ES2338687T3 - Procedimientos para purificar proteinas altamente anionicas. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para purificar una proteína diana altamente aniónica en una muestra a partir de una serie de complejos ADN/histona, que comprende las etapas de: (a) purificar la proteína diana mediante cromatografía de intercambio de iones; (b) cargar la muestra que contiene la proteína purificada mediante cromatografía de intercambio de iones en una columna de cromatografía de quelato metálico, donde la proteína es capturada en la columna; y (c) lavar la columna, donde el paso de carga (b) utiliza una solución que comprende NaCl 2M para retirar el ADN de la muestra.
Description
Procedimientos para purificar proteínas
altamente aniónicas.
La purificación de proteínas se ve a menudo
obstaculizada por una escasa retirada del ADN debido a las
interacciones entre las proteínas y el ADN. Las interacciones entre
las proteínas y el ADN son más problemáticas en la purificación de
proteínas diana altamente aniónicas, por ejemplo proteínas
sulfatadas.
La presente invención proporciona procedimientos
para aislar y purificar proteínas diana altamente aniónicas y
proteínas diana que comprenden campos de inmunoglobulinas, por
ejemplo, proteínas sulfatadas. Las proteínas aniónicas son
proteínas que tienen una carga negativa. Las proteínas sulfatadas
son proteínas en las cuales la carga negativa neta se debe a al
menos cerca de un (1) residuo sulfatado. La sulfatación de una
proteína sulfatada se refiere a la sustitución de al menos un grupo
de hidroxilo (-OH) con -SO_{4}H en o entre el aminoácido o
aminoácidos contenidos dentro de la proteína diana. En una
realización preferida, la proteína sulfatada tiene al menos cerca
de un (1) grupo sulfato. Los procedimientos de esta invención
abarcan igualmente las proteínas sulfatadas que contienen al menos
cerca de dos (2), tres (3), cuatro (4), cinco (5), seis (6) o más
grupos sulfato, por ejemplo, seis grupos sulfato en las tirosinas de
N-terminales tal como se indica en
PSGL-1 (Ligando-1 de las
Glucoproteínas de la Selectina-P).
En un aspecto, la invención proporciona un
procedimiento para purificar proteínas diana altamente aniónicas
que comprende los pasos de la cromatografía de intercambio de iones
en condiciones apropiadas para la purificación de proteínas diana.
Por ejemplo, este procedimiento permite (1) poner en contacto la
muestra con un substrato que pueda fijar reversiblemente moléculas
cargadas, con lo que las proteínas diana se fijan al substrato, (2)
lavar el substrato con una primera solución de lavado en condiciones
apropiadas, con lo que una serie de impurezas proteínicas y no
proteínicas en la muestra bien no se fijan o bien se lavan del
substrato mientras las proteínas diana altamente aniónicas
continúan fijadas, (3) eluir la muestra con una primera solución de
elución donde la primera solución de elución comprende una solución
salina a una concentración altamente molar, y (4) recoger la
muestra eluída que contiene proteínas diana aniónicas
purificadas.
En una realización, el pH de la primera solución
de lavado es aproximadamente 4,0 a 6,0. En otra realización, el pH
de la primera solución de lavado es aproximadamente 6,5.
En una realización preferida, la proteína diana
altamente aniónica es una proteína sulfatada y las impurezas
incluyen una forma sulfatada de la proteína diana.
En otro aspecto, se purifica adicionalmente la
muestra eluída, procedente de la purificación mediante
cromatografía de intercambio de iones, que contiene las proteínas
diana purificadas. Esta purificación adicional comprende el paso de
la cromatografía de quelato metálico en condiciones apropiadas para
la purificación de proteínas diana altamente aniónicas. Dicha
purificación adicional permite los pasos de (1) pasar la muestra
eluída que contiene las proteínas diana a través de una columna de
cromatografía de quelato metálico, con lo que la muestra eluída es
capturada en la columna, (2) lavar la columna con una segunda
solución de lavado bajo condiciones apropiadas, con lo que se
disocian los complejos de ADN/histona contenidos en la muestra, (3)
eluir la muestra con una segunda solución de elución, y (4) recoger
la muestra eluída que contiene las proteínas diana purificadas
altamente aniónicas.
