CN106715713B

CN106715713B - 试剂盒及其在核酸测序中的用途

Info

Publication number: CN106715713B
Application number: CN201480081856.4A
Authority: CN
Inventors: 耿春雨; 于竞; 祝珍珍; 章文蔚; 李计广; 龚梅花; 蒋慧; 贺玲瑜
Original assignee: MGI Tech Co Ltd
Current assignee: MGI Tech Co Ltd
Priority date: 2014-09-12
Filing date: 2014-09-12
Publication date: 2020-11-03
Anticipated expiration: 2034-09-12
Also published as: EP3192901A4; HK1250758A1; EP3192901A1; US10351848B2; EP3192901B1; CN108138364A; WO2016037418A1; CN108138364B; US20180291371A1; WO2016037361A1; CN106715713A

Abstract

提供了一种试剂盒、一种基于双链DNA制备环状双链DNA的方法、一种制备双链核酸融合分子的方法、一种基于双链DNA片段构建测序文库的方法、一种核酸测序方法、一种基于双链DNA制备环状双链DNA的装置、一种基于双链DNA片段构建测序文库的设备以及一种核酸测序***。

Description

试剂盒及其在核酸测序中的用途

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体的，本发明涉及试剂盒及其在核酸测序中的用途，更具体的，本发明涉及一种试剂盒、一种基于双链DNA制备环状双链DNA的方法、一种制备双链核酸融合分子的方法、一种基于双链DNA片段构建测序文库的方法、一种核酸测序方法、一种基于双链DNA制备环状双链DNA的装置、一种基于双链DNA片段构建测序文库的设备、以及一种核酸测序***。

背景技术

目前市场上第二代DNA测序技术的主要生产商主要有Illumina和LifeTechnologies。这些二代测序技术均是形成构建线性DNA(或cDNA)文库进行文库构建。这些线性文库，不能通过滚环复制形成DNA纳米球(DNA nanoball，DNB)，从而不能用于联合探针锚定连接测序技术(combinatorial probe-anchor ligation，cPAL)进行测序，已知cPAL的准确度是目前最高的。与桥式PCR扩增(Illumina)和乳液PCR扩增(Life Technologies)相比，滚环复制的优势在于扩增引入的错误率更低，并且形成的DNA纳米球直径小，可更有效地利用测序芯片表面积，从而得到更大的数据产出量。

因而，目前构建测序文库的手段仍有待改进。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一或至少提供一种有用的商业选择。为此，本发明的目的在于提出能够有效地用于构建测序文库的手段。

为此，根据本发明的第一方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包括：第一分离的寡核苷酸；第二分离的寡核苷酸；第一引物；以及第二引物，其中，所述第一和第二分离的寡核苷酸分别包括：第一链，所述第一链的5’末端核苷酸具有磷酸基团，并且所述第一链的3’末端核苷酸为双脱氧核苷酸；以及第二链，所述第二链的5’末端核苷酸不具有磷酸基团，并且所述第二链的3’末端核苷酸为双脱氧核苷酸，其中，所述第一链的长度大于所述第二链的长度，并且所述第一链和所述第二链之间形成双链结构，所述第一引物特异性识别所述第一分离的寡核苷酸的第一链，并且所述第一引物中含有尿嘧啶，以及所述第二引物特异性识别所述第二分离的寡核苷酸的第一链，并且所述第二引物中含有尿嘧啶。根据本发明的实施例，该试剂盒中包含有两个寡核苷酸，由于第一和第二寡核苷酸中各自的第一链和第二链的两个末端，即3’末端都为双脱氧核苷酸，因此，第一和第二寡核苷酸都不会发生自身连接。由此，可以将该试剂盒应用于构建测序文库，尤其是应用于cPAL技术，例如CG测序平台，能够有效地提高提高在DNA片段的末端添加接头的效率，从而提高构建测序文库的效率。

在本发明的第二方面，本发明提出了一种基于双链DNA制备环状双链DNA的方法，所述双链DNA片段具有两个平端末端，并且所述双链DNA片段的四个末端核苷酸均不具有磷酸基团，其特征在于，所述方法包括：使所述双链DNA与第一分离的寡核苷酸相连，以便获得第一连接产物；对所述第一连接产物进行第一热变性处理，以便获得第一单链DNA分子；利用第一引物与所述第一单链DNA分子互补配对发生链延伸反应，以便获得链延伸反应产物，其中，所述链延伸反应产物含有一个尿嘧啶；使所述链延伸反应产物与第二分离的寡核苷酸相连，以便获得第二连接产物；利用第二引物使所述第二连接产物发生引物介导的缺口平移和末端连接反应，以便获得第三连接产物，其中，所述第三连接反应产物含有两个尿嘧啶；利用USER酶(Uracil-Specific Excision Reagent)对所述第三连接产物进行切割，以便获得第一切割产物，所述第一切割产物含有两个缺口；以及使所述第一切割产物发生环化反应，以便获得所述环状双链DNA，其中一条链有碱基缺失，任选地所述碱基缺失的长度为1nt，其中，所述第一和第二分离的寡核苷酸分别包括：第一链，所述第一链的5’末端核苷酸具有磷酸基团，并且所述第一链的3’末端核苷酸为双脱氧核苷酸；以及第二链，所述第二链的5’末端核苷酸不具有磷酸基团，并且所述第二链的3’末端核苷酸为双脱氧核苷酸，其中，所述第一链的长度大于所述第二链的长度，并且所述第一链和所述第二链之间形成双链结构，所述第一引物特异性识别所述第一分离的寡核苷酸的第一链，并且所述第一引物中含有尿嘧啶，所述第二引物特异性识别所述第二分离的寡核苷酸的第一链，并且所述第二引物中含有尿嘧啶。发明人发现，通过该方法能够有效地制备环状双链DNA，该环状双链DNA可以用于构建适合cPAL技术的测序文库，例如CG测序平台。另外，前面针对试剂盒所描述的优点和技术特征，仍适用于本方法，在此不再赘述。

在本发明的第三方面，本发明提出了一种制备双链核酸融合分子的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：提供第一双链DNA片段，所述双链DNA片段具有两个平端末端，并且所述双链DNA片段的四个末端核苷酸均不具有磷酸基团，将所述第一双链DNA片段与寡核苷酸相连，以便获得第一连接产物；对所述第一连接产物进行第一热变性处理，以便获得第一单链DNA分子；以及利用引物与所述第一单链DNA分子互补配对发生链延伸反应，以便获得第一链延伸反应产物，其中，所述第一链延伸反应产物构成所述双链核酸融合分子，其中，所述寡核苷酸包括：第一链，所述第一链的5’末端核苷酸具有磷酸基团，并且所述第一链的3’末端核苷酸为双脱氧核苷酸；以及第二链，所述第二链的5’末端核苷酸不具有磷酸基团，并且所述第二链的3’末端核苷酸为双脱氧核苷酸，其中，所述第一链的长度大于所述第二链的长度，并且所述第一链和所述第二链之间形成双链结构，所述引物特异性识别所述寡核苷酸的第一链。发明人惊奇地发现，该方法能够有效地制备双链核酸融合分子，并且由于寡核苷酸的特殊结构以及双链DNA片段的结构性质，有效减少了不期望连接反应的发生几率，因此，构建双链核酸融合分子的效率能够有效地得到提高。另外，该双链核酸融合分子能够有效地应用于构建适合cPAL技术的测序文库，例如CG测序平台。另外，前面针对试剂盒所描述的优点和技术特征，仍适用于本方法，在此不再赘述。

在本发明第四方面，本发明提出了一种基于双链DNA片段构建测序文库的方法，所述双链DNA片段具有两个平端末端，并且所述双链DNA片段的四个末端核苷酸均不具有磷酸基团。根据本发明的实施例，该方法包括：根据前面所描述的方法，基于所述双链DNA制备双链环状DNA，其中，在所述双链环状DNA中包括第一接头，所述第一接头中包括III型内切酶识别位点以及碱基缺失，其中，所述第一接头是基于所述第一分离的寡核苷酸和第二分离的寡核苷酸形成的，任选地所述碱基缺失的长度为1nt；利用III型内切酶对所述双链环状DNA进行酶切，以便获得第二切割产物；对所述第二切割产物进行末端补平和去磷酸化处理，以便获得平端双链DNA片段；使所述平端双链DNA片段与第三分离的寡核苷酸相连，以便获得第四连接产物；对所述第四连接产物进行缺口平移反应并且在3’末端形成碱基A，以便获得具有3’碱基A的第四连接产物；使所述具有3’碱基A的第四连接产物与第四分离的寡核苷酸相连，以便获得第五连接产物；利用第三引物和第四引物对所述第五连接产物进行引物介导的缺口平移和连接反应，形成第六连接产物；利用第五引物和第六引物对第六连接产物进行扩增，以便获得扩增产物，其中所述扩增产物的一条链上携带生物素；从所述扩增产物分离单链DNA片段；以及将所述单链DNA片段进行环化，以便获得单链DNA环，所述单链DNA环构成所述测序文库，其中，所述第三分离的寡核苷酸包括：第一链，所述第一链的5’末端核苷酸具有磷酸基团，并且所述第一链的3’末端核苷酸为双脱氧核苷酸；以及第二链，所述第二链的5’末端核苷酸不具有磷酸基团，并且所述第二链的3’末端核苷酸为双脱氧核苷酸，所述第一链的长度大于所述第二链的长度，并且所述第一链和所述第二链之间形成双链结构，所述第四分离的寡核苷酸包括：第一链，所述第一链的5’末端核苷酸具有磷酸基团，并且所述第一链的3’末端核苷酸为双脱氧核苷酸；以及第二链，所述第二链的5’末端核苷酸不具有磷酸基团，并且所述第二链的3’末端为突出的为双脱氧胸腺嘧啶，所述第一链的长度大于所述第二链的长度，并且所述第一链和所述第二链之间形成双链结构，所述第三引物具有与所述第三分离的寡核苷酸的第一链匹配的序列，所述第四引物具有与所述第四分离的寡核苷酸的第一链匹配的序列，所述第五引物具有与所述第三引物相同的序列，所述第六引物具有与所述第四引物相同的序列，并且具有一个额外的生物素，所述单链DNA环中包括第二接头，所述第二接头是基于所述第三分离的寡核苷酸和第四分离的寡核苷酸形成的。由此，根据本发明的实施例，能够有效地制备适合cPAL技术的具有双接头的测序文库，例如CG测序平台。另外，前面针对试剂盒以及基于双链DNA制备双链环状DNA的方法所描述的技术特征和优点，仍然适用该方法，在此不再赘述。

在本发明的第五方面，本发明提出了一种核酸测序方法。根据本发明的实施例，该方法包括：根据前面所述的方法，构建测序文库；以及对所述测序文库进行测序。如前所述，根据本发明的构建测序文库的方法，能够有效地提高构建测序文库的效率。从而该核酸测序方法能够有效地提高测序的效率。

