ES2313792T3 - Mutantes atenuados de spi2 de salmonella como portadores de antigeno. - Google Patents

Abstract

Un portador para la presentación de un antígeno a un huésped cuyo portador es una célula gram-negativa atenuada que comprende el locus SPI2 del gen, en donde por lo menos uno de los genes efectores sseA de, sseC, el sseD, sseE, sseF y sseG es desactivado y/o en donde el gen chaperón sscB es desactivado y/o en donde por lo menos uno de los genes del aparato de secreción ssaE, ssaG y ssaH es desactivado y en donde dicha desactivación resulta en una atenuación/reducción de la virulencia comparada al tipo natural de dichas células, en donde la célula comprende por lo menos una molécula heteróloga de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para dicho antígeno, en donde dicha célula es capaz de expresar la molécula de ácido nucleico o capaz de causar la expresión de la molécula de ácido nucleico en una célula seleccionada.

Description

Mutantes atenuados de SPI2 de Salmonella como portadores de antígeno.

Antecedentes de la invención

En 1996, más de 17 millones de personas en todo el mundo, principalmente en países en desarrollo, muerieron por infecciones diversas. La aparición y la propagación de resistencias a los antibióticos asociadas con el incremento en los viajes por todo el mundo han conducido a un riesgo creciente para el desencadenamiento de infecciones pandémicas. Esta posibilidad debe ser tomada muy seriamente dado que, para algunas bacterias patógenas, las alternativas terapéuticas disponibles se hayan reducidas a una única opción. Desconcertantemente, se ha descubierto que las bacterias patógenas también son un factor relevante en muchas enfermedades crónicas. El cáncer del estómago, por ejemplo, es el segundo cáncer mundial más común y está directamente vinculado con las infecciones crónicas de Helicobacter pylori. Las neumonías por Clamidia han sido detectadas en placas arterioscleróticas y recientemente esta bacteria ha sido encontrada en las regiones enfermas del cerebro de personas que sufren de la enfermedad de Alzheimer. Muchas enfermedades autoinmunes, tales como la artritis reumatoide, parecen tener un origen bacteriano. La Borrelia burgdMLAeri es, además de muchas otras bacterias, un ejemplo prominente de un organismo que causa la enfermedad que afecta un número en aumento de personas. Finalmente, la Nanobacteria ha sido identificada en los riñones crónicamente enfermos de pacientes con depósitos cristalinos. Otras enfermedades crónicas severas se deben a los agentes patógenos virales, los más clínicamente relevantes son los virus de Hepatitis B y C (cáncer del hígado) y el virus del papiloma humano (cáncer cervical).

La importancia clínica creciente de los agentes patógenos bacterianos ha provocado la discusión creciente que considera el paradigma de prevención o tratamiento medicinal como la manera de tratar las enfermedades crónicas. Consistentemente, algunas enfermedades crónicas han sido exitosamente curadas por tratamiento con antibióticos. Sin embargo, como se ha indicado anteriormente, todos los microorganismos son genéticamente capaces de generar progenies rápidamente con resistencias adecuadas al antibiótico, impidiendo así el tratamiento eficiente de rutina. Concluyentemente, las vacunas representan una alternativa excelente para las drogas farmacológicas, y, considerando el aspecto financiero de que la prevención de la enfermedad es menos costosa que la terapia, la opción de la vacunación es aún más atractiva. Por consiguiente, el advenimiento de la vacunación terapéutica se ha vuelto particularmente relevante, especialmente con relación al tratamiento del cáncer y de las enfermedades crónicas bacterianas o
virales.

La estrategia más frecuentemente practicada usa la entrega oral ya sea de agentes patógenos desactivados (vacuna muerta) o de inyecciones parenterales de una mezcla definida de componentes purificados (vacunas de unidades secundarias). La mayoría de las vacunas muertas son eficaces, sin embargo, el riesgo de que el procedimiento de desactivación sea incompleto y que las vacunas puedan volverse infecciosas permanece como un problema. Además, las vacunas muertas muy a menudo no cubren todas las variantes genéticas que aparecen en la naturaleza. Las vacunas de unidades secundarias cancelan la mayoría de las desventajas de las vacunas muertas tradicionales. Sin embargo, requieren un antígeno y preparaciones adyuvantes desarrollados tecnológicamente, lo cual hace tales vacunas relativamente caras. Además, las vacunas de unidades secundarias son preferentemente inoculadas por la ruta parenteral, la cual no es la ruta óptima para producir una respuesta inmune amplia. En particular, la rama mucosa del sistema inmunológico, la cual es la línea primaria de protección en contra de muchos agentes patógenos, está fuertemente abandonada para las inmunizaciones parenterales.

Otra generación de vacunas es representada por vacunas atenuadas vivas, las cuales se basan en virus o bacterias patógenas que han sido mutadas a las variantes no patogénicas. Estas variantes se multiplican in vivo por un período de tiempo limitado antes de que sean completamente liberadas por el huésped. Su prevalencia limitada en el tejido huésped es suficiente para provocar adecuadamente que el sistema inmunológico del huésped, el cual es entonces capaz de establecer una respuesta inmune protectora. Desde el aspecto de la seguridad, las vacunas bacterianas vivas atenuadas están más favorecidas que las vacunas virales vivas atenuadas. Si una vacuna bacteriana se convirtiera en una amenaza para una vacuna, la bacteria atenuada puede generalmente controlarse por el tratamiento de antibiótico. En contraste, las vacunas virales vivas, que usan el mecanismo de replicación de la célula huésped, son casi imposibles de controlar. Las vacunas bacterianas vivas son típicamente administradas oralmente y sirven de estimuladores excelentes del sistema inmunológico mucoso. Además, las vacunas bacterianas vivas son también buenos estimuladores del sistema inmunológico sistemáticamente activo, a saber las ramas celulares y humorales. Debido a estas excelentes características inmunoestimuladoras, las cepas de la vacuna bacteriana viva, como la Salmonella, son portadores ideales para la expresión de los antígenos de un agente patógeno heterólogo. Tales vacunas bivalentes (o multivalentes) median la protección en contra de dos agentes patógenos: el agente patógeno homólogo para el portador así como también el agente patógeno cuyo antígeno protector (s) son expresados por el portador. Aunque ninguna vacuna bacteriana bivalente que expresa antígenos heterólogos está actualmente en uso, los portadores potenciales actualmente bajo investigación incluyen a las especies Bacille Calmette Guerin (BCG), Salmonella, Vibrio cholerae y Escherichia coli.

En el proceso de atenuación, las mutaciones son preferentemente dirigidas a sectores específicos para los genes que soportan la supervivencia del agente patógeno en el huésped. Inicialmente, los regímenes químicos de mutación fueron aplicados para la cepa Ty2 de Salmonella typhi, resultando en lo que fuera pensado para ser perfectamente atenuados los agentes patógenos capaces de mediar la inmunidad protectora, en contraste al del homólogo muerto. Sin embargo, las subsiguientes pruebas clínicas en gran escala revelaron que tales cepas no fueron todavía suficientemente eficaces en la prevención de la fiebre tifoidea. Aparece que tales cepas fueron mutadas en varios genes, resultando en una sobre atenuación, que adversamente afecta el potencial inmunogénico de la cepa. Las nuevas cepas de la vacuna de tifoidea han sido desarrolladas por la introducción de mutaciones genéticamente definidas. La mayoría de estas mutaciones han sido establecidas en la S. typhimurium. La infección con la S. typhimurium causa síntomas parecidos a los de la fiebre tifoidea en ratones y la salmonelosis murina es un modelo bien aceptado para la fiebre tifoidea humana. Tales cepas de la vacuna contienen mutaciones en proteínas que causan deficiencias en la biosíntesis de los aminoácidos aromáticos (por ejemplo aroA, aroC y aroD) o en las purinas (por ejemplo purA y purE), en el gen ciclasa adenilato (cya) o en la proteína del receptor cAMP (crp), o posee mutaciones que afectan la regulación de varios factores de virulencia (phoP y phoQ). Sin embargo, aunque un número de mutantes atenuados han sido generados y caracterizados en el modelo de ratón con respecto a su papel en la virulencia, relativamente pocos de ellos han sido evaluados como portadores de vacunas en humanos. La razón para esto es que los mutantes usados están ya sea todavía demasiado virulentos, causando efectos secundarios severos en el huésped, o no son suficientemente inmunogénicos, debido a la presentación inadecuada al sistema inmunológico, la cual requiere un nivel crítico de persistencia de la cepa de la vacuna en el huésped para la activación.

Un estudio reciente reveló que la desactivación de genes individuales de la Salmonella que causan atenuación de la virulencia directamente influye en la calidad de una respuesta inmune en contra de la cepa portadora de la vacuna. De este descubrimiento, uno puede concluir que podría lograrse generar una variedad de cepas de vacunas de Salmonella atenuadas diferentemente, cada una con un único perfil y capacidades individuales para producir como respuesta una respuesta inmune. Con este repertorio, podría lograrse hacer a la medida una cepa de vacuna según las demandas inmunológicas específicas. Como una consecuencia lógica, uno también debería poder desarrollar cepas de vacunas de Salmonella atenuadas ya sea para propósitos profilácticos o terapéuticos. Sin embargo, la manera por la cual un repertorio tan representativo de cepas de vacunas de Salmonella es obtenido y adicionalmente desarrollado en una vacuna eficaz debe ser determinada.

En los casos en los cuales una cepa de vacuna de Salmonella es utilizada como portador para antígenos heterólogos, los parámetros adicionales deben ser considerados. Tradicionalmente, los antígenos heterólogos han sido expresados en el citosol de la Salmonella. En el modelo de tifoidea del ratón, fue demostrado que, cuando los antígenos heterólogos son expresados en niveles altos en el Citosol de la Salmonella, los cuerpos de inclusión se forman a menudo, lo cual negativamente influye en la inmunogenicidad de la cepa de la vacuna viva recombinante en el huésped vacunado. Se concluyó que la formación de cuerpos de inclusión podría ser fatal para la bacteria, disminuyendo la vitalidad y aumentando la atenuación adicionalmente, y así bajando la inmunogenicidad. Ciertamente, los sistemas de expresión específicos que soslayan este principio secundario de atenuación, por ejemplo el sistema de expresión regulado de dos fases, pueden mejorar la eficacia de la presentación de antígenos heterólogos para el sistema inmunológico del huésped.

Ha sido demostrado que la secreción de antígenos por la Salmonella viva atenuada puede ser superior para la expresión intracelular de los mismos antígenos tanto en producir como respuesta respuestas de la célula T protectora (Hess et al., 1996; Hess et al., 1997b) como en producir como respuesta niveles elevados de anticuerpo específico de antígeno (Gentschev Et Al., 1998). Las eficiencias de los sistemas de secreción dirigidos HlyA, sin embargo, son usualmente bajas (30% o menos del total de antígeno sintetizado) (Hess Et Al., 1997a; Hess et al., 1996), y el sistema parece ser problemático en S. typhi para la exportación de antígenos heterólogos (Orr Et Al., 1999).

Un perfil inmunológico similar es inducido por los dos sistemas de secreción del tipo III, los cuales están codificados por las Islas 1 y 2 de patogenicidad de la Salmonella. Estas maquinarias complicadas de secreción naturalmente entregan "proteínas efectoras" en el citosol de la célula huésped infectada, dando apoyo a la supervivencia del agente patógeno dentro de la célula huésped. Por medio de la tecnología de gen, las "proteínas efectoras" pueden convertirse en vehículos portadores para los epítopes de los antígenos heterólogos. Tales "proteínas efectoras" quiméricas pierden su carácter virulento pero retienen su carácter secretor. Consecuentemente, la "proteína efectora" quimérica es entregada en el lumen de la célula huésped, en donde es apropiadamente procesada y subsiguientemente estimula la rama citotóxica del sistema inmunológico huésped.

La proteína más abundante secretada por la Salmonella es la flagelina (ver, por ejemplo (Hueck Et Al., 1995)). En la S. typhimurium, la flagelina ocurre en dos variantes alélicas, FliC o FljB, mientras la S. typhi porta sólo el gen FliC. La flagelinaes secretada mediante la senda de exportación específica del flagelo (FEX) (Macnab, 1996; Minamino y Macnab, 1999), el cual es homólogo a la senda de secreción de tipo III (Hueck, 1998). También ha sido mostrado recientemente que la senda FEX funciona en la secreción de proteínas no flagélicas en Yersinia enterocolitica (Young et al., 1999). Como en la secreción del tipo III, el terminal amino de FliC dirige la secreción. Así, una versión truncada de 183 aminoácidos de terminal amino de FliC (la longitud total es 495 aa) es constitutivamente secretada en cantidades grandes (Kuwajima et al 1989). En analogía a una secreción del tipo III, la señal de secreción efectiva en FliC puede ser tan pequeña como 10 a 20 aminoácidos. Las señales de excreción FliC o FljB potencialmente pueden usarse para secretar cantidades grandes de una proteína heteróloga que puede servir como antígeno en la vacunación de heterólogos. Es probable que la cantidad de antígeno secretado pueda estar aun adicionalmente aumentada en mutantes reguladores afectando la expresión de biosíntesis de genes flagelares (Macnab, 1996; Schmitt et al., 1996) o usando promotores recombinantes para conducir la expresión del gen de flagelina.

La secreción por medio de la senda de FEX puede permitir la entrega de grandes cantidades de antígeno en la Salmonella que contiene el fagosoma para el procesamiento rápido y eficiente del antígeno y la presentación del antígeno al sistema inmunológico huésped. Especialmente la rama dependiente clase II de CPH del sistema inmunológico del huésped es fuertemente respaldada por el sendero de la entrega de antígeno mediado de FEX.

Las otras maquinarias conocidas de exportación y los sistemas de despliegue de la superficie de bacterias gram negativas pueden ser también aplicadas para los portadores de vacuna bacteriana tales como la Salmonella. En general, una buena respuesta inmune es lograda cuando el antígeno es presentado en la superficie de la Salmonella. Sin embargo, como se sabe poco acerca de la consecuencia inmunológica de tales sistemas de presentación del antígeno, el trabajo experimental adicional es necesario.

Los efectos adicionales inmunomodulatorios pueden ser logrados cuando los promotores de Salmonella ambientalmente regulados se usan para la expresión de antígenos heterólogos. Por ejemplo, la expresión de un gen heterólogo en una cepa portadora de Salmonella bajo el control del promotor del gen htrA de respuesta de estrés regulada in vivo resultó en una respuesta inmune más fuerte que fue obtenida cuando está bajo el control del promotor inducible anaeróbicamente del gen nirB.

El WO 96/17951 se relaciona con un método para identificar un microorganismo que tiene una adaptación reducida a un ambiente particular, y a microorganismos mutantes y genes identificados por el método.

Hensel et al (1997) Mol. Microbiol. 24, 155-167 trata sobre el análisis funcional de ssaJ y el ssak/U operón.

Ochman et al (1996) Proc. Natl. Acad Sci. USA 93, 7800-7804 se relaciona con la identificación de una isla de patogenicidad requerida para la supervivencia de la Salmonella en las células huéspedes.

El acceso No. AF 0208080 de la base de datos EMBL/GenBank se relaciona con una secuencia parcial de la isla 2 de patogenicidad de la Salmonella typhimurium.

El acceso No. Z 95891 de la base de datos EMBL/GenBank se relaciona con los genes ssrA y ssrB de la Salmonella typhimurium

Valentine (1998) Infection Immun. 66, 3378-3383 se relaciona con la identificación de tres mutantes de la Salmonella typhimurium altamente atenuados que son más inmunogénicos y protectores en ratones que un mutante del aroA prototípico.

El mecanismo presente describe una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de ácido nucleico que consta de al menos 50 nucleótidos a) de la secuencia de ácido nucleico de una de las Figs. 21 A, B, b) de un alelo de la secuencia de ácido nucleico de una de las Figs. 21 A, B, o c) de una secuencia de ácido nucleico la cual bajo condiciones estrictas hibridiza con la secuencia de ácido nucleico de una de las Figs. 21 A, B.

Las condiciones estrictas de hibridación en el sentido de la invención presente están definidas como las descritas por Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), 1.101-1.104. Según esto, la hibridación bajo condiciones estrictas quiere decir que una señal positiva de hibridación es todavía observada después de lavar por 1 hora con tampón 1 x SSC y 0,1% a 55ºC, preferentemente a 62ºC y más preferentemente a 68ºC, en particular, por 1 hora en tampón 0,2 x SSC y de 0,1% a 55ºC, preferentemente a 62ºC y más preferentemente a 68ºC.

En particular, el mecanismo presente describe tal molécula de ácido nucleico la cual comprende las regiones completas de codificación o partes de la misma de los genes ssaD, ssaE, sseA, sseB, sscA, sseC, sseD, sseE, sscB, sseF, sseG, ssaG, ssaH, ssaE, ssaJ, ssrA y ssrB. La invención se aplica también para tales ácidos nucleicos, en donde al menos una región de codificación de dichos genes es funcionalmente suprimida.

En una realización, la molécula de ácido nucleico comprende un casete de inserción para facilitar la introducción de una molécula de ácido nucleico heteróloga por el mecanismo mediado por transposón o fago.

Además, dichas moléculas de ácido nucleico pueden comprender al menos una molécula de ácido nucleico heteróloga. En este caso la molécula de ácido nucleico heteróloga puede ser combinada 5' o 3', insertada o deleción-insertada a la molécula de ácido nucleico inventiva. Por el término "deleción-insertada" está sobreentendido que la inserción de la molécula heteróloga de ácido nucleico se asocia con una deleción concurrente de partes de la molécula de ácido nucleico inventiva. Preferentemente, la molécula de ácido nucleico está insertada o deleción-insertada y en una realización preferida la molécula de ácido nucleico heteróloga está flanqueada 5' y 3' por las secuencias de la molécula de ácido nucleico según la invención, en donde cada una de dichas secuencias tiene un largo de al menos 50 nucleótidos, preferentemente 200 a 250 nucleótidos.

Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico heteróloga codifica para un polipéptido o péptido, más preferiblemente codifica para un antígeno bacteriano o viral o un homólogo del mismo o para un antígeno del tumor.

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Es preferido que la molécula de ácido nucleico también comprenda al menos un casete de expresión del gen para permitir la expresión eficiente de la molécula de ácido nucleico heteróloga. Tal casete de expresión del gen usualmente comprende elementos tales como promotores y/o mejoradores los cuales mejoran la expresión de la molécula de ácido nucleico heteróloga. Usualmente, tal casete de expresión del gen comprende elementos para la terminación de la transcripción. La presencia de terminadores de la transcripción, sin embargo, no puede ser preferida en casos donde la molécula de ácido nucleico heteróloga debe trascribirse conjuntamente con otros genes en un mRNA
cistrónico.

La molécula de ácido nucleico, uno o más casetes marcadores selectivos y uno o más casetes transactivadores y opcionalmente casetes de invertasa para permitir la expresión de las moléculas de ácido nucleico heterólogas en un sistema de una fase o un sistema de dos fases. Además, las secuencias pueden estar presentes la cuales codifican para un polipéptido o un dominio de selección de péptido y, así, permitir la selección del producto de expresión de la molécula de ácido nucleico heteróloga en un compartimiento de la célula predeterminado tal como citosol, periplasma o una membrana exterior, o la secreción de dicho producto de expresión, o el cuál codifica para un dominio inmunoestimulador.

La presente solicitud también describe un vector recombinante que comprende la molécula de ácido nucleico descrita arriba. La presente solicitud también describe una célula que comprende una molécula de ácido nucleico inventiva modificada como se describió arriba por la inserción de una secuencia heteróloga o el vector recombinante. La célula puede ser una célula procariótica tal como una célula gram negativa, por ejemplo una célula de Salmonella, o puede ser una célula eucariótica tal como una célula de mamífero, por ejemplo una célula humana, y, en particular, un macrófago.

La presente solicitud describe un péptido o un polipéptido que comprende una secuencia péptida que comprende al menos 20 aminoácidos, a) de la secuencia de una de las Figs. 23 A-Q, o b) de una secuencia que es el 60%, preferible el 65% y más preferible el 70% de los homólogos a la secuencia de una de las Figs. 23 A-Q. En particular, la invención refiere a un polipéptido que comprende la secuencia a) de una de las Figs. 23 A-Q, o b) la cual es el 60%, preferible el 65% y más preferible el 70% del homólogo para la secuencia de una de las Figs. 23 A-Q.

Los porcentajes (%) de homología son determinados según la siguiente ecuación:

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1

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en donde las H son los % de homología, L es la longitud de la secuencia básica y n es el número de las diferencias de nucleótido o de aminoácido de una secuencia a la secuencia básica dada.

La presente solicitud también describe un anticuerpo el cual es dirigido en contra de un epítope el cual está comprendido del péptido o polipéptido antes mencionados. El anticuerpo puede ser policlonal o monoclonal. Los métodos para producir tal anticuerpo son conocidos por el experto en la técnica.

La presente solicitud también describe una proteína de fusión que comprende el polipéptido según cualesquiera de las reivindicaciones 17 y 18 teniendo insertado o insertado por deleción o estando combinada C- ó NH_{2}- terminalmente con al menos un polipéptido heterólogo. El polipéptido heterólogo preferido es un antígeno, más preferido un antígeno bacteriano o viral o un antígeno del tumor.

