JP2024503452A - ヒトパピローマウイルスウイルス様粒子ワクチンの安定な調製 - Google Patents

ヒトパピローマウイルスウイルス様粒子ワクチンの安定な調製 Download PDF

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Abstract

ヒトパピローマウイルスウイルス様粒子ワクチンの安定な製剤が提供される。安定な製剤は、ヒトパピローマウイルスウイルス様粒子と、緩衝液と、浸透圧調節剤と、界面活性剤と、アルミニウムアジュバントとから構成され、ワクチンの成分は、HPV 6型、11型、16型、18型、31型、33型、45型、52型および58型のL1タンパク質によって構築されたHPVウイルス様粒子と、他の病原性HPV型のL1タンパク質によって構築された1つ以上のHPVウイルス様粒子とを含む。製剤は、ワクチンの安定性を高め、水性製剤中のワクチンの有効期間を延長することができる。図8とともに公開される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2021年1月14日に出願された中国特許出願第202110049777．7号明細書の利益を主張し、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、生物学的医薬製剤の分野、特に、安定なヒトパピローマウイルスウイルス様粒子ワクチン製剤に関する。
子宮頸癌は、最も一般的な女性悪性腫瘍の一つであり、世界中で毎年約500，000人の患者が新たに生じ、その発生率は女性腫瘍の中で2番目である。子宮頸癌の95％超がヒトパピローマウイルス、HPV）感染に関連している。子宮頸癌の直接的な原因に加えて、HPVは、気管支原性癌、直腸癌、口腔癌および皮膚癌とも強く関連している。さらに、HPVは、皮膚および粘膜のいぼを引き起こす主な病原因子でもある。
現在、100を超えるHPV型が発見されており、異なるHPV型は異なる疾患を引き起こす可能性がある。子宮頸癌との密接な関係によれば、HPVは、高リスク型、発癌性が疑われる型、および低リスク型に分類することができる。高リスク型、および発癌性が疑われる型は、子宮頸癌などの癌を誘発する可能性がある。高リスク型には、16型、18型、31型、33型、35型、39型、45型、51型、52型、56型、58型および59型が含まれた。発癌性が疑われる型には、26型、53型、66型、68型、73型および82型が含まれる。6型、11型、40型、42型、43型、44型、54型、61型、70型、72型、81型および89型を含む低リスク型は、性器疣贅、尖圭コンジローマおよび他の疾患に主に関連する。HPV 6型、11型および16型は、性器病変を有する患者では、検出率が最も高いサブタイプであった。
HPVワクチンは、パピローマウイルスの感染を阻止する有効な方法である。ウイルス様粒子（VLP）ワクチンは、多くのワクチン形態の中で最も有効なワクチン形態である。しかし、VLPベースのHPVワクチンは型特異的であり、すなわち、VLPワクチンでは、HPV型に対する強力な防御が示されるにとどまる。広範囲な防御を提供するためには、多価HPVワクチンの開発が必要である。
しかし、投与前に、ヒトパピローマウイルスワクチン製剤は保存および輸送プロセスを受け、その間に抗原は物理的分解および化学的分解を受け、これらの不安定性は抗原の免疫原性および／または安全性を低下させる可能性があり、したがって、抗原が投与直前に予防目的を満たす免疫原性および安全性を維持したままであることを確実にするために安定な製剤が必要とされている。
一態様では、本発明は、アジュバントに吸着された複数のパピローマウイルスウイルス様粒子と、生理学的に許容される濃度の緩衝液と、浸透圧調節剤と、任意に界面活性剤とを含む、HPVに関連する疾患または感染を予防するための多価ヒトパピローマウイルスウイルス様粒子ワクチンの安定な製剤を提供する。
ここで、ヒトパピローマウイルスウイルス様粒子は、それぞれHPV 6型、11型、16型、18型、31型、33型、45型、52型および58型のL1タンパク質によって構築されたHPVウイルス様粒子、ならびに
他の病原性HPV型のL1タンパク質から構築された1つ以上のHPVウイルス様粒子から選択される。
一実施形態では、
緩衝液は、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液またはヒスチジン緩衝液のうちの1つ以上から選択され、
浸透圧調節剤は、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウムまたは硫酸ナトリウムのうちの1つ以上から選択され、
界面活性剤は、ポリエトキシエーテル、好ましくはポリソルベート80であり、
アジュバントは、アルミニウムヒドロキシホスフェート（AlPO4）、非晶質アルミニウムヒドロキシホスフェートサルフェート（amorphous aluminum hydroxyphosphate sulfate）（AAHS）または水酸化アルミニウム（Al（OH）3）、好ましくはアルミニウムヒドロキシホスフェート（AlPO4）のうちの1つ以上から選択される。
一実施形態では、
（a）すべての型のパピローマウイルスウイルス様粒子の総濃度は、40μg／mL～740μg／mLであり、（b）緩衝液の濃度は、10mM～26mM、好ましくは10mM、18mMまたは26mMであり、
（c）浸透圧調節剤の濃度は、150mM～320mM、好ましくは150mM～320mMであり、
（d）界面活性剤の濃度は0～0．02重量％であり、
（e）アジュバントの濃度は約1．0mg／mLであり、
（f）製剤のpHは、5．9～6．5、好ましくは5．9、6．2または6．5である。
一実施形態では、多価パピローマウイルスウイルス様粒子に含まれる任意の単一型のパピローマウイルスウイルス様粒子の濃度は、40μg／mL～120μg／mLである。
一実施形態では、その製剤は、合計0．74mg／mLのすべての型のパピローマウイルスウイルス様粒子、1．0mg／mLのリン酸アルミニウムアジュバント、18mMヒスチジン緩衝液、320mM塩化ナトリウム、6．2の製剤溶液のpH、任意に、0．3mg／mL以下の濃度のポリソルベート80を含む。
一実施形態では、1つ以上の他の病原性HPV型は、HPV 35型、39型、51型、56型および59型から選択される。
一実施形態では、ここで、HPVウイルス様粒子のうちの少なくとも1つは、キメラHPV L1タンパク質を含むキメラHPVウイルス様粒子であり、キメラHPV L1タンパク質は、そのN末端からそのC末端に向かって、