另外，根据本发明的实施例，本发明还提出了可以实施上述方法的装置。由此，

在本发明的第六方面，提出了一种基于双链DNA制备环状双链DNA的装置，所述双链DNA片段具有两个平端末端，并且所述双链DNA片段的四个末端核苷酸均不具有磷酸基团，根据本发明的实施例，该装置包括：第一连接单元，所述第一连接单元用于使所述双链DNA与第一分离的寡核苷酸相连，以便获得第一连接产物；第一热变性单元，所述第一热变性单元用于对所述第一连接产物进行第一热变性处理，以便获得第一单链DNA分子；链延伸单元，所述链延伸单元用于利用第一引物与所述第一单链DNA分子互补配对发生链延伸反应，以便获得第一链延伸反应产物，其中，所述第一链延伸反应产物含有一个尿嘧啶；第二连接单元，所述第二连接单元用于使所述第一链延伸反应产物与第二分离的寡核苷酸相连，以便获得第二连接产物；第三连接单元，所述第三连接单元利用第二引物使所述第二单链DNA分子发生引物介导的缺口平移和末端连接反应，以便获得第三连接产物，其中，所述第三连接反应产物含有两个尿嘧啶；第一切割单元，所述切割单元用于利用USER酶(Uracil-Specific Excision Reagent)对所述第三连接产物进行切割，以便获得第一切割产物，所述第一切割产物含有两个缺口；以及第一环化单元，所述第一环化单元用于使所述含有两个缺口的切割产物发生环化反应，以便获得所述环状双链DNA，任选地所述环状双链DNA中具有碱基缺失，任选地所述碱基缺失的长度为1nt；其中，所述第一和第二分离的寡核苷酸分别包括：第一链，所述第一链的5’末端核苷酸具有磷酸基团，并且所述第一链的3’末端核苷酸为双脱氧核苷酸；以及第二链，所述第二链的5’末端核苷酸不具有磷酸基团，并且所述第二链的3’末端核苷酸为双脱氧核苷酸，其中，所述第一链的长度大于所述第二链的长度，并且所述第一链和所述第二链之间形成双链结构，所述第一引物特异性识别所述第一和第二分离的寡核苷酸之一的第一链，并且所述第一引物中含有尿嘧啶，所述第二引物特异性识别所述第一和第二分离的寡核苷酸另一个的第一链，并且所述第二引物中含有尿嘧啶。

在本发明的第七方面，提出一种基于双链DNA片段构建测序文库的设备，所述双链DNA片段具有两个平端末端，并且所述双链DNA片段的四个末端核苷酸均不具有磷酸基团，该方法包括：前述的基于双链DNA制备环状双链DNA的装置，用于基于所述双链DNA制备双链环状DNA，其中，在所述双链环状DNA中包括第一接头，所述第一接头中包括III型内切酶识别位点以及碱基缺失，其中，所述第一接头是基于所述第一分离的寡核苷酸和第二分离的寡核苷酸形成的，任选地所述碱基缺失的长度为1nt；酶切装置，所述酶切装置利用III型内切酶对所述双链环状DNA进行酶切，以便获得第二切割产物；第一末端处理装置，所述末端处理装置用于对所述第二切割产物进行末端补平和去磷酸化处理，以便获得平端双链DNA片段；第一连接装置，所述连接装置用于使所述平端双链DNA片段与第三分离的寡核苷酸相连，以便获得第四连接产物；第二末端处理装置，所述第二末端处理装置用于对所述第四连接产物进行缺口平移反应并且在3’末端形成碱基A，以便获得具有3’碱基A的第四连接产物；第二连接装置，所述连接装置用于使所述具有3’碱基A的第四连接产物与第四分离的寡核苷酸相连，以便获得第五连接产物；第三连接装置，所述第三连接装置用于利用第三引物和第四引物对所述第五连接产物进行引物依赖的缺口平移和连接反应，形成第六连接产物，扩增装置，所述扩增装置用于利用第五引物和第六引物对所述第六连接产物进行扩增，其中所述扩增产物的一条链上携带生物素；单链DNA片段分离装置，所述单链DNA片段分离装置用于从所述扩增产物分离单链DNA片段；以及环化装置，所述环化装置用于将所述单链DNA片段进行环化，以便获得单链DNA环，所述单链DNA环构成所述测序文库，其中，所述第三分离的寡核苷酸包括：第一链，所述第一链的5’末端核苷酸具有磷酸基团，并且所述第一链的3’末端核苷酸为双脱氧核苷酸；以及第二链，所述第二链的5’末端核苷酸不具有磷酸基团，并且所述第二链的3’末端核苷酸为双脱氧核苷酸，所述第一链的长度大于所述第二链的长度，并且所述第一链和所述第二链之间形成双链结构，所述第四分离的寡核苷酸包括：第一链，所述第一链的5’末端核苷酸具有磷酸基团，并且所述第一链的3’末端核苷酸为双脱氧核苷酸；以及第二链，所述第二链的5’末端核苷酸不具有磷酸基团，并且所述第二链的3’末端为突出的为双脱氧胸腺嘧啶，所述第一链的长度大于所述第二链的长度，并且所述第一链和所述第二链之间形成双链结构，所述第三引物具有与所述第三分离的寡核苷酸的第一链匹配的序列，所述第四引物具有与所述第四分离的寡核苷酸的第一链匹配的序列，所述第五引物具有与所述第三引物相同的序列，所述第六引物具有与所述第四引物相同的序列并且具有一个额外的生物素，所述单链DNA环中包括第二接头，所述第二接头是基于所述第三分离的寡核苷酸和第四分离的寡核苷酸形成的。

本发明的第八方面，提供了一种核酸测序***，该***包括：根据前述的针对双链DNA片段构建测序文库的设备；以及测序设备，所述测序设备用于对所述测序文库进行测序。

根据本发明的实施例，所述测序设备为CG测序平台。另外，前面针对试剂盒、基于双链DNA制备双链环状DNA的方法以及基于双链DNA片段构建测序文库的方法或装置所描述的技术特征和优点，仍然适用该***，在此不再赘述。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1是本发明的一个实施例中的全外显子文库构建流程图；

图2是本发明的一个实施例中的文库结构组成以及测序方向示意图；

图3是本发明的一个实施例中的方向性的加入接头A的5’端臂(arm，片段)到目的片段的一端的步骤的示意图，5’PO4和3’OH表示可正常延伸的DNA片段，5’OH&3’ddN表示5’端去磷酸化及3’端双脱氧，不可正常延伸的DNA片段；

图4是本发明的一个实施例中的方向性的加入接头A的3’端臂(arm，片段)到目的片段的一端的步骤的示意图，5’PO4&3’OH表示可正常延伸的DNA片段，5’OH&3’ddN表示5’端去磷酸化及3’端双脱氧，不可正常延伸的DNA片段；

图5是本发明的一个实施例中的第一次环化形成双链环状DNA分子示意图；

图6是本发明的一个实施例中的酶切反应示意图；

图7是本发明的一个实施例中的方向性加入接头B步骤示意图；

图8是本发明的一个实施例中的样本经过两次磁珠片段选择后的DNA电泳结果图；

图9是本发明的一个实施例中的基于双接头的单链环状外显子捕获文库6％PAGE胶电泳检测结果示意图，使用的marker ladder为lowrange DNA ladder(massruler)；

图10是本发明的一个实施例的基于双接头的单链环状外显子捕获文库的单碱基深度分布图；

图11是本发明的一个实施例中的基于双链DNA制备环状双链DNA的步骤的流程图；

图12是本发明的一个实施例中的制备双链核酸融合分子的步骤流程图；

图13是本发明的一个实施例中的基于双链DNA片段构建测序文库的步骤示意图；

图14是本发明的一个实施例中获得双链DNA片段的步骤示意图；

图15是本发明的一个实施例中的基于双链DNA制备环状双链DNA的装置的结构示意图；

图16是本发明的一个实施例中的基于双链DNA片段构建测序文库的设备的结构示意图；

图17是本发明的一个实施例中的DNA获取装置的结构示意图；

图18是本发明的一个实施例中的DNA获取装置的结构示意图；

图19是本发明的一个实施例中的单链DNA片段分离装置的结构示意图。

具体实施方式

根据本发明的第一方面，本发明提供了一种试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包括：第一分离的寡核苷酸；第二分离的寡核苷酸；第一引物；以及第二引物，其中，所述第一和第二分离的寡核苷酸分别包括：第一链，所述第一链的5’末端核苷酸具有磷酸基团，并且所述第一链的3’末端核苷酸为双脱氧核苷酸；以及第二链，所述第二链的5’末端核苷酸不具有磷酸基团，并且所述第二链的3’末端核苷酸为双脱氧核苷酸，其中，所述第一链的长度大于所述第二链的长度，并且所述第一链和所述第二链之间形成双链结构，所述第一引物特异性识别所述第一分离的寡核苷酸的第一链，并且所述第一引物中含有尿嘧啶，以及所述第二引物特异性识别所述第二分离的寡核苷酸的第一链，并且所述第二引物中含有尿嘧啶。根据本发明的实施例，该试剂盒中包含有两个寡核苷酸，由于第一和第二寡核苷酸中各自的第一链和第二链的两个末端，即3’末端都为双脱氧核苷酸，因此，第一和第二寡核苷酸都不会发生自身连接。由此，可以将该试剂盒应用于构建测序文库，尤其是应用于cPAL技术，例如CG测序平台，能够有效地提高提高在DNA片段的末端添加接头的效率，从而提高构建测序文库的效率。

在本发明的一个实施例中，所述第一和第二分离的寡核苷酸分别包括一个III型内切酶的识别位点，优选地所述III型内切酶为EcoP15I。由此，可以后续通过采用III型内切酶进行切割，便于在测序文库的构建过程中，再添加其他的接头，从而可以进一步提高在DNA片段的末端添加接头的效率，进一步提高构建测序文库的效率。

在本发明的一个实施例中，所述第一和第二分离的寡核苷酸的至少之一包括：第一突出端，所述第一突出端位于所述第一链的3’端；以及任选的第二突出端，所述第二突出端位于所述第二链的3’端。在本发明的一个实施例中，所述第一突出端的长度大于所述第二突出端的长度。在本发明的一个实施例中，所述第一突出端的长度为大约6～12nt。在本发明的一个实施例中，所述第二突出端的长度为大约0～4nt。由此，可以进一步提高在构建测序文库时，DNA片段与寡核苷酸之间的连接准确性，从而可以进一步提高在DNA片段的末端添加接头的效率，进一步提高构建测序文库的效率。

在本发明的一个实施例中，所述第一分离的寡核苷酸、第二分离的寡核苷酸、第一引物以及第二引物均为DNA。由此，可以有效地提高试剂盒的使用效率。

在本发明的一个实施例中，在所述第一分离的寡核苷酸和所述第二分离的寡核苷酸的每一个中，所述第一链的长度为大约20～50nt，可选地为45nt。在本发明的一个实施例中，在所述第一分离的寡核苷酸和所述第二分离的寡核苷酸的每一个中，所述第二链的长度为大约10～15nt，可选地为11nt。由此，可以进一步提高在构建测序文库时，DNA片段与寡核苷酸之间的连接准确性，从而可以进一步提高在DNA片段的末端添加接头的效率，进一步提高构建测序文库的效率。

在本发明的一个实施例中，进一步包括：分离的第三寡核苷酸，分离的第四寡核苷酸，第三引物，以及第四引物，其中，所述第三分离的寡核苷酸包括：第一链，所述第一链的5’末端核苷酸具有磷酸基团，并且所述第一链的3’末端核苷酸为双脱氧核苷酸；以及第二链，所述第二链的5’末端核苷酸不具有磷酸基团，并且所述第二链的3’末端核苷酸为双脱氧核苷酸，所述第一链的长度大于所述第二链的长度，并且所述第一链和所述第二链之间形成双链结构，所述第四分离的寡核苷酸包括：第一链，所述第一链的5’末端核苷酸具有磷酸基团，并且所述第一链的3’末端核苷酸为双脱氧核苷酸；以及第二链，所述第二链的5’末端核苷酸不具有磷酸基团，并且所述第二链的3’末端为突出的为双脱氧胸腺嘧啶，所述第一链的长度大于所述第二链的长度，并且所述第一链和所述第二链之间形成双链结构，所述第三引物具有与所述第三分离的寡核苷酸的第一链匹配的序列，以及所述第四引物具有与所述第四分离的寡核苷酸的第一链匹配的序列。根据本发明的实施例，能够有效地引入另外的接头。从而可以进一步提高在DNA片段的末端添加接头的效率，进一步提高构建测序文库的效率。

