CZ304183B6

CZ304183B6 - Zpusob produkce polyhydroxyalkanoátu (PHA) na olejovém substrátu

Info

Publication number: CZ304183B6
Application number: CZ20120571A
Authority: CZ
Inventors: Márová@Ivana; Obruca@Stanislav; Prikryl@Radek
Original assignee: Vysoké ucení technické v Brne
Priority date: 2012-08-27
Filing date: 2012-08-27
Publication date: 2013-12-11
Also published as: WO2014032633A1; CZ2012571A3; CN104755623A

Abstract

Zpusob produkce polyhydroxyalkanoátu (PHA), pri kterém se na olejovém substrátu obsahujícím rostlinný olej a/nebo jedlý olej a/nebo odpadní jedlý olej, s výhodou fritovací olej, kultivuje kmen bakterií Cupriavidus necator H16, který pretvárí olej na PHA pri soucasné produkci vlastních extracelulárních lipolytických enzymu, které se z kultivacního média alespon cástecne izolují v prubehu fermentacního procesu pred ukoncením produkce a izolace PHA. Lipolytické enzymy izolované z C. necator v prubehu kultivace se pouzijí k úprave olejového substrátu tak, ze se pridají k produkcnímu médiu pred zahájením kultivace, prípadne téz v prubehu kultivace spolecne s príkrmovou dávkou oleje. Pri izolaci PHA vyprodukovaných zpusobem podle vynálezu se po ukoncení fermentace obsah produkcního reaktoru zahreje na teplotu 80 .degree.C po dobu alespon 30 minut, následne se zchladí na teplotu 60 .degree.C a pridají se lytická cinidla obsahující smes detergentu, napríklad SDS, a proteolytického enzymu, címz se získá surový homogenát, prípadne lyzát.

Description

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu produkce polyhydroxyalkanoátů (PHA), u něhož se na olejovém substrátu obsahujícím rostlinný olej a/nebo jedlý olej a/nebo odpadní jedlý olej, s výhodou fritovací olej, kultivuje kmen bakterií Cupriavidus necator H16, který přetváří olej na PHA při současné produkci extracelulárních lipolytických enzymů, které se z kultivačního média alespoň částečně izolují v průběhu fermentačního procesu před ukončením produkce a izolace PHA.

Dosavadní stav techniky

Jednou z nejefektivnějších možností výroby biomateriálu je využití přirozených procesů probíhajících v mikroorganismech. Některé bakterie vytváří z látek v prostředí, které jim slouží jako potrava, zásobní polymer PHA. Tento polymer si bakterie ukládají na horší časy a v době hladovění jej pak mohou využít jako vnitřní potravu.

Polyhydroxyalkanoáty (PHA) jsou skupina opticky aktivních polyesterů syntetizovaných některými bakteriálními kmeny jako zásobní forma energie. Monomerem PHA jsou (R)-3-hydroxykyseliny. Všechny monomerní jednotky jsou v R konfiguraci díky stereospecifitě enzymu, který je za syntézu PHA zodpovědný - PHA syntáze. Pouze v několika málo případech bylo zjištěno malé množství S monomeru v polyesteru. Molekulová hmotnost PHA se pohybuje v rozmezí od 200 000 do 3 000 000 Da v závislosti na mikroorganismu a kultivačních podmínkách. PHA se v buňce nachází cytoplazmě ve formě granulí o rozměrech 0,2 až 0,5 pm [1],

PHA mohou představovat až 90 % hmotnosti buňky. Na rozdíl od ostatních biopolymerů, jako jsou například polysacharidy, bílkoviny nebo DNA, jsou PHA termoplasty. Díky svým mechanickým a technologickým vlastnostem jsou PHA velmi zajímavé z hlediska svého použití a mohou představovat alternativu k plastům připravovaným synteticky z ropy [2].

V závislosti na počtu atomů v monomerní jednotce se PHA dělí na PHA s krátkým řetězcem (short-chain-lenght - SCL) o délce 3 až 5 atomů uhlíku a na PHA se středně dlouhým řetězcem (medium-chain-lenght - MCL) o délce 6 až 14 atomů uhlíku v monomeru. Struktura PHA je znázorněna na obr. 1, přičemž pro PHA s krátkým řetězcem je R = CH₃- C₅H_h a pro PHA se středním řetězcem je R = C₆H₁₃-Ci4H₂9.

Už v roce 1926 izoloval Lemoigne polyhydroxybutyrát (PHB) z bakterie Bacillus megaterium. Na konci 50-tých let minulého století byla prokázána přítomnost PHB jako zásobní formy energie a uhlíku u řady Gram-negativních bakterií. V roce 1974 byly kromě PHB izolovány také kopolymery obsahující 3-hydroxyvalerát a 3-hydroxyhexanoát. Od té doby byla identifikována řada mikroorganismů schopných syntézy PHA včetně průmyslových kmenů. Jsou to jak Grampozitivní, tak Gram-negativní bakterie (autotrofní, heterotrofní, fototrofní; aerobní i anaerobní viz patent WO 2009156950 A2), ale také některé kmeny archaebakterií. Mikroorganismy syntetizují PHA jako zásobní formu energie a uhlíku při dostatku uhlíkatého zdroje a limitaci ostatními živinami. Po vyčerpání uhlíkatého zdroje jsou pak PHA utilizátory jako zdroj energie a uhlíku. PHA představují ideální zásobní formu jak uhlíku, tak energie, což je dáno jejich nízkou rozpustností a vysokou molekulární hmotností. Díky těmto vlastnostem se výrazně nepodílí na osmotickém tlaku v buňce [1],

V roce 1976 britská společnost Imperiál Chemical Industrie (ICI) rozpoznala potenciál PHI3 nahradit syntetické polymery připravované většinou z ropy. Přestože bakteriální produkce PHB byla drahá, předpokládalo se, že prudký růst cen ropy umožní rentabilní bakteriální výrobu PHB. Protože k očekávanému růstu cen ropy nedošlo, nachází PHB uplatnění především jako bio- 1 CZ 304183 B6 degradabilní a biokompatibilní materiál. Kvůli vysoké ceně však PHB a P(HB-co-HV) (kopolymer hydroxybutyrátu a hydroxyvalerátu), které se objevují pod obchodní značkou Biopol, nacházejí spíše sporadické uplatnění na trhu. V roce 1990 německá firma Wella použila obaly z Biopolu pro nový šampón. V roce 1996 odkoupila americká firma Monsanto Biopol od firmy ZENECA BioProducsts, dceřinné společnosti ICL I v současné době jsou prezentovány patenty k produkci PHA pomocí transgenních rostlin, což by mělo snížit náklady na výrobu (př. US 2003/0017576 Al, US 2004/0101865 Al).

Biochemická stránka biosyntézy PHB je velmi dobře prostudována. U většiny bakterií, např. Alcaligenes eutrophus (též Ralstonia eutropha', nyní Cupriavidus necator) je PHB syntetizován reakcí, která se skládá ze tří kroků. Nejprve dvě molekuly acetyl-CoA reagují za vzniku acetoacetyl-CoA, tato reakce je katalyzována 3-ketothiolázou. Acetoacetyl-CoA je stereo selektivně redukován na (R)-3-hydroxybutyryl-CoA reakcí katalyzovanou NADPH-dependentní acetoacetyl-CoA reduktázou. Nakonec je PHB syntetizován polymerizací (R)-3-hydroxybutyryICoA, kteráje realizována enzymem PHB syntázou [1],

Schéma biosyntézy PHB je znázorněno na Obr. 2

K biosyntéze PHB dochází při dostatku uhlíkatého zdroje a při limitaci například dusíkem, železem, fosforem, sírou, draslíkem anebo kyslíkem. Syntéza PHB je regulována na enzymové úrovni. Z hlediska regulace syntézy PHB je zásadní intracelulární koncentrace acetyl-CoA a volného HSCoA. Při podmínkách vyrovnaného růstu je acetyl-CoA oxidován v Krebsově cyklu. Během této oxidace je produkováno NADH, které je dále využíváno pro biosyntetické účely. Při zastavení růstu kultury koncentrace NADH roste a dochází ke snížení aktivity citrátsyntázy a isocitrátdehydrogenázy. Acetyl-CoA pak nemůže být oxidován v Krebsově cyklu a vstupuje do biosyntetické dráhy PHB. 3-ketothioláza je inhibována volným HSCoA, který je produkován během oxidace acetyl-CoA v Krebsově cyklu během normálního růstu kultury [4],

Některé kmeny bakterií produkují různé typy kopolymerů PHA. Kopolymer PHB a PHV může být syntetizován například kmenem Alcaligenes eutrophus nebo jinými typy mikroorganismů, a to při růstu na substrátu obsahujícím glukózu a propionovou kyselinu, případně přímo prekurzor 3-hydroxyvalerát. Pokud je použita propionová kyselina, je syntéza podobná syntéze PHB jen s tím rozdílem, že acetyl-CoA kondenzuje s propionyl-CoA za vzniku 3-ketovaleryl-CoA, což vede k inkorporaci 3-hydroxyvalerátu do struktury polymeru. Pokud je uhlíkatým zdrojem kyselina s lichým počtem atomů uhlíku, pochází 3-hydroxyvalerát přímo z β-oxidace mastných kyselin. U Alcaligenes eutrophus také nízká hladina rozpuštěného kyslíku v médiu zvyšuje inkorporaci 3-hydroxyvalerátu do struktury polymeru [1]. Schéma struktury PHB a P(HB-co-HV) je znázorněno na obr. 3.

