ES2239440T3 - Composicion polinucleotidica, procedimiento para la preparacion y utilizacion de la misma. - Google Patents
Composicion polinucleotidica, procedimiento para la preparacion y utilizacion de la misma.Info
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Abstract
Composición polinucleotídica liofilizada que comprende: (a) por lo menos un polinucleótido, (b) por lo menos un crioprotector, en el que la relación de polinucleótido a crioprotector es de 0, 001 a 1, 0 parte en peso de polinucleótido por 1, 0 parte en peso de crioprotector, y (c) de 0, 5 por ciento en peso a 6 por ciento en peso de agua, sobre la base del peso total de la composición polinucleotídica; en la que dicha composición polinucleotídica retiene por lo menos 90% de superenrollamiento durante un período de tiempo de por lo menos 10 días a 37ºC.
Description
Composición polinucleotídica, procedimiento para
la preparación y utilización de la misma.
La presente invención se refiere a una
composición polinucleotídica que presenta estabilidad mejorada. La
presente invención también se refiere a un procedimiento para la
preparación de la composición polinucleotídica mediante
liofilización.
Las composiciones polinucleotídicas se emplean
para diversos fines en el ámbito industrial, farmacéutico, médico,
nutricional y/o agrícola. Como ejemplo, los polinucleótidos son
útiles para la producción de proteínas que se emplean en estos
ámbitos. Además, los polinucleótidos son útiles por sí mismos como
reactivos in vivo, en protocolos para el
diagnóstico/obtención de imágenes, como reactivos en terapia génica,
en protocolos con reactivos antisentido y en aplicaciones de
vacunas, o también como fármacos utilizados para tratar o prevenir
diversas afecciones tales como defectos genéticos, enfermedades
infecciosas, cáncer y enfermedades autoinmunitarias. Los
polinucleótidos también son útiles como reactivos in vitro en
ensayos tales como pruebas de investigación biológica, pruebas
médicas, diagnósticas y de cribado, así como en pruebas para la
detección de la contaminación. Para cada una de las utilizaciones
mencionadas anteriormente, los polinucleótidos, tales como ADN
plasmídico, deben conservarse durante períodos de tiempo
prolongados, preferentemente a temperaturas que no requieran
refrigeración o congelación. Un problema que ha retrasado el
desarrollo de polinucleótidos para dichas utilizaciones es que los
polinucleótidos tienden a ser inestables cuando no están
congelados. Por ejemplo, se ha comprobado que la actividad de los
polinucleótidos disminuye cuando se dejan en solución durante
períodos de más de unas pocas horas.
Un procedimiento recomendable para medir la
estabilidad de los polinucleótidos es la pérdida del
superenrollamiento (o "SC") de los polinucleótidos a lo largo
del tiempo. El término "superenrollamiento" se define como el
estado físico de un polinucleótido en el que una cadena del
polinucleótido está desenroscada o superenroscada en relación con
otras cadenas del polinucleótido. La pérdida de superenrollamiento
a lo largo del tiempo tiene el efecto indeseable de reducir la
pureza de la composición polinucleotídica. Por ello, se han
realizado muchos intentos para solucionar este problema y aumentar
la estabilidad de los polinucleótidos. Uno de dichos intentos
incluye un procedimiento para la preparación de polinucleótidos que
implica precipitación seguida por desecación. Sin embargo, dichos
procedimientos no han logrado las estabilidades deseadas de los
polinucleótidos. Otros intentos descritos en la técnica anterior
incluyen la conservación de los polinucleótidos en soluciones
salinas; sin embargo, estos procedimientos también comportan una
pérdida de la estructura superenrollada.
Otro procedimiento para estabilizar
polinucleótidos implica la liofilización de los polinucleótidos. La
liofilización, también conocida como criodesecación, ha sido
utilizada en el pasado para estabilizar o conservar artículos tales
como alimentos, plasma sanguíneo, órganos vitales, proteínas,
células intactas tales como bacterias y organismos unicelulares
eucarióticos, así como sustancias biológicamente activas tales como
fármacos. El procedimiento de liofilización incluye la disolución
del material que va a ser liofilizado en un disolvente,
generalmente agua, y la congelación de la solución. Frecuentemente
se incluye cierta cantidad de crioprotector para estabilizar el
polinucleótido. Tras congelar la solución, se aplica vacío y el
material congelado se calienta gradualmente para sublimar el
disolvente en estado congelado. El material liofilizado final se
recupera típicamente en forma de costra de la misma forma y tamaño
que el material congelado, y es de suficiente porosidad como para
permitir su reconstitución. A comienzos de la década de 1980, la
American Type Culture Collection, por ejemplo, comercializó ADN
liofilizado estabilizado con el crioprotector lactosa.
El documento WO 95/27721 da a conocer partículas
liofilizadas que comprenden ARN, y el procedimiento para la
preparación de las mismas. Las partículas que se preparan son
secas, y, por ello, se considera que son casi insensibles a varios
procesos de degradación.
La solicitud PCT nº WO96/41873, publicada el 27
de diciembre de 1996, y la patente relacionada US nº 5.811.406,
publicada el 22 de septiembre de 1998, que se incorporan en la
presente memoria a título de referencia, dan a conocer la
estabilización de un complejo de polinucleótidos que contiene un
crioprotector mediante liofilización del complejo de forma no
descrita. Sin embargo, los parámetros del procedimiento de
liofilización pueden tener un impacto significativo en la
estabilidad y la solubilidad de una composición polinucleotídica.
El procedimiento de liofilización puede dar lugar a una baja
solubilidad de los polinucleótidos, lo que requiere la utilización
de más disolvente para lograr la reconstitución. Estos documentos
no se ocupan de los problemas de liofilización y, por tanto, no
describen ningún procedimiento para proporcionar composiciones
liofilizadas con estabilidad o solubilidad mejoradas.
Persiste la necesidad en la técnica de obtener
composiciones polinucleotídicas caracterizadas por presentar
estabilidad mejorada, particularmente para fines farmacéuticos, así
como de procedimientos para producir dichas composiciones
polinucleotídicas estables.
En un aspecto, la presente invención proporciona
una composición polinucleotídica liofilizada que comprende por lo
menos un polinucleótido y por lo menos un crioprotector, en la que
la relación del polinucleótido al crioprotector es de
aproximadamente 0,001 a aproximadamente 1,0 parte en peso de
polinucleótido por 1,0 parte en peso del crioprotector. Esta
composición también comprende desde aproximadamente 0,5 por ciento
en peso hasta aproximadamente 6 por ciento en peso agua, sobre la
base del peso total de la composición polinucleotídica liofilizada
final. La composición polinucleotídica de la presente invención se
caracteriza por presentar una estabilidad mejorada, en el sentido
de que retiene por lo menos 90% de superenrollamiento durante un
período de tiempo de por lo menos 10 días a una temperatura de
aproximadamente 37ºC.
En otro aspecto, la presente invención
proporciona un procedimiento para preparar una composición
polinucleotídica liofilizada caracterizada por presentar
estabilidad mejorada. Las etapas de este procedimiento incluyen
someter una solución polinucleotídica que contiene un crioprotector,
habiéndose enfriado dicha composición hasta su congelación y
habiéndose sometido a vacío, a un ciclo principal de secado que
comprende calentar gradualmente la solución polinucleotídica a una
temperatura desde aproximadamente -20ºC hasta aproximadamente 20ºC
durante un período de aproximadamente 5 a aproximadamente 30 horas,
evitando al mismo tiempo la licuefacción (también denominada
"retrofusión") de la composición. Este ciclo principal de
secado reduce el tiempo necesario para completar el procedimiento
de liofilización y proporciona el polinucleótido liofilizado
resultante en una estructura física sustancialmente amorfa que
retiene por lo menos 90% de superenrollamiento durante un período
de tiempo de por lo menos 10 días a una temperatura de
aproximadamente 37ºC. Este producto puede reconstituirse después en
una solución acuosa, si se desea.
En un aspecto adicional, la presente invención
proporciona un procedimiento de liofilización con parámetros
diseñados para proporcionar una composición polinucleotídica
liofilizada que se caracteriza por presentar estabilidad y
solubilidad mejoradas. Este procedimiento comprende las etapas
de:
- (a)
- formar una solución polinucleotídica acuosa que tiene un pH de aproximadamente 6,2 a aproximadamente 7,8 y que comprende aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml de por lo menos un polinucleótido sobre la base del volumen total de la solución polinucleotídica, y desde aproximadamente 0,5 por ciento en peso hasta aproximadamente 10 por ciento en peso de por lo menos un crioprotector, sobre la base del peso total de la solución polinucleotídica;
- (b)
- enfriar la solución polinucleotídica hasta una temperatura de aproximadamente -30ºC a aproximadamente -70ºC, hasta su congelación;
- (c)
- aplicar vacío para reducir la presión hasta aproximadamente 25 mTorr (187,5 Pa) a aproximadamente 250 mTorr (1875 Pa);
- (d)
- calentar gradualmente la solución polinucleotídica en un primer momento hasta una temperatura de aproximadamente -40ºC a aproximadamente 20ºC durante un período de aproximadamente 5 horas a aproximadamente 40 horas;
- (e)
- mantener la solución polinucleotídica después de la etapa de calentamiento (d), a una temperatura de aproximadamente -35ºC a aproximadamente 10ºC y a una presión de 25 mTorr (187,5 Pa) a aproximadamente 250 mTorr (1875 Pa) durante un período de aproximadamente 1 hora hasta aproximadamente 10 horas;
- (f)
- calentar gradualmente la solución polinucleotídica tras el período de retención (e), hasta una temperatura de aproximadamente 20ºC a aproximadamente 35ºC durante un período de aproximadamente 1 hora hasta aproximadamente 20 horas y a una presión de aproximadamente 25 mTorr (187,5 Pa) a aproximadamente 150 mTorr (1125 Pa); y
- (g)
- recuperar una composición polinucleotídica liofilizada que tiene un contenido de agua de aproximadamente 0,5 por ciento en peso a aproximadamente 6 por ciento en peso sobre la base del peso total de la composición recuperada.
En otro aspecto, la presente invención
proporciona una composición liofilizada producida por los
procedimientos anteriores.
En otro aspecto adicional, la presente invención
también proporciona una composición polinucleotídica líquida que
comprende la composición liofilizada descrita anteriormente,
reconstituida en agua y caracterizada por tener un pH de
aproximadamente 6,2 hasta aproximadamente 7,8.
En otro aspecto adicional, la invención
proporciona una composición farmacéutica que comprende un principio
activo, que es una composición liofilizada como se ha descrito
anteriormente o una composición líquida reconstituida como se ha
descrito anteriormente. Estos principios activos se combinan
preferentemente con un excipiente o vehículo farmacéuticamente
aceptable.
