ES2313736T3 - Dominios de igg2 no activadores mutados y anticuerpos anti-cd3 que incorporan los mismos. - Google Patents
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Abstract
EN LA INVENCION SE PRESENTAN REGIONES CONSTANTES DE IGG2 MUTADAS Y ANTICUERPOS ANTI - CD3 QUE LAS COMPRENDEN. TALES ANTICUERPOS SE UNEN ESPECIFICAMENTE AL ANTIGENO CD3 SOBRE CELULAS T PERO INDUCEN UNA RESPUESTA MITOGENICA REDUCIDA EN COMPARACION A OTROS ANTICUERPOS DE LO CONTRARIO IDENTICOS QUE COMPRENDEN REGIONES CONSTANTES DE IGG2 NATURALES. LOS ANTICUERPOS SE PUEDEN UTILIZAR EN EL TRATAMIENTO DE TRASTORNOS EN LOS QUE SE REQUIERE UNA SUPRESION INMUNE CON MENOS EFECTOS SECUNDARIOS QUE LOS APARECIDOS CON UN TRATAMIENTO CON LOS ANTICUERPOS ANTI - CD3 HASTA AHORA CONOCIDOS.
Description
Dominios de IgG2 no activadores mutados y
anticuerpos anti-CD3 que incorporan los mismos.
La invención se refiere a los campos técnicos de
la inmunología y de la genética molecular para el diseño de
dominios de IgG2 no activadores mutados y de anticuerpos
anti-CD3 humanizados que incorporan los mismos.
El complejo CD3 en los linfocitos T está
íntimamente asociado con el heterodímero del receptor de linfocitos
T (TCR) y desempeña una importante función en la activación de
linfocitos T en la unión del antígeno. Determinados anticuerpos
anti-CD3 pueden activar linfocitos T en ausencia de
antígeno. Dicha activación depende de la interacción del fragmento
Fc del anticuerpo monoclonal (mAb) y los receptores de Fc en células
accesorias para reticular los complejos CD3 en los linfocitos T.
Los mAb anti-CD3 solubles no estimulan los
linfocitos T para proliferar in vitro a menos que se unan a
plástico o a células que llevan el receptor de Fc.
Aunque la inmunosupresión puede conseguirse
administrando estos anticuerpos a pacientes humanos o a ratones, la
eficacia con frecuencia está comprometida por dos factores. El
primero es la respuesta a la antiglobulina resultante de múltiples
inyecciones de proteínas extrañas y el segundo es el síndrome de la
primera dosis resultante de la activación de linfocitos T. Los
síntomas incluyen fiebre, escalofríos, diarrea y vómitos y en los
casos graves ha producido la muerte. El síndrome se produce por
liberación de un hospedador de citocinas como resultado de la
activación transitoria de linfocitos T (véase Abramowicz et
al., Transplantation 47, 606, (1989)). Las citocinas
tales como TNF-\alpha,
IFN-\gamma, IL-2,
IL-4, IL-6 y GM-CSF
han estado implicadas en estos efectos secundarios graves. En los
ratones, se han descrito dos formas de anti-CD3 que
son inmunosupresores sin activar los linfocitos T de ratón: la forma
F(ab')_{2} (véase Hirsch et al.,
Transplantation 49, 1117, (1990)) y la forma híbrida del
isotipo de IgG3 de ratón (véase Alegre et al., J.
Immunol. 155, 1544, (1995)). El primero carece del fragmento de
la región constante que une los receptores Fc\gamma y la región
constante del último presenta una baja afinidad para los receptores
de Fc\gamma de ratón.
En terapia humana, es deseable tener una
molécula anti-CD3 que no esté únicamente humanizada
sino que pueda asimismo interactuar con los receptores Fc\gamma
para minimizar la inmunogenicidad y toxicidad. Se han determinado
las respectivas afinidades de varios isotipos humanos de IgG para
los tres receptores de Fc\gamma, FcRI, FcRII y FcRIII, (véase
Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9, 457, (1991)). FcRI es
un receptor de gran afinidad que se une a las IgG en forma
monomérica, y estos dos últimos son receptores de baja afinidad que
se unen a las IgG solamente en forma multimérica. En general, tanto
IgG1 como IgG3 tienen una actividad de fijación significativa a los
tres receptores, IgG4 a FcRI e IgG2 a solamente un tipo de FcRII
denominado Ila^{LR} (véase Parren et al., J.
Immunol. 148, 695 (1992); J. Clin. Invest. 90, 1537
(1992)). Ila^{LR} es un alelo de FcRII que se expresa en el 40%
de la población caucásica. Varios investigadores han preparado
anti-CD3 híbrido de varios isotipos pero se
describió que todos eran PBMC (células mononucleares de la sangre
periférica) mitógenas de por lo menos algunos donantes (véase Bolt
et al., Eur. J. Immunol., 23, 403 (1993); Parren
et al., Res. Immunol. 142, 793 (1991)). Por
consiguiente, las formas naturales de Fc son inadecuadas para
producir los mAb anti-CD3 no activadores.
Se ha descrito que las mutaciones realizadas en
la región de la bisagra inferior/CH2 superior en IgG1
anti-CD3 e IgG4 hacen a estas moléculas menos
mitógenas (véase Alegre et al., Transplantation 57,
1537 (1994); Alegre et al., J. Immunol. 148, 3461
(1992)). Se ha descrito una mutación en la posición 235 de IgG3
para efectuar su interacción con FcRI y se han descrito mutaciones
en las posiciones 234 y 237 que afectan su interacción con FcRII
(véase Lund et al., J. Immunol. 147, 2657, (1991)). Se
ha descrito que una forma aglucosilada de anti-CD3
tiene la fijación alterada a los receptores Fc\gamma (véase Bolt
et al., Eur. J. Immunol. 23, 403 (1993)).
El documento WO 94/28027 afirma que los
anticuerpos monoclonales de IgG1 humanizados procedentes del
anticuerpo OKT3 murino, presentan mutaciones puntuales en las
posiciones 234 ó 235 y que presentan propiedades activadoras
reducidas tal como las compuestas con OKT3.
Woof et al., Molecular Immunology
23, 319-330 (1985) expone la localización de
regiones de fijación de monocitos en la secuencia de aminoácidos de
diferentes inmunoglobulinas G. La referencia describe que una
región procedente de Leu 234-239 en IgG1, IgG3
humanas, IgG de conejo e IgG2a de ratón, pueden ser en parte
responsables de la fijación a FcR de monocitos (pág. 327, primera
columna, segundo párrafo).
Ward et al., Therapeutic
Immunology 2, 77-94 (1985) es un artículo de
revista que describe que los puntos de fijación para Fc\gammaRs
en varios anticuerpos con IgG se descubrió que residen
principalmente en la región de la bisagra inferior de Leu 234 a
Pro-238 (párrafo que comprende las págs.
81-82).
A pesar de estos desarrollos, continúa habiendo
necesidad de anticuerpos anti-CD3 que tengan
regiones constantes mutadas que presenten actividad mitógena en
todavía menor medida y/o en menos pacientes que los anticuerpos
existentes.
La invención proporciona regiones constantes de
IgG2 humanas mutadas que comprenden un segmento no natural de
aminoácidos entre los restos 234 y 237 definidos por el sistema
numérico de la EU. Los anticuerpos anti-CD3 que
incorporan dichas regiones constantes de IgG2 pueden unirse
específicamente a antígenos CD3 en linfocitos T sin provocar una
respuesta mitógena en los linfocitos T por unión específica a
receptores de Fc\gamma. En las regiones constantes de IgG2
mutadas preferidas los restos 234, 235 y 237 forman uno de los
siguientes segmentos de aminoácidos: ala ala gly, val ala ala, ala
ala ala, val glu ala y ala glu ala. Obsérvese que la posición 236
(definida por el sistema numérico de la EU) está desocupada en estas
regiones constantes mutadas, ya que está en una región constante de
IgG2 natural. Normalmente, el segmento mutado está incluido si no en
una región constante de IgG2 humana natural. La invención
proporciona además anticuerpos anti-CD3,
preferentemente, anticuerpos humanizados, que incorporan las
regiones constantes de IgG2 mutadas.
La invención proporciona además nuevos
anticuerpos humanizados procedentes del anticuerpo M291 de ratón en
los que pueden incorporarse los dominios de IgG2 mutados. Una cadena
ligera humanizada preferida comprende tres regiones determinantes
de complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) con secuencias de
aminoácidos procedentes de las regiones determinantes de
complementariedad correspondientes de la cadena ligera de
inmunoglobulina M291, y procedente de una secuencia armazón de la
región variable de la cadena ligera kappa humana. Una cadena pesada
humanizada preferida comprende tres regiones determinantes de
complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) con secuencias de aminoácidos
procedentes de las regiones determinantes de complementariedad
correspondientes de la cadena pesada de inmunoglobulina M291, y un
armazón de la región variable de una secuencia armazón de la región
variable de la cadena pesada humana excepto en por lo menos una
posición seleccionada de entre un grupo constituido por H30, H67,
H68, H70, H72 y H74 en el que la posición del aminoácido está
ocupada por el mismo aminoácido presente en la posición equivalente
del armazón de la región variable de la cadena pesada de
inmunoglobulina M291 de ratón. La inmunoglobulina se une
específicamente a un antígeno CD3 en la superficie de los
linfocitos T y normalmente tiene una afinidad de unión con un límite
inferior de aproximadamente 10^{7} M^{-1} y un límite superior
de aproximadamente cinco veces la afinidad de unión de la
inmunoglobulina M291. Preferentemente, el armazón de la región
variable de la cadena ligera humanizada procede del armazón de la
región variable de la cadena ligera del anticuerpo
HF2-1/17 en el subgrupo I. Preferentemente, el
armazón de la región de la cadena pesada humanizada procede del
armazón variable de la región de la cadena pesada del anticuerpo
21/28. En este caso, la posición H44 puede sustituirse por el mismo
aminoácido presente en la posición equivalente de una secuencia de
consenso del subgrupo 1 de la inmunoglobulina humana.
Figura 1. Secuencias del ADNc (SEC. ID. nº: 1,
3, 5 y 7) y secuencias de aminoácidos traducidas (SEC. ID. nº: 2,
4, 6 y 8) de las regiones variables de la cadena ligera (A, C) y de
la cadena pesada (B, D) del anticuerpo M291 de ratón
(A-B) o humanizado (C-D). El primer
aminoácido de cadena madura está indicado por un doble subrayado.
Las tres CDR en cada cadena no están subrayadas.
Figura 2. Montajes de plásmido que expresan
anticuerpos anti-CD3 híbridos. Se prepararon los ADN
con V_{H} y V_{L} de OKT3 en exones flanqueados por las
regiones XbaI. La secuencia V_{L} se incorporó en un vector de
expresión pVk.rg. y la secuencia V_{H} en el vector de expresión
de la cadena pesada, pVg2.D.Tt. Los dos plásmidos se recombinaron a
continuación para generar un único plásmido que expresa
conjuntamente las cadenas pesada y ligera. Los puntos PstI y SfiI
no son exclusivos en estos plásmidos.
