JP2003528884A - 高アニオン性タンパク質の精製方法 - Google Patents
高アニオン性タンパク質の精製方法Info
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Abstract
Description
、表題”高アニオン性タンパク質の精製方法”の優先権を主張する。この引用に
よりこの出願の内容全体を本明細書に援用する。
除去されにくいことにより、しばしば妨げられる。DNA/タンパク質相互作用
は、高アニオン性タンパク質、たとえばスルフェート化(sulfated)タ
ンパク質の精製に際してはより問題となる。
ゲットタンパク質、たとえばスルフェート化タンパク質の単離および精製のため
の方法を提供する。アニオン性タンパク質は正味マイナス電荷をもつタンパク質
である。スルフェート化タンパク質は、正味マイナス電荷が少なくともほぼ1つ
のスルフェート化残基によるタンパク質である。ターゲットタンパク質のスルフ
ェート化とは、ターゲットタンパク質に含有されるアミノ酸上またはアミノ酸間
の少なくとも1つのヒドロキシル基(−OH)が−SO4Hで置換されることを
表わす。好ましい態様において、スルフェート化タンパク質は少なくともほぼ1
つのスルフェート基をもつ。少なくともほぼ2、3、4、5、6またはそれより
多いスルフェート基を含むスルフェート化タンパク質、たとえばPSGL−1(
P−セレクチン糖タンパク質リガンド−1)のようにN末端チロシン上に6つの
スルフェート基を含むものも本発明方法に包含される。
オン交換クロマトグラフィー工程を含む、高アニオン性ターゲットタンパク質の
精製方法を提供する。たとえばこの方法は、(1)荷電分子を可逆的に結合しう
る支持体と試料を接触させ、これによりターゲットタンパク質を支持体に結合さ
せ、(2)試料中の複数のタンパク性および非タンパク性不純物は結合しないか
または支持体から洗い去られ、一方、高アニオン性ターゲットタンパク質は結合
したままであるのに適した条件下で、第1洗浄溶液により支持体を洗浄し、(3
)試料を第1溶離溶液で溶離し、その際、第1溶離溶液は高モル濃度の塩類溶液
を含み、そして(4)精製されたアニオン性ターゲットタンパク質を含有する溶
離試料を採集することを含む。
おいて、第1洗浄溶液のpHは約6.5である。 好ましい態様において、高アニオン性ターゲットタンパク質はスルフェート化
タンパク質であり、不純物はスルフェート化形のターゲットタンパク質を含む。
クロマトグラフィー精製からの溶離試料を、後続精製することができる。この後
続精製は、たとえば高アニオン性ターゲットタンパク質の精製に適した条件下で
の疎水性相互作用クロマトグラフィーおよび/または金属キレートクロマトグラ
フィー工程を含む。たとえばこの後続精製は、(1)ターゲットタンパク質を含
有する溶離試料を金属キレートクロマトグラフィーカラムまたは疎水性相互作用
クロマトグラフィーカラムに通し、これにより溶離試料をカラムに捕獲し、(2
)試料に含有されるDNA/ヒストン複合体が解離するのに適した条件下で、カ
ラムを第2洗浄溶液により洗浄し、(3)試料を第2溶離溶液で溶離し、そして
(4)精製された高アニオン性ターゲットタンパク質を含有する溶離試料を採集
する工程を含む。
浄溶液より低い塩類濃度を含む。たとえば疎水性相互作用クロマトグラフィー条
件下で、第2洗浄溶液の塩類濃度は約4M、第2溶離溶液の塩類濃度は約0.4
8Mである。あるいは、疎水性相互作用クロマトグラフィー条件下で、第2洗浄
溶液は(a)約4MのNaClならびに約20mMおよびpH約7.4のトリス
を含む溶液、(b)約5%のイソプロパノールおよび約1.2Mの硫酸アンモニ
ウムを含む溶液、(c)約5%のエタノールおよび約1.2Mの硫酸アンモニウ
ムの溶液、(d)約5%のエタノールおよび約4MのNaClの溶液よりなる群
から選択される。
塩類濃度を含み、第2溶離溶液は約200mM〜1Mの塩類濃度を含む。あるい
は、鉄キレート化クロマトグラフィー条件下で、第2洗浄溶液は約40mMのM
ES、約2MのNaClおよび約5mMのイミダゾールを含み、第2溶離溶液は
約40mMのMES、約1MのNaClおよび約35mMのイミダゾールの溶液
を含む。
ト化をもつ。少なくともほぼ2、3、4、5、6またはそれより多いスルフェー
ト化をもつアニオン性ターゲットタンパク質、たとえばPSGL−1タンパク質
