KR20040101258A

KR20040101258A - 세균성 포자

Info

Publication number: KR20040101258A
Application number: KR10-2004-7013612A
Authority: KR
Inventors: 시몬미쉘 커팅
Original assignee: 로얄 할로웨이 유니버시티 오브 런던
Priority date: 2002-03-07
Filing date: 2003-03-07
Publication date: 2004-12-02
Also published as: CN1639321A; RU2004129738A; JP2005522195A; US20050232947A1; AU2003217007A1; EP1490473A1; GB0205378D0; WO2003074682A1

Abstract

본 발명은 키메라 유전자형으로 항원 및 포자 피복 단백질을 인코드하여, 포자 피복 단백질과 융합 단백질 형태로 포자에서 항원이 발현되는 적어도 한가지 유전자 구조물로 구성된 유전자 코드에 의해 유전학적으로 변형된 포자를 제공한다.

Description

세균성 포자{BACTERIAL SPORES}

인류의 가장 큰 죽음의 원인이 되는 것이 감염이다. 지난 100년간 대중의 건강에 가장 큰 기여를 한 두 가지가 공중위생(sanitation)과 백신 접종(Vaccination)인데, 이들 두 가지 모두 감염성 질환으로부터 사망을 상당히 줄여왔다.

개량된 백신주사 방법은 다음의 여러 가지 이유로 개발이 가장 중요하게 여겨져왔다.

우선, 주로 점막을 통하여 인체로 침투하는 병인균에 대한 면역원성을 강화시키기 위해, 백신은 일반적으로 장관외 경로를 통하여 제공된다. 그러나, 많은 질병들이 주요 침입 경로로 위장관(GI)을 이용한다. 따라서, 병인균 살모넬라 티피 (Salmonella typhi) 및 비브리오 콜레라(Vibrio cholera)를 섭취하고, 연속하여 GI의 점막 상피를 통하여 콜로니형성[비브리오 콜레라(Vibrio cholera)} 또는 전위[살모넬라 티피 (Salmonella typhi)]으로 인하여 콜레라 및 장티푸스가 발병된다. 유사하게, 미코박테리움 튜베르쿨로시스(Mycohacterium tuberculosis) 감염으로 TB가 발생된다. 주사를 통하여 면역 예방 주사를 놓게되면, 감염을 예방하는데 최소한 효과가 있는 IgG 반응을 포함하는 혈청 반응(체약 면역원)이 일어난다.

둘째로, 바늘을 사용하지 않는 투여 경로를 제공한다. 현재 백신 제공 과정의 주요 문제점은 주사를 해야한다는 것이다. 파상풍 백신을 예로 들 수 있다. 지난 10년간 사용된 보호 방법은 주사를 통하여 우선 3회 약량을 제공하고, 매 5년마다 부스터를 하는 것이다. 선진국에서는 많은 사람들이 "주사에 대한 공포심"으로 부스터를 맞지 않으려고 한다. 대조적으로 개발도상국에서는 파상풍으로 인한 치사율로 인하여 주사 바늘을 재사용하거나 멸균하지 않아서 발생되는 위험이 상당히 크다.

셋째, 안정성을 개선시키고, 부작용을 최소화하는 것이다. 많은 백신은 병원성이 없는(감쇠된) 또는 어느 정도 비활성 살아있는 유기체로 구성된다.

원칙적으로는 안전하지만, 더 안정적인 방법이 개발되어야 한다는 증거도 있다. 예를 들면, 1949년(쿄토 사건), 감염된 디프테리아 백신 주사로 인하여 68명의 어린이들이 사망하였다(Health 1996). 유사하게, 1995년 Cutter 사건의 경우에 105명의 아이들에서 소아마비가 발병하였다. 소아마비 백신이 포르말린에 의해 올바르게 활성화되지 않았던 것이 발견되었다. 다른 백신들 예를 들면, MMR (홍역-볼거리-풍진) 백신 및 백일해(Health, 1996)들도 부작용을 가진다.

넷째로, 저장 및 운송 시설 여건이 열악하여 효과적인 면역주사 프로그램을 방해하는 개발도상국들에 경제적인 백신을 제공하기 위함이다. 백신을 수입하는 개발도상국에서는 백신을 정확하게 보관 및 판매해야 한다. 냉장상태의 적절한 위생 여건 하에 백신을 보관하는 비용이 개발도상국에게는 상당히 부담된다. 경구용 소아마비 백신이나 BCG 백신과 같은 일부 백신의 경우에, 백신은 2-8℃에서 1년간만 생존할 수 있다(Health, 1996). 실온에서도 무한정으로 저장할 수 있는 강력한 백신이 개발도상국에서는 우선적으로 필요하다. 이와 같은 형태의 백신은 열에 안정적이고, 온도 및 건조상태에서도 상당한 변화에 저항할 수 있는 것이 이상적이다. 마지막으로 생산이 간단한 백신이 개발도상국에는 상당한 장점을 제공한다.

이와 같은 문제점을 경감시키는 방법을 찾아왔었다.

따라서, 본 발명은 키메라 유전자로써 항원과 포자 피복 단백질을 인코드하는 적어도 하나의 유전자 구조물과 표적 서열 또는 생장하는 세포 단백질을 포함하는 유전자 코드에 의해 유전적으로 변형된 포자를 제공하는데, 유전적으로 변형된 포자는 포자 피복 단백질과 융합된 단백질 형으로 발현되는 항원을 가진다.

본 발명의 장점은 백신을 투여하는데 포자를 이용하면, 주사를 할 필요가 없고, 개발 도상국에서 주사 바늘로 인한 문제점을 피할 수 있는 장점들이 있다. 이에 추가하여, 포자는 열이나 건조상태에 안정적이기 때문에 개발 도상국에서 백신을 보관할 때 생기는 문제점들을 극복할 수 있다. 포자는 만들기 쉽고, 경제적으로 저렴한 비용으로 백신을 만들 수 있고, 마지막으로, 비-병인성이며, 구강 생균제(probiotic)[미생불이 분비하는 물질로 다른 미생물의 생장을 자극하는 물질]로 이용하고, 바실러스 스브틸리스(Bacillus suhtilis)를 이용하여 현재 이용하는 것보다 훨씬 안정적인 백신 시스템을 만든다.

본 발명의 추가 장점으로는 포자가 점막에서 면역 반응을 유도한다는 것이다. 이는 점막 병인균 예를 들면, 살로넬라 티피(S.typhi), 비브리오 콜레라(V. cholera), 미코박테리움 튜베르클로시스(M. tuberculosis)에 대해 좀더 효과적으로 백신작용을 할 수 있도록 한다.

점막으로 운반되는 백신은 점막 경로를 통하여 이들 질병과 싸우는데 더 효과적일 것이다. 백신 투여의 점막 경로에는 구강, 비강, 직장 경로를 이용할 수 있다.

적절하게는 포자는 바실러스(Bacillus)종의 포자이다.

적절하게는 생장 세포는 바실러스(Bacillus) 종의 세포이다.