Některé mikroorganismy jsou schopny syntetizovat P(HB-co-HV) při růstu v médiu, které neobsahuje prekurzory 3-hydroxyvalerátu, např. i některé mutanty Alcaligenes eutrophus. Kopolymer 3-hydroxybutyrátu a 4-hydroxybutyrátu může být syntetizován u Alcaligenes eutrophus z kyseliny 4-hydroxybutyrové, 1,4-butandiolu, butyrolaktonu a 4-chlorbutyrátu [1].

PHA jsou uloženy v buňkách ve formě granulí. Počet a velikost granulí závisí na kultivačních podmínkách a také se liší v rámci různých bakteriálních kultur. Hustota PHB granulí se pohybuje okolo 1,18 až 1,24 g.cm^-3. hustota granulí MCL PHA je pak přibližně 1,05 g.cm'³. Granule se skládají z polyesterů, proteinů a lipidů. Polyestery jsou obsaženy uvnitř objemu granulí, povrch je tvořen fosfolipidovou vrstvou, do které jsou zabudovány proteiny plnící různé funkce. PHA obecně mají hydrofobní charakter, proto i fosfolipidy a proteiny vytvářejí rozhraní mezi PHA a okolním prostředí [1].

Jedním z proteinů PHA granulí je PHA syntáza. Pravděpodobně existují tři typy PHA syntáz, které se liší substrátovou specifitou a primární strukturou. Společným rysem je aktivní místo obsahující cystein. První typ PHA syntázy katalyzuje syntézu SCL PHA (short-chain-lengt) z 3-2CZ 304183 B6 uhlíkatých hydroxykyselin. Druhý typ inkorporuje delší hydroxykyseliny (6 až 14 uhlíků) do struktury PHA (MCL PHA). Třetí typ se od prvních dvou odlišuje svou strukturou. Zatímco předcházející PHA syntázy jsou tvořeny jednou podjednotkou o velikosti 60 až 70 kDa, třetí typ PHA syntázy je tvořeny dvěma podjednotkami: C-podjednotkou (~ 40 kDa) a E-podjednotkou (~ 40 kDa). Pro syntézu PHA tímto typem enzymu jsou nutné obě podjednotky. Substrátová specifita není tak striktní jako u předcházejících PHA syntáz, ale spíše je preferovaná syntéza SCL PHA [5].

Schéma struktury granule PHA je znázorněno na obr. 4.

Dalším proteinem, kterýje možno nalézt v granuli PHA, je intracelulámí PHA depolymeráza. Ta je zodpovědná za využívání PHA jako zdroje energie a uhlíku v případě limitace C zdrojem z prostředí. Dosavadní studie naznačují, že proces degradace PHA intracelulárními depolymerázami je přibližně 1 Okřát pomalejší než jejich syntéza. Regulace intracelulárních depolymeráz však ještě není zcela vysvětlena. Ve struktuře PHA granulí se nacházejí také nekatalytické proteiny, které se nazývají phasiny. Předpokládá se, že se podílí na stabilizaci hydrofobních PHA ve vodním prostředí buněčné cytoplasmy [6].

Homopolymer PHB je polyester se všemi asymetrickými uhlíkatými atomy v R konfiguraci. Vykazuje poměrně vysokou krystaličnost (asi 50 až 80 %), což ho činí tuhým a křehkým. Teplota skelného přechodu je 5 až 9 °C, teplota tání 173 až 180 °C. PHB se rozkládá při 200 °C, což je blízko teplotě tání. V chloroformovém roztoku vytváří pravotočivou šroubovici. Mechanickými vlastnostmi PHB (např. Youngův modul pružnosti (3,5 GPa), pružnost v tahu (40MPa)) připomíná polypropylen. Průtažnost je však jen okolo 3 %, což je výrazně méně, než je tomu u polypropylenu [1].

Některé vlastnosti derivátů PHA jsou uvedeny následující tabulce 1.

Tabulka 1

Para meter	PHB	P(3HB-HV)	P(3HB-4HO)	P(3HO-3HH)	Polyprophylene
Tm (°C)	179	145	150	61	176
Tg (°C)	-4	-1	-7	-36	-10
Crystallinity (%)	70	56	45	30	60
Rupture extension (%)	5	50	444	300	400
Young Module (GPa)	3.5	2.9	--	-	1.7

Pokud je do struktury polymeru zabudován 3-hydroxyvalerát, mechanické vlastnosti se výrazně zlepší. Youngův modul pružnosti klesne pod 0,7 GPa a pružnost v tahu klesne na 30 MPa. Průtažnost materiálu roste s rostoucím podílem 3-hydroxyvalerátu. Teplota tání kopolymeru klesá na přibližně 130 °C, mírně však klesne i teplota rozkladu. Díky těmto vlastnostem může být kopolymer taven bez toho, aby došlo kjeho rozkladu. Jak již bylo zmíněno, poly-(HB-co-HV) s obsahem 3-hydroxyvalerátu od 0 do 30 % je komerčně dostupný pod názvem Biopol [1],

Kopolymer 3-hydroxybutyrátu a 4-hydroxybutyrátu nevytváří krystalické struktury. Teplota skelného přechodu klesá od 5 do -50 °C, teplota tání také klesá od 180 do 54 °C s rostoucím

-3 CZ 304183 B6 obsahem 4-hydroxybutyrátu (0 až 100 %) v polymeru. Pro 94% 4-hydroxybutyrát je Youngův modul pružnosti přibližně 55 MPa, pružnost v tahu 39 MPa a průtažnost 500 % [1],

Přestože existuje řada bakteriálních kmenů schopná produkce PHA, k průmyslovému využití je možno aplikovat jen několik málo z nich. Použitelnost bakteriálního kmene ovlivňuje řada faktorů. Především je to stabilita a bezpečnost, růstové a akumulační schopnosti, dosažitelné množství biomasy a množství PHA. Dále to jsou míra extrahovatelnosti PHA, molekulová hmotnost PHA, množství použitelných substrátů a finanční náročnost jednotlivých komponent média [1],

Firma ZENECA Bioproducts využívala k produkci PHB a P(HB-co-HV) mutantní kmeny Alcaligenes eutrophus. Proces byl veden jako dvoufázový fed-batch systém. V prvním kroku byla kultivována biomasa v minerálním médiu obsahujícím glukózu jako zdroj uhlíku a energie a přesně stanovené množství fosfátu. Po nárůstu kultury došlo k vyčerpání fosfátu a v druhém kroku pak docházelo k limitaci fosforem, což vedlo k akumulaci PHA. V druhém kroku byla kultuře dodávána glukóza tak dlouho, dokud nedošlo k biosyntéze požadovaného množství PHA. Každá fáze probíhala přibližně 48 hodin a konečná koncentrace suché hmotnosti biomasy byla přibližně 48 hodin a konečná koncentrace suché hmotnosti biomasy byla přibližně 100 g/1. Kopolymer P(HB-co-HV) byl syntetizován přídavkem směsi glukózy a propionové kyseliny ve druhé fázi kultivace. Obsah 3-hydroxyvaIerátu v polymeru byl kontrolován poměrem glukózy a propionové kyseliny [7],

Jiný proces byl vyvinut rakouskou firmou Biotechnologische Forschungsgesellschaft. Ta k produkci homopolymeru PHB použila kmen Alcaligenes latus DSM 1124, který byl schopen produkce PHB v množství až 80% buněčné sušiny. Proces byl veden jako jednokrokový fed-batch a jako zdroj uhlíku byla použita sacharóza [8].

Produkční náklady lze snížit, pokud by byl jako substrát využíván např. methanol, který je jedním z nejlevnějších uhlíkatých zdrojů. Kmen Methylobacterium extorquens produkoval PHB při diskontinuální fed-batch kultivaci na methanolu. Optimální koncentrace methanolu byla 1,7 g/1. Byla dosažena koncentrace biomasy 9 až 10 g/1 a množství PHB dosahovala 30 až 33 % biomasy. Ani požití levného uhlíkatého zdroje ovšem nesníží provozní náklady, protože malé množství produkovaného PHB prodražuje a znesnadňuje následný separační proces.

