ES2243235T3 - Metodo para la produccion de polihidroxialcanoatos en organismos recombinantes. - Google Patents

Abstract

Método para la producción de un polihidroxialcanoato en un hospedante, que comprende: seleccionar un hospedante para la expresión de genes que codifican enzimas requeridas para la síntesis de un polihidroxialcanoato; introducir en dicho hospedante genes estructurales que codifican una tioesterasa, una acil-CoA sintetasa, una tiolasa, una proteína de -oxidación peroxisomal de levadura que tiene actividad de 3- hidroxiacil-CoA dehidrogenasa que producirá R-(-)- hidroxiacil CoA a partir de una ceto amino-CoA, y una polihidroxialcanoato sintasa; expresar las enzimas codificadas por los genes; y proporcionar los sustratos adecuados para las enzimas expresadas para la síntesis del polihidroxialcanoato.

Description

Método para la producción de polihidroxialcanoatos en organismos recombinantes.

La presente invención se refiere a un método para la producción de polihidroxialcanoatos en organismos recombinantes.

Antecedentes de la invención

Los materiales plásticos se han convertido en una parte integral de la vida contemporánea debido a que poseen muchas propiedades deseables, incluyendo durabilidad y resistencia a la degradación. Durante los últimos 10-20 años, su extenso uso ha sido considerado cada vez más como una fuente de problemas medioambientales y de tratamiento de residuos. Las sociedades industriales son ahora más conocedoras del impacto del plástico desechado sobre el medio ambiente y de su efecto perjudicial sobre la vida salvaje y las calidades estéticas de ciudades y bosques. Los problemas asociados con la distribución de residuos y la reducción de la disponibilidad de vertederos han centrado también la atención sobre los materiales plásticos, los cuales se acumulan en el medio ambiente en una cantidad de 25 millones de toneladas por año (Lee, 1996). Estos problemas han creado mucho interés en el desarrollo y producción de plásticos biodegradables. Los polímeros biodegradables están constituidos de material que puede ser degradado bien por hidrólisis no enzimática o bien por la acción de enzimas secretadas por microorganismos. Las estimaciones del mercado mundial actual para estos plásticos biodegradables ascienden hasta 1,3 billones de kilogramos por año (Lindsay, 1992).

Entre los diversos plásticos biodegradables disponibles, existe un interés cada vez mayor en el grupo de polihidroxialcanoatos (PHAs). Estos son polímeros naturales producidos por una variedad de bacterias y son 100% biodegradables. A través del cambio de la fuente de carbono y cepas bacterianas utilizadas en los procesos de fermentación, se han producido biopolímeros de PHA que tienen una amplia variedad de propiedades mecánicas. Sus características físicas van desde productos cristalinos puros a elásticos, en función de la composición de las unidades monómeras (Anderson & Dawes, 1990). La mayoría de los PHAs están constituidos por monómeros de ácidos R-(-)-3-hidroxialcanoicos que tienen una longitud de 3 a 14 átomos de carbono (C3-C14). El miembro más simple de la familia, P(3HB) (C4), es altamente cristalino, relativamente rígido y se hace frágil tras un periodo de días de almacenamiento bajo condiciones ambientales (Barham et al., 1984; De Koning et al., 1992; Doi, 1990; Holmes, 1988). Por tanto, se han realizado intentos para disminuir la fragilidad de P(3HB) bien mediante la incorporación de comonómeros tal como P(3HV), bien mediante la mezcla con otros polímeros o bien mediante la mezcla con P(3HB) atáctico sintetizado químicamente (colmes, 1988; Kumagai & Doi, 1992a, 1992b, 1992c; Pearce & Marchessault, 1994).

El copolímero P(3HB-co-3HV), desarrollado por ZENECA con el nombre comercial BIOPOL™, tiene propiedades mecánicas mejoradas en comparación con P(3HB). A medida que aumenta la fracción P(3HV) (C5), el polímero se vuelve más tenaz, más flexible y tiene un mayor alargamiento a la rotura (Doi et al., 1990). Los PHAs de longitud de cadena media (MCL) son elastómeros semicristalinos con un bajo punto de fusión, baja resistencia a la tracción y alto alargamiento a la rotura. De este modo, presentan características físico-químicas que los hacen más atractivos que el P(3HB) homogéneo; se pueden emplear como un caucho biodegradable después de la reticulación mediante irradiación con rayos de electrones (De Koning et al., 1994; Gagnon et al., 1992; Gross et al., 1989; Preusting et al., 1990).

Se ha comprobado que los PHAs están presentes en más de 90 géneros de especies de bacterias Gram-positivas y Gram-negativas (Steinbüchel, 1991). Han sido caracterizados más de 40 PHAs diferentes, conteniendo algunos polímeros enlaces insaturados o varios grupos funcionales (Steinbüchel, 1991). Las bacterias sintetizan y acumulan PHAs como materiales de reserva de carbono y energía o como un sumidero de poder reductor redundante bajo la condición de nutrientes limitadores en presenciad e un exceso de fuentes de carbono (Byrom, 1994; Doi, 1990; Steinbüchel & Valentin, 1995). Cuando se restablece el suministro del nutriente limitador, los PHAs son degradados por depolimerasas intracelulares y posteriormente metabolizados como fuentes de carbono y energía (Byrom, 1990; Doi, 1990). Los 3Has monómeros liberados tras la degradación de estos poliésteres microbianos se encuentran todos ellos en la configuración R-(-) debido a la estereoespecificidad de enzimas biosintéticas (Anderson & Dawes, 1990). Los pesos moleculares de los polímeros son del orden de 2x10^{5} a 3x10^{6} Daltons, en función del microorganismo y de las condiciones de crecimiento (Byrom, 1994).

Los PHAs se acumulan en las células como gránulos discretos, cuyo número por célula y cuyo tamaño pueden variar entre las diferentes especies; se han observado 8 a 13 gránulos por célula de 0,2 a 0,5 \mum de diámetro en Alcaligenes eutrophus (Byrom, 1994).

Los PHAs se pueden subdividir en dos grupos dependiendo del número de átomos de carbono en las unidades monómeras: PHAs de longitud de cadena corta (SCL), que contienen 3-5 átomos de carbono, y PHAs de longitud de cadena media (MCL), que contienen 6-14 átomos de carbono (Anderson & Dawes, 1990). Esto se debe principalmente a la especificidad por el sustrato de las PHA sintasas que únicamente pueden aceptar monómeros 3HA de un cierto intervalo de longitudes de átomos de carbono (Anderson & Dawes, 1990). La PHA sintasa de Alcaligenes eutrophus puede polimerizar monómeros C3-C5, pero no C6 o superiores. Por otro lado, la PHA sintasa de Pseudomonas oleovorans solo acepta monómeros C6-C14. De particular interés es la capacidad de alguna PHA sintasa para polimerizar 3-hidroxi-, 4-hidroxi- y 5-hidroxi-alcanoatos (Steinbüchel & Schlegel, 1991). Incluso aunque la mayoría de las PHA sintasas examinadas hasta la fecha son específicas para la síntesis de SCL- o MCL-PHAs, recientemente se han expuesto al menos seis casos en donde las bacterias son capaces de sintetizar copolímero consistente en unidades SCL y MCL (Lee, 1996).

El P(3HB) es el PHA más amplio y caracterizado a fondo y la mayor parte del conocimiento ha sido obtenido a partir de Alcaligenes eutrophus (Steinbüchel, 1991). En esta bacteria el P(3HB) se sintetiza a partir de acetil-CoA mediante la acción secuencial de tres enzimas (figura 1). La primera de ellas, 3-cetotiolasa, cataliza la condensación reversible de dos mitades acetil-CoA a forma acetoacetil-CoA. La acetoacetil-CoA reductasa reduce posteriormente acetoacetil-CoA a R-(-)-3-hidroxibuturil-CoA, el cual se polimeriza entonces mediante la acción de PHA sintasa para formar P(3HB). Se han producido varios PHAs con diferentes monómeros C3 a C5 en A. eutrophus, estando influenciada la naturaleza y proporción de estos monómeros por el tipo y cantidad relativa de las fuentes de carbono suministradas a los medios de crecimiento (Steinbüchel & Valentin, 1995).

