JP2008194049A - 脂肪酸生合成経路からの中間鎖長のポリヒドロキシアルカノエートの産生 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】3−ヒドロキシアシル−ACPチオエステラーゼ、PHAシンターゼおよびアシルCoAシンテターゼを用いて、脂肪酸生合成経路からポリヒドロキシアルカノエート(PHA)を生産する方法が開発された。3−ヒドロキシアシル−ACPチオエステラーゼ、アシルCoAシンテターゼ(中間鎖長の3−ヒドロキシ脂肪酸に対する基質特異性を有する)および中間鎖長のPHAシンターゼの触媒活性を有する酵素を用いて、非ネイティブな細菌PHA生産体および植物における脂肪酸生合成経路からのPHA産生を可能にするための方法論が開発された。
【選択図】なし
Description
多数の微生物は、ポリ[(R)−3−ヒドロキシアルカノエート](PHA)の細胞内貯蔵を蓄積する能力を有する。PHAは、生分解性および生体適合性の熱可塑性物質であり、再生可能資源から生成され、広範囲の産業的用途および生物医学的用途を有する(非特許文献1)。PHA生体高分子は、異なるモノマー組成物および広範囲の物理学的特性を有する、広範なクラスのポリエステルを含む。現在まで、約100の異なるモノマーが、PHAポリマーに組み込まれている(非特許文献2)。PHAは、PHAの側鎖の長さに従って2つの群に分けられ得る。短い側鎖を有するPHA(例えば、ポリヒドロキシ酪酸(PHB)(R−3−ヒドロキシ酪酸単位のホモポリマー))は、結晶性熱可塑性物質であり、一方、中間の長さの側鎖を有するPHA(例えば、ポリヒドロキシオクタン酸またはポリヒドロキシデカン酸)は、より弾性である。
イルACPへと転換する能力に基づいて、3−ヒドロキシアシル−アシルキャリアタンパク質−補酵素Aトランスフェラーゼとして同定された(非特許文献7)。Pseudomonas fragi(天然では、貯蔵物質としてPHAを産生しない生物)におけるphaGおよびPhaCの発現は、グルコネートからのPHAの産生を可能にした(非特許文献9)。しかし、E.coliにおいて、中間鎖長のシンターゼおよびPhaGの発現の際に、ポリマーは観察されなかった(非特許文献7)。E.coliは、P.fragiのように、少量の、低分子量のPHBの非顆粒形態を産生し得るが(非特許文献10)、貯蔵ポリマーの顆粒を産生できない。
(項目1) 3−ヒドロキシアシル−ACPチオエステラーゼの触媒活性を有する酵素をコードする導入遺伝子を発現する、トランスジェニック生物。
(項目2) アシル−CoAシンテターゼまたはアシルCoAトランスフェラーゼの触媒活性を有する酵素をコードする1つ以上の導入遺伝子をさらに含む、項目1に記載の生物。
(項目3) 上記アシル−CoAシンテターゼが3−ヒドロキシアシル−CoAシンテターゼである、項目2に記載の生物。
(項目4) 上記アシル−CoAシンテターゼがalkKである、項目2に記載の生物。
(項目5) PHAシンターゼをさらに発現する、項目2または3に記載の生物。
(項目6) 異種の3−ヒドロキシアシル−CoAシンテターゼ活性をさらに発現する、項目1または5に記載の生物。
(項目7) 上記酵素が改変される、項目1に記載の生物。
(項目8) 項目5に記載の生物であって、3−ヒドロキシアシル−ACPチオエステラーゼ、中間鎖長のPHAシンターゼおよび中間鎖長の3−ヒドロキシ脂肪酸アシルCoAシンターゼからなる群より選択される酵素を発現し、ここで、該生物が植物細胞、植物組織または植物全体である、生物。
(項目9) 選択マーカー遺伝子をさらに発現する、項目8に記載の生物であって、ここで、該生物は植物全体である、生物。
(項目10) 項目5に記載の生物であって、3−ヒドロキシアシル−ACPチオエステラーゼ、中間鎖長のヒドロキシ酸を組み込むPHAシンターゼおよび中間鎖長の3−ヒドロキシ脂肪酸アシルCoAシンテターゼからなる群より選択される酵素を発現し、ここで、該生物が細菌である、生物。
(項目11) 項目8に記載の生物であって、ここで、上記導入遺伝子の発現が、組織または種子、葉、色素体およびペルオキシソームからなる群より選択されるオルガネラに標的化される、生物。
(項目12) 上記細菌がE.coliであり、PHAが該細菌内で蓄積する、項目10に記載の生物。
(項目13) トランスジェニック生物におけるPHA生合成経路を操作する方法であって、該方法は、3−ヒドロキシアシル−ACPチオエステラーゼの触媒活性を有する酵素をコードする導入遺伝子を含む構築物を提供する工程、および該生物を作製する工程を包含する、方法。
(項目14) 項目13に記載の方法であって、ここで、上記構築物がアシル−CoAシンテターゼまたはアシルCoAトランスフェラーゼの触媒活性を有する酵素をコードする1つ以上の導入遺伝子をさらに含む、方法。
(項目15) 上記酵素が、3−ヒドロキシアシル−CoAシンテターゼの触媒活性を有する、項目14に記載の方法。
(項目16) 上記構築物が、PHAシンターゼをコードする導入遺伝子をさらに含む、項目15に記載の方法。