La presente solicitud además provee instrucciones para el desarrollo de una variedad de cepas de vacunas de Salmonella vivas potenciales con niveles de atenuación diferentes, las cuales subsiguientemente sirven como plataformas para el desarrollo de cepas portadoras de vacunas de Salmonella vivas recombinantes que expresan antígenos de agentes patógenos heterólogos, así sirviendo de vacunas multivalentes. Tales portadores de vacuna recombinante de Salmonella viva están equipados con módulos que comprenden casetes de gen variable que regulan la expresión de antígenos heterólogos en la Salmonella y determina la presentación de los antígenos heterólogos para el sistema inmunológico del huésped. Por combinaciones de ambos sistemas, las cepas de la vacuna de Salmonella viva atenuadas diferentemente y los casetes del gen variable, una variedad de cepas portadoras de la vacuna viva recombinante puede ser generada que tiene, debido a sus características inmunogénicas variables, un espectro amplio de aplicación para ambos usos profiláctico y terapéutico. El principio básico de atenuación se origina de las mutaciones nuevas en el locus del gen (SPI2) de la Isla 2 de patogenicidad de la Salmonella. Las mutaciones adicionales, las cuales pueden ser usadas ya sea solas o en combinación con las mutaciones en genes sse o SPI-2 o en combinación con la mutación del aroA para la atenuación óptima de las cepas portadoras de la vacuna viva, se han reportado recientemente (Heithoff et al., 1999; Valentine et al., 1998). Por la combinación de las mutaciones individuales en el locus del gen SPl-2 con cada otro y con otras mutaciones atenuantes del gen conocidas, tal como aroA, etc., un repertorio amplio de atenuación e immunogenicidad puede ser logrado. Los casetes de expresión diferentes pueden ser introducidos en estas plataformas, permitiendo la modulación adicional de la respuesta inmunológica dirigida en contra de los antígenos heterólogos. Finalmente, una biblioteca de cepas portadoras de la vacuna de Salmonella viva recombinante individual es generada, cubriendo un espectro amplio de potencial inmunoestimulante, de la cual una cepa de vacuna viva genuina puede estar hecha a la medida para el tratamiento o protección óptima de humanos y/o animales en contra de la enfermedad o de los agentes patógenos específicos.

Así, la presente solicitud también describe una célula gram negativa atenuada que comprende el locus del gen SPI2, en donde al menos un gen del locus del SPI2 es desactivado, en donde dicha desactivación resulta en una atenuación/reducción de la virulencia comparada al tipo natural de dicha célula.

Los genes presentes en la isla 2 de patogenicidad de la Salmonella que codifica para una variedad de proteínas involucradas en la secreción tipo III y esas que son requeridas para la propagación y la supervivencia sistémica dentro de las células fagocitarias son candidatos ideales para la atenuación del ssp de la Salmonella patógena.

Varios agentes patógenos bacterianos gram negativos secretan ciertas proteínas de virulencia por los sistemas de secreción de tipo III especializados. Los factores de virulencia posibilitan a la bacteria patógena colonizar un nicho en el huésped a pesar de los ataques específicos del sistema inmunológico. Los sistemas de secreción del tipo III comprenden un número grande de proteínas requeridas para transferir las proteínas efectoras específicas en las células huéspedes eucarióticas en una manera de contacto dependiente, así han sido nombrados los sistemas secretorios de contacto dependiente. Aunque varios componentes del mecanismo del sistema de secreción muestran conservación evolutiva y funcional a través de las especies bacterianas, las proteínas efectoras son menos bien conservadas y tienen funciones diferentes. Los efectores Yersinia YpkA y YopH tienen actividades treonina/serina quinasa y tirosina fosfatasa, respectivamente. Las acciones de estos y otros Yops inhiben la fagocitosis bacteriana por las células huéspedes, lo cual se piensa que posibilita la proliferación bacteriana extracelular. Las proteínas Shigella Ipa, secretadas por el sistema de secreción del tipo III de mxi/spa promueven la entrada de esta bacteria en las células epiteliales. EspA, EspB y EspD, codificadas por el locus de eliminación de enterocita (LEE) de la Escherichia coli enteropatogénica (ECEP) son requeridos para la translocación de las proteínas que causan nuevas disposiciones del citoesqueleto y la formación de estructuras como pedestales en la superficie de la célula
huésped.

Para los propósitos de la solicitud presente una "célula gram negativa que comprende el locus del gen SPI2" es una célula que tiene un locus del gen que alberga los genes requeridos para la propagación y la supervivencia sistémica dentro de las células fagocitarias y, así, es un homólogo o equivalente funcional del locus del SP12 de la Salmonella. Preferente, la célula gram negativa atenuada inventiva es una célula Enterobactérica, más preferente, una célula de Salmonella, una célula Shigella o una célula Vibrio. En general, las células que tienen un rango huésped amplio son preferidas. Los huéspedes típicos son mamíferos, por ejemplo, el hombre, y las aves, por ejemplo, el pollo. Las células de la Salmonella son más preferidas, y particularmente preferidas es la Salmonella Serotipo Typhimurium Tipo Definitivo 104 (DT 104).

La Salmonella typhimurium es inusual en que contiene dos sistemas de secreción de tipo III para los factores determinantes de virulencia. El primero controla la invasión bacteriana de células epiteliales, y está codificada por genes dentro de una isla (SP11) de patogenicidad de 40 kb. El otro está codificado por genes dentro de una segunda isla (SPI2) de patogenicidad de 40 kb y es requerido para el crecimiento sistémico de este agente patógeno dentro de su huésped. Los genes localizados en la isla de patogenicidad SPI1 son principalmente responsables de los pasos primarios del proceso de infección, la invasión de células huéspedes no fagocitarias por la bacteria. Para la mayoría de los genes SPI1, las mutaciones resultan en una invasividad reducida in vitro. Sin embargo, los mutantes que son defectuosos en la invasión no son necesariamente no virulentos; los estudios en ratones demostraron que, mientras estas mutaciones en los genes SPI1 significativamente redujeron la virulencia en la entrega por la ruta oral, no tuvieron influencia en la virulencia siguiendo una ruta intraperitoneal de infección. Tomados conjuntamente, estos resultados indican que las mutaciones en genes dentro de la isla SPI1 de patogenicitdad no cancelan la infección sistémica y son por consiguiente no muy útiles para el desarrollo de una cepa portadora de Salmonella atenuada inocua. En contraste, los estudios de virulencia de mutantes del SPI2 han mostrado estar atenuados por al menos en cinco órdenes de magnitud comparados con la cepa de tipo natural después de ambas inoculaciones oral e intraperitoneal en
ratones.

Muchos de los componentes de codificación de genes del sistema de secreción del SPI2 están ubicados en un segmento de 25 kb de SPI2. El SPI2 contiene genes para un mecanismo de secreción de tipo III (ssa) y un sistema regulador de dos componentes de (ssr), así como también genes candidatos para un conjunto de efectores secretados (sse) y sus chaperones específicos (ssc). En base de las similitudes con genes presentes en otros agentes patógenos bacterianos, los primeros 13 genes dentro del ssaK/U operón y ssaJ codifican los componentes del mecanismo del sistema de secreción. Un número de genes adicionales, incluyendo ssaC (MLA 11 en Shea et al., 1996; spiA en Ochman et al., 1996) y ssrA (MLA 12 en Shea et al., 1996; spiR en Ochman et al., 1996), los cuales codifican una proteína del mecanismo del sistema de secreción y una proteína de dos componentes reguladores, respectivamente, son encontrados en una región de aproximadamente 8 kb de ssaJ.

Preferentemente, la célula gram negativa atenuada ha desactivado al menos un gen seleccionado de los genes (ssa) del mecanismo de secreción del gen efector (sse), genes chaperones (ssc) y genes de regulación (ssr). Más preferentemente, al menos un gen desactivado es un gen sse, ssc y/o ssr, aún más preferente es un gen sse y/o un ssc.

Hasta que los genes sse son afectados por la desactivación, el gen desactivado es preferentemente sseC, sseD, sseE o una combinación de los mismos. Hasta que los genes ssr son afectados por la desactivación, preferentemente al menos el ssrB está desactivado. Hasta que los genes ssc son afectados por la desactivación, preferentemente al menos el sscB está desactivado.

La desactivación de dicho gen del locus del SPI2 (o el homólogo funcional del mismo en células que no sean de la Salmonella) es efectuada por una mutación que puede comprender la deleción. Son preferidas las deleciones de al menos seis nucleótidos, y más preferida es una deleción parcial y, en particular, la secuencia de codificación completa para dicho gen. La mutación también puede comprender la inserción de una molécula de ácido nucleico heteróloga en dicho gen para ser desactivada o una combinación de deleción e inserción.

El ssp de la Salmonella patógena sirve una base para la construcción de un panel de prototipos de vacunas de Salmonella viva diferentes generados por atenuaciones graduales logradas a través de la introducción de mutaciones del locus del gen SPI2 definidas. Cada prototipo de vacuna de Salmonella viva individual resultante es adicionalmente transformado en una vacuna multivalente recombinante por la introducción de módulos portadores de ADN intercambiables (1) los genes genéticamente diseñados de agentes patógenos heterólogos y (2) los sistemas adecuados de expresión que ejecutan la presentación eficaz del antígeno al sistema inmunológico del huésped. De concierto, estas características provocan una respuesta inmune específica que o bien protege a los huéspedes vacunados en contra de la Salmonella que subsiguientemente invade a y/u otros agentes patógenos (vacunación profiláctica) o elimina los agentes patógenos persistentes, tales como el Helicobacter pylori (vacunación
terapéutica).

El ssp de Salmonella patógena está gradualmente atenuado por mutaciones en los genes individuales de virulencia que son parte del locus del gen SPI2, por ejemplo, un gen sse que codifica para una proteína efectora, tal como sseC, sseD o sseE, o un gen ssc, tal como sscB, que codifican para un chaperón, o un gen ssr, tal como ssrB, que codifican para un regulador. La mutación individual de cada uno de estos genes conduce a un único grado de atenuación individual, la cual, a su vez, efectúa una característica de respuesta inmune en los niveles mucoso, humoral y celular. El grado individual de atenuación puede ser moderadamente aumentado por combinaciones de al menos dos mutaciones del gen dentro del locus del gen SP12 o por combinación con una mutación en otro gen de Salmonella conocido para atenuar la virulencia, por ejemplo, un gen aro, tal como aroA. Un grado más fuerte de atenuación es logrado por la mutación de un gen virulento que es parte de un grupo de genes policistrónicos que codifican varios factores de virulencia, tal como la unidad transcripcional que consiste de los genes sseC, sseD, sseE y sscB, tal que la mutación ejerce un efecto polar, que desestabiliza la expresión de los siguientes genes. El grado de atenuación directamente puede depender del número de genes de virulencia que son afectados por la mutación polar así como también sus características individuales. Finalmente, la atenuación más fuerte es lograda cuando los genes reguladores, tales como el ssrB, son mutados. Otra vez, cada modo de atenuación de una ssp de Salmonella conduce a la generación de un cepa de vacuna de Salmonella viva que evoca una respuesta inmune en los niveles mucoso, humoral y celular que es característica para el tipo y/o la combinación de las mutaciones atenuantes presentes en esa cepa. El panel de cepas de vacuna de Salmonella viva atenuadas diferentemente que es generada representa un grupo de cepas portadoras potenciales del cual el portador puede ser seleccionado para que provoque la respuesta inmune más eficaz para ya sea la prevención o la erradicación de la enfermedad en conjunto con los antígenos heterólogos que son
expresados.

Las mutaciones que conducen a la atenuación de los genes de virulencia de la Salmonella indicados son preferentemente introducidas por la tecnología de ADN recombinante como deleciones definidas que ya sea suprimir completamente el gen de virulencia seleccionado o resulta en un gen truncado que codifica un factor de virulencia inactivo. En ambos casos, la mutación implica un único gen y no afecta la expresión de genes vecinos (mutación no polar). Una mutación interseccional en uno de los genes de virulencia indicados es preferida cuando el gen seleccionado es parte de un grupo de genes de virulencia policistrónica y todos los genes de virulencia siguientes son incluidos en el proceso de atenuación (mutación polar). Las mutaciones insercionales con efectos no polares están en general restringidas para los genes que son ya sea individualmente transcritos o están localizados al final de un grupo policistrónico, tal como el ssrB. Sin embargo, otras mutaciones atenuantes pueden originarse espontáneamente, por productos químicos, energía u otras formas de mutagénesis físicas o como un resultado de aparejarse u otras formas de intercambio genético.

Así, la mutación que resulta en la preparación de la célula gram negativa atenuada puede ser una mutación polar o no polar. Además, el grado de atenuación puede ser modificado desactivando un gen adicional fuera del locus del SPI2, por ejemplo, otro gen de virulencia o un gen que está involucrado en la biosíntesis de un metabolito o un precursor del mismo tales como los genes aro, en particular, aroA, o cualquier otro gen adecuado tal como el superóxido dismutasa (SOD).

La célula atenuada según la presente solicitud además puede comprender elementos que facilitan la detección de dicha célula y/o la expresión de una molécula de ácido nucleico heteróloga insertada. Un ejemplo de un elemento que facilita la detección de la célula atenuada es un casete marcador selectivo en particular, un casete marcador selectivo que es capaz de adjudicar resistencia antibiótica a la célula. En una realización, el casete marcador selectivo confiere una resistencia antibiótica a un antibiótico el cual no se usa para la terapia en un mamífero. Los ejemplos de elementos que facilitan la expresión de una molécula de ácido nucleico heteróloga son un casete de expresión del gen el cual puede comprender uno o más promotores, aumentadores, opcionalmente terminadores de transcripción o una combinación de los mismos, un casete transactivador, un casete de invertasa para la expresión de una fase o de dos fases de un ácido nucleico heterólogo. Un ejemplo de un elemento que facilita la inserción de una molécula de ácido nucleico heteróloga es un casete de inserción.

En un primer aspecto, la invención provee un portador para la presentación de un antígeno a un huésped, cuyo portador es una célula gram negativa atenuada que comprende el locus del gene SPI2, en donde al menos uno de los genes efectores sseA, sseC, sseD, sseE, sseF y sseG es desactivado y/o en donde el gen chaperón sscB es desactivado y/o en donde al menos uno de los genes ssaE, ssaG y ssaH del mecanismo de secreción es desactivado y en donde los resultados de la desactivación en una atenuación/reducción de la virulencia se compararon al tipo natural de dichas células, en donde dicha célula comprende al menos una molécula de ácido nucleico heteróloga que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para dicho antígeno, en donde dicha célula es capaz de expresar dicha molécula de ácido nucleico o es capaz de causar la expresión de dicha molécula de ácido nucleico en una célula seleccionada.

Preferentemente, dichas moléculas de ácido nucleico comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica para un antígeno bacteriano o viral o para un antígeno del tumor. Los ejemplos de antígenos bacterianos son los antígenos de Helicobacter pyori, Chlamydia pneumoniae, Borrelia burgdMLAeri y Nanobacteria. Los ejemplos de antígenos virales son los antígenos del virus de Hepatitis, por ejemplo, las hepatitis B y C, el virus del papiloma humano y el Herpes virus. La molécula de ácido nucleico heteróloga puede comprender una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos un polipéptido o un dominio de péptido seleccionado y/o el dominio immunoestimulante. Así, el producto de expresión de dicha molécula de ácido nucleico heteróloga puede ser seleccionado específicamente para compartimientos predeterminados tales como el periplasma, la membrana exterior, etc. La molécula de ácido nucleico heteróloga puede codificar para una proteína de fusión.

Según una realización la molécula de ácido nucleico heteróloga es introducida en el locus del SPI2, preferiblemente, en un gen sse y, más preferiblemente, en sseC, sseD y/o sseE, en particular, sseC.

La inserción puede ser una inserción polar o una inserción no polar. Generalmente, la introducción de una inserción no polar es preferida, ya que permite la expresión de los genes restantes de un grupo de gen policistrónico, lo cual puede ser usado para la generación de portadores que tienen grados diferentes de atenuación.

Las vacunas de Salmonella vivas atenuadas son utilizadas como portadores para antígenos específicos de agentes patógenos heterólogos, por ejemplo, Helicobacter, etc., así actuando como una vacuna multivalente. Los antígenos heterólogos son provistos por un casete de expresión del gen (CEG) que está insertado por ingeniería genética en el genoma de una cepa de Salmonella atenuada. Preferentemente, la inserción del casete de expresión del gen es seleccionada para uno de los genes de virulencia indicados, por consiguiente causando una mutación insercional como la descrita en el párrafo anterior. En otra forma de aplicación, la expresión de los genes heterólogos en el casete de expresión del gen está regulada por los factores que transactúan codificados por un casete transactivador (CT) o un casete de invertasa realizando un modo variable de expresión de dos fases. Preferentemente, la inserción del casete transactivador es seleccionada por un segundo gen de virulencia escogido, el cual es entonces desactivado. Alternativamente, el casete de expresión del gen o el casete transactivador o el casete de invertasa puede ser introducido en el genoma de Salmonella por la inserción mediada por transposón, lo cual no tiene efecto de atenuación.

Se requieren principios de ingeniería genética para generar ya sea mutaciones de deleción ya sea inserción en genes de virulencia de Salmonella. Generalmente, un plásmido suicida que transporta un casete de gen de virulencia mutado el cual contiene un casete marcador selectivo (CMS) solo o en combinación con un casete de expresión de gen, o un casete transactivador, o el casete invertasa, es introducido en la cepa receptora de Salmonella por conjugación. El gen original de virulencia es reemplazado con el casete de gen de virulencia mutado por medio de la recombinación homóloga, y el plásmido suicida, incapaz de replicarse en la cepa receptora de Salmonella, se vuelve rápidamente agotado. La Salmonella exitosamente recombinada puede ser seleccionada en base a las propiedades (tales como la resistencia antibiótica, aunque no se limitada a ella) conferidas por el producto del gen (s) dentro del casete marcador selectivo. El casete del gen de virulencia mutado comprende secuencias de ADN que son homólogas al genoma de la cepa de Salmonella receptora en donde el gen de virulencia original es localizado. En el caso en donde el gen de virulencia original debe ser completamente suprimido, sólo esas secuencias de ADN genómicas que bordean el gen de virulencia original (indicado como regiones de flanqueo) son incluidas en el casete del gen de virulencia mutado. La arquitectura general de un casete del gen de virulencia mutado incluye en cada extremo una secuencia de ADN de al menos 50 nucleótidos, idealmente de 200 a 250 nucleótidos, que es homóloga para el segmento de genoma en donde el gen de virulencia original es localizado. Estas secuencias de ADN flanquean un casete marcador selectivo y los otros casetes, tales como el casete de expresión del gen (CEG) o el casete transactivador (CT) o el casete del invertasa. Como se indicó anteriormente, estos casetes son usados para generar mutaciones insercionales que deterioran la expresión del gen original. Para las deleciones en marco, un casete marcador selectivo es preferentemente
usado.

El casete marcador selectivo (CMS) principalmente consiste en un gen que media la resistencia para un antibiótico el cual puede desactivar la cepa de Salmonella receptora pero el cual no es usado actualmente en el tratamiento de la Salmonelosis. Alternativamente, otro marcador seleccionable puede ser usado. El casete marcador selectivo está insertado en el marco en el gen de virulencia seleccionado y, consecuentemente, la expresión del gen marcador está bajo el control del promotor del gen de virulencia. Alternativamente, el casete está insertado dentro de una unidad transcriptional policistrónica, en cuyo caso el gen marcador está bajo el control del promotor para esta unidad. En otra aplicación, el gen marcador selectivo está bajo el control de su propio promotor, en este caso un terminador transcriptional es adicionado secuencia abajo del gen. El marcador selectivo es necesario para indicar la introducción exitosa del casete del gen de virulencia mutado en el genoma de la cepa de Salmonella receptora. Además, el marcador de resistencia antibiótica es necesario para facilitar la valoración immunológica preclínica de las diversas cepas de Salmonella atenuadas. En otra forma de aplicación, el marcador selectivo está flanqueado por repeticiones directas, las cuales, en ausencia de la presión selectiva, conduce a la excisión recombinatoria del casete marcador selectivo del genoma, dejando la secuencia corta de la repetición directa. Alternativamente, el casete marcador selectivo puede ser completamente removido por la tecnología de ADN recombinante. En primer lugar, el casete selectivo del marcador es removido por la endonucleasa de restricción adecuada del casete del gen de virulencia mutado original en el plásmido suicida dejando las secuencias de la región flanqueadora las cuales son homólogas para el genoma de Salmonella. El plásmido suicida es entonces transferido en la cepa de Salmonella receptora atenuada por conjugación en donde el casete del gene de virulencia mutado de CMS agotado reemplaza el CMS que lleva el casete del gen de virulencia mutado por recombinación. Después de la extracción del marcador selectivo, la cepa de Salmonella atenuada está libre para la aplicación en humanos. Las secuencias del terminador transcripcional son generalmente incluidas en los casetes cuando las mutaciones polares son establecidas.

El casete de expresión del gen (CEG) comprende elementos que permiten, facilitan o mejoran la expresión de un gen. En un modo funcional el casete de expresión del gen adicionalmente comprende una o más unidades de expresión del gen derivadas ya sea de genes completos de una fuente de heterólogos o fragmentos de los mismos, con un tamaño mínimo de un epítope. Las unidades múltiples de expresión del gen están preferentemente organizadas como una estructura concatemérica. Los genes o los fragmentos del gen son adicionalmente diseñados genéticamente, tales que las proteínas resultantes o las proteínas de fusión son expresadas en el citosol, en el periplasma, en la superficie exhibida o secretada. Además los genes o los fragmentos de gen pueden ser combinados con secuencias de ADN que codifican immunologicamente porciones de proteína reactivas, por ejemplo, citoquinas o toxinas bacterianas atenuadas. Los genes o los fragmentos de gen son o controlados en un modo de una fase de un promotor dentro del casete de expresión del gen o en un modo de dos fases o indirectamente por un casete transactivador (CT). En el modo de una fase el promotor es preferentemente un promotor de Salmonella que es activado, por ejemplo, inducido, por las señales ambientales sino también por promotores constitutivos de fortaleza diferente pueden ser usados. En el modo de dos fases, la expresión del casete del gen se controla por una invertasa que se derivó de un casete de invertasa. La invertasa cataliza la inversión de un segmento de ADN que comprende el casete del gen. El segmento de ADN está flanqueado en cada extremo por una repetición invertida la cuál es el substrato específico para la invertasa finalmente causando dos orientaciones del casete del gen con relación al promotor del casete de expresión del gen. En la orientación ON el casete del gen es colocado correctamente permitiendo la transcripción del casete del gen. En OFF, la orientación del casete del gen es incorrecta y ninguna transcripción ocurre. El casete de invertasa comprende de una invertasa que se controla por un promotor constitutivo o un promotor de Salmonella inducido o reducido por las señales ambientales.

