ES2286905T3 - Sistema de estabilizacion de plasmidos para el suministro de antigenos. - Google Patents
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Abstract
Vector de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que codifica: un origen de replicación que confiere un número medio de copias que está comprendido entre 2 y 75, seleccionado de entre el grupo que consiste en: oriE1 (SEC ID nº.1), ori101 (SEC ID nº.3), ori15A (SEC ID nº.2) y sus derivados, y que está flanqueado en ambos extremos por terminadores de la transcripción; por lo menos una función de exterminio post-segregacional, seleccionada de entre el grupo que consiste en asd, ssb, phd-doc, kis-kid, y hok-sok, en la que la transcripción de flanqueo de los lugares que rodean dicha por lo menos una función post-segregacional es divergente y no perturbará significativamente los niveles de transcripción de tipo salvaje; y por lo menos una función de reparto seleccionada de entre el grupo que consiste en el lugar par de pSC101 y el parA de pR1, en la que la transcripción de flanqueo transcurre alejándose de dicha por lo menos una función de reparto; y un promotor ompC que comprende lasiguiente secuencia: AGATCX1X2TAAX3CATCCACAGGAGGATATCTGATG (SEC ID nº: 36), en la que X1 se selecciona de entre el grupo que consiste en G, C y A; X2 es un inserto que tiene de 1 a 5 nucleótidos; y X3 se selecciona de entre el grupo que consiste en A, T, G y C.
Description
Sistema de estabilización de plásmidos para el
suministro de antígenos.
La presente invención se refiere generalmente a
plásmidos de expresión estabilizados mediante un Sistema de
Estabilización de Plásmidos (según se define en la presente memoria)
capaz de expresar una proteína o péptido, tal como un antígeno para
uso en una vacuna vectorial viva, y a métodos para obtener y usar
los plásmidos estabilizados. La invención optimiza la
estabilización de plásmidos de expresión a dos niveles
independientes: (1) eliminando la dependencia única de sistemas de
estabilización letales equilibrados catalíticos; y (2) incorporando
un sistema de reparto de plásmidos para evitar la segregación al
azar de plásmidos de expresión, potenciando de ese modo la herencia
y estabilidad.
La patente US nº 4.760.022 (Molin et al.)
describe un vector de expresión que comprende elementos parA y
parB, los cuales se afirma que son función de reparto que permiten
una distribución ordenada de las moléculas del plásmido en la
división celular.
Kim et al. (1996) J. Fermentation and
Bioengineering, 82, 495-497, describe un número de
plásmidos que comprende un lugar par del plásmido pSC101. Estos
plásmidos se estabilizan cuando se suprime la transcripción del
promotor P_{L}, pero se pierden rápidamente cuando se activa la
transcripción.
Las vacunas de vectores vivos bacterianos
suministran antígenos a un sistema inmunitario de un hospedante
expresando los antígenos a partir de material genético contenido
dentro del vector vivo bacteriano. El material genético es
típicamente un replicón, tal como un plásmido. Los antígenos pueden
incluir una amplia variedad de proteínas y/o péptidos de origen
bacteriano, vírico, parasitario o de otro origen.
Entre los vectores vivos bacterianos actualmente
en investigación se encuentran los patógenos entéricos atenuados
(por ejemplo, Salmonella typhi, Shigella, Vibrio Cholerae),
comensales (por ejemplo, Lactobacillus, Streptococcus
gordonii) y cepas de vacunas autorizadas (por ejemplo, BCG).
S. typhi es una cepa particularmente atractiva para la
vacunación de seres humanos.
S. typhi es un vector vivo bien tolerado
que puede suministrar múltiples antígenos inmunógenos no
relacionados al sistema inmunitario de los seres humanos. Se ha
demostrado que los vectores vivos de S. typhi provocan
anticuerpos y una respuesta inmunitaria celular a un antígeno
expresado. Los ejemplos de antígenos suministrados con éxito
mediante S. typhi incluyen el fragmento C no toxigénico pero
muy inmunógeno de la toxina del tétano, y la proteína de la
circumsporozoita de la malaria procedente de Plasmodium
falciparum.
S. typhi se caracteriza por vías
entéricas de infección, una cualidad que permite el suministro oral
de la vacuna. S. typhi también infecta monocitos y
macrófagos, y por lo tanto puede dirigir antígenos como dianas a
APC profesionales.
La expresión de un antígeno mediante S.
typhi generalmente requiere la incorporación de un plásmido
recombinante que codifica el antígeno. En consecuencia, la
estabilidad del plásmido es un factor clave en el desarrollo de
vacunas de S. typhi atenuadas de alta calidad con la
capacidad para expresar consistentemente antígenos extraños.
Los candidatos a vacunas de S. typhi
atenuadas para uso en seres humanos deberían presentar por lo menos
dos mutaciones bien separadas y bien definidas que provocasen
independientemente la atenuación, puesto que la ocasión para la
inversión in vivo de tales mutantes dobles sería
insignificante. El candidato a vacuna atenuada CVD 908 de S.
typhi presenta tales propiedades. CVD 908 contiene dos
mutaciones de supresión no reversibles dentro de los genes
aroC y aroD. Estos dos genes codifican enzimas
críticas en la ruta biosintética que conduce a la síntesis de
corismato, el precursor clave requerido para la síntesis de los
aminoácidos aromáticos fenilalanina, tirosina y triptófano. El
corismato también se requiere para la síntesis del ácido
p-aminobenzoico; después de su conversión a tetrahidrofolato,
el ácido p-aminobenzoico se convierte en los nucleótidos
purínicos ATP y GTP.
Las células bacterianas sin plásmidos tienden a
acumularse más rápidamente que las células que tienen plásmidos.
Una razón para este aumento de tasa de acumulación es que la
transcripción y la traducción de genes plasmídicos impone una carga
metabólica que ralentiza el crecimiento celular y da a las células
sin plásmidos una ventaja competitiva. Además, algunas veces los
productos génicos de plásmidos extraños son tóxicos para la célula
hospedante.
\newpage
Es deseable la herencia estable de plásmidos en
el campo de vacunas de vectores vivos bacterianos atenuadas, para
asegurar la producción con éxito y continua de antígenos, así como
en operaciones con biorreactores comerciales, a fin de evitar que
el biorreactor sea ocupado por células sin plásmidos.
La herencia estable de un plásmido requiere
generalmente que: (1) el plásmido se deba replicar una vez cada
generación, (2) las desviaciones del número de copias se deben de
corregir rápidamente antes de la división celular, y (3) con la
división celular, los productos de la replicación plasmídica se
deben de distribuir a ambas células hijas.
Aunque la integración cromosómica de genes
extraños aumenta la estabilidad de tales secuencias, las
manipulaciones genéticas implicadas pueden ser difíciles, y la
caída en el número de copias del gen heterólogo a menudo da como
resultado la producción de niveles insuficientes de antígeno
heterólogo para asegurar una respuesta inmunitaria óptima. La
introducción de genes heterólogos en plásmidos de múltiples copias
mantenidos dentro de una cepa de vector vivo es una solución
natural al problema del número de copias; la manipulación genética
de tales plásmidos para la expresión controlada de tales genes
heterólogos es sencilla. Sin embargo, los plásmidos resultantes
pueden hacerse inestables in vivo, dando como resultado la
pérdida de estos genes extraños.
En la naturaleza, los plásmidos bacterianos a
menudo se mantienen de forma estable, incluso aunque estén presentes
habitualmente en números de copias muy bajos. La herencia estable
de plásmidos de bajo número de copias de origen natural puede
depender de la presencia de ciertos sistemas genéticos que evitan
activamente la aparición de una progenie libre de plásmidos. En
Jensen et al. Molecular Microbiol.
17:205-210, 1995 se pueden encontrar un repaso
reciente de sistemas de estabilización de plásmidos.
Un medio para estabilizar plásmidos es
proporcionar un gen de resistencia a antibióticos en el plásmido, y
hacer crecer las células en medios enriquecidos con antibióticos.
Sin embargo, este método es objeto de un número de dificultades. El
enfoque de la resistencia a antibióticos es caro, requiriendo el uso
de antibióticos costosos y, quizás de forma más importante, el uso
de antibióticos en conjunción con la administración in vivo
de vectores de vacunas está actualmente descartado por la U.S. Food
and Drug Administration.
En aplicaciones de producción a gran escala, el
uso de antibióticos puede imponer otras limitaciones. Con respecto
a biorreactores comerciales, los mecanismos de resistencia a
antibióticos pueden degradar el antibiótico y permitir que persista
en el cultivo una población sustancial de células sin plásmidos.
Tales células sin plásmidos no son productivas, y disminuyen el
rendimiento del biorreactor.
Por lo tanto, existe en la técnica la necesidad
de un sistema de estabilización de plásmidos diseñado especialmente
para uso en vacunas de vectores vivos bacterianos que no descanse
sobre la resistencia a antibióticos, y preferentemente que también
sea útil en aplicaciones con biorreactores comerciales.
Los plásmidos estables de bajo número de copias
emplean una función de reparto que distribuye activamente las
copias de plásmidos entre las células hijas. Las funciones de
reparto ejemplares incluyen, sin limitación, sistemas de pSC101, el
factor F, el profago P1, y los plásmidos de resistencia a fármacos
IncFII. Tales funciones se denominan en la presente memoria como
funciones "SEG".
Las funciones de estabilización de plásmidos de
PSK de origen natural emplean típicamente un sistema de dos
componentes de toxina-antitoxina, y generalmente
funcionan según lo siguiente: el plásmido codifica tanto una toxina
como una antitoxina. Las antitoxinas son menos estables que las
toxinas, que tienden a ser bastante estables. En una célula hija
sin plásmidos, ya no se producen las toxinas y las antitoxinas; sin
embargo, las antitoxinas menos estables se degradan rápidamente,
liberando de ese modo a la toxina para que mate a la célula.
Las toxinas generalmente son proteínas pequeñas,
y las antitoxinas son proteínas pequeñas (sistemas proteicos tales
como phd-doc) o ARN antisentido, que se unen
a ARNm que codifican la toxina, evitando su síntesis (sistemas
antisentido tales como hok-sok).
Los sistemas letales equilibrados, discutidos
más abajo en la Sección 1.2.7.3, son un ejemplo de una función de
PSK artificial.
En funciones de PSK proteicas, tanto la toxina
como la antitoxina son sintetizadas a partir de operones en las que
el gen que codifica la antitoxina está en dirección 5' del gen que
codifica la toxina. Estos operones autorregulan los niveles de
transcripción, y la síntesis de las proteínas codificadas está
acoplada traduccionalmente. La antitoxina generalmente se sintetiza
en exceso para asegurar que se bloquea la acción de la toxina. Las
antitoxinas inestables se degradan constantemente por proteasas
codificadas por el hospedante, requiriendo la síntesis constante de
antitoxina para proteger la célula. Con la pérdida del plásmido, ya
no se producen antitoxinas, y las antitoxinas existentes se
degradan rápidamente, permitiendo que la toxina mate a la célula
del hospedante.
El sistema phd-doc es un
ejemplo de una función de PSK proteica. El sistema
phd-doc se produce naturalmente dentro del
bacteriófago P1 que existe en células infectadas y que raramente
provoca la lisis, el cual lisogeniza Escherichia coli, como
un plásmido de \sim100 kb. Este lugar de estabilización codifica
dos proteínas pequeñas: la proteína Doc tóxica de 126 aminoácidos
provoca la muerte con la maduración del plásmido, mediante un
mecanismo desconocido, y la antitoxina Phd de 73 aminoácidos evita
la muerte del hospedante, presumiblemente uniéndose y bloqueando la
acción de Doc.
Phd y Doc están codificadas por un único
transcrito en el que el codón de partida ATG del gen doc en
dirección 3' solapa mediante una base al codón de parada TGA del
gen phd en dirección 5'. Por lo tanto, la expresión de estas
dos proteínas está acoplada de forma traduccional, excediendo la
síntesis de Phd la síntesis de la proteína Doc tóxica.
Además, la transcripción de este operón está
autorregulada a nivel de la transcripción mediante la unión de un
complejo proteínico Phd-Doc a un sitio que bloquea
el acceso de ARN polimerasa al promotor del operón a medida que las
concentraciones de ambas proteínas alcanzan un nivel crítico. Aunque
Doc parece que es relativamente resistente al ataque proteolítico,
Phd es muy susceptible a la escisión. El mecanismo de PSK de un
lugar phd-doc codificado por plásmidos es
activado por lo tanto cuando las bacterias pierden espontáneamente
este plásmido residente, conduciendo a la degradación de la
antitoxina Phd y a la activación subsiguiente de la toxina Doc que
provoca la muerte
celular.
celular.
En sistemas de estabilización antisentido, las
antitoxinas son ARN antisentido que inhiben la traducción de ARNm
que codifican la toxina. Al igual que los péptidos de la antitoxina,
los ARN antisentido son menos estables que el ARNm que codifica la
toxina. La pérdida del plásmido permite que se degraden las
antitoxinas existentes, permitiendo de ese modo la síntesis de la
toxina que mata a la célula del hospedante.
Un ejemplo de un sistema de estabilización
antisentido es el sistema hok-sok, codificado
por el lugar parB del plásmido R1. El sistema comprende tres
genes: hok, sok y mok.
Hok es una proteína asociada a membrana que daña
irreversiblemente la membrana celular, matando a las células del
hospedante. La expresión de Hok a partir de ARNm de hok
conduce a una pérdida del potencial de la membrana celular, a la
detención de la respiración, a cambios en la morfología celular, y a
la muerte celular.
El gen sok codifica un ARN que actúa en
trans, el cual bloquea la traducción de ARNm de hok, evitando
de este modo que Hok mate las células del hospedante. El ARN de
sok es menos estable que el ARNm de hok, y es
expresado a partir de un promotor relativamente débil. (Gerdes et
al. Annu. Rev. Genet., 31:1-31, 1997).
El mecanismo mediante el cual el ARN de sok bloquea la
traducción de Hok en células que contienen plásmidos se puso de
manifiesto sólo después de la identificación de mok
(modulación de la muerte), un tercer gen en el lugar de
parB. El marco de lectura abierta de mok solapa con
hok, y es necesario para la expresión y regulación de la
traducción de hok.
El ARN antisentido de hok forma un dúplex
con el extremo 5' del mensaje mok-hok,
haciendo inaccesible a ribosomas el sitio de unión a ribosomas de
mok, y promoviendo la escisión mediante ARNasa III y la
degradación del ARNm. En ausencia de la traducción de mok,
hok no se expresa a partir del mensaje intacto, incluso
aunque su propio sitio de unión a ribosoma no esté directamente
oscurecido por ARN de sok.
Cuando se forma una célula libre de plásmidos,
el ARN inestable de sok decae mucho más rápidamente que el
mensaje mok-hok estable. Cuando se pierde la
protección dada por sok, Mok y Hok son traducidos, y la
célula muere.
Una limitación del sistema
hok-sok es que puede surgir un número
significativo de células sin plásmidos cuando el sistema
hok-sok es inactivado por mutaciones dentro
del marco de lectura abierta de Hok.
En un sistema letal equilibrado (una función de
PSK), se suprime del cromosoma bacteriano un gen cromosómico que
codifica una proteína estructural esencial o una enzima, o se muta
de forma que el gen ya no puede operar. El gen dañado o eliminado
se sustituye entonces por un plásmido que comprende un gen
completamente operativo. La pérdida del plásmido da como resultado
una insuficiencia de la proteína esencial, y la muerte de la célula
sin plásmidos.
Se ha empleado con éxito un sistema letal
equilibrado en S. typhimurium basado en la expresión del gen
asd que codifica aspartato
\beta-semialdehído deshidrogenasa (Asd). Asd es
una enzima crítica implicada en la síntesis de
L-aspártico-\beta-semialdehído,
que es un precursor esencial para la síntesis de los aminoácidos
L-treonina (y L-isoleucina),
L-metionina, y L-lisina, así como
ácido diaminopimélico, un componente estructural clave esencial
para la formación de la pared celular en bacterias
Gram-negativas. La pérdida de plásmidos que
codifican Asd sería letal para cualquier bacteria capaz de
sintetizar Asd a partir del ribosoma, y daría como resultado la
lisis de la bacteria debido a una incapacidad para ensamblar
correctamente la capa de peptidoglicano de esta pared celular.
El sistema asd (una función de PSK) se ha
empleado con éxito en cepas de vectores vivos a base de S.
typhimurium atenuadas, para la inmunización de ratones con una
variedad de antígenos procariotas y eucariotas, incluyendo
antígenos diversos tales como el fragmento C de la toxina del tétano
dextoxificada y la enterotoxina LT, péptidos víricos de la
hepatitis B sintéticos, y antígenos específicos de gametos tales
como el antígeno SP10 del esperma humano.
La inmunización de la mucosa murina con estas
cepas de vectores vivos ha provocado respuestas inmunitarias
significativas que implican respuestas de IgG sérica e IgA secretora
en las superficies de la mucosa.
El sistema asd se ha introducido
recientemente en cepas de vacunas atenuadas de Salmonella
typhi, en un intento por incrementar la estabilidad de
plásmidos que expresan péptidos víricos de hepatitis B sintéticos.
Sin embargo, cuando se inmunizaron voluntarios con estas cepas de
vectores vivos, no se detectó ninguna respuesta inmunitaria al
antígeno extraño.
En realidad, hasta la fecha, muy pocos informes
han documentado una respuesta inmunitaria a la expresión, a base de
plásmidos, de un antígeno extraño a partir de plásmidos
estabilizados tras la vacunación de seres humanos con un vector
vivo atenuado de S. typhi. En un informe, la cepa Ty21a de la
vacuna se hizo auxotrófica para tiamina seleccionando, en presencia
de trimetoprima, una mutación indefinida en el gen thyA, que
codifica timidilato sintetasa.
Aunque en algunos casos el fracaso de las cepas
de vectores vivos puede haber resultado de la sobreatenuación de la
propia cepa, parece probable que los sistemas actuales de exterminio
para plásmidos sufren limitaciones adicionales. En aquellas
situaciones en las que se ha inactivado la copia cromosómica del
gen, más que eliminado, es posible la restauración de la copia
cromosómica vía recombinación homóloga con la copia génica portada
por el plásmido, si la cepa bacteriana utilizada es hábil en la
recombinación.
Los sistemas letales equilibrados, basados en la
producción de enzimas catalíticas, son el objeto de un número de
deficiencias importantes. En particular, puesto que la
complementación de la supresión del gen cromosómico requiere sólo
una única copia génica, es inherentemente difícil mantener más de
unas pocas copias de un plásmido de expresión. La cepa hospedante
sin plásmidos se debe de hacer crecer en medios especiales para
complementar químicamente la deficiencia metabólica existente.
Además, las células sin plásmidos también se
pueden beneficiar de efectos de "alimentación cruzada" cuando
un factor de crecimiento difusible es el limitante del
crecimiento.
Por lo tanto, existe la necesidad en la técnica
de un Sistema de Estabilización de Plásmidos que no solamente
dependa de un sistema letal equilibrado, particularmente para uso en
vacunas de vectores vivos bacterianos.
Según un primer aspecto de la presente
invención, se proporciona un vector de expresión que comprende una
secuencia nucleotídica que codifica:
- un origen de replicación que confiere un número medio de copias que se encuentra entre 2 y 75, seleccionado de entre el grupo que consiste en: oriE1 (SEC ID nº.1), ori101 (SEC ID nº.3), ori15A (SEC ID nº.2) y sus derivados, y que está flanqueado en ambos extremos mediante terminadores de la transcripción;
- por lo menos una función de exterminio post-segregacional seleccionada de entre el grupo que consiste en asd, ssb, phd-doc, kis-kid, y hok-sok, en la que la transcripción de flanqueo a partir de los lugares que rodean dicha por lo menos una función post-segregacional es divergente y no perturbará significativamente los niveles de transcripción de tipo salvaje; y
- por lo menos una función de reparto seleccionada de entre el grupo que consiste en el lugar par de pSC101 y el parA de pR1, en la que la transcripción de flanqueo avanza lejos de dicha por lo menos una función de reparto; y
- un promotor ompC que comprende la siguiente secuencia: AGATCX^{1}X^{2}TAAX^{3}CATCCACAGGAGGATA TCTGATG (SEC ID nº: 36), en la que X^{1} se selecciona de entre el grupo que consiste en G, C y A; X^{2} es un inserto que tiene de 1 a 5 nucleótidos; y X^{3} se selecciona de entre el grupo que consiste en A, T, G y C.
Según un segundo aspecto de la presente
invención, se proporcionan un vector de expresión que comprende una
secuencia nucleotídica que codifica: un vector de expresión que
comprende una secuencia nucleotídica que codifica:
- un origen de casete de replicación que comprende: una secuencia nucleotídica que codifica un origen de replicación que confiere un número medio de copias que está entre 2 y 75, seleccionado de entre el grupo que consiste en: oriE1 (SEC ID nº.1), ori101 (SEC ID nº.3), ori15A (SEC ID nº.2) y sus derivados; un primer sitio de escisión mediante enzima de restricción único, localizado 5' de la secuencia nucleotídica que codifica el origen de la replicación; y un segundo sitio de escisión mediante enzima de restricción único, localizado 3' de la secuencia nucleotídica que codifica el origen de la replicación;
- por lo menos un casete de exterminio post-segregacional que comprende: una secuencia nucleotídica que codifica por lo menos una función de exterminio post-segregacional seleccionada de entre el grupo que consiste en asd, ssb, phd-doc, kis-kid, y hok-sok; un primer sitio de escisión mediante enzima de restricción único, localizado 5' de la secuencia nucleotídica que codifica dicha por lo menos una función de exterminio post-segregacional, y un segundo sitio de escisión mediante enzima de restricción único, localizado 3' de la secuencia nucleotídica que codifica por lo menos una función de exterminio post-segregacional;
- por lo menos un casete de reparto que comprende: (i) una secuencia nucleotídica que codifica por lo menos una función de reparto seleccionada de entre el grupo que consiste en el lugar par de pSC101 y el parA de pR1; un primer sitio de escisión mediante enzima de restricción único, localizado 5' de la secuencia nucleotídica que codifica dicha por lo menos una función de reparto, y un segundo sitio de escisión mediante enzima de restricción único, localizado 3' de la secuencia nucleotídica que codifica dicha por lo menos una función de reparto; y
- un casete de expresión que comprende (i) una secuencia nucleotídica que codifica un promotor ompC que comprende la siguiente secuencia: AGATCX^{1}X^{2}TAAX^{3}CATCCACAGGAGGATATCTGATG (SEC ID nº: 36), en la que X^{1} se selecciona de entre el grupo que consiste en G, C y A; X^{2} es un inserto que tiene de 1 a 5 nucleótidos; y X^{3} se selecciona de entre el grupo que consiste en A, T, G y C, (ii) un primer sitio de escisión mediante enzima de restricción único, localizado 5' de la secuencia nucleotídica que codifica el promotor, y (iii) un segundo sitio de escisión mediante enzima de restricción único, localizado 3' de la secuencia nucleotídica que codifica el promotor.
Según un tercer aspecto de la presente
invención, se proporciona una célula que comprende un vector de
expresión según los aspectos primero o segundo de la invención.
Como un cuarto aspecto de la presente invención,
se proporciona una vacuna de vector bacteriano atenuada viva, para
uso en un método para provocar una respuesta inmunitaria en un
sujeto, en el que la vacuna de vector bacteriano atenuada viva
comprende una célula según el tercer aspecto de la invención.
Según un quinto aspecto de la presente
invención, se proporciona un método para obtener una vacuna de
vector bacteriano atenuada viva, que comprende transformar una cepa
bacteriana con un vector de expresión según el aspecto primero o
segundo de la invención.
En un aspecto particular, el plásmido de
expresión estabilizado se emplea en una vacuna de vector vivo de
Salmonella typhi, tal como la cepa CVD 908-htrA.
La estabilización de plásmidos de expresión se
optimiza a dos niveles independientes: (1) eliminando la dependencia
única de sistemas de estabilización letales equilibrados; y (2)
incorporando un sistema de reparto de plásmidos para evitar la
segregación al azar de plásmidos de expresión, potenciando de ese
modo su herencia y estabilidad. El plásmido de expresión
estabilizado se puede manipular recombinantemente mediante
ingeniería genética para expresar uno o más antígenos,
preferentemente uno o más antígenos de la toxina 2 de Shiga (Stx2) o
sus homólogos sustanciales, tales como los pentámeros de la
subunidad de la toxina de Shiga o una Stx 2 destoxificada
genéticamente.
El plásmido de expresión estabilizado comprende
preferentemente una o más funciones de estabilización de plásmidos
no catalíticas.
Se describen plásmidos de expresión que
comprenden un Sistema de Estabilización de Plásmidos, que comprende
por lo menos una función de PSK y por lo menos una función de SEG.
Por ejemplo, el Sistema de Estabilización de Plásmidos puede
comprender un Sistema de Estabilización de Plásmidos de dos
componentes que comprende una función de PSK y una función de SEG.
Como alternativa, el Sistema de Estabilización de Plásmidos puede
comprender un Sistema de Estabilización de Plásmidos de tres
componentes, que comprende una función de PSK, una función de SEG y
otra PSK. En una alternativa preferida, el Sistema de Estabilización
de Plásmidos comprende hok-sok + par
+ parA + phd-doc; en el que cualquiera
de las funciones expuestas
\hbox{se puede sustituir por un homólogo sustancial de la misma.}
Los Sistemas de Estabilización de Plásmidos se
pueden incorporar en plásmidos de expresión de múltiples copias que
codifican una o más proteínas o péptidos de interés. Tales plásmidos
de expresión de múltiples copias producen un efecto de dosificación
génica que potencia el nivel de expresión de la proteína o del
péptido de interés. Cuando el Sistema de Estabilización de
Plásmidos se emplea en una vacuna de vector viva bacteriana, la
proteína o péptido de interés es uno o más antígenos extraños.
En un aspecto, el plásmido de expresión es un
plásmido de expresión de vacuna que comprende un Sistema de
Estabilización de Plásmidos y por lo menos un antígeno, por ejemplo
por lo menos un antígeno de la toxina 2 de Shiga (Stx2) y/o un
homólogo sustancial del mismo. Cuando el antígeno es un antígeno de
la toxina 2 de Shiga, el antígeno de la toxina 2 de Shiga puede
ser, por ejemplo, un pentámero de la subunidad B o una Stx 2
destoxificada genéticamente.
Se describen además plásmidos de expresión que
comprenden un Sistema de Estabilización de Plásmidos que incorpora
el sistema letal equilibrado ssb, y el lugar ssb del
vector vivo bacteriano se ha inactivado usando un vector suicida
que comprende un origen de replicación sensible a la temperatura. En
un aspecto, el vector vivo bacteriano es S. typhi, y el
vector suicida se usa para inactivar el lugar ssb de S.
typhi. En un aspecto, el vector suicida es un derivado de
pSC101 que porta sacB, descrito en la presente memoria.
Se describe un Sistema de Estabilización de
Plásmidos que incorpora una función de PSK que implica un sistema
de adicción de plásmidos silenciosos, basado en mecanismos de
control de ARN antisentido que sólo sintetizan proteínas letales
después de que se ha producido la pérdida del plásmido.
El plásmido de expresión puede comprender una
serie de plásmidos de expresión, comprendiendo cada uno casetes
genéticos autocontenidos que codifican la expresión regulada de un
antígeno heterólogo, un origen de replicación, y un marcador
seleccionable para recuperar el plásmido.
El plásmido de expresión comprende un Sistema de
Estabilización de Plásmidos que incorpora una función de PSK basada
en el gen ssb. Se pueden incorporar en los plásmidos de
expresión alelos mutados, tales como ssb-1,
descritos en la presente memoria, para potenciar plásmidos de
mayores números de copias mediante la sobreexpresión de proteínas
similares a SSB1 para formar los tetrámeros biológicamente activos
requeridos de SSB.
El plásmido de expresión comprende un promotor.
El promotor es un promotor ompC modificado que tiene la
secuencia SEC ID nº. 36. El promotor inducible puede ser el promotor
P_{ompC1}, o P_{ompC3} mutado, descrito en la presente
memoria.
El plásmido de expresión puede comprender un
lugar de herencia (o de reparto) de plásmidos; un origen de
replicación seleccionado para proporcionar un número de copias que
estabilice eficazmente un antígeno dado; una función de PSK; y una
secuencia nucleotídica que codifica un antígeno y un promotor que
controla en último lugar la traducción del antígeno y tiene una
resistencia que se selecciona para mejorar la producción de
antígenos sin matar la célula.
También se describe un método para usar el
plásmido de expresión, que comprende transformar una célula
bacteriana usando dicho plásmido de expresión, y cultivar la célula
bacteriana para producir la proteína o péptido (por ejemplo, el
antígeno), y/o administrar dicha célula transformada o cultivo
celular a un sujeto. Cuando las células bacterianas transformadas
se administran a un sujeto, éstas se administran en una cantidad
necesaria para provocar una respuesta inmunitaria que confiera
inmunidad al sujeto frente a la proteína o péptido. El sujeto es
preferentemente un ser humano, pero también puede ser otro animal,
tal como un perro, un caballo, o un pollo.
El plásmido de expresión puede comprender por lo
menos tres casetes de expresión que funcionan independientemente,
en el que un casete codifica una proteína o péptido de interés, y
los casetes restantes codifican cada uno una Función de
Estabilización de Plásmidos diferente.
El plásmido de expresión puede codificar (1) un
antígeno de ensayo ligado operablemente a un promotor, y (2) un
Sistema de Estabilización de Plásmidos.
