ES2299064T3 - Metodo de sintesis de peptidos. - Google Patents
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Abstract
Método para la amidación del grupo a-carboxilo libre de un aminoácido o péptido, que comprende el primer paso de reaccionar dicho aminoácido o péptido, con un reactivo de acoplamiento peptídico en un solvente orgánico aprótico en presencia de una primera base, con la exclusión de una función a-amino de un péptido o aminoácido, y en presencia de una sal de amonio de al menos un aditivo de acoplamiento peptídico, donde el catión de amonio es seleccionado del grupo consistente de amoniaco protonado, amina primaria protonada y amina secundaria protonada, donde el pH es controlado durante la reacción para estar en el rango de 8 a 9, y donde la cadena lateral y la función a-amino de dicho aminoácido o péptido son protegidas con grupos protectores no-base-lábiles.
Description
Método de síntesis de péptidos.
La presente invención se relaciona con el campo
de los polipéptidos útiles farmacéuticamente, a saber con un método
respectivo de derivación química que mejora la actividad biológica
de tales péptidos. Esta concibe un método de amidación química del
C-terminal de un polipéptido.
Los fármacos de pequeños péptidos han ganado
importancia como una clase útil y diferente de ingredientes
farmacéuticamente activos. Por ejemplo, los péptidos
anti-infecciosos, particularmente los péptidos
catiónicos cuya fabricación biotecnológica industrial es concebida
en US 2003/0219854 A1, son una nueva clase de sustancias
antimicrobianas de amplio espectro que pueden ayudar a combatir la
rápida extensión de la resistencia multifármaco hacia los
antibióticos clásicos entre los microbios patógenos.
Los péptidos anti-infecciosos de
ocurrencia natural incluyen modificaciones
post-traduccionales como la amidación
C-terminal que son imperativas para sustentar la
actividad biológica (Boman, Immunol. Rev. 173:5, 2000). Por
ejemplo, la amidación C-terminal elimina cargas
potenciales y además protege de la degradación rápida por
exopeptidasas ubicuas. Mientras que la síntesis química total puede
introducir adecuadamente funciones amida C-terminal
durante la síntesis (por ejemplo Han y otros, J.Org. Chem. 1996, 61,
6326-6339; Albericio, F. y Barany, G., Int. J.
Peptide Protein Res. 30, 1987, 206-216), la ruta
biotecnológica más rentable para el procesamiento de un péptido
individual desde grandes concatenadores de péptidos de punta a cabo
carece de esta posibilidad. De aquí que un péptido fabricado
biotecnológicamente de acuerdo con US 2003/02 19854 A1 debe tener
amidación C-terminal en un paso del procesamiento
aguas abajo. Sin embargo, los enfoques de la amidación química
descritos hasta ahora han traído consigo un grado considerable de
racemización del esqueleto del péptido.
US 2003/0219854 describe la amidación del
terminal de un dodecámero protegido con Boc rico en triptófano por
reacción con un exceso de amoniaco y un reactivo base (20 eq.) en
solvente aprótico, DMF, en presencia de cantidades casi
estequiométricas (6 eq) de un reactivo de acoplamiento de uronio
(HATU: hexafluorofosfato de
O-(7-azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio)
y del coactivador
N-hidroxi-9-azabenzotriazol.
El rendimiento supuesto del derivado del péptido desprotegido y
amidado fue del 47%.
La reproducción cuidadosa de esta secuencia de
reacción y el análisis del producto de la reacción (ver la sección
experimental) muestra que el bajo rendimiento se debe mayormente a
la epimerización indeseada del aminoácido
C-terminal, dando lugar a dos diastereómeros
amidados en una proporción de casi 1:1 como se confirma por los
electroferogramas obtenidos tanto con el método de la Ciclodextrina
CE como con el Tween 20. Esta proporción obtenida fue también
confirmada por una cromatografía en tándem de fase reversa
LC/ESI-MS usando reactivo de Marfey como un agente
derivador quiral del péptido hidrolizado como se describe en detalle
en la sección experimental de la presente solicitud. O sea, la
mitad del producto se pierde en la amidación debido a la
racemización eficiente del aminoácido
C-terminal.
Otro método aplicable sólo en el contexto de la
síntesis de fase sólida es descrito en Albericio, F. y Barany, G.,
Int. J. Peptide Protein Res. 30, 1987, 206-216. El
método sin embargo se complica requiriendo la preparación de asas
especiales de
FMOC-trialcoxi-benzilamida para la
funcionalización del soporte de resina. Después del acoplamiento y
síntesis del péptido al soporte, la escisión del así modificado
soporte de resina produce el péptido amidado fácilmente al
alrededor del 80% de pureza óptica del diastereoisómero deseado, lo
que se añade a una baja eficiencia de la escisión para dar sólo un
rendimiento total de alrededor de 60 a 70% del diastereoisómero
amidado deseado del péptido. Un enfoque similar con asas amidas
ligeramente diferentes químicamente es descrito por el mismo autor
en US 5306562.