a．第1の型のパピローマウイルスL1タンパク質に由来し、その型のL1タンパク質の免疫原性を維持するN末端断片であって、第1の型のパピローマウイルスが、HPV 6型、11型、16型、18型、31型、33型、45型、52型および58型、ならびに1つ以上の他の病原性HPV型から選択されるN末端断片と、
b．他の型のL1タンパク質よりも良好な発現および溶解性の特徴を有する第2の型のパピローマウイルスL1タンパク質に由来するC末端断片とを含み、
キメラHPV L1タンパク質は、第1の型のパピローマウイルスL1タンパク質の免疫原性を有する。
一実施形態では、前記N末端断片は、第1のパピローマウイルス型の前記L1タンパク質の天然配列のC末端をそのα5領域内の任意のアミノ酸位置で切断することによって得られる断片、およびそれと少なくとも98％の同一性を有する断片であり、前記C末端断片は、第2のパピローマウイルス型の前記L1タンパク質の天然配列のN末端をそのα5領域内の任意のアミノ酸位置で切断することによって得られる断片、ならびに断片へのさらなる変異、欠失および／または付加から生じる機能的変異体である。
一実施形態では、C末端断片は、1つ以上の核局在化配列を含む。
一実施形態では、ここで、第1の型のパピローマL1タンパク質は、HPV 6型、11型、16型、18型、31型、35型、39型、45型、51型、52型、56型または58型から選択され、好ましくは、その天然配列は、それぞれ配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40または配列番号41に示されるコード遺伝子によってコードされるアミノ酸配列であり、
第2の型のパピローマL1タンパク質は、HPV 16型、28型、33型、59型または68型L1タンパク質から選択され、
さらに好ましくは、第2の型のパピローマL1タンパク質は、HPV 33型またはHPV 59型L1タンパク質から選択される。
一実施形態では、そのC末端断片は、配列番号1、もしくはm1アミノ酸の長さを有するその断片、好ましくは配列番号1のアミノ酸1～m1を包含する断片であるか（ここで、m1は、8～26の整数である）、またはそのC末端断片は、配列番号2、もしくはm2アミノ酸の長さを有するその断片、好ましくは配列番号2のアミノ酸1～m2を包含する断片である（ここで、m2は、13～31の整数である）。
一実施形態では、そのC末端断片は、配列番号3、またはnアミノ酸の長さを有するその断片、好ましくは配列番号3のアミノ酸1～nを包含する断片である（ここで、nは、16～38の整数である）。
一実施形態では、HPV 6型L1タンパク質のN末端断片は、配列番号4に示される配列のC末端をそのα5領域内の任意のアミノ酸部位で切断することによって得られる断片と98％、98．5％、99％、99．5％、99％または100％の同一性を有し、
HPV 11型L1タンパク質のN末端断片は、配列番号5に示される配列のC末端をそのα5領域内の任意のアミノ酸部位で切断することによって得られる断片と98％、98．5％、99％、99．5％、99％または100％の同一性を有し、
HPV 16型L1タンパク質のN末端断片は、配列番号6に示される配列のC末端をそのα5領域内の任意のアミノ酸部位で切断することによって得られる断片と98％、98．5％、99％、99．5％、99％または100％の同一性を有し、
HPV 18型L1タンパク質のN末端断片は、配列番号7に示される配列のC末端をそのα5領域内の任意のアミノ酸部位で切断することによって得られる断片と98％、98．5％、99％、99．5％、99％または100％の同一性を有し、
HPV 31型L1タンパク質のN末端断片は、配列番号8に示される配列のC末端をそのα5領域内の任意のアミノ酸部位で切断することによって得られる断片と98％、98．5％、99％、99．5％、99％または100％の同一性を有し、
HPV 35型L1タンパク質のN末端断片は、配列番号9に示される配列のC末端をそのα5領域内の任意のアミノ酸部位で切断することによって得られる断片と98％、98．5％、99％、99．5％、99％または100％の同一性を有し、
HPV 39型L1タンパク質のN末端断片は、配列番号10に示される配列のC末端をそのα5領域内の任意のアミノ酸部位で切断することによって得られる断片と98％、98．5％、99％、99．5％、99％または100％の同一性を有し、
HPV 45型L1タンパク質のN末端断片は、配列番号11に示される配列のC末端をそのα5領域内の任意のアミノ酸部位で切断することによって得られる断片と98％、98．5％、99％、99．5％、99％または100％の同一性を有し、
HPV 51型L1タンパク質のN末端断片は、配列番号12に示される配列のC末端をそのα5領域内の任意のアミノ酸部位で切断することによって得られる断片と98％、98．5％、99％、99．5％、99％または100％の同一性を有し、
HPV 52型L1タンパク質のN末端断片は、配列番号13に示される配列のC末端をそのα5領域内の任意のアミノ酸部位で切断することによって得られる断片と98％、98．5％、99％、99．5％、99％または100％の同一性を有し、
HPV 56型L1タンパク質のN末端断片は、配列番号14に示される配列のC末端をそのα5領域内の任意のアミノ酸部位で切断することによって得られる断片と98％、98．5％、99％、99．5％、99％または100％の同一性を有し、
HPV 58型L1タンパク質のN末端断片は、配列番号15に示される配列のC末端をそのα5領域内の任意のアミノ酸部位で切断することによって得られる断片と98％、98．5％、99％、99．5％、99％または100％の同一性を有する。
一実施形態では、N末端断片のC末端は、C末端断片のN末端に直接またはリンカーによって接続される。
一実施形態では、前記N末端断片のC末端が前記C末端断片のN末端に接続される場合、連続したアミノ酸配列RKFLは、スプライシング部位のプラスまたはマイナス4アミノ酸位置の範囲内に存在し、
好ましくは、連続したアミノ酸配列LGRKFLは、スプライシング部位のプラスまたはマイナス6アミノ酸位置の範囲内に存在する。
一実施形態では、キメラHPV 6型、11型、16型、18型、31型、35型、39型、45型、51型、52型、56型および58型キメラHPV L1タンパク質は、それぞれ配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26および配列番号27に対して98％、98．5％、99％、99．5％または100％の同一性を有し、HPV 33型L1タンパク質およびHPV 59型L1タンパク質は、それぞれ配列番号28および配列番号29に対して98％、98．5％、99％、99．5％または100％の同一性を有する。