も本発明に包含される。本発明により精製できるアニオン性タンパク質は、天然
または組換えタンパク質であってよい。
メイン)を含む高アニオン性ターゲットタンパク質、たとえばPSGL−1融合
タンパク質の精製方法を提供する。この方法は、(1)免疫グロブリンドメイン
を含むターゲットタンパク質のFc部分を結合しうる支持体と試料を接触させ、
これによりターゲット分子を支持体に結合させ、(2)試料に含有される不純物
を洗い去るのに適した条件下で、第1洗浄溶液により支持体を洗浄し、(3)試
料を第1溶離溶液で溶離し、その際、第1溶離溶液のpHは低く、たとえば約4
.0であり、そして(4)精製されたアニオン性ターゲット分子を含有する溶離
試料を採集する工程を含む。
製された高アニオン性ターゲットタンパク質を含有する溶離試料を、後続精製す
る。たとえば後続精製は、(1)免疫グロブリンドメインを含む精製されたアニ
オン性ターゲットタンパク質を含有する溶離試料を、荷電分子を可逆的に結合し
うる支持体と接触させ、これにより試料中の複数のタンパク性および非タンパク
性不純物は結合しないかまたは支持体から洗い去られ、一方、ターゲットタンパ
ク質は支持体に結合したままであり、(2)第2支持体を第2洗浄溶液で洗浄し
、その際、第2洗浄溶液のpHは低く、たとえば約4.0であり、(3)試料を
第2溶離溶液で溶離し、そして(4)免疫グロブリンドメインを含む精製された
アニオン性ターゲットタンパク質を含有する溶離試料を採集する工程を含む。
くともほぼ1つのスルフェート化をもつ。少なくともほぼ2、3、4、5、6ま
たはそれより多いスルフェート化をもつタンパク質を含む免疫グロブリンドメイ
ン、たとえばPSGL−Igも本発明に包含される。
も約99.9%純度の精製された高アニオン性ターゲットタンパク質および免疫
グロブリンドメインを含む精製された高アニオン性ターゲットタンパク質(たと
えばPSGL−Ig)を提供する。
質および免疫グロブリンドメインを含む高アニオン性ターゲットタンパク質から
少なくとも約95%または2.5 log10除去値(LRV)の汚染DNAを除
去する。
かになるであろう。 発明の詳細な記述 本発明は少なくとも一部は、高アニオン性ターゲットタンパク質および免疫グ
ロブリンドメインを含む高アニオン性ターゲットタンパク質、たとえばスルフェ
ート化タンパク質(たとえばPSGL−1)を精製するための新規方法を見いだ
したことに基づく。アニオン性タンパク質は、正味マイナス電荷をもつタンパク
質である。スルフェート化タンパク質は、正味マイナス電荷が少なくともほぼ1
つ、より好ましくは5以上のスルフェート化、たとえば少なくともほぼ6つのス
ルフェート化によるものであるアニオン性タンパク質である。ターゲットタンパ
ク質のスルフェート化とは、ターゲットタンパク質に含有されるアミノ酸上また
はアミノ酸間の少なくとも1つのヒドロキシル基(−OH)が−SO4Hで置換
されることを表わす。スルフェート化は、たとえばPSGL−1のようにN末端
チロシン上において起きる可能性がある。
USP5,827,817に示されたアミノ酸を含むPSGL−1であり、その
内容を本明細書に援用する。PSGL−1タンパク質の完全アミノ酸配列(すな
わち成熟ペプチド+リーダー配列)は、USP5,827,817に示されたア
ミノ酸配列のアミノ酸1からアミノ酸402までで表わされ、本明細書中にSE
Q ID NO:1として示される。疎水性分析および既知の開裂パターンとの
比較から、アミノ酸20〜22個のシグナル配列、すなわちPSGL−1のアミ
ノ酸1〜20またはアミノ酸1〜22が推定される。PSGL−1は、アミノ酸
残基38〜41にPACE(塩基性アミノ酸対変換酵素)開裂部位(−Arg−
Asp−Arg−Arg)を含む。成熟PSGL−1タンパク質は、SEQ I
D NO:1中のアミノ酸42からアミノ酸402までに示されるアミノ酸配列
で表わされる。可溶性形P−セレクチンリガンドタンパク質は、USP5,82
7,817に示されたアミノ酸配列のアミノ酸21からアミノ酸310までで表
わされる。他の可溶性形成熟PSGL−1タンパク質は、USP5,827,8
17に示されたアミノ酸配列のアミノ酸42からアミノ酸310までで表わされ
る。可溶性形P−セレクチンリガンドタンパク質はさらに、室温で水溶液中に可
溶性であることを特色とする。
