JP2003528884A

JP2003528884A - 高アニオン性タンパク質の精製方法

Info

Publication number: JP2003528884A
Application number: JP2001571700A
Authority: JP
Inventors: コフマン，ジョナサン・エル; フォスター，ウィリアム・バリー; ジャーメイン，ボニー・ジェイ; サン，シュージュン; ロビンソン，ジェフリー・ジェイ
Original assignee: Genetics Institute LLC
Current assignee: Genetics Institute LLC
Priority date: 2000-03-27
Filing date: 2001-03-27
Publication date: 2003-09-30
Anticipated expiration: 2021-03-27
Also published as: EP1681298A2; WO2001072769A3; EP1681299A3; JP2012184245A; US20020132991A1; DE60140493D1; ATE328895T1; CA2404155C; DE60120374T2; AU2001249515B2; ES2266188T3; EP1268514B1; JP5596078B2; ES2338687T3; DK1681299T3; EP1268514A2; DK1268514T3; CA2404155A1; EP1681299A2; JP5025874B2

Abstract

(57)【要約】本発明は、高アニオン性ターゲットタンパク質、たとえばスルフェート化タンパク質の単離および精製のための方法を提供する。スルフェート化タンパク質は５以上のスルフェート化をもつ。好ましい態様においては、スルフェート化タンパク質は６つのスルフェート化をもつ；たとえばＰＳＧＬ−１（Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド）のようにＮ末端チロシン残基上に６つのスルフェート化をもつ。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】関連出願本出願は、米国特許出願６０／１９３，３５１（２０００年３月２７日出願）
、表題”高アニオン性タンパク質の精製方法”の優先権を主張する。この引用に
よりこの出願の内容全体を本明細書に援用する。

【０００２】発明の背景ターゲットタンパク質の精製は、ＤＮＡ／タンパク質相互作用のためＤＮＡが
除去されにくいことにより、しばしば妨げられる。ＤＮＡ／タンパク質相互作用
は、高アニオン性タンパク質、たとえばスルフェート化（ｓｕｌｆａｔｅｄ）タ
ンパク質の精製に際してはより問題となる。

【０００３】発明の概要本発明は、高アニオン性タンパク質および免疫グロブリンドメインを含むター
ゲットタンパク質、たとえばスルフェート化タンパク質の単離および精製のため
の方法を提供する。アニオン性タンパク質は正味マイナス電荷をもつタンパク質
である。スルフェート化タンパク質は、正味マイナス電荷が少なくともほぼ１つ
のスルフェート化残基によるタンパク質である。ターゲットタンパク質のスルフ
ェート化とは、ターゲットタンパク質に含有されるアミノ酸上またはアミノ酸間
の少なくとも１つのヒドロキシル基（−ＯＨ）が−ＳＯ₄Ｈで置換されることを
表わす。好ましい態様において、スルフェート化タンパク質は少なくともほぼ１
つのスルフェート基をもつ。少なくともほぼ２、３、４、５、６またはそれより
多いスルフェート基を含むスルフェート化タンパク質、たとえばＰＳＧＬ−１（
Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１）のようにＮ末端チロシン上に６つの
スルフェート基を含むものも本発明方法に包含される。

【０００４】１態様において本発明は、ターゲットタンパク質の精製に適した条件下でのイ
オン交換クロマトグラフィー工程を含む、高アニオン性ターゲットタンパク質の
精製方法を提供する。たとえばこの方法は、（１）荷電分子を可逆的に結合しう
る支持体と試料を接触させ、これによりターゲットタンパク質を支持体に結合さ
せ、（２）試料中の複数のタンパク性および非タンパク性不純物は結合しないか
または支持体から洗い去られ、一方、高アニオン性ターゲットタンパク質は結合
したままであるのに適した条件下で、第１洗浄溶液により支持体を洗浄し、（３
）試料を第１溶離溶液で溶離し、その際、第１溶離溶液は高モル濃度の塩類溶液
を含み、そして（４）精製されたアニオン性ターゲットタンパク質を含有する溶
離試料を採集することを含む。

【０００５】１態様において、第１洗浄溶液のｐＨは約４．０〜８．０である。他の態様に
おいて、第１洗浄溶液のｐＨは約６．５である。好ましい態様において、高アニオン性ターゲットタンパク質はスルフェート化
タンパク質であり、不純物はスルフェート化形のターゲットタンパク質を含む。

【０００６】他の態様においては、精製されたターゲットタンパク質を含有するイオン交換
クロマトグラフィー精製からの溶離試料を、後続精製することができる。この後
続精製は、たとえば高アニオン性ターゲットタンパク質の精製に適した条件下で
の疎水性相互作用クロマトグラフィーおよび／または金属キレートクロマトグラ
フィー工程を含む。たとえばこの後続精製は、（１）ターゲットタンパク質を含
有する溶離試料を金属キレートクロマトグラフィーカラムまたは疎水性相互作用
クロマトグラフィーカラムに通し、これにより溶離試料をカラムに捕獲し、（２
）試料に含有されるＤＮＡ／ヒストン複合体が解離するのに適した条件下で、カ
ラムを第２洗浄溶液により洗浄し、（３）試料を第２溶離溶液で溶離し、そして
（４）精製された高アニオン性ターゲットタンパク質を含有する溶離試料を採集
する工程を含む。

【０００７】１態様において、第２洗浄溶液は高い塩類濃度を含み、第２溶離溶液は第２洗
浄溶液より低い塩類濃度を含む。たとえば疎水性相互作用クロマトグラフィー条
件下で、第２洗浄溶液の塩類濃度は約４Ｍ、第２溶離溶液の塩類濃度は約０．４
８Ｍである。あるいは、疎水性相互作用クロマトグラフィー条件下で、第２洗浄
溶液は（ａ）約４ＭのＮａＣｌならびに約２０ｍＭおよびｐＨ約７．４のトリス
を含む溶液、（ｂ）約５％のイソプロパノールおよび約１．２Ｍの硫酸アンモニ
ウムを含む溶液、（ｃ）約５％のエタノールおよび約１．２Ｍの硫酸アンモニウ
ムの溶液、（ｄ）約５％のエタノールおよび約４ＭのＮａＣｌの溶液よりなる群
から選択される。