Pseudomonas oleovorans y la mayoría de las pseudomónadas pertenecientes al grupo de homología de rRNA ribosómico I sintetizan MCL-PHAs a partir de varios MCL-alcanos, alcanoles o alcanoatos (Steinbüchel & Valentin, 1995). La composición del PHA producido está relacionada con el sustrato usado para el crecimiento, estando constituido fundamentalmente el polímero por monómeros que son 2n carbonos más cortos que los sustratos utilizados. Se ha sugerido que la acil-CoA derivada de ácidos alcanoicos entra en la vía de \beta-oxidación y las R-(-)-3hidroxiacil-CoA intermedias utilizadas por la PHA sintasa son generadas bien a través de la reducción de 3-cetoacil-CoA por una cetoacil-CoA reductasa, bien por conversión de S-(+)-3hidroxiacil-CoA normalmente producida por la vía al isómero R-(-) por una epimerasa, o bien por la hidratación directa de enoil-CoA por una enoil-CoA hidratasa (Poirier et al., 1995).

La mayoría de las pseudomónadas pertenecientes al grupo de homología de rRNA I, excepto P. oleovorans, sintetizan también MCL-PHAs cuando se hacen crecer sobre sustratos no relacionados con ácidos grasos y alcanoatos, tales como gluconato, lactato, glicerol y hexosas (Anderson & Dawes, 1990; Huijberts et al., 1994; Timm & Steinbüchel, 1990). Estos sustratos han de ser convertidos primeramente a acetil-CoA que ha de ser utilizada para la biosíntesis de PHAs. Esto sugiere que, en teoría, los microorganismos, las plantas e incluso los animales, deben ser capaces de sintetizar PHA después de la transfección de un número limitado de genes. En estas bacterias, se han propuesto tres vías principales para la síntesis de precursores de PHA (Huijberts et al., 1992, 1994).

(i)

Un análisis detallado de la composición de PHA producido por P. putida crecida en glucosa ha demostrado que los monómeros son estructuralmente idénticos a las mitades acilo de los compuestos intermedios de 3-hidroxiacil-ACP de la biosíntesis de novo de ácidos grasos. Puesto que no se ha demostrado que la PHA sintasa pueda aceptar acil-ACPs como sustratos, estos han de ser por tanto convertidos a acil-CoAs por una transacilasa antes de entrar en la vía de PHA.

(ii)

La degradación de ácidos grasos por \beta-oxidación es la principal vía cuando los ácidos grasos se emplean como sustrato.

(iii)

Se ha comprobado que algunas de las unidades monómeras de PHA son una unidad C2 más largas que el ácido graso empleado como sustrato. Se ha sugerido por tanto el alargamiento de la cadena por condensación de una acetil-CoA a la acil-CoA.

Surge así un cuadro complejo en el cual se desconocen en la actualidad las etapas que conectan las diferentes vías implicadas y la síntesis de PHA (figura 2). Se ha supuesto, pero no demostrado, que el sustrato final para la polimerización es la forma R de los 3-hidroxi-ácidos grasos intermedios activados por CoA. La expresión de las sintasas de P. putida en E. coli de tipo salvaje no es suficiente para producir PHA en esta bacteria (Huisman, 1991). Se necesita al parecer más información genética de Pseudomonas spp. Para permitir la síntesis de PHA en Escherichia coli. Se puede especular que la etapa ausente en organismos procarióticos distintos de las pseudomónadas es la formación de R-(-)-3-OH-acil-CoA de más de 5C.

El enfoque bio(tecno)lógico para la producción de PHAs utiliza sistemas microbianos. El principal inconveniente comercial de los PHAs bacterianos así producidos es su alto coste de producción, haciéndolos así sustancialmente más costosos que los plásticos sintéticos. En la actualidad, Zeneca produce aproximadamente 1.000 toneladas por año de copolímero P(3HB-co-3HV) a un coste de aproximadamente \textdollar16/kg. A un régimen de producción de 10.000 toneladas por año o más, el escenario más optimista impondría un coste de \textdollar5/kg. Teniendo en cuenta el coste de muchos plásticos sintéticos, tales como polipropileno y polietileno, que es inferior a \textdollar1/kg, el PHA aparece como demasiado costoso para la mayoría de los productos comerciales de bajo valor (Poirier et al.,
1995).

La ingeniería de nuevas vías en sistemas de células eucarióticas parece ser una alternativa beneficiosa a la producción de PHAs en bacterias. Por un lado, se pueden emplear células de levaduras e insectos como modelos para obtener información sobre la síntesis de PHAs en eucariotas (Hahn et al., 1996; Sherman, 1996). Por otro lado, a partir de la demostración de su producción en plantas transgénicas ha surgido una nueva posibilidad para la producción de PHAs a gran escala y a costes comparables a los de los plásticos sintéticos (Poirier et al., 1992). La producción de PHA a escala agronómica podría permitir la síntesis de plásticos biodegradables en la escala de millones de toneladas en comparación con la fermentación que produce material en la escala de miles de toneladas (Poirier et al., 1995). Además, la producción de PHAs de plantas utilizaría dióxido de carbono, agua y luz solar como materias primas para producir PHA de un modo respetuoso con el medio ambiente y sostenible.

La síntesis de PHB en plantas fue explorada inicialmente mediante la expresión de los genes biosintéticos de PHB de A. eutrophus en la planta Arabidopsis thaliana (Poirier et al., 1992). Aunque no es de importancia agrícola, esta pequeña planta oleaginosa fue elegida por su extensivo uso como un sistema modelo para estudios genéticos y moleculares en plantas. Dichas plantas acumulaban gránulos de P(3HB) que eran de 0,2 a 0,5 \mum de diámetro en el núcleo, vacuolos y citoplasma. Sin embargo, la cantidad de P(3HB) acumulado fue de solo 100 \mug/g de peso en fresco. Por otro lado, las plantas resultaron perjudicadas en su crecimiento, debido probablemente a la severa desviación del sustrato respecto de la vía de mevalonato que es esencial para la síntesis de clorofila.

Para evitar este problema y mejorar la acumulación de polímero, se ha realizado otra manipulación genética para desviar el carbono reducido respecto de las vías metabólicas endógenas y para regular la especificidad del tejido y la temporización de la expresión genética. Se sugirió que el plástido era el sitio ideal para la acumulación de P(3HB) debido a que es el sitio de alto flujo de carbono a través de acetil-CoA. En esta situación, se dirigieron con éxito genes construidos genéticamente de A. eutrophus hacia los plástidos de plantas, en donde las enzimas eran activas (Nawrath et al., 1995). Los genes de la biosíntesis de PHA en A. eutrophus fueron modificados para el reconocimiento de plástidos mediante la fusión del péptido de tránsito de ribulosa bifosfato carboxilasa a sus extremos N-terminales y se pusieron bajo el control del promotor constitutivo 35S de CaMV. El híbrido que expresa las enzimas de síntesis de PHA en A. eutrophus acumuló P(3HB) en una cantidad de hasta 10 mg/g de peso en fresco, lo que representa alrededor del 14% del peso en seco.

En conocimiento adquirido en este estudio no solo es útil para optimizar las estrategias para la producción de PHB en organismos recombinantes, sino que también podría utilizarse para la producción de PHAs distintos de PHB, por ejemplo MCL-PHAs. Para que la producción de PHAs en plantas llegue a ser comercialmente viable, los genes han de ser transfectados en especies de plantas adecuadas que tengan las propiedades agronómicas que proporcionen altos rendimientos de PHA por hectárea, a escala ilimitada y a precios económicos. Se han de elegir señales de localización subcelular y promotores que permitan utilizar las enzimas para interceptar los metabolitos deseados de las plantas para su incorporación en el polímero.

