidad de la secuencia del virus VEE parental presente en el replicón pVCR-Chimera2, se eliminó la NTR 3' (también conocida como secuencia 3' necesaria para la amplificación mediada por proteínas no estructurales o UTR 3') del VEE en su totalidad y se sustituyó por la NTR 3' del SIN. Se digirió el plásmido SINCR-GFP (Garner et al., 2000 ibid.) con NotI y PmeI, se purificó sobre gel el fragmento de 466 pb usando el equipo de extracción sobre gel QIAquick y se ligó tanto a pVCR-Chimera2 como a VCR-Chim2-GFP, que habían sido digeridos previamente con NotI y PmeI, purificados sobre gel y tratados con fosfatasa alcalina de langostino. Se verificaron los clones positivos, siendo los constructos denominados VCR-Chim2.1 y VCR-Chim2.1-GFP. Estos constructos difieren ahora del genoma del virus VEE parental mediante la eliminación de múltiples secuencias del VEE (p. ej., región de nsP3, genes de proteínas estructurales, NTR 3').

Para analizar la funcionalidad de la nueva configuración de los vectores replicones quiméricos, se linealizó el plásmido VCR-Chim2.1-GFP con una sola enzima de restricción PmeI y ARN transcrito in vitro. Se co-transfectó el ARN junto con los ARN auxiliares defectuosos codificantes de la cápside y de las glucoproteínas del SIN de los constructos VCR-DH-Sglydl160 y VCR-DH-Scap, también linealizados con PmeI. Se incubaron las células transfectadas a 37ºC durante 24 h, tras lo que se recogieron los sobrenadantes de los cultivos, se aclararon por centrifugación, se diluyeron en serie y se usaron para infectar células BHK-21 naïve durante aproximadamente 14 h. Usando un análisis de citometría de flujo, se determinaron los títulos de las partículas como los mismos títulos que VCR-Chim2-GFP, lo que demostró que la eliminación de la NTR 3' nativa y la sustitución con una NTR 3' de alfavirus heterólogo (p. ej., NTR 3' del SIN) mantiene la funcionalidad en el replicón del VEE.

Alternativamente, como medio para reducir las secuencias derivadas del VEE globales en VCR-Chimera2, se redujo la NTR 3' a la secuencia mínima que contenía las CSE conservadas de 19 nt. Tal NTR 3' modificada se generó usando oligonucleótidos solapantes:

28

Se mezcló cada par de oligonucleótido directo e inverso (p. ej., Vred2F con Vred2R, VEE2F con VEE2R, etc.), se fosforilaron, se desnaturalizaron y se aparearon lentamente. Luego se mezclaron los 3 pares de oligonucleótidos apareados, se ligaron entre sí, se digirieron con enzimas NotI y PmeI, se purificaron sobre gel usando un equipo de extracción sobre gel QIAquick, y se ligaron a VCR-Chim2-GFP, que había sido digerido previamente con las mismas enzimas para eliminar la NTR 3' de longitud completa, purificado sobre gel y tratado con fosfatasa alcalina de langostino. Se verificaron mediante secuenciación los clones positivos para el fragmento. Este constructo se denominó VCR-Chim2.2-GFP.

Para confirmar la funcionalidad de esta configuración de los vectores replicones quiméricos, se linealizó el plásmido VCR-Chim2.2-GFP con una sola enzima de restricción PmeI y ARN transcrito in vitro. Se co-transfectó el ARN junto con los ARN auxiliares defectuosos codificantes de la cápside y de las glucoproteínas del SIN de los constructos VCR-DH-Sglydl160 y VCR-DH-Scap, también linealizados con PmeI. Se incubaron las células transfectadas a 34ºC durante 24 h, tras lo que se recogieron los sobrenadantes de los cultivos, se aclararon por centrifugación, se diluyeron en serie y se usaron para infectar células BHK-21 naïve durante aproximadamente 14 h. Usando un análisis de citometría de flujo, se determinaron los títulos de las partículas como los similares a VCR-Chim2-GFP, lo que demostró que la reducción del tamaño de la NTR 3' de 117 pb a 37 pb, y la sustitución mantienen la funcionalidad del replicón.

