ES2308845T3 - La utilizacion de peptidos de il-2 y derivados de los mismos como agentes terapeuticos. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la detección in vitro de la presencia o actividad de IL-2R, en el que dicho IL-2R se mide de la siguiente manera: a) Contactando (1) una muestra biológica de un mamífero en el que se sospecha de la presencia o actividad de dicho IL-2R con (2) un péptido que consiste en la secuencia SEC ID NO.:2 o SEC ID NO.:4 bajo las condiciones que permiten que se produzca la fijación de dicho IL-2R a dicho péptido; y b) Detectando si ha ocurrido o no la fijación entre dicho IL-2R de dicha muestra y el péptido que consiste en la secuencia SEC ID NO.:2 o SEC ID NO.:4.
Description
La utilización de péptidos de
IL-2 y derivados de los mismos como agentes
terapáuticos.
La presente invención se refiere a nuevos
péptidos de IL-2 y derivados de los mismos y, a su
utilización como agentes terapéuticos.
La interleucina-2
(IL-2) es el principal factor de crecimiento de los
linfocitos T (THÈZE et al. 1996, Immunol. Today
17:481-486). Al regular la actividad de los
linfocitos T colaboradores la IL-2 aumenta las
respuestas inmunes humorales y celulares. Al estimular células T
citotóxicas CD8 y células NK esta citocina participa a los
mecanismos de defensa contra tumores e infecciones virales. La
IL-2 se utiliza en terapia contra el melanoma
metastático y el adenocarcinoma renal. La IL-2 se
utiliza en ensayos clínicos en muchas formas de cáncer (LOTZE and
ROSENBERG 1988, Interleukin 2 as a Pharmaclologic Reagent. in
Interleukin 2, K.A. Smith, Academic Press: p.
237-89). También se utiliza en pacientes infectados
con el VIH y conduce a un aumento significativo de CD4 (KOVACS et
al. 1996, New Engl. J. of Medicine 1350-6).
La IL-2 humana es una proteína
de 133 aminoácidos (aa) compuesta por cuatro hélices \alpha
conectadas mediante bucles de diversas longitudes; se ha
establecido su estructura tridimensional. La IL-2R
está compuesta por tres cadenas \alpha, \beta y \gamma. La
IL-2R\alpha controla la afinidad del receptor. La
IL-2R\beta y la IL-2R\gamma son
responsables de la transducción de señales de IL-2.
Se han definido las diferentes áreas moleculares de
IL-2 que interactúan con las tres cadenas de
IL-2R. Más concretamente, se ha determinado que
hélice-\alpha A así como el área terminal NH_{2}
de IL-2 (residuos 1 a 30) controlan las
interacciones IL-2/IL-2R\beta
(ECKENBERG et al. 1997, Cytokine 9:488-98):
la cadena IL-2R\beta es la más importante en la
señalización dependiente de IL-2 (THÈZE et
al. 1990).
Los efectos de la interleucina-2
(IL-2) humana en sus células diana son mediadas por
medio de receptores de superficie celular (IL-2R)
(TANIGUCHI et al. (1983) Nature 302:305-310;
ROBB et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
81:6486-6490; SMITH KA. 1988a.
Interleukin-2; SMITH KA (1988b) Science
240:1169-1176). El IL-2R comprende
por lo menos tres subunidades codificadas mediante diferentes genes
(MINAMI et al. (1993) Annu. Rev. Immunol.
11:245-267; TANIGUCHI et al. (1993) Cell
73:5-8). El primer componente a identificar,
IL-2R\alpha, es una proteína de 55 kDa que fija
IL-2 con Kd de \simeq 10 nM (UCHIYAMA et
al. (1981) J. Immunol. 126:1293-1297; LEONARD
et al. (1984) Nature 311:626-631). Se han
estudiado el papel de IL-2R\alpha (KUMAR et
al. (1987) J. Immunol. 139:3680-3684) y la
influencia de la IL-2 sobre la expresión genética de
IL-2R\alpha (BISMUTH et al. (1985) Eur. J.
Immunol. 15:723-727; FROUSSARD et al. (1991)
Mol. Immunol. 28:87-93). El segundo componente de
IL-2R, IL-2R\beta es una proteína
de 75 kDa con un dominio intracitoplásmico grande (286 aa)
(TESHIGAWARA et al. (1987) J. Exp. Med.
165:223-238; HATAKEYAMA et al. (1989) Science
244:551-556; TSUDO et al. (1989) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 86:1982-1986). El último componente a
identificar, IL-2R\gamma, es una proteína de 64
kDa (TAKESHITA et al. (1992) Science
257:379-382; ISHII et al. (1994) Int.
Immunol. 6:1273-1277). IL-2R\beta
e IL-2R\gamma pertenecen a la familia del receptor
de la hematopoyetina mientras que la IL-2R\alpha
pertenece a otra familia de moléculas (THÈZE J (1994) Eur. Cytokine
Netw. 5:353-368). En el sistema de ratones se
requieren las tres cadenas para formar un receptor funcional (MOREAU
et al. (1995a) J. Immunol. 155: 3401-3408;
CHASTAGNER et al. (1996) Eur. J. Immunol.
26:201-206). En el sistema humano dos receptores
son funcionales. Cuando están asociados, la
IL-2R\beta humana más la
IL-2R\gamma forman un receptor de afinidad
intermedia con un Kd de \simeq 1 nM, mientras que la expresión de
las tres cadenas conduce a la formación de un IL-2R
de alta afinidad (Kd \simeq 10 pM).
La estructura de la IL-2 (MACKAY
D (1992) Science 257:410-413) se compone de un
conjunto central compacto de cuatro hélices \alpha antiparalelas
conectadas mediante tres bucles (figura 1). Se han elucidado algunas
de las interacciones entre la IL-2 e
IL-2R\alpha (SAUV et al. (1991) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 88:4636-4640; WANG et al.
(1995) Eur. J. Immunol.
25:1212-1-216) y las subunidades
IL-2R\gamma (Voss et al. (1993) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 90:2428-2432; Buchli et
al. (1993) Arch. Biochm. Biophys. 307: 411-415),
pero se conoce menos sobre la interacción
IL-2/IL-2R\beta, a pesar del hecho
de que la cadena IL-2R\beta juega un papel muy
crítico en la transducción de señales (TANIGUCHI T (1995) Science
268:251-255).
Se ha mostrado que una sustitución Asp20 por Lys
(mutante-D20K) previene la fijación a
IL-2R\beta (COLLINS et al. (1988) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 85:7709-7713). En un informe
reciente se analizó el papel de la secuencia (Leu17, Leu18, Leu19,
Asp20, Leu21) de la hélice-\alpha A de
IL-2, en las interacciones
IL-2/IL-2R\beta mediante la
mutagénesis con casete (BERNDT et al. (1994) Biochemistry
33:6571-6577). Sin embargo resultó difícil
interpretar los datos dado que la mayoría de las proteínas
producidas tienen múltiples mutaciones dentro y fuera de la
secuencia de interés. Únicamente se estudió un análogo con una única
mutación (L21V). Más sorprendentemente, en este estudio se informó
que la eliminación del segmento que abarca los residuos
17-31 (Dell) proporciona una proteína con actividad
agonista completa.
Los péptidos de IL-2 y sus
derivados se describieron en Cytokine (1997)
7:488-498, pero no fueron sometidos a ensayo en un
sistema in vitro de comprobación de actividad bioquímica como
la actividad de citocina, y en particular de una actividad similar a
IL-2.
La solicitud de patente internacional PCT WO
9.1/02000 describe el uso de una proteína IL-2
mutante (IL-2m) resistente a la proteólisis, para
el tratamiento de enfermedades en la que el receptor de
IL-2 juega un papel. La IL-2m de
esta solicitud de patente internacional PCT comprende una supresión
de 1 a 5 aminoácidos en la secuencia de IL-2
correspondiente a los residuos 74, 74-78,
75-77, 76-78, 76-79,
75, 78 y 79 de la hélice C.
La solicitud de patente internacional PCT WO
90/00565 describe análogos de IL-2 con una o más
sustituciones de aminoácido en la hélice A, B, B', E o F, lo que
alteran el domino de fijación del receptor y/o que estabiliza la
estructura de la IL-2 con el fin de modificar la
especificidad de estos mutantes hacia las células portantes del
receptor de IL-2 p55 o p75 y a su vez de inducir la
deseada actividad de IL-2.
La solicitud de patente internacional PCT WO
90/00565 también describe análogos en los que se ha sustituido un
residuo de cisteína por un residuo en el extremo
N-terminal, el extremo C-terminal o
entre las hélices C y D de la IL-2, para permitir
la unión de un ligando (toxina, anticuerpo, fármaco, marcador).
Esta solicitud de patente internacional PCT
utiliza los análogos anteriormente descritos para el tratamiento de
enfermedades neoplásticas y de inmunodeficiencia.
En vista de las deficiencias anteriormente
indicadas relacionadas con el análisis de la técnica anterior de
los agonistas y los antagonistas de IL-2, así como
con los procedimientos de modulación de la actividad de
IL-2 con los mismos, está claro que existe una
necesidad en la técnica para los mismos.
Por consiguiente, un objeto de esta invención es
proporcionar composiciones que presenten una actividad similar a
IL-2 y unos procedimientos para su uso como agentes
terapéuticos. Las aplicaciones de tales péptidos recombinantes,
sintéticos o híbridos son por tanto un objeto de la invención. Estas
composiciones se definen como poseedoras de las siguientes
características: a) contienen uno o más péptidos de por lo menos
cinco aminoácidos en longitud; y b) inhiben o mimetizan la fijación
de la hélice A de la interleucina-2
(IL-2) a una subunidad de un receptor de
IL-2 (IL-2R).
Otro objeto de la invención es el uso de un
péptido purificante que presenta las siguientes características: a)
el péptido tiene por lo menos una longitud de cinco aminoácidos; b)
el péptido se fija a una subunidad de un receptor de
IL-2 (IL-2R); y c) el péptido induce
la fosforilación de la subunidad de IL-2R.
Un objeto adicional de la invención se refiere a
la preparación de los anticuerpos que reconocen los péptidos de la
invención, y el uso terapéutico de estos anticuerpos.
Un objeto adicional de la invención es el uso de
secuencias de ADN que codifican los péptidos de la invención y sus
derivados. Dichos fragmentos de ADN son útiles, entre otras
aplicaciones, para la terapia génica. El uso de un ADN de la
siguiente secuencia ATG GCT CCG ACG AGC AGC TCC ACC AAG AAA ACC CAG
CTC CAG CTC GAA CAC CTG CTG CTG GAC CTG CAG ATG ATC CTG AAC GGT ATC
AAC AAC (SEC ID NO.: 1) o dicha SEC ID NO.: 1 sin el primer codón
ATG (SEC ID NO.: 3) es un objeto particular de la invención.
Es también otro objeto de la invención
proporcionar un procedimiento de detección de un péptido similar a
IL-2, en el que la actividad de IL-2
se mide mediante la fijación de IL-2R al péptido con
actividad agonista o antagonista de IL-2. Es
también otro objeto de la invención el uso de compuestos que inhiben
la actividad de un receptor IL-2R contactando
IL-2R con una cantidad del péptido antagonista
seleccionado suficiente como para inhibir la fijación de
IL-2 al receptor IL-2R bajo
condiciones que permiten que se produzca la fijación del péptido al
receptor IL-2R.
Otro objeto de la invención es proporcionar un
procedimiento para la selección de anticuerpos específicos para
péptido purificado con actividad similar a IL-2 tal
como se define en la presente memoria. Estos anticuerpos
monoclonales o policlonales pueden inhibir la fijación de
IL-2 al receptor IL-2R bajo
condiciones que permiten que se produzca la fijación al receptor
IL-2R. El uso terapéutico de estos anticuerpos es
también una parte de la presente invención. En particular, estos
anticuerpos específicos para los péptidos purificados son útiles
para el tratamiento o la prevención de reacciones inmunes no
deseadas como por ejemplo el rechazo a un injerto o trastornos
autoinmunes, por ejemplo, la artritis reumatoide.
Otro objeto de la invención es proporcionar un
procedimiento para la inducción en un paciente de efectos biológicos
de la IL-2 administrando al paciente una cantidad
del péptido agonista de la invención suficiente como para inducir
esos efectos biológicos, o administrando una combinación de diversas
citocinas péptido purificado. Por diversas citocinas se refiere por
ejemplo a IL-4, IL-9,
IL-15 o IL-2.
Otro objeto de la invención se refiere a las
secuencias de ácidos nucleicos que corresponden a la secuencia de
aminoácidos del péptido purificado y sus derivados según la
invención. Un forma de realización preferente es la secuencia de
nucleótidos que codifica el péptido purificado IP130 que presenta la
siguiente secuencia (SEC ID NO.: 2): Met Ala Pro Thr Ser Ser Ser
Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met
Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn o una secuencia que no comprende la
primera Met (SEC ID NO.: 4).
Esta secuencia o una secuencia derivada de la
misma puede insertarse en un vector apropiado capaz de expresar el
producto in vivo, en una bacteria o en una célula
eucariótica, particularmente en levadura o una célula de mamífero.
Estas construcciones son, entre otros usos, útiles para la terapia
génica.
