JP2013139458A - ヒトil−12に対する抗体 - Google Patents
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Abstract
【課題】ヒトIL-12生物活性の中和に関して既知のヘテロダイマー特異的IL-12モノクローナル抗体より高い効力およびより大きい有効性を有するヒトIL-12抗体の提供。
【解決手段】ヒトIL-12 p75ヘテロダイマーの1つ以上のエピトープを認識するが、p40サブユニット単独には結合しないヘテロダイマー特異的抗体。ヘテロダイマー特異的IL-12抗体は、ヒトIL-12生物活性の中和に関するその効力と類似の効力でアカゲザルIL-12生物活性を中和し、そのため有用なIL-12拮抗剤となる。
【選択図】なし
Description
(1)ノックアウト哺乳動物、例えば、IL-12 p35サブユニットおよび/またはIL-12 p40サブユニットをコードする遺伝子を欠損するマウスを、ヒトIL-12 p75ヘテロダイマーによって免疫する段階;
(2)免疫したノックアウト哺乳動物から、脾細胞またはリンパ節細胞のようなIL-12に対する抗体を発現するよう活性化されている細胞を選択する段階;
(3)回収した細胞を骨髄細胞と融合させてハイブリドーマ細胞を形成する段階;
(4)例えば標識もしくは非標識ヒトIL-12を用いるELISAまたは免疫沈降アッセイ法を用いることによって、抗ヒトIL-12抗体の存在下でハイブリドーマコンディションド(conditioned)培地を調べることによって、ヒトIL-12を認識する抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を選択する段階;および
(5)抗体がp75へテロダイマーに結合するか否かを決定するために、抗体をヒトIL-12 p75ヘテロダイマーと共にインキュベートすることによって、そして次にp40サブユニットの存在によって、p75ヘテロダイマーの抗体結合または捕獲が阻害されるか否かを決定するために、p40サブユニットの存在下および非存在下でヒトIL-12 p75ヘテロダイマーと抗体とをインキュベートすることによって、抗体がp75 IL-12ヘテロダイマーのエピトープと免疫学的に反応するが、p40サブユニットのエピトープとは免疫学的に反応しないことを示すことによって、p75ヘテロダイマー特異的であるか否かを決定する段階。例えば、競合的免疫沈降アッセイ(本明細書の実施例7を参照のこと)を用いて、本明細書に記述の抗体がヒトIL-12のp75ヘテロダイマーと選択的に免疫学的に反応するが、p40サブユニット単独とは免疫学的に反応しないことを示すことができる。
実施例1
天然のヒトIL-12の調製
健常なボランティアドナーから、保存剤不含ヘパリン(シグマ社、セントルイス、ミズーリ州、アメリカ)を含むシリンジに血液を採取して、最終濃度を〜5単位ヘパリン/ml血液とした。ヘパリン化血液1容量を、0.1 mM非必須アミノ酸、60 μg/ml塩酸アルギニン、10 mM HEPES緩衝液、2 mM L-グルタミン、100 U/mlペニシリン、100 μg/mlストレプトマイシン(全て、ギブコBRL社、グランドアイランド、ニューヨーク州、アメリカから入手可能)、50 μM 2-メルカプトエタノール(フィッシャー・サイエンティフィック社、フェアローン、ニュージャージー州、アメリカ)、および1 mg/mlデキストロース(フィッシャー社)を添加した、RPMI 1640およびダルベッコ改変イーグル培地の1:1混合液を含む培地9容量で希釈した。この混合液にヒトインターフェロン-γ、20 U/ml(ペプロテックインク、ロッキーヒル、ニュージャージー州、アメリカ)およびパンソルビン(Pansorbin)細胞(ホルマリン固定黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、コワン(Cowan)株;カルビオケム社、サンジエゴ、カリフォルニア州、アメリカ)を最終希釈4000倍で加えた。(培養において使用する前に、パンソルビン(Pansorbin)細胞をダルベッコ燐酸緩衝生理食塩液(ギブコBRL社)によって2回洗浄し、製造元によって供給されたものと同じ容量にした。)