ES2340915T3 - Produccion de polihidroxialcanoatos de longitud media de cadena por caminos de biosintesis de acidos grasos. - Google Patents
Produccion de polihidroxialcanoatos de longitud media de cadena por caminos de biosintesis de acidos grasos. Download PDFInfo
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Abstract
Un organismo transgénico productor de PHA seleccionado de bacterias o plantas, organismo que expresa una PHA-sintasa y expresa adicionalmente un transgén que codifica una enzima que tiene la actividad catalítica de 3-hidroxiacil-ACP-tioesterasa, en el cual el organismo comprende adicionalmente uno o más transgenes que codifican enzimas que tienen la actividad catalítica de acil-CoA-sintetasa o acil-CoA-transferasa de tal modo que PHA que comprende (D)-3-hidroxiácidos de longitud de cadena media se acumula por el camino de la biosíntesis de los ácidos grasos.
Description
Producción de polihidroxialcanoatos de longitud
media de cadena por caminos de biosíntesis de ácidos grasos.
Numerosos microorganismos tienen la capacidad de
acumular reservas intracelulares de
poli[(R)-3-hidroxialcanoatos]
(PHAs). Los PHAs son materiales termoplásticos biodegradables y
biocompatibles, producidos a partir de fuentes renovables, con una
extensa gama de aplicaciones industriales y biomédicas (Williams y
Peoples, 1996, CHEMTECH 26, 38-44). Los
biopolímeros PHA abarcan una amplia clase de poliésteres con
diferentes composiciones de monómeros y una extensa gama de
propiedades físicas. Hasta la fecha se han incorporado
aproximadamente 100 monómeros diferentes en los polímeros PHA
(Steinbüchel y Valentin, 1995, FEMS Microbiol. Lett. 128;
219-228). Los PHAs pueden dividirse en dos grupos
de acuerdo con la longitud de sus cadenas laterales. Aquéllos que
tienen cadenas laterales cortas, tales como polihidroxibutirato
(PHB), un homopolímero de unidades de ácido
R-3-hidroxibutírico, son termoplásticos
cristalinos, mientras que los PHAs con cadenas laterales de longitud
media, tales como ácido polihidroxioctanoico o
polihidroxidecanoico, son más elastómeros.
En las bacterias, cada grupo PHA se produce por
un camino específico. En el caso de los PHAs con grupos colgantes
cortos, están implicadas tres enzimas, una
\beta-cetotiolasa, una
acetoacetil-CoA-reductasa, y una
PHA-sintasa. Por ejemplo, en la biosíntesis de PHB,
dos moléculas de acetil-coenzima A son fusionadas
por una \beta-cetotiolasa para producir
acetoacetil-coenzima A. La última se reduce luego al
compuesto intermedio quiral
R-3-hidroxibutiril-coenzima
A por la reductasa, y es polimerizada subsiguientemente por la
enzima PHA-sintasa. Las PHA-sintasas
de longitud de cadena corta permiten típicamente la polimerización
de monómeros de hidroxiácidos C3-C5 que incluyen a
la vez unidades de 4-hidroxiácidos y
5-hidroxiácidos. Este camino de biosíntesis se
encuentra en numerosas bacterias tales como Ralstonia
eutropha, Alcaligenes latus, Zoogloea ramigera, etc
(Madison, L.L. & Huisman, G.W. Microbiology and Molecular
Biology Reviews 1999, 63, 21-53).
Las PHAs con grupos colgantes de longitud de
cadena media son producidas por muchas bacterias Pseudomonas
diferentes. Las unidades monómeras de
hidroxiacetil-coenzima A pueden originarse por
caminos de \beta-oxidación de ácidos grasos y
biosíntesis de ácidos grasos. Las unidades monómeras se convierten
luego en polímero por las PHA-sintasas que tienen
especificidades de sustrato que favorecen las unidades monómeras
mayores C6-C14 (Madison, L. L. & Huisman, G. W.
Microbiology and Molecular Biology Reviews 1999, 63,
21-53). Se ha encontrado que, en los organismos
Pseudomonas, las PHA-sintasas responsables de
la producción de los PHAs de grupos colgantes largos están
codificadas en el locus pha, específicamente por los genes
phaA y phaC (U.S.5.245.023; U.S. 5.250.430; Huisman
et al., 1991, J. Biol. Chem.
266:2191-2198).
Copolímeros constituidos por grupos colgantes de
longitud de cadena corta y media pueden producirse también en
bacterias que poseen una PHA-sintasa con una
especificidad de sustrato amplia. Por ejemplo, Pseudomonas
sp. A33 (Appl. Microbiol. Biotechnol. 1995, 42,
901-909), Pseudomonas sp.
61-3 (Kato, M., Bao, H. J., Kang, C.-K, Fukui, T.,
Doi, Y. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1996, 45,
363-370), y Thiocapsa pfennigii (U.S.
6.011.144) poseen todas ellas PHA-sintasas que,
según se ha informado, producen copolímeros de unidades monómeras
de longitud de cadena corta y media.
Una enzima codificada por phaG fue
identificada recientemente a la vez en Pseudomonas putida y
Pseudomonas aeruginosa y se ha informado que es el enlace
entre la biosíntesis de los ácidos grasos y la formación de PHA de
longitud de cadena media (véase Camino A en la Figura 1) en estos
organismos (Rehm, B. H. A., Kruger, N., Steinbuchel, A. J. Biol.
Chem. 1998, 273, 24044-24051; WO 98/06854; U. S.
5.750.848; Hoffmann, N., Steinbuchel, A., Rehm, B. H. A. FEMS
Microbiology Letters, 2000, 184, 253-259). En estos
estudios, PhaG se identificó como una
proteína-coenzima A-transferasa
portadora de 3-hidroxiacil-acilo
basándose en la capacidad de las preparaciones parcialmente
purificadas de la enzima para convertir
3-hidroxidecanoil-CoA en presencia
de ACP en 3-hidroxidecanoil-ACP
(Rehm, B. H. A., Kruger, N., Steinbuchel, A. J. Biol. Chem. 1998,
273, 24044-24051). La expresión de PhaG y PhaC en
Pseudomonas fragi, un organismo que no produce naturalmente
PHAs como material de almacenamiento, permitía la producción de
PHAs a partir de gluconato (Fiedler, S., Steinbuchel, A., Rehm, B.
H. A. Applied and Environmental Microbiology 2000, 66,
2117-2124). Sin embargo, no se observó polímero
alguno después de la expresión de una sintasa de longitud de cadena
media y PhaG en E. coli (Rehm, B. H. A., Kruger, N.,
Steinbuchel, A. J. Biol. Chem. 1998, 273,
24044-24051). Si bien E. coli es capaz de
producir pequeñas cantidades de formas no granulares de PHB de peso
molecular bajo (Reusch, R.N. Can. J. Microbiol. 1995, 41 (supl. 1),
50-54), como P. fragi, el mismo es incapaz de
producir gránulos de polímero de almacenamiento.
La patente U.S. No. 5.750.848 consignó que el
gen phaG de Pseudomonas putida codifica una actividad
de
3-hidroxiacil-ACP-CoA-transferasa
útil para producir precursores de
(D)-3-hidroxiacil-CoA
para la biosíntesis de biopolímeros de polihidroxialcanoato (PHA)
que comprenden unidades C8 y C10. Esta actividad no ha sido
confirmada, sin embargo.
WO 00/55328 describe la creación de caminos
metabólicos para la producción de PHA a partir del compuesto
intermedio en la biosíntesis de ácidos grasos
acil-ACP, utilizando 5 transgenes diferentes para
producir un camino que inicialmente producirá ácidos grasos (C8)
libres por el camino de síntesis de ácidos grasos a través de la
acción de tioesterasas, que añadirán entonces un resto CoA al ácido
graso libre por la acción de una
acil-CoA-sintetasa, que producirá
3-cetoacil-CoAs a partir de la
acil-CoA por la acción de una tiolasa, que producirá
R-(-)-OH-acil-CoAs
a partir de las 3-cetoácido-CoAs por
la acción de una isoforma de deshidrogenasa de levaduras. Estas
R-(-)-3-OH-acil-CoAs
se utilizarán finalmente como sustrato para la reacción de la
PHA-sintasa.
Es por consiguiente un objeto de la presente
invención expresar PhaG en asociación con una
acil-CoA-sintetasa y una
PHA-sintasa en un organismo para la producción de
PHAs.
Por tanto, es un objeto adicional de la presente
invención expresar PhaG en asociación con una
acil-CoA-sintetasa y una
PHA-sintasa en un organismo para la producción de
PHAs de longitud de cadena media.
Se ha descubierto que un sistema recombinante de
E. coli que expresa el gen phaG y el gen de
PHA-sintasa 1 de Pseudomonas oleovorans no
acumula PHAs de longitud de cadena media. No obstante, se encontró
que el medio contenía niveles significativos de
3-hidroxiácidos. Se ha demostrado ahora que la
proteína PhaG se comportaba como una
3-hidroxiacil-ACP-tioesterasa.
Un sistema de E. coli que expresa el gen phaG, el gen
phaC1 y el gen alkK produce PHA. Estos resultados no
sólo proporcionan nuevos enfoques de ingeniería metabólica para
producir PHAs en E. coli u otras bacterias sino que
proporcionan varios nuevos enfoques para producir PHAs en otros
organismos, por ejemplo, cosechas de plantas.
Los métodos descritos en esta memoria incluyen
expresar enzimas que tienen actividad de
3-hidroxiacil-ACP-tioesterasa
en los plástidos de las hojas o semillas de cosechas de plantas o
en un organismo distinto de una planta tal como bacterias en
asociación con, por ejemplo, una
acil-CoA-sintetasa o
CoA-transferasa, o un gen o genes de
PHA-sintasa, en el caso de una sintasa de 2
subunidades, en el peroxisoma, el citosol o los plástidos de
plantas superiores. En algunos casos tales como la expresión de
plástidos de la tioesterasa y PHA-sintasa, es
también útil expresar un gen que tenga una actividad de
3-hidroxiacil-CoA-sintetasa
en el plástido. En los casos en que la PHA-sintasa
se expresa en el citosol, puede ser opcionalmente útil aumentar la
expresión de un gen o genes que codifican una enzima que tiene la
actividad catalítica de una
(D)-3-hidroxiacil-CoA-sintetasa.
En los casos en que la PHA-sintasa está
direccionada al peroxisoma, puede ser útil también direccionar una
enzima que tenga la actividad catalítica de una
(D)-3-hidroxiacil-CoA-sintetasa
al peroxisoma.
Un constructo transgénico que codifica una
enzima que tiene la actividad catalítica de una
3-hidroxiacil-ACP-tioesterasa
ha sido desarrollado. En una realización, el constructo transgénico
incluye adicionalmente un gen que codifica una
acil-CoA-sintetasa o una
CoA-transferasa. En otra realización, el constructo
transgénico incluye adicionalmente un gen que codifica una
acil-CoA-sintetasa o una
CoA-transferasa y un gen que codifica una
PHA-sintasa.
El constructo transgénico puede expresarse en
cualquier organismo y/o células del mismo para la producción de
PHAs. En un ejemplo, el PHA es un PHA de longitud de cadena media
que tiene, por ejemplo, unidades de hidroxiácidos C8 y C10. En otro
ejemplo, el organismo es una bacteria. En otro ejemplo, el organismo
es una planta. Pueden producirse PHAs por cultivo del organismo o
células del mismo en condiciones apropiadas.
El método descrito en esta memoria permite
también la modificación de la composición de aceites de la planta
para aumentar los niveles de hidroxiácidos o ácidos grasos C8 y
C10.
La Figura 1 es el camino propuesto para la
formación de copolímeros de polihidroxialcanoato de longitud de
cadena media y polihidroxialcanoato de longitud de cadena corta y
media por biosíntesis de ácidos grasos.
La Figura 2 es un gráfico que indica el consumo
de CoA con el tiempo en presencia de ácido octanoico en extractos
brutos preparados a partir de las cepas DH5\alpha/pTRCNalkK y
DH5\alpha/pTRCN.
