ES2893148T3 - Anticuerpos contra el receptor alfa de la interleucina 4 canina - Google Patents

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Abstract

Un anticuerpo caninizado aislado o un fragmento de unión a antígeno caninizado que se unen al receptor α de la interleucina 4 canina (IL-4Rα) con una especificidad que comprende tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de la cadena ligera: una CDR ligera 1 (CDRL1), una CDR ligera 2 (CDRL2) y una CDR ligera 3 (CDRL3); y tres CDR de la cadena pesada: una CDR pesada 1 (CDRH1), una CDR pesada 2 (CDRH2) y una CDR pesada 3 (CDRH3); (a) en donde la CDRL1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 131; (b) en donde la CDRL2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 60; (c) en donde la CDRL3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 138; (d) en donde la CDRH1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 142; (e) en donde la CDRH2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 147; (f) en donde la CDRH3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 152; y en donde el anticuerpo y el fragmento de unión a antígeno del mismo se unen al IL-4Rα canino y bloquean la unión del IL-4Rα canino a la interleucina 4 canina, en donde el anticuerpo caninizado o el fragmento de unión a antígeno caninizado comprenden una combinación de cadena pesada y cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 164 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 170, una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 166 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 172, y una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 168 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 174.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos contra el receptor a de la interleucina 4 canina
Campo de la invención
La presente invención se refiere a anticuerpos contra el receptor a de la IL-4 canina que tienen secuencias específicas y una elevada afinidad de unión por el receptor a de la IL-4 canina, que puede bloquear la unión de la IL-4 canina al receptor a de la IL-4 canina. La presente invención describe además epítopos únicos que se unen a los anticuerpos contra el receptor a de la IL-4 canina. La presente invención también se refiere al uso de los anticuerpos y los epítopos de la presente invención en el tratamiento de la dermatitis atópica en perros.
Antecedentes de la invención
El sistema inmunitario comprende una red de células especializadas residentes y recirculantes que funcionan en colaboración para proteger al hospedador contra enfermedades infecciosas y cáncer. La capacidad del sistema inmunitario para realizar esta función depende en gran medida de las actividades biológicas de un grupo de proteínas secretadas por los leucocitos y denominadas de manera colectiva interleucinas. Entre las interleucinas bien estudiadas se encuentran dos moléculas importantes identificadas como la interleucina 4 (IL-4) y la interleucina 13 (IL-13). Las IL-4 e IL-13 son dos proteínas estrechamente relacionadas que se pueden secretar por muchos tipos de células, incluidos linfocitos Th2 CD4+, linfocitos T citolíticos naturales (n Kt , del inglés "natural killer T"), macrófagos, mastocitos y basófilos. Las IL-4 e IL-13 muestran muchas funciones superpuestas y son fundamentales para el desarrollo de respuestas inmunitarias humorales dependientes de linfocitos T. A pesar de sus similitudes en la estructura general, fuentes celulares y funciones biológicas, cada una de estas citocinas media determinadas funciones especializadas, lo que ha estimulado una investigación considerable dirigida a identificar los receptores y las vías de señalización posteriores a través de las cuales estas interleucinas median en sus actividades biológicas tanto comunes como únicas.
Ahora se sabe que la IL-4 se une con elevada afinidad a dos receptores, es decir, los receptores de la IL-4 de tipo I y de tipo II. El receptor de la IL-4 de tipo I consiste en la cadena a del receptor de la IL-4 y la cadena C y común, que también es parte del receptor de varias otras interleucinas, incluidas la IL-2, IL-7, IL-9 e IL-15. El receptor de la IL-4 de tipo II consiste en la cadena a del receptor de la IL-4 y la cadena a l del receptor de la IL-13. Por otra parte, la IL-13 se une al receptor de la IL-4 de tipo II y a un receptor único denominado receptor a2 de la IL-13. La unión de la IL-13 al receptor a2 de la IL-13 no transduce una señal y este receptor también se secreta en forma soluble. Por consiguiente, el receptor a2 de la IL-13 se ha denominado a menudo receptor señuelo.
Los genes que codifican la proteína IL-4 de diversas especies se han clonado y expresado en células bacterianas y de mamíferos. Por ejemplo, el ADNc que codifica la IL-4 humana muestra que la IL-4 humana madura es un polipéptido secretado de 129 aminoácidos con un peso molecular previsto de 15 Kd [Yokota et al., Proc Natl Acad Sci u Sa .83(16): 5894-5898 (1986)]. También se ha identificado el ADNc que codifica la proteína IL-4 canina y se ha demostrado que codifica un polipéptido de 132 aminoácidos que comparte el 40 % de identidad con la IL-4 humana [van der Kaaij et al., Immunogenetics 49:142-143(1999)]. El gen que codifica la IL-13 humana se ha clonado y expresado en varios sistemas hospedadores [Minty et al., Nature 362:248-50 (1993)]. El ADNc que codifica la IL-13 humana muestra que la IL-13 madura es un polipéptido secretado con un peso molecular aparente de 12,4 Kd. También se ha identificado el ADNc que codifica la IL-13 canina [Yang et al., J. Interferon and Cytokine Research 20:779-785 (2000)]. El polipéptido maduro de la IL-13 canina predicho consiste en 111 aminoácidos y comparte el 61,8 % de identidad con la iL-13 humana.