Se han propuesto diferentes estrategias para la producción de PHAs en plantas. Se ha propuesto llevar a cabo la sustitución de cuerpos oleosos citoplásmicos por gránulos de PHA, la producción de PHAs en glioxisomas o la producción de PHAs en leucoplastos, en tejidos acumuladores de lípidos de cultivos oleaginosos, tal como el endosperma de las semillas o el mesocarpo de frutos (van der Leig & Witholt, 1995; Hahn et al., 1996; Srienc & Leaf, 1996). En este tejido, los triglicéridos proporcionan energía y carbono para la germinación de la nueva planta antes del establecimiento de la fotosíntesis. En contraste, los PHAs no se degradarían en plantas debido a la ausencia de enzimas endógenas capaces de hidrolizar el polímero. La interferencia con la síntesis y la degradación de ácidos grasos, en plástidos y glioxisomas respectivamente, mediante el desvío de energía a los PHAs en esta fase del desarrollo, es probable que perjudiquen a la germinación y/o crecimiento de la plántula. Como un evento posterior a la cosecha, esto puede resultar deseable. Sin embargo, esta característica inherente de la estrategia propuesta creará problemas en la producción de semillas híbridas viables. La expresión de las enzimas durante la germinación deberá restringirse a la segunda generación de semillas o frutos. Para esto, tendrán que encontrarse soluciones. Es probable que la expresión controlada de estos genes necesitará el uso de promotores estimulados por señales externas (Williams et al., 1992).

Los plástidos son considerados como las dianas más susceptibles para la producción de PHA. La producción en cloroplastos, directamente acoplada a la síntesis de novo de ácidos grasos, presenta muchas ventajas. En primer lugar, se pueden emplear todos los cultivos importantes. En segundo lugar, en las hojas, el metabolismo de ácidos grasos no es tan importante como en las semillas y el direccionamiento hacia este tejido no es probable que perjudique el crecimiento de la planta. En tercer lugar, se trata de la vía más directa para la producción de PHAs, puesto que la planta no ha de producir ácidos grasos de cadena larga o triglicerol antes del desvío de los productos de degradación de ácidos grasos a los PHAs, igual que en el caso de los mecanismos degradativos glioxisómicos. En cuarto lugar, como se ha demostrado para la síntesis de PHB, la compartimentación en plástidos no perjudica el crecimiento, pudiendo resultar favorecido con respecto a la síntesis no restringida en el citosol.

Pseudomonas aeruginosa pertenece al grupo de pseudomónadas del grupo de homología de rRNA I que sintetizan MCL-PHAs cuando se hacen crecer en alcanos o en sustratos no relacionados tal como glucosa (Timm & Steinbüchel, 1990). Se identificó un emplazamiento de PHA sintasa en P. aeruginosa mediante el uso de una sonda oligonucleótida sintética 30-mer marcada con ^{32}P, cuyo diseño de secuencia estaba basado en el de una región altamente conservada de PHA sintasas en A. europhus y P. oleovorans (Steinbüchel et al., 1992). La organización del emplazamiento consiste en dos genes que codifican PHA sintasas (phaC1, phaC2) separados por un gen que codifica una depolimerasa putativa de PHA (phaD), y un cuarto gen (ORF3) aguas abajo de phaC2 con una función desconocida (Timm & Steinbüchel, 1992). Se ha comprobado que estas sintasas son similares a las encontradas en P. oleovorans, que es incapaz de sintetizar MCL-PHAs a partir de sustratos no relacionados (Huijberts et al., 1992).

Como quedó demostrado en P. aeruginosa, es probable que los compuestos intermedios de la biosíntesis de ácidos grasos y \beta-oxidación contribuyan a la formación de polímeros PHA. Es sumamente probable que los precursores intermedios a la síntesis de PHA sean cetoacil-CoA, S-(+)-3-OH-acil-CoA o R-(-)-3-OH-acil-ACP. Sin embargo, puesto que la especificidad del sustrato para PHA sintasa no ha sido ensayada aún a fondo, todavía no resulta claro si esta enzima podría aceptar o no otras formas derivadas de mitades 3-hidroxiacilo, tal como, por ejemplo, derivados de ACP. Esto puede tener un impacto importante sobre la elección de la mejor estrategia para la producción en organismos recombinantes: si la enzima recombinante puede aceptar, incluso en proporciones inferiores a las óptimas, derivados de ACP como sustrato, entonces su direccionamiento a cloroplastos sería la única alteración de ingeniería requerida y necesaria para inducir la acumulación de PHA en células de hojas.

Las unidades monómeras de PHAs, como ocurre en el caso de PHBs, son de la forma isómera R-(-); esto ha podido demostrarse repetidamente mediante el análisis del hidrolizado a partir de gránulos de PHA. El análisis enzimológico demuestra también que las PHB sintasas tienen una especificidad definida para R-(-)-3-OH-acil-CoA como sustratos. Aunque la especificidad para el sustrato de PHA sintasas no ha sido aún caracterizada a fondo con preparados enzimáticos purificados, su alta homología con PHB sintasas y análisis de su producto de reacción sugieren fuertemente que las mismas comparten una preferencia para sustratos de R-(-)-3-OH-acil-CoA con las PHB sintasas.

No se ha demostrado una vía metabólica que pudiera suministrar subunidades monómeras a la reacción de polimerización en pseudomónadas ni en cualesquiera otros organismos. Las vías de degradación conocidas que comienzan con acil-CoAs producen S-(-)-3-OH-acil-CoAs y las vías sintéticas producen R-(-)-acil-ACPs, ninguna de las cuales puede servir como sustrato para la reacción de síntesis de PHA.

La WO 99/00505 describe un método para la biosíntesis de copolímeros de 3-hidroxibutirato (3HB) y 3-hidroxivalerato (3HV) en plantas por manipulación de las vías metabólicas normales utilizando técnicas recombinantes. Esta referencia proporciona secuencias de nucleótidos que codifican E1\alpha y E2\beta y el componente E2 del complejo de plástido tiruvato dehidrogenasa y las subunidades E1\alpha y E1\beta y el componente E2 del complejo de oxoácido de cadena ramificada dehidrogenasa de Arabidopsis thaliana. Estas secuencias de nucleótidos y los polipéptidos enzimáticos codificados por las mismas se pueden introducir en plantas en varias combinaciones con secuencias de codificación para las referidas enzimas, con el fin de mejorar la conversión de trionina a 2-oxibutirato, propionato, propionil-CoA, \beta-cetovaleril-CoA y \beta-hidroxivaleril-CoA.

La WO 95/05472 describe un método para la producción de ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico (PHB) y polihidroxialcanoatos (PHA) relacionados en plástidos de plantas. De acuerdo con esta referencia, el material vegetal contiene DNA foráneo que codifica un polipéptido bacteriano elegido del grupo consistente en 3-cetotiolato, acetoacetil-CoA reductasa y polihidroxialcanoato (PHA) y mezclas de los mismos que conducen a la producción de polihidroxialcanoato en el plástido de la planta.

La WO 98/00557 describe un método para la biosíntesis de copolímeros de 3-hidroxibutirato (3HB) y 3-hidroxivalerato (3HV) en plantas y bacterias mediante la manipulación de las vías metabólicas normales utilizando técnicas recombinantes. Concretamente, la referencia describe un método para proporcionar una variedad de enzimas de tipo salvaje y/o desreguladas implicadas en la biosíntesis de la familia aspartato de aminoácidos y formas de tipo salvaje o desreguladas de enzimas implicadas en la conversión de treonina a productos finales de copolímero P(3HB-co-3HV).

Como otros antecedentes, deberán revisarse las siguientes Patentes US: 5.650.555; 5.502.273; 5.245.023; 5.610.
041; 5.229.279; 5.534.432; 5.750.848; 5.663.063; 5.480.794; 5.750.848; 5.801.027; 5.298.421 y 5.250.430.

Resumen de la invención

Esta invención está dirigida a la producción de polihidroxialcanoatos en organismos recombinantes, a través de la construcción de una nueva vía metabólica que produce subunidades monómeras de R-(-)-3-OH-acil-CoAs de longitud adecuada para que sirvan como sustratos para la actividad de PHA sintasas.

Más concretamente, esta invención describe la metodología utilizada para producir un organismo transgénico con una nueva vía metabólica que desvía parcialmente ácidos grasos de sus vías sintéticas normales, hacia la formación de R-(-)-3-OH-acil-CoAs que sirve como sustrato para la síntesis de polímeros de hidroxialcanoatos en cloroplastos.