【０００８】鉄キレート化クロマトグラフィー条件下で、たとえば第２洗浄溶液は約２Ｍの
塩類濃度を含み、第２溶離溶液は約２００ｍＭ〜１Ｍの塩類濃度を含む。あるい
は、鉄キレート化クロマトグラフィー条件下で、第２洗浄溶液は約４０ｍＭのＭ
ＥＳ、約２ＭのＮａＣｌおよび約５ｍＭのイミダゾールを含み、第２溶離溶液は
約４０ｍＭのＭＥＳ、約１ＭのＮａＣｌおよび約３５ｍＭのイミダゾールの溶液
を含む。

【０００９】他の態様において、ターゲットタンパク質は少なくともほぼ１つのスルフェー
ト化をもつ。少なくともほぼ２、３、４、５、６またはそれより多いスルフェー
ト化をもつアニオン性ターゲットタンパク質、たとえばＰＳＧＬ−１タンパク質
も本発明に包含される。本発明により精製できるアニオン性タンパク質は、天然
または組換えタンパク質であってよい。

【００１０】他の態様において、本発明は免疫グロブリンドメイン（免疫グロブリンＦｃド
メイン）を含む高アニオン性ターゲットタンパク質、たとえばＰＳＧＬ−１融合
タンパク質の精製方法を提供する。この方法は、（１）免疫グロブリンドメイン
を含むターゲットタンパク質のＦｃ部分を結合しうる支持体と試料を接触させ、
これによりターゲット分子を支持体に結合させ、（２）試料に含有される不純物
を洗い去るのに適した条件下で、第１洗浄溶液により支持体を洗浄し、（３）試
料を第１溶離溶液で溶離し、その際、第１溶離溶液のｐＨは低く、たとえば約４
．０であり、そして（４）精製されたアニオン性ターゲット分子を含有する溶離
試料を採集する工程を含む。

【００１１】他の態様において、Ｆｃ結合支持体からの、免疫グロブリンドメインを含む精
製された高アニオン性ターゲットタンパク質を含有する溶離試料を、後続精製す
る。たとえば後続精製は、（１）免疫グロブリンドメインを含む精製されたアニ
オン性ターゲットタンパク質を含有する溶離試料を、荷電分子を可逆的に結合し
うる支持体と接触させ、これにより試料中の複数のタンパク性および非タンパク
性不純物は結合しないかまたは支持体から洗い去られ、一方、ターゲットタンパ
ク質は支持体に結合したままであり、（２）第２支持体を第２洗浄溶液で洗浄し
、その際、第２洗浄溶液のｐＨは低く、たとえば約４．０であり、（３）試料を
第２溶離溶液で溶離し、そして（４）免疫グロブリンドメインを含む精製された
アニオン性ターゲットタンパク質を含有する溶離試料を採集する工程を含む。

【００１２】１態様において、免疫グロブリンドメインを含むターゲットタンパク質は少な
くともほぼ１つのスルフェート化をもつ。少なくともほぼ２、３、４、５、６ま
たはそれより多いスルフェート化をもつタンパク質を含む免疫グロブリンドメイ
ン、たとえばＰＳＧＬ−Ｉｇも本発明に包含される。

【００１３】好ましい態様において本発明の精製方法は、汚染タンパク質について少なくと
も約９９．９％純度の精製された高アニオン性ターゲットタンパク質および免疫
グロブリンドメインを含む精製された高アニオン性ターゲットタンパク質（たと
えばＰＳＧＬ−Ｉｇ）を提供する。

【００１４】好ましい態様において本発明の精製方法は、高アニオン性ターゲットタンパク
質および免疫グロブリンドメインを含む高アニオン性ターゲットタンパク質から
少なくとも約９５％または２．５ｌｏｇ₁₀除去値（ＬＲＶ）の汚染ＤＮＡを除
去する。

【００１５】本発明の他の特色および利点は以下の詳細な記述および特許請求の範囲から明
かになるであろう。発明の詳細な記述本発明は少なくとも一部は、高アニオン性ターゲットタンパク質および免疫グ
ロブリンドメインを含む高アニオン性ターゲットタンパク質、たとえばスルフェ
ート化タンパク質（たとえばＰＳＧＬ−１）を精製するための新規方法を見いだ
したことに基づく。アニオン性タンパク質は、正味マイナス電荷をもつタンパク
質である。スルフェート化タンパク質は、正味マイナス電荷が少なくともほぼ１
つ、より好ましくは５以上のスルフェート化、たとえば少なくともほぼ６つのス
ルフェート化によるものであるアニオン性タンパク質である。ターゲットタンパ
ク質のスルフェート化とは、ターゲットタンパク質に含有されるアミノ酸上また
はアミノ酸間の少なくとも１つのヒドロキシル基（−ＯＨ）が−ＳＯ₄Ｈで置換
されることを表わす。スルフェート化は、たとえばＰＳＧＬ−１のようにＮ末端
チロシン上において起きる可能性がある。

【００１６】好ましい態様において、スルフェート化タンパク質はＰＳＧＬ−１、たとえば
ＵＳＰ５，８２７，８１７に示されたアミノ酸を含むＰＳＧＬ−１であり、その
内容を本明細書に援用する。ＰＳＧＬ−１タンパク質の完全アミノ酸配列（すな
わち成熟ペプチド＋リーダー配列）は、ＵＳＰ５，８２７，８１７に示されたア
ミノ酸配列のアミノ酸１からアミノ酸４０２までで表わされ、本明細書中にＳＥ
ＱＩＤＮＯ：１として示される。疎水性分析および既知の開裂パターンとの
比較から、アミノ酸２０〜２２個のシグナル配列、すなわちＰＳＧＬ−１のアミ
ノ酸１〜２０またはアミノ酸１〜２２が推定される。ＰＳＧＬ−１は、アミノ酸
残基３８〜４１にＰＡＣＥ（塩基性アミノ酸対変換酵素）開裂部位（−Ａｒｇ−
Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ）を含む。成熟ＰＳＧＬ−１タンパク質は、ＳＥＱＩ
ＤＮＯ：１中のアミノ酸４２からアミノ酸４０２までに示されるアミノ酸配列
で表わされる。可溶性形Ｐ−セレクチンリガンドタンパク質は、ＵＳＰ５，８２
７，８１７に示されたアミノ酸配列のアミノ酸２１からアミノ酸３１０までで表
わされる。他の可溶性形成熟ＰＳＧＬ−１タンパク質は、ＵＳＰ５，８２７，８
１７に示されたアミノ酸配列のアミノ酸４２からアミノ酸３１０までで表わされ
る。可溶性形Ｐ−セレクチンリガンドタンパク質はさらに、室温で水溶液中に可
溶性であることを特色とする。