유전자 코드는 DNA 또는 cDNA이다. "유전자-코드"는 코돈 이용에 있어서, 축중성도 포함된다는 것을 인지할 것이다.

유전자 구조물은 포자 피복 단백질 유전자의 일부분과 항원 유전자의 일부분이 키메라 유전자 형태로 포함된다.

항원 유전자는 포자 피복 단백질 유전자의 3'말단에 위치하는 것이 바람직하다. 대안으로 항원이 포자 피복 단백질유전자의 5'말단 또는 포자 피복 단백질 유전자의 내부에 위치할 수도 있다.

유전자 구조물은 플라스미드 또는 벡터로 구성되는데, 키메라 유전자는amyE유전자의 일부분에 적어도 인접된 다중 클로닝 부위에 위치한다. 대안으로, 유전자 구조물은 플라스미드 또는 벡터로 구성되는데, 이때 키메라 유전자는thrC유전자의 일부분에 적어도 인접된 다중 클로닝 부위에 위치한다. 본 발명은amyE및thrC유전자 삽입에만 한정시키는 것이 아님을 인지할 것이다.

유기체의 생장 및 포자 형성에 영향을 주지 않는 한, 즉 삽입은 기능적으로 과도한 경우가 되면, 임의 유전자내로 삽입이 가능하다.

적절하게는 유전자 구조물은 이중 교차 재조합에 의해 생장 모 세포를 변형시키는데 이용딘다. 대안으로, 유전자 구조물은 단일 교차 재조합에 의해 생장 모세포를 형질변환시키는데 이용되는 통합성(integrative) 벡터 가령, pJH101이 된다.

항원은 적절하게는 파상풍 독소 단편 C 또는 불안정한 독소 B 소단위중 적어도 하나가 된다. 대안으로, 항원은 면역 반응을 유도하는데 적절한 임의 항원이 될 수 있다.

포자 피복 단백질은 바람직하게는cotB가 된다. 대안으로, 포자 피복 단백질은cotA, cotC, cotD, cotE, cotF에서 선별된다. 대안으로, 포자 피복 단백질은cotG, cotH, cotJA, cotJC, cotM, cotSA, cotS, cotT, cotV, cotW, cotX, cotY, cotZ에서 선별된다.

포자는 경구, 비강 또는 직장 경로를 통하여 투여될 수 있다.

포자는 경구, 비강 또는 직장 경로중 한 가지 이상의 경로를 통하여 투여될 수 있다.

포자의 경구 투여는 정제, 캡슐 또는 액체 현탁액 또는 에멸젼을 이용하여 적절하게 투여할 수 있다. 대안으로, 포자는 미소 분말 또는 에러로졸 또는 변형된 Dischaler^R또는 Turbohaler^R형태로 투여될 수 있다.

비강 투여는 미소 분말 또는 에러로졸 코 스프레이 또는 변형된 Dischaler^R또는 Turbohaler^R형태로 투여될 수 있다.

좌약을 이용하여 직장으로 적절하게 투여할 수 있다.

본 발명의 포자는 투여하기 전에 열에 의해 비활성화되어, 생장 세포로 발아되지 않는다.

본 발명의 추가 특징에 따르면, 활성 약제로 이용하기 위해 본 발명에 따라 유전적으로 변형된 포자를 제공한다.

본 발명의 추가 특징에 따르면, 적어도 두 가지 유전적으로 변형된 포자를 제공하는데, 적어도 한 가지 상이한 항원을 발현시키는 각 변형된 포자를 활성 약학 조성물로 이용할 수 있다.

본 발명의 추가 특징에 따르면, 본 발명은 유전적으로 변형된 포자 생산 방법을 제공하는데, 이때 이 방법은 다음 단계로 구성된다;

키메라 유전자로써 항원 및 포자 피복 단백질을 인코드하는 적어도 한 가지 유전자 구조물로 구성된 유전자 코드를 만들고;

이와 같은 유전자 구조물을 이용하여 생장 모 세포를 형질변환시키고;

형질변형된 모 세포가 포자 형성하도록 유도하고;

유전적으로 변형된 생성 포자를 분리한다.

포자는 생장 세포로 발아되지 않도록 투여 전에 열에 의해 비활성화시킨다.

본 발명의 추가 특징에 따르면, 본 발명에서는 약학적으로 수용가능한 부형제 또는 담체와 연합하여 본 발명에 따른 유전적으로 변형된 포자로 구성된 조성물을 제공한다.

약학적으로 수용가능한 적절한 담체는 당분야에 공지된 것으로 제약학적 조성물은 구강, 직장 또는 비강 투여에 따라 달라질 수 있다.

본 발명의 추가 특징에 따르면, 본 발명은 의학적 치료 방법에 이용하기 위해 약물 제조에 이용하기 위한 유전적으로 변형된 포자를 제공한다.

의학적 치료 방법은 백신을 투여하여 사람 또는 동물을 질병에 대해 면역주사하는 것이다.

본 발명의 추가 특징에 따르면, 본 발명은 의학적 치료 방법을 제공하는 것인데, 이 방법은 다음과 같은 단계로 구성된다;

- 의학적 치료를 요하는 사람 또는 동물에 본 발명에 따른 유전적으로 변형된 포자를 경구, 비강 또는 직장을 통하여 투여하고;

- 유전적으로 변형된 포자는 질병을 예방하는데 이용하기 위해 면역 반응을 유도한다.

본 발명은 첨부된 도면과 함께 실시예를 통하여 설명할 것이다.

본 발명은 면역 반응을 유도하는데 포자를 이용하는 것과, 이와 같은 면역 반응을 유도하는 방법 및 이와 같은 포자를 만드는 방법에 관계한다.

도 1은 면역형광을 이용하여 CotB 및 TTFC가 존재를 감지한 것을 나타낸 것이다. 재현탁 방법[1]을 이용하여, 바실러스 서브틸리스(B. subtilis) 균주의 포자 형성을 유도하였고, 포자형성 개시후 5시간째에 샘플을 취하였다. 샘플은 토끼 항-CotB 및 생쥐 항-TTFC 항혈청으로 라벨링하고, 그 다음 항-토끼 IgG-FITC 공액체(녹색 형광, Panels A & Q; 항-생쥐 IgG-TRITC(적색 형광, Panels B & D) 공액체로 라벨하였다. Panels A & B, PY79(야생형); Panels C & D, RHI03(CotB-TTFC 발현 균주).

도 2는 점막 면역주사후에 전신 반응을 나타낸 것이다. 구강(Panel A) 또는 비강(Panel B)으로 CotB-TTFC를 발현시키는 바실러스 서브틸리스(B. subtilis)로 면역주사후에 혈청의 항-TTFC 특이적인 IgG 반응을 나타내었다. 7마리 생쥐 군을 CotB-TTFC(RH103; ●)을 발현시키는 포자 또는 비-재조합 포자(PY79: ○)를 구강 또는 비강으로 면역주사하였다(↑). 각 구강 투여 시에 약량은 1.67X10¹⁰포자이고, 비강 투여시에는 1.1X10⁹포자를 이용하고 각 군으로부터 얻은 혈청 샘플은 TTFC-특이적인 IgG에 대해 ELISA을 이용하여 테스트하였다. 고유 기준 군(△)에서 얻은 혈청과 정제된 TTFC 단백질(◇) 4(㎎/투여)로 구강 면역 주사를 맞은 군의 혈청을 검사하였다. 자료는 수학적 단위로 나타내고, 에러 막대는 표준 편차이다.