得られた細胞懸濁液を162 cm2組織培養フラスコ(コスター社、ケンブリッジ、マサチューセッツ州、アメリカ)に80 ml/フラスコの割合で加え、フラスコを5%CO2/95%空気の湿潤大気中で37℃で24時間水平にしてインキュベートした。次に培養上清液を遠心によって回収して、0.22 μmフィルター(コスター社)を通過させて滅菌した。IL-12ヘテロダイマープラスIL-12 p40は、表面への非特異的吸着による蛋白質の損失を最小限にするために、溶出緩衝液に0.01%ゼラチン(シグマ社)を含むことを除いては、アカゲザルのIL-12の精製に関する下記と同じように、2-4A1プロテインGセファロース(PGS)カラムを用いたイムノアフィニティクロマトグラフィーによって培養上清から精製した。溶出液を100〜200倍量のダルベッコ燐酸緩衝生理食塩液に対して4〜6時間透析した後、100 μg/mlゲンタマイシンを含むRPMI 1640の同じ容量に対して一晩透析した。透析した溶出液を0.22 μmフィルターを通過させることによって滅菌して、IL-12ヘテロダイマーおよびIL-12 p40(ゲイトリー、チッゾナイト、およびプレスキー(Gately, M. K., Chizzonite, R. and Presky, D. H.)の「ヒトおよびマウスインターロイキン12の測定(Measurement of human and mouse interleukin 12)」「免疫学の現行プロトコール(Current Protocols in Immunology)」第1巻、コリガン、クルイスビーク、マルグリース、シェバック&ストローバー(J. E. Colligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach, and W. Strober)編、ジョン・ウィリー&サンズインク、ニューヨーク、1995、6.16.1〜6.16.15ページ)の含有量ならびにIL-12生物活性(ibid)に関してELISAによってアッセイした。典型的に、IL-12 p40:IL-12ヘテロダイマーの重量比はELISAによって測定すると、約5:1であった。
組換え型ヒトIL-12の産生
組換え型ヒトIL-12は、米国特許第5,536,657号に述べたように調製され、特徴付けられおよび生成された。
アカゲザルIL-12の作製
アカゲザルIL-12のp35およびp40サブユニットcDNA配列(ビリンガー(F. Villinger)ら、J. Immunol. 155:3946〜3954(1995))を、標準的な方法(「分子生物学の現行プロトコール((Current Protocols in Molecular Biology)」、アウスユベール(Ausubel)編、J. ウィリー&サンズインク、ニューヨーク(1993))を用いて2つの異なるプラスミド上でCHO-dhfrマイナス細胞において発現するように操作した。増幅していない細胞集団からクローンを得て、そのIL-12産生をIL-12特異的ELISAによってモニターした。最適に産生するクローンを選択して、CHO血清不含培地(シグマ社)において増殖するよう適合させた。次に、蛋白質産生を目的として細胞をスピナ培養で増殖させた。アカゲザルIL-12を抗体アフィニティクロマトグラフィーによって上清から精製した。10 mMジメチルピメリミデート(ピアス社、ロックフォード、イリノイ州、アメリカ)を用いて、抗ヒトIL-12 p40 mAb 2-4A1の10 mgを1 mg mAb/mlゲルの密度でプロテインGセファロース(ファルマシア・バイオテック社)にクロスリンクさせることによってアフィニティカラムを作製した(スターン&ポドラスキ(Stern and Podlaski)、「蛋白質化学の技術(Tech. In Protein Chem.)」 IV巻、アカデミックプレス、ニューヨーク、353〜360(1993))。アカゲザルIL-12を含む血清不含CHO上清を0.2 μmフィルターを通じて濾過し、PBS(pH 7.2)で予め平衡化した10 ml 2-4A1 PGSカラムに直接ローディングした。流速は1 ml/分であった。カラムをPBSの10倍量で洗浄して、0.1 Mグリシン塩酸、0.15 M NaCl(pH3.0)で溶出した。溶出物を直ちに3 Mトリス塩酸(pH 9)で中和した。アフィニティカラムは、ブラッドフォードおよびSDS-PAGEによって測定すると、過剰量のp40モノマーを含めて、流したアカゲザルIL-12の〜2 mgsに結合することができた。