Figura 3. Secuencias en la región C_{H}2 de
los cuatro isotipos de IgG, los cinco mutantes de IgG2 y un mutante
de IgG4. Se utilizó el sistema numérico de la EU para los
restos.
Figura 4. Secuencia de aminoácidos (SEC. ID. nº:
9) en la región constante de la cadena pesada del mutante 3 de
IgG2. El dominio de C_{H}1 constituido por los restos
118-215, la bisagra 216-230, el
C_{H}2 231-340 y el C_{H}3
341-447. El símbolo "-" indica el espacio
introducido para la alineación correcta con EU. Los restos mutados
de la IgG2 natural están subrayados. Excepto para los restos
234-237, los cinco mutantes de IgG2 tienen
secuencias idénticas. Las secuencias en esta región para los cinco
mutantes se presentan en la figura 3. Todos los restos se nombran
según el sistema numérico de EU.
Figura 5. Proliferación de linfocitos T en
respuesta a anticuerpos anti-CD3 OKT3 híbridos. Se
determinó la incorporación de [^{3}H]-timidina
por los PBMC de ocho donantes humanos (donantes A-H)
producidos por los anticuerpos híbridos anti-CD3.
Se incubaron los PBMC con cada anticuerpo anti-CD3 a
10 ng/ml, 100 ng/ml y 1 \mug/ml durante 72 h, se pulsaron con
[^{3}H]-timidina durante 12 h. más y se determinó
la incorporación del isótopo por recuento por centelleo. PBS es la
referencia salina tamponada con fosfato, Fos representa una versión
de F(ab')_{2} de la molécula anti-CD3
híbrida que contiene la cremallera Fos de leucina,
M1-M5 se refiere a los mutantes 1-5
de IgG2, AA al mutante Ala-Ala de IgG4 y VZV IgG1 es
un anticuerpo humanizado irrelevante de referencia.
Figura 6. Lisis por blastocitos T redirigidos.
Las células K562 marcadas con [^{51}Cr] y los blastocitos T
humanos se incubaron con anticuerpos híbridos
anti-CD3 a varias concentraciones durante 4 h. y se
midió la liberación de ^{51}Cr. Fos representa una versión de
F(ab')_{2} de la molécula anti-CD3
híbrida.
Figura 7. Ensayo competitivo para comparar la
avidez relativa de los anticuerpos anti-CD3 OKT3
híbridos. Subsaturando cantidades de OKT3-FITC
murino en linfocitos T humanos activados se desplazaron aumentando
las cantidades de OKT3 murino, u OKT3-IgG1 híbrido,
IgG2 y mutante 3 de IgG2. IgG1 de VZV es un anticuerpo humanizado
inaplicable. Los valores se expresan en porcentaje de inhibición de
la intensidad de fluorescencia cuando se comparan con los de la
referencia sin ningún anticuerpo competitivo.
Figura 8. Liberación de
IFN-\gamma y TNF-\alpha
producida por anticuerpos anti-CD3 OKT3 híbridos.
Las PBMC de seis donantes humanos (donantes C-H) se
colocaron en el ensayo de proliferación de linfocitos T con tres
concentraciones de cada uno de los anticuerpos. Se determinó la
concentración de IFN-\gamma a las 72 h. (paneles
superiores) y TNF-\alpha a las 24 h. (paneles
medios). El símbolo (*) indica que la concentración de la citocina
está más allá del límite superior del análisis. Los perfiles de
proliferación de los linfocitos T de cada donante para los
anticuerpos analizados se toman de la figura 5 y se presentan en los
paneles inferiores. Los cuatro anticuerpos utilizados eran OKT3
F(ab')_{2} (Fos), IgG1, IgG2 y el mutante 3 (M3) de IgG2.
PBS es la referencia negativa sin ningún anticuerpo.
Figura 9. Liberación de IL-2 y
provocación de la expresión de receptores-\alpha
de IL-2 (CD25) en linfocitos T por anticuerpos
anti-CD3 OKT3 híbridos. Las PBMC de seis donantes
humanos (donantes C-H) se colocaron en el ensayo de
proliferación de linfocitos T con tres concentraciones de cada uno
de los anticuerpos. Se determinó el porcentaje de linfocitos T
(positivos a CD-7) que expresan a CD25 por
citometría de flujo a las 90 horas (paneles superiores) y se midió
la concentración de IL-2 a las 24 h. (paneles
medios). Los perfiles de proliferación de los linfocitos T de cada
donante para los anticuerpos analizados se toman de la figura 5 y se
presentan en los paneles inferiores. Los cuatro anticuerpos
utilizados fueron F(ab')_{2} anti-CD3
(Fos), IgG1, IgG2 y el mutante 3 (M3) de IgG2. PBS es la referencia
negativa sin ningún anticuerpo.
Figura 10. Unión competitiva de anticuerpos M291
de ratón y humanizados. Se incubaron concentraciones crecientes de
anticuerpos competidores en frío con linfocitos T en presencia del
anticuerpo M291 de ratón con trazador radiomarcado y se determinó
la relación de radioactividad ligada/libre.
Figura 11. Liberación de
TNF-\alpha, IFN-\alpha e
IL-2 provocada por anticuerpos M291
anti-CD3 humanizados. El análisis se realizó como
en la figura 8 con los PBMC de cinco donantes humanos utilizando las
concentraciones de anticuerpo indicadas y la liberación de citocina
medida en los tiempos indicados.
La expresión región constante de IgG2 se refiere
a la secuencia de la región constante de IgG2 específica descrita
por Ellison y Hood, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 1984
(1981), a las variantes alelas de los mismos y a otras formas de
los mismos que llevan un alto grado de identidad de secuencia (por
ejemplo por lo menos el 90, 95 o 99% de identidad de secuencia con
la secuencia de Elllison y Hood, anteriormente). Preferentemente,
las posiciones del resto que no son idénticas se diferencian por
sustituciones de aminoácidos conservadoras. La expresión incluye
una región constante completa y fragmentos de la misma tal como las
regiones CH1, bisagra, CH2 y CH3 y combinaciones de las mismas. Las
regiones constantes de IgG2 se encuentran en seres humanos y
primates.
Se determina el porcentaje de identidades de
secuencia mediante los programas GAP o BESTFIT utilizando pesos del
hueco por defecto.
Los aminoácidos en la región constante son
numerados por alineación con la EU del anticuerpo humano (véase
Cunningham et al., J. Biol. Chem., 9, 3161 (1970)). Es
decir, las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo se alinean con
las cadenas pesada y ligera de la EU para maximizar la identidad de
la secuencia de aminoácidos y cada aminoácido en el anticuerpo se
asigna el mismo número que el aminoácido correspondiente en la EU.
El sistema de numeración EU se utiliza convencionalmente en la
técnica (véase en general, Kabat et al., Sequences of
Protein of Immunological Interest, publicación NIH nº
91-3242, US Department of Health and Human Services
(1991)). Según este convenio, la región constante de IgG2 natural
descrita por Ellison y Hood, anteriormente, carece de un aminoácido
en la posición 236. Los aminoácidos de las regiones variables de las
cadenas pesada y ligera de las inmunoglobulinas se denominan aquí
Hx y Lx respectivamente, donde x es un número que designa la
posición en la secuencia de la región
variable.
variable.
Los anticuerpos anti-CD3 de la
invención presentan la unión específica al antígeno CD3 humano. La
mayoría de los anticuerpos contra el CD3 humano no reaccionan en
cruz con los antígenos afines de mamíferos inferiores.
Para la clasificación de sustituciones de
aminoácidos como conservadoras y no conservadoras, los aminoácidos
se agrupan de la manera siguiente: Grupo I (cadenas laterales
hidrófobas): norleucina, met, ala, val, leu, ile; Grupo II (cadenas
laterales hidrófilas neutras): cys, ser, thr; Grupo III (cadenas
laterales ácidas): asp, glu; Grupo IV (cadenas laterales básicas):
asn, gln, his, lys, arg; Grupo V (grupos que influye la orientación
de la cadena): gly, pro; y Grupo VI (cadenas laterales aromáticas):
trp, tyr, phe. Las sustituciones conservadoras implican
sustituciones entre aminoácidos en la misma clase. Las sustituciones
no conservadoras se constituyen intercambiando un miembro de una de
estas clases por un miembro de otra.
Desde el terminal N al terminal C, ambas cadenas
ligera y pesada comprenden los dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3,
CDR3 y FR4. La asignación de los aminoácidos a cada dominio está de
acuerdo con las definiciones de Kabat (1991), supra, y/o
Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917
(1987); Chothia et al., Nature
342:878-883 (1989).
La unidad estructural básica de anticuerpo es
conocida porque comprende un tetrámero. Cada tetrámero está
compuesto de dos pares idénticos de cadenas de polipéptido, teniendo
cada par una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kDa) y una
cadena "pesada" (aproximadamente 50 a 70 kDa). La fracción
amino-terminal de cada cadena incluye una región
variable de aproximadamente 100 a 110 aminoácidos principalmente
responsable del reconocimiento del antígeno. La fracción
carboxi-terminal de cada cadena define una región
constante principalmente responsable para la función del efector.
Las regiones variables de cada par de cadena ligera/pesada forman el
punto de unión del anticuerpo. De este modo, un anticuerpo intacto
presenta dos puntos de unión.
Las cadenas ligeras se clasifican en kappa o
lambda. Las cadenas pesadas se clasifican en gamma, mu, alfa, delta
o épsilon y definen el isótopo del anticuerpo como IgG, IgM, IgA,
IgD e IgE, respectivamente. Dentro de las cadenas ligera y pesada,
las regiones variable y constante se unen mediante una región
"J" de aproximadamente 12 o más aminoácidos, incluyendo
también la cadena pesada una región "D" de aproximadamente más
de 10 aminoácidos. (Véase en general, Fundamental Immunology
(Paul, W., ed., 2ª ed. Raven Press, N.Y., 1989), cap. 7).
El término epítopo incluye cualquier
determinante proteico capaz de la unión específica a una
inmunoglobulina o receptor de linfocitos T. Los determinantes
epitópicos están normalmente constituidos por grupos de moléculas
con superficie químicamente activa tales como las cadenas laterales
de aminoácidos o azúcar y normalmente presentan características
estructurales específicas tridimensionales, así como características
específicas de carga.
El término paciente incluye a personas e
individuos veterinarios.
Un anticuerpo de ensayo compite con un
anticuerpo de referencia por la unión específica un antígeno cuando
un exceso del anticuerpo de ensayo inhibe sustancialmente la unión
del anticuerpo de referencia al antígeno en un ensayo competitivo.
Sustancialmente inhibe los medios que el anticuerpo de ensayo reduce
la unión específica de la referencia normalmente en por lo menos
19%, 25%, 50%, 75% o 90%. Un anticuerpo competitivo se une al mismo
o similar epítopo en un antígeno como anticuerpo de referencia o a
un epítopo que está sustancialmente próximo al epítopo unido por el
anticuerpo de referencia para inhibir la unión del anticuerpo de
referencia al antígeno.