Con los anteriores y otros objetos, ventajas y
características de la invención que se pondrán de manifiesto a
continuación en la presente memoria, la naturaleza de la invención
puede entenderse con mayor claridad haciendo referencia a la
siguiente descripción detallada de las formas de realización
preferentes de la invención y a las reivindicaciones adjuntas.
Se tendrá fácilmente una apreciación más
completa de la invención y de muchas de las ventajas relacionadas
con la misma a medida que la misma se entienda mejor haciendo
referencia a la siguiente descripción detallada al considerarse en
conexión con los dibujos adjuntos, entre los que:
La figura 1 muestra una representación
esquemática de la estructura de la IL-2 humana. La
proteína contiene 133 residuos aminoácidos (peso molecular:
15-18 kDa, dependiendo del grado de glicosilación).
Cuatro hélices \alpha, indicadas como A (posiciones de residuos
6-29), B-B' (posiciones
53-72), C (posiciones 81-97) y D
(posiciones 113-113) rodean un núcleo hidrofóbico
central. Los residuos Leu17 y Asp20 (véase el texto) se producen en
la hélice A del extremo N-terminal. La estructura
del bucle entre la hélice-\alpha C y la
hélice-\alpha D resultó indeterminada. Las
coordinadas atómicas fueron obtenidas a partir del enlace de acceso
al banco de datos Brookhaven Protein Data Bank (BERNSTEIN et
al. (1977) J. Mol. Biol. 112:535-542),
depositadas por D.B. MCKAY (MACKAY D (1992) Science
257:410-413). La figura fue dibujada con el programa
Molscript (KRAULIS (1991) J. Appl. Crystallogr.
24:946-950).
La figura 2 muestra la fijación y la inhibición
de la fijación del anticuerpo monoclonal (mAb) H2-8.
Experimentos de fijación: se recubrieron placas con
IL-2, péptido 1-22 o péptido
1-30. El control lo representan las placas no
recubiertas. La fijación del anticuerpo monoclonal (mAb) fue
revelada con anticuerpo lg polivalente antiratón en cabra conjugado
con fosfatasa alcalina. Experimentos de inhibición: se utilizaron
unas concentraciones de los anticuerpos monoclonales (mAb)
H2-8 o 19B11 con una fijación máxima de ½ en placas
recubiertas con IL-2. Estas diluciones se mezclaron
durante 1 hora a 37ºC con la concentración indicada de inhibidores
antes ser añadidos a los pocillos recubiertos con
IL-2.
La figura 3 muestra la fijación del anticuerpo
monoclonal (mAb) H2-8 con el péptido
1-30. Se recubrieron placas con el anticuerpo
monoclonal (mAb) H2-8 y se incubaron con el péptido
1-30 como se describe.
La figura 4 muestra los efectos biológicos del
anticuerpo monoclonal (mAb) H2-8 sobre
IL-2 Pro^{125}. Se sometieron a ensayo diferentes
concentraciones de IL-2 Pro^{125} con motivo de la
proliferación de células TS1\beta (IL-2R\alpha-,
IL-2R\beta^{+} de humano,
IL-2R\gamma^{+} de ratón). La proliferación se
midió mediante la incorporación de [^{3H}TdR] como se indica.
Se sometieron a ensayo diversas concentraciones
de (indicado en paréntesis -\mug/ml) del anticuerpo monoclonal
(mAb) H2-8. Como control se verificó la ausencia de
efectos del anticuerpo monoclonal (mAb) H2-8 sobre
la proliferación dependiente de IL-2 de las células
TS1\beta.
La figura 5 muestra el modelo de las
interacciones de IL-2/IL-2R. Figura
5(A) Posición de los residuos Leu17 y Asp20 en la estructura
de la IL-2 con respecto a las hélices A, C y D, en
una vista perpendicular al eje de la hélice A. Figura 5(B)
Posición del residuo Leu17 con respecto a las hélices A y
B-B'. La cadena lateral de Leu17 se encuentra
situada en un núcleo hidrofóbico rico en leucina de la molécula. La
cadena lateral cargada de Asp20 se expone parcialmente a un
solvente. Las dos orientaciones de la molécula mostradas en la
presente memoria son aproximadamente perpendiculares a la mostrada
en la figura 1.
Figura 5(C) El modelo del complejo
IL-2/IL-2R (BAMBOROUGH et al.
(1994) Structure 2:839-851) se basa en la estructura
de la hormona de crecimiento humana y su receptor (DE VOS et
al. (1992) Science 255:306-312). Para mayor
claridad, únicamente se muestran las
hélices-\alpha A y D de IL-2 y las
cadenas \beta y \gamma del receptor. Las posiciones estudiadas
de IL-2, Leu17, Asp20 y los residuos Arg15 y Tyr134
de IL-2R\beta están marcadas. También se muestras
las posiciones Cys125 y Ser127. Elementos estructurales secundarios
como los define el programa DSSP (KABSCH et al. (1983)
Biopolymers 22:2577-2637). Las coordenadas atómicas
del complejo fueron obtenidas a partir de la película de código de
acceso del banco de datos Brookhaven Protein Data Bank.
La figura 6 es una representación esquemática de
las interacciones de IL2-/IL-2R y la secuencia de
IP130 (SEC ID NO.: 4). El receptor de IL-2 está
compuesto de tres subunidades (\alpha, \beta, \gamma). (Véase
Imm. Today, 1996).
La figura 7 demuestra que IP130 induce la
proliferación y actúa en sinergia con la IL-2. La
actividad proliferativa se sometió a ensayo sobre TS1\beta2
(crecida en IL-2). Se restó el fondo de de 1,4 x
10^{3} cpm. También se observa una sinergia con la
IL-2. Las células diana TS1\beta se derivan a
partir de células murinas de TS1 (que únicamente expresan la
IL-2R\gamma murina), tras las transfección con el
gen humano IL-2R\beta.
La figura 8 muestra que la proliferación
inducida por IP130 no se debe a la sinergia con el factor de
crecimiento residual obtenido a partir del medio de cultivo. Las
células TS1\beta, utilizadas en este estudio, son cultivadas en
IL-4. La célula TS1\beta prolifera con IP130 y
esta proliferación no es inhibida por el anticuerpo monoclonal (mAb)
11B11, que neutraliza la proliferación inducida por
IL-4. La figura 8A muestra la actividad
proliferativa de IP130. La figura 8B muestra la actividad
proliferativa de IL-4. La figura 8C muestra IP130 +
anticuerpo monoclonal (mAb) 11B11
(anti-IL-4). La figura 8D muestra
IL-4 + anticuerpo monoclonal (mAb) 11B11 (\Box) e
IL-4 + anticuerpo monoclonal (mAb) 145 (anticuerpo
monoclonal (mAb) de control) (\ding{116}). La actividad
proliferativa se sometió a ensayo sobre TS1\beta4 (crecida en
IL-4).
La figura 9 demuestra que la
IL-2R\beta humana es esencial para la
proliferación inducida por IP130. La figura 9A muestra la actividad
de IP130 sobre células de TS1 transfectadas con
IL-2R\beta humana. La figura 9B muestra el efecto
del anticuerpo (A41) antihumano que neutraliza la cadena
IL-2R\beta sobre la actividad de IP130. Las
células de TS1 únicamente proliferan tras la transfección mediante
el gen humano IL-2R\beta. Al igual que para la
IL-2, la cadena IL-2R\beta murina
no permite la proliferación en la presencia de IP130. La
proliferación de TS1\beta inducida por IP130 es específicamente
neutralizada por el anticuerpo monoclonal (mAb) A41
(IL-2R\beta antihumano).
La figura 10 es un resumen de IP130 (SEC ID NO.:
4) y de los estudios de la estructura-función de las
moléculas derivadas. Se estudió la helicidad, la oligomerización y
la actividad biológica en una familia de péptidos (véase también la
presentación general de los datos).
La figura 11 es un modelo de las interacciones
de IP130/IL-2R\beta. IP130 es tetramérico e
IL-2R\beta forma un dímero en solución. Propuesto
a partir de los resultados obtenidos con la estructura
tridimensional de la IL-2 y complejo de hormona de
crecimiento/receptor.
La figura 12 muestra el patrón de la
fosforilación inducida por IP130 y la implicación de SHC. IP130
induce la fosforilación de la proteína SHC. Las dos bandas
correspondientes a isoformos de SHC son fosforiladas tras una
estimulación de diez minutos mediante Ip130. En la izquierda se
muestra la cinética de la fosforilación de Shc. En la derecha se
muestra una transferencia Western o "Western blot" de la
proteína Shc.
La figura 13 es un ensayo de cambio de movilidad
electroforética que muestra que IP130 no induce una actividad de
STAT. La activación de STAT se analiza en extractos nucleares de
células KIT225 tras una estimulación mediante IL-2,
IP130 o IL-2 + IP130. Únicamente muestran una
activación de STAT las células estimuladas mediante
IL-2 o IL-2 + IP130. En el estudio
de utilizaron sondas de \beta-caseína. Se
obtuvieron los mismos resultados con otras dos sondas (GAS y
GIRE).
La figura 14 muestra un modelo de transducción
de señal e IP130. La IL-2 utiliza tres vías o rutas
principales: 1º/JAK/STAT dependiendo del complejo
IL-2R\gamma; 2º/SHC/MAPK iniciada en la cadena
IL-2R\beta fosforilada y 3º/PI3K. De acuerdo con
el modelo de
(IP130)_{4}/(IL-2R\beta)_{2}
(figura 14), IP130 no induce la vía o ruta JAK/STAT sino que induce
la vía o ruta SHC/MAPK. (JAK: quinasa janus; PI3K: quinasa
fosfatidilinositol-3 fosfato; STAT: transductores de
señal y activadores de trascripción; MAPKK: proteína quinasa
activada por mitógenos; MAPK: proteína quinasa activada por
mitógenos; \ding{218}): inducción de la trascripción).
La figura 15 muestra la entrada al ciclo celular
(S+G2/M) de células NK estimuladas por IP130. Se estimulan células
PBMC mediante IL-2, IP130 o IL-2 +
IP130. Se sustraen respuestas no específicas (J+1 en medio). Se mide
la entrada de las células NK en las fases de S+G2/M mediante ioduro
de propidio y se analiza con el software ModFit 2.0 (Becton
Dickinson).
La figura 16 muestra que el péptido IP130
estimula la actividad LAK. En este experimento, se ha estudiado la
cinética de la stimulación de la actividad LAK. Los histogramas
muestran los resultados con una relación de efector/diana de diez.
\Delta% lisis = lisis inducida mediante IL-2 y/o
IP130 - lisis espontánea.
La presente invención se refiere al uso de
péptidos de IL-2 derivados de la
interleucina-2 (IL-2), para su uso
terapéutico en mamíferos, y particularmente en humanos. Los péptidos
se seleccionan a partir de fragmentos de IL-2 y
derivados de IL-2. Los derivados se definen como
contenedores de una secuencia de aminoácidos con capacidad de
fijación a la cadena IL-2R\beta bajo las
condiciones descritas en la presente memoria, o con capacidad de
fijación a los anticuerpos monoclonales producidos por el hibridoma
H2-8. La invención también se refiere a los
anticuerpos dirigidos contra los péptidos según la invención que
asimismo mimetizan y/o modulan la actividad de
IL-2. El diagnóstico y los procedimientos
terapéuticos implican el uso de los péptidos purificados y los
anticuerpos para la detección y/o la modulación de la fijación de
IL-2 a IL-2R in vitro e in
vivo. De acuerdo con la presente invención pueden emplearse
técnicas convencionales de biología molecular, microbiología y ADN
recombinante dentro de las capacidades de la técnica. Dichas
técnicas se explican al completo en la literatura. Véase por
ejemplo, SAMBROOK et al., "Molecular Cloning: A Laboratory
Manual" (1989); "Current Protocols in Molecular Biology"
Volumes I-III [Ausubel, R. M., ed. (1994)]; "Cell
Biology: A Laboratory Handbook" Volumes I-III
[J. E. Celis, ed. (1994)]; "Current Protocols in Immunology"
Volumes IIII [Coligan, J. E., ed. (1994)]; "Oligonucleotide
Synthesis" (M.J. Gait ed. 1984); "Nucleic Acid
Hybridization" [B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985)];
"Transcription And Translation" [B.D. Hames & S.J. Higgins,
eds. (1984)]; "Animal Cell Culture" [R.I. Freshney, ed.
(1986)]; "Immobilized Cells And Enzymes" [IRL Press, (1986)];
B. Perbal, "A Practical Guide To Molecular Cloning" (1984).
Por tanto, en caso de aparecer en la presente
memoria, las siguientes expresiones tendrán las definiciones que se
describen a continuación.