En otro aspecto, la presente invención
proporciona un procedimiento para tratar a un mamífero
administrando a dicho individuo una cantidad eficaz de la
composición farmacéutica. Dicha administración puede realizarse por
cualquier vía de administración convencional, por ejemplo, vías
oral, parenteral, intranasal o intrapulmonar.
Otros aspectos y ventajas de la presente
invención se describen más adelante en la siguiente descripción
detallada de las formas de realización preferidas de la misma.
La Fig. 1 es una gráfica que representa la
disminución en el % de superenrollamiento ("SC"), es decir, la
estabilidad, de composiciones liofilizadas de ADN según la
invención (\blacklozenge) frente al mismo ADN en solución
(\bullet) a lo largo del tiempo, utilizando el procedimiento con
gel de agarosa. Sobre la base de la ecuación de velocidad 3 en el
Esquema 1 presentado más adelante, que describe la degradación del
ADN, se generaron gráficas de ln (% de SC) frente al tiempo para la
composición polinucleotídica liofilizada preferida del Ejemplo 1 y
para la composición líquida que contiene ADN plasmídico que no
estaba liofilizada (testigo). Las pendientes (-k_{obs}, constante
de velocidad observada de pseudoprimer orden) de las
representaciones se calcularon utilizando análisis de regresión
lineal por mínimos cuadrados. Para las composiciones liofilizadas,
la fórmula de la pendiente fue y = 0,001x + 4,5369, y la constante
de velocidad (R^{2}) = 0,7988. Para el testigo, la fórmula de la
pendiente fue y = 0,014x + 4,5611; y R^{2} = 0,9297. Puede
apreciarse en esta figura que la constante de velocidad de la
composición liofilizada preferida es por lo menos 10 veces menor
que la constante de velocidad de la composición líquida.
La Fig. 2 es una gráfica similar a la de la Fig.
1, pero para una composición liofilizada preferida según la
invención (\blacklozenge) que contiene ADN plasmídico y 2% p/p de
trehalosa como crioprotector con un contenido de humedad del 4%
(Lyo2T2H) frente al mismo ADN en solución no liofilizada (\bullet,
Líquida) frente al tiempo. Para la composición liofilizada, la
fórmula de la pendiente fue y = 0,0033x + 4,52223, y R^{2} =
0,9998. Para el testigo, la fórmula de la pendiente fue y = 0,014x +
4,5611, y R^{2} = 0,9297.
La Fig. 3 es un diagrama de barras que ilustra
las respuestas de inmunidad celular específicas de antígeno en
ratones Balb/C frente a composiciones de ADN liofilizadas
(plásmidos que contenían el gen del virus del herpes simple que
codifica la proteína gD_{2}) de la presente invención y frente a
testigos. Un testigo fue la solución polinucleotídica
preliofilizada nº 6 de la Tabla 4 del Ejemplo 3 presentado más
adelante, que no contenía crioprotector (Phos
Pre-Lyo). Otro testigo fue la composición de tampón
citrato liofilizada de la solución nº 8 de la Tabla 4 que no
contenía crioprotector (Citrato Post-Lyo). El
"testigo 023" es una solución preliofilizada en la que el ADN
es la misma cadena principal del plásmido utilizado en otras
composiciones, pero sin la secuencia gD_{2}. Las composiciones
liofilizadas de la invención que se emplearon incluían la solución
polinucleotídica liofilizada nº 1 de la Tabla 4 con trehalosa como
crioprotector en tampón fosfato (Trehalosa/Phos); solución
polinucleotídica liofilizada nº 3 de la Tabla 4 con sacarosa como
crioprotector en tampón fosfato (Sacarosa/Phos); y la solución
polinucleotídica liofilizada nº 7 con sacarosa como crioprotector en
tampón citrato (Sacarosa/Cit). Los efectos de cada composición
polinucleotídica en la respuesta de inmunidad celular se midieron
con un ensayo de linfoproliferación descrito en el Ejemplo 4, y se
notificaron como índice de estimulación (SI).
La Fig. 4 es un diagrama de barras que muestra la
respuesta de inmunidad humoral (anticuerpos) medida en forma de
densidad óptica (OD) a 450 nm en el suero de ratones
Balb-C individuales frente a las composiciones de
ADN liofilizadas de la presente invención y frente a los testigos
identificados en la Fig. 3. El testigo negativo y el testigo 023
son idénticos. Los efectos de cada composición polinucleotídica en
la respuesta de inmunidad humoral se midieron mediante una prueba
ELISA estándar, como se describe más adelante en el Ejemplo 4.
La presente invención resuelve el problema de la
técnica proporcionando, como se describe en la presente memoria, una
composición polinucleotídica que presenta estabilidad mejorada, una
composición polinucleotídica que presenta solubilidad mejorada, y
un procedimiento por liofilización que da lugar a una composición
polinucleotídica estabilizada.
La "composición polinucleotídica" de la
presente invención se refiere a la mezcla de polinucleótidos que
tiene mayor estabilidad y solubilidad que las mezclas de
polinucleótidos de la técnica anterior. Preferentemente, la
composición polinucleotídica de la presente invención es típicamente
un polvo que presenta una estructura predominantemente amorfa,
presentando sólo pequeñas cantidades de estructura cristalina, y
que se produce sometiendo una solución polinucleotídica a un nuevo
procedimiento de liofilización descrito en la presente memoria.
El término "solución polinucleotídica", tal
como se utiliza en lo sucesivo en la presente memoria, se refiere a
una mezcla acuosa de polinucleótidos anterior a la liofilización.
La solución polinucleotídica que se liofiliza es una mezcla acuosa
de por lo menos un polinucleótido y por lo menos un crioprotector.
Preferentemente, la relación de polinucleótido a crioprotector en la
solución polinucleotídica es desde aproximadamente 0,001 hasta
aproximadamente 1,0 parte en peso de polinucleótido por 1,0 parte
en peso de crioprotector. La solución polinucleotídica puede
contener también disolvente o disolventes opcionales no acuosos y
otros aditivos. La concentración del polinucleótido, crioprotector,
disolvente (incluida el agua) y de los aditivos opcionales se ajusta
de modo que se liofilice una masa adecuada de polinucleótido y de
modo que el polinucleótido no se degrade significativamente durante
la liofilización.
Puede utilizarse cualquier polinucleótido,
incluido cualquier polinucleótido modificado, en la presente
invención. Los polinucleótidos adecuados incluyen, por ejemplo,
ADN-B, ADN-A, ADN-Z,
ARN, ARNt y ARNm. El polinucleótido también puede encontrarse en
cualquier forma. Por ejemplo, el polinucleótido puede ser circular
o lineal. El polinucleótido puede contener una o más cadenas. Por
ejemplo, puede utilizarse un ADN o ARN monocatenarios, un ADN
bicatenario, un híbrido ADN-ARN bicatenario, o un
polinucleótido de tres o cuatro cadenas. Los ejemplos de ADN
bicatenario incluyen, entre otros, ADN cromosómico, Factor R,
productos de PCR, ADN plasmídico, bacteriófagos, ARN vírico y
vectores de ADN, incluidos, entre otros, alfavirus, adenovirus,
virus de la vacuna, retrovirus, virus asociados al adenovirus, virus
de ARN de cadena positiva y negativa, virus herpes, y viroides,
deltavirus y poliovirus. El ADN incluye preferentemente secuencias
codificantes que codifican proteínas, preferentemente ligadas
funcionalmente a elementos reguladores, genes que incluyen las
regiones de control del operador y de terminación, y sistemas
autorreplicantes tales como ADN plasmídico. Los polinucleótidos
monocatenarios incluyen polinucleótidos antisentido, ribozimas y
oligonucleótidos que forman cadenas triples. Los polinucleótidos
pueden estar modificados como tioatos, fosforotioatos y fosfonatos,
etc. En el caso de los polinucleótidos monocatenarios en las
composiciones de la invención destinados a su utilización
farmacéutica, es preferible preparar una cadena complementaria o
"cadena conectora" a la cadena terapéutica como parte de la
composición polinucleotídica. La cadena conectora puede ser una
cadena independiente, o puede estar unida covalentemente, o una
extensión de la cadena terapéutica, de modo que la cadena
terapéutica esencialmente se retrae y se hibrida consigo misma.
Como alternativa, la cadena conectora puede presentar varios brazos
que son complementarios, de modo que se hibrida con varias cadenas
de polinucleóti-
dos.
dos.
En las formas de realización preferidas, el
polinucleótido es ADN superenrollado de plásmido que es un vector
de expresión que codifica un inmunógeno conectado operativamente a
elementos reguladores que funcionan en células humanas. En algunas
formas de realización preferidas, el inmunógeno codificado por la
secuencia codificante es una proteína procedente de un patógeno tal
como la proteína gD_{2} del virus del herpes simple, o proteínas
del virus de la inmunodeficiencia humana tales como las codificadas
por los genes gag, pol o env del
VIH-1. Las secuencias codificantes están conectadas
funcionalmente a un promotor adecuado, tal como un promotor
intermedio temprano del citomegalovirus (CMV), y a una señal de
poliadenilación del SV40. Por ejemplo, la patente U.S. nº
5.593.972, que se incorpora en la presente memoria a título de
referencia, describe plásmidos útiles en la presente invención.
El polinucleótido puede comprender
polinucleótidos desnudos tales como ADN plasmídico, copias múltiples
del polinucleótido, o diferentes polinucleótidos, o puede
comprender un polinucleótido asociado a un "coagente", tal como
un anestésico local, un péptido, un lípido, incluidos lípidos
catiónicos, un liposoma o una partícula lipídica, un policatión tal
como polilisina, un policatión ramificado tridimensional tal como
un dendrímero, un carbohidrato, amfífilos catiónicos, detergentes,
tensioactivo de bencilamonio, u otros compuestos que facilitan la
transferencia del polinucleótido a las células. Ejemplos no
exclusivos de coagentes útiles en la presente invención se
describen en las patentes U.S. nº 5.593.972, nº 5.703.055, nº
5.739.118, nº 5.837.533, y en la solicitud de patente internacional
nº W096/10038, publicada el 4 de abril de 1996; y en la solicitud
de patente internacional nº W094/16737, publicada el 8 de agosto de
1994, que se incorporan en la presente memoria a título de
referencia. Cuando el agente utilizado es un anestésico local,
preferentemente bupivacaína, es preferible una cantidad desde
aproximadamente 0,1 por ciento en peso hasta aproximadamente 1,0 por
ciento en peso sobre la base del peso total de la solución
polinucleotídica. Véase también la solicitud de patente
internacional nº PCT/US98/22841, que describe la incorporación de
tensioactivos de bencilamonio como coagentes, administrados en una
cantidad de aproximadamente 0,001-0,03% en peso,
cuya descripción se incorpora en la presente memoria a título de
referencia.
