ES2313881T3 - Formulaciones de vacunas frente al papilomavirus humano. - Google Patents
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Abstract
Una formulación de vacuna frente al papilomavirus humano (VPH) que comprende: a) partículas similares a virus( VLP) de VPH que se absorben sobre un adyuvante de aluminio, estando presente cada tipo de VLP de VPH en una cantidad de 10-200 mug/ml, seleccionándose de forma independiente de VPH6a, VPH6b, VPH11, VPH16 y VPH18; b) una sal seleccionada de NaCl, KCl, Na2SO4, (NH4)2SO4, fosfato sódico y citrato sódico; c) un tampón que es histidina o imidazol que proporciona un intervalo de pH de la solución vacunal de pH 6,0 a 6,5; y d) un tensioactivo no iónico escogido de estrés de ácidos grasos de polioxietilen sorbitol, polioxietilen alquil éteres, Triton X-100 ® , Triton X-114 ® , NP-40 ® , Span 85 y la serie Pluronic de tensioactivos no iónicos.
Description
Formulaciones de vacunas frente al papilomavirus
humano.
Esta invención se refiere a formulaciones de
vacunas frente al papilomavirus humano (VPH) que proporcionan mayor
estabilidad de almacenamiento a largo plazo.
El virus del papiloma humano (VPH) infecta el
tracto genital y se ha asociado con varias displasias, tipos de
cáncer y otras enfermedades. Actualmente, estas enfermedades son
dianas para el desarrollo de vacunas y actualmente están en ensayos
clínicos vacunas que contienen partículas similares a virus (VPL)
que contienen L1 o la combinación de las proteínas L1 +L2.
No obstante, se ha descubierto que las VLP de
VPH no son estables durante el almacenamiento prolongado, bien en
solución o cuando se adsorbe en partículas adyuvantes de
aluminio.
Con el fin de desarrollar una vacuna
comercialmente útil se necesita una formulación estable.
El documento
WO-A-9844944 (Merck & Co., Inc.)
desvela vacunas frente a VPH adyuvadas con alúmina que comprenden
cloruro sódico, un tensioactivo no iónico y un tampón que puede ser
fosfato, citrato, acetato, succinato, Tris-HCl o
MOPS para mantener un intervalo de pH de
6,0-8,0.
El ejemplo 39 del documento
WO-A-9531532 (Merck & Co., Inc.)
desvela composiciones que comprenden VLP del VPH, estabilizantes de
la vacuna y adyuvantes de la vacuna. Los estabilizantes
polianiónicos de ejemplo enumerados en la lista no incluyen
carboximetilcelulosa (CMC).
Esta invención se refiere a formulaciones de
vacuna del papilomavirus humano que exhiben estabilidad a largo
placo, en la que las formulaciones de la vacuna comprenden:
- a)
- Partículas similares a virus del VOH (VPH) que se adsorben en un adyuvante de aluminio, en el que cada tipo de VLP de VPH está presente en una cantidad de 10-200 \mug/ml, en la que las VLP se seleccionan de forma independiente de VPH6a, VPH6b, VPH11, VPH16 y VPH18;
- b)
- Una sal seleccionada de NaCl, KCl, Na_{2}SO_{4}, (NH_{4})_{2}SO_{4}, fosfato sódico y citrato sódico;
- c)
- Un tampón que es histidina o imidazol que proporciona un intervalo de pH de la solución vacunal de un pH 6,0 a 6,5; y
- d)
- Un tensioactivo no iónico escogido de polioxietilensorbitol ésteres de ácidos grasos, polioxietilen alquil éteres, TritonX-100®, NP-40®, Span 85 y la serie Pluronic de tensioactivos no iónicos.
\vskip1.000000\baselineskip
En otra forma de realización, la comulación
además comprende un estabilizante polimérico polianiónico.