Se describe además un casete de expresión de un
antígeno de ensayo regulado, que opera de forma que, a medida que
aumenta la inducción de la expresión del antígeno, se produce una
carga metabólica sobre la bacteria que conduce fenotípicamente a la
inestabilidad del plásmido, es decir, se crea una ventaja selectiva
para todas las bacterias que pierden espontáneamente el plásmido
ofensivo. El antígeno de ensayo puede ser la proteína fluorescente
verde (GFPuv). El casete de expresión que codifica el antígeno de
ensayo puede comprender también un promotor inducible, tal como el
promotor ompC, situado de forma que el promotor inducible
conduzca en último lugar la traducción del antígeno de ensayo.
Se describe un método para obtener un plásmido
de expresión, que comprende sintetizar un plásmido de expresión que
comprende por lo menos 3 casetes de expresión que funcionan
independientemente, en el que un casete codifica una proteína o
péptido de interés, y los casetes restantes codifican cada uno una
Función de Estabilización de Plásmidos diferente.
Un método para identificar Sistemas de
Estabilización de Plásmidos puede comprender: proporcionar un casete
de expresión que codifique una proteína o péptido de interés, y por
lo menos otros dos casetes de expresión, que codifican cada uno y
que son capaces de expresar en el vector vivo bacteriano del
hospedante una Función de Estabilización de Plásmidos diferente;
insertar los tres casetes de expresión en un único plásmido de
expresión; transformar un vector vivo bacteriano con el único
plásmido de expresión; cultivar el vector vivo bacteriano
transformado, y determinar la velocidad de introducción de células
sin plásmidos en el cultivo.
Se describe una vacuna de vector vivo bacteriano
atenuada, que comprende un vector vivo bacteriano atenuado que se
ha transformado con un plásmido de expresión estabilizado que
comprende un Sistema de Estabilización de Plásmidos,
preferentemente un sistema de estabilización de plásmidos no
catalítico.
También se describe una vacuna de vector vivo
bacteriano atenuada, que comprende un vector vivo bacteriano
atenuado que se ha transformado con un plásmido de expresión que
comprende un Sistema de Estabilización de Plásmidos que incorpora
por lo menos un sistema de PSK y por lo menos un sistema de SEG. El
vector vivo bacteriano atenuado puede ser, por ejemplo, CVD
908-htrA de S. typhi.
Se describe además un método para vacunar un
sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad de una
vacuna de vector vivo bacteriano suficiente para provocar una
respuesta inmunitaria potenciada. También se describe un método
para evitar una enfermedad vacunando a un sujeto usando una cantidad
de tal vector vivo bacteriano suficiente para provocar una
respuesta inmunitaria protectora frente a uno o más patógenos de tal
enfermedad. El sujeto es preferentemente un ser humano, pero
también puede ser otro animal, tal como un caballo, una vaca o un
cerdo. Por ejemplo, se describe un método para evitar el síndrome
urémico hemolítico (HUS) provocado por Escherichia coli
enterohemorrágica productora de la toxina 2 de Shiga, administrando
a un sujeto una cantidad de un vector vivo bacteriano transformado
con un plásmido estabilizado que codifica por lo menos un antígeno
de la toxina 2 de Shiga.
Los Sistemas de Estabilización de Plásmidos se
pueden detectar en busca de la eficacia, comprendiendo el método:
proporcionar plásmidos de expresión que comprenden los Sistemas de
Estabilización de Plásmidos descritos en la presente memoria y que
codifican una proteína o péptido de interés, teniendo dichos
plásmidos de expresión números de copias que varían desde un número
pequeño de copias (por ejemplo, \sim5 copias por célula) a un
número medio de copias (por ejemplo, \sim15 copias por célula)
hasta un número elevado de copias (por ejemplo, \sim60 copias por
célula); transformar vectores vivos bacterianos con tales plásmidos
de expresión; y ensayar la velocidad de introducción de células sin
plásmidos y/o la velocidad de crecimiento de células que contienen
plásmidos. Los orígenes de replicación modificados pueden ser
orígenes de replicación procedentes de los plásmidos pSC101 (número
bajo de copias), pACYC184 (número medio de copias), y pAT153 (número
elevado de copias). Se pueden utilizar casetes de replicación de
plásmidos que funcionan independientemente, los cuales permiten
ensayar la eficacia de uno o más sistemas de estabilización de
plásmidos a medida que aumenta el número de copias.
Se describen plásmidos de expresión
estabilizados para uso en vectores vivos de S. typhi
atenuados, que contienen un marcador seleccionable que se puede
sustituir fácilmente por un lugar no resistente a fármacos o por un
gen que codifica un marcador de resistencia a fármacos aceptable,
tal como aph que codifica la resistencia a los
aminoglicósidos canamicina y neomicina.
Los Sistemas de Estabilización de Plásmidos
descritos en la presente memoria proporcionan estabilidad mejorada
a los plásmidos recombinantes, superando los problemas de la técnica
anterior de la inestabilidad de plásmidos, por ejemplo en usos en
biorreactores y en la vacunación de vectores vivos. Los plásmidos se
adecuan específicamente para aplicaciones de vacuna, aunque tales
plásmidos también son útiles en la producción a gran escala de
proteínas.
Los plásmidos son una mejora importante con
respecto a la técnica anterior, por cuanto superan los problemas
asociados con la ocupación sin plásmidos y con la inestabilidad de
plásmidos, y tienen una utilidad de amplio intervalo en campos
tales como la producción comercial de proteínas y la producción de
vacunas de vectores vivos bacterianos atenuadas.
Desde hace tiempo existe la necesidad de una
solución a los problemas de la ocupación sin plásmidos y de la
estabilidad de plásmidos asociados con el campo del suministro de
vacunas y de la producción de proteínas. La presente invención
resuelve esta necesidad largamente sentida.
La expresión "Sistema de Estabilización de
Plásmidos" ("PMS"), como se usa en la presente memoria, se
refiere a una secuencia nucleotídica que comprende por lo menos una
función de exterminio post-segregacional
("PSK") y por lo menos un sistema de reparto o de segregación
("SEG"), y que incluye opcionalmente cualquier otra Función de
Estabilización de Plásmidos.
La expresión "Función de Estabilización de
Plásmidos" se usa en la presente memoria para referirse a
cualquier función que potencie la estabilidad de los plásmidos
asociada con un PMS. La expresión incluye tanto secuencias
nucleotídicas de origen natural, que codifican funciones de
estabilización de plásmidos, así como secuencias nucleotídicas que
son sustancialmente homólogas a tales funciones de estabilización de
plásmidos de origen natural, y que retienen la función mostrada
mediante la función de estabilización de plásmidos de origen natural
correspondiente.
La expresión "Sistema de Exterminio
Post-Segregacional" (PSK) se usa en la presente
memoria para referirse a cualquier función que da como resultado la
muerte de cualquier célula bacteriana recientemente dividida que no
hereda el plásmido de interés, e incluye específicamente sistemas
letales equilibrados tales como asd o ssb, sistemas
proteicos tales como phd-doc, y sistemas
antisentido tales como hok-sok. La expresión
incluye secuencias nucleotídicas tanto de origen natural que
codifican tales PSK, así como también secuencias nucleotídicas que
son sustancialmente homólogas a tales secuencias nucleotídicas de
origen natural y que retienen la función exhibida por las
secuencias nucleotídicas de origen natural correspondientes.
La expresión "sustancialmente homóloga" o
"sustancialmente homólogo", en referencia a una secuencia
nucleotídica o secuencia de aminoácidos, indica que la secuencia de
aminoácidos tiene suficiente homología comparada con una secuencia
de referencia (por ejemplo, una secuencia nativa), para permitir que
la secuencia realice la misma función básica que la secuencia de
referencia correspondiente; una secuencia sustancialmente homóloga
es típicamente por lo menos aproximadamente 70 por ciento
secuencialmente idéntica según se compara con la secuencia de
referencia, típicamente por lo menos aproximadamente 85 por ciento
secuencialmente idéntica, preferentemente por lo menos
aproximadamente 95 por ciento secuencialmente idéntica, y más
preferentemente aproximadamente 96, 97, 98 o 99 por ciento
secuencialmente idéntica, según se compara con la secuencia de
referencia. Se apreciará que a lo largo de esta memoria descriptiva,
cuando se hace referencia a secuencias nucleotídicas específicas
y/o a secuencias de aminoácidos, que tales secuencias nucleotídicas
y/o secuencias de aminoácidos se pueden sustituir por secuencias
sustancialmente homólogas.
Las expresiones "Sistema de Segregación"
y/o "Sistema de Reparto" (ambas denominadas en la presente
memoria como "SEG") se usan de forma intercambiable en la
presente memoria para referirse a cualquier función que potencie la
estabilidad del plásmido y que opere para aumentar la frecuencia del
suministro exitoso de un plásmido a cada una de las células
bacterianas recientemente divididas, en comparación con la
frecuencia de suministro de un plásmido correspondiente sin tal
sistema de SEG. Los sistemas de SEG incluyen, por ejemplo, sistemas
de equirreparto, sistemas de reparto de sitios pares, y el lugar
par de pSC101. La expresión incluye tanto secuencias
nucleotídicas de origen natural que codifican tales sistemas de SEG,
así como secuencias nucleotídicas que son sustancialmente homólogas
a tales secuencias nucleotídicas de origen natural y que retienen
la función exhibida por las secuencias nucleotídicas de origen
natural correspondientes.
El término "destoxificada" se usa en la
presente memoria para describir una toxina que tiene una o más
mutaciones de punto que reducen significativamente la toxicidad de
la toxina en comparación con la toxina correspondiente sin tales
mutaciones de punto.
La expresión "inmunizantemente eficaz" se
usa en la presente memoria para referirse a una respuesta
inmunitaria que confiere memoria celular inmunológica al sujeto,
con el efecto de que una respuesta secundaria (a la misma o a una
toxina similar) se caracteriza por una o más de las siguientes
características: una fase más corta de desfase, en comparación con
la fase de desfase que resulta de la exposición correspondiente en
ausencia de inmunización; una producción de anticuerpo que continúa
durante un período más prolongado que la producción de anticuerpo
para una exposición correspondiente en ausencia de tal inmunización;
un cambio en el tipo y calidad de anticuerpo producido, en
comparación con el tipo y calidad de anticuerpo producido a partir
de tal exposición en ausencia de inmunización; un desplazamiento en
la respuesta de clase, apareciendo anticuerpos IgG en
concentraciones más elevadas, y con una persistencia mayor que IgM;
un aumento de la afinidad media (constante de unión) de los
anticuerpos por el antígeno, en comparación con la afinidad media de
anticuerpos por el antígeno a partir de tal exposición en ausencia
de inmunización; y/u otras características conocidas en la técnica
por caracterizar una respuesta inmunitaria secundaria.
Figuras 1A-1C: mapas genéticos
de plásmidos de expresión pGEN ejemplares (pGEN2, pGEN3 y pGEN4) de
la presente invención.
Figuras 2A-2D: mapas genéticos
de plásmidos de expresión ejemplares a base de oriE1 (pJN72, pJN51,
pJN10, y pJN12) de la presente invención.
Figuras 3A-H: histogramas de
citometría de flujo de fluorescencia de GFP para vectores de
expresión que portan CVD 908-htrA, con el
sistema de exterminio post-segregacional
hok-sok.
Figuras 4A-4D: secuencia
nucleotídica de pGEN2 completa (SEC ID nº. 1), que comprende los
nucleótidos 1-4196.
Figuras 5A-B: secuencia
nucleotídica de pGEN3 parcial (SEC ID nº. 2), que comprende los
nucleótidos 1201-2397, y que muestra la secuencia
de ori15A.
Figuras 6A-C: secuencia
nucleotídica de pGEN4 parcial (SEC ID nº. 3), que comprende los
nucleótidos 1201-3848, y que muestra la secuencia
de ori101.
Figuras 7A-7E: mapas genéticos
de plásmidos de expresión de pGEN ejemplares a base de ori15A
(pGEN91, pGEN111, pGEN121, pGEN193, y pGEN222) de la presente
invención.
Figuras 8A-C: histogramas de
citometría de flujo de la fluorescencia de GFP para plásmidos de
expresión pGEN91, pGEN111, pGEN121, pGEN193, y pGEN222.
Las vacunas de vectores vivos bacterianos
emplean un vector vivo bacteriano para expresar genes que codifican
antígenos protectores de patógenos bacterianos, víricos o
parasitarios. Los antígenos protectores bacterianos son
preferentemente no nativos al vector vivo bacteriano, es decir,
heterólogos. La vacuna del vector vivo bacteriano se administra a
un hospedante, exponiendo de ese modo los antígenos expresados al
sistema inmunitario del hospedante, provocando una respuesta
inmunitaria de carácter apropiado para conferir inmunidad al
hospedante.
A fin de lograr una inmunogenicidad potenciada,
los plásmidos que expresan tales antígenos protectores se deben
estabilizar. Según lo que se conoce, ningún Sistema de
Estabilización de Plásmidos a base de S. typhi actualmente
disponible aprovecha los mecanismos de reparto de origen natural
conocidos para mejorar la estabilidad de plásmidos de múltiples
copias en otras cepas.
Se describe un Sistema de Estabilización de
Plásmidos no catalítico para la estabilización de plásmidos de
expresión que codifican antígenos extraños en una cepa de vacuna de
vector vivo de S. typhi. La cepa de S. typhi puede
ser CVD 908-htrA. Se describen mejoras y/u optimizaciones de
la estabilización de plásmidos de expresión usando Sistemas de
Estabilización de Plásmidos que operan a dos niveles independientes:
(1) eliminar la dependencia única de sistemas de estabilización
letales equilibrados catalíticos; y (2) incorporar un sistema de
reparto de plásmidos que evitará la segregación al azar de los
plásmidos de expresión, potenciando de ese modo su herencia y
estabilidad. Una razón crítica para perseguir este enfoque
particular es que este método de mejora de la estabilización de
plásmidos no implica manipulaciones adicionales de la cepa del
vector vivo, y por lo tanto puede mejorar la inmunogenicidad de
antígenos heterólogos expresados dentro de cualquier cepa de vector
vivo.
El Sistema de Estabilización de Plásmidos no
catalítico descrito en la presente memoria mejora la estabilidad de
plásmidos de expresión de múltiples copias dentro de una vacuna de
vector vivo bacteriano, tal como CVD
908-htrA.
908-htrA.
La función de PSK de origen natural
hok-sok procedente del factor pR1 de
resistencia a antibióticos, o su homólogo sustancial, se puede
incorporar dentro de plásmidos de expresión de múltiples copias. El
sistema hok-sok es un sistema de adicción de
plásmidos silencioso, basado en mecanismos de control de ARN
antisentido que sólo dan como resultado la síntesis de proteínas
letales después de que se ha producido la pérdida de plásmidos.
Se describe además un sistema de estabilización
de plásmidos que comprende una función de PSK a base de
complementación, en el que el gen cromosómico ssb, que codifica la
proteína de unión monocatenaria no catalítica esencial (SSB)
requerida para la replicación del ADN, está específicamente
suprimido e insertado dentro de un plásmido de expresión de
múltiples copias.
También se describe un Sistema de Estabilización
de Plásmidos mejorado, que comprende un plásmido de expresión que
codifica por lo menos un lugar de SEG y por lo menos una función de
PSK.
Los antígenos heterólogos se pueden expresar
dentro de cepas de vectores vivos, tales como CVD 908-htrA,
a partir de genes que residen en plásmidos o integrados dentro del
cromosoma. Una técnica para integrar estos genes en el cromosoma
del hospedante implica el uso de "vectores suicidas" sensibles
a la temperatura, tales como pIB307, que contiene un origen de
replicación sensible a la temperatura procedente de pSC101
(ori101^{ts}). Se describe un vector suicida mejorado para
uso en CVD 908 y CVD 908-htrA, derivado de pIB307, que
permite una construcción más fácil de casetes de mutagénesis para
alterar el cromosoma del vector vivo.
La integración de estos vectores suicidas en el
cromosoma mediante recombinación homóloga resulta de la inactivación
por temperatura de la proteína de replicación del plásmido, RepA,
una proteína esencial para la función de ori101. La
resolución espontánea de los intermedios merodiploides inestables
resultantes se detecta mediante contraselección en busca de la
pérdida del gen sacB contenido en el vector suicida de la
resolución. El gen sacB contenido en todos los plásmidos
cortados codifica la enzima levanosacarasa, que es letal cuando se
expresa dentro del citoplasma de bacterias entéricas, incluyendo
S. typhi, que crecen en presencia de sacarosa. Puesto que se
seleccionan merodiploides de resolución incubando en presencia de
sacarosa al 10%, los plásmidos cortados exterminarán bacterias del
hospedante excepto que se curen espontáneamente.
Este sistema se usó con éxito para integrar un
casete de resistencia a canamicina en el lugar de
\squarearoC1019 de CVD 908. Sin embargo, estos
experimentos tuvieron éxito debido a que el gen que se movilizaba en
el cromosoma de S. typhi codificó un marcador de resistencia
a fármacos seleccionable. Usando estos vectores primitivos, la
sustitución del casete de resistencia a canamicina con un marcador
no seleccionable no tuvo éxito debido a que, aunque el marcador
entrante se pudo integrar en el cromosoma como un merodiploide, la
resolución del merodiploide para sustituir al gen de resistencia a
fármacos nunca se detectó.
Por lo tanto, se describe un método para usar
tales vectores suicidas para inactivar el lugar ssb de las
cepas de Salmonella typhi atenuadas, tales como CVD
908-htrA.
Esto permite que tales vectores suicidas
permitan la movilización eficaz de genes que expresan proteínas o
péptidos de interés, tales como antígenos heterólogos, en el
cromosoma de CVD 908-htrA de S. typhi, en dos etapas.
Por ejemplo, se introdujo un casete de
sacB-aph en el lugar de
\squarearoC1019, que entonces se seleccionó usando
canamicina. La generación de esta cepa de CVD
908-htrA\squarearoC1019:sacB-aph
de S. typhi produjo una cepa intermedia valiosa en la que,
en teoría, cualquier gen estructural se puede insertar eficazmente
en el lugar de aroC mediante intercambio de marcadores. El
gen sacB se usó como un marcador contraseleccionable
haciendo pasar merodiploides en presencia de sacarosa al 10%, para
seleccionar la sustitución del casete sacB-aph con
el casete de antígeno entrante, puesto que la resolución de
merodiploides en presencia de sacarosa dará como resultado la
pérdida del gen sacB, a fin de producir una progenie viable.
Esta cepa intermedia se empleó para integrar eficazmente el mutante
no toxigénico LT-K63 de la enterotoxina lábil al
calor de E. coli, crando CVD
908\squarearoC1019:LT-K63.
Aunque la integración cromosómica de genes
extraños confiere estabilidad a tales secuencias, las manipulaciones
genéticas implicadas pueden ser difíciles, y la caída en el número
de copias del gen heterólogo a menudo da como resultado la
producción de niveles insuficientes de antígeno heterólogo para
asegurar una respuesta inmunitaria
óptima.
óptima.
Por el contrario, la estabilidad del plásmido es
un fenómeno complejo que depende de múltiples factores, incluyendo
(1) el número de copias del plásmido; (2) la expresión
apropiadamente regulada de genes contenidos en el plásmido; y (3)
la presión selectiva para asegurar la segregación y herencia
apropiadas del plásmido.
Para asegurar la estabilidad, los plásmidos se
deben de replicar de manera regulada, para evitar que su número de
copias se eleve hasta niveles letales.
Además, los plásmidos se deben de segregar
durante la división de una bacteria en crecimiento, para asegurar
que cada célula hija reciba por lo menos una copia del plásmido. La
segregación puede ser un suceso pasivo, al azar, o un proceso
activo que implica la síntesis de nuevas proteínas que ayudan en la
segregación y herencia de plásmidos. La herencia con éxito de
plásmidos que se segregan al azar reside en un número
suficientemente elevado de copias de plásmidos distribuidos al azar
dentro de una bacteria que se divide, para garantizar virtualmente
la herencia de por lo menos un plásmido por cada célula hija.
Los vectores de clonación de plásmidos usados
habitualmente, que incluyen derivados de pBR322 de número medio de
copias y plásmidos de pUC de número elevado de copias, se heredan
mediante segregación al azar.
La segregación activa implica la síntesis de
proteínas que se propone que se unen a tales plásmidos y que se
coordinan después con las membranas de bacterias en división, para
asegurar que cada hija recibe por lo menos una copia del plásmido.
Los plásmidos que emplean tales sistemas de reparto activos son
típicamente plásmidos de números muy pequeños de copias, tales como
el factor de sexo F de E. coli, o los factores R de
resistencia a antibióticos, tales como pR1 y pRK2.
Se describe el uso de funciones de SEG de origen
natural para potenciar la herencia de plásmidos de expresión de
múltiples copias, que de otro modo se heredarían mediante
segregación al azar, para aumentar la estabilidad de estos
plásmidos.
También se usan otros sistemas genéticos de
origen natural, en los que las células hijas que no heredan con
éxito un plásmido de expresión serán exterminadas y eliminadas de la
población en crecimiento, es decir, funciones de PSK. La
incorporación de más de una categoría de función de estabilización
de plásmidos se denomina en la presente memoria como un Sistema de
Estabilización de Plásmidos. Por ejemplo, la incorporación de tanto
una función de SEG, tal como un lugar de reparto, como una función
de PSK, en un único plásmido de expresión, produce un Sistema de
Estabilización de Plásmidos.
Se debería señalar que un gen que confiere
resistencia a un antibiótico bactericida, tal como el gen aph
que codifica resistencia a canamicina y neomicina, también se
considera como una función de PSK, como lo es el sistema letal
equilibrado basado en asd.
Un método para asegurar la herencia de plásmidos
de expresión implica la construcción de un sistema de PSK o un
homólogo sustancial del mismo, denominado como sistema letal
equilibrado, para plásmidos que expresan antígenos heterólogos. En
un sistema letal equilibrado basado en plásmidos, los plásmidos que
se replican en el citoplasma de la bacteria expresan una proteína
crítica requerida por la bacteria para crecer y replicarse. La
pérdida de tales plásmidos elimina la capacidad de la bacteria para
expresar la proteína crítica, y da como resultado la muerte
celular.
El sistema asd se ha introducido
recientemente en cepas de vacunas de S. typhi atenuadas, en
un intento por aumentar la estabilidad de plásmidos que expresan
péptidos víricos de la hepatitis B sintéticos.
Sin embargo, cuando se inmunizaron voluntarios
con estas cepas de vectores vivos, no se detectó ninguna respuesta
inmunitaria al antígeno extraño. Veánse Tacket et al., Infection
and Immunity, 65:3381, 1997. En realidad, hasta la fecha, pocos
informes han documentado una respuesta inmunitaria a la expresión,
basada en plásmidos, de un gen extraño a partir de plásmidos
(estabilizados o de otro modo) tras la vacunación de seres humanos
con un vector vivo de S. typhi atenuado.
Aunque en algunos casos el fracaso de las cepas
del vector vivo pueden haber resultado de la sobreatenuación de la
propia cepa, la conclusión es que las funciones de PSK actualmente
usadas para plásmidos sufren limitaciones adicionales, en
particular limitaciones de segregación y limitaciones de la
actividad catalítica. Por lo tanto, se proporcionan plásmidos de
expresión mejorados que comprenden capacidades de segregación
potenciadas incorporando por lo menos un sistema de reparto junto
con por lo menos un sistema de PSK.
Una limitación de los sistemas de estabilización
de plásmidos, tales como la función asd (así como la función
thyA), es que no potencian la herencia de plásmidos
residentes, que continúan segregándose al azar con o sin la
presencia de la función asd. Por lo tanto, si los plásmidos
de expresión residentes, que portan los genes asd, son
inherentemente inestables, se perderán, independientemente del
requisito de la bacteria por Asd.
La estabilidad inherente de un plásmido de
expresión asd se puede definir haciendo crecer cepas que
tienen el plásmido en presencia de DAP, que elimina la presión
selectiva que asegura que todas las bacterias viables contienen el
plásmido de expresión. Si un plásmido dado es inherentemente
inestable, se perderá de la bacteria a una velocidad elevada, y
tales bacterias sin plásmido se lisarán en ausencia de suplementos
de crecimiento; el resultado global de este efecto será una
población de bacterias que crece mucho más lentamente que las cepas
inalteradas de tipo
salvaje.
salvaje.
Los plásmidos descritos en la presente memoria
tienen una estabilidad plasmídica mejorada incorporando una función
de SEG, tal como un lugar de reparto, o un homólogo sustancial de
una función de SEG, sobre el plásmido de expresión, para potenciar
la herencia de tales plásmidos mediante bacterias que se dividen
activamente. Los lugares de reparto están presentes de forma
natural en los plásmidos virulentos de S. typhi. Tinge y
Curtiss, Journal of Bacteriology, 172:5266, 1990, dieron a
conocer que tales lugares de reparto estaban bien conservados entre
plásmidos virulentos de S. typhimurium, y que, cuando se
introdujo un fragmento de restricción de 3,9 kb, que codifica este
lugar, sobre el plásmido de bajo número de copias pACYC184 (\sim15
copias por célula), la estabilidad del plásmido observada aumentó
desde 34% de células que contienen plásmido hasta 99% de células
que contienen plásmido, después de 50 generaciones. La secuencia
nucleotídica de este lugar se determinó más tarde por Cerin y
Hackett, Plasmid, 30:30, 1993, (Número de Acceso de GenBank
M97752).
Otra limitación potencial de una función de
estabilización de plásmidos, tal como la función asd (así
como el sistema thyA), es su dependencia de una enzima con
actividad catalítica. Dado que la complementación con sólo una
única copia del gen asd es suficiente para eliminar la
auxotrofía, no está claro por qué todas las copias de un plásmido
de múltiples copias deben de permanecer estables, especialmente si
codifican un antígeno heterólogo especialmente problemático que
inhibe el crecimiento de la bacteria.
Además, aunque los plásmidos de expresión de
mayores números de copias pueden expresar niveles apreciables de un
antígeno heterólogo dado in vitro, tales plásmidos puede que
no se mantengan en los números de copias esperados in vivo
debido a toxicidad, y de hecho pueden estar presentes en números de
copias mucho menores, que sería de esperar para reducir cualquier
respuesta inmunitaria observada específica para el gen heterólogo.
En consecuencia, la presente invención proporciona así plásmidos de
números bajos y medios de copias, estabilizados, para expresar
antígenos heterólogos.
La limitación potencial de la actividad
catalítica asociada con sistemas letales equilibrados se resuelve
en la presente memoria mediante el uso de plásmidos que expresan la
proteína de unión monocatenaria (SSB) procedente de S. typhi
para complementar en trans una mutación de otro modo letal
introducida en el gen ssb cromosómico. La bioquímica y los
papeles metabólicos de la proteína de SSB de E. coli se han
repasado ampliamente en Lohman et al., Annual Reviews in
Biochemistry 63:527, 1994 y en Chase et al., Annual
Reviews in Biochemistry 55:103, 1986.
SSB es una proteína no catalítica de 177
aminoácidos, con un peso molecular relativo de 19 kDa, que se une
con actividad elevada a ADN monocatenario (ADNss), y desempeña un
papel esencial como una proteína accesoria en la replicación,
recombinación y reparación del ADN. La forma biológicamente
relevante de SSB implicada en la unión a ADNss es un tetrámero, que
se une en dos modos a ADNss, asociándose íntimamente con una media
de 35 (modo de unión de SSB_{35}) o 65 bases (modo de unión de
SSB_{65}). Las condiciones específicas que controlan el modo de
unión preferido son complejas y dependen de la concentración
circundante de sales monovalentes y divalentes, del pH, y de la
temperatura, así como de la cantidad de proteína de SSB presente.
En condiciones dadas, concentraciones elevadas de SSB favorecen el
modo de unión de SSB_{35}, mientras que concentraciones más bajas
de SSB favorecen el modo de SSB_{65}. Sin embargo, se debe de
enfatizar que en ambos modos de unión, la conformación requerida de
SSB es un tetrámero.
Ahora se han caracterizado a nivel bioquímico,
fisiológico y nucleotídico las mutaciones de punto sensibles a la
temperatura que se producen espontáneamente dentro del gen
ssb; uno de tales mutantes, ssb-1,
contiene la mutación de punto His 55 a Tyr, y se ha encontrado que
es incapaz de ensamblarse correctamente en tetrámeros a
temperaturas no permisivas y a niveles de expresión naturales. Estas
cepas mutantes muestran defectos letales en la replicación y
recombinación del ADN, sensibles a la temperatura.
Las frecuencias de segregación de plásmidos que
portan ssb, que complementan mutaciones de ssb
cromosómicas en bacterias de E. coli, se examinaron por
Porter et al. Bio/Technology 8:47, 1990. Estos autores
observaron que, en experimentos que implican biorreactores, la
frecuencia de segregación en cepas que contienen plásmidos que
crecen en cultivo continuo en condiciones no selectivas durante 150
horas fue menor que 1 x 10^{-7}; esta frecuencia de segregación
fue independiente del número de copias, puesto que tanto los
plásmidos pACYC184 de menor número de copias como los plásmidos
pUC19 de número de copias muy elevado se estabilizaron a la misma
frecuencia. Sin embargo, se debe de señalar que los plásmidos
implicados expresaron sólo un marcador de resistencia a fármacos,
además de la proteína de SSB.
Se describe un sistema de estabilización de
plásmidos mejorado, que incorpora un lugar de reparto, tal como
aquel presente en pSC101, o un homólogo sustancial de tal lugar de
reparto, y también puede incorporar un sistema de reparto activo, o
un homólogo del mismo, tal como el descrito anteriormente para el
plásmido virulento de S. typhimurium.
La presente invención elimina la dependencia de
sistemas catalíticos para conferir estabilidad plasmídica. Se
pueden introducir, en los plásmidos de expresión, alelos mutados
similares a ssb-1, para potenciar plásmidos
de mayor número de copias mediante sobreexpresión de proteínas
similares a SSB1 para formar los tetrámeros de SSB biológicamente
activos requeridos. También se puede usar una función de PSK que
implica un sistema de adicción de plásmidos silencioso basado en
mecanismos de control de ARN antisentido, que sólo sintetizan
proteínas letales después de que se ha producido la pérdida del
plásmido.