La vía metabólica sintética construida según la presente invención produce inicialmente ácidos grasos (C_{8}) libres a partir de la vía de síntesis de ácidos grasos a través de la acción de una tioesterasa, que adicionará entonces una mitad CoA al ácido graso libre a través de la acción de una acil-CoAs sintasa, que producirá 3-(-)-cetoacil-CoAs a partir de la acil-CoA a través de la acción de una tiolasa, que producirá R-(-)-3-OH-acil-CoAs a partir del 3-cetoácido-CoAs a través de la acción de una isoforma única de dehidrogenasa de levadura. Estas R-(-)-3-OH-acil-CoAs se utilizarán finalmente como sustrato para la reacción de la PHA sintasa.

De este modo, de acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para la producción de polihidroxialcanoatos que comprende: seleccionar un organismo transgénico que comprende una secuencia de DNA foráneo que codifica una enzima que tiene actividad de dehidrogenasa, la cual producirá una R-(-)-hidroxiacil-CoA a partir de un cetoácido-CoA, en donde dicha R-(-)-hidroxiacil-CoA servirá como sustrato para la polihidroxialcanoato sintasa; y producir dicho polihidroxialcanoato.

Además, de acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para producir un polihidroxialcanoato en un hospedante que comprende: seleccionar un hospedante para la expresión de genes que codifican las enzimas requeridas para la síntesis de un polihidroxialcanoato; introducir en dicho hospedante genes estructurales que codifican enzimas seleccionadas del grupo consistente en: una tioesterasa, una acil-CoA sintasa, una tiolasa, una hidroxiacil-CoA dehidrogenasa y una polihidroxialcanoato sintasa; expresar las enzimas codificadas por los genes; y proporcionar los sustratos adecuados para las enzimas expresadas para la síntesis del polihidroxialcanoato.

De acuerdo con la presente invención, se proporciona también un vector de clonación que comprende DNA foráneo que codifica una enzima que tiene actividad de dehidrogenasa, la cual producirá R-(-)-hidroxiacil-CoA a partir de un cetoácido-CoA. De acuerdo con una modalidad de la invención, el vector de clonación comprende además una secuencia de DNA que codifica una enzima que tiene actividad de tioesterasa; una enzima que tiene actividad de acil-CoA sintasa; una enzima que tiene actividad de tiolasa; y una enzima que tiene actividad de polihidroxialcanoato sintasa.

De acuerdo con la presente invención se proporciona también una célula hospedante que comprende DNA foráneo que codifica una enzima que tiene actividad de dehidrogenasa, la cual producirá R-(-)-hidroxiacil-CoA a partir de un cetoácido-CoA. De acuerdo con una modalidad de la invención, la célula hospedante comprende además una secuencia de DNA que codifica una enzima que tiene actividad de dioesterasa; una enzima que tiene actividad de acil-CoA sintasa; una enzima que tiene actividad de tiolasa; y una enzima que tiene actividad de polihidroxialcanoato sintasa.

De acuerdo con la presente invención, se proporciona también un organismo transgénico que comprende DNA foráneo que codifica una enzima que tiene actividad de dehidrogenasa, la cual producirá R-(-)-hidroxiacil-CoA a partir de un cetoácido-CoA. De acuerdo con una modalidad de la invención, el organismo transgénico comprende además una secuencia de DNA que codifica una enzima que tiene actividad de tioesterasa; una enzima que tiene actividad de acil-CoA sintasa; una enzima que tiene actividad de tiolasa; y una enzima que tiene actividad de polihidroxialcanoato sintasa. En un ejemplo de esta modalidad, el organismo transgénico es una planta.

Breve descripción de los dibujos

Estas y otras características de la invención llegarán a ser más evidentes a partir de la siguiente descripción en la cual se hace referencia a los dibujos adjuntos en donde:

La figura 1 muestra la vía para la producción de P(3HB) por Alcaligenes eutrophus.

La figura 2 es una vía hipotética para la síntesis de PHAs a partir de pseudomónadas.

La figura 3 es la vía sintética de la presente invención que muestra las cinco etapas implicadas en la producción de PHAs de longitud de cadena media.

La figura 4 muestra los constructos de DNA de la presente invención.

La figura 5 muestra las secuencias de DNA para pKitmus/Rbsck-DH-3' nc, Figura 5a (SEQ ID NO:1) (Los sitios SalI, SphI, ApaI, EcoRI y SmaI están subrayados y el sitio ATG está en negrita); pUC/35S.C4PPDK.DH.3' nc, Figura 5b (SEQ ID NO:2) (Los sitios XhoI, SphI, ApaI y EcoRI están subrayados y el ATG de la proteína está en negrita); y pCambia/RbscK-DH-3' nc, Figura 5c (SEQ ID NO:3) (Los sitios SalI, SphI, ApaI, EcoRI y SmaI están subrayados y el ATG de la proteína está en negrita).

La figura 6 muestra la actividad de dehidrogenasa en E. coli. La actividad reguladora se muestra en la figura 6a y la parte lineal del gráfico que presenta la actividad de D-3-hidroxiacil-CoA se muestra en la figura 6b.

Descripción de la modalidad preferida

La presente invención está dirigida a la producción de polihidroxialcanoatos en organismos recombinantes, a través de la construcción de una nueva vía metabólica que produce subunidades monómeras de R-(-)-3-OH-acil-CoAs de longitud adecuada para servir como sustratos para la actividad de PHA sintasas.

Más concretamente, la presente invención está dirigida a una metodología utilizada para producir organismos transgénicos con una nueva vía metabólica que desvía parcialmente ácidos grasos de sus vías sintéticas normales, hacia la formación de R-(-)-3-OH-acil-CoAs que sirve como sustratos para la síntesis de polímeros de hidroxialcanoatos en cloroplastos. La nueva vía sintética de la presente invención se muestra en la figura 3.

En una modalidad de la presente invención, el organismo transgénico es una planta o cualquier órgano de una planta en donde exista actividad de plástidos activos.

De acuerdo con la presente invención, ejemplos de plantas adecuadas incluyen, pero no de forma limitativa, Arabidopsis, tabaco, alfalfa y plantas de tubérculos tales como patata, boniato, remolacha y mandioca.

Con anterioridad a la presente invención, no ha podido demostrarse una vía metabólica que pudiera suministrar subunidades monómeras a la reacción de polimerización en pseudomónadas ni en cualesquiera otros organismos. Las vías de degradación conocidas que comienzan con acil-CoAs producen S-(-)-3-OH-acil-CoAs y las vías sintéticas producen R-(-)-acil-ACPs, ninguna de las cuales puede servir como sustrato para la reacción de síntesis de PHA. De este modo, la presente invención está dirigida a una vía sintética que producirá R-(-)-OH-acil-CoAs a partir de 3-cetoácido-CoAs a través de la acción de una isoforma de dehidrogenasa de levadura. Dichas R-(-)-OH-acil-CoAs servirán entonces como sustrato para la reacción de PHA sintasa.

De acuerdo con la presente invención, el término "polihidroxialcanoato" está destinado a incluir un polímero de monómeros de ácidos R-(-)-3-hidroxialcanoicos de alrededor de 3 a 14 átomos de carbono de longitud. En una modalidad de la presente invención, se emplea la PHA sintasa de Pseudomonas aeruginosa en la última etapa de la vía sintética. Esta enzima prefiere, como sustrato, R-(-)-3-OH-acil-CoAs de C6 a C14.

La vía biosintética de la presente invención implica cinco enzimas: una tioesterasa, una acil-CoA sintasa, una tiolasa, una D-3-hidroxiacil-CoA dehidrogenasa y una PHA sintasa.