一実施形態では、製剤は、それぞれ配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26および配列番号27に示されるアミノ酸配列を有するHPV 6型、11型、16型、18型、31型、35型、39型、45型、51型、52型、56型および58型キメラHPV L1タンパク質と、
それぞれ配列番号28および配列番号29に示されるアミノ酸配列を有するHPV 33型L1タンパク質およびHPV 59型L1タンパク質とを含む。
一態様では、本発明は、多価ヒトパピローマウイルスウイルス様粒子ワクチン製剤の安定な製剤を対象に投与するステップを含む、HPVに関連する疾患または感染を予防する方法を提供する。予防は治療と考えてもよく、この2つの用語は区別なく使用される。一実施形態では、対象はヒトである。
一態様では、製剤は、2～8℃で少なくとも24ヶ月間、および25℃で少なくとも16週間安定である。
一態様では、本発明は、HPVに関連する疾患または感染を予防するためのワクチンの調製におけるヒトパピローマウイルスウイルス様粒子ワクチン製剤の使用を提供する。
実施例1の各製剤試料の吸着度試験の結果を示す。 実施例1の各製剤試料の抗原含有量の分析結果を示す。T0：37℃、0週目；37℃＿1W：37℃、1週目；37℃＿2 W：37℃、2週目；37℃ 4W：37℃ 4週目。 実施例2の各製剤試料の吸着度試験の結果を示す。 実施例2の各製剤試料の抗原含有量の分析結果を示す。T0：37℃、0週目；37℃＿1W：37℃、1週目；37℃＿2 W：37℃、2週目；37℃ 4W：37℃ 4週目。 実施例3の各製剤試料の吸着度試験の結果を示す。 実施例3の各製剤試料の抗原含有量の分析結果を示す。T0：37℃、0週目；37℃＿1W：37℃、1週目；37℃＿2 W：37℃、2週目；37℃ 4W：37℃ 4週目。 実施例4の各製剤試料の吸着度試験の結果を示す。 実施例4の各製剤試料の抗原含有量の分析結果を示す。T0：37℃、0週目；37℃＿1W：37℃、1週目；37℃＿2 W：37℃、2週目；37℃ 4W：37℃ 4週目。
本発明は、ヒトパピローマウイルスワクチンの安定な製剤を提供し、保存および輸送の過程における抗体安定性の問題を解決し、投与前抗原が、予防目的を満たす免疫原性および安全性を有したままであることを確実にする
用語「製剤」は、有効な様式で活性成分の生物学的活性を維持し、対象にとって許容できないほど毒性である他の成分を含有しない組成物を指す。そのような製剤は無菌である。用語「無菌」は、生きている細菌が存在しないこと、またはあらゆる生きている微生物およびそれらの胞子が存在しないかもしくは実質的に存在しないことを指す。
本明細書で使用される場合、「安定な」製剤は、活性成分が保存後にその物理的および／もしくは化学的安定性ならびに／または生物学的活性を実質的に保持する製剤を指す。好ましくは、製剤は、保存後にその物理的および化学的安定性ならびにその生物学的活性を実質的に保持する。
用語「患者」または「対象」は、区別なく使用され、本発明による病態または疾患に罹患している任意の哺乳動物を指す。好ましくは、ヒト。
本明細書で使用される場合、「生理学的に許容される」は、緩衝液、賦形剤または塩の濃度またはイオン強度が、製剤を免疫された標的宿主、例えば、ヒトと生物学的に適合性にすることを意味する。
本発明の安定な製剤は、ヒトパピローマウイルスウイルス様粒子と、緩衝液と、浸透圧調節剤と、アルミニウムアジュバントとを含む。
用語「含む（comprising）」および「含有する（containing）」は、言及された成分に加えて追加の成分が含まれ得ることを意味する。
本明細書およびその添付の特許請求の範囲で使用する場合、単数形「a」、「an」、「the」および「said」は、文脈上他に明確に指示されない限り、複数の指示対象を含む。
本明細書で使用される場合、「緩衝液」は、そのコンジュゲート酸－塩基対の作用によるpH変化に抵抗する緩衝溶液を指す。本発明の一実施形態では、ヒスチジン緩衝液が使用され、製剤溶液のpHは、好ましくは約5．9～6．5、さらに好ましくは6．2である。
本明細書で使用される場合、「界面活性剤（surfactant）」は、界面活性剤（surface active agent）を指し、一実施形態では、本明細書の界面活性剤はポリソルベート80である。
用語「浸透圧調節剤」は、薬学的に許容される浸透圧調節剤を意味する。好適な浸透圧調節剤には、限定するものではないが、塩が含まれ、本発明の一実施形態では、好適な浸透圧調節剤は、約150mM～320mMの濃度を有する塩化ナトリウム（NaCl）である。
用語「アジュバント」は、免疫応答を増強する化合物または混合物を指す。特に、ワクチンは、アジュバントを含み得る。本発明で使用されるアジュバントは、アルミニウムヒドロキシホスフェート（AlPO4）、非晶質アルミニウムヒドロキシホスフェートサルフェート（AAHS）または水酸化アルミニウム（Al（OH）3）、好ましくはアルミニウムヒドロキシホスフェート（AlPO4）のうちの1つ以上から選択される。
選択された温度で選択された期間にわたって保存した後のタンパク質の「安定性」は、いくつかの異なる方法で定性的および／または定量的に評価され得る。本発明の実施形態では、酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）を使用して、組換えヒトパピローマウイルス中和抗体に結合する活性抗原の含有量を測定し、T0に対する各時点での活性抗原含有量の比を使用して、対応する製剤の安定性を比較した。酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）を使用して、遠心分離によって、リン酸アルミニウムアジュバントに吸着されなかった抗原の含有量を測定し、次いで、吸収度を計算した。組換えヒトパピローマウイルス中和抗体に対するヒトパピローマウイルスワクチン製剤および陽性対照のEC50をそれぞれ決定し、ワクチン製剤と陽性対照とのEC50比を計算し、それによって、ワクチンのインビトロ相対効力を決定すること。
用語「免疫原性」は、タンパク質またはポリペプチドなどの物質が免疫応答を刺激する、すなわち、抗体の産生、特に体液性応答、または刺激された細胞によって媒介される応答を生じる応答を刺激する能力を指す。