En condiciones cromatográficas de quelación del
hierro, por ejemplo, la segunda solución de lavado comprende una
concentración de sal de aproximadamente 2M, y la segunda solución de
elución comprende una concentración de sal de aproximadamente 200
mM a 1M. Como variante, en condiciones de cromatografía de quelato
de hierro, la segunda solución de lavado comprende MES a
aproximadamente 40 mM, NaCl a aproximadamente 2M, e imidazol a
aproximadamente 5 mM, y la segunda solución de elución comprende una
solución de MES de aproximadamente 40 mM, NaCl a aproximadamente 1M
e imidazol a aproximadamente 35 mM.
En otro aspecto, las proteínas diana tienen al
menos cerca de una (1) sulfatación o sulfataciones. La presente
invención también abarca las proteínas diana aniónicas que tienen al
menos cerca de dos (2), tres (3), cuatro (4), cinco (5), seis (6) o
más sulfataciones, por ejemplo proteínas PSGL-1. Las
proteínas aniónicas capaces de ser purificadas según la presente
invención pueden ser proteínas naturales o bien recombinantes.
En otro aspecto, la invención proporciona un
procedimiento para la purificación de proteínas altamente aniónicas
que comprenden un campo de immunoglobulinas (por ejemplo un campo de
immunoglobulinas Fc), tal como una proteína de fusión
PSGL-1. Este procedimiento comprende los pasos de
(1) poner en contacto la muestra con un substrato que puede fijar
la parte Fc de la proteína diana que comprende un campo de
inmunoglobulinas, con lo que las moléculas diana se fijan al
substrato, (2) lavar el substrato con una primera solución de lavado
en condiciones apropiadas para lavar los contaminantes contenidos
en la muestra, (3) eluir la muestra con una primera solución de
elución, donde el pH de la primera solución de elución es bajo, por
ejemplo cerca de 4,0, y (4) recoger la muestra eluída que contiene
las proteínas diana purificadas altamente aniónicas.
En otra realización, se purifica adicionalmente
la muestra eluída procedente del substrato de fijación del Fc, que
contiene las proteínas diana purificadas altamente aniónicas que
comprenden un campo de immunoglobulinas. Por ejemplo, la
purificación adicional comprende los pasos de (1) poner en contacto
la muestra eluída que contiene las proteínas diana aniónicas
purificadas que comprenden un campo de immunoglobulinas con un
substrato que puede fijar reversiblemente moléculas cargadas con lo
que una serie de impurezas proteínicas y no proteínicas en la
muestra o bien no se fijan o bien se lavan del substrato mientras
que las proteínas diana continúan fijadas al substrato, (2) lavar
el substrato con una segunda solución de lavado donde el pH de la
segunda solución de lavado es bajo, por ejemplo de aproximadamente
4,0, (3) eluir la muestra con una segunda solución de elución, y
(4) recoger la muestra eluída que contiene las proteínas diana
purificadas aniónicas que comprenden un campo de
immunoglobulinas.
En un aspecto, las proteínas diana que
comprenden un campo de immunoglobulinas tienen al menos una (1)
sulfatación o sulfataciones. La presente invención también abarca a
las immunoglobulinas que comprenden proteínas con al menos dos (2),
tres (3), cuatro (4), cinco (5), seis (6) o más sulfataciones, por
ejemplo proteínas PSGL-Ig.
En una realización preferida, los procedimientos
de purificación de la invención proporcionan proteínas diana
purificadas altamente aniónicas y proteínas purificadas altamente
aniónicas que comprenden un campo de immunoglobulinas (por ejemplo
PSGL-Ig) con una pureza mínima del 99,9%
aproximadamente de proteínas contaminadas.
En otra realización, los procedimientos de
purificación de la invención retiran al menos un 95% o 2,5
log_{10} aproximadamente de valor de retirada (LRV) del ADN
contaminante de las proteínas diana altamente aniónicas y de las
proteínas altamente aniónicas que comprenden un campo de
immunoglobulinas.
Otras características y ventajas de la invención
serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y
reivindicaciones.
\vskip1.000000\baselineskip
Las Figuras 1-3 ilustran los
procedimientos de purificación descritos en la presente, por ejemplo
los procesos I-III, tal como se describen en los
Ejemplos.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se basa, al menos en
parte, en el descubrimiento de nuevos procedimientos para purificar
proteínas diana altamente aniónicas y proteínas altamente aniónicas
que comprenden un campo de immunoglobulinas, por ejemplo, proteínas
sulfatadas (tal como la PSGL-1). Las proteínas
aniónicas son proteínas que tienen una carga negativa. Las
proteínas sulfatadas son proteínas aniónicas en las que la carga
negativa se debe a al menos una, o más preferentemente, cinco (5) o
más sulfataciones, por ejemplo al menos aproximadamente seis (6)
sulfataciones. Las sulfataciones en una proteína diana se refieren a
la sustitución de al menos un grupo de hidroxilo (-OH) con
SO_{4}H en o entre el aminoácido o aminoácidos contenidos dentro
de la proteína diana. Las sulfataciones pueden ocurrir, por
ejemplo, en las tirosinas N-terminales incorporadas
en la PSGL-1.