Se describe además una serie de plásmidos de
expresión que se denominan en la presente memoria como plásmidos de
pGEN. Los plásmidos pGEN comprenden casetes genéticos autocontenidos
que codifican la expresión regulada de un antígeno heterólogo, un
origen de replicación, y un marcador seleccionable para recuperar el
plásmido. Esta serie de vectores se ha diseñado específicamente
para probar si cualquier Sistema de Estabilización de Plásmidos
puede incrementar la estabilidad de plásmidos, por ejemplo dentro de
un marco de vacuna de S. typhi
atenuada.
atenuada.
La estructura básica de estos vectores se
representa en la Figura 1, y la secuencia génica compuesta para el
vector pGEN 2 (SEC ID nº. 1) se representa en la Figura 4; las
Figuras 5 y 6 muestran secuencias compuestas específicas para los
orígenes de replicación en pGEN3 (SEC ID nº.2) y en pGEN4 (SEC ID
nº. 3), respectivamente.
Es crítico señalar que los plásmidos de pGEN se
diseñan para que comprendan 3 casetes genéticos que funcionan
independientemente. Estos casetes se han construido de forma que los
componentes individuales se pueden optimizar mediante sustitución,
según sea necesario. En consecuencia, además de los diversos
Sistemas de Estabilización de Plásmidos descritos en la presente
memoria, los casetes pueden probar otros sistemas prometedores ahora
en existencia, o que puedan estar disponibles en el futuro. Además,
el o los plásmidos optimizados se pueden adaptar para expresar
antígenos heterólogos protectores relevantes dentro de cepas de
vacunas atenuadas, para la inmunización de seres humanos.
Los plásmidos de pGEN proporcionan un casete de
expresión de antígenos de ensayo regulado, que opera de forma que
se aumenta la inducción de la expresión del antígeno, se añade una
carga metabólica sobre la bacteria que conduce fenotípicamente a la
inestabilidad plasmídica, es decir, se crea una ventaja selectiva
para todas las bacterias que pueden perder espontáneamente el
plásmido agresor. De este modo, se describe un plásmido
condicionalmente inestable que se puede examinar en busca de la
estabilidad, a medida que se incorporan sistemas de estabilización
de
plásmidos.
plásmidos.
En un modo preferido, el casete de expresión de
antígenos de ensayo regulado, contenido dentro de los plásmidos de
pGEN, comprende el promotor ompC inducible, o un homólogo
sustancial del mismo, que es el responsable de la expresión de una
proteína detectable, tal como la proteína fluorescente verde
optimizada en el codón (GFPuv, disponible de Clontech), cuya
sobreexpresión es tóxica para E. coli y S. typhi.
También se describe una serie de replicones
plasmídicos que tienen números de copias que varían desde un número
bajo de copias (es decir, \sim1 hasta \sim10, preferentemente
\sim5 copias por célula) hasta un número medio de copias (es
decir, \sim11 hasta \sim25, preferentemente \sim15 copias por
célula) hasta un número elevado de copias (es decir, \sim26 hasta
\sim100, preferentemente \sim60 copias por célula). Para lograr
esto, se han modificado orígenes de replicación procedentes de los
plásmidos bien caracterizados pSC101, pACYC184, y pAT153), usando
técnicas de reacción en cadena de polimerasa (PCR), para crear
casetes de replicación plasmídica que funcionan independientemente.
Estos casetes de replicación permiten ensayar la eficacia de un
sistema de estabilización de plásmidos, a medida que aumenta el
número de copias.
También se describen plásmidos de expresión
seleccionables, para uso en vectores vivos de S. typhi
atenuados. Estos plásmidos de expresión contienen un marcador
seleccionable que se pueden sustituir, en último lugar, por un
lugar no resistente a fármacos, tal como ssb, o por un gen
que codifica un marcador de resistencia a fármacos aceptable, tal
como aph que codifica resistencia a los aminoglicósidos
canamicina y neomicina.
Para lograr esto, se han construido casetes de
resistencia que codifican resistencia a carbenicilina y
tetraciclina, terminándose eficazmente la transcripción mediante un
terminador rrnBT1T2. A continuación sigue una descripción de
los componentes individuales que comprenden los casetes de expresión
y de replicación.
Los componentes específicos del Sistema de
Estabilización de Plásmidos se pueden insertar sistemáticamente en
los replicones de expresión básicos, para evaluar cualquier
influencia individual o sinérgica de estas funciones en la
estabilidad plasmídica en presencia y en ausencia de selección. Por
ejemplo, se puede insertar una función de exterminio
post-segregacional (por ejemplo, el lugar
hok-sok) como un casete de
EcoRI-XbaI, de tal forma que la transcripción de
flanqueo procedente de lugares circundantes, tales como los casetes
del antígeno y de selección, sea divergente y no perturbará
significativamente los niveles de transcripción de tipo salvaje que
controlan la letalidad de este lugar (Figura 7B, pGEN111).
De forma similar, el lugar de reparto pasivo
par se puede insertar como un fragmento de
BamHI-BglII entre el origen de replicación y los
casetes de selección (Figura 7C, pGEN121). De forma interesante, en
el trabajo que condujo a la presente invención, se observó que la
orientación del lugar par potencia la síntesis de GFPuv en
medio sólido cuando se inserta en la orientación natural encontrada
dentro de ori101 de pSC101; esta orientación se adoptó para
todos los plásmidos de expresión.
El lugar de reparto activo es preferentemente el
lugar parA, construido como un casete de
XhoI-EcoRI procedente del mismo plásmido de
resistencia pR1 a partir del cual se adaptó
hok-sok. Para conservar los niveles de
transcripción natural y la regulación dentro de este lugar, el
casete se sitúa preferentemente en un área de los plásmidos de
expresión de forma que la transcripción de flanqueo transcurre
alejándose desde parA (Figuras 7D y 7E, pGEN193 y
pGEN222).
Se apreciará por el experto en la materia que se
puede incluir, en los casetes de expresión, una amplia variedad de
componentes conocidos en la técnica, incluyendo una amplia variedad
de señales de transcripción, tales como promotores y otras
secuencias que regulan la unión de ARN polimerasa al promotor. La
operación de los promotores es bien conocida en la técnica, y se
describe en Doi, Regulation of Gene Expression, Modern Microbial
Genetics, páginas 15-39 (1991). La descripción
que sigue usa el promotor ompC a título de ejemplo, y no
delimita la invención.
Es promotor es preferentemente un promotor
medioambientalmente regulable, controlado mediante una señal
biológicamente relevante tal como osmolaridad. En un modo
preferido, el promotor es el promotor ompC. El gen
ompC codifica una proteína purínica que se inserta como un
trímero en la membrana externa de la célula bacteriana. La
expresión y el control de ompC son complejos, y se han
repasado recientemente con considerable detalle en Pratt et al.,
Molecular Microbiology 20:911, 1996 y en Egger et al.,
Genes to Cells 2:167, 1997.
La síntesis de la proteína OmpC se controla
finalmente a nivel de la transcripción mediante la osmolaridad del
entorno circundante, de forma que los incrementos en la osmolaridad
están acompañados por incrementos en la transcripción de
ompC. Sin embargo, los incrementos de la osmolaridad no
median directamente incrementos en la transcripción de ompC.
Más bien, la bacteria percibe la osmolaridad circundante usando un
sistema de transducción de señales de dos componentes codificado
por el operón ompB. Este operón está compuesto de dos genes
transcritos en el orden envZ-ompR. El gen
envZ codifica una proteína de 450 aminoácidos (a.a.), que
contiene dos regiones transmembránicas, que se inserta en la
membrana interna bacteriana (quizás como un dímero), con un dominio
de 118 a.a. N-terminal, sensible a la osmolaridad,
que se extiende en el espacio periplásmico, y con un dominio
catalítico de 270 a.a. C-terminal, que se extiende
en el citoplasma. El dominio catalítico C-terminal
presenta actividades tanto de quinasa como de fosfatasa, que están
moduladas por la osmolaridad, de tal manera que, a medida que
aumenta la osmolaridad, predomina la actividad de quinasa, y a
medida que cae la osmolaridad, predomina la actividad de
fosfatasa.
La actividad de quinasa de EnvZ fosforila el
resto 55 de ácido aspártico de la proteína OmpR citoplásmica de 239
a.a., creando OmpR-P. Es esta proteína modificada
OmpR-P la que se une al promotor ompC y
activa la transcripción mediante ARN polimerasa; por lo tanto, a
medida que aumenta la osmolaridad, la actividad creciente de
quinasa de EnvZ produce niveles más elevados de
OmpR-P, lo que a su vez conduce a una mayor
transcripción de ompC. OmpR-P se une a una
región del promotor ompC que se extiende desde las bases -41
(con relación al sitio de comienzo transcripcional de +1) hasta
-102, estando seguida la unión inicial de OmpR-P a
las bases -78 hasta -102 por una unión adicional a bases que se
extienden hasta -41, a medida que la concentración de
OmpR-P aumenta con la osmolaridad. Además, se ha
demostrado que OmpR-P se une a una región en
dirección 5' rica en AT, que se extiende hasta la base -405, que
potencia además la transcripción de ompC.
En una realización preferida, el fragmento del
promotor ompC procedente de E. coli se extiende desde
los nucleotídicos +70 hasta -389. Este promotor puede dirigir la
transcripción dentro de cepas de S. typhi atenuadas de un
gen de resistencia a antibióticos, tal como el gen de resistencia a
canamicina, de manera sensible osmóticamente. Por ejemplo, se ha
demostrado que, cuando la concentración de NaCl en el medio líquido
de crecimiento aumentó desde 0 mM hasta 300 mM, la resistencia a
canamicina aumentó desde 0 \mug/ml hasta >800 \mug/ml.
Debido a grados variables de toxicidad asociada
con diferentes antígenos heterólogos (es decir, mayor toxicidad
para antígenos derivados de organismos parasitarios tales como
Plasmodium falciparum, frente a una toxicidad virtualmente
inexistente para el fragmento C de la toxina del tétanos), se
describen vacunas de vectores vivos que expresan preferentemente
tales antígenos a partir de plásmidos de número bajo o medio de
copias. El experto en la materia apreciará que la selección de un
origen de replicación dependerá del grado de toxicidad, es decir,
el número de copias debe bajar a medida que la toxicidad para la
cepa bacteriana aumente. En un modo preferido, el o los Sistemas de
Estabilización de Plásmidos usados son capaces de estabilizar
replicones de números bajos o medios de copias.
Es preferible para el origen de replicación
conferir un número medio de copias que está entre aproximadamente 2
y aproximadamente 75. En un modo preferido, el origen de replicación
se selecciona para conferir un número medio de copias que está
entre aproximadamente 5 y aproximadamente 50. De forma más
preferible, el intervalo es desde aproximadamente 5 hasta
aproximadamente 30. Óptimamente, el intervalo es desde
aproximadamente 15 hasta aproximadamente 20.
El origen de replicación puede proceder de
pSC101, que confiere un número de copias de aproximadamente 5 por
equivalente genómico.
El lugar onE1 especifica la síntesis de
un transcrito de 555 bases denominado ARN I, y la síntesis de un
transcrito de ARN antisentido de 110 bases, denominado ARN II. A
medida que se sintetiza ARN I, la región próxima de 5' del
transcrito adopta una estructura de bucle de cañón compuesta de 3
dominios que se pueden hibridar a una estructura de bucle de cañón
complementaria formada por ARN II, dando como resultado una
estructura de ARN-ARN bicatenaria que provoca que
se aborte la replicación plasmídica.
A medida que continúa la síntesis de ARN I,
generando el transcrito de 555 bases de longitud completa, un
reordenamiento de la estructura secundaria del transcrito destruye
la estructura inicial de bucle de cañón de 3 dominios, para formar
una configuración alternativa de bucle de cañón que ya no se hibrida
a ARN II. La formación de esta estructura alternativa permite que
el transcrito se hibride a una hebra de ADN del propio plásmido,
formando un complejo de ARN-ADN que se rompe
mediante ARNasa H endógena para desencadenar la síntesis de la
primera hebra de ADN del plásmido y la replicación del plásmido.
Por lo tanto, la replicación plasmídica está
controlada por la síntesis de ARN I, que sufre una cascada de
configuraciones estructurales que conducen a la iniciación de la
replicación. La progresión necesaria de la cascada de plegamiento
del ARN I (y la iniciación resultante de la replicación) se
interrumpe por competición de los dominios con ARN II. Este
mecanismo es esencialmente el mismo en plásmidos que contienen
oriE1 u ori15A.
La razón de que estos dos tipos de plásmidos
puedan coexistir dentro de la misma bacteria se debe a la
divergencia de secuencias dentro de la región de hibridación entre
ARN I y ARN II, de tal forma que el ARN II de ori15A no se
hibridará a ARN I de oriE1; esta divergencia de secuencias
también afecta a la estabilidad del híbrido ARN I:ARN II, dando
cuenta de las diferencias en el número de copias entre plásmidos que
portan los orígenes de replicación oriE1 u
ori15A.
La organización estructural de los casetes de
los orígenes de replicación manipulados mediante ingeniería para
pSC101 (ori101; \sim5 copias por equivalente genómico),
pACYC184 (derivado de ori15A; \sim15 copias por
equivalente genómico), y pAT153 (derivado de oriE1; \sim60
copias por equivalente genómico) es análoga en estructura y en
función.
Cuando el casete de expresión se usa para
identificar Sistemas de Estabilización de Plásmidos, preferentemente
expresa una proteína o péptido sin ninguna actividad metabólica.
Una proteína preferida es la proteína fluorescente verde (GFP) de
la medusa bioluminiscente Aequiorea victoria, una proteína de
238 aminoácidos que sufre una modificación
post-traduccional en la que están implicados 3
aminoácidos internos
(^{65}Ser-Tyr-Gly^{67}) en una
reacción de ciclación y oxidación. El fluoróforo resultante emite
una luz azul verdosa de forma máxima a una longitud de onda de 509
nm al irradiarlo con luz ultravioleta de onda larga a una longitud
de onda de 395 nm. Además, la actividad de fluorescencia es
notablemente constante a lo largo de un amplio intervalo de pH,
desde 5,5-12, y a temperaturas de hasta
70ºC.
70ºC.
Puesto que GFP no tiene ninguna actividad
catalítica conocida, el nivel de fluorescencia observada dentro de
la bacteria individual que expresa GFP puede proporcionar una
indicación directa de niveles de transcripción del gen gfp
portado por cada bacteria. La expresión de la proteína de GFP se ha
cuantificado ahora en una variedad tanto de células procariotas
como eucariotas, y no requiere cofactores adicionales o enzimas
procedentes de A. victoria. La formación del fluoróforo
depende aparentemente de enzimas y cofactores que se encuentran en
todas partes, o es un suceso autocatalítico.
Las bacterias individuales que expresan GFP se
pueden cuantificar ya sea solas o dentro de macrófagos, estirpes
celulares epiteliales, y en tejidos de animales infectados, usando
citometría de flujo. La fluorescencia de GFP depende absolutamente
de los restos 2-232 de la proteína no
desnaturalizada. Sin embargo, la fusión de dominios proteínicos
biológicamente activos no relacionados al término N de GFP ha dado
como resultado todavía proteínas de fusión con la actividad
biológica heteróloga esperada, que continúa igualmente la
fluorescencia.
Se ha confirmado, mediante análisis de
secuencias (Clontech), que el alelo gfp preferido en la
presente memoria (es decir, gfpuv) expresa un mutante de GFP
(GFPuv) que contiene 3 sustituciones de aminoácidos (que no
implican al fluoróforo), lo que incrementa la fluorescencia 18 veces
con respecto a la de GFP de tipo salvaje.
Además, se han optimizado 5 codones de arginina
raramente usados, para la expresión eficaz de GFP en E.
coli. Puesto que la comparación de los niveles de expresión de
diversas proteínas heterólogas en E. coli y CVD 908 ha
demostrado una expresión equivalente o superior dentro de CVD 908,
se esperaba que gfpuv funcionaría eficazmente en CVD
908-htrA.
Se inserta una secuencia codificante en una
relación correcta al promotor, en la que el promotor y la secuencia
codificante están tan relacionados que el promotor acciona la
expresión de la secuencia codificante, de forma que se produce en
último lugar el péptido o proteína codificado. Se entenderá que la
secuencia codificante también debe de estar en relación correcta
con cualesquiera otras secuencias reguladoras que puedan estar
presentes.
Los plásmidos de expresión expresan
preferentemente un antígeno para presentación a un hospedante para
provocar una respuesta inmunitaria que dé como resultado la
inmunización y protección frente a la enfermedad. Aunque en la
presente memoria se presentan las toxinas de Shiga como ejemplos de
antígenos expresados de forma útil mediante plásmidos de expresión
de vacunas descritos en la presente memoria, la invención tiene un
alcance amplio y engloba la expresión de cualquier antígeno que no
destruya el vector vivo bacteriano y que provoque una respuesta
inmunitaria cuando el vector vivo bacteriano que contiene dicho
plásmido o plásmidos de expresión se administra a un hospedante, es
decir, a un ser humano o a otro animal.
Los plásmidos de expresión de vacunas
proporcionados en la presente memoria se usan para transformar
genéticamente cepas bacterianas atenuadas, preferentemente cepas
usadas para la vacunación de seres humanos, y usadas muy
preferentemente para transformar cepas de vacunas de S. typhi
atenuadas tales como CVD 908-htrA, y preferentemente
codifican la subunidad B de Stx2 o una holotoxina de Stx2
genéticamente destoxificada.
Un subconjunto de STEC, más a menudo denominado
como E. coli enterohemorrágica (EHEC), es capaz de provocar
síndromes clínicos graves, incluyendo colitis hemorrágina, síndrome
urénico hemolítico (HUS) y púrpura trombocitopénica trombótica
(TTP), en una proporción pequeña de individuos infectados, además de
provocar diarrea no hemorrágica en muchos otros.
La colitis hemorrágica se caracteriza por una
diarrea hemorrágica copiosa, habitualmente sin fiebre, o con sólo
un grado bajo de fiebre, y una cantidad relativamente pequeña de
leucocitos fecales demostrables en las heces diarreicas. Estas
características diferencian la colitis hemorrágica de la disentería
provocada por Shigella, que típicamente presenta pocas heces
de sangre y moco, precedidas por fiebre alta y con grandes números
de leucocitos fecales visibles por microscopía.
HUS, una enfermedad potencialmente mortal que
afecta muy a menudo a niños pequeños, pero que puede afectar a
individuos de cualquier edad, se caracteriza por la triada de anemia
hemolítica microangiopática, trombocitopenia y uremia. Actualmente,
en Estados Unidos de América, HUS es la causa más frecuente de
insuficiencia renal aguda en bebés y en niños pequeños. En un
estudio de Siegler et al. con 288 pacientes tratados para HUS
postdiarreico en Utah desde 1970-1994, apareció la
enfermedad grave (definida como anuria que dura más de 7 días,
oliguria que dura más de 14 días, o daño estructural extrarrenal
tal como apoplejía) en el 25% de los casos, y estaba asociada con
niños de menos de dos años de edad; aproximadamente un tercio de
estos casos graves de HUS murieron (5%) o tuvieron secuelas
importantes, incluyendo nefropatía de etapa terminal (5%) o daño
cerebral crónico (3-5%), implicando los problemas
crónicos menos graves la hipertensión, proteinuria o azotemia.
La TTP, que afecta muy a menudo a los adultos,
se caracteriza por complicaciones neurológicas tales como apoplejía,
además de trombocitopenia, anemia hemolítica e insuficiencia
renal.
De lejos, el serotipo de EHEC más habitual es
O157:H7. No obstante, otros serotipos de EHEC también provocan HUS
y colitis hemorrágica, incluyendo O26:H11, O111:H8 y un número de
otros. Las cepas de EHEC asociadas con HUS siempre elaboran una o
más toxinas de Shiga, y portan un plásmido virulento de 60 MDa.
Además, la mayoría también alberga el islote de patogenicidad
cromosómica (el denominado LEE), que tiene un conjunto de genes que
codifican la capacidad para unirse y desvanecerse. Está bien
aceptado que las toxinas de Shiga elaboradas mediante EHEC
desempeñan un papel clave en la patogénesis de colitis hemorrágica y
de HUS.
Como se describe en detalle más abajo, la
familia de toxinas de Shiga comprende dos grupos de toxinas, Stx1
(que es esencialmente idéntica a la
citotoxina/neurotoxina/enterotoxina producida por el tipo 1 de
Shigella dysenteriae, del bacilo de Shiga), y Stx'' (que es
inmunológicamente distinta de Stx1, y tiene varias variantes
relacionadas). En los Estados Unidos de América, la mayoría
aplastante de EHEC asociada con casos de HUS expresa Stx2, ya sea
sola o conjuntamente con Stx1.
Los focos más importantes de infección de EHEC
son los bóvidos. El modo único más importante de transmisión de
EHEC a seres humanos es vía el consumo de carne de res contaminada
sin cocinar, a menudo carne de res triturada. De forma menos
habitual, se ha inculpado a una variedad de otros vehículos
alimentarios y otros modos de transmisión. De forma muy importante,
EHEC es uno del puñado de patógenos entéricos bacterianos que, al
igual que Shigella, se puede transmitir mediante contacto
directo o mediante contacto con artículos contaminados.
Hay una gran expectativa y optimismo en parte de
la mayoría de los epidemiólogos de que la irradiación de carne
vendida en los Estados Unidos de América reducirá drásticamente la
transmisión de EHEC a seres humanos, puesto que reducirá el único
modo más importante de transmisión.
No obstante, ciertos grupos de riesgo expuestos
a otros modos de transmisión de EHEC no se beneficiarán de esta
intervención. Por ejemplo, la exposición de los trabajadores del
matadero a EHEC, un peligro ocupacional, se produce en un punto en
el ciclo del procesado de la carne, antes de que se utilizase la
irradiación. Para tales grupos especiales, tales como aquellos para
los cuales el riesgo permanecerá incluso después de la irradiación
de la carne, pueden ser útiles las vacunas contra EHEC. Los
plásmidos descritos en la presente memoria se pueden usar en la
construcción de vacunas contra EHEC útiles para la prevención de la
infección (en los focos animales o en seres humanos), y para
prevenir las complicaciones graves de la infección de EHEC
estimulando antitoxina de Shiga neutralizante.
Estudios con O1 de Vibrio cholerae que
expresa la subunidad B de Stx1 han demostrado la factibilidad de
provocar antitoxina de Shiga neutralizante mediante inmunización
mucosal con vectores vivos. Sin embargo, puesto que virtualmente
todas las EHEC asociadas con casos de HUS en los Estados Unidos de
América expresan Stx2, sola o junto con Stx1, es preferible que una
vacuna para evitar las complicaciones graves de la infección por
EHEC, mediante la provocación de anticuerpos neutralizantes de la
toxina, debiera estimular anti-Stx2 así como Stx1.
Está dentro del amplio alcance de la presente invención proporcionar
un sistema plasmídico estabilizado para expresar antígenos de Stx2,
solos o junto con Stx1, en un vector vivo de S. typhi
atenuado.
Otros antígenos que se pueden suministrar
adecuadamente según las composiciones y métodos descritos en la
presente memoria incluyen, por ejemplo, aquellos para la hepatitis
B, Haemophilus influenzae tipo b, hepatitis A, pertussis
acelular (_{ac}P), varicela, rotavirus, Streptococcus
pneumoniae (pneumocócico), y Neisseria meningitidis
(meningocócico). Véase Ellis et al., Advances in Pharm.,
39:393-423, 1997.
Preferentemente, los antígenos codificados por
los plásmidos de expresión son vacunas contra el cáncer.
Los antígenos codificados por estos plásmidos se
pueden diseñar para provocar una respuesta inmunitaria frente a
autoantígenos, receptores de células B y/o receptores de células T
que están implicados en enfermedades autoinmunitarias o
inmunológicas. Por ejemplo, cuando se provocan respuestas
inmunitarias inapropiadas contra tejidos corporales o antígenos
medioambientales, las vacunas de la presente invención pueden
inmunizar contra los autoantígenos, los receptores de células B y/o
los receptores de células T, para modular las respuestas y mejorar
las enfermedades. Por ejemplo, tales técnicas pueden ser eficaces
tratando miastenia grave, lupus eritematoso, artritis reumatoide,
esclerosis múltiple, alergias y asma.
En 1903 Conradi fue el primero en dar a conocer
que S. dysenteriae 1 producía una exotoxina poderosa. Debido
a que la inyección de esta toxina conduce a la parálisis de los
miembros traseros de conejos, se denominó originalmente
neurotoxina. Subsiguientemente, esta toxina, la toxina de Shiga,
demostró ser letal para ciertas células en cultivo de tejidos (es
decir, fue una citotoxina). Vicari et al., y después Keusch
et al., demostraron que también funcionó como una
enterotoxina.
Los científicos reconocen ahora la existencia de
una familia de citotoxinas de Shiga que inhiben la síntesis de las
proteínas, conduciendo a la muerte celular para células
susceptibles. Durante muchos años después de la revelación de que
tales toxinas se producían mediante ciertas cepas de E. coli
además de la toxina de Shiga original producida por Shigella
dysenteriae tipo 1, la nomenclatura para esta familia de toxinas
fue confusa. Puesto que informes tempranos describieron la
actividad de estas toxinas sobre células Vero (una estirpe celular
derivada de células epiteliales de riñón de mono verde africano),
muchos investigadores las denominaron verotoxinas. Otros se
refirieron a estas toxinas expresadas en E. coli como toxinas
similares a Shiga.
Las toxinas proteínicas se denominan
colectivamente en la presente memoria como toxinas de Shiga (Stx), y
los genes que codifican estas toxinas se denominan como stx,
representando los subíndices el grupo y variante [es decir,
stx_{1} para la toxina de Shiga producida por E.
coli que es esencialmente idéntica a aquella de Shigella
dysenteriae tipo 1 (stx), y stx_{2},
stx_{2c}, stx_{2d}, stx_{2e} para el
grupo antigénicamente distinto de toxinas relacionadas].
La estructura, bioquímica y antigenicidad de las
toxinas de Shiga están bien descritas en
Melton-Celsa et al., Escherichia coli
0157:H7 and Other Shiga Toxin-producing E. coli
Strains, 1998; Takeda, Bacterial Toxins and Virulence
Factors in Disease, 1995; Gyles, Canadian J. of
Microbiology, 38:734, 1992; y O'Brien et al., Current
Topics in Microbiology and Immunology, 180:165, 1992.
\newpage
Estas citotoxinas de Shiga están compuestas de
una única subunidad A catalítica de aproximadamente 32 kDa no
asociada covalentemente con el dominio de unión a receptor
pentamérico de aproximadamente 7,7 kDa de las subunidades B. Estas
subunidades están codificadas por un único operón del orden
stxA-stxB; la transcripción de los operones
de stx y stx_{1} está regulada por hierro tanto en S.
dysenteriae tipo 1 como en E. coli, pero aún no se han
determinado, para ningún operón stx_{2}, ninguna señal de
control medioambiental. Ninguna de estas toxinas está codificada en
un plásmido; más bien, son codificadas por fagos (Stx1, Stx2,
Stx2c, y Stx2d), o están codificadas cromosómicamente (Stx,
Stx2e).
Como se ha mencionado anteriormente, todos los
miembros de la familia de toxinas de Shiga son toxinas citolíticas
que inhiben la síntesis de proteínas dentro de células susceptibles,
bloqueando la unión a ribosomas del ARNt aminoacílico dependiente
del factor 1 de alargamiento. Para todas las toxinas identificadas a
partir de infecciones humanas, la penetración de células
susceptibles mediante endocitosis sigue a la unión de la holotoxina
a la globotriaosil ceramida del receptor glucolípido de la
superficie celular (Gb_{3}), moviendo la toxina hasta el aparato
de Golgi y al retículo endoplásmico, seguido de la liberación en el
citoplasma. Las toxinas de Shiga son N-glucosidasas de ARN
que despurinan una única adenina a partir del ARN de 28S de la
subunidad ribosómica de 60S eucariota, inactivando de este modo la
subunidad 60S, y conduciendo eventualmente a la muerte celular.
Hay seis miembros prototípicos de la familia de
toxinas de Shiga: Stx, Stx1, Stx2, Stx2c, Stx2d, y Stx2e, que
difieren entre sí inmunológicamente y en actividad tóxica. El
detalle significativo se ha incluido en la presente memoria para
proporcionar un antecedente para comprender la significancia de las
mutaciones de punto discutidas más abajo, que se requieren para las
holotoxinas destoxificadas genéticamente. Los miembros de la
familia de toxinas de Shiga difieren entre sí en 3 formas
fundamentales, como se ha resumido recientemente por
Melton-Celsa et al., Escherichia coli
0157:H7 and Other Shiga toxin-producing E. coli
Strains, 1998.
- (1)
- Inmunológicamente: la familia de toxinas de Shiga está compuesta de dos serogrupos, Stx/Stx1 y Stx2; antisueros provocados contra Stx/Stx1 no neutralizan miembros del serogrupo de Stx2, según se juzga mediante el ensayo de citotoxicidad con células Vero.