用語「HPV」または「HPVウイルス」は、約8kbのサイズの二本鎖閉ループDNAゲノムを有する非被覆DNAウイルスであり、3つの領域に一般に分けることができる、パピローマウイルス科（Papillomaviridae）のパピローマウイルスを指す：（1）E1、E2、E4～E7ウイルスの複製、転写および形質転換に関連する非構造タンパク質をコードする6つのオープンリーディングフレーム、ならびにE3およびE8オープンリーディングフレームを含む初期領域（E）；（2）後期領域（L）は、主要カプシドタンパク質L1および副カプシドタンパク質L2をコードするリーディングフレームを含む；（3）長い調節領域（long regulatory region）（LCR）は、いかなるタンパク質もコードしないが、複製起点および複数の転写因子結合部位を有する。
用語「HPV L1タンパク質」および「HPV L2タンパク質」は、HPV遺伝子の後期領域（L）によってコードされ、HPV感染サイクルの中期および後期に合成されるタンパク質を指す。L1タンパク質は、主要カプシドタンパク質であり、55～60kDaの分子量を有する。L2タンパク質は、副カプシドタンパク質である。72個のL1五量体は、閉ループ二本鎖DNA微小染色体を包む、正二十面体HPVウイルス粒子の殻を形成する。L2タンパク質は、L1タンパク質の内側ライニングに位置する。
用語「ウイルス様粒子」は、ウイルス核酸を含まない、ウイルスの1つ以上の構造タンパク質を含有する中空粒子である。
用語「任意の単一型のパピローマウイルスウイルス様粒子の濃度」は、製剤中の任意の単一型のパピローマウイルスウイルス様粒子の含有量を指し、用語「すべての型のパピローマウイルスウイルス様粒子の総濃度」は、製剤中に含まれる各単一型のパピローマウイルスウイルス様粒子の濃度の和である。
本発明の一実施形態では、2020年7月17日に出願された特許出願PCT／CN2020／102601に記載されているヒトパピローマウイルス多価免疫原性組成物が採用され、PCT／CN2020／102601は、参照により本明細書および特許請求の範囲に組み込まれる。
本発明の特に好ましい実施形態では、製剤は、0．74mg／mLのパピローマウイルスウイルス様粒子と、1．0mg／mLのリン酸アルミニウムアジュバントと、18mMヒスチジン緩衝液と、320mM塩化ナトリウムと、6．2のpHとを含む。ここで、ワクチンは、調製中のプロセス残留物に起因して0．3mg／mL以下の濃度のポリソルベート80を含む。製剤は、良好な安定性を有し、2～8℃で少なくとも24ヶ月間、および25℃で少なくとも16週間安定に保存することができる。
本発明の製剤は、液体形態で提供されてもよいか、または凍結乾燥形態で提供されてもよい。凍結乾燥製剤は、投与前に再構成され得る。
実施例
本発明は、以下の実施例を参照することによって、さらに完全に理解されるであろう。ただし、それらは本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。文書、特許および特許出願はいずれも、参照により本明細書に組み込まれる。
下記の実施例では、使用される様々な型のパピローマウイルスウイルス様粒子の調製、特性評価および性能特定は、2020年7月17日に出願された特許出願PCT／CN2020／102601に記載されている。
以下の実施例では、使用した検出方法は以下の通りであった：
1）抗原含有量の分析（酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）
陽性対照（ヒトパピローマウイルスウイルス様粒子標準、提供元：Sino Cell Tech Ltd．、それぞれ配列番号16～29のアミノ酸配列に対応するキメラHPV 6型、16型、18型、31型、35型、30型、45型、51型、52型および56型キメラHPV L1タンパク質ならびにHPV 33型およびHPV 59型L1タンパク質、以下と同じ）および分析物を、脱離緩衝液を使用して完全に溶解させ、陽性対照および被検出分析物とした。
組換えヒトパピローマウイルス中和抗体（提供元：Sino Biological，Inc．、以下と同じ）を固相担体と組み合わせて固相抗体を形成した。陽性対照および被検出分析物を試料希釈剤によって希釈し、次いで、固相抗体と組み合わせて固相抗原抗体複合体を形成する。次いで、酵素標識抗体を加え、現像のために基質を加え、波長450nmで発色産物を読み取った。一連の陽性対照の濃度と対応する吸光度とに対して線形回帰を行い、分析物の吸光度値を線形回帰方程式に代入し、被検出試料の抗原含有量を求める（M．Shank－Retzlaff，F．Wang，T．Morley et al．Correlation between Mouse Potency and In Vitro Relative Potency for Human Papillomavirus Type 16 Virus－Like Particles and Gardasil Vaccine Samples．Human Vaccines，1：5，191－197）。
2）吸着度分析（酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）
組換えヒトパピローマウイルス中和抗体を固相担体と組み合わせて固相抗体を形成する。被検出試料を遠心分離し、上清を分析物とする。陽性対照および分析物をそれに応じて試料希釈剤によって希釈し、次いで、固相抗体と組み合わせて固相抗原抗体複合体を形成する。次いで、酵素標識抗体を加え、現像のために基質を加え、波長450nmで発色産物を読み取った。一連の陽性対照の濃度と対応する吸光度とに対して線形回帰を行い、分析物によって測定した吸光度値を線形回帰方程式に代入して上清の抗原濃度を求め、以下の式により被検出試料の吸着度を計算する（Michael J．Caulfield，Li Shi，Su Wang et al．Effect of Alternative Aluminum Adjuvants on the Absorption and Immunogenicity of HPV16 L1 VLPs in Mice．Human Vaccines 3：4，139－146）。
吸着度（％）＝（1－上清中の抗原濃度／被検出試料の抗原濃度）％。
3）インビトロ相対効力、IVRP（IVRP）の決定