Los genes que codifican las cadenas a del receptor de la IL-4 humana y de ratón se han clonado y expresado en varios sistemas hospedadores. Por ejemplo, el ADNc que codifica la cadena a del receptor de la IL-4 humana ha sido descrito por Galizzi et al., [International Immunology 2(7):669-675 (1990)] y el ADNc que codifica la cadena a del receptor de la IL-4 murina ha sido descrito por Mosley et al., [Cell, 59(2):335-348 (1989)]. El ADNc de la cadena a del receptor de la IL-4 humana codifica 825 restos de aminoácidos que incluyen una secuencia señal de 24 restos de aminoácidos. Aunque la proteína murina es 15 restos de aminoácidos más corta que el receptor humano, ambas proteínas están estrechamente relacionadas con una identidad de secuencia global del 50 % a nivel de aminoácidos.
También se han divulgado genes que codifican las cadenas a del receptor de la IL-4 equina, canina y felina [véase, el documento US 7.208.579 B2]. De manera adicional, el ADNc que se predice que corresponde a una isoforma del receptor a de la IL-4 canina se puede encontrar en la base de datos de Genbank (SEQ Id NO: 1). Por lo tanto, la presente invención se propuso determinar el ADNc de la cadena a del receptor de la IL-4 y determinar de manera definitiva su secuencia polipeptídica codificada.
Aunque la IL-4 y la IL-13 son citocinas fundamentales para el desarrollo de respuestas inmunitarias Th2 que se requieren para la protección contra patógenos extracelulares (por ejemplo, parásitos que viven en el tejido o en la luz), ambas citocinas están implicadas en la patogenia de varias enfermedades alérgicas en seres humanos y animales, que incluyen asma y dermatitis atópica. El asma es una enfermedad respiratoria común en los seres humanos. La enfermedad se caracteriza por la inflamación de los pulmones, hipersensibilidad de las vías respiratorias bronquiales a estímulos externos y modificaciones estructurales de los tejidos de la pared bronquial. Vatrella et al. ha revisado la fisiopatología del asma alérgica, [Journal of Asthma and Allergy 7:123-130 (2014)]. El asma se mantiene por linfocitos Th2 CD4+ que producen grandes cantidades de IL-4 e IL-13 y orquestan la respuesta inmunitaria inflamatoria en las vías respiratorias alérgicas. Los avances recientes en la comprensión de la respuesta asmática resaltan el importante papel que desempeñan tanto la IL-4 como la IL-13 en la patogenia de la enfermedad. Por ejemplo, ambas citocinas estimulan el cambio de isotipo de inmunoglobulina en los linfocitos B de IgM a IgE, y esta IgE específica de alérgeno contribuye a la desgranulación de los mastocitos y la liberación de mediadores inflamatorios en las vías respiratorias. De manera adicional, tanto la IL-4 como la IL-13 aumentan la contracción del músculo liso bronquial y estimulan el reclutamiento de eosinófilos en las vías respiratorias, que también pueden desgranularse en respuesta al entrecruzamiento de IgE unida a alérgenos con su receptor en eosinófilos. De manera adicional, la IL-13 también estimula la secreción de moco y promueve la remodelación de las vías respiratorias mediante la estimulación de la hiperplasia de células caliciformes, el depósito de colágeno y la proliferación de células de músculo liso de las vías respiratorias. Por tanto, ahora está claro que la IL-4 y la IL-13 están íntimamente implicadas en los cambios patológicos que conducen a la expresión de episodios asmáticos que incluyen la constricción bronquial y el aumento de la hiperactividad de las vías respiratorias.