Las expresiones "péptido de
IL-2", "agonista/antagonista de
IL-2", "IP130/derivados de IP130", y
cualquier variante no indicada específicamente, pueden utilizarse
en la presente memoria de manera intercambiable, y como se utilizan
durante toda la presente solicitud. Estas expresiones hacen
referencia a un material proteináceo que incluye una única proteína
o múltiples proteínas o un producto recombinante o péptidos
obtenidos mediante síntesis química, y se extiende a aquellas
proteínas que presentan unos datos de secuencia de aminoácidos
descritos en la presente memoria y presentados en la figura 10 (SEC
ID NO.: 3). El perfil de las actividades biológicas presentadas a
continuación en la presente memoria es uno de los aspectos de la
presente solicitud. Por consiguiente, se contemplan asimismo las
proteínas que muestran una actividad considerablemente equivalente
o alterada. Estas modificaciones pueden se deliberadas, como por
ejemplo, las modificaciones obtenidas mediante la mutagénesis
dirigida, o pueden ser accidentales, como por ejemplo las obtenidas
por medio de mutaciones en huéspedes que son productores del
complejo o sus correspondientes subunidades. También, las
expresiones "péptido de IL-2",
"agonista/antagonista de IL-2", e
"IP130/derivados o péptido(s) purificado(s) de
IP130" están destinadas a incluir dentro de su alcance proteínas
específicamente enumeradas en la presente memoria así como todos
los análogos considerablemente homólogos y todas las variaciones
alélicas.
Los residuos de aminoácidos descritos en la
presente memoria preferentemente se encuentran en la forma isomérica
"L". Sin embargo, los residuos en la forma isomérica "D"
pueden sustituirse por cualquier residuo de aminoácido L, siempre
que la deseada propiedad funcional o fijación de la inmunoglobulina
sea retenida por el polipéptido. NH_{2} hace referencia al grupo
amino libre presente en el aminoterminal de un polipéptido. COOH
hace referencia al grupo carboxi libre presente en el terminal
carboxi de un polipéptido. En la siguiente Tabla de Correspondencia
se muestran abreviaciones de residuos de aminoácidos, de acuerdo con
la nomenclatura estándar de los polipéptidos, J. Biol. Chem.,
243:3552-59 (1969):
Hay que reseñar que todas las secuencias de
residuos de aminoácidos en la presente memoria se representan
mediante fórmulas cuya orientación izquierda y derecha se encuentra
en la dirección convencional de aminoterminales a terminales
carboxi. Además, debe reseñarse que una raya al comienzo o al final
de una secuencia de residuo de aminoácido indica un enlace
peptídico a otra secuencia de uno o más residuos de aminoácidos. La
tabla anteriormente mostrada se presenta para correlacionar las
notaciones de tres letras y de una letra que pueden aparecer en la
presente memoria de forma alternante.
Un "replicón" es cualquier elemento
genético (por ejemplo, plásmido, cromosoma, virus) que funciona como
una unidad autónoma de replicación del ADN in vivo; es decir,
con capacidad de replicación bajo su propio control.
Un "vector" es un replicón, como por
ejemplo plásmido, fago o cósmido, al cual puede fijarse otro
segmento de ADN para provocar la replicación del segmento
fijado.
Una "molécula de ADN" hace referencia a la
forma polimérica de los desoxirribonucleótidos (adenina, guanina,
timina o citosina) en su forma de cadena simple o, hélice de cadena
doble. Esta expresión hace referencia únicamente a la estructura
primaria y secundaria de la molécula, y no la limita a ninguna forma
terciaria particular. Así, esta expresión incluye el ADN de cadena
doble que se encuentra, entre otros, en las moléculas lineales de
ADN (por ejemplo, fragmentos de restricción), virus, plásmidos y
cromosomas. Al analizar la estructura de moléculas de ADN de cadena
doble particulares, las secuencias pueden describirse en la presente
memoria según la convención normal de proporcionar únicamente la
secuencia en la dirección de 5' a 3' a lo largo de la cadena no
trascrita de ADN (es decir, la cadena que presenta una secuencia
homóloga al ARNm).
Un "origen de replicación" hace referencia
a aquellas secuencias de ADN que participan en la síntesis del
ADN.
Una "secuencia de codificación" de ADN es
una secuencia de ADN de cadena doble que se trascribe y se traduce
en un polipéptido in vivo situado bajo el control de
secuencias regulatorias apropiadas. Los límites de la secuencia de
codificación se determinan mediante un codón de arranque en el
terminal (amino) 5' y un codón de parada de traducción en el
terminal (carboxi) 3'. Una secuencia de codificación puede incluir,
aunque sin limitarse a ello, secuencias procarióticas, ADNc a
partir de ARNm eucariótico, secuencias de ADN genómico a partir de
ADN eucariótico (por ejemplo, de mamífero), e incluso secuencias de
ADN sintético. Una secuencia de terminación de trascripción y señal
de poliadenilación generalmente estará situada en 3' con respecto a
la secuencia de codificación.
Las secuencias de control de trascripción y de
traducción son secuencias regulatorias de ADN, como por ejemplo
promotores, mejoradores, señales de poliadenilación, terminadores, y
similares, que proporcionan la expresión de una secuencia de
codificación en una célula huésped.
Una "secuencia promotora" es una región
regulatoria de ADN con capacidad de fijación de la ARN polimerasa
en una célula y de inicio de la trascripción de una secuencia de
codificación aguas abajo (dirección 3'). Con el fin de definir la
presente invención, la secuencia promotora se fija en el terminal 3'
junto el sitio de inicio de la trascripción y se extiende aguas
arriba (dirección 5') para incluir el mínimo número de bases o
elementos necesarios para iniciar la trascripción a niveles
detectables sobre el fondo. Dentro de la secuencia promotora se
encontrará un sitio de inicio de la trascripción (convenientemente
definido mediante el mapeo con la nucleasa S1), así como unos
dominios de fijación a proteína (secuencias consenso) responsables
de la fijación de la ARN polimerasa. Los promotores eucarióticos
con frecuencia contendrán, aunque no siempre, cajas "TATA" y
cajas "CAT". Los promotores procarióticos contienen secuencias
Shine-Dalgarno además de las secuencias consenso -10
y -35.
Una "secuencia de de control de la
expresión" es una secuencia de ADN que controla y regula la
trascripción y la traducción de otra secuencia de ADN. Una
secuencia de codificación se encuentra "bajo el control" de
las secuencias de control de la trascripción y la traducción en una
célula cuando la ARN polimerasa trascribe la secuencia de
codificación en ARNm, que seguidamente es traducida en la proteína
codificada por la secuencia de codificación.
Una "secuencia de señal" puede incluirse
antes que una secuencia de codificación. Esta secuencia codifica un
péptido de señal, N-terminal con respecto al
polipéptido, que se comunica con la célula huésped para dirigir el
polipéptido a la superficie celular o secretar el polipéptido en los
medios, y este péptido de señal es cortado por la célula huésped
antes de que la proteína abandone la célula. Pueden encontrarse
secuencias de señal asociadas a una variedad de proteínas nativas a
los procariotas y los eucariotas.
El término "oligonucleótido" se define como
una molécula compuesta por dos o más ribonucleótidos,
preferentemente más de tres. Su tamaño exacto dependerá de muchos
factores, que a su vez, dependen de la función y el uso final del
oligonucleótido.
Una célula habrá sido "trasformada" por un
ADN exógeno o heterólogo cuando dicho ADN haya sido introducido
dentro de la célula. El ADN transformador puede estar o no integrado
(enlazado covalentemente) en un ADN cromosómico formando el genoma
de la célula. En los procariotas, la levadura y las células de
mamífero, por ejemplo, el ADN transformador puede mantenerse sobre
un elemento episomal como por ejemplo un plásmido. Con respecto a
las células eucarióticas, una célula establemente transformada en
una en la que el ADN transformador se ha integrado en un cromosoma
de manera que es heredado por células hijas a través de la
replicación cromosómica. Esta estabilidad se demuestra mediante la
capacidad de la célula eucariótica de establecer líneas celulares o
clones compuestos por una población de células hijas que contienen
el ADN transformador. Un "clon" es una población de células
derivadas a partir de una única célula o antecesor común mediante
mitosis. Una "línea celular" es un clon de una célula primaria
que tiene la capacidad de un crecimiento estable in vitro por
muchas generaciones.
Dos secuencias de ADN son "considerablemente
homólogas" cuando por lo menos aproximadamente el 75%
(preferentemente por lo menos aproximadamente el 80% y, lo más
preferentemente por lo menos aproximadamente entre el 90% y el 95%)
de los nucleótidos coinciden sobre la longitud definida de las
secuencias de ADN. Las secuencias que son considerablemente
homólogas pueden identificarse comparando las secuencias utilizando
software estándar disponible en bancos de datos de secuencias, o en
un experimento de hibridación "Southern" bajo, por ejemplo,
condiciones rigurosas como las que se definen para aquél sistema
particular. La definición de condiciones de hibridación adecuadas
se encuentra dentro de las capacidades de la técnica. Véase pro
ejemplo MANIATIS et al., supra; DNA Cloning, Vols. I &
II, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra.
Debe observarse que también dentro del alcance
de la presente invención se encuentran los usos biológicos de las
secuencias de ADN que codifican los péptidos de IL-2
con la misma secuencia de aminoácidos que IP130 (SEC ID NO.: 2 o
SEC ID NO.: 4), pero que están degeneradas con respecto a las
secuencias de codificación de ADN SEC ID NO.: 2 o SEC ID NO.: 4.
"Degeneradas con respecto a" hace referencia a que se utiliza
un codón diferente de tres letras para especificar un aminoácido
particular. Es bien conocido en la técnica que pueden utilizarse los
siguientes codones de forma intercambiable para codificar cada
aminoácido específico:
Debe entenderse que los codones anteriormente
especificados son para secuencias de ARN. Los correspondientes
condones para ADN tienen una T como sustituta de U.
Pueden realizarse modificaciones de los péptidos
en la secuencia de codificación de ADN, SEC ID NO.:2 o SEC ID NO.:
4 de manera que se cambia de un codón particular a un codón que
codifica un aminoácido diferente. Dicha mutación generalmente se
lleva a cabo realizando el menor número posible de cambios de
nucleótidos. Puede realizarse una mutación de sustitución de este
tipo para cambiar un aminoácido en la proteína resultante de una
manera no conservadora (es decir, cambiando el codón de un
aminoácido perteneciente a un grupo de aminoácidos con unas
dimensiones o características particulares a un aminoácido
perteneciente a otro grupo) o de una manera conservadora (es decir,
cambiando el codón de un aminoácido perteneciente a un grupo de
aminoácidos con unas dimensiones o características particulares a
un aminoácido perteneciente al mismo grupo). Dicho cambio
conservador generalmente conduce a menos cambios en la estructura y
la función de la proteína resultante. Es más probable que un cambio
no conservador altere la estructura, actividad o función de la
proteína resultante. Debería considerase que la presente invención
incluya secuencias que contengan cambios conservadores que no
alteran de manera significativa las características de fijación o
actividad de la proteína resultante.
\global\parskip0.930000\baselineskip
El siguiente es un ejemplo de diversos grupos de
aminoácidos:
Aminoácidos con grupos R no polares
Alanina
Valina
Leucina
Isoleucina
Prolina
Fenilalanina
Triptofan
Metionina
\vskip1.000000\baselineskip
Aminoácidos con grupos R polares
descargados
Glicina
Serina
Treonina
Cisteína
Tirosina
Asparagina
Glutamina
\vskip1.000000\baselineskip
Aminoácidos con grupos R polares cargados
(negativamente cargados a pH 6,0)
Ácido aspártico
Ácido glutámico
\vskip1.000000\baselineskip
Aminoácidos básicos (positivamente cargados a pH
6,0)
Lisina
Arginina
Histidina (a pH 6,0)
\vskip1.000000\baselineskip
Otro grupo puede ser el de aquellos aminoácidos
con grupos fenilo:
Fenilalanina
Triptofan
Tirosina
\global\parskip1.000000\baselineskip
Otro grupo puede ser según el peso molecular (es
decir, tamaño de los grupos R):
- Glicina
- 75
- Alanina
- 89
- Serina
- 105
- Prolina
- 115
- Valina
- 117
- Treonina
- 119
- Cisteína
- 121
- Leucina
- 131
- Isoleucina
- 131
- Asparagina
- 132
- Ácido aspártico
- 133
- Glutamina
- 146
- Lisina
- 146
- Ácido glutámico
- 147
- Metionina
- 149
- Histidina (a pH 6,0)
- 155
- Fenilalanina
- 165
- Arginina
- 174
- Tirosina
- 181
- Triptofan
- 204
\vskip1.000000\baselineskip
Las sustituciones conservadoras particularmente
preferentes son;
- Lys por Arg y viceversa de manera que puede
mantenerse una carga positiva;
- Glu por Asp y viceversa de manera que puede
mantenerse una carga negativa;
- Ser por Thr de manera que puede mantenerse un
-OH libre;
- Gln por Asn de manera que puede mantenerse un
NH_{2} libre;
\vskip1.000000\baselineskip
También pueden introducirse sustituciones de
aminoácidos en la IL-2 o péptidos de la misma para
sustituir un aminoácido con una propiedad particularmente
preferente. Por ejemplo, puede introducirse un Cys como un
potencial sitio para puentes disulfuro con otro Cys. Puede
introducirse un His como un sitio particularmente "catalítico"
(es decir, His puede actuar como un ácido o base y es el aminoácido
más común en la catálisis química). Puede introducirse Pro debido a
su estructura particularmente planar, que induce giros \beta en la
estructura de la proteína.