Esta invención también se refiere a una
formulación de vacuna mejorada realizada mediante (i) ajuste de la
resistencia iónica de la solución con diversas concentraciones de
sales; ajuste y control del Ph de la solución con agentes tampón
concretos; (iii) adición de un tensioactivo no iónico; y (iv)
adición de excipientes estabilizantes adicionales en forma de
polianiones poliméricos.
La Figura 1A es un gráfico que muestra los
efectos de la concentración de NaCl y los excipientes añadidos sobre
la estabilidad de las formulaciones de VLP del
VPH16-aluminio a 2-8ºC; La Figura 1B
muestra los resultados a 15ºC.
La Figura 2 es un gráfico que muestra los
efectos de excipientes polianiónicos sobre la estabilidad acelerada
de las formulaciones de VLP del VPH16-aluminio.
La Figura 3 es un gráfico de barras que muestra
los efectos de los excipientes polianiónicos sobre la estabilidad
acelerada de las formulaciones de VLP del
VPH16-aluminio.
La Figura 4 es un gráfico de barras que ilustra
el efecto de la concentración de carboximetilcelulosa (CMC) sobre la
estabilidad acelerada de las formulaciones de VLP del
VPH16-aluminio.
La Figura 5 es un gráfico que muestra los
efectos del peso molecular de la carboximetilcelulosa (CMC) y la
concentración de NaCl sobre la estabilidad acelerada de las
formulaciones de VLP del VPH16-aluminio.
En condiciones de solución fisiológica de sal y
pH, las partículas similares a virus (VLP) de la proteína L1 del
papilomavirus humano (VPH) no son estables durante el almacenamiento
a largo plazo, bien en solución o bien después de la adsorción en
una adyuvante de aluminio a 2-8ºC. Por tanto, esta
invención se refiere a nuevas formulaciones de vacunas con VLP de
VPH adyuvadas con una mejor estabilidad en el almacenamiento. Las
formulaciones pueden estar en solución acuosa.
De acuerdo con esta invención se puede usar
cualquier tipo de VLP de VPH como la porción antigénica de la
vacuna. Las VLP pueden contener únicamente la proteína L1 o pueden
estar formadas ambas proteínas L1 y L2. Las proteínas pueden ser de
una composición de aminoácidos de tipo salvaje o pueden contener
mutaciones. Se prefieren las VLP que contienen sólo la proteína L1
que es de una composición de aminoácidos de tipo salvaje.
Los VPH que son particularmente preferidos son
aquéllos asociados con la enfermedad, incluidos, entre otros: VPH6a,
VPH6b, VPH11, VPH16 y VPH18. Además, las formulaciones de esta
invención son adecuadas para combinaciones de los tipos de VPH,
incluidas las vacunas multivalentes que contienen una pluralidad de
antígenos de VPH, tales como una combinación de VPH6, 11, 16 Y 18.
Se prefiere que las VLP se preparen mediante técnicas recombinantes,
como se conoce en la técnica. Es particularmente preferido que la
célula huésped usada para hacer las VLO sea una célula de levadura,
aunque se conocen otros tipos de células, tales como células
bacterianas, de insectos y de mamíferos, y actualmente se usan como
huéspedes.
La concentración de las VLP de VPH que se
absorben en aluminio es de aproximadamente 10-200
mcg/ml para cada tipo de VLP de VPH. Esto se puede ajustar,
dependiendo de factores tales como la antigenicidad del tipo
concreto de VPH, y la presencia de múltiples tipos de VPH en una
vacuna de tipo "cóctel".
Otra forma de realización de esta invención es
una formulación que omite la concentración de sal más elevada y
comprende VLP de VPH absorbidos en aluminio, una concentración
fisiológica de sal (aproximadamente 0,15M) y un estabilizante
polianiónico polimérico en presencia o ausencia de agentes tampón y
detergentes no iónicos.