La dermatitis atópica (DA) es una enfermedad cutánea inflamatoria pruriginosa recidivante que se caracteriza por una desregulación del sistema inmunitario y anomalías de la barrera epidérmica. Los atributos patológicos e inmunológicos de la DA han sido objeto de extensas investigaciones [revisado en Rahman et al. Inflammation & Allergy-drug target 10:486-496 (2011) y en Harskamp et al., Seminar in Cutaneous Medicine and Surgery 32:132-139 (2013)]. La DA es la enfermedad cutánea más común en el ser humano y afecta del 2 al 10 % de la población adulta en Estados Unidos y a alrededor del 25 % de los niños en todo el mundo. En el ser humano, las lesiones cutáneas de la DA se caracterizan por infiltraciones con linfocitos Th2, eosinófilos, mastocitos y células dendríticas. En la fase aguda de la DA, estas lesiones muestran una expresión predominante de citocinas de tipo Th2 que incluyen la IL-4 y la IL-13. La DA también se caracteriza por niveles circulantes elevados de IgE y se correlaciona de manera positiva con la expresión de IL-4 e IL-13 en linfocitos Th2 CD4+ en la piel. Aunque la DA se ha clasificado como una enfermedad de Th2, otros subconjuntos de linfocitos T tales como Th1, Th22 y Th17 también podrían contribuir a la patogenia de la enfermedad. A pesar de la creciente incidencia de DA en todo el mundo, las opciones de tratamiento disponibles para los pacientes cuyos síntomas no se controlan de manera adecuada con agentes tópicos se limitan a los corticoesteroides orales, la ciclosporina oral y la fototerapia UVB de banda estrecha. Estas terapias no siempre son eficaces y su uso está asociado a varios efectos adversos. Recientemente, se han desarrollado anticuerpos monoclonales específicos para Ra de la IL-4 R humana y algunos de estos anticuerpos se han probado de manera extensa por sus utilidades terapéuticas en el ser humano para el tratamiento de la dermatitis atópica [véase, por ejemplo, el documento US20150017176 A1].
La DA también es una enfermedad común en los animales de compañía, especialmente en perros, donde su prevalencia se ha estimado en aproximadamente entre un 10 y un 15 % de la población canina. La patogenia de la DA en perros y gatos [revisado en Nuttall et al., Veterinary Records 172(8):201-207 (2013)] tiene similitudes significativas con la de la DA en el ser humano, lo que incluye la infiltración cutánea por varias células inmunitarias y un entorno de citocinas polarizadas Th2 CD4+ que incluye preponderancia de las citocinas IL-4 e IL-13. Como en los seres humanos, las terapias actuales para la dermatitis atópica en perros y gatos se basan en terapias paliativas tales como champús y humectantes o terapia sintomática a través del uso de corticoesteroides orales o sistémicos y ciclosporina oral. Al igual que con la DA humana, estas terapias no abordan el mecanismo subyacente de la enfermedad y tienen importantes problemas de seguridad y eficacia. Por lo tanto, existe una necesidad médica insatisfecha de una opción de tratamiento segura y eficaz para la DA en los animales de compañía. Preferentemente, dicho tratamiento debería interferir con el mecanismo subyacente de la enfermedad.
La cita de cualquier referencia en el presente documento no debe interpretarse como una admisión de que dicha referencia está disponible como "técnica anterior" para la presente solicitud.
Sumario de la invención
La presente invención se refiere a anticuerpos caninizados antirreceptor a de la interleucina 4 canina (IL-4Ra ) que tienen una elevada afinidad de unión por el IL-4Ra canino y también tienen la capacidad de bloquear la unión de la IL-4 canina y posteriormente inhibir la señalización de la IL-4 canina. En una realización más particular, los anticuerpos antirreceptor a de la interleucina 4 canina (IL-4Ra ) también tienen la capacidad de bloquear la unión de la IL-13 canina a los receptores de la IL-4 de tipo I o de tipo II y posteriormente inhibir la señalización tanto de la IL-4 como de la IL-13 canina. En realizaciones particulares, dichos anticuerpos anti-IL-4Ra canino son anticuerpos murinos anti-IL-4Ra canino. En realizaciones más particulares, los anticuerpos anti-IL-4Ra canino tienen una elevada afinidad de unión al IL-4Ra canino, así como tienen la capacidad de bloquear la unión de la IL-4 canina y la IL-13 canina a los receptores de la IL-4 de tipo I y de tipo II.
Además, la presente invención se refiere a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) comprendidas por estos anticuerpos y la combinación de estas CDR (por ejemplo, obtenidas a partir de anticuerpo murinos anti-IL-4Ra canino) en marcos caninos para formar anticuerpos caninizados anti-IL-4Ra canino. La presente invención también se refiere al uso de dichos anticuerpos en el tratamiento de afecciones tales como la dermatitis atópica y/u otras afecciones adversas debido a los efectos posteriores de la señalización de la unión de la IL-4 canina y/o la IL-13 canina a los receptores de la IL-4 de tipo I y/o de tipo II.
En consecuencia, la presente invención describe conjuntos únicos de CDR de catorce (14) anticuerpos murinos anti-IL-4Ra canino ilustrativos. Los 14 anticuerpos murinos anti-IL-4Ra canino ilustrativos tienen conjuntos únicos de CDR, es decir, tres CDR de cadena ligera: CDR ligera 1 (CDRL1), CDR ligera 2 (CDRL2) y CDR ligera 3 (CDRL3) y tres CDR de cadena pesada: CDR pesada 1 (CDRH1), CDR pesada 2 (CDRh 2) y CDR pesada 3 (Cd Rh 3). Como se detalla a continuación, hay una homología de secuencia sustancial dentro de cada grupo de CDR, e incluso alguna redundancia, por ejemplo, véase, el conjunto de CDRL1 a continuación. Se describen las secuencias de aminoácidos de las seis CDR de los 14 anticuerpos murinos anti-IL-4Ra canino ilustrativos, así como variantes modificadas de manera conservadora de estas CDR y variantes que comprenden (por ejemplo, comparten) la misma estructura canónica y/o se unen a uno o más (por ejemplo, de 1 a 4, o más) restos de aminoácidos del IL-4Ra canino que están compuestos por un epítopo del IL-4Ra canino.