Los antígenos heterólogos codificados dentro del casete de expresión del gen pueden ser expresados bajo el control de un promotor, por ejemplo, un promotor específico de tejido, el cual puede ser constitutivo o inducible. La expresión puede ser activada en una célula seleccionada, por medio de la cual una señal es transmitida de la célula seleccionada al interior de la célula de Salmonella, cuya señal induce la expresión. La célula seleccionada, por ejemplo, puede ser un macrófago. El producto de expresión puede comprender un dominio de selección o dominio immunoestimulante por ejemplo, en forma de una proteína de fusión La proteína heteróloga misma también puede ser una proteína de fusión. Los antígenos heterólogos pueden ser opcionalmente expresados como citosólico, periplásmico, superficie exhibida o proteínas secretorias o proteínas de fusión para lograr una respuesta inmune eficaz. Las secuencias de codificación del antígeno pueden estar combinadas para las secuencias accesorias que dirigen las proteínas al periplasma o la membrana exterior de la célula de Salmonella o en el ambiente extracelular. Si los polipéptidos heterólogos son secretados, la secreción puede ocurrir usando un sistema de secreción de tipo III. La secreción por el sistema de secreción de tipo III de SP12 está disponible. Las proteínas que están destinadas al compartimiento citosólico de la Salmonella no necesitan secuencias accesorias, en este caso, las secuencias accesorias que ocurren naturalmente deben ser removidas de los genes que codifican tales antígenos.

Las secuencias accesorias para el compartimiento periplasmático de la Salmonella comprenden una secuencia de ADN deducida del péptido de la señal amino terminalmente localizado de una proteína heteróloga naturalmente translocalizada por medio de la senda de secreción general, por ejemplo, CtxA, etc.

Las secuencias accesorias para el compartimiento exterior de la membrana de la Salmonella preferentemente comprenden las secuencias de ADN deducidas de las porciones funcionalmente relevantes de una proteína secretora tipo IV (autoportadora), por ejemplo, proteasa AIDA o IgA. La proteína apropiada de fusión contiene un péptido de la señal amino terminalmente localizada y, en los terminales carboxi, un dominio de la transmembrana en forma de \beta-barril al cual la proteína pasajera extraña está acoplada por un espaciador que ancla la proteína pasajera a la superficie bacteriana.

Las secuencias accesorias para la secreción en el ambiente extracelular comprenden las secuencias de ADN deducidas de las proteínas naturalmente secretadas por el sistema de secreción de tipo III. En una proteína de fusión generalmente funcional, el antígeno heterólogo es combinado en el centro de una proteína naturalmente secretada por la senda de tipo III o en el extremo terminal carboxi de la proteína respectiva.

Los casetes transactivadores (CT) suministran activadores que generalmente mejoran la expresión de los antígenos heterólogos codificados por los variados casetes de expresión de gen. Tales activadores actúan o directamente (polimerasa de ARN) o indirectamente (activador transcripcional) sobre el nivel de transcripción en un orden muy específico. Preferencialmente, la expresión de tales activadores son controlados por promotores de Salmonella los cuales son producidos in vivo por señales ambientales. En otra forma de aplicación la síntesis del activador dentro del casete transactivador es regulada en un modo de dos fases. La invertasa expresada por el casete de invertasa coloca el activador que codifica al fragmento de ADN en dos orientaciones con respecto al promotor transcripcional. En la orientación ON el gen activador está en el orden transcripcional correcto. En el modo OFF el activador es orientado incorrectamente y ninguna expresión ocurre.

En el sistema simple, el producto de gen del casete transactivador ejerce su efecto directamente sobre el promotor presente en el casete de expresión de gen, directamente activando o reprimiendo la expresión del gen heterólogo. En el sistema complejo, la activación del promotor en el casete de expresión de gen heterólogo es dependiente de dos o más factores interactuantes, al menos uno de los cuales (codificado en el casete transactivador) puede ser regulado por las señales externas. La complejidad adicional es encontrada en los sistemas de cascada, en los cuales la señal externa no ejerce directamente su efecto sobre el casete transactivador, sino más bien a través de un proceso de múltiples pasos, o en el cual el producto de gen del casete transactivador no ejerce directamente su efecto en el casete de expresión de gen heterólogo, sino más bien a través de un proceso multifase.

La presente solicitud describe una célula gram negativa atenuada que comprende el locus del gen SPI2, caracterizada por una falta de al menos un polipéptido SPI2, en donde dicha falta resulta en una atenuación/reducción de la virulencia comparada con el tipo natural de dicha célula. Preferentemente, dicho polipéptido SPI2 faltante es uno o más polipéptidos efectores, polipéptido de mecanismo de secreción, polipéptido chaperón o polipéptido regulador. Además, dicha célula atenuada puede ser una portadora la cual entonces es caracterizada por la presencia de al menos un péptido heterólogo o polipéptido que tiene propiedades inmunogénicas.

Un aspecto adicional de la invención presente es una composición farmacéutica la cual comprende como agente activo una vacuna viva protectora immunologicamente la cual es una portadora gram negativa atenuada de acuerdo con la invención. La composición farmacéutica comprenderá aditivos tales como diluentes, portadores y/o adyuvantes aceptables farmacéuticamente. Estos aditivos son conocidos por la persona experta en la técnica. Generalmente, la composición se administrará a un paciente por medio de una superficie mucosa o por medio de la ruta
parenteral.

Los aspectos adicionales de la invención presente incluyen un método para la preparación de una vacuna viva, la cual comprende suministrar una célula gram negativa viva que comprende el locus de SPI2 y desactivar al menos un gen del locus de SPI2 para obtener una célula gram negativa atenuada de la invención, e insertar al menos una molécula de ácido de nucleico heterólogos que codifica para un antígeno para obtener un portador de acuerdo con la invención. Un aspecto adicional está relacionado con un método para la preparación de una composición de vacuna viva que comprende la formulación de un portador de acuerdo con la invención en una cantidad efectiva farmaceuticamente junto con diluentes, portadores y/o adyuvantes aceptables farmaceuticamente. Un aspecto adicional de la invención se relaciona con un método para la detección de un portador de acuerdo con la invención, que comprende suministrar una muestra que contiene dicha célula portadora y detectar una propiedad específica no presente en una célula de tipo natural. Los métodos para detectar una propiedad específica del portador, la cual no está presente en el tipo natural, son conocidos por la persona experta en la técnica. Por ejemplo, si esta propiedad específica de la célula atenuada comprende una deleción de uno o más partes del locus de SPI2, entonces la presencia de dicha célula puede ser detectada proveyendo un par de cebadores específicos los cuales son complementarios a las secuencias que flanquean esta deleción y que amplifican un fragmento de longitud específica usando métodos de amplificación tales como PCR. Los métodos para detectar la presencia de un portador inventivo comprenden la amplificación PCR de un fragmento insertado o un fragmento que cruza el límite de inserción, los métodos de hibridización o la detección del producto de expresión de heterólogos o de un marcador selectivo.

Un aspecto adicional de la invención es un método para establecer una biblioteca de portadores atenuados de acuerdo con la invención. El método comprende la preparación de cepas de vacuna recombinante atenuadas cada una teniendo una mutación diferente en el locus de SPI2 que resulta en un grado de atenuación diferente. La patogenicidad o el potencial de virulencia de dichas cepas puede ser entonces determinada usando métodos conocidos como la determinación del LD50, y las cepas son evaluadas de acuerdo con las patogenicidades diferentes, o sea, a un grado diferente de atenuación. Preferentemente, el método comprende también la determinación de los otros parámetros de interés tales como la inmunogenicidad o la respuesta immunoestimulatoria levantada en un huésped. Los métodos para determinar el potencial immunoestimulante son conocidos por la persona experta en la técnica y algunos de ellos son descritos en el Ejemplo 6. Preferentemente, el potencial immunoestimulante de los portadores inventivos es determinado en el nivel humoral, celular y/o mucoso. De este modo es posible establecer una biblioteca de portadores los cuales tienen un grado de atenuación predeterminado y propiedades immuno estimulatoras predeterminadas. Por lo tanto, para cada aplicación, la cepa que tiene las propiedades deseadas puede ser seleccionada específicamente. Por ejemplo, será usualmente preferido seleccionar una cepa atenuada fuerte para la administración a pacientes los cuales reciben fármacos inmunosupresores.

De manera similar, la invención permite el establecimiento de bibliotecas de portadores atenuados que tienen definidas patogenicidades y opcionalmente immunogenicidades. El establecimiento de una biblioteca de portadores adicionalmente comprenderá la determinación de la presentación de antígeno de dichas cepas portadoras a un huésped, en donde un panel de cepas portadoras diferentes será obtenido habiendo definido las propiedades con respecto a la patogenicidad, el potencial immunoestimulante de los antígenos portadores y el potencial immunoestimulante del antígeno heterólogo.

Otro aspecto de la invención es el uso del portador de acuerdo con la invención para la preparación de un fármaco para el tratamiento preventivo o terapéutico de una enfermedad aguda o crónica causada esencialmente por una bacteria o virus. Un portador de acuerdo con la invención puede ser usado para la preparación de un fármaco para el tratamiento preventivo o terapéutico de un tumor.

El potencial inmunoprotector individual de cada una de las cepas de vacuna de Salmonella recombinante establecidas es determinado en un modelo de ratón que usa una Salmonella typhimurium patogénica como cepa de
provocación.

-

Determinación del potencial de virulencia de la cepa de la vacuna de Salmonella recombinante: (1) Índice competitivo o LD50; (2) Prevalencia sistémica en sangre, hígado y bazo estrictamente excluida.

-

Determinación del potencial immunoestimulante de la cepa portadora con un antígeno de prueba heterólogo citosólicamente expresado: (1) Inmunización oral única y evaluación subsiguiente de la respuesta inmunológica a corto y largo plazo: (a) análisis del perfil de respuesta inmunológica humoral, (b) análisis del perfil de respuesta inmunológica de la mucosa, (c) análisis del perfil de respuesta inmunológica celular; (2) Inmunizaciones orales múltiples y evaluación subsiguiente de la respuesta inmunológica a corto y largo plazo: (a) análisis del perfil de respuesta inmunológica humoral, (b) análisis del perfil de respuesta inmunológica de la mucosa, c) análisis del perfil de respuesta inmunológica celular;

-

Determinación del potencial immunoestimulante de la cepa portadora para la entrega de ADN heterólogo (vacunación de ADN).

Preferencialmente, la cepa aceptora de Salmonella tiene un rango de huésped amplio, que exhibe patogenicidad importante tanto en animales como en humanos. Idealmente, esta es una cepa de Salmonella que es fuertemente patogénica para los ratones, tal como la S. typhimurium Después del desarrollo exitoso de la cepa de vacuna de salmonella recombinante, la cepa es directamente aplicable para el uso tanto en animales como en humanos. Si tal cepa aceptora de Salmonella ideal no es satisfactoria para el huésped respectivo, otro huésped de Salmonella específica debe ser seleccionado, tal como S. typhi para humanos.

Otros aspectos de la invención se relacionan con el uso de una molécula de ácido nucleico como se muestra en las Figs. 21 A o B o en una de las Figs. 22 A - Q, modificadas opcionalmente como se describe más arriba o de un vector como se describe más arriba para la preparación de un portador para la presentación de un antígeno a un huésped y para el uso del locus de SPI2 de Salmonella para la preparación de un portador para la presentación de un antígeno a un huésped. En este contexto el término "Locus de SPI2 de Salmonella" se refiere a cualquier secuencia de ácido nucleico, que codifica o no codifica, y al producto de expresión de las secuencias de codificación.

La presente solicitud también describe una molécula de ácido nucleico aislada que comprende un ácido nucleico de al menos 100 nucleótidos a) de la secuencia de ácido nucleico de una de las Figs. 24 A, B, b) de una secuencia de ácido nucleico la cual bajo las condiciones estrictas hibridiza con la secuencia de ácido nucleico de una de las Figs. 24 A, B. Dicha molécula de ácido nucleico la cual es capaz de inducir la expresión de una secuencia de ácido nucleico que codifica para un péptido o polipéptido operativamente conectado a dicha molécula de ácido
nucleico.

El Pivi promotor inducible in vivo comprende un fragmento de ADN que porta las secuencias para un operador y un promotor transcripcional. Tal promotor inducible in vivo puede ser identificado aplicando un método de gen reportero adecuado. Dos de tales promotores inducibles in vivo han sido identificados dentro del locus de SPI2 los cuales inician la expresión del operón ssaBCDE (promotor A2) y el operón de sseABsscAsseCDEsscBsseFG (promotor B), respectivamente. Estos promotores son inducidos por un sistema regulativo que comprende los productos de gen ssrA y ssrB. Este sistema regulativo es parte del locus de SPI2 responsable de la activación de genes de locus de SPI2 adicionales. El sistema regulativo es activado en macrófagos por señal (s) ambiental por medio de la proteína sensora SsrA. La proteína SsrB se une definitivamente en una secuencia de ADN definida la cual inicia la transcripción a través de la polimerasa de ARN.

En una forma de aplicación el fragmento de ADN que comprende las secuencias operadora/promotora es insertado delante de un gen invertasa o un gen activador o un casete de expresión de gen, para por ello ejecutar una expresión inducible in vivo en bacterias que llevan por lo menos el y los genes ssrA y ssrB o el locus de SPI2 completo.

Por lo tanto, la presente solicitud describe un sistema de expresión para la expresión inducible in vivo de un ácido nucleico heterólogo en una célula seleccionada, que comprende una célula portadora para dicho ácido nucleico heterólogo, en donde dicha célula portadora comprende (a) un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido mostrada en la Fig. 23 P (ssrA) o un homólogo funcional del mismo, (b) un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido mostrada en la Fig. 23 Q (ssrB) o un homólogo funcional del mismo, y, (c) la molécula de ácido nucleico de una de las Figs. 24 A, B o un homólogo funcional del mismo, como se describió arriba.

La célula seleccionada podría ser cualquier célula apropiada pero preferentemente es un macrófago. La célula portadora preferentemente es una célula de Salmonella. La célula seleccionada también podría comprender uno o más de los elementos descritos más arriba tales como los casetes marcadores selectivos, casetes de expresión de gen, casetes transactivadores, casetes de invertasa y/o casetes de inserción. Además, podría comprender un ácido nucleico heterólogo, en particular, los ácidos nucleicos heterólogos pueden ser insertados en un casete de expresión de gen, dando por lo tanto el GEC funcional.

La presente solicitud también describe el uso de una molécula de ácido nucleico que comprende al menos 100 nucleótidos de la secuencia de ácido nucleico mostrada en una de las Figs. 24 A, B o hibridizar con éstos y que tiene actividad promotora, para la expresión inducible in vivo de una molécula de ácido nucleico heteróloga.

La presente solicitud también describe el uso de dicha molécula de ácido nucleico para la detección de promotores inducibles in vivo.

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Procedimientos experimentales

Las cepas, el material, y los métodos usados en el sistema de secreción de tipo III de la Isla 2 del trabajo de Patogenicidad de la Salmonella (SPI2) como se describió arriba son como sigue:

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Ratones

Las hembras BALB/c (H-2^{d}) de 6 a 12 semanas de edad fueron mantenidas bajo las condiciones estándar de acuerdo con las pautas institucionales. Este estudio fue aprobado por un comité de ética para el uso de animales en la investigación experimental.

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Cepas bacterianas, fagos y plásmidos

Las cepas bacterianas, fagos y plásmidos usados en este estudio son listados en la Tabla 1. A menos que se indique otra cosa, las bacterias fueron cultivadas a 37ºC en caldo de Luria Bertani (LB) o agar, complementado con ampicillín (50 \mug/ml), kanamicina (50 \mug/ml), o cloramfenicol (50 \mug/ml) donde fue apropiado. Las células eucarióticas fueron cultivadas en RPMI 1640 complementada con 10% de suero de feto de ternero (SFT), 100 U/ml de penicilina, 50 \mug/ml estreptomicina, 5x10^{- 5} M de 2-mercaptoetanol y 1 mM de L-glutamina (GIBCO BRL Prisley, Escocia). Para lograr la expresión constitutiva de \beta-gal, el plásmido pAH97 (Holtel et al., 1992) fue electroporado en las cepas portadoras como se describió en otra parte (O'Callaghan y Charbit, 1990).

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1 Fagos, plásmidos y cepas bacterianas usados en este trabajo

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Ejemplo 1

Distribución de la patogenicidad de la isla SPI-2 dentro de cepas diferentes de Salmonella

La presencia de marcos de lectura abiertos de la región SPI-2 en varias Salmonellas aisladas y E. coli k -12 fueron analizadas por hibridización Southern como se muestra en la Tabla 2.

TABLA 2 Prevalencia de los genes SPI-2 en ssp de Salmonella diversas deducidas de las sondas del gen representativo

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La presencia o falta de bandas de hibridización son indicadas por + o -, respectivamente.

Hibridización

El ADN genómico de distintas cepas de Salmonella y E. coli k-12 fue preparado como previamente se describió (Hensel et al., 1997a). Para el análisis de hibridización Southern, el ADN genómico fue digerido con EcoRI o EcoRV, fraccionado sobre 0,6% de geles de agarosa y se transfirieron a membranas N^{+} de Hybond (Amersham, Braunschweig). Diversas sondas que corresponden a la región de SPI - 2 fueron obtenidas como fragmentos de restricción de la inserción subclonados de \lambda1. Las sondas que corresponden a MLA 242 y a MLA 319 fueron generadas por PCR usando juegos de cebadores D89 (5'-TTTTTACGTGAAGCGGGGTG-3') y D90 (5'-GGCATTAGCGGATGTCTGACTG-3'), y D91 (5'-CACCAGGAACCATTTTCTCTGG-3') y D92 (5'-CAGCGATGACGA- TATTCGACAAG- 3'), respectivamente. El PCR fue efectuado de acuerdo con las especificaciones del fabricante (Perkin - Elmer, Weiterstadt). Los productos de PCR fueron sometidos a electroforesis de gel de agarosa y los fragmentos del tamaño esperado fueron recuperados y purificados. Las sondas de hibridización fueron etiquetadas usando el sistema de etiquetamiento DIG como se describe por el fabricante (Boehringer, Mannheim).

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Ejemplo 2

Caracterización de los genes sse y construcción de sseC::aphT, sseD::a phT y sseE\Delta de las cepas mutantes de S. Typhimurium MvP103, MvP101 y MvP102 Organización de los genes sse y ssc

Para caracterizar el SPI2 genéticamente y funcionalmente, una región central de la isla de patogenicidad (Fig. 1 A) ha sido clonada y secuenciada. Los fragmentos de ADN que cubren la región entre ssaC y ssaJ fueron subclonados en plásmidos p5 - 2 y p5 - 4 como se indica en la Fig. 1C. El arreglo y la designación de los genes en la región de 8 kb entre ssaC y ssaK son mostrados en la Fig. 1 B. Esta secuencia estará disponible en la base de datos de EMBL bajo el número de acceso AJ224892 en un futuro próximo. La región secuenciada extiende el marco de lectura abierto (MLA) de un gen que codifica una subunidad putativa de los mecanismos de secreción de tipo III referido como spiB (Ochman et al., 1996). Para la coherencia con la nomenclatura universal para subunidades del sistema de secreción de tipo III (Bogdanove et al.., 1996) y la nomenclatura de otros genes SPI2 (Hensel et al., 1997b), este gen ha sido designado ssaD. La secuencia de aminoácido deducida de ssaD es 24% idéntico a YscD de la Y. Enterocolítica. Esto es seguido por un MLA con la capacidad de codificación para 9,3 kDa de una proteína, 34% idéntica a YscE de Y. enterocolitica. Por lo tanto, este gen es designado ssaE. Una secuencia de 263 bp separa el ssaE y un juego de nueve genes, varios de los cuales codifican proteínas con secuencia semejante a las proteínas efectoras segregadas o sus chaperones de otros agentes patógenos. Estos genes están separados por las regiones intergénicas cortas o tienen marcos de lectura de superposición y es probable que algunos sean cotranscritos y acoplados translacionalmente. Por lo tanto, los genes con semejanza a esos chaperones de codificación fueron designados sscA y sscB, y los otros sseA - E. La secuencia de aminoácido deducida de sscA muestra el 26% de identidad y el 49% de semejanza sobre residuos de aminoácidos 158 a SycD, el producto de lcrH de Y. Pseudotuberculosis que actúan como chaperones específicos de secreción para YopB y YopD (Wattiau et al., 1994). La secuencia de aminoácido deducida de sscB muestra el 23% de identidad y el 36% de semejanza sobre los residuos de aminoácido 98 a Ippl de Shigella flexneri. Ippl es un chaperón para las proteínas de invasión S. flexneri (Ipas) (Baundry et al., 1988). Como es el caso para los chaperones de secreción SycD, Ippl y SicA (Kaniga et al.., 1995), SscB tiene un pl ácido (Tabla 3), mientras que SscA tiene un pl inusitadamente alto de 8,8. SseB es el 25% idéntica y el 47% similar al EspA de EPEC sobre la longitud completa de la proteína de residuo de aminoácido 192 (Fig. 2b). SseD es el 27% idéntico y el 51% similar al EspB de EPEC sobre residuos de aminoácido 166. SseC tiene semejanza de secuencia a una clase de proteínas efectoras involucradas en el translocación de otros efectores en la célula huésped seleccionada. Éstas incluyen YopB de Y. Enterocolítica, EspD de EPEC y PepB de Pseudomonas aerugunosa. SseC es aproximadamente el 24% idéntico y el 48% similar a tanto el EspD de EPEC como a la YopB de Y. Enterocolitica (Fig. 2 a). EspD y YopB tienen dos dominios hidrofóbicos que son previstos para insertarse en las membranas celulares seleccionadas (Pallen et al., 1997). SseC contiene tres regiones hidrofóbicas que podían representar dominios extensores de membrana. Las otras características de estas proteínas efectoras previstas se muestran en la Tabla 1. Usando el programa de pronóstico TM (Hofmann y Stoffel, 1993), las hélices transmembrana son previstas para todas las proteínas efectoras separadas de SseA las cuales son muy hidrofílicas. Las alineaciones de SseC a los homólogos en otros agentes patógenos son mostradas en la Fig. 2 b. Los aminoácidos conservados están principalmente agrupados en la parte central más hidrofóbica de la proteína, pero a diferencia de YopB, no hay ninguna semejanza importante a la familia RTX de toxinas. Los residuos conservados en SseD están presentes principalmente en la mitad terminal N de la proteína. La comparación de las secuencias de aminoácido deducidas de sseABCDEF con las anotaciones en la base de datos de PROSITE no revela la presencia de ningún motivo de proteína característica. Nosotros sometimos las secuencias de aminoácido pronosticadas de los genes sse a las búsquedas usando los programas COIL y MULTICOIL como se describe por (Pallen et al.. (1997). SseA y SseD son previstos para que tengan una espiral trimérica cada uno, y SseC es previsto para que tenga dos espirales triméricas (Tabla 3). Ya que EspB y EspD son previstos para tengan una y dos espirales triméricas, respectivamente (Pallen et al.., 1997), esto provee pruebas adicionales de que estas proteínas están relacionadas funcionalmente.