【００１７】ＰＳＧＬ−１の融合タンパク質（たとえばＰＳＧＬ−Ｉｇ）はＵＳＰ５，８２
７，８１７（本明細書に援用する）の教示に従って製造できる。ＰＳＧＬ−１は糖タンパク質であり、下記の末端炭水化物を１以上含む可能性
がある：

【００１８】

【化１】

【００１９】これらにおいてＲは炭水化物鎖の残りの部分であり、Ｐ−セレクチンリガンドタ
ンパク質に直接に、またはＰ−セレクチンリガンドタンパク質に共有結合した脂
質部分に、共有結合している。ＰＳＧＬ−１はさらにスルフェート化または他の
形で翻訳後修飾されている可能性がある。ＣＯＳまたはＣＨＯ細胞において発現
する全長Ｐ−セレクチンリガンドタンパク質は、非還元性ＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動により示される見掛け分子量２２０ｋＤのホモダイマータン
パク質である。

【００２０】全長ＰＳＧＬ−１の構造は、細胞外ドメイン（ほぼアミノ酸２１〜３１０）、
膜貫通ドメイン（ほぼアミノ酸３１１〜３３２）、および細胞内細胞質ドメイン
（ほぼアミノ酸３３３〜４０２）を含む。細胞外ドメインは、Ａｓｎ残基６５、
１１１および２９２から始まる潜在Ｎ−結合グリコシル化の３つのコンセンサス
トリペプチド部位（Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）を含む。細胞外ドメインはさ
らに、残基４６、４８および５１に３つの潜在チロシンスルフェート化部位を含
む。残基５５〜２６７からなる領域は、高い割合のプロリン、セリンおよびトレ
オニンを含む；これには１０アミノ酸コンセンサス配列Ａｌａ−Ｔｈｒ／Ｍｅｔ
−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｘ−Ｐｒｏ／Ｌｅｕ−Ａｌａ／Ｔ
ｈｒのデカマー反復配列１５のサブドメインが含まれ、ここでＸはＰｒｏ、Ａｌ
ａ、Ｇｌｎ、ＧｌｕまたはＡｒｇであってよい。このような領域は高Ｏ−グリコ
シル化タンパク質に特徴的である。

【００２１】Ｐ−セレクチンリガンドタンパク質活性を維持した状態でＰＳＧＬ−１配列を
実質的に欠失させることができる。たとえばＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸
４２からアミノ酸１８９までの配列、アミノ酸４２からアミノ酸１１８までの配
列、またはアミノ酸４２からアミノ酸８９までの配列を含むＰＳＧＬ−１は、そ
れぞれＰ−セレクチンタンパク質結合活性およびＥ−セレクチン結合能を保持す
る。１以上のＮ−結合グリコシル化部位（たとえばアミノ酸６５、１１１および
２９２）が他のアミノ酸に変化した、または欠失したＰＳＧＬ−１タンパク質も
、Ｐ−セレクチンタンパク質結合活性およびＥ−セレクチン結合能を保持する。
アミノ酸４２からアミノ酸６０までを含む（アミノ酸４５からアミノ酸５８まで
の高アニオン領域を含む）Ｐ−セレクチンリガンドタンパク質も、Ｐ−セレクチ
ンタンパク質結合活性を保持する；しかしそのような配列に限定されたＰ−セレ
クチンリガンドタンパク質は、Ｅ−セレクチンには結合しない。好ましくは、Ｐ
−セレクチンリガンドタンパク質はアミノ酸４６、４８および５１にみられるチ
ロシン残基を少なくとも１つ（より好ましくは少なくとも２つ、最も好ましくは
３つすべて）保有する；そのスルフェート化がＰ−セレクチンリガンドタンパク
質活性に関与すると思われる。

【００２２】本発明をさらに下記の例により説明する。これらを限定と解すべきではない。
本明細書全体、ならびに図面および付表Ａにおいて引用したすべての参考文献、
特許および公開特許出願を本明細書に援用する。ＰＳＧＬ−１のアミノ酸配列に
ついての記述はすべて、ＵＳＰ５，８２７，８１７に示された、および本明細書
にＳＥＱＩＤＮＯ：１として示された、ＰＳＧＬ−１のアミノ酸配列に基づ
く。

【００２３】実施例方法：タンパク質精製のための一般法は下記にみられる：Ｊａｎｓｏｎ，Ｊ．
Ｃ．，ａｎｄＬ．Ｒｙｄｅｎ（編）ＰｒｏｔｅｉｎＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏ
ｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，ＨｉｇｈＲｅｓｏｌｕｔｉｏｎＭｅｔｈｏｄｓ
ａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＶＨＣＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ社，ニュ
ーヨーク（１９８９）、ＵＳＰ５，４２９，７４６（表題：抗体精製）、および
ＵＳＰ５，１１５，１０１（表題：抗体調製物からのタンパク質の除去）；これ
らの内容を本明細書に援用する。

【００２４】実施例１：組換えＰＳＧＬ−Ｉｇ融合タンパク質の精製−方法Ｉこの実施例は、組換えＰＳＧＬ−Ｉｇ融合タンパク質のカラムクロマトグラフ
ィーによる精製を記載する（図１）。

【００２５】可溶性Ｐ−セレクチンリガンドタンパク質をＣＨＯ細胞において発現させ、コ
ンディショニングした培地をタンパク質精製のために収集した。床深さ８ｃｍの
ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＦａｓｔＦｌｏｗ（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈ
ａｒｍａｃｉａ）カラムを製造業者の指示に従って調製した。コンディショニン
グした培地中のＰＳＧＬに対するカラム容量は約１ｍｇＰＳＧＬ／ｍｌ樹脂で
ある。