Por consiguiente, la presente invención proporciona un anticuerpo caninizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo caninizado que se une al IL-4Ra con especificidad que comprende una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 1 (CDRL1) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 131, y una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 2 (CDRL2) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 60, y una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 3 (CDRL3) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 138, y una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 1 (CDRH1) en la que la CDRH1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 142, y una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 2 (CDRH2) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 147, y una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 3 (CDRH3) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 152, y en donde el anticuerpo caninizado o el fragmento de unión a antígeno caninizado comprende una combinación de cadena pesada y cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 164 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 170, una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 166 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 172, y una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 168 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 174.
De manera adicional, se describe un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a IL-4Ra con especificidad que comprende una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 1 (VL CDR1) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47, SeQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130 o SEQ ID NO: 131, y/o una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 2 (VL CDR2) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133 o SEQ ID NO: 134, y/o una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 3 (VL CDR3) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138 o SEQ ID NO: 139, y/o una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 1 (VH CDR1) en la que la CDRH1 comprende la secuencia de aminoácidos de s Eq ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142 o SEQ ID NO: 143, y/o una región determinante de complementariedad de cadena pesada 2 (VH CDR2) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 147 o SEQ ID NO: 148 y/o una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 3 (VH CDR3) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 152 o SEQ ID NO: 153. En realizaciones particulares, el anticuerpo es un anticuerpo de mamífero. En realizaciones más particulares, el anticuerpo es un anticuerpo caninizado.
Se describe un anticuerpo caninizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una o más de la región determinante de la complementariedad de la cadena pesada 1 (VH CDR1) con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142 o SEQ ID NO: 143. Se divulga una región determinante de la complementariedad de la cadena pesada 2 (VH CDR2) que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 147 o SEQ ID NO: 148. Se divulga una región determinante de la complementariedad de la cadena pesada 3 (VH CDR3) que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 152 o SEQ ID NO: 153. De manera adicional, se divulga un anticuerpo caninizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende tanto una VH CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, Se Q ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142 o SEQ ID NO: 143 como una VH CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 147 o SEQ ID NO: 148. Se divulga otro anticuerpo caninizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende tanto una VH CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142 o SEQ ID NO: 143, como una VH CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99 o SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 152 o SEQ ID NO: 153. Se divulga otro anticuerpo caninizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende tanto una VH CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, Se Q ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 147 o SEQ ID NO: 148 como una VH CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99 o SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 152 o SEQ ID NO: 153. Se divulga otro anticuerpo caninizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una VH CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142 o SEQ ID NO: 143, una VH CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 147 o SEQ ID NO: 148 como una VH CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99 o SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 152 o SEQ ID NO: 153.
Se divulga un anticuerpo caninizado o un fragmento de unión a antígeno que también comprende una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 1 (VL CDR1) que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130 o SEQ ID NO: 131. Además, se divulga un anticuerpo caninizado o un fragmento de unión a antígeno en donde la región determinante de la complementariedad de la cadena ligera 2 (VL CDR2) comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133 o SEQ ID NO: 134. Además, se divulgan anticuerpos caninizados o fragmentos de unión a antígeno en donde la región determinante de la complementariedad de la cadena ligera 3 (VL CDR3) comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138 o SEQ ID NO: 139. También se divulga un anticuerpo caninizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende tanto una VL CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130 o SEQ ID NO: 131 como una VL CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID No : 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133 o SEQ ID NO: 134.
Además, se divulga un anticuerpo caninizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende tanto una VL CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130 o SEQ ID NO: 131 como una VL CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138 o SEQ ID NO: 139. También se divulga un anticuerpo caninizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende tanto una VL CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, Se Q ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133 o SEQ ID NO: 134 como una VL CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138 o SEQ ID NO: 139.
Además, se divulga un anticuerpo caninizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una VL CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130 o SEQ ID NO: 131, una VL CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133 o SEQ ID NO: 134, como una VL CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138 o SEQ ID NO: 139.