その他の混入物質は痕跡レベルであった。アカゲザルIL-12を濃縮してさらに精製するために、IL-12含有溶出物を20 mM 燐酸ナトリウム(pH 7)に対して透析し、同じ緩衝液で慣らしたS-セファロースカラム上にローディングした。流速は1 ml/分であった。全ての蛋白質を結合させた。カラムを燐酸緩衝液10倍量で洗浄して、0.3 M NaClを含むリン酸緩衝液で溶出した。溶出したプールは、バイオウィッタッカー社のLALキットを用いてエンドトキシンの有無をアッセイし、蛋白質の10 EU/mg未満であることが判明した。mAb 2-4A1を検出物質として用いるウェスタンブロット分析によって、〜80 kDaでのアカゲザルのIL-12ヘテロダイマー並びに40 kDaでp40モノマーの明らかな過剰量が示された。クーマシー染色を施したSDS-PAGEによって、〜70 kDaでのp80ヘテロダイマーと同じ強度のさらなる顕著な蛋白質が示された。80 kDaおよび70 kDa蛋白質はいずれも、2-メルカプトエタノールによる処理後、そのモノマー型に還元するが、後者の蛋白質のバンドは、mAb 2-4A1とは反応しない。
ハイブリドーマ抗体の調製、特徴付け、および精製
遺伝背景がBalb/cでIL-12 p35サブユニット遺伝子に変異を有するマウスを、マットナー(Mattner, F.)ら、Eur. J. Immunol. 26:1553〜1559(1996)に記述のように作製した。精製した組換え型ヒトIL-12 5μgをフロイントの完全アジュバントと共に腹腔内投与することによって、IL-12 p35欠損マウスを免疫した。続く2.5ヶ月間に、マウスにヒトIL-125μgをフロイントの不完全アジュバントと共に腹腔内注射を3回行った。ヒトIL-12 75 μgのPBS溶液の最後の注射(50 μg i.p.および25 μg i.v.)を脾臓摘出の3日前および2日前に行い、その後ヒトIL-12 50 μgのPBS溶液を脾臓摘出の前日に腹腔内注射した。これらのマウスから脾細胞を回収して、オイ&ヘルツェンベルグ(Oi and Herzenberg、「細胞免疫学の選り抜きの方法(Selected Methods in Cellular Immunology)」、ミシェル&シイギ(Mishell and Shiigi)編、W. H. フリーマン&カンパニー、ニューヨーク、1980、351〜372ページ)の方法に従って、50%w/vポリエチレングリコール1500(ベーリンガーマンハイム社)を用いてマウス骨髄腫SP2/0細胞と1:1の比で融合した。96ウェルクラスタープレートにおいて、10%FBS(ハイクローン社)、100 U/mlペニシリンG(バイオウィッタッカー社)、100μg/mlストレプトマイシン(バイオウィッタッカー社)、250 ng/mlファンギゾン(バイオウィッタッカー社)、2 mMグルタミン(バイオウィッタッカー社)、100 μg/ml硫酸ゲンタマイシン(バイオウィッタッカー社)、50 μM 2-メルカプトエタノール(バイオラド社)、100 μMヒポキサンチン(シグマ社)、400 nMアミノプテリン(シグマ社)、16 μMチミジン(シグマ社)、および2.5%P388D1上清(ノーダン(Nordan, R. P.)ら、J. Immunol., 139:813(1987)による記述通りに調製)を添加したIMDM中で、融合細胞を60,000個/ウェルの密度で播種した。下記のように125I-標識ヒトIL-12の免疫沈降によってハイブリドーマの上清に特異的抗ヒトIL-12抗体が存在するか否かをアッセイした。抗ヒトIL-12抗体を分泌するハイブリドーマ細胞株を限界希釈によってクローニングした。既に記述されているように(レイク(Reik, L.)ら、J. Immunol. Methods, 100:123〜130(1987))、カプリル酸および硫酸アンモニウムで連続処理することによって、抗体を腹水から精製した。
125I-標識ヒトIL-12の調製