脱離緩衝液を使用して陽性対照（試験試料中のタンパク質配列と同じ配列を有する、Sino Cell Tech Ltdから入手した14価ヒトパピローマウイルスワクチン（6型、11型、16型、18型、31型、33型、35型、39型、45型、51型、52型、56型、58型および59型）対照生成物）および分析物を完全に溶解させ、陽性対照および被検出分析物として使用した。組換えヒトパピローマウイルス中和抗体を2μg／mLの最終濃度に希釈し、96ウェルプレートに100μL／ウェルで加え、プレートを軽くたたいて試料を混合し、試料を4℃で一晩コーティングした。プレートを200μL／ウェルの用量の洗浄液を用いて1回洗浄し、ELISAプレートを乾燥させた。次いで、ELISAプレートを300μL／ウェルのブロッキング溶液を用いて室温で1時間ブロッキングした。試料を300μL／ウェルの洗浄液を用いて2回洗浄し、100μLの処理したブランク対照（分析物に対応する緩衝液）と、陽性対照と、被検出分析物とを各ウェルに加え、室温で1時間インキュベートした。プレートを200μL／ウェルの洗浄液を用いて3回洗浄した後、希釈した酵素標識組換えヒトパピローマウイルス中和抗体を100μL／ウェルで加えた。室温で1時間インキュベートした後、プレートを200μL／ウェルの洗浄液を用いて3回洗浄し、現像液を200μL／ウェルで加え、室温に20±5分間置いた。50μL／ウェルの停止溶液を加えることによって反応を停止させた。450nmでの吸光度をマイクロプレートリーダーによって検出した。コンピュータプログラムOriginまたは4パラメータフィッティング法を使用して処理し、横軸に陽性対照または分析物の濃度を取り、縦軸に平均吸光度を取って分析物および陽性対照のEC50を求め、分析物のEC50を陽性対照のEC50で割って分析物のインビトロ相対効力を求める（M．Shank－Retzlaff，F．Wang，T．Morley et al．Correlation between Mouse Potency and In Vitro Relative Potency for Human Papillomavirus Type 16 Virus－Like Particles and Gardasil Vaccine Samples．Human Vaccines，1：5，191－197）。
実施例1：界面活性剤濃度のスクリーニング試験
本実施例のパピローマウイルスウイルス様粒子ワクチン製剤の組成を以下の表に示す：
パピローマウイルスウイルス様粒子ワクチン製剤の調製方法：
パピローマウイルスウイルス様粒子ワクチン製剤中のパピローマウイルスウイルス様粒子、リン酸アルミニウムアジュバント、ヒスチジン、塩化ナトリウムおよびポリソルベート80のpH、対応する濃度がそれぞれ表1の要件を満たすように、製剤に適したHPV 18ウイルス様粒子を一定量採取し、次いで、リン酸アルミニウムアジュバントと混合し、4℃で一晩吸着させ、アリコートを分注した。これを対応する番号によってマークし、試料を37℃のインキュベーターに入れ、0週目に吸着度および抗原含有量の分析のために、ならびに1、2および4週目に抗原含有量分析のために取り出した。
分析試験方法：
吸着度分析：検出原理は、リン酸アルミニウムアジュバントに吸着されていない抗原を遠心分離によって得、その含有量を分析して吸着度を計算するというものである。
抗原含有量分析：検出原理は、組換えヒトパピローマウイルス中和抗体に結合することができる活性抗原含有量をELISAによって測定し、各時点での活性抗原含有量とT0の活性抗原含有量との比を比較することによって各製剤の安定性を比較するというものである。比が高いほど、製剤中の活性抗原含有量が高くなり、活性がさらに良好に維持された。
試験結果を表2～表3および図1～図2に示す。
試験結果から、2つのパピローマウイルスウイルス様粒子ワクチン製剤の両方の吸着度が99％超であり、F1とF2との間で抗原含有量の変化に有意差がない、すなわち、F1およびF2の安定性が同等であることが示された。
実施例2：pHのスクリーニング試験
本実施例のパピローマウイルスウイルス様粒子ワクチン製剤の組成を以下の表に示す：
パピローマウイルスウイルス様粒子ワクチン製剤の調製方法：
パピローマウイルスウイルス様粒子ワクチン製剤中のパピローマウイルスウイルス様粒子、リン酸アルミニウムアジュバント、ヒスチジン、塩化ナトリウムおよびポリソルベート80のpH、対応する濃度がそれぞれ表4の要件を満たすように、製剤に適したHPV 18ウイルス様粒子を一定量採取し、次いで、リン酸アルミニウムアジュバントと混合し、4℃で一晩吸着させ、アリコートを分注した。これを対応する番号によってマークし、試料を37℃のインキュベーターに入れ、0週目に吸着度および抗原含有量の分析のために、ならびに1、2および4週目に抗原含有量分析のために取り出した。
分析試験方法：
吸着度分析：検出原理は、リン酸アルミニウムアジュバントに吸着されていない抗原を遠心分離によって得、その含有量を分析して吸着度を計算するというものである。
抗原含有量分析：検出原理は、組換えヒトパピローマウイルス中和抗体に結合することができる活性抗原含有量をELISAによって測定し、各時点での活性抗原含有量とT0の活性抗原含有量との比を比較することによって各製剤の安定性を比較するというものである。比が高いほど、製剤中の活性抗原含有量が高くなり、活性がさらに良好に維持された。
試験結果を表5～表6および図3～図4に示す。
試験結果から、3つのパピローマウイルスウイルス様粒子ワクチン製剤の吸着度が99％超であり、F1およびF2ではパピローマウイルスウイルス様粒子ワクチンの抗原含有量変化傾向がF3製剤よりも良好であること、すなわち、F1およびF2の安定性がF3よりも良好であることが示された。
実施例3：浸透圧調節剤濃度のスクリーニング試験
本実施例のパピローマウイルスウイルス様粒子ワクチン製剤の組成を以下の表に示す：
パピローマウイルスウイルス様粒子ワクチン製剤の調製方法：
パピローマウイルスウイルス様粒子ワクチン製剤中のパピローマウイルスウイルス様粒子、リン酸アルミニウムアジュバント、ヒスチジン、塩化ナトリウムおよびポリソルベート80のpH、対応する濃度がそれぞれ表7の要件を満たすように、製剤に適したHPV 18ウイルス様粒子を一定量採取し、次いで、リン酸アルミニウムアジュバントと混合し、4℃で一晩吸着させ、アリコートを分注した。これを対応する番号によってマークし、試料を37℃のインキュベーターに入れ、0週目に吸着度および抗原含有量の分析のために、ならびに1、2および4週目に抗原含有量分析のために取り出した。
分析試験方法：
吸着度分析：検出原理は、リン酸アルミニウムアジュバントに吸着されていない抗原を遠心分離によって得、その含有量を分析して吸着度を計算するというものである。