Los péptidos biológicamente activos de la
invención preferentemente abarcan una región de la secuencia de la
IL-2 que incluye los aminoácidos
17-20, a pesar de que uno o más de estos residuos de
aminoácidos pueden sustituirse con otro aminoácido o, un aminoácido
modificado. El uso del péptido preferente que contiene por lo menos
5 aminoácidos en longitud, más preferentemente de 8 a 12
aminoácidos, y más preferentemente por lo menos 15 aminoácidos en
longitud es un aspecto de la invención, así como el uso del péptido
de la invención basado en los aminoácidos 1-30 de la
IL-2.
Puede considerarse que la actividad biológica o
fisiológica de la IL-2 incluya la estimulación de
células CD4, CD8 y NK, y puede incluir actividades antivirales y
antitumorales. La actividad biológica o fisiológica de IP130 y
otros péptidos de la invención puede incluir las actividades de
IL-2 anteriormente indicadas, así como la inducción
de la fosforilación de SHC y la inducción de la vía o ruta
SHC/MAPK.
Una región "heteróloga" de la construcción
de ADN es una segmento inidentificable de ADN dentro de una molécula
más grande de ADN que no se encuentra en asociación con la molécula
más grande en la naturaleza. De esta manera, cuando la región
heteróloga codifica un gen de mamífero, el gen generalmente estará
flanqueado por ADN que no flanquea el ADN genómico de mamífero en
el genoma del organismo fuente. Otro ejemplo de una secuencia de
codificación heteróloga es una construcción en la que la propia
secuencia de codificación no se encuentra en la naturaleza (por
ejemplo, un ADNc en el que la secuencia de codificación genómica
contiene intrones, o secuencias sintéticas con codones diferentes
al gen nativo). Las variaciones alélicas o los sucesos mutacionales
que se producen de manera natural no dan lugar a una región
heteróloga de ADN como se define en la presente memoria.
Un "anticuerpo" es cualquier
inmunoglobulina, incluyendo sus anticuerpos y fragmentos, que fija
un epítopo específico. El término abarca anticuerpos policlonales,
monoclonales y quiméricos, estando los últimos descritos con mayor
detalle en las patentes estadounidenses US nº 4.816.397 y US nº
4.816567.
Un "sitio de combinación del anticuerpo" es
aquella parte estructural de una molécula de anticuerpo compuesta
por regiones variables e hipervariables de cadena pesada y cadena
ligera que específicamente fija el antígeno.
La frase "molécula de anticuerpo" en sus
diversas formas gramaticales como se utiliza en la presente memoria
contempla tanto una molécula de inmunoglobulina intacta como una
parte inmunológicamente activa de una molécula de
inmunoglobulina.
Son Moléculas de anticuerpo ejemplares las
moléculas de inmunoglobulina intacta, las moléculas de
inmunoglobulina considerablemente intacta y aquellas partes de una
molécula de inmunoglobulina que contiene el paratopo, incluyendo
aquellas partes conocidas en la técnica como Fab, Fab',
F(ab')_{2} y F(v), partes que preferentemente se
utilizan en los procedimientos terapéuticos descritos en la presente
memoria.
Las partes Fab y F(ab')_{2} de las
moléculas de anticuerpo se preparan mediante la reacción
proteolítica de la papaína y la pepsina, respectivamente, en
moléculas de anticuerpo considerablemente intacto por medio de
procedimientos de que son bien conocidos. Véase, por ejemplo, la
patente estadounidense de US nº 4.342.566 de Theofilopolous et
al. También son conocidas las partes de molécula de anticuerpo
Fab' y son producidas a partir de partes F(ab')_{2}
seguido de la reducción de los enlaces disulfuro que unen las dos
partes de cadena pesada como con el mercaptoetanol, y seguido de la
alquilación de la proteína-mercaptano resultante
con un reactivo como la iodoacetamida. En la presente memoria
resulta preferente un anticuerpo que contenga moléculas de
anticuerpo intacto.
La frase "anticuerpo monoclonal" en sus
diversas formas gramaticales hace referencia a un anticuerpo que
presenta únicamente una especie de sitio de combinación del
anticuerpo con capacidad para inmunoreaccionar con un antígeno
particular. De esta manera un anticuerpo monoclonal generalmente
muestra una afinidad de fijación simple para cualquier antígeno con
el que inmunoreacciona. Por tanto un anticuerpo monoclonal puede
contener una molécula de anticuerpo con una pluralidad de sitios de
combinación del anticuerpo, cada uno inmunoespecífico para un
antígeno diferente; por ejemplo, un anticuerpo monoclonal
biespecífico (quimérico).
Los anticuerpos preferentes de la invención se
fijan a los péptidos de la invención, anteriormente descritos. Los
anticuerpos que se fijan a los péptidos de la invención pueden
utilizarse como agentes de diagnóstico para el análisis de la
fijación de IL-2 a su receptor, y también pueden
utilizarse como agentes terapéuticos, para mejorar o inhibir la
fijación de IL-2 a su receptor. En una forma de
realización preferente, el anticuerpo de la invención inhibe la
fijación de IL-2 y/o IP130 al receptor
IL-2R.
La frase "farmacéuticamente aceptable" hace
referencia a composiciones y entidades moleculares que son
fisiológicamente tolerables y generalmente no producen una reacción
adversa alérgica o similar, como por ejemplo molestias gástricas,
mareos y similares, al ser administradas a un humano.
La frase "cantidad terapéuticamente
efectiva" se utiliza en la presente memoria para hacer referencia
a una cantidad suficiente para prevenir, y preferentemente reducir
por lo menos en un 30 por ciento, más preferentemente por lo menos
en un 50 por ciento, lo más preferentemente por lo menos en un 90
por ciento, un cambio clínicamente significativo en una
característica de patología como por ejemplo, presión sanguínea
elevada, fiebre o número de células blancas como puede comportar su
presencia y actividad.
Una secuencia de ADN se encuentra
"operativamente ligada" a una secuencia de control de la
expresión cuando la secuencia de control de la expresión controla y
regula la trascripción y la traducción de la secuencia de ADN. La
expresión "operativamente ligada" incluye el tener una señal de
inicio apropiada (por ejemplo, ATG) frente a la secuencia de ADN a
expresar y mantener el correcto marco de lectura para permitir la
expresión de la secuencia de ADN bajo el control de la secuencia de
control de la expresión y producción del producto deseado
codificado por la secuencia de ADN. Si un gen que uno desea insertar
en una molécula de ADN recombinante no contiene una apropiada señal
de inicio, dicha señal de inicio puede insertarse frente al gen.
La expresión "condiciones estándares de
hibridación" hace referencia a condiciones de sal y temperatura
considerablemente equivalentes a 5 x SSC y 65ºC tanto para la
hibridación como para el lavado. Sin embargo, un experto en la
materia podrá observar que dichas "condiciones estándares de
hibridación" son dependientes de condiciones particulares que
incluyen la concentración de sodio y magnesio en el tampón, longitud
y concentración de la secuencia de nucleótidos, porcentaje de
desemparejamiento, porcentaje de formamida, y similares. También es
importante en la determinación de las "condiciones estándares de
hibridación" si las dos secuencias de hibridación son
ARN-ARN, ADN-ADN, o
ARN-ADN. Dichas condiciones estándares de
hibridación las determina fácilmente un experto en la materia según
formulas bien conocidas, en el que la hibridación generalmente es de
entre el 10ºC y el 20ºC por debajo del T_{m} predecido o
determinado con lavados de mayor severidad, si se desea.
En su aspecto primario, la presente invención se
refiere al uso de los péptidos de IL-2 que modulan
la actividad de IL-2. El término "modular"
hace referencia a la actividad agonista o antagonista que incrementa
o elimina los efectos fisiológicos de IL-2, como
por ejemplo la proliferación de las células, tal como se describe a
continua-
ción.
ción.
Tal y como se ha indicado anteriormente, la
presente invención también se refiere a un gen clonado o molécula
de ADN recombinante, o una variante degenerada del mismo, que
codifica un péptido de IL-2, o un fragmento del
mismo, que posea un peso molecular preferentemente de entre 2 kD y 5
kD y una secuencia de aminoácidos presentada en la figura 10 (SEC
ID NO.: 4) o una secuencia en la que la secuencia SEC ID NO.: 4 se
modifica por inserción, eliminación y/o sustitución;
preferentemente una molécula de ácido nucleico, en particular un
gen clonado o molécula de ADN recombinante, que codifica el péptido
tiene una secuencia de nucleótidos, es complementaria a, o se
hibridiza bajo condiciones estándares de hibridación a una secuencia
de ADN que codifica la secuencia SEC ID NO.:2 o SEC ID NO.: 4.
Las posibilidades tanto diagnósticas como
terapéuticas que surgen o se elevan por la existencia de los
péptidos de IL-2, se derivan del hecho de que los
péptidos parecen participar en una interacción
proteína-proteína directa y causal entre el péptido
de IL-2 y el receptor de IL-2,
específicamente IL-2R\beta, y aquellos factores
que seguidamente median sucesos celulares. En particular se ha
comprobado que el péptido IP130 induce la fosforilación de
IL-2R\beta, para inducir c-myc; y
que induce que las células asesinas naturales o "natural
killer" (NK) entren al ciclo celular. Tal como se ha sugerido
anteriormente y como se elabora más adelante en la presente
memoria, la presente invención contempla la intervención
farmacéutica en la cascada de reacciones en las que se encuentra
implicado el receptor IL-2R, para modular la
actividad iniciada por IL-2 y los péptidos de la
misma.
De esta manera, en casos en los que se desea
reducir o inhibir la actividad inducida por IL-2,
podría introducirse un inhibidor de IL-2 del
péptido de IL-2 apropiado para bloquear la
interacción de la IL-2 con el receptor
IL-2R. Por consiguiente, los casos en los que tiene
lugar una actividad inducida por IL-2 insuficiente
podrían remediarse mediante la introducción de cantidades
adicionales del agonista del péptido de IL-2
apropiado, como por ejemplo IP130, o sus cognados, análogos,
fragmentos y similares químicos o farmacéuticos.
Tal y como se ha analizado anteriormente, los
péptidos de IL-2 o sus parejas de fijación u otros
ligandos o agentes que muestran mimetismo o antagonismo a
IL-2 o control sobre su producción, pueden
prepararse en composiciones farmacéuticas, con un portador adecuado
y a una fuerza efectiva para la administración por medio de
diversos medios a un paciente que esté experimentando un estado
médico adverso asociado a niveles no deseables de
IL-2 para el tratamiento del mismo. Pueden
utilizarse una diversidad de técnicas de administración, entre
ellas las técnicas parenterales como las inyecciones subcutáneas,
intravenosas e intraperitoneales, cateterizaciones y similares. Las
cantidades medias de los péptidos de IL-2 o sus
subunidades pueden variar y en particular deberían basarse en las
recomendaciones y prescripción de un médico o veterinario
cualificado.
También, los anticuerpos que incluyen tanto
anticuerpos policlonales como monoclonales, y los fármacos que
modulan la producción o actividad de IL-2 y/o
péptidos de la misma pueden tener ciertas aplicaciones diagnósticas
y pueden por ejemplo, utilizarse con el fin de detectar y/o medir la
actividad del receptor de IL-2 o similares. Por
ejemplo, la IL-2 o péptidos de la misma pueden
utilizarse para producir tanto anticuerpos policlonales como
monoclonales a sí mismos en una diversidad de medios celulares,
mediante técnicas conocidas como por ejemplo la técnica del
hibridoma utilizando, por ejemplo, linfocitos de bazo de ratón
fusionados y células de mieloma. Asimismo, pueden descubrirse o
sintetizarse pequeñas moléculas que mimetizan o antagonizan la
actividad o las actividades de los péptidos de IL-2
de la invención, y pueden utilizarse en protocolos diagnósticos y/o
terapéuticos.
La metodología general para fabricar anticuerpos
monoclonales mediante hibridomas es bien conocida. También pueden
crearse líneas celulares productoras de anticuerpos, inmortales,
mediante técnicas diferentes a la fusión, como por ejemplo la
transformación directa de linfocitos B con ADN oncogénico, o la
transfección con el virus Epstein-Barr. Véase, por
ejemplo, M. SCHREIER et al., "Hybridoma Techniques"
(1980); HAMMERLING et al., "Monoclonal Antibodies And
T-cell Hybridomas" (1981); KENNETT et al.,
"Monoclonal Antibodies" (1980); véanse también las patentes
estadounidendes US nº 4.341.761; US nº 4.399.121; US nº 4.427.783;
US nº 4.44US nº 4.887; US nº 4.451.570; US nº 4.466.917; US nº
4.472.500; US nº 4.491.632; US nº 4.493.890.
Pueden cribarse paneles de anticuerpos
monoclonales producidos contra péptidos de IL-2 par
diversas propiedades; es decir, isotipo, epítopo, afinidad, etc.
Son de un interés particular los anticuerpos monoclonales que
modulan la actividad de IL-2 o péptidos de la
misma. Dichos anticuerpos monoclonales pueden identificarse
fácilmente en ensayos de proliferación celular. También son útiles
los anticuerpos de alta afinidad cuando es posible la purificación
por inmunoafinidad de la IL-2 nativa o recombinante
o péptidos de IL-2 nativos o recombinantes.