- (2)
- Estructuralmente: Stx y Stx1
son esencialmente idénticas, difiriendo en un único aminoácido en la
posición 45 de la subunidad A madura, y se ha resuelto la
estructura cristalina para la holotoxina de Stx. El prototipo Stx2
es solamente 55% homólogo a los restos de la subunidad A madura de
Stx/Stx1, y 57% homólogo a la subunidad B madura, lo que explica
por qué los antisueros producidos contra Stx/Stx1 no neutralizan
miembros del grupo de Stx2. Dentro del grupo de Stx2, Stx2e es la
más distantemente relacionada, compartiendo una homología de
aminoácidos del 93% con la subunidad A madura de Stx2, y una
homología de 84% con la subunidad B madura; Stx2c y Stx2d son muy
similares a Stx2, compartiendo una homología de
99-100% con restos
\hbox{de la subunidad A madura, y una homología de 97% con restos de la subunidad B madura.}
- (3)
- Citotoxicidad: Stx2 está entre las más letales de las toxinas de Shiga, con una LD_{50} para ratones inyectada intraperitonealmente de 0,5-2 ng. La LD_{50} para Stx1 y Stx2e es 200-400 ng, y 1-5 ng para Stx2d; sin embargo, Stx2d es poco habitual, por cuanto esta toxina se puede activar mediante el moco intestinal murino para aumentar la toxicidad de la toxina, reduciendo la LD_{50} hasta 0,5 ng.
Se describe una toxina de Shiga genéticamente
destoxificada. La destoxificación se logra mediante mutagénesis
específica del sitio, introduciendo dos mutaciones de punto
definidas y bien separadas que alteran los restos críticos dentro
del sitio catalítico de la subunidad A. Se introducen dos mutaciones
de punto definidas y bien separadas, adicionales, dentro de la
subunidad B, para alterar los restos críticos dentro del sitio de
unión primario (es decir, SITIO I) que reside dentro de la hendidura
formada por subunidades B adyacentes del anillo pentamérico de la
holotoxina.
Se han hecho intentos previos para alterar el
SITIO II de unión de menor afinidad. Sin embargo, este sitio de
unión sólo se ha identificado a partir de estudios de modelos
moleculares, y no está extensamente apoyado por estudios de
mutación que favorecen la unión al SITIO I del receptor de Gb_{3}.
Incluso si el SITIO II es un sitio de unión de baja afinidad
alternativo, que permite la entrada de la holotoxina mutante en
células susceptibles, la inactivación del dominio catalítico aún
prevendrá la muerte celular.
Basándose en alineamientos de secuencias de
aminoácidos, estudios de cristalografía mediante rayos X, y estudios
de modelos moleculares, se han identificado los aminoácidos
esenciales que comprenden el sitio activo dentro de la subunidad A
catalítica de Stx, así como aquellos restos que comprenden el SITIO
I de unión dentro del pentámero de la subunidad B de Stx/Stx1. La
conclusión es que los aminoácidos esenciales para el sitio activo
se seleccionan de entre el grupo que consiste en Tyr 77, Tyr 114,
Glu 167, Arg 170, y Trp 203. Se cree que los restos que se
requieren para la unión al receptor a las hendiduras formadas por
subunidades B adyacentes incluyen Lys 13, Asp 16, Asp 17, Asp 18,
Thr 21, Glu 28, Phe 30, Gly 60, y Glu 65. Estas predicciones de
sitios son consistentes con estudios funcionales y experimentos
in vivo que usan mutaciones individuales y dobles mutaciones
definidas, dentro de dominios individuales de la halotoxina,
introducidas mediante mutagénesis específica del sitio. En la Tabla
1 se presenta un resumen de tales mutaciones. Basándose en estos
datos y en predicciones cristalográficas, está dentro de la amplia
práctica de la invención proporcionar plásmidos de expresión que
codifican toxinas de Shiga que tienen dos conjuntos específicos de
mutaciones de punto tanto dentro de las subunidades A como B, para
crear holotoxinas de Stx2 mutantes no tóxicas para uso como vacunas,
tales como mediante expresión dentro de vectores vivos de S.
typhi atenuados, tales como CVD 908-htrA.
Se contempla que las vacunas de vectores vivos
bacterianos descritas en la presente memoria se administrarán en
formulaciones farmacéuticas para uso en la vacunación de individuos,
preferentemente seres humanos. Tales formulaciones farmacéuticas
pueden incluir vehículos farmacéuticamente eficaces, y,
opcionalmente, pueden incluir otros ingredientes terapéuticos,
tales como diversos adyuvantes conocidos en la técnica.
El vehículo o vehículos deben de ser
farmacéuticamente aceptables en el sentido de que sean compatibles
con los ingredientes terapéuticos, y que no sean indebidamente
perjudiciales para su receptor. El ingrediente o ingredientes
terapéuticos se proporcionan en una cantidad y frecuencia necesarias
para lograr el efecto inmunológico deseado.
El modo de administración y las formas de
dosificación afectarán a las cantidades terapéuticas de los
compuestos que son deseables y eficaces para la aplicación de
vacunación. Los materiales de vectores vivos bacterianos se
suministran en una cantidad capaz de provocar una reacción
inmunitaria que es eficaz para incrementar la respuesta inmunitaria
del paciente a la holotoxina mutante expresada, o a otro antígeno o
antígenos heterólogos deseados. Una cantidad inmunizacionalmente
eficaz es una cantidad que confiere una capacidad aumentada para
prevenir, restrasar o reducir la gravedad del comienzo de una
enfermedad, en comparación con tales habilidades en ausencia de tal
inmunización. Será fácilmente manifiesto para la persona experta en
la técnica que esta cantidad variará basándose en factores tales
como el peso y la salud del receptor, el tipo de proteína o péptido
que se expresa, el tipo de organismo infeccioso que se combate, y el
modo de administración de las composiciones.
Los modos de administración pueden comprender el
uso de cualquier medio y/o métodos adecuados para suministrar las
vacunas de vectores vivos bacterianos a un lugar corpóreo del animal
hospedante en el que las vacunas de vectores vivos bacterianos sean
inmunoestimulantemente eficaces.
Los modos de suministro pueden incluir, sin
limitación, métodos de administración parenteral, tales como el
subcutáneo (SC), inyección, inyección intravenosa (IV),
transdérmico, intramuscular (IM), intradérmico (ID), así como no
parenteral, por ejemplo mediante administración oral, nasal,
intravaginal, pulmonar, oftálmica y/o rectal.
La frecuencia de la dosis y las formas de
dosificación adecuadas para las composiciones de vacunas de vectores
vivos bacterianos se pueden determinar fácilmente por aquellos
expertos normales en la técnica, sin experimentación innecesaria,
mediante el uso de técnicas de determinación convencionales de
títulos de anticuerpos, y mediante protocolos de
bioeficacia/biocompatibilidad convencionales. Entre otras cosas, la
frecuencia de la dosis y las formas de dosificación adecuadas
dependen del antígeno particular empleado, del efecto terapéutico
deseado, y del intervalo de tiempo deseado de bioactividad.
Las vacunas de vectores vivos bacterianos se
pueden administrar de forma útil al animal hospedante con
cualesquiera otros agentes activos farmacológica o fisiológicamente
activos adecuados, por ejemplo sustancias antigénicas y/u otras
sustancias biológicamente activas.
Las formulaciones se pueden presentar, por
ejemplo, como unidades discretas, tales como cápsulas, obleas,
comprimidos o pastillas para chupar, conteniendo cada una una
cantidad predeterminada de la estructura de suministro de vector; o
como una suspensión.
Se ha construido una serie isogénica de
plásmidos de expresión compuestos de casetes individuales para uso
en vacunas de vectores vivos bacterianos, tales como E. coli
y Salmonella. Con la excepción de sitios de unión
ribosómicos (RBS), los lugares genéticos claves que controlan la
iniciación y terminación de la transcripción, la replicación del
plásmido, o que codifican proteínas expresadas, están contenidos
dentro de fragmentos de restricción definidos, como se representa
mediante el diagrama de plásmido representativo de pGEN2 observado
en la Figura 1A. La estructura básica de estos plásmidos de
expresión se resaltará en primer lugar, y después se resumirán los
datos que demuestran la función de cada lugar dentro de la cepa CVD
908-htrA de vacuna atenuada.
La transcripción de cualquier antígeno
heterólogo que va a ser expresado dentro de CVD 908-htrA está
controlada principalmente por un promotor inducible contenido en un
casete de EcoRI-BglII. Puesto que los plásmidos de
expresión se modelaron inicialmente tras pTETnir15, las
primeras versiones portaban el promotor nir15
anaeróbicamente activado (P_{nir15}). Sin embargo, este promotor
se ha sustituido por un promotor P_{ompC} osmóticamente
controlado, fuertemente regulado, que se manipula fácilmente in
vitro variando la concentración de NaCl.
Los antígenos heterólogos están contenidos en un
casete BglII-AvrII, flanqueado por un RBS optimizado
en el extremo próximo 5' y por un terminador transcripcional
trpA en el extremo distal de 3' de este casete. El origen de
replicación para estos plásmidos de expresión se ha diseñado como un
casete de AvrII-BglII, y está protegido de la
transcripción de lectura que se origina en las regiones de flanqueo.
Estas casetes portan un derivado extremadamente eficaz del
terminador transcripcional T1T2 en un término, con el terminador
transcripcional trpA, procedente del casete del antígeno
heterólogo, en el extremo opuesto del casete de replicación.
Los sitios BglII y SpeI de flanqueo
(véase la Fig. 2), entre el casete de replicación y el casete de
selección, están destinados a la inserción de una función de
estabilización de plásmidos, tal como el lugar par de
pSC101. Los casetes de selección contenidos dentro de los plásmidos
están contenidos dentro de los casetes de SpeI-XbaI,
y se pueden usar, por ejemplo, para codificar resistencia a
carbenicilina (el gen bla) o resistencia a tetraciclina (el
gen tetA, véase la Fig. 1).
El casete de resistencia a fármacos se puede
sustituir por el gen ssb que codifica la proteína de unión
monocatenaria esencial de CVD 908-htrA de Salmonella
typhi.
Los sitios XbaI y EcoRI de
flanqueo, entre el casete de selección y P_{ompC}, están
destinados a la inserción de funciones de estabilización
adicionales, incluyendo un lugar de PSK tal como
hok-sok (véase las Figs. 1 y 2), o una
función de reparto adicional tal como el lugar parA de pR1
(véase la Fig. 7).
Se pretendía que cualquier promotor que controla
la transcripción de un gen heterólogo sea sensible a una señal
medioambiental de importancia biológica. Para los plásmidos de
expresión descritos en la presente memoria, se usó un casete del
promotor ompC (P_{ompC}) procedente de E. coli, que
se indujo mediante el incremento de la osmolaridad. La construcción
de este casete se basó en la secuencia publicada de P_{ompC},
publicada por Norioka et al. (Norioka et al. 1986), y
se llevó a cabo usando cebadores sintéticos para crear un casete de
EcoRI-BglII de 459 pb, del que se eliminó el RBS
natural.
Para confirmar que este promotor estaba
controlado osmóticamente dentro de CVD 908-htrA, se construyó
un derivado de pTETnir15 en el que P_{nir15}-toxC
se sustituyó por un casete compuesto de P_{ompC} que conduce la
expresión de un casete aphA-2 sin promotor,
que confiere resistencia a canamicina. Este plásmido, denominado
pKompC, se introdujo en CVD 908-htrA mediante
electroporación, y se seleccionaron sistemáticamente receptores
para resistencia a canamicina en medio LB. La expresión regulada
osmóticamente de aphA-2 se determinó
inoculando CVD 908-htrA(pKompC) en 50 ml de caldo
nutriente suplementado (NB) que contiene concentraciones crecientes
de canamicina, desde 0 hasta 300 \mug/ml; se construyó un conjunto
paralelo de cultivos con los intervalos idénticos de canamicina
añadidos, pero que también contienen sacarosa al 10%, para inducir
P_{ompC}. Los cultivos se incubaron toda la noche a 37ºC, y se
midió la O.D._{600}. Los resultados se dan en la Tabla 2,
Experimento 1.
La Tabla 2 muestra la inducción con la
osmolaridad del promotor P_{ompC}, que controla la expresión de
resistencia a canamicina, dentro del CVD 908-htrA del vector
vivo de S. typhi.
Independientemente de la presión selectiva
usando canamicina, la presencia de sacarosa al 10% tuvo un efecto
inhibidor sobre el crecimiento de CVD
908-htrA(pKompC). Sin embargo, los resultados
sugirieron que P_{ompC} de E. coli estaba osmóticamente
controlado cuando conduce la expresión del gen
aphA-2 dentro de CVD
908-htrA(pKompC). Para confirmar esto, se inoculó CVD
908-htrA(pKompC) en 50 ml de caldo NB suplementado,
que contiene concentraciones crecientes de canamicina, desde 200
hasta 800 \mug/ml; nuevamente se creó un conjunto paralelo de
cultivos que contienen 300 mM de NaCl, para inducir
P_{ompC}. Los cultivos se incubaron a 37ºC durante 16 h, y los
resultados se dan en la Tabla 2, Experimento 2. Se confirmó que la
expresión, dirigida por P_{ompC}, del gen
aphA-2 dentro de CVD 908-htrA confiere
resistencia a canamicina a niveles de hasta 800 \mug/ml, de
manera osmóticamente regulada.
El casete del gen aph se sustituyó
entonces por un casete de BglII-NheI de
756 pb que contiene el alelo gfpuv que codifica GFPuv.
Durante la identificación visual de colonias de E. coli
subiluminadas con luz ultravioleta, se escogieron para un estudio
posterior una colonia fluorescente muy brillante y otra colonia
fluorescente representativa, denominadas clon 1 y clon 3,
respectivamente. Con la purificación de los plásmidos implicados,
se determinó que el clon 1 contenía un plásmido que ya no portaba un
sitio de BglII que separa P_{ompC} y gfpuv,
mientras que el clon 3 portaba el sitio de BglII esperado.
Se examinó la inducción de la expresión de GFP cuando los clones 1 y
3 se hicieron crecer en agar nutriente en presencia o en ausencia
de NaCl, y se determinó mediante inspección visual que el clon 3
presentaba muy poca fluorescencia cuando se hacía crecer en agar
nutriente que no contiene NaCl pero que daba una fluorescencia
brillante cuando se cultivaba en placas en agar nutriente que
contienen 300 mM de NaCl (datos no mostrados). Sin embargo, el clon
1 tuvo un nivel de fluorescencia de fondo mucho más elevado cuando
no se inducía, pero daba una fluorescencia intensa cuando se
inducía con 300 mM de NaCl. Para excluir mutaciones dentro del gen
gfpuv que puedan afectar a la fluorescencia, se sustituyó
P_{ompC} del clon 1 por PompC del clon 3, y se confirmó la
disminución esperada de la fluorescencia según se juzga mediante
subiluminación (datos no mostrados). Por lo tanto, se concluye que
las diferencias en la fluorescencia observada estaban controladas
por dos versiones genéticamente distintas del promotor P_{ompC},
que se designan P_{ompC1} (niveles de transcripción más elevados
con menos control osmótico) y P_{ompC3} (niveles de transcripción
moderados con control osmótico similar al observado para el casete
de P_{ompC}-aph descrito antes); los plásmidos que
contienen estos casetes de expresión se denominan como
pGFPompC1 y pGFPompC3, respectivamente.
Para cuantificar las diferencias en la expresión
inducida y no inducida de gfpuv controlada por P_{ompC1} y
P_{ompC3}, se monitorizó la síntesis de GPFuv tanto con
DH5\alpha de E. coli como con CVD 908-htrA de S.
typhi, usando citometría de flujo. Esta técnica poderosa tiene
las ventajas únicas de permitir una medida rápida de la expresión
de GFPuv entre grandes números de bacterias individuales, así como
de determinar exactamente la intensidad media de la fluorescencia
debida a la síntesis de GFPuv dentro de cada población bacteriana
analizada. Para lograr esto, se introdujeron pGFPompC1 y
pGFPompC3 mediante electroporación, y las colonias se
aislaron sobre 1 X de agar con LB suplementado, que contiene 100
\mug/ml de carbenicilina, que se hizo crecer a 30ºC durante 48 h.
Las colonias aisladas se hicieron crecer entonces, y los cultivos
se congelaron como lotes maestros. Las colonias recientes se
inocularon entonces en caldo nutriente suplementado o en caldo
nutriente suplementado que contiene 150 mM de NaCl, y se hicieron
crecer a 37ºC/250 rpm durante 24 h; la diferencia en O.D._{600}
para cualquier cultivo nunca fue mayor que 0,07. La inducción de la
expresión de gfpuv, controlada por P_{ompC1} y
P_{ompC3}, se analizó mediante citometría de flujo, y los
resultados se presentan en la Tabla 3.
La Tabla 3 muestra una comparación de la
inducción de P_{ompC1} y P_{ompC3}, que controlan la expresión
de GFPuv, dentro de las cepas hospedantes DH5\alpha de E.
coli y CVD 908-htrA^{1}.
El nivel basal de expresión para el casete de
P_{ompC1}-gfpuv es 2,5 veces superior que para el casete
de P_{ompC3}-gfpuv, cuando se expresa en DH5\alpha, y 2,1
veces superior cuando se expresa en CVD 908-htrA; sin
embargo, el nivel basal de la fluorescencia detectada para la
síntesis de GFPuv nunca superó una intensidad media fluorescente de
5,37, independientemente del fondo del hospedante. Si se define la
relación de inducción como la relación de intensidad media
fluorescente medida después de la inducción, dividida entre el
nivel basal de la intensidad media fluorescente, se observó que,
cuando se induce con 150 mM de NaCl, P_{ompC1} y P_{ompC3}
presentaron relaciones de inducción en DH5\alpha de 1,7 y 2,4,
respectivamente. De forma sorprendente, la relación de inducción
para P_{ompC1} cuando se mide en CVD 908-htrA fue 4,4, y
produjo una intensidad media máxima de la fluorescencia de 23,4 para
estos experimentos. Aunque la relación de inducción para
P_{ompC3} en CVD 908-htrA fue 6,7, la intensidad media de
la fluorescencia de 17,1 fue menor que la medida para P_{ompC1}.
Basándose en estos datos, parece que P_{ompC1} es el más fuerte y
el controlado osmóticamente de los dos promotores de ompC.
Por lo tanto, P_{ompC1} se escogió para la síntesis del intervalo
más amplio posible de antígeno de ensayo heterólogo, para examinar
los efectos de tales síntesis sobre la estabilidad
plasmídica.
plasmídica.
Estos datos muestran claramente que, cuando
conducen la expresión de gfpuv dentro de la cepa CVD
908-htrA de vectores vivos, P_{ompC1} y P_{ompC3} son
inducibles con la osmolaridad creciente, aunque el nivel basal de
transcripción es todavía digno de mención en ambos casos. Los
resultados observados en condiciones de baja molaridad apoyan
todavía las observaciones, usando medios sólidos, de que P_{ompC1}
dirige la expresión de antígenos heterólogos de forma superior a
P_{ompC3}. Puesto que se observó que P_{ompC3} presenta el
sitio de BglII 3' terminal pretendido, que no se detectó para
P_{ompC1}, se determinó la secuencia nucleotídica para
P_{ompC1} para detectar quizás una mutación o mutaciones de punto
que pudiesen explicar la fortaleza de P_{ompC1}. Las únicas
diferencias identificadas estaban localizadas en el término 3' del
casete. La secuencia pretendida dentro de esta región fue
5'-...catataacAGATCTtaatcatccacAGGAGGatatctgATG-3'
(SEC ID nº. 4) (de izquierda a derecha, la mayúscula representa el
sitio de BglII, el sitio de unión a ribosoma, y el codón de
partida de GFPuv, respectivamente); la secuencia real demostró ser
5'-...catataacAGATC GATCT taa A catccacAGG
AGG A t A tctgATG-3 (SEC ID nº. 5) (representándose las bases insertadas o cambiadas medaine una mayúscula en negrita subrayada). Estos cambios detectados en la secuencia del promotor ompC1 son aparentemente responsables del incremento de la fuerza observada de P_{ompC1} mediante un mecanismo desconocido, puesto que ni la secuencia del promotor ompC básica, ni el sitio de unión a ribosoma optimizado han sido alterados espontáneamente.
AGG A t A tctgATG-3 (SEC ID nº. 5) (representándose las bases insertadas o cambiadas medaine una mayúscula en negrita subrayada). Estos cambios detectados en la secuencia del promotor ompC1 son aparentemente responsables del incremento de la fuerza observada de P_{ompC1} mediante un mecanismo desconocido, puesto que ni la secuencia del promotor ompC básica, ni el sitio de unión a ribosoma optimizado han sido alterados espontáneamente.
El éxito de expresar antígenos heterólogos
potencialmente tóxicos o de otro modo problemáticos en CVD
908-htrA depende del número de copias del plásmido de
expresión. Además, las respuestas inmunitarias observadas frente a
un antígeno heterólogo dado están afectadas por el número de copias
del gen o genes que codifican el antígeno, provocando los antígenos
cromosómicamente expresados respuestas inmunitarias más pobres en
comparación con la expresión a base de plásmidos.
Una respuesta inmunitaria optimizada dependerá
de la expresión basada en plásmidos de múltiples copias del
antígeno o antígenos heterólogos a partir de plásmidos con el número
de copias apropiado.
Puesto que el número de copias apropiado para un
gen heterólogo dado no se puede conocer a priori, la
presente invención proporciona un conjunto de plásmidos de expresión
que contienen los orígenes de replicación oriE1 (amplificado
a partir de pAT153; número de copias \sim60), ori15A
(amplificado a partir de pACYC184; número de copias \sim15), y
ori101 (amplificado a partir de pSC101; número de copias
\sim5). Estos casetes de replicación autocontenidos están todos
portados sobre fragmentos de BglII-BamHI, y se
representan para un conjunto de 3 plásmidos de expresión con
resistencia a tetraciclina mostrados en las Figuras
1A-1C.
Se analizó, mediante citometría de flujo, la
expresión del casete de expresión de gfpuv controlado por
P_{ompC1}, contenido en estos plásmidos de expresión. Estos
experimentos se diseñaron para detectar si las diferencias a nivel
de la fluorescencia observada se podrían correlacionar con el número
de copias esperado de un plásmido de expresión dado. Se hicieron
pasar cepas de CVD 908-htrA que portan pGEN2, pGEN3 y pGEN4,
sobre el medio rico SuperAgar suplementado con DHB y 20 \mug/ml de
tetraciclina cuando fuese apropiado. Se usó SuperAgar debido a que
es un medio muy rico (3X de agar de LB). Las placas se incubaron a
30ºC para reducir la toxicidad de la síntesis de GFP y permitir que
las bacterias crezcan lujosamente sobre las placas. Las colonias
aisladas se inocularon entonces en 45 ml de SuperBroth suplementado
con DHB y 20 \mug/ml de tetraciclina cuando fuese
apropiado, y se incubaron a 37ºC durante 16 h. Las bacterias se
concentraron mediante centrifugación y se resuspendieron en 1 ml de
PBS estéril, pH = 7,4, y se diluyeron 1:100 en PBS, pH = 7,4, antes
del análisis de FACS. Las bacterias se analizaron mediante
citometría de flujo, como se describe anteriormente, para dos
experimentos de crecimiento independientes, y los resultados se
presentan en la Tabla 4 al final de esta sección.
Estos datos apoyan la conclusión de que la
sobreexpresión de GFPuv en CVD 908-htrA es tóxica para la
bacteria. Puesto que el número teórico de copias aumenta para los
plásmidos pGEN4, pGEN3, y pGEN2 que expresan GFPuv en condiciones
de crecimiento idénticas, a partir del promotor P_{ompC1}
idéntico, disminuye el porcentaje de la población en crecimiento
que fluorece. Se espera que las bacterias "dim" no sean
bacterias viables y que ya no contengan el plásmido de expresión,
puesto que estos cultivos se hicieron crecer en presencia de 20
\mug/ml de tetraciclina. Sin embargo, se observa que, cuando se
hacen pasar sobre medio sólido y se hacen crecer a 37ºC durante
24-36 h, CVD 908-htrA(pGEN2) crece malamente
y no produce colonias aisladas, mientras que CVD
908-htrA(pGEN3) y CVD 908-htrA(pGEN4) crecen bastante
bien y producen colonias aisladas que fluorecen
intensamente.
intensamente.
GFPuv se emplea en la presente memoria como
representante de otros antígenos heterólogos problemáticos que
sería de interés incluir en un vector vivo bacteriano, tal como el
vector vivo a base de S. typhi; sin embargo, se apreciará
que GFPuv se puede sustituir por cualquier antígeno proteínico o
peptídico no metabólico.
Los datos anteriores muestran que aunque el uso
de plásmidos de expresión de número medio de copias que contienen
replicones oriE1 puede ser utilizable en la expresión de
algunos antígenos, la expresión de antígenos de mayor toxicidad se
expresará de forma más exitosa a partir de plásmidos con menor
número de copias que emplean orígenes de replicación que producen
números medios de copias entre 2 y 30, tales como los orígenes de
replicación ori101 u ori15A.
Usando la reacción en cadena de polimerasa, se
amplificaron los genes de PSK de hok-sok,
usando el plásmido R de resistencia a múltiples antibióticos pR1
como el molde en estas reacciones. Todos los intentos iniciales
para clonar este lugar sobre plásmidos de números elevados o medios
de copias no tuvieron éxito. A fin de seleccionar directamente el
lugar de hok-sok durante la subclonación, se
diseñó un conjunto de cebadores para uso en reacciones de PCR que
solapan, de forma que el producto final fue un fragmento que
contiene una fusión genética del lugar de
hok-sok a partir de pR1 y un gen tetA
sin promotor procedente de pBR322 que codifica resistencia a
tetraciclina. Este casete se manipuló mediante ingeniería de forma
que la transcripción del gen hok continuase en tetA; los dos
lugares dentro de este casete se separaron mediante un sitio de
restricción de XbaI para manipulaciones
futuras.
futuras.
La construcción de este casete no sólo permitió
la selección directa del lugar de hok-sok,
sino también permitió la confirmación de que la función de PSK
operaría en CVD 908-htrA de S. typhi. Después de la
electroporación de plásmidos que portan el casete en CVD
908-htrA, los transformantes se podrían seleccionar usando
tetraciclina. La recuperación exitosa de colonias aisladas indica la
síntesis exitosa del ARNm de hok-tetA, y la
síntesis exitosa del ARN de sok antisentido para evitar la
producción y síntesis de Hok, que mataría a la bacteria. La
recuperación del casete de
hok-sok-tetA fue después
simple, y se incorporó fácilmente en los plásmidos de expresión
para crear el casete de marcador seleccionable de los plásmidos
pGEN2, pGEN3, y pGEN4 representados en las Figuras
1A-1C.
1A-1C.
Después se iniciaron experimentos para
determinar el efecto de la función de PSK de
hok-sok sobre la estabilidad de plásmidos de
expresión que contienen oriE1 y el marcador de resistencia
bla que codifica \beta-lactamasa, que
confiere resistencia a carbenicilina. El casete de
hok-sok se insertó en el plásmido de
expresión pTETnir15 a base de pAT153, en el que el casete
del antígeno heterólogo pnir15-toxC se sustituyó por
el casete de P_{ompC1}-gfpuv, creando los plásmidos pJN72
(sin hok-sok) y pJN51 (con
hok-sok). Se creó un conjunto adicional de
plásmidos sustituyendo P_{ompC1} por el promotor más débil
P_{ompC3}, creando pJN10 y pJN12; las estructuras de estos cuatro
plásmidos isogénicos se representan en la Figura 2. Se hicieron
pasar cepas de CVD 908-htrA, que portan pJN72, pJN51, pJN10,
o pJN12, sobre el medio rico SuperAgar suplementado con DHB y 100
\mug/ml de carbenicilina, y las placas se incubaron como antes en
busca de los plásmidos de pGEN a 30ºC, para reducir la toxicidad de
la síntesis de GFPuv y permitir que las bacterias crezcan
lujosamente sobre las placas.
Después, las colonias aisladas se inocularon en
45 ml de caldo Super suplementado con DHB y 100 \mug/ml de
carbenicilina, y se hicieron crecer a 37ºC durante 24 horas para el
análisis mediante citometría de flujo de fluorescencia. Se llevó a
cabo un segundo experimento independiente, exactamente igual que el
primero, excepto que las colonias aisladas se suspendieron en 500
\mul de caldo Super, y cada uno de 250 \mul se inoculó en 45 ml
de cultivos de caldo Super pareados, con o sin 300 mM de NaCl
añadido para inducir los casetes de P_{ompC}-gfpuv; los
cultivos se incubaron a 37ºC durante 48 h, y se analizaron
nuevamente mediante citometría de flujo; los resultados de ambos
experimentos se presentan en la Tabla 5. Los histogramas de
fluorescencia para plásmidos de expresión no inducidos e inducidos
procedentes del experimento 2 se representan en las Figuras
3A-3H.
Estos resultados de la citometría de flujo se
pueden explicar según lo siguiente: la expresión de GFPuv (u otro
antígeno heterólogo potencialmente perjudicial) a partir de un
plásmido de expresión de múltiples copias, tal como pJN72, aumenta
el estrés metabólico sobre el vector vivo de CVD
908-htrA(pJN72), y aumenta la inestabilidad plasmídica en
ausencia de selección. Puesto que el marcador seleccionable del
plásmido de expresión codifica la enzima segregada
\beta-lactamasa, entonces, a medida que aumenta el
tiempo, disminuye la concentración de carbenicilina en el medio
circundante, disminuye la presión selectiva, y aumenta la frecuencia
de pérdida de plásmido; sin embargo, puesto que están implicados
plásmidos de múltiples copias, relativamente pocas bacterias tienen
éxito a la hora de perder todos los plásmidos residentes, pero el
número medio de copias de pJN72 por bacteria
cae.
cae.
La cuantificación mediante citometría de flujo
de la producción de GFPuv para una población no inducida de CVD
908-htrA(pJN72) en crecimiento sana indica que la mayoría de
las bacterias expresan GFPuv, y se detectan pocas células que no
fluorescen (Figura 3A). Sin embargo, el incremento de la producción
de GFPuv mediante inducción del casete de P_{ompC1}-gfpuv
aumenta el estrés metabólico sobre CVD 908-htrA(pJN72), y
aunque se duplica la producción de GFP, el porcentaje de bacterias
no fluorescentes aumenta a medida que se pierden más plásmidos de
la población (Figura 3B).