La Figura 3 es un gráfico que indica el consumo
de CoA con el tiempo en presencia de ácido
3-hidroxioctanoico en extractos brutos preparados a
partir de las cepas DH5\alpha/TRCNalkK y DH5\alpha/pTRCN.
La Figura 4A muestra el mapa de inserción en
pCambia-Rbc.PhaG.PhaC que contiene el promotor
rubisco de alfalfa fusionado a la señal de direccionamiento de
cloroplastos de alfalfa, un fragmento que codifica PhaG, un
fragmento que codifica la secuencia de terminación de rubisco de
alfalfa, el promotor rubisco de alfalfa fusionado a la señal de
direccionamiento de los cloroplastos de alfalfa, un fragmento que
codifica PhaC de Pseudomonas aeruginosa, y un fragmento que
codifica la secuencia de terminación de rubisco de alfalfa. La
Figura 4B muestra el mapa de inserción en
pBI-C4PPDK.PhaG.Rbc.PhaC que contiene el promotor
35S-C4PPDK, la señal de direccionamiento del
cloroplastos de rubisco del guisante que incluye DNA que codifica
los 24 aminoácidos N-terminales de la proteína
rubisco del guisante, un fragmento que codifica PhaG, la secuencia
de terminación Nos, el promotor rubisco de alfalfa fusionado a la
señal de direccionamiento de los cloroplastos de alfalfa, un
fragmento que codifica PhaC de Pseudomonas aeruginosa, y un
fragmento que codifica la secuencia de terminación de rubisco de
alfalfa.
La Figura 5A es el mapa de inserciones en el
vector de transformación de plantas para expresión específica de
las hojas de phaG, alkK y phaC para la
acumulación de polímero en los cloroplastos de las hojas.
La Figura 5B es el mapa de inserciones en el
vector de transformación de plantas para la expresión específica de
las hojas de phaG, alkK y phaC para la acumulación de
polímero en el citosol de las hojas.
La Figura 5C es el mapa de inserciones en el
vector de transformación de plantas para expresión específica de
las hojas de phaG, alkK y phaC para la acumulación de
polímero en los peroxisomas de las hojas.
La Figura 6A es el mapa de inserciones en el
vector de transformación de plantas para expresión específica de
semilla de phaG, alkK y phaC para la acumulación de polímero
en los plástidos de las semillas.
La Figura 6B es un mapa de inserciones en el
vector de transformación de plantas para expresión específica de
semilla de phaG, alkK y phaC para la acumulación de polímero
en el citosol de las semillas.
La Figura 6C es el mapa de inserciones en el
vector de transformación de plantas para expresión específica de
semilla de phaG, alkK y phaC para la acumulación de polímero
en los peroxisomas de las semillas.
La incapacidad de E. coli para formar
PHAs de longitud de cadena media a partir de glucosa cuando se
expresan PhaG y PhaC sugiere que puede ser necesaria una actividad
adicional de enzima cuando este camino se modifica por ingeniería
genética en productores no nativos de PHA distintos de
Pseudomonas. La patente U.S. No. 5.750.848 describe métodos
de cribado para aislar una enzima o combinación de enzimas que
permiten la conversión de
3-hidroxiacil-ACPs en
3-hidroxiacil-CoAs en bacterias
PHA-negativas, pero tales enzimas no han sido
descritas en la bibliografía ni en la patente. Klinke et al.
(Klinke, S., Ren, Q., Witholt, B., Kessler, B. Appl. Environ.
Microbiol. 1999, 65, 540-548) han demostrado la
producción de PHA en E. coli después de coexpresión de una
tioesterasa y una PHA-sintasa. Dado que la
tioesterasa empleada en este estudio no convierte
3-hidroxiacil-ACPs en
3-hidroxiácidos grasos sino que convierte en su
lugar acil-ACPs en ácidos grasos, las enzimas de
\beta-oxidación nativas de la célula hospedadora
son necesarias para formar los
3-hidroxiacil-CoAs para formación de
PHA. Esta estrategia está limitada por tanto en las plantas, dado
que las enzimas de \beta-oxidación están
localizadas predominantemente en los peroxisomas, localización que
limita la producción de PHA.
Se ha descubierto una
acil-CoA-sintetasa como actividad
enzimática que se requiere para producción de PHA de longitud de
cadena media en sistemas heterólogos que expresan PhaG y PhaC. Las
acil-CoA-sintetasas catalizan la
conversión de los ácidos grasos libres, coenzima A, y ATP en
acil-CoAs grasos más AMP (véase Camino C en la
Figura 1; Black, P. N., DiRusso, C. C., Metzger, A. K., Heimert, T.
L. J. Biol. Chem. 1992, 267, 25513-25520). El
requerimiento de actividad suplementaria de
acil-CoA-sintetasa para hacer
posible que PhaG complete la reacción de la
3-hidroxiacil-ACP-CoA-transferasa
in vivo sugiere que PhaG codifica inesperadamente sólo
actividad de
3-hidroxiacil-ACP-tioesterasa
(véase el camino B en la Figura 1). Genes para
acil-CoA-sintetasas han sido
aislados y caracterizados, con inclusión del gen fadD de
E. coli (Black, P. N., DiRusso, C. C., Metzger, A. K.,
Heimert, T. L. J. Biol. Chem. 1992, 267,
25513-25520), el gen alkK de Pseudomonas
oleovorans (van Beilen, J. B., Eggink, G., Enequist, H., Bos,
R., Witholt, B. Molecular Microbiology 1992, 6,
3121-3136), y el gen Pfacs1 de Plasmodium
falciparum (Matesanz, F., Duran-Chica, I.,
Alcina, A. J. Mol. Biol. 1999, 291, 59-70).
Al igual que las
acil-CoA-sintetasas, las
CoA-transferasas son capaces también de convertir
3-hidroxiácidos grasos en
3-hidroxiacil-CoAs. Las
CoA-transferasas catalizan la transferencia de CoA
desde una acil-CoA a un ácido graso libre (véase
Camino D en la Figura 1). La coexpresión de una
3-hidroxiacil-ACP-tioesterasa
con una CoA-transferasa permitiría la conversión
exitosa de un 3-hidroxiacil-ACP en
su correspondiente
3-hidroxiacil-CoA. WO 98/39453
describe métodos para utilización de actividades de
CoA-transferasa y PHA-sintasa para
producir PHAs de longitud de cadena corta en organismos
hospedadores, pero no describe el uso combinado de
3-hidroxiacil-ACP-tioesterasas
y CoA-transferasas para convertir
3-hidroxiacil-ACP en
3-hidroxiacil-CoA. Para obtener una
CoA-transferasa capaz de transferir CoA desde un
CoA-tioéster fácilmente asequible en el organismo
hospedador en un ácido graso de longitud de cadena media, pueden
construirse bibliotecas de DNA genómico y cribarse en bacterias
PHA-menos que expresan una
PHA-sintasa de longitud de cadena media adecuada y
una
3-hidroxiacil-ACP-tioesterasa.
Alternativamente, el desordenamiento de los genes de las
CoA-transferasas existentes, tales como el gen
orfZ de Clostridium kluyveri (Sohling, B. &
Gottschalk, G.J. Bacteriol. 1996, 178, 871-880),
puede utilizarse para crear nuevas CoA-transferasas
con la capacidad de transferir CoA desde un
CoA-tioéster fácilmente disponible en el organismo
hospedador a un ácido graso de longitud de cadena media. Nuevas
CoA-transferasas que contienen la actividad deseada
pueden cribarse en bacterias PHA-menos que expresan
una PHA-sintasa de longitud de cadena media
adecuada y una
3-hidroxiacil-ACP-tioesterasa.
Ha sido desarrollada una metodología para la
manipulación genética de plantas a fin de producir PHAs que
comprenden (D)-3-hidroxiácidos de
longitud de cadena media por caminos de biosíntesis de ácidos grasos
mediante la expresión de una enzima que tenga la actividad
catalítica de
3-hidroxiacil-ACP-tioesterasa,
una PHA-sintasa capaz de incorporar
3-hidroxiácidos de cadena media, y una enzima que
tenga actividad de
(D)-3-hidroxiacil-CoA-sintetasa
o actividad de CoA-transferasa. La metodología
descrita en esta memoria es útil para la manipulación genética de
cosechas tanto de semillas oleaginosas como de biomasa para producir
los biopolímeros PHA deseados.
Se describen también en esta memoria métodos y
materiales para identificación de
acil-CoA-sintetasa como una
actividad enzimática cuya presencia es necesaria para producción de
polímeros por caminos de biosíntesis de ácidos grasos en E.
coli recombinante que expresa phaG y una
PHA-sintasa de longitud de cadena media (PhaC).
Específicamente, se demuestra que la co-expresión de
PhaG, una enzima caracterizada previamente como una
3-hidroxiacil-ACP-CoA-transferasa
(patente U.S. No. 5.750.848) y PhaC en E. coli y
Arabidopsis thaliana no produce inclusión intracelular
alguna de polímero. En el sistema bacteriano, se observa una
excreción de 3-hidroxiácidos en el sobrenadante de
cultivo, lo que indica que está ocurriendo una desviación de carbono
catalizada por PhaG de la biosíntesis de ácidos grasos. La
co-expresión de alkK, una
acil-CoA-sintetasa de P.
oleovorans que posee actividad sobre los
3-hidroxiácidos grasos de longitud de cadena media,
da como resultado la acumulación intracelular de polímero de
longitud de cadena media y una reducción en la cantidad de
3-hidroxiácidos excretados en el medio de cultivo.
La capacidad de las células E. coli que expresan phaC y
phaG para producir polímero solamente después de la expresión de
alkK sugiere que phaG se comporta como una
3-hidroxiacil-ACP-tioesterasa,
no como una
acil-ACP-CoA-transferasa
in vivo en E. coli. Las plantas que expresan phaG
y phaC pueden requerir también actividad suplementaria de
acil-CoA-sintetasa para la
producción exitosa de PHA por los caminos de biosíntesis de los
ácidos grasos.
Se conocen en la técnica
PHA-sintasas y pueden desarrollarse también a partir
de otras PHA-sintasas por técnicas conocidas como
se describe por ejemplo en la patente U.S. No. 6.143.952.
Los constructos de DNA descritos en esta memoria
incluyen vectores de transformación capaces de introducir
transgenes en plantas. Existen muchas opciones de vectores
disponibles de transformación en plantas (Gene Transfer to Plants
(1995), Potrykus, I. y Spangenberg, G. eds.
Springer-Verlag Berlín, Heidelberg, Nueva York;
"Transgenic Plants: A Production System for Industrial and
Pharmaceutical Proteins" (1996), Owen, M.R.L. y Pen, J. eds.
John Wiley & Sons Ltd. Inglaterra y Methods in Plant Molecular
Biology- a laboratory course manual (1995), Maliga, P., Klessig,
D.F., Cashmore, A. R., Gruissem, W. y Vamer, J.E. eds. Cold Spring
Laboratory Press, Nueva York). En general, los vectores de
transformación de plantas comprenden una o más secuencias
codificantes de interés bajo el control de transcripción de
secuencias reguladoras 5' y 3', que incluyen un promotor, una señal
de terminación de la transcripción y/o poliadenilación y un gen
marcador seleccionable o susceptible de cribado. Los requisitos
usuales para secuencias reguladoras 5' incluyen un promotor, un
sitio de iniciación de la transcripción, y una señal de
procesamiento de RNA. Las secuencias reguladoras 3' incluyen una
señal de terminación de transcripción y/o una señal de
poliadenilación.
Un gran número de promotores de plantas se
conocen y dan como resultado la expresión constitutiva, o regulada
ambiental o experimentalmente, del gen de interés. Los promotores de
plantas pueden seleccionarse para controlar la expresión del
transgén en diferentes tejidos u orgánulos de la planta, para todo
lo cual se conocen métodos por los expertos en la técnica (Gasser y
Fraley, 1989, Science 244; 1293-1299).