組換え型ヒトIL-12は、本明細書に参照として組み入れられる、チッゾナイト(Chizzonite)ら、J. Immunol. 147:1548〜1556(1991)およびチッゾナイト(Chizzonite)ら、J. Immunol. 148:3117〜3124(1992)に既に記載されている改変されたヨードゲン(ピアスケミカルカンパニー)法を用いて、比活性約2200 Ci/mmolとなるように放射標識した。ヨードゲンをクロロホルムに溶解して、0.05 mgを12×15 mmホウケイ酸ガラス管中で乾燥させた。放射標識するために、1.0 mCi Na[125I](アマシャム社、シカゴ、イリノイ州、アメリカ)を、トリスヨウ素化緩衝液(25 mMトリス塩酸(pH 7.5)、0.4 M NaCl、および1 mM EDTA)0.05 mlを含むヨードゲンコーティングチューブに加えて、室温で6分間インキュベートした。活性化125I溶液を、IL-12(31.5 μg)のトリスヨウ素化緩衝溶液0.1 mlを含むチューブに移して、室温で6分間インキュベートし、反応させた。インキュベート終了時、ヨードゲン停止緩衝液(10 mg/mlチロシン、10%グリセロールのダルベッコPBS溶液(pH 7.40))0.05 mlを加えて5分間反応させた。混合液を、1%(w/v)BSAのトリス・ヨウ素化緩衝溶液1.0 mlで希釈して、クロマトグラフィーのためにバイオゲルP10DG脱塩カラム(バイオラドラボラトリーズ(BRL))に載せた。標識した蛋白質のピーク量を含む分画(1 ml)を合わせて、1%(w/v)BSAのトリス・ヨウ素化緩衝溶液で1×108 cpm/mlに希釈した。TCAによって沈殿可能な放射活性(10%TCA最終濃度)は、典型的には総放射活性の95%を超えていた。組換え型ヒトIL-12の放射特異的活性は典型的には約2200 Ci/mmolであった。
125I-標識ヒトIL-12の免疫沈降アッセイ法
5μg/mlウサギ抗マウスIgGのカーボネート・コーティング緩衝溶液(15 mM Na2CO3/35 mM NaHCO3)(pH 9.6)100 μl/ウェルの割合で4℃で18時間インキュベートすることによって、ヌンク・マキシソープ96ウェル分離型プレートを、マウスIgGに対するウサギアフィニティ精製抗体(カッペル、ダーハム、ノースカロライナ州、アメリカ)でコーティングした。コーティングしたウェルをPBS/0.05%Tween-20/0.01%チメロソルで洗浄し、1%(w/v)BSA/PBS/0.01%チメロソル200 μlと共に37℃で4時間インキュベートすることによってブロッキングした。ハイブリドーマ上清(75 μl)を抗マウスIgG-コーティングウェルに加えて、22℃で3時間インキュベートした。ウェルをPBS/0.05%Tween-20/0.01%チメロソル300 μlで3回洗浄し、次に125I-標識ヒトIL-12の100,000 cpmを抗体希釈緩衝液(PBS/1%BSA(w/v)/0.5 M NaCl/0.05%Tween-20/0.01%チメロソル)100 μlを含むそれぞれのウェルに加えた。4℃で18時間後、ウェルをPBS/0.05%Tween-20/0.01%チメロソル200 μlで3回洗浄した。次にウェルを分離して、ウェルに結合した放射活性の量をガンマカウンターを用いて測定した。幾つかの実験では、ウサギ抗マウスIgG-コーティングウェル中でハイブリドーマ上清をインキュベートした後、既に記述されたように(ガブラー(Gubler)ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4143〜4147(1991))調製したヒトIL-12 p40トランスフェクトCOS細胞からの培養上清100 μlを37℃で1時間ウェル中でインキュベートしてから、125I-標識ヒトIL-12を加え、捕獲されたマウス抗ヒトIL-12抗体がヒトIL-12のp40サブユニットに結合するか否かを調べた。
抗ヒトIL-12モノクローナル抗体の同定
96ウェルプレートに基づく免疫沈降アッセイ法を用いて、抗ヒトIL-12抗体を分泌するハイブリドーマを同定した。ハイブリドーマの上清を、上記のようにヒトIL-12 p40サブユニットを含むCOS細胞上清100 μlの非存在下および存在下でインキュベートした。125I-標識ヒトIL-12(100,000 cpm/ウェル)を加え、ウェル上で捕獲された125I-標識ヒトIL-12の量を測定した。図1は、125I-標識ヒトIL-12を捕獲したハイブリドーマ5F2、16F2、16G2、20E11および17E2からの上清に抗体が含まれることを示している。さらに、免疫沈降反応の際に非標識ヒトIL-12 p40サブユニットが存在しても、抗体5F2、16F2、16G2および20E11による125I-標識ヒトIL-12の捕獲は阻害されず、このことは、これらの抗体がIL-12 p40サブユニットのみに対して高い親和性を有しないことを示している。対照的に、免疫沈降反応の際に非標識ヒトIL-12 p40サブユニットが存在すれば、17E2による125I-標識ヒトIL-12の捕獲は完全に阻害され、このことは17E2がヒトIL-12のp40サブユニットを認識することを示している。