Asimismo, para su utilización como polinucleótido
en las soluciones de la presente invención, el polinucleótido base,
carbohidrato, o conector puede modificarse según técnicas bien
conocidas por los expertos en la materia.
Preferentemente, el polinucleótido está presente
en la solución polinucleotídica a una concentración de
aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 5,0 mg/ml. En otras
formas de realización, el polinucleótido está presente en la
solución a una concentración de aproximadamente 1,0 mg/ml a
aproximadamente 3,0 mg/ml. En aún otras formas de realización, el
polinucleótido está presente en la solución a una concentración de
aproximadamente 1,0 mg/ml a aproximadamente 2,0 mg/ml.
El término "crioprotector" puede utilizarse
de modo intercambiable con el término "lioprotector" y se
utiliza para referirse a crioprotectores y lioprotectores solos,
así como a mezclas de dos o más compuestos crioprotectores. Un
crioprotector puede ser cualquier compuesto que estabiliza el
polinucleótido durante y después de la liofilización. Se han
descrito diversos crioprotectores en textos convencionales, tales
como Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Vol. 2, 19ª
edición (1995).
En una forma de realización, el crioprotector
útil en la presente invención es un azúcar alcohólico, tal como
alditol, manitol, sorbitol, inositol, polietilenglicol, y
combinaciones de los mismos. Particularmente deseable es el
polietilenglicol. En otra realización, el crioprotector es un azúcar
ácido, incluido un ácido aldónico, un ácido urónico, un ácido
aldárico, y combinaciones de los mismos.
El crioprotector de la presente invención también
puede ser un carbohidrato. Los carbohidratos adecuados son
compuestos de aldehídos o cetonas que contienen dos o más grupos
hidroxilo. Los carbohidratos pueden ser cíclicos o lineales, e
incluyen por ejemplo aldosas, cetosas, aminoazúcares, alditoles,
inositoles, ácidos aldónicos, ácidos urónicos o ácidos aldáricos, o
combinaciones de los mismos. El carbohidrato también puede ser un
monocarbohidrato, dicarbohidrato o policarbohidrato, tal como por
ejemplo, un disacárido o polisacárido. Los carbohidratos adecuados
incluyen, por ejemplo, gliceraldehído, arabinosa, lixosa, pentosa,
ribosa, xilosa, galactosa, glucosa, hexosa, idosa, manosa, talosa,
heptosa, glucosa, fructosa, ácido glucónico, sorbitol, lactosa,
manitol,
metil-\alpha-glucopiranósido,
maltosa, ácido isoascórbico, ácido ascórbico, lactona, sorbosa,
ácido glucárico, eritrosa, treosa, arabinosa, alosa, altrosa,
gulosa, idosa, talosa, eritrulosa, ribulosa, xilulosa, psicosa,
tagatosa, ácido glucurónico, ácido glucónico, ácido glucárico,
ácido galacturónico, ácido manurónico, glucosamina, galactosamina,
sacarosa, trehalosa o ácido neuramínico, o derivados de los mismos.
Los policarbohidratos adecuados incluyen, por ejemplo, arabinanos,
fructanos, fucanos, galactanos, galacturonanos, glucanos, mananos,
xilanos (tales como, por ejemplo, inulina), levano, fucoidano,
carragenano, galactocarolosa, pectinas, ácidos pécticos, amilosa,
pululano, glucógeno, amilopectina, celulosa, dextrano, pustulano,
quitina, agarosa, queratina, condroitina, dermatano, ácido
hialurónico, ácido algínico, goma xantana o almidón. Entre los
carbohidratos particularmente útiles se encuentran sacarosa,
glucosa, lactosa, trehalosa, y combinaciones de los mismos. La
sacarosa es un crioprotector particularmente útil.
Preferentemente, el crioprotector de la presente
invención es un carbohidrato o "azúcar" alcohólico, que puede
ser un alcohol polihídrico. Los compuestos polihídricos son
compuestos que contienen más de un grupo hidroxilo.
Preferentemente, los compuestos polihídricos son lineales. Los
compuestos polihídricos adecuados incluyen, por ejemplo, glicoles
tales como etilenglicol, polietilenglicol y propilenglicol;
glicerol; o pentaeritritol; o combinaciones de los mismos.
En algunas formas de realización preferidas, el
agente crioprotector es sacarosa, trehalosa, manitol o sorbitol. En
otras formas de realización preferidas, el agente crioprotector es
sacarosa. Cualquiera de estos crioprotectores puede estar en forma
de mezcla con por lo menos uno de los otros, según se desee.
El crioprotector o mezcla de crioprotectores está
preferentemente presente en la solución polinucleotídica a una
concentración desde aproximadamente 0,5 por ciento en peso hasta
aproximadamente 10 por ciento en peso. En algunas formas de
realización, el crioprotector o crioprotectores están presentes en
la solución a una concentración desde aproximadamente 1,0 por
ciento en peso hasta aproximadamente 8,0 por ciento en peso. En aún
otras formas de realización, el crioprotector o crioprotectores
están presentes en la solución a una concentración desde
aproximadamente 1,0 por ciento en peso hasta aproximadamente 5,0 por
ciento en peso.
La solución polinucleotídica tiene
preferentemente base acuosa. Sin embargo, si se desea, pueden
añadirse a la solución uno o más disolventes que son compatibles
con el agua, el polinucleótido y el crioprotector. Por ejemplo,
pueden añadirse a la solución alcoholes hidrosolubles, tales como
etilenglicol, propilenglicol o glicerol.
La solución polinucleotídica se prepara
preferentemente con un tampón, de modo que pueda alcanzarse la
isotonicidad al rehidratar la composición polinucleotídica
liofilizada. La solución polinucleotídica tiene preferentemente un
pH de aproximadamente 6,2 hasta aproximadamente 7,8. En una
realización, la solución polinucleotídica tiene un pH de
aproximadamente 6,2 hasta aproximadamente 7,4. En otra realización,
la solución polinucleotídica de la presente invención tiene
preferentemente un pH de aproximadamente 6,2 hasta aproximadamente
6,9. Este intervalo de pH ayuda a prevenir la degradación del
polinucleótido durante el procedimiento de liofilización de la
presente invención. Por consiguiente, los tampones que pueden
utilizarse comprenden cualquier compuesto capaz de mantener el pH
deseado mencionado anteriormente durante la liofilización. Los
tampones preferidos comprenden tampones fosfato y citrato,
generalmente a una concentración de 5 a 60 mM. Preferentemente, los
tampones se utilizan a un nivel de aproximadamente 0,1 por ciento
en peso hasta aproximadamente 1,2 por ciento en peso sobre la base
del peso total de la solución polinucleotídica.
Otros aditivos opcionales tal como facilitadores
(como se ha descrito anteriormente), tensioactivos o sales, o
combinaciones de los mismos, pueden ser añadidos a la solución
polinucleotídica. Pueden añadirse sales para ajustar la
isotonicidad de la solución polinucleotídica. Por ejemplo, pueden
utilizarse sales tales como cloruro de sodio. Preferentemente, la
sal se utiliza en una cantidad de aproximadamente 0,1 por ciento en
peso hasta aproximadamente 1,0 por ciento en peso sobre la base del
peso total de la solución polinucleotídica.
En general, estos aditivos opcionales comprenden
preferentemente desde aproximadamente 0,1 por ciento en peso hasta
aproximadamente 3 por ciento en peso sobre la base del porcentaje
del peso total de la solución polinucleotídi-
ca.
ca.
\newpage
La solución polinucleotídica formada por
combinación de estos componentes se somete después al procedimiento
de liofilización de la presente invención, que da lugar a una
composición polinucleotídica liofilizada de la presente
invención.
Por tanto, la composición polinucleotídica
liofilizada de la presente invención preparada a partir de la
solución polinucleotídica descrita anteriormente, comprende:
- (a)
- por lo menos un polinucleótido,
- (b)
- por lo menos un crioprotector, en el que la relación de polinucleótido a crioprotector es desde aproximadamente 0,001 hasta aproximadamente 1,0 parte en peso de polinucleótido por 1,0 parte en peso de crioprotector, y
- (c)
- desde aproximadamente 0,5 por ciento en peso hasta aproximadamente 6 por ciento en peso de agua, sobre la base del peso total de la composición polinucleotídica.
Esta composición polinucleotídica liofilizada
contiene, en algunas formas de realización, aproximadamente 6% o
menos de agua. En algunas formas de realización, el producto de la
composición polinucleotídica contiene aproximadamente 5% o menos de
agua. En otras formas de realización, la composición liofilizada
contiene agua desde aproximadamente 2 por ciento en peso hasta
aproximadamente 3 por ciento en peso.
La composición polinucleotídica de la presente
invención se caracteriza por presentar una mayor estabilidad en
comparación con las composiciones polinucleotídicas de la técnica
anterior. El porcentaje de superenrollamiento define el nivel de
pureza del polinucleótido. Así, la estabilidad de un polipéptido se
determina por el nivel de pureza retenida con el tiempo.
Por "estabilidad aumentada o mejorada" se
entiende que el polinucleótido retiene por lo menos 90% de su
superenrollamiento durante un período de tiempo de por lo menos 10
días a aproximadamente 37ºC. En algunas formas de realización, el
polinucleótido, preferentemente ADN, de la presente invención
retiene por lo menos 90% de su superenrollamiento durante por lo
menos 20 días a 37ºC. Más preferentemente, en algunas formas de
realización, el polinucleótido de la presente invención retiene por
lo menos 90% de su superenrollamiento durante por lo menos 30 días
a aproximadamente 37ºC.
Además de estabilidad, la composición
polinucleotídica de la presente invención preferentemente presenta
mayor solubilidad en comparación con otras composiciones
polinucleotídicas de la técnica anterior. Por "mayor
solubilidad" se entiende que la composición polinucleotídica de
la presente invención presenta preferentemente una solubilidad en
agua a aproximadamente 25ºC (es decir, a temperatura ambiente) de
por lo menos 1 miligramo por mililitro ("mg/ml").
Preferentemente, la composición polinucleotídica de la presente
invención presenta una solubilidad en agua a aproximadamente 25ºC de
por lo menos 2 mg/ml. En otras formas de realización preferidas, la
composición polinucleotídica de la presente invención presenta una
solubilidad en agua a aproximadamente 25ºC de por lo menos 10
mg/ml. También son posibles solubilidades tan elevadas como
aproximadamente 20 mg/ml. La mayor estabilidad y solubilidad de las
composiciones polinucleotídicas de la presente invención se obtienen
preferentemente mediante liofilización de una solución
polinucleotídica siguiendo los procedimientos descritos en la
presente memoria.