在本发明的一个实施例中，所述第一寡核苷酸的第一链的序列为：5’ACTGCTGACGTACTG(N)mAGCACGAGACGTTCTCGACA3’，其中，N代表A、T、G或C，m为大约0～15的整数，所述第一寡核苷酸的第二链的序列为5’TACGTCAGCAG3’,所述第二寡核苷酸的第一链的序列为5’TCTGCTGAGTCGAGAACGT3’，所述第二寡核苷酸的第二链的序列为5’CGACTCAGCAG3’，第一引物的序列为5’GTCGAGAACGUCTCGTGCT3’，第二引物的序列为5’ACGTTCTCGACUCAGCAGA3’,所述第三分离的寡核苷酸的第一链的序列为5’GCTTCGACTGGAGA3’,所述第三分离的寡核苷酸的第二链的序列为5’GTCTCCAGTCGAAGCCCGACG3’,所述第四分离的寡核苷酸的第一链的序列为5’AGTCGGAGGCCAAGCGGTCGT3’,所述第四分离的寡核苷酸的第二链的序列为5’TTGGCCTCCGACT3’,所述第三引物的序列为5’TCCTAAGAC CGCTTGGCCTCCGACT 3’；以及所述第四引物的序列为5’AGACAAGCTCGAGCTCGAGCGATCGGGCTTCGACTGGAGAC3’。在本发明的一个实施例中，m为10。从而可以进一步提高在DNA片段的末端添加接头的效率，进一步提高构建测序文库的效率。

在本发明的一个实施例中，进一步包括单链核酸分子，所述单链核酸分子的序列为5’TCGAGCTTGTCTTCCTAAGACCGC3’。由此，利用该单链核酸分子能够有效地辅助形成单链环状DNA，从而可以进一步提高构建测序文库的效率。

在本发明的第二方面，本发明提出了一种基于双链DNA制备环状双链DNA的方法，所述双链DNA片段具有两个平端末端，并且所述双链DNA片段的四个末端核苷酸均不具有磷酸基团，如图11所示，该方法包括：使所述双链DNA与第一分离的寡核苷酸相连，以便获得第一连接产物；对所述第一连接产物进行第一热变性处理，以便获得第一单链DNA分子；利用第一引物与所述第一单链DNA分子互补配对发生链延伸反应，以便获得链延伸反应产物，其中，所述链延伸反应产物含有一个尿嘧啶；使所述链延伸反应产物与第二分离的寡核苷酸相连，以便获得第二连接产物；利用第二引物使所述第二连接产物发生引物介导的缺口平移和末端连接反应，以便获得第三连接产物，其中，所述第三连接反应产物含有两个尿嘧啶；利用USER酶(Uracil-Specific Excision Reagent)对所述第三连接产物进行切割，以便获得第一切割产物，所述第一切割产物含有两个缺口；以及使所述第一切割产物发生环化反应，以便获得所述环状双链DNA，其中一条链有碱基缺失，任选地所述碱基缺失的长度为1nt，其中，所述第一和第二分离的寡核苷酸分别包括：第一链，所述第一链的5’末端核苷酸具有磷酸基团，并且所述第一链的3’末端核苷酸为双脱氧核苷酸；以及第二链，所述第二链的5’末端核苷酸不具有磷酸基团，并且所述第二链的3’末端核苷酸为双脱氧核苷酸，其中，所述第一链的长度大于所述第二链的长度，并且所述第一链和所述第二链之间形成双链结构，所述第一引物特异性识别所述第一分离的寡核苷酸的第一链，并且所述第一引物中含有尿嘧啶，所述第二引物特异性识别所述第二分离的寡核苷酸的第一链，并且所述第二引物中含有尿嘧啶。发明人发现，通过该方法能够有效地制备环状双链DNA，该环状双链DNA可以用于构建适合cPAL技术的测序文库，例如CG测序平台。另外，前面针对试剂盒所描述的优点和技术特征，仍适用于本方法，在此不再赘述。

在本发明的第三方面，本发明提出了一种制备双链核酸融合分子的方法。根据本发明的实施例，如图12所示，该方法包括：提供第一双链DNA片段，所述双链DNA片段具有两个平端末端，并且所述双链DNA片段的四个末端核苷酸均不具有磷酸基团，将所述第一双链DNA片段与寡核苷酸相连，以便获得第一连接产物；对所述第一连接产物进行第一热变性处理，以便获得第一单链DNA分子；以及利用引物与所述第一单链DNA分子互补配对发生链延伸反应，以便获得第一链延伸反应产物，其中，所述第一链延伸反应产物构成所述双链核酸融合分子，其中，所述寡核苷酸包括：第一链，所述第一链的5’末端核苷酸具有磷酸基团，并且所述第一链的3’末端核苷酸为双脱氧核苷酸；以及第二链，所述第二链的5’末端核苷酸不具有磷酸基团，并且所述第二链的3’末端核苷酸为双脱氧核苷酸，其中，所述第一链的长度大于所述第二链的长度，并且所述第一链和所述第二链之间形成双链结构，所述引物特异性识别所述寡核苷酸的第一链。发明人惊奇地发现，该方法能够有效地制备双链核酸融合分子，并且由于寡核苷酸的特殊结构以及双链DNA片段的结构性质，有效减少了不期望连接反应的发生几率，因此，构建双链核酸融合分子的效率能够有效地得到提高。另外，该双链核酸融合分子能够有效地应用于构建适合cPAL技术的测序文库，例如CG测序平台。另外，前面针对试剂盒所描述的优点和技术特征，仍适用于本方法，在此不再赘述。

在本发明第四方面，本发明提出了一种基于双链DNA片段构建测序文库的方法，所述双链DNA片段具有两个平端末端，并且所述双链DNA片段的四个末端核苷酸均不具有磷酸基团。根据本发明的实施例，如图13所示，该方法包括：根据前面所描述的方法，基于所述双链DNA制备双链环状DNA，其中，在所述双链环状DNA中包括第一接头，所述第一接头中包括III型内切酶识别位点以及碱基缺失，其中，所述第一接头是基于所述第一分离的寡核苷酸和第二分离的寡核苷酸形成的，任选地所述碱基缺失的长度为1nt；利用III型内切酶对所述双链环状DNA进行酶切，以便获得第二切割产物；对所述第二切割产物进行末端补平和去磷酸化处理，以便获得平端双链DNA片段；使所述平端双链DNA片段与第三分离的寡核苷酸相连，以便获得第四连接产物；对所述第四连接产物进行缺口平移反应并且在3’末端形成碱基A，以便获得具有3’碱基A的第四连接产物；使所述具有3’碱基A的第四连接产物与第四分离的寡核苷酸相连，以便获得第五连接产物；利用第三引物和第四引物对所述第五连接产物进行引物介导的缺口平移和连接反应，形成第六连接产物；利用第五引物和第六引物对第六连接产物进行扩增，以便获得扩增产物，其中所述扩增产物的一条链上携带生物素；从所述扩增产物分离单链DNA片段；以及将所述单链DNA片段进行环化，以便获得单链DNA环，所述单链DNA环构成所述测序文库，其中，所述第三分离的寡核苷酸包括：第一链，所述第一链的5’末端核苷酸具有磷酸基团，并且所述第一链的3’末端核苷酸为双脱氧核苷酸；以及第二链，所述第二链的5’末端核苷酸不具有磷酸基团，并且所述第二链的3’末端核苷酸为双脱氧核苷酸，所述第一链的长度大于所述第二链的长度，并且所述第一链和所述第二链之间形成双链结构，所述第四分离的寡核苷酸包括：第一链，所述第一链的5’末端核苷酸具有磷酸基团，并且所述第一链的3’末端核苷酸为双脱氧核苷酸；以及第二链，所述第二链的5’末端核苷酸不具有磷酸基团，并且所述第二链的3’末端为突出的为双脱氧胸腺嘧啶，所述第一链的长度大于所述第二链的长度，并且所述第一链和所述第二链之间形成双链结构，所述第三引物具有与所述第三分离的寡核苷酸的第一链匹配的序列，所述第四引物具有与所述第四分离的寡核苷酸的第一链匹配的序列，所述第五引物具有与所述第三引物相同的序列，所述第六引物具有与所述第四引物相同的序列，并且具有一个额外的生物素，所述单链DNA环中包括第二接头，所述第二接头是基于所述第三分离的寡核苷酸和第四分离的寡核苷酸形成的。由此，根据本发明的实施例，能够有效地制备适合cPAL技术的具有双接头的测序文库，例如CG测序平台。另外，前面针对试剂盒以及基于双链DNA制备双链环状DNA的方法所描述的技术特征和优点，仍然适用该方法，在此不再赘述。

根据本发明的实施例，上述方法还可以具有下列附加技术特征：

在本发明的一个实施例中，如图14所示，所述双链DNA片段是通过下列步骤获得的：对DNA样本进行片段化，以便获得片段化产物；对所述片段化产物进行去磷酸化处理，以便获得去磷酸化处理的片段化产物；以及对所述经过去磷酸化处理的片段化产物进行末端修复处理，以便获得所述双链DNA片段。在本发明的一个实施例中，所述DNA样本为基因组DNA的至少一部分或者RNA的反转录产物。在本发明的一个实施例中，在进行所述去磷酸化处理之前，预先对所述片段化产物进行磁珠纯化。由此，可以进一步提高获得双链DNA片段的效率，从而进一步提高构建测序文库的效率。

在本发明的一个实施例中，从所述扩增产物分离单链DNA片段是通过下列步骤进行的：使所述扩增产物与磁珠接触，以便形成磁珠-DNA复合物，其中，所述磁珠上连接有链霉亲和素；将所述磁珠-DNA复合物与pH高于7的溶液接触，以便获得所述单链DNA片段，以及任选地进一步包括：利用杂交寡核苷酸对不含有生物素的单链DNA进行捕获。由此，可以进一步提高分离单链DNA片段的效率，从而进一步提高构建测序文库的效率。

在本发明的一个实施例中，所述pH高于7的溶液为氢氧化钠溶液。由此，可以进一步提高分离单链DNA片段的效率，从而进一步提高构建测序文库的效率。

在本发明的一个实施例中，所述氢氧化钠溶液的浓度为大约2M以下。由此，可以进一步提高分离单链DNA片段的效率，从而进一步提高构建测序文库的效率。

在本发明的一个实施例中，所述氢氧化钠溶液的浓度为大约0.1M。由此，可以进一步提高分离单链DNA片段的效率，从而进一步提高构建测序文库的效率。

在本发明的一个实施例中，通过采用单链核酸分子将所述单链DNA片段进行环化，其中，所述单链核酸分子上限定出第一区段和第二区段，并且所述第一区段能够与包含所述单链DNA片段的5’末端核苷酸和3’末端核苷酸的序列之一匹配，所述第二区段能够与包含所述单链DNA片段的5’末端核苷酸和3’末端核苷酸的另一序列匹配。由此，可以进一步提高单链DNA片段环化的效率，从而进一步提高构建测序文库的效率。

在本发明的一个实施例中，所述第一区段和所述第二区段是毗邻连接的。由此，可以进一步提高单链DNA片段环化的效率，从而进一步提高构建测序文库的效率。

在本发明的一个实施例中，所述单链核酸分子具有5’TCGAGCTTGTCTTCCTAAGACCGC3’的序列，所述第三分离的寡核苷酸的第一链具有5’GCTTCGACTGGAGA3’的序列；所述第三分离的寡核苷酸的第二链具有5’GTCTCCAGTCGAAGCCCGACG3’的序列；所述第四分离的寡核苷酸的第一链具有5’AGTCGGAGGCCAAGCGGTCGT3’的序列；所述第四分离的寡核苷酸的第二链具有5’TTGGCCTCCGACT3’的序列；所述第三引物具有5’TCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACT3’的序列；以及所述第四引物具有5’AGACAAGCTCGAGCTCGAGCGATCGGGCTTCGACTGGAGAC3’的序列。由此，可以进一步提高构建测序文库的方法。

本发明的这一方面的基于双链DNA片段构建测序文库的方法，可用于构建全基因组、全外显子、Gene panel(基因面板，靶定的基因或区域)以及反转的cDNA文库等。在本发明的一个实施例中，全外显子文库构建过程如图1所示，最终形成的单链环状文库，文库的结构组成以及测序方向如图2所示。