7,817(本明細書に援用する)の教示に従って製造できる。 PSGL−1は糖タンパク質であり、下記の末端炭水化物を1以上含む可能性
がある:
ンパク質に直接に、またはP−セレクチンリガンドタンパク質に共有結合した脂
質部分に、共有結合している。PSGL−1はさらにスルフェート化または他の
形で翻訳後修飾されている可能性がある。COSまたはCHO細胞において発現
する全長P−セレクチンリガンドタンパク質は、非還元性SDS−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動により示される見掛け分子量220kDのホモダイマータン
パク質である。
膜貫通ドメイン(ほぼアミノ酸311〜332)、および細胞内細胞質ドメイン
(ほぼアミノ酸333〜402)を含む。細胞外ドメインは、Asn残基65、
111および292から始まる潜在N−結合グリコシル化の3つのコンセンサス
トリペプチド部位(Asn−X−Ser/Thr)を含む。細胞外ドメインはさ
らに、残基46、48および51に3つの潜在チロシンスルフェート化部位を含
む。残基55〜267からなる領域は、高い割合のプロリン、セリンおよびトレ
オニンを含む;これには10アミノ酸コンセンサス配列Ala−Thr/Met
−Glu−Ala−Gln−Thr−Thr−X−Pro/Leu−Ala/T
hrのデカマー反復配列15のサブドメインが含まれ、ここでXはPro、Al
a、Gln、GluまたはArgであってよい。このような領域は高O−グリコ
シル化タンパク質に特徴的である。
実質的に欠失させることができる。たとえばSEQ ID NO:1のアミノ酸
42からアミノ酸189までの配列、アミノ酸42からアミノ酸118までの配
列、またはアミノ酸42からアミノ酸89までの配列を含むPSGL−1は、そ
れぞれP−セレクチンタンパク質結合活性およびE−セレクチン結合能を保持す
る。1以上のN−結合グリコシル化部位(たとえばアミノ酸65、111および
292)が他のアミノ酸に変化した、または欠失したPSGL−1タンパク質も
、P−セレクチンタンパク質結合活性およびE−セレクチン結合能を保持する。
アミノ酸42からアミノ酸60までを含む(アミノ酸45からアミノ酸58まで
の高アニオン領域を含む)P−セレクチンリガンドタンパク質も、P−セレクチ
ンタンパク質結合活性を保持する;しかしそのような配列に限定されたP−セレ
クチンリガンドタンパク質は、E−セレクチンには結合しない。好ましくは、P
−セレクチンリガンドタンパク質はアミノ酸46、48および51にみられるチ
ロシン残基を少なくとも1つ(より好ましくは少なくとも2つ、最も好ましくは
3つすべて)保有する;そのスルフェート化がP−セレクチンリガンドタンパク
質活性に関与すると思われる。
本明細書全体、ならびに図面および付表Aにおいて引用したすべての参考文献、
特許および公開特許出願を本明細書に援用する。PSGL−1のアミノ酸配列に
ついての記述はすべて、USP5,827,817に示された、および本明細書
にSEQ ID NO:1として示された、PSGL−1のアミノ酸配列に基づ
く。
C.,and L.Ryden(編)Protein Purificatio
n:Principles,High Resolution Methods
and Applications,VHC Publishers社,ニュ
ーヨーク(1989)、USP5,429,746(表題:抗体精製)、および
USP5,115,101(表題:抗体調製物からのタンパク質の除去);これ
らの内容を本明細書に援用する。
ィーによる精製を記載する(図1)。
ンディショニングした培地をタンパク質精製のために収集した。床深さ8cmの
Q Sepharose(商標)Fast Flow(Amersham Ph
armacia)カラムを製造業者の指示に従って調製した。コンディショニン
グした培地中のPSGLに対するカラム容量は約1mg PSGL/ml樹脂で
ある。
レーションしたCHOコンディショニング培地を、ほぼpH7、伝導率20mS
/cm未満でカラムに装填した。カラムを20mMヒスチジン、400mM N
aCl、pH6.5で洗浄して低スルフェート化rPSGL−Ig(たとえば4
以下のスルフェート化)を除去した。装填および洗浄工程を3.5cm/分で実
施した。カラムをpH6.5で1M NaCl、20mMヒスチジン、pH6.