Velký potenciál v sobě skrývá geneticky modifikovaná bakterie Escherichia coli. To je schopna produkce PHA v extrémně velkých intracelulárních množstvích (až 80 až 90 % sušiny), pomocí metod genového inženýrství je možno připravit také kmeny produkující kopolymer P(HB-coHV), případně jiné kopolymery. Syntéza PHA pomocí rekombinantní E. coli není spojena s limitací, ale závisí na množství dostupného acetyl-CoA. Výhodou je také rychlý růst, schopnost utilizovat ekonomicky nenáročné zdroje uhlíku, vysoká hustota buněk narostlé kultury a snadná purifikace produktu (př. patenty KR20030070790 (A) - 2003-09-02, KR20030070789 (A) 2003-09-02, KR20070097883 (A) - 2007-10-05, KR20070097884 (A) - 2007-10-05, US 2003/0004299 A1 atd.).

Hlavní slabinou PHA v souboji se syntetickými polymery připravovanými z nafty jsou prozatím vysoké produkční náklady. Díky tomu je bakteriálně produkovaný PHA asi 5 až lOkrát dražší než například polypropylen nebo polyethylen. Naším cílem je najít efektivní způsob řízení produkce PHA v bakteriích tak, aby bakterie produkovaly co nejvíce polymeru. Výslednou cenu polymeru ovlivňuje zejména cena vstupních surovin pro kultivaci a náročné oddělení polymeru z buněk. Naše strategie počítá se snížením ceny vstupů využitím vhodných odpadních surovin jako krmivá pro bakterie, a to na bázi odpadních olejů. Dále počítáme s optimalizací purifikačního procesu a s využitím doprovodného produktu fermentace - extracelulární lipázy k předzpracování substrátu v médiu, případně jako samostatný doprovodný produkt s řadou průmyslových aplikací.

Lipolytické enzymy řadíme mezi esterové hydrolázy, katalyzující ve dvoufázovém systému voda — lipid, rozklad mono-, di— a triacylglycerolů na vyšší mastné kyseliny, alkohol a glycerol kom-4CZ 304183 B6 plexním mechanizmem závislým na mnoha faktorech. Lipolytické enzymy jsou definovány jako karboxylesterázy, které hydrolyzují acylglyceroly. Lipolytické enzymy, které hydrolyzují acylglyceroly s uhlíkatým řetězcem mastných kyselin kratším než .0 °C, jsou považovány za esterázy nebo karboxylázy (EC 3.1.1.1). Enzymy, které hydrolyzují acylglyceroly obsahující řetězce mastných kyselin s počtem uhlíků >10, jsou označovány jako lipázy nebo také jako triacylglycerolacylhydrolázy (EC 3.1.1.3). Esterázy jsou aktivní ve vodných roztocích, zatímco „pravé“ lipázy jsou aktivnější spíše na rozhraní voda-lipid než ve vodní fázi [20].

Lipolytické enzymy jsou děleny do tří skupin:

• První skupina je nespecifická. Lipolytické enzymy této skupiny uvolňují mastné kyseliny ze všech tří pozic acylglycerolu a kompletně hydrolyzují triacylglyceroly na mastné kyseliny a glycerol.

• Druhá skupina lipolytických enzymů je 1,3-specifická. Uvolňuje mastné kyseliny z vnějších pozic triacylglycerolu a dává vznik 1,2-diacylglycerolům, 2,3-diacylglycerolům a 2-monoacylglycerolům za uvolnění mastných kyselin. Dlouhá inkubace triacylglycerolu s 1,3-specifickými lipázami vede většinou k úplné hydrolýze triacylglycerolů na mastné kyseliny a glycerol.

• Třetí skupina zahrnuje lipolytické enzymy, které preferují jen určité mastné kyseliny.

Většina lipáz patří mezi extracelulární enzymy, které jsou uvolňovány do prostředí během pozdní exponenciální a časné stacionární růstové fáze. Produkce lipáz je ovlivněna řadou různých faktorů, jako je teplota, pH, zdroj dusíku, uhlíku a lipidů, stres, a koncentrace rozpuštěného kyslíku a. anorganických solí. Optimumlipázové aktivity je většinou kolem pH 6 až 9. Lipázy ιΑ. niger a Rhizopus sp. jsou však aktivní i v kyselém prostředí při pH 4. Naopak alkalická lipáza aktivní při pH 11 byla izolována od P. nitroreducens. Také teplotní optimum a tepelná stabilita se různí. U mezofilních MO je maximální aktivita lipáz při teplotě 30 až 35 °C. U termofilních MO je to většinou 60 °C. U psychrofilních mikroorganizmů jsou lipázy produkovány již při nízkých teplotách okolo 5 °C. Většina mikroorganizmů může také produkovat více než jeden typ extracelulárních lipáz s různou specifikou [21].

Mechanizmus lipázové aktivity je znázorněn na obr. 5.

Lipolytické enzymy řadíme mezi tzv. serinové hydrolázy. Trojrozměrná 3D struktura těchto enzymů vykazuje charakteristické α/β-ohyby - α-helixy a β—listy. Katalytická triáda je složena ze tří aminokyselinových zbytků, a to šeřinu, asparaginu a histidinu; u některých lipáz se vyskytuje glutamin namísto asparaginu. Lipolytická reakce probíhá pouze na rozhraní fází lipid - voda, koncentrace substrátu na rozhraní fází tedy přímo ovlivňuje rychlost reakce. V jedné fázi mohou tak existovat molekuly substrátu v rozdílném stavu bez přímého vlivu na reakční rychlost [22],

Aktivita esteráz je funkcí koncentrace substrátu a řídí se kinetikou Michaelis-Mentenové, maximální reakční rychlost je dosažena při koncentraci substrátu, kteráje mnohonásobně menší než je saturační koncentrace. Naopak lipázy nevykazují žádnou aktivitu, dokud je substrát (lipid) ve stavu jednotlivých molekul ve vodě. Když koncentrace substrátu převýší bod rozpustnosti, začíná se formovat emulze, a reakční rychlost výrazně narůstá. Aktivita lipáz pak přímo závisí na přítomnosti rozhraní fází. Objasněním prostorové struktury lipáz se potvrdilo, že aktivní centrum enzymu je chráněno polypeptidovým řetězcem znemožňujícím napojení samotné molekuly lipidu na enzym a následnou tvorbu aktivního komplexu. Pokud však lipáza přichází do přímého styku s lipidovou fází, začínají konformační změny, které posunou chránící polypeptidový řetězec a umožní přístup lipidu do aktivního centra enzymu. V důsledku hydrofobní interakce s lipidovou fází se zvyšuje síla vazby enzym-substrát. Tato skutečnost vysvětluje fenomén aktivace lipáz v přítomnosti fázového rozhraní. Pokud enzym působící na triacylglyceroly nevykazuje tento typ aktivace, měl by být považován za esterázu. Kinetika lipolytické reakce se na rozdíl od esteráz neřídí rovnicí Michaelis-Mentenové, předpokládá se dvoukrokový mechanismus zahrnující fyzikální adsorpci lipázy na povrch lipidové fáze probíhající souběžně s aktivací enzymu a posunem

-5 CZ 304183 B6 ochranné polypeptidové pokličky a následné vytvoření komplexu enzym-substrát, který je poté hydrolyzován na produkt a regenerovaný enzym [20 - 22],

Mechanismus hydrolýzy esterové vazby je v podstatě stejný jak pro lipázu, tak i esterázu, je složen ze čtyř kroků, jak vyplývá z obr. 6, na němž je znázorněno schéma mikrobiální degradace lipidů. Porovnáním aminokyselinových sekvencí a 3D struktury lipáz a esteráz bylo navrženo, aby jejich rozlišení bylo provedeno na základě pH; aktivní místo lipázy disponuje negativním potenciálem v rozmezí pH spojeným s maximem lipázové aktivity (typicky při pH 8,0), zatímco aktivní místo esterázy vykazuje podobné chování při hodnotách pH 6,0, což souvisí s obvyklým nižším pH optimem aktivity.

Většina známých mikroorganizmů je schopna produkovat lipázy, ale jen některé druhy jsou průmyslově využívané. Důvodem je nedostatečná produkce enzymů, nežádoucí fyzikálně chemické vlastnosti lipáz, omezené možnosti izolace z kultivačního média, atd. Komerčně nejvyužívanější plísně jsou rody Aspergillus, Penicillium, Mucor a Rhizopus. Hlavními producenty komerčních lipáz jsou Aspergillus niger, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Rhizopus arrhizus, R. delemar, R. japonicus, R. niveus a R. oryzae [20].