El objeto de la presente invención es evitar las
desventajas en el arte anterior y concebir otro o mejorar el método
de amidación química, no enzimática de un grupo
\alpha-carboxilo no protegido de un péptido o
aminoácido. De acuerdo a la presente invención, este objeto es
resuelto por un método para la amidación del grupo
\alpha-carboxilo libre de un aminoácido o péptido,
que comprende un primer paso de reaccionar dicho aminoácido o
preferiblemente dicho péptido con un reactivo de acoplamiento
peptídico en un solvente orgánico en presencia de una base y además
en presencia de una sal de amonio de al menos un aditivo de
acoplamiento peptídico donde el catión de amonio es seleccionado
del grupo consistente de amoniaco protonado, amina primaria
protonada y amina secundaria protonada, y donde la cadena lateral y
la función \alpha-amino de dicho aminoácido o
péptido están protegidas con grupos protectores
no-base-lábiles.
Debe ser entendido que el reactivo base y el
catión de amonio de la sal preferiblemente no son idénticos y de
aquí que no están formando un par conjugado
ácido-base. Más bien, que hay una primera base y una
segunda base cuya segunda base es el catión de amonio de acuerdo a
la presente invención. En lo adelante, el término "base" será
siempre interpretado para hacer referencia sólo a dicha primera
base. La segunda base siempre estará referida como el catión de
amonio.
El método de la presente invención tiene la
ventaja de minimizar la epimerización adversa del átomo de
\alpha-carbono del residuo de aminoácido que está
realmente amidado en su grupo \alpha-carboxilo. En
péptidos di-mer o superior n-mer,
este residuo de aminoácido es el residuo C-terminal
de un péptido que es una realización particularmente preferida de la
presente invención.
El péptido o polipéptido de acuerdo a la
presente invención puede ser cualquier péptido. La protección de
las cadenas laterales y la función \alpha-amino
permitirá lograr una solubilidad suficiente de un péptido o
aminoácido adecuadamente protegido en el solvente orgánico. No es
necesario decir que las condiciones del solvente de acuerdo a la
presente invención demuestran favorablemente la amidación eficiente
bajo retención de la configuración, pero pudieran demostrar
desnaturalización en vista de que dejan ilesa la estructura
secundaria o aún terciaria de los péptidos más largos,
especialmente cuando tal estructura secundaria o terciaria no está
estabilizada por enlaces covalentes intracadenas o similares,
posiblemente elementos estructurales no naturales. Preferiblemente,
un péptido de acuerdo a la presente invención comprende 100 o menos
residuos de aminoácidos, más preferiblemente 50 o menos residuos de
aminoácidos, lo más preferido 20 o menos residuos de aminoácidos.
Esta definición incluye péptidos que comprenden compuestos no
naturales tales como D-aminoácidos, L- o
D-aminoácidos con cadenas laterales modificadas o
inusuales o bloques de construcción no aminoácidos que enlazan
diferentes partes de la cadena peptídica dentro del antedicho
péptido. La síntesis de fase sólida permite la síntesis eficiente
de péptidos con cerca de 50 residuos, aunque la reacción de
condensación del segmento de fase líquida adicional permite la
producción de péptidos totalmente sintéticos aún más largos. Ahora
existen restricciones a la longitud para los péptidos obtenidos por
producción biotecnológica. La reducción del contenido de agua de la
mezcla de reacción, así como la exclusión adecuada de otros
solventes próticos, en particular la exclusión además del agua de
alcoholes de alquilo inferiores C1-C5 tales como
metanol, isopropanol o etanol, es preferida por la presente
invención. Preferiblemente, el péptido es un péptido bactericida,
antimicrobiano o anti-infeccioso, preferiblemente
es un péptido catiónico antimicrobiano como por ejemplo
ILRWPWWPWRRK, a saber indolicidina, que son más activos en su forma
C-terminal amidada. Los péptidos
anti-infecciosos, particularmente los péptidos
catiónicos tales como los derivados de la indolicidina y en
particular ILRWPWWPWRRK cuya fabricación biotecnológica industrial
es concebida en US 2003/0219854 A1, son una nueva clase de
sustancias antimicrobianas de amplio espectro que pueden ayudar a
combatir la rápida extensión de la resistencia multifármaco hacia
los antibióticos clásicos entre los microbios patógenos.
Preferiblemente la reacción de amidación es
conducida teniendo un contenido de agua menor que el 25% (v/v), más
preferiblemente menor que el 15% (v/v), lo más preferido menor que
el 5% (v/v). En una realización preferida adicional, la reacción es
conducida bajo condiciones esencialmente libres de agua. Esto puede
incluir el uso por ejemplo de solventes destilados recientemente o
atmósfera protectora de nitrógeno.