【００２６】アニオン交換クロマトグラフィーを下記に従って実施した。マイクロフィルト
レーションしたＣＨＯコンディショニング培地を、ほぼｐＨ７、伝導率２０ｍＳ
／ｃｍ未満でカラムに装填した。カラムを２０ｍＭヒスチジン、４００ｍＭＮ
ａＣｌ、ｐＨ６．５で洗浄して低スルフェート化ｒＰＳＧＬ−Ｉｇ（たとえば４
以下のスルフェート化）を除去した。装填および洗浄工程を３．５ｃｍ／分で実
施した。カラムをｐＨ６．５で１ＭＮａＣｌ、２０ｍＭヒスチジン、ｐＨ６．
５により＜１．１ｃｍ／分において溶離した。この工程のｐＨは４〜８であって
よいが、好ましくは６．５である。溶出ピークはＰＳＧＬ−Ｉｇ、ＤＮＡおよび
ヒストンならびに他の汚染物質を含有する。ＱカラムはＤＮＡを結合し、ヒスト
ンはこのＤＮＡに結合している。ＰＳＧＬ溶出（塩類濃度上昇により起きる）は
ＤＮＡ溶出と一致する。ＰＳＧＬ−Ｉｇの純度は＞８０％である。ＤＮＡの５０
％がこの工程で実施されたにすぎない。

【００２７】これらの条件下で、高スルフェート化ｒＰＳＧＬ−Ｉｇ分子（たとえば５また
は６のスルフェート化）が優先的に精製される。理想的には活性ｒＰＳＧＬ−Ｉ
ｇはＮ末端チロシン上に５または６のスルフェート化をもつ。

【００２８】アニオン交換カラムからの溶出液を、下記のように疎水性相互作用クロマトグ
ラフィー（ＨＩＣ）カラムによりさらに精製した。床深さ９ｃｍのＰｈｅｎｙｌＴｏｙｏｐｅａｒｌ６５０Ｃカラム（Ｒｏｈ
ｍａｎｄＨａａｓ）を製造業者の指示に従って調製した。ＨＩＣカラム容量
は約３．５ｍｇＰＳＧＬ／ｍＬ樹脂である。カラムを１．２Ｍ硫酸アンモニウ
ム、２０ｍＭトリス、ｐＨ７．４中、≦１．３ｃｍ／分で平衡化した。ＱＳｅ
ｐｈａｒｏｓｅカラムからの溶出液を、３Ｍ硫酸アンモニウム、５０ｍＭトリス
、ｐＨ７．４の添加により、１．２Ｍ硫酸アンモニウム、２０ｍＭトリス、ｐＨ
７．４に調整し、ＨＩＣに装填した。あるいは、１．２Ｍ硫酸アンモニウムでは
なく４ＭＮａＣｌで装填することができる。カラムを１．２Ｍ硫酸アンモニウ
ム、２０ｍＭトリス、ｐＨ７．４で洗浄した。装填および洗浄の両工程とも約１
．３ｃｍ／分の速度で実施した。ＨＩＣカラムを０．４８Ｍ硫酸アンモニウム、
２０ｍＭトリス、ｐＨ７．４により０．６５ｃｍ／分で溶離した。これらの条件
下で、ＨＩＣカラムからまずＨ２ＡおよびＨ２Ｂヒストンが除去される。これら
はＨ３およびＨ４ヒストンほど強固にＤＮＡを結合しない。Ｈ２ヒストンは洗浄
画分中に出現し、ピークはＨ３およびＨ４ヒストン、ならびに少量のＨ２ヒスト
ンを含有する。さらに、ＤＮＡの大部分がヒストン上に留まり、このピーク中に
溶出する。生成物は汚染タンパク質について＞９５％の純度であり、８５％のＤ
ＮＡがこの工程で除去される。

【００２９】ＨＩＣカラムからの溶出液を、下記のように金属キレートクロマトグラフィー
（ＩＭＡＣ）カラムによりさらに精製した。ＦｒａｃｔｏｇｅｌＣｈｅｌａｔｅ（Ｍ）（Ｅ．Ｍｅｒｃｋ）上のＩＭＡＣ
銅（ＩＩ）カラムを製造業者の指示に従って調製した。ＩＭＡＣカラムは６．４
〜７．２ｃｍの床深さ、および約６．６ｍｇＰＳＧＬ／ｍＬ樹脂の容量をもっ
ていた。

【００３０】カラムを５０ｍＭリン酸カリウム（ＫＰＯ₄）、２．０ＭＮａＣｌ、２ｍＭ
イミダゾール、ｐＨ７中、５ｃｖ、≦５ｃｍ／分で平衡化した。ＨＩＣカラムか
らの溶出液を２ｍＭイミダゾール、５０ｍＭＫＰＯ₄、ｐＨ７，２００ｍＭ
ＮａＣｌに調整し、ＩＭＡＣカラムに装填した。カラムをまず平衡化緩衝液で洗
浄し、次いで４０ｍＭＭＥＳ、１ＭＮａＣｌ、５ｍＭイミダゾール、ｐＨ６
．６中、≦５ｃｍ／分で平衡化した。この低い塩類濃度では、ＩＭＡＣカラム上
のヒストン／ＤＮＡ複合体は分解されない。カラムを４０ｍＭＭＥＳ、１Ｍ
ＮａＣｌ、３５ｍＭイミダゾール、ｐＨ６．６で溶離した。ＩＭＡＣカラムから
まずＨ３およびＨ４ヒストンが除去される。ＩＭＡＣピーク中に少量のＨ３およ
びＨ２ヒストンがみられるが、Ｈ３およびＨ４ヒストン、ならびに少量のＨ２は
ストリップ液中にある。得られた生成物は汚染タンパク質について＞９９．９％
の純度であり、９５％のＤＮＡがこの工程で除去される。全体として、この全工
程で約２．５ＬＲＶのＤＮＡクリアランスである。