En una realización preferida, la proteína
sulfatada es PSGL-1, por ejemplo,
PSGL-1 que comprende el aminoácido expuesto en la
Patente de los EE.UU. número 5.827.817, cuyos contenidos se
incorporan a la presente mediante referencia, o una parte activa
del mismo. La secuencia completa de aminoácidos de la proteína
PSGL-1 (es decir el péptido maduro más la secuencia
inicial), se caracteriza por la secuencia de aminoácidos expuesta
en la Patente de los EE.UU. número 5.827.817 desde el aminoácido 1
al aminoácido 402, indicada aquí como SEQ ID NO:1. El análisis de
la hidrofobicidad y la comparación con modelos conocidos de escisión
predicen una secuencia de señal de 10 a 22 aminoácidos, es decir
los aminoácidos 1 a 20 o aminoácidos 1 a 22 del
PSGL-1. La PSGL-1 contiene un lugar
de escisión
(-Arg-Asp-Arg-Arg-)
de la PACE (Enzima de Conversión de Aminoácidos Básicos Apareados)
en los residuos de aminoácidos 38-41. La proteína
madura de la PSGL-1 se caracteriza por la secuencia
de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:1 desde el aminoácido 42 hasta
el aminoácido 402. Una forma soluble de la proteína ligando de la
selectina-P se caracteriza por los aminoácidos 21 a
310 de la secuencia de aminoácidos expuesta en la Patente de los
EE.UU. número 5.827.817. Otra forma soluble de la proteína madura
PSGL-1 se caracteriza por la secuencia de
aminoácidos expuesta en la Patente de los EE.UU. número 5.827.817
del aminoácido 42 al aminoácido 310. La forma soluble de la proteína
ligando de la selectina-P se caracteriza también
por ser soluble en una solución acuosa a temperatura ambiente.
Las proteínas de fusión de la
PSGL-1 (por ejemplo PSGL-Ig) pueden
obtenerse de acuerdo con las enseñanzas de la Patente de los EE.UU.
número 5.827.817.
\newpage
La PSGL-1 es una glucoproteína
que puede contener uno o más de los siguientes carbohidratos
terminales:
en donde R representa el resto de
la cadena de carbohidratos, que va acoplada de manera covalente
directamente a la proteína ligando de la
selectina-P o a una mitad lípidica que va fijada de
manera covalente a la proteína ligando de la
selectina-P. La PSGL-1 podría además
ser sulfatada o modificada de otro modo después de la traslación.
Como se expresa en las células COS y CHO, la proteína ligando de la
selectina-P de longitud total es una proteína
homodimérica que tiene un peso molecular aparente de 220 kD tal como
se observa por medio de la electroforesis no reductora del gel de
SDS-poliacrilamida.
La estructura de la PSGL-1 de
longitud total incluye un campo extracelular (del aminoácido 21 al
310 aproximadamente), un campo de transmembrana (del aminoácido 311
al 332 aproximadamente), y un campo citoplásmico intracelular (del
aminoácido 333 al 402 aproximadamente). El campo extracelular
contiene tres lugares de tripéptidos de consenso
(Ans-X-Ser/Thr) de glucosilación
fijada a N potencial que comienza en los residuos de Asn 65, 111 y
292. El campo extracelular contiene también tres posibles lugares de
sulfatación de la tirosina en los residuos 46, 48 y 51. La región
comprendida por los residuos 55-267 contiene un alto
porcentaje de prolina, serina y treonina, incluido un subcampo de
quince repeticiones decaméricas de la secuencia de consenso de diez
aminoácidos
Ala-Thr/Met-Glu-Ala-Gln-Ala-Gln-Thr-Thr-X-Pro/Leu-Ala/Thr,
en donde X puede ser Pro, Ala, Gln, Glu o Arg. Las regiones de este
tipo son características de proteínas altamente glucosiladas O.