(項目17) 上記生物が植物である、項目16に記載の方法。
(項目18) 項目16に記載の方法であって、上記構築物が、3−ヒドロキシアシル−ACPチオエステラーゼ、中間鎖長のPHAシンターゼおよび中間鎖長の3−ヒドロキシ脂肪酸アシルCoAシンターゼからなる群より選択される酵素を発現し、ここで、上記生物が植物細胞、植物組織または植物全体である、方法。
(項目19) 項目16に記載の方法であって、上記構築物が、3−ヒドロキシアシル−ACPチオエステラーゼ、中間鎖長のヒドロキシ酸を組み込むPHAシンターゼ、および中間鎖長の3−ヒドロキシ脂肪酸アシルCoAシンテターゼからなる群より選択される酵素を発現し、ここで、上記生物が細菌である、方法。
(項目20) PHAを作製する方法であって、該方法が、3−ヒドロキシアシル−ACPチオエステラーゼの触媒活性を有する酵素をコードする導入遺伝子を発現するトランスジェニック生物を成長させる工程を包含する、方法。
(項目21) 項目20に記載の方法であって、上記生物がさらに、アシル−CoAシンテターゼまたはアシルCoAトランスフェラーゼの触媒活性を有する酵素をコードする1つ以上の導入遺伝子を含む、方法。
(項目22) 上記アシル−CoAシンテターゼが3−ヒドロキシアシル−CoAシンテターゼである、項目21に記載の方法。
(項目23) 上記生物がPHAシンターゼをさらに発現する、項目21に記載の方法。
(項目24) 上記生物がPHAシンターゼをさらに発現する、項目22に記載の方法。
(項目25) 項目24に記載の方法であって、上記生物が、3−ヒドロキシアシル−ACPチオエステラーゼ、中間鎖長のPHAシンターゼおよび中間鎖長の3−ヒドロキシ脂肪酸アシルCoAシンターゼからなる群より選択される酵素を発現し、ここで、上記生物が植物細胞、植物組織または植物全体である、方法。
(項目26) 項目24に記載の方法であって、上記生物が、3−ヒドロキシアシル−ACPチオエステラーゼ、中間鎖長のヒドロキシ酸を組み込むPHAシンターゼ、および中間鎖長の3−ヒドロキシ脂肪酸アシルCoAシンテターゼからなる群より選択される酵素を発現し、ここで、上記生物が細菌である、方法。
(項目27) 3−ヒドロキシアシルACPチオエステラーゼ活性をコードする酵素についてのスクリーニング方法であって、該方法が以下の工程:
a)PHAシンターゼおよび3−ヒドロキシアシル−CoAシンテターゼまたは3−ヒドロキシアシル−CoAトランスフェラーゼを発現する異種の生物において酵素を同時発現させる工程、ならびに
b)PHAの産生に適切な条件下で該生物を成長させる工程、
を包含する、方法。
(項目28) 植物油組成物のC8およびC10のヒドロキシ酸または脂肪酸のレベルを増加させる方法であって、該方法は以下の工程:
a)3−ヒドロキシアシルACPチオエステラーゼの触媒活性を有する酵素をコードする導入遺伝子を発現させる工程、および
b)植物油組成物の産生にとって最適な条件下で該植物を成長させる工程、
を包含する、方法。
(項目29) 上記細菌がE.coliであり、ここで、3−ヒドロキシ酸が培養培地中に分泌される、項目10に記載の生物。
Pseudomonas oleovorans由来のphaG遺伝子およびPHAシンターゼ1遺伝子を発現する組換えE.coli系は、中間鎖長のPHAを蓄積しないことが発見された。しかし、培地は、有意なレベルの3−ヒドロキシ酸を含んでいたことが見出された。ここで、PhaGタンパク質は、3−ヒドロキシアシル−ACPチオエステラーゼとして機能したことが示された。phaG遺伝子、phaC1遺伝子およびalkK遺伝子を発現するE.coli系は、PHAを産生する。これらの結果は、E.coliまたは他の細菌においてPHAを産生するための、新規の代謝操作アプローチを提供するのみならず、他の生物(例えば、作物(plant crop))においてPHAを産生するための、いくつかの新規のアプローチを提供する。
E.coliが、PhaGおよびPhaCを発現する場合に、グルコースから中間鎖長のPHAを形成することができないことは、この経路が、Pseudomonadsではない、非ネイティブのPHAプロデューサー中に操作される場合、さらなる酵素活性が要求され得ることを示唆する。米国特許第5,750,848号は、PHA陰性の細菌において、3−ヒドロキシアシルACPの3−ヒドロキシアシルCoAへの転換を可能にする、酵素または酵素の組み合わせを単離するためのスクリーニング方法を記載するが、このような酵素は、文献にも特許にも記載されていない。Klinkeら(Klinke,S.,Ren,Q.,Witholt,B.,Kessler,B.Appl.Environ.Microbiol.1999,65,540−548)は、E.coliにおける、チオエステラーゼおよびPHAシンターゼの同時発現の際のPHA産生を実証した。この研究に用いられるチオエステラーゼは、3−ヒドロキシアシルACPを3−ヒドロキシ脂肪酸へ転換しないが、代わりに、アシルACPを脂肪酸に転換するので、宿主細胞のネイティブのβ−酸化酵素は、PHA形成のために3−ヒドロキシアシルCoAを形成することが要求される。従って、このストラテジーは、植物に限定される。なぜならば、β酸化酵素は、ペルオキシソームに主に局在し、これによりPHAが産生され得る場所が制限されるからである。