本发明这一方面的方法提供了一种与现在市面上通用的线性文库构建方法完全不同的单链环状文库制备技术，用这种技术构建的文库可进行超高通量的核酸测序，获得巨大的数据产量，降低测序成本，数据质量与信息分析结果均良好。此方法中间步骤采用的许多方法设计巧妙，构思精良，除了可以为制备高质量文库奠定基础外，对其它类型的文库构建优化及应用也具有启发和指导意义。本发明的这一方法的主要优点有：两步磁珠片段选择的方法不仅可以避免繁琐的切胶进行片段选择，更节约了成本，还可进行自动化操作，省时省力高通量；方向性接头的设计和接头的分步定向连接，不仅可以巧妙灵活的进行接头序列引入，更有效的避免了接头自连以及目的片段自身的自连；设计的含有尿嘧啶的引物，保证了双链DNA分子酶切时产生粘性末端，高效介导了后续的双链DNA环化；Ecop15I酶切的方法获得测序时***片段；单链核酸分子环化，可高效的进行单链核酸环化，为后续滚环扩增提供了高质量的模板。在基因组DNA进行打断后，两步磁珠片段选择法可简单高效的进行目的片段筛选。接下来进行的目的片段去磷酸化步骤，目的核酸片段经过去磷酸化的末端封闭处理和末端补平后，成为了两端5’端封闭的平末端片段，完全避免了片段间相互作用的发生，使连接前片段的利用率得到了极高的保证。方向性接头设计的巧妙之处在于灵活的进行末端封闭封闭修饰，保证了每个接头每个臂(Arm，第一和/或第二分离的寡核苷酸)的连接均为与目的片段单链连接，再通过引物延伸或缺口平移/连接反应完成完整的双链接头连接。解决了文库构建或接头连接反应中让实验人员深为困扰的接头自连问题。通过设计含有尿嘧啶的引物形成粘性末端，引导双链环化，保证了双链环化的效率。设计的接头中含有Ecop15I酶切位点，通过Ecop15I酶切，获得测序所需的两段25-27bp序列***片段，这种***片段的引入方式与目前通用的文库构建流程中片段引入方式均不相同。单链环制备的方法可为高通量测序中使用的DNB(DNA nanoballs)的制备提供基础。本发明提供的实施例涉及的各实验步骤均经过最佳条件的摸索，试验了不同样品并进行多次重复实验，最终文库制备结果与相同样本的其他测序所得结果进行比较，并且进行了稳定性和可重复性验证。本发明的数据结果与其他建库测序技术的数据相关性非常高，重复性很好，均证实了本发明的效果和真实可靠性。

本发明这一方面的方法可用于所有类型DNA，包括RNA反转录得到的cDNA，可用于进行全基因组、全外显子、gene panel及cDNA测序等，能用于利用单链环状文库进行测序的基因测序平台，如Complete Genomcis测序平台，效果好，通量高；其中的方法和思路同样也可应用于其它需要制备单链环状DNA分子的方法、装置或***。

根据本发明的实施例，采用CG测序平台，对所述测序文库进行测序。从而能够进一步提高测序的效率。

在本发明的第六方面，提出了一种基于双链DNA制备环状双链DNA的装置，所述双链DNA片段具有两个平端末端，并且所述双链DNA片段的四个末端核苷酸均不具有磷酸基团，根据本发明的实施例，如图15所示，该装置包括：第一连接单元，所述第一连接单元用于使所述双链DNA与第一分离的寡核苷酸相连，以便获得第一连接产物；第一热变性单元，所述第一热变性单元用于对所述第一连接产物进行第一热变性处理，以便获得第一单链DNA分子；链延伸单元，所述链延伸单元用于利用第一引物与所述第一单链DNA分子互补配对发生链延伸反应，以便获得第一链延伸反应产物，其中，所述第一链延伸反应产物含有一个尿嘧啶；第二连接单元，所述第二连接单元用于使所述第一链延伸反应产物与第二分离的寡核苷酸相连，以便获得第二连接产物；第三连接单元，所述第三连接单元利用第二引物使所述第二单链DNA分子发生引物介导的缺口平移和末端连接反应，以便获得第三连接产物，其中，所述第三连接反应产物含有两个尿嘧啶；第一切割单元，所述切割单元用于利用USER酶(Uracil-Specific Excision Reagent)对所述第三连接产物进行切割，以便获得第一切割产物，所述第一切割产物含有两个缺口；以及第一环化单元，所述第一环化单元用于使所述含有两个缺口的切割产物发生环化反应，以便获得所述环状双链DNA，任选地所述环状双链DNA中具有碱基缺失，任选地所述碱基缺失的长度为1nt；其中，所述第一和第二分离的寡核苷酸分别包括：第一链，所述第一链的5’末端核苷酸具有磷酸基团，并且所述第一链的3’末端核苷酸为双脱氧核苷酸；以及第二链，所述第二链的5’末端核苷酸不具有磷酸基团，并且所述第二链的3’末端核苷酸为双脱氧核苷酸，其中，所述第一链的长度大于所述第二链的长度，并且所述第一链和所述第二链之间形成双链结构，所述第一引物特异性识别所述第一和第二分离的寡核苷酸之一的第一链，并且所述第一引物中含有尿嘧啶，所述第二引物特异性识别所述第一和第二分离的寡核苷酸另一个的第一链，并且所述第二引物中含有尿嘧啶。

根据本发明的实施例，所述第一和第二分离的寡核苷酸分别包括一个III型内切酶的识别位点，所述III型内切酶为EcoP15I。另外，前面针对试剂盒以及基于双链DNA制备双链环状DNA的方法所描述的技术特征和优点，仍然适用该装置，在此不再赘述。

根据本发明的第七方面，提出一种基于双链DNA片段构建测序文库的设备，所述双链DNA片段具有两个平端末端，并且所述双链DNA片段的四个末端核苷酸均不具有磷酸基团，如图16所示，该装置包括：前述的基于双链DNA制备环状双链DNA的装置，用于基于所述双链DNA制备双链环状DNA，其中，在所述双链环状DNA中包括第一接头，所述第一接头中包括III型内切酶识别位点以及碱基缺失，其中，所述第一接头是基于所述第一分离的寡核苷酸和第二分离的寡核苷酸形成的，任选地所述碱基缺失的长度为1nt；酶切装置，所述酶切装置利用III型内切酶对所述双链环状DNA进行酶切，以便获得第二切割产物；第一末端处理装置，所述末端处理装置用于对所述第二切割产物进行末端补平和去磷酸化处理，以便获得平端双链DNA片段；第一连接装置，所述连接装置用于使所述平端双链DNA片段与第三分离的寡核苷酸相连，以便获得第四连接产物；第二末端处理装置，所述第二末端处理装置用于对所述第四连接产物进行缺口平移反应并且在3’末端形成碱基A，以便获得具有3’碱基A的第四连接产物；第二连接装置，所述连接装置用于使所述具有3’碱基A的第四连接产物与第四分离的寡核苷酸相连，以便获得第五连接产物；第三连接装置，所述第三连接装置用于利用第三引物和第四引物对所述第五连接产物进行引物依赖的缺口平移和连接反应，形成第六连接产物，扩增装置，所述扩增装置用于利用第五引物和第六引物对所述第六连接产物进行扩增，其中所述扩增产物的一条链上携带生物素；单链DNA片段分离装置，所述单链DNA片段分离装置用于从所述扩增产物分离单链DNA片段；以及环化装置，所述环化装置用于将所述单链DNA片段进行环化，以便获得单链DNA环，所述单链DNA环构成所述测序文库，其中，所述第三分离的寡核苷酸包括：第一链，所述第一链的5’末端核苷酸具有磷酸基团，并且所述第一链的3’末端核苷酸为双脱氧核苷酸；以及第二链，所述第二链的5’末端核苷酸不具有磷酸基团，并且所述第二链的3’末端核苷酸为双脱氧核苷酸，所述第一链的长度大于所述第二链的长度，并且所述第一链和所述第二链之间形成双链结构，所述第四分离的寡核苷酸包括：第一链，所述第一链的5’末端核苷酸具有磷酸基团，并且所述第一链的3’末端核苷酸为双脱氧核苷酸；以及第二链，所述第二链的5’末端核苷酸不具有磷酸基团，并且所述第二链的3’末端为突出的为双脱氧胸腺嘧啶，所述第一链的长度大于所述第二链的长度，并且所述第一链和所述第二链之间形成双链结构，所述第三引物具有与所述第三分离的寡核苷酸的第一链匹配的序列，所述第四引物具有与所述第四分离的寡核苷酸的第一链匹配的序列，所述第五引物具有与所述第三引物相同的序列，所述第六引物具有与所述第四引物相同的序列并且具有一个额外的生物素，所述单链DNA环中包括第二接头，所述第二接头是基于所述第三分离的寡核苷酸和第四分离的寡核苷酸形成的。

根据本发明的实施例，本发明的设备进一步包括双链DNA片段获取装置，如图17所示，所述双链DNA片段获取装置包括：片段化单元，所述片断化单元用于对DNA样本进行片段化，以便获得片段化产物；去磷酸化单元，所述去磷酸化单元用于对所述片段化产物进行去磷酸化处理，以便获得经过去磷酸化处理的片段化产物；末端修复单元，所述末端修复单元用于对所述经过去磷酸化处理的片段化产物进行末端修复，以便获得所述双链DNA片段。

根据本发明的实施例，如图18所示，双链DNA片段获取装置进一步包括：基因组DNA提取单元，所述基因组DNA提取单元用于从生物样本提取基因组DNA；和/或反转录单元，所述反转录单元用于对RNA样本进行反转录反应，以便获得反转录产物，其中，所述基因组DNA的至少一部分和/或RNA的反转录产物构成所述DNA样本。

根据本发明的实施例，本发明的设备进一步包括纯化装置，用于在进行所述磷酸化处理之前，预先对所述片段化产物进行磁珠纯化。

根据本发明的实施例，如图19所示，所述单链DNA片段分离装置进一步包括：磁珠捕获单元，所述磁珠捕获单元用于使所述扩增产物与磁珠接触，以便形成磁珠-DNA复合物，其中，所述磁珠上连接有链霉亲和素；碱性裂解单元，所述碱性裂解单元中设置有pH高于7的溶液，用于将所述磁珠-DNA复合物与pH高于7的溶液接触，以便获得所述单链DNA片段；以及任选的杂交单元，所述杂交单元中设置有杂交寡核苷酸以便利用所述杂交寡核苷酸对不含有生物素的单链DNA进行捕获。

根据本发明的实施例，所述pH高于7的溶液为氢氧化钠溶液。所述氢氧化钠溶液的浓度为2M以下，在本发明的一个实施例中，氢氧化钠溶液的浓度为大约0.1M。由此，可以进一步的提高单链DNA的分离效率。

根据本发明的实施例，所述环化装置中设置有单链DNA片段，用于通过采用单链核酸分子将所述单链DNA片段进行环化，其中，所述单链核酸分子上限定出第一区段和第二区段，并且所述第一区段能够与包含所述单链DNA片段的5’末端核苷酸和3’末端核苷酸的序列之一匹配，所述第二区段能够与包含所述单链DNA片段的5’末端核苷酸和3’末端核苷酸的另一序列匹配。根据本发明的实施例，所述第一区段和所述第二区段是毗邻连接的。

根据本发明的实施例，所述单链核酸分子具有TCGAGCTTGTCTTCCTAAGACCGC的序列，所述第三分离的寡核苷酸的第一链具有5’GCTTCGACTGGAGA3’的序列；所述第三分离的寡核苷酸的第二链具有5’GTCTCCAGTCGAAGCCCGACG3’的序列；所述第四分离的寡核苷酸的第一链具有5’AGTCGGAGGCCAAGCGGTCGT3’的序列；所述第四分离的寡核苷酸的第二链具有5’TTGGCCTCCGACT3’的序列；所述第三引物具有5’TCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACT 3’的序列；以及所述第四引物具有5’AGACAAGCTCGAGCTCGAGCGATCGGGCTTCGACTGGAGAC3’的序列。另外，前面针对试剂盒、基于双链DNA制备双链环状DNA的方法以及基于双链DNA片段构建测序文库的方法或装置所描述的技术特征和优点，仍然适用该设备，在此不再赘述。