La primera reacción es catalizada por una tioesterasa. En una modalidad de la presente invención, la enzima ha sido clonada a partir de una biblioteca de cDNA de Cuphea hookeriana, un arbusto mejicano que acumula hasta 75% de ácidos grasos C8:0 y C10:0 en las semillas. Este clon Cl FatB2 (GenBnak registro #U39834) ha sido expresado den E. coli en donde exhibió una alta especificidad para C8:0 y C10:0-ACPs como sustratos. En los cloroplastos, esta enzima separa C8- y C-10 acil-ACPs de la vía sintética de ácidos grasos y libera ácidos grasos libres de longitud de cadena media en el estroma al igual que lo hacen las tioesterasas endógenas con C16- y C18-acil-ACPs en la vía sintética de ácidos grasos (Dehesh, K. et al., 1996, The Plant Journal 9(2): 167-172).

La segunda reacción es catalizada por una acil-CoA sintetasa. En una modalidad de la invención, la enzima se aisló a partir de Pseudomonas oleovorans, una bacteria que acumula PHAs_{mcl} (polihidroxialcanoatos de longitud de cadena media). La enzima es codificada por el gen K del operón alkBFGHJKL, el cual es responsable de la síntesis de alcanoatos. Esta acil-CoA sintetasa (GenBank registro #X65936) es específica a ácidos grasos de longitud de cadena media (van Beilen, J.B. et al. (1992) DNA sequence determination and functional characterization of the OCT-plasmid-encoded alkJKL genes of Pseudomonas oleovorans. Molecular Microbiology 6(21):
3121-3136).

La tercera reacción es catalizada por una ceto tiolasa. Esta reacción es una reacción de condensación que adicionará una mitad acetil-CoA a la acil-CoA, liberando así una molécula de CoA. Esta reacción de condensación es reversible y crea una 3-cetoacil CoA con dos carbonos extra. Los productos que surgen de esta reacción serán por tanto C10- y C12-3-OH-acil CoAs y CoA libre. La enzima descrita en un ejemplo de la presente invención ha sido aislada a partir de Brassica napus, en donde forma parte de la vía de oxidación (Olesen, C.J. et al. (1997) The glyoxysomal 3-ketoacyl-CoA thiolase precursor from Brassica napus has enzymatic activity when synthesized in E. coli (FEBS Letters 6(21): 138-140; GenBank registro #X93015).

La cuarta reacción, de acuerdo con la presente invención, es catalizada por una 3-hidroxiacil-CoA dehidrogenasa de levadura que produce R-(-)-3-OH-acil-CoAs (Hiltunen, J.K. et al. (1992) Peroxisomal multi functional B-oxidation protein of Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 267:6646-6653; GenBank registro #M86456). Los homólogos de esta 3-ceto-acil-CoA dehidrogenasa producen normalmente S-(-)-3-OH-acil-CoAs en la vía de \beta-oxidación. El dominio de 3-hidroxiacil-CoA dehidrogenasa de la proteína multifuncional (MFP) de levaduras exhibe esta propiedad catalítica única. De este modo, el producto de esta reacción será R-(-)-3-OH-decanoil-CoA y R-(-)-3-OH-dodecanoil-CoA. Ambas moléculas pueden servir como sustrato para la reacción de polimerización catalizada por PHA
sintasas.

La última reacción de esta modalidad es catalizada por una PHA sintasa de Pseudomonas aeruginosa, que acumula grandes cantidades de gránulos de PHA en condiciones de estrés nutriente (Timm, A. and Steinbüchel, A., 1992) Cloning and molecular analysis of the poly(3-hidroxialcanoic acid) gene locus of Pseudomonas aeruginosa PAO1. Eur. J. Appl. Microbiol. 209: 15-30; GenBank registro #X66592). El análisis de los productos de despolimerización demuestra que esta enzima utiliza R-(-)-3-OH-acil-CoAs de C6 a C14 de longitud como sustratos, con una preferencia aparente para R-(-)-3-OH-acil-CoAs C10 y C12.

En una modalidad de la presente invención, cada uno de estos genes es sub-clonado en un vector de expresión adecuado. En una modalidad de esta invención, el hospedante es una célula de una planta y, según la presente invención, se puede emplear cualquier vector de expresión conocido de la planta. Dicho vector de expresión de la planta puede contener una secuencia promotora, una secuencia 5'UTR, una secuencia péptida de tránsito de cloroplastos, la secuencia codificadora completa del gen, un codón de parada, una región 3'UTR que contiene una señal de poliadenilación eucariótica y un sitio de poliadenilación. La señal de poliadenilación se caracteriza normalmente efectuando la adición de residuos de ácido poliadenílico al extremo 3' del precursor de mRNA. Las señales de poliadenilación son reconocidas normalmente por la presencia de homología a la forma canónica 5'AATAAA-3' aunque son usuales variaciones.

Ejemplos de regiones 3' adecuadas son las regiones 3' transcritas no traducidas que contienen una señal de poliadenilación de genes de plásmidos de Agrobacterium inductores de tumores (Ti), tal como la nopalina sintasa (gen Nos) y genes de plantas tal como los genes de proteínas de almacenamiento de soja y la pequeña subunidad del gen de ribulosa-1,5-bifosfato carboxilasa (ssRUBISCO). La región 3' sin traducir del gen estructural del presente constructo se puede emplear, por tanto, para construir genes quiméricos para la expresión en plantas.

El constructo genético quimérico de la presente invención puede incluir también otros amplificadores, bien de la traducción o bien de la transcripción, según pueda ser necesario. Estas regiones amplificadoras son bien conocidas para los expertos en la materia y pueden incluir el codón de iniciación de ATG y secuencias adyacentes. El codón de iniciación debe estar en fase con el marco de lectura de la secuencia codificadora para asegurar la traducción de toda la secuencia. Las señales de control y los codones de iniciación de la traducción pueden ser de diversos orígenes, tanto naturales como sintéticos. Las regiones de iniciación de la traducción pueden ser proporcionadas a partir de la fuente de la región de iniciación de la transcripción, o bien a partir del gen estructural. La secuencia se puede derivar también del promotor seleccionado para expresar el gen y puede ser modificada específicamente con el fin de aumentar la traducción del mRNA.

Para facilitar la identificación de células de plantas transformadas, los constructos de esta invención pueden ser manipulados adicionalmente para incluir marcadores seleccionables de plantas. Marcadores seleccionables útiles incluyen enzimas que proporcionan resistencia a un antibiótico tal como gentamicina, higromicina, kanamicina y similares. Análogamente, son útiles las enzimas que proporcionan la producción de un compuesto identificable por un cambio de color, tal como GUS (\beta-glucuronidasa), o luminiscencia, tal como luciferasa.

Esta invención está dirigida a cualquier medio por el cual los genes de interés pueden ser transfectados en una planta siempre que ello de lugar a una integración y expresión estables. Los medios preferidos son transferencia de DNA mediada por Agrobacterium que requiere fronteras de T-DNA y marcadores seleccionables; bombardeo de DNA, que requiere marcadores seleccionables y electroporación que, en algunos casos, se puede emplear sin marcadores seleccionables. Estos diversos métodos de clonación y transformación de plantas son bien conocidos en la técnica. En relación con estas técnicas véase, por ejemplo, Weissbach and Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academy Press, New York VIII, pp. 421-463 (1988); y Geierson and Corey, Plant Molecular Biology, 2d Ed.
(1988).

También se consideran parte de esta invención los organismos transgénicos que contienen el constructo genético quimérico de la presente invención. En una modalidad de esta invención, el organismo transgénico es una planta. En la técnica se conocen métodos para regenerar plantas enteras a partir de células de plantas y en esta invención no resulta crítico el método de obtención de plantas transformadas y regeneradas. En general, las células de plantas transformadas se cultivan en un medio adecuado, el cual puede contener agentes selectivos, tales como antibióticos, en donde se utilizan marcadores seleccionables para facilitar la identificación de las células de plantas transformadas. Una vez formado el callo, se puede promover la formación de retoños mediante el empleo de las hormonas vegetales adecuadas de acuerdo con métodos conocidos y los retoños pueden ser transferidos al medio de enraizamiento para la regeneración de plantas. Las plantas pueden ser utilizadas entonces para establecer generaciones repetitivas, bien a partir de semillas o bien empleando técnicas de propagación vegetativa.