素活性としてのアシルCoAシンテターゼが、発見されている。アシルCoAシンテターゼは、遊離脂肪酸、補酵素AおよびATPの、脂肪酸アシルCoAおよびAMPへの転換を触媒する(図1の経路C;Black,P.N.、DiRusso,C.C.、Metzger,A.K.、Heimert,T.L.、J.Biol.Chem.1992、267、25513−25520を参照のこと)。PhaGが、インビボの3−ヒドロキシアシルACP−CoAトランスフェラーゼ反応を完了することを可能にするために、補充的アシルCoAシンテターゼを必要とすることは、PhaGが、予測とは異なり、3−ヒドロキシアシルACPチオエステラーゼ活性のみをコードすることを示唆する(図1の経路Bを参照のこと)。アシルCoAシンテターゼの遺伝子は、単離され、そして特徴づけられており、これらとしては、E.coli由来のfadD遺伝子(Black,P.N.、DiRusso,C.C.、Metzger,A.K.、Heimert,T.L.、J.Biol.Chem.1992、267、25513−25520)、Pseudomonas oleovorans由来のalkK遺伝子(van Beilen,J.B.、Eggink,G.、Enequist,H.、Bos,R.、Witholt,B.、Molecular Microbiology 1992、6、3121−3136)およびPlasmodium falciparum由来のPfacs1遺伝子(Matesanz,F.、Duran−Chica,I.、Alcina,A.、J.Mol.Biol.1999、291、59−70)が挙げられる。
:833−839;Kyozukaら、1991、Mol.Gen.Genet.228:40−48)、ユビキチンプロモーター、ゴマノハグサ(Figwort)モザイクウイルスプロモーター、マンノピンシンターゼプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーターおよびオクトピンシンターゼプロモーターが挙げられる。有用な調節可能なプロモーター系としては、ホウレンソウ硝酸誘導性プロモーター、ヒートショックプロモーター、リブロース二リン酸カルボキシラーゼの小サブユニットのプロモーターおよび化学的誘導性プロモーターが挙げられる(米国特許第5,364,780号;同第5,364,780号;同第5,777,200号)。
入遺伝子とインフレームで連結された葉緑体標的化ペプチドをコードする配列を含むように操作される。葉緑体標的化配列は、葉緑体または色素体に対してタンパク質を標的化し得る任意のペプチド配列である(例えば、アルファルファのリブロース二リン酸カルボキシラーゼの小サブユニットの一過性(transit)ペプチド(Khoudi,H.、Vezina,L.−P.、Mercier,J.、Castonguay,Y.、Allard,G.、Laberge,S.、Gene 1997,197、343−351)またはpea rubisco葉緑体標的化シグナル(Cashmore,A.R.(1983)、Genetic Engineering of plants、Kosuge,T.、Meredith,C.P.およびHollaender,A.編(Plenum、New York)、29−38頁;Nawrath,C.、Poirier,Y.およびSomerville,C.(1994)PNAS.91:12760−12764))。葉緑体への全てのポリペプチドの輸送は、葉緑体中のポリマーの蓄積を生じる。1つの実施形態において、葉緑体標的化CoAトランスフェラーゼは、アシルCoAシンテターゼの代わりに使用される。この実施形態において、CoAトランスフェラーゼは、宿主生物に存在するアシルCoAから、3−ヒドロキシ脂肪酸にCoAを転移させ、PHAシンターゼについてのモノマー単位を形成する。
6,268号)が挙げられる。EP0530129A1は、増殖培地に添加された不活性化合物を活性化する酵素をコードする導入遺伝子を発現させることにより、形質転換した植物を、形質転換していない系統より大きく成長させることを可能にするポジティブ選択系を記載する。米国特許第5,767,378号は、トランスジェニック植物のポジティブ選択のためにマンノースまたはキシロースを用いることを記載する。有用なスクリーニング可能なマーカーとしては、β−グルクロニダーゼ遺伝子(Jeffersonら、1987,EMBO J.6:3901−3907;米国特許第5,268,463号)およびネイティブ緑色蛍光タンパク質遺伝子または改変緑色蛍光タンパク質遺伝子(Cubittら、1995,Trends Biochem Sci.20:448−455;Pangら、1996,Plant Physiol.112:893−900)が挙げられる。これらのマーカーのいくつかは、形質(例えば、投入側にさらなる作物的価値を提供する、目的の植物への除草剤耐性)を導入する付加された利点を有する。