La composición liofilizada según la presente
invención también se caracteriza por presentar una estructura
física predominantemente amorfa. En algunas formas de realización,
la composición contiene un polinucleótido que es sustancialmente
amorfo, pero que contiene también una pequeña cantidad o porcentaje
de estructura cristalina, por ejemplo, estructura reticular.
La composición polinucleotídica liofilizada puede
formularse en diversas formas para su conservación o para su
utilización in vitro o in vivo. Ejemplos de
utilizaciones in vivo para las que son particularmente útiles
las composiciones polinucleotídicas de la invención incluyen los
procedimientos de vacunación y terapia génica utilizando ADN
plasmídico como se describe en las patentes US nº 5.593.972, nº
5.703.055, nº 5.676.954, nº 5.580.859, nº 5.589.466, nº 5.739.118 y
nº 5.837.533; la solicitud de patente internacional nº WO96/41873,
publicada el 27 de diciembre de 1996; y la solicitud de patente
internacional nº WO94/16737, publicada el 8 de agosto de 1994, que
se incorporan en la presente memoria a título de referencia.
La composición polinucleotídica liofilizada de la
presente invención puede formularse en varias formas secas o
líquidas. Si se desea, las composiciones polinucleotídicas
liofilizadas secas de la presente invención puede ser molidas,
trituradas o tamizadas para formar un polvo mediante técnicas bien
conocidas por los expertos en la materia. Por ejemplo, las
composiciones polinucleotídicas liofilizadas pueden convertirse en
un polvo utilizando un granulador, molino de chorro, eliminador de
grumos, o trituradora. Preferentemente, la composición
polinucleotídica tiene un tamaño promedio de partículas de menos de
aproximadamente 100 \mum. Si la composición está destinada para
su utilización farmacéutica para administración por vía pulmonar,
por ejemplo, es preferible un tamaño de partículas de \leq 10
\mum. En algunas formas de realización preferidas, la composición
polinucleotídica de la invención se prepara para su administración
a mamíferos en forma de, por ejemplo, polvos, comprimidos,
cápsulas, comprimidos o cápsulas con recubrimiento entérico, o
supositorios.
Como muestra de otro ejemplo, puede prepararse
una composición polinucleotídica líquida reconstituyendo la
composición liofilizada en agua, y/o preparando composiciones
líquidas. La composición reconstituida tiene preferentemente un pH
de aproximadamente 6,2 hasta aproximadamente 7,8, como se ha
descrito anteriormente para la solución polinucleotídica
inicial.
Dichas composiciones secas o soluciones líquidas
se utilizan preferentemente como composiciones farmacéuticas. Por
tanto, otra realización de la presente invención es una composición
farmacéutica, que comprende como principio activo una composición
liofilizada como se describe en la presente memoria o una
composición líquida reconstituida como se describe en la presente
memoria, en combinación con un excipiente o vehículo opcional
farmacéuticamente aceptable. En función del propósito al que se
destina la composición farmacéutica, el excipiente o vehículo es
adecuado para cualquier vía de administración, tales como vías
oral, parenteral, intranasal, e intrapulmonar. Esta composición
polinucleotídica liofilizada puede utilizarse como material de
partida en asociación con otros excipientes aceptables desde el
punto de vista farmacéutico para el desarrollo de formas
farmacéuticas en polvo, liquido o suspensión, incluidas las
destinadas a aplicaciones por vía intranasal o pulmonar. Véase, por
ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Vol. 2,
19ª edición (1995), por ejemplo, el capítulo 95: Aerosoles, cuya
descripción se incorpora en la presente memoria a título de
referencia.
Una composición farmacéutica preferida que emplea
estos agentes activos es un comprimido con recubrimiento entérico.
En una forma de realización preferida, la composición
polinucleotídica se proporciona en forma de vacuna oral en una
cápsula con recubrimiento entérico. El polinucleótido es ADN
plasmídico. Preferentemente, se carga aproximadamente 1 mg de ADN
en una cápsula de gelatina dura tal como las fabricadas por
Capsugel, una división de Warner Lambert Parke Davis. También
pueden añadirse a la composición polinucleotídica lubricantes para
facilitar el flujo, tales como talco y estearato de magnesio. De
modo similar, pueden añadirse también agentes de relleno tales como
celulosa. Las cápsulas de gelatina reciben el recubrimiento
entérico utilizando, por ejemplo, material polimérico para
recubrimiento entérico como EUDRAGIT. Según otras formas de
realización, la composición polinucleotídica de la presente
invención puede utilizarse para formar un polvo que puede
administrarse en forma de aerosol para el suministro del
polinucleótido al pulmón. Por ejemplo, la composición
polinucleotídica puede prepararse para el suministro de genes útiles
en el tratamiento de una enfermedad pulmonar. Asimismo, por
ejemplo, una composición polinucleotídica de la presente invención
que tiene ADN que codifica el regulador de conductancia
transmembranal de la fibrosis quística puede utilizarse como
tratamiento de la fibrosis quística.
Por tanto, según otra realización adicional de la
presente invención, se proporciona un procedimiento para el
tratamiento de un individuo que es un mamífero, que comprende
administrar al individuo una cantidad eficaz de las composiciones
farmacéuticas descritas anteriormente. En función del propósito para
el que se administra la composición, estos procedimientos de
tratamiento comprenden la administración de la composición por una
vía de administración deseada, incluidas, entre otras, las vías
oral, parenteral, intranasal e intrapulmonar. Por ejemplo, la
composición polinucleotídica puede formularse en un líquido con
isotonicidad aceptable y aplicarse por vía intramuscular,
intravenosa, intradérmica o subcutánea. La composición
polinucleotídica también puede aplicarse mediante suministro por
vía intranasal o intrapulmonar (inhalación) de un polvo. La
composición polinucleotídica también puede aplicarse en forma de
supositorio en cavidades corporales tales como la vagina, el recto y
la boca. Los procedimientos que emplean estas composiciones
incluyen, entre otros, protocolos de terapia génica para el
tratamiento de enfermedades, por ejemplo, fibrosis quística.
Para fabricar las composiciones polinucleotídicas
liofilizadas y los productos farmacéuticos de la presente invención,
una solución polinucleotídica formada como se ha descrito
anteriormente se liofiliza siguiendo etapas cuidadosamente
controladas que producen el efecto de aumentar la estabilidad y la
solubilidad de la composición polinucleotídica liofilizada
resultante. El dispositivo utilizado para liofilizar la solución
puede ser cualquier dispositivo que permita el enfriamiento gradual
y el calentamiento gradual de la solución polinucleotídica en
vacío. Tal como se utiliza en la presente memoria, "retener" o
"retención" significa mantener una temperatura y/o vacío dados
durante un período de tiempo. "Lanzar" o "lanzamiento"
significa cambiar las condiciones de temperatura y/o vacío durante
un período de tiempo. En los procedimientos de liofilización,
algunas etapas son etapas de retención y otra son etapas de
lanzamiento.
El procedimiento de liofilización de la presente
invención se describe con más detalle a continuación:
La solución polinucleotídica acuosa que tiene un
pH de aproximadamente 6,2 hasta aproximadamente 7,8 y que comprende
de aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml de por lo
menos un polinucleótido sobre la base del volumen total de la
solución polinucleotídica, y desde aproximadamente 0,5 por ciento
en peso hasta aproximadamente 10 por ciento en peso de por lo menos
un crioprotector, sobre la base del peso total de la solución
polinucleotídica, se enfría primero para solidificar o congelar la
solución. En una realización, la solución se enfría hasta una
temperatura de aproximadamente -30ºC a aproximadamente -70ºC. En
otra realización, la solución se enfría hasta una temperatura de
aproximadamente -40ºC a aproximadamente -60ºC. En otras formas de
realización, la solución se enfría hasta una temperatura de
aproximadamente -40ºC a aproximadamente -50ºC. Esta etapa de
enfriamiento es preferentemente gradual y se lanza, o realiza,
durante un período de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 5
horas, y más preferentemente de aproximadamente 1 hora a
aproximadamente 3 horas. En algunas formas de realización, la
solución se enfría durante un período de tiempo de 1 hora a 2
horas. En algunas formas de realización, la solución se enfría
durante un período de tiempo de 2 horas a 3 horas. Preferentemente,
la solución se enfría a una velocidad lineal durante el período
enfriamiento deseado. Aunque es preferible el enfriamiento gradual,
también es posible enfriar rápidamente (por ejemplo, menos de 10
minutos) la solución sin que se degrade significativamente el
polinucleótido durante la liofilización.
Cuando se alcanza la temperatura de congelación
deseada, se aplica inmediatamente vacío, reduciendo la presión
hasta aproximadamente 25 mTorr (187,5 Pa) a aproximadamente 250
mTorr (1875 Pa). En algunas formas de realización, el vacío reduce
la presión hasta aproximadamente 50 (375 Pa) a aproximadamente 100
mTorr (750 Pa). La composición se mantiene opcionalmente en estos
valores de temperatura y presión durante aproximadamente 30 minutos
a aproximadamente 5 horas, preferentemente por lo menos un hora. En
una realización particularmente preferida, el vacío se aplica
reduciendo rápidamente la presión desde aproximadamente 300 mTorr
(2250 Pa) hasta aproximadamente 200 mTorr (1500 Pa), y después
reduciendo gradualmente la presión hasta aproximadamente 150 mTorr
(1125 Pa), y después hasta aproximadamente 40 mTorr (300 Pa)
durante un período de aproximadamente 1 hora hasta aproximadamente
2 horas.
Tras enfriado, la solución polinucleotídica se
somete al "ciclo principal de secado o calentamiento", que
contribuye significativamente al rendimiento de este procedimiento.
En esta etapa principal de calentamiento, la solución congelada se
calienta gradualmente en una primera etapa hasta una temperatura de
aproximadamente -40ºC a aproximadamente 20ºC durante un período de
aproximadamente 5 horas a aproximadamente 40 horas. En una
realización preferida, la solución congelada se calienta
gradualmente en una primera etapa hasta una temperatura de
aproximadamente -10ºC a aproximadamente 20ºC durante un período de
aproximadamente 5 horas a aproximadamente 20 horas. En otra
realización, la solución congelada se calienta gradualmente hasta
una temperatura de aproximadamente -40ºC a aproximadamente 10ºC. En
otra realización, la solución congelada se calienta gradualmente en
una primera etapa hasta una temperatura de aproximadamente -5ºC a
aproximadamente 5ºC durante un período de aproximadamente 8 horas a
aproximadamente 20 horas. En una realización particularmente
preferida, la solución congelada se calienta en una primera etapa
hasta una temperatura de 0ºC. Esta etapa principal de calentamiento
se realiza preferentemente durante un período de aproximadamente 5
horas a 40 horas, preferentemente de aproximadamente 5 a 20 horas, y
más preferentemente durante un período de aproximadamente 6 a 15
horas. En algunas formas de realización, esta primera etapa de
calentamiento se realiza durante un período de aproximadamente 10
horas.