Preferiblemente el solvente orgánico es un
solvente orgánico aprótico, más preferiblemente es un solvente
orgánico aprótico polar. Ejemplos adecuados son acetonitrilo,
sulfóxido de dimetilo, diclorometano y
N,N-dimetilformamida. Lo más preferido es que el
solvente aprótico orgánico sea
N,N-dimetilformida.
Preferiblemente la reacción de amidación es
conducida entre -15ºC y 50ºC y el pH es controlado durante la
reacción para estar en el rango de alrededor de 8 a 9,
preferiblemente es controlado alrededor de 8.5.
El tipo de reactivos referidos arriba como
reactivos de acoplamiento, aditivos de acoplamiento y grupos
protectores son bien conocidos de la síntesis de péptidos clásica,
que en esencia es una reacción de amidación, y son descritos en
detalle por ejemplo en Bodanszky, M., Principles of Peptide
Synthesis, 2^{a} ed., Springer Verlag Berlin/Heidelberg, 1993.
Los grupos protectores
no-base-lábiles son bien conocidos
en el arte, siendo interpretado el término "base lábil" para
hacer referencia a la abstracción por aminas primarias o secundarias
en un pH básico y/o aminólisis como es común en el arte. Ejemplos
adecuados son por ejemplo los grupos
2-nitrometoxifenilsulfenilo, Aloc
(aliloxicarbonilo), Z (benziloxicarbonilo), Boo
(tert-butoxicarbonilo),
Bpoc-(bifenilil-isopropoxicarbonilo). Los esquemas
de protección ortogonales que incluyen la protección base lábile son
por supuesto excluidos de la presente invención. Si se requiere o
no de protección global con un tipo único de grupo protector o
protección por diferentes tipos de grupos protectores en el mismo
péptido o aminoácido, depende de si la fuente del péptido es la
síntesis química o biotecnológica y del tipo de cadenas laterales
comprendidas en el péptido o aminoácido. Notablemente, la
eliminación de tales grupos
no-base-lábiles puede ser efectuada
por diferentes medios o bajo diferentes condiciones de reacción.
Por ejemplo, el grupo Nps (O-nitrofenilsulfenilo) es
favorablemente eliminado por nucleófilos sulfídrilos, los grupos Z-
son eliminados por hidrogenólisis o los grupos Aloc pueden ser
eliminados por hidrogenación catalizada por Pd(I). De acuerdo
a la presente invención, los grupos protectores
no-base-lábiles adecuados son
preferiblemente eliminados después de la amidación por acidólisis,
como es por ejemplo factible para los grupos Boc, Z, tritilo, Nps o
Bpoc.
De la esencia de la presente invención, es
evidente que la protección de las cadenas laterales de aspartil y
glutamil que pudieran estar presentes en el péptido de acuerdo a la
presente invención merecen atención especial y requieren adecuados
grupos de protección carboxilo para la protección selectiva o el
enmascaramiento de los grupos \omega-carboxilo
que dejan el C-terminal del grupo
\alpha-carboxilo. Esto puede ser logrado, por
ejemplo, por esterificación global de los grupos carboxilo con un
halogenuro de bencilo para producir un éster de bencilo, seguido
por la escisión regioselectiva del \alpha-éster con LiOH en
acetona (Bryant, P. y otros, 1959, J. Chem. Soc., p. 3868 ff.) o
por esterificación selectiva de los grupos
\omega-carboxilo con halogenuros de alquilo en
presencia de sales de Cu(II) enmascarando la
\alpha-función durante la esterificación por
formación compleja (Ledger, R., 1965, Austral. J. Chem. 18:1477ff.);
la desprotección del grupo \omega-carboxilo puede
también ser facilitada por catálisis de Cu(II) (Prestidge,
R., 1975, J. Org. Chem. 40:3287ff.).
En otra realización preferida de la presente
invención, el péptido o aminoácido a ser amidado está libre de
grupos carboxilo distintos al grupo
\alpha-carboxilo C-terminal a ser
amidado, preferiblemente está libre de residuos glutamil o
aspartil.
Dado que la generación de residuos glutaminil o
asparaginil por grupos \omega-carboxilo
concomitantes es deseable y ha sido tomada en cuenta en la
estrategia sintética global de un péptido o aminoácido de acuerdo a
la presente invención, es un objeto independiente adicional de dicha
invención el concebir un método para la amidación del grupo
\alpha-carboxilo libre de un aminoácido o péptido,
que comprende el paso de reaccionar dicho aminoácido o péptido con
un reactivo de acoplamiento peptídico en presencia de una primera
base y además en presencia de una sal de amonio de al menos un
aditivo de acoplamiento peptídico donde el catión de amonio es
seleccionado del grupo consistente de amoniaco protonado, amina
primaria protonada y amina secundaria protonada y donde la cadena
lateral y la función \alpha-amino de dicho
aminoácido o péptido están protegidas con grupos protectores
no-base-lábiles con la excepción de
los grupos \omega-carboxilo de residuos aspartil o
glutamil individuales y donde dichos grupos
\omega-carboxilo son amidados concomitantemente
con el grupo \alpha-carboxilo libre en la
reacción. Este segundo objeto es particularmente preferido cuando se
u-
sa amoniaco como compuesto de sal, produciendo amidas de aminoácidos naturales, a saber asparaginil y/o glutaminil.
sa amoniaco como compuesto de sal, produciendo amidas de aminoácidos naturales, a saber asparaginil y/o glutaminil.