Promotores constitutivos de plantas adecuados incluyen el promotor
35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) y promotores CaMV
mejorados (Odell et al., 1985, Nature, 313: 810), el
promotor actina (McElroy et al., 1990, Plant Cell 2:
163-171), el promotor AdhI (Fromm et al.,
1990, Bio/Technology 8: 833-839; Kyozuka et
al., 1991, Mol. Gen. Genet. 228: 40-48),
promotores ubiquitina, el promotor del virus del mosaico de la
escrofularia, el promotor manopina-sintasa, el
promotor nopalina-sintasa y el promotor
octopina-sintasa. Sistemas promotores regulables
útiles incluyen el promotor de espinaca inducible por nitrato, los
promotores del choque térmico, la subunidad pequeña de los
promotores de
ribulosa-bifosfato-carboxilasa y
promotores químicamente inducibles (U.S. 5.364.780; U.S. 5.364.780;
U.S. 5.777.200).
En una realización, una enzima que tiene la
actividad catalítica de
3-hidroxiacil-ACP-tioesterasa
y una acil-CoA-sintetasa se
utilizan para convertir
3-hidroxiacil-ACPs en
3-hidroxiacil-CoAs. La coexpresión
de una PHA-sintasa permite la formación de PHA. En
una realización, se utiliza la actividad endógena del organismo
hospedador acil-CoA-sintetasa, si
está presente en cantidades suficientes. En una realización
alternativa, la actividad de
acil-CoA-sintetasa del organismo
hospedador se complementa por sobreexpresión de un gen que codifica
acil-CoA-sintetasa, tal como el gen
alkK de Pseudomonas oleovorans (van Beilen, J. B.,
Eggink, G., Enequist, H., Bos, R., Witholt, B. Molecular
Microbiology 1992, 6, 3121-3136).
En otra realización, se utilizan una enzima que
tiene la actividad catalítica de
3-hidroxiacil-ACP-tioesterasa
y una enzima que codifica actividad de
acil-CoA-transferasa. En esta
realización, la acil-CoA-transferasa
cataliza la transferencia de CoA desde una acil-CoA
fácilmente disponible en el organismo hospedador al
3-hidroxiácido graso, dando como resultado la
formación de 3-hidroxiacil-CoA. La
coexpresión de una PHA-sintasa permite la formación
de PHA.
En una realización, genes que codifican enzimas
con actividades relacionadas con
3-hidroxiacil-ACP-tioesterasas,
o genes que codifican enzimas con cierta homología a PhaG, se
modifican por evolución molecular o técnicas de desordenamiento de
genes para producir nuevas enzimas con actividades de
3-hidroxiacil-ACP-tioesterasa
de longitud de cadena media. La patente U.S. No. 5.750.848 describe
la producción de variantes de phaG, pero no describe la
modificación de enzimas relacionadas para producir nueva actividad
de
3-hidroxiacil-ACP-tioesterasa.
En una realización de este aspecto de la invención, los genes
rhlAB de Pseudomonas aeruginosa, que codifican
actividad de ramnosil-transferasa (Ochsner, U.A.,
Fiechter, A., Reiser, J.J., Biol. Chem. 1994, 269,
19787-19795), se modifican por desordenamiento
génico. Específicamente, las regiones codificantes rhlAB,
rhlA, o rhlB, o segmentos de cualquiera de las regiones
codificantes arriba mencionadas, se modifican por desordenamiento
génico a fin de producir enzimas que codifican actividades de
3-hidroxiacil-ACP-tioesterasa
de longitud de cadena media. Las bibliotecas de genes desordenados
pueden testarse respecto a complementación de cepas mutantes phaG o
en bacterias heterólogas que expresan una
PHA-sintasa adecuada y una
3-hidroxiacil-CoA-sintetasa.
En una realización, los transgenes se expresan
únicamente en la hoja. Un promotor adecuado para este propósito
incluiría el promotor C4PPDK precedido por el intensificador 35S
(Sheen, J. EMBO, 1993, 12, 3497-3505) o cualquier
otro promotor que sea útil para expresión en hojas. En una
realización de la expresión de transgenes específicos de hoja, el
extremo 5' de los transgenes que codifican una enzima que tiene la
actividad catalítica de
3-hidroxiacil-ACP-tioesterasa,
PHA-sintasa y actividades de
acil-CoA-sintetasa se modifican por
ingeniería genética para incluir secuencias que codifican péptidos
de direccionamiento de cloroplastos enlazados en marco con el
transgén. Una secuencia de direccionamiento a los cloroplastos es
cualquier secuencia peptídica que pueda direccionar una proteína a
los cloroplastos o plástidos, tales como el péptido de tránsito de
la subunidad pequeña de la
ribulosa-bifosfato-carboxilasa de
alfalfa. El transporte de todos los polipéptidos al cloroplasto dará
como resultado la acumulación de polímero en el cloroplasto. En una
realización, se utiliza una CoA-transferasa
direccionada a los cloroplastos en lugar de una
acil-CoA-sintetasa. En esta
realización, la CoA-transferasa cataliza la
transferencia de CoA desde una acil-CoA presente en
el organismo hospedador al 3-hidroxiácido graso que
forma la unidad monómera para PHA-sintasa.
En otra realización de la expresión de
transgenes específicos de las hojas, únicamente se modifica por
ingeniería genética el transgén phaG para incluir una
secuencia que codifica un péptido de direccionamiento a los
cloroplastos. Un transgén que codifica phaC no está direccionado a
un orgánulo que permita el transporte del polipéptido al citosol.
En esta realización, los 3-hidroxiácidos grasos de
longitud de cadena media se desvían de la biosíntesis de los ácidos
grasos por PhaG y son exportados predominantemente del cloroplasto
al citosol de tal modo que los mismos pueden incorporarse en
triacilgliceroles o dirigirse a los peroxisomas para degradación.
La presencia de PhaC citosólico hace posible la conversión de una
porción de los ácidos grasos no usuales en PHAs antes de su
degradación o incorporación en lípidos. En una realización, la
acil-CoA-sintetasa endógena de la
planta es complementada por la expresión de un transgén que codifica
una acil-CoA-sintetasa dirigida al
citosol. En una realización alternativa de la invención, se utiliza
una CoA-transferasa en lugar de una
acil-CoA-sintetasa.
En una realización alternativa, se expresan
transgenes únicamente en las semillas en desarrollo. Promotores
adecuados para este propósito incluyen el promotor del gen napín
(U.S. 5.420.034; U.S. 5.608.152), y el promotor
acil-CoA-carboxilasa (U.S.
5.420.034; U.S. 5.608.152), el promotor 2S de albúmina, el promotor
de la proteína de almacenamiento en la semilla, el promotor
faseolina (Slightom et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
80: 1897-1901), el promotor oleosina (Plant et
al., 1994, Plant Mol. Biol. 25: 193-205; Rowley
et al., 1997, Biochim. Biophys. Acta.1345:
1-4; U.S. 5.650.554; PCT WO 93/20216), el promotor
zeína, el promotor glutelina, el promotor de
almidón-sintasa, el promotor de la enzima de
ramificación del almidón, etc.
En una realización de la expresión de transgenes
específica de semillas, el extremo 5' de los transgenes que
codifican una enzima que tiene la actividad catalítica de
3-hidroxiacil-ACP-tioesterasa,
PHA-sintasa, y
acil-CoA-sintetasa se modifica por
ingeniería genética para incluir secuencias que codifican péptidos
de direccionamiento a los plástidos enlazados en marco con el
transgén. Una secuencia de direccionamiento a los plástidos es
cualquier secuencia peptídica que puede direccionar una proteína a
los cloroplastos o plástidos. La dirección de todos los
polipéptidos al plástido dará como resultado acumulación de polímero
predominantemente en el plástido de la semilla. En una realización
alternativa, se utiliza una CoA-transferasa
direccionada a los plástidos en lugar de una
acil-CoA-sintetasa.
En otra realización de la expresión específica
de semilla, únicamente el transgén phaG se modifica por
ingeniería genética para incluir una secuencia que codifica un
péptido de direccionamiento a los plástidos. Un transgén que
codifica phaC no está direccionado a un orgánulo que permita el
transporte del polipéptido al citosol. En esta realización, los
3-hidroxiacil-ácidos grasos desviados de la
biosíntesis de los ácidos grasos por PhaG se exportan fuera del
plástido y se convierten en PHAs del citosol de la semilla en
desarrollo por el PhaC citosólico. En una realización, la
acil-CoA-sintetasa endógena de la
planta es complementada por expresión de un transgén que codifica
una acil-CoA-sintetasa dirigida al
citosol. En una realización alternativa, se utiliza una
CoA-transferasa en lugar de una
acil-CoA-sintetasa.
En una realización alternativa, la producción de
PHA puede direccionarse a los peroxisomas de hojas o semillas. En
esta realización, el extremo 5' del transgén phaG se modifica
por ingeniería genética a fin de incluir una secuencia que codifica
un péptido de direccionamiento a los cloroplastos o plástidos
enlazado en marco con el transgén. El transgén phaC está
enlazado en marco con una secuencia adecuada de direccionamiento a
los peroxisomas N-terminal o
C-terminal. Una señal de direccionamiento a los
peroxisomas es cualquier secuencia peptídica que pueda direccionar
una proteína a los peroxisomas de las hojas o las semillas, tal como
los 34 aminoácidos del terminal C de la
isocitrato-liasa de Brassica napus (Olsen, L.
J., Ettinger, W. F., Damsz, B., Matsudaira, K., Webb, M. A.,
Harada, J. J. 1993, Plant Cell, 5, 941-952). Los
3-hidroxiacilácidos grasos desviados del
cloroplasto o de la biosíntesis de ácidos grasos de los plástidos
por phaG son exportados del orgánulo y son, o bien transportados a
los peroxisomas para degradación, o incorporados en
triacilglicéridos. La presencia de phaC direccionado
peroxisómicamente convertiría los 3-hidroxiácidos
grasos que entran en los peroxisomas en PHAs. La incorporación de
3-hidroxiácidos grasos de longitud de cadena media
en triacilglicéridos en la semilla podría producir nuevos aceites
vegetales. En una realización, la
acil-CoA-sintetasa endógena de la
planta es complementada por la expresión de un transgén que codifica
una acil-CoA-sintetasa dirigida a
los peroxisomas. En una realización alternativa, se utiliza una
CoA-transferasa direccionada a los peroxisomas en
lugar de una acil-CoA-sintetasa.
En el extremo 3' de cada transcrito, puede
modificarse por ingeniería genética una señal de poliadenilación.
Una señal de poliadenilación hace referencia a cualquier secuencia
que pueda dar como resultado la poliadenilación del mRNA en el
núcleo antes de la exportación del mRNA al citosol, tal como la
región 3' de nopalina-sintasa (Bevan, M., Barnes,
W. M. Chilton, M. D. Nucleic Acids Res. 1983, 11,
369-385).
En una realización alternativa, los genes pueden
manipularse genéticamente de tal modo que la expresión se consigue
a partir de un promotor y una señal de poliadenilación. En una
realización, los genes pueden expresarse como una poliproteína y
escindirse en secuencias codificantes maduras por la acción de una
proteasa viral (Dasgupta, S., Collins, G. B., Hunt, A. G. The Plant
Journal, 1998, 16, 107-116; U.S. 5.846.767). En una
realización alternativa, cada región codificante va precedida por un
sitio de entrada interno de ribosoma que permite la iniciación de
la traducción en sitios múltiples en un solo mRNA policistrónico (WO
98/54342).
Genes marcadores seleccionables útiles en la
práctica de la invención descrita incluyen el gen de
neomicin-fosfotransferasa nptII (U.S. 5.034.322,
U.S. 5.530.196), el gen de resistencia a la higromicina (U.S.
5.668.298), y el gen bar que codifica resistencia a fosfinotricina
(U.S. 5.276.268). EP 0 530 129 A1 describe un sistema positivo de
selección que permite que las plantas transformadas superen en
crecimiento a las líneas no transformadas por expresión de un
transgén que codifica una enzima que activa un compuesto inactivo
añadido al medio de cultivo. La patente U.S. No. 5.767.378 describe
el uso de manosa o xilosa para la selección positiva de plantas
transgénicas. Genes marcadores susceptibles de cribado útiles
incluyen el gen de \beta-glucuronidasa (Jefferson
et al., 1987, EMBO J. 6:3901-3907;
U.S. 5.268.463) y el gen de la proteína fluorescente verde nativo o
modificado (Cubitt et al., 1995, Trends Biochem. Sci.