J.編,John Wiley&Sons Ltd.,EnglandならびにMethods in Plant Molecular Biology−a laboratory course manual(1995),Maliga,P.,Klessig,D.F.,Cashmore,A.R.,Gruissem,W.and Varner,J.E.編 Cold Spring Laboratory Press,New York)。
PhaGをコードする遺伝子を、プライマーphaGF−EcoRIおよびphaGR−KpnIを用いてPseudomonas putidaゲノムDNAからPCRにより単離し、E.coli発現ベクターpTRCNのEcoRI部位およびKpnI部位にクローニングして、プラスミドpMTX−phaGを形成した。pMTX−phaGにおけるphaG挿入物の配列(配列番号9)は、Genbankに列挙された配列と同一であることが分かった(登録番号AF052507)。
た。
炭素源としてグルコースを用いてE.coliにおいてPHAを生成する試みにおいて、宿主株JM109(Promega,Madison,WI)を、以下からなる群より選択されるプラスミドを用いて形質転換した:pSU−PhaC.P.o.trc.PhaG(中間鎖長のシンターゼおよびPhaGの発現プラスミド)、pSU18(pSU−PhaC.P.o.trc.PhaGについてのコントロールベクター)、およびpTRCN(さらなる遺伝子を挿入することができるプラスミド)。JM109/pTRCN/pSU18およびJM109/pSU−PhaC.P.o.trc.PhaGの開始培養物(5mL)を、アンピシリン(100mg/L)およびクロラムフェニコール(25mg/L)を含有するLB培地(Difco)に単一コロニーを用いて接種した。この培養物を30℃で一晩増殖させた。開始培養物を、アンピシリンおよびクロラムフェニコールを含有するLB培地(5mL)中に希釈し(1:100)、250RPMで攪拌しながら30℃で10時間増殖させた。この培養物を採取し、細胞を2.5mLの培地E塩(Vogel,J.H.およびBonner,D.M.,J.Biol.Chem.1956,218,97−106)を用いて2回洗浄した。細胞ペレットを2.5mLの培地E塩中に再懸濁し、1mLの懸濁液を用いて、遺伝子発現のためにフラスコに接種した。培養を、100mLの培地E塩、1.5%グルコース、1mg/Lチアミン、100mg/L アンピシリン、および25mg/Lクロラムフェニコールを含有する500mLのエルレンマイヤーフラスコ中で行った。このフラスコを、600nmでの吸光度が0.4に達するまで30℃でインキュベートした。遺伝子発現を0.4mM IPTGを用いて誘導し、採取する前に、フラスコをさらに48時間、30℃でインキュベートした。
ラリーGCカラム(30m;内径0.32mm;0.25μmフィルム;Supelco;Bellefonte,Pa.)上で、分配比1:50および流速2mL/分を使用して分析した。この分析についての温度プロフィールは、以下の通りであった:80℃、2分;1分につき10℃で250℃まで;250℃、2分。
3−ヒドロキシアシルCoA(図1、経路A)の代わりに3−ヒドロキシアシルACPから遊離脂肪酸へのPhaG触媒変換(図1、経路B)は、PhaGおよびPhaCを発現するE.coli株由来の誘導体化培養上清のGCクロマトグラムにおいて3−ヒドロキシアシルブチルエステルが観察されることについての、1つの説明を提供し得た。実施例2に記載されるE.coli蓄積研究において、ネイティブE.coliアシルCoAシンテターゼは、FadR(転写調節因子として機能するE.coliタンパク質)(Black,P.N.、DiRusso,C.C.、Metzger,A.K.、Heimert,T.L.、J.Bio.Chem.1992、267、25513〜25520)によるアシルCoAシンテターゼをコードする遺伝子(fadD)の転写抑制に起因して、使用された最小培地増殖条件において誘導されなかったかもしれない。あるいは、FadDは、中間鎖長の3−ヒドロキシ脂肪酸について基質特異性を有さないかもしれない。
70〜77)を使用して410nmで補酵素Aの消費をモニターすることによって、アシルCoAシンテターゼ活性を評価した。このアッセイ混合物(500μl)は、200mM KH2PO4(pH7)、7.5mM CoA、3.75mM ATP、5mM MgCl2、4.2mM脂肪酸酵素を含んだ。オクタン酸および3−ヒドロキシオクタン酸を、この反応における脂肪酸基質として使用した。この反応は室温で実施し、そして酵素の添加によって開始した。アリコート(10μl)を30秒毎に取り出し、そして140μlの5%トリクロロ酢酸中でクエンチした。微小遠心分離機における1分間の遠心分離によって、沈殿したタンパク質を除去し、そしてその上清のアリコート(100μl)を、690μlの500mM KPi(pH7.4)中に希釈した。DTNBストックのアリコート[500mM KPi(pH7.4)中の10mMストック溶液10μl]を添加し、そしてそのサンプルを、室温で2分間インキュベートした。その反応の各時点で消費されたCoAの量を、410nmでの吸光度の値(ε=13.7mM−1cm−1)から定量した(図2および図3)。