Pueden realizarse supresiones sustanciales de la
secuencia PSGL-1 conservando a su vez la actividad
de la proteína ligando de la selectina-P. Por
ejemplo, la PSGL-1 que comprende la secuencia del
aminoácido 42 al aminoácido 189, la secuencia del aminoácido 42 al
aminoácido 118, o la secuencia del aminoácido 42 al aminoácido 89
de la SEQ ID NO:1 conservan cada una de ellas la actividad de
fijación de proteína de la selectina-P y la
capacidad de fijar la selectina-E. Las proteínas
PSGL-1 en las que uno o más lugares de glucosilación
vinculados a N (en los aminoácidos 65, 111 y 292) se han cambiado
por otros aminoácidos o han sido eliminados, conservan también la
actividad de fijación de la proteína de la
selectina-P y la capacidad para fijar la
selectina-E. Las proteínas ligando de la
selectina-P comprendidas del aminoácido 42 al
aminoácido 60 (que incluye una región altamente aniónica de la
proteína del aminoácido 45 al aminoácido 58) también conservan la
actividad de proteína ligando de la selectina-P; no
obstante, las proteínas ligando de la selectina-P
limitadas a dicha secuencia no se fijan en la
selectina-E. Una proteína ligando de la
selectina-P conserva preferentemente al menos uno
(más preferentemente al menos dos y más preferentemente los tres) de
los residuos de tirosina encontrados en los aminoácidos 46, 48 y
51, cuya sulfatación puede contribuir a la actividad de la proteína
ligando de la selectina-P.
La presente invención se ilustra adicionalmente
por los ejemplos siguientes que no deberán interpretarse como
limitativos en modo alguno. Todas las referencias a la secuencia de
aminoácidos de la PSGL-1 se basan en la secuencia
de aminoácidos de la PSGL que aparece en la Patente de los EE.UU
número 5.827.817 y que se expone aquí como SEQ ID NO:1.
Procedimientos: Los procedimientos generales
para la purificación de proteínas se encuentran en Janson, J.C. y
L. Ryden (eds.) Protein Purification: Principles, High Resolution
Methods and Applications (Purificación de Proteínas:
Principios, Procedimientos de Alta Resolución y Aplicaciones). VCH
Publishers, Inc. Nueva York (1989), Patente de los EE.UU, número
5.429.746, titulada Antibody Purification (Purificación de
Anticuerpos) y la Patente de los EE.UU. número 5.115.101 titulada
Renoval of Protein from Antibody Preparations (Retirada de
las Proteínas de las Preparaciones de Anticuerpos).
(No incluida en la
invención)
El presente ejemplo describe la purificación de
una proteína de fusión PSGL-Ig recombinante mediante
la cromatografía de columna (Figura 1).
Una proteína ligando de la
selectina-P soluble se expresó en las células CHO y
se recolectaron los medios condicionados para la purificación de la
proteína. Se preparó una columna A Q Sepharose^{TM} Fast Flow
(Amersham Pharmacia) con una profundidad de lecho de 8 cm, según las
instrucciones del fabricante. La capacidad de la columna para la
PSGL en los medios condicionado es aproximadamente 1 mg PSGL/ml de
resina.
Se efectuó la cromatografía de intercambio de
aniones del modo siguiente. Los medios microfiltrados
acondicionados con CHO se cargaron en la columna a un pH de
aproximadamente 7, y a una conductividad por debajo de 20 mS/cm. La
columna se lavó con histidina 20 mM, NaCl 400 mM, con un pH de 6,5
para retirar la rPSGL-Ig hiposulfatada, por
ejemplo, con 4 sulfataciones o menos. Los pasos de carga y lavado se
efectuaron a 3,5 cm/minuto. La columna se eluyó a un pH de 6,5 con
NaCl 1M, histidina 20 mM, con un pH de 6,5, a <1,1 cm/minuto. El
pH de este paso podría estar entre 4 y 8, pero es preferentemente
6,5. El pico eluído contiene PSGL-Ig, ADN e
histonas, así como otros contaminantes. La columna Q fija el ADN, y
las histonas se fijan al ADN. La elución de PSGL (provocada por la
elevación de la concentración de sal) coincide con la elución del
ADN. La pureza del PSGL-Ig es >80%. En este paso
se retira únicamente un 50% del ADN.
En estas condiciones, se purifican
preferentemente las moléculas rPSGL-Ig
hipersulfatadas, por ejemplo con cinco o seis sulfataciones. La
rPSGL-Ig activa tiene idealmente cinco o seis
sulfataciones en las tirosinas N-terminales.