La invención proporciona regiones constantes de
IgG2 mutadas de modo que pierden sustancialmente la capacidad para
unirse específicamente a receptores Fc\gamma y de este modo
activan respuestas mitógenas en linfocitos T en la mayoría de los
pacientes. La invención también proporciona nuevos anticuerpos
anti-CD3 humanizados procedentes del anticuerpo
M291 de ratón, en los que pueden incorporarse las regiones
constantes de IgG2 mutadas. Las regiones constantes de IgG2 mutadas
pueden incorporarse también en otro anti-CD3 u otros
anticuerpos.
La invención proporciona regiones constantes de
IgG2 con mutaciones en la región C_{H}2 que carece sustancialmente
de capacidad para interactuar con los receptores de Fc\gamma. Las
mutaciones asociadas a la pérdida de unión del receptor Fc\gamma
se producen en los restos 234-237 de la región
constante de IgG2 con los restos numerados por el convenio de la
EU. Las mutaciones se seleccionan según varias limitaciones. En
primer lugar, las mutaciones deberían producir la pérdida de unión
específica (es decir, Ka<10^{6} M^{-1}) al receptor
Fc\gamma reconocido naturalmente por IgG2 (FcRII) sin producir la
adquisición correspondiente de la unión a otros receptores de
Fc\gamma no reconocidos de forma natural por IgG2. En otras
palabras, las formas mutadas de IgG2 de la invención no presentan
habitualmente unión específica a ninguno de los receptores de
Fc\gamma, por lo menos en las formas alélicas que se producen
frecuentemente. La pérdida sustancial de unión a los receptores
Fc\gamma produce la pérdida sustancial de actividad mitógena de
linfocito T.
En segundo lugar, un anticuerpo
anti-CD3 que incorpora una región constante de IgG2
mutada tendría sustancialmente la misma afinidad de unión y avidez
por CD3 (por ejemplo sin un factor de 3, 5 o 10 veces) como un
segundo anticuerpo anti-CD3, que presenta una
región constante de IgG2 natural, pero que si no es idéntico. Las
mutaciones no deberían afectar la especificidad de unión (por
ejemplo un anticuerpo que lleva una región constante de IgG2 mutada
debería competir para unirse a un CD3 humano con una forma no mutada
del anticuerpo). Tercero, la mutación no debería perturbar la
estructura de la región constante hasta ahora desde la de una región
constante natural en cuanto que resulta la inmunogenicidad
aumentada. De este modo, los anticuerpos que llevan regiones
constantes mutadas de la invención continúan siendo útiles para
suprimir las respuestas inmunitarias de los linfocitos T en
procedimientos terapéuticos.
El aislamiento de cinco regiones constantes de
IgG2 a título de ejemplo que contienen diferentes combinaciones de
mutaciones que satisfacen estos criterios se describe a
continuación. En estas regiones constantes, los restos 234, 235 y
237, definidos por el sistema de numeración de la EU, forman un
segmento de aminoácidos seleccionados de entre el grupo constituido
por:
ala ala gly,
val ala ala,
ala ala ala,
val glu ala, y
ala glu ala.
La posición 236 está ocupada en estas regiones
constantes mutantes, ya que es una región constante de IgG2
natural.
Igualmente, estas regiones constantes mutantes
pueden describirse como que comprenden uno de los siguientes
segmentos no naturales de los aminoácidos entre las posiciones 234 y
237:
ala ala_gly,
val ala_ala,
ala ala_ala,
val glu_ala,
ala glu_ala,
en los que _ representa la ausencia de un
aminoácido en la posición 236.
Aunque no todas las sustituciones en estos
ejemplos son conservadoras por la clasificación de aminoácidos
descrita anteriormente, no introducen cambios sustanciales en la
distribución de la carga o la configuración de la región constante
de IgG2 que las contienen. De este modo, la unión del receptor de
Fc\gamma y la activación mitógena de los linfocitos T puede
reducirse sustancialmente por modificaciones relativamente
conservadoras. Pueden realizarse otras mutaciones que pueden
satisfacer los criterios sustituyendo los aminoácidos 234 a 237,
independientemente o conjuntamente, con cualquiera de los 20
aminoácidos habituales o eliminando alguno de estos
aminoácidos.
Las regiones constantes de IgG2 mutadas se
incorporan en los anticuerpos anti-CD3 por técnicas
recombinantes. Los anticuerpos anti-CD3
completamente humanos o humanizados son los más adecuados, por
ejemplo, M291 humanizado u OKT3 humanizado (Allegre et al.
(1992), supra). Los anticuerpos que incorporan estas regiones
constantes presentan propiedades deseables como agentes
inmunosupresores porque pueden suprimir las respuestas inmunitarias
de los linfocitos T sin provocar actividad mitógena produciendo una
liberación perjudicial de citocinas, por lo menos en la mayoría de
los pacientes (significando por lo menos el 67%, 75%, 90% o 95% tal
como se utiliza en la presente memoria). Un anticuerpo
anti-CD3 que incorpora las regiones constantes de
IgG2 mutadas de la invención no presenta unión significativamente
mayor (por ejemplo más de 2, 5 ó 10 veces) a los receptores de
Fc\gamma que un fragmento de
F(ab')_{2} del anticuerpo (que carece completamente de un dominio de unión de Fc\gamma R). Como resultado de esta pérdida de afinidad de unión, los anticuerpos anti-CD3 que incorporan regiones constantes de IgG2 mutadas no estimulan actividad proliferante significativa en los linfocitos T en comparación con los niveles de referencia. Además, los anticuerpos anti-CD3 que incorporan regiones constantes de IgG2 mutadas de la invención no estimulan de manera significativa la liberación de citocinas, tales como TNF-\alpha, IL-2 o IFN-\gamma o inducen la expresión del receptor de IL-2 por los linfocitos T unidos por los anticuerpos en comparación con los fragmentos de F(ab')_{2} correspondientes. Es decir, en la mayoría de los pacientes o in vitro con células procedentes de la mayoría de los donantes, la actividad mitógena (es decir, la proliferación inducida y/o la liberación de citocinas y/o la expresión del receptor) se reduce en al menos 2, 5, 10 ó 100 veces de la actividad correspondiente observada con los anticuerpos anti-CD3 de IgG1 y/o IgG2 no mutados, y/o está comprendida en 2, 5 ó 10 veces la de éste con los fragmentos de F(ab')_{2}. Los anticuerpos que incorporan regiones constantes de IgG2 mutadas ofrecen ventajas sobre los fragmentos F(ab')_{2} de vida media más larga en el suero. Los anticuerpos que incorporan las regiones IgG2 mutadas presentan también con frecuencia vidas medias más largas in vivo e inmunogenicidad reducida en comparación con los anticuerpos que tienen regiones constantes naturales debido supuestamente a su incapacidad para interactuar con los receptores de Fc\gamma.
F(ab')_{2} del anticuerpo (que carece completamente de un dominio de unión de Fc\gamma R). Como resultado de esta pérdida de afinidad de unión, los anticuerpos anti-CD3 que incorporan regiones constantes de IgG2 mutadas no estimulan actividad proliferante significativa en los linfocitos T en comparación con los niveles de referencia. Además, los anticuerpos anti-CD3 que incorporan regiones constantes de IgG2 mutadas de la invención no estimulan de manera significativa la liberación de citocinas, tales como TNF-\alpha, IL-2 o IFN-\gamma o inducen la expresión del receptor de IL-2 por los linfocitos T unidos por los anticuerpos en comparación con los fragmentos de F(ab')_{2} correspondientes. Es decir, en la mayoría de los pacientes o in vitro con células procedentes de la mayoría de los donantes, la actividad mitógena (es decir, la proliferación inducida y/o la liberación de citocinas y/o la expresión del receptor) se reduce en al menos 2, 5, 10 ó 100 veces de la actividad correspondiente observada con los anticuerpos anti-CD3 de IgG1 y/o IgG2 no mutados, y/o está comprendida en 2, 5 ó 10 veces la de éste con los fragmentos de F(ab')_{2}. Los anticuerpos que incorporan regiones constantes de IgG2 mutadas ofrecen ventajas sobre los fragmentos F(ab')_{2} de vida media más larga en el suero. Los anticuerpos que incorporan las regiones IgG2 mutadas presentan también con frecuencia vidas medias más largas in vivo e inmunogenicidad reducida en comparación con los anticuerpos que tienen regiones constantes naturales debido supuestamente a su incapacidad para interactuar con los receptores de Fc\gamma.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención proporciona además nuevos
anticuerpos anti-CD3 humanizados procedentes del
anticuerpo M291 de ratón en los que las regiones constantes de IgG2
mutadas pueden incorporarse (véase también el documento USSN
08/397.411). Los anticuerpos humanizados pueden también utilizarse
con otras regiones constantes o como fragmentos que carecen de
regiones constantes intactas. Las formas humanizadas de las
inmunoglobulinas tienen zona(s) con armazón variable
sustancialmente procedente(s) de una inmunoglobulina humana
(denominada inmunoglobulina aceptora) y regiones determinantes de
complementariedad sustancialmente de una inmunoglobulina de ratón
(denominada inmunoglobulina donante). La(s) zona(s)
constante(s), si está(n) presente(s), son también
sustancialmente (por ejemplo 85%, 90%, 95% o más) de una
inmunoglobulina humana. Los anticuerpos humanizados presentan una
afinidad de unión específica por sus antígenos respectivos de por lo
menos 10^{7}, 10^{8}, 10^{9} ó 10^{10} M^{-1}. Con
frecuencia los límites superior e inferior de la afinidad de unión
de los anticuerpos humanizados están comprendidos dentro de un
factor de tres o cinco o diez del anticuerpo de ratón del que
derivan.
Una vez seleccionada la CDR y los componentes
del armazón de las inmunoglobulinas humanizadas, están disponibles
una variedad de procedimientos para producir dichas
inmunoglobulinas. Debido a la degeneración del código, una variedad
de secuencias de ácido nucleico codifican cada secuencia de
aminoácidos de la inmunoglobulina. Las secuencias de ácido nucleico
deseadas pueden producirse por la síntesis de ADN en fase sólida de
nuevo o por mutagénesis de PCR de una variante preparada
inicialmente del polinucleótido deseado. Todos los ácidos nucleicos
que codifican los anticuerpos descritos en esta aplicación están
expresamente incluidos en la invención.
Los segmentos variables de anticuerpos
humanizados como se describió anteriormente están unidos por lo
general a las regiones constantes de IgG2 mutadas como se describió
anteriormente. Sin embargo, pueden utilizarse también otras
regiones constantes, incluyendo IgM, IgG, IgD, IgA e IgE, y
cualquier isotipo, incluyendo IgG1, IgG2 natural, IgG3 e IgG4.
Cuando se desea que el anticuerpo humanizado presente actividad
citotóxica, el dominio constante es normalmente un dominio
constante que fija el complemento y la clase es por lo general
IgG_{1}. Cuando dicha actividad citotóxica no es deseable, el
dominio constante puede ser de clase IgG2 o IgG4. El anticuerpo
humanizado puede comprender secuencias de más de una clase o
isotipo. Las secuencias de ADN de la región constante humana pueden
aislarse según procedimientos bien conocidos a partir de una
variedad de células humanas, pero preferentemente linfocitos B
inmortalizados (véase Kabat et al., supra, y el
documento WO 87/02671). Normalmente, el anticuerpo contiene las
regiones constantes tanto de cadena ligera como de cadena pesada.