5により<1.1cm/分において溶離した。この工程のpHは4〜8であって
よいが、好ましくは6.5である。溶出ピークはPSGL−Ig、DNAおよび
ヒストンならびに他の汚染物質を含有する。QカラムはDNAを結合し、ヒスト
ンはこのDNAに結合している。PSGL溶出(塩類濃度上昇により起きる)は
DNA溶出と一致する。PSGL−Igの純度は>80%である。DNAの50
%がこの工程で実施されたにすぎない。
は6のスルフェート化)が優先的に精製される。理想的には活性rPSGL−I
gはN末端チロシン上に5または6のスルフェート化をもつ。
ラフィー(HIC)カラムによりさらに精製した。 床深さ9cmのPhenyl Toyopearl 650Cカラム(Roh
m and Haas)を製造業者の指示に従って調製した。HICカラム容量
は約3.5mg PSGL/mL樹脂である。カラムを1.2M硫酸アンモニウ
ム、20mMトリス、pH7.4中、≦1.3cm/分で平衡化した。Q Se
pharoseカラムからの溶出液を、3M硫酸アンモニウム、50mMトリス
、pH7.4の添加により、1.2M硫酸アンモニウム、20mMトリス、pH
7.4に調整し、HICに装填した。あるいは、1.2M硫酸アンモニウムでは
なく4M NaClで装填することができる。カラムを1.2M硫酸アンモニウ
ム、20mMトリス、pH7.4で洗浄した。装填および洗浄の両工程とも約1
.3cm/分の速度で実施した。HICカラムを0.48M硫酸アンモニウム、
20mMトリス、pH7.4により0.65cm/分で溶離した。これらの条件
下で、HICカラムからまずH2AおよびH2Bヒストンが除去される。これら
はH3およびH4ヒストンほど強固にDNAを結合しない。H2ヒストンは洗浄
画分中に出現し、ピークはH3およびH4ヒストン、ならびに少量のH2ヒスト
ンを含有する。さらに、DNAの大部分がヒストン上に留まり、このピーク中に
溶出する。生成物は汚染タンパク質について>95%の純度であり、85%のD
NAがこの工程で除去される。
(IMAC)カラムによりさらに精製した。 Fractogel Chelate(M)(E.Merck)上のIMAC
銅(II)カラムを製造業者の指示に従って調製した。IMACカラムは6.4
〜7.2cmの床深さ、および約6.6mg PSGL/mL樹脂の容量をもっ
ていた。
イミダゾール、pH7中、5cv、≦5cm/分で平衡化した。HICカラムか
らの溶出液を2mMイミダゾール、50mM KPO4、pH7,200mM
NaClに調整し、IMACカラムに装填した。カラムをまず平衡化緩衝液で洗
浄し、次いで40mM MES、1M NaCl、5mMイミダゾール、pH6
.6中、≦5cm/分で平衡化した。この低い塩類濃度では、IMACカラム上
のヒストン/DNA複合体は分解されない。カラムを40mM MES、1M
NaCl、35mMイミダゾール、pH6.6で溶離した。IMACカラムから
まずH3およびH4ヒストンが除去される。IMACピーク中に少量のH3およ
びH2ヒストンがみられるが、H3およびH4ヒストン、ならびに少量のH2は
ストリップ液中にある。得られた生成物は汚染タンパク質について>99.9%
の純度であり、95%のDNAがこの工程で除去される。全体として、この全工
程で約2.5LRVのDNAクリアランスである。
通して運ばれた。Q工程でDNAは、Qカラムへの本発明の装填物中に存在する
天然のDNA結合タンパク質であるヒストン(たとえばH2A、H2B、H3お
よびH4)にも結合した。したがってQカラム上にはDNAがQカラムに結合し
、このDNAにヒストンに結合したサンドイッチがあった。後続工程でサンドイ
ッチは逆転した;DNAはHICまたはIMACカラムには直接結合しないので
、その代わりヒストンがHICまたはIMACカラムに結合し、DNAはこれら
のヒストンに結合した。ヒストンがHICまたはIMACカラムから溶出すると
、それらと共に汚染物質DNAが運ばれる。DNA/タンパク質相互作用のため
、タンパク質精製に際し、特に高アニオン性ターゲットタンパク質の場合、殊に
これらのアニオン性タンパク質をアニオン交換カラムから溶離する場合、しばし
ばDNAが除去されにくい可能性がある。
ィーによる精製を記載する;これは汚染性のヒストン/DNA複合体を塩類また