抗原含有量分析：検出原理は、組換えヒトパピローマウイルス中和抗体に結合することができる活性抗原含有量をELISAによって測定し、各時点での活性抗原含有量とT0の活性抗原含有量との比を比較することによって各製剤の安定性を比較するというものである。比が高いほど、製剤中の活性抗原含有量が高くなり、活性がさらに良好に維持された。
試験結果を表8～表9および図5～図6に示す。
試験結果から、2つのパピローマウイルスウイルス様粒子ワクチン製剤の吸着度が99％超であることが示された。37℃下、4週間でのF1製剤およびF2製剤の活性抗原含有量変化に有意差はなく、すなわち、F1およびF2の安定性は同等であった。
実施例4：緩衝液濃度のスクリーニング試験
本実施例のパピローマウイルスウイルス様粒子ワクチン製剤の組成を以下の表に示す：
パピローマウイルスウイルス様粒子ワクチン製剤の調製方法；
パピローマウイルスウイルス様粒子ワクチン製剤中のパピローマウイルスウイルス様粒子、リン酸アルミニウムアジュバント、ヒスチジン、塩化ナトリウムおよびポリソルベート80のpH、対応する濃度がそれぞれ表10の要件を満たすように、製剤に適したHPV 18ウイルス様粒子を一定量採取し、次いで、リン酸アルミニウムアジュバントと混合し、4℃で一晩吸着させ、アリコートを分注した。これを対応する番号によってマークし、試料を37℃のインキュベーターに入れ、0週目に吸着度および抗原含有量の分析のために、ならびに1、2および4週目に抗原含有量分析のために取り出した。
分析試験方法：
吸着度分析：検出原理は、リン酸アルミニウムアジュバントに吸着されていない抗原を遠心分離によって得、その含有量を分析して吸着度を計算するというものである。
抗原含有量分析：検出原理は、組換えヒトパピローマウイルス中和抗体に結合することができる活性抗原含有量をELISAによって測定し、各時点での活性抗原含有量とT0の活性抗原含有量との比を比較することによって各製剤の安定性を比較するというものである。比が高いほど、製剤中の活性抗原含有量が高くなり、活性がさらに良好に維持された。
試験結果を表11～表12および図7～図8に示す。
試験結果から、3つのパピローマウイルスウイルス様粒子ワクチン製剤の吸着度が99％超であり、F1およびF2ではパピローマウイルスウイルス様粒子ワクチンの抗原含有量変化傾向がF3製剤よりも良好であること、すなわち、F1およびF2の安定性がF3よりも良好であることが示された。
実施例5：各単一型（6型、11型、16型、18型、31型、33型、35型、39型、45型、51型、52型、56型、58型、59型）パピローマウイルスウイルス様粒子ワクチン製剤の組成確認試験
パピローマウイルスウイルス様粒子ワクチン製剤（製剤：0．74mg／mLパピローマウイルスウイルス様粒子＋1．0mg／mLリン酸アルミニウムアジュバント＋18mMヒスチジン緩衝液＋320mM塩化ナトリウムpH6．2）の各単一型（6型、11型、16型、18型、31型、33型、35型、39型、45型、51型、52型、56型、58型および59型）をそれぞれ2～8℃で安定性モニタリングに供した。ここで、ワクチンは、調製中のプロセス残留物に起因して0．3mg／mL以下の濃度のポリソルベート80を含有した。モニタリング時点は3m（3ヶ月）、6m（6ヶ月）、9m（9ヶ月）および12m（12ヶ月）であり、吸着度およびインビトロ相対効力をモニタリングした。
分析試験方法：
吸着度分析：検出原理は、リン酸アルミニウムアジュバントに吸着されていない抗原を遠心分離によって得、その含有量を分析して吸着度を計算するというものである。
インビトロ相対効力：この方法の検出原理は、分析物および陽性対照のEC50をそれぞれ組換えヒトパピローマウイルス中和抗体を用いて検出し、次いで、そのEC50の百分率比を計算することである。値が高いほど、インビトロ相対効力が高く、試験試料の品質が良好である。
実験結果を表13に示す。
実験結果は、本発明によって開示されるパピローマウイルスウイルス様粒子ワクチン製剤の各単一型が良好な安定性を有し、2～8℃の条件下で少なくとも12ヶ月間安定に保存され得ることを示す。
実施例6 14価ヒトパピローマウイルスワクチン（6型、11型、16型、18型、31型、33型、35型、39型、45型、51型、52型、56型、58型、59型）の製剤調製および組成確認
14価ヒトパピローマウイルスワクチン（6型、11型、16型、18型、31型、33型、35型、39型、45型、51型、52型、56型、58型、59型）の調製方法：
パピローマウイルスウイルス様粒子ワクチン製剤（組成：0．74mg／mLパピローマウイルスウイルス様粒子＋1．0mg／mLリン酸アルミニウムアジュバント＋18mMヒスチジン緩衝液＋320mM塩化ナトリウム、pH値：6．2）の各単一型（6型、11型、16型、18型、31型、33型、35型、39型、45型、51型、52型、56型、58型および59型）をそれぞれ採取し、一定の体積比（6型、11型、16型、18型、31型、33型、35型、39型、45型、51型、52型、56型、58型、59型＝1．5：2：3：2：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1）で混合して、ウイルス様粒子の各型のそれぞれ0．06mg／mL、0．08mg／mL、0．12mg／mL、0．08mg／mL、0．04mg／mL、0．04mg／mL、0．04mg／mL、0．04mg／mL、0．04mg／mL、0．04mg／mL、0．04mg／mL、0．04mg／mL、0．04mg／mL、0．04mg／mLの濃度に対応する14価ヒトパピローマウイルスワクチン（6型、11型、16型、18型、31型、33型、35型、39型、45型、51型、52型、56型、58型、59型）半製品を得、次いで、ペニシリンバイアルに充填し、次いで、これにコルク栓をし、キャップをし、標識して、組換え14価ヒトパピローマウイルスワクチン（6型、11型、16型、18型、31型、33型、35型、39型、45型、51型、52型、56型、58型および59型）を調製し、ここで、ワクチンは、調製プロセス中のプロセス残留物に起因して0．3mg／mL以下の濃度のポリソルベート80を含んでいた。次いで、安定性モニタリングを2～8℃（時点は3、6、9、12、18および24ヶ月である）および25±2℃（時点は2週間、4週間、8週間および16週間である）で行い、インビトロ相対効力および吸着度をモニタリングした。
分析試験方法：