Similares a los vectores replicones anteriores para su uso como partículas de ARN o replicones, cualquier experto en la técnica puede obtener replicones basados en ADN de alfavirus que funcionen directamente en una célula eucariota (p. ej., sistemas eucariotas de iniciación de vectores en capas), usando las enseñanzas proporcionadas en la presente memoria. Tales replicones basados en ADN se pueden eliminar de una variedad de secuencias virales parentales, incluyendo, por ejemplo, pero no limitándose a, secuencias de la región carboxi-terminal de nsP3, la región de genes de proteínas estructurales, la región de CSE 3' y similares.

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Ejemplo 6 Uso de diferentes proteínas estructurales para la administración del ARN replicón

Se expresó un antígeno del VIH a partir de ARN replicón del SIN empaquetado con proteínas estructurales bien del SIN o del VEE, y a partir de ARN replicón del VEE empaquetado con proteínas estructurales bien del SIN o del VEE como se explica a continuación. Específicamente, se insertó un fragmento que contenía la secuencia de genes heteróloga que codificaba el VIH con optimización de los codones p55gag (zur Megede, J. Virol. 74: 2628, 2000) del plásmido pCMVKm2.GagMod.SF2 en el vector replicón SINCR (Gardner et al., 2000, ibid) en los sitios AhoI-NotI, en el vector replicón VCR en los sitios BbvCI-NotI y en el vector VCR-Chim2.1 en los sitios BbvCI-MfeI. Los constructos de replicones codificantes de p55gag se denominaron SINCR-p55gag, VCR-p55gag y VCR-Chim2.1-p55gag, respectivamente. Para producir partículas de replicones del SIN, del VEE y de quimeras que expresaran a p55gag, se linealizaron los plásmidos anteriores con una sola enzima de restricción PmeI y ARN transcrito in vitro. Se co-transfectó el ARN junto con ARN auxiliar defectuoso que codificaba las proteínas estructurales apropiadas que fueron transcritas desde los plásmidos linealizados con PmeI como se muestra a continuación.

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Se incubaron a 34ºC las células transfectadas, se recogieron los sobrenadantes a las 20 y a las 36 horas, tras lo que se aclararon mediante centrifugación y se purificaron mediante cromatografía según lo descrito anteriormente (PCT WO 01/92552).

Se determinaron los títulos de las partículas mediante tinción intracelular para la expresión de gag en células BHK21 durante 16 h con la dilución en serie de preparaciones de partículas purificadas. Primero se permeabilizaron las células y se fijaron con un equipo Cytofix/Cytoperm® (Pharmingen), luego se tiñeron para detectar el p55gag intracelular con anticuerpos conjugados con FITC contra el antígeno del núcleo del VIH-1 (Coulter). Usando un análisis de citometría de flujo, se determinó el porcentaje de las células positivas en gag y se usó para calcular los títulos de las partículas.

Se determinó la inmunogenicidad en modelos de roedores tras la inmunización con las diferentes preparaciones de partículas de replicones de alfavirus que expresaban el p55gag del VIH, a dosis de 10^{6} ó 10^{7} UI de partículas de replicones (Figura 12). Se descubrió que todos eran inmunogénicos, descubriéndose que la quimera VEErep/SINenv es un inmunógeno particularmente potente.