はアルコール類で解離し、これによりPSGL−Igタンパク質の純度を高める
工程を含む(図2)。
記載に従って実施した。 アニオン交換カラムからの溶出液を、下記のように疎水性相互作用クロマトグ
ラフィー(HIC)カラムによりさらに精製した。床深さ9cmのPhenyl Toyopearl 650Cカラム(Rohm and Haas)を製造
業者の指示に従って調製し、1.2M硫酸アンモニウム、20mMトリス、pH
7.4で平衡化した。この工程のpHは6〜8であってよいが、好ましくはpH
7.4である。
り、1.2M硫酸アンモニウム、20mMトリス、pH7.4に調整し、カラム
に装填した。あるいは、1.2M硫酸アンモニウムではなく4M NaClで装
填することができる。カラムを1.2M硫酸アンモニウム、20mMトリス、p
H7.4、続いて4M NaCl、20mMトリス、pH7.4で洗浄した。4
M NaClによる洗浄で90%のDNAがカラムから除去される(または1
log10除去値、すなわち1 LRV)。あるいは5%イソプロパノールおよび
1.2M硫酸アンモニウムで洗浄してもよい。これにより99.9%のDNAが
カラムから除去される(”3 log10除去値”、すなわち3 LRV)。ある
いは5%エタノールおよび1.2M硫酸アンモニウムで洗浄してもよい。これに
より99.9%のDNAがカラムから除去される(”3 log10除去値”、す
なわち3 LRV)。あるいは5%エタノールおよび4M NaClで洗浄して
もよい。これにより99.9%のDNAがカラムから除去される(”3 log10 除去値”、すなわち3 LRV)。あるいは5%イソプロパノールおよび4M
NaClで洗浄してもよい。これにより99.9%のDNAがカラムから除去
される(”3 log10除去値”、すなわち3 LRV)。装填および洗浄の両
工程とも約1.3cm/分の速度で実施した。次いでカラムを0.48M硫酸ア
ンモニウム、20mMトリス、pH7.4により0.65cm/分で溶離した。
ストンが除去される。これらはH3およびH4ヒストンほど強固にDNAを結合
しない。H2ヒストンは洗液中に出現する。ピークはH3およびH4ヒストン、
ならびに少量のH2ヒストンを含有する。しかし本発明者らは、より高い塩類濃
度で洗浄するとDNA/ヒストン相互作用を破壊しうることを見いだした。たと
えば1.2M硫酸アンモニウムではなく4M NaClで洗浄すると、DNAは
ヒストンから分離し、洗液中へ流出する。これらの条件下では、DNAの大部分
が洗液中へ流出し、ヒストンはなおピーク中に溶出する。あるいはこのHIC工
程をIMAC工程(下記を参照)の後に実施してもよい。これにより99.9%
以上のDNAが除去される(3 LRV)。
(IMAC)カラムによりさらに精製した。 Fractogel Chelate(M)(E.Merck)上のIMAC
銅(II)カラムを製造業者の指示に従って調製した。IMACカラムは6.4
〜7.2cmの床深さ、および約6.6mg PSGL/mL樹脂の容量をもっ
ていた。この工程のpHは4.8〜8であってよいが、好ましくはpH6.6で
ある。
イミダゾール、pH7中、5cv、≦5cm/分で平衡化した。あるいは、2M
NaClではなく200mM NaClで5カラムを平衡化してもよい。HI
Cカラムからの溶出液を2mMイミダゾール、50mM KPO4、pH7、2
00mM NaClに調整し、IMACカラムに装填した。あるいは、2M N
aClではなく200mM NaClで装填を行ってもよい。
Cl、5mMイミダゾール、pH6.6中、≦5cm/分で平衡化した。カラム
を40mM MES、1M NaCl、35mMイミダゾール、pH6.6で溶
離した。IMACカラムからまずH3およびH4ヒストンが除去される。これら
のヒストンおよび少量のH2ヒストンはストリップ液中にある。少量のH3およ
びH4ヒストンがIMACピーク中にもみられる。
去される。この工程の新規性は、ヒストン/DNA複合体からDNAを分離する
ために2M NaClで装填するか、または2M NaClで洗浄することであ
る。ヒストンはIMACカラムに付着し、DNAはこれらのヒストンに付着する
。DNAはH3/H2または単にH2複合体よりH3/H4複合体の方により良