Cuando se hace referencia a secuencias específicas en la presente invención, ha de entenderse que dichas secuencias incluyen dentro de su alcance secuencias que son "sustancialmente similares" a dichas secuencias específicas. Las secuencias son "sustancialmente similares" cuando al menos el 80% aproximadamente, con preferencia al menos 90% aproximadamente y con suma preferencia al menos 95% aproximadamente de los nucleótidos coinciden en una longitud definida de la molécula. Las secuencias que son "sustancialmente similares" incluyen cualquier sustitución, cancelación o adición dentro de la secuencia. Las secuencias de DNA que son sustancialmente similares pueden ser identificadas en experimentos de hibridación Southern, por ejemplo, bajo condiciones de hibridación rigurosas (véase Maniatis et al., en Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory (1982) p 387 a
389).

Las secuencias específicas, referidas en la presente invención, también incluyen secuencias que son "funcionalmente equivalentes" a dichas secuencias específicas. En la presente invención, las secuencias funcionalmente equivalentes se refieren a secuencias que, aunque no idénticas a las secuencias específicas, proporcionan la misma o prácticamente la misma función. Las secuencias de DNA que son funcionalmente equivalentes incluyen cualquier sustitución, cancelación o adición dentro de la secuencia.

Dado que la creación de la nueva vía metabólica requiere la expresión simultánea de cinco transgenes diferentes, se pueden producir cinco transformantes independientes y se producen genotipos que contienen los cinco transgenes mediante cruce repetido de mono-transgénicos y selección. Alternativamente, se pueden co-transfectar series de genes en constructos individuales, reduciendo así la necesidad de realizar un cruce extensivo. Otros medios para integrar los nuevos genes en cloroplastos incluyen también la transfección directa de DNA sobre DNA cloroplástico mediante recombinación utilizando secuencias de frontera homólogas o heterólogas. Empleando esta metodología, se podrían utilizar constructos policistrónicos (constructo genético múltiple bajo el control de un solo promotor) para producir las 5 modificaciones. Estos métodos son bien conocidos para los expertos en la materia.

Sin bien esta invención ha sido descrita detalladamente con referencia particular a modalidades preferidas de la misma, dichas modalidades se ofrecen para ilustrar y de ningún modo limitar la invención, tal como se muestra en el siguiente ejemplo.

Ejemplos PHA sintasa

La clonación del gen PhaC1 de PHA sintasa (X66592, Timm, 1992) se realizó por amplificación PCR de DNA genómico de la cepa PAO1 de Pseudomonas aeruginosa con el sistema "Expand" de Boehringer Mannheim. Se extrajo el DNA molde y se purificó. El cebador en el terminal 5' fue 5'GATC GCATGC GAAGGATTTCTATGAGTCAG3'; contiene los sitios de restricción SphI y XmnI aguas arriba de la ATG. El cebador en el terminal 3' fue 5'GATC GAATTCTCATCGTTCATGCACGTAGG3'; se había introducido un sitio EcoR1 aguas abajo del codón de parada. Las condiciones para la PCR fueron:

1

Los productos PCR formados fueron separados sobre geles de agarosa y se retiró del gel la banda correspondiente al tamaño esperado. El DNA purificado fue digerido entonces con SphI/EcoRI y el fragmento de 1.692 pb fue clonado en pUC18. La homología completa del clon seleccionado fue verificada mediante secuenciación. El gel de sintasa fue clonado entonces en los sitios SphI/EcoRI de pGEM-7Zf (Promega) que contienen la región no codificadora 3' (3' nc) del gen SSU-rubisco de RbcsK (Khoudi et al., 1997) previamente clonado en el sitio EcoRI/SmaI. El fragmento SphI/SacI (2.138 pb) que contiene PhaC1 + 3' nc fue entonces sub-clonado en Litmus28 (NE Biolabs) que contiene la región 5' completa de RbcsK con el promotor y el péptido de tránsito (5' RbcsK), previamente clonado en el sitio SalI/SphI. Finalmente, un fragmento de 4.112 pb que contiene 5'RbcsK + PhaC1 + 3' nc fue clonado en el sitio SalI/SacI de pBI 101,2 (Clontech), separando entonces el gen de GUS. Este constructo fue transfectado entonces a la cepa LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens e incorporado en el genoma de las células de las plantas seleccionadas a través de co-cultivo con A. tumefaciens transgénico, en la forma descrita por Desgagnés et al (1995). Las plantas fueron regeneradas a partir de células transgénicas y se utilizó el tejido de la hoja para la selección de las mejores líneas transgénicas mediante análisis Northern. La actividad de PHA sintasa de las líneas seleccionadas fue medida entonces en extractos de hojas clarificados como se ha descrito en la técnica anterior.

Hidroxiacil-CoA dehidrogenasa

El dominio de la proteína de \beta-oxidación multifuncional (MFP) (M86456) (Hiltunen, 1992) que codifica R-3-hidroxiacil-CoA dehidrogenasa fue amplificado por PCR a partir de Saccharomyces cerevisiae. Se ha comprobado que la proteína contiene dos actividades: una 2-enoil-CoA hidratasa 2, que convierte trans-2-enoil-CoA a R-3-hidroxiacil-CoA, y una R-3-hidroxiacil-CoA dehidrogenasa, que convierte R-3-hidroxiacil-CoA a 3-cetoacil-CoA. Una versión truncada de MFP que carece de 271 aminoácidos carboxilo-terminales fue también sobre-expresada y purificada y se comprobó que solo tenía la actividad de R-3-hidroxiacil-CoA dehidrogenasa. Estos resultados demuestran claramente que la \beta-oxidación de ácidos grasos en la levadura sigue un curso estereoquímico previamente desconocido, concretamente ocurre por vía de intermedios de R-3-hidroxiacil-CoA.

La expresión de la versión truncada en cloroplastos de plantas con una tioesterasa específica de longitud de cadena media, una acil-CoA sintetasa y una tiolasa permitirá la producción de R-3-hidroxiacil-CoAs, el sustrato para la PHA sintasa.

Se extrajo y purificó DNA genómico molde a partir de S. cerevisiae como se ha descrito en Current Protocols in Molecular Biology, 1997, sección 13.11.1-13.11.4. El cebador 5' utilizado contiene el sitio SphI aguas arriba de la ATG (GATCGCATGCTAATGCCTGGAAATTTATCCTTC), y el cebador 3' tiene un sitio ApaI aguas abajo de un codón de parada recientemente introducido (GATCGGGCCCTTACGGGTTGATAGTGTTGCGACT). Las condiciones PCR fueron como las descritas anteriormente, excepto que la temperatura de templado utilizada fue de 50ºC. El fragmento PCR fue purificado, digerido con SphI/ApaI y el fragmento de 1.799 pb fue clonado en pKitmus/RbscK-3'nc. Este vector es un derivado de pLitmus28 que contiene una cassette para la expresión de cloroplastos. Esta cassette tiene en 5' el promotor de la pequeña subunidad de ribulosa 1,5-bifosfato carboxilasa (rubisco) de alfalfa, su región 5' no traducida y la señal de direccionamiento a cloroplastos, seguido por un sitio de clonación múltiple (MCS), y en 3' tiene la región 3' no codificadora de rubisco (Khoudi et al., 1997). La región en 5' es un fragmento SalI/SphI de 1.978 pb que tiene en su extremo 3' la secuencia que codifica los 58 aminoácidos del péptido de tránsito, seguido por la ATG de la proteína madura. Se ha comprobado que esta ATG es única en el sitio SphI. El clon de dehidrogenasa en el MCS se encuentra entonces en marco con la señal de direccionamiento, teniendo una leucina entre la ATG de la proteína madura de rubisco y aquella del gen. La región 3' no codificadora es un fragmento EcoRI/SmaI de 441 pb que tiene las dos señales de PoliA de la pequeña subunidad de rubisco.

Se ha secuenciado un clon potencial con estos cebadores:

Jonc. Rub.	5'	AAGTCCATGGCTGGCTTCCA
Rub 1023r	5'	AGATAGTAAATTCTCAAATGAATTC
DHSc125c	5'	TTGACAGGTGGCTATAAG
DHSc498r	5'	CGTTTCTGCATGAGGAGC

Y se ha conservado un clon de tipo salvaje, pKitmus/RbscK-DH-3'nc#9, para posteriores manipulaciones (figura 5a).