Lipolytické enzymy přitahují v dnešní době značnou pozornost kvůli svému biotechnologickému potenciálu. Představují nej významnější skupinu biokatalyzátorů pro biotechnologické aplikace, které se úspěšně využívají při syntézách biopolymerů, bionafty, při produkci agrochemikálií a aromatických sloučenin. Poptávka po průmyslových enzymech, především mikrobiálního původu, je tak stále větší. Enzymy nachází využití v potravinářském a farmaceutickém průmyslu, textilním a kosmetickém průmyslu a při výrobě detergentů. Lipázy se používají v pivovarnictví a vinařství, při výrobě sýrů a potravinových doplňků. Jsou významné i ve farmacii při transesterifikacích a hydrolýzách hrají primární roli v produkci speciálních lipidů. Mají význam při modifikacích monoglyceridů ajejich následném využití jako emulgátorů. Některé průmyslové významné chemikálie vyráběné chemickými procesy z tuků a olejů mohou být produkované i lipázami s mnohem větší a lepší specifikou. Lipázy se také využívají při výrobě náhražky kakaového másla a výrobě esterů pro použití v kosmetickém průmyslu. V mlékárenském průmyslu jsou používány pro hydrolýzu mléčného tuku. Aktuální aplikace jsou zvýšení chuti sýrů, zrychlení zrání sýrů, výrobu sýrů, přísada do jiných výrobků. Využití v pracích prášcích má lipáza z Aspergillus oryzae. Lipázy se používají při úpravě olejů a tuků, jako kosmetická změkčovadla, dále jako průmyslové katalyzátory při přípravě některých prostaglandinů, steroidů, karbocyklických analogů nukleosidů a farmaceuticky významných polyfenolických sloučenin [21],

Rovněž využití PHA se nabízí v řadě oblastí. Předpokládá se, že jeho hlavní využití bude v oblasti obalového průmyslu, zejména k produkci kojeneckých a dětských lahví, plastů pro dětské a ekologické výrobky (např. hračky), obalů pro kosmetický průmysl, tzv. inteligentních potravinářských obalů. Zajímavá je aplikace pro výrobu nádob (př. kelímky) pro jednorázové použití, např. pro řetězce rychlého občerstvení, které mohou zase poskytovat odpadní olej jako substrát pro produkci bioplastu.

Polymer PHA lze však využít i kjiným aplikacím: lze zněj připravit nanovlákna a nanočástice pro cílený transport léčiv, dají se z něj vyrobit biokompatibilní implantáty použitelné v lékařství jako vlákna, cévní náhrady apod.

Je třeba konstatovat, že produkce bioplastů je v současné době poměrně nízká, protože jejich cena je prozatím vyšší než u syntetických plastů, což značně omezuje poptávku. V nejbližších letech však lze očekávat podstatně přísnější regulace pro použití ekologických plastů a tím rozvoj výroby bioplastů.

V současné době je produkce PHA z olejových substrátů pomocí bakterií známá, ale ve srovnání s klasickou výrobou plastů z ropy je příliš nákladná, takže se obtížně prosazuje.

-6CZ 304183 B6

Cílem vynálezu je navrhnout způsob produkce PHA z olejového substrátu, který by byl ekonomický a produkoval velké množství PHA.

Podstata vynálezu

Cíle vynálezu je dosaženo způsobem produkce polyhydroxyalkanoátů (PHA) na olejovém substrátu obsahujícím rostlinný olej a/nebo jedlý olej a/nebo odpadní jedlý olej, s výhodou fritovací olej, na němž se kultivuje kmen bakterií Cupriavidus necator H16, který přetváří olej na PHA při současné produkci extracelulárních lipolytických enzymů, které se z kultivačního média alespoň částečně izolují v průběhu fermentačního procesu před ukončením produkce a izolace PHA, přičemž podstata vynálezu spočívá v tom, že před zahájením kultivace se do olejového substrátu přidají extracelulámí lipolytické enzymy vyprodukované Cupriavidus necator H16, čímž se urychlí růst bakteriální kultury.

Souběžná produkce PHA a extracelulárních lipolytických enzymů, při níž se před zahájením kultivace do olejového substrátu přidají extracelulámí lipolytické enzymy vyprodukované Cupriavidus necator H16, představuje novinku v produkci PHA, přičemž extracelulámí lipolytické enzymy jsou indukovány přítomností olejového substrátu a bakterie Cupriavidus necator H16 produkují účinnou molekulární formu schopnou efektivně zpřístupnit olejový substrát kutilizaci. Přitom je výhodné, že enzymy jsou extracelulámí produkt a PHA je intracelulámí produkt, což usnadňuje separaci obou produktů.

Vzhledem ktomu, že maximální produkce extracelulárních lipolytických enzymů předchází maximální produkci PHA o několik hodin, byl navržen nový technologický postup pro izolaci extracelulárních lipolytických enzymů v průběhu produkce PHA pomocí sterilní nebo nesterilní ultrafiltrace.

Optimální prostředí pro kultivaci se vytváří udržováním pH kultivačního média na hodnotě 7 nebo hodnotě blízké, přídavkem NaOH nebo H₂SO₄ a řízeným vzdušněním se koncentrace rozpuštěného kyslíku v průběhu fermentace udržuje v rozmezí hodnot 20 až 30 %.

Vzdušněním se reguluje růst kultury, produkce PHA a obsah 3- hydroxyvalerátu v kopolymerů.

Pro podporu růstu bakterií na olejovém substrátu se po izolaci extracelulárních lipolytických enzymů tyto enzymy přidávají alespoň částečně zpět do kultivačního média společně s doplňkovou dávkou oleje/olejového substrátu.

Přehled obrázků na výkresech

Na přiložených výkresech znázorňuje obr. 1 strukturu PHA, obr. 2 schéma biosyntézy PHB, obr. 3 schéma struktury PHB a P(HB-co-HV), obr. 4 schéma struktury PHA granule, obr. 5 mechanizmus lipázové aktivity, obr. 6 schéma mikrobiální degradace lipidů, obr. 7 srovnání indukce aktivity extracelulámí lipázy na různých typech uhlíkatého substrátu, obr. 8 výtěžek metabolitů v průběhu typického fermentačního procesu, obr. 9 charakterizaci průběhu centrifugace polymerního produktu metodou analytické centrifugace (4000 rpm, 2 hodiny, 5 °C), obr. 10 vliv přídavku lipázy na průběh kultivace Cupriavidus necator H16 při použití oleje jako zdroje uhlíku, obr. 11 Příklad GC-FID chromatogramu PHA, obr. 12 příklad GPC chromatogramu PHA, obr. 13 TGA analýza PHB, obr. 14 DSC analýza PHB, obr. 15 pH optimum extracelulámí lipázy, obr. 16 vliv iontové síly na aktivitu lipázy a obr. 17 záznam separace - barvení stříbrem.

-7CZ 304183 B6

Příklady provedení vynálezu

Produkční kmen

K souběžné produkci extracelulárních lipolytických enzymů a PHA byl používán kmen bakterie Cupriavidus necator H16; Czech Collection of Microorganisms (CCM 3726). Jedná se o sbírkový kmen povolený k produkci PHA určených pro styk s potravinami, u kmene nebyla provedena žádná genetická modifikace.

Kultivace bakterií na odpadním oleji

Odpadní substráty jsou využívány k produkci PHA v řadě patentů. Jeden z nejobecnějších postupů zpracování zřejmě většiny typů odpadů je uveden v patentu US 2009/0317879 Al, kde však jsou odpady vesměs zpracovány methanotrofními bakteriemi na nižší karboxylové kyseliny (propionová, octová) a na methan, čímž se odpad zpřístupní produkčnímu kmeni. V jiném patentu (US 2010/0190221 Al) jsou využívány dokonce substráty, které mohou být toxické pro mikroorganismy nebo životní prostředí. Pomocí enzymu methanmonooxygenázy jsou převáděny organické sloučeniny na utilizovatelné substráty.

Rovněž vlastní produkce PHA na odpadních olejích nejrůznějšího druhuje součástí řady různých patentů. Autoři využívali např. skládkový odpad obsahující olej (CN 101255277 (A) - 2008-0903), dále jedlý odpadní olej k produkci PHA pomocí vodíkových bakterií (JP 2004254668 (A) 2004-09-16), různé typy rostlinných olejů - uvedeno obecně (WO 2009/156950 A2 -jmenovitě slunečnicový, řepkový, konopný a další bez bližšího upřesnění; neuvádějí odpadní fritovací olej). Dalším možným substrátem je olej zBrassica carinata utilizovaný bakteriemi rodu Pseudomonas (WO 2010/0441180A1). Dále existuje několik publikací zabývajících se produkcí PHA z olejů a příbuzných substrátů [9-19], V žádném z dostupných zdrojů se nevyskytuje možnost využití odpadního fritovacího oleje předem hydrolyzovaného enzymem indukovaným v průběhu kultivace samotným produkčním kmenem.