20:488-455; Pang et al., 1996, Plant
Physiol. 112:893-900). Algunos de estos
marcadores tienen la ventaja añadida de introducir un rasgo, v.g.
resistencia a los herbicidas, en la planta de interés,
proporcionando un valor agronómico adicional en el lado de
aporte.
La transformación de hospedadores agronómicos
adecuados de plantas utilizando estos vectores puede realizarse por
una gama de métodos y tejidos vegetales. Plantas adecuadas incluyen,
pero sin carácter limitante, cosechas de biomasa tales como tabaco,
alfalfa, y hierba de pan, y cosechas de semillas oleaginosas tales
como maíz, soja, algodón, girasol, palma, coco, cártamo, lino, y
cacahuete, así como mostazas con inclusión de Sinapis alba,
y la familia Brassica con inclusión de napus, rappa, sp.
carinata y juncea. Tejidos adecuados para transformación que
utilizan estos vectores incluyen protoplastos, células, tejido de
callo, discos de hoja, polen, meristemos, etc. Procedimientos de
transformación adecuados incluyen transformación mediada por
Agrobacterium, biolística, microinyección, electroporación,
transformación de protoplastos mediada por polietilenglicol,
transformación mediada por liposomas, transformación mediada por
fibras de silicio (U.S. 5.464.765) etc. (Gene Transfer to Plants
(1995), Potrykus, I. y Spangenberg, G. eds. Springer -Verlag Berlín,
Heidelberg, Nueva York; "Transgenic Plants: A Production System
for Industrial and Pharmaceutical Proteins" (1996), Owen, M.R.L.
y Pen, J. eds. John Wiley & Sons Ltd. Inglaterra y Methods in
Plant Molecular Biology-a laboratory course manual
(1995), Maliga, P., Klessig, D.F., Cashmore, A. R., Gruissem, W. y
Varner, J.E. eds. Cold Spring Laboratory Press, Nueva York). La
transformación de monocotiledóneas, tales como maíz, se describe en
la patente U.S. No. 5.591.616.
Con objeto de generar plantas transgénicas
utilizando los constructos, después de la transformación por uno
cualquiera de los métodos arriba descritos, pueden utilizarse los
procedimientos siguientes para obtener una planta transformada que
expresa los transgenes: seleccionar las células de la planta que se
han transformado en un medio selectivo; regenerar las células de la
planta que se han transformado para producir plantas diferenciadas;
seleccionar plantas transformadas que expresan el transgén de tal
modo que se obtiene el nivel de polipéptido(s)
deseado(s) en el tejido y localización celular deseados.
Para las cosechas específicas útiles, se han
establecido procedimientos de transformación (Gene Transfer to
Plants (1995), Potrykus, I. y Spangenberg, G. eds. Springer -Verlag
Berlín, Heidelberg, Nueva York; "Transgenic Plants: A Production
System for Industrial and Pharmaceutical Proteins" (1996), Owen,
M.R.L. y Pen, J. eds. John Wiley & Sons Ltd. Inglaterra y
Methods in Plant Molecular Biology-a laboratory
course manual (1995), Maliga, P., Klessig, D.F., Cashmore, A. R.,
Gruissem, W. y Vamer, J.E. eds. Cold Spring Laboratory Press, Nueva
York).
El método descrito en esta memoria puede
utilizarse también para aumentar los niveles de hidroxiácidos o
ácidos grasos C8 y C10 de una composición de aceites vegetales
mediante, por ejemplo, a) expresión de un transgén que codifica una
enzima que tiene la actividad catalítica de
3-hidroxiacil-ACP-tioesterasa,
y b) cultivo de la planta en condiciones apropiadas para la
producción de la composición de aceites vegetales.
Los ejemplos que siguen ilustran adicionalmente
la modificación de productores de PHA bacterianos no nativos y
plantas para producción de PHA de longitud de cadena media por
caminos de biosíntesis de ácidos grasos.
\vskip1.000000\baselineskip
El gen codificante de PhaG se aisló por PCR a
partir de DNA genómico de Pseudomonas putida utilizando los
iniciadores phaGF-EcoRI y phaGR-KpnI
y se clonó en los sitios EcoRI y KpnI del vector de expresión de
E. coli pTRCN formando el plásmido pMTX-phaG.
Se encontró que la secuencia de la inserción phaG en
pMTX-phaG (SEQ ID NO: 9) era idéntica a la secuencia
indicada en GenBank (Accession # AF052507).
El plásmido pSU18-KPS1.2N #3,
que expresaba la sintasa 1 de Pseudomonas oleovorans, se
construyó a partir del plásmido pKPS1.2 utilizando un procedimiento
de etapas múltiples como sigue. El plásmido pKPS1.2 contiene
phaC con su sitio de fijación de ribosoma nativo en el vector
pKK223-3 (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway,
NJ). El fragmento es equivalente a las bases 535 a 2241 del
fragmento EcoRI de 6459 kb descrito en WO 91/00917. El fragmento
PhaC de pKPS1.2 que contenía los sitios flanqueantes BamHI y HindIII
se subclonó en pTRCN formando pTRCNKPS1.2. El análisis por
SDS-PAGE de los lisados brutos de E. coli que
expresaban pTRCN-KPS1.2 no exhibía expresión
detectable alguna de la sintasa.
Para optimizar ulteriormente la expresión de la
sintasa, se dispuso un sitio de fijación de ribosoma de E.
coli óptimo aguas arriba del codón inicial de la sintasa
utilizando PCR. Se amplificó un fragmento de 0,43 kb del plásmido
pTRCN-KPS1.2 utilizando los iniciadores
Posyn1-N y Posyn1-nrSacII y se clonó
en los sitios EcoRI/SmaI del vector pTRCN como un fragmento de
extremos romos EcoRI.
La secuenciación del DNA verificó que la
secuencia de tipo salvaje del fragmento PCR había sido aislada. Se
reconstruyó el gen intacto de sintasa por subclonación de un
fragmento de 1,2 kb de sintasa C-terminal
SacII/HindIII en los sitios SacII/HindIII inmediatamente detrás del
fragmento PCR formando el plásmido pTRCN-KPS1.2N. La
secuencia de DNA del plásmido pTRCN-KPS1.2N se
muestra en SEQ ID NO: 10. (pKPS1.2N). El análisis
SDS-PAGE de los lisados brutos de E. coli
que expresaban pTRCN-KPS1.2 demostró la expresión de
una banda a aproximadamente 60 kDa que no estaba presente en los
lisados brutos de la cepa de control que contenía el vector pTRCN
solo.
Se creó el plásmido pSU-PhaC_{P
. o . }trc.PhaG, que expresaba a la vez PhaC y PhaG de un solo
plásmido utilizando el procedimiento de clonación multietápico
siguiente. Un fragmento EcoRI/HindIII de 1,64 kb que contenía un
sitio de fijación de ribosoma fuerte de E. coli y la región
codificante entera de la sintasa se aisló del plásmido
pTRCN-KPS1.2N y se clonó en los sitios EcoRI y
HindIII de pSU18 formando el plásmido pSU18-KPS1.2N
#3. El vector pSU18 es un plásmido de número de copias medio
derivado de pSU2718 (Martínez, E.; Bartolomé, B.; de la Cruz, F.
Gene 1988, 68, 159) y contiene el origen de replicación p15A y el
marcador de resistencia a cloranfenicol. Un fragmento que
codificaba el promotor trc y phaG del plásmido
pMTX-phaG se insertó en
pSU18-KPS1.2N #3 como sigue. Se generó un fragmento
de 1002 kb por PCR, utilizando el iniciador
trc-PhaG.c, el iniciador
trc-PhaG.r, y el molde pMTX-PhaG, y
se clonó en los sitios HindIII de pSU18-KPS1.2N #3.
El plásmido resultante pSU-PhaC_{P . o .
}trc.PhaG contiene phaC detrás del promotor lac de
pSU18 y phaG detrás del promotor trc. La secuencia de
la inserción PhaC._{P . o . }trc.PhaG para el plásmido
pSU-PhaC_{P . o . }trc.PhaG se muestra en SEQ ID
NO: 11.
\vskip1.000000\baselineskip
En un intento de producir PHA en E. coli
utilizando glucosa como fuente de carbono, la cepa hospedadora
JM109 (Promega, Madison, WI) se transformó con plásmidos
seleccionados del grupo siguiente: pSU-PhaC._{P . o
. }trc.PhaG (sintasa de longitud de cadena media y plásmido de
expresión de PhaG), pSU18 (vector de control para
pSU-PhaC._{P . o . }trc.
PhaG), y pTRCN (plásmido en el cual podrían insertarse genes adicionales). Se inocularon cultivos iniciales (5 ml) de JM109/pTRCN/pSU18 y JM109/pSU-PhaC._{P . o . }trc.PhaG con una sola colonia en medio LB (Difco) que contenía ampicilina (100 mg/l) y cloranfenicol (25 mg/l). Los cultivos se dejaron crecer a 30ºC durante una noche. Los cultivos iniciales se diluyeron (1:100) en medio LB (5 ml) que contenía ampicilina y cloranfenicol y se dejaron crecer durante 10 horas a 30ºC con agitación a 250 rpm. Se cosecharon los cultivos y las células se lavaron dos veces con 2,5 ml de sales de medio E (Vogel, H.J. Bonner D.M., J. Biol. Chem. 1956, 218, 97-106). Se resuspendieron los sedimentos de células en 2,5 ml de sales de medio E y se utilizó 1 ml de la suspensión para inocular matraces para la expresión de los genes. Los cultivos se realizaron en matraces Erlenmeyer de 500 ml que contenían 100 ml de sales de medio E, 1,5% de glucosa, 1 mg/l de tiamina, 100 mg/l de ampicilina, y 25 mg/l de cloranfenicol. Los matraces se incubaron a 30ºC hasta que la absorbancia a 600 nm alcanzó 0,4. La expresión de los genes se indujo con IPTG 0,4 mM y los matraces de incubaron a 30ºC durante 48 horas más antes de la cosecha.
PhaG), y pTRCN (plásmido en el cual podrían insertarse genes adicionales). Se inocularon cultivos iniciales (5 ml) de JM109/pTRCN/pSU18 y JM109/pSU-PhaC._{P . o . }trc.PhaG con una sola colonia en medio LB (Difco) que contenía ampicilina (100 mg/l) y cloranfenicol (25 mg/l). Los cultivos se dejaron crecer a 30ºC durante una noche. Los cultivos iniciales se diluyeron (1:100) en medio LB (5 ml) que contenía ampicilina y cloranfenicol y se dejaron crecer durante 10 horas a 30ºC con agitación a 250 rpm. Se cosecharon los cultivos y las células se lavaron dos veces con 2,5 ml de sales de medio E (Vogel, H.J. Bonner D.M., J. Biol. Chem. 1956, 218, 97-106). Se resuspendieron los sedimentos de células en 2,5 ml de sales de medio E y se utilizó 1 ml de la suspensión para inocular matraces para la expresión de los genes. Los cultivos se realizaron en matraces Erlenmeyer de 500 ml que contenían 100 ml de sales de medio E, 1,5% de glucosa, 1 mg/l de tiamina, 100 mg/l de ampicilina, y 25 mg/l de cloranfenicol. Los matraces se incubaron a 30ºC hasta que la absorbancia a 600 nm alcanzó 0,4. La expresión de los genes se indujo con IPTG 0,4 mM y los matraces de incubaron a 30ºC durante 48 horas más antes de la cosecha.