TABLA 3 Características de las proteínas previstas

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Expresión de genes SPI2 Generación de anticuerpos contra proteínas SPI2 recombinantes

Para monitorear la expresión de genes SPI2 sseB, sseA y ssaP, fue realizado un análisis de transferencia Western de células bacterianas totales con anticuerpos policlonales levantados contra las proteínas SPI2 recombinantes SseB, SscA, y SsaP.

La electroforesis de gel de proteína y la prueba de manchado Western fueron realizadas como se describió en otra parte (Laemmli, 1970 y Sambrook et al., 1989). Los plásmidos para la expresión de la proteína SPI2 recombinante fueron construidos clonando los genes SPI2 individuales en plásmidos pQE30, pQE31 o pQE32 (Qiagen, Hilden) para generar la fusión en marco a la etiqueta 6His de terminal N. Los genes SP12 recombinantes fueron expresados en E. coli M 15 [pREP] (Qiagen) y purificados por cromatografía quelante de metal de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Qiagen). Para la inmunización, aproximadamente 1 mg de proteínas SPI2 recombinantes fueron emulsionadas con el adyuvante completo e incompleto de Freund para las inmunizaciones primaria y de refuerzo, respectivamente. Los conejos fueron inmunizados subcutáneamente de acuerdo con los protocolos estándar (Harlow y Lane, 1988). Las proteínas SPI2 fueron detectadas con antisuero levantados contra las proteínas SPI2 recombinantes después de la separación electroforética de las proteínas de las células totales y transferidas en una membrana nitrocelulosa (Schleicher y Schuell) usando un dispositivo de manchado "Semi Seco" (Bio - Rad) de acuerdo con el manual del fabricante. El anticuerpo unido fue visualizado usando una combinación de fosfatasa alcalina anticuerpo secundaria de acuerdo con los protocolos estándar (Harlow y Lane).

Generación de fusiones de gen reportero

Las fusiones de la luciferasa de luciérnaga (luc) del gen reportero a varios genes SPI2 fueron obtenidas usando los vectores suicidas pLB02 y pGPL01 (Gunn y Miller, 1996), los cuales fueron amablemente suministrados por los Drs. Gunn y Miller (Seattle).

Para la generación de una fusión a ssaB, un fragmento de EcoRV de 831 bp de p2 - 2 fue subclonado en EcoRV pSK^{+} digerido. Para la generación de una fusión transcripcional a sseA, un fragmento de SmaI/HincII de 1060 bp de p5 - 4 fue subclonado en pSK^{+}. Las insersiones de las contrucciones resultantes pGPL01 y pLB02 fueron recuperadas como un fragmento de EcoRI/KpnI y ligados con los vectores reporteros digeridos de EcoR/KpnI. Para la generación de una fusión transcripcional a ssaJ, un fragmento de SmaI/KpnI de 3 kb de p5 - 2 fue directamente subclonado en pGPL01 y pLB02.

Las construcciones con fusiones transcripcionales de los genes SPI2 a luc fueron entonces integradas en el cromosoma de la S. typhimurium por el apareamiento entre E. coli S17-1 \lambdapir que alberga la construcción respectiva y un mutante espontáneo de S typhimurium resistente a 100 \mug x de ml^{-1} de ácido nalidíxico y la selección para exconjugantes resistentes a la carbenicilina y al ácido nalidíxico. La integración seleccionada en SPI2 (para las construcciones que usan pGLP01) o la región zch (para las construcciones que usan pLB02) fue confirmada por el análisis de manchado Southern. Las fusiones fueron entonces instaladas en una cepa NCTC12023 de S. Typhimurium pasada a un ratón por una transducción P22 de acuerdo con los procedimientos estándar (Maloy et al., 1996).

Ensayo de genes reporteros

Las actividades de \beta-galactosidasa de las fusiones de gen reportero fueron determinadas de acuerdo con los procedimientos estándar (Miller, 1992).

Las cepas bacterianas que albergan las fusiones de la luciferasa de luciérnaga a los genes SPI2 (cepa MvP127, sseA:: luc, cepa MvP131, ssaB:: luc, cepa MvP266, ssaH:: luc) fueron cultivadas en un medio con varias concentraciones de Mg^{2+}. La actividad luciferasa de los alícuotas de los cultivos fueron determinadas usando el equipo de ensayo de luciferasa Promega (Heidelberg) o reactivos hechos al efecto consecuentemente.

En resumen, las bacterias fueron granuladas por centrifugación durante 5 minutos en 20.000 x g a 4ºC y resuspendidas en tampón de disolución (100 mM de KHPO_{4} de pH 7,8, 2 mM de EDTA, 1% de Triton X - 100, 5 mg x ml^{-1} de albúmina de suero bovino, 1 mM de DTT, 5 mg x ml^{-1} de lisozima). Los lisatos fueron incubados durante 15 minutos en temperatura ambiente con agitación repetida y sometida a un ciclo de congelación/descongelación. Los alicuotas de los lisatos (25 \mul) fueron transferidos a placas de microtítulo (MicroFLUOR, Dynatech) e inmediatamente probados después de la adición de 50 \mu de reactivo de luciferasa (20 mM deTricina-HCl, de pH 7,8, 1,07 mM de (MgCO_{3})_{4}Mg(OH)_{2}, 100 \muM de EDTA, 33,3 mM de DTT, 270 \muM de MLi3-coenzima A, 470 \muM de D (-)-luciferina, 530 \muM de Mg-ATP) para la emisión de fotón usando el luminómetro TriLux MicroBeta (Wallac, Turku). Todos los ensayos fueron hechos en triplicado y repetidos en ocasiones independientes.

La expresión de genes SPI2 como ssaB y ssaH es inducida por concentraciones bajas de Mg^{2+} del medio de cultivo

La cepa de S. typhimurium y las cepas de tipo natural que albergan las fusiones de gen reportero luc a ssaB (cepa MvP131) y a ssaH (cepa MvP266 ) fue cultivada a la fase media del registro (OD en 600 nm de aproximadamente 0,5) en medios mínimos que contienen las cantidades altas de Mg^{2+} (10 mM de MgCl_{2}). Este medio es referido como el medio G. Las bacterias fueron recuperadas por centrifugación, lavadas tres veces en un medio mínimo que contiene 8 \muM de Mg2+, Este medio es referido como el medio F. Las bacterias fueron resuspendidas en el medio F o en el medio G y el cultivo a 37ºC fue continuado. Los alícuotas de los cultivos de las cepas MvP131 y MvP266 fueron retirados en varios puntos de tiempo diferentes y sometidas al análisis de la actividad de luciferasa. Los alícuotas de la cepa de tipo natural fueron retirados en los mismos puntos de tiempo. La proteína de las células bacterianas totales fueron separada por SDS - PAGE y transferidas a membranas de nitrocelulosa. Estas manchas fueron incubadas con anticuerpos levantados contra la proteína recombinante SsaP y SscA para detectar proteínas sintetizadas después del cambio de concentración de magnesio en la concentración de magnesio.

Después de cambiar las bacterias de un medio de cultivo con cantidades altas de Mg^{2+} a un medio con cantidades limitadas de Mg^{2+}, la expresión de genes SPI2 fue altamente inducida. Esta inducción puede ser monitoreada usando el gen reportero luc combinado en posiciones diferentes de SPI2. Además, las proteínas sintetizadas después de la inducción de SPI2 fueron detectadas por manchas Western. Sin embargo, aún en presencia de cantidades altas de Mg^{2+}, un bajo nivel de expresión de genes SPI2 fue observado.

La expresión de genes SPI2 como sseA y ssaB es modulada por la regulación de PhoP/PhoQ

Ninguna expresión de sseB o sscA fue observada durante el cultivo en varios medios ricos, o medios de cultivo de células con o sin suero. Sin embargo una cantidad baja de SsaP fue detectada después del cultivo en LB u otros medios ricos como la infusión de cerebro corazón (BHI). El cultivo en un medio mínimo que contiene menos de 30 \muM de Mg^{2+} induce la expresión de genes SPI2. Tal efecto de la concentración de Mg^{2+} hasta ahora ha sido observado solamente para los genes regulados por PhoP/PhoQ. Esta observación está en contraposición con un informe anterior de Valdivia y Falkow (1997) que postularon que la expresión del gen SPI2 era independiente de PhoP/PhoQ. Sin embargo, en un ambiente de cepa (constitutiva) de PhoP^{c} (CS022, Miller et al., 1989) la expresión de genes SPI2 no era constitutiva sino aún así era dependiente de la concentración de Mg^{2+} del medio. Esto indica que la expresión del gen de SPI2 es modulada por PhoP/PhoQ, pero que los elementos reguladores adicionales tales como SsrA/B son necesarios.

Clonación y secuenciación de ADN

Las preparaciones y manipulaciones genéticas de ADN fueron realizadas de acuerdo con los protocolos estándar (Sambrook et al, 1989). La transformación de ADN plásmido de células bacterianas fue realizada por electroporación (O'Callaghan y Charbit, 1990).

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Los clones que albergan fragmentos de SP12 fueron identificados de una biblioteca de ADN genómicos de S. typhimurium de \lambda1059 la cual ha sido descrita previamente (Shea et al., 1996). Los genes sse y ssc fueron subclonados del clon \lambda5 en un fragmento de 5,7 kb de EcoRI (p5 - 2) y un fragmento de HindIII (p5 - 4) de 5,8 kb en de pBluescriptKS+ como se induce en la Fig. 1 y en la Tabla 1. La secuenciación del ADN fue realizada usando una estrategia de cebador errante. El método didesoxi (Sanger et al., 1977) fue aplicado usando el sistema de secuenciación de Pharmacia T7 para la secuenciación manual y la química de terminador de tinte por el análisis automático en un instrumento de secuenciación ABI377. El ensamblaje de cóntigos de las secuencias de ADN fue realizada por medio del programa AssemblyLign and MacVector (Oxford Molecular, Oxford). Para los análisis de las secuencia adicionales, los programas de la versión 8 del paquete GCG (Devereux et al., 1984) fueron usados en la red de HGMP.

Construcción de mutaciones no polares

La construcción de las mutaciones no polares en sseC (MvP103), sseD (MvP101) y sseE (MvP102) son descritas abajo. Todas las modificaciones cromosómicas fueron confirmadas por PCR y el análisis de hibridización Southern (Southern, 1975, J. Mol. Biol. 98: 503-517).

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El MvP103 mutante, sseC. Un fragmento de 2,6 kb fue recuperado después de la digestión de BamHI y ClaI de p5 - 2 y subclonado en pBluescript II KS+ digerido por BamHI/ClaI. La construcción roma resultante llamada p5 - 50 fue digerida por HindIII, terminada roma usando el fragmento Klenow de ADN polimerasa y ligada al casete aphT. Un fragmento HincII de 900 bp de pSB315 que contiene un gen de aminoglicósido 3'-fosfotransferasa (aphT) del cual el terminador transcripcional había sido retirado (Galán et al., 1992) fue ligado en la misma orientación en el sitio HindIII romo del plásmido p5 - 50. Después de la transformación de E. coli XL - 1 Blue y la selección para la resistencia en contra de la kanamicina y la carbenicilina (50 \mug/ml de cada una) un clon ha sido escogido y el plásmido de alojamiento se aisló. Este plásmido fue nombrado p5 - 51 y su identidad confirmada por el análisis de restricción. Fue además digerido con SalI y XbaI y el inserto de 3,5 kb fue ligado a pGP704 digerido por SalI/XbaI. Este plásmido fue electroporado en E. coli CC 118 \lambdapir y los transformantes seleccionados para la resistencia a la kanamicina y la carbenicilina (50 \mug/ml cada una). Como se hizo antes, un clon fue escogido, su plásmido con el correspondiente fragmento de ADN en pGP704, nombrado p5 - 53, aislado y confirmado por el análisis de restricción. El plásmido P5 - 53 fue electroporado en E. coli S17-1 \lambdapir y transferido en NCTC12023 de S typhimurium (resistente al ácido nalídixico, 100 \mug/ml) por conjugación como ha sido descrito previamente (de Lorenzo y Timmis, 1994). Los exconjugantes en los cuales el gen sseC había sido reemplazado por el gen clonado alterado por la inserción del casete aphT fueron seleccionados para la resistencia a la kanamicina y al ácido nalídixico (100 \mug/ml). Los exconjugantes resultantes fueron finalmente probados para un fenotipo de lactosa negativa y sus sensibilidades a la carbenicilina. Los clones seleccionados fueron además examinados por el análisis de manchado Southern. Para excluir las posibles mutaciones que han sido adquiridas durante el procedimiento de clonación el alelo sseC mutado fue transferido en un ambiente de Salmonella fresca por transducción de P22 (descrito por Maloy et al., 1996). La cepa MvP103 de Salmonella resultante fue examinada para la presencia del casete de resistencia dentro del gen sseC por el uso de PCR. La amplificación fue realizada usando los cebadores E25 (5'-GAAATCCCGCAGAAATG-3') y E28 (5'-AAGGCGATAATATAAAC-3'). El fragmento resultante tuvo un tamaño de 1.6 kb para el tipo natural de S. typhimurium y 2,5 kb para la cepa MvP103. Para la complementación de las mutaciones no polares en sseC, los genes correspondientes fueron amplificados por PCR de ADN genómico usando una serie de cebadores que corresponden a la región 5' de los codones de inicio putativos y a los extremos 3' de los genes. Estos cebadores introdujeron sitios de restricción de BamHI en los terminales de los genes amplificados. Después de la digestión con BamHI, los genes fueron ligados a pACYC184 digerido por BamHI (Chang y Cohen, 1978) y transferidos en E. coli DH5\alpha. La orientación del inserto fue determinada por PCR, y además, la secuenciación de ADN fue realizada para confirmar la orientación y la secuencia de ADN correcta de los insertos. Los plásmidos con insertos en la misma orientación transcripcional como el gen Tetr de pACYC184 fueron seleccionados para estudios de complementación y electroporados en las cepas de S typhimurium que albergan las mutaciones no polares correspondientes.

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MvP101 mutante, sseD. Un fragmento de 3,0 kb fue recuperado después de la digestión de PstI y EcoRI de p5-2 y subclonado en pUC18 digerido por PstI/EcoRI. La construcción resultante llamada p5 - 30 fue digerida por EcoRV y tratada con fosfatasa alcalina. El casete aphT fue aislado como se describió arriba y ligado al plásmido linearizado p5-30 en la misma orientación en el sitio de EcoRV única. Después de la transformación de E. coli XL - 1 Blue y la selección en contra de la kanamicina y la carbenicilina (50 \mug/ml cada una) un clon ha sido escogido y el plásmido de alojamiento aislado. Este plásmido fue nombrado p5 -31 y su identidad confirmada por el análisis de restricción. El p5 - 31 fue además digerido con SphI y EcoRI, un fragmento de 4,0 kb aislado y ligado a pGP704 digerido por SphI/EcoRI. Este plásmido fue electroporado en E. coli CC118 \lambdapir y los transformantes seleccionados a la kanamicina y a la carbenicilina (50 \mug/ml cada una). Como se hizo antes, un clon fue escogido, su plásmido con el correspondiente fragmento de ADN en pGP704, nombrado p5 - 33, aislado y confirmado por el análisis de restricción. El plásmido P5 -33 fue electroporado en E. coli S17-1 \lambdapir y trasferido en S Typhimurium NCTC12023 (resistente al ácido nalidíxico) por conjugación como ha sido descrito previamente (de Lorenzo y Timmis, 1994). Los exconjugantes en los cuales el gen sseD había sido reemplazado por el gen clonado alterado por la inserción del casete aphT fueron seleccionados para la resistencia a la kanamicina y al ácido nalidíxico (100 \mug/ml). Los exconjugantes resultantes fueron finalmente probados para un fenotipo de lactosa negativa y su sensibilidad a la carbenicilina. Los clones seleccionados fueron además examinados por el análisis de manchado Southern. Para excluir las posibles mutaciones las cuales podrían haber sido acumuladas durante el procedimiento de clonación el alelo sseD mutado fue transferido en un ambiente de Salmonella fresca por transducción de P22 (descrita por Maloy et al., 1996). La cepa de MvP101de Salmonella resultante fue examinada para la presencia del casete de resistencia en el gen sseD por el uso de PCR. La amplificación fue realizada usando los cebadores E6 (5'-AGAGATGTATTAGATAC-3') y E28 (5'-AAGGCGATAATATAAAC-3'). El fragmento resultante tuvo un tamaño de 0,8 kb para la S. typhimurium de tipo natural fue usado y 1,7 kb en el caso de la cepa MvP101.

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MvP102 mutante, la deleción de partes de sseE y sscB. Un fragmento de 4,5 kb fue recuperado después de la digestión de SstI y HindIII de p5-2 y subclonado en pKS+ digerido por SstI/HindIII. La construcción resultante llamada p5-40 fue digerida por SmaI, digerida con fosfatasa alcalina y ligada al casete aphT en la misma orientación en el sitio SmaI único creado en el plásmido de deleción p5-40 sseE/sseB como se describió arriba. Después de la transformación de E. coli XL-1 Blue y la selección en contra de la kanamicina y la carbenicilina (50 \mug/ml cada una) un clon fue escogido y el plásmido de alojamiento aislado. Este plásmido fue nombrado p5-41 y su identidad confirmada por medio del análisis de restricción. Fue además digerido con KpnI y SstI y el inserto fue ligado a pNQ705 digerido por KpnI/SstI. Este plásmido fue electroporado en E. coli CC118 \lambdapir y las bacterias transformadas seleccionadas a la kanamicina y al cloramfenicol (50 \mug/ml cada una) Como se hizo antes, un clon fue escogido, su plásmido con el correspondiente fragmento de ADN en pNQ705, nombrado p5-43, aislado y confirmado por el análisis de restricción. El plásmido resultante fue usado para transferir el gen mutado en el cromosoma de la Salmonella como se describió arriba. Los clones resultantes han sido examinados por el análisis de manchas Southern. Para excluir las mutaciones posibles las cuales pueden haber sido adquiridas durante el procedimiento de clonación el alelo sseE/SscB mutado fue transferido en un ambiente de Salmonella fresca por transducción de P22 (descrita por Maloy et al., 1996). La cepa MvP102 de Salmonella resultante fue examinada para la presencia del casete de resistencia dentro del gen sseE/sseB por el uso de PCR. La amplificación fue realizada usando los cebadores E6 (5'-AGAGATGTATTAGATAC-3') y E4 (5'-GCAATAAGAGTATCAAC-3'). El fragmento resultante tuvo un tamaño de 1,6 kb para la S. typhimurium del tipo natural y un tamaño de 1,9 kb para la cepa MvP102.

Construcción de cepas mutantes que portan las deleciones en marco en sseC, sseD y sscB

En base a la observación de que un no polar en sseE no resultó en una atenuación importante de la virulencia en el modelo de ratón (Hensel et al., 1998), la generación de un mutante de deleción para el gen sseE no es de interés para la generación de cepas portadoras.

Construcción de una deleción en marco en sseC, MvP337 mutante

Una deleción de 158 bp entre el codón 264 y 422 de sseC se generó. El plásmido p5-2 fue digerido por ClaI y el fragmento más grande que contiene la porción del vector se recuperó y se autoligó para generar p5-60. El plásmido p5-60 fue linearizado por digestión con HindIII el cual corta una vez dentro del gen sseC. Los cebadores sseC-del-1 (5'-GCT AAG CTT CGG CTC AAA TTG TTT GGA AAA C-3') y sseE-del-2 (5'-GCT AAG CTT AGA GAT GTA TTA GAT ACC-3') fueron diseñados para introducir sitios de HindIII. PCR se realizó usando un p5-60 linearizado como plantilla de ADN. La polimerasa TaqPlus (Stratagene) se usó según las instrucciones del fabricante. Las reacciones de volumen de 100 \mul fueron fijadas a usando un 10 \mul de tampón de 10 x TaqPlus Precisión que contiene cloruro de magnesio, 0,8 \mul de 100 mM de dNTPs, 250 ng de plantilla de ADN (p5-8 linearizado), 250 ng de cada cebador y 5 U de polimerasa de ADN TaqPlus. PCR fue realizado durante 35 ciclos de: 95ºC durante 1 minuto, 60ºC durante 1 minuto, 72ºC durante 6 minutos. Entonces un paso final de 72ºC durante 10 minutos fue agregado. 10 \mul de la reacción de PCR se analizaron. Un producto del tamaño esperado fue recuperado, digerido por HindIII, autoligado, y la mezcla de la ligación fue usada para transformar E. coli DH5\alpha a la resistencia a la carbenicilina. Los plásmidos se aislaron de los transformantes y la integridad del inserto y la deleción fueron analizadas por digestión de la restricción y secuenciación de ADN. El inserto de una estructura confirmada se aisló después de la digestión con XbaI y KpnI y ligado al vector pKAS32 digerido por XbaI/KpnI. La construcción resultante fue usada para transformar la E. coli S17-1 \lambdapir a la resistencia a la carbenicilina, y la transferencia conjugacional del plásmido a la S. typhimurium (NalR, StrepR) se realizó según los procedimientos estándar (de Lorenzo y Timmis, 1994). Los exconjugantes que habían integrado el plásmido suicida por recombinación homóloga fueron seleccionados a través de resistencia al ácido nalidíxico y a la carbenicilina, y protegidos para la sensibilidad a la estreptomicina. Tales clones fueron crecidos en LB a OD600 de aproximadamente 0,5 y los alícuotas fueron colocados en placas en LB que contienen 250 \mug/ml de estreptomicina para seleccionar por colonias que habían perdido el plásmido integrado y habían sufrido intercambio alélico. Los clones resistentes a la estreptomicina pero sensibles a la carbenicilina se usaron para el análisis ulterior. El filtrado de los mutantes con una deleción dentro del locus sseC fue realizado por PCR usando los cebadores sseC-For (5'-ATT GGA TCC GCA AGC GTC CAG AA-3') y sseC-Rev (5-TAT GGA TCC TCA GAT TAA GCG CG-3'). La amplificación de ADN de clones que contienen el alelo de sseC de tipo natural resultó en un producto de PCR de 1520 bp, el uso de ADN de los clones que albergan un alelo de sseC con una deleción interna resultó en un producto de PCR de 1050 bp. La integridad de los clones que albergan la deleción de sseC fue además confirmada por el análisis Southern del locus de sseC. Finalmente, el locus del sseC que contiene la deleción interna en marco se pasó a un ambiente de cepa fresca de S. typhimurium a través de la transducción P22 (Maloy et al., 1996) y la cepa resultante se nombró MvP 337.