Además de calentar la solución polinucleotídica
durante el ciclo principal de secado, se aplica vacío para iniciar
el secado de la solución. Preferentemente, el vacío se aplica tan
pronto como comienza la etapa principal de calentamiento. La presión
de vacío durante esta etapa de calentamiento es preferentemente
menor que aproximadamente 250 mTorr (1875 Pa), y más preferentemente
de aproximadamente 25 (187,5 Pa) a aproximadamente 150 mTorr (1125
Pa). En ciertas formas de realización, la presión de vacío es desde
aproximadamente 40 (300 Pa) a aproximadamente 150 mTorr (1125 Pa).
En otra realización adicional, la presión de vacío durante esta
etapa de calentamiento es de aproximadamente 60 mTorr (400 Pa) a
aproximadamente 150 mTorr (1125 Pa). En una realización preferida,
el vacío se aplica preferentemente de modo que la presión disminuya
en menos de 5 minutos hasta 200 mTorr (1500 Pa) y después se reduce
hasta la presión deseada durante un período de aproximadamente 1
hora a aproximadamente 2 horas.
Tras la etapa principal de calentamiento, la
solución polinucleotídica se mantiene a temperatura y presión
constantes para equilibrar la solución polinucleotídica. Esta etapa
de retención se realiza preferentemente durante un período de
aproximadamente 1 hora a aproximadamente 10 horas, y más
preferentemente de aproximadamente 2 horas a aproximadamente 6
horas. Preferentemente, la temperatura durante esta etapa de
retención se mantiene de aproximadamente -35ºC a aproximadamente
10ºC. En algunas formas de realización, la temperatura se mantiene
de aproximadamente -10ºC a aproximadamente 10ºC durante un período
de aproximadamente 2 a aproximadamente 10 horas. En otras formas de
realización, la temperatura se mantiene de aproximadamente -5ºC a
aproximadamente 5ºC durante un período de aproximadamente 5 horas a
aproximadamente 7 horas. En una realización preferida, la
temperatura se mantiene a aproximadamente 0ºC. Preferentemente, la
presión de vacío durante este período de retención se mantiene a
menos de aproximadamente 200 mTorr (1500 Pa), y más preferentemente
desde aproximadamente 25 mTorr (187,5 Pa) a aproximadamente 250
mTorr (1875 Pa), durante un período de aproximadamente 1 hora a
aproximadamente 10 horas. En algunas formas de realización, la
presión de vacío durante este período de retención se mantiene a
aproximadamente 40 mTorr (300 Pa) hasta aproximadamente 150 mTorr
(1125 Pa). En algunas formas de realización, la presión de vacío
durante este período de retención se mantiene a aproximadamente 60
mTorr (450 Pa) hasta aproximadamente 150 mTorr (1125 Pa). La
presión y la temperatura seleccionadas son preferentemente la
temperatura y la presión alcanzadas al final de la etapa principal
de calentamiento.
El vacío se aplica preferentemente de forma
continua desde esta etapa retención hasta la etapa siguiente.
Tras esta etapa retención, se lleva a cabo la
etapa secundaria de secado. La solución polinucleotídica se
calienta gradualmente una segunda vez hasta una temperatura desde
aproximadamente 20ºC hasta aproximadamente 35ºC, durante un período
de aproximadamente 1 hora hasta aproximadamente 20 horas y a una
presión de aproximadamente 25 mTorr (187,5 Pa) hasta
aproximadamente 250 mTorr (1875 Pa). En una realización preferida,
esta etapa secundaria de calentamiento consiste en calentar
gradualmente la solución hasta una temperatura desde
aproximadamente 20ºC hasta aproximadamente 30ºC y a una presión de
25 mTorr (187,5 Pa) a aproximadamente 150 mTorr (1125 Pa) durante
un período de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 10 horas. En
otra realización, la etapa secundaria de calentamiento consiste en
aumentar la temperatura desde aproximadamente 23ºC hasta
aproximadamente 27ºC durante un período de aproximadamente 2 horas
hasta aproximadamente 3 horas. En una etapa secundaria de
calentamiento preferida, la temperatura se aumenta hasta
aproximadamente 25ºC. La presión de vacío durante la segunda etapa
de calentamiento es preferentemente menor de aproximadamente 250
mTorr (1875 Pa), y más preferentemente de aproximadamente 25 mTorr
(187,5 Pa) a aproximadamente 150 mTorr (1125 Pa), y en algunas
formas de realización de aproximadamente 40 mTorr (300 Pa) a
aproximadamente 110 mTorr (825 Pa). Esta segunda etapa de
calentamiento se lleva cabo preferentemente durante un período de
aproximadamente 1 hora a aproximadamente 5 horas, y más
preferentemente durante un período de aproximadamente 2 a 3
horas.
En una forma de realización particularmente
preferida del procedimiento de liofilización de la presente
invención, la etapa principal de calentamiento tiene lugar
preferentemente durante un período de aproximadamente 7 horas a
aproximadamente 11 horas, la etapa de retención subsiguiente tiene
lugar durante un período de aproximadamente 1 hora, y la etapa
secundaria de calentamiento tiene lugar durante un período de
aproximadamente 2 horas.
Tras esta segunda etapa calentamiento, la
solución polinucleotídica puede, opcionalmente, mantenerse otra vez
a temperatura y presión constantes para equilibrar de nuevo la
solución polinucleotídica. Preferentemente, esta segunda etapa
retención se realiza durante un período de aproximadamente 1 hora a
aproximadamente 10 horas, y más preferentemente durante
aproximadamente 2 horas a aproximadamente 5 horas. En algunas
formas de realización, la segunda etapa retención es de
aproximadamente 2 a 3 horas. Preferentemente, la temperatura
durante esta etapa retención se mantiene a aproximadamente 20ºC
hasta aproximadamente 30ºC, más preferentemente desde
aproximadamente 23ºC hasta aproximadamente 27ºC, y lo más
preferentemente a 25ºC. Preferentemente, la presión de vacío durante
esta etapa retención se mantiene a menos de aproximadamente 150
mTorr (1125 Pa), y más preferentemente desde aproximadamente 20
mTorr (150 Pa) hasta aproximadamente 100 mTorr (750 Pa). La presión
y temperatura seleccionadas son preferentemente la temperatura y
presión alcanzadas al final de la segunda etapa de
calentamiento.
En una realización preferida, la etapa principal
de calentamiento implica el calentamiento gradual de la solución a
una temperatura desde aproximadamente -20ºC hasta aproximadamente
20ºC durante un período de aproximadamente 5 horas a aproximadamente
30 horas, evitando la retrofusión (licuefacción) de la solución. Un
período de tiempo preferido para esta etapa de calentamiento es
desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 20 horas, y más
preferentemente, desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 10
horas. Una temperatura preferida para esta etapa es desde
aproximadamente -10ºC hasta aproximadamente 20ºC, y más
preferentemente la temperatura es aproximadamente 0ºC. Este ciclo
principal de secado preferido reduce el tiempo necesario para
completar el procedimiento de liofilización. De hecho, la etapa
principal de secado preferida permite la realización de la etapa
secundaria de secado, en la que la solución polinucleotídica se
calienta hasta una temperatura desde aproximadamente 23ºC hasta
aproximadamente 27ºC, durante un período de aproximadamente 2 horas
hasta aproximadamente 3 horas, y proporciona el polinucleótido
liofilizado en una estructura física sustancialmente amorfa que
retiene por lo menos 90% de superenrollamiento durante un período de
tiempo de por lo menos 10 días a aproximadamente 37ºC.
En general, es preferible que una vez aplicado el
vacío en las etapas de este procedimiento, se aplique de forma
continua hasta que se complete la última etapa (es decir, bien el
segundo calentamiento o bien la segunda etapa de retención
opcional). Sin embargo, es posible variar la presión de vacío en
cada etapa de calentamiento siempre y cuando la presión de vacío
aplicada en cualquier momento sea inferior a aproximadamente 200
mTorr (1500 Pa).
Una vez completada la etapa de retención final
opcional, se recupera la composición polinucleotídica resultante,
que tiene un contenido de agua de aproximadamente 0,5 por ciento en
peso a aproximadamente 6 por ciento en peso sobre la base del peso
total de la composición recuperada. La composición polinucleotídica
recuperada tiene de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 6 por
ciento en peso, preferentemente aproximadamente 1 por ciento en peso
a aproximadamente 5 por ciento en peso, y más preferentemente de
aproximadamente 2 por ciento en peso a aproximadamente 4 por ciento
en peso de agua, sobre la base del peso total de la composición
polinucleotídica. La composición polinucleotídica liofilizada
preferentemente contiene desde aproximadamente 0,001 partes en peso
de polinucleótido hasta aproximadamente una parte en peso de
polinucleótido por cada parte en peso de crioprotector. En una
realización, la composición polinucleotídica contiene
preferentemente desde aproximadamente 0,001 partes en peso de
polinucleótido hasta aproximadamente 0,5 partes en peso de
polinucleótido por cada parte en peso de crioprotector. La
composición polinucleotídica tiene preferentemente una estructura
amorfa, para mejorar la solubilidad de la composición. Es deseable
obtener una solubilidad aumentada para permitir una reconstitución
relativamente rápida y para preparar composiciones más
concentradas.
Los siguientes ejemplos ilustran de forma
pormenorizada algunas formas de realización de la presente
invención. Estos ejemplos son a título ilustrativo de la presente
invención y de ningún modo deben considerarse limitativos del
alcance de la invención.
Una composición liofilizada preferida de la
presente invención que utiliza ADN plasmídico como polinucleótido y
sacarosa como crioprotector se prepara siguiendo el procedimiento
descrito anteriormente. El plásmido de ADN utilizado en estas
composiciones contiene el gen del virus del herpes simple que
codifica la proteína gD_{2} ligado a un promotor de
citomegalovirus y al sitio de poliadenilación del SV40. Este
plásmido, denominado plásmido 24, se describe en detalle en la
solicitud de patente internacional nº WO97/41892, publicada el 13
de noviembre de 1997 y en la Fig. 8D de la patente US nº
5.593.972.
Los componentes de la solución polinucleotídica
preliofilizada y de una composición líquida testigo se presentan en
la Tabla 1.
La solución preliofilizada de la Tabla I se
sometió a un procedimiento de liofilización según la presente
invención, caracterizado por los parámetros específicos que
comprenden etapas de congelación, secado principal y secado
secundario. Estos parámetros se desarrollan en el orden presentado
en la Tabla 2 e incluyen dos etapas principales de secado
consecutivas y cuatro etapas secundarias de secado
consecutivas.