Preferentemente, el anticuerpo
anti-IL-2 utilizado en los
procedimientos de diagnóstico de esta invención es un anticuerpo
policlonal purificado por afinidad. Más preferentemente, el
anticuerpo es un anticuerpo monoclonal (mAb). Además, es preferente
que las moléculas de anticuerpo
anti-IL-2 utilizados en la presente
memoria se encuentren en la forma de partes Fab, Fab',
F(ab')_{2} o F(v) o moléculas de anticuerpo
enteras.
Un procedimiento de diagnóstico de la presente
invención comprende el examen de un medio o muestra celular por
medio de un ensayo que incluye una cantidad efectiva de un péptido
de IL-2 marcado o un antagonista del mismo, como
por ejemplo un anticuerpo anti-IP130,
preferentemente un anticuerpo policlonal purificad por afinidad, y
más preferentemente un anticuerpo monoclonal (mAb). Además, es
preferente que las moléculas de anticuerpo
anti-IL-2 utilizadas en la presente
memoria se encuentren en la forma de partes Fab, Fab',
F(ab')2 o F(v) o moléculas de anticuerpo enteras. Tal
como se ha analizado anteriormente, entre los pacientes con
capacidad de beneficiarse de este procedimiento se incluyen
aquellos que sufren de cáncer, una lesión precancerosa, una
infección viral u otro trastorno patológico similar. Los
procedimientos para aislar el péptido de IL-2 e
inducir anticuerpos anti-IL-2 y
determinar y optimizar la capacidad de los anticuerpos
anti-IL-2 para facilitar el examen
de las células diana son bien conocidos en la técnica.
Los procedimientos para producir anticuerpos
antipolipéptido policlonales son bien conocidos en la técnica.
Véase la patente estadounidense US nº 4.493.795 de Nestor et
al. Un anticuerpo monoclonal, que generalmente contiene partes
Fab y/o F(ab')_{2} de moléculas de anticuerpo útiles, puede
prepararse utilizando la tecnología del hibridoma descrita en
Antibodies - A Laboratory Manual, Harlow and Lane, eds., Cold Spring
Harbor Laboratory, New York (1988). En resumen, para formar el
hibridoma a partir del que se produce la composición del anticuerpo
monoclonal, se fusiona un mieloma u otra línea celular
autoperpetuante con linfocitos obtenidos a partir del bazo de un
mamífero hiperinmunizado con un péptido de IL-2 o
una parte de fijación al receptor IL-2R del
mismo.
Los esplenocitos generalmente se fusionan con
células de mieloma utilizando polietilenglicol (PEG) 6000. Los
híbridos fusionados son seleccionados por su sensibilidad a HAT. Los
hibridomas que producen un anticuerpo monoclonal útil para llevar a
la práctica esta invención son identificados por su capacidad para
inmunoreaccionar con el presente péptido o mutante de
IL-2 y su capacidad para inhibir la especificada
actividad de IL-2 en las células diana.
Un anticuerpo monoclonal útil para llevar a la
práctica la presente invención puede producirse iniciando un
cultivo de hibridoma monoclonal que comprende un medio de nutriente
que contiene un hibridoma que segrega moléculas de anticuerpo de la
especificidad antigénica apropiada. El cultivo se mantiene bajo unas
condiciones y por un periodo de tiempo suficientes para que el
hibridoma segregue las moléculas de anticuerpo en el medio. A
continuación se recoge el medio que contiene el anticuerpo. A
continuación pueden aislarse más las moléculas de anticuerpo
mediante técnicas bien conocidas.
Los medios útiles para la preparación de estas
composiciones son bien conocidos en la técnica y se encuentran
comercialmente disponibles e incluyen medios de cultivo sintéticos,
ratones endogámicos y similares. Un medio sintético ejemplar es el
medio "medio mínimo esencial" de Dulbecco (DMEM; DULBECCO et
al., Virol. 8:396 (1959)) suplementado con 4,5 mg/l de glucosa,
20 mm de glutamina y 20% de suero fetal bovino. Una cepa de ratón
endogámico ejemplar es el Balb/c.
Los procedimientos para producir anticuerpos
anti-L2 monoclonales también son bien conocidos en
la técnica. Véase NIMAN et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
80:4949-4953 (1983). Generalmente, se utiliza el
presente péptido de IL-2 o un péptido análogo bien
sea solo o conjugado con un portador inmunogénico, como el inmunogen
del procedimiento anteriormente descrito para producir anticuerpos
anti-IL-2 monoclonales. Los
hibridomas son cribados para medir la capacidad para producir un
anticuerpo que inmunoreaccione con el mutante o péptido análogo de
IL-2.
La presente invención contempla además el uso de
composiciones terapéuticas que sean útiles para llevar a la
práctica los procedimientos terapéuticos de esta invención. En una
forma de realización, la composición terapéutica incluye, en
mezcla, un excipiente (portador) farmacéuticamente aceptable y uno o
más de un péptido de IL-2, un péptido purificado o
un derivado del mismo o un polipéptido análogo del mismo o fragmento
del mismo, tal y como se describe en la presente memoria como un
ingrediente activo. En una forma preferente, la composición
terapéutica comprende un compuesto activo que contiene un péptido
purificado con capacidad de modular la fijación específica del la
presente IL-2 con el receptor
IL-2R.
La preparación de las composiciones terapéuticas
que contienen polipéptidos, análogos o fragmentos activos como
ingredientes activos se entiende bien en la técnica. Generalmente,
dichas composiciones se preparan como soluciones líquidas o
suspensiones inyectables, aunque, también pueden prepararse formas
sólidas adecuadas para una solución en líquido, o una suspensión en
líquido previamente a la inyección. El preparado también puede ser
emulsionado. El ingrediente terapéutico activo con frecuencia se
mezcla con excipientes que son farmacéuticamente aceptables y
compatibles con el ingrediente activo. Son excipientes adecuados,
por ejemplo, el agua, la salina, la dextrosa, el glicerol, el
etanol o similares y combinaciones de los mismos. Además, si se
desea, la composición puede contener menores cantidades de
sustancias auxiliares como agentes humectantes o emulsionantes,
agentes tampón de pH que mejoran la efectividad del ingrediente
activo.
El uso de las composiciones puede ser mediante
la administración en una manera compatible con la formulación de
dosificación, y en una cantidad terapéuticamente efectiva. La
cantidad a administrar depende del sujeto a tratar, la capacidad
del sistema inmune del sujeto para utilizar el ingrediente activo, y
el grado de modulación de la capacidad de fijación de
IL-2 deseada. Las cantidades de ingrediente activo
requeridas para su administración dependen de la opinión del médico
y son peculiares para cada individuo. Sin embargo, las dosis
adecuadas pueden encontrarse en un intervalo de entre
aproximadamente 0,1 y aproximadamente 20, preferentemente de entre
aproximadamente 0,5 y aproximadamente 10, y más preferentemente de
uno a varios, miligramos de ingrediente activo por kilogramo de
peso corporal del individuo por día y dependen de la vía de
administración. Los regímenes adecuados para la administración
inicial y las dosis de refuerzo o recuerdo son también variables,
pero están tipificados por una administración inicial seguida de
dosis repetidas a intervalos de una hora o más mediante una
posterior inyección u otra administración. Alternativamente, se
contemplan infusiones intravenosas continuas suficientes para
mantener concentraciones en la sangre de entre diez nanomolar y diez
micromolar.
El uso de las composiciones terapéuticas puede
ser mediante la administración en una composición que incluye
además una cantidad efectiva del agonista/antagonista de
IL-2 o análogo del mismo, y uno o más de los
siguientes ingredientes activos: un antibiótico, un esteroide.
Tal como se utiliza en la presente memoria,
"pg" hace referencia a picogramo, "ng" hace referencia a
nanogramo, "ug" o "\mug" hace referencia a microgramo,
"mg" hace referencia a miligramo, "ul" o "\mul"
hace referencia a microlitro, "ml" hace referencia a mililitro,
"l" hace referencia a litro.
Otra característica de esta invención es la
expresión de las secuencias de ADN descritas en la presente memoria.
Como bien es conocido en la técnica, las secuencias de ADN pueden
expresarse enlazando operativamente las mismas a una secuencia de
control de la expresión en un vector de expresión adecuado y
empleando ese vector de expresión para transformar un huésped
unicelular adecuado.
Por supuesto, dicho enlace operativo de una
secuencia de ADN de esta invención a una secuencia de control de la
expresión incluye, si no es que ya es parte de la secuencia de ADN,
la provisión de un codón de iniciación, ATG, en al marco de lectura
correcto aguas arriba de la secuencia de ADN.
Puede emplearse una gran variedad de
combinaciones huésped/vector de expresión al expresar las secuencias
de ADN de esta invención. Los vectores de expresión útiles, por
ejemplo; pueden consistir en segmentos de secuencias de ADN
cromosómico, no cromosómico y sintético. Los vectores adecuados
incluyen derivados de SV40 y plásmidos bacterianos conocidos, por
ejemplo, plásmidos de E. coli col El, pCR1, pBR322, pMB9 y
sus derivados, plásmidos como RP4; ADNs de fago, por ejemplo, los
numerosos derivados de fago \lambda, por ejemplo, NM989, y otro
ADN de fago, por ejemplo, M13 y ADN de fago filamentoso de cadena
simple; plásmidos de levadura como el plásmido 2 \mu o derivados
de los mismos; vectores útiles en células eucarióticas, como por
ejemplo vectores útiles en células de insectos o de mamíferos;
vectores derivados de combinaciones de plásmidos y ADNs de fago,
como por ejemplo plásmidos que han sido modificados para emplear ADN
de fago u otras secuencias de control de la expresión; y
similares.
Puede utilizarse cualquiera de una amplia
variedad de secuencias de control de la expresión (secuencias que
controlan la expresión de una secuencia de ADN operativamente
ligadas a la misma) en estos vectores para expresar las secuencias
de ADN de esta invención. Dichas secuencias de control de la
expresión útiles incluyen, por ejemplo, los promotores tempranos o
tardíos de SV40, CMV, vacunas, polioma o adenovirus, el sistema
lac, el sistema trp, el sistema TAC, el
sistema TRC, el sistema LTR, las principales regiones
de operadores y promotores de fago \lambda, las regiones de
control de la proteína de recubrimiento fd, el promotor para
3-fosfoglicerato quinasa u otras enzimas
glicolíticas, los promotores de fospatasa ácida (por ejemplo,
Pho5), los promotores de los factores de apareamiento \alpha de la
levadura, y otras secuencias conocidas para controlar la expresión
de genes de células procarióticas o eucarióticas o sus virus, y
diversas combinaciones de los mismos.
También son útiles una amplia variedad de
células huésped unicelulares al expresar las secuencias de ADN de
esta invención. Estos huéspedes pueden incluir huéspedes
eucarióticos y procarióticos bien conocidos, como por ejemplo las
cepas E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, hongos
como por ejemplo las levaduras, y células de animales, como por
ejemplo células CHO, R1.1, B-W y
L-M, células de riñón de mono verde africano (por
ejemplo, COS 1, COS 7, BSC1, BSC40, y BMT10), células de insectos
(por ejemplo, Sf9), y células de humano y células de planta en
cultivo de tejido.
Se podrá entender que no todos los vectores,
secuencias de control de la expresión y huéspedes funcionarán igual
de bien para expresar las secuencias de ADN de esta invención. Ni
tampoco funcionarán todos los huéspedes igual de bien con el mismo
sistema de expresión. Sin embargo, un experto en la materia podrá
seleccionar vectores, secuencias de control de la expresión y
huéspedes apropiados sin excesiva experimentación para completar la
expresión deseada sin alejarse del alcance de esta invención. Por
ejemplo, al seleccionar un vector, debe considerarse el huésped
debido a que el vector debe funcionar en el mismo. También se
considerarán el número de copia del vector, la capacidad de
controlar dicho número de copia, y la expresión de cualquier otra
proteína codificada por el vector, como por ejemplo marcadores
antibióticos.
\newpage
Al seleccionar una secuencia de control de la
expresión, normalmente se considerarán una diversidad de factores.
Entre estos se incluyen, por ejemplo, la fuerza relativa del
sistema, su control habilidad, y su compatibilidad con la
particular secuencia de ADN o gen a expresar, particularmente en lo
que se refiere a potenciales estructuras secundarias. Los huéspedes
unicelulares adecuados serán seleccionados mediante la consideración
de, por ejemplo, su compatibilidad con el vector elegido, sus
características secretoras, su capacidad para doblar proteínas
correctamente, y sus requerimientos de fermentación, así como la
toxicidad con respecto al huésped del producto codificado por las
secuencias de ADN a expresar, y la facilidad de purificación de los
productos de expresión.
Considerando estos y otros factores un experto
en la materia podrá construir una diversidad de combinaciones de
vector/secuencia de control de la expresión/huésped que expresarán
las secuencias de ADN de esta invención sobre la fermentación o en
cultivo animal a gran escala.
Se pretende además que para el uso terapéutico
de los péptidos según la invención, los análogos de péptido de
IL-2 puedan prepararse a partir de secuencias de
nucleótidos del complejo/la subunidad de proteína derivado/a dentro
del alcance de la presente invención. Los análogos, como los
fragmentos, pueden producirse, por ejemplo, mediante la digestión
con pepsina de material de IL-2. Otros análogos,
como por ejemplo las muteínas, pueden producirse mediante la
mutagénesis dirigida estándar de secuencias de codificación de
IL-2. Los análogos que muestran ka "actividad de
IL-2" como las moléculas pequeñas, funcionen como
promotores o como inhibidores, pueden identificarse mediante ensayos
in vivo e in vitro conocidos.