Las células se separaron de los sobrenadantes de
cultivo por centrifugación a 12.000 g. Los sedimentos de células se
lavaron dos veces con 25 ml de sales de medio E y se secaron durante
una noche en un liofilizador. Una porción del sobrenadante de
células (3 ml) se congeló en N_{2} líquido y se evaporó a sequedad
en un liofilizador. Los sedimentos de células, las muestras del
sobrenadante de células, y los estándares de ácidos
3-hidroxialcanoicos
(3-hidroxihexanoato,
3-hidroxioctanoato,
3-hidroxidecanoato,
3-hidroxidodecanoato) se prepararon para análisis
por cromatografía de gases por conversión de los mismos en los
ésteres butílicos correspondientes como sigue. Se añadió una parte
alícuota (2 ml) de un reactivo de butanólisis [9 partes de butanol:
1 parte de HCl:1 mg/ml de estándar interno de ácido metilbenzoico] a
las muestras en un vial con tapón roscado y las muestras se
incubaron a 110ºC durante 2 horas. Los viales se recogieron y se
añadió agua (3 ml). Las muestras se agitaron tumultuosamente y las
capas acuosa y orgánica se separaron por centrifugación en una
centrífuga de sobremesa. Se analizó una parte alícuota de la fase
orgánica (1 \mul) en una columna GC capilar de sílice fundida
SPB-1 (30 m; 0,32 mm DI; película de 0,25 \mum;
Supelco; Bellefonte, Pa.) conectada a un cromatógrafo de gases
Hewlett Packard utilizando una relación de división de 1:50 y un
caudal de 2 ml/min. El perfil de temperatura para el análisis era
como sigue: 80ºC, 2 min; 10ºC por min hasta 250ºC; 250ºC, 2 min.
El análisis GC de los sedimentos de células
enteras de las cepas JM109/pSU-PhaC._{P . o .
}trc.PhaG/pTRCN, que expresaban PhaC y PhaG, y JM109/pSU18/pTRCN,
que contenían solamente vectores de control, no produjo pico alguno
correspondiente a los ésteres butílicos de las unidades monómeras de
PHA. Sin embargo, se observaron picos que poseían tiempos de
retención comparables a 3-hidroxioctanoato de butilo
y 3-hidroxidecanoato de butilo en los cromatogramas
GC de los sobrenadantes JM109/pSU-PhaC._{P . o .
}trc, PhaG que se habían derivatizado por butanólisis. Se encontró
que los picos contenían 3-hidroxioctanoato de butilo
0,14 mM y 3-hidroxidecanoato de butilo 0,32 mM
después de comparación con picos que contenían cantidades conocidas
de ácido 3-hidroxioctanoico y ácido
3-hidroxidecanoico que se habían derivatizado por
butanólisis (Tabla 1). Los sobrenadantes de cultivo de la cepa
JM109/pSU18/pTRCN no contenían pico alguno correspondiente a los
ésteres butílicos de 3-hidroxiácidos (Tabla 1).
\vskip1.000000\baselineskip
Una conversión catalizada por PhaG de
3-hidroxiacil-ACPs en ácidos grasos
libres (Figura 1, Ruta B) en lugar de
3-hidroxiacil-CoAs (Figura 1, Ruta
A) podría proporcionar una explicación a la observación de
3-hidroxiacil-butil-ésteres en los
cromatogramas GC de los sobrenadantes de cultivo derivatizados de
cepas de E. coli que expresaban PhaG y PhaC. En los estudios
de acumulación de E. coli descritos en el Ejemplo 2, la
acil-CoA-sintetasa nativa de E.
coli no puede haber sido inducida en las condiciones de
crecimiento en medio mínimo empleadas debido a la represión de la
transcripción del gen codificante de la
acil-CoA-sintetasa (fadD) por
FadR, una proteína de E. coli que funciona como un regulador
de la transcripción (Black, P. N., DiRusso, C. C., Metzger, A. K.,
Heimert, T. L. J. Biol. Chem. 1992, 267,
25513-25520). Alternativamente, FadD puede no tener
especificidad de sustrato para los 3-hidroxiácidos
grasos de longitud de cadena media.
Para testar si la adición de una
acil-CoA-sintetasa podría promover
la formación de polímero, se amplificó una
acil-CoA-sintetasa citosólica,
codificada por alkK, (van Beilen, J. B.; Eggink, G.;
Enequist, H.; Bos, R.; Witholt, B. Mol. Microbiol. 1992, 6,
3121-3136) a partir de DNA genómico de
Pseudomonas oleovorans utilizando los iniciadores Posynrbs.c
y Posynrbs.r.
El producto PCR se digirió con EcoRI y BamHI y
se clonó en los sitios EcoRI y BamHI del vector de expresión pTRCN
formando el plásmido pTRCNalkK. La secuencia de alkK
en el constructo de expresión bacteriana pTRCNalkK se
muestra en SEQ ID NO: 12. La comparación del producto PCR con la
secuencia de alkK en GenBank (Acceso a GenBank # X65936)
reveló dos diferencias. Se observó una "t" en lugar de una
"c" (346 bases desde la "A" del "ATG") que daba como
resultado fenilalanina en lugar de leucina en la secuencia
codificante. Se observó una "g" en lugar de una "a" (386
bases desde la "A" del "ATG") que daba como resultado la
observación de una arginina en la secuencia codificante en lugar de
una histidina. Seis productos PCR separados contenían ambas
discrepancias de secuencia, lo que sugería que las mismas no eran
mutaciones introducidas por PCR, sino que eran reflejo de la
secuencia codificante verdadera del gen utilizado como molde en la
reacción PCR.
La actividad de
acil-CoA-sintetasa de alkK se
estimó utilizando el procedimiento siguiente. Se prepararon
cultivos iniciales de 5 ml de DH5\alpha/pTRCN y
DH5\alpha/pTRCN-AlkK en 2XYT que contenía 100 mg/l
de ampicilina. Los cultivos se incubaron con agitación mediante
sacudidas a 30ºC durante 16 horas. El cultivo se diluyó en relación
1 a 100 en 100 ml de 2XYT en un matraz Erlenmeyer 250 ml y las
células se incubaron a 30ºC hasta que la absorbancia a 600 nm era
aproximadamente 0,6. Se indujo la expresión génica con IPTG 0,4 mM
y los matraces se llevaron de nuevo a 30ºC durante 4 horas. Se
recogieron las células por centrifugación, se resuspendieron en
tampón Tris-Cl 10 mM (pH 7,5), y se disgregaron por
tratamiento mediante ultrasonidos. La actividad de
acil-CoA-sintetasa se estimó por
monitorización del consumo de coenzima A a 410 nm utilizando
reactivo de Ellman [ácido
5,5'-ditiobis(2-nitrobenzoico),
DTNB] (Ellman, G.L. 1959, Arch. Biochem. Biophys. 82,
70-77). La mezcla de ensayo (500 ml) contenía
KH_{2}PO_{4} 200 mM (pH 7), CoA 7,5 mM, ATP 3,75 mM, MgCl_{2}
5 mM, ácidos grasos 4,2 mM y enzima. Se utilizaron ácido octanoico y
ácido 3-hidroxioctanoico como los sustratos de
ácidos grasos en la reacción. La reacción se efectuó a la
temperatura ambiente y se inició por la adición de enzima. Se
separaron partes alícuotas (10 \mul) cada 30 segundos y se
extinguieron en 140 \mul de ácido tricloroacético al 5%. Las
proteínas precipitadas se separaron por centrifugación en una
microcentrífuga durante 1 min y se diluyó una parte alícuota (100
\mul) del sobrenadante en 690 \mul de KPi 500 mM (pH 7,4). Se
añadió una parte alícuota de stock de DTNB [10 \mul y una solución
stock 10 mM en KPi 500 mM (pH 7,4)] y las muestras se incubaron a
la temperatura ambiente durante 2 minutos. La cantidad de CoA
consumida en cada momento de la reacción se cuantificó a partir de
los valores de absorbancia a 410 nm (\varepsilon = 13,7 mM^{-1}
cm^{-1}) (Figuras 2 y 3).
La cepa DH5\alpha/pTRCN-alkK
poseía 0,22 U/mg de actividad cuando se ensayó respecto a actividad
de acil-CoA-sintetasa en presencia
de ácido octanoico utilizando el procedimiento de ensayo enzimático
arriba descrito. La cepa de control DH5\alpha/pTRCN contenía
0,00081 U/mg de actividad. Cuando se ensayó en presencia de ácido
3-hidroxioctanoico,
DH15\alpha/pTRCN-alkK poseía 0,21 U/mg de
actividad comparada con las 0,00063 U/mg observadas en la cepa de
control DH5\alpha/pTRCN.
Para testar si la presencia de una
acil-CoA-sintetasa citosólica hacía
posible la producción de polímero en cepas de E. coli que
expresaban PhaG y PhaC, se preparó la cepa
JM109/pSU-PhaC._{P . o .
}trc.PhaG/pTRCN-alkK para estudios de acumulación
de polímero como se describe en el Ejemplo 2. Los cromatogramas GC
de células enteras derivatizadas por butanólisis contenían 2,2% en
peso referido a células secas de polímero compuesto de 20,1% molar
de ácido 3-hidroxioctanoico y 79,9% molar de ácido
3-hidroxidecanoico (Tabla 1). La presencia de
ésteres 3-hidroxibutílicos en los cromatogramas GC
de los sobrenadantes de JM109/pSU-PhaC._{P . o .
}trc-PhaG/pTRCN-alkK disminuía
significativamente en comparación con los cromatogramas GC de
sobrenadantes de células JM109/pSU-PhaC._{P . o .
}trc-PhaG que producían 0,16 mM de
3-hidroxidecanoato de butilo y no producían cantidad
alguna de 3-hidroxi-octanoato de
butilo (Tabla 1). El requerimiento de actividad suplementaria de
acil-CoA-sintetasa en E. coli
para producción de polímero sugiere que PhaG posee únicamente
actividad de
3-hidroxi-acil-ACP-tioesterasa
in vivo (Figura 1, Ruta B).
Para determinar si la regulación por FadR de la
transcripción de acil-CoA-sintetasa
impedía la expresión de
acil-CoA-sintetasa en los
experimentos descritos en el Ejemplo 2, se utilizó la cepa
FadR^{-} LS5218 [fadR601, atoC 512 (con); cepa CGSC #6966;
Centro de Stocks Genéticos de E. coli, Universidad de Yale)
como cepa hospedadora para estudios de acumulación de polímero. Las
cepas LS5218/pSU18 (cepa de control) y
LS5218/pSU-PhaC._{P . o . }.trc.PhaG (cepa de
expresión de PhaC y PhaG) se prepararon y se cultivaron como se
describe en el ejemplo 2 con la excepción de que se utilizó 0,4% de
glucosa como la fuente de carbono en todos los experimentos que
implicaban LS5218. La cepa LS5218/pSU-PhaC._{P . o
. }.trc.PhaG (cepa de expresión de PhaC y PhaG) producía 4,5% en
peso de células secas de polímero constituido por 9,9% molar de
ácido 3-hidroxioctanoico y 90,1% molar de ácido
3-hidroxidecanoico (Tabla 1). No se observó
3-hidroxiácido de cadena de longitud media alguno en
el sobrenadante de cultivo (Tabla 1). La cepa LS5218/pSU18 (cepa de
control) no producía acumulaciones intracelulares de polímero y no
excretaba hidroxiácidos de longitud de cadena media en el
sobrenadante de cultivo (Tabla 1). Estos resultados sugieren que la
regulación por FadR de la transcripción de
acil-CoA-sintetasa puede haber
impedido la expresión de la
acil-CoA-sintetasa nativa en la cepa
JM109/pSU-PhaC._{P . o . }trc.PhaG (Ejemplo 2)
impidiendo la formación de polímero.
Se prepararon constructos para la expresión de
phaG y phaC para transformación a fin de determinar si PhaG y PhaC
en los cloroplastos de las plantas conducían a la producción de PHA
(Figuras 4A y 4B).