Todas las explicaciones técnicas y descripciones
de las realizaciones preferidas de la invención dadas arriba o en
las siguientes secciones que se relacionan al primer objeto de la
invención se extienden igualmente a este segundo objeto a menos que
sean evidentemente incompatibles con tal segundo objeto de la
presente invención, por ejemplo cuando se reivindica la ausencia
completa de cualquier residuo aspartil o glutamil en el péptido.
Los reactivos de acoplamiento para la síntesis
de péptidos son bien conocidos en el arte (ver por ejemplo
Bodanszky, supra.). Los reactivos de acoplamiento pueden ser
anhídridos mezclados (por ejemplo T3P: anhídrido propanofosfónico)
u otros agentes de acilación tales como ésteres activados o
halogenuros ácidos (por ejemplo ICBF, cloroformato de isobutilo),
o estos pueden ser carbodiimidas, derivados de benzotriazina
activada (DEPBT: 3-(dietoxifosfo-
riloxi)-1,2,3-benzotriazina-4(3H)-ona) o derivados de sales de uronio o fosfonio del benzotriazol. En una realización preferida de la presente invención, el reactivo de acoplamiento es un reactivo de acoplamiento distinto a una carbodiimida.
riloxi)-1,2,3-benzotriazina-4(3H)-ona) o derivados de sales de uronio o fosfonio del benzotriazol. En una realización preferida de la presente invención, el reactivo de acoplamiento es un reactivo de acoplamiento distinto a una carbodiimida.
En una realización preferida, el reactivo de
acoplamiento es seleccionado del grupo consistente de sales de
uronio y sales de fosfonio que se ha descubierto dan los mejores
rendimientos totales y la mejor protección contra la racemización en
el método de la presente invención.
Además, más preferido es que el reactivo de
acoplamiento sea seleccionado del grupo consistente de sales de
uronio y sales de fosfonio del benzotriazol capaces de activar dicho
grupo \alpha-carboxilo y que la reacción sea
conducida en presencia de una base. Ejemplos adecuados e igualmente
preferidos de tales sales de acoplamiento de uronio y fosfonio son
por ejemplo HBTU (hexafluorofosfato de
O-(1H-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametilorunio),
BOP (hexafluorofosfato de
benzotriazol-1-iloxi-tris(dimetilamino)fosfonio),
PyBOP (hexafluorofosfato de
benzotriazol-1-iloxi-tripirrolidinofosfonio),
PyAOP, HCTU (hexafluorofosfato de
O-(1H-6-clorobenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tretametiluronio,
TCTU (tetrafluoroborato de
O-(1H-6-clorobenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio),
HATU (hexafluorofosfato de
O-(7-azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio),
TATU (tetrafluoroborato de
O-(7-azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio),
TOTU (tetrafluoroborato de
O-[ciano(etoxicarbonil)metilenoamino]-N,N',N',N'-tetrametiluronio),
HAPyU (hexafluorofosfato de
O-(benzotriazol-1-il)
oxidipirrolidinouronio).
Preferiblemente, la base de la primera base es
una base débil cuyo ácido conjugado tiene un valor pKa de desde pKa
7.5 a 15, más preferiblemente de desde pKa 7.5 a 10, con la
exclusión de una función \alpha-amino de un
péptido o aminoácido o derivado de aminoácido, y cuya base es
preferiblemente una amina terciaria con impedimento estérico.
Ejemplos de tales y adicionalmente preferidos son la base de Hünig
(N,N-diisopropiletilamina),
N,N-dialquilanilina,
2,4,6-trialquilpiridina o
N-alquilmorfolina con el alquilo siendo alquilo
C1-C4 recto o ramificado, más preferiblemente es
N-metilmorfolina o colidina
(2,4,6-trimetilpiridina), lo más preferido es la
colidina. Todas las realizaciones preferidas descritas arriba y
abajo son particularmente preferidas siendo trabajadas en
combinación con un primer reactivo de base débil como se describe en
esta sección.
En otra realización preferida, el método de
amidación es conducido con una carbodiimida como reactivo de
acoplamiento y particularmente es conducido en presencia de una
amina terciaria. Más preferiblemente, el reactivo de acoplamiento
de carbodiimida es seleccionado del grupo consistente de
diisopropilcarbodiimida, dicicloexil-carbodiimida y
1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida,
lo más preferido es
1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida.