抗ヒトIL-12モノクローナル抗体の分析的等電点電気泳動
分析的等電点電気泳動は、ファルマシアバイオテック社(コード番号、80-1124-80、アップサラ、スウェーデン)のpH 3.5〜9.5アンフォリンPAGプレートを用いて実施した。等電点電気泳動は、1 M燐酸および1 N水酸化ナトリウムの電解質溶液を用いて、製造元の説明書に従って実施した。ゲルに、それぞれが単一の免疫グロブリン、すなわち20E11、5F2、20C2、16G2および16F2を含む試料5個をローディングした。標準物質はファルマシア・バイオテック社の等電点電気泳動pH 3〜10較正キット(コード番号17-0471-01)のものであった。実験条件は1000ボルト、10ワット、2.5時間、4℃であった。ゲルは、製造元の説明書に従って蛋白質用のファルマシアバイオテック・プラスワン銀染色キット(コード番号17-1150-01)を用いて銀染色した。図2は、抗ヒトIL-12モノクローナル抗体、20C2、16G2、16F2、20E11、および5F2の等電点電気泳動パターンを示す。
抗ヒトIL-12モノクローナル抗体の等電点電気泳動パターン
図2に示すように、モノクローナル抗体20C2(チッゾナイト(Chizzonite)ら、Cytokine, 6:A82a(1994))、20E11、および5F2は、独自の免疫グロブリンである。モノクローナル抗体16G2および16F2は、等電点電気泳動では同一であるように思われるが、いずれも20C2、20E11および5F2とは異なる。これらの抗体のpIはpH 5〜6の範囲である。
PHA-活性化リンパ芽球の作製
天然のヒトIL-12およびアカゲザルIL-12による増殖の双方を測定するために、4日目のPHA活性化ヒト末梢血単核球細胞(PBMC)を用いた。PBMCを単離して(ゲイトリー(Gately)ら、J. Natl. Cancer Inst., 69:1245(1982))、0.1%PHA-P(ディフコラボラトリーズ社、デトロイト、ミシガン州、アメリカ)によって刺激した。3日後、記述通りに培養を新鮮な培地および50 U/ml組換え型ヒトIL-12によって1:1に分割した(ゲイトリイ、チッゾナイト、およびプレスキー(Gately, M. K., Chizzonite, R. and Presky, D. H.)の「ヒトおよびマウスインターロイキン12の測定(Measurement of human and mouse interleukin 12)」「免疫学の現行プロトコール(Current Protocols in Immunology)」第1巻、コリガン、クルイスビーク、マルグリース、シェバック&ストローバー(J. E. Colligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach, and W. Strober)編、ジョン・ウィリー&サンズインク、ニューヨーク、1995、6.16.1〜6.16.15ページ)。細胞培養に用いた添加培地は天然のヒトIL-12の製造に関して先に記述したものに5%ヒトAB血清(アーバインサイエンティフィック社、サンタアナ、カリフォルニア州、アメリカ)を加えたものであった。
リンパ球増殖アッセイ法
様々な抗ヒトIL-12モノクローナル抗体がIL-12およびIL-2刺激PHA活性化ヒトリンパ芽球増殖に及ぼす影響は、M. K. ゲイトリーら(ゲイトリー、チゾナイト、およびプレスキー(Gately, M. K., Chizzonite, R. and Presky, D. H.)の「ヒトおよびマウスインターロイキン12の測定(Measurement of human and mouse interleukin 12)」「免疫学の現行プロトコール(Current Protocols in Immunology)」第1巻、コリガン、クルイスビーク、マルグリース、シェバック&ストローバー(J. E. Colligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach, and W. Strober)編、ジョン・ウィリー&サンズインク、ニューヨーク、1995、6.16.1〜6.16.15ページ)に基づく方法によって調べた。