El plásmido
pCambia-Rbc.PhaG.PhaC1 (Figura 4A) es un derivado
del vector de transformación de plantas pCambia 2300 (Centro para
la Aplicación de Biología Molecular a la Agricultura Internacional,
Canberra, Australia) y contiene una casete de expresión que
codifica el promotor rubisco de alfalfa (Khoudi, H., Vézina, L.-P.,
Mercier, J., Castonguay, Y., Allard, G., Laberge, S. 1997. Gene 197:
343-351), la señal de direccionamiento a los
cloroplastos de rubisco de alfalfa (Khoudi, H., Vézina, L.-P.,
Mercier, J., Castonguay, Y., Allard, G., Laberge, S. 1997. Gene
197: 343-351), el gen que codifica PhaG, y la
secuencia de terminación de rubisco de alfalfa (Khoudi, H., Vézina,
L.-P., Mercier, J., Castonguay, Y., Allard, G., Laberge, S. 1997.
Gene 197: 343-351), seguido por una casete de
expresión que codifica el promotor rubisco de alfalfa, la señal de
direccionamiento de los cloroplastos de rubisco de alfalfa, el gen
codificante de PhaC1 de Pseudomonas aeruginosa (Timm, A.
& Steinbuchel, A. J. Appl. Microbiol. 1992, 209,
15-30), y la secuencia de terminación de rubisco de
alfalfa.
El plásmido
pBI-C4PPDK.PhaG.Rbc.PhaC (Figura 4B) es un derivado
del vector de transformación de plantas pBI101 (Clontech, Palo
Alto, California) y contiene una casete de expresión que codifica el
promotor 35S-C4PPDK (Sheen, J. EMBO 1993, 12,
3497-3505), la señal de direccionamiento a los
cloroplastos de rubisco de guisante con inclusión de DNA
codificante de los 24 aminoácidos N-terminales de la
proteína rubisco del guisante (Cashmore, A.R., 1983, en Genetic
Engineering of Plants, eds Kosuge, T., Meredith, C.P. &
Hollaender, A. (Plenum, Nueva York), p 29-38;
Nawrath, C., Poirier, Y. y Somerville, C., 1994, PNAS. 91:
12760-12764), y la secuencia de terminación Nos
(Bevan, M.; Barnes, W. M.; Chilton, M-D. Nucleic
Acids Research 1983, 11, 369-385), seguida por una
casete de expresión que codifica el promotor rubisco de alfalfa, la
señal de direccionamiento a los cloroplastos de rubisco de alfalfa,
el gen que codifica PhaC1 de Pseudomonas aeruginosa, y la
secuencia de terminación de rubisco de alfalfa.
Los plásmidos se transformaron en Arabidopsis
thaliana con la cepa de Agrobacterium GV3101/pMP90 (Konz,
C. & Schell, J. Mol. Gen. Genet. 1986, 204,
383-396) utilizando el procedimiento de inmersión
floral mediada por Agrobacterium de Clough y Bent (Clough,
S. J. & Bent, A. F. Plant Journal, 1998, 16,
735-743). Se aislaron semillas de silicuas maduras
y se extendieron en placas sobre medio de selección que contenía
1/2X Medio Orgánico Mínimo de Murashige (Life Technologies,
Rockville, MD), 0,7% agar, 1 x vitaminas B5 de Gamborg (Sigma, St.
Louis, MO), y 50 \mug/ml de kanamicina. Después de 7 días,
aparecieron sobre las placas plantas de semillero verdes,
resistentes a la selección de kanamicina, y plantas de semillero
blancas, sensibles a la selección de kanamicina. Las plantas de
semillero verdes se transfirieron a suelo y se dejaron madurar.
Para el análisis de polímero, las hojas de
plantas maduras (aproximadamente de 6 semanas) se cosecharon y
liofilizaron. Los tejidos secados (30-150 mg) se
trituraron y se añadió a cada tubo una parte alícuota de hexano (2
a 5 ml). Las muestras se calentaron a 70ºC durante 4 horas con
agitación tumultuosa ocasional. La fracción de hexano se separó del
material sólido celular por centrifugación y se transfirió a un tubo
limpio. Los restos residuales de células en el tubo se lavaron con
una parte alícuota adicional (1 ml) de hexano, y el lavado hexánico
se reunió con la fracción de hexano del paso anterior.
La fracción de hexano se purificó ulterior por
extracción (2 veces) con un volumen de una solución saturada de
NaHCO_{3} seguido por extracción con un volumen de H_{2}O. La
fracción de hexano (Fracción A) se evaporó a sequedad a 70ºC en una
campana de humos. Las fases de bicarbonato del paso previo se
agruparon, se acidificaron a pH 2 con HCl, se extrajeron con un
volumen de hexano, y la capa de hexano resultante (Fracción B) se
evaporó a sequedad a 70ºC en una campana de humos.
Las muestras de las Fracciones A y B, así como
muestras de estándares de ácidos 3-hidroxialcanoicos
(3-hidroxihexanoato,
3-hidroxioctanoato,
3-hidroxidecanoato,
3-hidroxidodecanoato), se prepararon para análisis
por cromatografía de gases mediante conversión de las mismas en los
ésteres butílicos correspondientes como se ha descrito previamente
en el Ejemplo 2. Los cromatogramas GC de las Fracciones A y B
preparadas a partir de 66 plantas transgénicas de
Arabidopsis transformadas con
pCambia-Rbc.PhaG.PhaC1 y 9 plantas transgénicas de
Arabidopsis transformadas con
pBI-C4PPDK.PhaG.Rbc.PhaC no contenían traza alguna
de polímero o monómero. El polímero, en caso de estar presente, se
esperaba en la Fracción A, mientras que el monómero, en caso de
estar presente, se esperaba en la Fracción B. Se realizó una
RT-PCR de las hojas de 12 plantas transgénicas
transformadas con pBI-C4PPDK.PhaG.Rbc.PhaC y 8
plantas transgénicas transformadas con
pCambia-Rbc.PhaG.PhaC1 utilizando el kit
RT-PCR ProSTAR HF de un solo tubo (Stratagene, La
Jolla, California) para las reacciones en cadena de polimerasa con
transcriptasa inversa. Cuatro de las 12 plantas
pBI-C4PPDK.PhaG.Rbc.PhaC contenían transcritos del
tamaño esperado tanto para phaG como para phaC (Tabla
2). Ninguna de 8 plantas pCambia-Rbc.PhaG.PhaC1
analizadas contenía productos del tamaño esperado tanto para
phaG como para phaC, aunque varias plantas contenían
transcritos para phaG o phaC (Tabla 2).
\vskip1.000000\baselineskip
La incapacidad de Arabidopsis thaliana
para producir PHA en cloroplastos a pesar de la producción exitosa
de transcritos de RNA para phaG y phaC sugiere que los
cloroplastos de las plantas pueden ser incapaces de completar con
éxito una reacción de
3-hidroxi-acil-ACP-CoA-transferasa
cuando PhaG se expresa en los cloroplastos. La complementación de
la actividad de
3-hidroxiacil-ACP-tioesterasa
de PhaG con una acil-CoA-sintetasa
que posee actividad sobre los 3-hidroxiácidos de
longitud de cadena media puede hacer posible la formación exitosa
de 3-hidroxiacil-CoAs para la
síntesis de PHA.
La secuencia de alkK en el constructo de
expresión de plantas pUC-C4PPDK.TS.AlkK se muestra
en SEQ ID NO: 13. Las secuencias "tctaga" (SEQ ID NO:
14) y "ggtacc" (SEQ ID NO: 15) son sitios de restricción
XbaI y KpnI, respectivamente, introducidos para propósitos de
clonación. El codón de comienzo "ATG" y el codón de parada
"TGA" se indican en letras mayúsculas. Las dos discrepancias de
secuencia observadas en el producto PCR se indican en letras
cursivas mayúsculas y negrilla. El plásmido
pUC-C4PPDK.TS.AlkK se utilizó como plásmido de
partida para crear otros constructos de expresión en plantas que
contenían alkK.
Para la producción de PHA en los cloroplastos de
las hojas, se diseñó el plásmido
pCambia-C4PPDK.TS.PhaG.TS.
AlkK.TS.PhaC_{P . o . } (Figura 5A). El plásmido pCambia-C4PPDK.TS.PhaG.TS.AlkK.TS.PhaC_{P . o . } contiene el promotor 35S-C4PPDK, la señal de direccionamiento a los cloroplastos de rubisco del guisante con inclusión de DNA codificante de los 24 aminoácidos N-terminales de la proteína rubisco del guisante, un fragmento codificante de PhaG, una secuencia de terminación Nos, el promotor 35S-C4PPDK, la señal de direccionamiento a los cloroplastos de rubisco del guisante con inclusión de DNA codificante de los 24 aminoácidos N-terminales de la proteína rubisco del guisante, un fragmento codificante de alkK, una secuencia de terminación Nos, el promotor 35S-C4PPDK, la señal de direccionamiento a los cloroplastos de rubisco del guisante con inclusión de DNA codificante de los 24 aminoácidos N-terminales de la proteína rubisco del guisante, un fragmento codificante de PhaC de Pseudomonas oleovorans y una secuencia de terminación Nos.
AlkK.TS.PhaC_{P . o . } (Figura 5A). El plásmido pCambia-C4PPDK.TS.PhaG.TS.AlkK.TS.PhaC_{P . o . } contiene el promotor 35S-C4PPDK, la señal de direccionamiento a los cloroplastos de rubisco del guisante con inclusión de DNA codificante de los 24 aminoácidos N-terminales de la proteína rubisco del guisante, un fragmento codificante de PhaG, una secuencia de terminación Nos, el promotor 35S-C4PPDK, la señal de direccionamiento a los cloroplastos de rubisco del guisante con inclusión de DNA codificante de los 24 aminoácidos N-terminales de la proteína rubisco del guisante, un fragmento codificante de alkK, una secuencia de terminación Nos, el promotor 35S-C4PPDK, la señal de direccionamiento a los cloroplastos de rubisco del guisante con inclusión de DNA codificante de los 24 aminoácidos N-terminales de la proteína rubisco del guisante, un fragmento codificante de PhaC de Pseudomonas oleovorans y una secuencia de terminación Nos.
El plásmido
pCambia-C4PPDK.TS.PhaG.TS.AlkK.TS.PhaC_{P . o . }
puede transformarse en Arabidopsis, como se ha descrito
previamente en el Ejemplo 5, o en Tabaco, como se describe en el
procedimiento siguiente. En una campana de flujo laminar en
condiciones asépticas, se esterilizan hojas de una planta de tabaco
durante 15 minutos en un vaso de precipitados de 1 litro que
contiene una solución de lejía al 10% y 0,1% de Tween 20. Las hojas
esterilizadas se lavan en 1 litro de agua durante 10 minutos, se
decanta el agua, y el paso de lavado se repite dos veces más. La
parte intacta de las hojas se corta en pequeños trozos con un
bisturí, evitando cualesquiera áreas lesionadas de las hojas. Una
parte alícuota (20 ml) de suspensión MS se mezcla con 5 ml de un
cultivo nocturno de la cepa GV3101/pMP90 de Agrobacterium
(Konz, C. & Schell, J. Mol. Gen. Genet. 1986, 204,
383-396) que lleva el constructo a transformar [la
suspensión MS contiene (por litro) 4,3 g de sales MS, 1 ml de
vitaminas B5 (Sigma, St. Louis, MO), 30 g de sacarosa, 2 mg de ácido
p-clorofenoxiacético, y 0,05 mg de cinetina, pH 5,8). Los
rozos de hojas de tabaco se introducen en la solución y se agitan
tumultuosamente durante unos cuantos segundos. Se retiran las
hojas, se limpian sobre un papel de filtro estéril, y se ponen en
una cápsula Petri para eliminar el exceso de solución de
Agrobacterium. Se añade una parte alícuota (1 ml) de cultivo
de células de tabaco encima del medio MS-104
solidificado en una cápsula Petri y se pone directamente un trozo
estéril de papel de filtro sobre la parte superior del cultivo [el
medio MS-104 contiene (por litro) 4,3 g de sales
MS, pH 5,8, 1 ml de vitaminas B5, 30 g de sacarosa, 1 mg de
bencil-aminopurina, 0,1 mg de ácido
naftalenoacético, y 8 g de Phytagar]. Los trozos de hoja de tabaco
se ponen sobre el filtro y se incuban durante 2 días a 25ºC. Los
trozos de hoja se transfieren con el haz hacia arriba a una cápsula
de Petri que contiene medio de selección MS y se prensan suavemente
en el medio [el medio de selección MS contiene (por litro) 4,3 g de
sales MS, pH 5,8, 1 ml de vitaminas B5, 30 g de sacarosa, 1 mg de
bencilaminopurina, 0,1 mg de ácido
naftaleno-acético, 500 mg de carbenicilina, 500 mg
de kanamicina y 6,5 g de Phytagar]. Las cápsulas se envuelven con
parafilm, y se incuban a 25ºC durante 3 semanas. Se transfieren las
hojas a un medio de selección MS reciente y se continúa la
incubación a 25ºC hasta que aparecen plántulas. Las plántulas se
separan del callo y se ponen en tubos de ensayo (24 x 3 cm) que
contienen 10 ml de medio de enraizamiento MS [el medio de
enraizamiento MS contiene (por litro) 4,3 g de sales MS, pH 5,8, 1
ml de vitaminas B5, 30 g de sacarosa, y 6,5 g de Phytagar]. Cuando
las raíces alcanzan 1 cm de longitud, las plantas transformadas se
transfieren al suelo y se cubren con una copa de plástico invertida
y transparente en la cual se ha practicado un orificio en el fondo.