도 3은 항체 이소타입 프로파일을 나타낸다. CotB-TTFC(RH103) 또는 비-재조합(PY79) 바실러스 서브틸리스(B. subtilis) 포자로 구강 면역주사후 54일 또는 비강 면역주사후 48일에 항-TTFC 항체 이소타입 프로파일을 도 2A 및 2B에 범례로 나타내었다. TTFC 특이적인 IgG1, IG2a, IgG2b, IgG3, IgM, IgA 이소타입은 간접 ELISA를 이용하여 결정한다. 고유 기준 군의 혈청도 검사하였다. 엔드-포인트 역가는 프레이뮨 혈청을 1/40 희석하였을 때 동일한 광학 밀도를 나타내는 희석비로 계산한다. 자료는 수학적 단위로 나타내고, 에러 막대는 표준 편차이다.

도 4는 TTFC-특이적인 배설물 IgA 반응을 나타낸 것이다. 7마리 생쥐 군은 도 2A 및 2B에서 각각 설명하는 것과 같이, CotB-TTFC(RH103)를 발현시키는 재조합 포자 또는 비-재조합(PY79) 포자로 구강(Panel A) 또는 비강(Panel B)으로 면역주사하였다. 면역주사를 맞은 생쥐 및 고유 군의 생쥐 모두에서 새로운 배설물을 수거하고, 실시예 2에서 설명하는 것과 같이 TTFC-특이적인 IgA 가 존재하는 지에 대해 테스트하였다. 엔드-포인트 역가는 희석안된 프레이뮨 배설물 추출물에서 얻는 것과 동일한 광학 밀도를 나타내는 배설물 추출물 희석비로 계산한다. 자료는 수학적 단위로 나타내고, 에러 막대는 표준 편차이다.

도 5는 항-포자 혈청 IgG 및 점막 IgA 반응을 나타낸 것이다. 7마리 생쥐 군은 도 2A 및 2B에서 각각 설명하는 것과 같이, CotB-TTFC(RH103)를 발현시키는 재조합 포자(●) 또는 비-재조합 포자(○)로 구강(Panel A, B) 또는 비강(Panel C, D)으로 면역주사(↑)하였다. 개별 샘플은 바실러스 서브틸리스(B. subtilis) 포자 피복-특이적인 혈청 IgG(Panel A, C) 또는 포자 피복 특이적인 배설물 IgA(Panel B, D)에 대해 간접 ELISA 테스트하였다. 고유 군에서 얻은 혈청(△)도 검사하였다. 엔드-포인트 IgG 역가는 희석안된 프레이뮨 배설물 추출물에서 얻는 것과 동일한 광학 밀도를 나타내는 배설물 추출물 희석비로 계산한다. 엔드-포인트 IgA 역가는 희석안된 프레이뮨 배설물 추출물에서 얻는 것과 동일한 광학 밀도를 나타내는 배설물 추출물 희석비로 계산한다. 자료는 수학적 단위로 나타내고, 에러 막대는 표준 편차이다.

본 발명은 다음의 실시예를 참고하여 설명하나 이에 국한시키지는 않는다.

실시예 1

TTFC 또는 LTB 유전자 서열을cot유전자에in frame융합시킨 키메라 유전자를 만들었다. 그 다음 유전자 구조물을 바실러스 서브틸리스(B. subtilis)의 염색체 내로 도입시켰다. 그 다음 키메라 유전자 발현을 확인하고, 동종 생식(Black C57)을 이용하여 면역 주사를 실시하였다. 그 다음 면역 반응을 측정하였다. 다른 언급이 없는 한,cot유전자는cotA, cotB, cotC, cotD, cotE, cotF를 말한다.

¹-amyE좌위에 위치

²-thrC좌위에 위치

a) 키메라 유전자의 작제

PCR(폴리메라제 연쇄 반응)을 이용하여 특이적인cot유전자가 증폭된cot유전자 서열의 3'단부가 TTFC 또는 LTB의 5'말단을 운반하는 유사한 PCR 생성물의5'단부에 융합될 수 있도록 한다. 결찰 PCR 생성물은 PCR 생성물을 제한효소 절단하면 얻을 수 있다. 제한효소절단 부위를 가지는 프라이머를 이용하면 PCR 증폭에 의해 가능하다. 적절한 클로닝 벡터(하기 참조)는cot유전자의 5'단부 또는 항원 유전자의 3'단부를 인지하는 제한효소를 이용하여 절단하였다. 절단된 PCR 생성물은 절단된 벡터로 결찰시키고, 당분야에 공지된 표준 기술을 이용하여 재조합을 평가하였다.

(이 과정에서,cot유전자는 유전자의 5'단부에 자신의 프로모터 서열을 운반하는 것은 필수적이다).

b) 염색체 삽입을 위한 벡터

벡터 pDG364의 기본적인 특징은amyE유전자의 좌·우측 암(arm)부분(amyE전방 및 후방으로 칭함)에 있다. 클론된 DNA(즉,cot-항원 키메라)를 일반적인 PCR 기술을 이용하여 다중 클로닝 부위로 도입시킨다. 클론을 확인하고, 플라스미드 클론은 기본 서열(PstI)을 인지하는 효소로 절단하여 선형화시킨다. 선형화된 DNA를 이용하여, 플라스미드에 의해 운반되는 항생제 저항성(클로람페니콜 저항성)에 대한 선별성을 이용하여 바실러스 서브틸리스(B. subtilis)의 컴피턴스 세포를 형질변환시킨다. 선형화된 플라스미드는 재조합을 위해amyE의 전후 암(arm) 부분를 이용하여 이중 교차 재조합 반응을 이용하는 경우에만 통합된다. 이 과정에서, 클론된 DNA를amyE유전자로 도입시켜,amyE유전자를 비활성화시킨다. 이 과정은 염색체에 손상을 최소화시키고, 세포 생장, 대사 과정 및 포자 형성에도 영향을 주지 않다. 유전자 키메라는 염색체의amyE좌위에 삽입되기 때문에, 유전자는 정상cot유전자 좌위에trans이다. 예를 들면,cotA유전자가 TTFC에 융합되어amyE좌위에 도입되는 경우에, 염색체에는 정상적인cotA유전자도 존재한다. 따라서, 세포는 부분적으로 배수체이고, 세포는 한 개의 정상cotA유전자 및 한 개의 키메라 유전자를 운반한다.

pDG364에 추가하여, 또 다른 적절한 벡터는 pDG1664이다. 이 벡터는 다음 사항을 제외하고는 pDG364와 거의 동일하다;

I) 이 벡터는 에리트로마이신-저항성 유전자,erm을 운반한다. 이것은 클로람페니콜대신 에리트로마이신을 이용하여 형질변환된 바실러스 서브틸리스(B. subtilis) 세포를 선별하는데 이용된다.

ii)amyE유전자의 전후 부분 대신에,thrC유전자의 전후 부분을 운반한다.thrC는 여분의 것이다.