El anticuerpo caninizado anti-IL-4Ra canino como se divulga en el presente documento puede comprender regiones determinantes de la complementariedad (CDR) en las que las CDR tienen estructuras canónicas de: H1-1, H2-3A y H3-12, respectivamente para CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada, es decir, la CDR1 de la cadena pesada tiene la clase de estructura canónica de 1, la CDR2 de la cadena pesada tiene la clase de estructura canónica de 3A y la CDR3 de la cadena pesada tiene la clase de estructura canónica de 12. Además, las CDR para las cadenas ligeras correspondientes, como se divulga en el presente documento, pueden tener estructuras canónicas de: L1-1, L2-1 y L3-1, respectivamente para CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera. Además, el anticuerpo caninizado anti-IL-4Ra canino como se divulga en el presente documento puede comprender regiones determinantes de la complementariedad (CDR) en las que las CDR tienen estructuras canónicas de: H1-1, H2-2A y H3-7, respectivamente para CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada. Las CDR para las cadenas ligeras correspondientes, como se divulga en el presente documento, pueden tener estructuras canónicas de: L1-2A, L2-1 y L3-1, respectivamente para CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera. Además, se describe un anticuerpo caninizado anti-IL-4Ra canino que además comprende regiones determinantes de la complementariedad (CDR) en las que las CDR tienen estructuras canónicas de: H1-1, H2-2B y H3-15, respectivamente para CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada. También se describen las CDR para las cadenas ligeras correspondientes que tienen estructuras canónicas de: L1-4, L2-1 y L3-1, respectivamente para CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera. Además, se describe un anticuerpo caninizado anti-IL-4Ra canino que además comprende regiones determinantes de la complementariedad (CDR) en las que las CDR tienen estructuras canónicas de: H1-1, H2-1 y H3-15, respectivamente para CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada. También se describen las CDR para las cadenas ligeras correspondientes que tienen estructuras canónicas de: L1-3, L2-1 y L3-1, respectivamente para CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera. Además, se describe un anticuerpo caninizado anti-IL-4Ra canino que comprende regiones determinantes de la complementariedad (CDR) en las que las CDR tienen estructuras canónicas de: H1-1, H2-2B y H3-6, respectivamente para CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada. De manera adicional, se describen las CDR para las cadenas ligeras correspondientes que tienen estructuras canónicas de: L1-2A, L2-1 y L3-1, respectivamente para CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera.
Además, se divulga que el anticuerpo caninizado anti-IL-4Ra canino comprende además regiones determinantes de la complementariedad (CDR) en las que las CDR tienen estructuras canónicas de: H1-1, H2-2B y H3-4, respectivamente para CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada. Se divulga además que las CDR para las cadenas ligeras correspondientes tienen estructuras canónicas de: L1-6, L2-1 y L3-1, respectivamente para CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera. Además, se divulga que el anticuerpo caninizado anti-IL-4Ra canino comprende además regiones determinantes de la complementariedad (CDR) en las que las CDR tienen estructuras canónicas de: H1-1, H2-1 y H3-13, respectivamente para CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada. Además se describe que las CDR para las cadenas ligeras correspondientes tienen estructuras canónicas de: L1-1, L2-1 y L3-1, respectivamente para CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera. Se describe además que el anticuerpo caninizado anti-IL-4Ra canino comprende además regiones determinantes de la complementariedad (CDR) en las que las CDR tienen estructuras canónicas de: H1-1, H2-2A y H3-6, respectivamente para CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada. Además se describe que las CDR para las cadenas ligeras correspondientes tienen estructuras canónicas de: L1-2A, L2-1 y L3-1, respectivamente para Cd R1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera.
Se describe además que el anticuerpo caninizado anti-IL-4Ra canino comprende además regiones determinantes de la complementariedad (CDR) en las que las CDR tienen estructuras canónicas de: H1-1, H2-3A y H3-15 o de manera alternativa H3-13, respectivamente para CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada. Además se describe que las CDR para las cadenas ligeras correspondientes tienen estructuras canónicas de: L1-6, L2-1 y L3-1, respectivamente para CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera. Se describe además que el anticuerpo caninizado anti-IL-4Ra canino comprende además regiones determinantes de la complementariedad (CDR) en las que las CDR tienen estructuras canónicas de: H1-1, H2-2A y H3-10, respectivamente para CDR1, CDR2 y Cd R3 de la cadena pesada. En realizaciones aún más particulares de este tipo, las CDR para las correspondientes cadenas ligeras tienen estructuras canónicas de: L1-6, L2-1 y L3-1, respectivamente para c DR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera. Se describe además que el anticuerpo caninizado anti-IL-4Ra canino comprende además regiones determinantes de la complementariedad (CDR) en las que las CDR tienen estructuras canónicas de: H1-1, H2-3A y H3-9, respectivamente para CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada. Además se describe que las CDR para las cadenas ligeras correspondientes tienen estructuras canónicas de: L1-3, L2-1 y L3-3, respectivamente para CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera.
La presente invención también proporciona un anticuerpo caninizado aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une de manera específica al IL-4Ra que comprende una cadena pesada de IgG canina y una cadena ligera k o A canina. De acuerdo con la invención, la cadena ligera k o A canina que comprende tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de cadena ligera: CDR ligera 1 (CDRL1), CDR ligera 2 (CDRL2) y CDR ligera 3 (CDRL3); y la cadena pesada de IgG canina que comprende tres CDR de cadena pesada: CDR pesada 1 (CDRH1), CDR pesada 2 (CDRH2) y CDR pesada 3 (c Dr H3) se obtienen de los anticuerpos murinos anti-IL-4Ra canino. Los anticuerpos caninizados y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la presente invención se unen al IL-4Ra canino y bloquean la unión de IL-4Ra canino a la IL-4 canina.