Construcción de una deleción en marco en sseD, cepa mutante MvP338

Una deleción de 116 bp entre el codón 26 y 142 de sseD se generó. El plásmido p5-2 fue digerido por HindIII/PstI y un fragmento de 2,1 kb se aisló y subclonó en un vector pBluescript SK+ digerido por HindIII/PstI. La construcción resultante se nombró p5-8. El p5-8 fue linearizado por digestión con EcoRV el cual corta dos veces dentro del gen sseD. Los cebadores sseD-del-1 (5'-ATA GAA TTC GGA GGG AGA TGG AGT GGA AG -3') y sseD-del-2 (5'-ATA GAA TTC GAA GAT AAA GCG ATT GCC GAC-3') fueron diseñados para introducir sitios de EcoRI. PCR se realizó usando p5-8 linearizado como plantilla de ADN. La polimerasa TaqPlus (Stratagene) se usó según las instrucciones del fabricante. Las reacciones de volumen de 100 \mul fueron fijadas usando 10 \mul de tampón 10 x TaqPlus Precisión que contiene cloruro de magnesio, 0,8 \mul de 100 mM de dNTPs, 250 ng de plantilla de ADN (p5-8 linearizada), 250 ng de cada cebador y 5 U de polimerasa de ADN TaqPlus.. PCR se realizó durante 35 ciclos de: 95ºC durante 1 minuto, 60ºC durante 1 minuto, 72ºC durante 5 minutos. Entonces un paso final de 72ºC durante 10 minutos fue agregado. 10 \mul de la reacción de PCR se analizaron. Un producto del tamaño esperado fue recuperado, digerido por EcoRI, autolimitado, y la mezcla de la ligación fue usada para transformar la E. coli DH5\alpha a la resistencia a la carbenicilina. Los plásmidos se aislaron de los transformantes y la integridad del inserto y la deleción fueron analizadas por mapeo de restricción y secuenciación de ADN. El inserto de una construcción confirmada se aisló después de la digestión con XbaI y KpnI y ligado al vector pKAS32 digerido por XbaI/KpnI. La construcción resultante fue usada para transformar la E. coli S17-1 \lambdapir a la resistencia a la carbenicilina, y la transferencia conjugacional del plásmido a la S. typhimurium de (Nal^{R}, Strep^{R}) se realizó según los procedimientos estándar (de Lorenzo y Timmis, 1994). Los exconjugantes que habían integrado el plásmido suicida por recombinación homóloga fueron seleccionados por la resistencia al ácido nadilíxico y a la carbenicilina, y protegidos para la sensibilidad a la estreptomicina. Tales clones fueron crecidos en LB a OD600 de aproximadamente 0,5 y los alícuotas se colocaron en placas en LB que contienen 250 \mug/ml de estreptomicina para seleccionar por las colonias que habían perdido el plásmido integrado y habían sufrido intercambio alélico. Los clones resistentes a la estreptomicina pero sensibles a la carbenicilina se usaron para el análisis ulterior. La protección de los mutantes con una deleción dentro del locus del sseD fue realizada por PCR usando los cebadores sseD-For (5'-GAA GGA TCC ACT CCA TCT CCC TC-3') y sseD-Rev (5-GAA GGA TCC ATT TGC TCT ATT TCT TGC-3'). La amplificación de ADN de clones que contienen el alelo de sseD de tipo natural resultó en un producto de PCR de 560 bp, el uso del ADN de los clones que albergan un alelo del sseD con una deleción interna resultó en un producto de PCR de 220 bp. La integridad de los clones que albergan la deleción del sseD fue además confirmada por análisis Southern del locus del sseD. Finalmente, el locus del sseD que contiene la deleción interna en marco se pasó a un ambiente de cepa fresca de S. typhimurium a través de la transducción de P22 (Maloy et al., 1996) y la cepa resultante se nombró MvP338.

Construcción de una deleción en marco en sscB, cepa mutante MvP339

Una deleción de 128 bp entre el codón 32 y 160 de sscBse se generó. Un fragmento de 3kb de Bg/II de plásmido p5-2 fue ligado en el sitio de BamHI de pBluescript KS+ para generar el plásmido p5-70. El plásmido p5-70 fue linearizado por digestión con NcoI que corta una vez dentro del gen sscB. Los cebadores sscB-del-1 (5'-ATG GGA TCC GAG ATT CGC CAG AAT GCG CAA-3') y sscB-del-2 (5'-ATG GGA TCC ACT GGC ATA AAC GGT TTC CGG-3') fueron diseñados para introducir sitios BamHI. PCR se realizó usando p5-70 linearizado como plantilla de ADN. La polimerasa TaqPlus (Stratagene) se usó según las instrucciones del fabricante. Las reacciones de volumen de 100 \mul fueron fijadas usando 10 \mul de tampón de 10 x TaqPlus Precision que contiene cloruro de magnesio, 0.8 \mul de 100 mM de dNTPs, 250 ng de plantilla de ADN (p5-70 linearizado), 250 ng de cada cebador y 5 U de polimerasa de ADN TaqPlus.. PCR se realizó durante 35 ciclos de: 95ºC durante 1 minuto, 60ºC durante 1 minuto, 72ºC durante 6 minutos. Entonces un paso final de 72ºC durante 10 minutos fue agregado. 10 \mul de la reacción PCR fue analizada. Un producto del tamaño esperado fue recuperado, digerido por BamHI, autoligado, y la mezcla de la ligación fue usada para transformar E. coli DH5\alpha a la resistencia a la carbenicilina. Los plásmidos se aislaron de los transformantes y la integridad del inserto y la deleción fueron analizadas por análisis de restricción y secuenciación de ADN. El inserto de una construcción confirmada se aisló después de la digestión con XbaI y KpnI y ligado al vector pKAS32 pnI digerido por XbaI/K.. La construcción resultante fue usada para transformar la E. coli S17-1 \lambdapir a la resistencia a la carbenicilina, y la transferencia conjugacional del plásmido a la S. typhimurium (Nal^{R}, Strep^{R}) se realizó según los procedimientos estándar (de Lorenzo y Timmis, 1994). Los exconjugantes que habían integrado el plásmido suicida por recombinación homóloga fueron seleccionados a través de la resistencia al ácido nadilíxico y a la carbenicilina, y protegidos para la sensibilidad a la estreptomicina. Tales clones fueron crecidos en LB a OD600 de aproximadamente 0,5 y los alícuotas se colocaron en placas en LB que contienen 250 \mug/ml de estreptomicina para seleccionar por colonias que habían perdido el plásmido integrado y habían sufrido intercambio alélico. Los clones resistentes a la estreptomicina pero sensibles a la carbenicilina se usaron para el análisis ulterior. La protección de los mutantes con una deleción dentro del locus sseC fue realizada por PCR que usa los cebadores sscB-For (5'-ATT GGA TCC TGA CGT AAA TCA TTA TCA -3') y sscB-Rev (5-ATT GGA TCC TTA AGC AAT AAG TGA ATC -3'). La amplificación de ADN de clones que contienen el alelo de sscB de tipo natural resultó en un producto de PCR de 480 bp, el uso de ADN del de clones que albergan un alelo del sscB con una deleción interna resultó en un producto de PCR de 100 bp. La integridad de los clones que albergan la deleción del sseC fue además confirmada por análisis de manchado Southern del locus del sscB. Finalmente, el locus del sscB que contiene la deleción en marco interna se pasó a un ambiente de cepa fresca de S. typhimurium a través de la transducción P22 (Maloy et al., 1996) y la cepa resultante se nombró MvP339.

Construcción de una mutación de deleción en el gen sseC

En un acercamiento ulterior la secuencia completa del gen sseC cromosomal fue suprimida por el reemplazo alélico con una copia suprimida del gen. La deleción se construyó en un plásmido suicida pCVD442 (Donnenberg et al., 1991). Primero, dos fragmentos de ADN que flanquean el gen sseC (fragmento A, que porta sitios artificiales SalI y XbaI en sus extremos 5' y 3', respectivamente; y un fragmento B, que porta los sitios artificiales XbaI y SacI en sus extremos 5' y 3', respectivamente, fueron amplificados por PCR. Los oligonucleótidos usados para PCR fueron: 1.) sseDelfor1 GCTGTCGACTTGTAGTGAGTGAGCAAG (el nucleótido 3' corresponde a 941 bp en la secuencia incluida en la Fig. 21 A); 2.) sseCDelrev2 GGATCTAGATTTTAGCTCCTGTCAGAAAG (el nucleótido 3' corresponde a 2585 bp en la secuencia incluida, el oligo liga a la cadena inversa); 3.) sseCDelfor2 GGATCTA
GATCTGAGGATAAAAATATGG (el nucleótido 3' corresponde a 4078 bp en la secuencia incluida); 4.) sseDelrev1 GCTGAGCTCTGCCGCTGACGGA-ATATG (el nucleótido 3' corresponde a 5592 bp en la secuencia incluida, el oligo liga a la cadena inversa). Los fragmentos de PCR resultantes se fundieron juntos por la vía del sitio XbaI. El fragmento resultante fue cortado con SalI y SacI y clonado en pCVD442 cortado con SalI y SacI. El plásmido resultante se introdujo en S. Typhimurium NCTC12023 por la conjugación y los integrantes cromosómicos del plásmido en el locus del sseC se seleccionaron por medio del marcador para la resistencia de ampicillina codificado por el plásmido. En un segundo paso, los clones que habían perdido el plásmido se protegieron para la pérdida de la resistencia a la ampicillina. Los clones resultantes se probaron para la deleción cromosomal del gen sseC por PCR, y la deleción de un fragmento de 1455 bp que comprende un marco de lectura abierto del sseC entero, fueron confirmadas. Esta cepa mutante de \DeltasseC se nombró III-57\DeltasseC.

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Construcción de un mutante doble sseC-aroA

Para construir un mutante doble el cual puede servir como un prototipo para una vacuna atenuada viva, el marcador sseC:aphT (Km^{r}) de MvP103 fue transferido a través de la transducción de fago P22 en S. typhimurium SL7207 (hisG46 DEL407 [aroA544:Tn10], Tc^{R}) una cepa que porta una deleción estable en el gen aroA.

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Ejemplo 3

La invasión y el crecimiento intracelular en el cultivo del tejido Replicación intramacrófaga de cepas mutantes

Varias cepas las cuales son defectuosas en su habilidad de replicarse dentro de las líneas celulares macrófagas y similares a macrófagas se han probado, como la supervivencia del macrófago y la replicación se piensa que representen un aspecto importante de la patogénesis de la Salmonella en vivo (Fields et al., 1986). Se ha reportado previamente que varias cepas mutantes SPI2 no eran defectuosas para la supervivencia o la replicación dentro de los macrófagos RAW (Hensel et al., 1997b) sino que los experimentos subsiguientes han revelado que algunos mutantes SP12 pueden mostrarse que tienen un defecto de replicación si los cultivos bacterianos de fase estacionaria se airean opsonizados con suero de ratón normal (vea también artículo chaperón: Cirillo et al., 1998). El incremento en cfu para las cepas diferentes en macrófagos RAW en un periodo de 16 horas se muestra en la Fig. 3. Los defectos de la replicación se observaron para cepas que portan mutaciones en ssaV (codificando un componente del mecanismo de secreción), sseB y sseC y en menor extensión para las cepas que portan las mutaciones en sseE. La complementación parcial de este defecto se logró con cepas de plásmidos que albergan que portan copias funcionales de sseB y sseC, HH103 y MvP103 [psseC], respectivamente. La habilidad de las cepas mutantes SPI2 de replicarse dentro de la línea de la célula macrófaga J 774.1 (Fig. 4 A) y en macrófagos peritoneales producidos como respuesta de periodato de ratones C3H/HeN (Fig. 4 B) también se ha probado. Los defectos de replicación similares de S. typhimurium que portan transposón o mutaciones no polares en genes SPI2 se observaron, sin tener en cuenta el tipo de célula fagocita examinada, aunque las células peritoneales dadas como respuesta tenían una actividad antimicrobiana superior comparadas a cualquier línea de células.

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Ensayos de supervivencia de macrófago

Las células RAW 264.7 (ECACC 91062702), una línea de la célula similar al macrófago murino, fueron cultivadas en el medio Eagle's modificado de Dulbecco (DMEM) que contiene 10% de suero de feto de ternero (SFT) y 2 mM de glutamina a 37ºC en 5% de CO_{2}. Las cepas de S. typhimurium fueron crecidas en LB a la fase estacionaria y diluidas a un OD600 de 0,1 y opsonizadas por 20 minutos en DMEM que contiene 10% de suero de ratón normal. Las bacterias se centrifugaron entonces en macrófagos sembrados en 24 placas de cultivo de tejido sano a una multiplicidad de infección de aproximadamente 1:10 y se incubaron por 30 minutos. A continuación de la Infección, los macrófagos se lavaron dos veces con PBS para quitar las bacterias extracelulares e incubadas por 90 minutos (2 horas después de la infección) o 16 horas en un medio que contiene gentamicina (12 \mug/ml). Los macrófagos infectados se lavaron dos veces con PBS y se diluyeron con 1% de Triton X-100 por 10 minutos y los alícuotas apropiados y las diluciones se colocaron en placas en agar LB para contar los cfu.

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La supervivencia de las cepas opsonizadas de S. typhimurium en las células J774.1 (Ralph et al., 1975) o en células exudadas peritoneales murinas C3H/HeN (de Charles River Laboratories, Wilmington, MA) fue esencialmente determinada como se describió por (DeGroote et al. 1997), pero sin la adición del interferón \gamma. En resumen, las células peritoneales cosechadas en PBS con 10% de suero de feto de ternero inactivado por calor 4 días después de la inyección intraperitoneal de 5 mM de periodato de sodio (Sigma, St. Louis, MO) se colocaron bien al fondo de 96 placas de microtítulo (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ) y se les permitió adherirse por 2 horas. Las células no adherentes se enjuagaron con un medio pre calentado que contiene 10% de suero de feto de ternero inactivado por calor. En estudios anteriores, nosotros hemos establecido que más del 95% de las células que permanecen después de este procedimiento son macrófagos. La S. typhimurium de los cultivos aireados toda la noche fue opsonizada con suero de ratón normal y centrifugada en las células adherentes en un efector a la proporción seleccionada de 1:10. A las bacterias se les permitió internalizar por 15 minutos, y se lavaron con un medio que contiene 6 \mug/ml de gentamicina para matar las bacterias extracelulares. A las 0 horas y 20 horas, las células fueron diluidas con PBS que contiene 0,5% de deoxicolato (Sigma, St. Louis, MO), con la colocación en placas de las diluciones en serie para contar las unidades formadas en colonias.

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Ejemplo 4

Evaluación de la seguridad en el modelo de ratón de la S. typhimurium de la Salmonelosis Pruebas de virulencia con cepas que portan las mutaciones no polares

El análisis de la secuencia de ADN sugirió que los genes sse podrían codificar proteínas efectoras del sistema de secreción, pero aparte de un posible efecto polar de una inserción de transposón en sscA ninguna cepa que porta mutaciones en estos genes se recuperó en el filtrado de STM original para los genes de virulencia de S. typhimurium que usan mutagénesis mTn5 (Hensel et al., 1995), y sus papeles en la virulencia eran poco claros. Para salir de dudas, las cepas que portan mutaciones no polares en sseC, sseD y sseEsscB (Fig. 1) se han construido y se han sometido a las pruebas de virulencia. La Tabla 4 muestra que todos los ratones inoculados con cepas que portan las mutaciones sseC y sseD sobrevivieron a una dosis de 1 x 10^{4} cfu, tres órdenes de magnitud mayor que el LD50 de la cepa del tipo natural, la cual es menor de 10 cfu cuando la vacuna es administrada por la ruta i.p. (Buchmeier et al., 1993; Shea et al, 1996). Las mismas cepas que contienen un plásmido que porta el alelo del tipo natural correspondiente también se inocularon en los ratones a una dosis de 1 x 10^{4} cfu. Ningún ratón sobrevivió estas infecciones, lo cual muestra que cada mutación puede ser complementada por la presencia de una copia funcional de cada gen, y que cada uno de estos genes juega un papel importante en la virulencia de la Salmonella. Las cepas que portan las mutaciones no polares en sseEsscB causaron infecciones letales cuando aproximadamente 1 x 10^{4} de células de cada cepa se inocularon en los ratones por la ruta i.p. (Tabla 4) y se analizaron en más detalle por un ensayo de competencia con la cepa de tipo natural en infecciones mixtas (cinco ratones por prueba) para determinar si ellas se atenuaron en virulencia. El índice de competencia, definido como la proporción del rendimiento de salida del mutante a las bacterias del tipo natural, dividido por la proporción de la entrada del mutante a las bacterias del tipo natural, muestra que el mutante sseEsscB no era significativamente diferente al de una cepa totalmente virulenta que porta un marcador de resistencia a los antibióticos, lo cual implica que este gen no juega un papel significante en la infección de Salmonella sistémica del ratón.

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TABLA 4 Virulencia de las cepas de S. Typhimurium en ratones

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Ejemplo 5

Vacunación con cepas MvP103 y MvP101 de S. typhimurium sseC::aphT, y \DeltasseD::aphT Cepas que portan mutaciones no polares como portadoras de vacuna viva

Para confirmar la conveniencia de los mutantes MvP101 y MvP103 como portadores de la vacuna viva sus niveles de atenuación fueron evaluados determinando los LD_{50} después de la inoculación oral en ratones. Grupos de 10 ratones se alimentaron con las diluciones de cepas MvP101, MvP103 o del tipo natural de cepa parental NCTCNCTC12023 y los animales muertos fueron registrados dentro de un periodo de 10 días post infección. Los resultados obtenidos demostraron que ambos mutantes son muy atenuados cuando se dan oralmente a los ratones de BALB/c (LD_{50} sobre 10^{9}) cuando se comparan con la cepa parenteral (LD_{50} = 6.9 x 10^{5} CFU). Después de la inoculación intraperitoneal los LD_{50} de la S. typhimurium NCTC12023 de tipo natural en BALB/c es 6 de bacterias, y los LD_{50} de MvP103 en BALB/c es 2,77 x 10^{6} después de la inoculación intraperitoneal. La mutación puede ser complementada por psseC, pero ninguna determinación LD_{50} para la cepa mutante complementada fue realizada. LD_{50} de MvP101 en BALB/c es 3,54 x 10^{6} después de la inoculación intraperitoneal. Una complementación parcial por el plásmido p5-K 1 fue posible. Un LD_{50} intraperitoneal para MvP101 [p5-K1] de 8,45 x 10^{2} fue determinado. (Descripción de p5-K1: un fragmento de 3,2 kb PstI de p5-2 que contiene sseC'sseDsseEsscBsseF' fue subclonado en un vector de clonación de número de copias bajo pWSK29).

Determinación del LD_{50}

Dosis en el rango de 10^{5} a 10^{9} CFU de S. typhimurium NCTCNCTC12023 (tipo natural) o los mutantes MvP103 y MvP101 se inocularon oralmente en grupos de 10 ratones y los supervivientes se registraron sobre 10 días de LD_{50} de S typhimurium del tipo natural y las cepas mutantes MvP101 y MvP103 después de la infección intraperitoneal fueron determinadas por inoculación de dosis en el rango de 10^{1} a 10^{7} CFU en los grupos de 5 ratones BALB/c hembras de 6 a 8 semanas de edad. La supervivencia se registró sobre un periodo de tres semanas. La dosis de las cepas de provocación fue calculada por el método de Reed y Muench (Reed y Muench, 1938).

Protocolos de inmunización

Para la vacunación, las bacterias fueron crecidas durante la noche hasta que alcanzaron la fase de registro media. Entonces, ellas fueron cosechadas por centrifugación (3,000 x g) y resuspendidas en 5% de bicarbonato de sodio. Los ratones se inmunizaron cuatro veces a intervalos de 1 5 días alimentándolos delicadamente con la suspensión bacteriana (10^{9} CFU por ratón) en un volumen de aproximadamente 30 \mul. Los ratones de control se vacunaron con el portador, carente de plásmido.

Ensayo de citotoxicidad

Las células del bazo de los ratones se obtuvieron 14 días después de la última inmunización y 2x10^{6} células efectoras fueron reestimuladas in vitro durante 5 días en un medio completo complementado. con 20 U/ml de rIL-2 y 20 \muM de péptido \betaGP1 (\beta-gal p876-884, TPHPARIGL), los cuales abarcan el epítope \beta-galH inmunodominante restringido por H-2L^{d}. Después de la reestimulación, el ensayo se realizó usando el método de incorporación de [^{3}H]-timidina. En resumen, 2x10^{6} de células P815 por ml fueron etiquetadas con [^{3}H]-timidina por 4 horas en un medio completo o en un medio completo complementado con 20 \muM de péptido \betaGP1 y usadas como células seleccionadas. A continuación del lavado, se incubaron 2x10^{5} selecciones etiquetadas con diluciones en serie de células efectoras en 200 \mul del medio completo por 4 horas a 37ºC. Las células se cosecharon y la dilución específica fue determinada como sigue:

[(c.p.m.\ retenidos\ en\ ausencia\ de\ efectores) - (c.p.m\ retenidos\ experimentalmente\ en\ presencia\ de\ efectores)/ c.p.m.\ retenidos\ en\ ausencia\ de\ efectores]\ x\ 100.

Ejemplo 6

Evaluación de la respuesta inmunológica inducida Inducción de las respuestas inmunológicas mucosas después de la vacunación oral

Para lograr la protección contra los patógenos mucosos que usan portadores de Salmonella viva, la estimulación de una respuesta mucosa eficaz es altamente deseable.