después de 4 ó 5 días, se retira la copa y las plantas de tabaco
transformadas se cultivan en una Cámara de Crecimiento
Arabidopsis de Percival Scientific (23ºC, 70% de humedad,
días de 16 horas, noches de 8 horas). Las hojas de las plantas de
tabaco transgénicas pueden analizarse respecto a polímero
utilizando los procedimientos de extracción descritos previamente en
el Ejemplo 5 para plantas transgénicas de Arabidopsis.
Para la producción de PHA específica de siembra
basada en plástido, puede construirse un plásmido que contiene un
promotor específico de semilla, una señal de direccionamiento de
plástido fusionada a PhaG, una señal de poliadenilación, un
promotor específico de semilla, una señal de de direccionamiento de
plástido fusionada a AlkK, una señal de poliadenilación, un
promotor específico de semilla, una señal de direccionamiento de
plástido fusionada a PhaC, y una señal de poliadenilación (Figura
6A). Promotores específicos de semilla tales como el promotor del
gen napín (U.S. 5.240.034; U.S. 5.608.152), el promotor de
acetil-CoA-carboxilasa (U.S.
5.420.034; U.S. 5.608.152), el promotor 2S de albúmina, el promotor
de la proteína de almacenamiento de semilla, el promotor faseolina
(Slightom et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:
1897-1901), el promotor oleosina (Plant et
al., 1994, Plant. Mol. Biol. 25:193-205; Rowley
et al., 1997, Biochim. Biophys. Acta.
1345:1-4; U.S. 5.650.554; PCT WO 93/20216),
el promotor zeína, el promotor glutelina, el promotor sintasa de
almidón, el promotor de la enzima de ramificación del almidón, etc,
son útiles para construir el constructo de producción de PHA
específico de semilla, basado en plástido.
El constructo de producción de PHA específico de
semilla basado en plástido puede transformarse en Arabidopsis
como se describe en el Ejemplo 5. Alternativamente, el constructo
puede transformarse en Brassica napus utilizando el
procedimiento siguiente (Moloney L.M. Walker J.M., Sharma K.K. Plant
Cell, 1989, 8, 238-242). Semillas de Brassica
napus cv. Westar se esterilizan superficialmente en lejía
comercial al 10% (Javex, Colgate-Palmolive Canada
Inc.) durante 30 min con agitación suave mediante sacudidas. Las
semillas se lavan 3 veces en agua destilada estéril. Se ponen las
semillas en medio de germinación que comprende sales
Murashige-Skoog (MS) y vitaminas, 3% de sacarosa y
0,7% de Phytagar, pH 5,8 a una densidad de 20 por placa y se
mantienen a 24ºC en un fotoperiodo de 16 horas luz/8 horas
oscuridad con una intensidad de luz de 60-80
\muEm^{-2}s^{-1} durante 4-5 días. Los
constructos se introducen en la cepa EHA101 de Agrobacterium
tumefaciens (Hood EE, Helmer GL, Fraley R.T., Chilton M.D., J.
Bacteriol. 1986, 168, 1291-1301) por
electroporación. Antes de la transformación de peciolos
cotiledonarios, colonias simples de la cepa EHA101 que albergan cada
constructo se cultivan en 5 ml de medio mínimo, complementado con
los antibióticos apropiados de selección para el vector de
transformación, durante 48 horas a 28ºC. Se reduce a un sedimento 1
ml de suspensión bacteriana por centrifugación durante 1 min en una
microcentrífuga. El sedimento se resuspende en 1 ml de medio
mínimo.
Para la transformación, se escinden los
cotiledones de plantas de semillero de 4 a 5 días de tal modo que
los mismos incluyen aproximadamente 2 mm de peciolo en la base. Los
cotiledones individuales con la superficie cortada de sus peciolos
se sumergen en suspensión bacteriana diluida durante 1 s y se
incrustan inmediatamente hasta una profundidad de \sim 2 mm en
ayuno de cocultivo, medio MS con 3% de sacarosa y 0,7% de Phytagar,
enriquecido con benciladenina 20 \muM. Los cotiledones inoculados
se extienden en placas a una densidad de 10 por placa y se incuban
en las mismas condiciones de cultivo durante 48 h. Después del
co-cultivo, se transfieren los cotiledones a medio
de regeneración que comprende medio MS complementado con 3% de
sacarosa, benciladenina 20 \muM, 0,7% de Phytagar, pH 5,8, 300
mg/l de timentinina y los antibióticos apropiados para selección
del vector de transformación de plantas.
Después de 2-3 semanas, se
obtienen brotes regenerantes, se cortan, y se mantienen en medio de
"elongación de brotes" (medio MS que contiene 3% de sacarosa,
300 mg/l de timentina, 0,7% de Phytagar y el antibiótico apropiado)
en frascos Magenta. Los brotes elongados se transfieren a medio de
"enraizamiento" que comprende medio MS, 3% de sacarosa, 2 mg/l
de ácido indol-butírico, 0,7% de Phytagar y 500 mg/l
de carbenicilina. Después de la aparición de las raíces, se
transfieren las plántulas a "Potting Mix" (Redi Earth, W.R.
Grace and Co. Canada Ltd.). Las plantas se mantienen en una cámara
de nebulización (75% de humedad relativa) en las mismas condiciones
de crecimiento.
La expresión de una actividad de
3-hidroxiacil-ACP-tioesterasa
en cloroplastos o plástidos debería conducir a una desviación del
carbono de la biosíntesis de los ácidos grasos produciendo
3-hidroxiácidos grasos. Dado que los cloroplastos y
plástidos no acumulan normalmente 3-hidroxiácidos
grasos, las moléculas deberían exportarse del orgánulo e
incorporarse en triacilglicéridos o transportarse a los peroxisomas
para degradación. La incorporación de
3-hidroxiácidos de longitud de cadena media en
triacilglicéridos en las semillas de las cosechas oleaginosas
produciría nuevos aceites de semillas. La presencia de una
acil-CoA-sintetasa citosólica y una
PHA-sintasa citosólica podría convertir los
3-hidroxiácidos grasos de cadena media en el citosol
en PHAs de longitud de cadena media.
El plásmido
pCambia-C4PPDK.TS.PhaG.AlkK.PhaC_{P . o . }
(Figura 5B) es un vector de transformación de plantas diseñado para
producción de PHA citosólico. El mismo codifica secuencias para
expresión específica de hojas de PhaG en los cloroplastos, y
expresión específica de hojas de alkK y PhaC en el citosol. El
plásmido pCambia-C4PPDK.TS.PhaG.AlkK.PhaC_{P . o .
} contiene el promotor 35S-C4PPDK, la señal de
direccionamiento a los cloroplastos de rubisco del guisante que
incluye DNA que codifica los 24 aminoácidos
N-terminales de la proteína rubisco del guisante, un
fragmento que codifica PhaG, una secuencia de terminación Nos, el
promotor 35S-C4PPDK, un fragmento que codifica AlkK,
una secuencia de terminación Nos, el promotor
35S-C4PPDK, un fragmento que codifica PhaC de
Pseudomonas oleovorans y una secuencia de terminación Nos.
El plásmido pCambia-C4PPDK.TS.PhaG.AlkK.PhaC_{P . o
. } puede transformarse en Arabidopsis o Tabaco como se
describe en los ejemplos previos.
Para producción de PHA citosólico específico de
semilla, puede construirse un plásmido que contiene un promotor
específico de semilla, una señal de direccionamiento a plástidos
fusionada a PhaG, una señal de poliadenilación, un promotor
específico de semilla, un fragmento que codifica AlkK, una señal de
poliadenilación, un promotor específico de semilla, un fragmento
que codifica PhaC, y una señal de poliadenilación (Figura 6B). El
constructo de producción de PHA citosólico específico de semilla
puede transformarse en Arabidopsis o cosechas de semillas
oleaginosas tales como Brassica napus como se describe en los
ejemplos previos.
Dado que una porción de los
3-hidroxiácidos grasos de longitud de cadena media
exportados de cloroplastos o plástidos puede entrar a los
peroxisomas para degradación, el direccionamiento de una
acil-CoA-sintetasa y una
PHA-sintasa en los peroxisomas de las hojas o
semillas podría producir PHA. El plásmido
pCambia-C4PPDK.TS.PhaG.AlkK.
PhaC_{P . o . }perox (Figura 5B) es un vector de transformación de plantas diseñado para acumulación de PHA peroxisómico basado en hojas. El constructo contiene el promotor 35S-C4PPDK, la señal de direccionamiento a los cloroplastos de rubisco del guisante con inclusión de DNA que codifica los 24 aminoácidos N-terminales de la proteína rubisco del guisante, un fragmento que codifica PhaG, una secuencia de terminación Nos, el promotor 35S-C4PPDK, un fragmento codificante de AlkK fusionado a una señal de direccionamiento peroxisómica C-terminal compuesta de los 34 aminoácidos C-terminales de isocitrato-liasa de Brassica napus (Olsen, L. J., Ettinger, W. F., Damsz, B., Matsudaira, K., Webb, M. A., Harada, J. J. 1993, Plant Cell, 5, 941-952), una secuencia de terminación Nos, el promotor 35S-C4PPDK, un fragmento codificante de PhaC de Pseudomonas oleovorans fusionado a una señal de direccionamiento peroxisómica C-terminal, compuesta de los 34 aminoácidos C-terminales de isocitrato-liasa liasa de Brassica napus, y una secuencia de terminación Nos. El plásmido pCambia-C4PPDK.TS.PhaG.AlkK.PhaC_{P . o . }perox puede transformarse en Arabidopsis o Tabaco como se describe en los ejemplos previos.
PhaC_{P . o . }perox (Figura 5B) es un vector de transformación de plantas diseñado para acumulación de PHA peroxisómico basado en hojas. El constructo contiene el promotor 35S-C4PPDK, la señal de direccionamiento a los cloroplastos de rubisco del guisante con inclusión de DNA que codifica los 24 aminoácidos N-terminales de la proteína rubisco del guisante, un fragmento que codifica PhaG, una secuencia de terminación Nos, el promotor 35S-C4PPDK, un fragmento codificante de AlkK fusionado a una señal de direccionamiento peroxisómica C-terminal compuesta de los 34 aminoácidos C-terminales de isocitrato-liasa de Brassica napus (Olsen, L. J., Ettinger, W. F., Damsz, B., Matsudaira, K., Webb, M. A., Harada, J. J. 1993, Plant Cell, 5, 941-952), una secuencia de terminación Nos, el promotor 35S-C4PPDK, un fragmento codificante de PhaC de Pseudomonas oleovorans fusionado a una señal de direccionamiento peroxisómica C-terminal, compuesta de los 34 aminoácidos C-terminales de isocitrato-liasa liasa de Brassica napus, y una secuencia de terminación Nos. El plásmido pCambia-C4PPDK.TS.PhaG.AlkK.PhaC_{P . o . }perox puede transformarse en Arabidopsis o Tabaco como se describe en los ejemplos previos.