Tal como se he indicado anteriormente, una
secuencia de ADN que codifica péptidos de IL-2 puede
prepararse sintéticamente en vez de ser clonado. La secuencia de
ADN puede diseñarse con los codones apropiados para la secuencia de
aminoácidos del péptido de IL-2. En general, se
seleccionarán codones preferentes para el pretendido huésped si se
desea utilizar la secuencia para la expresión. La secuencia completa
se monta a partir de oligonucleótidos superpuestos preparados
mediante procedimientos estándares y montados en una secuencia de
codificación completa. Véase, por ejemplo, EDGE, Nature, 292:756
(1981); NAMBAIR et al., Science, 223:1299 (1984); JAY et
al., J. Biol. Chem., 259:6311 (1984).
Las secuencias de ADN sintético permiten la
adecuada construcción de genes que expresarán los análogos de
péptidos de IL-2 o "muteínas".
Alternativamente, las muteínas codificadoras de ADN pueden
producirse mediante la mutagénesis dirigida de
ADNc-s o genes nativos de IL-2, y
las muteínas pueden producirse directamente utilizando la síntesis
convencional de polipéptidos.
Se describe un procedimiento general para la
incorporación específica de sitio de aminoácidos no naturales en
proteínas en Christopher J. Noren, Spencer J.
Anthony-Cahill, Michael C. Griffith, Peter G.
Schultz, Science, 244:182-188 (April 1989). Este
procedimiento puede utilizarse para crear análogos con aminoácidos
no naturales.
De acuerdo con las aplicaciones de terapia
génica de la presente invención, puede utilizarse la preparación de
oligonucleótidos antisentido y ribozimas para modular la expresión
de IL-2 al nivel de traducción. Este procedimiento
utiliza ácido nucleico y ribozimas para bloquear la traducción de un
ARNm específico, bien sea mediante enmascarado del ARNm con un ácido
nucleico antisentido o clivando el mismo con una ribozima.
Los ácidos nucleicos antisentido son moléculas
de ADN o ARN que son complementarias a por lo menos una parte de
una molécula específica de ARNm (véase WEINTRAUB, 1990;
MARCUS-SEKURA, 1988). En la célula, se hibridizan a
dicho ARNm, formando una molécula de cadena doble. La célula no
traduce un ARNm en esta forma de cadena doble. Por tanto, los
ácidos nucleicos interfieren con la expresión del ARNm en la
proteína. Los oligómeros de aproximadamente quince nucleótidos y
moléculas que se hibridizan al codón de iniciación AUG serán
particularmente eficientes, dado que son fáciles de sintetizar y es
probable que presenten menos problemas que las moléculas más
grandes al introducirlos en las células. Los procedimientos
antisentido se han utilizado para inhibir la expresión de muchos
genes in vivo (MARCUS-SEKURA, 1988; HAMBOR
et al., 1988).
Las secuencias de ADN descritas en la presente
memoria pueden por tanto utilizarse para preparar moléculas
antisentido en contra, y ribozimas que clivan ARNm-s
para IL-2 o moléculas que estimulan o reducen la
secreción de IL-2 y sus ligandos.
La presente invención también se refiere a una
diversidad de aplicaciones de diagnóstico, incluyendo procedimientos
para detectar la presencia y la actividad de IL-2,
como referencia a su capacidad de provocar las actividades que son
mediadas por los presentes péptidos de IL-2. Tal
como se ha indicado anteriormente, el péptido de
IL-2 puede utilizarse para producir anticuerpos a sí
mismo mediante una diversidad de técnicas conocidas, y a
continuación dichos anticuerpos podrían ser aislados y utilizados
como en los ensayos de detección de la presencia de una actividad
particular de IL-2 y/o IL-2R en
presuntas células diana.
Tal y como se ha indicado en detalle
anteriormente, el anticuerpo o los anticuerpos para los péptidos de
IL-2 pueden producirse y aislarse mediante
procedimientos estándares que incluyen las bien conocidas técnicas
del hibridoma. Por comodidad, el anticuerpo o los anticuerpos para
el péptido de IL-2 serán referidos en la presente
memoria como Ab_{1} y el anticuerpo o los anticuerpos crecidos en
otras especies serán referidos como Ab_{2}.
\newpage
La presencia de IL-2 y péptidos
de IL-2 en células puede determinarse mediante los
habituales procedimientos inmunológicos aplicables a dichas
determinaciones. Son conocidos una serie de procedimientos útiles.
Tres de dichos procedimientos que son especialmente útiles utilizan
bien sea el péptido de IL-2 marcado con un marcador
detectable, el anticuerpo Ab_{1} marcado con un marcador
detectable, o el anticuerpo Ab_{2} marcado con un marcador
detectable. Los procedimientos pueden resumirse mediante las
siguientes ecuaciones en las que el asterisco indica que la
partícula está marcada, e "ILP" hace referencia al péptido de
IL-2:
Los procedimientos y su aplicación son todos
familiares a los expertos en la materia y por consiguiente pueden
utilizarse dentro del alcance de la presente invención. El
procedimiento "competitivo", Procedimiento A, se describe en
las patentes estadounidenses US nº 3.654.090 y US nº 3.850.752. El
Procedimiento C, procedimiento "sándwich", se describe en las
patentes estadounidenses US nº RE 31.006 y US nº 4.016.043. También
se conocen otros procedimientos como por ejemplo el del "doble
anticuerpo" o procedimiento "DASP".
En cada caso, el ILP forma complejos con uno o
más anticuerpos o parejas de fijación y un miembro del complejo es
marcado con un marcador que es detectable. El hecho de que se ha
formado un complejo y, si se desea, la cantidad del mismo, pueden
determinarse mediante procedimientos conocidos aplicables a la
detección de marcadores.
A partir de lo anteriormente indicado podrá
apreciarse que, una propiedad característica de Ab_{2} es que
reaccionará con Ab_{1}. Esto se debe a que Ab_{1} crecido en una
especie de mamífero ha sido utilizado en otras especies como un
antígeno para crecer el anticuerpo Ab_{2}. Por ejemplo, Ab_{2}
puede crecerse en cabras utilizando anticuerpos para conejo como
antígenos. Por tanto Ab_{2} sería un anticuerpo anticonejo
crecido en cabras. Para los fines de esta descripción y de las
reivindicaciones, Ab_{1} será referenciado como anticuerpo
primario o anti-ILP, y Ab_{2} será referenciado
como anticuerpo secundario o anti-Ab.
Los marcadores más comúnmente empleados para
estos estudios son elementos radioactivos, enzimas, químicos que son
fluorescentes cuando son expuestos a la luz ultravioleta, y
otros.
Se conoce una serie de materiales fluorescentes
y pueden utilizarse como marcadores. Entre estos se incluyen, por
ejemplo, fluoresceína, rodamina, auramina, Rojo Texas, azul AMCA y
Amarillo Lucifer. Un material particular de detección es el
anticuerpo anticonejo preparado en cabras y conjugado en
fluoresceína a través de un isotiocianato.
El péptido de IL-2 o su pareja o
parejas de fijación también pueden marcarse con un elemento
radioactivo o con una enzima. El marcador radioactivo puede
detectarse por cualquiera de los procedimientos de conteo
disponibles en la actualidad. El isótopo preferente puede
seleccionarse de entre ^{3}H ^{14}C ^{32}P ^{35}S,
^{36}Cl, ^{51}Cr ^{57}Co, ^{58}Co ^{59}Fe, ^{90}Y
^{125}I ^{131}I y ^{186}Re.
Los marcadores de enzima son asimismo útiles, y
pueden detectarse por cualquiera de las actualmente utilizadas
técnicas colorimétricas, espectrofotométricas,
fluoroespectrofotométricas, amperométricas o gasométricas. La
enzima se conjuga a la partícula seleccionada mediante reacción con
moléculas puente como carbodiimidas, diisocianatos, glutaraldehido
y similares. Se conocen y pueden utilizarse muchas enzimas que
pueden utilizarse en estos procedimientos. Las preferentes son
peroxidasa, \beta-glucuronidasa,
\beta-D-glucosidasa,
\beta-D-galactosidasa, ureasa,
glucosa oxidasa más peroxidasa y fosfatasa alcalina. Son
referenciadas las patentes estadounidenses US nº 3.654.090; US nº
3.850.752; y US nº 4.016.043 a modo de ejemplo por su descripción de
material de marcado alternante y procedimientos.
Un sistema de ensayo particular que puede
utilizarse de acuerdo con la presente invención es conocido como
ensayo receptor. En un ensayo receptor, el material a ensayar es
marcado apropiadamente y a continuación son inoculadas ciertas
colonias celulares de ensayo con una cantidad del material marcado y
no marcado tras los cual son llevados a cabo unos estudios de
fijación para determinar el grado al que se fija el material marcado
a los receptores celulares. De esta manera, pueden determinarse las
diferencias en afinidad entre materiales.
Una forma de realización adicional de esta
invención es la aplicación diagnóstica de kits de ensayo comerciales
para su uso por un especialista médico. El kit puede prepararse
para determinar la presencia o ausencia de capacidad de la
actividad predeterminada de IL-2R o de la actividad
predeterminada de IL-2 en presuntas células dianas.
De acuerdo con las técnicas de ensayo anteriormente analizadas, una
clase de dichos kits contendrá por lo menos el péptido de
IL-2 marcado o su pareja de fijación, por ejemplo un
anticuerpo específico del mismo, e instrucciones, por supuesto,
dependido del procedimiento seleccionado, por ejemplo,
"competitivo", "sándwich", "DASP" y similares. Los
kits pueden también contener reactivos periféricos como tampones,
estabilizadores, etc.
Por consiguiente, puede prepararse un kit de
ensayo para la demostración de la presencia o capacidad de las
células de una actividad de IL-2R predeterminada,
que comprende:
a) Una cantidad predeterminada de por lo menos
un componente inmunoquímicamente reactivo marcado obtenido mediante
la fijación directa o indirecta del presente factor peptídico de
IL-2 o una pareja de fijación específica del mismo,
a un marcador detectable;
b) Otros reactivos; y
c) Instrucciones de uso de dicho kit.
\vskip1.000000\baselineskip
Más específicamente, el kit de ensayo de
diagnóstico puede comprender:
a) Una cantidad conocida del péptido de
IL-2 tal como se ha descrito anteriormente (o una
pareja de fijación) generalmente fijado a una fase sólida para
formar un inmunosorbente, o alternativamente, fijado a un marcador
adecuado, o varios de dichos productos finales, etc. (o sus parejas
de fijación) uno de cada;
b) En caso de ser necesario, otros reactivos;
y
c) Instrucciones de uso de dicho kit de
ensayo.
\vskip1.000000\baselineskip
En otra variación, el kit de ensayo puede
prepararse y utilizarse para los fines anteriormente indicados,
operando según un protozoo predeterminado (por ejemplo,
"competitivo", "sándwich", "doble anticuerpo", etc.),
y comprende:
a) Un componente marcado que ha sido obtenido
mediante el acoplamiento del péptido 11-2 a un
marcador detectable;
b) Un o más reactivos inmuniquímicos adicionales
de los cuales por lo menos un reactivo es un ligando o un ligando
inmovilizado, cuyo ligando es seleccionado a partir de un grupo que
consiste en:
- i)
- Un ligando con capacidad de fijación con el componente marcado (a);
- ii)
- Un ligando con capacidad de fijación con una pareja de fijación del componente marcado (a);
- iii)
- Un ligando con capacidad de fijación con por lo menos uno de los componentes a determinar; y
- iv)
- Un ligando con capacidad de fijación con por lo menos una de las parejas de fijación de por lo menos uno de los componentes a determinar; y
c) Instrucciones para la realización de un
protocolo para la detección y/o determinación de uno o más
componentes de una reacción inmunoquímica entre el péptido de
IL-2 y una pareja de fijación específica del
mismo.
\vskip1.000000\baselineskip
Habiendo descrito la invención de forma general,
puede obtenerse un mayor entendimiento haciendo referencia a algunos
ejemplos específicos que son proporcionados en la presente memoria
únicamente con fines ilustrativos y que no son en modo alguno
limitativos a menos que se especifique lo contrario.
\vskip1.000000\baselineskip
Se inmunizaron repetidamente ratones hembra
BALB/c con una cantidad de entre 25 \mug y 50 \mug del péptido
1-30 por inyección. El péptido se acopló a la
portadora KLH y se inyectó con adyuvante completo de Freund
(primera inyección) o con adyuvante incompleto de Freund
(inyecciones posteriores). El título de la actividad
anti-IL-2 fue evaluado en un grupo
de cinco animales. Se utilizaron células de bazo del animal con la
mejor respuesta para la fusión con la línea celular
SP2-0. Se clonaron cuatro hibridomas con una
actividad anti-IL-2 específica. Los
anticuerpos monoclonales (mAbs) fueron purificados a partir del
correspondiente fluido ascítico mediante una precipitación de
sulfato de amonio. Se verificó la pureza de los reactivos (>80%)
mediante geles de poliacrilamida. Se caracterizaron las propiedades
de los mAbs. Se muestran únicamente resultados para el mAb
H2-8. Se determinaron el isótopo (IgG1) y el Kd (1,4
x 10^{-9} M) del mAb H2-8.