Por consiguiente, la presencia de anticuerpos específicos \beta-gal en lavados intestinales de ratones inmunizados con MvP101, MvP103 o SL7207 que portan pAH97 se investigó 52 días después de la inmunización. Como es mostrado en la Fig. 5., la inmunización con todos los tres portadores estimula la producción de cantidades significantes de IgA \beta-gal específica y, en menor grado, favorece la transudación de IgG de antígeno específico en el lumen intestinal. Ningunas diferencias significantes estadísticamente se observaron entre las respuestas a los clones recombinantes mucosos diferentes.

Respuestas inmunológicas celulares activadas después de la inmunización oral con mutantes sseC y sseD que expresan \beta-gal

Para evaluar la eficacia de las respuestas de las células T antígeno específicas generadas en ratones inmunizados, las células del bazo se enriquecieron en células CD4+T y se reestimularon in vitro durante cuatro días con \beta-gal. Como es mostrado en la Fig. 6, aunque las células del bazo enriquecidas con el antígeno específico CD4+ se generaron después de la vacunación con los tres portadores, MvP1 03 y MvP101 fueron significativamente más eficaces que SL7207 (P 0,05) al activar la respuesta inmunológica celular específica. En contraste, las células aisladas de ratones inmunizados con el portador solo fallaron al proliferar en la presencia de \beta-gal.

Para investigar el tipo Th de respuesta inmunológica activada por la inmunización, el contenido de IFN -\gamma, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6 y IL-10 fue medido en los fluidos sobrenadantes de las células reestimuladas. Los resultados demostraron que un patrón de respuesta Th1 predominante fue inducido en ratones inmunizados con todos los portadores. La IFN-\gamma fue la única citoquina con niveles aumentados significativamente en comparación con aquéllos observados en los sobrenadantes de las células del bazo aisladas de los ratones inmunizados con portadores sin plásmido (Fig. 7). Interesantemente, de acuerdo con los patrones isotipo de IgG, los niveles de IFN-\gamma detectados en los sobrernadantes de las células de ratones inmunizados con MvP103 [pAH97] fueron significativamente más altos (P 0,05) que aquéllos de los animales que reciben MvP101 [pAH97] o SL7207 [pAH97] (Fig. 7).

Respuestas de anticuerpo antígeno específico generadas en ratones inmunizados oralmente con portadores de vacuna S. typhimurium atenuada que expresan el antígeno \beta-gal modelo

Los grupos de ratones se inmunizaron con las cepas recombinantes MvP101 [pAH97] y MvP103 [pAH97]. Para estimar la eficacia de los prototipos otro grupo se vacunó con la cepa portadora SL7207 [pAH97] bien establecida. Las habilidades de los portadores diferentes de inducir una respuesta humoral sistémica fueron determinadas midiendo el título de los anticuerpos específicos \beta-gal en el suero de los ratones vacunados. Como es mostrado en la Fig. 8, los títulos significantes de IgG específicos \beta-gal y los anticuerpos IgM se detectaron en el día 30 en todos los animales vacunados. En contraste con los títulos de IgM los cuales alcanzan una meseta en el día 30, los títulos de IgG aumentaron continuamente hasta el día 52 de la inmunización cuando el experimento fue concluido. Aunque todos los portadores probados exhiben una actuación excelente, el mutante MvP1 03 fue el más eficaz en inducir anticuerpos IgG anti \beta-gal (P 0,05). Ningunos niveles significantes de IgA específico \beta-gal se descubrieron en ratones inmunizados con cualquiera de los tres clones recombinantes (datos no mostrados).

Para determinar la distribución de las subclases de IgG anti-\beta-gal, las muestras de suero se analizaron para los niveles específicos de IgG1, IgG2a, IgG2b e IgG3. Los resultados mostrados en la Fig. 9 demuestran que el isotipo de IgG específico \beta-gal principal presente en los sueros de todos los ratones inmunizados era el IgG2, sugiriendo una respuesta de Th1 predominante. Interesantemente, una concentración más baja de IgG1 (P 0,05) se observó en los ratones inmunizados con MvP103 que en aquéllos que recibieron MvP101 y SL7202, indicando un patrón de respuesta similar en los animales inmunizados con los últimos dos portadores.

Colección de muestras

Las muestras de suero fueron recogidas en puntos de tiempo diferentes y monitoreados para la presencia de los anticuerpos \beta-gal específicos. Al día 52 después de la inmunización, las purgas intestinales fueron obtenidas enjuagando el pequeño intestino con 2 ml de PBS complementados con 50 mM de EDTA, 0,1% albúmina de suero bovino y 0,1 mg/ml de inhibidor de tripsina de soja (Sigma). Entonces, las purgas fueron centrifugadas (10 minutos a 600 x g) para remover los restos, los sobrenadantes fueron removidos y se complementaron con fluoruro de fenilmetilsulfonilo (10 mM) y NaN_{3}, y guardados a -20ºC.

Ensayo de anticuerpos

Los títulos de anticuerpo fueron determinados por un ensayo de inmunosorbentes unidos por enzima (ELISA). Brevemente, 96 placas sanas de ensayo Nunc-Inmuno MaxiSorp^{TM} (Nunc, Roskilde, Dinamarca) se cubrieron con 50 \mul de \beta-gal sano (5 \mug/ml) en tampón de recubrimiento (0,1 M de Na_{2}HPO_{4}, pH 9,0). Después de la incubación de noche a 4ºC, las placas se bloquearon con 10% de FCS en PBS por 1 hora a 37ºC. Las diluciones dobles en serie de suero en FCS-PBS se agregaron (100 \mul/sano y las placas se incubaron por 2 horas a 37ºC. Después de cuatro lavados con PBS al 0.05% deTween 20, los anticuerpos secundarios se agregaron: IgG de anti ratón de cabra específico de cadena \gamma biotinilatada, IgM de anti ratón de cabra específico de cadena \mu, anticuerpos IgA de anti ratón de cabra específico de cadena \alpha (Sigma, St. Louis, MO) o, para determinar las sublases IgG, los IgG1, IgG2a, IgG2b y IgG3 de anti ratón de rata combinada con biotina (Pharmingen) y las placas además se incubaron por 2 horas a 37ºC. Después de cuatro lavados, 100 \mul de estreptavidina combinada con peroxidasa (Pharmingen, St. Diego, CA) se agregaron a cada sano y las placas se incubaron a temperatura ambiente por 1 hora. Después de cuatro lavados, las reacciones se desarrollaron usando ABTS [2,2'-azino-bis-(ácido 3-etibenzotiazolina-6-sulfúrico)] en 0,1 M de tampón de citratofosfato (pH 4,35) que contiene 0,01% de H_{2}O_{2.} Los títulos finales se expresaron como el recíproco del log_{2} de la última dilución la cual dio una densidad óptica en 405 nm, 0,1 unidad sobre los valores de los controles negativos después de una incubación de 30 minutos.

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Para determinar la concentración de Ig total presente en el lavado intestinal, diluciones en serie de las muestras correspondientes se incubaron en placas de microtítulo que se habían cubierto con Ig anti ratón de cabra, IgM y IgA como anticuerpos de captura (100 \mug/sano, Sigma) y las diluciones en serie de ratón IgG, IgM y IgA (Sigma) purificadas fueron usadas para generar curvas estándar. La detección de Ig antígeno específico se realizó como se describió anteriormente.

Inducción de respuestas CTL antígeno específicas en ratones oralmente inmunizados con las cepas portadoras que expresan \beta-gal

La estimulación de respuestas restringídas de clase I de CPH son particularmente importantes para la protección contra muchos agentes patógenos y tumores intracelulares. Se ha mostrado que CD8 + CTL antígeno específico puede generarse tanto in vitro como in vivo después de la inmunización con el spp de la Salmonella recombinante que expresan antígenos heterólogos. Por consiguiente, nosotros lo consideramos importante para determinar si los portadores probados también eran capaces de activar una respuesta CTL \beta-gal específica. Las células del bazo fueron recolectadas de ratones vacunados con cualquiera MvP101 [pAH97], MvP103 [pAH97] o SL7207 [pAH97] al día 52 de la inmunización y reestimuladas in vitro con células de bazo singénicas pulsadas por \betaGP1 durante 5 días. Como es mostrado en la Fig. 10, las células del bazo de ratones inmunizados con cualquiera de las tres construcciones indujeron la lisis significante de células designadas cargadas con \beta-GP1 comparadas con los controles descargados. Las respuestas más eficaces se observaron usando la cepa portadora MvP103. La lisis fue mediada a través de células CD8 + T ya que la actividad citotóxica fue completamente abrogada cuando las células efectoras CD8 + T se agotaron (datos no mostrados).

Determinación de la citoquina

Los sobrenadantes del cultivo fueron colectados de las células proliferantes en los días 2 y 4, y guardados a -70ºC. La determinación de IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 y IFN -\gamma fue realizada por ELISA específico. En resumen, 96 placas de microtítulo sano se cubrieron toda la noche a 4ºC con IL-2 mAb (clon JESG-1A12) anti ratón de rata purificado, anti IL-4 mAb (clon 11B11), anti IL-5 mAb (clon TRFK5), anti IL-6 mAb (clon MP5-20F3), anti IL-10 mAb (clone JES5-2A5), y anti IFN-\gammamAb (clon R4-6A2) (Pharmingen). Después de tres lavados, las placas se bloquearon y las diluciones dobles de fluidos sobrenadantes se agregaron. Una curva estándar se generó para cada citocina usando murina recombinante IL-2 (rIL-2), rIL-4, rIL-5, rIL-6, rIFN-\gamma, rIL-10 (Pharmingen). Las placas se incubaron además a 4ºC toda la noche. Después de lavar, 100 \mul/sano de anticuerpos monoclonales IL-2 (clon JES6-5H4), IL-4 (clon BVD6-24G2), IL-5 (clon TRFK4), IL-6 (clon MP5-32C11), IL-10 (clon SXC-1) y INF-y (clon XMG1.2) de antiratón de rata biotinilatados se agregaron y se incubaron por 45 minutos a temperatura ambiente. Después de seis lavados, la estreptavidina y la peroxidasa combinadas se agregaron y se incubaron por 30 minutos a temperatura ambiente. Finalmente, las placas se desarrollaron usando ABTS.

Agotamiento de las células del bazo CD8

Los subconjuntos celulares CD8+ se agotaron usando MiniMACS Magnetics Ly-2 Microbeads según las instrucciones del fabricante (Miltenyi Biotec). Las preparaciones celulares agotadas contenían 1% de células CD8 +.

Análisis FACScan

Aproximadamente 5x10^{5} de células se incubaron en tampón de manchado (PBS complementado con 2% de FCS y 0,1% de azida de sodio) con el anticuerpo o la combinación de anticuerpos deseados por 30 minutos a 4ºC. Después de los lavados, las células se analizaron en un FACScan (Becton Dickinson). Los anticuerpos monoclonales usados anti CD4 y anti CD8 (clones H129.19 y 53-6.7; Pharmingen) se conjugaron por FITC.

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Ejemplo 7

Proliferación celular Ensayo de proliferación celular

Las suspensiones de célula de bazo se enriquecieron por células CD4 + T usando MiniMACS Magnetic Ly-2 y Microcuentas IgG de anti ratón de cabra indirectos según las instrucciones del fabricante (Mitenyi Biotec GmbH, Alemania). Las preparaciones celulares contuvieron > 65% de células CD4+. Las células se ajustaron a 2 x 10^{6} células/ml en un medio completo complementado con 20 U/ml de rIL-2 de ratón (Pharmigen), sembradas en 100 \mul/sano en una placa de fondo llano de microtítulo 96 sano (Nunc, Roskilde, Dinamarca) e incubadas durante cuatro días en presencia de concentraciones diferentes de \beta-gal soluble. Durante el final de 18 horas de cultivo 1 \muCi de [^{3}H]-timidina (Amersham International, Amersham, Reino Unido) fue añadido por sano. Las células se cosecharon en filtros de papel usando a un cosechador celular y la [^{3}H]-timidina incorporada en el ADN de las células proliferantes fue determinada en un contador de centelleo de \beta.

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Ejemplo 8

Caracterización de los genes ssr y construcción y caracterización de las cepas mutantes MvP284, MvP320 y MvP333 de S. typhimurium Homología de dos genes reguladores componentes ssrA y ssrB de SPI2 con otras proteínas bacterianas

El ssrA del gen SPI2 codifica una proteína similar a los componentes sensores de dos sistemas reguladores componentes bacterianos como se ha descrito antes (Ochman et al., 1996). Para la consistencia con la nomenclatura de genes de virulencia SP12 (Hensel et al., 1997b; Valdivia y Falkow, 1997), este gen se nombra ssrA. Secuencia abajo del ssrA, un MLA con capacidad de codificar para una proteína de 24,3 kDa se identificó. Este gen comparte una similitud significante con una familia de genes que codifican los activadores transcripcionales similares al DegU del Bacilus subtilis, UvrY de E. coli y BvgA de Bordetella pertussis. Por consiguiente, es probable que la proteína actúe como el componente regulador del sistema del ssr y el gen se nombró ssrB.

Regulación inversa de SPI1 y SPI2

La expresión de los sistemas de secreción del tipo III de SPI1 y SPI2 son estrechamente regulados por las condiciones ambientales. Mientras el SPI1 es inducido durante la fase estacionaria previa/registro tardío después del crecimiento en un medio rico de alta osmolaridad y que limita la concentración de O_{2} (oxígeno), ninguna inducción de expresión del gen SPI2 fue observada. En contraste, después del crecimiento en un medio mínimo con cantidades limitantes de Mg^{2+} (8 \muM) la fusión de ssaB::luc fue muy expresada mientras la fusión de sipC::lacZ no fue expresada. La expresión de la fusión de ssaB::luc es dependiente de la función de SsrA/B, ya que no hay ninguna expresión en la cepa P8G12 del ambiente de ssrB negativa (Hensel et al., 1998). La expresión de la fusión de sipC::lacZ es dependiente de HilA, el regulador transcripcional de SPI1. Nosotros también observamos que una mutación en ssrB afecta la expresión de la fusión de ipC::lacZ. Esto indica que el SPI2 tiene un efecto regulador en la expresión de los genes SPI1.

Las cepas bacterianas que albergan una fusión de luc al ssaB en la SPI2 (cepa MvP131) y una fusión de lacZ al sipC en la SPI1 (cepa MvP239) fueron crecidas bajo las condiciones previamente mostradas para inducir la expresión del gen SPI. Las bacterias fueron crecidas durante toda la noche en un medio mínimo que contiene 8 \muM de Mg^{2+} o durante toda la noche en un caldo de LB que contiene 1% de NaCl (LB 1% de NaCl). La actividad de luc de la cepa MvP131 y la actividad de \beta-galactosidasa de la cepa MvP239 fueron determinadas. Como un control, ambas fusiones reporteras se ensayaron en el ambiente de la cepa ssrB negativa de P8G12.

La expresión de los niveles de fusiones del gen reportero lacZ a los genes SPI se ensayó como se describe en Miller, 1992.

Construcción y análisis de la fusión del gen reportero sseA

Un fragmento de 1,1 kb de SmaI/HincII de p5-4 fue subclonado en pGPL01, un vector suicida para la generación de fusiones de luc (Gunn y Miller, 1996). La construcción resultante, en la cual 1,0 kb secuencia arriba y 112 bp de sseA es transcripcionalmente fusionado al luc fue usada para transformar la E. coli de S17-1 \lambdapir, y la transferencia conjugacional a la S. typhimurium fue realizada como es descrito previamente (Gunn y Miller, 1996). Las cepas que habían integrado la fusión del gen reportero en el cromosoma por recombinación homóloga fueron confirmadas por PCR y el análisis de hibridación Southern. Seguidamente, la fusión fue pasada a través de la transducción de P22 al tipo natural y los varios ambientes de la cepa mutante con inserciones de mTn5 en los genes SPI1 o SPI2 (Maloy et al., 1996). Como un control, una cepa fue construida albergando una integración cromosomal de pLB02, un plásmido suicida sin una fusión promotora al gen luc (Gunn y Miller, 1996). Para el análisis de expresión de las cepas fueron crecidas por 16 horas en un medio mínimo con ventilación. Los alícuotas de los cultivos bacterianos fueron lisados y la actividad de la luciferasa fue determinada usando un equipo de ensayo de luciferasa según el protocolo del fabricante (Boehringer Mannheim). La detección del fotón se realizó en un contador Microplaca de centelleo/luminiscencia (Wallac, Turku). Todos los ensayos se hicieron en triplicado, y replicados en ocasiones independientes.

La expresión de sseA es dependiente de SrrAB

Para establecer si los genes del sse son parte del sistema de secreción de SPI2, la expresión de la fusión de un gen reportero sseA::luc, integrada por recombinación homóloga en el cromosoma de las cepas mutantes SPI2 diferentes, se ha investigado (Fig. 11). La actividad transcripcional de sseA en un ambiente de tipo natural durante el crecimiento en un medio mínimo fue dramáticamente reducida por la desactivación del sistema de dos componentes SPI2. Las inserciones de transposón en ssrA (cepa mutante P3F4) y ssrB (cepa mutante de P8G12), que codifican el componente sensor y el activador transcripcional, respectivamente, resultaron en la expresión. reducida 250 a 300 veces de sseA. La desactivación de hilA, el activador transcripcional de SPI1 (Bajaj et al., 1996), no tuvo efecto en la expresión del gen sseA. Las inserciones de transposón en dos genes que codifican componentes del mecanismo de secreción tipo III de SP12 (ssaJ::mTn5 y ssaT::mTn5; cepas mutantes P11D10 y P9B7; Shea et al., 1996) tampoco tenían ninguna significación. Estos datos muestran que el SsrA/B se requiere para la expresión del sseA, pero que hilA no lo es.

La expresión de los genes SPI2 dentro de los macrófagos es dependiente del SsrA/B

La presencia de la S. typhimurium dentro de las células eucarióticas (macrófagos) induce la expresión de los genes SPI2 como es indicado por el análisis de las fusiones al ssaB y ssaH. Esta expresión es dependiente del sistema regulador de dos componente SsrA/B codificados por SPI2.

La estirpe celular de la estirpe de macrófago murino J744 se usó para este experimento. Los macrófagos se infectaron a una multiplicidad de infección de 10 bacterias por macrófago con MvP131 (fusión de luc al ssaB), MvP266 (fusión de luc de ssaH) y MvP244 (fusión de luc al ssaB en un ambiente negativo de ssrB). Las bacterias extracelulares fueron matadas por la adición de gentamicina (20 \mug/ml). En varios puntos de tiempo, los macrófagos fueron lisados por la adición de 0,1% de Triton X-100, las bacterias intracelulares fueron enumeradas en diluciones en serie de revestimiento sobre las placas de agar LB. Un alícuota ulterior de las bacterias fue recuperado y la actividad de la luciferasa fue determinada. Las actividades de la luciferasa expresaron una emisión ligera relativa por
bacteria.

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Efectos de una mutación en ssrB en la proteína efectora secretada de SPI1 SipC

El análisis de las proteínas secretadas en el medio de crecimiento por la cepa mutante MvP320 de SPI2 de la S. typhimurium (mutación no polar en a, Fig. 12) reveló la ausencia o la reducción fuerte en las cantidades de las proteínas efectoras secretadas SPI1 (Hensel et al., 1997b). Estos mutantes de SPI2 también están reducidos en su habilidad de invadir las células epiteliales cultivadas o los macrófagos cultivados (Hensel et al., 1997b). Para examinar este fenómeno en mayor detalle, nosotros expresamos el recombinante SipC (rSipC) y levantamos anticuerpos contra el rSipC en conejos. En las prueba de manchado Western, el antisuero contra rSipC reaccionó con una proteína de 42 kDa de los precipitados sobrenadantes del cultivo de la cepa de tipo natural NCTC12023 de S. typhimurium. Ninguna reacción se observó con los sobrenadantes de los cultivos de EE638, una cepa deficiente en SipC (Hueck et al., 1995). Además, en la prueba de manchado Western el SipC no pudo detectarse en los sobrenadantes del cultivo de los MvP320 mutantes de SPI2. Sin embargo, el SipC se detectó en los sobrenadantes del cultivo de otros mutantes de SPI2 como P2D6 (ssaV::mTn5), P9B6 (ssaV::m Tn5) y NPssa V (ssaV::aphT) (Deiwick et al., 1998). La detección por el antisuero de SipC en los sobrenadantes del cultivo de varias cepas estuvo de acuerdo con la presencia o ausencia de SipC cuando se detectó por SDS-PAGE. Además fue analizado si la ausencia de SipC en sobrenadantes del cultivo de cepas mutantes de SPI2 era debida a la secreción defectuosa de SipC por medio del sistema de secreción del tipo III o redujo la síntesis de SipC en estas cepas. El antisuero contra el rSipC fue usado para detectar SipC en los gránulos de los cultivos crecidos bajo condiciones de inducción para la expresión de los genes SPI1 (es decir la fase estacionaria, alta osmolaridad, oxígeno bajo) (Bajaj et al., 1996). El análisis de tipo natural y las cepas que portan varias mutaciones en los genes SPI1 y SPI2 indicó cantidades altamente reducidas de SipC en los mutantes con una mutación no polar en ssrB. Sin embargo, SipC fue detectado en niveles comparables a aquéllos observados en los gránulos de cultivos de tipo natural y en las cepas mutantes P2D6, P9B6 y NPssa V de SPI2. El efecto en la síntesis de SipC no es debido a las tasas de crecimiento reducido o a los niveles de proteína reducidos en los mutantes de SPI2, ya que ambos parámetros eran comparables para el tipo natural y los mutantes de
SPI2.

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Efectos de una mutación en el gen de SPI2 ssrB en la expresión de genes SPI1

Para ensayar el efecto de las mutaciones de SPI2 en la expresión de los genes SPI1, las fusiones previamente caracterizadas de lacZ a varios genes SPI1 (Bajaj et al., 1995; Bajaj et al., 1996) fueron transducidas en el mutante MvP320 de SPI2 y en varios mutantes de SPI1 para generar un juego de cepas de fusión reporteras. La expresión de la \beta-galactosidasa reportera en cultivos crecidos bajo condiciones que inducen para la expresión de SPI1 (vea arriba) se ensayó. Una inserción de Tn en hilA (P4H2) redujo la expresión de prgK así como del sipC, mientras que una inserción en spaRS (P6E11) sólo afectó la expresión de sipC. Algunas cepas mutantes con una mutación en ssrB del gen SPI2 que codifica a los componentes del sistema regulador de dos componentes mostraron una expresión reducida de fusiones reporteras a prgK y a sipC (Fig. 11). Los efectos en la expresión de ambos genes fueron similares. Otro cepas mutantes con inserciones de Tn en ssaV (P2D6, P9B6), así como el NPssaV mutante que alberga inserciones no polares en ssaV, tuvieron niveles de expresión de prgK y sipC comparables al de las fusiones reporteras correspondientes en un ambiente genético de tipo natural. El análisis de las fusiones del lacZ a prgH y invF revelaron un efecto similar en la expresión como es mostrado para el prgK y sipC.