吸着度分析：検出原理は、リン酸アルミニウムアジュバントに吸着されていない抗原を遠心分離によって得、その含有量を分析して吸着度を計算するというものである。
抗原含有量分析：検出原理は、組換えヒトパピローマウイルス中和抗体に結合することができる活性抗原含有量をELISAによって測定し、各時点での活性抗原含有量とT0の活性抗原含有量との比を比較することによって各製剤の安定性を比較するというものである。比が高いほど、製剤中の活性抗原含有量が高くなり、活性がさらに良好に維持された。
実験結果を表14～表17に示す。
実験結果は、本発明によって開示される14価ヒトパピローマウイルスワクチン（6型、11型、16型、18型、31型、33型、35型、39型、45型、51型、52型、56型、58型および59型）調製物が良好な安定性を有し、2～8℃の温度で少なくとも24ヶ月間、および25℃の温度で少なくとも16週間安定に保存され得ることを示す。

Claims (20)

  1. （a）複数のヒトパピローマウイルスウイルス様粒子と、
    （b）アジュバントと、
    （c）生理学的に許容される濃度の緩衝液と、
    （d）生理学的に許容される濃度の浸透圧調節剤と、任意に、
    （e）生理的に許容される濃度の界面活性剤と、を含み、
    前記ヒトパピローマウイルスウイルス様粒子が、HPV 6型、11型、16型、18型、31型、33型、45型、52型および58型のL1タンパク質によって構築されたHPVウイルス様粒子、ならびに
    他の病原性HPV型のL1タンパク質から構築された1つ以上のHPVウイルス様粒子から選択され、
    そのヒトパピローマウイルスウイルス様粒子が、アジュバントに吸着される、
    HPVに関連する疾患または感染を予防するための多価ヒトパピローマウイルスウイルス様粒子ワクチンの安定な製剤。
  2. 前記緩衝液が、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液またはヒスチジン緩衝液のうちの1つ以上から選択され、
    前記浸透圧調節剤が、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウムまたは硫酸ナトリウムのうちの1つ以上から選択され、
    前記界面活性剤が、ポリエトキシエーテル、好ましくはポリソルベート80であり、
    前記アジュバントが、好ましくはアルミニウムアジュバント、さらに好ましくはアルミニウムヒドロキシホスフェート（AlPO4）、非晶質アルミニウムヒドロキシホスフェートサルフェート（AAHS）または水酸化アルミニウム（Al（OH）3）のうちの1つ以上、最も好ましくはアルミニウムヒドロキシホスフェート（AlPO4）である、
    請求項1に記載の製剤。
  3. （a）すべての型のパピローマウイルスウイルス様粒子の総濃度が、40～740μg／mLであり、
    （b）前記緩衝液の濃度が、10mM～26mM、好ましくは10mM、18mMまたは26mMであり、
    （c）前記浸透圧調節剤の濃度が、150mM～320mM、好ましくは150mM～320mMであり、
    （d）前記界面活性剤の濃度が0～0．02重量％であり、
    （e）前記アジュバントの濃度が約1．0mg／mLであり、
    （f）前記製剤のpHが、5．9～6．5、好ましくは5．9、6．2または6．5である、
    請求項1または2に記載の製剤。
  4. 前記多価パピローマウイルスウイルス様粒子に含まれる任意の単一型のパピローマウイルスウイルス様粒子の濃度が、40μg／mL～120μg／mLである、請求項3に記載の製剤。
  5. 0．74mg／mLのすべての型の総パピローマウイルスウイルス様粒子と、1．0mg／mLのリン酸アルミニウムアジュバントと、18mMヒスチジン緩衝液と、320mM塩化ナトリウムと、6．2のpHと、
    任意に、0．3mg／mL以下の濃度のポリソルベート80とを含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の製剤。
  6. 1つ以上の他の病原性HPV型が、HPV 35型、39型、51型、56型および59型から選択される、請求項5に記載の製剤。
  7. HPVウイルス様粒子のうちの少なくとも1つが、キメラHPV L1タンパク質を含むキメラHPVウイルス様粒子であり、前記キメラHPV L1タンパク質が、そのN末端からそのC末端に向かって、
    a．第1のパピローマウイルス型のL1タンパク質に由来し、第1のパピローマウイルス型の前記L1タンパク質の免疫原性を維持するN末端断片であって、第1のパピローマウイルス型の前記L1タンパク質が、HPV 6型、11型、16型、18型、31型、35型、39型、45型、51型、52型、56型、58型、および1つ以上の他の病原性HPV型から選択されるN末端断片と、
    b．第2のパピローマウイルス型のL1タンパク質に由来するC末端断片であって、第2のパピローマウイルス型の前記L1タンパク質が、他の型のL1タンパク質よりも良好な発現レベルおよび溶解性を有するC末端断片とを含み、
    前記キメラHPV L1タンパク質が、第1のパピローマウイルス型の前記L1タンパク質の免疫原性を有する、請求項6に記載の製剤。
  8. 前記N末端断片が、第1のパピローマウイルス型の前記L1タンパク質の天然配列のC末端をそのα5領域内の任意のアミノ酸位置で切断することによって得られる断片、およびそれと少なくとも98％の同一性を有する断片であり、
    前記C末端断片が、第2のパピローマウイルス型の前記L1タンパク質の天然配列のN末端をそのα5領域内の任意のアミノ酸位置で切断することによって得られる断片、ならびに前記断片へのさらなる変異、欠失および／または付加から生じる機能的変異体である、
    請求項7に記載の製剤。
  9. 前記C末端断片が、1つ以上の核局在化配列を含む、請求項8に記載の製剤。
  10. 第1の型の前記パピローマウイルスL1タンパク質が、HPV 6型、11型、16型、18型、31型、35型、39型、45型、51型、52型、56型または58型から選択され、好ましくは、その天然配列が、それぞれ配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40または配列番号41に示されるコード遺伝子によってコードされるアミノ酸配列であり、
    第2の型のそのパピローマウイルスL1タンパク質が、HPV 16型、28型、33型、59型または68型L1タンパク質から選択され、