Las carbodiimidas son, sin embargo, menos adecuadas por razones
técnicas para el escalamiento industrial de los procesos
sintéticos. Preferiblemente, la reacción usando una carbodiimida
como reactivo de acoplamiento es conducida en presencia de un
segundo aditivo de acoplamiento distinto a dicha sal de amonio cuyo
segundo aditivo es un protonado, es decir un
N-hidroxibenzotriazol no iónico o derivado de
N-hidroxibenzotriazol conforme con las definiciones
dadas a continuación.
El uso de aditivos de acoplamiento, en
particular de aditivos de acoplamiento del tipo benzotriazol, es
también conocido. De aquí que es además preferido que el aditivo
reactivo de acoplamiento sea un compuesto hidroxi nucleofílico capaz
de formar ésteres activados, más preferiblemente que tenga una
función N-hidroxi nucleofílica acídica, donde N es
imida o triazeno substituido con N-acilo o
N-arilo, lo más preferido es que el aditivo de
acoplamiento sea un derivado de
N-hidroxi-benzotriazol (derivado de
1-hidroxi-benzotriazol) o sea un
derivado de N-hidroxibenzotriazina. Tales compuestos
N-hidroxilo como aditivos de acoplamiento han sido
descritos en WO 94/07910 y EP-410 182. Ejemplos son
por ejemplo N-hidroxisuccinimida,
N-hidroxi-3,4-dihidro-4-oxo-1,2,3-benzotriazina,
1-hidroxi-7-azabenzotriazol
y N-hidroxibenzotriazol. Los derivados de
N-Hidroxibenzotriazina son particularmente
preferidos, en la realización más preferida el aditivo reactivo de
acoplamiento es
hidroxi-3,4-dihidro-4-oxo-1,2,3-benzotriazina.
Los compuestos de sales de amonio de los
aditivos de acoplamiento son conocidos y han sido descritos, por
ejemplo en US 4806641.
En una realización adicional particularmente
preferida, el reactivo de acoplamiento de sal de uronio o fosfonio
es un reactivo de sal de uronio y preferiblemente es HCTU, TCTU o
HBTU y todavía más preferiblemente es usado en la reacción en
combinación con una sal de amonio de
N-hidroxi-3,4-dihidro-4-oxo-1,2,3-benzotriazina.
En el contexto de la presente invención, debe
notarse que HCTU y TCTU son definidos como para ser comprendidos por
el término "reactivo de sal de uronio" a pesar de que se ha
demostrado mediante análisis de la estructura cristalina que estos
compuestos y sus análogos de la formula I comprenden una fracción
isonitroso en lugar de una fracción uronio (O. Marder, Y. Shvo, y F.
Albericio HCTU amd TCTU: New Coupling Reagents: Development and
Industrial Applications, Poster, Presentation Gordon Conference
Febrero 2002), un sustituyente N-amidino en el
núcleo heterocíclico dando lugar en cambio a una estructura de
guanidio. De aquí que tal clase de compuestos de acuerdo a la
fórmula I es nombrado subclase tipo guanidio de reactivos de sal de
uronio de acuerdo a la presente invención:
donde R1, R2, R3, R4 son cada uno
alquilo, preferiblemente son independientemente etilo o metilo; A es
N o C; R5 es H o, preferiblemente, es un sustituyente para el
electrón retirado, más preferiblemente es cloro; y X es un anión
complejo, preferiblemente es hexafluorofosfato o
tetrafluoroborato.
En cuanto al catión de amonio a ser usado en las
sales de la presente invención, el catión amonio es
H_{2}N^{+}R1R2 con R1 y R2 siendo independientemente H o
hidrocarbilo alifático o alicíclico C1-C10,
preferiblemente C1-C5, que puede opcionalmente
además ser sustituido con arilo, alcoxilo, aralcoxilo, alquilarilo,
ariloxilo, hidroxilo o halógeno, preferiblemente excluyendo
fracciones N-hetemaromáticas. Preferiblemente, R1 y
R2 no son adicionalmente sustituidos y son alquilos como se definió
anteriormente. Más preferiblemente, R1 es H y R2 es metilo, etilo,
propilo o isopropilo o R1 y R2 son ambas H, es decir el catión es
NH_{4}^{+} el cual es el más preferido.
Preferiblemente, en un segundo paso luego del
primer paso de la reacción, el aminoácido o péptido amidado es
aislado y en un tercer paso es desprotegido para producir las
cadenas laterales libres y la función
\alpha-amino. Preferiblemente, el aminoácido o
péptido amidado es parcial o completamente desprotegido por
acidólisis. En una realización posible aunque menos preferida de la
presente invención, un aminoácido es amidado de esta manera y
carboxamida de L-aminoácido puro es obtenido,
reteniendo adecuadamente el enmascaramiento de la cadena lateral o
los grupos protectores, para el uso de tal amida de aminoácido en
exceso en un esquema de síntesis de péptidos por condensación de
segmentos normal con un segundo fragmento peptídico. De esta manera,
el péptido más costoso que surge por ejemplo de la fase sólida de la
síntesis es conservado de pérdidas innecesarias debido a la
racemización causada por la amidación mientras la amida de
aminoácido disponible de forma más barata puede ser usada en gran
exceso para un acoplamiento eficiente. Dicha realización es
particularmente adecuada para el uso de amoniaco o aminas de
alquilos inferiores como es descrito arriba en la reacción de
amidación de acuerdo al método de la presente invención.