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Una mutación en el gen de SPI2 ssrB afecta la expresión del hilA regulador de SPI1

El análisis de las fusiones reporteras al sipC y prgK indicó que esa expresión de genes en dos operones diferentes de SPI1 puede ser afectada por las mutaciones de SPI2, sugiriendo que estas mutaciones afectan otros genes SPI1 involucrados en la regulación de sipC y prgK. Se ha demostrado previamente que la expresión de los genes SPI1 está bajo el control del activador transcripcional HilA (Bajaj et al., 1995; Bajaj et al., 1996). La expresión de hilA por consiguiente se analizó en presencia de una mutación de SPI2 en ssrB. La MvP320 cepa mutante de SPI2 había disminuido grandemente los niveles de expresión del hilA. De nuevo, niveles muy bajos de expresión de hilA se observaron en mutantes que tenían niveles reducidos de expresión de prgK y de sipC. Para analizar si el efecto de la mutación de SPI2 en la expresión de sipC resultó de la expresión reducida de hilA, nosotros a continuación realizamos experimentos de complementación en varias cepas mutantes que albergan el pVV135 (expresión constitutiva de hilA) (Bajaj et al., 1996) o pVV214 (expresión de hilA del promotor nativo) (Bajaj et al., 1995). En acuerdo con un estudio anterior (Bajaj et al., 1995), la mutación hilA de la cepa P4H2 fue complementada por pVV214. Sin embargo, la expresión del sipC o no se restauró en la cepa mutante MvP320 que alberga el pVV 135 o el
pVV214.

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Construcción de las cepas MvP284 y MvP320 de S. typhimurium mutantes de ssrA y ssrB

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MvP284 mutante, ssrA. El gen ssrA (Fig. 12) fue subclonado del clon del fago \lambda2 de plásmido p2-2 derivado en un fragmento de 5,7 kb de BamHI en pUC18 como se indicó en la Tabla 1. Un fragmento de 1,6 kb se recuperó después de la digestión de HindIII y de EcoRV de p2-2 y subclonado en pBluescript II KS + digerido por HindIII/HincII. La construcción resultante nombrada p2-20 fue digerida con HincII y defosforilada con fosfatasa alcalina. El casete de aphT se aisló como se describió anteriormente y ligado al plásmido linearizado p2-20 en la misma orientación en el único sitio de HincII. Después de la transformación de E. coli XL-1 Blue y la selección contra la kanamicina y la carbenicilina (50 \mug/ml de cada una) un clon ha sido escogido y el plásmido albergante se aisló. Este plásmido fue nombrado p2-21 y su identidad demostrada por medio del análisis de restricción. El p2-21 fue además digerido con KpnI y XbaI, un fragmento de 2,5 kb se aisló y se ligó a pKAS32 digerido por KpnI/XbaI. Este plásmido fue electroporado en E. coli CC 118 \lambdapir y los transformantes seleccionados a la kanamicina y la carbenicilina (50 \mug/ml cada una). Como se hizo antes, un clon fue escogido, su plásmido con el fragmento de ADN concordante en pKAS32, nombrado p2-22, aislado y confirmado por el análisis de restricción. El plásmido p2-22 fue electroporado en E. coli S17-1 \lambdapir y transferido en NCTC12023 de S. typhimurium (resistente a la estreptomicina) por combinación como se ha descrito previamente (de Lorenzo y Timmis, 1994). Los exconjugantes en los cuales el gen ssrA había sido reemplazado por el gen clonado afectado por la inserción del casete de aphT fue seleccionado para su crecimiento en placas de agar de un medio mínimo de glucosa M9 + l (Maloy et al., 1996) y su resistencia a la kanamicina y a la carbenicilina (100 \mug/ml). Los exconjugantes resultantes finalmente mostraron tener un fenotipo negativo de lactosa y ser sensibles a la kanamicina y a la estreptomicina. Los clones seleccionados fueron además examinados por análisis de Southern. Para excluir las posibles mutaciones que se podrían haber desarrollado durante el procedimiento de clonación el alelo de ssrA mutado fue transferido en un ambiente de Salmonella fresca por la transducción de P22 (descrito por Maloy et al., 1996). La cepa MvP284 resultante de Salmonella se examinó para la presencia del casete de resistencia dentro del gen del ssrA por el uso de los cebadores ssrAFor (5'- AAG GAA TTC AAC AGG CAA CTG GAG G-3') y ssrA-Rev (5- CTG CCC TCG CGA AAA TTA AGA TAA TA -3'). La amplificación de ADN de clones que contienen el alelo de ssrA de tipo natural resultó en un producto PCR de 2.800 bp, el uso de ADN de los clones que albergan un alelo del ssrA afectado por el casete de aphT resultó en un producto de PCR de 3.750 bp. La cepa MvP320 resultante de Salmonella se examinó para la presencia del casete de resistencia dentro del gen ssrB por el uso del análisis de hibridación Southern del ADN total de los exconjugantes.

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MvP320 mutante, ssrB. El gen ssrB (Fig. 12) fue subclonado del clon del fago \lambda1 de plásmido p1-6 derivado en un fragmento de 4,8 kb de amHI-PstI/B en pT7-Blue como se indicó en la Tabla 1. Un fragmento de 1,7 kb se recuperó después de la digestión de BamHI y HincII de p1-6 y subclonado en pBluescript II KS + digerido por BamHI/HincII. La construcción resultante nombrada p1-20 fue digerida con EcoRV y defosforilatada con fosfatasa alcalino. El casete de aphT se aisló como se describió anteriormente y ligado al plásmido linearizado p1-20 en la misma orientación en el único sitio de EcoRV. Después de la transformación de E. coli XL-1 Blue y la selección contra la kanamicina y la carbenicilina (50 \mug/ml de cada una) un clon ha sido escogido y el plásmido huésped se aisló. Este plásmido fue nombrado p1-21 y su identidad confirmada por análisis de restricción. El p1-21 fue además digerido con KpnI y XbaI, un fragmento de 2, 5 kb se aisló y ligó a pKAS32 digerido por KpnI/XbaI. Este plásmido fue electroporado en E. coli CC118 \lambdapir y las bacterias transformadas seleccionadas a la kanamicina y la carbenicilina (50 \mu g/ml de cada una) se realizaron. Como se hizo antes, un clon fue escogido, su plásmido con el fragmento de ADN concordante en pKAS32, nombrado p1-22, aislado y confirmado por análisis de restricción. El plásmido p 1-22 fue electroporado en E. coli E. S17-1 \lambdapir y transferido en NCTC12023 de S. typhimurium (resistente a la estreptomicina) por conjugación como se ha descrito previamente (de Lorenzo y Timmis, 1994). Los exconjugantes en los cuales el gen ssrB había sido reemplazado por el gen clonado desestabilizado por la inserción del casete de aphT fue seleccionado por su crecimiento en placas de agar de medio mínimo de glucosa M9 + (Maloy et al., 1996) y su resistencia a la kanamicina y a la carbenicilina (100 \mug/ml). Los exconjugantes resultantes mostraron finalmente que tienen un fenotipo negativo de lactosa y que son sensibles a la kanamicina y a la estreptomicina. Los clones seleccionados fueron además examinados por análisis del manchado de Southern. Para excluir las posibles mutaciones que se podrían haber desarrollado durante el procedimiento de clonación el alelo ssrB mutado se ha transferido en un ambiente de Salmonella fresca por la transducción de P22 (descrito por Maloy et al., 1996). El muestreo de los mutantes con una inserción del casete de aphT dentro del sitio del ssrB fue realizado por PCR usando los cebadores ssrB-For (5'- CTT AAT TTT CGC GAG GG -3') y ssrB-Rev (5'- GGA CGC CCC TGG TTA ATA -3'). La amplificación de ADN de clones que contienen el alelo de ssrB de tipo natural resultó en un producto PCR de 660 bp, el uso de ADN de los clones que albergan un alelo del ssrB desestabilizado por la inserción del casete de aphT resultó en un producto PCR de 1.600 bp. La cepa MvP320 resultante de Salmonella se examinó para la presencia del casete de resistencia dentro del gen ssrB por el uso del análisis de hibridación Southern del ADN total de los ex conjugantes.

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Construcción de la cepa mutante MvP340 que porta una deleción en marco en ssrA

Una deleción de 407 codones entre el codón 44 y el 451 de ssrB se generó. El plásmido p2-2 fue digerido por BamHI y KpnI, un fragmento de 3,7 kb fue recuperado y subclonado en pBluescript KS + para generar p2-50. El plásmido p2-50 fue linearizado por digestión con PstI el cual corta una vez dentro del fragmento del gen subclonado ssrA. Los cebadores ssrA-del-1 (5'-GGT CTG CAG GAT TTT TCA CGC ATC GCG TC -3') y ssrB-del-2 (5'-GGT CTG CAG AAC CAT TGA TAT ATA AGC TGC -3') fueron diseñados para introducir sitios PstI. PCR se realizó usando p2-50 linearizado como plantilla de ADN. La polimerasa TaqPlus (Stratagene) se usó según las instrucciones del fabricante. Las reacciones de volumen de 100 \mul fueron fijadas usando 10 \mul de tampón 10 x TaqPlus Precision que contiene cloruro de magnesio, 0,8 \mul de 100 nM de dNTPs, 250 ng de plantilla de ADN (linearizado p2-50), 250 ng de cada cebador y 5 U de polimerasa de ADN TaqPlus. PCR se realizó durante 35 ciclos a 95ºC durante 1 minuto, 60ºC durante 1 minuto, 72ºC durante 6 minutos. Entonces un paso final de 72ºC durante 10 minutos fue agregado. 10 \mul de la reacción PCR se analizaron. Un producto del tamaño esperado fue recuperado, digerido por PstI, autoligado, y la mezcla de la ligación fue usada para transformar E. coli DH5\alpha a la resistencia a la carbenicilina. Los plásmidos se aislaron de los transformantes y la integridad de la inserción y la deleción fueron analizadas por el análisis de restricción y la secuenciación de ADN. La inserción de una construcción confirmada se aisló después de la digestión con XbaI y KpnI y ligada al vector pKAS32 digerido por XbaI/KpnI. La construcción resultante fue usada para transformar E. coli S17-1 \lambdapir a la resistencia a la carbenicilina, y la transferencia conjugacional del plásmido a la S. typhimurium (NaI^{R}, Strep^{R}) se realizó según los procedimientos estándar (de Lorenzo y Timmis, 1994). Los exconjugantes que habían integrado el plásmido suicida por recombinación homóloga fueron seleccionados por la resistencia al ácido nadilíxico y a la carbenicilina, y protegidos para la sensibilidad a la estreptomicina. Tales clones fueron crecidos en LB a OD600 de aproximadamente 0,5 y los alícuotas se colocaron en placas LB que contienen 250 de \mug/ml de estreptomicina para seleccionar por colonias las cuales habían perdido el plásmido integrado y habían sufrido intercambio alélico. Los clones resistentes a la estreptomicina pero sensibles a la carbenicilina se usaron para el análisis ulterior. El filtrado de los mutantes con una deleción dentro del sitio de ssrA fue realizado por PCR usando los cebadores ssrA-F o (5'-AAG GAA TTC AAC AGG CAA CTG GAG G-3') y ssrA-Rev (5-CTG CCC TCG CGA AAA TTA AGA TAA TA -3'). La amplificación de clones de ADN que contienen el alelo ssrA de tipo natural resulto en un producto PCR de 2,800 bp, el uso de los clones de ADN que albergan un alelo ssrA con una deleción interna resultó en un producto PCR de 1.580 bp, La integridad de los clones que albergan la deleción de ssrA fue además confirmada por el análisis Southern del locus del ssrA. Finalmente, el locus del ssrA que contiene la deleción en marco interna se pasó a un ambiente de la cepa fresca de S. typhimurium por transducción de P22 (Maloy et al., 1996) y la cepa resultante se nombró MvP340.

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Hibridación Southern

El ADN genómico de la Salmonella se preparó ADN como se describió previamente (Hensel et al., 1997). Para el análisis de hibridación Southern, el ADN genómico fue digerido con EcoRI o EcoRV, fraccionado en 0,6% de geles de agarosa y transferido a las membranas Hybond N+ (Amersham, Braunschweig). Varias sondas que corresponden a la región ssrA y ssrB se obtuvieron como fragmentos de restricción de la inserción subclonada de \lambda1 y \lambda2.

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Ejemplo 9

Evaluación de la seguridad de la cepa MvP320 de S. typhimurium

Para los ensayos de la competencia entre el S. typhimurium de tipo natural y la cepa mutante MvP320, las bacterias fueron crecidas en LB a una densidad óptica a 600 nm de 0,4 - 0,6. Los cultivos se diluyeron y los alícuotas de las dos cultivos se mezclaron para formar un inóculo que contiene cantidades iguales de ambas cepas. La proporción de ambas cepas fue determinada por diluciones de revestimiento en placas de LB que contienen antibióticos selectivos para las cepas individuales. Un inóculo de aproximadamente 10^{4} unidades que forman colonia (cfu) fue usado para infectar los ratones BALB/c hembras viejas de 6 a 8 semanas (Charles River Breeders, Wiga) por inyección en la cavidad peritoneal. A varios puntos de tiempo después de la infección los ratones fueron sacrificados por dislocación cervical y la carga bacteriana del hígado y del bazo fue determinada por revestimiento de homogenatos del tejido usando el dispositivo de recubrimiento espiral "WASP" (Meintrup, Lähden). El plaqueo se realizó usando placas LB conteniendo 50 \mug/ml de kanamicina o 100 \mug/ml de ácido nadilíxico para seleccionar las cepas mutantes o el tipo natural, respectivamente.

La cepa MvP320 que alberga el casete de gen aphT en ssrB se recuperó en por lo menos en números 1.000 veces más bajos que la cepa del tipo natural de S. typhimurium. Estos datos indican que ssrB contribuye significativamente a las infecciones sistémicas de de S. typhimurium en el modelo de ratón de la salmonelosis.

Análisis estadístico de todos los experimentos

La importancia estadística entre las muestras apareadas fue determinada por la prueba t de Student. La importancia de los resultados obtenidos fue determinada usando el software statgraphic plus para Windows 2,0 (Statistical Graphic Corp.).

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Ejemplo 10

Caracterización del Promotor de P_{ssaE} inducible in vivo (Promotor B, Fig. 24 B)

El promotor el cual se localiza secuencia arriba del ssaE (P_{ssaE}, anteriormente nombrado Promotor B) fue mostrado para ser regulado por el locus del ssrAB. Un fragmento de ADN que comprende nucleótido 800 a 120 (800-1.205) en la secuencia incluida (Fig.21 A) fue mostrado para conferir regulación dependiente de ssrB sobre la expresión de un gen reportero (gfp) combinado al promotor. El fragmento de ADN fue clonado en un plásmido de copia baja delante del gen gfp. Como se ha mostrado previamente para otras construcciones de gen reportero, la inducción de la expresión de P_{ssaE} (800-1,205) se observó en un medio mínimo de magnesio (Deiwick et al., 1999) y fue dependiente en la presencia de un alelo de tipo natural cromosomal de ssrB. Un fragmento más corto de ADN, que comprende nucleótido 923 a 1205 (923-1,205) en la secuencia incluida, no confirió regulación en la expresión de gfp. Sin embargo, la expresión era reducida comparada al fragmento de P_{ssaE} (800-1205) el y no era inducida en el medio mínimo de magnesio ni era ello dependiente en ssrB. Así, el fragmento PssaE (800-1205) comprende al promotor activo y las secuencias reguladoras, probablemente incluyendo un sitio de unión SsrB.

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Descripción de los dibujos

Fig. 1. Mapa de la Isla 2 de la Patogenicidad de la Salmonella (A) que indica las posiciones de las mutaciones en las cepas MvP101, MvP102, y MvP103 (B). Un mapa de la restricción parcial de la región genómica se muestra, y las posiciones de las inserciones del plásmido pertinentes para este trabajo se indican (C). B, BamHI,; C, ClaI,; E, EcoRI,; P, PstI,; V, EcoRV,; S, SmaI; los números de acceso a la base de datos EMBL se indican para las secuencias en (A).

Fig. 2a. La alineación de la secuencia de aminoácido de SseB deducida a EspA de EPEC (Elliot et al., 1998). El algoritmo Clustal W del programa MacVector 6,0 fue usado para construir las alineaciones.. Los residuos de aminoácido similares se embalan, los residuos idénticos se embalan y se oscurecen.

Fig. 2b. La alineación de la secuencia de aminoácido SseC deducida a EspD de EPEC (Elliot et al., 1998), YopB de Yersinia enterocolitica (Hakansson et al., 1993), y PepB de Pseudomonas aeruinosa (Hauser et al., 1998). El algoritmo ClustaIW del programa MacVector 6.0 fue usado para construir las alineaciones. Las posiciones en donde por lo menos tres residuos de aminoácido son similares se embalan, en donde por lo menos tres residuos son idénticos se embalan y se oscurecen.

Fig. 3. La acumulación intracelular de los mutantes SP12 de S. typhimurium en macrófagos 264,7 de RAW. A continuación de la opsonización y la infección, los macrófagos fueron lisados y cultivados para la enumeración de las bacterias intracelulares (gentamicina protegida) a 2 horas y 16 horas después de la infección. Los valores mostrados representan el aumento de pliegue calculados como una proporción de las bacterias intracelulares entre las 2 horas y las 16 horas después de la infección. La infección se realizó en triplicado para cada cepa y el error estándar del promedio se muestra.

Fig. 4. La supervivencia intracelular y la repetición de la S. typhimurium mutante SP12 en (A) células J774.1 y (B) los periodatos sacados de macrófagos peritoneales de ratones C3H/HeN. Después de la opsonización y la internalización, los fagocitos fueron lisados y cultivados para la enumeración de las bacterias intracelulares viables en el tiempo de 0 horas. Los valores muestran la proporción de este inóculo intracelular al represente viable a 20 horas \pm el error estándar del promedio. Las muestras se procesaron en triplicado, y cada experimento fue realizado por lo menos dos veces.

Fig. 5. Los anticuerpos específicos \beta-gal en los lavados intestinales de los ratones oralmente inmunizados con o MvP101[pAH97], MvP103 [pAH97], SL7207 [pAH97] o MvP101 al día 52 después de la inmunización. Los resultados se expresan como el porcentaje de la subclase Ig total correspondiente presente en el lavado intestinal, el SEM es indicado por líneas verticales. Niveles significantes de antígeno IgM específico no pudieron ser detectados en cualquiera de los grupos. Los resultados obtenidos con MvP103 y SL7207 (no mostrados)fueron similares a aquéllos para MvP101.

Fig. 6. La respuesta proliferativa específica \beta-gal de las células del bazo enriquecidas CD4+ de ratones oralmente inmunizados con o MvP101 [pAH97], MvP103 [pAH97], SL7207 [pAH97] o MvP101. Las células fueron reestimuladas in vitro durante una incubación al día 4 con diferentes concentraciones de \beta-gal soluble. Los valores se expresan como cpm promedio de triplicados; el SEM fue en todos los casos menor que el 10%. Los valores del ambiente obtenidos de los sanos sin el antígeno estimulante se sustrajeron. Los resultados obtenidos con MvP103 y SL7207 (no mostrados) eran similares a aquéllos obtenidos con MvP101.

Fig. 7. IFN-\gamma presente en los sobrenadantes de las células del bazo CD4+ enriquecido de los ratones oralmente inmunizados con o MvP101 [pAH97], MvP103 [pAH97], SL7207 [pAH97] o MvP101 sin plásmido al día 2 y 4 de cultivo. Las células del bazo de los ratones se aislaron al día 52 después de la inmunización, y las poblaciones de CD4+ enriquecidas fueron reestimuladas in vitro durante cuatro días en presencia de \beta-gal soluble (20 \mug/ml). La producción de IFN-\gamma fue determinada por ELISA, los resultados representan los promedios de tres determinaciones. El SEM es indicado por líneas verticales, resultados similares se obtuvieron usando cualquiera de los portadores sin plásmido (no mostrados). Ninguna diferencia significante con los grupos de control se observó cuando IL- 2, IL-4, IL-5, IL-6 y IL-10 se probaron (no mostrados).

Fig. 8. Cinética de IgG del suero \beta-gal específico (símbolos cerrados) y las respuestas anticuerpo IgM (símbolos abiertos) en ratones (n = 5) después de la inmunización oral con o MvP101 [pAH97] (triángulo), MvP103 [pAH97] (círculo), SL7207 [pAH97] (cuadrado) o MvP101 sin plásmido (diamante). Los resultados se expresan como el log2 recíproco del promedio geométrico del punto extremo del título (GMT), el SEM fue en todos los casos menor que el 10%. Resultados similares se obtuvieron usando cualquiera de los portadores sin plásmido (no mostrado), las inmunizaciones son indicadas por flechas.

Fig. 9. Perfiles de las subclases de los anticuerpos IgG \beta-gal específicos presentes en el suero de los ratones (n = 5) oralmente inmunizados con o MvP101 [pAH97], MvP103 [pAH97], SL7207 [pAH97] o MvP101 sin plásmido al día 52 después de la inmunización. Los resultados se expresaron como ng/ml, el SEM es indicado por líneas verticales. Resultados similares se obtuvieron usando cualquiera de los portadores sin plásmido (no mostrados).