La estabilidad de esta composición
polinucleotídica liofilizada y de la composición líquida testigo a
37ºC se controló midiendo el descenso en el % de superenrollamiento
(% de SC). Se analizó el % de SC de las muestras utilizando el
procedimiento con gel de agarosa. El procedimiento con gel de
agarosa es un procedimiento electroforético utilizado habitualmente
en biología molecular para la separación de diferentes formas de
ADN. La detección por el procedimiento con gel de agarosa se basa en
la intercalación del cromóforo bromuro de etidio en el ADN. El
procedimiento utiliza la unión de un fluoróforo al ADN bicatenario
(ds) para la detección, y la fluorescencia se mide indirectamente.
El ADN se somete a electroforesis en geles de agarosa que contienen
bromuro de etidio (EtBr). Tras su intercalación en el ADN, la
fluorescencia del EtBr aumenta considerablemente. La señal de
fluorescencia se registra utilizando un sensor CCD (dispositivo de
carga acoplada). La imagen se integra (con el software de Alpha
Innotech TM) para calcular las cantidades relativas de plásmido
circular abierto y superenrollado presentes en la muestra. Los
resultados se basan en la unión constante y uniforme del EtBr a los
plásmidos. Las observaciones indican, sin embargo, que cuando el %
de SC se sitúa por debajo del 93%, el procedimiento con gel
proporciona resultados artificialmente bajos. Por este motivo, se
ha puesto a punto un procedimiento de HPLC alternativo, como se
describe en Montgomery et al, Pharmsci., (supl. 1998)
"HPLC Assay for Determining Purity of [% Supercoiled] Plasmid
DNA in a Vaccine Product", Resumen 2503. La pureza del ADN
plasmídico se evalúa atendiendo al contenido de la forma T
superenrollada. Una sola etapa hidrolítica en el enlace fosfodiéster
de la cadena principal es suficiente para convertir el ADN
superenrollado (SC) en la forma circular abierta (OC). Este cambio
en la topología se traduce en una movilidad alterada en geles de
agarosa. En la actualidad, el ensayo de pureza más frecuentemente
utilizado (ensayo del % de SC) para el ADN plasmídico es el
procedimiento que utiliza gel de agarosa.
Las ecuaciones de velocidad que describen la
degradación del ADN se presentan a continuación en la Tabla 3.
- Ecuación 1-
- k_{obs} es la constante de velocidad observada y representa la degradación global del ADN (SC = superenrollamiento; OC = circular abierto)
ADN(SC)
\xrightarrow{\textstyle{k_{obs}}}
ADN(OC)
\frac{d[ADN]}{dt} =
-k_{obs}[ADN]t
- Ecuación 2-
- En condiciones de (pseudo)primer orden, la ecuación de velocidad para la degradación del ADN puede describirse como sigue: en la que [ADN] es la pureza (% de SC) o potencia del ADN
- Ecuación 3-
- La integración de la ecuación anterior utilizando las condiciones iniciales, a tiempo t = 0 [ADN] = [ADN]_{0} da lugar a la siguiente ecuación:
ln[ADN]
= ln[ADN]_{0} -
k_{obs}t
- \quad
- Utilizando la ecuación 3 con los datos de estabilidad de % de SC (pureza del ADN) obtenidos a una temperatura específica, puede generarse una gráfica del ln(% de SC) frente al tiempo y puede calcularse la k_{obs} a partir de la pendiente de la gráfica.
- Ecuación 4-
- A cualquier temperatura dada, el período de validez (t_{90}, tiempo que se tarda en alcanzar 90% de SC) puede calcularse como sigue:
t_{90} =
\frac{ln\left(\frac{[%SC]_{0}}{90}\right)}{k_{obs}}
- \quad
- en la que [% de SC]_{0} representa la pureza del ADN en el tiempo t = 0
- Ecuación 5-
- Suponiendo que [% de SC]_{0} = 95 en la ecuación 4, el período de validez del ADN plasmídico a una temperatura dada puede calcularse como sigue:
t_{90} =
\frac{0,0541}{k_{obs}}
Partiendo de la ecuación 3 de la Tabla 2, se
generaron gráficas del ln (% de SC) frente al tiempo para la
composición polinucleotídica liofilizada descrita anteriormente y
para el testigo de la Tabla 1. Los resultados se presentan en la
gráfica de la Fig. 1. Las pendientes (-k_{obs}, constante de
velocidad observada de pseudoprimer orden) de las gráficas se
calcularon utilizando análisis de regresión lineal por mínimos
cuadrados. La Fig. 1 indica que la constante de velocidad de la
composición polinucleotídica liofilizada preferida es por lo menos
10 veces menor que la constante de velocidad de la composición
líquida testigo. Estos resultados también indican que el período de
validez de la composición liofilizada es por lo menos 10 veces
superior al de la composición líquida a 37ºC (54 días frente a 4
días, calculado utilizando la ecuación 5 del esquema 1).
La composición polinucleotídica liofilizada de la
Tabla 1 se comparó después por difracción de rayos X con una
solución de ADN que comprendía el mismo ADN plasmídico que contenía
el gen gD_{2} como se ha mencionado anteriormente(0,2%
p/v) en tampón citrato a pH 6,4, y esta solución se precipitó
utilizando el procedimiento de precipitación con etanol [Sambrook,
J. et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^{a}
ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY,
págs. E10=E11 "Concentrating Nucleic Acid: Precipitation with
Ethanol or Isopropanol"]. Los diagramas de difracción de
rayos X se obtuvieron convencionalmente para ambas composiciones y
demostraron que la composición liofilizada presenta un diagrama de
difracción de rayos X característico de una estructura amorfa,
mientras que el ADN precipitado produce un diagrama de difracción
característico de una estructura altamente cristalina. Debido a que
las composiciones polinucleotídicas liofilizadas de la presente
invención presenta las propiedades físicas características de una
estructura amorfa y muy porosa, las composiciones de la presente
invención son muy solubles en agua (hasta un máximo de
aproximadamente 20 mg/ml). Se realizaron pruebas de solubilidad
utilizando un procedimiento de HPLC convencional.
Otra composición liofilizada preferida de la
presente invención que utiliza el ADN plasmídico descrito en el
Ejemplo 1 como polinucleótido y trehalosa como crioprotector y
estabilizante se prepara mediante el procedimiento de la presente
invención.
El testigo líquido fue idéntico al utilizado en
el Ejemplo 1. La Tabla 4 presenta la composición de la solución
preliofilizada, así como la del testigo líquido con plásmido.
La solución preliofilizada se sometió al
procedimiento de liofilización descrito anteriormente en el Ejemplo
1, y se controló la estabilidad de esta composición a 37ºC midiendo
el descenso % de superenrollamiento (SC) como se ha descrito
anteriormente en el Ejemplo 1. Se analizó el % de SC de las muestras
utilizando el procedimiento con gel de agarosa. La Fig. 2 muestra
una gráfica del ln (% de SC) frente al tiempo para la composición
polinucleotídica liofilizada y para la composición líquida testigo
de la Tabla 4. Las pendientes (-k_{obs}, constante de velocidad
observada) de las gráficas se calcularon utilizando análisis de
regresión lineal por mínimos cuadrados, como se describe en el
Ejemplo 1. Los resultados de la Fig. 2 indican que la constante de
velocidad de la composición liofilizada de la presente invención es
4 veces menor que la constante de velocidad de la composición
líquida testigo. Estos datos también indican que el período de
validez de la composición liofilizada de la presente invención es
cuatro veces mayor que el de la composición líquida testigo a
37ºC.
Se liofilizaron varias soluciones
polinucleotídicas que contenían ADN plasmídico con diferentes
crioprotectores (sacarosa, trehalosa, PVP y sorbitol) según la
presente invención. El ADN plasmídico utilizado en estos
experimentos fue el mismo plásmido que expresa el antígeno gD_{2}
del virus del herpes simple, tipo 2, empleado en el Ejemplo 1.
La Tabla 5 presenta las composiciones de ocho
soluciones polinucleotídicas preliofilizadas evaluadas. Los
parámetros de la liofilización fueron los mismos que se describen
en la Tabla 2 para el ejemplo 1. El % de SC se midió utilizando el
procedimiento con gel de agarosa como se ha descrito anteriormente
en el Ejemplo 1, tanto antes como después de la liofilización de
estas soluciones según la presente invención. Así, la Tabla 5
también proporciona el % de SC antes de la liofilización para cada
solución polinucleotídica y el % de SC después de la liofilización
para cada composición polinucleotídica liofilizada según la presente
invención.
Sobre la base de estos resultados, la trehalosa y
la sacarosa son crioprotectores más eficaces que el PVP y el
sorbitol. En ausencia de crioprotectores, el testigo liofilizado
con tampón fosfato basado en la liofilización de la solución 6 según
la presente invención presentó más de un 30% de pérdida en el
porcentaje de superenrollamiento, y el testigo liofilizado con
tampón citrato basado en la liofilización de la solución 8 presentó
una pérdida menor del 5%. Este dato podría atribuirse a un posible
cambio del pH hacia un pH ácido en la muestra con fosfato debido a
la congelación de especies dibásicas cristalinas antes que las
especies monobásicas amorfas. Sin embargo, no se observó este
fenómeno en las composiciones polinucleotídicas liofilizadas en
presencia del crioprotector sacarosa (véanse las soluciones 3 y 7).
Por consiguiente, en presencia de crioprotector las especies del
tampón no muestra ningún efecto en la composición polinucleotídica
liofilizada.
Los resultados de las medidas de la humedad de
las composiciones polinucleotídicas liofilizadas indican que el PVP
no ofrecía buenas propiedades como crioprotector, ya que las
composiciones liofilizadas que contenían PVP estaban casi secas
(humedad: << 1%) en comparación con las composiciones
liofilizadas que contenían otros crioprotectores (contenido de
humedad: 1 a 2%). Las composiciones liofilizadas que contenían PVP
también presentaron una pérdida de más del 15% en el porcentaje de
superenrollamiento. Según estos datos, la sacarosa y la trehalosa
son buenos crioprotectores para las composiciones de ADN plasmídico
liofilizadas según la presente invención.
Para valorar la utilidad de las composiciones
polinucleotídicas liofilizadas de la presente invención como
reactivos farmacéuticos o de investigación, se evaluó el efecto de
las composiciones polinucleotídicas liofilizadas y de los testigos
en las respuestas inmunitarias utilizando las composiciones
liofilizadas preparadas como se ha descrito en el Ejemplo 3
anterior.