本发明中的“分离的寡核苷酸”、“寡核苷酸”至少包含2个核苷酸，长度上限无限制。

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中，自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。需要说明的是在本文中所使用的术语“第一”、“第二”、“第三”、“第四”、“第五”或者“第六等仅用于方便描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性，也不能理解为之间有先后顺序关系。在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。

除另有交待，以下实施例中涉及的试剂及仪器，都是常规市售产品，比如购自CG公司(Complete Genomics)等。

实施例一：全外显子单链环状文库构建、测序

实验目的：构建全外显子单链环状文库，并用于需要单链环状文库的测序平台测序

实验样本来源：人的YH(炎黄)标准品DNA

全外显子文库构建过程如图1所示，最终形成的单链环状文库，该文库结构组成以及测序方向如图2所示。以下详述全外显子文库具体构建步骤：

1、基因组核酸链被打断成片段

基因组DNA打断：基因组DNA打断有多种方式，无论是物理超声法还是酶反应法，市场上有非常成熟的方案。本实施例采用的是物理超声打断法。

在PCR管中加入一根聚四氟乙烯线，加入基因组DNA 1ug，加入1XTE缓冲溶液或无酶水补齐至80ul。至于E220超声打断仪上超声打断。打断条件设置：

填充系数	21
		压力(PIP)	500
脉冲系数	500
		打断时间	20s*27

1XTE缓冲溶液配方如下：

Tris-HCl,pH8.0	10mM
		EDTA	0.1mM

2、两步磁珠选择法进行目的片段筛选

打断片段选择：可以采用磁珠纯化法或凝胶回收法。本实施例采用磁珠纯化法。

取打断后的DNA，每个样本中加入72ul AmpureXP磁珠，混匀后放置10min；置入磁力架静置5min后收集上清，在上清中加入36ul AmpureXP磁珠，混匀后放置10min；置入磁力架静置5min后吸弃上清，用500ul 75％乙醇洗磁珠2次，最后一次除尽乙醇，晾干后加入50ul 1XTE缓冲溶液或无酶水溶解磁珠，混匀后放置10min，置入磁力架静置5min后，回收上清产物。

打断样本质控：PAGE胶电泳质控检测：要求片段选择后的DNA片段集中在200-400bp之间，取1.5ul样本加4ul TE，再加入2ul 6X溴酚蓝混匀后用于6％PAGE胶检测，电压200V，电泳25min，上样1.5ul 20bp Marker(Fermentas)，电泳结果如图8所示。

浓度测试：市场上成熟的浓度检测方法有很多，本实施例采用Qubit进行核酸定量，具体步骤参照Qubit相应的定量类型的说明书，此处不作赘述。根据浓度测试结果，取样500-750ng进行下面文库构建反应，使用1xTE补齐使总体积不超过45ul。

3、对目的片段进行去磷酸化

去磷酸化用于封闭目的片段5’端，防止目的片段自连；

去磷酸化反应：取上步骤回收产物，按下表配制体系：

将10.8ul反应液加入前一步的回收产物中，混匀，按下表条件进行反应。反应产物直接用于下一步骤。

4、片段末端修复

补平片段两端，使两端均为平末端，按下表配制体系：

Water	11ul
		10x NEBuffer2	1.62ul
100mM ATP	0.72ul
		25mM dNTP	0.72ul
BSA(10mg/ml)	0.36ul
		T4DNA polymerase(3U/ul)	1.8ul
Total	16.2ul

将体系混匀后加入上一步骤产物中，混匀后置于12℃孵育20min。

加入86.4ul Ampure XP进行纯化，混匀后放置10min，置入磁力架静置5min后吸弃上清，用320ul 75％乙醇洗磁珠2次，最后一次除尽乙醇，晾干后加入35ul 1XTE缓冲液溶解磁珠，混匀后放置10min，置入磁力架静置5min待液体澄清后，回收上清产物。(反应产物的纯化有多种方式，有磁珠法、柱纯化法、凝胶回收法等等。均可用于替换。本实施例如不做特殊说明，均采用磁珠法纯化。

第3和第4步骤无顺序要求。

5、在目的片段两端方向性的分别加入接头A的3’端Arm和5’端Arm

接头A的5’端Arm由一条正常的长链和一条两端封闭的短链组成，这样可以有效的防止Arm之间的自连反应。首先在连接酶的作用下，由于目的片段去磷酸化，接头A的5’端Arm长链与目的片段的3’端单链连接，变性后形成一端加入接头5’端Arm长链的DNA单链。通过加入的已知序列，在含有尿嘧啶的引物1及聚合酶的作用下，进行引物延伸合成二链，完成在目的片段一端加入完整的接头A5’端Arm，示意图如图3。接头A的3’端Arm由一条3’端封闭的长链和一条两端封闭的短链组成以防止自连反应。同样的原理在连接酶的作用下接头A3’端Arm的长链5’端与目的片段的3’端单链连接，加入含有尿嘧啶的引物2，在聚合酶和连接酶作用下通过缺口平移和连接反应完成完整的接头A3’端Arm连接，示意图如图4；

接头A5’端Arm连接：接头序列如下(序列从左到右为5’端至3’端，“//”中为末端修饰基团，“phos”示磷酸化，“dd”示双脱氧，“bio”示生物素，加粗斜体区域表示barcode区域)。

长链：/Phos/ACTGCTGACGTACTGTGTCATAAATAGCACGAGACGTTCTCGACA(SEQ ID NO：1)

短链：TACGTCAGCAG/ddT/(SEQ ID NO：2)

配制以下体系：

3x HB缓冲液配方如下：以下简称为3X HB

Tris-HCl,pH 7.8	150mM
		PEG8000	15％
MgCl<sub>2</sub>	30mM
		ATP	3mM

将以上体系与之前的产物混匀，按下表进行反应：

14℃	1hour
		4℃	保持

反应完成后加入86.5ul Ampure XP磁珠进行纯化，混匀后放置10min，320ul 75％乙醇洗涤2次，37ul TE缓冲溶液溶解回收产物。引物延伸，配制以下反应体系：

引物1序列(序列从左到右为5’端至3’端，“//”中为末端修饰基团，“phos”示磷酸化，“dd”示双脱氧，“bio”示生物素，“ideoxy”表示脱氧，加粗斜体区域表示barcode区域)：GTCGAGAACG/ideoxyU/CTCGTGCT(SEQ ID NO：3)

2x PfuCx缓冲液配方如下：

将以上体系与之前的产物混匀，按下表进行反应：

反应完成后加入86.4ul Ampure XP进行纯化，混匀后放置10min，置入磁力架静置5min后吸弃上清，用320ul 75％乙醇洗磁珠2次，最后一次除尽乙醇，晾干后加入32ul 1XTE缓冲液溶解磁珠，混匀后放置10min，置入磁力架静置5min待液体澄清后，回收上清产物约34.7ul。

接头A3’端Arm连接：本方案中使用的接头序列如下(序列从左到右为5’端至3’端，“//”中为末端修饰基团，“phos”示磷酸化，“dd”示双脱氧，“bio”示生物素。)。

长链：/5phos/TCTGCTGAGTCGAGAACGT/3ddC/(SEQ ID NO：4)

短链：CGACTCAGCAG/ddT/(SEQ ID NO：5)

配制以下体系：

将以上体系与之前的产物混匀，按下表进行反应：

14℃	1hour
		4℃	保持

反应完成后加入86.5ul Ampure XP磁珠进行纯化，混匀后放置10min，320ul 75％乙醇洗涤2次，37ul TE缓冲溶液溶解回收产物。

缺口平移，配制以下反应体系：

Water	19.7ul
		10x Taq buffer(LK)	7.2ul
100mM ATP(LK)	0.72ul
		25mM dNTP(LK1)	0.288ul
引物2	0.9ul
		Total	28.8ul

引物2(序列从左到右为5’端至3’端，“//”中为末端修饰基团，“phos”示磷酸化，“dd”示双脱氧，“bio”示生物素，“ideoxy”表示脱氧，加粗斜体区域表示barcode区域)：ACGTTCTCGAC/ideoxyU/CAGCAGA(SEQ ID NO：6)

将以上体系与之前的产物混匀，按下表进行反应：

60℃	5min
		梯度降温到37℃	每0.1℃/sec

配制以下酶反应混合液：

将该酶反应混合液与上步反应产物混匀，按下表进行反应：

37℃	20min
		4℃	保持

反应完成后加入86.4ul Ampure XP进行纯化，混匀后放置10min，置入磁力架静置5min后吸弃上清，用320ul 75％乙醇洗磁珠2次，最后一次除尽乙醇，晾干后加入42ul 1XTE缓冲液溶解磁珠，混匀后放置10min，置入磁力架静置5min待液体澄清后，回收上清产物。

6、用引物1和引物2进行接头A连接产物的扩增，之后纯化及定量

接头A连接产物PCR前定量

用Qubit进行定量，按照Qubit测定的浓度调整下一步酶反应使用的样本起始量，调整为60ng，使用1XTE将总体积补为80ul。

接头A连接产物扩增，配制以下PCR反应混合液：

Water	27.5ul
		2X PfuCx缓冲液	125ul
PfuCx polymerase(2.5U/ul)	5ul
		引物1(20uM)	6.25ul
引物2(20uM)	6.25ul
		Total	170ul

向已经定量至60ng，并将体积调整至80ul的接头A连接产物中加入170ul PCR反应混合物混匀，离心。将混好的mix分装入2个新的PCR管中，每个管约120ul。在PCR仪中按下表进行反应：

将2管PCR反应产物合并成1管，加入288ul Ampure XP进行纯化，混匀后放置10min，置入磁力架静置5min后吸弃上清，用1000ul 75％乙醇洗磁珠2次，最后一次除尽乙醇，晾干后加入62ul ddH₂O溶解磁珠，混匀后放置10min，置入磁力架静置5min待液体澄清后，回收上清产物约60ul。用Qubit对接头A的PCR产物进行定量。

7、对接头A连接产物进行外显子杂交捕获

可进行单个样本的杂交捕获，或在接头A中引入标签序列，可对8个样本进行Pooling后杂交，实现通量的提高和成本降低。

取750ng接头A的PCR产物转入一个新的PCR管中，使用真空浓缩将产物浓缩蒸干。

在上步PCR管中按照下表配制用于富集目的片段的样品文库体系，外显子捕获有几种方法，此处采用市场上广泛使用的Aglient SureSelect外显子捕获杂交试剂盒。

试剂	体积(μl)
		Pre-PCR library(上述750ng接头A的PCR产物)	750ng
Nuclease-free Water	补水至3.4μl
		SureSelect Block#1	2.5
SureSelect Block#2	2.5
		Block#3(1000μM)	0.3
Block#4(1000μM)	0.3
		Total volume	9

Block#3序列(序列从左到右为5’端至3’端，“//”中为末端修饰基团，“phos”示磷酸化，“dd”示双脱氧，“bio”示生物素，加粗斜体区域表示barcode区域)。：ACTGCTGACGTACTGTGTCATAAATAGCACGAGACGTTCTCGAC(SEQ ID NO：7)

Block#4序列(序列从左到右为5’端至3’端，“//”中为末端修饰基团，“phos”示磷酸化，“dd”示双脱氧，“bio”示生物素，加粗斜体区域表示barcode区域)。：TCTGCTGAGTCGAGAACGT(SEQ ID NO：8)