Para producción de PHA peroxisómico específico
de semilla, puede construirse un plásmido que contiene un promotor
específico de semilla, una señal de direccionamiento a los plástidos
fusionada a PhaG, una señal de poliadenilación, un promotor
específico de semilla, un fragmento codificante de AlkK fusionado a
una señal de direccionamiento peroxisómica, una señal de
poliadenilación, un promotor específico de semilla, un fragmento
codificante de PhaC fusionado a una señal de direccionamiento
peroxisómico, y una señal de poliadenilación (Figura 6C). El
constructo de producción de PHA peroxisómico específico de semilla
puede transformarse en Arabidopsis o cosechas de semillas
oleaginosas tales como Brassica napus como se describe en los
ejemplos previos.
Copolímeros que comprenden polihidroxibutirato y
unidades monómeras de longitud de cadena media pueden producirse en
bacterias o plantas por caminos de co-expresión para
formación de 3-hidroxibutiril-CoA y
3-hidroxiacil-CoA de longitud de
cadena media (Figura 1). Para la formación de unidades monómeras de
longitud de cadena corta, un camino constituido por una
\beta-cetotiolasa (phaA) y una
acetoacetil-CoA-reductasa
(phaB) convierte dos unidades de acetil-CoA
en
R-3-hidroxibutiril-CoA
(Figura 1). Para formación de unidades monómeras de longitud de
cadena media, un camino constituido por una
3-hidroxiacetil-ACP-tioesterasa,
tal como PhaG, y una
acil-CoA-sintetasa, tal como AlkK,
convertirá los 3-hidroxiacil-ACPs de
longitud de cadena media por biosíntesis de ácidos grasos en
3-hidroxiacil-CoAs (Figura 1). La
polimerización de las unidades monómeras de longitud de cadena corta
y media en un copolímero se consigue con una
PHA-sintasa que posee una especificidad amplia de
sustratos, tal como la sintasa de Pseudomonas sp. A33 (Appl.
Microbiol. Biotechnol. 1995, 42, 901-909),
Pseudomonas sp. 61-3 (Kato, M., Bao, H. J.,
Kang, C.-K, Fukui, T., Doi, Y. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1996,
45, 363-370), o Thiocapsa pfennigii (U.S.
6.011.144).
Para producir copolímeros constituidos por PHB y
unidades monómeras de longitud de cadena media en los cloroplastos
de hojas o plástidos de semillas, transgenes que codifican
\beta-cetotiolasa (phaA),
acetoacetil-CoA-reductasa
(phaB), PHA-sintasa de especificidad amplia
de sustrato (phaC),
3-hidroxiacil-ACP-tioesterasa,
y acil-CoA-sintasa se fusionan a
una señal de direccionamiento de cloroplastos o plástidos para
dirigir los polipéptidos a los cloroplastos o plástidos para
producción de polímero.
Para producir copolímeros constituidos por PHB y
unidades monómeras de longitud de cadena media en el citosol de
hojas o semillas, el transgén codificante de
3-hidroxiacil-ACP-tioesterasa
se fusiona a una señal de direccionamiento de cloroplastos o
plástidos a fin de dirigir el polipéptido a los cloroplastos o
plástidos. Todos los restantes polipéptidos, con inclusión de
\beta-cetotiolasa,
acetoacetil-CoA-reductasa,
PHA-sintasa de especificidad de sustrato amplia y
acil-CoA-sintetasa se direccionan al
citosol, dando como resultado acumulación de polímero en el
citosol.
Para producir copolímeros constituidos por PHB y
unidades monómeras de longitud de cadena media en los peroxisomas
de hojas o semillas, el transgén que codifica
3-hidroxiacil-ACP-tioesterasa
se fusiona a una señal de direccionamiento a los cloroplastos o
plástidos para dirigir el polipéptido a los cloroplastos o
plástidos. Todos los restantes polipéptidos, con inclusión de
\beta-cetotiolasa,
acetoacetil-CoA-reductasa,
PHA-sintasa con especificidad de sustrato amplia y
acil-CoA-sintasa se fusionan a una
señal de direccionamiento peroxisómica para dirigir los
polipéptidos a los peroxisomas para la producción de polímero.
<110> Metabolix, Inc.
\hskip1cm Aquin, Stephanie
\hskip1cm Peoples, Oliver P.
\hskip1cm Snell, Kristi D.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> PRODUCCIÓN DE POLIHIDROXIALCANOATOS
DE LONGITUD MEDIA DE CADENA POR CAMINOS DE BIOSÍNTESIS DE ÁCIDOS
GRASOS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> MBX 041
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> iniciador
phaGF-EcorI
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1cm8
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> iniciador
phaGR-KpnI
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip1cm9
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> iniciador
Posyn1-N
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm10
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> iniciador
Posyn1-nrSacII
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm11
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> iniciador
trc-PhaG.c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip1cm12
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> iniciador
trc-PhaG.r
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm13
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> iniciador Posynrbs.c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\hskip1cm14
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> iniciador Posynrbs.r
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\hskip1cm15
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 911
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> PhaG en el constructo de expresión
bacteriana pMTX-PhaG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\hskip1cm16
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1715
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> plásmido
pTRCN-KPS1.2N. PhaC en el constructo de expresión
bacteriana pKPS1.2N
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\hskip1cm17
\hskip1cm18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2703
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> plásmido
pSU-PhaCp.o.trc.PhaG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm19
\hskip1cm20
\hskip1cm21
\hskip1cm22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1664
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> alkK en el constructo de expresión
bacteriana pTRCNalkK
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\hskip1cm23
\hskip1cm24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1653
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> alkK en el constructo de expresión
bacteriana pUC-C4PPDK.TS.A1kK
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\hskip1cm25
\hskip1cm26
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sitio de restricción XbaI
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\hskip1cm27
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sitio de restricción XpnI
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\hskip1cm28
Claims (22)
1. Un organismo transgénico productor de PHA
seleccionado de bacterias o plantas, organismo que expresa una
PHA-sintasa y expresa adicionalmente un transgén que
codifica una enzima que tiene la actividad catalítica de
3-hidroxiacil-ACP-tioesterasa,
en el cual el organismo comprende adicionalmente uno o más
transgenes que codifican enzimas que tienen la actividad catalítica
de acil-CoA-sintetasa o
acil-CoA-transferasa de tal modo
que PHA que comprende
(D)-3-hidroxiácidos de longitud de
cadena media se acumula por el camino de la biosíntesis de los
ácidos grasos.
2. El organismo de la reivindicación 1, en el
cual la acil-CoA-sintetasa es
3-hidroxiacil-CoA-sintetasa.
3. El organismo de la reivindicación 1, en el
cual la acil-CoA-sintetasa es
alkK.
4. El organismo de la reivindicación 1 ó 2,
que expresa adicionalmente un transgén que codifica una
PHA-sintasa.
5. El organismo de la reivindicación 1 ó 4,
que expresa adicionalmente una actividad de
3-hidroxiacil-CoA-sintetasa
heteróloga.
6. El organismo de la reivindicación 1 que
expresa una enzima seleccionada del grupo constituido por
3-hidroxiacil-ACP-tioesterasa,
PHA-sintasa de longitud de cadena media, y
acil-CoA-sintasa de
3-hidroxiácido graso de longitud de cadena media,
en donde el organismo es una célula de planta, un tejido de planta,
o una planta entera.
7. El organismo de la reivindicación 6, que
expresa adicionalmente genes marcadores seleccionables, en donde el
organismo es una planta entera.
8. El organismo de la reivindicación 1 que
expresa una enzima seleccionada del grupo constituido por
3-hidroxiacil-ACP-tioesterasa,
una PHA-sintasa que incorpora hidroxiácidos de
longitud de cadena media, y
acil-CoA-sintetasa de
3-hidroxiácido graso de longitud de cadena media,
en donde el organismo es una bacteria.
9. El organismo de la reivindicación 6, en el
cual la expresión del transgén está direccionada a un tejido u
orgánulo seleccionado del grupo constituido por semillas, hojas,
plástidos, y peroxisomas.
10. El organismo de la reivindicación 8, en el
cual la bacteria es E. coli y el PHA se acumula dentro de la
bacteria.
11. Un método de manipulación genética de un
camino biosintético de PHA en un organismo transgénico seleccionado
del grupo constituido por plantas y bacterias, en el cual el
organismo expresa una PHA-sintasa, comprendiendo el
método proporcionar al organismo uno o más constructos que
comprenden un transgén que codifica una enzima que tiene la
actividad catalítica de
3-hidroxiacil-ACP-tioesterasa,
y uno o más transgenes que codifican enzimas que tienen la
actividad catalítica de
acil-CoA-sintetasa o
acil-CoA-transferasa de tal modo que
PHA que comprende
(D)-3-hidroxiácidos de longitud de
cadena media se acumula por el camino de la biosíntesis de los
ácidos grasos.
12. El método de la reivindicación 11, en el
cual el uno o más constructos comprenden un transgén que codifica
una enzima que tiene la actividad catalítica de
3-hidroxiacil-CoA-sintetasa.
13. El método de la reivindicación 12, en el
cual el uno o más constructos comprenden adicionalmente un transgén
que codifica una PHA-sintasa.
14. El método de la reivindicación 13, en el
cual el organismo es una planta.
15. El método de la reivindicación 13, en el
cual el uno o más constructos expresan una enzima seleccionada del
grupo constituido por
3-hidroxiacil-ACP-tioesterasa,
PHA-sintasa de longitud de cadena media, y
acil-CoA-sintasa de
3-hidroxiácido graso de longitud de cadena media, en
el cual el organismo es una célula de planta, tejido de planta, o
planta entera.
16. El método de la reivindicación 13, en el
cual el uno o más constructos expresan una enzima seleccionada del
grupo constituido por
3-hidroxiacil-ACP-tioesterasa,
una PHA-sintasa que incorpora hidroxiácidos de
longitud de cadena media, y
acil-CoA-sintetasa de
3-hidroxiácido graso de longitud de cadena media, en
el cual el organismo es una bacteria.
17. Un método de fabricación de PHA que
comprende (D)-3-hidroxiácidos de
longitud de cadena media que comprende cultivar un organismo
transgénico productor de PHA seleccionado de una planta o bacteria,
organismo que expresa una PHA-sintasa y expresa
adicionalmente un transgén que codifica una enzima que tiene la
actividad catalítica de
3-hidroxiacil-ACP-tioesterasa,
y uno o más transgenes que codifican enzimas que tienen la actividad
catalítica de acil-CoA-sintetasa o
acil-CoA-transferasa.
18. El método de la reivindicación 17, en el
cual la acil-CoA-sintetasa es
3-hidroxiacil-CoA-sintetasa.
19. El método de la reivindicación 17 ó 18, en
el cual el organismo expresa adicionalmente un transgén que
codifica una PHA-sintasa.
20. El método de la reivindicación 18, en el
cual el organismo expresa una enzima seleccionada del grupo
constituido por
3-hidroxiacil-ACP-tioesterasa,
PHA-sintasa de longitud de cadena media, y
acil-CoA-sintasa de
3-hidroxiácidos grasos de longitud de cadena media,
en el cual el organismo es una célula de planta, un tejido de
planta, o una planta entera.
21. El método de la reivindicación 18, en el
cual el organismo expresa una enzima seleccionada del grupo
constituido por
3-hidroxiacil-ACP-tioesterasa,
una PHA-sintasa que incorpora hidroxiácidos de
longitud de cadena media, y
acil-CoA-sintasa de
3-hidroxiácidos grasos de longitud de cadena media,
en el cual el organismo es una bacteria.
22. El organismo de la reivindicación 8, en el
cual la bacteria es E. coli, y en el cual se secretan
3-hidroxiácidos en el medio de cultivo.
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