En una realización preferida adicional, el
péptido protegido de la presente invención es acoplado a un soporte
de resina convencional por vía de una cadena lateral anclándose a la
fracción del enlace funcional de la resina. De aquí que el
C-terminal es dejado libre para el propósito de la
amidación. Dicho soporte puede ser cualquier resina comúnmente usada
en el arte tales como las resinas CTC, Wang o Merrifield. De esta
manera, el método de la presente invención permite una recuperación
y desprotección eficiente del producto de la amidación.
Es además preferido que en un segundo paso luego
del primer paso de la reacción, el aminoácido o preferiblemente el
péptido protegido y amidado, es aislado y en un posterior tercer
paso es desprotegido para producir las cadenas laterales libres y la
función \alpha-amino, preferiblemente es parcial o
completamente desprotegido por acidólisis.
En una realización adicional de la presente
invención, es concebido un método de amidación por ejemplo de un
péptido biotecnológicamente producido, desprotegido que tiene un
grupo \alpha-carboxilo, que comprende los pasos
de
- a)
- recuperar y aislar dicho péptido de una proteína de fusión concatemérica de dicho péptido, proteína de fusión que puede además comprender secuencias de enlace intercaladas,
- b)
- derivar al menos la función \alpha-amino del péptido desprotegido con grupos protectores no-base-lábiles, preferiblemente también protegiendo los grupos nucleofílicos de las cadenas laterales de aminoácidos individuales por grupos protectores no-base-lábiles,
- c)
- preferiblemente recuperar el péptido protegido por precipitación con agua,
- d)
- amidar el grupo carboxilo C-terminal por el método descrito en las secciones precedentes,
- e)
- preferiblemente aislar el péptido amidado,
- f)
- y desproteger las cadenas laterales y la función \alpha-amino.
Todas las realizaciones preferidas anteriores
dirigidas a los péptidos de la presente invención igualmente se
aplican específica y preferiblemente a péptidos antimicrobianos de
amidación (C-terminal), preferiblemente a los
péptidos antimicrobianos, lo más preferido a ILRWPWWPWRRK y/o
derivados de indolicidina.
La protección del péptido fue conducida
esencialmente como es descrita en US 2003/0219854 A1, con excepción
del hecho de que el producto fue recuperado por precipitación en
lugar de liofilización. El ILRWPWWPWRRK-OH
di-Boc-protegido
(diBoc-MBI 1187) (ESI-MS: m/z 1980)
fue usado en la posterior amidación sin purificación adicional. La
estrategia Boc fue conducida usando dicarbonato de
di-tert-butilo (Boc_{2}O) en
acetonitrilo/1 N NaOH/H_{2}O. La mezcla de reacción fue agitada a
temperatura ambiente, el pH fue entonces ajustado a pH 4.6 y los
solventes orgánicos fueron eliminados al vacío. El pH fue entonces
otra vez ajustado a 2. Fue añadida agua y la suspensión enfriada
a 4ºC antes del aislamiento del precipitado así formado. El sólido
fue lavado en agua y entonces secado al vacío.
HCTU (209 mg, 0.5 mmol) es añadido a la solución
de diBoc-MBI 11B7 (900 mg, 0.455 mmol),
N-metilmorfolina (150 \mul, 1.365 mmol) y
NH_{3}/HOOBt (250 mg, 1.365 mmol) en DMF (36 ml) y agitado a 25ºC
bajo atmósfera de nitrógeno. Si es requerido, el pH es ajustado con
N-metilmorfolina a pH 8.5 (\pm0.5). La mezcla de
reacción es agitada a 25ºC por 2 h y controlada para mantener un pH
de 8.5 (\pm0.2).
DMF es entonces evaporado bajo presión reducida
(temperatura del baño de agua <50ºC). Agua es añadida (90 ml) y
la suspensión mantenida a 4ºC por al menos 2 h antes del
aislamiento. El sólido es filtrado y la torta lavada con agua (dos
veces 25 ml). El péptido crudo es secado al vacío por 15 h
(temperatura <50ºC). Un polvo blanco es obtenido (910 mg) que es
sometido a posterior análisis.