按照如下反应条件进行预杂交：

Step	Temperature	Time
			Step 1	95℃	5 min
Step 2	65℃	Holding

在一个新的1.5ml离心管中按照下表配制杂交Buffer反应体系：

试剂	体积(μl)单管	体积(μl)N管
			Hyb#1	25	25×(20N/49)
Hyb#2	1	1×(20N/49)
			Hyb#3	10	10×(20N/49)
Hyb#4	13	13×(20N/49)
			Total volume	49	49×(20N/49)

按每个反应13μl的量分别加入到新PCR管中，放入PCR仪中65℃孵育至少5min。

在一个新的PCR管中按照下表配制Oligo Library Mix(冰上进行)：

试剂	体积(μl)
		Nuclease-free water	1
RNase Block	1
		Oligo Capture Library	5
Total volume	7

将Oligo Library Mix放入PCR仪中65℃孵育2min；保持各反应体系于65℃，揭开样品文库管和杂交Buffer管的管盖，迅速把13μl的杂交Buffer转移到样品文库管中；保持各反应体系于65℃，揭开Oligo Library Mix管盖，迅速将样品文库管中的所有反应体系全部转移到Oligo Library Mix管中，用移液器吹打混匀，盖好管盖，此时的杂交混合液约27-29μl。保持PCR管于65℃(热循环仪热盖设为105℃)杂交24h。

1)杂交产物洗脱

a.提前2h将水浴锅调至65℃，待水温稳定后为每个杂交反应准备1.8ml WashBuffer#2置于水浴锅中预热；

b.用漩涡混合仪剧烈振荡重悬DynabeadsM-280Streptavidin Beads(INVITROGEN，配有磁珠结合缓冲液(binding buffer)、磁珠洗涤缓冲液(washingbuffer)#1和#2)至混匀；

c.每一个杂交反应取50μl DynabeadsM-280Streptavidin Beads于一新的2.0ml离心管；

d.将200μl Binding buffer加入磁珠中，用漩涡混合仪剧烈振荡5秒钟重悬磁珠；

e.将离心管置于磁力架上2min，待液体完全澄清；小心吸取并弃去上清；

f.重复步骤d)到步骤e)2次；

g.加入200μl Binding buffer重悬磁珠；

h.将经24h孵育后，继续保持杂交混合液于PCR仪上的杂交反应液全部转移到准备好的磁珠中，上下颠倒离心管3到5次直到混匀；

i.将装有杂交混合液和磁珠的离心管对称的固定于Nutator或类似的装置上360度旋转混匀，室温下孵育30min；

j.将样品从混匀装置取下，瞬时离心5s确保管盖上没有液体残留；

k.将2.0ml离心管转移放置在磁力架上，静置3-5min待液体完全澄清，小心吸取并弃去上清；

l.用500μl Wash Buffer#1重悬磁珠，并于漩涡混合仪上振荡5秒混匀样品，室温下孵育样品15min；

m.将离心管瞬时离心3s，然后放置在磁力架上，静置3-5min待液体完全澄清，小心吸取并弃去上清；

n.用500μl Wash Buffer#2重悬磁珠，并于漩涡混合仪上振荡5秒以混匀样品，将其置于Thermomixer中65℃孵育10min；

o.颠倒离心管以混匀样品，瞬时离心3s，然后将其放置在磁力架上，静置3-5min待液体完全澄清，小心吸取并弃去上清；

p.重复步骤n)到步骤o)2次；

q.用70ul ddH₂O重悬磁珠。

2)杂交产物PCR

配制以下反应体系：

将反应混合液与上步得到的70ul DNA样品混匀，将混好的mix分装入2个新的PCR管中，每个管约120ul。按以下条件进行反应：

PCR完成后将2管产物合并为1管并转移至一新的离心管中，加入288ul Ampure XP进行纯化，混匀后放置10min，置入磁力架静置5min后吸弃上清，用1000ul 75％乙醇洗磁珠2次，最后一次除尽乙醇，晾干后加入32ul 1XTE溶解磁珠，混匀后放置10min，置入磁力架静置5min待液体澄清后，回收上清产物约30ul。用Qubit进行定量。

3)外显子捕获后产物Pooling：此处可取单管产物1.5-2ug继续进行单个样本的文库构建流程，也可把不同样本产物进行Pooling。若需进行Pooling，不同样本间需连接带有不同barcode的接头A。最多可进行8管不同样本产物的Pooling，Pooling后总量为1.5-2ug继续进行后续建库步骤。用1XTE补齐使总体积不超过60ul。

8、USER酶反应和第一次双链DNA环化

USER酶反应混合液配制如下：

取1.5ug上步外显子捕获后PCR扩增产物或Pooling后产物与反应混合液混匀，按以下条件反应：37℃1hour；4℃forever。

通过USER酶切接头A3’和5’端Arm中的尿嘧啶，在含有完整接头A的双链DNA捕获后扩增DNA产物两端产生缺口，在连接酶作用下进行环化反应，形成第一个双链环状分子，也使得接头A的3’端和5’端Arm合并在一起形成完整的接头A。接头A两端设计含有限制性内切酶EcoP15I识别位点，以便后续的限制性内切酶酶切反应。另外通过接头A中尿嘧啶位点的设计，在形成的双链环的一条链中引入1nt的碱基缺失(Gap)，示意图如图5；

第一次双链DNA环化，准备反应混合液，配制如下：

将上一步得到的110ul User酶反应产物瞬时离心，转入2.0ml离心管中，加入1700ul上述混合液混匀，离心，分装到4个1.5ml离心管中，每管约450ul；放入水浴锅中温浴：60℃30min；反应完成后，置入常温水浴中，放置冷却20min。

准备环化酶反应混合液，配制如下：

环化反应缓冲液配方如下：

10X TA Buffer	20％
		ATP	20mM

将上述酶反应混合液分别加入上步处理后的4个反应中，每孔加入50ul，混匀，离心；

把4个有反应液的离心管放置在桌面上室温反应1h。

9、通过两步磁珠结合法进行目的环状分子筛选

向上步4管环化后的样品(每管500ul体积)中，分别加入330ul Ampure XP进行纯化，混匀后放置10min，置入磁力架静置5min，待液体澄清后分别回收830ul上清到新的离心管中，向回收的上清中再次分别加入170ul磁珠，混匀后放置10min，置入磁力架静置5min后吸弃上清，用1000ul 75％乙醇洗磁珠2次，最后一次除尽乙醇，晾干后加入64ul 1XTE逐管溶解磁珠(即先将TE加入一管磁珠中，混匀后全部转入下一管磁珠中，以此类推直到4管磁珠全部溶解)，混匀后放置10min，置入磁力架静置5min待液体澄清后，回收上清产物约60ul。

10、对未成环的DNA分子进行消化

该步骤是可选的，消化未环化DNA，准备Plasmid Safe酶反应混合液，配制体系如下：

Plasmid-safe反应缓冲液配方如下：

10X TA Buffer	90％
		ATP	9mM

向上一步纯化后的60ul DNA样本板中加入20ul Plasmid Safe酶反应混合液，混匀，瞬时离心后置于PCR仪上孵育，反应条件如下：37℃1hour；4℃forever。

向上步反应中加入80ul Ampure XP进行纯化，混匀后放置10min，置入磁力架静置5min后吸弃上清，用320ul 75％乙醇洗磁珠2次，最后一次除尽乙醇，晾干后加入40ul 1XTE溶解磁珠，混匀后放置10min，置入磁力架静置5min待液体澄清后，回收上清产物。

10、EcoP15I酶切

限制性内切酶EcoP15I酶切识别接头A上的酶切位点，在接头A两端切出25-27bp大小的片段，示意图如图6。

准备EcoP15I酶切反应混合物，配制体系如下：

EcoP15I酶切反应缓冲液配方如下：

将上一步纯化后的DNA样本转到新1.5ml离心管中，加入323ul EcoP15I酶切反应混合物，混匀瞬时离心后置于孵育箱中37℃孵育16h。

用PEG32磁珠进行产物纯化，上步反应完成后加入270ul PEG32磁珠，混匀后放置10min，置入磁力架静置5min后吸弃上清，用1000ul 75％乙醇洗磁珠2次，最后一次除尽乙醇，晾干后加入46ul 1XTE溶解磁珠，混匀后放置10min，置入磁力架静置5min待液体澄清后，回收上清产物。

PEG32磁珠配方为：含32％(质量体积比)PEG 3350的AmpureXP磁珠。

11、进行第二轮目的片段末端补平及去磷酸化反应

1)第二次T4ploymerase末端补平，准备T4ploymerase末端补平反应混合液：

10x NEBuffer2	5.4ul
		25mM dNTP	0.8ul
10mg/ml BSA	0.4ul
		T4DNA polymerase(3U/ul)	2ul
Total	8.6ul

向上步反应中加入8.6ul T4ploymerase末端补平反应混合液，混匀后瞬时离心。将装有54.6ul反应混合液的PCR管放入PCR仪中反应，反应条件：12℃20min；4℃forever(PCR仪需要热盖)。

加入71ul PEG32磁珠，混匀后放置10min，置入磁力架静置5min后吸弃上清，用320ul75％乙醇洗磁珠2次，最后一次除尽乙醇，晾干后加入46ul 1XTE溶解磁珠，混匀后放置10min，置入磁力架静置5min待液体澄清后，回收上清产物。

2)去磷酸化反应(FastAP)

准备FastAP反应混合液,配制如下：

向上一步纯化得到的约46ul产物中加入11.5ul FastAP反应混合液，混匀后瞬时离心。将装有57.5ul反应混合液的PCR管放入PCR仪中反应，反应条件：37℃45min；4℃forever(PCR仪需要热盖)。

上步样本中加入75ul PEG32磁珠，混匀后放置10min，置入磁力架静置5min后吸弃上清，用320ul 75％乙醇洗磁珠2次，最后一次除尽乙醇，晾干后加入40ul 1XTE溶解磁珠，混匀后放置10min，置入磁力架静置5min待液体澄清后，回收上清产物。

12、连接接头B

首先进行接头B 3’端Arm中单链连接。接头B 3’端Arm由一条3’端封闭的长链和一条两端封闭的短链组成以防止自连反应，在连接酶作用下接头B3’端Arm的长链5’端与目的片段的3’端单链连接。由于目的片段中含有由接头A环化连接时引入的1nt gap，在聚合酶作用下该gap处目的片段按5’到3’方向进行缺口平移，并在Klenow Exo酶的作用下在3’末端加入一突出的腺嘌呤(A碱基)，形成一端连有接头B 3’端Arm中长链，另一端含有一突出A碱基的双链DNA分子。接下来进行接头B 5’端Arm中单链连接。接头B 5’端Arm由一条3’端封闭的长链和一条两端封闭的短链组成以防止自连反应，其中短链的3’端含有一个突出的双脱氧胸腺嘧啶(ddT)以和目的片段中突出的A碱基配对。在连接酶的作用下目的片段中含有突出A碱基的目的片段单链与接头B 5’端Arm的长链连接完成目的片段与接头B 5’端Arm的单链连接。加入5’端生物素标记的引物3和5’端磷酸化的引物4，引物3和接头B5’端Arm的长链配对，引物4和接头B 3’端Arm的长链配对，在聚合酶和连接酶作用下进行缺口平移和连接反应完成完整的接头B 5’端和3’端Arm连接，示意图如图7。

1)接头B 3’端Arm平末端连接

准备接头B 3’端Arm连接反应混合液，配制如下：

向已经纯化的上步反应产物中加入接头B3’端Arm 5.6ul，移液器上下混匀3次；在上述混合物中每孔加入28.5ul接头B3’端Arm连接反应混合液，混匀后瞬时离心。将装有74.1ul反应混合液的PCR管放入PCR仪中反应，反应条件：14℃2hour；4℃forever。

接头B 3’端Arm序列如下：(序列从左到右为5’端至3’端，“//”中为末端修饰基团，“phos”示磷酸化，“dd”示双脱氧，“bio”示生物素，加粗斜体区域表示barcode区域)。

短链：GCTTCGACTGGAGA/3ddC/(SEQ ID NO：9)