    さらに好ましくは、第2の型の前記パピローマL1タンパク質が、HPV 33型または59型L1タンパク質からなる群から選択される、
    請求項7に記載の製剤。
  11. C末端断片が、配列番号1、もしくはm1アミノ酸の長さを有するその断片、好ましくは配列番号1のアミノ酸1～m1を包含する断片であるか（ここで、m1は、8～26の整数である）、またはそのC末端断片が、配列番号2、もしくはm2アミノ酸の長さを有するその断片、
    好ましくは配列番号2のアミノ酸1～m2を含む断片である（ここで、m2は、13～31の整数である）、請求項10に記載の製剤。
  12. C末端断片が、配列番号3、またはnアミノ酸の長さを有するその断片、好ましくは配列番号3のアミノ酸1～nを包含する断片である（ここで、nは、16～38の整数である）、請求項10に記載の製剤。
  13. 前記HPV 6型L1タンパク質の前記N末端断片が、配列番号4に示される配列のC末端をそのα5領域内の任意のアミノ酸部位で切断することによって得られる断片と98％、98．5％、99％、99．5％、99％または100％の同一性を有し、
    前記HPV 11型L1タンパク質の前記N末端断片が、配列番号5に示される配列のC末端をそのα5領域内の任意のアミノ酸部位で切断することによって得られる断片と98％、98．5％、99％、99．5％、99％または100％の同一性を有し、
    前記HPV 16型L1タンパク質の前記N末端断片が、配列番号6に示される配列のC末端をそのα5領域内の任意のアミノ酸部位で切断することによって得られる断片と98％、98．5％、99％、99．5％、99％または100％の同一性を有し、
    前記HPV 18型L1タンパク質の前記N末端断片が、配列番号7に示される配列のC末端をそのα5領域内の任意のアミノ酸部位で切断することによって得られる断片と98％、98．5％、99％、99．5％、99％または100％の同一性を有し、
    前記HPV 31型L1タンパク質の前記N末端断片が、配列番号8に示される配列のC末端をそのα5領域内の任意のアミノ酸部位で切断することによって得られる断片と98％、98．5％、99％、99．5％、99％または100％の同一性を有し、
    前記HPV 35型L1タンパク質の前記N末端断片が、配列番号9に示される配列のC末端をそのα5領域内の任意のアミノ酸部位で切断することによって得られる断片と98％、98．5％、99％、99．5％、99％または100％の同一性を有し、
    前記HPV 39型L1タンパク質の前記N末端断片が、配列番号10に示される配列のC末端をそのα5領域内の任意のアミノ酸部位で切断することによって得られる断片と98％、98．5％、99％、99．5％、99％または100％の同一性を有し、
    前記HPV 45型L1タンパク質の前記N末端断片が、配列番号11に示される配列のC末端をそのα5領域内の任意のアミノ酸部位で切断することによって得られる断片と98％、98．5％、99％、99．5％、99％または100％の同一性を有し、
    前記HPV 51型L1タンパク質の前記N末端断片が、配列番号12に示される配列のC末端をそのα5領域内の任意のアミノ酸部位で切断することによって得られる断片と98％、98．5％、99％、99．5％、99％または100％の同一性を有し、
    前記HPV 52型L1タンパク質の前記N末端断片が、配列番号13に示される配列のC末端をα5領域内の任意のアミノ酸部位に切断することによって得られる断片と98％、98．5％、99％、99．5％、99％または100％の同一性を有し、
    前記HPV 56型L1タンパク質の前記N末端断片が、配列番号14に示される配列のC末端をα5領域内の任意のアミノ酸部位に切断することによって得られる断片と98％、98．5％、99％、99．5％、99％または100％の同一性を有し、
    前記HPV 58型L1タンパク質の前記N末端断片が、配列番号15に示される配列のC末端をそのα5領域内の任意のアミノ酸部位で切断することによって得られる断片と98％、98．5％、99％、99．5％、99％または100％の同一性を有する、
    請求項7に記載の製剤。
  14. 前記N末端断片のC末端が、前記C末端断片のN末端に直接またはリンカーによって接続される、請求項7に記載の製剤。
  15. 前記N末端断片のC末端が前記C末端断片のN末端に接続される場合、連続したアミノ酸配列RKFLが、スプライシング部位のプラスまたはマイナス4アミノ酸位置の範囲内に存在し、
    好ましくは、連続したアミノ酸配列LGRKFLが、スプライシング部位のプラスまたはマイナス6アミノ酸位置の範囲内に存在する、請求項7に記載の製剤。
  16. 6型、11型、16型、18型、31型、35型、39型、45型、51型、52型、56型および58型の前記キメラHPV L1タンパク質が、それぞれ配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26および配列番号27に対して98％、98．5％、99％、99．5％または100％の同一性を有し、
    HPV 33型L1タンパク質およびHPV 59型L1タンパク質が、それぞれ配列番号28および配列番号29に対して98％、98．5％、99％、99．5％または100％の同一性を有する、
    請求項7に記載の製剤。
  17. それぞれ配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26および配列番号27に示されるアミノ酸配列を有するHPV 6型、11型、16型、18型、31型、35型、39型、45型、51型、52型、56型および58型キメラHPV L1タンパク質と、
    それぞれ配列番号28および配列番号29に示されるアミノ酸配列を有するHPV 33型L1タンパク質およびHPV 59型L1タンパク質とを含む、
    請求項16に記載の製剤。
  18. 2～8℃で少なくとも24ヶ月間、および25℃で少なくとも16週間安定に保存され得ることを特徴とする、請求項1～17に記載のパピローマウイルスワクチンの製剤。
  19. 請求項1～18のいずれか一項に記載の製剤を対象に投与するステップ
    を含む、HPVに関連する疾患または感染を予防する方法。
  20. HPVに関連する疾患または感染を予防するためのワクチンの製剤における、請求項1～18のいずれか一項に記載の製剤の使用。
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