Souběžná produkce dvou průmyslově významných metabolitů (PHA a extracelulárních lipolytických enzymů), z nichž jeden (extracelulámí lipolytický enzym) je indukován výhradním typem substrátu o konkrétním chemickém složení (rostlinný olej), přičemž tento substrát je s výhodou navíc odpadní a specifický (fritovací olej, který nemá další využití), je odbouratelný druhým z produktů (lipolytickými enzymy) a současně poskytuje nejvyšší výtěžky druhého z metabolitů (na oleji byly dosaženy u produkčního kmene absolutně nejvyšší výtěžky PHA - až 96 % biomasy) nebyla dosud v případě produkce PHA popsána v literatuře odborné ani patentové.

V některých patentech se vyskytuje popis produkce doprovodných produktů (př. WO 02/070659 A2), většinou se však jedná o alespoň částečně anaerobní proces zpracování substrátu (výjimečně olej, který však musí být utilizován aerobně) a jedná se většinou o malé molekuly - produkty typicky kvasných procesů (kyselina octová, propionová apod.), které mohou být dále nějakým způsobem využity. Jeden publikovaný patent popisuje simultánní produkci intracelulárních PHA a extracelulárních polysacharidů, avšak za využití geneticky modifikovaných kmenů (WO 95/33 838).

Aktivity extracelulárních lipolytických enzymů na různých typech uhlíkatého substrátu jsou uvedeny v Tabulce 2

-8CZ 304183 B6

	Relativní aktivita [%]	U/ml	U/mg
Olej	100.0 ± 1.1	34.37±0.37	72.23±0.77
Fruktóza	5.3±1.4	1.83±0.49	0.21 ±0.06
NB	38.7±7.1	13.29±2.46	0.26±0.05
Glycerol	38.1 ±4.1	13.11 ±1.40	10.15±1.09
Propionát	23.9±5.4	8.23±1.85	25.68±5.77
Palmitát	54.3+3.5	18.67±1.20	37.92±2.44

a srovnání indukce aktivity extracelulámích lipolytických enzymů na různých typech uhlíkatého substrátu je znázorněna na obr. 7.

Složení médií: inokulační; produkční; přídavek prekurzoru

Dosud nejběžnějším druhem PHA akumulovaným v bakteriích produkčních kmenů je homopolymer PHB. Vzhledem k nízké krystalinitě a flexibilitě byly postupně vyvíjeny procesy k produkci kopolymerů P(3HB-co-3HHx), kde byl produkován zejména kopolymer s kyselinou 3hydroxyvalerovou, obvykle s využitím transgenního kmene Ralstonia eulropha nebo transgenních kmenů s geny z některého druhu Pseudomonas sp. (japonské patenty Kokai 57-150393, 59220192). Nedávno byly přihlášeny patenty na produkci p(3HB-co-3-HHx) obsahující kyselinu 3-hydroxyhexanovou (patenty Kokai 5-93049, 7-93049) pomocí půdní bakterie Aeromonas cavie. Zavedením 3-HH bylo dosaženo vysoké flexibility polymeru. Rovněž byly přihlášeny práce zaměřené na produkci kopolymeru s 3-hydroxyalkanovými kyselinami se zavedenou methylovou skupinou, nejčastěji s využitím rekombinantních kmenů (př. US 2011/0081692 Al). Také byl prezentován patent na produkci PHA u vybraných druhů rodu Pseudomonas s řízeným složením kopolymeru regulovaným pomocí složení média (C-zdroj - mastné kyseliny) a přídavků vhodných prekurzorů (US 2011/0166318 Al), případně patent na přípravu blokových kopolymerů pomocí řízení enzymových aktivit a složení média (WO 0006762 Al).

Vzhledem k širokému použití a rovněž souladu složení kopolymeru 3-HB-HV s evropskou legislativou pro použití v potravinářství (tj. na potenciální aplikace) jsme se zaměřili na produkci kopolymeru 3-HB-HV s obsahem HV od 4 do 10 %.

Složení médií

Médium pro úchovu a inokulum I

Beef extrakt 10 g

Pepton 10 g

NaCl 5 g

Destilovaná voda 1000 ml

Médium pro další inokulační kroky a produkční médium:

Olej (odpadní, rostlinný) (NH₄)₂SO₄

Na₂PO₄

KH₂PO₄

Micro element solution* Destilovaná voda

FeCI₃

CaCal₃

CuSO₄

CoCI₂

NiCl₂

CrCl₂

Destilovaná voda g

3g

11,1 g

1,02 g ml

1000 ml*Micro element solution

9.7 g

7.8 g

0,156 g

0,119 g

0,118g

0,062 g

1000 ml

-9CZ 304183 B6

Kultivace bakterií, produkce biomasy a její řízení

Bylo připraveno inokulum I o celkovém objemu 2000 ml (obvykle v Erlenmeyerových baňkách), pak zaočkovací inokulum II ve fermentoru o objemu 25 1 a po 23 h kultivace bylo inokulem zaočkováno 200 1 kultivačního média v produkčním tanku.

Kultivace v produkčním médiu probíhala po dobu 32 až 38 hodin. V 8. až 12. hodině bylo přidáno 10 g/1 prekurzoru (propionát sodný), 3 g/1 (NH₄)₂SO₄ a 20 g/1 oleje (příkrm). V čase 8 až 21,5 h bylo obvykle dosaženo maximální aktivity extracelulárních lipolytických enzymů, část média (10 až 50%) byla tedy odčerpána, biomasa byla odseparována pomocí ultrafdtrace a následně (i) sterilně vrácena zpět do procesu nebo (ii) přidána do reaktoru nesterilně před izolací PHA. Permeát obsahující extracelulámí lipolytické enzymy byl dále zakoncentrován na ultrafiltraci (vylučovací limit molekulové hmotnosti, tzv. „cut-ofP‘ 10 kDa). V čase 20 až 25 h byla přidána další dávka oleje (20 g/1).

Výtěžky metabolitů v průběhu typického fermentačního procesu jsou znázorněny na Obr. 8 a popsány v Tabulce 3:

Čas	Biomasa[g/I]	PHA [g/1]	PHA %	3HV [%]	Lipáza[U/ml]
8	6.23 ± 0.04	4.08 ± 0.04	65.45 ± 0.72	0.00 ± 17.20	17.20 ±2.70
14.5	11.52 ±0.09	8.89 ± 0.25	77.15 ±2.17	0.51 ± 18.68	18.68 ±0.91
21.5	16.14 ±0.49	10.85 ± 0.41	67.23 ± 2.54	1.32 ± 16.40	16.40 ± 1.27
24.5	37.65 ± 0.74	31.23 ± 0.20	82.95 ± 0.53	2.43 ± 5.22	5.22 ± 0.72
29.5	43.79 ±0.18	36.19 ± 1.89	82.65 ±4.31	4.01 ± 7.04	7.04 ± 1.82
32	53.90 ± 0.70	49.94 ±	92.66 ±3.21	6.37 ± 9.27	9.27 ± 1.38

1.73

Výtěžnostní koeficient Y_PHa/s ⁼ θ·7 (do kalkulace byl zahrnut olej i prekurzor).

V průběhu kultivace bylo pH kultivačního média udržováno na hodnotě 7 přídavkem 1M NaOH nebo 0,5M H₂SO₄, vzdušnění bylo regulováno tak, aby hodnota koncentrace rozpuštěného kyslíku („dissolved oxygen“, DO) byla v průběhu fermentace 20 až 30 %.

Jednokroková ekologická izolace polymeru z buněk přímo v průmyslovém reaktoru bezprostředně po ukončení kultivace

Buňky se od média obvykle nejprve oddělují centrifugaci nebo filtrací. Poté musí být narušeny, aby došlo k uvolnění polymeru. Nejčastěji používanou metodou je extrakce polymeru pomocí vhodného rozpouštědla (chloroform, methylen chlorid propylen karbonát, dichlorethylen). Tento proces je však na spotřebu rozpouštědla velmi náročný, a to jej prodražuje. Jiná metoda využívá chlornanu sodného, ten ovšem způsobuje částečnou degradaci PHB a snižuje jeho molekulovou hmotnost. Byla publikována řada patentů využívajících snad všechny typy dostupných organických rozpouštědel - i těch, v nichž se PHA prokazatelně nerozpouští. Postupy izolace polymeru PHA pomocí organických rozpouštědel lze najít v řadě publikací i v patentech, př. RU 2199 587 C2, US 2002/0081646 A1 a další.