Un testigo para las composiciones liofilizadas
fue la solución polinucleotídica preliofilizada nº 6 de la Tabla 5,
que no contenía crioprotector (Phos Pre-Lyo). Otro
testigo utilizado en estos elementos fue la composición liofilizada
con tampón citrato de la solución nº 8 de la Tabla 5, que no
contenía crioprotector (Citrato Post-Lyo). Las
composiciones liofilizadas de la invención evaluadas en este
experimento fueron la solución polinucleotídica liofilizada nº 1 de
la Tabla 5 con trehalosa como crioprotector en tampón fosfato
(Trehalosa/Phos); la solución polinucleotídica liofilizada nº 3 de
la Tabla 5 con sacarosa como crioprotector en tampón fosfato
(Sacarosa/Phos); y la solución polinucleotídica liofilizada nº 7 con
sacarosa como crioprotector en tampón citrato (Sacarosa/Cit). Los
testigos de las Figs. 3 y 4 (testigo 023 y testigo negativo) son
idénticos y contienen la cadena principal del plásmido sin la
secuencia gD_{2} y tampón.
Cada composición liofilizada se reconstituyó bien
en solución tampón fosfato o citrato, según corresponda a lo
utilizado en la solución de preliofilización original. Se
inmunizaron ratones Balb/C (5 por grupo) por vía intramuscular con
50 \mug/dosis de ADN en un volumen de 100 \mul de cada
composición liofilizada reconstituida del Ejemplo 3. No se añadió
ningún otro componente de estas composiciones. Después de tres
semanas se sacrificaron los animales.
Se extrajeron los bazos de los ratones descritos
anteriormente y se utilizaron para determinar las respuestas de
inmunidad celular específicas de antígeno utilizando un ensayo de
linfoproliferación. Se prepararon suspensiones unicelulares a
partir de los bazos extraídos, y después se cultivaron estas
células a 2 x 10^{5} células/pocillo en ausencia o presencia de 20
ng/ml de la proteína gD_{2} purificada. Los cultivos se incubaron
a 37ºC en CO_{2} al 5% durante cuatro días, antes de añadir 20
\mul de medio RPMI-1640 completo que contenía 1
\muCi de ^{3}[H]-timidina (ICN Inc.,
Costa Mesa, Ca) a cada pocillo e incubar durante otras 18 horas.
Las células se recogieron en placas de filtros de fibra de vidrio
utilizando un colector de muestras múltiples y la radiactividad
incorporada se midió utilizando procedimientos convencionales de
centelleo líquido en un contador beta (Wallac, Finlandia).
Se recogieron muestras de suero para el análisis
de la respuesta de anticuerpos (humoral) contra la gD_{2} del
HSV. Los anticuerpos de IgG específicos de gD_{2} en el suero se
analizaron por ELISA. Brevemente, se recubrieron placas de 96
pocillos de fondo plano (Co-star, Cambridge, MA)
durante toda la noche a 4ºC con proteína gD2 purificada a una
concentración de 0,4 \mug/ml. Las placas se lavaron tres veces
con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se bloquearon con
seroalbúmina bovina (BSA) al 4% durante una hora a temperatura
ambiente. Después se añadieron a la placa cincuenta \mul de la
dilución apropiada de suero y se dejaron durante toda la noche a
4ºC. Tras lavar cinco veces con BPST, se añadió una dilución 1:2000
de IgG dirigida contra anticuerpos de conejo y conjugada con
peroxidasa (Sigma, St. Louis, Mo) y las placas se incubaron durante
una hora. Las placas se lavaron con PBST antes de añadir el
sustrato 3,3',5,5'-tetrametilbencidina
(TMB)-H_{2}O_{2} (Biotecx, Houston, Tx). Se
dejó que el color se desarrollase durante 30 minutos antes de
realizar la lectura a 450 nm en un lector de microplacas E_{max}
(Molecular Devices, Sunnyvale, CA).
Las Figs. 3 y 4 representan las respuestas de
inmunidad celular y humoral para las composiciones mencionadas con
anterioridad, respectivamente. Los resultados indican mayores
respuestas de inmunidad celular y humoral en la composición
liofilizada con citrato/sacarosa de la presente invención, en
comparación con la composición liofilizada con fosfato/citrato de
la presente invención y la composición liofilizada testigo con
citrato/sin crioprotector. Comparando los resultados para las
composiciones liofilizadas de la presente invención con los de la
composición preliofilizada testigo en tampón fosfato, es evidente
que el procedimiento de liofilización y la inclusión de
crioprotectores (sacarosa o trehalosa) en las composiciones
polinucleotídicas según la presente invención no afectan
negativamente a las respuestas de inmunidad celular y humoral. Las
composiciones liofilizadas de la presente invención retienen la
actividad del plásmido o polinucleótido contenido en las mismas.
Se evaluaron dieciséis soluciones preliofilizadas
diferentes, que se describen en la Tabla 6. El ADN utilizado en
cada solución fue el mismo plásmido que contenía gD_{2} descrito
en el Ejemplo 1. Estas soluciones se identifican mediante códigos
diferentes en la tabla, y difieren en la concentración de ADN
(representada por el primer número en el código de la composición),
la identidad del crioprotector (representada por la primera letra
en el código), la concentración de crioprotector (representada por
el segundo número en el código) y el contenido de humedad tras la
liofilización (representado como bajo, L, o alto, H, en el código).
Las soluciones preliofilizadas fueron preparadas con agua para
inyección en cantidad suficiente para 100 ml, y fueron liofilizadas
según la presente invención utilizando los parámetros del ciclo de
liofilización presentados en la Tabla 2 anterior.
Todas las composiciones liofilizadas de la Tabla
6 fueron sometidas a pruebas de estabilidad acelerada a 37ºC, al
igual que la composición líquida testigo (composición de código #
96F0254), que tiene la fórmula de la composición líquida testigo
descrita en la Tabla 1 del Ejemplo 1 con 1 mg/ml de ADN plasmídico.
El estudio de estabilidad también incluía una composición plasmídica
liofilizada sin crioprotector, como testigo adicional. Se
recogieron muestras a diferentes intervalos temporales desde el día
0 hasta el día 30, y se analizó su % de SC utilizando el
procedimiento con gel de agarosa como se describe en el Ejemplo 1.
Utilizando los datos de % de SC en el análisis de regresión de
mínimos cuadrados (véase la Ecuación 3 de la Tabla 3), se
calcularon las constantes de velocidad de pseudoprimer orden
(k_{obs}) para la degradación del ADN en las diferentes
composiciones. Los valores de k_{obs} con intervalos de confianza
(IC) del 95% y los valores de R^{2} (bondad del ajuste) para
diferentes composiciones se resumen asimismo en la Tabla 6.
Los resultados relativos al % de SC indican que
todas las composiciones liofilizadas de la invención que contienen
sacarosa son estables a 37ºC durante por lo menos 4 semanas (es
decir, la duración del experimento). A partir de las constantes de
velocidad de pseudoprimer orden (k_{obs}) con los intervalos de
confianza (IC) del 95% y valores de R^{2} (bondad del ajuste)
presentados en la Tabla 5 es evidente que la k_{obs} para la
presente composición clínica es por lo menos 10 veces mayor que la
k_{obs} de la mayoría de las composiciones polinucleotídicas
liofilizadas de la presente invención que contienen sacarosa como
crioprotector. De modo similar, la k_{obs} para la presente
composición clínica es por lo menos 1,5 veces mayor que la k_{obs}
para las composiciones polinucleotídicas liofilizadas de la
presente invención que contienen trehalosa como crioprotector.
Sobre la base de estos datos, la sacarosa es el mejor
crioprotector, así como el mejor agente estabilizante para las
composiciones polinucleotídicas liofilizadas de la presente
invención.
El período de validez (% de superenrollamiento de
95% a 90%) de la composición liofilizada que contiene sacarosa
(código 2S2L) es 54 días a 37ºC, en comparación con un período de
validez de 4 días para la composición líquida de código 96F0254. A
5ºC, sin embargo, la presente composición clínica es estable
durante dos años. Por consiguiente, por extrapolación, cabría
esperar que la composición liofilizada de la presente invención
tenga un período de validez muy prolongado. A temperatura ambiente
(25ºC), se espera una estabilidad de por lo menos seis meses. Las
composiciones liofilizadas de la presente invención con alto nivel
de humedad que contienen trehalosa como crioprotector presentaron
una mejor estabilidad en comparación con composiciones similares
con bajo nivel de humedad que contenían trehalosa.
Las constantes de velocidad para las
composiciones liofilizadas de la presente invención con bajo nivel
de humedad que contenían sacarosa son relativamente inferiores en
comparación con las composiciones liofilizadas de la presente
invención con alto nivel de humedad que contienen sacarosa. Sobre la
base de estos datos, se seleccionó la composición liofilizada del
Ejemplo 1 (que contiene sacarosa al 2%) como composición preferida
para el siguiente experimento.
Se proporciona una composición liofilizada
preferida de la invención para liofilizar ADN a granel para la
preparación de un producto farmacéutico de alta concentración final
que también contiene un facilitador. Esta composición contiene el
mismo ADN plasmídico descrito en el Ejemplo 1 a una concentración de
0,2% p/v en la solución preliofilizada, sacarosa como crioprotector
a una concentración de 2,0% p/v, tampón citrato (5 mM, pH 6,7) y
agua para inyección en cantidad suficiente para 100 ml. La
composición se liofilizó utilizando el ciclo expuesto en el Ejemplo
1 de la Tabla 2 anterior. Se prepararon diferentes concentraciones
de bupivacaína, un facilitador (0,25, 0,6 y 1,0% p/v) en tampón
citrato (5 mM, pH 6,7) y se utilizaron para reconstituir el producto
liofilizado descrito anteriormente. Para obtener las
concentraciones deseadas de ADN, se añadieron diferentes cantidades
de las soluciones tamponadas de bupivacaína al polvo liofilizado.
Las formulaciones "farmacéuticas" resultantes se describen en
la Tabla 7, en la que también se representa la estabilidad, en
días, del producto de alta concentración de ADN a lo largo del
tiempo, tras la reconstitución, medida como % de SC, según se ha
descrito anteriormente.
Puede apreciarse a partir de estos resultados que
por lo menos hasta un máximo de 20 mg/ml, las composiciones
polinucleotídicas liofilizadas reconstituidas de la presente
invención son estables durante 18 días a juzgar por los datos de
pureza. Hay que señalar asimismo que las soluciones reconstituidas
eran uniformes a juzgar por su aspecto físico.
En la especificación mencionada anteriormente se
incluyen numerosas modificaciones y variaciones de la presente
invención que se espera sean obvias para el experto en la materia.
Dichas modificaciones y alteraciones de las composiciones y
procedimientos de la presente invención se consideran incluidas en
el alcance de las reivindicaciones que se adjuntan.