La región constante de cadena pesada normalmente incluye las
regiones CH1, bisagra, CH2, CH3 y, algunas veces, CH4.
En otro aspecto, la invención comprende
segmentos de ADN que codifican los anticuerpos dados a conocer y las
regiones constantes. Los ácidos nucleicos que codifican regiones
variables de cadena ligera y pesada humanizadas, opcionalmente
unidos a regiones constantes, se insertan en vectores de expresión.
Las cadenas ligera y pesada pueden clonarse en los mismos o
diferentes vectores de expresión. Los segmentos de ADN que codifican
cadenas de inmunoglobulina están operativamente unidos a secuencias
de referencia en el/los vector(es) de expresión que aseguran
la expresión de los polipéptidos de inmunoglobulina. Dichas
secuencias de referencia incluyen una secuencia señal, un
activador, un potenciador y una secuencia de terminación de la
transcripción (véase Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 86, 10029 (1989); documento WO 90/7861; Co et al.,
J. Immunol. 148, 1149 (1992), Antibody Engineering, A
Practical Guide (Borrebaeck, ed., Freeman, NY 1992)).
E. coli es un hospedador procariótico
particularmente útil para clonar y/o expresar secuencias de ADN de
la presente invención. Otros hospedadores microbianos adecuados para
su utilización incluyen bacilli, tal como Bacillus
subtilis, y otras enterobacteriáceas, tales como
Salmonella, Serratia, y varias especies de
Pseudomonas. En estos hospedadores procarióticos, se pueden
preparar también vectores de expresión, que contienen por lo
general las secuencias de control de la expresión compatibles con la
célula hospedadora (por ejemplo un origen de replicación). Además,
cualquier número de una variedad de activadores bien conocidos
puede estar presente, tal como el sistema activador de lactosa, un
sistema activador de triptófano (trp), un sistema activador de
beta-lactamasa, o un sistema activador del fago
lambda. Los activadores por lo general controlan la expresión,
opcionalmente con una secuencia de operador, y presentan secuencias
del punto de unión del ribosoma y similares, para iniciar y
completar la transcripción y traducción.
Otros microbios, tales como levadura, pueden
utilizarse para la expresión. Saccharomyces es un hospedador
preferido, con vectores adecuados que tienen secuencias de control
de la expresión, tal como activadores, incluyendo la
3-fosfoglicerato cinasa o otras enzimas glucolíticas
y un origen de replicación, secuencias de terminación y similares
como se desee.
Pueden utilizarse plantas y cultivos de células
vegetales para la expresión de las inmunoglobulinas humanizadas de
la invención. (Larrick y Fry, Hum. Antibodies Hybridomas
2(4):172-89 (1991); Benvenuto et al.,
Plant Mol. Biol. 17(4):865-74 (1991);
Durin et al., Plant Mol. Biol.
15(2):281-93 (1990); Hiatt et al.,
Nature 342:76-8 (1989)). Los hospedadores
vegetales preferibles incluyen, por ejemplo: Arabidopsis,
Nicotiana tabacum, Nicotiana rustica y Solanum tuberosum.
Un casete de expresión preferido para expresar secuencias de
polinucleótido que codifican los anticuerpos
anti-CD3 humanizados de la invención es el plásmido
pMOG18 en el que la secuencia polinucleotídica insertada que
codifica la cadena de inmunoglobulina humanizada se une
operativamente a un activador CaMV 35S con un potenciador duplicado;
el pMOG18 se utiliza según el procedimiento de Sijmons et
al., Bio/Technology 8:217-221 (1990).
Alternativamente, una forma de realización preferida para la
expresión de inmunoglobulinas humanizadas en las plantas sigue los
procedimientos de Hiatt et al., anteriormente, con la
sustitución de secuencias polinucleotídicas que codifican los
anticuerpos anti-CD3 humanizados de la invención
para las secuencias de inmunoglobulina utilizadas por Hiatt et
al., supra. Los vectores a base de T-ADN
de Agrobacterium tumifaciens pueden utilizarse también para
expresar secuencias humanizadas de inmunoglobulina, preferentemente
dichos vectores incluyen un gen marcador que codifica la
resistencia a la espectinomicina o a otro marcador
seleccionable.
Puede utilizarse también el cultivo de células
de insecto para producir las inmunoglobulinas humanizadas de la
invención, utilizando por lo general un sistema de expresión a base
de baculovirus. Las inmunoglobulinas humanizadas pueden producirse
expresando secuencias polinucleotídicas que codifican las
inmunoglobulinas humanizadas según los procedimientos de Putlitz
et al., Bio/Technology 8: 651-654
(1990). El procedimiento de Putlitz et al. puede seguirse
con la modificación de que las secuencias de polinucleótido que
codifican los anticuerpos anti-CD3 humanizados de
la invención se insertan en lugar de las secuencias de ADNc de
cadena pesada y cadena ligera Ab 6A4 monoclonal de ratón de Putlitz
et al..
Además de los microorganismos y plantas, puede
utilizarse también el cultivo celular de tejido de mamífero para
expresar y producir los polipéptidos de la presente invención (véase
Winnacker, From Genes to Clones (VCH Publishers, NY, 1987)).
Las células de mamífero son actualmente preferidas, porque un número
adecuado de estirpes de células hospedadoras capaces de segregar
inmunoglobulinas intactas se ha desarrollado en la técnica, e
incluyen las estirpes de las células CHO, varias estirpes de las
células COS, las células HeLa, preferentemente las estirpes de la
células de mieloma, etc., o los linfocitos B transformados o
hibridomas. Los vectores de expresión para estas células pueden
incluir secuencias de control de expresión, tal como un origen de
replicación, un activador, un potenciador (Queen et al.,
Immunol. Rev. 89:49-68 (1986)), y los puntos
de información del tratamiento necesario, tales como los puntos de
unión del ribosoma, los puntos de corte y empalme del ARN, los
puntos de poliadenilación y las secuencias del terminador de
transcripción. Las secuencias del control de la expresión
preferidas son activadores derivados de los genes de
inmunoglobulina, SV40, adenovirus, virus del papiloma bovino,
citomegalovirus y similares. Generalmente, un marcador
seleccionable, tal como una casete de expresión neo^{R}, se
incluye en el vector de expresión.
Los anticuerpos de la invención incluyen
fragmentos así como anticuerpos intactos. Por lo general, estos
fragmentos compiten con el anticuerpo intacto del que se derivan
por la fijación del antígeno. Los fragmentos por lo general se unen
con una afinidad de por lo menos 10^{7} M^{-1}, y más
típicamente 10^{8} o 10^{9} M^{-1} (es decir, dentro de los
mismos intervalos que el anticuerpo intacto). Los fragmentos de
anticuerpo humanizado incluyen cadenas pesadas independientes, Fab,
Fab', F(ab')_{2} y Fv y anticuerpos monocatenarios. Los
fragmentos se producen mediante técnicas de recombinación de ADN o
por separación enzimática o química de las inmunoglobulinas
intactas.
Las regiones constantes de IgG2 mutadas de la
invención pueden también unirse a los dominios variables de los
anticuerpos completamente humanos a CD3 por técnicas de expresión
recombinante. Los anticuerpos humanos se producen mediante una
variedad de técnicas descritas a continuación. Se seleccionan
algunos anticuerpos humanos mediante experimentos de unión
competitivos, o si no, por tener la misma, o solape, especificidad
del epítopo como un anticuerpo de ratón específico, tal como M291 u
OKT3.
El método básico y un acompañante de la fusión
celular a título de ejemplo, SPAZ-4, para su
utilización en este método han sido descritos por Oestberg et
al., Hybridoma 2:361-367 (1983);
Oestberg, patente US nº 4.634.664; y Engleman et al.,
patente US nº 4.634.666. Las estirpes celulares que producen
anticuerpos obtenidas por este procedimiento se denominan triomas,
porque descienden de tres células, dos humanas y una de ratón.
Inicialmente, una estirpe de mieloma de ratón se fusiona con un
linfocito-B humano para obtener una célula híbrida
xenogeneica que no produce anticuerpo, tal como la estirpe celular
SPAZ-4 descrita por Oestberg, anteriormente. La
célula xenogeneica se fusiona a continuación con un linfocito B
humano inmunizado dando como resultado una estirpe celular con
trioma que produce el anticuerpo.
Los linfocitos B inmunizados se obtienen a
partir de la sangre, del bazo, de los ganglios linfáticos o de la
médula ósea de un donante humano. La inmunización in vivo de
un ser humano con linfocitos T humanos o CD3 es habitualmente
indeseable debido al riesgo de iniciar una respuesta perjudicial.
Por lo tanto, los linfocitos B se inmunizan normalmente con
linfocitos T in vitro, CD3 purificado o un fragmento
antigénico de los mismos. La forma humana de CD3 se utiliza
preferentemente. Los linfocitos B se exponen por lo general al
antígeno durante un periodo de 7 a 14 días en un medio tal como
RPMI-1640 (véase Engleman, supra) enriquecido
con plasma humano al 10%.
Los linfocitos B inmunizados se fusionan a una
célula híbrida xenogeneica tal como SPAZ-4 por
procedimientos bien conocidos. Por ejemplo, las células se tratan
con polietilenglicol al 40-50% de P.M.
1.000-4.000, a aproximadamente 37ºC, durante
aproximadamente 5 a 10 min. Se separan las células de la mezcla de
fusión y se propagan en un medio selectivo para los híbridos
deseados (por ejemplo HAT o AH). Los clones que segregan anticuerpos
que tienen la especificidad de unión requerida se identifican
analizando el medio de cultivo del trioma la capacidad para unirse
a CD3 o a un fragmento del mismo. Los triomas que producen
anticuerpos humanos que tienen la especificidad deseada se
subclonan por la técnica de dilución limitativa y se cultivan in
vitro en medio de cultivo. En las estirpes celulares de trioma
obtenidas se ensaya a continuación la capacidad para unir CD3 o un
fragmento del mismo.
Aunque los triomas son genéticamente estables no
producen anticuerpos a muy bajos niveles. Los niveles de expresión
pueden aumentarse clonando los genes del anticuerpo procedentes del
trioma en uno o más vectores de expresión, y transformando el
vector en una estirpe celular tal como las estirpes celulares
expuestas anteriormente para la expresión de inmunoglobulinas
recombinantes o humanizadas.