Byly ale rovněž popsány procesy (obvykle obecně), které mohou být použity při komerční produkci PHB a P(HB-co-HV) jako alternativa k extrakci rozpouštědly. Jednou z možností je lyofi- 10CZ 304183 B6 lizace (mrazové sušení; WO 2006103699 Al, WO 2010/082810 Al), dále byly popsány postupy používající směsi enzymů a detergentů bez bližšího upřesnění složení lytické směsi (př. WO2010116681 (Al) - 2010-10-14).

V předložené přihlášce nejsou buňky předem oddělovány, polymer je izolován přímo ve fermentačním reaktoru bezprostředně po ukončení kultivace (obvykle 32 až 38 hodin). Buňky v kultivačním médiu jsou nejprve vystaveny zahřátí, kdy se kultivační médium ohřeje na teplotu 80 °C (30 min) a po následném ochlazení na 60 °C je přidána směs obsahující proteolytícký enzym (tj. enzym hydrolyzující bílkoviny, např. alkalázu) a detergent (př. dodecylsulfát sodný) s optimalizovanou koncentrací (0,04 g SDS/1 g CDW; Alcojet - neutrální průmyslový detergent). Většina buněčných komponent je působením těchto dvou činidel hydrolyzována, zatímco polymer zůstane nedotčen. Poté se polymer oddělí frakční membránovou ultrafiltrací, promyje vodou a vysuší lyofilizací.

Centrifugace jakožto běžně používaná technika k oddělení buněk od média, případně polymeru od zbytku buněk se ukázala být obtížně použitelnou. Zejména centrifugace produktu je docela obtížná, protože zbytkový olej unáší relativně velkou část (cca 1/4 až 1/3) centrifugovaného vzorku k hladině, což představuje značnou ztrátu, jak vyplývá z Obr. 9, na němž je znázorněna charakterizace průběhu centrifugace polymerního produktu metodou analytické centrifugace (4000 rpm, 2 hodiny, 5 °C).

Proto byla v předložené přihlášce optimalizována frakční membránová ultrafiltrace za použití filtračních kazet s „cut-off“ vylučovacím limitem 200 až 400 kDa.

Finální produkt může být ještě promyt za účelem zvýšení čistoty. V následující tabulce (Tabulka 5) je uveden přehled možných purifikačních podmínek a jejich vliv na čistotu produktu PHA.

Tabulka 5
H₂O 25 °C	PHA % 92.39 ±6.15
H₂O 40 °C	93.79 ±9.78
H₂O 60 °C	101,64±0.86
H₂O 80 °C	102.44±5.91
OJMNaOH	100.55±1.92
0,lM HCI	91.73±1.42
3% H₂O₂	58.36±1.42
1% EtOH	91.34±1.43
kontrola	91.72±2.49

Produkce, izolace a využití extracelulámích lipolytických enzymů

Pokud se bakterie kultivuje na oleji (a to výhradně na oleji), kterým může být rostlinný olej a/nebo jedlý olej a/nebo odpadní jedlý olej, s výhodou fritovací olej, produkuje extracelulámí lipolytické enzymy, které jí pomáhají olej rozkládat a využít. Extracelulámí lipolytické enzymy jsou průmyslově významné enzymy a v průběhu této kultivace jsou produkovány ve velkém, tedy průmyslově zajímavém množství. Proto navrhujeme celkové technologické řešení zahrnující společnou produkci PHA (intracelulární polymer; výtěžek 93 až 96 %) a lipázy (extracelulámí enzym; aktivita ca 100 U/ml). Při společné produkci je potřeba předřadit finální lýze buněk a izolaci PHA krok zahrnující izolaci extracelulámích lipolytických enzymů z kultivačního média.

Navrhli jsme efektivní technologické řešení izolace extracelulámích lipolytických enzymů v průběhu fermentačního procesu metodou frakcionované membránové filtrace. Maximální produkce extracelulámích lipolytických enzymů předchází maximální produkci PHA o několik hodin, v průběhu produkce PHA se tedy odčerpá, buď sterilně všechno kultivační médium, nebo nesterilně část kultivačního média i s buňkami (záleží na vybavení biotechnologické linky). A následně jsou techniky možné dva způsoby izolace extracelulárních lipolytických enzymů;

a) sterilní ultrafiltrace kultivačního média od buněk ve vhodném čase (obvykle po 24. h kultivace), doplnění nového kultivačního média se substrátem a prekurzorem k rostoucím buňkám. Prekurzor se přidává do kultivačního média společně s doplňkovou dávkou oleje (příkrm) a s extracelulárními lipolytickými enzymy.

b) nesterilní odčerpání části kultury (př. 1/3 buněk v kultivačním médiu), izolace buněk a následná purifikace extracelulárním lipolytických enzymů ultrafiltraci; poté návrat buněk s cca 70% obsahem polymeru zpět do reaktoru těsně před finální izolací PHA.

Extracelulámí lipolytické enzymy je dále možné využít v následující kultivaci jako faktor navyšující produkci biomasy a tím zrychlující celý proces. Pokud jsou do média obsahujícího olej přidány extracelulámí lipolytické enzymy izolované dle postupu popsaného výše v množství 0,5 až 3 U na ml kultivačního média (tj. cca 2%) a následně je médium inokulováno kulturou Cupriavidus necator, roste bakteriální kultura o cca 20 až 30 % více. Extracelulámí lipolytické enzymy produkované C. necator se pro tento účel jeví vhodnější než např. komerčně dodávaná lipáza produkovaná mikroorganismem Rhizopus oryzae. Vliv přídavku extracelulárních lipolytických enzymů na průběh kultivace Cupriavidus necator H16 při použití oleje jako zdroje uhlíku je znázorněn na Obr. 10.

Charakterizace polymeru PHA

Stanovení obsahu a struktury produkovaného PHA

Koncentrace a složení PHA se nejčastěji stanovuje metodou plynové chromatografie (GC) s detekcí F1D (plamenově ionizační detektor). Před vlastní analýzou je polymer podroben kyselé hydrolýze a následné methylaci za vzniku těkavých methylesterů 3-hydroxykyselin. Tyto estery jsou následně separovány a detekovány pomocí GC. Na Obr. 11 je uveden typický chromatogram polymeru složeného z 3-hydroxybutyrátu a 3-hydroxyvalerátu. Integrací píků a posléze metodou kalibrační křivky (Tab. 6) lze odečíst obsah každé ze složek a vyjádřit jejich poměr, tedy zastoupení 3-HV v kopolymeru PHB-HV.

Tabulka 6 Vztah mezi plochou píku a koncentrací 3HB (3HV)

3HB (mg-ml'¹)	3HB plocha (-)	3HV (mg-ml'¹)	3HV plocha (-)
2,0592	16133,8	0,2808	3076,1
4,1272	31629,3	0,5628	6159,2
6,1952	44894,3	0,8448	8801,3
8,2632	65493,6	1,1268	12837,5
10,296	77344,3	1,4040	15265,1

Stanovení molekulové hmotnosti produkovaného PHA

Molekulová hmotnost PHA je velmi důležitým parametrem zejména z hlediska aplikačního využití. Důležitá je její hodnota jak při zpracování PHA např. na bioplazmy, nanovlákna nebo částice, ale i při řadě farmaceutických aplikací, zejména v souvislosti s biodegradabilitou použitých materiálů. Proto je důležité charakterizovat produkovaný mikrobiální polymer co nejdetailněji, případně objektivizovat podmínky pro produkci polymeru o definované molekulové hmotnosti.

- 12CZ 304183 B6

Molekulová hmotnost produkovaného PHA polymeru byla stanovována metodou gelové permeační chromatografie (GPC). Příklad GPC chromatografu PHA je znázorněn na obr. 12. V průběhu řady testovacích experimentů bylo zjištěno, že pouhou modifikací kultivačních podmínek (např. nutriční stres) a volbou kultivačního média lze ovlivnit molekulovou hmotnost výsledného polymeru. Někteří autoři k tomuto účelu používali enzymové preparáty, chemické látky nebo radiaci (viz př. US 2006/0183205 Al).