【００３１】ＤＮＡはＱカラムに直接結合したので、この方法でＤＮＡは全プロセス工程を
通して運ばれた。Ｑ工程でＤＮＡは、Ｑカラムへの本発明の装填物中に存在する
天然のＤＮＡ結合タンパク質であるヒストン（たとえばＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３お
よびＨ４）にも結合した。したがってＱカラム上にはＤＮＡがＱカラムに結合し
、このＤＮＡにヒストンに結合したサンドイッチがあった。後続工程でサンドイ
ッチは逆転した；ＤＮＡはＨＩＣまたはＩＭＡＣカラムには直接結合しないので
、その代わりヒストンがＨＩＣまたはＩＭＡＣカラムに結合し、ＤＮＡはこれら
のヒストンに結合した。ヒストンがＨＩＣまたはＩＭＡＣカラムから溶出すると
、それらと共に汚染物質ＤＮＡが運ばれる。ＤＮＡ／タンパク質相互作用のため
、タンパク質精製に際し、特に高アニオン性ターゲットタンパク質の場合、殊に
これらのアニオン性タンパク質をアニオン交換カラムから溶離する場合、しばし
ばＤＮＡが除去されにくい可能性がある。

【００３２】実施例２：組換えＰＳＧＬ−Ｉｇ融合タンパク質の精製−方法ＩＩこの実施例は、組換えＰＳＧＬ−Ｉｇ融合タンパク質のカラムクロマトグラフ
ィーによる精製を記載する；これは汚染性のヒストン／ＤＮＡ複合体を塩類また
はアルコール類で解離し、これによりＰＳＧＬ−Ｉｇタンパク質の純度を高める
工程を含む（図２）。

【００３３】ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅ上でのアニオン交換クロマトグラフィーを実施例１の
記載に従って実施した。アニオン交換カラムからの溶出液を、下記のように疎水性相互作用クロマトグ
ラフィー（ＨＩＣ）カラムによりさらに精製した。床深さ９ｃｍのＰｈｅｎｙｌＴｏｙｏｐｅａｒｌ６５０Ｃカラム（ＲｏｈｍａｎｄＨａａｓ）を製造
業者の指示に従って調製し、１．２Ｍ硫酸アンモニウム、２０ｍＭトリス、ｐＨ
７．４で平衡化した。この工程のｐＨは６〜８であってよいが、好ましくはｐＨ
７．４である。

【００３４】Ｑピークを、３Ｍ硫酸アンモニウム、５０ｍＭトリス、ｐＨ７．４の添加によ
り、１．２Ｍ硫酸アンモニウム、２０ｍＭトリス、ｐＨ７．４に調整し、カラム
に装填した。あるいは、１．２Ｍ硫酸アンモニウムではなく４ＭＮａＣｌで装
填することができる。カラムを１．２Ｍ硫酸アンモニウム、２０ｍＭトリス、ｐ
Ｈ７．４、続いて４ＭＮａＣｌ、２０ｍＭトリス、ｐＨ７．４で洗浄した。４
ＭＮａＣｌによる洗浄で９０％のＤＮＡがカラムから除去される（または１
ｌｏｇ₁₀除去値、すなわち１ＬＲＶ）。あるいは５％イソプロパノールおよび
１．２Ｍ硫酸アンモニウムで洗浄してもよい。これにより９９．９％のＤＮＡが
カラムから除去される（”３ｌｏｇ₁₀除去値”、すなわち３ＬＲＶ）。ある
いは５％エタノールおよび１．２Ｍ硫酸アンモニウムで洗浄してもよい。これに
より９９．９％のＤＮＡがカラムから除去される（”３ｌｏｇ₁₀除去値”、す
なわち３ＬＲＶ）。あるいは５％エタノールおよび４ＭＮａＣｌで洗浄して
もよい。これにより９９．９％のＤＮＡがカラムから除去される（”３ｌｏｇ₁₀ 除去値”、すなわち３ＬＲＶ）。あるいは５％イソプロパノールおよび４Ｍ
ＮａＣｌで洗浄してもよい。これにより９９．９％のＤＮＡがカラムから除去
される（”３ｌｏｇ₁₀除去値”、すなわち３ＬＲＶ）。装填および洗浄の両
工程とも約１．３ｃｍ／分の速度で実施した。次いでカラムを０．４８Ｍ硫酸ア
ンモニウム、２０ｍＭトリス、ｐＨ７．４により０．６５ｃｍ／分で溶離した。

【００３５】前記のように、これらの条件を用いるＨＩＣによりまずＨ２ＡおよびＨ２Ｂヒ
ストンが除去される。これらはＨ３およびＨ４ヒストンほど強固にＤＮＡを結合
しない。Ｈ２ヒストンは洗液中に出現する。ピークはＨ３およびＨ４ヒストン、
ならびに少量のＨ２ヒストンを含有する。しかし本発明者らは、より高い塩類濃
度で洗浄するとＤＮＡ／ヒストン相互作用を破壊しうることを見いだした。たと
えば１．２Ｍ硫酸アンモニウムではなく４ＭＮａＣｌで洗浄すると、ＤＮＡは
ヒストンから分離し、洗液中へ流出する。これらの条件下では、ＤＮＡの大部分
が洗液中へ流出し、ヒストンはなおピーク中に溶出する。あるいはこのＨＩＣ工
程をＩＭＡＣ工程（下記を参照）の後に実施してもよい。これにより９９．９％
以上のＤＮＡが除去される（３ＬＲＶ）。

【００３６】ＨＩＣカラムからの溶出液を、下記のように金属キレートクロマトグラフィー
（ＩＭＡＣ）カラムによりさらに精製した。ＦｒａｃｔｏｇｅｌＣｈｅｌａｔｅ（Ｍ）（Ｅ．Ｍｅｒｃｋ）上のＩＭＡＣ
銅（ＩＩ）カラムを製造業者の指示に従って調製した。ＩＭＡＣカラムは６．４
〜７．２ｃｍの床深さ、および約６．６ｍｇＰＳＧＬ／ｍＬ樹脂の容量をもっ
ていた。この工程のｐＨは４．８〜８であってよいが、好ましくはｐＨ６．６で
ある。

【００３７】カラムを５０ｍＭリン酸カリウム（ＫＰＯ₄）、２．０ＭＮａＣｌ、２ｍＭ
イミダゾール、ｐＨ７中、５ｃｖ、≦５ｃｍ／分で平衡化した。あるいは、２Ｍ
ＮａＣｌではなく２００ｍＭＮａＣｌで５カラムを平衡化してもよい。ＨＩ
Ｃカラムからの溶出液を２ｍＭイミダゾール、５０ｍＭＫＰＯ₄、ｐＨ７、２
００ｍＭＮａＣｌに調整し、ＩＭＡＣカラムに装填した。あるいは、２ＭＮ
ａＣｌではなく２００ｍＭＮａＣｌで装填を行ってもよい。