Los anticuerpos humanos contra CD3 pueden
producirse también a partir de mamíferos transgénicos no humanos
que tienen transgenes que codifican por lo menos un segmento del
locus de inmunoglobulina humano. Normalmente, el locus de
inmunoglobulina endógeno de dichos mamíferos transgénicos está
funcionalmente inactivado. Preferentemente el segmento del locus de
inmunoglobulina humana incluye secuencias desordenadas de
componentes de la cadena pesada y ligera. Tanto la inactivación de
los genes de la inmunoglobulina endógena como la introducción de
genes de inmunoglobulina exógena pueden conseguirse por
recombinación homóloga dirigida, o por introducción de cromosomas
YAC. Los mamíferos transgénicos resultantes de este proceso pueden
reordenar funcionalmente las secuencias del componente
inmunoglobulina y expresar un repertorio de anticuerpos de varios
isotipos codificados por genes de inmunoglobulina humana, sin
expresar genes de inmunoglobulina endógena. La producción y
propiedades de los mamíferos que presentan estas propiedades se
describen en detalle por, por ejemplo, Lonberg et al.,
documento WO 93/12227 (1993); Kucherlapati, documento WO 91/10741
(1991). Son particularmente adecuados los ratones transgénicos. Los
anticuerpos anti-CD3 pueden obtenerse inmunizando un
mamífero transgénico no humano, tal como describe Lonberg o
Kucherlapati, anteriormente, con linfocitos T, CD3 o un fragmento
antigénico del mismo. Los anticuerpos monoclonales se preparan, por
ejemplo, fundiendo linfocitos B de dichos mamíferos para las
estirpes celulares de mieloma adecuadas utilizando la tecnología
convencional de Kohler-Milstein.
Un método más para obtener anticuerpos
anti-CD3 humanos consiste en cribar un banco de ADN
de linfocitos B humanos según el protocolo general esbozado por
Huse et al., Science 246:1275-1281
(1989). Se seleccionan los anticuerpos que se unen a CD3 o un
fragmento de los mismos. Las secuencias que codifican dichos
anticuerpos (o fragmentos de unión) se clonan a continuación y se
amplían. El protocolo descrito por Huse resulta más eficaz en
combinación con la tecnología de presentación del fago. Véase, por
ejemplo, Dower et al., documento WO 91/17271 y McCafferty
et al., documento WO 92/01047. En estos procedimientos, se
producen bancos del fago en los que los miembros presentan
diferentes anticuerpos en sus superficies externas. Los anticuerpos
se presentan normalmente como fragmentos Fv o Fab. Los anticuerpos
que presentan el fago con una especificidad deseada se seleccionan
mediante enriquecimiento por afinidad a CD3 o un fragmento del
mismo.
En una variación del procedimiento de
presentación del fago, pueden producirse anticuerpos humanos con
especificidad de unión de un anticuerpo murino seleccionado. Véase
Winter, documento WO 92/20791. En este procedimiento, ya sea la
región variable de la cadena pesada o ligera del anticuerpo murino
seleccionado (por ejemplo M291) se utiliza como material de
partida. Si, por ejemplo, se selecciona una región variable de la
cadena como material de partida, se construye un banco de fago en
el que los miembros presentan la misma región de la cadena ligera
(es decir, el material de partida murino) y una región variable de
la cadena pesada diferente. Las regiones variables de la cadena
pesada se obtienen de un banco de regiones variables de la cadena
pesada humana reconfiguradas. Se selecciona un fago que presenta
unión específica potente para CD3 (por ejemplo por lo menos
10^{8} y preferentemente por lo menos 10^{9} M^{-1}). La
región variable de la cadena pesada humana de este fago actúa a
continuación como material de partida para construir un banco de
fagos adicional. En este banco, cada fago presenta la misma región
variable de la cadena pesada (es decir, la región identificada del
primer banco de presentación) y una región variable de la cadena
ligera diferente. Las regiones variables de la cadena ligera se
obtienen a partir de un banco de regiones de la cadena ligera
variables humana reconfiguradas. De nuevo, se seleccionan los fagos
que presentan unión específica fuerte para CD3. Estos fagos
presentan las regiones variables de anticuerpos
anti-CD3 completamente humanos. Estos anticuerpos
normalmente tienen la misma o similar especificidad para el epítopo
como el material de partida murino (por ejemplo M291).
Las composiciones farmacéuticas que comprenden
anticuerpos de la presente invención son útiles para la
administración parenteral, es decir, por vía subcutánea,
intramuscular y especialmente, intravenosa, a pacientes que padecen
de, en situación de o riesgo de, afecciones que manifiestan
respuestas inmunitarias indeseadas. Dichas afecciones incluyen
enfermedades autoinmunitarias, rechazo del trasplante
(especialmente, después de trasplantes de corazón, pulmón, riñón o
hígado), injerto frente a la enfermedad del hospedador (después de
trasplantes de médula ósea), inflamación, reacciones alérgicas e
infección. Las enfermedades autoinmunitarias a título de ejemplo son
la artritis reumatoide, la esclerosis múltiple, la diabetes de tipo
I, el lupus eritematoso generalizado y la enfermedad inflamatoria
del intestino. Las composiciones farmacéuticas son particularmente
útiles para el tratamiento de ardores agudos o empeoramientos de
éstas u otras enfermedades autoinmunitarias.
Las composiciones para administración parenteral
comprenden normalmente una solución del anticuerpo o una mezcla de
las mismas disuelta en un vehículo aceptable, preferentemente un
vehículo acuoso. Puede utilizarse una variedad de vehículos
acuosos, por ejemplo, agua, agua tamponada, solución salina al 0,4%,
glicina al 0,3% y similares. Estas soluciones son estériles y
generalmente están exentas de materia particulada. Las
composiciones pueden contener sustancias auxiliares
farmacéuticamente aceptables como las requeridas para las
afecciones fisiológicas aproximadas tal como ajuste de pH y agentes
de tamponación, agentes de ajuste de toxicidad y similares, por
ejemplo acetato sódico, cloruro sódico, cloruro potásico, cloruro
cálcico, lactato sódico. La concentración de los anticuerpos en
estas formulaciones puede variar ampliamente, es decir, desde menos
de aproximadamente 0,01%, normalmente por lo menos aproximadamente
0,1% hasta como mucho 5% en peso y se seleccionan principalmente
basándose en los volúmenes de fluido y en las viscosidades según el
modo específico de administración seleccionado.
Puede prepararse una composición típica para
infusión intravenosa que contenga 250 mg de solución de Ringer
esterilizada, y 10 mg a 100 mg de anticuerpo. Véase Remington's
Pharmaceutical Science (15ª ed., Mack Publishing Company, Easton,
Pensilvania, 1980).
Las composiciones que contienen los presentes
anticuerpos pueden administrarse para tratamientos profilácticos
y/o terapéuticos. En la aplicación terapéutica, las composiciones se
administran a un paciente ya afectado en una cantidad suficiente
para curar o al menos detener parcialmente la enfermedad y sus
complicaciones. Una cantidad adecuada para cumplir esto se define
como "dosis terapéuticamente eficaz". Las cantidades eficaces
para esta utilización dependen de la gravedad de la enfermedad y del
estado general del sistema inmunitario del propio paciente, pero
generalmente oscilan entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente
100 mg de anticuerpo por dosis, siendo las dosis entre 0,1 y 50 mg
y entre 1 y 10 mg por paciente las utilizadas más habitualmente.
Las administraciones individuales o múltiples en un programa semanal
o mensual pueden realizarse con concentraciones de dosis y
seleccionándose el modelo por el médico del tratamiento.
En las aplicaciones profilácticas, las
composiciones que contienen los anticuerpos se administran a un
paciente que está en situación de riesgo de desarrollar la
enfermedad para aumentar la resistencia del paciente. Dicha
cantidad se define que es una "dosis profilácticamente eficaz".
En esta utilización, las cantidades exactas dependen de nuevo del
estado de salud del paciente y del nivel general de inmunidad, pero
generalmente oscilan entre 0,1 y 100 mg por dosis, especialmente
entre 1 y 10 mg por paciente.
El anticuerpo M291 (tanto las formas de ratón
como humanizadas) es también útil en los procedimientos de
diagnóstico en el control inmunológico de pacientes infectados con
organismos patógenos (por ejemplo en la determinación del recuento
de linfocitos T de pacientes con SIDA) o en los pacientes que
presentan trastornos del sistema inmunitario. Los procedimientos de
diagnóstico pueden realizarse in vitro utilizando una muestra
celular (por ejemplo muestra de sangre, biopsia del ganglio
linfático o tejido) de un paciente o pueden realizarse por
diagnóstico por la imagen in vivo. El anticuerpo M291 puede
utilizarse también para investigar con el fin de clasificar
subtipos de leucocitos, por ejemplo, como parte de un panel de
anticuerpo. En este contexto, se utiliza preferentemente M291 en un
ELISA, RIA u otro formato de análisis conocido en la técnica.
Los ADNc del dominio V de las cadenas H y L de
OKT3 se clonaron por un procedimiento de PCR (reacción en cadena de
polimerasa) anclada descrito por Co et al., J.
Immunol. 148, 1149 (1992) a partir de células de hibridoma que
expresan OKT3 (ATCC CRL 8001). Se realizó la ampliación en ADNc
utilizando cebadores 3' que se hibridan respectivamente con la
región C de la cadena gamma y la cadena kappa de ratón, y un cebador
5' que se hibrida con la cola G añadida del ADNc. Los ADNc de VH y
VL se subclonaron en un vector pUC19 para la determinación de las
secuencias. Sus secuencias eran idénticas a las publicadas por
Woodle et al. (véase Woodle et al., J.
Immunol. 148, 2756 (1992)).
Los ADNc de V_{H} y V_{L} de OKT3 se
presentan en exones que incluyen secuencia señal, segmentos J y
secuencias donantes de corte y empalme; y estaban rodeados por
secuencias XbaI (véase Co et al., J. Immunol. 148,
1149 (1992)). La secuencia V_{L} se insertó en la secuencia XbaI
de un vector de expresión pVk.rg, y la secuencia V_{H} se insertó
de manera similar en varios vectores de expresión de la cadena
pesada, un ejemplo de los cuales es pVg2.D.Tt. El vector pVk.rg es
similar a pVk (Co et al., ibid.) con la excepción de
que la orientación de la unidad gpt se ha invertido. El vector
pVg2.D.T.t es similar al pVg1 (Co et al., ibid.) pero
contiene un fragmento genómico que incluye la región constante
\gamma2 (Ellison y Hood, Op. cit.) en lugar de \gamma1,
y contiene el terminador de transcripción (Tt) del gen C2 del
complemento humano (+37 a +162 bp de la secuencia poli A de C2;
véase Ashfield et al., EMBO J. 10, 4197 (1991)).
Varios vectores de la cadena pesada humana se diferencian solamente
en las secuencias de codificación de Fc. Para la expresión conjunta
de las cadenas pesada y ligera en un plásmido, un fragmento EcoRI
que contiene el activador del CMVh, el gen con cadena pesada
completo, la señal poliA y la señal de terminación de la
transcripción se extrajeron del vector de expresión de la cadena
pesada; y se clonaron en la secuencia EcoRI única del plásmido con
expresión de la cadena ligera (Figura 2). Cada plásmido resultante
tiene tanto la cadena pesada como la ligera codificada en un
vector. Debido a la presencia de la señal de terminación de la
transcripción (Tt) situada entre ellos, los dos genes son
transcritos independientemente por activadores de CMVh (véase
Boshart et al., Cell 41, 521, (1985)). En un caso,
solamente los exones C_{H}1 y la bisagra del gen con cadena
constante \gamma1 humano se incluyeron y el exón con bisagra se
fusionó con el ADN que codifica la cremallera Fos de la leucina
para preparar un F(ab')_{2} Fos híbrido (véase Tso et
al., J. Hematother. 4, 389 (1995)). Para la expresión de
un anticuerpo específico, el plásmido correspondiente se transfectó
en la estirpe celular TS0 del mieloma de ratón por electroporación.