El gen se puso en una cassette para la expresión transitoria. Se obtuvo el plásmido 35SC4PPDK-sGFP-TYG-nos en Jen Sheen en el Departamento de Biología Molecular en Massachustts General Hospital y contiene lo siguiente: el promotor 35S-C4PPDK flanqueado por sitios XhoI y BamHI; un gen que codifica GFP flanqueado por sitios BamHI y PstI y que contiene un cambio de aminoácido en la posición 65 para una mayor fluorescencia y cuya utilización de codones se optimiza para la expresión en plantas; y una secuencia de poliadenilación flanqueada por sitios PstI y EcoRI. El sitio BamHI después del promotor fue cambiado por un sitio ShpI mediante tratamiento del BamHI digerido con vector con el Klenow y su ligación con un ligador de SphI. El vector producido fue entonces digerido con EcoRI, tratado con el Klenow y digerido con SphI para proporcionar un fragmento de vector SphI/rum de 3.290 pb que ha perdido el gen GPF y el NOS. El pKitmus/RbscK-DH-3'nc fue digerido con SphI-SmaI y el fragmento de 2.198 pb que contiene la dehidrogenasa y la región 3' no codificadora de rubisco de alfalfa fue ligado en el vector para producir pUC/35S.C4PPDK.DH.3'nc, un clon de 5.488 pb utilizado en el experimento de expresión transitoria (figura 5b).

Para la expresión en plantas, se obtuvo la cassette que contiene el promotor rubisco de alfalfa, la dehidrogenasa y la región 3' no codificadora de rubisco de alfalfa mediante una digestión con SalI/SmaI de pKitmus/RbscK-DH-3'nc#9 y clonación en pCambia 2300. El clon formado se denomina pCambia/RbscK-DH-3'nc (figura 5c).

En la figura 4 se muestran diagramas de los constructor y en la figura 5 se ofrecen archivos de las secuencias.

Para la actividad enzimática de la (D)-3-hidroxiacil-CoA dehidrogenasa en E. coli, se inocula un cultivo líquido de 2XYT.Ap (5 ml) con una sola colonia de DH5\alpha:pTRCN/FOX2 y el cultivo se pone bajo agitación a 30ºC durante 16 horas. Este cultivo durante la noche se utiliza para inocular (1%) 50 ml de medio de 2XYT.Ap. Los cultivos se ponen a 30ºC bajo agitación hasta que el valor OD_{600nm} alcanza 0,6. Se añade IPTG (0,4 mM) y el cultivo se incuba durante otras 4 horas. Las células se recogen por centrifugado (15 min/5.000 g/4ºC) y se guardan a -80ºC. Las células se resuspenden en tampón de 20 mM KH_{2}PH_{4} (pH 7,0), 0,5 mM DTT, 0,1 mM PMSF y se rompen por sonicación con impulsos de 0,2 segundos durante un periodo total de 20 segundos. Las células se retornan a hielo para su enfriamiento y se repite el procedimiento de sonicación dos veces más para asegurar la lisis. El extracto se clarifica por centrifugado en una micrófuga (12.000 g/15 min/4ºC) antes de realizar las mediciones de actividad.

La reacción de dehidrogenasa midió la oxidación de una 3-hidroxiacil-CoA en una 3-cetoacil-CoA y es seguida por el control de la formación del complejo de Mg^{2+} de 3-cetoacil-CoA a 303 nm. La mezcla de incubación consistía en 50 \mumol Tris-Cl (pH 9,0), 50 \mug albúmina de suero bovino, 50 \mumol KCl,1 \mumol NAD^{+}, 25 \mumol MgCl_{2}, 1 \mumol piruvato y 10 \mug lactato dehidrogenasa en un volumen total de 1 ml. La lactato dehidrogenasa permite la regeneración de NAD^{+} empleando el piruvato como sustrato. La reacción es controlada a temperatura ambiente con todos los componentes de la mezcla de incubación y luego se añaden 10 \mug de L-3-hidroxiacil-CoA dehidrogenasa. Después de 1 minuto aproximadamente, se añaden 50 nmol del sustrato DL-3-hidroxioctanoil-CoA. Cuando se estabiliza el valor OD_{303nm}, significando ello que la L-3-hidroxioctanoil-CoA se ha oxidado por completo, se añade entonces el extracto (1%). La reacción se controla durante otros 5 minutos.

Se midió la actividad de R-3-hidroxiacil-CoA dehidrogenasa en sobre-expresión de DH5\alpha el gen Fox2 de MFP de Saccharomyces cerevisiae. El coeficiente de extinción empleado para la 3-cetooctanoil-CoA es de 14,5 x 10^{3} cm^{-1} M^{-1}. La actividad de control se muestra en la figura 6a y la parte lineal del gráfico que representa la actividad de R-3-hidroxiacil-CoA dehidrogenasa se muestra en la figura 6b. La actividad específica es de 0,81 Units/mg proteína.

La expresión transitoria de la 3-hdiroxiacil-CoA dehidrogenasa en células de plantas fue realizada por transformación de protoplastos de Arabidopsis thaliana con pUC/35S.C4PPDK.DH.3'nc (Sheen, J., et al., 1995). Para la actividad enzimática de (D)-3-hidroxiacil-CoA dehidrogenasa en células de plantas, se recogieron protoplastos de Arabidopsis thaliana por centrifugado (115 g) y se retiró el sobrenadante. A la muestra se añade una parte alícuota (14 \mul) de material 7X de inhibidor de proteasa y la muestra se lleva a un volumen final de 100 \mul con una solución que contiene 20 mM tampón KH_{2}PO_{4} (pH 7,0), 0,5 mM DTT, 0,1 mM PMSF. El material 7X de inhibidores de proteasa se prepara disolviendo un "Mini Comprimido de Inhibidor de Proteasa Completo" (Boehringer Manneheim) en 1,5 ml tampón 20 mM KH_{2}PO_{4} (pH 7,0), 0,5 mM DTT, 0,1 mM PMSF. Los protoplastos se rompen en un tubo de centrífuga de 1,5 ml empleando un mezclador de almirez para pellets (Kontes) durante 30 segundos. Se separan las proteínas solubles de las insolubles por centrifugado a una velocidad máxima en una microcentrífuga (10 minutos, 4ºC). Se midió la actividad de dehidrogenasa en la forma anteriormente descrita. Se midió la actividad de R-3-hidroxiacil-CoA dehidrogenasa en protoplastos de Arabidopsis thaliana transformados con pUC/35S.C4PPDK.DH.3'nc. El coeficiente de extinción empleado para la 3-cetooctanoil-CoA es de 14,5 x 10^{3} cm^{-1} M^{-1}.

Se transformaron plantas de Arabidopsis thaliana con pCambia/RbscK-DH-3'nc siguiendo un protocolo de goteo floral (Clough, S.J., et al., 1998) y empleando la cepa de Agrobacterium tumefasciens GV3101/pMP90 (Koncz, C., et al., 1986). Para la actividad enzimática de la (D)-3-hidroxiacil-CoA dehidrogenasa en plantas, se recogen hojas de Arabidopsis thaliana que expresa la enzima y se muelen en 5 volúmenes de tampón de extracción que contiene 50 mM tampón Tris-Cl (pH 8,0), 0,4% \beta-mercaptoetanol, 2 mM PMSF. El extracto se clarifica sobre Miracloth y se centrifuga (12.000 g/15 min/4ºC). El sobrenadante es desalificado en una columna Sephadex G-25 PD-10 (Pharmacia) eluyendo en un tampón que contiene 20 mM KH_{2}PO_{4} (pH 7,0), 0,5 mM DTT, 0,1 mM PMSF. La actividad de dehidrogenasa se determinó en la forma anteriormente descrita. Se midió la actividad de R-3-hidroxiacil-CoA dehidrogenasa en plantas de Arabidopsis thaliana transformadas con pCambia/RbscK-DH-3'nc. El coeficiente de extinción empleado para la 3-cetooctanoil-CoA es de 14,5 x 10^{3} cm^{-1} M^{-1}.