細胞質ゾルアシルCoAシンテターゼの存在によってPhaGおよびPhaCを発現するE.coli株におけるポリマー生成が可能になる否かを決定するために、実施例2に記載されるポリマー蓄積研究のために株JM109/pSU−PhaC.P.o.trc.PhaG/pTRCN−AlkKを調製した。加ブタノール分解により誘導体化された
細胞全体のGCクロマトグラムは、20.1モル%の3−ヒドロキシオクタン酸および79.9モル%の3−ヒドロキシデカン酸から構成される、2.2乾燥細胞重量%のポリマーを含んだ(表1)。JM109/pSU−PhaC.P.o.trc.PhaG/pTRCN−AlkK上清のGCクロマトグラム中の3−ヒドロキシブチルエステルの存在は、0.16mMのブチル3−ヒドロキシデカノエートを生じブチル3−ヒドロキシオクタノエートを生じなかったJM109/pSU−PhaC.P.o.trc.PhaG細胞上清(表1)のGCクロマトグラムと比較して、有意に減少した。ポリマー生成のためにE.coliにおいて補助的アシルCoAシンテターゼ活性が必要なことは、PhaGが、インビトロでは3−ヒドロキシアシルACPチオエステラーゼ活性のみを有する(図1、経路B)ことを示唆する。
てガスクロマトグラフに注入した。そのサンプル中の3−ヒドロキシアシルブチルエステルを、既知量の標準サンプル3−ヒドロキシ脂肪酸の加ブタノール分解誘導体化によって定量した。
PhaG発現用構築物およびPhaC発現用構築物を、植物の葉緑体中のPhaGおよびPhaCがPHA生成をもたらすか否かを決定するための形質転換用に調製した(図4Aおよび図4B)。
to International Agriculture,Canberra,Australia)の誘導体であり、アルファルファrubiscoプロモーター(Khoudi,H.,Vezina,L.P.,Mercier,J.,Castonguay,Y.,Allard,G.,Laberge,S.、1997、Gene 197:343〜351)、アルファルファrubisco葉緑体標的化シグナル(Khoudi,H.,Vezina,L.P.,Mercier,J.,Castonguay,Y.,Allard,G.,Laberge,S.、1997、Gene 197:343〜351)、PhaGコード遺伝子、およびアルファルファrubisco終結配列(Khoudi,H.,Vezina,L.P.,Mercier,J.,Castonguay,Y.,Allard,G.,Laberge,S.、1997、Gene 197:343〜351)をコードする発現カセットと、その後に続く、アルファルファrubiscoプロモーター、アルファルファrubisco葉緑体標的化シグナル、Pseudomonas aeroginosa由来のPhaC1コード遺伝子(Timm,A.およびSteinbuchel,A.、J.Appl.Microbiol.1992,209,15〜30)、およびアルファルファrubisco終結配列をコードする発現カセットと、を含む。
C.およびSchell,J.、Mol.Gen.Genet.1986,204,383〜396)を用いて、CloughおよびBentのAgrobacterium媒介性花浸漬(floral dip)手順(Clough,S.J.およびBent,A.F.、Plant Journal,1998,16,735〜743)を使用して形質転換した。成熟長角果から種子を単離し、そしてその種子を、1/2×ムラシゲ最小有機培地(Life Technologies,Rockville,MD)、0.7%寒天、1×ガンボーグB5ビタミン(Sigma,St.Louis,MO)および50μg/mLカナマイシンを含む選択培地上に、プレーティングした。7日後、カナマイシン選択耐性である緑色実生と、カナマイシン選択感受性である白色実生が、プレート上に出現した。この緑色実生を、土壌に移し、そして成熟させた。
表2.コントロール植物由来のRNAサンプルに対して行ったRT−PCR反応の結果
phaGおよびphaCのRNA転写物の首尾よい産生にもかかわらず、Arabidopsis thalianaが葉緑体中でPHAを産生し得ないことは、植物の葉緑体が、その葉緑体においてPhaGが発現される場合に、3−ヒドロキシアシルACP−CoAトランスフェラーゼ反応を首尾よく完了し得ないかもしれないことを示唆する。中間鎖長の3−ヒドロキシ酸に対して活性を有するアシルCoAシンテターゼと共にPhaGの3−ヒドロキシアシルACPチオエステラーゼ活性を補充することは、PHA合成のための3−ヒドロキシアシルCoAの首尾よい形成を可能にし得る。
o葉緑体標的化シグナル(エンドウrubiscoタンパク質のN末端24アミノ酸をコードするDNAを含む)、PhaGをコードするフラグメント、Nos終結配列、35S−C4PPDKプロモーター、エンドウrubisco葉緑体標的化シグナル(エンドウrubiscoタンパク質のN末端24アミノ酸をコードするDNAを含む)、AlkKをコードするフラグメント、Nos終結配列、35S−C4PPDKプロモーター、エンドウrubisco葉緑体標的化シグナル(エンドウrubiscoタンパク質のN末端24アミノ酸をコードするDNAを含む)、Pseudomonas oleovorans由来のPhaCをコードするフラグメントおよびNos終結配列。