La demostración de la inmunización secuencial de roedores o primates con partículas de replicones de alfavirus, tales como las partículas de replicones anteriores, que difieren en sus proteínas estructurales, se puede realizar usando una variedad de vías (p. ej., intramuscular, intradérmica, subcutánea, intranasal) y con intervalos de dosificación de 10^{3} UI hasta 10^{8} UI, o más. Por ejemplo, primero se inmunizan los primates con 10^{7} partículas de SINCR-p55gag que contienen proteínas estructurales del VEE en 0,5 ml de diluyente de PBS por vía subcutánea. Entonces se administran los mismos materiales una segunda vez 30 días después por la misma vía de inyección. Aproximadamente 6-12 meses después, se inmunizan los animales una o más veces con 10^{7} partículas de SINCR-p55gag que contienen proteínas estructurales del SIN en 0,5 ml de diluyente de PBS por vía intramuscular. La demostración de la inmunogenicidad se realiza usando análisis estándar y se puede comparar con animales paralelos que sólo recibieron un solo tipo de partícula de replicón en el momento de la administración.

Los ejemplos anteriores han descrito diversas técnicas adecuadas para preparar partículas de alfavirus quiméricos usando ácidos nucleicos, proteínas no estructurales y proteínas estructurales, así como partes de los mismos, derivados de dos alfavirus diferentes. Sin embargo, cualquier experto en la técnica, usando las enseñanzas proporcionadas en la presente memoria, podría preparar las partículas de alfavirus quiméricos de tres o más virus sin la necesidad de realizar ninguna experimentación Sería lógico combinar las enseñanzas encontradas en la presente memoria con las enseñanzas de otras revelaciones técnicas relevantes accesibles en general a los expertos en la técnica que incluyen, pero no se limitan a, patentes, solicitudes de patente, revistas científicas, tratados científicos, y referencias y libros de texto estándar.

Por ejemplo, las partículas de alfavirus quiméricos se crean usando vectores replicones del SIN y al menos dos moléculas de ARN auxiliar defectuoso. El ARN replicón codifica proteínas no estructurales del SIN, una señal de empaquetamiento del VEE y un gen heterólogo de interés. El primer ARN auxiliar defectuoso codifica una proteína de la cápside híbrida que tiene un dominio de unión a ARN del VEE y un dominio de interacción con glucoproteínas del WEE. El segundo ARN auxiliar defectuoso codifica glucoproteína del WEE. Las partículas de alfavirus quiméricos resultantes tienen ácido nucleico derivado del SIN con una cápside híbrida de VEE/WEE y una glucoproteína de la envoltura del WEE.

En otro ejemplo, se crea una partícula de alfavirus quimérico según las enseñanzas de la presente invención, en la que se combina un replicón del SIN que tiene proteínas no estructurales del SIN y un gen heterólogo de interés con dos moléculas de ARN auxiliar defectuoso. El primer ARN auxiliar defectuoso codifica una cápside híbrida que tiene un dominio de unión a ARN del SIN y un dominio de interacción con glucoproteínas del SFV. El segundo ARN auxiliar defectuoso codifica una glucoproteína híbrida que tiene una cola citoplasmática del SFV con el resto de la envoltura glucoproteica proporcionada por el VEE. La partícula de alfavirus quimérico resultante tiene ácidos nucleicos del SIN con un gen heterólogo de interés encapsulado en una cápside híbrida de SIN/SFV con una glucoproteína de la envoltura híbrida de SFV/VEE, estando la parte del ectodominio exterior de la glucoproteína derivada del VEE.

En otro ejemplo más, se usan cuatro alfavirus diferentes para preparar la partícula de alfavirus quimérico. En este ejemplo, se proporcionan un ARN replicón del SIN que codifica proteínas no estructurales del SIN, una señal de empaquetamiento del VEE y un gen heterólogo de interés. El primer ARN auxiliar defectuoso codifica una cápside híbrida que tiene un dominio de unión a ARN del VEE y un dominio de interacción con glucoproteínas del WEE. El segundo ARN auxiliar defectuoso codifica una glucoproteína híbrida que tiene una cola citoplasmática del WEE con el resto de la glucoproteína proporcionado por el SFV. La partícula de alfavirus quimérico resultante tiene ARN del SIN y un gen heterólogo de interés, una cápside híbrida de VEE/WEE y una glucoproteína híbrida de WEE/SFV, estando la parte del ectodominio exterior de la glucoproteína derivada del SFV.