【００３８】カラムをまず平衡化用緩衝液で洗浄し、次いで４０ｍＭＭＥＳ、２ＭＮａ
Ｃｌ、５ｍＭイミダゾール、ｐＨ６．６中、≦５ｃｍ／分で平衡化した。カラム
を４０ｍＭＭＥＳ、１ＭＮａＣｌ、３５ｍＭイミダゾール、ｐＨ６．６で溶
離した。ＩＭＡＣカラムからまずＨ３およびＨ４ヒストンが除去される。これら
のヒストンおよび少量のＨ２ヒストンはストリップ液中にある。少量のＨ３およ
びＨ４ヒストンがＩＭＡＣピーク中にもみられる。

【００３９】この工程で実施例１の方法Ｉの工程（１ＬＲＶ）より９０％多いＤＮＡが除
去される。この工程の新規性は、ヒストン／ＤＮＡ複合体からＤＮＡを分離する
ために２ＭＮａＣｌで装填するか、または２ＭＮａＣｌで洗浄することであ
る。ヒストンはＩＭＡＣカラムに付着し、ＤＮＡはこれらのヒストンに付着する
。ＤＮＡはＨ３／Ｈ２または単にＨ２複合体よりＨ３／Ｈ４複合体の方により良
く結合するので、Ｈ３／Ｈ４複合体を可能な限り速やかに除去するのが有益であ
る。したがって、ＩＭＡＣ実施後にＨＩＣを実施すると、より大きなＤＮＡクリ
アランス（９９．９％高いクリアランス、すなわち３ＬＲＶ）を達成できるこ
とが示された。したがってＩＭＡＣを可能な限り早期にプロセスに挿入すると、
さらにＤＮＡを減少させうると考えられる。しかしＩＭＡＣを第１工程にすると
、低分子量アミノ酸および他のアミン含有基を装填物から除去するために限外濾
過／透析濾過（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）が必要となる。

【００４０】実施例３：組換えＰＳＧＬ−Ｉｇ融合タンパク質の精製−方法ＩＩＩこの実施例は、組換えＰＳＧＬ−Ｉｇ融合タンパク質のカラムクロマトグラフ
ィーによる精製のための別法を記載する。実施例１に記載した精製方式と異なり
、この方法は第１精製工程としてアフィニティー工程を用いる（図３）。このア
フィニティー精製工程には、ｒＰＳＧＬ−ＩｇキメラのＦｃ部分を結合するプロ
テインＡを用いる。ｒＰＳＧＬ−ＩｇはプロテインＡカラムから低いｐＨ、この
場合ｐＨ３．７で溶出する。装填後にカラムを１ＭＮａＣｌで洗浄すると、プ
ロテインＡ工程はより良いクリアランスを与える。この塩類濃度は一般に用いら
れるものより高い（通常は約１５０ｍＭＮａＣｌ）ので、新規である。この塩
工程の付加により、この工程からのＤＮＡクリアランスは４ｌｏｇ₁₀除去値（
ＬＲＶ）ないし６ＬＲＶになる。これは１００倍のＤＮＡ除去増加である。

【００４１】プロテインＡ工程はヒストンを結合しないと思われ、良好なＤＮＡクリアラン
スを与える。したがってプロテインＡ工程後の各工程には認めうるほどのヒスト
ンは存在しない。しかしプロテインＡがプロテインＡカラムから浸出するので、
プロテインＡを除去するための後続工程を実施する。浸出したプロテインＡを除
去するための最良の方法は、プロテインＡ溶出液を中性もしくは低いｐＨで直接
Ｑカラムに装填するか、またはＱカラムを低いｐＨで洗浄するものである。Ｑカ
ラムは普通は低いｐＨ、特にｐＨ４で操作されることはない。したがって、低い
ｐＨでｒＰＳＧＬ−ＩｇをプロテインＡ溶出液から直接捕獲することまたはＱカ
ラムを洗浄すること、あるいはそれらの組合わせは、新規である。ｒＰＳＧＬ−
ＩｇおよびプロテインＡは低いｐＨにあるので、大部分のｒＰＳＧＬ−Ｉｇは浸
出したプロテインＡに結合していない。その結果、プロテインＡはＱカラムに結
合せず、Ｑ通過液中にみられる。これも新規である。したがってＱカラムはプロ
テインＡを除去するために用いられる。

【００４２】床深さ６〜１０ｃｍのＰｒｏｔｅｉｎＡＦａｓｔＦｌｏｗカラム（Ａｍ
ｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａ）を製造業者の指示に従って調製する。カラ
ム容量は約１ｍｇ／ｍＬである。カラムを２０ｍＭトリス、２００ｍＭＮａＣ
ｌ、ｐＨ７．２〜８、好ましくはｐＨ７．４で平衡化する。マイクロフィルトレ
ーションしたコンディショニング培地を、ｐＨ７〜８、好ましくはｐＨ７．４、
約３０〜３００ｃｍ／時、好ましくは１５０ｃｍ／時でカラムに装填する。カラ
ムを２０ｍＭトリス、２００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７〜８、好ましくはｐＨ７．
４で洗浄し、２０ｍＭクエン酸、ｐＨ３〜４、好ましくはｐＨ３．７、約５０〜
３００ｃｍ／時で溶離する。純度はタンパク質については＞９５％であり、ＤＮ
Ａの＞９９％がこの工程で除去される。

【００４３】プロテインＡカラムからの溶出液をさらに、床深さ８ｃｍのＱＳｅｐｈａｒ
ｏｓｅ（商標）ＦａｓｔＦｌｏｗカラム（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃ
ｉａ）で精製する。プロテインＡ工程後のＱＳｅｐｈａｒｏｓｅカラムのＰＳ
ＧＬに対する容量は、ｐＨ３．６〜４．０、好ましくはｐＨ３．７において約≧
６ｍｇＰＳＧＬ／ｍＬ樹脂である。