La fuerza iónica de la solución se mantiene
mediante la presencia de sales. Se puede usar casi cualquier sal
que puede contribuir al control de la fuerza iónica. Las sales
preferidas que se pueden usar para ajustar la fuerza iónica son:
cualquier sal fisiológicamente aceptable, tal como NaCl, KCl,
Na_{2}SO_{4}, (NH_{4})_{2}SO_{4}, fosfato sódico y
citrato sódico. Sales particularmente preferidas son: NaCl, KCl y
Na_{2}SO_{4}. Se ha descubierto que una fuerza iónica creciente
potencia espectacularmente la estabilidad de las VLP del VPH frente
a la agregación inducida por calor. Por ejemplo, la estabilidad de
la solución proteica con VLP de VPH se analizó para detectar la
formación de agregados como una función de la temperatura usando un
espectrofotómetro UV (ensayo de turbidez para la determinación del
punto de turbidez). Los datos del punto de turbidez indican que una
fuerza iónica creciente (usando NaCl de 0,15M a 1M) potencia
espectacularmente la estabilidad de las VLP del VPH en solución
frente a la agregación inducida por calor, y la temperatura del
inicio de la formación de turbidez se eleva aproximadamente 7ºC.
Las sales deben estar presentes en
concentraciones de 0,10M 1M. No obstante no se prefieren
concentraciones muy elevadas debido a las limitaciones prácticas de
la inyección parental de concentraciones elevadas de sales. En su
lugar, concentraciones de sales más moderadas, tales como
concentraciones más fisiológicas de 0,15M a 0,5M, siendo más
preferidas 0,15M-0,32M de NaCl.
Algunas formulaciones de esta invención también
contienen un tampón para mantener el intervalo de pH, de modo que la
vacuna está en el intervalo de pH no irritante con una estabilidad
óptima de las VLP de VPH. El efecto del pH sobre la estabilidad de
los VPH tanto en solución como absorbido en formulación de aluminio
también se investigó de acuerdo con esta invención. Los resultados
indican que las VLP de los VPH sólo son estables dentro de un
intervalo relativamente pequeño de pH 5,5-7,0 y que
el intervalo de pH preferido es de 6,0-6,5, y
particularmente 6,2, medido mediante antigenicidad in
vitro.
La estabilidad en almacenamiento de las
formulaciones de VPH-aluminio se analizó además con
la adición de un tampón y un tensioactivo no iónico. Se observó un
mejor control del pH de la vacuna de VLP de VPH adyuvada con
aluminio durante el almacenamiento cuando se añadió histidina o
imidazol como agente tampón. En general, la concentración del tampón
debería variar de 2 mM a 100 mM, siendo preferida de 5 mM a
aproximadamente 20 mM, y siendo 10 mM otra concentración preferida.
Generalmente no se prefieren los tampones que contienen fosfato, ya
que pueden interaccionar con adyuvantes de aluminio. La interacción
de iones de tampón fosfato con adyuvante de aluminio, así como la
falta de interacción de los tampones de histidina e imidazol con
adyuvante aluminio se demostró mediante mediciones del potencial
zeta de la carga de superficie del adyuvante aluminio.
Otro componente en alguna formulación de esta
invención es un tensioactivo no iónico. El tensioactivo se puede
seleccionar del grupo compuesto por: ésteres de ácidos grasos de
polioxietilen sorbital (Polisorbatos) tales como Polisorbato 80 (p.
ej., TWEEN 80®), Polisorbato 20 (p. ej., TWEEN 20®), éteres de
polioxietilenalquilo (p. ej., Brij 35® y Brij 58®), así como otros,
incluidos Triton X-100®), Triton
X-114®), NP-40®), Span 85 y la serie
Pluronic de tensioactivos no iónicos (p. ej., Pluronic 121), siendo
particularmente preferido el Polisorbato 80. Generalmente, el
tensioactivo está presente en una concentración de 0,0005% a 0,5%
(p/vol). Se encontró que el polisorbato 80 protegía a las VLP de
VPH-aluminio de la inactivación durante un estrés de
envío simulado (es decir, agitación o temblor). Para el polisorbato
80, una concentración preferida es de aproximadamente 0,01%.