Hay otras muchas combinaciones posibles y los ejemplos anteriores sirven para ilustrar la enorme versatilidad de la presente invención. Por lo tanto, estos ejemplos no restrictivos representan sólo unas cuantas de las numerosas partículas de alfavirus quiméricos que se pueden crear según las enseñanzas de la presente invención.

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Ejemplo 7 Uso de vectores replicones de alfavirus y auxiliares defectuosos con diferentes elementos de control

Para producir las partículas de replicones de alfavirus usando componentes de vector (p. ej., ARN replicón, sistema eucariota de iniciación de vectores en capas) y de empaquetamiento (p. ej., auxiliar defectuoso, casete de expresión de proteínas estructurales) con diferentes elementos de control, se puede utilizar una amplia variedad de combinaciones según la presente invención. Por ejemplo, se puede construir un replicón basado en ADN plasmídico del SIN (sistema eucariota de iniciación de vectores en capas) para que contenga una secuencia 3' necesaria para la amplificación mediada por proteínas no estructurales (CSE 3') diferente de la contenida en los casetes de expresión de proteínas estructurales de una línea celular de empaquetamiento del SIN. Más específicamente, a continuación se describe una modificación del extremo 3' del SIN para incorporar una señal de poliadenilación derivada del gen de la hormona del crecimiento bovino. La secuencia resultante:

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así se diseña genéticamente en el constructo de plásmido del SIN. Se sustituye esta nueva secuencia por el extremo 3' existente, tracto poli(A) sintético, ribozima y sitio poli(A) de BHG del plásmido pSINCP (véase el documento WO 01/81690) como se explica a continuación. El plásmido pSINCP-bgal (pSINCP que expresa a bgal) se elimina de los elementos anteriormente mencionados mediante PCR con los siguientes cebadores:

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NPSfwd:
5'ACAGACAGACCGCGGCCGCACAGACAGACGTTTAAACGTGGGCGAAGAAC
TCCAGCATGAGATCC	(SEC ID N.º 57)

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que contiene un sitio NotI (12-19 nt.), un sitio PmeI (30-37 nt.) y 38-65 nt. que son complementarios a las secuencias de SINCP-bgal secuencia abajo de los elementos anteriormente mencionados, un sitio NotI los precede.

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NPSrev:
5'-TTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCCCGAC	(SEC ID N.º 58)

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que es complementario a la región de la estructura del plásmido que contiene el sitio SphI. El fragmento de 492 pb amplificado se purifica del gel de agarosa usando un equipo de extracción sobre gel QIAquick, se digiere con NotI y SphI, y se liga a SINCP-bgal, que también ha sido digerido con NtoI y SphI para eliminar la secuencia existente (1.106 pb). Se verifican mediante secuenciación los clones que contienen el fragmento recién generado, y el constructo intermedio se denomina SINCPt-bgal. Entonces se generó el nuevo extremo 3' usando los oligonucleótidos solapantes:

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Se mezclaron los oligonucleótidos, se fosforilaron, se desnaturalizaron, se aparearon lentamente y se ligaron. Tras desactivar la ligasa, se digirió el ADN con las enzimas NotI y PmeI, se purificó sobre gel usando el equipo de extracción sobre gel QIAquick y se ligó a SINCPt-bgal digerido con las mismas enzimas y tratado con fosfatasa alcalina. Se verifican mediante secuenciación los clones que contienen el fragmento recién generado, y el constructo final se denomina SINCP-pA-bgal.

Para producir las partículas de replicones, se transfecta este plásmido en una línea celular de empaquetamiento del SIN que contiene casetes de expresión de proteínas estructurales que no tienen secuencias del extremo 3' modificadas de una manera similar (Polo et al., 1999. Proc. Natl. Acad. Sci., EE.UU., 96: 4598-603). Tras una incubación apropiada, se cosechan las partículas de replicones y se purifican según lo descrito anteriormente.