【００４４】プロテインＡピークをｐＨ調整せずに直接にＱＳｅｐｈａｒｏｓｅカラムに
装填するか、またはピークをＱＳｅｐｈａｒｏｓｅカラムに装填する前に中性
にする。いずれの場合も、カラムを２００ｍＭＮａＣｌおよび２０ｍＭクエン
酸、ｐＨ３．５〜４、好ましくはｐＨ３．７で洗浄して、残留プロテインＡを除
去する。両方法とも、浸出プロテインＡ、低スルフェート化ｒＰＳＧＬ−Ｉｇ、
Ｎ末端クリップｒＰＳＧＬ−Ｉｇ、およびｐｒｏ−ｒＰＳＧＬ−Ｉｇ（ｒＰＳＧ
Ｌ−Ｉｇの前駆物質種；Ｎ末端の酵素開裂部位をもたない）を除去する。ｐＨ３
．５〜４での洗浄後、カラムを２０ｍＭヒスチジン、４００ｍＭＮａＣｌ、ｐ
Ｈ６．５で洗浄して低スルフェート化ｒＰＳＧＬ−Ｉｇを除去することができる
。低スルフェート化ｒＰＳＧＬ−Ｉｇ分子は４以下のスルフェート化をもち、こ
れに対し活性ｒＰＳＧＬ−Ｉｇは理想的には５または６のスルフェート化をＮ末
端チロシン上にもつ。カラムの装填および洗浄工程を３．５ｃｍ／分の速度で実
施する。カラムをｐＨ６．５で１ＭＮａＣｌ、２０ｍＭヒスチジン、ｐＨ６．
５により溶離する。あるいは、ｐＨ３．５〜４．０、好ましくはｐＨ３．７、５
００ｍＭＮａＣｌ、２０ｍＭクエン酸、＜１．１ｃｍ／分で溶離してもよい。
タンパク質はピークの＜２％である。

【００４５】均等物当業者には本明細書に記載した具体的態様の多くの均等物が自明であるか、ま
たはルーティン程度の実験により確認できるであろう。そのような均等物は本発
明に包含されるものとする。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１に記載した本発明の精製方法、方法Ｉを示す。

【図２Ａ】実施例２に記載した本発明の精製方法、方法ＩＩを示す。

【図２Ｂ】実施例２に記載した本発明の精製方法、方法ＩＩを示す。

【図２Ｃ】実施例２に記載した本発明の精製方法、方法ＩＩを示す。

【図２Ｄ】実施例２に記載した本発明の精製方法、方法ＩＩを示す。

【図２Ｅ】実施例２に記載した本発明の精製方法、方法ＩＩを示す。

【図２Ｆ】実施例２に記載した本発明の精製方法、方法ＩＩを示す。

【図２Ｇ】実施例２に記載した本発明の精製方法、方法ＩＩを示す。

【図３】実施例３に記載した本発明の精製方法、方法ＩＩＩを示す。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者フォスター，ウィリアム・バリーアメリカ合衆国マサチューセッツ州01824，チェルムズフォード，チェストナッツ・ヒル・ロード 11 (72)発明者ジャーメイン，ボニー・ジェイアメリカ合衆国ニューハンプシャー州 03303，ウェブスター，キンボール・レーン５ (72)発明者サン，シュージュンアメリカ合衆国ニューハンプシャー州 03833，ブレントウッド，ピーボディー・ドライブ 43 (72)発明者ロビンソン，ジェフリー・ジェイアメリカ合衆国マサチューセッツ州01913，アムズバリー，ユニコーン・サークル 22 Ｆターム(参考） 4H045 AA20 BA10 BA41 CA40 GA25 GA26