Se utilizaron como controles los mAbs 19B11
(IgG1) y 2C4 (IgG1) de ratón previamente caracterizados (MOREAU
et al (1995b) Mol. Immunol. 32:1047-1056;
REBOLLO et al (1992) Mol. Immunol.
29:119-130). Los mAbs 19B11 y 2C4 inhiben la
fijación de IL-2 a IL-2R\beta y
reconocen los péptidos 1-10 (véase abajo),
1-22 y 1-30. El 11B11 monoclonal de
rata (IgG, k) específico para IL-4 murina lo
proporcionó el Dr. W. PAUL (National Institute of Health, Bethesda
MD, USA) y se utilizó tal como se ha descrito anteriormente (MOREAU
et al. (1995b) Mol. Immunol.
32:1047-1056).
Primero se sometió a ensayo el efecto
inhibitorio del mAb H2-8 purificado sobre la
fijación de IL-2 marcada con ^{125}I. Sus efectos
se midieron en dos transfectantes derivados de una línea celular de
ratón que expresaba únicamente mIL-2R\gamma. Se
obtuvieron los transfectantes TS1\beta y TS1\alpha tras una
transfección con IL-2R\beta de humano y ADNc de
IL-2R\alpha de humano, respectivamente. Ambas
líneas celulares fijan la IL-2. El mAb
H2-8 inhibe la fijación de IL-2 a
TS1\beta sin afectar de manera significativa la fijación de
IL-2 a TS1\alpha (datos no mostrados).
Las propiedades de fijación del mAb
H2-8 fueron estudiadas con ELISA. Las placas fueron
recubiertas con IL-2 o con los péptidos
1-22 o 1-30. El mAb
H2-8 se fija a IL-2 y al péptido
1-30, pero no reconoce el péptido
1-22. Como control el mAb 19B11 (previamente
caracterizado) reconoció ambos péptidos (figura 2).
Se llevaron a cabo experimentos de inhibición de
la fijación para caracterizar adicionalmente la especificidad del
mAb H2-8. Las placas se recubrieron con
IL-2 y se utilizó una concentración del mAb
H2-8 con aproximadamente el 50% de la fijación
máxima. Se preincubó el H2-8 con diferentes péptidos
que incluyen cinco decapéptidos (1-10,
5-15, 10-20, 15-25,
20-30). Únicamente la IL-2 y el
péptido 1-30 fueron capaces de inhibir la fijación
del mAb H2-8 a IL-2. El péptido
1-30 fue el inhibidor más eficiente en estos
experimentos (figura 2). Este resultado es compatible con el hecho
de que el péptido aislado 1-30 se dobla en una
configuración de hélice \alpha (contenido de hélice \alpha del
50% \pm 7%) mientras que el péptido 1-22 (13%
\pm 5%) no se dobla según medición por dicroísmo circular. Por
tanto el péptido 1-30 puede adoptar una conformación
estructural única muy cercana a la de la IL-2
nativa. Como control la fijación del mAb 19B11 es inhibida por la
IL-2 pero también por los péptidos
1-10, 1-22 y 1-30.
Esto confirma que el epítopo del mAb 19B11 se encuentra próximo a
la posición terminal NH_{2} de IL-2 tal como se ha
sugerido anteriormente (MOREAU et al. (1995b) Mol. Immunol.
32:1047-1056).
\vskip1.000000\baselineskip
Los péptidos fueron sintetizados por medio de la
fase sólida progresiva utilizando el procedimiento de Boc/ácido
trifluoroacético (MERRIFIELD (1963) J. Am. Chem. Soc.
85:2149-2145), sobre una resina
p-metil-benzidrilamina (Applied
Biosystems) con un sintetizador de péptidos 430A de Applied
Biosystems.
\vskip1.000000\baselineskip
Fueron sometidos a ensayo la reactividad del mAb
H2-8 a diversos mutantes de IL-2
incluyendo un mutante en la posición 17 (Leu \rightarrow Asp),
cuatro mutantes en la posición 20 (Asp \rightarrow Asn; Asp
\rightarrow Lys; Asp \rightarrow Arg y Asp \rightarrow Leu) y
un doble mutante 17-20 (Leu17 \rightarrow Asp y
Asp20 \rightarrow Leu) mediante el análisis de transferencia
Western o "Western blot" (figura 3).
El mAb H2-8 no reconoce
mutaciones en la posición 20 o el doble mutante (THÈZE J (1994) Eur.
Cytokine Netw. 5:353-368; MOREAU et al.
(1995a) J. Immunol. 155:3401-3408; CHASTAGNER et
al. (1996) Eur. J. Immunol. 26:201-206; MACKAY
D (1992) Science 257:410-413). También se ve
afectada el reconocimiento de la mutación en la posición 17. Como
control positivo son mostrados los resultados obtenidos con el mAb
2C4 que reconoce un epítopo próximo al área terminal NH_{2} de
IL-2. Dado que este mAb (como 19B11) reconoce el
péptido 1-10 sin mutación alguna, su fijación a
IL-2 no se ve afectada. Asimismo las mutaciones en
las posiciones 125 y/o 127 no afectan a la fijación a los mAbs H28
y 2C4, y sirven como controles adicionales. Los experimentos ELISA
llevados a cabo con todos los mutantes soportan los datos obtenidos
con las transferencias Western o "Wstern blots" (datos no
mostrados).
El mAb H2-8 según es
caracterizado en el Ejemplo 1 y el 19B11 (descrito en Molec.
Immunol. (1995) 32:1047-1056) presentan propiedades
similares: ambos se fijan al extremo terminal NH_{2} de
IL-2 e inhiben específicamente la fijación de
IL-2 a la cadena IL-2R\beta. Dado
que ambos anticuerpos reconocen las secuencias situadas en el
péptido 1-30 resultaba interesante comparar la
relación entre los correspondientes epítopos. Se utilizaron placas
recubiertas con el mAb H2-8 para fijar el péptido
1-30. La fijación del mAb 19B11 a estas placas fue
positiva, indicando de esta manera que los epítopos de los mAbs
H2-8 y 19B11 no se superponen de manera
significativa. Se muestran varios controles llevados a cabo para
verificar estos resultados (figura 3). La fijación de 19B11 depende
estrictamente de la presencia del péptido 1-30 y del
recubrimiento mediante el mAb H2-8. Los resultados
obtenidos con el mAb 3H9 reconociendo el péptido
30-54 demostraron adicionalmente la especificidad de
los datos presentados en la figura 3.
Las células de TS1 expresan únicamente la cadena
IL-2R\gamma de ratón. Se obtuvieron células
TS1\beta tras la transfección de las células de TS1 con ADNc de
IL-2R\beta de humano clonado en el vector de
expresión pdKCR amablemente proporcionado por el Dr. T. TANIGUCHI
(Institute for Molecular and Cellular Biology, Tokyo University,
Japón). Se obtuvieron células TS1\alpha tras la transfección de
las células de TS1 con ADNc de IL-2R\alpha de
humano clonado en el vector de expresión pCMV4 proporcionado por los
Drs W.A. KUZIEL y W.C. GREENE (Gladstone Institute Virol./
Immunol., San Francisco CA, USA). Las células TS1\beta y
TS1\alpha fueron previamente caracterizadas (PITTON et al.
(1993) Cytokine 5:362-371). También se utilizaron
CTLL2 y YT para los estudios de fijación de
IL-2.
Todos los cultivos fueron realizados en un medio
completo compuesto por RPMI 1640 (BioProducts, Walkerville, MD),
10% de FCS inactivado por calor (Serovial, Vogelgsun, Francia), 2 mM
de glutamina, 100 unidades/ml de penicilina, 100 \mug/ml de
estreptomicina, 50 mM de
2-\beta-mercaptoetanol
(2\betaME). Las líneas celulares de TS1\beta y TS1\alpha
fueron crecidas como células de TS1 en un medio completo
suplementado con supernadante de baculovirus recombinante que
expresa proteínas de IL-9 murina (DIB 349)
(UYTTENHOVE et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
85:6934-6938).
Las células TS1\beta fueron cultivadas
(10^{4} células/pocillo) en placas de microtitulación con fondo
plano de 96 pocillos con un volumen final de 0,2 ml. Se sometieron a
ensayo diversas concentraciones de rIL-2 de humano,
muteínas de IL-2 o rIL-9 de ratón.
Con el fin de analizar el efecto inhibitorio de los mAbs, se
mezclaron diferentes concentraciones de estos reactivos en los
pocillos de cultivo con las respectivas linfoquinas durante 30
minutos a baja temperatura antes de añadir las células. Se
estudiaron los efectos inhibitorios de la muteína 20 Leu (descrita
en Cytokine (1997) 9:488-498, que se incorpora en la
presente memoria en su totalidad por referencia) preincubando las
células (30 minutos a 4ºC) con la concentración indicada de
inhibidor antes de añadir IL-2 o
IL-9 a los pocillos. Los cultivos fueron pulsados
con 0,5 \muCi/pocillo de (^{3}H) TdR tras 36 horas de incubación
y cosechados 15 horas después.
Las propiedades biológicas del mAb
H2-8 fueron evaluadas sobre la proliferación de la
línea celular de TS1\beta dependiente de IL-2 o
IL-9 (figura 4). En estos experimentos se utilizó el
mutante de IL-2, IL-2 Pro^{125}
(Cys \rightarrow Pro). Esta mutación reduce sensiblemente la
afinidad de IL-2 por IL-2R sin
afectar la proliferación máxima obtenida al utilizar mayores
concentraciones de mutante.
La figura 4 muestra que las diferentes
concentraciones del mAb H2-8 reducen la
proliferación de TS1\beta dependiente de IL-2. Se
observa un cambio progresivo de la curva de titulación o titración
de IL-2 con concentraciones crecientes del mAb
H2-8. Los efectos inhibitorios del mAb
H2-8 son comparables a los obtenidos con el mAb
19B11, para el que también se descubrió que inhibe la proliferación
de células con IL-2R de gran afinidad (MOREAU et
al. (1995b) Mol. Immunol. 32:1047-1056). La
adición tanto del mAb H2-8 como del 19B11 elimina
completamente la proliferación dependiente de IL-2
incluso a dosis muy elevada de IL-2.
Como controles la figura 4 muestra que el mAb
11B11 (específico para la IL-4 de ratón) no afecta a
la proliferación dependiente de IL-2 de TS1\beta.
La proliferación de TS1\beta inducida por IL-9
tampoco se ve afectada ni por H2-8 ni por 19B11.
El ensayo de fijación de IL-2 se
realizó tal y como ya ha sido descrito anteriormente (MOREAU et
al. (1995b) Mol. Immunol. 32: 1047-1056).
Primero se estudió la fijación de IL-2 marcada con
^{125}I a diferentes líneas celulares. Se realizaron experimentos
de inhibición a concentraciones de IL-2 marcada con
^{125}I con una fijación máxima de entre el 50% y el 70%. Fueron
analizados los efectos de las diferentes muteínas tras 1 hora de
preincubación a 4ºC seguido de una incubación con
IL-2 marcada con ^{125}I (3 horas a 4ºC). En cada
experimento se determinó una fijación no específica. Los datos se
expresaron como % de la capacidad inhibitoria de las diferentes
muteínas versus proteína de tipo salvaje.
El péptido aminoterminal de IL-2
que incluye los aa 1 a 30 tiene un peso molecular de 3422.
Los estudios de dicroísmo circular llevados a
cabo con IP130 indican que a 20ºC, en tampón fosfato (20 mM, pH
7,2), el 50% de los residuos se encuentran en una configuración de
hélice \alpha.
También se estudió la estructura cuaternaria del
péptido IP130 por equilibrio de sedimentación - difusión. A una
concentración por encima de 5 x 10^{-6}M, la mayoría de las
moléculas tienen forma tetramérica (en equilibrio con un complejo
octomérico).
La secuencia de aminoácidos 1 a 30 muestra 7
leucinas y 2 isoleucinas entre los primeros 20 residuos. La
periodicidad de estos aa así como los resultados anteriormente
indicados sugieren un modelo estructural para IP130 que
comprendería 4 péptidos organizados en 4 hélices \alpha. En este
modelo las cadenas laterales de leucinas e isoleucinas aparecen en
la misma cara. Esta cara es hidrofóbica y cuatro de estas caras
formarían un núcleo hidrofóbico inaccesible al agua. A elevadas
concentraciones los péptidos 1-10 tienden a
dimerizar y esto explicaría la formación de péptidos
octaméricos.
Se estudió la fijación de IP130 a una cadena
IL-2R\beta soluble. Se ha descubierto que la
cadena IL-2R\beta soluble es dimérica en
solución. A partir de los resultados, se ha propuesto un modelo
estructural: el complejo incluiría cuatro péptidos IP130 y dos
cadenas IL-2R\beta
((IP130)4/(IL-2R\beta)_{2}).
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevaron a cabo estudios con una línea
celular murina transfectada por un gen de
IL-2R\beta de humano (TS1\beta) o con una línea
celular leucémica de humano dependiente de IL-2 (Kit
225 del Dr. T. HORI).