长链：/5Phos/GTCTCCAGTCGAAGCCCGACG/3ddC/(SEQ ID NO：10)

上步反应中加入63ul PEG32磁珠，混匀后放置10min，置入磁力架静置5min后吸弃上清，用320ul 75％乙醇洗磁珠2次，最后一次除尽乙醇，晾干后加入40ul 1XTE溶解磁珠，混匀后放置10min，置入磁力架静置5min待液体澄清后，回收上清产物。

2)末端补平/加A

准备末端补平反应混合液，配制如下：

Water	1.5ul
		末端补平/加A缓冲液	10.7ul
5U/ul Klenow exo<sup>-</sup>	1.1ul
		Total	13.3ul

末端补平/加A缓冲液配方如下：

NEBuffer 2,10X	50％
		dNTP	1.25mM
dATP	5mM

向上一步纯化得到的约40ul/孔的样本板中加入13.3ul末端补平反应混合液，混匀后瞬时离心。将装有53.3ul反应混合液的PCR管放入PCR仪中反应，反应条件：37℃60min；4℃forever(PCR仪需要热盖)。

上步样本中加入69ul PEG32磁珠，混匀后放置10min，置入磁力架静置5min后吸弃上清，用320ul 75％乙醇洗磁珠2次，最后一次除尽乙醇，晾干后加入40ul 1XTE溶解磁珠，混匀后放置10min，置入磁力架静置5min待液体澄清后，回收上清产物。

3)接头B 5’端Arm连接

连接反应混合液配制如下：

向已经纯化的上步末端修复产物中加入接头B 5’端Arm 5.6ul，移液器上下混匀3次。在上述混合物中加入28.5ul接头B 5’端Arm连接反应混合液，混匀后瞬时离心。将装有74.1ul反应混合液的PCR管放入PCR仪中反应，反应条件：13℃2hour；4℃forever。

接头B 5’端Arm序列如下：(序列从左到右为5’端至3’端，“//”中为末端修饰基团，“phos”示磷酸化，“dd”示双脱氧，“bio”示生物素，加粗斜体区域表示barcode区域)。

短链：TTGGCCTCCGACT/3ddT/(SEQ ID NO：11)

长链：/5phos/AGTCGGAGGCCAAGCGGTCGT/ddC/(SEQ ID NO：12)

上步样本中加入63ul PEG32磁珠，混匀后放置10min，置入磁力架静置5min后吸弃上清，用320ul 75％乙醇洗磁珠2次，最后一次除尽乙醇，晾干后加入40ul 1XTE溶解磁珠，混匀后放置10min，置入磁力架静置5min待液体澄清后，回收上清产物。

4)缺口平移及连接反应

准备缺口平移及连接反应缓冲液混合液，配制如下：

Water	20.9ul
		10x Taq buffer	8ul
100mM ATP	0.8ul
		25mM dNTP	0.32ul
20uM引物3	1ul
		20uM引物4	1ul
Total	32.0ul

引物3序列(序列从左到右为5’端至3’端，“//”中为末端修饰基团，“phos”示磷酸化，“dd”示双脱氧，“bio”示生物素，加粗斜体区域表示barcode区域)：/5bio/TCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACT(SEQ ID NO：13)

引物4序列(序列从左到右为5’端至3’端，“//”中为末端修饰基团，“phos”示磷酸化，“dd”示双脱氧，“bio”示生物素，加粗斜体区域表示barcode区域)：/5phos/AGACAAGCTCGAGCTCGAGCGATCGGGCTTCGACTGGAGAC(SEQ ID NO：14)

准备缺口平移及连接反应酶反应混合液，配制如下：

向已经纯化的上步接头连接产物板中加入32.0ul缺口平移及连接反应缓冲液混合液，混匀，离心。将装有72ul反应混合液的PCR管放入PCR仪中反应，反应条件：60℃5min；梯度降温到37℃，0.1℃/sec。

将PCR管取出瞬时离心，每孔再加入8.0ul缺口平移及连接反应酶反应混合液混匀后，瞬时离心。将装有80ul反应混合液的PCR管放入PCR仪中反应，反应条件：37℃20min；4℃forever。

上步样本中加入80ul PEG32磁珠，混匀后放置10min，置入磁力架静置5min后吸弃上清，用320ul 75％乙醇洗磁珠2次，最后一次除尽乙醇，晾干后加入40ul 1XTE溶解磁珠，混匀后放置10min，置入磁力架静置5min待液体澄清后，回收上清产物。

13、用引物3和引物4进行接头B连接产物的扩增，之后进行纯化及定量

1)接头B连接产物PCR前定量：用Qubit进行定量，样本起始量不超过59.8ng，用1XTE将总体积补为80ul。

2)接头B连接产物扩增

PCR反应混合物配制如下：

Water	27.5ul
		2X PfuCx缓冲液	125ul
PfuCx polymerase(2.5U/ul)	5ul
		引物3(20uM)	6.25ul
引物4(20uM)	6.25ul
		Total	170ul

向已经取好样的装有80ul DNA的离心管中加入170ul PCR反应混合物，混匀后瞬时离心。将250ul样本分装到2个PCR管中，每管约120ul。

将PCR管放入PCR仪中反应，PCR反应条件(需要热盖)：

将2管PCR产物合并，加入240ul PEG32磁珠，混匀后放置10min，置入磁力架静置5min后吸弃上清，用1000ul 75％乙醇洗磁珠2次，最后一次除尽乙醇，晾干后加入80ul1XTE溶解磁珠，混匀后放置10min，置入磁力架静置5min待液体澄清后，回收上清产物。

用Qubit进行定量，下一步反应使用的样本起始量不超过627ng，取至新的离心管中，用1XTE将总体积补为60ul。

14、单链分离

通过核酸双链中一条链上的生物素标记，分离获得另一条无生物素标记的核酸单链。

Streptavidin Beads(LIFE TECHNOLOGIES，35002D)准备：取出需要使用的Streptavidin Beads加入一新的离心管中，置于磁力架上澄清后去掉上清。加入5倍体积的1X磁珠结合缓冲液，混匀后置于磁力架上，澄清后弃上清液，重复上述操作一次，加入1倍体积1X磁珠结合缓冲液悬浮，再加入1/100体积0.5％Tween20，混匀后室温静置。

1X磁珠结合缓冲液配方如下：

Tris-HCl,ph7.5	20mM
		NaCl	500mM

向上步已准备好的60ul样品中加入20ul 4X磁珠结合缓冲液，混匀后离心。向样本中加入30ul Streptavidin Beads。混匀后放置10min，磁力架上放置5min，待液体澄清后吸弃上清，1000ul 1X磁珠洗涤缓冲液洗涤2次，75ul 0.1M NaOH溶解磁珠，回收上清。向产物中加入37.5ul 0.3M 3-(N-吗啉基)丙磺酸(MOPS acid)(MOPS free acid，SIGMA ALDRICH，M3183-100G)，离心后可于-20℃保存。

注：其中Streptavidin Beads、1X磁珠洗涤缓冲液和0.1M NaOH需现用现配。

4X磁珠结合缓冲液配方如下：

Tris-HCl,ph7.5	80mM
		NaCl	2M

1X磁珠洗涤缓冲液配方如下：

Tris-HCl,ph7.5	20mM
		NaCl	150mM
Tween20	0.005％

15、单链环杂交捕获

根据接头A中的序列设计生物素标记的探针(杂交oligo)与目的片段进行杂交反应，过滤掉产生的非正常双链酶切产物；使用链霉亲和素包裹磁珠回收被捕获的正确产物。

准备杂交反应混合液，配制如下：

10x杂交反应缓冲液	13ul
		杂交oligo	4.5ul
Total	17.5ul

杂交oligo序列(序列从左到右为5’端至3’端，“//”中为末端修饰基团，“phos”示磷酸化，“dd”示双脱氧，“bio”示生物素，加粗斜体区域表示barcode区域)：/5Bio/TCTGCTGAGTCGAGAACGTCTCGTGCT(SEQ ID NO：15)

10x杂交反应缓冲液配方如下：

Tris-HCl,ph7.5	200mM
		NaCl	500mM

向上步样本中加入17.5ul杂交反应混合液，轻轻吹打混匀，将反应混合液转移到一个新的PCR管中，放入PCR仪中反应，反应条件：95℃2min；0.1℃/sec降温至25℃forever。

将上步已完成杂交反应的130ul反应产物置入离心机中2000rpm离心1min，加入43.3ul4X磁珠结合缓冲液，混匀离心，加入90ul已经洗好的Streptavidin Beads。混匀后放置10min，磁力架上静置5min，待液体澄清后吸弃上清，1000ul 1X杂交捕获洗涤液洗涤2次，56℃1X杂交捕获洗涤液100ul洗涤1次，78ul 0.1M NaOH溶解磁珠，回收产物75ul中加入37.5ul0.3M3-(N-吗啉基)丙磺酸(MOPS acid)(MOPS free acid，SIGMA ALDRICH，M3183-100G)，离心后可于-20℃保存。

注：1X杂交捕获洗涤液、0.1M NaOH，Streptavidin Beads需现配现用。

1X杂交捕获洗涤液配方如下：

Tris-HCl,ph7.5	20mM
		NaCl	50mM
Tween20	0.005％

16、环化

利用获得的单链核酸分子5’末端的磷酸基团，在辅助环化oligo的作用下，进行该核酸单链环化；并通过外切酶等方法的处理，去掉剩余的未环化单链。对单链环状核酸产物进行纯化回收，即为最终制备得到的单链环状文库；

1)准备引物反应混合液，配制如下：

Water	43ul
		20uM辅助环化oligo	20ul
Total	63ul

辅助环化oligo(序列从左到右为5’端至3’端，“//”中为末端修饰基团，“phos”示磷酸化，“dd”示双脱氧，“bio”示生物素，加粗斜体区域表示barcode区域)：TCGAGCTTGTCTTCCTAAGACCGC(SEQ ID NO：16)

混匀离心后，向上一步得到的112ul样品中加入63ul的引物反应混合液。

准备连接酶反应混合液，配制如下：

混匀离心后，向上步已经加入引物反应混合液的反应管中加入连接酶反应混合液175ul，混匀，离心。37℃孵育1.5h。

2)酶切消化(Exo I and III)

该步骤为可选步骤。酶切反应混合液配制如下：

混匀离心后加入上步反应中。混匀离心，37℃孵育30min后，加入15.4ul 500mMEDTA终止酶反应。

向上步样本中加入500ul PEG32磁珠，混匀后放置10min，置入磁力架静置5min后吸弃上清，用1000ul 70％乙醇洗磁珠2次，最后一次除尽乙醇，晾干后加入82ul 1XTE溶解磁珠，混匀后放置10min，置入磁力架静置5min待液体澄清后，回收上清产物约80ul。

用Qubit进行单链环DNA定量。本实施例最终文库胶图检测结果见图9。

17、测序

环化后的单链环状核酸产物进入后续的测序步骤，经过滚环复制后形成核酸纳米球(DNB)进行核酸序列信息读取。测序分析结果见附表1、表2和图10。表1中的“uniq_depth”为利用唯一比对上参考序列的读段计算得的测序深度，“uniq_coverage”为为利用唯一比对上参考序列的读段计算得的测序覆盖度，“duplicate rate”表示重复的读段所占得比例。从实验结果来看，各产物浓度与总量满足了后续测序要求，电泳结果也显示片段集中，是质量非常高的文库。分析结果中各指标均较好，都证明本方案是完全成功的。

表1 2个基于双接头的单链环状外显子捕获文库的测序结果基本指标

表2 2个基于双接头的单链环状外显子捕获文库的测序结果SNP分析指标

序列表

<110> 深圳华大基因科技有限公司

<120> 试剂盒及其在核酸测序中的用途

<130> PIOC145937PCN

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> 磷酸化

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(45)

<223> 接头A 5’端臂长链

<220>

<221> misc_feature

<222> (16)..(25)