Otra potenciación significativa de la
estabilidad de la formulación de VLP-VPH también se
consiguió mediante la adición de excipientes poliméricos
polianónicos, tales como un estabilizante. Como se usa en la
especificación y las reivindicaciones, con el término "polímero
polianiónico" se pretende referir a los compuestos que tienen una
única cadena larga o a aquéllos con múltiples cadenas reticuladas;
cualquiera de los tipos posee múltiples cargas negativas a lo largo
de las cadena(s) cuando están en solución. Ejemplos de
polímeros polianiónicos incluyen: proteínas, polianiones, péptidos y
ácidos polinucleicos. Se pueden seleccionar estabilizantes
específicos del grupo compuesto por:
carboximetilcelulosa (particularmente
10-800 cps),
heparina (6-30 kDa),
poliaminoácidos (2-100 kDa) tal
como poli(Glu), Poli(Asp) y Poli(Glu, Phe),
glutation oxidado
[Glu-Cys-Gly]2 (613 Da)
polinucleótidos tales como ácido policitidílico
(200-700 kDa) y ácido poliadenílico
(200-700 kDa),
ARN,
ADN, y
albúminas séricas
\vskip1.000000\baselineskip
La concentración del estabilizante, cuando está
presente, es de 0,01% a 0,5%, particularmente
0,05-0,1% (en peso), aunque la adición de una
cantidad incluso diez veces menor de excipientes polianiónicos (por
ejemplo 0,01% de albúmina, ADN o heparina) todavía proporciona una
estabilidad potenciada a las formulaciones de VLP de
VPH-aluminio, aunque el efecto estabilizante es
relativamente menos significativo, quizá debido a las menores
concentraciones. Como se describe con más detalle en los ejemplos,
los polianiones proporcionaron una estabilización espectacular de
las formulaciones de VPH-aluminio. Los mecanismos
estabilizantes de estas clases de excipientes pueden variar desde
unión directa a la molécula de VLP de VPH (tal como se produce con
ADN), inhibición de la adsorción de VLP de VPH o VLP de
VPH-aluminio sobre las superficies, incremento de la
viscosidad de la solución, neutralización de la carga de
superficie, reformación de los puentes disulfuro de las VLP de VPH
o interferencia con la oxidación de la cadena lateral de aminoácidos
y/o incremento de la rigidez conformacional de las VLP de VPH. Es
importante observar que la proteína L1 de VLP de VPH contiene un
sitio de unión a polianión de múltiples aminoácidos cargados
positivamente en la región C terminal de la proteína.
Estos polianiones se analizaron además en
condiciones del estudio de estabilidad acelerada a 37ºC. Las
formulaciones que contienen polianión de
VPH-aluminio conservaron aproximadamente un 80% de
la antigenicidad in vitro, mientras que el control de la
formulación del VPH (sin adición de polianiones) no presentaban casi
antigenicidad in vitro tras una semana de incubación a 37ºC.
El mismo grupo de muestras tras dos semanas de incubación a 37ºC no
muestran diferencias significativas de los datos de una semana, lo
que indica el fuerte efecto estabilizante de estos excipientes
polianiónicos.
El efecto de estabilización polianiónica también
se investigó para las VLP de VPH en solución en condiciones
aceleradas a 37ºC. Los datos indican que para los polianiones
polinucleotídicos, poli(a) o poli(C) se requiere una
concentración de 0,001% (en peso o 10 mcg/ml) para que las VLP de
VPH16 (a 80 mcg/ml de proteína( mantengan una estabilidad máxima
frente a la inactivación inducida por calor medida mediante la
antigenicidad in vitro. La sedimentación y el análisis UV
indican que los polianiones se unen a las VLP directamente.
Además, la adsorción de VLP de VPH en el
adyuvante de aluminio se puede inhibir mediante la unión previa de
los polianiones a las VLP de VPH. Por ejemplo, la
carboximetilcelulosa puede inhibir la unión de VLP de VPH al
aluminio a ciertas concentraciones del polianión. Sin embargo, la
adición de carboximetilcelulosa tras la adsorción de VLP de VPH al
adyuvante aluminio tiene como resultado una liberación prácticamente
no detectable de VLP de VPH de aluminio mientras que proporciona una
espectacular potenciación de la estabilidad de un modo dependiente
de la concentración.