Fig. 10. Reconocimiento del epítope \betaGP1 restringido por CPH de clase I por linfocitos cebados in vivo en ratones por vacunación oral con o MvP101 [pAH97], MvP103 [pAH97], SL7207 [pAH97] o MvP101 sin plásmido. Las células del bazo de los ratones inmunizados fueron reestimuladas in vitro cinco días en presencia de 20 \muM de \betaGP1. Al final del cultivo, los linfocitos se probaron en un ensayo de liberación de [^{3}H]-timidina usando P815 (símbolos abiertos) y P815 cargado de \betaGP1 (símbolos cerrados) como blancos. Los resultados son valores promedio de sanos triplicados (uno fuera de tres experimentos independientes se muestra) y fueron expresados como: [(cpm retenido en l ausencia de efectores) - (cpm retenido experimentalmente en presencia de efectores)/cpm retenido en ausencia de efectores] x 100; SEM fueron más bajos que el 5% de los valores. Resultados similares se obtuvieron usando cualquiera de los portadores sin plásmido (no mostrados).

Fig. 11. Expresión de una fusión de sseA::luc en cepas mTn5 de tipo natural y mutantes de S typhimurium.

Fig. 12. Mapa de la Isla 2 de Patogenicidad de la Salmonella (A) que indica las posiciones de las mutaciones en las cepas MvP284 y MvP320 (B). Un mapa de restricción parcial de la región genómica se muestra, y la posición de las inserciones de plásmidos pertinentes para este trabajo se indica (C). B, BamHI; C, ClaI; H, HindIII; P, PstI; V; S, SmaI; EcoRV; II, HincII.

Fig. 13. Modelo para la organización transcripcional de los genes de virulencia SPI2. Este modelo está basado en la observación de la dirección transcripcional de los genes SPI2, caracterización de las actividades del promotor.

Fig. 14 muestra el principio de cómo las mutaciones que tienen una calidad diferente de atenuación pueden generarse. Como es mostrado en A, la desactivación de un gen efector como sse resulta en un grado bajo de atenuación. Como es mostrado en B, la desactivación adicional de un gen localizado fuera del locus de SPI2 como aroA resulta un grado mediano de atenuación. Por la mutación insercional con un efecto polar todos los genes en un grupo policistrónico son afectados lo cual resulta en un grado alto de atenuación, como es mostrado en C. Como es mostrado en D, la desactivación de un gen regulador tal como ssrB resulta en una atenuación suprema.

Fig. 15 muestra el principio de la mutación insercional por el ejemplo de la mutación insercional en un gen de virulencia. Casetes diferentes tales como SMC, GEC, TC y/o el casete de invertasa pueden ser insertados en un gen de virulencia clonado, produciendo así un gen de virulencia desactivado el cual puede introducirse en una célula por recombinación homóloga usando un casete de gen de virulencia.

Fig. 16 ilustra el casete marcador selectivo.

Fig. 17 ilustra el casete de expresión de gen y la inducción del mismo en un sistema de dos fases. El casete de expresión de gen comprende un promotor, opcionalmente un casete de gen que comprenden una o más unidades de expresión y opcionalmente uno o más terminadores transcripcionales para las unidades de la expresión y/o una secuencia 5' transcrita al casete de expresión de gen.

Fig. 18 muestra los requisitos estructurales de la unidad de expresión de gen para la entrega de antígenos heterólogos en varios compartimientos, es decir, secuencias accesorias que dirigen la selección del producto de la
expresión.

Fig. 19 muestra un casete transactivador en un sistema de una fase y en un sistema de dos fases.

Fig. 20 muestra los modos diferentes de expresión del gen como realizados por la combinación de secuencias accesorias diferentes y/o casetes en un sistema de una fase y en un sistema de dos fases.

Fig. 21 A muestra la secuencia genómica de una región del locus de SPI2 de Salmonella que comprende las secuencias completas de los genes ssaE a ssal y las secuencias parciales de ssaD y ssaJ (cf. Fig. 12).

Fig. 21 B muestra la secuencia de nucleótidos de una región del locus de SPI2 de la Salmonella que comprende las secuencias codificadas para el ssrA y ssrB.

Figs. 22 A-Q muestran cada una la secuencia nucleótida del gen respectivo indicado.

Figs. 23 A-Q muestran cada una la secuencia de aminoácido del polipéptido respectivo indicado.

Figs. 24 A, B muestran cada una, una secuencia nucleótida comprendiendo un promotor inducible in vivo.

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Listado de secuencias

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1000

1001

1002

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Referencias citadas en la descripción Este listado de referencias citadas por el solicitante tiene como único fin la conveniencia del lector. No forma parte del documento de la Patente Europea. Aunque se ha puesto gran cuidado en la compilación de las referencias, no pueden excluirse errores u omisiones y la OEP rechaza cualquier responsabilidad en este sentido. Documentos de patentes citados en la descripción

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\vskip0.400000\baselineskip

<211> 216

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Salmonella

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> exón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(213)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0.7cm

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 228

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Salmonella

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> exón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(225)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0.8cm

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 249

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Salmonella

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> exón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(246)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\hskip0.7cm

28

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 750

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Salmonella

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> exón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(747)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\hskip0.7cm

29

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2763

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Salmonella

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> exón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(2760)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\hskip0.7cm

30

\hskip0.7cm

31

\hskip0.7cm

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 639

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Salmonella

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> exón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(636)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0.8cm

33

\hskip0.6cm

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 388

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Salmonella

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0.7cm

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 262

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Salmonella

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0.7cm

36

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 192

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> EPEC

\vskip0.400000\baselineskip

<300>

\vskip0.400000\baselineskip

<303> Mol. Microbiol.

\vskip0.400000\baselineskip

<304> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<306> 1-4

\vskip0.400000\baselineskip

<307> 1998

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0.7cm

37

\hskip0.6cm

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 380

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> EPEC

\vskip0.400000\baselineskip

<300>

\vskip0.400000\baselineskip

<303> Mol. Microbiol.

\vskip0.400000\baselineskip

<304> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<306> 1-4

\vskip0.400000\baselineskip

<307> 1998

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0.7cm

39

\hskip0.7cm

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 401

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Yersinia enterocolitica

\vskip0.400000\baselineskip

<300>

\vskip0.400000\baselineskip

<301> Hakansson, S. Schesser, K. Persson, C. Galyov, E. E. Rosqvist, R. Homble, F. Wolf Watz, H.

\vskip0.400000\baselineskip

<303> EMBO J.

\vskip0.400000\baselineskip

<304> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<306> 5812-5823

\vskip0.400000\baselineskip

<307> 1996

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0.7cm

41

\hskip0.7cm

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 390

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pseudomonas aeruginosa

\vskip0.400000\baselineskip

<300>

\vskip0.400000\baselineskip

<301> Hauser, A. R. Fleiszig, S. Kang, P. J. Mostov, K. Engel, J. N.

\vskip0.400000\baselineskip

<303> Infect. Immun.

\vskip0.400000\baselineskip

<304> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<306> 1413-1420

\vskip0.400000\baselineskip

<307> 1998

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0.7cm

43

\hskip0.7cm

44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Precursor

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tttttacgtg aagcggggtg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Precursor

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggcattagcg gatgtctgac tg

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Precursor

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caccaggaac cattttctct gg

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Precursor

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cagcgatgac gatattcgac aag

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Precursor

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaaatcccgc agaaatg

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Precursor

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaggcgataa tataaac

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Precursor

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agagatgtat tagatac

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Precursor

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcaataagag tatcaac

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Precursor

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gctaagcttc ggctcaaatt gtttggaaaa c

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Precursor

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gctaagctta gagatgtatt agatacc

\hfill

27

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Precursor

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

attggatccg caagcgtcca gaa

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Precursor

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tatggatcct cagattaagc gcg

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Precursor

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atagaattcg gagggagatg gagtggaag

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Precursor

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atagaattcg aagataaagc gattgccgac

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Precursor

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaaggatcca ctccatctcc ctc

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Precursor

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaaggatcca tttgctctat ttcttgc

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Precursor

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atgggatccg agattcgcca gaatgcgcaa

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Precursor

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atgggatcca ctggcataaa cggtttccgg

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Precursor

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

attggatcct gacgtaaatc attatca

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Precursor

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

attggatcct taagcaataa gtgaatc

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Precursor

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaggaattca acaggcaact ggagg

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Precursor

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctgccctcgc gaaaattaag ataata

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Precursor

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cttatttttc gcgaggg

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Precursor

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggacgcccct ggttaata

\hfill

18

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Precursor

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtctgcagg atttttcacg catcgcgtc

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Precursor

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\hskip0,7cm

45

\hskip0,7cm

46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

LISTADO DE SECUENCIAS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<110> Creatogen Biosciences GmbH

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Sistema portador para vacunas

\vskip0.400000\baselineskip

<130> 19130pwo sistema portador

\vskip0.400000\baselineskip

<140> PCT/EP99/06514

\vskip0.400000\baselineskip

<141> 1999-09-03

\vskip0.400000\baselineskip

<150> EP 98116827.1

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 1998-09-04

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn Ver. 2.1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8457

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Salmonella

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

47

\hskip0,7cm

48

\hskip0,7cm

49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3921

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Salmonella

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

50

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 327

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Salmonella

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(324)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\hskip0,7cm

51

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 108

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Salmonella

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\hskip0,7cm

52

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 591

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Salmonella

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(588)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

53

\hskip0,5cm

54

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 196

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Salmonella

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,6cm

55

\hskip0,6cm

56

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1455

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Salmonella

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1452)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

57

\hskip0,7cm

58

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 484

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Salmonella

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

59

\hskip0,7cm

60

\hskip0,7cm

61

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 504

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Salmonella

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(501)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

62

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 167

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Salmonella

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

63

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 195

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Salmonella

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

64

\hskip0,7cm

65

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 417

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Salmonella

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(414)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

66

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 138

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Salmonella

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

67

\hskip0,7cm

68

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 789

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Salmonella

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(786)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\hskip0,7cm

69

\hskip0,7cm

70

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 262

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Salmonella

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

71

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 690

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Salmonella

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(687)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

72

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 229

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Salmonella

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

73

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 474

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Salmonella

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(471)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

74

\hskip0,7cm

75

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 157

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Salmonella

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

76

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 435

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Salmonella

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1) .. (432)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

77

\hskip0,7cm

78

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 144

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Salmonella

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

79

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1212

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Salmonella

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1209)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

80

\hskip0,7cm

81

\hskip0,7cm

82

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 403

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Salmonella

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

83

\hskip0,7cm

84

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 243

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Salmonella

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(240)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

85

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 80

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Salmonella

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

86

\hskip0,7cm

87

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 216

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Salmonella

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(213)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

88

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 71

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Salmonella

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

89

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 228

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Salmonella

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(225)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

90

\hskip0,7cm

91

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 75

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Salmonella

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

92

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 249

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Salmonella

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(246)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

93

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 82

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Salmonella

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

94

\hskip0,6cm

95

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 750

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Salmonella

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(747)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

96

\hskip0,7cm

97

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 249

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Salmonella

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\hskip0,7cm

98

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2763

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Salmonella

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(2760)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\hskip0,7cm

99

\hskip0,7cm

100

\hskip0,7cm

101

\hskip0,7cm

102

\hskip0,7cm

103

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 920

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Salmonella

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

104

\hskip0,7cm

105

\hskip0,7cm

106

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 639

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Salmonella

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(636)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

107

\hskip0,5cm

108

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 212

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Salmonella

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

109

\hskip0,5cm

110

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 388

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Salmonella

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

111

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 262

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Salmonella

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\hskip0,8cm

112

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 192

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> EPEC

\vskip0.400000\baselineskip

<300>

\vskip0.400000\baselineskip

<303> Mol. Microbiol.

\vskip0.400000\baselineskip

<304> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<306> 1-4

\vskip0.400000\baselineskip

<307> 1998

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\hskip0,5cm

113

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 380

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> EPEC

\vskip0.400000\baselineskip

<300>

\vskip0.400000\baselineskip

<303> Mol. Microbiol.

\vskip0.400000\baselineskip

<304> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<306> 1-4

\vskip0.400000\baselineskip

<307> 1998

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

114

\hskip0,7cm

115

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 401

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Yersinia enterocolitica

\vskip0.400000\baselineskip

<300>

\vskip0.400000\baselineskip

<301> Hakansson, S.

{}\hskip1cm Schesser, K.

{}\hskip1cm Persson, C.

{}\hskip1cm Galyov, E. E.

{}\hskip1cm Rosqvist, R.

{}\hskip1cm Homble, F.

{}\hskip1cm Wolf Watz, H.

\vskip0.400000\baselineskip

<303> EMBO J.

\vskip0.400000\baselineskip

<304> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<306> 5812-5823

\vskip0.400000\baselineskip

<307> 1996

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

116

\hskip0,7cm

117

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 390

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pseudomonas aeruginosa

\vskip0.400000\baselineskip

<300>

\vskip0.400000\baselineskip

<301> Hauser, A. R.

{}\hskip1cm Fleiszig, S

{}\hskip1cm Kang, P. J.

{}\hskip1cm Mostov, K.

{}\hskip1cm Engel, J. N.

\vskip0.400000\baselineskip

<303> Infect. Immun.

\vskip0.400000\baselineskip

<304> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<306> 1413-1420

\vskip0.400000\baselineskip

<307> 1998

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,6cm

118

\hskip0,7cm

119

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Precursor

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tttttacgtg aagcggggtg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Precursor

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggcattagcg gatgtctgac tg

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Precursor

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caccaggaac cattttctct gg

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Precursor

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cagcgatgac gatattcgac aag

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Precursor

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaaatcccgc agaaatg

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Precursor

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaggcgataa tataaac

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Precursor

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agagatgtat tagatac

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Precursor

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcaataagag tatcaac

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Precursor

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gctaagcttc ggctcaaatt gtttggaaaa c

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Precursor

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gctaagctta gagatgtatt agatacc

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Precursor

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

attggatccg caagcgtcca gaa

\hfill

23

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<210> 55

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<211> 23

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Precursor

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<400> 55

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tatggatcct cagattaagc gcg

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23

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<210> 56

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<211> 29

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Precursor

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<400> 56

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\hskip-.1em\dddseqskip

atagaattcg gagggagatg gagtggaag

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29

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<210> 57

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<211> 30

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Precursor

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atagaattcg aagataaagc gattgccgac

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30

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<210> 58

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Precursor

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gaaggatcca ctccatctcc ctc

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23

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<210> 59

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Precursor

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gaaggatcca tttgctctat ttcttgc

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27

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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atgggatccg agattcgcca gaatgcgcaa

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30

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<210> 61

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<211> 30

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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atgggatcca ctggcataaa cggtttccgg

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<210> 62

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<211> 27

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Precursor

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<400> 62

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attggatcct gacgtaaatc attatca

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27

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<210> 63

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<211> 27

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Precursor

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<400> 63

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attggatcct taagcaataa gtgaatc

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27

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Precursor

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<400> 64

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aaggaattca acaggcaact ggagg

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25

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<210> 65

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<211> 26

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Precursor

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ctgccctcgc gaaaattaag ataata

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26

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<211> 17

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Precursor

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cttatttttc gcgaggg

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17

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<211> 18

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Precursor

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<400> 67

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ggacgcccct ggttaata

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18

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<210> 68

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Precursor

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<400> 68

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ggtctgcagg atttttcacg catcgcgtc

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29

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<210> 69

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<211> 30

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Precursor

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<400> 69

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ggtctgcaga accattgata tataagctgc

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30

Claims (28)

1. Un portador para la presentación de un antígeno a un huésped cuyo portador es una célula gram-negativa atenuada que comprende el locus SPI2 del gen, en donde por lo menos uno de los genes efectores sseA de, sseC, el sseD, sseE, sseF y sseG es desactivado y/o en donde el gen chaperón sscB es desactivado y/o en donde por lo menos uno de los genes del aparato de secreción ssaE, ssaG y ssaH es desactivado y en donde dicha desactivación resulta en una atenuación/reducción de la virulencia comparada al tipo natural de dichas células, en donde la célula comprende por lo menos una molécula heteróloga de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para dicho antígeno, en donde dicha célula es capaz de expresar la molécula de ácido nucleico o capaz de causar la expresión de la molécula de ácido nucleico en una célula seleccionada.

2. La célula gram-negativa atenuada según la reivindicación 1, en donde dicha célula es una célula enterobacteriana, en particular, una célula de Salmonella, una célula de Shigella o una célula de Vibrio.

3. La célula según la reivindicación 1 ó 2, en donde por lo menos un gen adicional localizado fuera del locus de SP12 es desactivada, en donde la desactivación produce una atenuación/reducción adicional de virulencia comparada al tipo natural.

4. La célula según la reivindicación 3, en donde dicho gen adicional comprende un gen aro, particularmente el aroA.

5. El portador según cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 4, en donde dicha molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para un antígeno de una bacteria o antígeno viral o a un antígeno de tumor, preferentemente para un antígeno de Helicobacter pylori, Chlamydia pneumoniae, Borrelia burgdMLAeri, Nanobacteria, Hepatitis virus, virus de papiloma humano o virus Herpes.

6. El portador según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicha molécula de ácido nucleico es insertada en el locus de SPI2.

7. El portador según la reivindicación 6, en donde dicha molécula de ácido nucleico es insertada en un gen sse, particularmente en el gen sseC, sseD y sseE.

8. El portador según cualquiera de las Reivindicaciones precedentes, en donde dicha inserción es una inserción no polar.

9. El portador según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicha molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para por lo menos un polipéptido o un péptido que seleccionan y/o un dominio inmunoestimulador.

10. El portador según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicha molécula de ácido nucleico codifica para una proteína de fusión.

11. Un portador para la presentación de un antígeno a un huésped, en donde dicho portador es una célula gram-negativa atenuada que comprende al locus de SPI2, caracterizado por una falta de por lo menos un polipéptido SPI2, en donde ducha falta resulta en una atenuación/reducción de la virulencia comparado al tipo natural de dicha célula, además caracterizado por la presencia de por lo menos un péptido heterólogo o polipéptido con propiedades inmunogénicas.

12. Una composición farmacéutica, que comprende como agente activo una vacuna viviente protectora inmunológicamente, la cual es una portadora según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, opcionalmente junto con diluentes, portadores y/o adyuvantes aceptables farmacéuticamente.

13. La composición según la reivindicación 12 la cual es conveniente para la administración a una superficie mucosa o por medio de la ruta parenteral.

14. Un método para la preparación de una vacuna viviente, que comprende el suministro de una célula gram-negativa viviente que comprende el locus de SPI2 y que desactiva por lo menos un gen del locus de SPI2 para obtener una célula gram-negativa atenuada, que además comprende por lo menos una inserción de una molécula de ácido nucleico heterólogo que codifica para un antígeno para obtener un portador según cualquiera de una de las reivindicaciones 1 a 11, opcionalmente junto con diluentes, portadores y/o adyuvantes aceptables farmacéuticamente.

15. Un método para la detección de un portador según cualquiera de una de las reivindicaciones 1 a 11, que comprende proporcionar una muestra que contiene dicha célula y detectar la desactivación de un gen seleccionado de cualquiera de sseA, sseC, sseD, sseE, sseF, sseG, sscB, ssaE, ssaG y ssaH cuya desactivación no está presente en el tipo natural.

\newpage

16. Un método para establecer una biblioteca de portadores atenuados para la presentación de un antígeno a un huésped, que comprende obtener por lo menos a dos portadores según cualquiera de una de las reivindicaciones 1 a 11, que determina (a) la patogenicidad de dichas células y la relación de la patogenicidad de dichas células, y (b) que determina el efecto de dicha presentación del antígeno en dicho portador y que determina la relación de los efectos causados por dichas células.

17. El método de la reivindicación 16, en donde el efecto de la presentación del antígeno está determinada en el nivel humoral, celular y/o mucoso.

18. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 16 ó 17 que además comprende determinar la immunogenicidad de dichas células y determinar la relación de la immunogenicidad de dichas células, en donde dicha determinación opcionalmente es una determinación de la inmunogenicidad humoral, celular y/o mucosa.

19. El uso de un portador según cualquiera de una de las reivindicaciones 1 a 11 para la preparación de un fármaco para el tratamiento preventivo o terapéutico de una enfermedad aguda o crónica causada esencialmente por una bacteria o virus o para la preparación de un fármaco para el tratamiento preventivo o terapéutico de un tumor.

20. El uso de una molécula de ácido nucleico o un vector, que comprende una secuencia de ácido nucleico

a)

de la secuencia de ácido nucleico de una de las Figs. 21 A, B,

b)

de un alelo de la secuencia de ácido nucleico de una de las Figs. 21 A, B, o

c)

de una secuencia de ácido nucleico la cual bajo condiciones severas hibridizan con la secuencia de ácido nucleico de una de las Figs. 21 A, B, para la preparación de un portador para la presentación de un antígeno a un huésped como se definió en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

21. El uso según la reivindicación 20, en donde dicha secuencia de ácido nucleico comprende

a)

la secuencia de ácido nucleico de una de las Figs. 22 A-Q,

b)

una secuencia de ácido nucleico que corresponde a la secuencia de ácido nucleico de una de las Figs. 22 A-Q, dentro de la degeneración del código genético, o

c)

de una secuencia de ácido nucleico que bajo condiciones severas hibridiza con la secuencia de ácido nucleico de una de las Figs. 22 A-Q.

22. El uso según la reivindicación 20 ó 21, en donde por lo menos una región codificadora de dicha molécula de ácido nucleico se suprime funcionalmente.

23. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 20 ó 22, en donde dicha molécula de ácido nucleico tiene insertado por lo menos un casete de inserción para la inserción mediada por transposón o fago.

24. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, en donde por lo menos una molécula de ácido nucleico heteróloga que codifica para un polipéptido o péptido es insertada o suprimida-insertada en dicha molécula de ácido nucleico, en donde dicha molécula de ácido nucleico heterólogo preferentemente codifica para un antígeno bacteriano o viral u homologo de los mismos.

25. El uso según la reivindicación 24, en donde dicha molécula de ácido nucleico heterólogo comprende por lo menos un casete de expresión de un gen, opcionalmente con por lo menos un casete transactivador, un casete marcador selectivo, un casete de invertasa o combinación de los mismos.

26. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 25, en donde dicha molécula de ácido nucleico heterólogo comprende por lo menos una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido o péptido seleccionado y/o un dominio immunoestimulante.

27. El uso del locus SPI2 de Salmonella para la preparación de un portador para la presentación de un antígeno a un huésped como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

28. El uso de un locus de gen de virulencia de una célula gram-negativa para la preparación de un portador para la presentación de un antígeno a un huésped como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.