V našem případě bylo dosaženo produkce polymeru s molekulovou hmotností v rozmezí 1,85 až 2,41 E+05, přičemž na sacharidovém substrátu bylo dosažené více než dvojnásobné hodnoty.

o

Molekulová hmotnost vybraných vzorků PHA je uvedena v tabulce 7

	Mn	Mw	D
Biomer PHB (komerčně dostupný materiál)	1.75-10 5	5.15-10 5	2.94
Sigma P(HB-co-HV); 5 % HV (komerčně dostupný	1.84-10	5.51-10	2.99
materiál)	5	5
Sigma P(HB-co-HV); 12 % HV (komerčně	1.36-10	2.95-10	2.17
dostupný materiál)	5	5
PHB, kultivace C. necator H16, substrát fruktóza	6.94-10 5	1.81-10 6	2.61
PHB, kultivace C. necator H16, substrát olej	3.84-10 5	1.15-10 6	3.00
P(HB-co-HV), 6 % HV; kultivace C. necator H16,	2.41-10	6.60-10	2.74
substrát olej, prekurzor propionát sodný	5	5

Tepelná stabilita

Tepelné vlastnosti PHA závisí na zastoupení jednotlivých monomerů (viz. tab. 1). Jednotlivé parametry jako teplota degradace materiálu, teplota tání atd. se rutinně stanovují pomocí TGA (termogravimetrická analýza), která je znázorněná na obr. 13, a DSC (diferenciální skenovací kalorimetrie), která je znázorněna na obr. 14.

Teplota tání a bodu degradace vybraných vzorků PHA je uvedena v Tabulce 8

	Teplota degradace [*€]	Teplota tání [Ό]
Biomer PHB (komerčně dostupný materiál)	264	168.52
Sigma P(HB-co-HV); 5 % HV (komerčně dostupný
materiál)	264	144,87
Sigma P(HB-co-HV); 12 % HV (komerčně
dostupný materiál)	278	146,36
PHB, kultivace C. necator H16, substrát fruktóza	281	172.36
PHB, kultivace C. necator H16, substrát olej	281	171.05
P(HB-co-HV), 6 % HV; kultivace C. necator H16,
substrát olej, prekurzor propionát sodný	256	166,40

Rozpustnost PHA

PHA není rozpustné v jednoznačně polárních nebo jednoznačně nepolárních rozpouštědlech. Schopnost polymer zčásti rozpustit nebo vytvořit gel mají rozpouštědla ze střední oblasti eluo30 tropní řady. Rozpustnost PHA ve vybraných organických rozpouštědlech ukazuje Tabulka 9:

Rozpustnost Barva kapaliny	Hexan HX nr. slabě nažl.	Dichlormetha n DCM mr. slabě nažl.	Xylen XYL mr. + gel slabě nažl.	Toluen TOL gel slabě nažl.
Rozpustnost Barva kapaliny	Dioxan DOX mr. slabě nažl.	Chloroform CHL gel slabě nažl.	Dimethylsulfoxi d DMSO gel slabě nažl.	Butylacetát BuAc mr. + gel slabě nažl.
Rozpustnost Barva kapaliny	Ethylacetát EthAc nr. slabě nažl.	Aceton ACE nr. slabě nažl.	2-propylalkohol 2PrOH nr. slabě nažl.	Ethanol EtOH nr. slabě nažl.
R - dobře rozpustný;	r - rozpustný; mr	- málo rozpustný;	nr-

nerozpustný; gel- tvoří gel

Charakterizace extracelulárních lipolytických enzymů

K základním molekulárním charakteristikám patří pH optimum, jehož hodnoty jsou shrnuty v obr. 15 a uvedeny v Tabulce 10, která uvádí změny aktivity extracelulárních lipolytických enzymů při různém pH hodnocené v % ve srovnání s nejvyšší hodnotou 100 %.

PH	Aktivita (%)
3,0	7,42 ± 2,22
4,0	6,52 ±1,96
4,8	9,59 ±0,31
5,8	18,8 0± 1,13
6,6	27,49 ±1,48
7,0	37,21 ±2,36
7,4	76,60± 9,89
8,0	79,28 ± 5,69
8,3	54,6 ± 1,78
9,0	10,1 ±2,66
9,4	16,88 ±2,49
9,8	68,54 ±3,49
10,6	100 ± 17,47
11,0	60,23 ±8,70
11,5	2,05 ± 0,96
12,0	6,14 ±5,04
13,0	11,13 ± 6,93

Průběh pH optima vykazuje dvě maxima, což odpovídá dvěma molekulárním formám extracelulárních lipolytických enzymů. U mikroorganismů je podobný typ sekrece lipolytických enzymů obvyklý; vzhledem k hodnotě pH optima lze předpokládat, že obě formy štěpí acylglyceroly a jde zřejmě o enzymy s odlišnou preferencí esterové vazby v triacylglycerolech.

Vliv iontové síly (NaCl, 0 až 5 mol/1) na aktivitu extracelulárních lipolytických enzymů je uveden na Obr. 16. Z průběhu závislosti je patrné, že aktivita extracelulárních lipolytických enzymů klesá s rostoucí iontovou silou, což je významné z hlediska složení kultivačního média.

- 14CZ 304183 B6

Parciální purifikace extracelulárních lipolytických enzymů

Kultivační médium obsahuje po separaci buněk kromě extracelulárních lipolytických enzymů i řadu jiných proteinů a dalších látek. Navíc jsou všechny tyto látky včetně cílového enzymu značně zředěny. Za účelem zahuštění a bližší charakterizace extracelulárních proteinů byly provedeny některé následující experimenty zaměřené na ověření levné a efektivní izolace a současné purifikace enzymu.

Srážení acetonem vedlo ke značným ztrátám aktivity, výtěžek představoval cca 1 %. Při srážení síranem amonným v rozmezí koncentrací 60 až 80 % bylo nasycení úspěšnější, avšak následná dialýza vedla k prakticky kompletní ztrátě aktivity, výtěžky se pohybovaly kolem 3 %. Další metodou použitou na purifikací extracelulárních lipolytických enzymů byla frakcionovaná ultrafiltrace. V první fázi byly odstraněny buňky (na filtru s cut-off 1 mil. kDa) a dále byly izolovány extracelulámí lipolytické enzymy na ultrafiltru s „cut-off‘ vylučovacím limitem 10 kDa. Došlo k 8-násobnému zkoncentrování a výtěžku cca 91 U/ml kultury, viz Tabulka 11. Ultrafiltrace byla tedy navržena jako optimální součást technologie.

Tabulka 11

	Aktivita (U-ml'¹)	Koncentrace proteinů (mg-ml·¹)	Aktivita (U-mg'¹)	objem (ml)	výtěžek (-)
Supernatant	29,92 ± 3,24	0,30± 0,01	99,74 ± 10,83	400	1,00
Ultrafiltration	90,68+ 1,47	0,44 + 0,01	206,11 ±3,36	50	0,38

Molekulová hmotnost extracelulárních proteinů a čistota preparátů extracelulárních lipolytických enzymů stanovená pomocí PAGE/SDS

Za účelem charakterizace proteinového složení a tedy i čistoty zahuštěného preparátu extracelulárních lipolytických enzymů byla využita metoda polyakrylamidové gelové elektroforézy (PAGE) v přítomnosti dodecylsulfátu sodného (SDS), kde se proteiny separují na základě pohyblivosti ve stejnosměrném elektrickém poli. Pohyblivost je dána poměrem hmotnosti a náboje částice. Poněvadž všechny proteiny mají za těchto podmínek stejný náboj i tvar, separace probíhá v podstatě na základě rozdílů molekulové hmotnosti. Záznam separace (barvení stříbrem) je na obr. 17. Legenda k obr. 17 je v následující Tabulce 12

linie	Vzorek - purifikačni krok
1	Standard
2	Dialýza
3	Dialýza
4	Ultrafiltrace
5	Aceton- precipitace
6	(NH₄)₂SO₄ precipitace 60%
7	(NH₄)₂SO₄ precipitace 70%
8	(NH₄)₂SO₄ precipitace 80%

- 15 CZ 304183 B6 a Tabulce 113, která popisuje proteinové frakce elektroforézy

Zóna	relativní molekulová hmotnost (Da-10³)
Proteinová frakce 1	15,95
Proteinová frakce 2	18,80
Proteinová frakce 3	24,34
Proteinová frakce 4	47,54
Proteinová frakce 5	64,52

Extracelulámí frakce C. necator H16 obsahuje 5 hlavních proteinových frakcí o molekulové hmotnosti 15,95 kDa; 18,00 kDa; 24,34 kDa a 47,54 kDa a 64,52 kDa. Z nich první čtyři byly viditelné i po dialýze. Po aplikaci ultrafiltrace (membránový filtr s 10 kDa „cut-off‘ vylučovacím limitem) byly majoritními frakcemi proteiny s MR 18,80 kDa a 24,34 kDa, frakce 15,95 kDa byla viditelná pouze slabě. Současně bylo metodou PAGE/SDS potvrzeno, že preparát extracelulárních lipolytických enzymů získaný frakcionovanou ultrafiltrací je sice poměrně málo koncentrovaný, ale obsahuje minimum příměsí a lze jej použít k přímé aplikaci - buď jako přídavek do kultivačního média k průmyslové produkci PHA, k předzpracování olejového substrátu, nebo k jiným průmyslovým aplikacím.