Entre los polianiones
(0,001-0,25 en peso), especialmente preferida es la
carboximetilcelulosa (10-800 cps) con un peso
molecular típico aproximado de 50.000-700.000 Da,
siendo especialmente preferida la carboximetilcelulosa de viscosidad
menor 10-200 cps.
Entre las formulaciones preferidas de esta
invención se incluyen las siguientes:
- I.a)
- 10-200 mcg/ml de cada tipo de VLP de VPH adsorbido en aluminio, en la que las VLP se selecciona del grupo compuesto por: VPH 6a, VPH 6b, VPH 11, VPH16, VPH18 y mezclas de los mismos; b) NaCl 0,32M, c) tampón de histidina 10 mM, pH 6,2; y d) polisorbato 80 0,01%.
- II.a)
- 10-200 mcg/ml de cada tipo de VLP de VPH adsorbido en aluminio, en la que las VLP se seleccionan del grupo compuesto por: VPH 6a, VPH 6b, VPH 11, VPH16, VPH18 y mezclas de los mismos; b) NaCl 0,32M, c) tampón de histidina 10 mM, pH 6,2; y d) polisorbato 80 0,01% y carboximetilcelulosa 0,05%.
- III.a)
- 10-200 mcg/ml de cada tipo de VLP de VPH adsorbido en aluminio, en la que las VLP se seleccionan del grupo compuesto por: VPH 6a, VPH 6b, VPH 11, VPH16, VPH18 y mezclas de los mismos; b) NaCl 0,15M, y c) carboximetilcelulosa 0,05% y d) opcionalmente histidina 10 mM, pH 6,2; y polisorbato 80 0,01%.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la mayoría de estos experimentos se usó una
solución congelada de proteína L1 recombinante de VLP de VPH
derivada de levadura (con una pureza superior al 95%) a una
concentración de proteínas de 870 mcg/ml en NaCl 0,5M, polisorbato
80 0,003%, a pH de aproximadamente 6,2. El adyuvante aluminio se
fabricó en Merck. Los excipientes se adquirieron comercialmente.
Todas las formulaciones vacunales se prepararon del siguiente modo:
la solución de VLP de VPH con o sin dilución se añadió al adyuvante
de aluminio para la adsorción en aluminio de las VLP de VPH, a
continuación se añadieron los excipientes. Se pudieron obtener todas
las concentraciones deseadas para todos los excipientes, VLP de VPH
y adyuvante de aluminio en la formulación mediante mezcla directa
con el volumen designado o a través del ajuste con un procedimiento
de sedimentación/decantación.
Para liberar el VPH del adyuvante de aluminio se
desarrolló un procedimiento de disolución de aluminio que incluyó
la dilución de la formulación de VPH-aluminio en una
solución rica en sales que contiene citrato y polisorbato 80. Las
muestras de VLP de VPH del procedimiento de disolución de aluminio
se someten directamente a un ensayo de antigenicidad in
vitro usando el análisis Biacore (utilizando un anticuerpo
neutralizante específico de tipo de VLP de VPH). Las muestras de
VLP de VPH de los estudios de estabilidad con adyuvación con
aluminio se comparan directamente con una solución madre congelada
de las mismas VLP de VOH para determinar la antigenicidad in
vitro.
Las mediciones del pH de las formulaciones de
VPH-aluminio se realizaron a temperatura ambiente
usando un peachímetro Orion del modelo 420A. Todas las muestras
incubadas a varias temperaturas se equilibraron a temperatura
ambiente durante 30 minutos antes de la determinación del pH. El
peachímetro se calibró manualmente usando dos tampones estándar que
entran el intervalo de pH previsto de la muestra, con un coeficiente
de correlación entre 95-100%. El efecto de la
temperatura sobre el pH de las soluciones tamponadas con histidina
se determinó variando la temperatura gradualmente de 4ºC a 37ºC.