클로닝을 위한 최종 경로는 통합 벡터를 이용하는 것이다. 많은 벡터가 존재하나, pSGMU2 또는 pJH101이 바람직하다. 이 방법에서, 클론에서cot유전자와 잔유 염색체 cot 유전자를 공유하는 동종성에 의해 염색체내로 cot-항원 키메라를 도입시킨다. 단일 교차 재조합 후에,cot-항원 키메라와 전체 플라스미드를cot유전자 염색체 위치에서 염색체내로 도입시켰다. 이렇게 함으로써, 잔류cot유전자가 변형된다. 이는 잔류cot유전자를 변형시키지 않는 pDG364/pDG1664 벡터와는 대조적이다.

c) 다중 항원 프리젠테이션

포자 피복상에 다중 항원을 제공하기 위해, 두 가지 상이한 플라스미드 벡터예를 들면, pDG364, pDG1664를 이용하는 것이 필수적이다. 한 개 키메라 유전자는 pDG364에서 만들고,amyE좌위로 키메라를 도입시킨다. 두 번째 키메라는 pDG1664에 만들고, thrC 좌위로 도입시킨다. 이 경우에 각 형질도입 과정에서는 별도의 항생제 저항성 선별을 요한다. 당분야에 공지된 임의 관련 기술을 포자 피복에 다중 항원을 제공하는데 응용할 수 있다는 것을 인지할 것이다.

d) 균주 확인

표 1에서 볼 수 있는 키메라를 운반하는 이소타입 균주는 외부 항원 발현으로 확인할 수 있다. 특히, 균주를 생장시키고, 적절한 과정을 이용하여 포자 형성하도록 유도한다. 포자 유도후 20-24시간에 포자를 수거하고, 총 포자 피복 단백질을 SDS-DTT 추출 또는 NaOH 추출을 이용하여 회수하였다. 항-TTFC 또는 항-LTV 항체를 이용한 웨스턴 블랏팅을 이용하여 외부 항원이 존재하는 지를 확인하였다. 단백질 수준은 일반적으로cotE및cotF키메라에서 일반적으로 더 낮았다. 확인하면 이와 같은 항원들은 부적절한 단백질 가수 분해 또는 분해 대상이 되지 않는다는 것을 알 수 있다.

thrC좌위 및amyE좌위의 LTB에서 동일한 유전자 발현 수준으로 TTFC가 발현될 수 있다.

포자의 저항성 성질이 어떤 방식으로 영향을 받는지를 평가하기 위해 균주의 최종 확인한다. 각 균주의 포자 현탁액을 준비하였다(표 1). 이와 같은 포자 현탁액을 30분간 80℃로 가열하고, 열 처리 전후에 살아있는 포자 단위를 운반하였다. 외부 항원 발현은 포자 저항성 성질에 영향을 주지않았다.

e) 복막내 면역주사

표 1에 나타낸 것과 같이 각 재조합 균주로부터 포자를 준비하고, 오염된 생장 세포를 제거하기 위해 현탁액을 반복 세척하여 정제시켰다. 그 다음 현탁액을 열-처리하여(65℃), 임의 잔류 생장(비-포자형성 세포) 세포를 비활성화시키고, 연속하여 0, 14, 28일에 1X10⁹포자/㎖를 복막 경로를 통하여 생쥐에 투여하였다. 그 다음 혈청 샘플을 취하고, 항체 역가는 ELISA를 이용하여 결정하였다. 모든 유전자 구조물은 고유 생쥐 또는 비-재조합 포자를 면역주사맞은 생쥐와 비교하였을 때 더 높은 수준의 혈청 IgG를 제공하였다. 이 결과에서 볼 때, TTFC 및 LTB 키메라는 면역원성이고, 면역 반응을 유도할 수 있다.

f) 점막 면역원성

점막 면역원성을 얻기 위해, 두 가지 방법 즉, 경구 투여 및 비강내 투여를 이용한다. TTFC 융합 단백질을 발현하는 포자를 경구 투여하기 위해, 35일간 다중 투여 방식을 이용하여 Black C57 생쥐에 위관법을 이용하여, 1X10¹¹spores/dose를 투여하였다. 적절한 시간대에 꼬리에 피를 내고, 배설물 샘플을 수거하여 꼬리 피에서 혈청 IgG에 대해 그리고 배설물 샘플에서 IgA에 대해 분석하였다.

항-TTFC IgG 및 IgA가 높은 수준이었다. 생쥐에 LTB를 발현하는 포자를 면역주사한 후에 유사한 면역원성(IgG 및 IgA)이 관찰되었다(데이타는 나타내지 않음).

유사하게, LTB를 발현시키는 포자로 비강 투여하면 0, 14, 28일에 포자(20㎕)를 투여하기 위해 미량적정 피펫으로 1X10⁹포자를 투여하여 얻었다. 점막 면역원성이 높게 나타나는데, 이는 운반을 위해 비강 경로를 이용하는 점막 백신 운반체로 포자의 가능성을 설명하는 것이다. TTFC를 발현하는 포자를 생쥐 비강으로 면역 주사한 후에 유사한 높은 면역원성(IgG 및 IgA)이 나타나는 것을 볼 수 있었다.

TTFC 및 LTB를 모두 발현시키는 포자를 이용하여, 비강 및 구강 면역주사후에 항-TTFC 및 항-LTB IgG 및 IgA 수준이 비슷하게 높게 나타났다.

g) 투약량

시험 연구에서, 경구 면역주사용으로 요구되는 최소 포자 양은 1X10⁹포자/투여량이고, 비강의 경우에는 1X10⁸포자/투여량이다. 또 다른 투약 섭생으로 더 낮은 약량을 이용할 수 있는 것도 가능하다.

본 발명에 따른 포자를 이용하여 임의 생물학적으로 활성 분자를 나타낼 수 있다. 예를 들면, 산업상 이용할 수 있는 효소를 나타낼 수 있다.

임의 포자를 형성하는 종을 이용하여, 이형성(heterologous) 항원 제공을 할 수 있다. 그러나, 다른 포자-형성 미생물은 포자 피복 단백질의 동일한 보체를 운반하지는 않았다. 바실러스 세레우스(B. cereus)와 같은 일부 포자 형성 균에는 한 개cat단백질만을 포함한다. 그러나, cotA, cotB, cotC, cotD, cotE, cotF에 대한 항혈청을 이용하면, 포자 형성균의 피복으로부터 동종 또는 cy가 반응 피복 단백질을 확인하는 것이 가능하고, 역 유전학을 이용하여 이들의 유전자를 클론시킬 수 있다.