Reference

1. Flickinger, Michael C.; Drew, Stephen W. Encyclopedia of Bioprocess Technology - Fermentation, Biocatalysis and Bioseparation, Volumes 15. John Wiley&Sons, 1999. 2024-2133 s. ISBN 1-59124-457-9.

2. Sudech K., Abe H., Doi Y, Synthesis, structure and properties of polyhydroxyalkanoates: biological polyesters, Progres in Polymeric Science, 2000, vol. 25. 1503-1555 p. ISSN 00796700.

3. Steinbuchel A, Valentin Η. E. Diversity of bacterial polyhydroxyalkanoic acids: minireview, FEMS Mikrobiology Letters, 1995, vol. 125. 219-228 p. ISSN 0378-1097.

4. Kessler B., Wilholt B. Factors involved in theregularoty network of Polyhydroxyalkanoate metabolism: review, Journal of Biotechnology, 2001, vol. 86, 97- 104p., ISSN 0168-1656.

5. Rehm, B.H.A.: Polyester synthases: natural catalystsforplastics. TheBiochemical Journal 2003, vol. 376, 15 -33 p., ISSN 0264-6021.

6. Rehm Β. H. A. Genetics and biochemistry of polyhydroxyalkanoates granule self-assembly: The key role of polyester synthese, Biotechnology Letters, 2006, vol. 28, 207—213 p. ISSN 1573-6776

7. Byrom D. Novel Biodegradable Microbial Polymers. Springer, 1990.113-117 p. ISBN 9780792309499.

8. Hrabak O. Industrial production of poly-P-hydroxybutyrate, FEMS Mikrobiology Reviews, 1992, vol. 103, 251-255 p. ISSN 0168-6445.

9. Taniguchi I., Kagotani K., Kimura Y. Microbial production of poly(hydroxyalkanoates)s from waste edible oils. Green Chemistry, 2003, vol. 545-548 p., ISSN 1463-9270.

10. Chán P.-L., Yu V., Wai L., Yu H.-F. Production of medium-chain-length polyhydroxy alkanoates by Pseudomonas aeruginosa with fatty acids and alternativě carbon sources. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2006, vol. 129, 933-941 p. ISSN 0273-2289.

l.Bhubalan K., Lee W.-H., Loo C.-Y., Yamamoto T., Tsuge T., Doi Y., Sudesh K. Controlled biosynthesis and characterization of poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate-co-3- 16CZ 304183 B6 hydroxyhexanoate) from mixtures of palm kemel oil and 3HV-precursors. Polymer Degradation and Stability, 2008, vol 93, 17—23 p. ISSN 0141-3910.

12. Kimura H., Takahashi T., Hiraka H., Iwana M., Takeishi M. Effective biosynthesis of poly(3hydroxybutyrate) from plant oils by Chromobacterium sp. Polymer Journal, 1999, vol. 31, 210-212 p. ISSN 0032-3896.

13. Fukui T., Doi Y. Efficient production of polyhydroxyalkanoates from plant oils by Alcaligenes eutrophus and its recombinant strain. Applied Microbiology and Biotechnology, 1998, vol. 49, 333-336 p. ISSN 1432-0614.

14. Kek Y-Κ., Chang C.-W., Amirul A.-A., Sudesh K. Heterologous expression of Cupriavidus sp. USMAA2-4 PHA synthase gene in PHB¹ mutant for the production of poly(3-hydroxybutyrate) and its copolymers. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2010, online first, DOI 10.1007/sl 1274-010-0335-5.

15. Alias Z., Tan I. K. P. Isolation of palmoil- utilizin, polyhydroxyalkanoate (PHA)-producting bacteria by an enrichement technique. Bioresource Technology, 2005, vol. 96, 1229-1234 p. ISSN 0960-8524.

ló.Marsudi S., Unno H., Hoři K. Palm oil utilization for the simultaneous production of polyhydroxyalkanoates and rhamnolipids by Pseudomonas aeruginosa, Applied Microbiology and Biotechnology, 2008, vol. 78, 955-961 p. ISSN 1432-0614.

17.Akiyama M., Taima YDoi Y. Production of poly(3-hydroxyalkanoates) by bacterium of the genus Alcaligenes utilizin long-chain fatty acids. Applied Microbiology and Biotechnology, 1992, vol. 37, 698-701 p. ISSN 1432-0614.

18.0bruca S., Marova I., Snajdar O., Mravcova L., Svoboda Z. Productionofpoly(3hydroxybutyrate-co-3-hydroxyalerate) by Cupriavidus necator from waste rapeseed oil using propanol as a precursor of 3-hydroxyvalerate, Biotechnology, Letters, 2010, vol. 32, 1925— 1932 p. ISSN 0141-5492

19. Verlinden R. A. J., Hill DJ, Kenward MA, Williams CG, Piotrowska-Seget Z., Radecka IK Production o fpolyhydroxyalkanoates from waste frying oil by Cupriavidus necator. AMB· Express, 2011, vol. 1, DOE10.1186/2191-0855-1-11

20. Hasan F., Shah AA, Hameed A: Industrial applications of microbial lipases. Enzyme and Microbial Technology 2006, vol. 39, 35-251 p.

21. Joseph, B., Ramteke P. W., Thomas, G., Shrivastava, N.: Standard Rewiew Cold-active microbial Lipases: a versatile tool forindustrial applications. Biotechnology and Molecular Biology Rewiew, June 2007, vol. 2, pp. 39—48. ISSN 1538/2273.

22. Bornscheuer U.T.: Microbial carboxylesterases: classification, properties and application in biocatalysis; FEMS Microbiology Reviews 26 (2002) 73-81.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob produkce polyhydroxyalkanoátů, PHA, u něhož se na olejovém substrátu obsahujícím rostlinný olej a/nebo jedlý olej a/nebo odpadní jedlý olej, s výhodou fritovací olej, kultivuje kmen bakterií Cupriavidus necator H16, který přetváří olej na PHA při současné produkci extracelulámích lipolytických enzymů, které se z kultivačního média alespoň částečně izolují v průběhu fermentačního procesu před ukončením produkce a izolace PHA, vyznačující se tím , že před zahájením kultivace se do olejového substrátu přidají extracelulámí lipolytické enzymy vyprodukované Cupriavidus necator H16, čímž se urychlí růst bakteriální kultury.

- 17 CZ 304183 B6
2. Způsob produkce PHA podle nároku 1, vyznačující se tím, že extracelulární lipolytické enzymy se z kultivačního média izolují sterilní ultrafiltrací kultivačního média, při níž se oddělí buňky bakterií Cupriavidus necator H16 a vrátí se zpět do produkčního zařízení.
3. Způsob produkce PHA podle nároku 1, vyznačující se tím, že extracelulární lipolytické enzymy se z kultivačního média izolují nesterilním odčerpáním části fermentovaného kultivačního média, načež se z odčerpané části fermentovaného kultivačního média oddělí buňky bakterií, které se před izolací PHA vrátí do fermentovaného kultivačního média, a ze zbytku se izolují extracelulární lipolytické enzymy.
4. Způsob produkce PHA podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že po izolaci extracelulárních lipolytických enzymů se tyto do kultivačního média alespoň částečně vrací společně s doplňkovou dávkou olejového substrátu pro podporu růstu bakterií Cupriavidus necator H16.
5. Způsob produkce PHA podle libovolného z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že během kultivace se pH kultivačního média udržuje na hodnotě 7 přídavkem NaOH nebo H2SO4 a koncentrace rozpuštěného kyslíku se řízeným vzdušněním v průběhu fermentace udržuje v rozmezí hodnot 20 až 30 %.
6. Způsob produkce PHA podle libovolného z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že olejový substrát obsahuje přídavek látky ze skupiny propionát sodný, n-propanol, levulinová kyselina.
7. Způsob produkce PHA podle libovolného z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že po ukončení fermentace se obsah produkčního reaktoru zahřeje na teplotu 80 °C po dobu alespoň 30 minut, následně se zchladí na teplotu 60 °C a přidají se lytická činidla obsahující směs detergentu, například SDS, a proteolytického enzymu, čímž se získá surový homogenát, případně lyzát.
8. Způsob produkce PHA podle nároku 7, vyznačující se tím, že surový homogenát/lyzát se čistí frakcionovanou membránovou filtrací a promytím vodou o teplotě 20 až 60 °C, přičemž konečná výtěžnost PHA je až 96 % z původní biomasy buněk.
9. Způsob produkce PHA podle nároku 2 nebo 3, vyznačující se tím, že extracelulární lipolytické enzymy se zahustí ultrafiltrací, čímž se dosáhne jejich čistoty v intervalu 100 až 200 U/mg.