La presente invención proporciona un anticuerpo de mamífero aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une al receptor a de la interleucina-4 canina (IL-4Ra) con especificidad que comprende tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de la cadena ligera: CDR ligera 1 (CDRL1), c Dr ligera 2 (CDRL2) y CDR ligera 3 (CDRL3); y tres CDR de la cadena pesada: CDR pesada 1 (CDRH1), CDR pesada 2 (CDr H2) y c DR pesada 3 (CDRH3) como se describe en el presente documento. Se divulgan anticuerpos caninizados y fragmentos de unión a antígeno de los mismos en donde la CDRL1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47, una variante del SEQ ID NO: 47, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 47, una variante del SEQ ID NO: 47 que comprende la clase de estructura canónica de 1, SEQ ID NO: 48, una variante del SEQ ID NO: 48, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 48, una variante del SEQ ID NO: 48 que comprende la clase de estructura canónica de 2A, SEQ ID NO: 49, una variante del SEQ ID NO: 49, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 49, una variante del SEQ ID NO: 49 que comprende la clase de estructura canónica de 4, SEQ ID NO: 50, una variante del SEQ ID NO: 50, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 50, una variante del SEQ ID NO: 50 que comprende la clase de estructura canónica de 3, SEQ ID NO: 51, una variante del SEQ ID NO: 51, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 51, una variante del SEQ ID NO: 51 que comprende la clase de estructura canónica de 3, SEQ ID NO: 52, una variante del SEQ ID NO: 52, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 52, una variante del SEQ ID NO: 52 que comprende la clase de estructura canónica de 2A, SEQ ID NO: 53, una variante del SEQ ID NO: 53, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 53, una variante del SEQ ID NO: 53 que comprende la clase de estructura canónica de 6, SEQ ID NO: 54, una variante del SEQ ID NO: 54, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 54, una variante del SEQ ID NO: 54 que comprende la clase de estructura canónica de 1, SEQ ID NO: 55, una variante del SEQ ID NO: 55, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 55, una variante del SEQ ID NO: 55 que comprende la clase de estructura canónica de 2A, SEQ ID NO: 129, una variante del SEQ ID NO: 129, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 129, una variante del SEQ ID NO: 129 que comprende la clase de estructura canónica de 6, SEQ ID NO: 130, una variante del SEQ ID NO: 130, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 130, una variante del SEQ ID NO: 130 que comprende la clase de estructura canónica de 6, una variante del SEQ ID NO: 131, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 131 o una variante del SEQ ID NO: 131 que comprende la clase de estructura canónica de 3.
Se divulgan anticuerpos caninizados y fragmentos de unión a antígeno de los mismos en donde la CDRL2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 56, una variante del SEQ ID NO: 56, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 56, una variante del SEQ ID NO: 56 que comprende la clase de estructura canónica de 1, SEQ ID NO: 57, una variante del SEQ ID NO: 57, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 57, una variante del SEQ ID NO: 57 que comprende la clase de estructura canónica de 1, SEQ ID NO: 58, una variante del SEQ ID NO: 58, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 58, una variante del SEQ ID NO: 58 que comprende la clase de estructura canónica de 1, SEQ ID NO: 59, una variante del SEQ ID NO: 59, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 59, una variante del SEQ ID NO: 59 que comprende la clase de estructura canónica de 1, una variante del SEQ ID NO: 60, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 60, una variante del SEQ ID NO: 60 que comprende la clase de estructura canónica de 1, SEQ ID NO: 61, una variante del SEQ ID NO: 61, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 61, una variante del SEQ ID NO: 61 que comprende la clase de estructura canónica de 1, SEQ ID NO: 62, una variante del SEQ ID NO: 62, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 62, una variante del SEQ ID NO: 62 que comprende la clase de estructura canónica de 1, SEQ ID NO: 63, una variante del SEQ ID NO: 63, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 63, una variante del SEQ ID NO: 63 que comprende la clase de estructura canónica de 1, SEQ ID NO: 64, una variante del SEQ ID NO: 64, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 64 o una variante del SEQ ID NO: 64 que comprende la clase de estructura canónica de 1, SEQ ID NO: 132, una variante del SEQ ID NO: 132, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 132, una variante del SEQ ID NO: 132 que comprende la clase de estructura canónica de 1, SEQ ID NO: 133, una variante del SEQ ID NO: 133, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 133, una variante del SEQ ID NO: 133 que comprende la clase de estructura canónica de 1, SEQ ID NO: 134, una variante del SEQ ID NO: 134, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 134 o una variante del SEQ ID NO: 134 que comprende la clase de estructura canónica de 1.