La concentración de proteínas de VPH en las
soluciones BULK y las muestras formuladas (tras la disolución de
aluminio) se determinaron mediante medición de los espectros de
absorbancia UV a temperatura ambiente usando un espectrofotómetro
HP 8452A Diode Array y una cubeta con un recorrido de 1 cm. Los
volúmenes de las muestras usadas fueron de aproximadamente 200 a 250
microlitros. La concentración de proteínas se calculó usando una
segunda técnica de análisis de múltiples componentes desarrollada
para usar con VLP de VPH.
Se realizaron experimentos de la velocidad de
sedimentación con una ultracentrífuga analítica Beckman XL I.
Los ensayos de turbidez se llevaron a cabo
usando un espectrofotómetro HP 8452A Diode Array equipado con un
software de sistemas HP 845X UV-Visible y un sistema
de control de la temperatura. La dispersión de la luz de las
soluciones se siguió a 320-350 nm en modo cinético
del programa, incrementando la temperatura de aproximadamente 25ºC a
80ºC.
El potencial zeta de las partículas de aluminio
y las VLP de VOH se determinaron usando un Malvern Zetasizer 3000
con variación del pH de la solución de 4 a 9 o las concentraciones
del excipiente,
Los estudios de estabilidad de la formulación de
VPH-aluminio se realizaron en condiciones de
aceleración y de tiempo real. La temperatura de los estudios de
estabilidad acelerada varió de 15ºC a 37ºC. La temperatura de los
estudios de estabilidad a tiempo real fue a 2-8ºC.
Estos intervalos de temperatura se escogieron en base al hecho de
que la tasa de inactivación de VLP de VPH es muy sensible a la
temperatura. Datos previos de integridad conformacional a través de
mediciones biofísicas han mostrado que el incremento de la
temperatura por encima de 40-45ºC induce cambios
conformacionales significativos en las VLP de VPH en solución, una
condición que debe evitarse en los estudios de estabilidad
acelerada.
Se estudiaron los efectos de la concentración de
NaCl y los excipientes añadidos sobre la estabilidad de las
formulaciones de VLP de VPH16-aluminio sobre la
estabilidad de las formulaciones VLP de
VPH16-aluminio a 2-8ºC. Las
formulaciones de 160 mcg/ml de VLP de VPH16 en 450 mcg/ml de
adyuvante de aluminio en una solución a concentraciones diferentes
de NaCl con/sin la adición de polisorbato 80 0,01%, histidina 10 mM
se incubaron a 2-8ºC. Después se analizó la
antigenicidad in vitro de las formulaciones después de
diferentes tiempos de incubación mediante análisis Biacore. Los
resultados se muestran en la Figura 1A. Después se repitió el
experimento para incubación a 15ºC. La Figura 1B muestra los
resultados cuando se incubaron a 15ºC. En ambos gráficos, los
cuadrados cerrados son los puntos para NaCl 0,15M; los cuadrados
abiertos son los puntos para NaCl 0,30M; los círculos cerrados son
para NaCl 0,30M, polisorbato 80 0,01% e histidina 10 mM. Los datos
indican que crecientes concentraciones de sal potencia la
estabilidad de la vacuna y la adición de tampón y polisorbato
potencia más la estabilidad.
Se investigaron los efectos de los excipientes
estabilizantes sobre la estabilidad acelerada de las formulaciones
de VLP VPH16-aluminio. Las formulaciones de 200
mcg/ml de VLP de VPH16 en 450 mcg/ml de adyuvante de aluminio
con/sin la adición de diferentes excipientes estabilizantes se
incubaron a pH 6,2 Y 25ºC. La antigenicidad in vitro de las
formulaciones se analizó tras diferentes tiempos de incubación
mediante análisis Biacore. Las composiciones de la formulación se
muestran en la Figura 2: los círculos cerrados son para NaCl 0,3M +
ácido poliglutámico 0,1% (poliGlu); los cuadrados a rayas son para
NaCl 0,3M + ácido poliadenílico (poli-A); los
cuadrados abiertos son para NaCl 0,3M + histidina 10 mM +
polisorbato 80 0,01%; los triángulos abiertos son para NaCl 0,3M; y
los círculos abiertos son para NaCl 0,15M. Los datos indican que a
25ºC, concentraciones crecientes de sal de 0,15 a 0,3M y la adición
de tampón y polisorbato potencian la estabilidad de la formulación.