く結合するので、H3/H4複合体を可能な限り速やかに除去するのが有益であ
る。したがって、IMAC実施後にHICを実施すると、より大きなDNAクリ
アランス(99.9%高いクリアランス、すなわち3 LRV)を達成できるこ
とが示された。したがってIMACを可能な限り早期にプロセスに挿入すると、
さらにDNAを減少させうると考えられる。しかしIMACを第1工程にすると
、低分子量アミノ酸および他のアミン含有基を装填物から除去するために限外濾
過/透析濾過(diafiltration)が必要となる。
ィーによる精製のための別法を記載する。実施例1に記載した精製方式と異なり
、この方法は第1精製工程としてアフィニティー工程を用いる(図3)。このア
フィニティー精製工程には、rPSGL−IgキメラのFc部分を結合するプロ
テインAを用いる。rPSGL−IgはプロテインAカラムから低いpH、この
場合pH3.7で溶出する。装填後にカラムを1M NaClで洗浄すると、プ
ロテインA工程はより良いクリアランスを与える。この塩類濃度は一般に用いら
れるものより高い(通常は約150mM NaCl)ので、新規である。この塩
工程の付加により、この工程からのDNAクリアランスは4 log10除去値(
LRV)ないし6LRVになる。これは100倍のDNA除去増加である。
スを与える。したがってプロテインA工程後の各工程には認めうるほどのヒスト
ンは存在しない。しかしプロテインAがプロテインAカラムから浸出するので、
プロテインAを除去するための後続工程を実施する。浸出したプロテインAを除
去するための最良の方法は、プロテインA溶出液を中性もしくは低いpHで直接
Qカラムに装填するか、またはQカラムを低いpHで洗浄するものである。Qカ
ラムは普通は低いpH、特にpH4で操作されることはない。したがって、低い
pHでrPSGL−IgをプロテインA溶出液から直接捕獲することまたはQカ
ラムを洗浄すること、あるいはそれらの組合わせは、新規である。rPSGL−
IgおよびプロテインAは低いpHにあるので、大部分のrPSGL−Igは浸
出したプロテインAに結合していない。その結果、プロテインAはQカラムに結
合せず、Q通過液中にみられる。これも新規である。したがってQカラムはプロ
テインAを除去するために用いられる。
ersham Pharmacia)を製造業者の指示に従って調製する。カラ
ム容量は約1mg/mLである。カラムを20mMトリス、200mM NaC
l、pH7.2〜8、好ましくはpH7.4で平衡化する。マイクロフィルトレ
ーションしたコンディショニング培地を、pH7〜8、好ましくはpH7.4、
約30〜300cm/時、好ましくは150cm/時でカラムに装填する。カラ
ムを20mMトリス、200mM NaCl、pH7〜8、好ましくはpH7.
4で洗浄し、20mMクエン酸、pH3〜4、好ましくはpH3.7、約50〜
300cm/時で溶離する。純度はタンパク質については>95%であり、DN
Aの>99%がこの工程で除去される。
ose(商標)Fast Flowカラム(Amersham Pharmac
ia)で精製する。プロテインA工程後のQ SepharoseカラムのPS
GLに対する容量は、pH3.6〜4.0、好ましくはpH3.7において約≧
6mg PSGL/mL樹脂である。
装填するか、またはピークをQ Sepharoseカラムに装填する前に中性
にする。いずれの場合も、カラムを200mM NaClおよび20mMクエン
酸、pH3.5〜4、好ましくはpH3.7で洗浄して、残留プロテインAを除
去する。両方法とも、浸出プロテインA、低スルフェート化rPSGL−Ig、
N末端クリップrPSGL−Ig、およびpro−rPSGL−Ig(rPSG
L−Igの前駆物質種;N末端の酵素開裂部位をもたない)を除去する。pH3
.5〜4での洗浄後、カラムを20mMヒスチジン、400mM NaCl、p
H6.5で洗浄して低スルフェート化rPSGL−Igを除去することができる
。低スルフェート化rPSGL−Ig分子は4以下のスルフェート化をもち、こ
れに対し活性rPSGL−Igは理想的には5または6のスルフェート化をN末
端チロシン上にもつ。カラムの装填および洗浄工程を3.5cm/分の速度で実
施する。カラムをpH6.5で1M NaCl、20mMヒスチジン、pH6.