Las células TS0 proceden de las células NS0 del mieloma de ratón
(ECACC 85110503) seleccionando la capacidad de cultivarse en medio
exento de suero según el procedimiento de Sato et al. (véase
Sato et al., J. Exp. Med. 165, 1761 (1987)). Las
células de cada transfección se seleccionaron para la expresión de
gpt. Se cultivaron transfectantes en medio exento de suero y
se purificaron los anticuerpos de cultivos gastados por
cromatografía de afinidad a la proteína G.
Se utilizó un procedimiento de PCR para
introducir mutaciones en las regiones C_{H}2 de los exones
\gamma2 y \gamma4. Para cada mutagénesis, se sintetizaron los
dos cebadores complementarios que contienen la secuencia mutada. Se
utilizó uno de éstos con un cebador corriente arriba para sintetizar
por reacción de PCR la fracción 5', y el otro con un cebador
corriente abajo para sintetizar la fracción 3' del fragmento
deseado. Se utilizaron secuencias Fc naturales como plantillas. Los
dos productos de PCR se mezclaron a continuación, se hibridaron y
se ampliaron de nuevo utilizando los cebadores corriente arriba y
corriente abajo. Para la mutagénesis de \gamma2, el cebador
corriente arriba utilizado fue 5' GGACACCTTCTCTCCTCCC (SEC. ID. nº:
10) y el cebador corriente abajo fue 5' CCCAAGCTTGGGTGGGCC
GAGCCGGCCTCTGTCC (SEC. ID. nº: 11). Los cebadores flanquean respectivamente el exón con bisagra y el exón C_{H}2. Los dos cebadores complementarios para el mutante 1 fueron 5' GCACCACCTGCGGCAGGACCGTCA y (SEC. ID. nº: 12) 5' TGACGGTCCTGCCGCAGGTGGTGC SEC. ID. nº: 13). Los cebadores complementarios para todos los demás mutantes de IgG2 fueron similares excepto para los codones mutados. El producto de la reacción de ampliación se cortó con PstI y SfiI, dos secuencias de restricción que flanquean los exones con bisagra y el C_{H}2 y el fragmento resultante de 525 bp se introdujo en el vector de expresión IgG2 entre las secuencias PstI y SfiI. Asimismo, se generó un fragmento PstI-PmlI de 241 bp mutagenizado para el exón C_{H}2 de \gamma4 y se introdujo en el vector de expresión IgG4. Se realizó el análisis de la secuencia para cada vector de expresión para asegurar solamente que se introducían las mutaciones deseadas.
GAGCCGGCCTCTGTCC (SEC. ID. nº: 11). Los cebadores flanquean respectivamente el exón con bisagra y el exón C_{H}2. Los dos cebadores complementarios para el mutante 1 fueron 5' GCACCACCTGCGGCAGGACCGTCA y (SEC. ID. nº: 12) 5' TGACGGTCCTGCCGCAGGTGGTGC SEC. ID. nº: 13). Los cebadores complementarios para todos los demás mutantes de IgG2 fueron similares excepto para los codones mutados. El producto de la reacción de ampliación se cortó con PstI y SfiI, dos secuencias de restricción que flanquean los exones con bisagra y el C_{H}2 y el fragmento resultante de 525 bp se introdujo en el vector de expresión IgG2 entre las secuencias PstI y SfiI. Asimismo, se generó un fragmento PstI-PmlI de 241 bp mutagenizado para el exón C_{H}2 de \gamma4 y se introdujo en el vector de expresión IgG4. Se realizó el análisis de la secuencia para cada vector de expresión para asegurar solamente que se introducían las mutaciones deseadas.
Se colocaron en placas células mononucleares de
la sangre periférica (PBMC) en RPMI más FCS al 10% en
2\times10^{5} células por pocillo en placas de microvaloración
de 96 pocillos. Se añadieron anticuerpos a varias
concentraciones y se incubaron las células a 37ºC durante 3 días. Se
añadió [^{3}H]-timidina a razón de 1 \muCi por
pocillo, y se incubaron las placas durante 12 h. más antes de la
recogida. Se recogieron las células en un recogedor de células y se
midió la incorporación de [^{3}H]-timidina en un
contador de centelleo líquido. Todos los datos se expusieron como
media de las determinaciones por triplicado.
Se obtuvieron linfocitos T humanos activados
incubando PBMC con fitohemaglutinina (PHA) durante tres días en
medio RPMI enriquecido con FCS al 10% a 37ºC seguido de atenuación
en medio que contiene IL-2 durante 5 días. Las
células K562, que expresan FcRII, se marcaron con ^{51}Cr
añadiendo 100 \muCi de ^{51}Cr para 5 \times 10^{6} células
diana en 1 ml de medio RPMI. Tras 1 hora de incubación a 37ºC, se
lavaron las células dos veces. Los linfocitos T (50 ml) y las
células diana K562 marcadas (7 \times 10^{4} en 50 ml) en una
relación efector:diana de 25:1 se colocaron en placas de
microvaloración con fondo en U. El anticuerpo
anti-CD3 híbrido a una concentración deseada se
añadió a continuación. Todas las muestras se colocaron en placas
por triplicado. Se centrifugaron las placas, se incubaron durante 4
h a 37ºC y se centrifugaron de nuevo. Se midió la lisis celular
determinando la cantidad de ^{51}Cr liberado en 100 \mul de
sobrenadante exento de células de cada muestra. Se hizo el recuento
en un contador gamma modelo 5500 de Beckman. El porcentaje de lisis
específica se determinó mediante la ecuación siguiente: (E - S/M -
S) \times 100, en la que E es la media de los recuentos de
muestras por triplicado por minuto para la muestra, S es la
liberación espontánea en la muestra con células diana solamente y M
es la liberación máxima para las muestras con células diana y 100
\mul de SDS al 1%.
Se volvieron a poner en suspensión linfocitos T
humanos en medio RPMI completo a razón de 2,5 \times 10^{6}
células/ml. Las diluciones de los anticuerpos de la prueba (OKT3
híbrido) o del anticuerpo de referencia (OKT3 murino) se añadieron
y se incubaron a 4ºC durante 1 h. Se añadió una cantidad fija, por
debajo de la saturación de OKT3 murino conjugado con FITC y se
incubaron las células a 4ºC durante 1 h., se lavaron y se volvieron
a poner en suspensión en paraformaldehído al 1%. Se analizaron a
continuación las células utilizando citometría de flujo. Cada
intensidad de fluorescencia de la muestra se comparó con la de
referencia sin ningún anticuerpo competitivo. Se expresan los
valores en tanto por ciento de intensidad de la fluorescencia de
referencia.
Se colocaron en placas las PBMC y los
anticuerpos como en el ensayo de proliferación de linfocitos T. Las
muestras se tomaron a las 24 h. para la determinación de
TNF-\alpha e IL-2, y a las 72 h.
para determinaciones de IFN-\gamma. Se utilizaron
kits analíticos comerciales para determinar las concentraciones de
TNF-\alpha e IFN-\gamma en el
medio. Las concentraciones de IL-2 se determinaron
mediante un ensayo de proliferación utilizando una estirpe celular
HT-2 dependiente de IL-2. Se midió
el porcentaje de linfocitos T que expresa el
receptor-\alpha de IL-2 del
marcador de activación (CD25) a las 90 h. utilizando un análisis
FACS de dos colores. Se utilizó un anticuerpo humanizado,
anti-Tac conjugado con FITC para marcar el marcador
de activación CD25 en la superficie del linfocito T y un anticuerpo
de ratón CD7 antihumano en conjugación con IgG
anti-ratón de cabra conjugada con PE para marcar
los linfocitos T totales. La relación de los números de los dos
números de célula se expresa como porcentaje de linfocitos T que
son positivos a CD25.
En la figura 3 se muestran las secuencias de
todos los isotipos de IgG naturales en la región CH2. IgG1 e IgG3
tienen idéntica secuencia,
Leu-Leu-Gly-Gly, en
esta zona; e IgG4 se diferencia solamente en que tiene el resto Phe
en la posición 234. IgG2, sin embargo, tiene una secuencia muy
diferente en esta zona. Además de carecer de un aminoácido en la
posición 236, se diferencia de las secuencias IgG1, IgG3 e IgG4 en
dos de las tres posiciones restantes (234 y 235). La única
secuencia, Val Ala_Gly, de IgG2 puede tenerse en cuenta para su
especificidad por FcRII solamente.
Se introdujeron mutaciones, bien una a la vez, o
en combinaciones, para abarcar todos los restos en esta zona. En la
figura 3 se presentan las secuencias en las posiciones
234-237 de cinco variantes Fc de IgG2 generadas.
Los primeros tres mutantes fueron mutaciones de exploración de Ala.
No se realizó ningún cambio en la posición 235 porque está ya en el
resto Ala. En los mutantes 4 y 5, la posición 235 estaba también
cambiada por un resto de Glu. El anti-CD3 del
isotipo IgG2b de ratón, que no es mitógeno, tiene un resto Glu en
esta posición. Por comparación, se preparó un mutante que contiene
dos sustituciones de Ala en las posiciones 234 y 235 de IgG4 (véase
Alegre et al., Transplantation, 57, 1537 (1994)). La
secuencia completa de la región constante de la cadena pesada del
mutante 3' de IgG2 se presenta en la figura 4.
Se incorporaron las cinco regiones constantes
del mutante IgG2 en los anticuerpos OKT3 híbridos por combinación
con la región variable OKT3, como está en la variante IgG4 en dos
sustituciones de Ala en las posiciones 234 y 235, y todos los
isotipos IgG humanos naturales. Además un F(ab')_{2} de
OKT3 híbrido procedente de IgG1 se realizó por la técnica de la
cremallera de leucina (véase Kostelny et al., J.
Immunol., 148, 1547 (1992)). El F(ab')_{2}
recombinante está exento de Fc completamente. Todos estos
anticuerpos híbridos OKT3 y los fragmentos se identificaron para la
proliferación de linfocitos T en un ensayo mitógeno utilizando PBMC
humana procedente de ocho donantes. Se utilizaron donantes múltiples
debido a que sus PBMC pueden responder a un
anti-CD3 de manera diferente debido al polimorfismo
de los receptores de Fc. Una variante útil de
anti-CD3 debería preferentemente ser no mitógena
para los linfocitos T de la mayoría o de todos los donantes. Se
utilizaron también concentraciones diferentes de los anticuerpos
para asegurar la activación de linfocitos T no se produce en el
intervalo de dosis clínicamente aplicable.