본 발명에 따른 포자를 어쥬번트와 함께 이용하는 것도 가능하다. 이들에는콜레라 독소, 키토산, 아프로토닌들이 포함될 수도 있다.

실시예 2

재료 및 방법

포자 준비

바실러스 서브틸리스(B. subtilis) 균주 RH103(amyE::cotB-tetC)와 이의 동종 조상 PY79을 함께 모든 면역주사에 이용하였다(2). RHI03는 잘 알려진 것으로[3], 외측 포자 피복 단백질 CotB(59kDa)의 C-단부에 파상풍 독소 단편 C(TTFC:47kDa) 융합 단백질을 운반한다. 키메라cotB-tetC유전자는 바실러스 서브틸리스(B. subtilis)의 amyE 좌위에 있고, 따라서, 내생cotB유전자에 대해trans형이 된다. 참고문헌 [1]에서 설명하는 소모성 방법(exhaustion)을 이용하여 DSM (Difco-포자 형성 배지)를 이용하여 RH103 또는 PY79의 포자 형성시켰다. 포자 형성 배양물은 포자 형성 개시 후 22시간에 수득한다. 임의 잔류 포자 세포를 라이소자임으로 처리한 후, 연속하여 1M NaCl, 1M KCl로 세척하고, 물로 2회 세척하는 하는 Nicholson and Setlow[1]의 방법에 따라 포자의 정제된 현탁액을 만든다. 단백질 분해를 막기 위해, 세척액에는 PMSF(10mM)이 포함된다. 최종 현탁액을 얻은 후에, 포자는 68℃에서 1시간 처리하여 임의 잔류 세포를 죽인다. 그 다음 포자 현탁액을 cfu/㎖에 대해 역가 조사한 후, 몇 방울을 -20℃에 냉동시킨다. 이 방법을 이용하여 DSM 배양물 ℓ당 6X10¹⁰포자를 만들 수 있다. 이와 같은 방법으로 준비된 각 포자 배취에서 다클론 TTFC 항혈청을 이용한 웨스턴 블랏에 의해 포자피복 단백질 추출물에 있는 106kDa 하이브리드 CotB-TTFC 단백질이 존재하는지를 점검하였다.

면역형광 현미경

바실러스 서브틸리스(B. subtilis) 균주(PY79 및 SC2362)를 재현탁 방법[1]을 이용하여 포자를 형성시키도록 유도하였다. 샘플은 포자 형성 개시 후에 정해진 시간에 수거하고, Harry et al[4]의 방법에서 설명하는 과정에 다음과 같은 약간의 변형을 시켜 재현탁 배지에 직접 고정하였다. GTE-라이소자임(50mM 포도당, 20mM Tris-HCl pH7.5, 10mM EDTA, 라이소자임 2mg/㎖)에 재현탁후에, 샘플(10㎕)을 0.010(w/v) poly-L-lysine(Sigma)로 처리한 현미경 덮개 유리(BDH)에 얹는다. 4분 후에, 액체를 덮개 유리에서 흡출시키고, 실온에서 2시간동안 건조시킨다. 유리는 PBS pH7.4로 3회 세척하고, 2% BSA/PBS를 이용하여 실온에서 15분간 차단시킨 다음 9회 더 세척하였다. 실온에서 45분간 샘플을 토끼 항-CotB와 생쥐 항-TTFC 혈청과 함께 배양하고, 3회 세척한 후에, 항-생쥐 IgG-TRITC 공액체(Sigma)와 추가 배양시켰다. 3시간 세척 후에, 덮개 유리를 현미경 슬라이드에 얹고, 이미지는 Nikon DMX1200 디지털 카메라로 찍고, Lucia GF 소프트웨어로 처리하고, TIFF 포맷으로 저장하였다.

TTFC 단백질

C-말단 플로히스티딘 태그에 융합된tetC유전자를 운반하는 pET28b 발현 벡터(Novagen)으로부터 대장균(E.coli) BL21(DE3 pLys)에서 재조합 TTFC을 만들었다. 박테리아를 유도하여 높은 수준의 발현을 얻고, 니켈 친화력 컬럼을 통하여세포 용해질을 통과시켜 TTFC를 정제하였다.

SDS-PAGE를 이용하여 일체성(integrity)에 대해 용출된 TTFC-His 단백질을 점검하고, 농도는 BioRad DC Protein Assay kit를 이용하여 측정하였다.

항원-특이적인 혈청 및 점막 항체 감지를 위한 간접 ELISA

플레이트에 특정 항원을 웨당 50㎕(2㎍/㎖ 탄산염/중탄산염 완충액)을 피복시키고, 실온에서 하룻밤동안 둔다. 항원은 포자 피복 단백질 또는 정제된 TTFC 단백질로 추출된다. 37℃에서 1시간동안 0.5% BSA로 차단후에, 혈청 샘플은 ELISA 희석 완충액(0.1M Tris-HCl, pH 7.4; 3%(w/v) NaCl; 0.5% (w/v) BSA; 10%(v/v) 양 혈청(Sigma); 0.1%(v/v) Triton-X-100; 0.05% (v/v) Tween-20)에서 1/40 희석배로 시작하여 2배 연속 희석한다. 모든 플레이트에는 네가티브 기준(1/40 희석된 프레이뮨 혈청), 포지티브 기준(TTFC 단백질 또는 포자로 장관외 면역주사 맞은 생쥐의 혈청)의 복제 웰이 있다. 플레이트는 37℃에서 2시간동안 배양시키고, 항-생쥐 HRP 공액체(서브클레스의 경우 Serotec는 예외이고 모두 Sigma에서 구입)를 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 추가 배양시키고, 기질 TMB(3, 3', 5, 5'-테트라메틸-벤지딘; Sigma)을 이용하여 발생시켰다. 반응은 2M H₂SO₄를 첨가하여 중지시켰다. 각 샘플에 대한 희석 곡선을 얻고, 엔드포인트 역가는 모은(pool) 프레이뮨 1/40 희석 혈청과 동일한 광학 밀도를 만드는 희석비로 계산한다. Mann-Whitney U 테스트를 이용하여 그룹간의 통계학적 비교하였다. P 값이 > 0.05 인 경우에 통계학적으로 유의성이 없는 것으로 간주한다. 배설물에서 IgA의 ELISA를 위해, Robinson[5]에서 설명하는 것과 같이, PBS에 BSA(1%), PMSF(1mM)에 0.1g 배설물을 현탁시키고, 4℃ 하룻밤동안 배양시키고, ELISA 전에 -20℃에 저장하였다. 각 샘플의 엔드포인트 역가는 희석안된 프레이뮨 배설물 추출물과 동일한 광학 밀도를 만드는 희석비로 계산한다.