IP130 estimula la proliferación de TS1\beta en
la ausencia de IL-2. En la presencia de
IL-2 se observa una gran sinergia con el péptido.
Ambas actividades se obtienen a concentraciones comparables
(IC-50 \simeq \muM).
IP130 actúa únicamente sobre líneas celulares
que expresan la cadena IL-2R\beta de humano. Esto
concuerda con estudios previos que muestran que la cadena
IL-2R\beta murina no se fija a
IL-2 (CHASTAGNER et al. 1996, Eur. J.
immunol. 26:201-6). Por consiguiente, las líneas
celulares murinas clásicas (C30-1, CTLL,
HT-2, ...) habitualmente utilizadas para someter a
ensayo la actividad IL-2 permanecen insensible a los
efectos de IP130. Además el mAb bloqueante de
IL-2R\beta antihumano neutraliza los efectos de
IP130.
Solo el péptido induce la fosforilación de las
proteínas en la línea celular Kit 225. Sobre el patrón de las
proteínas fosforiladas, la quinasa Shc se reconoce fácilmente. Tras
una inmunoprecipitación específica y transferencia o
"blotting" con el mAb 4G10 (anti-Ptyr), la
cadena IL-2R\beta fosforilada se identifica en
lisados a partir de la línea celular Kit 225 estimulada por IP130.
También se observa una inducción de c-myc que
depende de la fosforilación IL-2R\beta tras la
estimulación con IP130. STAT-3 y
STAT-5 no se activan tras la estimulación con IP130
dado que la cadena IL-2R\gamma no está implicada
en la interacción de IP130 con Kit 225.
\vskip1.000000\baselineskip
La cadena IL-2R\beta se
expresa constitutivamente mediante células NK de humano de todos los
donantes estudiados (DAVID et al., Blood 91:
165-172, 1998). Los monocitos únicamente expresan la
cadena IL-2R\gamma. Otros linfocitos no expresan
ni la cadena IL-2R\beta ni la
IL-2R\alpha ni la IL-2R\gamma
(DAVID et al., 1998).
IP130 induce a que las células NK entren al
ciclo celular.
IP130 también ha sido analizado sobre la
generación de LAK in Vitro. IP130 induce la actividad LAK
como en el ensayo con las dianas K562.
Al mAb H2-8 fue aislado tras la
inmunización con el péptido 1-30 de
IL-2. Reconoce tanto la IL-2 como el
péptido 1-30, pero no péptidos más cortos que
cubren la misma región (figura 2). Este resultado sugiere que el mAb
H2-8 reconoce un epítopo conformacional en la
región del extremo N-terminal de
IL-2, y que este epítopo es mimetizado por el
péptido 1-30. De hecho, las mediciones del dicroísmo
circular revelan una fracción significativa de la estructura de la
hélice \alpha para el péptido 1-30. Además, el
H2-8 puede fijarse al péptido 1-30
incluso en la presencia del mAb 19B11 (que reconoce un epítopo
lineal dentro de la parte no helicoidal del péptido
1-30), pero no reconoce los mutantes de
IL-2 en la posición 20 (en le centro de la
hélice-\alpha A) según lo determina el análisis
de transferencia Western o "Western blot" o, ELISA (figura 3 y
otros datos no mostrados). El anticuerpo también inhibe la
bioactividad de IL-2 sobre células TS1\beta
(figura 4), cuya proliferación es estrictamente dependiente de la
expresión de la cadena IL-2R\beta de humano.
Consideradas a la vez, estos resultados demuestran que el mAb
H2-8 reconoce un epítopo alrededor de Asp20 de
IL-2, una región que influye directamente sobre la
interacción de la citocina con la cadena
IL-2R\beta.
\newpage
Esta lista de referencias citadas por el
solicitante es solamente para conveniencia del lector. La misma no
forma parte del documento de patente europea. A pesar de que se ha
tenido mucho cuidado durante la recopilación de las referencias, no
deben excluirse errores u omisiones y a este respecto la OEP se
exime de toda responsabilidad.
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\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> INSTITUTO PASTEUR
\hskip1cmTHEZE, Jacques
\hskip1cmECKENBERG, Ralph
\hskip1cmMOREAU, Jean-Louis
\hskip1cmGOLDBERG, Michel
\hskip1cmROSE, Thierry
\hskip1cmALZARI, Pedro
\hskip1cmMAZIE, Jean-Claude
\vskip0.400000\baselineskip
<120> NUEVOS PÉPTIDOS DE
IL-2 Y DERIVADOS DE LOS MISMOS Y SU UTILIZACIÓN COMO
AGENTES TERAPÉUTICOS
\vskip0.400000\baselineskip
<130> BLOcb226/79PCT
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 09/116,594
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1999-07-16
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 93
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 90
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
Claims (20)
1. Procedimiento para la detección in
vitro de la presencia o actividad de IL-2R, en
el que dicho IL-2R se mide de la siguiente
manera:
a) Contactando (1) una muestra biológica de un
mamífero en el que se sospecha de la presencia o actividad de dicho
IL-2R con (2) un péptido que consiste en la
secuencia SEC ID NO.:2 o SEC ID NO.:4 bajo las condiciones que
permiten que se produzca la fijación de dicho IL-2R
a dicho péptido; y
b) Detectando si ha ocurrido o no la fijación
entre dicho IL-2R de dicha muestra y el péptido que
consiste en la secuencia SEC ID NO.:2 o SEC ID NO.:4.
2. Procedimiento de inhibición de la actividad
de un IL-2R que comprende contactar dicho
IL-2R con una cantidad del péptido que consiste en
una secuencia SEC ID NO.:2 o SEC ID NO.:4 suficiente para inhibir la
fijación de IL-2 a dicho IL-2R bajo
condiciones que permiten que se produzca la fijación de dicho
péptido a dicho IL-2R.
3. Uso de un péptido que consiste en una
secuencia SEC ID NO.:2 o SEC ID NO.:4 útil para inducir en un
paciente seleccionado actividades de IL-2 útiles
seleccionadas de entre el grupo que consiste en la estimulación de
células CD4, estimulación de células CD8+, estimulación de células
NK, inducción de actividad antiviral o antitumoral de la
fosforilación de SHC e inducción de la vía o ruta SHK/MAPK, para la
preparación de un medicamento.
4. Uso de un vector que contiene una secuencia
de ADN que codifica un péptido que consiste en una secuencia SEC ID
NO.:2 o SEC ID NO.:4 para la preparación de un medicamento útil para
tratar una paciente deficiente en actividad
IL-2.
5. Uso según la reivindicación 3 en el que dicho
péptido que consiste en una secuencia SEC ID NO.:2 o SEC ID NO.:4 se
incluye en una mezcla que comprende una citocina.
6. Uso según la reivindicación 5 en el que la
citocina es IL-2, IL-4,
IL-9, IL-7 o
IL-15.
7. Uso según la reivindicación 6 en el que la
cantidad de IL-2, administrada por inyección, es de
1 x 10^{6} unidades internacionales.
8. Uso de un péptido que consiste en la
secuencia homóloga de SEC ID NO.:2 o SEC ID NO.:4, estando dicho
péptido codificado mediante una secuencia de nucleótidos que
presenta por lo menos aproximadamente el 75% de los nucleótidos de
la secuencia que codifica SEC ID NO.:2 o SEC ID NO.:4, difiriendo
dicho péptido de SEC ID NO.:2 o SEC ID NO.:4 en uno o más cambios
conservadores, en el que dicha secuencia homóloga muestra
prácticamente la misma actividad o características de fijación o los
dos que la secuencia SEC ID NO.:2 o SEC ID NO.:4, útil para inducir
en un paciente seleccionado actividades de IL-2
útiles, seleccionadas de entre un grupo que consiste en la
estimulación de células CD4, estimulación de células CD8+,
estimulación de células NK, inducción de actividad antiviral o
antitumoral de la fosforilación de SHC e inducción de la vía o ruta
SHK/MAPK, para la preparación de un medicamento.
9. Uso de un péptido según la reivindicación 8,
caracterizado porque dicho cambio conservador es el cambio de
grupos R no polares por otros grupos R no polares en aminoácidos del
mismo, para la preparación de un medicamento útil para inducir en un
paciente seleccionado actividades de IL-2 útiles,
seleccionadas de entre un grupo que consiste en la estimulación de
células CD4, estimulación de células CD8+, estimulación de células
NK, actividad antiviral, actividad antitumoral, inducción de la
fosforilación de SHC e inducción de la vía o ruta SHK/MAPK.
10. Uso de un péptido según la reivindicación 8,
caracterizado porque dicho cambio conservador es el cambio de
grupos R polares no cargados por otros grupos R polares no cargados
en aminoácidos del mismo, para la preparación de un medicamento útil
para inducir en un paciente seleccionado actividades de
IL-2 útiles, seleccionadas de entre un grupo que
consiste en la estimulación de células CD4, estimulación de células
CD8+, estimulación de células NK, actividad antiviral, actividad
antitumoral, inducción de la fosforilación de SHC e inducción de la
vía o ruta SHK/MAPK.
11. Uso de un péptido según la reivindicación 8,
caracterizado porque dicho cambio conservador es el cambio de
grupos R polares cargados por otros grupos R polares cargados en
aminoácidos del mismo, para la preparación de un medicamento útil
para inducir en un paciente seleccionado actividades de
IL-2 útiles, seleccionadas de entre un grupo que
consiste en la estimulación de células CD4, estimulación de células
CD8+, estimulación de células NK, actividad antiviral, actividad
antitumoral, inducción de la fosforilación de SHC e inducción de la
vía o ruta SHK/MAPK.
12. Uso de un péptido según la reivindicación 8,
caracterizado porque dicho cambio conservador corresponde a
una Lys sustituida por Arg, o viceversa de manera que se mantiene
una carga positiva, para la preparación de un medicamento útil para
inducir en un paciente seleccionado actividades de
IL-2 útiles, seleccionadas de entre un grupo que
consiste en la estimulación de células CD4, estimulación de células
CD8+, estimulación de células NK, actividad antiviral, actividad
antitumoral, inducción de la fosforilación de SHC e inducción de la
vía o ruta SHK/MAPK.
13. Uso de un péptido según la reivindicación 8,
caracterizado porque dicho cambio conservador corresponde a
un Glu sustituido por Asp, o viceversa de manera que se mantiene una
carga negativa, para la preparación de un medicamento útil para
inducir en un paciente seleccionado actividades de
IL-2 útiles, seleccionadas de entre un grupo que
consiste en la estimulación de células CD4, estimulación de células
CD8+, estimulación de células NK, actividad antiviral, actividad
antitumoral, inducción de la fosforilación de SHC e inducción de la
vía o ruta SHK/MAPK.
14. Uso de un péptido según la reivindicación 8,
caracterizado porque dicho cambio conservador corresponde a
una Ser sustituida por Thr, de manera que se mantiene un grupo OH
libre, para la preparación de un medicamento útil para inducir en un
paciente seleccionado actividades de IL-2 útiles,
seleccionadas de entre un grupo que consiste en la estimulación de
células CD4, estimulación de células CD8+, estimulación de células
NK, actividad antiviral, actividad antitumoral, inducción de la
fosforilación de SHC e inducción de la vía o ruta SHK/MAPK.
15. Uso de un péptido según la reivindicación 8,
caracterizado porque dicho cambio conservador corresponde a
una Gln sustituida por Asn, de manera que se mantiene un grupo
NH_{2} libre, para la preparación de un medicamento útil para
inducir en un paciente seleccionado actividades de
IL-2 útiles, seleccionadas de entre un grupo que
consiste en la estimulación de células CD4, estimulación de células
CD8+, estimulación de células NK, actividad antiviral, actividad
antitumoral, inducción de la fosforilación de SHC e inducción de la
vía o ruta SHK/MAPK.
16. Uso de un péptido que consiste en una
secuencia homóloga de SEC ID NO.:2 o SEC ID NO.:4, estando dicho
péptido codificado mediante una secuencia de nucleótidos que
presenta por lo menos aproximadamente el 75% de los nucleótidos de
la secuencia que codifica SEC ID NO.:2 o SEC ID NO.:4 y que presenta
una actividad que comprende la inducción de la fosforilación de SHC;
o la inducción de la vía o ruta SHK/MAPK, para la preparación de un
medicamento útil para inducir en un paciente seleccionado
actividades de IL-2 antivirales o antitumorales
útiles.
17. Uso según las reivindicaciones 8 a 16, en el
que dicho péptido se incluye en una mezcla que comprende
citocina.
18. Uso según las reivindicaciones 8 a 16, en el
que dicho péptido se encuentra en una cantidad capaz de inducir
dichas actividades útiles, seleccionadas del grupo que consiste en
la estimulación de células CD4, estimulación de células CD8+,
estimulación de células NK, actividad antiviral, actividad
antitumoral, inducción de la fosforilación de SHC e inducción de la
vía o ruta SHK/MAPK.
19. Uso según la reivindicación 17 en el que la
citocina es IL-2, IL-4,
IL-9, IL-7 o
IL-15.
20. Uso según la reivindicación 19 en el que la
cantidad de IL-2, administrada por inyección, es de
1 x 10^{6} unidades internacionales.
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