Se divulgan anticuerpos caninizados y fragmentos de unión a antígeno de los mismos en donde la correspondiente CDRL3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 65, una variante del SEQ ID NO: 65, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 65, una variante del SEQ ID NO: 65 que comprende la clase de estructura canónica de 1, SEQ ID NO: 66, una variante del SEQ ID NO: 66, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 66, una variante del SEQ ID NO: 66 que comprende la clase de estructura canónica de 1, SEQ ID NO: 67, una variante del SEQ ID NO: 67, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 67, una variante del SEQ ID NO: 67 que comprende la clase de estructura canónica de 1, SEQ ID NO: 68, una variante del SEQ ID NO: 68, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 68, una variante del SEQ ID NO: 68 que comprende la clase de estructura canónica de 1, SEQ ID NO: 69, una variante del SEQ ID NO: 69, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 69, una variante del SEQ ID NO: 69 que comprende la clase de estructura canónica de 1, SEQ ID NO: 70, una variante del SEQ ID NO: 70, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 70, una variante del SEQ ID NO: 70 que comprende la clase de estructura canónica de 1, SEQ ID NO: 71, una variante del SEQ ID NO: 71, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 71, una variante del SEQ ID NO: 71 que comprende la clase de estructura canónica de 1, SEQ ID NO: 72, una variante del SEQ ID NO: 72, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 72, una variante del SEQ ID NO: 72 que comprende la clase de estructura canónica de 1, SEQ ID NO: 73, una variante del SEQ ID NO: 73, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 73, una variante del SEQ ID NO: 73 que comprende la clase de estructura canónica de 1, SEQ ID NO: 135, una variante del SEQ ID NO: 135, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 135, una variante del SEQ ID NO: 135 que comprende la clase de estructura canónica de 1, SEQ ID NO: 136, una variante del SEQ ID NO: 136, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 136, una variante del SEQ ID NO: 136 que comprende la clase de estructura canónica de 1, SEQ ID NO: 137, una variante del SEQ ID NO: 137, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 137, una variante del SEQ ID NO: 137 que comprende la clase de estructura canónica de 1, una variante del SEQ ID NO: 138, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 138, una variante del SEQ ID NO: 138 que comprende la clase de estructura canónica de 3, SEQ ID NO: 139, una variante del SEQ ID NO: 139, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 139 o una variante del SEQ ID NO: 139 que comprende la clase de estructura canónica de 1.
Se divulgan anticuerpos caninizados y fragmentos de unión a antígeno de los mismos en donde la correspondiente CDRH1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 74, una variante del SEQ ID NO: 74, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 74, una variante del SEQ ID NO: 74 que comprende la clase de estructura canónica de 1, SEQ ID NO: 75, una variante del SEQ ID NO: 75, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 75, una variante del SEQ ID NO: 75 que comprende la clase de estructura canónica de 1, SEQ ID NO: 76, una variante del SEQ ID NO: 76, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 76 o una variante del SEQ ID NO: 76 que comprende la clase de estructura canónica de 1, SEQ ID NO: 77, una variante del SEQ ID NO: 77, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 77 o una variante del SEQ ID NO: 77 que comprende la clase de estructura canónica de 1, SEQ ID NO: 78, una variante del SEQ ID NO: 78, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 78, una variante del SEQ ID NO: 78 que comprende la clase de estructura canónica de 1, SEQ ID NO: 79, una variante del SEQ ID NO: 79, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 79, una variante del SEQ ID NO: 79 que comprende la clase de estructura canónica de 1, SEQ ID NO: 80, una variante del SEQ ID NO: 80, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 80, una variante del SEQ ID NO: 80 que comprende la clase de estructura canónica de 1, SEQ ID NO: 81, una variante del SEQ ID NO: 81, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 81, una variante del SEQ ID NO: 81 que comprende la clase de estructura canónica de 1, SEQ ID NO: 82, una variante del SEQ ID NO: 82, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 82 o una variante del SEQ ID NO: 82 que comprende la clase de estructura canónica de 1, SEQ ID NO: 140, una variante del SEQ ID NO: 140, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 140, una variante del SEQ ID NO: 140 que comprende la clase de estructura canónica de 1, SEQ ID NO: 141, una variante del SEQ ID NO: 141, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 141, una variante del SEQ ID NO: 141 que comprende la clase de estructura canónica de 1, una variante del SEQ ID NO: 142, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 142, una variante del SEQ ID NO: 142 que comprende la clase de estructura canónica de 1, SEQ ID NO: 143, una variante del SEQ ID NO: 143, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 143 o una variante del SEQ ID NO: 143 que comprende la clase de estructura canónica de 1.