면역주사

7마리 또는 8마리 생쥐 군(암컷, BALB/C, 8주령)에 구강, 비강 또는 복막내로 CotB-TTFC(RH103)을 발현시키는 포자 또는 기준의 발현시키지 않는 포자(균주 PY79) 현탁액을 투여하였다. 구강 또는 비강 투여의 경우에 생쥐에 할로탄을 이용하여 가볍게 마취시킨다. 구강 및 비강 경우는 적정 점막 면역주사[6, 5]에서 이용한 것과 같은 다중 투여 섭생을 이용하였다. 고유, 면역주사를 맞지 않은 군도 포함된다. 구강 투여에는 정제된 TTFC 단백질 4(㎍/투여)를 받은 7마리 군도 포함되었다.

a) 구강 면역주사에는 0.15㎖ 용적에 1.67X10¹⁰포자가 포함되고, 0, 2, 4, 18, 20, 22, 34, 35, 36일에 위관법으로 투여하였다. 혈청 샘플은 -1, 17, 33, 54 일에 수거하고, 배설물은 -2, 17, 33, 52일에 수거한다.

b) 비강내 면역주사에는 0.20㎕ 용적에 1.11X10⁹포자가 포함되고, 0, 2, 16, 17, 30, 31일에 위관법으로 투여하였다. 혈청 샘플은 -1, 15, 29, 48 일에 수거하고, 배설물은 -1, 15, 29, 47일에 수거한다.

c) 복막 면역주사에는 0.15㎖ 용적에 1.5X10⁹포자가 포함되고, 0, 14, 28일에 위관법으로 투여하였다. 혈청 샘플은 -1, 7, 22, 36, 43 일에 수거하였다.

파상풍 독소 도전

1차, 구강 면역주사후 60일에, RH103-면역주사를 맞은 생쥐의 피하로 10 또는 20 LD₅₀에 상응하는 파상풍 독소를 주사한다. 정제된 독소(20㎍ protein/Lf; Lf = 응집 단위)를 멸균 0.9% NaCl에 현탁시켰다. 파상풍 독소 LD₅₀은 실험적으로 0.0003Lf(i.e., 1LD₅₀= 6ng 단백질)으로 측정되었고, 주사 용적은 생쥐 한 마리당 200㎕이다. 동물에게서 파상풍 징후를 면멸히 관찰하고, 마비 증세가 나타나는 생쥐를 인도주의적으로 안락사시킨다. 14일 후에도 증세를 보이지 않은 생쥐는 면역되었다고 볼 수 있다. TTFC 정제 단백질을 구강으로 제공받은 생쥐에게 10 LD₅₀를 제공하였다. 고유 생쥐 또는 PY70 포자를 제공받은 생쥐에는 2 LD₅₀를 제공하였다.

포자 피복 단백질 추출

참고문헌[1]에 기술된 것과 같이 SDS-DTT 추출 완충액을 이용하여, 고밀도(1X10¹⁰포자/세포)에서 균주 PY79의 포자 현탁액으로부터 포자 피복 단백질을 추출하였다.

추출된 단백질을 SDS-PAGE를 통하여 일체성을 검사하고, BioRad DC 단백질 검사 키트를 이용하여 농도를 평가하였다.

산재 실험(Dissemination experiments)

Balb/c 생쥐(암컷, 5주령)에 5일간 연속하여 균주 SC2362(rrnO-lacZ cat)1x10⁹포자를 구강으로 투여하였다. SC2362는 영양요구성 한천(Xgal 포함)에서 청색 콜로니로 식별가능한 Lac 표현형과 클로람페니콜 저항성(5㎎/㎖;cat유전자에 의해 인코드됨)을 제공한다. 시간대에 4마리 생쥐군을 죽이고, 샘플 기관 및 조직을 다음과 같은 과정으로 잘라낸다.

우선, 새로운 배설물 펠렛을 수득하고, 동물은 CO₂를 흡입시켜 죽이고, 70% 알코올로 소독하였다. 복부강으로 3㎖ 멸균 PBS를 주사하고, 부드럽게 맛사지하여 복막 대식세포를 수집하였다. 21가우지 바늘 및 주사기를 이용하여 복막 삼출액을 수집하고, 바로 처리하였다. 복부 강을 개복하고 간을 잘라낸다.

내장을 분리하고, 장간막을 제거하였다. 그 다음 지라 및 신장을 수득하고, 내장 관강 내용물(주변 조직은 네가티브 기준으로 사용하기 위해 잘라낸다)로부터 오염을 피하기 위해 Peyer 패취를 넣고, 절제하였다. 마지막으로, 경부와 하악선 (submandibular glands)을 수집하였다. 기관사이에 멸균 절단 기구들이 교환되었다. 3㎖ 유리 비드(2㎜와 4㎜ 직경이 혼합)를 포함하는 1㎖ PBS에 볼텍스하여 샘플을 균질화시키고, CFU를 위해 바로 도말하여(Xgal 및 클로람페니콜을 포함하는 영양 배지), 전체 살아있는 수 또는 열 처리된 수(65℃, 1시간)를 헤아리고, 포자 수를 결정하기 위해 도말하였다.

결과

포자 표면상에 이형성 항원의 표면 발현

포자 피복 단백질 CotB에 키메라로 융합된 TTFC를 발현시키는 재조합 포자(RH103)은 [3]에 설명되어 있다. TTFC를 발현시키는 포자의 면역 반응을 평가하기 위해, 도 1에서 볼 수 있는 것과 같이 면역형광으로 TTFC가 표면에 노출된다는 것을 확인하였다. TTFC 및 CotB에 대한 다클론 혈청을 이용하여 포자 형성 개시후 5시간에 수득된 포자 형성 배양물에서 TTFC를 감지하였다. 우리는 4시간과 6시간에 CotB 및 TTFC를 또한 감지하였다(데이타는 나타내지 않음). 포자 형성 세포를 라벨링에 이용하는데, 다른 연구에 따르면 배경 라벨링 수준이 높은 경우에 방출된 내생포자 이용을 방해하기 때문이다[4]. 우리 결과에서 항-TTFC 혈청으로 라벨된 고유의 알모양의 전포자(forespores)가 나타났다. 재조합 및 비-재조합 포자(panel A, C)에서 CotB 항혈청으로 라벨하면 CorB를 감지하였다.

TTFC를 발현시키는 재조합 포자의 복막 주사루에 혈청 항-TTFC 반응

구강 및 비강 면역주사를 개시하기 전에 우리는 재조합 포자의 면역원성을 평가하기 위한 시험 연구를 하였다. 8마리 C57 생쥐 군에 재조합 또는 재조합되지 않은 포자를 주사하였다(복막으로). 면역 주사 과정은 재조합 RH103(하이브리드 CotB-TTFC를 발현시키는) 또는 재조합되지 않은 PY79 포자를 3회 주사(1.5x10⁹spores/dose)하는 표준 섭생을 이용하였다. 기존 연구에서[3], RH103 포자는 약 9.75X 10^-5pg TTFC 폴리펩티드/(포자)를 포함하여, 면역주사 약량에는 0.15㎍ TTFC를 포함할 것이다. RH103 포자로 면역주사를 하면, 간접 ELISA를 통하여 측정한 결과(데이타 나타내지 않음) 항-TTFC IgG 역가가 1.5X10³에서 피크로 나타났고, 기준군(PY70의 경우, 1.1X10²에; 고유 군의 경우 0.8X10¹)과 비교하였을 때, 유의성 수준으로 상이하였다(p<0.05). 이는 포자 표면에 나타나는 경우에 TTFC가 안정적으로 발현되고, 적절한 면역원성을 가진다는 것을 설명하는 것이다.