El eluente de la columna de intercambio de
aniones se purificó posteriormente utilizándose una columna de
cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) del modo
siguiente:
Se preparó una columna Phenyl Toyopearl 650C
(Rohm and Haas) con una profundidad de lecho de 9 cm según las
instrucciones del fabricante. La capacidad de la columna de HIC es
aproximadamente 3,5 mg PSGL/mL de resina. La columna se equilibró
en sulfato amónico 1,2M, Tris 20 mM, a un pH de 7,4 a \leq 1,3
cm/minuto. El eluente de la columna de Sefarosa Q se ajustó a
sulfato amónico 1,2M, Tris 20 mM, a un pH de 7,4, añadiendo sulfato
amónico 3M, Tris 50 mM, a un pH de 7,4 y se cargó en la HIC. Como
variante, la carga pudo realizarse en NaCl 4M en lugar de sulfato
amónico 1,2M. La columna se lavó con sulfato amónico 1,2M. Tris 20
mM, con un pH de 7,4. Tanto los pasos de carga como de lavado se
realizaron a una velocidad de aproximadamente 1,3 cm/minuto. La
columna HIC se eluyó con sulfato amónico 0,48M, Tris 20 mM, con un
pH de 7,4 a 0,65 cm/minuto. En estas condiciones, la columna de HIC
retira principalmente las histonas H2A y H2B que no fijan el ADN tan
firmemente como las histonas H3 y H4. Las histonas H2 aparecen en
la fracción de lavado, y el pico contiene histonas H3 y H4, y
algunas histonas H2. Además, una gran variedad del ADN permanece en
las histonas y se eluye en el pico. El producto tiene una pureza
del >95% de proteínas contaminadas, y se ha retirado el 85% del
ADN mediante este paso.
El eluente de la columna HIC se purificó
posteriormente utilizándose una columna de cromatografía de quelato
metálico (IMAC) del modo siguiente.
Se preparó una columna IMAC Copper (II) en
Fractogel Chelate (M) (E. Merck) según las instrucciones del
fabricante. La columna IMAC tenía una profundidad de lecho de
6,4-7,2 cm, y una capacidad de aproximadamente 6,6
mg PSGL/ml de resina.
La columna se equilibró con fosfato de potasio
(KPO4) 50 mM, NaCl 2,0M, imidazol 2 mM, con un pH de 7 para 5 cv a
\leq5 cm/minuto. El eluente de la columna de HIC se ajustó a
imidazol 2 mM, 50 mM KPO_{4}, con un pH de 7, NaCl 200 mM y se
cargó en la columna de IMAC. La columna se lavó en primer lugar con
tampón de equilibración, y después se lavó con MES 40 mM, NaCl 1M,
imidazol 5 mM, con un pH de 6,6 a \leq5 cm/minuto. Esta baja
concentración de sal no rompe el complejo histona/ADN en la columna
IMAC. La columna se eluyó con MES 40 mM, NaCl 1M, imidazol 35 mM,
con un pH de 6,6. La columna de IMAC retira principalmente las
histonas H3 y H4. Las histonas H3 y H4 y algunas H2 se encuentran
en la tira, aunque algunas histonas H3 y H2 se encuentran en el
pico de la IMAC. El producto resultante tiene una pureza de
>99,9% de proteínas contaminantes, y este paso retira el 95% del
ADN. En total, existe una eliminación de aproximadamente un 2,5 LRV
del ADN de todo este proceso.
Este proceso permitió que el ADN se transportara
a través de toda la secuencia del proceso, dado que el ADN se fijó
directamente a la columna Q. En el paso Q, el ADN también se fijó a
las histonas (por ejemplo H2A, H2B, H3 y H4) que son proteínas
fijadoras del ADN que aparecen naturalmente, las cuales están
presentes en nuestra carga a la columna Q. En consecuencia, en la
columna Q había un sándwich, en el cual el ADN se fijó a la columna
Q y las histonas se fijaron al ADN. En los pasos posteriores se
invirtió el sándwich, dado que el ADN no se fija a la columna de
HIC o de IMAC directamente. En lugar de ello, las histonas se
fijaron a la columna de HIC o de IMAC, y el ADN se fijó a las
histonas. Cuando las histonas se eluyen desde la HIC o la IMAC,
transportan con ellas la contaminación de ADN. En la purificación de
proteínas puede encontrarse a menudo una escasa retirada del ADN
debido a las interacciones ADN/proteína, especialmente en el caso de
proteínas diana altamente aniónicas, y especialmente cuando estas
proteínas aniónicas se eluyen desde una columna de intercambio de
aniones.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo describe la purificación de una
proteína de fusión PSGL-Ig recombinante mediante
cromatografía de columna, incluido el paso de disociar los
complejos de histona/ADN contaminantes, con sal o un alcohol,
aumentando así la pureza de las proteínas PSGL-Ig
(Figura 2).