シグナル、ポリアデニル化シグナル、種子特異的プロモーター、PhaCに融合された色素体標的化シグナル、ポリアデニル化シグナル。以下のような種子特異的プロモーターが、種子特異的な、色素体に基づくPHA産生構築物を構築するために、有用である:ナピン(napin)遺伝子プロモーター(米国特許第5,420,034号;米国特許第5,608,152号)、アセチル−CoAカルボキシラーゼプロモーター(米国特許第5,420,034号;米国特許第5,608,152号)、2Sアルブミンプロモーター、種子貯蔵タンパク質プロモーター、ファゼオリンプロモーター(Slightomら、1983、Proc.Natl.Acad.Sci.USA:80:1897−1901)、オレオシンプロモーター(plantら、1994、Plant Mol.Biol.25:193−205;Rowleyら、1997、Biochim.Biophys.Acta.1345:1−4;米国特許第5,650,554号;PCT WO93/20216)、ゼインプロモーター、グルテリンプロモーター、デンプンシンターゼプロモーター、デンプン分枝化酵素プロモーターなど。
Inc.)中で、30分間、ゆっくりと振盪しながら、浮遊させて滅菌する。種子を、滅菌蒸留水中で3回洗浄する。種子を、Murashige−Skoog(MS)塩およびビタミン、3% スクロースおよび0.7% フィトアガーを含む発芽培地(pH5.8)に、1プレートあたり20個の密度で置き、そして60〜80μEm−2s−1の光強度での16時間の明/8時間の暗の光周期に、24℃にて4〜5日間維持する。構築物を、エレクトロポレーションを使用して、Agrobacterium tumefaciens株EHA101(Hood EE、Helmer GL、Fraley R.T.、Chilton M.D.、J.Bacteriol.1986、168、1291−1301)に導入する。子葉の葉柄の形質転換の前に、各構築物を有する株EHA101の単一コロニーを、5mLの最小培地(形質転換ベクターについての適切な選択抗生物質を補充した)中で、28℃にて48時間成長させる。1mLの細菌懸濁物を、微量遠心管における1分間の遠心分離によってペレット化する。ペレットを、1mLの最小培地中に再懸濁する。
フィトアガーおよび適切な抗生物質を含むMS培地)に維持する。伸長した苗条を、「発根」培地(MS培地、3% スクロース、2mg/L インドール酪酸、0.7% フィトアガーおよび500mg/L カルベニシリンを含む)に移す。根の発生後、小植物を、栽培用ミックス(Redi Earth,W.R.Grace and Co.Ca
nada Ltd.)に移した。植物を、同じ成長条件下で霧チャンバ(75%相対湿度)中で維持する。
葉緑体または色素体における3−ヒドロキシアシルACPチオエステラーゼ活性の発現は、3−ヒドロキシ脂肪酸を産生する脂肪酸生合成からの炭素の流れを導くはずである。葉緑体および色素体は、通常、3−ヒドロキシ脂肪酸を蓄積しないので、これらの分子は、オルガネラから搬出され、そしてトリアシルグリセリドに組み込まれるか、またはペルオキシソームに輸送されて分解されるかの、いずれかであるはずである。脂肪種子穀物の種子におけるトリアシルグリセリドへの中間鎖長の3−ヒドロキシ酸の組み込みは、新規な種子脂肪を産生する。細胞質ゾルアシルCoAシンテターゼおよび細胞質ゾルPHAシンターゼの存在は、細胞質ゾル中の中鎖3−ヒドロキシ脂肪酸を中間鎖長のPHAに変換し得る。
葉緑体または色素体から搬出された中間鎖長の3−ヒドロキシ脂肪酸の一部分は、分解のためにペルオキシソーム中に進入し得るので、アシルCoAシンテターゼおよびPHAシンターゼの葉または種子のペルオキシソームへの標的化は、PHAを生じ得る。プラスミドpCambia−C4PPDK.TS.PhaG.AlkK.perox.PhaCp.o.perox(図5B)は、葉に基づくペルオキシソームPHA蓄積について設計された植物形質転換ベクターである。この構築物は、以下を含む:35S−C4PPDKプロモーター、エンドウrubisco葉緑体標的化シグナル(エンドウrubiscoタンパク質のN末端24アミノ酸をコードするDNAを含む)、PhaGをコードするフラグメント、Nos終結配列、35S−C4PPDKプロモーター、AlkK(Brassica napusイソシトレートリアーゼのC末端34アミノ酸から構成されるC末端ペルオキシソーム標的化シグナル(Olsen,L.J.,Ettinger,W.F