Los resultados del análisis de proliferación de
linfocitos T se presentan en la figura 5. Los anticuerpos
anti-CD3 del isotipo IgG1 e IgG4 eran mitógenos en
la mayoría de los donantes analizados, y existían variaciones en
las respuestas de los donantes a anti-CD3 de los
isotipos IgG2 e IgG3. Los cinco mutantes de IgG2 presentaban
actividades mitógenas atenuadas en los PBMC mientras que el IgG2
natural dio proliferación significativa. Los mutantes 2 a 5
produjeron la mínima proliferación. Para la mayoría de las muestras
del donante, las actividades mitógenas de los mutantes 2 a 5 fueron
tan bajas como las del F(ab')_{2} sin Fc y menos mitógenas
que el mutante IgG4. Únicamente en un donante (D), a grandes
concentraciones de anticuerpo (1 \mug/ml), se observó
proliferación notable para estos mutantes, pero ésta no estaba
asociada a la liberación de citocina o a la producción del marcador
CD25 de activación de linfocitos T. Los mutantes 2 a 5 de este modo
tienen los atributos de un anticuerpo no activador. En particular,
producen mucha menos proliferación que el mutante IgG4, que era
comparable a IgG1 e IgG4 no mutado a concentración alta (1
\mug/ml).
Las células que llevan el receptor Fc y los
linfocitos T pueden tender un puente mediante el anticuerpo
anti-CD3 si tiene un Fc operativo. Dicho puente
puede activar linfocitos T para lisar las células que llevan el
receptor Fc (lisis inversa), proporcionando un ensayo sensible para
sondar la interacción del mutante IgG2 anti-CD3 y
los receptores de Fc. El mutante 3 se seleccionó como representativo
de los mutantes de IgG2 en este ensayo. Ya que IgG2 interactúa
principalmente con las células FcRII, K562, que expresan FcRII en su
superficie, se utilizaron como células diana para la lisis inversa
mediada por el mutante 3 de IgG2. Los datos se presentan en la
figura 6. El mutante 3 de IgG2 anti-CD3 era tan
inerte como la forma F(ab')_{2} del anticuerpo en mediar
la lisis inversa, mientras que el IgG2 natural podría mediar hasta
el 32% de la lisis específica de las células K562. Aunque la
actividad del isotipo IgG1 era baja debido a su baja afinidad por
FcRII, pudo mediar todavía la lisis equivalente al nivel de IgG2 a
concentraciones altas de anticuerpo. En un experimento por
separado, la IgG2 anti-CD3 y el mutante 3 eran ambos
ineficaces en la mediación de la lisis inversa dependiente de FcRI.
Las mutaciones introducidas en el Fc del mutante 3 de IgG2, no
invirtieron la escasa afinidad de IgG2 por FcRI. Estos experimentos
confirmaron que el mutante 3 tiene muy poca afinidad por FcRI y
FcRII.
La avidez relativa de OKT3 murino,
F(ab')_{2} de OKT3 híbrido, IgG1, IgG2 y el mutante 3 de
IgG2 por los linfocitos T se evaluó utilizando el ensayo
competitivo descrito anteriormente para eliminar la posibilidad de
que la falta de activación del linfocito T o la lisis inversa
mediada por FcRII por el mutante 3 de IgG2 de OKT3 es debida a su
falta de unión a los linfocitos T. El IgG1 de OKT3 híbrido bloqueó
la unión de OKT3 murino marcado con FITC así como el OKT3 no
marcado (Fig. 7). Este anticuerpo, por lo tanto, debe tener una
avidez muy similar a la del OKT3 murino. IgG2 de OKT3 híbrido y el
mutante 3 de IgG2, eran ligeramente menos eficaces en el bloqueo de
la unión de OKT3 murino marcado con FITC que el OKT3 no marcado. Su
avidez se estimó que estaba comprendida dentro de 2 a 3 veces en
comparación con la del IgG1 híbrido. Este experimento, por
consiguiente, demostró que la actividad de fijación del antígeno de
IgG2 y su mutante se conservaba sustancialmente. Dado que el IgG2
natural con avidez similar era capaz de activar los linfocitos T en
los PBMC de donantes apropiados, dicha ligera reducción en la
avidez no es suficiente para tener en cuenta la falta de actividad
en el mutante 3.
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación se determinó la capacidad de los
mutantes de IgG2 para provocar la liberación de citocina y para
regular por incremento los receptores de IL-2 en
linfocitos T. Los PBMC de seis de los ocho donantes probados
anteriormente se colocaron con diferentes concentraciones de
F(ab')_{2} de OKT3 híbrido y OKT3 híbrido de los isotipos
IgG1, IgG2 y el mutante 3 de IgG2; y se determinó en los
sobrenadantes los marcadores de activación
TNF-\alpha e IL-2 a las 24 h.; e
IFN-\gamma a las 72 h. Además, se ensayó en los
linfocitos T el receptor-\alpha del marcador de
activación IL-2 (CD25) a las 90 h. Los resultados se
presentan en las Figs. 8 y 9. Como era de esperar, IgG1 fue el más
activo en la liberación de las tres citocinas y en la inducción de
la expresión de CD25. Existía también inducción mensurable de CD25 y
liberación de citocina con IgG2 en los seis donantes. El mutante 3
de IgG2, por otra parte, fue el menor activador entre los tres
anticuerpos probados. En todos los casos estos marcadores de
activación fueron poco detectables por encima del fondo. Incluso en
el donante D en el que se observó previamente alguna proliferación a
alta concentración (1 \mug/ml) del mutante 3 de IgG2 (Fig. 5), la
expresión de estos marcadores de activación fue insignificante.
Basándose en estos ensayos, el mutante 3 de IgG2
anti-CD3 parecía que presentaba efectos mínimos en
la activación de linfocitos T y sería el más seguro entre todos los
anticuerpos probados en estos experimentos.
\vskip1.000000\baselineskip
Los ADNc de la región variable de la cadena
pesada y ligera de M291 de ratón se clonaron en el ARNm aislado de
células de hibridoma que utilizan PCR anclada (Co et al.,
J. Immunol. 148: 1149 (1992)). Los cebadores 5' utilizados
se hibridaron a las colas de poli-dG añadidas al
ADNc, y los cebadores 3' a las regiones constantes. Los fragmentos
de ADN ampliados se insertaron a continuación en pUC19, y varios
clones de cadena pesada y ligera se secuenciaron y se descubrió
respectivamente que eran los mismos. Estas secuencias de ADNc de la
región variable y las secuencias de aminoácidos procedentes de ellos
se presentan en las Figuras 1A y B.
\vskip1.000000\baselineskip
Para conservar la afinidad de unión del
anticuerpo de ratón en el anticuerpo humanizado, se siguieron los
procedimientos generales de Queen et al. (Queen et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 10029 (1989) y el
documento WO 90/07861). La selección de los restos del armazón puede
ser crítica para mantener la afinidad de unión. En principio, una
secuencia armazón de cualquier anticuerpo humano puede servir como
plantilla para el injerto de CDR; sin embargo, se ha demostrado que
la sustitución directa de CDR en dicho armazón puede conducir a la
pérdida significativa de afinidad de unión al antígeno (Glaser et
al., J. Immunol. 149: 2606 (1992); Tempest et
al., Biotechnology 9: 266 (1992); Shalaby et al.,
J. Exp. Med. 17: 217 (1992)). El más homólogo a un
anticuerpo humano es el anticuerpo murino original, el menos
apropiado al armazón humano introduce distorsiones en los CDR de
ratón que podrían reducir la afinidad. Basándose en la búsqueda de
homología de secuencia contra una base de datos de la secuencia del
anticuerpo, el anticuerpo humano HF2-1/17
proporciona buena homología del armazón a la región variable de la
cadena ligera M291 de ratón y el anticuerpo 21/28 humano
proporciona buena homología del armazón a la región variable de la
cadena pesada M291 de ratón, aunque otros anticuerpos humanos muy
homólogos serían adecuados también, especialmente las cadenas
ligeras kappa del subgrupo I humano o las cadenas pesadas del
subgrupo I humano (definidas por Kabat et al., op.
cit.).
El programa informático ENCAD (Levitt et
al., J. Mol. Biol. 168: 595 (1983)) se utilizó para
construir un modelo molecular del dominio variable M291, que se
utilizó para colocar los aminoácidos en el armazón de M291 que eran
bastante próximos a las CDR para interactuar potencialmente con
ellos. Para diseñar las regiones variables de la cadena ligera y
pesada de M291 humanizada, los CDR del anticuerpo M291 de ratón se
injertaron respectivamente en las regiones armazón de las cadenas
ligera y pesada del anticuerpo HF2-1/17 y 21/28
humano. En las posiciones del armazón en las que el modelo
informático sugería contacto significativo con las CDR, los
aminoácidos del anticuerpo de ratón se sustituyeron por los
aminoácidos del armazón humano original. Para M291 humanizada, esto
se realizó en los restos 30, 67, 68, 70, 72 y 74 de la cadena pesada
y en ningún resto de la cadena ligera. También, los restos del
armazón que se produjo únicamente en raras ocasiones en sus
posiciones en la base de datos de los anticuerpos humanos se
sustituyeron por un aminoácido de consenso humano en aquellas
posiciones. Para el M291 humanizado esto se realizó en el resto 44
de la cadena pesada.
La secuencia final de las regiones variables de
la cadena ligera y pesada del anticuerpo M291 humanizado
(HuM291), se presenta en las Figuras 1C y D. Sin embargo, muchos de los restos potenciales del contacto de CDR son adecuados para sustituciones de otros aminoácidos que pueden todavía permitir al anticuerpo conservar afinidad sustancial al antígeno. La tabla siguiente presenta un número de posiciones en el armazón en las que los aminoácidos alternativos pueden ser adecuados (LC=cadena ligera, HC = cadena pesada):
(HuM291), se presenta en las Figuras 1C y D. Sin embargo, muchos de los restos potenciales del contacto de CDR son adecuados para sustituciones de otros aminoácidos que pueden todavía permitir al anticuerpo conservar afinidad sustancial al antígeno. La tabla siguiente presenta un número de posiciones en el armazón en las que los aminoácidos alternativos pueden ser adecuados (LC=cadena ligera, HC = cadena pesada):
Asimismo, muchos de los restos del armazón que
no están en contacto con las CDR en el dominio M291 humanizado
pueden alojar sustituciones de aminoácidos en las posiciones
correspondientes de los anticuerpos HF2-1/17 y
21/28 humanos, de otros anticuerpos humanos, del anticuerpo M291 de
ratón, o de otros anticuerpos de ratón, sin pérdida significativa
de la afinidad o sin inmunogenicidad del anticuerpo humanizado. La
tabla siguiente presenta un número de posiciones adicionales en el
armazón en las que los aminoácidos alternativos pueden ser
adecuados:
La selección de combinaciones de aminoácidos
alternativos puede utilizarse para producir versiones de M291
humanizada que tiene concentraciones variables de afinidad,
especificidad, falta de inmunogenicidad, facilidad de preparación y
otras propiedades deseables. De este modo, los ejemplos en las
tablas anteriores se proporcionan a título ilustrativo no
limitativo.