<223> 标签

<400> 1

actgctgacg tactgtgtca taaatagcac gagacgttct cgaca 45

<210> 2

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(12)

<223> 接头A 5‘端臂短链

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(12)

<223> 双脱氧

<400> 2

tacgtcagca gt 12

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> 引物1

<220>

<221> misc_feature

<222> (11)..(11)

<223> k=u

<220>

<221> misc_feature

<222> (11)..(11)

<223> 脱氧

<400> 3

gtcgagaacg kctcgtgct 19

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(20)

<223> 接头A 3’端臂长链

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(20)

<223> 双脱氧

<400> 4

tctgctgagt cgagaacgtc 20

<210> 5

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(12)

<223> 接头A 3‘端臂短链

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(12)

<223> 双脱氧

<400> 5

cgactcagca gt 12

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> 引物2

<220>

<221> misc_feature

<222> (11)..(11)

<223> k=u

<220>

<221> misc_feature

<222> (11)..(11)

<223> 脱氧

<400> 6

acgttctcga ckcagcaga 19

<210> 7

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(44)

<223> 阻断序列3

<220>

<221> misc_feature

<222> (16)..(25)

<223> 标签

<400> 7

actgctgacg tactgtgtca taaatagcac gagacgttct cgac 44

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> 阻断序列4

<400> 8

tctgctgagt cgagaacgt 19

<210> 9

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(15)

<223> 接头B 3’端臂短链

<220>

<221> misc_feature

<222> (15)..(15)

<223> 双脱氧

<400> 9

gcttcgactg gagac 15

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> 磷酸化

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(22)

<223> 接头B 3‘端臂长链

<220>

<221> misc_feature

<222> (22)..(22)

<223> 双脱氧

<400> 10

gtctccagtc gaagcccgac gc 22

<210> 11

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(14)

<223> 接头B 5’端臂短链

<220>

<221> misc_feature

<222> (14)..(14)

<223> 双脱氧

<400> 11

ttggcctccg actt 14

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> 磷酸化

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(22)

<223> 接头B 5‘端臂长链

<220>

<221> misc_feature

<222> (22)..(22)

<223> 双脱氧

<400> 12

agtcggaggc caagcggtcg tc 22

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> 生物素标记

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(25)

<223> 引物3

<400> 13

tcctaagacc gcttggcctc cgact 25

<210> 14

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> 磷酸化

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(41)

<223> 引物4

<400> 14

agacaagctc gagctcgagc gatcgggctt cgactggaga c 41

<210> 15

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> 生物素标记

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(27)

<223> 用于杂交捕获的寡核苷酸序列

<400> 15

tctgctgagt cgagaacgtc tcgtgct 27

<210> 16

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(24)

<223> 辅助环化的寡核苷酸序列

<400> 16

tcgagcttgt cttcctaaga ccgc 24

Claims

1.一种基于双链DNA制备环状双链DNA的方法，所述双链DNA片段具有两个平端末端，并且所述双链DNA片段的四个末端核苷酸均不具有磷酸基团，其特征在于，所述方法包括：

使所述双链DNA与第一分离的寡核苷酸相连，以便获得第一连接产物；

对所述第一连接产物进行第一热变性处理，以便获得第一单链DNA分子；

利用第一引物与所述第一单链DNA分子互补配对发生链延伸反应，以便获得链延伸反应产物，其中，所述链延伸反应产物含有一个尿嘧啶；

使所述链延伸反应产物与第二分离的寡核苷酸相连，以便获得第二连接产物；

利用第二引物使所述第二连接产物发生引物介导的缺口平移和末端连接反应，以便获得第三连接产物，其中，所述第三连接反应产物含有两个尿嘧啶；

利用USER酶(Uracil-Specific Excision Reagent)对所述第三连接产物进行切割，以便获得第一切割产物，所述第一切割产物含有两个缺口；以及

使所述第一切割产物发生环化反应，以便获得所述环状双链DNA，其中一条链有碱基缺失，任选地所述碱基缺失的长度为1nt，其中，

所述第一和第二分离的寡核苷酸分别包括：

第一链，所述第一链的5’末端核苷酸具有磷酸基团，并且所述第一链的3’末端核苷酸为双脱氧核苷酸；以及

第二链，所述第二链的5’末端核苷酸不具有磷酸基团，并且所述第二链的3’末端核苷酸为双脱氧核苷酸，

其中，

所述第一链的长度大于所述第二链的长度，并且所述第一链和所述第二链之间形成双链结构，

所述第一引物特异性识别所述第一分离的寡核苷酸的第一链，并且所述第一引物中含有尿嘧啶，

所述第二引物特异性识别所述第二分离的寡核苷酸的第一链，并且所述第二引物中含有尿嘧啶。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一和第二分离的寡核苷酸分别包括一个III型内切酶的识别位点。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述III型内切酶为EcoP15 I。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一和第二分离的寡核苷酸的至少之一包括：

第一突出端，所述第一突出端位于所述第一链的3’端；以及

任选的第二突出端，所述第二突出端位于所述第二链的3’端。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，当存在第二分离的寡核苷酸时，所述第一突出端的长度大于所述第二突出端的长度。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述第一突出端的长度为10～35nt。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述第二突出端的长度为0～10nt。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一分离的寡核苷酸、第二分离的寡核苷酸、第一引物以及第二引物均为DNA。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一链的长度为20～50nt。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二链的长度为10～15nt。

11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一分离的寡核苷酸的第一链的序列为：5’ACTGCTGACGTACTG(N)mAGCACGAGACGTTCTCGACA3’，其中，N代表A、T、G或C，m为0～15的整数，

所述第一分离的寡核苷酸的第二链的序列为5’TACGTCAGCAG3’,

所述第二分离的寡核苷酸的第一链的序列为5’TCTGCTGAGTCGAGAACGT3’，

所述第二分离的寡核苷酸的第二链的序列为5’CGACTCAGCAG3’，

第一引物的序列为5’GTCGAGAACGUCTCGTGCT3’，以及

第二引物的序列为5’ACGTTCTCGACUCAGCAGA3’。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，m为10。

13.一种制备双链核酸融合分子的方法，其特征在于，包括：

提供第一双链DNA片段，所述双链DNA片段具有两个平端末端，并且所述双链DNA片段的四个末端核苷酸均不具有磷酸基团，

将所述第一双链DNA片段与寡核苷酸相连，以便获得第一连接产物；

对所述第一连接产物进行第一热变性处理，以便获得第一单链DNA分子；以及

利用引物与所述第一单链DNA分子互补配对发生链延伸反应，以便获得第一链延伸反应产物，其中，所述第一链延伸反应产物构成所述双链核酸融合分子，

其中，所述寡核苷酸包括：

其中，

所述引物特异性识别所述寡核苷酸的第一链。

14.一种基于双链DNA片段构建测序文库的方法，所述双链DNA片段具有两个平端末端，并且所述双链DNA片段的四个末端核苷酸均不具有磷酸基团，其特征在于，所述方法包括：

根据权利要求1～12任一项所述的方法，基于所述双链DNA制备双链环状DNA，其中，在所述双链环状DNA中包括第一接头，所述第一接头中包括III型内切酶识别位点以及碱基缺失，其中，所述第一接头是基于所述第一分离的寡核苷酸和第二分离的寡核苷酸形成的，任选地所述碱基缺失的长度为1nt；

利用III型内切酶对所述双链环状DNA进行酶切，以便获得第二切割产物；

对所述第二切割产物进行末端补平和去磷酸化处理，以便获得平端双链DNA片段；

使所述平端双链DNA片段与第三分离的寡核苷酸相连，以便获得第四连接产物；

对所述第四连接产物进行缺口平移反应并且在3’末端形成碱基A，以便获得具有3’碱基A的第四连接产物；

使所述具有3’碱基A的第四连接产物与第四分离的寡核苷酸相连，以便获得第五连接产物；

利用第三引物和第四引物对所述第五连接产物进行引物介导的缺口平移和连接反应，形成第六连接产物；

利用第五引物和第六引物对第六连接产物进行扩增，以便获得扩增产物，其中所述扩增产物的一条链上携带生物素；

从所述扩增产物分离单链DNA片段；以及

将所述单链DNA片段进行环化，以便获得单链DNA环，所述单链DNA环构成所述测序文库，

其中，所述第三分离的寡核苷酸包括：

第二链，所述第二链的5’末端核苷酸不具有磷酸基团，并且所述第二链的3’末端核苷酸为双脱氧核苷酸，所述第一链的长度大于所述第二链的长度，并且所述第一链和所述第二链之间形成双链结构，

所述第四分离的寡核苷酸包括：

第二链，所述第二链的5’末端核苷酸不具有磷酸基团，并且所述第二链的3’末端为突出的为双脱氧胸腺嘧啶，所述第一链的长度大于所述第二链的长度，并且所述第一链和所述第二链之间形成双链结构，

所述第三引物具有与所述第三分离的寡核苷酸的第一链匹配的序列，

所述第四引物具有与所述第四分离的寡核苷酸的第一链匹配的序列，

所述第五引物具有与所述第三引物相同的序列，

所述第六引物具有与所述第四引物相同的序列，并且具有一个额外的生物素，

所述单链DNA环中包括第二接头，所述第二接头是基于所述第三分离的寡核苷酸和第四分离的寡核苷酸形成的。

15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述双链DNA片段是通过下列步骤获得的：

对DNA样本进行片段化，以便获得片段化产物；

对所述片段化产物进行去磷酸化处理，以便获得去磷酸化处理的片段化产物；以及

对所述经过去磷酸化处理的片段化产物进行末端修复处理，以便获得所述双链DNA片段。

16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述DNA样本为基因组DNA的至少一部分或者RNA的反转录产物。

17.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，在进行所述去磷酸化处理之前，预先对所述片段化产物进行磁珠纯化。

18.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，从所述扩增产物分离单链DNA片段是通过下列步骤进行的：

使所述扩增产物与磁珠接触，以便形成磁珠-DNA复合物，其中，所述磁珠上连接有链霉亲和素；

将所述磁珠-DNA复合物与pH高于7的溶液接触，以便获得所述单链DNA片段,

以及任选地进一步包括：

利用杂交寡核苷酸对不含有生物素的单链DNA进行捕获。

19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述pH高于7的溶液为氢氧化钠溶液。

20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述氢氧化钠溶液的浓度为2M以下。

21.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，所述氢氧化钠溶液的浓度为0.1M。

22.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，通过采用单链核酸分子将所述单链DNA片段进行环化，

其中，

所述单链核酸分子上限定出第一区段和第二区段，并且所述第一区段能够与包含所述单链DNA片段的5’末端核苷酸和3’末端核苷酸的序列之一匹配，所述第二区段能够与包含所述单链DNA片段的5’末端核苷酸和3’末端核苷酸的另一序列匹配。

23.根据权利要求22所述的方法，其特征在于，所述第一区段和所述第二区段是毗邻连接的。

24.根据权利要求22所述的方法，其特征在于，所述单链核酸分子具有5’TCGAGCTTGTCTTCCTAAGACCGC3’的序列，

所述第三分离的寡核苷酸的第一链具有5’GCTTCGACTGGAGA3’的序列；

所述第三分离的寡核苷酸的第二链具有5’GTCTCCAGTCGAAGCCCGACG3’的序列；

所述第四分离的寡核苷酸的第一链具有5’AGTCGGAGGCCAAGCGGTCGT3’的序列；

所述第四分离的寡核苷酸的第二链具有5’TTGGCCTCCGACT3’的序列；

所述第三引物具有5’TCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACT 3’的序列；以及

所述第四引物具有5’

AGACAAGCTCGAGCTCGAGCGATCGGGCTTCGACTGGAGAC3’的序列。

25.一种核酸测序方法，其特征在于，包括：

根据权利要求14～24任一项所述的方法，构建测序文库；以及

对所述测序文库进行测序。

26.根据权利要求25所述的测序方法，其特征在于，采用CG测序平台，对所述测序文库进行测序。