En una población similar de CVD
908-htrA(pJN51) en crecimiento, cada bacteria porta plásmidos
de múltiples copias que codifican tanto GFPuv como una función de
PSK. La frecuencia de pérdida de plásmido para pJN51 sigue siendo
la misma que para pJN72, pero en este caso, a medida que las
bacterias individuales pierden copias del plásmido de expresión, se
perturba la estequiometría 1:1 entre los niveles de ARNm de
hok y de sok, y la producción de Hok conduce a la
muerte celular; por lo tanto, las únicas bacterias de CVD
908-htrA(pJN51) que crecerán rápidamente serán aquellas que
retienen todos sus plásmidos de expresión. En consecuencia, no es
sorprendente que la cuantificación mediante citometría de flujo de
la producción de GFPuv para una población no inducida de CVD
908-htrA(pJN51) en crecimiento sana ahora detecta una
población de bacterias que fluorescen, que presentan niveles de
fluorescencia de GFPuv equivalentes a los observados para CVD
908-htrA(pJN72) que se hace crecer en condiciones de
inducción (Figura 3C frente a Figura 3B); sin embargo, el porcentaje
de bacterias que no fluorescen se eleva hasta aproximadamente la
mitad de la población global de organismos.
El aumento de la producción de GFPuv en esta
población, mediante inducción del casete de P_{ompC1}-gfpuv
en CVD 908-htrA(pJN51), aumenta nuevamente el estrés
metabólico sobre el vector vivo, pero ahora el porcentaje de
bacterias no fluorescentes supera casi completamente las pocas
bacterias que fluorescen, puesto que se pierden presumiblemente
muchos plásmidos de la población, y mueren las bacterias (Figura
2D).
Sería de esperar que si se usa un promotor más
débil para controlar la expresión de GFPuv, la fluorescencia global
de la población disminuiría (en comparación con la observada para
una población similar de organismos que se hace crecer con un
promotor potente que expresa GFPuv en idénticas condiciones), y el
porcentaje de bacterias no fluorescentes debería de caer debido a
la caída global en la síntesis de GFPuv. Sin embargo, como se
observa en las Figuras 3E-3H, el uso del casete de
P_{ompC3}-gfpuv más débil no mejoró significativamente la
viabilidad de bacterias inducidas que portan un sistema de
exterminio, incluso aunque se redujo la expresión global de
GFPuv.
Se concluye que, a fin de maximizar el
porcentaje de una población de vectores vivos que expresan el
antígeno heterólogo de elección, no es suficiente sólo incorporar
una función de PSK en un plásmido de expresión dado, tanto si es un
marcador de resistencia a fármacos, el sistema asd, un
sistema ssb alternativo, o el sistema de exterminio
hok-sok. Además de optimizar el número de
copias y los niveles de expresión, también se deben de mejorar las
frecuencias de segregación de estos plásmidos, para asegurar que
cada célula hija en una población activamente en crecimiento
heredará por lo menos un plásmido de expresión, y aquellos que no
lo hagan serán exterminados y eliminados de la población. Por lo
tanto, está dentro del alcance de la presente invención
proporcionar un plásmido de expresión que tiene una función de PSK y
que tiene además un número de copias y/o niveles de expresión
optimizados, acoplados con la incorporación de una o más funciones
de SEG.
También está dentro del amplio alcance de la
presente invención proporcionar un plásmido de expresión que
comprende un sistema de exterminio a base de la complementación, por
ejemplo un sistema que implica la supresión del lugar ssb
cromosómico de CVD 908-htrA mediante recombinación homóloga,
y la transcomplementación de esta lesión usando plásmidos de
múltiples copias que portan ssb funcional.
Para llevar a cabo tales construcciones se
requiere la clonación de la sección pertinente del cromosoma de
S. typhi que engloba el gen ssb y las secuencias de
flanqueo, en la que se pueden introducir supresiones específicas
para mutagénesis cromosómica.
Desde la presentación original, se ha realizado
un progreso sustancial en la secuenciación del cromosoma de
Salmonella typhi en el Sanger Centre en Londres. El Sanger
Centre es un centro de investigación genómico creado en 1992 por
Wellcome Trust y el Medical Research Council a fin de fomentar
nuestro conocimiento de los genomas. Entre otros proyectos, el
Sanger Centre está secuenciando el genoma de 4,5 Mb de S.
typhi, en colaboración con Gordon Dougan del Departamento de
Bioquímica, Imperial College, Londres. Están secuenciando la cepa
CT18, una cepa muy patógena, resistente a múltiples fármacos,
aislada de un paciente tifoide en Cho Quan Hospital, Ho Chi Minh
City, Vietnam. Se sabe que esta cepa aloja pVN100 (un plásmido de
resistencia a múltiples fármacos, de 130 kb) y un plásmido de 80 kb
críptico. El genoma está siendo secuenciado mediante un enfoque de
pistola de disparo genómico completo, usando una librería de pUC de
2 kb, generado en el laboratorio a partir de ADN cromosómico
suministrado por el laboratorio del Prof. Dougan. Cada inserto está
siendo secuenciado una vez desde cada extremo. La fase de pistola
de disparo está ahora terminada, y el acabado ha comenzado. En el
presente, hay 60 contigs a lo largo de 1 kb en la base de datos; un
total de 5,106 Mb de la secuencia se ensambló a partir de
87.331
lecturas.
lecturas.
Basándose en resultados actualizados presentados
el 4 de octubre de 1999, se ha identificado el Contig 343, que
contiene el lugar ssb de S. typhi, y las secuencias de
flanqueo críticas dentro de una región de 205.199 pb. Se han
diseñado los cebadores 1 y 4 (enumerados más abajo) para amplificar,
mediante PCR, un fragmento de 3535 pb del cromosoma de S.
typhi en el que el lugar ssb está flanqueado por 1,5 kb
de secuencia cromosómica. Esta simetría de flanqueo se requiere
para frecuencias de intercambio de genes o segmentos óptimos entre
cromosomas homólogos, para introducir el casete de
sacB-neo contraseleccionable, y sustituir
ssb. Usando la metodología previamente presentada, se usarán
los cebadores 1 y 2 para manipular mediante ingeniería un casete de
EcoRI-XmaI de 1,5 kb próximo a 5', en dirección 5' de
ssb. Los cebadores 3 y 4 se usarán para generar el casete de
XmaI-EcoRI de 1,5 kb distal de 3', en dirección 3' de
ssb; ambos casetes de 1,5 kb se ligarán juntos, formando el
fragmento de EcoRI de 3 kb que contiene un único sitio de
XmaI exactamente en el centro del casete. El casete de
sacB-neo se puede insertar ahora fácilmente
en el sitio de XmaI, para completar la construcción del
casete de mutagénesis a insertar en pCON (previamente descrito en
la primera presentación). El casete de ssb-1
de complementación requerido se construirá usando los cebadores 5 y
6 como un casete de NheI para la sustitución de los
marcadores de resistencia a fármacos dentro de los casetes de
XbaI-SpeI de pGEN211, pGEN222, pGEN206, o cualquier
versión posterior de los plásmidos de expresión detallados en la
presente memoria.
\vskip1.000000\baselineskip
Cebador
1
\vskip1.000000\baselineskip
Cebador
2
\vskip1.000000\baselineskip
Cebador
3
\newpage
Cebador
4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Cebador
5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Cebador
6
\vskip1.000000\baselineskip
A fin de desarrollar un sistema de
estabilización de plásmidos no catalítico, para potenciar la
estabilidad de plásmidos de expresión de múltiples copias que
codifican antígenos extraños en CVD 908-htrA, se iniciaron
experimentos para monitorizar la estabilidad plasmídica
cuantificando la expresión de GFPuv mediante citometría de flujo
cuando las cepas se hacen pasar en ausencia de selección de
antibióticos. Estos experimentos se diseñaron para superar 3
cuestiones fundamentales: 1] ¿cuál es el efecto del nivel de
inducción de P_{ompC1} sobre la estabilidad de plásmidos que
codifican un antígeno heterólogo tal como GFPuv?, 2] ¿cuál es el
efecto del número de copias sobre la estabilidad de plásmidos que
expresan GFPuv?, 3] ¿cómo afectan las funciones de estabilización
hok-sok, par y parA a la
retención plasmídica, tanto como componentes individuales como
sinérgicamente?.
Se llevaron a cabo experimentos iniciales de
citometría de flujo en los que CVD 908-htrA portaba
replicones con el origen de replicación oriE1,
ori15A, u ori101. Se determinó rápidamente que los
replicones que portan los orígenes oriE1 de mayor número de
copias eran inestables, incluso cuando las cepas se hacían crecer
en presencia de selección de antibióticos. Los resultados de la
citometría de flujo indicaron que, cuando se cultivaban en
presencia de carbenicilina, el porcentaje de las poblaciones
bacterianas que ya no expresaban GFPuv detectable oscilaba desde
aproximadamente 50% para pGEN71 (que porta
hok-sok) y pGEN84
(hok-sok + par) hasta 62% para pGEN211
(hok-sok + par + parA). Puesto
que los replicones que portan un origen oriE1 no permitieron
claramente la síntesis óptima del antígeno de ensayo de GFPuv
heterólogo dentro de la mayoría de una población en crecimiento de
bacterias vectoriales vivas, esta serie de plásmidos de expresión
no se examinó más.
Después se examinaron CVD 908-htrA que
portan plásmidos de expresión con un origen ori15A. Las cepas
se inocularon en 25 ml de cultivos de 1 X LB + DHB (sin selección
de antibiótico) que contiene 50 mM, 150 mM, o 300 mM de NaCl. Los
cultivos se incubaron durante 24 h a 37ºC/250 rpm, se diluyeron
1:1000 en medio reciente de osmolaridad idéntica, y se incubaron
durante otras 24 h; las muestras de todos los cultivos se
analizaron para determinar los niveles de síntesis de GFPuv mediante
citometría de flujo. Los resultados para la primera pasada en
ausencia de selección se enumeran en la Tabla 6, y los histogramas
que representan estos datos se muestran en la Figura 8.
\newpage
La Tabla 6 muestra la estabilidad dentro de CVD
908-htrA de los replicones ori15A, que contienen
sistemas de estabilización de plásmidos de complejidad creciente,
que se hacen crecer sin selección y en presencia de una osmolaridad
creciente.^{1}
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{ ^{1} Estos datos están representados como histogramas en la Figura 8.\cr ^{2} \begin{minipage}[t]{150mm} Todas las cepas se hicieron pasar a partir de lotes maestros congelados sobre 2 X de agar de LB suplementado con DHB y 50 \mu g/ml de carbenicilina, y se incubaron durante 36 h a 30 ^{o}C . Las colonias aisladas se reunieron en 300 \mu l de 1 X de caldo de LB suplementado con DHB, a partir de los cuales se inocularon 25 \mu l en 25 ml de 1 X de caldo de LB que contiene DHB y 50 mM, 150 mM, o 300 mM de NaCl; los cultivos se incubaron a 37 ^{o}C , 250 rpm durante 24 h. Para los resultados presentados en esta tabla, las bacterias se peletizaron entonces, se resuspendieron en 1 ml de PBS, pH 7,4, y después se diluyeron 1:1000 en PBS para el análisis mediante citometría de flujo. \end{minipage} \cr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
En general, a medida que aumenta la osmolaridad
y se eleva la inducción de P_{ompC1}, cae el porcentaje de la
población de vectores vivos que expresan GFPuv; no obstante, el
nivel medio de la intensidad de fluorescencia aumenta según lo
esperado. Por ejemplo, en presencia de 50 mM de NaCl, el 80,5% de
una población de CVD 908-htrA(pGEN121) expresa GFPuv con una
intensidad media de fluorescencia de 53,3. A medida que aumenta la
concentración de NaCl hasta 300 mM de NaCl, el porcentaje de la
población que expresa GFPuv cae hasta 56,7%; no obstante, la
intensidad media de la fluorescencia se eleva hasta 105,3. Sin
embargo, es notable que, para cepas que portan pGEN222 con un
sistema de estabilización de plásmidos completo (es decir,
hok-sok + par + parA), el
porcentaje de la población que expresa el antígeno heterólogo
permanece a aproximadamente 95%, mientras que la intensidad media
de la fluorescencia aumenta desde 52,1 (50 mM de NaCl) hasta 89,2
(300 mM de NaCl). Se observó que, con la pasada posterior de estas
cepas durante 24 horas adicionales en ausencia de selección de
antibiótico, menos del 5% de las bacterias continuó expresando GFPuv
funcional. Las tiras de estos cultivos sobre medio sólido, antes
del análisis de flujo, indicaron que las bacterias no fluorescentes
permanecían viables, pero eran sensibles a la selección mediante
antibióticos. Cuando las bacterias que no fluorescen se
clasificaron y se colocaron en placas, se confirmó que eran
sensibles a antibióticos y no eran fluorescentes cuando se
irradiaban con luz ultravioleta, indicando la pérdida de
plásmidos
residentes.
residentes.
Un experimento de pasada que implica CVD
908-htrA que porta plásmidos de expresión con un origen
ori101 no detectó ninguna pérdida significativa de la
expresión de GFPuv después de la pasada de las cepas durante 48 h
sin selección, independientemente de la osmolaridad. Por lo tanto,
las cepas se hicieron pasar en un experimento separado durante 96 h
(es decir, 4 x 24 h) en presencia de 50, 150 ó 300 mM de NaCl. Las
poblaciones se analizaron mediante citometría de flujo después de
las pasadas 3 y 4, y los resultados se registraron en la Tabla
7.
\global\parskip0.900000\baselineskip
La Tabla 7 muestra la estabilidad dentro de CVD
908-htrA de los replicones ori101, que contienen
sistemas de estabilización de plásmidos de complejidad creciente,
que se hacen crecer sin selección y en presencia de una osmolaridad
creciente.
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{ ^{1} \begin{minipage}[t]{150mm} Todas las cepas se hicieron pasar a partir de lotes maestros congelados sobre 2 X de agar de LB suplementado con DHB y 50 \mu g/ml de carbenicilina, y se incubaron durante 36 h a 30 ^{o}C . Las colonias aisladas se reunieron en 300 \mu l de 1 X de caldo LB suplementado con DHB, a partir de los cuales se inocularon 25 \mu l en 25 ml de 1 X de caldo de LB que contiene DHB y 50 mM, 150 mM ó 300 mM de NaCl; los cultivos se incubaron a 37 ^{o}C , 250 rpm durante 24 h (definido en la presente memoria como pasada número 1). Para la pasada número 2, se inocularon 25 \mu l de la pasada número 1 en 25 ml (es decir, dilución 1:1000) de medio idéntico, y se incubaron a 37 ^{o}C , 250 rpm durante 24 h adicionales, sin selección. Las pasadas 3 y 4 se llevaron a cabo de manera idéntica, pero después de que se creó la siguiente pasada, las bacterias que quedan se peletizaron entonces, se resuspendieron en 1 ml de PBS, pH 7,4, y después se diluyeron 1:1000 en PBS para el análisis mediante citometría de flujo. \end{minipage} \cr ^{2} ND = no realizado.\cr}
Los vectores vivos que portan replicones
ori101 inestabilizados pierden eventualmente la capacidad de
sintetizar el antígeno heterólogo después de 96 h. Por ejemplo,
después del crecimiento durante 96 h en presencia de 50 mM de NaCl,
sólo el 10,9% de CVD 908-htrA(pGEN132) expresó GFPuv y
fluoresció. A medida que la concentración de NaCl en el medio
aumentó hasta 150 mM, la fluorescencia se detectó en sólo 7,6% de la
población; curiosamente, a 300 mM de NaCl, el porcentaje se
recuperó hasta 51,3% de bacterias que fluorescen. De forma notable,
CVD 908-htrA que porta pGEN142
(hok-sok) o pGEN206
(hok-sok + parA) retuvo la síntesis de
GFPuv en más del 95% de la población después de 3 pasadas (72 h),
independientemente de la osmolaridad (véase la Tabla 7). El
porcentaje de CVD 908-htrA(pGEN142) que fluoresce permaneció
casi a este nivel después de 4 pasadas (96 h), mientras que
disminuyó ligeramente para CVD 908-htrA(pGEN206).
Tomados en conjunto, estos datos muestran que a
medida que se reduce el número de copias, aumenta la estabilidad
aparente de plásmidos residentes y la habilidad de un vector vivo
para sintetizar un antígeno heterólogo tal como GFPuv; puesto que
los sistemas de estabilización de plásmidos se acumulan en un
plásmido dado, la estabilidad aparente y la síntesis de antígenos
se potencian adicionalmente. Además, a medida que aumenta la
inducción de P_{ompC1} y la producción concomitante del antígeno
heterólogo, el porcentaje de una población en crecimiento que sigue
siendo capaz de sintetizar el antígeno se puede reducir
drásticamente.
Todas las construcciones plasmídicas se
recuperaron en la cepa DH5\alpha o DH5\alphaF'IQ de
Escherichia coli (Gibco BRL). La construcción del casete
génico de hok-sok usó ADN molde de pR1
aislado de la cepa J53(pR1) de E. coli, una donación
generosa por parte de James B. Kaper. El vector vivo de CVD
908-htrA de S. typhi es un derivado auxotrófico de la
cepa Ty2 de tipo salvaje, con supresiones en aroC, aroD, y
htrA (Tacket et al. 1997b). Todas las cepas usadas
para el examen de la estabilidad plasmídica se hicieron crecer en
medios suplementados con ácido 2,3-dihidroxibenzoico
(DHB), como se describió previamente (Hone et al. 1991;
Galen et al. 1997). Cuando se hicieron crecer en medio
sólido, las cepas de CVD 908-htrA portadoras de plásmidos se
hicieron pasar desde lotes maestros congelados (-70ºC) sobre 2 X de
agar de Luria-Bertani que contiene (por litro) 20 g
de Bacto triptona, 10 g de extracto de levadura Bacto, y 3 g de
NaCl (2 X de agar de LB), más carbenicilina a una concentración de
50 \mug/ml. Las placas se incubaron a 30ºC durante
24-36 h para obtener colonias aisladas de \sim2 mm
de diámetro; las cepas se incubaron a 30ºC para minimizar la
toxicidad de la expresión de GFPuv en CVD 908-htrA.
Cuando se hicieron crecer en medio líquido, los
cultivos se incubaron a 37ºC, 250 rpm durante 16-24
h. Para examinar la inducción osmótica del promotor ompC
(P_{ompC}) dentro de DH5\alpha de E. coli o de CVD
908-htrA, las cepas se hicieron crecer en caldo nutriente
Bacto (Difco) que contiene DHB y NaCl o sacarosa; los cultivos se
suplementaron con 50 \mug/ml de carbenicilina o con
concentraciones crecientes de canamicina cuando se examinaron los
casetes de P_{ompC}-aphA-2. Para la
cuantificación de la síntesis de GFPuv usando citometría de flujo,
se inocularon 6-8 colonias aisladas, procedentes de
lotes maestros que se hacen pasar sobre 2 X de agar de LB como
antes, en 25 ml de 1 X caldo de LB suplementado con 50 \mug/ml de
carbenicilina, cuando se desee, y NaCl a concentraciones crecientes,
para incrementar la inducción de los promotores de ompC. Los
cultivos se incubaron a 37ºC, 250 rpm durante 16-24
h antes de peletizar las bacterias para la citometría de flujo como
se describe más abajo.
Se usaron técnicas estándares para la
construcción de los plásmidos representados en la presente memoria
(Sambrook et al., 1989). Excepto que se señale de otro modo,
se usó ADN polimerasa de Taq nativa (Gibco BRL) en las reacciones
en cadena de polimerasa (PCR). S. typhi se preparó para
electroporación de plásmidos recombinantes después de cosechar a
partir de caldo de LB de MIller (Gibco BRL) suplementado con DHB;
después de peletizar las bacterias, las células se lavaron tres
veces con un volumen de cultivo de agua destilada estéril, y se
resuspendieron en agua destilada estéril hasta un volumen final de
1/100 del volumen de cultivo original. La electroporación de las
cepas se realizó en un aparato Gene Pulser (Bio-Rad)
ajustado a 2,5 kV, 200 \Omega, y 2,5 \muF. Después de la
electroporación, las bacterias se repararon usando medio SOC, e
incubando a 37ºC, 250 rpm durante 45 minutos; las bacterias se
colocaron entonces en placas sobre 1 X de medio de LB que contiene
DHB más 50 \mug/ml de carbenicilina, y se incubaron a 30ºC durante
24 h. Las colonias aisladas se limpiaron entonces sobre 2 X LB
suplementado, y se incubaron a 30ºC durante 16 h. Se prepararon
lotes maestros congelados cosechando bacterias en medio SOC sin
suplementación adicional, y congelando a -70ºC.
Los vectores de expresión enumerados en la
siguiente Tabla 8 se prepararon durante el transcurso del reciente
trabajo.
Los plásmidos de expresión construidos para
estos estudios están compuestos de 3 casetes básicos que codifican
1] la expresión de un antígeno heterólogo, 2] un origen de
replicación plasmídico, y 3] funciones de selección y
estabilización. Para lograr esto, se construyó un replicón básico en
el que estos casetes se separaron mediante sitios de restricción
únicos. Los cebadores usados en la construcción de los
\hbox{casetes plasmídicos se exponen en la siguiente Tabla 9:}
\global\parskip1.000000\baselineskip
Se remodificó mediante ingeniería genética
pTETnir15 (véase la Tabla 8; Oxer et al. 1991) de tal
manera que el origen de replicación de oriE1 y el gen
bla se separaron mediante un único sitio SpeI. Para este
fin, se sintetizó un casete de oriE1 mediante PCR usando Vent
polimerasa con cebadores 1 y 2, y pCVD315 (Galen et al.
1990) como el molde. El fragmento de 735 pb resultante porta los
sitios SpeI y BglII modificados mediante ingeniería
próximos a 5' al promotor que controla la transcripción de ARN II, y
un sitio AvrII modificado mediante ingeniería de 675 bases
procedente de estos sitios. Se llevó a cabo una reacción de PCR
separada usando cebadores 3 y 4 para crear un casete de bla
de 1234 pb que contiene un sitio XbaI modificado mediante
ingeniería próximo a 5' al sitio de EcoRI original. Los
productos de estas dos reacciones de PCR se purificaron en gel, y
se usaron en una PCR de solapamiento, con los cebadores 1 y 4, para
producir un fragmento oriE1-bla de 1916 pb final que
se autoligó para crear pJN1. El fragmento P_{nir15}-toxC a
partir de pTETnir15 se cortó como un fragmento EcoRI
(digestión parcial)-AvaI, en el que el término AvaI
se pulió, y se insertó en la región de clonación múltiple de pSL1180
(Brosius, 1989) escindida con EcoRI y StuI; este
casete se volvió a cortar entonces como un fragmento de EcoRI
(digestión parcial)-AvrII, y se insertó en pJN1 escindido
con EcoRI-AvrII, creando pJN2 (véase Tabla 8).
Para facilitar la identificación sistemática de
un alelo de P_{ompC} osmóticamente regulado funcional a partir de
Escherichia coli, se construyó un casete de
aphA-2, que codifica resistencia a los
aminoglucósidos neomicina y canamicina (Shaw et al. 1993).
Se llevó a cabo una reacción en cadena de polimerasa (PCR) usando
cebadores 5 y 6 con el molde pIB279 (Blomfield et al. 1991),
para generar un producto de 1044 pb, a partir del cual se escindió
un fragmento de BglII-NheI de
aphA-2 de 903 pb sin promotor, para la
sustitución de un casete de BglII-NheI toxC que
codifica el fragmento C de la toxina del tétano en
pTETnir15. El promotor P_{nir15} anaeróbicamente regulado
se sustituyó por un alelo de EcoRI-BglII P_{ompC}
de 459 pb construido usando los cebadores 7 y 8 con ADN molde
cromosómico procedente de DH5\alpha de E. coli, para crear
pKompC. Después de confirmar la inducción osmótica de
P_{ompC} examinando el incremento de la resistencia a canamicina
con la osmolaridad creciente, el casete de
aphA-2 se sustituyó entonces por un gen que
codifica un alelo de GFPuv optimizado en el codón procariota
(Clontech; Crameri et al. 1996). El gen gfpuv se
recuperó mediante PCR usando los cebadores 9 y 10 con el molde
pGFPuv para generar un fragmento de BglII-NheI de 751
pb que se insertó en pKompC, para generar pGFPompC. Las
colonias se identificaron en busca de GFPuv funcional, y después las
colonias más brillantes se examinaron para determinar la inducción
de la fluorescencia con concentraciones crecientes de NaCl. Se
escindió un casete de P_{ompC1}-gfpuv a partir de
pGFPompC1 como un fragmento de EcoRI-NheI, y se
insertó en un derivado de pJN2 escindido con
EcoRI-NheI para crear pJJ4.
Puesto que se pretende que el número de copias
no esté influido por la transcripción que se origina a partir de
promotores fuera del origen de replicación, fue necesario asegurar
que todos los casetes de replicación estuvieran flanqueados en
ambos extremos por terminadores de la transcripción. Debido a que
los casetes del origen y del antígeno de pJN2 están separados por
el terminador trpA, sólo fue necesario insertar un terminador
adicional entre los casetes del origen y de bla.
Para facilitar la construcción de plásmidos
adicionales más tarde, se creó un casete de terA-T1T2.
Primero se escindió pYA292 (Galan et al. 1990) con
HindIII y BglII, y el fragmento del terminador T1T2
se pulió y se insertó en el sitio SmaI de la región de clonación
múltiple de pBluescript II KS (Stratagene); cuando se identificó la
orientación apropiada, este casete se volvió a cortar como un
fragmento de BamHI-PstI, y se insertó en pIB307
(Blomfield et al. 1991) escindido con
BamHI-PstI, creando pJG14. Después se determinó,
mediante análisis de secuencias, que el casete había sufrido una
supresión de aproximadamente 100 pb, eliminando la mitad del
terminador T2.
Usando pBR322 como molde, se usaron los
cebadores 11 y 12 para sintetizar un fragmento de tetA BglII
de 1291 pb. Este fragmento tetA BglII se insertó entonces en
el sitio de BamHI de pJG14 de forma que la transcripción del
gen tetA termine en el terminador T1T2, creando
pJG14tetA. Finalmente, este casete de tetA-T1T2 se
escindió de pJG14tetA como un fragmento de
EcoRI-PstI en el que el sitio de PstI se había
eliminado puliéndolo; el fragmento resultante se insertó en pJJ4, se
escindió con SpeI, se pulió y se volvió a escindir con EcoRI
para sustituir el casete de bla y crear pNRB1.
La función de exterminio
post-segregacional no catalítica a incorporar en los
sistemas de estabilización de plásmidos de los plásmidos de
expresión descritos en la presente memoria fue el lugar
hok-sok, procedente del factor R de
resistencia a múltiples fármacos pR1. Los intentos iniciales en la
recuperación del lugar de hok-sok después de
la PCR no tuvieron éxito. Por lo tanto, fue necesario usar PCR de
solapamiento para generar un casete en el que
hok-sok se fusionó transcripcionalmente a un
gen tetA sin promotor, de tal manera que la transcripción
que se origina a partir del promotor hok continuase en
tetA y diese como resultado un transcrito que codifica tanto
Hok como resistencia a tetraciclina. El ADN plasmídico de pR1 se
purificó a partir de J53(pR1) de E. coli, en la que
pR1 codifica resistencia tanto a carbenicilina como a
cloranfenicol. El fragmento de hok-sok de 640
pb se sintetizó usando los cebadores 13 y 14; se recuperó un
fragmento de tetA de 1245 pb sin promotor en una PCR
separada, usando los cebadores 15 y 12, con pNRB1 como molde. Los
productos de estas dos reacciones de PCR se usaron entonces en una
PCR de solapamiento, con los cebadores 12 y 13, para producir el
fragmento de hok-sok-tetA de
1816 pb final. Este fragmento se insertó como un fragmento de
EcoRI-SphI en pNRB1 escindido con
EcoRI-SphI, regenerando el gen tetA y
creando
pGEN1.
pGEN1.
Entonces se construyó un conjunto de 3 plásmidos
isogénicos, que difieren solamente en el número de copias, a partir
de los cuales se pudiesen derivar todos los demás plásmidos de
expresión. El casete del origen de replicación de
BglII-AvrIIde pGEN1 se sustituyó por un casete de
oriE1 procedente de pJN2, para generar pGEN2. Se sintetizó
un casete de replicación ori15A mediante PCR, usando los
cebadores 16 y 17, con pACYC184 como molde, para generar un
fragmento de BamHI-AvrII de 629 pb, que se insertó en
pGEN2 escindido con BglII-AvrII para generar pGEN3.
Finalmente, se sintetizó un casete de replicación de ori101
mediante PCR usando los cebadores 18 y 19, con pSC101 como molde,
generando un fragmento de BamHI-AvrII de 1949 pb que
se insertó en pGEN2 escindido con BglII-AvrII para
crear pGEN4.
El conjunto principal de plásmidos de expresión
isogénicos, a los que se añadieron secuencialmente elementos
individuales de un sistema de estabilización de plásmidos, estaba
compuesto de pGEN51 (que contiene oriE1), pGEN91 (que
contiene ori15A), y pGEN132 (que contiene ori101). El
replicón básico a partir del cual se construyeron estos 3 plásmidos
fue pJN5, que se ensambló escindiendo el cartucho
P_{ompC}-gfpuv con un fragmento de
EcoRI-NheI a partir de pGFPompC para sustituir
el casete de P_{nir15}-toxC de pJN2. La construcción de
pGEN51 se logró entonces mediante eliminación del casete de
replicación a partir de pGEN2 como un fragmento de BamHI, y
la sustitución del origen de replicación dentro de pJN5, digerido
con BglII y BamHI, regenerando de ese modo el gen
gfpuv. La construcción de pGEN91 y pGEN132 se realizó de
manera idéntica mediante corte de los casetes del origen como
fragmentos de BamHI a partir de pGEN3 y pGEN4,
respectivamente (véase la Figura 7 para la representación de
plásmidos de expresión isogénicos basados en pGEN91).