Ceto-acil CoA tiolasa

Se realizó la clonación del gen de tiolasa (X93015) (Olesen, 1997) mediante amplificación PCR de DNA genómico de Brassica napus como se ha descrito anteriormente, excepto que la temperatura de templado utilizada fue de 50ºC. Se preparó DNA molde a partir de hojas de B. napus en la forma descrita por Rogers & Bendich, Plant Mol. Biol., 1988, A6:1-10. El cebador en el extremo fue 5'-GATCGCATGCTAGCTGGGGACAGTGCTGCGTATC-3' con un sitio SphI añadido, y en el extremo 3' fue 5'-GATCGAATTCCTAACGAGCGTCCTTGGACAAAAG-3' con un sitio EcoRI aguas abajo del codón de parada. Los cebadores se seleccionaron de manera que la amplificación se iniciase en la posición 106 del cDNA y eliminar así la señal de direccionamiento N-terminal para glioxisomas. Los productos PCR purificados en gel fueron digeridos con SphI/EcoRI y clonados en un derivado de pLitmus 28 modificado como se ha descrito anteriormente para la clonación de dehidrogenasa de levadura. Los clones adecuados son totalmente secuenciados. La secuencia se comparó con el cDNA publicado (1.389 pb), aunque se produjeron amplicones a partir del molde de DNA genómico. Los amplicones homólogos con intrones y sin la señal de direccionamiento tienen un tamaño de 2.568 pb. El constructo entero con el gen homólogo fue sub-clonado en el sitio SalI/SmaI de pBI 101,2. La transformación de A. tumefaciens, la transformación de plantas seleccionadas y la regeneración de líneas transgénicas se llevó a cabo en la forma anteriormente descrita. La selección de las mejores líneas transgénicas se realizó con hibridación Northern.

Acil-ACP tioesterasa

Un gen que codifica una tioesterasa con especificidad para sustratos 8:0 y 10:0-ACP (U39834) (Dehesh, 1996) fue amplificado por PCR a partir de Cuphea hookeriana como se ha descrito anteriormente, excepto que la temperatura de templado utilizada fue de 60ºC. Se preparó DNA genómico molde con el Qiagen Genomic Tip Protocol tal como describe el fabricante. El cebador en el extremo 5' fue 5'-GATCTCTAGAATGGTGGCTGCTGCAGCAAGTTCCG-3' con un sitio XbaI aguas arriba de la ATG; el cebador en el extremo 3' fue 5'-GATCGGGCCCCTAAGAGACCGAGTT
TCCATTTGAAG-3' con un sitio ApaI aguas abajo del codón de parada. El producto PCR fue clonado en el sitio XbaI/ApaI en el vector de la planta pCambia 2.300, modificado para albergar el promotor de RbscK (SalI/SphI) con el péptido de tránsito, un sitio de clonación múltiple entre SphI y EcoRI y la región 3' no codificadora de RbscK (EcoRI/SmaI). La transformación de A. tumefaciens, la transformación de plantas seleccionadas y la regeneración de líneas transgénicas se realizó en la forma anteriormente descrita. La selección de las mejores líneas transgénicas se realizó con hibridación Northern.

Acil-CoA sintasa

La clonación del gen de acil-CoA sintasa (X65936) (van Beilen, 1992) fue realizada por amplificación PCR de DNA genómico de Pseudomonas oleovorans. Se preparó DNA molde en la forma descrita en Current Protocols in Molecular Biology, 1997, 2.4.1-2.4.2. El cebador en el extremo 5' fue GATCGGATCC ATGTTAGGTCAGATGATGCGT-3' con un sitio BamHI aguas arriba de la ATG; el cebador en el extremo 3' fue 5'-GATCGAATTC TTATTCACAGACA
GAAGAACT-3' con un sitio EcoRI aguas abajo del codón de parada. El producto PCR fue clonado en el sitio BamHI/EcoRI de pLitmus 28 modificado como antes se ha descrito para la clonación de dehidrogenasa de levadura. Los clones adecuados fueron totalmente secuenciados. Se sub-clonaron entonces constructos Wjole en pBI-101,2. La transformación de A. tumefaciens, la transformación de plantas de alfalfa y tabaco y la regeneración de líneas transgénicas se llevó a cabo en la forma anteriormente descrita. La selección de las mejores líneas transgénicas se realizó por hibridación Northern.

Referencias

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Claims (13)

1. Método para la producción de un polihidroxialcanoato en un hospedante, que comprende:

seleccionar un hospedante para la expresión de genes que codifican enzimas requeridas para la síntesis de un polihidroxialcanoato;

introducir en dicho hospedante genes estructurales que codifican una tioesterasa, una acil-CoA sintetasa, una tiolasa, una proteína de \beta-oxidación peroxisomal de levadura que tiene actividad de 3-hidroxiacil-CoA dehidrogenasa que producirá R-(-)-hidroxiacil CoA a partir de una ceto amino-CoA, y una polihidroxialcanoato sintasa;

expresar las enzimas codificadas por los genes; y

proporcionar los sustratos adecuados para las enzimas expresadas para la síntesis del polihidroxialcanoato.

2. Método para la producción de un polihidroxialcanoato, que comprende:

seleccionar un organismo transgénico que comprende una secuencia de DNA exógeno que codifica una proteína de \beta-oxidación peroxisomal de levadura que tiene actividad de 3-hidroxiacil-CoA-dehidrogenasa que producirá R-(-)-hidroxiacil-CoA a partir de una ceto amino-CoA;

proporcionar una ceto ácido-CoA que proporcionará R-(-)-hidroxiacil-CoA por la dehidrogenasa, en donde dicha R-(-)-hidroxiacil-CoA servirá como sustrato para polihidroxialcanoato sintasa; y

producir dicho polihidroxialcanoato.

3. Método según la reivindicación 2, en donde el organismo transgénico comprende además una secuencia de DNA exógeno que codifica una enzima que tiene actividad de tioesterasa; una enzima que tiene actividad de acil-CoA sintetasa; una enzima que tiene actividad de tiolasa; y una enzima que tiene actividad de polihidroxialcanoato sintasa.

4. Método según la reivindicación 3, en donde el organismo transgénico es una planta.

5. Método según la reivindicación 4, en donde el organismo transgénico es una planta seleccionada del grupo consistente en patata, boniato, mandioca, remolacha, alfalfa, Arabidopsis y tabaco.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la proteína de \beta-oxidación peroxisomal de levadura es de Saccharomyces cerivisiae.

7. Un vector de expresión vegetal que comprende un DNA que codifica una proteína de \beta-oxidación peroxisomal de levadura de Saccharomyces cerivisiae, que producirá R-(-)-hidroxiacil-CoA a partir de una ceto ácido-CoA.

8. Un vector de expresión vegetal según la reivindicación 8, en donde el vector de clonación comprende además una secuencia de DNA que codifica una enzima que tiene actividad de tioesterasa; una enzima que tiene actividad de acil-CoA sintetasa; una enzima que tiene actividad de tiolasa; y una enzima que tiene actividad de polihidroxialcanoato sintasa.

9. Una célula hospedante que comprende DNA del vector de expresión vegetal según la reivindicación 7.

10. Una célula hospedante según la reivindicación 9, en donde la célula hospedante comprende además una secuencia de DNA exógeno que codifica una enzima que tiene actividad de tioesterasa; una enzima que tiene actividad de acil-CoA sintetasa; una enzima que tiene actividad de tiolasa; y una enzima que tiene actividad de polihidroxialcanoato sintasa.

11. Una planta transgénica que contiene el vector de expresión vegetal de la reivindicación 7.

12. Una planta transgénica según la reivindicación 11, en donde la planta transgénica comprende además una secuencia de DNA exógeno que codifica una enzima que tiene actividad de tioesterasa; una enzima que tiene actividad de acil-CoA sintetasa; una enzima que tiene actividad de tiolasa; y una enzima que tiene actividad de polihidroxialcanoato sintasa.

13. Una planta transgénica según la reivindicación 11 o 12, en donde la planta transgénica se elige entre patata, boniato, mandioca, remolacha, alfalfa, Arabidopsis y tabaco.