5により溶離する。あるいは、pH3.5〜4.0、好ましくはpH3.7、5
00mM NaCl、20mMクエン酸、<1.1cm/分で溶離してもよい。
タンパク質はピークの<2%である。
たはルーティン程度の実験により確認できるであろう。そのような均等物は本発
明に包含されるものとする。
Claims (35)
- 【請求項1】 試料中の高アニオン性ターゲットタンパク質を試料中の複数の
タンパク性および非タンパク性不純物ならびにDNA/ヒストン複合体から精製
する方法であって、アニオン性ターゲットタンパク質を支持体に結合させるのに
適した条件下で、荷電分子を可逆的に結合しうる支持体と試料を接触させ、そし
て試料中の複数のタンパク性および非タンパク性不純物は結合しないかまたは支
持体から洗い去られ、一方、高アニオン性ターゲットタンパク質は結合したまま
であり、かつ試料中のDNA/ヒストン複合体は解離し、これにより試料中の高
アニオン性ターゲットタンパク質が精製される条件下で、高アニオン性ターゲッ
トタンパク質を精製することを含む方法。 - 【請求項2】 ターゲットタンパク質がスルフェート化タンパク質であり、不
純物が低スルフェート化形のターゲットタンパク質を含む、請求項1に記載の方
法。 - 【請求項3】 スルフェート化タンパク質がP−セレクチン糖タンパク質リガ
ンド−1またはP−セレクチン糖タンパク質リガンド−1融合タンパク質である
、請求項2に記載の方法。 - 【請求項4】 試料中の高アニオン性ターゲットタンパク質を試料中の複数の
タンパク性および非タンパク性不純物ならびにDNA/ヒストン複合体から精製
する方法であって、(a)荷電分子を可逆的に結合しうる支持体と試料を接触さ
せ、これによりターゲットタンパク質を支持体に結合させ、(b)複数のタンパ
ク性および非タンパク性不純物は結合しないかまたは支持体から洗い去られ、一
方、ターゲットタンパク質は結合したままであるのに適した条件下で、第1洗浄
溶液により支持体を洗浄し、(c)試料を第1溶離溶液で溶離し、その際、第1
溶離溶液は高モル濃度の塩類溶液を含み、そして(d)精製されたアニオン性タ
ーゲットタンパク質を含有する溶離試料を採集することを含む方法。 - 【請求項5】 第1洗浄溶液のpHが約4.0〜8.0である、請求項4に記
載の方法。 - 【請求項6】 第1洗浄溶液のpHが約6.5である、請求項4に記載の方法
。 - 【請求項7】 支持体から溶離した試料を後続精製する、請求項4に記載の方
法。 - 【請求項8】 後続精製が、(a)ターゲットタンパク質を含有する溶離試料
を金属キレートクロマトグラフィーカラムまたは疎水性相互作用クロマトグラフ
ィーカラムに通し、これにより溶離試料をカラムに捕獲し、(b)試料に含有さ
れるDNA/ヒストン複合体が解離するのに適した条件下で、カラムを第2洗浄
溶液により洗浄し、(c)試料を第2溶離溶液で溶離し、そして(d)精製され
たアニオン性ターゲットタンパク質を含有する溶離試料を採集することを含む、
請求項7に記載の方法。 - 【請求項9】 第2洗浄溶液が高い塩類濃度を含み、第2溶離溶液が第2洗浄
溶液より低い塩類濃度を含む、請求項8に記載の方法。 - 【請求項10】 ターゲットタンパク質を含有する溶離試料を疎水性相互作用
クロマトグラフィーカラムに通し、第2洗浄溶液が濃度約4MのNaClおよび
濃度約1.2Mの硫酸アンモニウムよりなる群から選択され、第2溶離溶液が濃
度約0.48Mの硫酸アンモニウムである、請求項8に記載の方法。 - 【請求項11】 第2洗浄溶液が(a)約4MのNaClならびに約20mM
およびpH約7.4のトリスを含む溶液、(b)約5%のイソプロパノールおよ
び約1.2Mの硫酸アンモニウムを含む溶液、(c)約5%のエタノールおよび
約1.2Mの硫酸アンモニウムの溶液、(d)約5%のエタノールおよび約4M
のNaClの溶液よりなる群から選択される、請求項9に記載の方法。 - 【請求項12】 ターゲットタンパク質を含有する溶離試料を金属キレートク
ロマトグラフィーカラムに通し、第2洗浄溶液が約2Mの塩類濃度を含み、第2
溶離溶液が約200mM〜1Mの塩類濃度を含む、請求項9に記載の方法。 - 【請求項13】 第2溶離溶液が約1Mの塩類濃度を含む、請求項12に記載
の方法。 - 【請求項14】 第2洗浄溶液が約40mMのMES、約2MのNaClおよ
び約5mMのイミダゾールを含み、第2溶離溶液が約40mMのMES、約1M
のNaClおよび約35mMのイミダゾールの溶液を含む、請求項12に記載の
方法。 - 【請求項15】 ターゲットタンパク質が少なくともほぼ1つのスルフェート