.,Damsz,B.,Matsudaira,K.,Webb,M.A.,Harada,J.J.1993,Plant Cell,5,941−952)に融合される)をコードするフラグメント、Nos終結配列、35S−C4PPDKプロモーター、Pseudomonas oleovoransに由来するPhaC(Brassica napusイソシトレートリアーゼのC末端34アミノ酸から構成されるC末端ペルオキシソーム標的化シグナルに融合された)をコードするフラグメント、およびNos終結配列。プラスミドpCambia−C4PPDK.TS.PhaG.AlkK.perox.PhaCp.o.peroxを、先の実施例に記載するように、ArabidopsisまたはTobacco中に形質転換し得る。
ポリヒドロキシブチレートおよび中間鎖長のモノマーユニットから構成されるコポリマーを、細菌または植物において、3−ヒドロキシブチリルCoAおよび中間鎖長の3−ヒドロキシアシルCoA形成のための経路を同時発現させることよって産生し得る(図1)。短い鎖長のモノマーユニット形成のために、β−ケトチオラーゼ(phaA)およびアセトアセチル−CoAレダクターゼ(phaB)からなる経路は、2ユニットのアセチルCoAをR−3−ヒドロキシブチリルCoAに転換する(図1)。中間鎖長のモノマーユニットを形成するために、3−ヒドロキシアシルACP−チオエステラーゼ(例えば、PhaG)およびアシルCoAシンテターゼ(例えば、AlkK)からなる経路は、脂肪酸生合成に由来する中間鎖長の3−ヒドロキシアシルACPを、3−ヒドロキシアシルCoAに転換する(図1)。短いかまたは中間鎖長のモノマーユニットのコポリマーへの重合は、広範な基質特異性を有するPHAシンターゼ(例えば、Pseudomonas sp.A33(Appl.Microbiol.Biotechnol.1995,42,901−909)、Pseudomonas sp.61−3(Kato,M.,Bao,H.J.,Kang,C.−K,Fukui,T.,Doi,Y.Appl.Microbiol.Biotechnol.1996,45,363−370)またはThiocapsa pfennigii(米国特許第6,011,144号)由来のシンターゼ)を用いて達成される。
ゼ、アセトアセチル−CoAレダクターゼ、広範な基質特異性PHAシンターゼおよびアシルCoAシンテターゼを含む)を細胞質ゾルに標的化し、細胞質ゾル中にポリマー蓄積を得る。
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CN114717208B (zh) * | 2022-05-18 | 2024-07-09 | 上海交通大学 | 一种酰基CoA合成酶及其应用 |
WO2024072953A1 (en) * | 2022-09-30 | 2024-04-04 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | In vitro bioproduction of specific chain length poly(hydroxyalkanoate) monomers |
Family Cites Families (26)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5352605A (en) * | 1983-01-17 | 1994-10-04 | Monsanto Company | Chimeric genes for transforming plant cells using viral promoters |
US5034322A (en) * | 1983-01-17 | 1991-07-23 | Monsanto Company | Chimeric genes suitable for expression in plant cells |
US5668298A (en) * | 1984-12-24 | 1997-09-16 | Eli Lilly And Company | Selectable marker for development of vectors and transformation systems in plants |
US5420034A (en) * | 1986-07-31 | 1995-05-30 | Calgene, Inc. | Seed-specific transcriptional regulation |
US5276268A (en) * | 1986-08-23 | 1994-01-04 | Hoechst Aktiengesellschaft | Phosphinothricin-resistance gene, and its use |
US5268463A (en) * | 1986-11-11 | 1993-12-07 | Jefferson Richard A | Plant promoter α-glucuronidase gene construct |
US5245023A (en) * | 1987-06-29 | 1993-09-14 | Massachusetts Institute Of Technology | Method for producing novel polyester biopolymers |