Método analítico: La derivación de
aminoácidos simples luego de la hidrólisis completa del péptido
\vskip1.000000\baselineskip
Usando un tratamiento con HCL 6N el péptido es
hidrolizado en los aminoácidos simples. Durante este tratamiento la
lisinamida C-terminal es convertida en el
correspondiente ácido carboxílico (Lys-OH) como es
descrito por Marfey y otros (Marfey, P., Carlsberg Res. Commun., 49,
(1984), 591). Excepto posiblemente para Cys, tal hidrólisis completa
no promueve la racemización de aminoácidos. Resumiendo, el método
concibe la derivación de isómeros ópticos de aminoácidos en el
hidrolizado con FDDA
(1-fluoruro-2,4-dinitrofenil-5-L-alanina
amida). El procedimiento de derivación simple es completado en 90
minutos.
En el presente contexto, los derivados de lisina
pueden ser fácilmente separados y cuantificados por HPLC de fase
inversa. Los derivados tienen un coeficiente de absorción \sim3 x
10^{4} y pueden ser detectados por UV a 340 nm con sensibilidad
picomolar. Primero el L-Lys-NH_{2}
y el D-Lys-NH_{2} fueron
hidrolizados y derivados. La tasa de conversión y de aquí el
rendimiento total (conv. %) fue determinada por separación HPLC de
los diastereómeros amidados del educto. El producto que retiene la
configuración L- en la lisinamida terminal fue identificado por el
método de Marfey y otros, y el exceso relativo del producto
L-Lys no epimerizado vs. el producto
D-Lys (%P) fue determinado por HPLC. Un método HPLC
fue desarrollado para el análisis de diastereoisómeros esencialmente
como es descrito en Marfey y otros y una buena separación fue
obtenida.
Para la amidación del mismo péptido, diferentes
combinaciones de aditivos y reactivos de acoplamiento han sido
probados (Tabla I). Con propósitos comparativos, dónde fue indicado,
excepcionalmente fue usado amoniaco acuoso junto con el aditivo de
acoplamiento separado en lugar de la sal de amonio del aditivo de
acoplamiento concebido de acuerdo a la presente invención (Tabla I).
"SM" indica la cantidad de Boc-ILRWPWWPWRRK
(Boc)-OH reaccionado.
El uso de una sal de amonio de un reactivo de
coactivación refuerza la retención de la configuración
C-terminal del aminoácido.
La desprotección de 100 mg de
diBoc-péptidos amida tiene lugar en 0.8 ml de DMF al
que fueron añadidos 0.2 ml de ácido trifluoroacético. La mezcla es
agitada por 30 min. a temperatura ambiente. El
péptido-amida desprotegido es entonces
adicionalmente purificado por HPLC de fase inversa y es finalmente
liofilizado (ESI-MS: m/z 1779).
Claims (19)
1. Método para la amidación del grupo
\alpha-carboxilo libre de un aminoácido o péptido,
que comprende el primer paso de reaccionar dicho aminoácido o
péptido, con un reactivo de acoplamiento peptídico en un solvente
orgánico aprótico en presencia de una primera base, con la exclusión
de una función \alpha-amino de un péptido o
aminoácido, y en presencia de una sal de amonio de al menos un
aditivo de acoplamiento peptídico, donde el catión de amonio es
seleccionado del grupo consistente de amoniaco protonado, amina
primaria protonada y amina secundaria protonada, donde el pH es
controlado durante la reacción para estar en el rango de 8 a 9, y
donde la cadena lateral y la función \alpha-amino
de dicho aminoácido o péptido son protegidas con grupos protectores
no-base-lábiles.
2. Método para la amidación del grupo
\alpha-carboxilo libre de un aminoácido o péptido,
que comprende el paso de reaccionar dicho aminoácido o péptido con
un reactivo de acoplamiento peptídico en un solvente orgánico
aprótico en presencia de una primera base, con la exclusión de una
función \alpha-amino de un péptido o aminoácido, y
en presencia de una sal de amonio de al menos un aditivo de
acoplamiento peptídico, donde el catión de amonio es seleccionado
del grupo consistente de amoniaco protonado, amina primaria
protonada y amina secundaria protonada, donde el pH es controlado
durante la reacción para estar en el rango de 8 a 9, y donde la
cadena lateral y la función \alpha-amino de dicho
aminoácido o péptido son protegidas con grupos protectores
no-base-lábiles con la excepción de
los grupos \omega-carboxilo de residuos
individuales aspartil o glutamil, y donde dichos grupos
\omega-carboxilo son amidados concomitantemente
con el grupo \alpha-carboxilo libre en la
reacción.
3. Método de acuerdo a las reivindicaciones 1 ó
2, caracterizado porque la primera base es una base débil
cuyo ácido conjugado tiene un valor pKa de 7.5 a 15, preferiblemente
de 7.5 a 10.
4. Método de acuerdo a la reivindicación 3,
caracterizado porque la base débil es
N,N-diisopropiletilamina,
2,4,6-trialquilpiridina o
N-alquilmorfolina, preferiblemente con el alquilo
siendo alquilo C1-C4 recto o ramificado.
5. Método de acuerdo a una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el
reactivo de acoplamiento es seleccionado del grupo consistente de
sales de uronio y sales de fosfonio del benzotriazol capaces de
activar dicho grupo \alpha-carboxilo.