El lugar de hok-sok se
insertó entonces como un fragmento de XbaI-SalI en
pJN5 escindido con XbaI y SalI, regenerando
nuevamente el gen gfpuv para crear pJN6 (véase la Tabla 2).
La construcción de pGEN71, pGEN111, y pGEN142 se llevó a cabo
entonces exactamente de igual manera que para pGEN51, pGEN91, y
pGEN132, mediante inserción en pJN6 de casetes de origen como
fragmentos de BamHI a partir de pGEN2, pGEN3, y pGEN4,
respectivamente.
La construcción de los plásmidos de expresión de
oriE1 y ori15A que contienen un sistema de
estabilización de plásmidos, compuesto tanto de un sistema de
exterminio post-segregacional como de por lo menos
una función de reparto, se intentó en primer lugar usando la
función par procedente de pSC101. Se sintetizó un fragmento
de BamHI-BglII de 377 pb usando los cebadores 18 y 20,
con ADN molde de pSC101; este fragmento se insertó en pJN6
escindido con BglII, para crear pJN7. Al igual que en las
construcciones anteriores, los casetes del origen procedentes de
pGEN2 y pGEN3 se cortaron entonces como fragmentos de BamHI,
y se insertaron en pJN7 digerido con BglII y BamHI,
para crear pGEN84 y pGEN121.
Los plásmidos de expresión finales se
construyeron introduciendo el lugar de reparto activo parA
procedente de pR1. Al igual que con hok-sok,
los intentos iniciales por recuperar el lugar parA tras la
PCR no tuvieron éxito. Fue necesario usar PCR de solapamiento para
generar un casete de aph-parA, en el que
aph y parA se transcribieron divergentemente y se
separaron mediante sitios de XbaI y XhoI, para
permitir subclonar el lugar de parA. Se sintetizó un
fragmento de parA de 1737 pb usando los cebadores 21 y 22
con pR1 como molde; se recuperó un fragmento de
aphA-2 de 1076 pb en una PCR separada, usando
los cebadores 23 y 24, con pIB279 como molde. Los productos de
estas dos reacciones de PCR se usaron entonces en una PCR de
solapamiento, con los cebadores 22 y 23, para producir el fragmento
de aphA2-parA de 2743 pb final. Este
fragmento se insertó como un fragmento de
EcoRI-SpeI de 2703 pb en pJN6. El casete de
parA se volvió a cortar entonces como un fragmento de
XhoI, y se insertó nuevamente en pJN6 escindido con
XhoI, regenerando el gen gfpuv, y creando pJN8.
Los plásmidos que portan un sistema de
estabilización de plásmidos compuesto de la función
hok-sok de exterminio
post-segregacional y parA se construyeron
mediante corte de los casetes de BamHI-SpeI de
oriE1 y ori15A procedentes de pGEN51 y pGEN91
respectivamente, y mediante inserción en pJN8 escindido con
BamHI y SpeI para crear pGEN183 y pGEN193,
respectivamente. Los plásmidos que contienen el complemento
completo de las funciones de estabilización de
hok-sok, par, y parA, se construyeron
mediante inserción de casetes de origen que contienen par,
tales como los casetes de BamHI-SpeI procedentes de
pGEN84, pGEN121, y pGEN132, en pJN8 escindido con BamHI y
SpeI para crear pGEN211, pGEN222, y pGEN206,
respectivamente.
La cuantificación de GFPuv y de la
estabilización de plásmidos se analizó midiendo la fluorescencia de
vectores vivos que portan plásmidos, usando un sistema de citómetro
de flujo/seleccionador de células Epics Elite ESP (Coulter), con un
láser de argón que excita a las bacterias a 488 nm, detectándose las
emisiones a 525 nm. Se peletizaron 25 ml de 1 X de cultivos de LB,
que se hacen crecer como se describe anteriormente, y las bacterias
se resuspendieron en 1 ml de PBS. Las células se diluyeron entonces
1:1000 en PBS antes de la determinación de recuentos viables y del
análisis de flujo. Se usó dispersión de la luz directa frente a
lateral, medida con amplificadores logarítmicos, para dejar pasar
las bacterias. Se adquirió un mínimo de 50.000 casos de cada
muestra, a una velocidad de recogida de aproximadamente 3500 casos
por segundo. La intensidad media de la fluorescencia, para una
población bacteriana dada, se determinó usando el Paquete de
Análisis Mediante Programa de Ordenador Epics Elite. Los niveles de
la autofluorescencia, determinados usando plásmido menos las cepas
CVD 908-htrA de S. typhi y DH5\alpha de E.
coli, se usaron para colocar marcadores que cuantifican los
porcentajes de bacterias en una población dada que expresa
GFPuv.
El objetivo general de la investigación
presentada en las Sección 6.6-6.10 fue investigar la
factibilidad a la hora de desarrollar un sistema de estabilización
de plásmidos para la estabilización de plásmidos de expresión de
múltiples copias que codifican antígenos extraños en una cepa de
vacuna de vector vivo de S. typhi, sin modificación
adicional del cromosoma. La estabilización de plásmidos de expresión
se potenció a dos niveles independientes. En primer lugar, se
eliminó la dependencia de los sistemas de estabilización letales
equilibrados, que implican enzimas catalíticas expresadas a partir
de plásmidos de múltiples copias; esto se logró mediante la
incorporación, en los plásmidos de expresión, de un sistema de
exterminio post-segregacional basado en el sistema
de adicción de plásmidos hok-sok no
catalítico, procedente del factor pR1 de resistencia a
antibióticos. También se introdujo en estos plásmidos de expresión
por lo menos una función de reparto de plásmidos de origen natural,
para eliminar potencialmente la segregación al azar de tales
plásmidos, potenciando de ese modo su herencia y estabilidad.
Aunque se pretende en último lugar que estos
plásmidos de expresión expresen antígenos inmunógenos y protectores
para el suministro al sistema inmunitario humano, se seleccionó
GFPuv como un antígeno informador de ensayo, debido a que la
cuantificación de la fluorescencia media en una población de
vectores vivos en crecimiento se podría usar como una medida de la
estabilidad de los plásmidos residentes dentro del vector vivo.
Todos los plásmidos de expresión portaron un casete de expresión de
antígeno idéntico, con un alelo P_{ompC1} que controla la
transcripción, y optimizándose la traducción mediante incorporación
de un sitio de unión a ribosoma de consenso. Debido a que no hay
ninguna actividad catalítica asociada con la fluorescencia de GFPuv,
el nivel de intensidad de la fluorescencia medido mediante
citometría de flujo dentro de las bacterias individuales se pudo
correlacionar directamente con la dosificación génica y con el
número de copias. Además, el uso de un promotor de ompC
osmóticamente regulado permitió una evaluación de la estabilidad
plasmídica y de la viabilidad del vector vivo, ya que el aumento de
la osmolaridad indujo niveles más elevados de la síntesis de GFPuv
y presumiblemente niveles más elevados de esfuerzo metabólico sobre
el vector vivo. Como se puede observar en la Tabla 2, se confirmó
que el alelo de P_{ompC1}, modificado mediante ingeniería para
estos estudios, fue sensible a un aumento de la osmolaridad; cuando
dirige la expresión de un gen de resistencia
aph-2, se observó una resistencia a menos de
50 \mug/ml de canamicina en ausencia de presión osmótica, pero la
resistencia aumentó hasta más de 800 \mug/ml en presencia de 300
mM de NaCl. Fue sorprendente que, aunque el alelo P_{ompC1} se
manipuló mediante ingeniería a partir del lugar cromosómico de E.
coli, pareció que funcionaba más eficazmente en S.
typhi. El nivel no inducido de expresión de GFPuv fue el mismo
tanto para DH5\alpha como para CVD 908-htrA (intensidad
media de la fluorescencia de 4,45 frente a 5,37, respectivamente;
Tabla 3). Sin embargo, la síntesis de GFPuv aumentó un 70% en
DH5\alpha después de la inducción, pero se elevó por encima de
300% en CVD 908-htrA (intensidad media de la fluorescencia
de 7,69 frente a 23,4, respectivamente). Este efecto no se limitó al
alelo de P_{ompC1}, sino que fue igualmente notable cuando se usa
P_{ompC3} (Tabla 3). Estos datos no concuerdan con las
observaciones recientes de Martines-Flores et
al. (1999), que informaron que las fusiones genéticas de
ompC-lacZ de E. coli se expresaron
constitutivamente dentro de S. typhi, y que este nivel
constitutivo de expresión fue comparable a niveles inducidos dentro
de E. coli. Aunque se ha indentificado un lugar definido de
mutaciones de punto en el término 3' del alelo P_{ompC1} de E.
coli, que podría explicar su comportamiento controlado
osmóticamente dentro de CVD 908-htrA de S. typhi,
tales mutaciones no se identificaron en P_{ompC3}, lo que también
responde a la osmolaridad en CVD 908-htrA. Sin embargo, se
debe observar que las fusiones genéticas estudiadas por
Martinez-Flores et al. implicaron 1.150 pb de
la región de control en dirección 5' de 5'-ompC de E.
coli, mientras que los alelos de P_{ompC}, construidos en la
presente memoria, implican sólo 459 pb de la región de control
próxima de 5' de ompC. Independientemente de esta
discrepancia, es alentador que los niveles más elevados de expresión
de genes heterólogos regulada se observan dentro de la cepa de
vacuna de vector vivo de S. typhi atenuada.
Se examinaron entonces las contribuciones de
varios sistemas de estabilización de plásmidos a la estabilidad de
los plásmidos dentro de CVD 908-htrA, que crecen en ausencia
de selección de antibióticos. Ninguna combinación de funciones de
estabilización pudo estabilizar plásmidos que contienen orígenes de
replicación de oriE1; de hecho, estos constructos fueron
difíciles de propagar incluso en presencia de antibióticos. Estas
observaciones plantean la duda de la razón de usar plásmidos de
números más elevados de copias para optimizar la expresión de
antígenos heterólogos dentro del citoplasma de vectores vivos a base
de S. typhi, una estrategia que, hasta ahora, han seguido
otros grupos que investigan Salmonella como vectores vivos
(Covone et al. 1998).
La incorporación de sistemas de estabilización
de plásmidos en plásmidos que portan un origen de replicación de
ori15A fue más prometedora. Cuando los vectores vivos que
portan tales plásmidos se hicieron pasar sin selección durante 24 h
a 37ºC, se pusieron de manifiesto los efectos de diversas
combinaciones de funciones de estabilización. En ausencia de
funciones de estabilización, el replicón de ori15A pGEN91 se
perdió en más del 90% de la población, independientemente del nivel
de inducción de P_{ompC1} (véanse la Tabla 6 y la Figura 8). Con
la incorporación del lugar de exterminio
post-segregacional hok-sok en
pGEN111, el porcentaje de bacterias que expresan GFPuv se triplicó
en todas las condiciones de inducción, confirmando las
observaciones de otros de que el lugar de
hok-sok potencia la estabilidad de replicones
de ori15A (Gerdes et al. 1985; Gerdes, 1988; Gerdes
et al. 1997b). Sin embargo, aún se observa que,
independientemente de las condiciones de inducción, más del 50% de
la población bacteriana ya no fluoresce. Puesto que se confirmó que
por lo menos una porción de esta población que no fluoresce aún era
viable y carecía de resistencia a fármacos, estos datos confirman
los informes previos (Gerdes et al. 1986; Wu y Wood, 1994;
Pecota et al. 1997) de que la presencia de un sistema de
exterminio post-segregacional
hok-sok es insuficiente por sí misma para
asegurar que se produzcan bacterias viables sin plásmidos en una
población en crecimiento.
Un posible mecanismo que permite escapar de la
influencia de hok-sok implica mutaciones de
punto espontáneas que surgen dentro del marco de lectura abierta de
Hok letal, que podría inactivar conformacionalmente Hok y de ese
modo permitiría que se produjera la pérdida de plásmido sin
letalidad. Este punto enfatiza el requisito de mecanismos múltiples
para potenciar la estabilidad de plásmidos residentes dentro de
bacterias en crecimiento; si una función de estabilización se
inactiva, la probabilidad de que otras funciones independientes se
inactiven espontáneamente es verdaderamente pequeña. De hecho, tal
redundancia en las funciones de estabilización está muy extendida
dentro de plásmidos de bajo número de copias de origen natural
(Nordstrom y Austin, 1989). Por ejemplo, el factor F del sexo de
Escherichia coli contiene una función de reparto activa (sop)
y dos sistemas de exterminio (ccd y flm) (Loh et
al. 1988; Golub y Panzer, 1988; Van Melderen et al. 1994;
Niki e Hiraga, 1997). De forma similar, el plásmido pR1 de
resistencia a fármacos contiene la función de reparto activa
parA, así como el sistema de exterminio
post-segregacional hok-sok;
además, porta todavía otro sistema de exterminio
kis-kid recientemente definido (Bravo et
al. 1987; Bravo et al. 1988;
Ruiz-Echevarria et al. 1995). Se demuestra
en el trabajo dado a conocer en la presente memoria que la inserción
en replicones de ori15A de múltiples copias de un sistema de
estabilización más completo, compuesto tanto de un sistema
post-segregacional como de dos funciones de reparto,
mejora drásticamente la estabilidad de estos plásmidos de expresión
en ausencia de selección, independientemente de las condiciones de
inducción para la expresión de antígenos heterólogos. Sin embargo,
después de la pasada sin selección durante 48 h, los plásmidos se
perdieron eventualmente de la población bacteriana, debido a que
escapan de la letalidad de Hok. Este problema se ha resuelto
recientemente por Pecota et al (1997), que dio a conocer que
la incorporación de sistemas de exterminio duales mejora
significativamente la estabilidad plasmídica en comparación con el
uso de hok-sok solo; en estos plásmidos no
había funciones de reparto. Quizás la inclusión del sistema de
exterminio kis-kid, para representar de forma más
completa el complemento de funciones de estabilidad de pR1, puede
ser necesaria para la estabilidad óptima de plásmidos de expresión
de mayores números de copias dentro de vectores vivos de S.
typhi; puesto que se han construido recientemente casetes de PSK
de phd-doc, también se examina la
compatibilidad de esta función de PSK en los plásmidos de expresión
pGEN211, pGEN222 y pGEN206.
Una comparación de las cepas que portan pGEN121
(un replicón de ori15A que porta
hok-sok + par, \sim15 copias por
equivalente cromosómico) con el plásmido de un número mucho menor de
copias pGEN142 (un replicón de ori101 que porta
hok-sok + par; \sim5 copias por
equivalente cromosómico) muestra que, en condiciones de inducción
máxima de P_{ompC1} con 300 mM de NaCl, el 57% de una población de
CVD 908-htrA(pGEN121) que se hace pasar durante sólo 24 h
sin selección, fluoresce con una intensidad media de la
fluorescencia de 105,3; para una población de CVD
908-htrA(pGEN142), que se hace pasar durante 96 h sin
selección en condiciones de inducción idénticas, el 94% de las
bacterias analizadas mediante citometría de flujo aún mantiene una
intensidad media de la fluorescencia de 47,7. Basándose en tales
resultados con GFPuv como un antígeno de ensayo, es tentador
suponer que se puede lograr un nivel óptimo de antígeno heterólogo
presentado mediante una vacuna de vector vivo a base de S.
typhi atenuada al sistema inmunitario humano disminuyendo el
número de copias de plásmidos de expresión residentes hasta quizás
5 copias por equivalente cromosómico.
La eficacia de provocar una respuesta
inmunitaria dirigida contra un antígeno heterólogo dependerá, en
parte, de la capacidad del vector vivo para presentar tales
antígenos al sistema inmunitario. La capacidad del vector vivo para
presentar antígenos dependerá a su vez de la estabilidad de los
plásmidos de expresión de múltiples copias que codifican los
antígenos heterólogos. Los resultados demuestran que la inclusión de
un sistema de estabilización de plásmidos dentro de plásmidos de
expresión de múltiples copias, sin posterior manipulación genética
del vector vivo, potencia la estabilidad de tales plásmidos de
expresión. Sin embargo, la presencia de plásmidos de múltiples
copias también puede influir en la capacidad metabólica del vector
vivo. Esto es importante debido a que algunos antígenos extraños de
interés ejercen un efecto pernicioso sobre el vector vivo.
Aunque no se pretende estar atados por esta
teoría, se concluye que se produce una carga metabólica
significativa sobre CVD 908-htrA que porta un plásmido de
expresión de múltiples copias; a medida que aumenta el número de
copias y/o el nivel de expresión génica, aumenta la carga
metabólica. Los estudios con E. coli han establecido
claramente que las bacterias que portan plásmidos crecen de forma
más lenta que las bacterias sin plásmidos (Boe et al. 1987;
McDermott et al. 1993; Wu y Wood, 1994; Pecota et al.
1997; Summers, 1998). También se ha demostrado que, a medida que
aumenta el número de copias, disminuye la velocidad de crecimiento
de tales cepas; de forma similar, a medida que aumenta la inducción
de genes heterólogos, disminuye además la velocidad de crecimiento
(Wu y Wood, 1994; Pecota et al. 1997). Claramente, la pérdida
espontánea de plásmido eliminaría cualquier carga metabólica, y
permitiría que las bacterias sin plásmido superen rápidamente la
población de bacterias que portan plásmidos. En estudios elegantes,
Wu y Wood (Wu y Wood, 1994) mostraron que las cepas de E.
coli que portan plásmidos mantenían los plásmidos en condiciones
cuando la expresión de genes clonados era baja durante 100 h cuando
se hacían pasar en ausencia de selección; por el contrario, en
condiciones de inducción máximas, la pérdida completa de plásmidos
ocurría a las 10 h. De forma interesante, cuando se insertó el
lugar hok-sok en estos plásmidos de
expresión, los plásmidos se mantuvieron durante 300 h en
condiciones no inducidas, y durante 30 h en condiciones de
inducción. Sería de esperar que tal desplazamiento en la expresión
del antígeno dentro de una población de bacterias de vectores vivos
redujese la eficacia de la estimulación de cualquier respuesta
inmunitaria específica frente a un antígeno extraño. El análisis
conduce a concluir que la meta de una vacuna de vector vivo a base
de S. typhi multivalente eficaz es optimizar la viabilidad
usando vectores de expresión estabilizados de menor número de
copias, capaces de expresar niveles elevados de antígeno heterólogo
en respuesta a una señal medioambiental probablemente encontrada
in vivo después de que los organismos de la vacuna hayan
alcanzado un nicho ecológico apropiado. Actualmente se está
ensayando esta estrategia usando el modelo intranasal murino, para
examinar la inmunogenicidad del fragmento C de la toxina del tétano
expresado en CVD 908-htrA a partir de los vectores de
expresión pGEN211 (oriE1), pGEN222 (ori15A), y
pGEN206 (ori101), todos los cuales portan sistemas de
estabilización de plásmidos idénticos, y difieren sólo en el número
de copias. El trabajo presentado en la presente memoria permite el
desarrollo de vacunas de vectores vivos a base de S. typhi
orales, de una sola dosis, capaces de inducir respuestas
inmunitarias protectoras contra patógenos humanos no relacionados
múltiples.
Acheson, D. W. K. 1998.
Nomenclature of enterotoxins. Lancet 351:1003.
Acheson, D. W. K., M. M. Levine,
J. B. Kaper, y G. T. Keusch. 1996. Protective
immunity to Shiga-like toxin I following oral
immunization with Shiga-like toxin I
B-subunit-producing Vibrio
cholerae CVD 103-HgR. Infection and
Immunity 64:355.
Austin, S. J. 1988. Plasmid
partition. Plasmid 20:1.
Austin, S., S. Friedman, y D.
Ludtke. 1986. Partition functions of
unit-copy plasmids can stabilize the maintenance of
plasmid pBR322 at low copy number. J Bacteriol 168:
1010-1013.
Barry, E. M., O. G.
Gomez-Duarte, S. Chatfield, R.
Rappuoli, M. Pizza, G. Losonsky, J. E.
Galen, y M. M. Levine. 1996. Expression and
immunogenicity of pertussis toxin S1 subunit-tetanus
toxin fragment C fusions in Salmonella typhi vaccine strain
CVD 908. Infection and Immunity
64:4172-4181.
Barth, P. T., H. Richards, y N.
Datta. 1978. Copy numbers of coexisting plasmids in
Escherichia coli K-12. J. Bacteriol
135: 760-765.
Bast, D. J., J. L. Brunton, M. A.
Karmali, y S. E. Richardson. 1997. Toxicity and
immunogenicity of a verotoxin 1 mutant with reduced
globotriaosylceramide receptor binding in rabbits. Infection and
Immunity 65:2019.
Baumler, A. J., J. G. Kusters, I.
Stojiljkovic, y F. Heffron. 1994. Salmonella
typhimurium loci involved in survival within macrophages.
Infection and Immunity 62:1623.
Beaucage, S. L., C. A. Miller, y
S. N. Cohen. 1991. Gyrase-dependent
stabilization of pSC101 plasmid inheritance by transcriptionally
active promoters. EMBO J 10: 2583-2588.
Blattner, F. R., G. Plunkett III,
C. A. Bloch, N. T. Perna, V. Burland, M.
Riley, J. Collado-Vides, J. D.
Glasner, C. K. Rode, G. F. Mayhew, J.
Gregor, N. W. Davis, H. A. Kirkpatrick, M. A.
Goeden, D. J. Rose, B. Mau, y Y. Shao.
1997. The complete genome sequence of Escherichia coli
K-12. Science 277:1453.
Blomfield, I. C., V. Vaughn, R. F.
Rest, y B. I. Eisenstein. 1991. Allelic
exchange in Escherichia coli using the Bacillus subtilis
sacB gene and a temperature-sensitive pSC101
replicon. Molecular Microbiology
5:1447-1457.
Boe, L. y K. V. Rasmussen.
1996. Suggestions as to quantitative measurements of plasmid
loss. Plasmid 36:153.
Boe, L., K. Gerdes, y S.
Molin. 1987. Effects of genes exerting growth
inhibition and plasmid stability on plasmid maintenance. Journal
of Bacteriology 169:4646-4650.
Bokman, S. H. y W. W. Ward.
1981. Renaturation of Aequorea
green-fluorescent protein. Biochemical and
Biophysical Research Communications 101:1372.
Bosworth, B. T., J. E. Samuel, H.
W. Moon, A. D. O'Brien, V. M. Gordon, y S. C.
Whipp. 1996. Vaccination with genetically modified
Shiga-like toxin lle prevents edema disease in
swine. Infection and Immunity 64:55.
Bouvier, J., C. Richaud, W.
Higgins, O. Bogler, y P. Stragier. 1992.
Cloning, characterization, and expression of the dapE gene
of Escherichia coli. Journal of Bacteriology 174:5265.
Boyd, B. y C. A. Lingwood.
1989. Verotoxin receptor glycolipid in human renal tissue.
Nephron 51:207.
Bravo, A., G. de Torrontegui, y R.
Diaz. 1987. Identification of components of a new
stability system of plasmid R1, ParD, that is close to the origin
of replication of this plasmid. Mol Gen Genet 210:
101-110.
Bravo, A., S. Ortega, G. de
Torrontegui, y R. Diaz. 1988. Killing of
Escherichia coli cells modulated by components of the
stability system parD of plasmid R1. Mol Gen Genet
215: 146-151.
Brosius, J. 1989. Superpolylinkers
in cloning and expression vectors. DNA 8:
759-777.
Butterton, J. R., E. T. Ryan, D.
W. Acheson, y S. B. Calderwood. 1997.
Coexpression of the B subunit of Shiga toxin 1 and EaeAfrom
enterohemorrhagic Escherichia coli in Vibrio choleraevaccine
strains. Infection and Immunity
65:2127-2135.
Cabello, F., K. Timmis, y S. N.
Cohen. 1976. Replication control in a composite
plasmid constructed by in vitro linkage of two distinct
replicons. Nature 259: 285-290.
Calderwood, S. B., D. W. K.
Acheson, G. T. Keusch, T. J. Barrett, P. M.
Griffin, N. A. Strockbine, B. Swaminathan, J.
B. Kaper, M. M. Levine, B. S. Kaplan, H.
Karch, A. D. O'Brien, T. G. Obrig, Y.
Takeda, P. I. Tarr, y I. K. Wachsmuth.
1996. Proposed new nomenclature for SLT (VT) family. ASM
News 62:118.
Calderwood, S. B., F. Auclair, A.
Donohue-Rolfe, G. T. Keusch, y J. J.
Mekalanos. 1987. Nucleotide sequence of the
Shiga-like toxin genes of Escherichia coli.
Proceedings of the National Academy of Sciences USA
84:4364.
Carlini, L. E., R. D. Porter, U.
Curth, y C. Urbanke. 1993. Viability and
preliminary in vivo characterization of
site-specific mutants of Escherichia coli
single-stranded DNA-binding protein.
Molecular Microbiology 10:1067.
Carter, P. B. y F. M. Collins.
1974. Growth of typhoid and paratyphoid bacilli in
intravenously infected mice. Infection and Immunity
10:816.
Cerin, H. y J. Hackett.
1989. Molecular cloning and analysis of the incompatibility
and partition functions of the virulence plasmid of Salmonella
typhimurium. Microbial Pathogenesis 7:85.
Cerin, H. y J. Hackett.
1993. The parVP region of the Salmonella
typhimurium virulence plasmid pSLT contains four loci required
for incompatibility and partition. Plasmid 30:30.
Chalfie, M., Y. Tu, G.
Euskirchen, W. W. Ward, y D. C. Prasher.
1994. Green fluorescent protein as a marker for gene
expression. Science 263:802.
Chambers, S. P., S. E. Prior, D.
A. Barstow, y N. P. Minton. 1988. The
pMTLnic cloning vectors. I. Improved pUC polylinker regions
to facilitate the use of sonicated DNA for nucleotide sequencing.
Gene 68:139.
Chang, A. C. Y., y S. N. Cohen.
1978. Construction and characterization of amplifiable
multicopy DNA cloning vehicles derived from the P1 5A cryptic
miniplasmid. J Bacteriol 134: 1141-1156.
Chase, J. W. y K. R. Williams.
1986. Single-stranded DNA binding proteins
required for DNA replication. Annual Reviews in Biochemistry
55:103.
Chase, J. W., J. B. Murphy, R. F.
Whittier, E. Lorensen, y J. J. Sninsky.
1983. Amplification of ssb-1 mutant
single-stranded DNA-binding protein
in Escherichia coli. Journal of Molecular Biology
163,164:193.
Chatfield, S., K. Strahan, D.
Pickard, I. G. Charles, C. E. Hormaeche, y G.
Dougan. 1992. Evaluation of Salmonella
typhimurium strains harbouring defined mutations in htrA
and areA in the murine salmonellosis model. Microbial
Pathogenesis 12:145.
Clark, C., D. Bast, A. M.
Sharp, P. M. St.Hilaire, R. Agha, P. E.
Stein, E. J. Toone, R. J. Read, y J. L.
Brunton. 1996. Phenylalanine 30 plays an important
role in receptor binding of verotoxin-1.
Molecular Microbiology 19:891.
Conradi, H. 1903. Ueber
losliche,durch aseptische autolyse erhaltene giftstoffe von ruhr-
und Typhusbazillen. Dtsch. Med. Wochenschr.
29:26.
Covarrubias, L., L. Cervantes, A.
Covarrubias, X. Soberon, I. Vichido, A.
Blanco, Y. M. Kupersztoch -Portnoy, y F.
Bolivar. 1981. Construction and characterization of
new cloning vehicles. V. Mobilization and coding properties of
pBR322 and several deletion derivatives including pBR327 and pBR328.
Gene 13: 25-35.
Covone, M. G., M. Brocchi, E.
Palla, W. D. da Silveira, R. Rappuoli, y C. L.
Galeotti. 1998. Levels of expression and
immunogenicity of attenuated Salmonella enterica serovar
typhimurium strains expressing Escherichia coli mutant
heat-labile enterotoxin. Infection and Immunity
66:224-231.
Crameri, A., E. A. Whitehorn, E.
Tate, y W. P. Stemmer. 1996. Improved green
fluorescent protein by molecular evolution using DNA shuffling.
Nat Biotechnol 14: 315-319.
Dam, M. y K. Gerdes. 1994.
Partitioning of plasmid R1: ten direct repeats flanking the
parA promoter constitute a centromere-like
partition site parC, that expresses incompatibility.
Journal of Molecular Biology 236:1289-
1298.
1298.
Dopf, J. y T. M. Horiagon.
1996. Deletion mapping of the Aequorea victoria green
fluorescent protein. Gene 173:39.
Downes, F. P., T. J. Barrett, J.
H. Green, C. H. Aloisio, J. S. Spika, N. A.
Strockbine, y I. K. Wachsmuth. 1988. Affinity
purification and characterization of Shiga-like
toxin II and production of toxin-specific monoclonal
antibodies. Infection and Immunity 56:1926.
Egger, L. A., H. Park, y M.
Inouye. 1997. Signal transduction via the
histidyl-aspartyl phosphorelay. Genes to Cells
2:167.
Endo, Y., K. Tsurugi, T.
Yutsudo, Y. Takeda, T. Ogasawara, y K.
Igarashi. 1988. Site of action of a Vero toxin (VT2)
from Escherichia coli O1 57:H7 and of Shiga toxin on
eukaryotic ribosomes: RNA N-glycosidase activity of the
toxins. European Journal of Biochemistry 171:45.
Forrest, B. D., J. T. Labrooy, S.
R. Attridge, G. Boehm, L. Beyer, R.
Morona, D. J. C. Shearman, y D. Rowley.
1989. Immunogenicity of a candidate live oral
typhoid/cholera hybrid vaccine in humans. J. Infect. Dis.
159: 145.
Fraser, M. E., M. M. Chernaia, Y.