基を有する、請求項4に記載の方法。 - 【請求項16】 ターゲットタンパク質が少なくともほぼ5つのスルフェート
化を有する、請求項5に記載の方法。 - 【請求項17】 タンパク質がP−セレクチン糖タンパク質リガンド−1また
はP−セレクチン糖タンパク質リガンド−1融合タンパク質である、請求項4に
記載の方法。 - 【請求項18】 タンパク質が組換えタンパク質である、請求項4に記載の方
法。 - 【請求項19】 試料中の免疫グロブリンFcドメインを含む高アニオン性タ
ーゲット分子を試料中の複数のタンパク性および非タンパク性不純物ならびにD
NA/ヒストン複合体から精製する方法であって、高アニオン性ターゲット分子
のFc部分を結合しうる支持体と試料を、複数のタンパク性および非タンパク性
不純物は結合しないかまたは支持体から洗い去られ、一方、ターゲットタンパク
質は結合したままであり、かつ試料中のDNA/ヒストン複合体は解離し、これ
により試料中の高アニオン性ターゲット分子をDNA/ヒストン複合体から精製
する条件下で、接触させることを含む方法。 - 【請求項20】 ターゲット分子がスルフェート化タンパク質であり、不純物
が低スルフェート化形のターゲット分子を含む、請求項19に記載の方法。 - 【請求項21】 スルフェート化分子がP−セレクチン糖タンパク質リガンド
−1融合タンパク質である、請求項19に記載の方法。 - 【請求項22】 P−セレクチン糖タンパク質リガンド−1融合タンパク質が
rPSGL−Igである、請求項21に記載の方法。 - 【請求項23】 非タンパク性およびタンパク性不純物を濃度約1MのNaC
lでカラムから洗い去る、請求項19に記載の方法。 - 【請求項24】 非タンパク性およびタンパク性不純物を濃度約1MのNaC
lでカラムから洗い去り、その際、高アニオン性ターゲット分子がP−セレクチ
ン糖タンパク質リガンド−1融合タンパク質である、請求項19に記載の方法。 - 【請求項25】 P−セレクチン糖タンパク質リガンド−1融合タンパク質が
rPSGL−Igである、請求項24に記載の方法。 - 【請求項26】 試料中の免疫グロブリンFcドメインを含む高アニオン性タ
ーゲット分子を試料中の複数のタンパク性および非タンパク性不純物ならびにD
NA/ヒストン複合体から精製する方法であって、(a)高アニオン性ターゲッ
ト分子のFc部分を結合しうる支持体と試料を接触させ、これによりターゲット
免疫グロブリンを支持体に結合させ、(b)試料中の複数のタンパク性および非
タンパク性不純物は結合しないかまたは支持体から洗い去られ、一方、ターゲッ
ト分子は結合したままであるのに適した条件下で、第1洗浄溶液により支持体を
洗浄し、(c)試料を第1溶離溶液で溶離し、その際、第1溶離溶液のpHは低
く、そして(d)精製された高アニオン性ターゲット分子を含有する溶離試料を
採集することを含む方法。 - 【請求項27】 第1溶離溶液のpHが約4.0である、請求項26に記載の
方法。 - 【請求項28】 精製されたアニオン性ターゲット分子を含有する溶離試料を
後続精製する、請求項26に記載の方法。 - 【請求項29】 後続精製が、(a)精製されたアニオン性ターゲット分子を
含有する溶離試料を、荷電分子を可逆的に結合しうる第2支持体と接触させ、こ
れによりターゲット免疫グロブリンが第2支持体に結合し、(b)第2支持体を
第2洗浄溶液で洗浄し、その際、第2洗浄溶液のpHは低く、これにより試料中
のタンパク性および非タンパク性不純物は除去され、(c)試料を第2溶離溶液
で溶離し、そして(d)精製されたアニオン性ターゲット分子を含有する溶離試
料を採集することを含む、請求項28に記載の方法。 - 【請求項30】 タンパク性不純物が一部は浸出プロテインAからなる、請求
項29に記載の方法。 - 【請求項31】 第1溶離溶液のpHが約4.0である、請求項29に記載の
方法。 - 【請求項32】 ターゲット分子が少なくともほぼ1つのスルフェート化を有
する、請求項26に記載の方法。 - 【請求項33】 ターゲット分子が少なくともほぼ5つのスルフェート化を有
する、請求項26に記載の方法。 - 【請求項34】 分子がP−セレクチン糖タンパク質リガンド−1融合タンパ
ク質である、請求項26に記載の方法。 - 【請求項35】 P−セレクチン糖タンパク質リガンド−1融合タンパク質が
rPSGL−Igである、請求項34に記載の方法。
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