6. Método de acuerdo a una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el
solvente orgánico es un solvente orgánico aprótico polar.
7. Método de acuerdo a la reivindicación 6,
caracterizado porque el solvente es seleccionado del grupo
consistente de acetonitrilo, sulfóxido de dimetilo,
dimetilacetamida, dicloxometano y
N,N-dimetilformamida, preferiblemente es
N,N-dimetilformamida.
8. Método de acuerdo a una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el aditivo
reactivo de acoplamiento es un compuesto N-hidroxi
nucleofílico capaz de formar ésteres activados.
9. Método de acuerdo a la reivindicación 8,
caracterizado porque el aditivo reactivo de acoplamiento es
seleccionado del grupo consistente de
N-hidroxisuccinimida,
N-hidroxi-3,4-dihidro-4-oxo-1,2,3-benzotriazina,
1-hidroxi-7-azabenzotriazol
y N-hidroxi-benzotriazol.
10. Método de acuerdo a la reivindicación 9,
caracterizado porque el aditivo reactivo de acoplamiento es
hidroxi-3,4-dihidro-4-oxo-1,2,3-benzotriazina.
11. Método de acuerdo a una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el pH es
controlado durante la reacción para estar en el rango de 8 a 9,
preferiblemente es controlado a alrededor de 8.5.
12. Método de acuerdo a las reivindicaciones 1 ó
2, caracterizado porque el método es conducido con una
carbodiimida como el reactivo de acoplamiento y, preferiblemente, en
presencia de un N-hidroxi benzotriazol protonado
como segundo aditivo de acoplamiento.
13. Método de acuerdo a la reivindicación 5,
caracterizado porque el reactivo de acoplamiento de sales de
uronio o fosfonio es un reactivo de sal de uronio y preferiblemente
es HCTU, TCTU o HBTU y más preferiblemente es usado en la reacción
en combinación con una sal de amonio de
N-hidroxi-3,4-dihidro-4-oxo-1,2,3-benzotriazina.
14. Método de acuerdo a una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el catión
de amonio es H_{2}N^{+}R1R2 con R1 y R2 siendo
independientemente H o C1-C10, preferiblemente
C1-C5, hidrocarbilo alifático o alicíclico.
15. Método de acuerdo a la reivindicación 14,
caracterizado porque R1 es H y R2 es metilo, etilo, propilo o
isopropilo; o porque R1 y R2 son H.
16. Método acorde a una de las reivindicaciones
precedentes, caracterizado porque en un segundo paso luego
del primer paso de la reacción, el aminoácido o péptido amidado,
protegido es aislado y en un tercer paso es desprotegido para
producir las cadenas laterales libres y la función
\alpha-amino, preferiblemente es parcial o
completamente desprotegido por acidólisis.
17. Método para la amidación del grupo
\alpha-carboxilo libre de un péptido ILRWPWWPWRRK,
que comprende el primer paso de reaccionar dicho ILRWPWWPWRRK con un
reactivo de acoplamiento peptídico en un solvente orgánico en
presencia de una primera base, con la exclusión de una función
\alpha-amino de un péptido o aminoácido, y además
en presencia de una sal de amonio de al menos un aditivo de
acoplamiento peptídico, donde el catión de amonio es seleccionado
del grupo consistente de amoniaco protonado, amina primaria
protonada y amina secundaria protonada, donde el pH es controlado
durante la reacción para estar en el rango de 8 a 9, y donde la
cadena lateral y la función \alpha-amino de dicho
ILRWPWWPWRRK son protegidas con grupos protectores
no-base-lábiles.
18. Método para la amidación del grupo
\alpha-carboxilo libre de un péptido
antimicrobiano; preferiblemente un péptido antimicrobiano catiónico,
que comprende el primer paso de reaccionar dicho péptido con
reactivo de acoplamiento peptídico en un solvente orgánico aprótico
en presencia de una primera base, con la exclusión de una función
\alpha-amino de un péptido o aminoácido, y además
en presencia de una sal de amonio de al menos un aditivo de
acoplamiento peptídico, donde el catión de amonio es seleccionado
del grupo consistente de amoniaco protonado, amina primaria
protonada y amina secundaria protonada, donde el pH es controlado
durante la reacción para estar en el rango de 8 a 9, y donde la
cadena lateral y la función \alpha-amino de dicho
péptido son protegidas con grupos protectores
no-base-lábiles.
19. Método de acuerdo a una de las
reivindicaciones 17 ó 18, caracterizado porque en un segundo
paso después del primer paso de la reacción, el péptido
antimicrobiano o ILRWPWWPWRRK amidado, protegido, preferiblemente el
péptido antimicrobiano catiónico es aislado y en un tercer paso es
desprotegido para producir las cadenas laterales libres y la función
\alpha-amino, preferiblemente es parcial o
completamente desprotegido por acidólisis.
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