Claims

1. Una partícula de alfavirus quimérico que comprende

: ARN que codifica una o más proteínas no estructurales derivadas de un primer alfavirus y una señal de empaquetamiento derivada de un segundo alfavirus diferente de dicho primer alfavirus, en la que dicha señal de empaquetamiento está insertada en un sitio seleccionado del grupo constituido por la unión de nsP3 con nsP4, en el extremo 3' del marco de lectura abierto de nsP4, y una eliminación en un gen de proteína no estructural;

: una proteína de la cápside derivada de dicho segundo alfavirus; y

: una proteína de la envoltura derivada de un alfavirus diferente de dicho primer alfavirus,

: en la que dicho ARN comprende además una secuencia de ácido nucleico heteróloga que codifica un agente terapéutico o un inmunógeno.

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2. La partícula de alfavirus quimérico de la reivindicación 1, en la que la señal de empaquetamiento está insertada en una eliminación carboxi-terminal de un gen de proteína no estructural.

3. La partícula de alfavirus quimérico de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2, en la que dicha proteína de la envoltura deriva del segundo alfavirus.

4. Una partícula de alfavirus según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dicha partícula es una partícula de replicón y en la que además dicho ARN comprende, en el sentido de 5' a 3' (i) una secuencia 5' necesaria para la amplificación mediada por proteínas no estructurales; (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica proteínas no estructurales de alfavirus; (iii) un medio para expresar un ácido nucleico heterólogo; (iv) la secuencia de ácido nucleico heteróloga; (v) una secuencia 3' necesaria para la amplificación mediada por proteínas no estructurales y (vi) un tracto poliadenilado, en el que dicha secuencia de ácido nucleico heteróloga sustituye un gen de proteína estructural de alfavirus.

5. La partícula de alfavirus quimérico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dicho primer alfavirus es el Virus Sindbis (SIN) y en la que dicho segundo alfavirus es el Virus de la Encefalitis Equina Venezolana (VEE).

6. La partícula de alfavirus quimérico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dicho primer alfavirus es el VEE y en la que dicho segundo alfavirus es el SIN.

7. La partícula de alfavirus según la reivindicación 1, en la que dicho ácido nucleico heterólogo sustituye al menos una proteína estructural de alfavirus.

8. Una composición farmacéutica que comprende la partícula de alfavirus según cualquiera de las reivindicaciones 1-7 en combinación con un vehículo, diluyente o receptor farmacéuticamente aceptable.

9. Una partícula de alfavirus según cualquiera de las reivindicaciones 1-7 que expresa uno o más antígenos derivados de al menos un agente patógeno, para su uso en la estimulación de una respuesta inmune en un animal de sangre caliente.

10. Un procedimiento para generar partículas de replicones de alfavirus que comprende introducir en una célula huésped:

(a): un ARN replicón de alfavirus que codifica una o más proteínas no estructurales de un primer alfavirus, una señal de empaquetamiento derivada de un segundo alfavirus diferente de dicho primer alfavirus y una o más secuencias heterólogas que codifican un agente terapéutico o inmunógeno, en el que dicha señal de empaquetamiento está insertada en un sitio seleccionado del grupo constituido por la unión de nsP3 y nsP4, en el extremo 3' del marco de lectura abierto de nsP4, y una eliminación en un gen de proteína no estructural; y

(b): al menos un ARN auxiliar defectuoso separado que codifica una o varias proteínas estructurales ausentes del ARN replicón, en el que al menos una de dichas proteínas estructurales es una proteína de la cápside derivada de dicho segundo alfavirus y al menos una de dichas proteínas estructurales es una proteína de la envoltura derivada de un alfavirus diferente de dicho primer alfavirus,

: en el que se producen partículas de replicones de alfavirus.