US5250430A (en) * | 1987-06-29 | 1993-10-05 | Massachusetts Institute Of Technology | Polyhydroxyalkanoate polymerase |
US5614395A (en) * | 1988-03-08 | 1997-03-25 | Ciba-Geigy Corporation | Chemically regulatable and anti-pathogenic DNA sequences and uses thereof |
EP0463056A1 (en) * | 1989-03-17 | 1992-01-02 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | External regulation of gene expression |
US5302523A (en) * | 1989-06-21 | 1994-04-12 | Zeneca Limited | Transformation of plant cells |
ES2131489T3 (es) | 1989-07-10 | 2003-05-16 | Massachusetts Inst Technology | Una planta o una celula vegetal recombinante capaz de producir polihidroxibutirato u otro polihidroxialcanoato. |
WO1993020216A1 (en) | 1991-02-22 | 1993-10-14 | University Technologies International, Inc. | Oil-body protein cis-elements as regulatory signals |
US5650554A (en) * | 1991-02-22 | 1997-07-22 | Sembiosys Genetics Inc. | Oil-body proteins as carriers of high-value peptides in plants |
GB9304200D0 (en) * | 1993-03-02 | 1993-04-21 | Sandoz Ltd | Improvements in or relating to organic compounds |
DK152291D0 (da) | 1991-08-28 | 1991-08-28 | Danisco | Fremgangsmaade og kemiske forbindelser |
DE69334225D1 (de) * | 1992-07-07 | 2008-07-31 | Japan Tobacco Inc | Verfahren zur transformation einer monokotyledon pflanze |
GB9326271D0 (en) * | 1993-12-23 | 1994-02-23 | Zeneca Ltd | Expression of self-processing polyprotein in transgenic plants |
DE4433134A1 (de) * | 1994-09-16 | 1996-03-21 | Buck Chem Tech Werke | Verfahren zur Herstellung von Polyhydroxyfettsäuren sowie rekombinanter Bakterienstämme zur Durchführung des Verfahrens |
US5750848A (en) * | 1996-08-13 | 1998-05-12 | Monsanto Company | DNA sequence useful for the production of polyhydroxyalkanoates |
US5932440A (en) * | 1996-08-16 | 1999-08-03 | Life Technologies, Inc. | Mammalian ribonuclease inhibitors and use thereof |
FI972293A (fi) | 1997-05-30 | 1998-12-01 | Joseph Atabekov | Useamman kuin yhden geenin yhteisekspressiomenetelmät |
US6143952A (en) * | 1998-03-31 | 2000-11-07 | Regents Of The University Of Minnesota | Modified pseudomonas oleovorans phaC1 nucleic acids encoding bispecific polyhydroxyalkanoate polymerase |
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