구강 및 비강 면역주사후에 혈청 항-TTFC 반응

점막 및 전신 반응 유도에 대해 검사하기 위해, 7마리 생쥐 군에 구강(1.67 x10¹⁰spores/dose; 1.65㎍ TTFC/dose) 또는 비강(1.11x10⁹spores/dose; 0.11㎍ TTFC/dose)을 면역주사하였다. 기술적으로, 비강 경로에는 더 많이 투여하지 못한다. 도 2A에서 볼 수 있는 것과 같이, RH103(CotB-TTFC)로 경구 면역주사를 맞은 생쥐는 33일에 1X10³이상의 역가를 제공하였고, 이는 재조합안된 포자(PY79)를 투여받은 생쥐, 정제된 TTFC 단백질(4㎍/dose)을 제공받은 생쥐 또는 기준 고유 군의 것이상으로 유의성(p < 0.05)있는 것이다. TTFC 단백질을 비강 경로에서는 기준으로 이용하지 않는데, 그 이유는 기존 연구에서 비강으로 운반된 TTFC(10㎍/dose 이하의 낮은 약량)가 면역원성이 없었기 때문이다[8].

비강 면역주사 후 48일에 다소 낮은 수준의 TTFC-특이적인 IgG 엔드포인트 역가가 발견되었다(도 2B). 우리 자료에 따르면 어느 경로이든, 고유 및 비-재조합 면역 주사의 역가는 큰 차이가 없었다(p>0.05). CotB에 융합된 TTFC를 발현시키는 포자를 투여한 군은 경구 투여한 군의 33일에 역가와 비강 투여의 경우 29일에 역가보다 상당히 높은 TTFC-특이적인 IgG 역가를 가진다(p<0.05). 나타내지 않은 작업에서, 우리는 또한, 콜레라 독소(type Inaba 569B, 0.33㎍/dose) 유무하에 투여된 RH103 포자는 항-TTFC IgG 역가에서 큰 차이를 제공하지 못하였다.

혈청 항-TTFC 항체 이소타입

점막으로 면역주사를 맞은 생쥐 혈청에서 TTFC 특이적인 IgG, IgG, IgA, IgM 항체 이소타입 및 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 아강(subclasses) 존재에 대해 검사하였다(도 3). CotB-TTFC를 발현시키는 RF103을 구강으로 면역주사한 생쥐에서는 54일에 IgG1, IgG2a, IgG2b 이소타입 높은 것으로 나타났다. IgG1, IgG2a, IgG2b 아강의 경우에 평균 역가는 두가지 기준 군, i) 고유 생쥐와 ii) 비-재조합 포자(p<0.05)로 면역주사를 맞은 생쥐의 기저수준 역가와는 상당히 큰 차이가 있었다. IgG3, IgM, IgA 아강의 경우에 큰 변화는 없었다. 비강으로 면역주사를 맞은 생쥐에서, 48일째에 혈청에는 IgG1, IgG2b, IgM 아강이 우세하였다. 이들 아강에서, 역가는 기준 군보다 훨씬 높았다(p<0.05). 대조적으로, 이소타입중 어느 것에서도 비재조합 포자와 고유 군을 투여받은 그룹간에 큰 변이는 없었다(p>0.05).

점막 항-TTFC IgA 반응

구강 또는 비강으로 면역주사를 맞은 새로운 배설물 펠렛에 ELISA를 이용하여 TTFC-특이적인 분비성 IgA(sIgA)가 존재하는지 검사하였다(도 4). 어느 경로이건간에 CotB-TTFC를 발현시키는 포자로 면역주사하면 분명한 TTFC-특이적인 sIgA 반응을 유도하였다. 구강 또는 비강으로 면역 주사를 맞은 생쥐군에서, TTFC-특이적인 sIgA 역가는 33일에 최고였다(도 4A & 4B). 배설물 TTFC-특이적인 sIgA의 엔드포인트 역가는 기준 군에 비하여 훨씬 높았고(p<0.05), 기준 그룹간(비재조합 포자와 고유 그룹; p>0.05)간에 차이는 거의 없었다.

구강 면역주사후에 파상풍 독소 도전으로부터 보호

구강 면역주사후에 관찰된 높은 혈청 IgG 역가(>10³)는 잠재적인 보호 수준이었다. 유도된 항-독소 반응의 생물학적 활성과 보호 수준을 테스트하기 위해, CotB-TTFC를 발현시키는 바실러스 서브틸리스(B. subtilis) 포자(RH103)로 경구 면역주사를 맞은 생쥐에 치명적인 파상풍 독소(10 또는 20 LD₅₀)을 복막으로 제공하였다(표 2).

경구 면역주사후에 파상풍 독소로 치명적인 전신 도전에 대해 생쥐의 보호

그룹	독소 더전 약량(LD₅₀)	생존율/전체
고유	2	0/5
PY79 포자	2	0/8
TTFC 정제 단백질	10	0/8
RH103 (CotB-TTFC) 포자	10	8/8
RH103 (CotB-TTFC) 포자	20	7/8

표 2에서는 1.67x10¹⁰바실러스 서브틸리스(B. subtilis) 포자 또는 4㎍의 정제된 TTFC 단백질을 0, 2, 4, 18, 20, 22, 34, 35, 36일에 구강으로 면역주사한 8마리 생쥐 그룹에서 60일째에 파상풍 독소를 피하로 투여한 처리 결과를 나타낸 것이다. 14일 이후에 증상을 나타내지 않은 개체는 면역된 것으로 간주하였다.

생쥐는 10 LD₅₀에 대해서는 완전하게 보호받았다. 20 LD₅₀으로 도전을 받은 생지 8마리중에서 1마리에서는 72시간 뒤에 명백한 증상이 나타났다. 고유 생쥐 및 야생형 바실러스 서브틸리스(B. subtilis) 포자(PY79)로 면역주사맞은 생쥐에서2LD₅₀으로 도전한 후에 72시간내에 파상풍 징후가 분명하게 나타났다. TTFC 정제 단백질(4㎍/dose)로 구강 면역주사한 후에 10 LD₅₀에 대해서는 보호를 하지 못하였고, 모든 생쥐에서 24시간 이내에 파상풍 징후가 유도되었다. CotB-TTFC를 발현시키는 바실러스 서브틸리스(B. subtilis)로 구강 면역주사한 경우에 유도된 전신 항체 반응은 보호성이 있었다.

항-포자 반응

구강 및 비강 면역주사후에 항-TTFC 반응에 추가하여, 항-포자 IgG 및 sIgA 반응을 측정하였다(도 5).