上記のように調製した4日目のPHA活性化リンパ芽球を採取して、洗浄し、添加培地に4×105個/mlで再懸濁し、精製モノクローナル抗ヒトIL-12抗体および関連するサイトカイン、すなわちヒトまたはサルのIL-12と共に96ウェルプレート(2×104個/ウェル)でインキュベートした。天然のヒトIL-12を1 ng/mlまたはサルIL-12を2 ng/mlの双方の25 μlアリコットを、抗ヒトIL-12モノクローナル抗体(mAbs)の様々な希釈液の25 μlアリコットと混合した。ウェルにおける最終の抗体濃度は0.0005 μg/ml〜0.5 μg/mlであった。様々な抗ヒトIL-12 mAbsおよび組換え型IL-2を含む、異なる同一のセットのウェルを調製して、阻害特異性の手段として抗ヒトIL-12 mAbsがIL-2刺激増殖に及ぼす作用を調べた。IL-12反応性を決定するために、ヒトまたはサルIL-12のそれぞれ250 pg〜500 pg/ウェルから、加えた抗体がない0pgにまで及ぶ標準的な用量反応曲線も含められた。サイトカインおよび抗体の混合液を含むプレートを37℃で30分インキュベートし、次に細胞懸濁液50 μlをウェルに加えた。培養プレートを5%CO2の湿潤大気中で37℃で48時間維持した後3H-チミジンのパルスを行った。10 μCi/ml 3H-チミジン50 μl(5%ヒトAB血清の代わりに5%FCSを加えた培地で希釈する)を各ウェルに加えた。37℃でさらに6時間インキュベートした後、セルハーベスタを用いてウェルの内容物をグラスファイバーフィルター上に回収し、細胞DNAへの3H-チミジン取り込みを、液体シンチレーションカウンターを用いて測定した。図3および4に示す値はウェル3個の平均値である。
抗ヒトIL-12モノクローナル抗体によるサイトカイン刺激PHA活性化リンパ芽球増殖の阻害
0.25 ng/ml IL-12で刺激したPHA活性化ヒトリンパ芽球の増殖は、抗体5F2、16F2、16G2、および20E11(図3)によって用量依存的に阻害された。0.25 ng/ml IL-12刺激増殖において50%の最大阻害を生じる濃度(IC50)として定義されるこれらの抗ヒト抗体の効力は、5F2に関して0.03 μg/ml、16F2に関して0.01 μg/ml、16G2に関して0.01 μg/ml、および20E11に関して0.01 μg/mlである。リンパ芽球の最大(9440 cpm)およびバックグラウンド(1480 cpm)レベルをそれぞれ、プロットの上端および下端での水平の破線として表す。図3に示すように、5F2、16F2、16G2、および20E11抗体はヒトIL-12刺激PHA活性化リンパ芽球増殖を少なくとも90%阻害することができた。対照的に、図3に示すように、これまでに同定された抗ヒトIL-12 p75特異的抗体20C2(チッゾナイト(Chizzonite)ら、Cytokine, 6:A82a(1994))は、ヒトIL-12生物活性を実質的に阻害することができない。
インターフェロン-γ合成アッセイ法
インターフェロン-γ(IFN-γ)合成は、上記のように4日目のPHA活性化ヒトリンパ芽球を用いて誘導した。用いた培地は、天然のヒトIL-12の調製に関してRPMIおよび上記のように添加し、さらにヒトAB血清の代わりに5%熱不活化(56℃、30分)ウシ胎児血清(ハイクローン、ローガン、ユタ州)を含むダルベッコ改変イーグル培地の1:1混合液であった。培養1 mlずつ2個を24ウェル組織培養プレート(コスター社)のウェルに加えた。それぞれのウェルにPHA活性化リンパ芽球5×105個、0.25 ng/ml精製ヒトIL-12、20 単位/ml組換え型ヒトIL-2、1 ng/ml組換え型ヒトIL-1β(ホフマンラロシュ社のR.チッゾナイト(R. Chizzonite)博士からの供与)、および抗ヒトIL-12抗体の表示の濃度を加えた。最初に、リンパ芽球を除く全ての試薬をウェルに加えて、37℃で30分インキュベートし、その後リンパ芽球を加えた。次に培養を5%CO2を含む空気の湿潤大気中で37℃で24時間インキュベートした。この期間の終了時に培養上清液を遠心によって回収して、IFN-γの含有量をELISAを用いてアッセイした。リンパ芽球を含む培養においてIL-2+IL-1によって産生されたIFN-γの量は、IL-2+IL-1のほかに0.25 ng/ml IL-12を含む培養において産生された場合の常に15%以下であって、たいていの場合5%未満であった。