No obstante, la adición de un polianión potencia espectacularmente
la estabilidad de las VLP de VPH adsorbido en aluminio frente a la
pérdida de antigenicidad in vitro inducida por calor.
Los efectos de los excipientes polianiónicos
sobre la estabilidad acelerada de las formulaciones de VLP de
VPH16-aluminio se investigaron con más detalle. Las
formulaciones de 160 mcg/ml de VLP de VPH16 en 450 mcg/ml de
adyuvante de aluminio en NaCl 0,3M, polisorbato 80 0,01%, histidina
10 mM, pH 6,2 con/sin la adición de un excipiente polianiónico se
incubaron a 37ºC durante 1 semana. La antigenicidad in Vitro
de las formulaciones se analizó después mediante análisis Biacore.
Los tipos y las concentraciones de los excipientes polianiónicos
añadidos son como se muestra en la Figura 3, de izquierda a derecha:
control; ácido poliadenílico (poli A) 0,1%; ácido policitidílico
0,1% (poli C); ácido poliaspártico 0,1% (poliAsp)
(5-15 K); ácido poliglutámico 0,1% (poli Glu)
(5-15K); ácido poliglutámico 0,1% (poli Glu)
(50-100K); seroalbúmina bovina (BSA) 0,1%; ácido
poliglutámico-fenilalalina (poliGlu, Phe) 0,1%;
heparina 0,1%; heparina 0,25%; glutation oxidado 2 mM;
carboximetilcelulosa 0,1% (CMC) (200 cps); carboximetilcelulosa 0,1%
(CMC) (800 cps).
Se puede observar que todos estos polianiones
poliméricos tienen la capacidad para estabilizar significativamente
las formulaciones de VLP de VPH-aluminio como se ve
mediante el mantenimiento de la antigenicidad in vitro medido
mediante Biacore.
Se examinó el efecto de la concentración de la
carboximetilcelulosa (CMC) sobre la estabilidad acelerada de las
formulaciones de VLP de VPH-aluminio. Se incubaron
formulaciones de mcg/ml de VPH16 en 450 mcg/ml de adyuvante de
aluminio en NaCl 0,3M, polisorbato 80 0,01%, histidina 10 mM, pH
6,2 (200 cps) a 37ºC durante 1 semana. A continuación se analizó la
antigenicidad in Vitro de las formulaciones mediante análisis
Biacore. Los resultados se muestran en la Figura 4 para CMC 0,
0,005%, 0,01%, 0,05%, 0,1% y 0,2%. Los datos indican que la
potenciación de la estabilidad es una función de la concentración de
CMC añadida. La antigenicidad in vitro se conserva en
presencia de al menos 0,05% de CMC.