Se efectuó un paso de cromatografía de
intercambio de aniones en la Sefarosa Q tal como se describe en el
Ejemplo 1.
El eluente procedente de la columna de
intercambio de aniones se purificó posteriormente utilizándose una
columna de cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) del modo
siguiente. Se preparó una columna Phenyl Toyopearl 650C (Rohm and
Haas) con una profundidad de lecho de 9 cm, según las instrucciones
del fabricante, y se equilibró en sulfato amónico 1,2M, Tris 20 mM,
con un pH de 7,4. El pH se este paso podría estar entre
6-8, pero es preferentemente un pH de 7,4.
Se ajustó el pico Q a sulfato amónico 1,2M, Tris
20 mM, con un pH de 7,4, añadiéndose sulfato amónico 3M, Tris 50
mM, con un pH de 7,4, y se cargó en la columna. Como variante, la
carga pudo realizarse en NaCl 4M en lugar de sulfato amónico 1,2M.
La columna se lavó con Sulfato Amónico 1,2M, Tris 20 mM, con un pH
de 7,4, seguido por el lavado con NaCl 4M, Tris 20 mM, con un pH de
7,4. El lavado con NaCl 4M retira el 90% (o retirada de 1
Log_{10} o 1 LRV) del ADN de la columna. Como variante, podría
efectuarse el lavado con isopropanol al 5% y Sulfato Amónico 1,2M.
Esto retira el 99,9% del ADN de la columna ("retirada de 3
log_{10}", o 3 LRV). Como variante, podría efectuarse el
lavado con etanol al 5% y Sulfato Amónico 1,2 M. Esto retira el
99,9% del ADN de la columna ("retirada de 3 log_{10}", o 3
LRV). Como variante, podría efectuarse el lavado con etanol al 5% y
NaCl 4M. Esto retira el 99,9% del ADN de la columna ("retirada de
3 log_{10}", o 3 LRV). Como variante, podría efectuarse el
lavado con isopropanol al 5% y NaCl 4M. Esto retira el 99,9% del ADN
de la columna ("retirada de 3 log_{10}", o 3 LRV). Los pasos
de carga y lavado se efectuaron a una velocidad de aproximadamente
1,3 cm/minuto. La columna se eluyó a continuación con Sulfato
Amónico 0,48M, Tris 20 mM, con un pH de 7,4, a una velocidad de
0,65 cm/minuto.
Como anteriormente, esta HIC con estas
condiciones retira principalmente las histonas H2A y H2B, que no
fijan el ADN tan firmemente como las histonas H3 y H4. Las histonas
H2 aparecen en el lavado. El pico contiene H3 y H4, con algunas
histonas H2. Sin embargo, hemos observado que mediante el lavado con
concentraciones más elevadas de sal, puede romperse la interacción
entre el ADN y las histonas. Así pues, efectuándose el lavado con,
por ejemplo, NaCl 4M, en lugar de Sulfato Amónico 1,2M, el ADN se
desprende de la histona, y pasa al líquido de lavado. En estas
condiciones, una amplia variedad del ADN aparece en el lavado, y las
histonas siguen eluyéndose en el pico. Este paso de la HIC podría
realizarse como variante después del paso de la IMAC (véase a
continuación). Esto podría tener como resultado la retirada de un
999,% más del ADN (3 LRV).
El eluente de la columna de HIC se purificó
posteriormente utilizándose una columna de cromatografía de quelato
metálico (IMAC) del modo siguiente.
Se preparó una columna IMAC Copper (II) en
Fractogel Chelate (M) (E. Merck) según las instrucciones del
fabricante. La columna IMAC tenía una profundidad de lecho de
6,4-7,2 cm, y una capacidad de aproximadamente 6,6
mg PSGL/ml de resina. El pH de esta columna puede estar entre 4,8 y
8, pero es preferentemente un pH de 6,6.