抗ヒトIL-12モノクローナル抗体によるサイトカイン刺激インターフェロン-γ産生の阻害
0.25 ng/mlヒトIL-12によって刺激したPHA活性化ヒトリンパ芽球によるIFN-γの産生は、抗体5F2、16F2、16G2、および20E11によって用量依存的に阻害された(図5)。これらの抗ヒト抗体の効力を、0.25 ng/mlヒトIL-12刺激IFN-γ産生における50%の最大阻害を生じる濃度(IC50)として定義すると、5F2に関して0.02 μg/ml、16F2に関して0.02 μg/ml、16G2に関して0.01 μg/ml、および20E11に関して0.02 μg/mlである。これらの抗ヒトヘテロダイマー特異的IL-12抗体は、0.5 μg/mlで用いると、IL-12刺激IFN-γ産生の90%以上を阻害することができた。対照的に、これまでに同定された抗ヒトIL-12 p75特異的抗体20C2(チッゾナイト(Chizzonite)ら、Cytokine, 6:A82a(1994))は作用がより弱く、IL-12刺激IFN-γ産生を0.5 μg/ml以下の濃度で65%以上阻害することができない。
抗ヒトIL-12抗体産生ハイブリドーマ細胞株に存在する抗体重鎖の可変領域をコードする遺伝子の配列分析
ウルトラスペックRNA単離システムを用いて製造元のプロトコールに従って(バイオテック、ハウストン、テキサス州、アメリカ)、ハイブリドーマ細胞から総RNAを抽出した。一本鎖cDNAを20 μl容量中の10 μgの総RNAおよびオリゴ-dTプライマーから合成した。ダッタマジュンダール(Dattamajumdar)ら(A. K. Dattamajumdar)ら、Immunogenetics 43:141〜151(1996))によって報告されたように、フレームワーク1および4の配列情報に従ってデザインしたプライマーを用いて、cDNA反応混合液4μlアリコットをマウスIgG重鎖可変領域のPCR増幅の鋳型として用いた。30サイクルPCR反応をアニーリング温度50℃を用いて実施した。全PCR反応物をフェノール抽出して、エタノール沈殿させ、1%低温溶解アガロースゲル上で流してアンプリコンを単離した。DNA断片をゲルから切り出して、70℃で融解し、5μlを30サイクルPCR反応において再増幅させて、より多くの材料を生成した。再増幅されたアンプリコンをゲル精製して、アプライドバイオシステムズ・インコーポレイテッド自動シークエンサーによって、蛍光に基づくサンガー・シークエンシング法を用いてシークエンシングした。
抗ヒトIL-12モノクローナル抗体重鎖の可変領域におけるヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列
ハイブリドーマ細胞株HIL-12F3-16G2およびHIL-12F3-20E11によって産生されたIL-12抗体のフレームワーク領域(FR)1、相補性決定領域(CDR)1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、およびFR4を含む免疫グロブリン重鎖遺伝子の可変領域の一部のヌクレオチド配列、およびその推定アミノ酸配列をそれぞれ、図6および図7に示す。CDR配列を下線で示す。利用できる配列情報を比較すると、ハイブリドーマHIL-12F3-16G2およびHIL-12F3-20E11によって産生された抗体の重鎖は、DNAレベルで94%の相同性およびアミノ酸レベルで93%の類似性を示すことが示された。
Claims (18)
- p35サブユニットおよびp40サブユニットを含む、ヒトIL-12 p75ヘテロダイマーに対する、以下の特徴を有する抗体:
(a)ヒトIL-12のp75ヘテロダイマーによって示されるエピトープと免疫学的に反応するが、p40サブユニットによって示されるいかなるエピトープとも免疫学的に反応しない;および
(b)IL-12のp35サブユニットまたはp40サブユニットをコードする遺伝子を欠損する哺乳動物、好ましくはマウスから製造される。 - p75ヘテロダイマーを形成するp35サブユニットおよびp40サブユニットを含むモノクローナル抗体であって、以下の特徴を有するヒトIL-12に対するモノクローナル抗体:
(a)ヒトIL-12のp75ヘテロダイマーによって示されるエピトープと免疫学的に反応するが、p40サブユニットによって示されるいかなるエピトープとも免疫学的に反応しない;および
(b)ヒトIL-12生物活性の少なくとも約90%を中和する。 - 請求項2記載の抗体であって、抗体の濃度が0.5 μg/mlでありヒトIL-12の濃度が0.25 ng/mlである、IL-12刺激PHA活性化ヒトリンパ芽球増殖を阻害することによって、ヒトIL-12の生物活性の少なくとも約90%を中和する抗体。
- 請求項2記載の抗体であって、抗体の濃度が0.5 μg/mlでありヒトIL-12の濃度が0.25 ng/mlである、IL-12刺激IFN-γ産生を阻害することによって、抗体がヒトIL-12の生物活性の少なくとも約90%を中和する抗体。
- アカゲザルIL-12と交叉反応する、請求項1から4のいずれか一項に記載の抗体。
- マウスの細胞株から製造される、請求項1から5のいずれか一項に記載の抗体。
- 抗体がモノクローナル抗体である、請求項1から6のいずれか一項に記載の抗体。
- 抗体がハイブリドーマ、特にATCC指定番号HB-12446、HB-12447、HB-12448、またはHB-12449を有するハイブリドーマによって製造される、請求項1から7のいずれか一項に記載の抗体。
- 抗体がヒト化されている、請求項1から8のいずれか一項に記載の抗体。
- 請求項1から9のいずれか一項に記載の抗体を製造するハイブリドーマ。
- 請求項1から9のいずれか一項に記載の抗体を少なくとも1つ含む薬学的組成物。
- p35サブユニットおよびp40サブユニットを含む、ヒトIL-12 p75ヘテロダイマーと選択的に免疫学的に反応する抗体を製造する方法であって、以下の段階を含む方法:
(a)抗体を製造するために、ヒトIL-12 p75ヘテロダイマーによってp35サブユニットまたはp40サブユニットをコードする遺伝子を欠損する哺乳動物を免疫する段階;
(b)免疫した哺乳動物から抗体を得る段階;
(c)選択的に結合する抗体を得るために、抗体がp75ヘテロダイマーによって示されるエピトープに選択的に結合することができるか否かをスクリーニングする段階。 - p35サブユニットおよびp40サブユニットを含む、ヒトIL-12 p75ヘテロダイマーと選択的に免疫学的に反応するモノクローナル抗体を製造する方法であって、以下の段階を含む方法:
(a)抗体を製造するために、ヒトIL-12 p75ヘテロダイマーによって、p35サブユニットまたはp40サブユニットをコードする遺伝子を欠損する哺乳動物を免疫する段階;
(b)免疫した動物から抗体産生細胞を回収する段階;
(c)該細胞からモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを製造し、モノクローナル抗体を得る段階;
(d)選択的に結合するモノクローナル抗体を得るために、該ハイブリドーマによって製造される該モノクローナル抗体が、p75ヘテロダイマーによって示されるエピトープに選択的に結合するか否かをスクリーニングする段階。 - ハイブリドーマから製造された抗体が、アカゲザルIL-12との交叉反応能に関してさらにスクリーニングおよび選択される、請求項13記載の方法。
- 請求項12から14のいずれか一項に記載のプロセス、または請求項12から14のいずれか一項に記載のプロセスを含むプロセスによって製造される、請求項1から9のいずれか一項に記載の抗体。
- 治療的活性物質として請求項1から9のいずれか一項に記載の抗体。
- 免疫メカニズムを通じて媒介される病態を有する疾患、特に、IL-12生物活性の増加に関連し、その結果、例えば、多発性硬化症、リウマチ性関節炎、自己免疫性真性糖尿病、ならびにクローン病および潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患(IBD)などの、自己免疫疾患のようなTh1-型のヘルパー細胞活性の異常が起こる疾患を制御する薬剤の調製における、請求項1から9のいずれか一項に記載の抗体の使用。
- 本明細書においてこれまでに記載した発明。
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