Se examinaron los efectos del peso molecular de
la carboximetilcelulosa (CMC) y de la concentración de NaCl sobre
la estabilidad acelerada de las formulaciones de VLP de
VPH-aluminio. Se incubaron formulaciones de 160
mcg/ml de VPL de VPH16 en 450 mcg/ml de adyuvante de aluminio en
histidina 10 mM, pH 6,2, polisorbato 80 0,01% con/sin la adición de
CMC a 37ºC. A continuación se analizó la antigenicidad in
vitro de las formulaciones tras diferentes tiempos de incubación
mediante análisis Biacore. La concentración de CMC fue 0,05% y el
peso molecular de la CMC es del nivel de 10-20 cps o
200 cps. Los resultados se muestran en la Figura 5: el círculo
abierto es para NaCl 0,32M, CMC 200 cps; el cuadrado abierto con
línea continua es para NaCl 0,32M, CMC 10-20 cps;
el rombo cerrado es para NaCl 0,15M, CMC 10-20 cps;
el cuadrado abierto con línea semidiscontinua es para NaCl 0,32M; u
el círculo cerrado es para NaCl 0,15M. Los datos indican que la CMC
con peso molecular menor (aproximadamente 10-20 cps)
básicamente proporciona una potenciación de la estabilidad similar a
las formulaciones de VPH de VPH-aluminio con CMC 200
cps y que la presencia de CMC permite que la preparación vacunal se
formule a una concentración fisiológica de sal (NaCl 0,15M).
Claims (14)
1. Una formulación de vacuna frente al
papilomavirus humano (VPH) que comprende:
- a)
- partículas similares a virus( VLP) de VPH que se absorben sobre un adyuvante de aluminio, estando presente cada tipo de VLP de VPH en una cantidad de 10-200 \mug/ml, seleccionándose de forma independiente de VPH6a, VPH6b, VPH11, VPH16 y VPH18;
- b)
- una sal seleccionada de NaCl, KCl, Na_{2}SO_{4}, (NH_{4})_{2}SO_{4}, fosfato sódico y citrato sódico;
- c)
- un tampón que es histidina o imidazol que proporciona un intervalo de pH de la solución vacunal de pH 6,0 a 6,5; y
- d)
- un tensioactivo no iónico escogido de estrés de ácidos grasos de polioxietilen sorbitol, polioxietilen alquil éteres, Triton X-100®, Triton X-114®, NP-40®, Span 85 y la serie Pluronic de tensioactivos no iónicos.
2. Una vacuna de acuerdo de la reivindicación 1,
en la que la sal está presente en una concentración de 0,10M a
0,5M.
3. Una vacuna de acuerdo de la reivindicación 2,
en la que la sal es NaCl 0,32M.
4. Una vacuna de acuerdo de la reivindicación 1,
2 ó 3, en lal que el tampón está presente en una concentración de 2
mM a 100 mM.
5. Una vacuna de acuerdo de la reivindicación 4,
en la que el tampón es histidina 10 mM, pH 6,2.
6. Una vacuna de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 5, en la que el tensioactivo no iónico se
selecciona de : Polisorbato 20, Polisorbato 80,
NP-40®, Triton X-100®, Triton
X-114®, Span 85, Brij 35®, Brij 58®.
7. Una vacuna de acuerdo con cualquier
reivindicación precedente, en la que el tensioactivo está presente
en una concentración de 0,0005% a 0,5% (p/vol).
8. Una formulación de vacuna de acuerdo con la
reivindicación 1, que comprende:
- b)
- NaCl 0,32M
- c)
- tampón histidina 10 mM, pH 6,2; y
- d)
- Polisorbato 80 0,01%
9. Una formulación de vacuna de acuerdo con
cualquier reivindicación precedente, que es una solución acuosa.
10. Una vacuna de acuerdo con cualquier
reivindicación precedente, que comprende un estabilizante
polianiónico polimérico.
11. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación
10, en la que el estabilizante se selecciona de:
carboximetilcelulosa (CMC), heparina, Poli(Glu),
Poli(Asp), Poli(Glu, Phe), glutation oxidado, ácido
policitidílico, ácido poliadenílico, ARN, ADN y albúminas
séricas.
12. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación
10 u 11, en la que la concentración del estabilizante es de 0,01% a
0,5% (en peso/volumen).
13. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación
11 o 12, en la que el estabilizante es CMC.
14. Una formulación vacunal de VPH de acuerdo
con la reivindicación 13, que comprende:
- b)
- NaCl 0,32M;
- c)
- tampón histidina 10 mM, pH 6,2;
- d)
- Polisorbato 80 0,01%; y
- e)
- Carboximetilcelulosa 0,05%.
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