V. Kozlov, y M. N. G. James. 1994. Crystal
structure of the holotoxin from Shigella dysenteriae at 2.5
A resolution. Nature Structural Biology 1:59.
Galan, J. E., K. Nakayama, y R.
Curtiss III. 1990. Cloning and characterization of the
asd gene of Salmonella typhimurium: use in stable
maintenance of recombinant plasmids in Salmonella vaccine
strains. Gene 94:29-35.
Galen, J. E. y M. M. Levine.
1995. Improved suicide vectors for chromosomal mutagenesis in
Salmonella typhi. Abstracts of the Annual Meeting of the
American Society of Microbiology H192:(Abstract).
Galen, J. E. y M. M. Levine.
1996. Further refinements of suicide
vector-mediated chromosomal mutagenesis in
Salmonella typhi. Abstracts of the Annual Meeting of the
American Society of Microbiology H260:(Abstract).
Galen, J. E., O. G.
Gomez-Duarte, G. Losonsky, J. L.
Halpern, C. S. Lauderbaugh, S. Kaintuck, M. K.
Reymann, y M. M. Levine. 1997. A murine model
of intranasal immunization to assess the immunogenicity of
attenuated Salmonella typhi live vectorvaccines in
stimulating serum antibody responses to expressed foreign antigens.
Vaccine 15:700-708.
Galen, J. E., E. R. Vimr, L.
Lawrisuk, y J. B. Kaper. 1990. Cloning,
sequencing, and expression of the gene, nanH, for Vibrio
cholerae neuraminidase. In Advances in research on
cholera and related diarrheas (Publicado por Sack R. B. y
Zinnake Y. Tokyo: KTK Scientific Publishers. p.
143-153.
Gay, P., D. Le Coq, M.
Steinmetz, E. Ferrari, y J. A. Hoch.
1983. Cloning structural gene sacB, which codes for
exoenzyme levansucrase of Bacillus subtilis: expression of
the gene in Escherichia coli. Journal of Bacteriology
153:1424.
Gerdes, K. 1988. The parB
(hok-sok) locus of plasmid R1: a general purpose
plasmid stabilization system. Biol. Technology 6:
1402-1405.
Gerdes, K. y S. Molin.
1986. Partitioning of plasmid R1: structural and functional
analysis of the parA locus. Journal of Molecular Biology
190:269.
Gerdes, K., A. P. Gultyaev, T.
Franch, K. Pedersen, y N. D. Mikkelsen.
1997. Antisense RNA-regulated programmed
cell death. Annual Reviews in Genetics
31:1-31.
Gerdes, K., J. S. Jacobsen, y T.
Franch. 1997b. Plasmid stabilization by
post-segregational killing. Genet Eng (NY)
19: 49-61.
Gerdes, K., J. E. Larsen, y S.
Molin. 1985. Stable inheritance of plasmid R1 requires
two different loci. J. Bacteriol 161:
292-298.
Gerdes, K., P. B. Rasmussen, y S.
Molin. 1986. Unique type of plasmid maintenance
function: postsegregational killing of plasmid-free
cells. Proc Natl Acad Sci USA 83:
3116-3120.
Gerichter, C. B. 1960. The
dissemination of Salmonella typhi, S. paratyphiA, and
S. paratyphi B through the organs of the white mouse
by oral infection. Journal of Hygiene, Cambridge 58:307.
Gerichter, C. B. y D. L. Boros.
1962. Dynamics of infection of the blood stream and internal
organs of white mice with Salmonella typhi by
intraperitoneal injection. Journal of Hygiene, Cambridge
60:311.
Golub, E. I., y H. A. Panzer.
1988. The F factor of Escherichia coli carries a locus
of stable plasmid inheritance stm, similar to the
parB locus of plasmid R1. Mol Gen Genet 214:
353-357.
Gomez-Duarte, O. G., J.
E. Galen, S. N. Chatfield, R. Rappuoli, L.
Eidels, y M. M. Levine. 1995. Expression of
fragment C of tetanus toxin fused to a
carboxyl-terminal fragment of diphtheria toxin in
Salmonella typhi CVD 908 vaccine strain. Vaccine
13:1596.
Gonzalez, C., D. M. Hone, F.
Noriega, C. O. Tacket, J. R. Davis, G.
Losonsky, J. P. Nataro, S. Hoffman, A.
Malik, E. Nardin, M. Sztein, D. G.
Heppner, T. R. Fouts, A. Isibasi, y M. M.
Levine. 1994. Salmonella typhi vaccine strain
CVD 908 expressing the circumsporozoite protein of Plasmodium
falciparum: strain construction and safety and immunogenicity
in humans. Journal of Infectious Diseases
169:927-931.
Gordon, V. M., S. C. Whipp, H. W.
Moon, A. D. O'Brien, y J. E. Samuel.
1992. An enzymatic mutant of Shiga like toxin II variant is
a vaccine candidate for edema disease of swine. Infection and
Immunity 60:485.
Gottesman, S., W. P. Clark, V. de
Crecy-Lagard, y M. R. Maurizi.
1993. ClpX, an alternative subunit for the
ATP-dependent Clp protease of Escherichia
coli. Journal of Biological Chemistry 268:22618.
Green, J. M., B. P. Nichols, y R.
G. Matthews. 1996. Folate biosynthesis, reduction, and
polyglutamylation. In Escherichia coli and Salmonella: Cellular
and molecular biology. 2ª ed. F. C. Neidhardt, R. Curtiss III,
J. L. Ingraham, E. C. C. Lin, K. B. Low, B. Magasanik, W. S.
Reznikoff, M. Riley, M. Schaechter y H. E. Umbarger, eds. ASM
Press, Washington, D.C. p. 665.
Griffin, P. M. 1995.
Escherichia coli O157:H7 and other enterohemorrhagic
Escherichia coli. In Infections of the gastrointestinal
tract. M. J. Blaser, P. D. Smith, J. I. Ravdin, H. B. Greenberg
y R. L. Guerrant, ed. Raven Press, Ltd, Nueva York, p. 739.
Gyles, C. L. 1992. Escherichia
coli cytotoxins and enterotoxins. Canadian Journal of
Microbiology 38:734.
Heim, R., D. C. Prasher, y R. Y.
Tsien. 1994. Wavelength mutations and
posttranscriptional autoxidation of green fluorescent protein.
Proceedings of the National Academy of Sciences USA
91:12501.
Hiszczynska-Sawicka, E.,
y J. Kur. 1997. Effect of Escherichia coli IHF
mutations on plasmid p15A copy number. Plasmid 38:
174-179.
Hoiseth, S. K. y B. A. Stocker.
1981. Aromatic-dependent Salmonella
typhimurium are non-virulent and effective as
live vaccines. Nature 291:238.
Hone, D. M., A. M. Harris, S.
Chatfield, G. Dougan, y M. M. Levine.
1991. Construction of genetically defined double aro
mutants of Salmonella typhi. Vaccine 9:
810-816.
Hovde, C. J., S. B. Calderwood, J.
J. Mekalanos, y R. J. Collier. 1988. Evidence
that glutamic acid 167 is an active-site residue of
Shiga-like toxin I. Proceedings of the National
Academy of Sciences USA 85:2568.
Jackson, M. P., E. A. Wadolkowski,
D. L. Weinstein, R. K. Holmes, y A. D. O'Brien.
1990. Functional analysis of the Shiga toxin and
Shiga-like toxin type II variant binding subunits by
using site-directed mutagenesis. Journal of
Bacteriology 172:653.
Jackson, M. P., R. J. Neill, A. D.
O'Brien, R. K. Holmes, y J. W. Newland.
1987. Nucleotide sequence analysis and comparison of the
structural genes for Shiga-like toxin I and
Shiga-like toxin II encoded by bacteriophages from
Escherichia coli. FEMS Microbiology Letters
44:109.
Jackson, M. P., R. L. Deresiewicz,
y S. B. Calderwood. 1990. Mutational analysis of the
Shiga toxin and Shiga like toxin II enzymatic subunits. Journal
of Bacteriology 172:3346.
Jarvis, K. G. y J. B. Kaper.
1996. Secretion of extracellular proteins by
enterohemorrhagic Escherichia coli via a putative type III
secretion system. Infection and Immunity 64:4826.
Jarvis, K. G., J. A. Giron, A. E.
Jerse, T. K. McDaniel, M. S. Donnenberg, y J.
B. Kaper. 1995. Enteropathogenic Escherichia
coli contains a putative type III secretion system necessary for
the export of proteins involved in attaching and effacing lesion
formation. Proceedings of the National Academy of Sciences USA
92:7996.
Jensen, R. B. y K. Gerdes.
1995. Programmed cell death in bacteria: proteic plasmid
stabilization systems. Molecular Microbiology 17:205.
Jensen, R. B. y K. Gerdes.
1997. Partitioning of plasmid R1. The ParM protein
exhibits ATPase activity and interacts with the
centromere-like ParR-parC complex.
Journal of Molecular Biology 269:505-513.
Karem, K. L., S. Chatfield, N.
Kuklin, y B. T. Rouse. 1995. Differential
induction of carrier antigen-specific immunity by
Salmonella typhimurium live-vaccine strains
after single mucosal or intravenous immunization of BALB/c mice.
Infection and Immunity 63:4557-4563.
Karmali, M. A. 1989. Infection by
verocytotoxin-producing Escherichia coli.
Clinical Microbiological Reviews 2:15.
Karmali, M. A., M. Petric, C.
Lim, P. C. Fleming, y B. T. Steele.
1983. Escherichia coli cytotoxin, haemolyticuraemic
syndrome, and haemorrhagic colitis. Lancet ii: 1299.
Karmali, M. A., M. Petric, C.
Lim, P. C. Fleming, G. S. Arbus, y H.
Lior. 1985. The association between idiopathic
hemolytic uremic syndrome and infection by
verotoxin-producing Escherichia coli.
Journal of Infectious Diseases 151:775.
Karpman, D., H. Connell, M.
Svensson, F. Scheutz, P. Alm, y C.
Svanborg. 1997. The role of lipopolysaccharide and
Shiga-like toxin in a mouse model of Escherichia
coli O157:H7 infection. Journal of Infectious Diseases
175:611.
Keusch, G. T., G. F. Grady, L. J.
Mata, y J. Mclver. 1972. Pathogenesis of
shigella diarrhea. 1. Enterotoxin production by Shigella
dysenteriae 1. Journal of Clinical Investigation
51:1212.
Killeen, K. P., V. Escuyer, J. J.
Mekalanos, y R. J. Collier. 1992. Reversion of
recombinant toxoids: mutations in diphtheria toxin that partially
compensate for active-site deletions. Proceeding
of the National Academy of Sciences USA 89:6207.
Kim, J. Y., H. A. Kang, y D. D.
Ryu. 1993. Effects of the par locus on the growth rate
and structural stability of recombinant cells. Biotechnology
Progress 9:548.
Konowalchuk, J., J. I. Speirs, y
S. Stavric. 1977. Vero response to a cytotoxin of
Escherichia coli. Infection and Immunity 18:775.
Langermann, S., S. Palaszynski, A.
Sadziene, C. K. Stover, y S. Koenig.
1994. Systemic and mucosal immunity induced by BCG vector
expressing outer-surface protein A of Borrelia
burgdorferi. Nature 372: 552-555.
Lee, S. F., R. J. March, S. A.
Halpern, G. Faulkner, y L. Gao. 1999.
Surface expression of a protective recombinant pertussis toxin S1
subunit fragment in Streptococcus gordonii. Infect Immun
67: 1511-1516.
Lehnherr, H. y M. B. Yarmolinsky.
1995. Addiction protein Phd of plasmid prophage P1 is a
substrate of the CIpXP serine protease of Escherichia coli.
Proceedings of the National Academy of Sciences USA
92:3274.
Lehnherr, H., E. Maguin, S.
Jafri, y M. B. Yarmolinsky. 1993. Plasmid
addiction genes of bacteriophage P1: doc, which causes cell death
on curing of prophage, and phd, which prevents host death
when prophage is retained. Journal of Molecular Biology
233:414.
Levine, M. M., J. E. Galen, E. M.
Barry, F. Noriega, S. Chatfield, M.
Sztein, G. Dougan, y C. O. Tacket. 1996.
Attenuated Salmonella as live oral vaccines against typhoid
fever and as live vectors. Journal of Biotechnology 44:
193.
Lindgren, S. W., J. E. Samuel, C.
K. Schmitt, y A. D. O'Brien. 1994. The specific
activities of Shiga-like toxin type II
(SLT-II) and
SLT-II-related toxins of
enterohemorrhagic Escherichia coli differ when measured by
Vero cell cytotoxicity but not by mouse lethality. Infection and
Immunity 62:623.
Lloyd, R. G. and K. B. Low.
1996. Homologous recombination. In Escherichia coli
and Salmonella: Cellular and molecularbiology. 2ª ed.
F. C. Neidhardt, R. Curtiss III, J. L. Ingraham, E. C. C. Lin, K. B.
Low, B. Magasanik, W. S. Reznikoff, M. Riley, M. Schaechter y H. E.
Umbarger, ed. ASM Press, Washington, D.C. p. 2236.
Loh, S. M., D. S. Cram, y R. A.
Skurray. 1988. Nucleotide sequence and transcriptional
analysis of a third function (Flm) involved in F plasmid
maintenance. Gene 66: 259-268.
Lohman, T. M. y M. E. Ferrari.
1994. Escherichia coli single-stranded
DNA-binding protein: multiple
DNA-binding modes and cooperativities. Annual
Reviews in Biochemistry 63:527.
Louise, C. B. y T. G. Obrig.
1995. Specific interaction of Escherichia coli
O157:H7-derived Shiga-like toxin II
with human renal endothelial cells. Journal of Infectious
Diseases 172:1397.
Love, C. A., P. E. Lilley, y N. E.
Dixon. 1996. Stable
high-copy-number bacteriophage
lambda promoter vectors for overproduction of proteins in
Escherichia coli. Gene 176:49.
Lynch, A. S. y E. C. C. Lin.
1996. Responses to molecular oxygen. In Escherichia
coli and Salmonella: Cellular and
molecularbiology. 2a ed. F. C. Neidhardt, R. Curtiss III, J. L.
Ingraham, E. C. C. Lin, K. B. Low, B. Magasanik, W. S. Reznikoff,
M. Riley, M. Schaechter y H. E. Umbarger, ed. ASM Press, Washington,
D.C. p. 1526.
\newpage
Magnuson, R., H. Lehnherr, G.
Mukhopadhyay, y M. B. Yarmolinsky. 1996.
Autoregulation of the plasmid addiction operon of bacteriophage P1.
Journal of Biological Chemistry 271:18705.
Makoff, A. J., y A .E. Smallwood.
1988. Heterologous expression in Escherichia coli:
effects of alterations in the sequence 5' to the initiation codon.
Biochem Soc Trans 16: 48-49.
Mangeney, M., C. A. Lingwood, S.
Taga, B. Caillou, T. Tursz, y J. Wiels.
1993. Apoptosis induced in Burkitt's lymphoma cells via
Gb3/CD77, a glycolipid antigen. Cancer Research 53:5314.
Marshall, J., R. Molloy, G. W. J.
Moss, J. R. Howe, y T. E. Hughes. 1995.
The jellyfish green fluorescent protein: a new tool for studying
ion channel expression and function. Neuron 14:211.
Martinez-Flores, I., R.
Cano, V. H. Bustamante, E. Calva, y J. L.
Puente. 1999. The ompB operon partially
determines differential expression of OmpC in Salmonella
typhi and Escherichia coli. J Bacteriol 181:
556-562.
Matthews, R. G. 1996.
One-carbon metabolism. In Escherichia coli
and Salmonella: Cellular and molecularbiology. 2ª ed.
F. C. Neidhardt, R. Curtiss III, J. L. Ingraham, E. C. C. Lin, K. B.
Low, B. Magasanik, W. S. Reznikoff, M. Riley, M. Schaechter y H. E.
Umbarger, ed. ASM Press, Washington, D.C. p. 600.
Maurizi, M. R., W. P. Clark, Y.
Katayama, S. Rudikoff, J. Pumphrey, B.
Bowers, y S. Gottesman. 1990. Sequence and
structure of Clp P, the proteolytic component of the
ATP-dependent Clp protease of Escherichia
coli. Journal of Biological Chemistry 265:12536.
McClelland, M. y R. Wilson.
1998. Sample sequencing of the Salmonella typhi
genome: comparison to the E. coli K-12
genome. Infection and Immunity.
McDaniel, T. K., K. G. Jarvis, M
.S. Donnenberg, y J. B. Kaper. 1995. A genetic
locus of enterocyte effacement conserved among diverse
enterobacterial pathogens. Proceedings of the National Academy of
Sciences USA 92: 1664.
McDermott, P. J., P. Gowland, y P.
C. Gowland. 1993. Adaptation of Escherichia
coli growth rates to the presence of pBR322. Lett Appl
Microbiol 17: 139-143.
Meacock, P. A., y S. N. Cohen.
1980. Partitioning of bacterial plasmids during cell
division: a cis-acting locus that accomplishes
stable plasmid inheritance. Cell 20:
529-542.
Medaglini, D., G. Pozzi, T. P.
King, y V. A. Fischetti. 1995. Mucosal and
systemic immune responses to a recombinant protein expressed on the
surface of the oral commensal bacterium Streptococcus
gordonii after oral colonization. Proc Natl Acad Sci USA
92: 6868-6872.
Melton-Celsa, A. R. y A.
D. O'Brien. 1998. The structure, biology, and relative
toxicity for cells and animals of Shiga toxin family members. In
Escherichia coli O157:H7 and other Shiga
toxin-producing E. coli strains.
J. B. Kaper y A. D. O'Brien, ed. ASM Press, Washington, D.C. In
press.
Mikkelsen, N. D. y K. Gerdes.
1997. Sok antisense RNA from plasmid R1 is functionally
inactivated by RNaseE and polyadenylated by poly(A)
polymerase I. Molecular Microbiology 26:311.
Miller, C. A., S. L. Beaucage, y
S. N. Cohen. 1990. Role of DNA superhelicity in
partitioning of the pSC101 plasmid. Cell 62:
127-133.
Moxley, R. A. y D. H. Francis.
1998. Overview of Animal Models. In Escherichia coli
O157:H7and other Shiga toxin-producing E. coli
strains. J. B. Kaper y A. D. O'Brien, eds. ASM Press,
Washington, D.C. In press.
Muhldorfer, I., J. Hacker, G. T.
Keusch, D. W. Acheson, H. Tschape, A. V.
Kane, A. Ritter, T. Olschiager, y A.
Donohue-Rolfe. 1996. Regulation of the
Shiga-like toxin II operon in Escherichia
coli. Infection and Immunity 64:495.
Nakayama, K., S. M. Kelley, y R.
Curtiss III. 1988. Construction of an Asd+
expression-cloning vector: stable maintenance and
high level expression of cloned genes in a Salmonella vaccine
strain. Bio/Technology 6: 693-697.
Nakayama, K., S. M. Kelley, y R.
Curtiss III. 1988. Construction of an Asd+
expression-cloning vector: stable maintenance and
high level expression of cloned genes in a Salmonella vaccine
strain. Bio/Technology 6:693.
Nelson, S., S. E. Richardson, C.
A. Lingwood, M. Petric, y M. A. Karmali.
1994. Biological activity of verocytotoxin (VT)2c and
VT1/VT2c chimeras in the rabbit model. In Recent advances in
verocytotoxin-producing Escherichia Coli
infections. M.A. Karmali y A.G. Goglio, ed. Elsevier Science,
Nueva York, p. 245.
Niki, H., y S. Hiraga.
1997. Subcellular distribution of actively partitioning F
plasmid during the cell division cycle of E. coli. Cell
90: 951-957.
Nordstrom, K. y S. J. Austin.
1989. Mechanisms that contribute to the stable segregation of
plasmids. Annual Reviews in Genetics 23:37.
Noriega, F. R., G. Losonsky, J. Y.
Wang, S. B. Formal, y M. M. Levine.
1996. Further characterization of \DeltaaroA\DeltavirG Shigella flexneri2a strain CVD 1203 as a mucosal
Shigella vaccine and as a live-vector
vaccine for delivering antigens of enterotoxigenic Escherichia
coli. Infect Immun 64: 23-27.
Norioka, S., G. Ramakrishnan, K.
Ikenaka, y M. Inouye. 1986. Interaction of a
transcriptional activator, OmpR, with reciprocally osmoregulated
genes, ompF and ompC, of Escherichia coli.
Journal of Biological Chemistry 261:
17113-17119.
Nyholm, P., G. Magnusson, Z.
Zheng, R. Norel, B.
Binnington-Boyd, y C. A. Lingwood.
1996. Two distinct binding sites for globotriaosyl ceramide
on verotoxins: identification by molecular modelling and
confirmation using deoxy analogues and a new glycolipid receptor
for all verotoxins. Chemistry and Biology 3:263.
Nyholm, P., J. L. Brunton, y C. A.
Lingwood. 1995. Modelling of the interaction of
verotoxin-1 (VT1) with its glycolipid receptor,
globotriaosylceramide (Gb3). International Journal of Biological
Macromolecules 17:199.
O'Brien, A. D. 1982. Innate
resistance of mice to Salmonella typhi infection.
Infection and Immunity 38:948.
O'Brien, A. D., V. L. Tesh, A.
Donohue-Rolfe, M. P. Jackson, S.
Olsnes, K. Sandvig, A. A. Lindberg, y G. T.
Keusch. 1992. Shiga toxin: biochemistry,genetics,mode
of action, and role in pathogenesis. Current Topics in
Microbiology and Immunology 180:65.
Olitsky, P. K. y I. J. Kligler.
1920. Toxins and antitoxins of Bacillus dysenteriae
Shiga. Journal of Experimental Medicine 31:19.
Orosz, A., I. Boros, y P.
Venetianer. 1991. Analysis of the complex
transcription termination region of the Escherichia coli rrnB gene. European Journal of Biochemistry
201:653.
Oxer, M. D., C. M. Bentley, J. G.
Doyle, T. C. Peakman, I. G. Charles, y A. J.
Makoff. 1991. High level heterologous expression in
E. coli using the anaerobically-activated
nirB promoter. Nucleic Acids Research
19:2889-2892.
Pallen, M. J. y B. W. Wren.
1997. The HtrA family of serine proteases. Molecular
Microbiology 26:209.
Pecota, D. C., C. S. Kim, K.
Wu, K. Gerdes, y T. K. Wood. 1997.
Combining the hok/sok, parDE, and pnd
postsegregational killer loci to enhance plasmid stability.
Applied and Environmental Microbiology
63:1917-1924.
Perera, L. P., J. E. Samuel, R. K.
Holmes, y A. D. O'Brien. 1991. Mapping the
minimal contiguous gene segment that encodes functionally active
Shiga-like toxin II. Infection and Immunity
59:829.
Perera, L. P., J. E. Samuel, R. K.
Holmes, y A. D. O'Brien. 1991. Identification
of three amino acid residues in the B subunit of Shiga toxin and
Shiga-like toxin type II that are essential for
holotoxin activity. Journal ofBacteriology 173:1151.
Pittard, A. J. 1996. Biosynthesis
of the aromatic amino acids. In Escherichia coli and Salmonella:
Cellular and molecularbiology. 2ª ed. F. C. Neidhardt, R.
Curtiss III, J. L. Ingraham, E. C. C. Lin, K. B. Low, B. Magasanik,
W. S. Reznikoff, M. Riley, M. Schaechter y H. E. Umbarger, ed. ASM
Press, Washington, D.C. p. 458.
Polisky, B. 1986. Replication
control of the ColE1-type plasmids. In Maximizing
gene expression. W. S. Reznikoff y L. Gold, ed. Butterworths,
Boston, p. 143.
Porter, R. D., S. Black, S.
Pannuri, y A. Carlson. 1990. Use of the
Escherichia coli ssb gene to prevent bioreactor
takeover by plasmidless cells. Bio/Technology 8:47.
Pouwels, P. H., R. J. Leer, M.
Shaw, M. J. Heijne den Bak-Glashouwer,
F. D. Tielen, E., Smit, B. Martinez, J.
Jore, y P. L. Conway. 1998. Lactic acid
bacteria as antigen delivery vehicles for oral immunization
purposes. Int J Food Microbiol 41:
155-167.
Pratt, L. A., W. Hsing, K. E.
Gibson, y T. J. Silhavy. 1996. From acids to
osmZ: mutiplefactors influence synthesis of the OmpF and
OmpC porins in Escherichia coli. Molecular Microbiology
20:91 1.
Puente, J. L., V.
Alvarez-Scherer, G. Gosset, y E.
Calva. 1989. Comparative analysis of the Salmonella
typhi and Escherichia coli ompC genes. Gene
83:197.
Richardson, S. E., T. A. Rotman,
V. Jay, C. R. Smith, L. E. Becker, M.
Petric, N. F. Olivieri, y M. A. Karmali.
1992. Experimental verocytotoxemia in rabbits. Infection
and Immunity 60:4154.
Ringquist, S., S. Shinedling, D.
Barrick, L. Green, J. Binkley, G. D.
Stormo, y L. Gold. 1992. Translation
initiation in Escherichia coli: sequences within the
ribosome-binding site. Molecular Microbiology
6:1219.
Roberts, M., S. Chatfield, y G.
Dougan. 1994. Salmonella as carriers of
heterologous antigens. In Novel delivery systems for oral
vaccines. D. T. O'Hagan, ed. CRC Press, Ann Arbor, p.
27-58.
Ruiz-Echevarria, M. J.,
G. Gimenez-Gallego, R.
Sabariegos-Jareno, y R.
Diaz-Orejas. 1995. Kid, a small
protein of the parD stability system of plasmid R1, is an
inhibitor of DNA replication acting at the initiation of DNA
synthesis. J Mol Biol 247: 568-577.
Rupp, W. D. 1996. DNA repair
mechanisms. In Escherichia coli and Salmonella: Cellular and
molecular biology. 2ª ed. F. C. Neidhardt, R. Curtiss III, J.
L. Ingraham, E. C. C. Lin, K. B. Low, B. Magasanik, W. S. Reznikoff,
M. Riley, M. Schaechter y H. E. Umbarger, ed. ASM Press,
Washington, D.C. p. 2277.
Ryan, E. T., J. R. Butterton, R.
N. Smith, P. A.. Carroll, T. I. Crean, y S. B.
Calderwood. 1997a. Protective immunity against
Clostridium difficile toxin A induced by oral immunization
with a live, attenuated Vibrio cholerae vector strain.
Infect Immun 65: 2941-2949.
Ryan, E. T., J. R. Butterton, T.
Zhang, M. A. Baker, S. L. J. Stanley, y S. B.
Calderwood. 1997b. Oral immunization with attenuated
vaccine strains of Vibrio cholerae expressing a dodecapeptide
repeat of the serine-rich Entamoeba
histolytica protein fused to the cholera toxin B subunit induces
systemic and mucosal antiamebic and anti-V. cholerae
antibody responses in mice. Infect Immun 65:
3118-3125.
Sambrook, J., E. F. Fritsch, y T.
Maniatis. 1989. Molecular cloning: A Laboratory
Manual, 2ª edition. Cold Spring Harbor, Nueva York: Cold Spring
Harbor Laboratory Press.
Selzer, G., T. Som, T.
Itoh, y J. Tomizawa. 1983. The origin of
replication of plasmid p15A and comparative studies on the
nucleotide sequences around the origin of related plasmids. Cell
32:119.
Shaw, K. J., P. N. Rather, R. S.
Hare, y G. H. Miller. 1993. Molecular genetics
of aminoglycoside resistance genes and familial relationships of
the aminoglycoside-modifying enzymes. Microbiol
Rev 57: 138-163.
Siegler, R. L. 1995. The hemolytic
uremic syndrome. Pediatric Nephrology 42:1505.
Siegler, R. L., A. T. Pavia, R. D.
Christofferson, y M. K. Milligan. 1994. A
20-year population-based study of
postdiarrheal hemolytic uremic syndrome in Utah. Pediatrics
94:35.
Sixma, T. K., P. E. Stein, W. G.
Hol, y R. J. Read. 1993. Comparison of the
B-pentamers of heat-labile
enterotoxin and verotoxin-1: two structures with
remarkable similarity and dissimilarity. Biochemistry
32:191.
Srinivasan, J., S. A. Tinge, R.
Wright, J. C. Herr, y R. Curtiss III.
1995. Oral immunization with attenuated Salmonella
expressing human sperm antigen induces antibodies in serum and the
reproductive tract. Biology of Reproduction 53:462.
Stein, P. E., A. Boodhoo, G. J.
Tyrrell, J. L. Brunton, y R. J. Read.
1992. Crystal structure of the cell-binding
B oligomer of verotoxin-1 from E. coli.
Nature 355:748.
Stoker, N. G., N. F. Fairweather,
y B. G. Spratt. 1982. Versatile
low-copy-number plasmid vectors for
cloning in Escherichia coli. Gene 18:
335-341.
Streatfield, S. J., M. Sandkvist,
T. K. Sixma, M. Bagdasarian, W. G. Hol, y T. R.
Hirst. 1992. Intermolecular interactions between the
A and B subunits of heat-labile enterotoxin from
Escherichia coli promote holotoxin assembly and stability
in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences
USA 89:12140.
Strockbine, N. A., L. R. M.
Marques, J. W. Newland, H. W. Smith, R. K.
Holmes, y A. D. O'Brien. 1986. Two
toxin-converting phages from Escherichia
coli O157:H7 strain 933 encode antigenically distinct toxins
with similar biologic activities. Infection and Immunity
53:135.
Strockbine, N. A., M. P. Jackson,
L. M. Sung, R. K. Holmes, y A. D. O'Brien.
1988. Cloning and sequencing of the genes for Shiga toxin
from Shigella dysenteriae Type 1. Journal of Bacteriology
170:1116.
Strugnell, R. A., D. Maskell, N.