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】試料中の高アニオン性ターゲットタンパク質を試料中の複数の
タンパク性および非タンパク性不純物ならびにＤＮＡ／ヒストン複合体から精製
する方法であって、アニオン性ターゲットタンパク質を支持体に結合させるのに
適した条件下で、荷電分子を可逆的に結合しうる支持体と試料を接触させ、そし
て試料中の複数のタンパク性および非タンパク性不純物は結合しないかまたは支
持体から洗い去られ、一方、高アニオン性ターゲットタンパク質は結合したまま
であり、かつ試料中のＤＮＡ／ヒストン複合体は解離し、これにより試料中の高
アニオン性ターゲットタンパク質が精製される条件下で、高アニオン性ターゲッ
トタンパク質を精製することを含む方法。
【請求項２】ターゲットタンパク質がスルフェート化タンパク質であり、不
純物が低スルフェート化形のターゲットタンパク質を含む、請求項１に記載の方
法。
【請求項３】スルフェート化タンパク質がＰ−セレクチン糖タンパク質リガ
ンド−１またはＰ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１融合タンパク質である
、請求項２に記載の方法。
【請求項４】試料中の高アニオン性ターゲットタンパク質を試料中の複数の
タンパク性および非タンパク性不純物ならびにＤＮＡ／ヒストン複合体から精製
する方法であって、（ａ）荷電分子を可逆的に結合しうる支持体と試料を接触さ
せ、これによりターゲットタンパク質を支持体に結合させ、（ｂ）複数のタンパ
ク性および非タンパク性不純物は結合しないかまたは支持体から洗い去られ、一
方、ターゲットタンパク質は結合したままであるのに適した条件下で、第１洗浄
溶液により支持体を洗浄し、（ｃ）試料を第１溶離溶液で溶離し、その際、第１
溶離溶液は高モル濃度の塩類溶液を含み、そして（ｄ）精製されたアニオン性タ
ーゲットタンパク質を含有する溶離試料を採集することを含む方法。
【請求項５】第１洗浄溶液のｐＨが約４．０〜８．０である、請求項４に記
載の方法。
【請求項６】第１洗浄溶液のｐＨが約６．５である、請求項４に記載の方法
。
【請求項７】支持体から溶離した試料を後続精製する、請求項４に記載の方
法。
【請求項８】後続精製が、（ａ）ターゲットタンパク質を含有する溶離試料
を金属キレートクロマトグラフィーカラムまたは疎水性相互作用クロマトグラフ
ィーカラムに通し、これにより溶離試料をカラムに捕獲し、（ｂ）試料に含有さ
れるＤＮＡ／ヒストン複合体が解離するのに適した条件下で、カラムを第２洗浄
溶液により洗浄し、（ｃ）試料を第２溶離溶液で溶離し、そして（ｄ）精製され
たアニオン性ターゲットタンパク質を含有する溶離試料を採集することを含む、
請求項７に記載の方法。
【請求項９】第２洗浄溶液が高い塩類濃度を含み、第２溶離溶液が第２洗浄
溶液より低い塩類濃度を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】ターゲットタンパク質を含有する溶離試料を疎水性相互作用
クロマトグラフィーカラムに通し、第２洗浄溶液が濃度約４ＭのＮａＣｌおよび
濃度約１．２Ｍの硫酸アンモニウムよりなる群から選択され、第２溶離溶液が濃
度約０．４８Ｍの硫酸アンモニウムである、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】第２洗浄溶液が（ａ）約４ＭのＮａＣｌならびに約２０ｍＭ
およびｐＨ約７．４のトリスを含む溶液、（ｂ）約５％のイソプロパノールおよ
び約１．２Ｍの硫酸アンモニウムを含む溶液、（ｃ）約５％のエタノールおよび
約１．２Ｍの硫酸アンモニウムの溶液、（ｄ）約５％のエタノールおよび約４Ｍ
のＮａＣｌの溶液よりなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】ターゲットタンパク質を含有する溶離試料を金属キレートク
ロマトグラフィーカラムに通し、第２洗浄溶液が約２Ｍの塩類濃度を含み、第２
溶離溶液が約２００ｍＭ〜１Ｍの塩類濃度を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】第２溶離溶液が約１Ｍの塩類濃度を含む、請求項１２に記載
の方法。
【請求項１４】第２洗浄溶液が約４０ｍＭのＭＥＳ、約２ＭのＮａＣｌおよ
び約５ｍＭのイミダゾールを含み、第２溶離溶液が約４０ｍＭのＭＥＳ、約１Ｍ
のＮａＣｌおよび約３５ｍＭのイミダゾールの溶液を含む、請求項１２に記載の
方法。
【請求項１５】ターゲットタンパク質が少なくともほぼ１つのスルフェート
基を有する、請求項４に記載の方法。
【請求項１６】ターゲットタンパク質が少なくともほぼ５つのスルフェート
化を有する、請求項５に記載の方法。
【請求項１７】タンパク質がＰ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１また
はＰ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１融合タンパク質である、請求項４に
記載の方法。
【請求項１８】タンパク質が組換えタンパク質である、請求項４に記載の方
法。
【請求項１９】試料中の免疫グロブリンＦｃドメインを含む高アニオン性タ
ーゲット分子を試料中の複数のタンパク性および非タンパク性不純物ならびにＤ
ＮＡ／ヒストン複合体から精製する方法であって、高アニオン性ターゲット分子
のＦｃ部分を結合しうる支持体と試料を、複数のタンパク性および非タンパク性
不純物は結合しないかまたは支持体から洗い去られ、一方、ターゲットタンパク
質は結合したままであり、かつ試料中のＤＮＡ／ヒストン複合体は解離し、これ
により試料中の高アニオン性ターゲット分子をＤＮＡ／ヒストン複合体から精製
する条件下で、接触させることを含む方法。
【請求項２０】ターゲット分子がスルフェート化タンパク質であり、不純物
が低スルフェート化形のターゲット分子を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】スルフェート化分子がＰ−セレクチン糖タンパク質リガンド
−１融合タンパク質である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１融合タンパク質が
ｒＰＳＧＬ−Ｉｇである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】非タンパク性およびタンパク性不純物を濃度約１ＭのＮａＣ
ｌでカラムから洗い去る、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】非タンパク性およびタンパク性不純物を濃度約１ＭのＮａＣ
ｌでカラムから洗い去り、その際、高アニオン性ターゲット分子がＰ−セレクチ
ン糖タンパク質リガンド−１融合タンパク質である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１融合タンパク質が
ｒＰＳＧＬ−Ｉｇである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】試料中の免疫グロブリンＦｃドメインを含む高アニオン性タ
ーゲット分子を試料中の複数のタンパク性および非タンパク性不純物ならびにＤ
ＮＡ／ヒストン複合体から精製する方法であって、（ａ）高アニオン性ターゲッ
ト分子のＦｃ部分を結合しうる支持体と試料を接触させ、これによりターゲット
免疫グロブリンを支持体に結合させ、（ｂ）試料中の複数のタンパク性および非
タンパク性不純物は結合しないかまたは支持体から洗い去られ、一方、ターゲッ
ト分子は結合したままであるのに適した条件下で、第１洗浄溶液により支持体を
洗浄し、（ｃ）試料を第１溶離溶液で溶離し、その際、第１溶離溶液のｐＨは低
く、そして（ｄ）精製された高アニオン性ターゲット分子を含有する溶離試料を
採集することを含む方法。
【請求項２７】第１溶離溶液のｐＨが約４．０である、請求項２６に記載の
方法。
【請求項２８】精製されたアニオン性ターゲット分子を含有する溶離試料を
後続精製する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】後続精製が、（ａ）精製されたアニオン性ターゲット分子を
含有する溶離試料を、荷電分子を可逆的に結合しうる第２支持体と接触させ、こ
れによりターゲット免疫グロブリンが第２支持体に結合し、（ｂ）第２支持体を
第２洗浄溶液で洗浄し、その際、第２洗浄溶液のｐＨは低く、これにより試料中
のタンパク性および非タンパク性不純物は除去され、（ｃ）試料を第２溶離溶液
で溶離し、そして（ｄ）精製されたアニオン性ターゲット分子を含有する溶離試
料を採集することを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】タンパク性不純物が一部は浸出プロテインＡからなる、請求
項２９に記載の方法。
【請求項３１】第１溶離溶液のｐＨが約４．０である、請求項２９に記載の
方法。
【請求項３２】ターゲット分子が少なくともほぼ１つのスルフェート化を有
する、請求項２６に記載の方法。
【請求項３３】ターゲット分子が少なくともほぼ５つのスルフェート化を有
する、請求項２６に記載の方法。
【請求項３４】分子がＰ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１融合タンパ
ク質である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３５】Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１融合タンパク質が
ｒＰＳＧＬ−Ｉｇである、請求項３４に記載の方法。