La columna se equilibró con fosfato de potasio
(KPO4) 50 mM, NaCl 2,0M, imidazol 2 mM, con un pH de 7 para 5 cv a
\leq5 cm/minuto. Como variante, la columna puede equilibrarse a
NaCl 200 mM en lugar de NaCl 2M. El eluente de la columna de la HIC
se ajustó a imidazol 2 mM, KPO4 50 mM, con un pH de 7, NaCl 200 mM y
se cargó en la columna de IMAC. Como variante, la columna puede
efectuarse a NaCl 200 mM en lugar de NaCl 2M.
La columna se lavó en primer lugar con un tampón
de equilibración, y después se lavó con MES 40 mM, NaCl 2M,
imidazol 5 mM, con un pH de 6,6 a \leq5 cm/minuto. La comuna se
eluyó con MES 40 mM, NaCl 1M, imidazol 35 mM, con un pH de 6,6. La
columna de IMAC retira principalmente las histonas H3 y H4. Estas
histonas, y algunas histonas H2, están en la tira. En el pico de la
IMAC se encuentran también algunas histonas H3 y H2.
Este paso retira un 90% más de ADN que el paso I
del proceso del Ejemplo 1 (1 LRV) utilizando la carga o el lavado
con elevado contenido de sal. La novedad de este paso es efectuar la
carga con NaCl 2M o el lavado con NaCl 2M para retirar el ADN del
complejo histonas/ADN. Las histonas se pegan a la columna de la
IMAC, y el ADN se pega a las histonas. Dado que el ADN se fija
mejor al complejo H3/H4 que al complejo H3/H2 o simplemente al
complejo H2, sería beneficioso retirar el complejo H3/H4 tan pronto
como sea posible en el proceso. Así pues, al efectuar la HIC
después de la IMAC se ha demostrado que puede obtenerse más
eliminación de ADN (99,9% más de eliminación, o 3 LRV). En
consecuencia, la colocación de la IMAC lo antes posible en el
proceso podría tener como resultado claramente una reducción
adicional del ADN. Sin embargo, la IMAC como primer paso requeriría
una ultrafiltración/diafiltración para retirar de la carga los
aminoácidos de peso molecular bajo y otros grupos que contienen
aminas.
\vskip1.000000\baselineskip
(No incluida en la
invención)
Este ejemplo describe un procedimiento
alternativo para la purificación de una proteína de fusión
PSGL-Ig recombinante mediante la cromatografía de
columna. En contraste con el esquema de purificación descrito en el
Ejemplo 1, este proceso utiliza un paso de afinidad como el primer
paso de purificación (Figura 3). El paso de purificación de
afinidad utiliza la Proteína A que fija la parte Fc de la quimera
rPSGL-Ig. La rPSGL-Ig se eluye de
la columna de Proteína A a un pH bajo, en este caso un pH de 3,7. El
paso de la Proteína A da una mejor eliminación si la columna se
lava con NaCl 1M después de la carga. Esta concentración de sal es
mayor que la que se utiliza habitualmente (normalmente cerca de NaCl
150 mM) y, en consecuencia, es novedosa. La eliminación del ADN
desde este paso va de un valor de retirada (LRV) de 4 log_{10} a
un LRV de 6, con la adición de este paso de sal. Esto representa un
aumento de 100 veces en la retirada del ADN.
El paso de la Proteína A parece no fijar las
histonas, y proporciona una buena eliminación del ADN. Así, las
histonas no están visiblemente presentes en los pasos siguientes al
paso de la Proteína A. Sin embargo, dado que la Proteína A se
lixivia de la columna de la Proteína A, se efectúan los pasos
posteriores para retirar la Proteína A. El procedimiento más
novedoso para retirar la Proteína A lixiviada es el de cargar el
eluado de Proteína A directamente sobre la columna Q, a un pH
neutro o incluso bajo, o el de lavar la columna Q a un pH bajo. Las
columnas Q no se procesan normalmente a un pH bajo, especialmente a
un pH de 4. Así pues, la captura de la rPSGL-Ig
directamente del eluado de Proteína A o el lavado de la columna Q a
un pH bajo, o una combinación de los mismos, es una novedad. Dado
que la rPSGL-Ig y la Proteína A tienen un pH bajo,
una amplia variedad de la rPSGL-Ig no se fija a la
Proteína A lixiviada. Como resultado de ello, la Proteína A no se
fija a la columna Q, sino que se encuentra en el flujo que pasa por
Q. Esto es también una novedad. De ese modo, la columna Q se
utiliza para retirar la Proteína A.