CotB-TTFC를 발현시키는 포자(RH103)와 비재조합 포자(PY79)로 구강 면역주사하면 전신 포자 피복 단백질 IgG 수준이 고유 군보다는 훨씬 높게 나타난다(도 5A)(p<0.05). 재조합 또는 비재조합 포자를 이용하는 경우에 비강 면역 주사후에 포자 피복 특이적인 IgG 역가는 더 낮지만, 여전히 유의성있는 수준(p<0.05)이 관찰되었다(도 5C).

구강으로 면역주사를 맞은 생쥐의 배설물에서 관찰되는 포자 피복-틱이적인 sIgA 수준(도 5B)에서는 포자에 대해 실질적인 반응이 나타났다. 이와 같은 수준은 비-재조합 포자를 면역주사에 이용하는 경우보다 훨씬 더 높게 나타났다(p<0.05). 비강 경로(도 5D)를 면역주사에 이용하면, 포자 피복 특이적인 sIgA 수준의 프로파일이 비-재조합 포자를 투여받은 생쥐에서 시간에 따른 IgA 수준이 감소되는 것과 유사한 것으로 관찰되었다. 다시, 포자 피복 특이적인 sIgA 수준은 고유 생쥐의 것보다는 훨씬 높았다(p<0.05).

포자 산포(Dissemination of spores)

동종번식 Balb/c 생쥐에 5일 연속 1x10⁹spores/dose를 투여하였다. 시험 연구에서 이와 같은 연속 투여는 회수가능한, 통계학적으로 연관된 수치를 얻을 수 있다는 것을 보여주었다. 4마리 생쥐군에 최종 투여후에 생쥐를 죽이고, 주요 임파 기관을 절단해낸다. 추가로 배설물도 수거하고, 균질화시켜, 카운트를 하였다. 균질화된 조직 및 배설물에서 총 살아있는 카운트와 열 저항성 카운트를 결정하였다. 표 3에서는 회수된 살아있는 카운트를 제공하였고, 내장 Peyer's 패취 및 장간막 임파구로부터 세균 회수를 나타내고, 이는 GALT와 상호작용이 있음을 나타내는 것이다.

표 3에서는 5일 연속하여 바실러스 서브틸리스(B. subtilis) 균주SC2362(rrnO-lacZ) 포자 1x10⁹를 구강 투여받은 4마리 Balb/c 생쥐를 처리한 결과를 나타낸 것이다(총 약량, 5x10⁹). 결과는 최종 투여한 후에 지정된 시간에 취한 생쥐 기관당 콜로니 형성 단위 평균 수(numbers of colony forming units)로 나타내었다. 전체 카운트(열 처리 없음); 포자 카운트(65℃, 1시간동안 열처리). ND, 결정되지 않음; NS, 유의성 없음(샘플당 10개 살아있는 단위 미만인 경우)로 나타냄. 데이터는 수학적 단위 ± 표준 편차로 나타내었다.

표 3에서, PP/MLN은 Peyer's 패취와 장간막 임파구의 약어이다; SMG/CLN은 하악선 및 경부 임파구의 약어이고, PM은 복막 대식세포의 약어이다.

가장 흥미로운 것은 간 및 지라로부터 상당한 회수없이 하악선 및 경부 임파구에서 생존 카운트를 얻었다는 것이다. 광범위하게 산포된 전신 부위로부터 거의회수없이 머리 및 목 조직으로부터 세균을 회수하였다는 것은 포자가 비인두( rhinopharanygeal) 점막을 통과한다는 것을 암시한다. 배설물에서 카운트는 GIT로부터 박테리아가 제거되지 때문에 점진적으로 감소되는데, 전체 카운트 및 포자 카운트에는 거의 차이가 없는 것으로 나타났다.

References

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Claims

키메라 유전자형으로 항원 및 포자 피복 단백질을 인코드하여, 포자 피복 단백질과 융합 단백질 형태로 포자에서 항원이 발현되는 적어도 한가지 유전자 구조물로 구성된 유전자 코드에 의해 유전학적으로 변형된 포자.
제 1 항에 있어서, 포자는 바실러스(Bacillus)종인 것을 특징으로 하는 포자.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 유전 구조물은 키메라 유전자형태로 항원 유전자의 일부분과 포자 피복 단백질 유전자의 일부분으로 구성된 것을 특징으로 하는 포자.
전술한 어느 한 항에 있어서, 항원 유전자는 포자 피복 단백질 유전자의 3'단부에 위치하는 것을 특징으로 하는 포자.
전술한 어느 한 항에 있어서, 유전자 구조물은 키메라 유전자의 5'단부에서 포자 피복 프로모터를 포함하는 것을 특징으로 하는 포자.
전술한 어느 한 항에 있어서, 항원은 파상풍 독소 C 또는 불안정한 독소 B소단위 중 적어도 하나인 것을 특징으로 하는 포자.
전술한 어느 한 항에 있어서, 포자 피복 단백질은cotA, cotC, cotD, cotE, cotF, cotG, cotH, cotJA, cotJC, cotM, cotSA, cotS, cotT, cotV, cotW, cotX, cotY, cotZ에서 선별되는 것을 특징으로 하는 포자.
전술한 어느 한 항에 있어서, 포자는 열에 의해 비활성화되어, 사용시에 생장세포로 발아되지 않는 것을 특징으로 하는 포자.
전술한 어느 한 항에 있어서, 포자는 의학적 질환을 치료하는데 이용되는 것을 특징으로 하는 포자.
두 가지 다른 치료요법적으로 활성 화합물을 발현시키는 것을 특징으로 하는전술한 어느 한 항에서 정의된 것과 같은 적어도 두 가지 상이한 포자를 포함하는 조성물.
제 10 항에 있어서, 약학적으로 수용가능한 부형제 또는 담체가 추가 포함된 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항 내지 제9항중 어느 한 항에 따른 포자와 약학적으로 수용가능한 부형제 또는 담체로 구성된 것을 특징으로 하는 조성물.
염증, 통증, 호르몬 불균형, 내장 질환 치료용으로 제10항 내지 제12항중 어느 한 항에 따른 포자와 약학적으로 수용가능한 부형제 또는 담체로 구성된 것을 특징으로 하는 조성물.
염증, 통증, 호르몬 불균형, 내장 질환 치료용 약물을 제조하는데 있어서, 제1항 내지 제9항중 어느 한 항에 따른 포자의 용도.
a) 의학적 치료를 요하는 사람 또는 동물에 제 1 항 내지 제9항에서 정의된 바와 같은 포자를 투여하고;

b) 유전학적으로 변형된 포자가 질병 예방에 이용될 수 있는 면역 반응을 유도하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 치료 방법.
제 15 항에 있어서, 포자는 구강, 비강 또는 직장으로 투여되는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
유전적으로 변형된 포자를 만드는 방법에 있어서

키메라 유전자 형태로 항원 및 포자 피복 단백질을 인코드하는 적어도 한가지 유전자 구조물을 포함하는 유전자 코드를 만들고;

유전자 구조물을 이용하여 생장 모세포를 형질변환시키고;

형질변환된 모세포가 포자 형성하도록 유도하고;

생성된 유전적으로 변형된 포자를 분리하는 단계로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.