Una vez se han diseñado las secuencias de
aminoácido con región variable humanizada como se describió
anteriormente, se construyeron segmentos de ADN para codificarlos,
incluyendo péptidos señal, señales del donante de corte y empalme y
secuencias de restricción apropiadas. Cada segmento de codificación
de la región variable se construyó y amplió utilizando diez
oligonucleótidos sintéticos solapantes en cuatro etapas: (1) los
cuatro pares centrales de los oligonucleótidos solapantes se
desnaturalizaron, se dejaron hibridar y se prolongaron con el
fragmento de Klenow de la ADN polimerasa para producir cuatro
oligonucleótidos solapantes más largos a partir de los ocho más
cortos; (2) estos cuatro oligonucleótidos se desnaturalizaron y
después se combinaron igualmente para formar dos fragmentos
solapantes de ADN; (3) el par resultante de los oligonucleótidos se
unió asimismo para formar la parte central del segmento de
codificación; y (4) los dos oligonucleótidos flanqueantes finales,
que contenían cada uno una secuencia de restricción XbaI, se
utilizaron en la PCR para completar y ampliar los segmentos de
codificación.
Los segmentos de codificación de la región
variable humanizados se insertaron en los vectores de expresión
humana que contenían el segmento de codificación C_{\kappa} humano
o el mutante 3 de C\gamma_{2} humano que codifica el segmento o
el segmento de codificación de C\gamma_{1}, es decir
respectivamente pVk.rg y pVg2.D.Tt como se describió anteriormente,
o el vector análogo pVg1.D.Tt. Los segmentos que codifican la
cadena ligera y cada cadena pesada se colocaron a continuación
respectivamente en un vector de expresión como se describe (véase
la figura 2). Los dos plásmidos de expresión se linealizaron con
FspI en preparación para la transfección. Aproximadamente 20 \mug
de cada plásmido se transfectó por separado en 1 \times 10^{7}
TS0 células utilizando el aparato Gene Pulser
(Bio-Rad) con dos pulsaciones a 1.500 V y 3 \muF
según las instrucciones del fabricante. Se colocaron en placas las
células en una placa de cultivo tisular de 96 pocillos, y después
de dos días, se aplicó el medio de selección (DMEM, FCS al 10%, 1
\times penicilina-estreptomicina (P/S) (Gibco), 1
\times suplemento HT (Sigma), 0,25 mg/ml de xantina y 1 \mug/ml
de ácido micofenólico).
Después de aproximadamente dos semanas, en los
clones que aparecían se identificó la producción de anticuerpos por
ELISA. Los anticuerpos de un clon de IgG1 de alta producción y de un
clon del mutante 3 de IgG2 se prepararon cultivando las células a
confluencia en medio exento de suero y cultivándolas hasta que las
células murieron. El sobrenadante del cultivo se introdujo en una
columna con proteína G-Sepharose (Pharmacia); se
eluyó el anticuerpo con glicina-HCl 0,1 M, NaCl 100
mM, pH 2,5 y se dializó posteriormente frente a solución salina
tamponada con fosfato (PBS). Se verificó la pureza del anticuerpo
introduciéndolo en un gel de acrilamida y se determinó su
concentración mediante una lectura de D.O._{280}, suponiendo que
1,3 mg de proteína del anticuerpo tiene una lectura de D.O._{280}
de 1.0.
Para evaluar la capacidad de los anticuerpos
humanizados de M291 para competir con el anticuerpo M291 de ratón
por la fijación a CD3, y de este modo medir su afinidad de unión, se
mezclaron respectivamente concentraciones crecientes de los
anticuerpos con 12,5 ng de anticuerpo murino marcado con trazador
^{125}I y se incubaron con linfocitos T humanos activados por 4
\times 10^{5} IL-2 en 0,2 ml de tampón de unión
(PBS con suero de ternero fetal al 2%, azida sódica al 0,1%)
durante 90 min. en hielo. Se lavaron las células y se centrifugaron,
y se midieron sus radioactividades. Se calculó la relación de
anticuerpo ligado y libre. Se calcularon las afinidades de unión
según los procedimientos de Berzofsky y Berkower (J.A. Berzofsky e
I.J. Berkower, en Fundamental Immunology, W.E. Paul, ed.,
Raven Press, New York, 1984). El anticuerpo M291 de ratón y el M291
de IgG1 compitió con eficacias iguales (Figura 10) y presentaba las
afinidades muy altas calculadas de K_{a}=1,6 \times 10^{9}
M^{-1}, de modo que el procedimiento de humanización no alteró de
manera significativa la afinidad de unión del anticuerpo original.
El anticuerpo mutante 3 de IgG2 humanizado (IgG2M3) compitió algo
peor, debido quizás a la mayor rigidez de la región bisagra de IgG2,
pero todavía tenía la gran afinidad de K_{a} = 5 \times
10^{8} m^{-1}.
La capacidad del anticuerpo M291 de IgG2M3
humanizado para provocar la proliferación de linfocitos T y la
liberación de linfocina utilizando las PBMC de varios donantes se
evaluó en experimentos análogos a los descritos anteriormente para
los mutantes híbridos de IgG2 de OKT3. Como estos mutantes, el
anticuerpo M291 de IgG2M3 humanizado produjo menos proliferación y
ninguna o reducida liberación de las citocinas
IFN-\gamma y TNF-\alpha e
IL-2 de la mayoría de todos los donantes (Figura
11).
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Tso, J. Yun
\hskip3.9cmCole, Michael S.
\hskip3.9cmAnasetti, Claudio
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Dominios de IgG2 no activadores mutados y anticuerpos anti-CD3 que incorporan los mismos
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 13
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DIRECCIÓN/DESTINATARIO: Townsend and Townsend and Crew LLP
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Two Embarcadero Center, Eighth Floor
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: San Francisco
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: California
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: USA
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CP: 94111-3834
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- MEDIO LEGIBLE POR ORDENADOR
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE SOPORTE: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC compatible IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FECHA DE SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/656.586
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 31-mayo-1996
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- DATOS DE ABOGADO/AGENTE DE INFORMACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Liebeschuetz, Joseph O.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 37.505
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- REFERENCIA/NÚMERO DE DOCUMENTO/ETIQUETA: 11823-007210US
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE CONTACTO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (415) 576-0200
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FAX: (415) 576-0300
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 384 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..384
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRAS INFORMACIONES: /: nota= "ADNc para región variable de cadena ligera de ancticuerpo M291 de ratón"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 128 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 417 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..417
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRAS INFORMACIONES: /nota= "ADNc para región variable de cadena pesada de ancticuerpo M291 de ratón"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 139 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 378 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..378
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRAS INFORMACIONES: /nota= "ADNc para región variable de cadena ligera de anticuerpo M291 de ratón humanizada"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 126 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 417 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..417
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRAS INFORMACIONES: /nota= "ADNc para la región variable de cadena ligera de anticuerpo M291 de ratón humanizada"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 7
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 139 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 8
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 326 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Proteína
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..326
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRAS INFORMACIONES: /nota= "región constante de cadena pesada del mutante3 de IgG2"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 9
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 34 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 13
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (12)
1. Región constante de IgG2 humana mutada que
comprende un segmento no natural de aminoácidos entre los restos
234 y 237 definidos por el sistema de numeración de la EU, en la que
las posiciones 234, 235 y 237 del segmento natural correspondiente
están ocupadas por val ala y gly respectivamente, en la que un
anticuerpo que comprende la región variable de un anticuerpo
anti-CD3 está unido a la región constante de IgG2
humana mutada, el anticuerpo provoca una respuesta mitógena
reducida en los linfocitos T humanos con respecto a un segundo
anticuerpo que comprende la región variable del anticuerpo
anti-CD3 unido a una región constante de IgG2
natural.
2. Región constante de IgG2 humana mutada, en la
que los restos 234, 235 y 237, definidos por el sistema de
numeración de la EU, forman un segmento de aminoácidos
seleccionados de entre el grupo constituido por:
ala ala gly,
val ala ala,
ala ala ala,
val glu ala, y
ala glu ala.
3. Región constante de IgG2 mutada según la
reivindicación 1 ó 2, en la que el segmento está contenido dentro
de una región constante de IgG2 humana de otra manera natural.
4. Región constante de IgG2 mutada según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende por lo menos
las regiones CH1, bisagra, CH2 y CH3.
5. Región constante de IgG2 mutada que comprende
la secuencia SEC. ID. nº: 9.
6. Anticuerpo, que se une específicamente a CD3
humano que comprende una región constante de IgG2 mutada según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
7. Anticuerpo según la reivindicación 6, en el
que
la cadena ligera humanizada comprende la
secuencia de aminoácidos madura SEC. ID. nº:6, y
el dominio variable de cadena pesada humanizada
comprende la secuencia de aminoácidos madura SEC. ID. nº:8
fusionada a la región constante de IgG2.
8. Anticuerpo según la reivindicación 7, en el
que los restos 234, 235 y 237 de la región constante IgG2 mutada
forman el segmento ala ala ala.
9. Anticuerpo humanizado según la reivindicación
6, que comprende una cadena pesada humanizada y una cadena ligera
humanizada:
- (1)
- comprendiendo la cadena ligera humanizada tres regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que presentan secuencias de aminoácidos de las regiones determinantes de complementariedad correspondientes de la cadena ligera de inmunoglobulina M291 de ratón, y un armazón de la región variable de una secuencia de armazón de la región variable de cadena ligera kappa humana, y
- (2)
- comprendiendo la cadena pesada humanizada tres regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que presentan secuencias de aminoácidos de las regiones determinantes de complementariedad correspondientes de la cadena pesada de inmunoglobulina M291 de ratón, y un armazón de la región variable de una secuencia de armazón de la región variable de cadena pesada humana excepto en por lo menos una posición seleccionada de entre un grupo constituido por H30, H67, H68, H70, H72 y H74 en el que la posición del aminoácido está ocupada por el mismo aminoácido presente en la posición equivalente del armazón de la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina M291 de ratón;
en el que la inmunoglobulina se une
específicamente a un antígeno CD3 en la superficie de los linfocitos
T con una afinidad de unión que presenta un límite inferior de
aproximadamente 10^{7} M^{-1} y un límite superior de
aproximadamente cinco veces la afinidad de unión de la
inmunoglobulina M291;
en el que M291 es un anticuerpo de ratón
caracterizado porque presenta una región variable de cadena
ligera madura de la SEC. ID. nº: 2 y una región variable de cadena
pesada madura de la SEC. ID. nº:4.
10. Anticuerpo humanizado según la
reivindicación 9, en el que
el armazón de la región variable de cadena
ligera humanizada procede del armazón de la región variable de
cadena ligera del anticuerpo HF2-1/17 en el subgrupo
I;
el armazón de la región de cadena pesada
humanizada procede del armazón variable de la región de cadena
pesada del anticuerpo 21/28 excepto en por lo menos una posición
seleccionada de entre dicho grupo, y excepto en la posición H44, en
el que la posición del aminoácido está ocupada por el mismo
aminoácido presente en la posición equivalente de una secuencia de
consenso del subgrupo 1 de la inmunoglobulina humana.
11. Anticuerpo según la reivindicación 6, en el
que el anticuerpo es un anticuerpo humanizado.
12. Anticuerpo según la reivindicación 6, en el
que el anticuerpo es M291 humanizado en el que M291 es un anticuerpo
de ratón caracterizado porque presenta una región variable
de cadena ligera madura de la SEC. ID. nº: 2 y una región variable
de cadena pesada madura de la SEC. ID. nº:4.
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