Se preparó una columna Fast Flow (Amersham
Pharmacia) de la Proteína A con una profundidad de lecho de
6-10 cm, según las instrucciones del fabricante. La
capacidad de la columna es aproximadamente 1 mg/ml a 6 mg/mL. La
columna se equilibró con Tris 20 mM, NaCl 200 mM, con un pH de 7,4,
a aproximadamente 30-300 cm/hora, preferentemente
150 cm/hora. La columna se lavó con histidina 20 mM, NaCl 200 mM,
con un pH de 7 a 8, preferentemente un pH de 7,4, y se eluyó con
citrato 200 mM, con un pH de 3 a 4, preferentemente un pH de 3,7, a
50-300 cm/hora. La pureza es >95% para las
proteínas y mediante este paso se ha retirado >99% del ADN.
El eluente de la columna de Proteína A se
purificó adicionalmente con una columna Q Sepharose^{TM} Fast
Flow (Amersham Pharmacia) con una profundidad de lecho de 8 cm. La
capacidad de la columna de Sefarosa Q para la PSGL, a un pH de 3,6
a 4,0, preferentemente un pH de 3,7, después del paso de la Proteína
A, es aproximadamente \geq6 mg PSGL/mL de resina.
El pico de Proteína A se carga directamente en
la columna de Sefarosa Q sin ajustar el pH, o bien se neutraliza el
pico antes de ser cargado en la columna de Sefarosa Q. En cualquiera
de ambos casos, la columna se lava con NaCl 200 mM y citrato 20 mM
a un pH de 3,5 a 4, preferentemente un pH de 3,7, para retirar los
restos de Proteína A. Ambos procedimientos retiran la Proteína A
lixiviada, la rPSGL-Ig hiposulfatada, la
rPSGL-Ig recortada N-terminalmente,
y la prorPSGL-Ig (una especie precursora de la
rPSGL-Ig que no tiene escisión enzimática del
término N. Después del lavado a un pH de 3,5 a 4, la columna podría
lavarse con histidina 20 mM, NaCl 400 mM, a un pH de 6,5, a fin de
retirar la rPSGL-Ig hiposulfatada. Las moléculas
rPSGL-Ig hiposulfatadas tienen 4 o menos
sulfataciones, mientras que la rPSGL-Ig activa tiene
idealmente 5 o 6 sulfataciones en las tirosinas
N-terminales. Los pasos de carga y lavado de la
columna se efectúan a una velocidad de 3,5 cm/minuto. La columna se
eluyó a un pH de 6,5 con NaCl 1M, histidina 20 mM, a un pH de 6,5.
Como variante, podría efectuarse la elución a un pH de 3,5 a 4,0,
preferentemente 3,7, en NaCl 500 mM, citrato 20 mM a <1,1
cm/minuto. Las proteínas representan el <2% del pico.
Esta lista de referencias citadas por el
solicitante es para comodidad del lector solamente. No forma parte
del documento de la patente europea. Aun cuando se tuvo gran cuidado
en cumplir las referencias, no se pueden excluir errores u
omisiones y la EPO declina toda responsabilidad a este respecto.
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\vskip0.400000\baselineskip
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PROTEÍNAS ALTAMENTE ANIÓNICAS
\vskip0.400000\baselineskip
<130> GFN-002PC
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 402
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
Claims (4)
1. Procedimiento para purificar una proteína
diana altamente aniónica en una muestra a partir de una serie de
complejos ADN/histona, que comprende las etapas de:
- (a)
- purificar la proteína diana mediante cromatografía de intercambio de iones;
- (b)
- cargar la muestra que contiene la proteína purificada mediante cromatografía de intercambio de iones en una columna de cromatografía de quelato metálico, donde la proteína es capturada en la columna; y
- (c)
- lavar la columna,
donde el paso de carga (b) utiliza una solución
que comprende NaCl 2M para retirar el ADN de la muestra.
2. Procedimiento para purificar una proteína
diana altamente aniónica en una muestra a partir de una serie de
complejos ADN/histona, que comprende las etapas de:
- (a)
- purificar la proteína diana mediante cromatografía de intercambio de iones;
- (b)
- cargar la muestra que contiene la proteína purificada mediante cromatografía de intercambio de iones en una columna de cromatografía de quelato metálico, donde la proteína es capturada en la columna; y
- (c)
- lavar la columna,
donde el paso de carga (c) utiliza una solución
que comprende NaCl 2M para retirar el ADN de la muestra.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 o 2
donde la proteína es hipersulfatada.
4. Procedimiento según la reivindicación 3 donde
la proteína es PSGL-1.
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