F. Fairweather, D. Pickard, A. Cockayne, C.
Penn, y G. Dougan. 1990. Stable expression of
foreign antigens from the chromosome of Salmonella
typhimurium vaccine strains. Gene
88:57-63.
Summers, D. K. The Biology of
Plasmids, 65-91, 1996.
Summers, D. K. 1998. Timing,
self-control and sense of direction are the secrets
of multicopy plasmid stability. Mol Microbiol 29:
1137-1145.
Summers, D. K. y D. J. Sherratt.
1984. Multimerization of high copy number plasmids causes
instability: ColE1 encodes a determinant essential for plasmid
monomerization and stability. Cell 36:1097.
Tacket, C. O., D. M. Hone, R.
Curtiss III, S. M. Kelly, G. Losonsky, L.
Guers, A. M. Harris, R. Edelman, y M. M.
Levine. 1992. Comparison of the safety and
immunogenicity of \DeltaaroC\DeltaaroD and
\Deltacya\Deltacrp Salmonella typhi strains in adult
volunteers. Infection and Immunity 60:536.
Tacket, C. O., M. Sztein, G.
Losonsky, S. S. Wasserman, J. P. Nataro, R.
Edelman, D. Pickard, G. Dougan, S.
Chatfield, y M. M. Levine. 1997. Safety of
live oral Salmonella typhi vaccine strains with deletions in
htrA and aroC aroD and immune responses in humans.
Infection and Immunity 65:452-456.
Tacket, C. O., S. M. Kelley, F.
Schodel, G. Losonsky, J. P. Nataro, R.
Edelman, M. M. Levine, y R. Curtiss III.
1997. Safety and immunogenicity in humans of an attenuated
Salmonella typhi vaccine vector strain expressing
plasmid-encoded hepatitis B antigens stabilized by
the Asd-balanced lethal vector system. Infection
and Immunity 65:3381-3385.
Takeda, Y. 1995. Shiga and
Siga-like (Vero) toxins. In Bacterial toxins and
virulence factors in disease. J. Moss, B. Iglewski, M. Vaughan
y A. Tu, ed. Marcel Dekker, Inc. Nueva York, p. 313.
Tauxe, R. V. 1998. Public health
perspective on immunoprophylactic strategies for Escherichia
coliO157:H7: who or what would we immunize? In Escherichia
coli O157:H7 and other Shiga toxin -producing E. coli strains.
J. B. Kaper y A. D. O'Brien, ed. ASM Press, Washington, D.C. In
press.
Tesh, V. L., J. A. Burris, J. W.
Owens, V. M. Gordon, E. A. Wadolkowski, A. D.
O'Brien, y J. E. Samuel. 1993. Comparison of
the relative toxicities of Shiga-like toxins type I
and type II for mice. Infection and Immunity 61:
3392.
3392.
Thisted, T., A. K. Nielsen, y K.
Gerdes. 1994. Mechanism of
post-segregational killing: translation of Hok,
SrnB and Pnd mRNAs of plasmids R1, F and R483 is activated by
3'-end processing. EMBO Journal 13:1950.
Thisted, T., N. S. Sorensen, y K.
Gerdes. 1995. Mechanism of
post-segregational killing: secondary structure
analysis of the entire Hok mRNA from plasmid R1 suggests a
fold-back structure that prevents translation and
antisense RNA binding. Journal of Molecular Biology
247:859.
Thisted, T., N. S. Sorensen, E. G.
Wagner, y K. Gerdes. 1994. Mechanism of
post-segregational killing: Sokantisense RNA
interacts with Hok mRNA via its 5'-end
single-stranded leader and competes with the
3'-end of Hok mRNA for binding to the mok
translational initiation region. EMBO Journal 13:1960.
Tinge, S. A. y R. Curtiss III.
1990. Conservation of Salmonella typhimurium virulence
plasmid maintenance regions among Salmonella serovars as a
basis for plasmid curing. Infection and Immunity 58:3084.
Tinge, S. A. y R. Curtiss III.
1990. Isolation of the replication and partitioning regions
of the Salmonella typhimurium virulence plasmid and
stabilization of heterologous replicons. Journal of Bacteriology
172:5266.
Twigg, A. J., y D. Sherratt.
1980. Trans-complementable
copy-number mutants of plasmid ColE1. Nature
283: 216-218.
Umbarger, H. E. 1978. Amino acid
biosynthesis and its regulation. Annual Reviews in Biochemistry
47:533.
Valdivia, R. H. y S. Falkow.
1997. Fluorescence-based isolation of
bacterial genes expressed within host cells. Science
277:2007.
Valdivia, R. H., A. E. Hromockyj,
D. Monack, L. Ramakrishnan, y S. Falkow.
1996. Applications for green fluorescent protein (GFP) in
the study of host-pathogen interactions. Gene
173:47.
Van Melderen, L., P. Bernard, y M.
Couturier. 1994. Lon-dependent
proteolysis of CcdA is the key control for activation of CcdB in
plasmid-free segregant bacteria. Mol Microbiol
11: 1151-1157.
Vicari, G., A. J. Olitzki, y Z.
Olitzki. 1960. The action of the thermolabile toxin of
Shigella dysenteriae on cells cultivated in vitro.
British Journal of Experimental Pathology 41:179.
Wada, K., Y. Wada, F.
Ishibashi, T. Gojobori, y T. Ikemura.
1992. Codon usage tabulated from the GenBank genetic
sequence data. Nucleic Acids Research 20:2111.
Wadolkowski, E. A., L. M. Sung, J.
A. Burris, J. E. Samuel, y A. D. O'Brien.
1990. Acute renal tubular necrosis and death of mice orally
infected with Escherichia coli strains that produce
Shiga-like toxin type II. Infection and Immunity
58:3959.
Wahle, E., y A. Kornberg.
1988. The partition locus of plasmid pSC101 is a specific
binding site for DNA gyrase. EMBO J 7:
1889-1895.
Wang, S. y T. Hazelrigg.
1994. Implications for bcd mRNA localization from
spatial distribution of exu protein in Drosophila oogenesis.
Nature 369:400.
Wang, Y., Z. Zhang, S.
Yang, y R. Wu. 1992. Cloning of par region and
the effect of par region on the stability of pUC9. Chinese
Journal of Biotechnology 8:107.
Williams, K. R., J. B. Murphy, y
J. W. Chase. 1984. Characterization of the structural
and functional defect in the Escherichia coli
single-stranded DNA binding protein encoded by the
ssb-1 mutant gene. Journal of Biological
Chemistry 259:11804.
Wu, K., y T. K. Wood. 1994.
Evaluation of the hoklsok killer locus for enhanced plasmid
stability. Biotechnol Bioeng 44:
912-921.
Yamasaki, S., M. Furutani, K.
Ito, K. lgarashi, M. Nishibuchi, y Y.
Takeda. 1991. Importance of arginine at postion 170
of the A subunit of Vero toxin 1 produced by enterohemorrhagic
Escherichia coli for toxin activity. Microbial
Pathogenesis 11:1.
Yanofsky, C., T. Platt, I. P.
Crawford, B. P. Nichols, G. E. Christie, H.
Horowitz, M. Van Cleemput, y A. M. Wu.
1981. The complete nucleotide sequence of the tryptophan
operon of Escherichia coli. Nucleic Acids Res 9:
6647-6668.
Yu, J. y J. B. Kaper. 1992.
Cloning and characterization of the eae gene of enterohaemorrhagic
Escherichia coli. Molecular Microbiology 6:411.
Zalkin, H. y P. Nygaard.
1996. Biosynthesis of purine nucleotides. In Escherichia
coli and Salmonella: Cellular and molecularbiology. 2ª ed. F.
C. Neidhardt, J. L. Ingraham, E. C. C. Lin, K. B. Low, B. Magasanik,
W. S. Reznikoff, M. Riley, M. Schaechter y H. E. Umbarger, ed. ASM
Press, Washington, D.C. p. 561.
Zhang, X., Y. Lou, M.
Koopman, T. Doggett, K. S. K. Tung, y R.
Curtiss III. 1997. Antibody responses and infertility
in micefollowing oral immunization with attenuated Salmonella
typhimuriumexpressing recombinant murine ZP3. Biology of
Reproduction 56:33.
Zoja, C., D. Corna, C.
Farina, G. Sacchi, C. A. Lingwood, M. P.
Doyle, V. V. Padhye, M. Abbate, y G.
Remuzzi. 1992. Verotoxin glycolipid receptors
determinethe localization of microangiopathic process in rabbits
given verotoxin-1. Journal of Laboratory and
Clinical Medicine 120:229.
Zurita, M., F. Bolivar, y X.
Soberon. 1984. Construction and characterization of
new cloning vehicles. VII. Construction of plasmid pBR327par, a
completely sequenced, stable derivative of pBR327 containing the
par locus of pSC101. Gene 28:119.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> Galen, James
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> SISTEMA DE ESTABILIZACIÓN DE
PLÁSMIDOS PARA EL SUMINISTRO DE ANTÍGENOS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> Solicitud de James Galen
\vskip1.000000\baselineskip
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<190> 09/204.117
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<141>
02-12-1998
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4196
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia nucleotídica
1-4196 de pGEN2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencia nucleotídica 1-4196 de pGEN2
(véanse las figuras 4a-g)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
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<210> 2
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<211> 1197
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencia nucleotídica 1201-2397 de
pGEN3 (véanse las figuras 5a-b)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
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<210> 3
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<211> 2647
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencia nucleotídica 1201-3847 de
pGEN4 (véanse las figuras 6a-e)
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 3
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<110> University of Maryland,
Baltimore
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<120> SISTEMA DE ESTABILIZACIÓN DE
PLÁSMIDOS PARA EL SUMINISTRO DE ANTÍGENOS
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<130> P011459EP
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<140> EP99964042.8
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<141>
02-12-1999
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<150> US 09/204.117
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<151>
02-12-1998
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<150> US 60/158,738
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<151>
12-10-1999
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<160> 40
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<170> PatentIn version 3.2
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<210> 1
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<211> 4196
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Secuencia nucleotídica completa de
pGEN2
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<400> 1
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<210> 2
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<211> 1197
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Secuencia nucleotídica parcial de
pGEN3: nucleótidos 1201-2397 que codifican
ori15A
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<400> 2
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<210> 3
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<211> 2647
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Secuencia nucleotídica parcial de
pGEN4: nucleótidos 1201-3848 que codifican
ori101
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<400> 3
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<212> ADN
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<223> Porción de secuencia del
promotor
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<213> Secuencia artificial
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<223> Porción de secuencia del
promotor
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<212> ADN
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<211> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgaagcccaa cctttcatag aaactagtgg tggaatcgaa atctcgtgat ggcaggttg
\hfill59
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia Promotora
Modificada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6)..(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n" puede ser G, C o A
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (7)..(7)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n" es un inserto de 1 a 5
nucleótidos seleccionados de A, C, G y T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (11)..(11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n" es A, C, G o T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagatcnntaa ncatccacag gaggatatct gatg
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia de toxina de Shiga
modificada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacagcagacg cgtta
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia de toxina de Shiga
modificada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgaacctag ggcga
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia de toxina de Shiga
modificada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaattcgcga ccagt
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia de toxina de Shiga
modificada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaatcagatt ctgga
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (34)
1. Vector de expresión que comprende una
secuencia nucleotídica que codifica:
- un origen de replicación que confiere un número medio de copias que está comprendido entre 2 y 75, seleccionado de entre el grupo que consiste en: oriE1 (SEC ID nº.1), ori101 (SEC ID nº.3), ori15A (SEC ID nº.2) y sus derivados, y que está flanqueado en ambos extremos por terminadores de la transcripción;
- por lo menos una función de exterminio post-segregacional, seleccionada de entre el grupo que consiste en asd, ssb, phd-doc, kis-kid, y hok-sok, en la que la transcripción de flanqueo de los lugares que rodean dicha por lo menos una función post-segregacional es divergente y no perturbará significativamente los niveles de transcripción de tipo salvaje; y
- por lo menos una función de reparto seleccionada de entre el grupo que consiste en el lugar par de pSC101 y el parA de pR1, en la que la transcripción de flanqueo transcurre alejándose de dicha por lo menos una función de reparto; y
- un promotor ompC que comprende la siguiente secuencia:
- AGATCX^{1}X^{2}TAAX^{3}CATCCACAGGAGGATATCTGATG (SEC ID nº: 36), en la que X^{1} se selecciona de entre el grupo que consiste en G, C y A; X^{2} es un inserto que tiene de 1 a 5 nucleótidos; y X^{3} se selecciona de entre el grupo que consiste en A, T, G y C.
2. Vector de expresión según la reivindicación
1, que comprende además una secuencia nucleotídica que codifica una
proteína de interés controlada transcripcionalmente mediante el
promotor ompC, en el que la secuencia nucleotídica que
codifica la proteína de interés comprende un terminador
transcripcional en el extremo 3' distante.
3. Vector de expresión según la reivindicación 1
ó 2, que comprende además un polinucleótido que codifica un
marcador seleccionable.
4. Vector de expresión que comprende una
secuencia nucleotídica que codifica:
- un casete de origen de replicación que comprende: una secuencia nucleotídica que codifica un origen de replicación que confiere un número medio de copias que está entre 2 y 75, seleccionado de entre el grupo que consiste en: oriE1 (SEC ID nº: 1), ori101 (SEC ID nº: 3), ori15A (SEC ID nº: 2) y sus derivados; un primer sitio de escisión mediante enzima de restricción único, localizado 5' de la secuencia nucleotídica que codifica el origen de la replicación; y un segundo sitio de escisión mediante enzima de restricción único, localizado 3' de la secuencia nucleotídica que codifica el origen de la replicación;
- por lo menos un casete de exterminio post-segregacional, que comprende: una secuencia nucleotídica que codifica por lo menos una función de exterminio post-segregacional seleccionada de entre el grupo que consiste en asd, ssb, phd-doc, kis-kid, y hok-sok; un primer sitio de escisión mediante enzima de restricción único, localizado 5' de la secuencia nucleotídica que codifica dicha por lo menos una función de exterminio post-segregacional, y un segundo sitio de escisión mediante enzima de restricción único, localizado 3' de la secuencia nucleotídica que codifica por lo menos una función de exterminio post-segregacional;
- por lo menos un casete de reparto, que comprende: (i) una secuencia nucleotídica que codifica por lo menos una función de reparto seleccionada de entre el grupo que consiste en el lugar par de pSC101 y el parA de pR1; un primer sitio de escisión mediante enzima de restricción único, localizado 5' de la secuencia nucleotídica que codifica dicha por lo menos una función de reparto, y un segundo sitio de escisión mediante enzima de restricción único, localizado 3' de la secuencia nucleotídica que codifica dicha por lo menos una función de reparto; y
- un casete de expresión que comprende (i) una secuencia nucleotídica que codifica un promotor ompC que comprende la siguiente secuencia:
- AGATCX^{1}X^{2}TAAX^{3}CATCCACAGGAGGATATCTGATG (SEC ID nº: 36), en la que X^{1} se selecciona de entre el grupo que consiste en G, C y A; X^{2} es un inserto que tiene de 1 a 5 nucleótidos; y X^{3} se selecciona de entre el grupo que consiste en A, T, G y C, (ii) un primer sitio de escisión mediante enzima de restricción único, localizado 5' de la secuencia nucleotídica que codifica el promotor, y (iii) un segundo sitio de escisión mediante enzima de restricción único, localizado 3' de la secuencia nucleotídica que codifica el promotor.
5. Vector de expresión según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el número medio de copias
del plásmido está comprendido dentro del intervalo de
aproximadamente 5 hasta aproximadamente 60 copias por
célula.
célula.
6. Vector de expresión según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la función de reparto es una
función de reparto activa.
7. Vector de expresión según la reivindicación
6, en el que la secuencia nucleotídica que codifica dicha por lo
menos una función de reparto comprende parA.
8. Vector de expresión según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que la función de reparto es una
función de reparto pasiva.
9. Vector de expresión según cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 8, en el que la secuencia nucleotídica que
codifica dicha por lo menos una función de reparto es el lugar
par de pSC101.
10. Vector de expresión según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la función de exterminio
post-segregacional es ssb.
11. Vector de expresión según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que X^{1} es G.
12. Vector de expresión según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que X^{2} tiene de 1 a 4
nucleótidos.
13. Vector de expresión según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que X^{2} tiene 4
nucleótidos.
14. Vector de expresión según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que X^{2} tiene 4 nucleótidos,
seleccionados independientemente de entre el grupo que consiste en
A, T y C.
15. Vector de expresión según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que X^{2} comprende un
nucleótido o secuencia nucleotídica seleccionado de entre el grupo
que consiste en ATCT; ATC; AT; TCT; CT; TC; A; T; C; y T.
16. Vector de expresión según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que X^{2} se selecciona de
entre el grupo que consiste en ATCT; ATC; AT; TCT; CT; TC; A; T; C;
y T.
17. Vector de expresión según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que X^{2} es ATCT.
18. Vector de expresión según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que X^{3} es A.
19. Vector de expresión según cualquiera de las
reivindicaciones 4 a 18, que comprende además una secuencia
nucleotídica que codifica una proteína de interés localizada en el
extremo 3' de la secuencia nucleotídica que codifica el
promotor.
20. Vector de expresión según la reivindicación
2 ó 19, en el que la proteína de interés es un antígeno de
interés.
21. Vector de expresión según la reivindicación
20, en el que el antígeno de interés se selecciona de entre el
grupo que consiste en un antígeno vírico, un antígeno bacteriano, un
antígeno cancerígeno, y un antígeno autoinmunitario.
22. Vector de expresión según la reivindicación
20 o la reivindicación 21, en el que el antígeno de interés
comprende una toxina de Shiga destoxificada.
23. Vector de expresión según cualquiera de las
reivindicaciones 20 a 22, en el que el antígeno de interés
comprende un antígeno de la toxina 2 de Shiga, seleccionado de entre
el grupo que consiste en el pentámero de la subunidad B de la
toxina 2 de Shiga, y una toxina 2 de Shiga genéticamente
destoxificada.
24. Vector de expresión según la reivindicación
23, en el que la secuencia nucleotídica que codifica la toxina 2 de
Shiga destoxificada tiene segmentos modificados seleccionados de
entre el grupo que consiste en:
- (797) - ACA GCA GAC GCG TTA - (811) (SEC ID nº: 37);
- (902) - CTG AAC CTA GGG CGA - (916) (SEC ID nº: 38);
- (1345) - GAA TTC GCG ÁCIDO AGT - (1359) (SEC ID nº: 39); y
- (1435) - GAA TCA GAT TCT GGA - (1449) (SEC ID nº: 40).
25. Vector de expresión según cualquiera de las
reivindicaciones 4 a 24, que comprende además un casete de
selección que comprende (i) un polinucleótido que codifica por lo
menos un marcador seleccionable; (ii) un primer sitio de escisión
mediante enzima de restricción único, localizado 5' de la secuencia
nucleotídica que codifica dicho por lo menos un marcador
seleccionable, y (iii) un segundo sitio de escisión mediante enzima
de restricción único, localizado 3' de la secuencia nucleotídica que
codifica dicho por lo menos un marcador seleccionable.
\newpage
26. Vector de expresión según la reivindicación
3 ó 25, en el que el marcador seleccionable es una proteína que
proporciona resistencia a un antibiótico seleccionado de entre el
grupo que consiste en un aminoglucósido, un cloranfenicol, una
tetraciclina y una carbenicilina.
27. Vector de expresión según la reivindicación
3, la reivindicación 25 o la reivindicación 26, en el que el
polinucleótido que codifica el marcador seleccionable se selecciona
de entre el grupo que consiste en tetA, bla,
aphA-2, y kan.
28. Célula que comprende el vector de expresión
según cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
29. Célula según la reivindicación 28, en la que
la célula es una célula procariota.
30. Célula según la reivindicación 29, en la que
la célula procariota es Salmonella typhi.
31. Vacuna de vector bacteriano atenuado vivo,
para uso en un método para provocar una respuesta inmunitaria en un
sujeto, en el que la vacuna de vector bacteriano atenuado vivo
comprende una célula según cualquiera de las reivindicaciones 28 a
30.
32. Vacuna de vector bacteriano atenuado vivo
según la reivindicación 31, para uso según se especifica en la
presente memoria, en la que la célula es Salmonella
typhi.
33. Vector bacteriano atenuado vivo según la
reivindicación 31 ó 32, en el que el sujeto es un ser humano.
34. Método para obtener una vacuna de vector
bacteriano atenuado vivo, que comprende transformar una cepa
bacteriana con un vector de expresión según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 27.
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Families Citing this family (41)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8076130B2 (en) * | 1998-12-02 | 2011-12-13 | University Of Maryland, Baltimore | Plasmid maintenance system for antigen delivery |
CA2352457A1 (en) * | 1998-12-02 | 2000-06-08 | University Of Maryland, Baltimore | Plasmid maintenance system for antigen delivery |
DK1154791T3 (da) * | 1999-02-22 | 2008-06-16 | Health Prot Agency | Neisseria-vaccinesammensætninger og fremgangsmåder |
US7081244B2 (en) * | 1999-02-22 | 2006-07-25 | Health Protection Agency | Neisserial vaccine compositions and methods |
AU777298B2 (en) * | 1999-09-10 | 2004-10-07 | Secretary Of State For Defence, The | Recombinant microorganisms |
GB0024203D0 (en) * | 2000-10-03 | 2000-11-15 | Peptide Therapeutics Ltd | Stabilisation of plasmid inheritance in bacteria |
EP1917975A1 (en) | 2001-11-30 | 2008-05-07 | University of Maryland, Baltimore | Novel proteins in Enteroaggregative Escherichia Coli (EAEC) useful for diagnosis and therapy of EAEC infections |
GB0325494D0 (en) * | 2003-10-31 | 2003-12-03 | Sbl Vaccin Ab | Expression system |
GB0327056D0 (en) * | 2003-11-20 | 2003-12-24 | Cobra Biolog Ltd | Plasmid maintenance |
JP2007530013A (ja) * | 2003-12-12 | 2007-11-01 | コンジュゴン インコーポレーティッド | 緻密に調節された遺伝子発現のためのシステム |
US8475810B2 (en) * | 2005-10-28 | 2013-07-02 | University Of Maryland, Baltimore | Attenuated Salmonella enterica serovar paratyphi a and uses thereof |
US8137930B2 (en) | 2005-10-28 | 2012-03-20 | University Of Maryland, Baltimore | Attenuated Salmonella enterica serovar paratyphi A and uses thereof |
US20080124355A1 (en) * | 2006-09-22 | 2008-05-29 | David Gordon Bermudes | Live bacterial vaccines for viral infection prophylaxis or treatment |
WO2009011940A2 (en) * | 2007-04-06 | 2009-01-22 | University Of Maryland, Baltimore | Microcin h47 plasmid selection system |
EP2152883A4 (en) * | 2007-05-10 | 2010-10-27 | Univ Arizona | RECOMBINANT BACTERIA COMPRISING VECTORS FOR THE EXPRESSION OF NUCLEIC ACID SEQUENCES ENCODING ANTIGENS |
EP2150616A4 (en) | 2007-05-10 | 2011-07-27 | Univ Arizona | REGULATED ANTIGEN SYNTHESIS AND / OR REGULATED ATTENUATION FOR IMPROVING VACCINATE IMMUNOGENICITY AND / OR SAFETY |
CN101688253A (zh) * | 2007-07-12 | 2010-03-31 | 新泽西内科与牙科大学 | 抗毒素不稳定化技术 |
WO2009046451A1 (en) * | 2007-10-05 | 2009-04-09 | The Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University | Recombinant bacterium capable of eliciting a protective immune response against c. perfringens |
JP5210675B2 (ja) * | 2008-03-19 | 2013-06-12 | 株式会社東芝 | 不揮発性半導体記憶装置及びその製造方法 |
EP2294090B1 (en) * | 2008-06-03 | 2014-05-14 | University of Maryland, Baltimore | NON-HEMOLYTIC ClyA FOR EXCRETION OF PROTEINS |
US8647642B2 (en) | 2008-09-18 | 2014-02-11 | Aviex Technologies, Llc | Live bacterial vaccines resistant to carbon dioxide (CO2), acidic PH and/or osmolarity for viral infection prophylaxis or treatment |
WO2010045620A1 (en) | 2008-10-17 | 2010-04-22 | The Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University | Recombinant bacterium capable of eliciting an immune response against streptococcus pneumoniae |
US9163219B2 (en) * | 2009-04-14 | 2015-10-20 | Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University | Single expression vector for generation of a virus with a segmented genome |
WO2010135563A1 (en) | 2009-05-22 | 2010-11-25 | The Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University | Recombinant bacterium and methods of antigen and nucleic acid delivery |
US9045742B2 (en) * | 2009-05-29 | 2015-06-02 | The Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University | Recombinant Edwardsiella bacterium |
WO2011060431A2 (en) | 2009-11-16 | 2011-05-19 | University Of Maryland Baltimore | Multivalent live vector vaccine against clostridium difficile-associated disease |
US9062297B2 (en) | 2010-01-13 | 2015-06-23 | The Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University | Yersinia pestis vaccine |
US8889121B2 (en) | 2010-01-22 | 2014-11-18 | The Arizona Board Of Regents For An On Behalf Of Arizona State University | Bacterium comprising a regulated rfaH nucleic acid |
WO2011150421A2 (en) | 2010-05-28 | 2011-12-01 | The Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University | Recombinant bacterium to decrease tumor growth |
US9217152B2 (en) | 2010-11-23 | 2015-12-22 | Oslo Universitetssykehus Hf | DinQ-sRNA type I toxin-antitoxin system for plasmid maintenance |
US9198950B2 (en) | 2010-11-24 | 2015-12-01 | Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University | Recombinant bacterium comprising a toxin/antitoxin system |
US9303264B2 (en) | 2012-05-18 | 2016-04-05 | The Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University | Photosynthetic microorganisms expressing thermostable lipase |
WO2014062580A1 (en) | 2012-10-15 | 2014-04-24 | University Of Maryland, Baltimore | Bacterial live vector vaccines expressing chromosomally-integrated foreign antigens |
US9580718B2 (en) | 2013-06-17 | 2017-02-28 | Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University | Attenuated live bacteria with increased acid resistance and methods of use thereof |
WO2015118146A1 (en) | 2014-02-10 | 2015-08-13 | Univercells Nv | System, apparatus and method for biomolecules production |
AR102548A1 (es) | 2014-11-07 | 2017-03-08 | Takeda Vaccines Inc | Vacunas contra la enfermedad de manos, pies y boca y métodos de fabricación y uso |
MA40920A (fr) | 2014-11-07 | 2017-09-12 | Takeda Vaccines Inc | Vaccins de la main, du pied et de la bouche, et procédés de fabrication et d'utilisation de ceux-ci |
US11129906B1 (en) | 2016-12-07 | 2021-09-28 | David Gordon Bermudes | Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria |
US11180535B1 (en) | 2016-12-07 | 2021-11-23 | David Gordon Bermudes | Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria |
WO2019090233A2 (en) | 2017-11-03 | 2019-05-09 | Takeda Vaccines, Inc. | Method for inactivating zika virus and for determining the completeness of inactivation |
CN109321591B (zh) * | 2018-10-22 | 2021-07-13 | 上海海洋大学 | 一种重组质粒及其构建方法 |
Family Cites Families (18)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4735801A (en) | 1982-09-07 | 1988-04-05 | Board Of Trustees Of Leland Stanford Jr. University | Novel non-reverting salmonella live vaccines |
US5643771A (en) | 1980-05-19 | 1997-07-01 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Non-reverting live bacterial vaccines |
DK410783D0 (da) * | 1982-09-16 | 1983-09-09 | Benzon A Salfred | Fremgangsmade til stabilisering af plasmider |
US4764370A (en) * | 1984-09-12 | 1988-08-16 | Scripps Clinic And Research Foundation | Vaccine utilizing an avirulent strain of Salmonella typhimurium |
DK275685D0 (da) * | 1985-06-18 | 1985-06-18 | Benzon As Alfred | Stabilisering af biologiske systemer |
ATE107697T1 (de) | 1986-03-26 | 1994-07-15 | Genexpress Aps | Biologische eindämmung. |
EP0381706B1 (en) * | 1987-10-07 | 1995-04-26 | Washington University | A method of maintaining a desired recombinant gene in a genetic population of cells |
US5811105A (en) | 1987-12-23 | 1998-09-22 | Glaxo Wellcome, Inc. | Vaccines containing bacteria attenuated by mutations in two genes of the aromatic amino acid biosynthetic pathway |
GB8912330D0 (en) * | 1989-05-30 | 1989-07-12 | Wellcome Found | Live vaccines |
GB9007194D0 (en) | 1990-03-30 | 1990-05-30 | Wellcome Found | Live vaccines |
US5695983A (en) | 1990-12-18 | 1997-12-09 | The General Hospital Corporation | Salmonella vaccines |
US5459072A (en) | 1992-02-25 | 1995-10-17 | Regents Of The University Of Minnesota | Food-grade integration vectors for industrial bacterial strains |
US5674703A (en) | 1992-12-02 | 1997-10-07 | Woo; Savio L. C. | Episomal vector systems and related methods |
US5763270A (en) | 1995-06-07 | 1998-06-09 | Genemedicine, Inc. | Plasmid for delivery of nucleic acids to cells and methods of use |
US5824538A (en) | 1995-09-06 | 1998-10-20 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army | Shigella vector for delivering DNA to a mammalian cell |
US5922583A (en) * | 1995-10-17 | 1999-07-13 | Biostar Inc. | Methods for production of recombinant plasmids |
GB9621091D0 (en) * | 1996-10-09 | 1996-11-27 | Fondation Pour Le Perfectionem | Attenuated microorganisms strains and their uses |
CA2352457A1 (en) * | 1998-12-02 | 2000-06-08 | University Of Maryland, Baltimore | Plasmid maintenance system for antigen delivery |
-
1999
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