Claims (48)
1. Composición polinucleotídica liofilizada que
comprende:
- (a)
- por lo menos un polinucleótido,
- (b)
- por lo menos un crioprotector, en el que la relación de polinucleótido a crioprotector es de 0,001 a 1,0 parte en peso de polinucleótido por 1,0 parte en peso de crioprotector, y
- (c)
- de 0,5 por ciento en peso a 6 por ciento en peso de agua, sobre la base del peso total de la composición polinucleotídica;
en la que dicha composición polinucleotídica
retiene por lo menos 90% de superenrollamiento durante un período de
tiempo de por lo menos 10 días a 37ºC.
2. Composición según la reivindicación 1, en la
que dicha agua está presente desde 1 por ciento en peso hasta 5 por
ciento en peso.
3. Composición según la reivindicación 1, en la
que dicha agua está presente desde 2 por ciento en peso hasta 3 por
ciento en peso.
4. Composición según la reivindicación 1, en la
que el polinucleótido se selecciona de entre el grupo formado por
ADN-A, ADN-B, ADN-Z,
ARN, ARNt, ARNm, y combinaciones de los mismos.
5. Composición según la reivindicación 4, en la
que el polinucleótido es ADN bicatenario.
6. Composición según la reivindicación 4, en la
que el polinucleótido es ADN plasmídico.
7. Composición según la reivindicación 4, en la
que el polinucleótido es un vector vírico.
8. Composición según la reivindicación 1, que
comprende, además, una combinación de dos o más
crioprotectores.
9. Composición según la reivindicación 1 o la
reivindicación 7, en la que dicho crioprotector es un azúcar
alcohólico.
10. Composición según la reivindicación 9, en la
que dicho alcohol se selecciona de entre el grupo formado por
alditol, manitol, sorbitol, inositol, polietilenglicol, y
combinaciones de los mismos.
11. Composición según la reivindicación 10, en la
que el crioprotector es polietilenglicol.
12. Composición según la reivindicación 1 o la
reivindicación 7, en la que dicho crioprotector es un azúcar
ácido.
13. Composición según la reivindicación 12, en la
que dicho ácido se selecciona de entre el grupo formado por un ácido
aldónico, un ácido urónico, un ácido aldárico, y combinaciones de
los mismos.
14. Composición según la reivindicación 1 o la
reivindicación 7, en la que dicho crioprotector es un
carbohidrato.
15. Composición según la reivindicación 14, en la
que dicho carbohidrato se selecciona de entre el grupo formado por
una aldosa, una cetosa, un aminoazúcar, un disacárido, un
polisacárido, y combinaciones de los mismos.
16. Composición según la reivindicación 15, en la
que dicho azúcar se selecciona de entre el grupo formado por
sacarosa, glucosa, lactosa, trehalosa, y combinaciones de los
mismos.
17. Composición según la reivindicación 16, en la
que el crioprotector es sacarosa.
18. Composición según la reivindicación 1, que
presenta una estructura física predominantemente amorfa.
19. Composición según la reivindicación 6, en la
que dicho ADN plasmídico retiene por lo menos 90% de
superenrollamiento durante un período de tiempo de por lo menos 20
días a 37ºC.
20. Composición farmacéutica que comprende un
principio activo que consta de una composición liofilizada según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 y un excipiente o
vehículo opcional farmacéuticamente aceptable.
21. Composición según la reivindicación 20, en la
que dicho excipiente o vehículo es adecuado para una vía de
administración seleccionada de entre el grupo formado por las vías
oral, parenteral, intranasal e intrapulmonar.
22. Composición según la reivindicación 1, para
su utilización en medicina.
23. Utilización de una composición según la
reivindicación 1 en la preparación de un medicamento para la
administración de un polinucleótido a un mamífero.
24. Utilización según la reivindicación 23, en la
que ser realiza la administración por una vía seleccionada de entre
el grupo formado por las vías oral, parenteral, intranasal e
intrapulmonar.
25. Procedimiento para la preparación de una
composición polinucleotídica liofilizada que comprende las etapas
siguientes:
- (a)
- formar una solución polinucleotídica acuosa que tiene un pH de 6,2 a 7,8 y que comprende de 0,1 mg/ml a 5 mg/ml de por lo menos un polinucleótido sobre la base del volumen total de dicha solución polinucleotídica, y de 0,5 por ciento en peso a 10 por ciento en peso de por lo menos un crioprotector, sobre la base del peso total de dicha solución polinucleotídica;
- (b)
- enfriar dicha solución polinucleotídica hasta una temperatura de -30ºC a -70ºC, hasta su congelación;
- (c)
- aplicar vacío para reducir la presión hasta 25 mTorr (187,5 Pa) a 250 mTorr (1875 Pa);
- (d)
- calentar gradualmente dicha solución polinucleotídica en una primera etapa hasta una temperatura de -40ºC a 20ºC durante un período de 5 horas a 40 horas;
- (e)
- mantener dicha solución polinucleotídica tras la etapa de calentamiento (d) a una temperatura de -35ºC a 10ºC y a una presión de 25 mTorr (187,5 Pa) a 250 mTorr (1875 Pa) durante un período de 1 hora a 10 horas;
- (f)
- calentar gradualmente dicha solución polinucleotídica tras la etapa de retención (e) hasta una temperatura de 20ºC a 35ºC durante un período de 1 hora a 20 horas, y a una presión de 25 mTorr (187,5 Pa) a 150 mTorr (1125 Pa), y
- (g)
- recuperar una composición polinucleotídica liofilizada que tiene un contenido de agua de 0,5 por ciento en peso a 6 por ciento en peso sobre la base del peso total de dicha composición recuperada.
26. Procedimiento según la reivindicación 25, en
el que dicha solución polinucleotídica de la etapa (a) comprende
además un tampón.
27. Procedimiento según la reivindicación 25, que
comprende además, después de la etapa (f), la etapa de mantener la
solución polinucleotídica a una temperatura de 20ºC a 30ºC, y a una
presión de 25 mTorr (187,5 Pa) a 150 mTorr (1125 Pa) durante un
período de 1 hora hasta 10 horas.
28. Procedimiento según la reivindicación 25, en
el que la etapa (d) comprende calentar gradualmente dicha solución
polinucleotídica en una primera etapa hasta una temperatura de
-10ºC a 20ºC durante un período de 5 horas a 20 horas.
29. Procedimiento según la reivindicación 27, en
el que durante la etapa de retención (e) dicha solución
polinucleotídica se mantiene a una temperatura de -10ºC a 10ºC
durante un período de 2 a 10 horas.
30. Procedimiento según la reivindicación 29, en
el que durante la etapa de retención (e) dicha solución
polinucleotídica se mantiene a una temperatura de -5ºC a 5ºC y
durante un período de 5 horas a 7 horas.
31. Procedimiento según la reivindicación 30, en
el que durante la etapa de retención (e) dicha solución
polinucleotídica se mantiene a una presión de 40 mTorr (300 Pa) a
150 mTorr (1125 Pa).
32. Procedimiento según la reivindicación 25, en
el que durante la etapa de refrigeración (b) dicha solución
polinucleotídica se enfría gradualmente hasta una temperatura de
-30ºC a -70ºC durante un período de 1 hora a 5 horas.
33. Procedimiento según la reivindicación 25, en
el que durante la etapa (c) se reduce la presión hasta 50 a 100
mTorr (375 a 750 Pa).
34. Procedimiento según la reivindicación 25, en
el que entre las etapas (c) y (d) dicha composición
polinucleotídica se mantiene a una temperatura de la etapa (b) y a
una presión de la etapa (c) durante 0,5 a 5 horas.
35. Procedimiento según la reivindicación 25, en
el que durante la etapa de calentamiento (d) dicha solución
polinucleotídica se calienta gradualmente hasta una temperatura de
-5ºC a 5ºC durante un período de 8 horas a 20 horas.
36. Procedimiento según la reivindicación 35, en
el que durante la etapa de calentamiento (d) la presión es de 40
mTorr (300 Pa) a 150 mTorr (1125 Pa).
37. Procedimiento según la reivindicación 25, en
el que en la etapa (c) el vacío se aplica disminuyendo rápidamente
la presión hasta 300 mTorr (2250 Pa) a 200 mTorr (1500 Pa), y
después reduciendo gradualmente la presión hasta 150 mTorr (1125
Pa) a 40 mTorr (300 Pa) durante un período de 1 hora a 2 horas.
38. Procedimiento según la reivindicación 23, en
el que durante la etapa de calentamiento (f), la solución
polinucleotídica se calienta hasta una temperatura de 23ºC a 27ºC
durante un período de 2 horas a 3 horas.
39. Procedimiento según la reivindicación 38, en
el que durante la etapa de calentamiento (f), la presión es de 40
mTorr (300 Pa) a 110 mTorr (825 Pa).
40. Procedimiento según la reivindicación 25, en
el que la etapa de calentamiento (d) comprende un período de 7
horas a 11 horas; la etapa de retención (e) comprende un período de
1 hora, y la etapa de calentamiento (f) comprende un período de 2
horas.
41. Procedimiento según la reivindicación 25, en
el que el crioprotector se selecciona de entre el grupo formado por
sacarosa, trehalosa, manitol, sorbitol, polietilenglicol, y
combinaciones de los mismos.
42. Procedimiento según la reivindicación 41, en
el que dicho crioprotector es sacarosa y polietilenglicol.
43. Procedimiento para la liofilización de una
composición polinucleotídica, en el que dicho procedimiento
comprende congelar dicha composición, someter dicha composición
congelada a vacío, realizar una etapa principal de secado, aumentar
la presión sobre dicho producto de dicha etapa de secado, realizar
una etapa secundaria de secado, y recuperar un producto
liofilizado, comprendiendo la mejora la etapa de:
someter una solución polinucleotídica que
contiene un crioprotector, habiendo sido enfriada dicha solución
hasta su congelación y sometida a vacío, a un ciclo principal de
secado que comprende calentar gradualmente dicha solución a una
temperatura de -20ºC a 20ºC durante un período de 5 horas a 30 horas
y evitando la retrofusión de dicha solución, en el que dicho ciclo
principal de secado reduce el tiempo necesario para completar el
procedimiento de liofilización y proporciona el polinucleótido
liofilizado en una estructura física sustancialmente amorfa que
retiene por lo menos 90% de superenrollamiento durante un período
de tiempo de por lo menos 10 días a aproximadamente 37ºC.
44. Procedimiento según la reivindicación 43, en
el que dicho período de tiempo es de 5 a 20 horas.
45. Procedimiento según la reivindicación 43, en
el que dicho período de tiempo es de 5 a 10 horas.
46. Procedimiento según la reivindicación 43, el
que dicha temperatura es de -10ºC a 20ºC.
47. Procedimiento según la reivindicación 43, en
el que dicha temperatura es 0ºC.
48. Procedimiento según la reivindicación 43, que
comprende además una etapa secundaria de secado, en la que la
solución polinucleotídica se calienta hasta una temperatura de 23ºC
a 27ºC durante un período de 2 horas a 3 horas.
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