Se divulgan anticuerpos caninizados y fragmentos de unión a antígeno de los mismos en donde la correspondiente CDRH2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 83, una variante del SEQ ID NO: 83, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 83, una variante del SEQ ID NO: 83 que comprende la clase de estructura canónica de 3A, SEQ ID NO: 84, una variante del SEQ ID NO: 84, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 84, una variante del SEQ ID NO: 84 que comprende la clase de estructura canónica de 2A, SEQ ID NO: 85, una variante del SEQ ID NO: 85, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 85 o una variante del SEQ ID NO: 85 que comprende la clase de estructura canónica de 2B, SEQ ID NO: 86, una variante del SEQ ID NO: 86, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, una variante del SEQ ID NO: 87, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 87, una variante del SEQ ID NO: 87 que comprende la clase de estructura canónica de 1, SEQ ID NO: 88, una variante del SEQ ID NO: 88, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 88, una variante del SEQ ID NO: 88 que comprende la clase de estructura canónica de 2B, SEQ ID NO: 89, una variante del SEQ ID NO: 89, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 89, una variante del SEQ ID NO: 89 que comprende la clase de estructura canónica de 2B, SEQ ID NO: 90, una variante del SEQ ID NO: 90, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 90, una variante del SEQ ID NO: 90 que comprende la clase de estructura canónica de 1, SEQ ID NO: 91, una variante del SEQ ID NO: 91, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 91, una variante del SEQ ID NO: 91 que comprende la clase de estructura canónica de 2A, SEQ ID NO: 144, una variante del SEQ ID NO: 144, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 144, una variante del SEQ ID NO: 144 que comprende la clase de estructura canónica de 3A, SEQ ID NO: 145, una variante del SEQ ID NO: 145, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 145, una variante del SEQ ID NO: 145 que comprende la clase de estructura canónica de 2A, SEQ ID NO: 146, una variante del SEQ ID NO: 146, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 146, una variante del SEQ ID NO: 146 que comprende la clase de estructura canónica de 3A, una variante del SEQ ID NO: 147, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 147, una variante del SEQ ID NO: 147 que comprende la clase de estructura canónica de 3A, SEQ ID NO: 148, una variante del SEQ ID NO: 148, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 148 o una variante del SEQ ID NO: 148 que comprende la clase de estructura canónica de 3A.
Se divulgan anticuerpos caninizados y fragmentos de unión a antígeno de los mismos en donde la correspondiente CDRH3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 92, una variante del SEQ ID NO: 92, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 92, una variante del SEQ ID NO: 92 que comprende la clase de estructura canónica de 12, SEQ ID NO: 93, una variante del SEQ ID NO: 93, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 93, una variante del SEQ ID NO: 93 que comprende la clase de estructura canónica de 7, SEQ ID NO: 94, una variante del SEQ ID NO: 94, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 94 o una variante del SEQ ID NO: 94 que comprende la clase de estructura canónica de 15, SEQ ID NO: 95, una variante del SEQ ID NO: 95, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 95 o una variante del SEQ ID NO: 95 que comprende la clase de estructura canónica de 11, SEQ ID NO: 96, una variante del SEQ ID NO: 96, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 96, una variante del SEQ ID NO: 96 que comprende la clase de estructura canónica de 15, SEQ ID NO: 97, una variante del SEQ ID NO: 97, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 97, una variante del SEQ ID NO: 97 que comprende la clase de estructura canónica de 6, SEQ ID NO: 98, una variante del SEQ ID NO: 98, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 98, una variante del SEQ ID NO: 98 que comprende la clase de estructura canónica de 4, SEQ ID NO: 99, una variante del SEQ ID NO: 99, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 99, una variante del SEQ ID NO: 99 que comprende la clase de estructura canónica de 13, SEQ ID NO: 100, una variante del SEQ ID NO: 100, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 100 o una variante del SEQ ID NO: 100 que comprende la clase de estructura canónica de 6, SEQ ID NO: 149, una variante del SEQ ID NO: 149, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 149, una variante del SEQ ID NO: 149 que comprende la clase de estructura canónica de 15, SEQ ID NO: 150, una variante del SEQ ID NO: 150, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 150, una variante del SEQ ID NO: 150 que comprende la clase de estructura canónica de 10, SEQ ID NO: 151, una variante del SEQ ID NO: 151, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 151, una variante del SEQ ID NO: 151 que comprende la clase de estructura canónica de 15, una variante del SEQ ID NO: 152, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 152, una variante del SEQ ID NO: 152 que comprende la clase de estructura canónica de 9, SEQ ID NO: 153, una variante del SEQ ID NO: 153, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 153 o una variante del SEQ ID NO: 153 que comprende la clase de estructura canónica de 13.
Se describen anticuerpos de mamíferos (incluidos los anticuerpos caninizados) en donde la CDRL1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47, una variante del SEQ ID NO: 47, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 47 o una variante del SEQ ID NO: 47 que comprende la clase de estructura canónica de 1; la CDRL2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 56, una variante del SEQ ID NO: 56, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 56 o una variante del SEQ ID NO: 56 que comprende la clase de estructura canónica de 1; la CDRL3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 65, una variante del SEQ ID NO: 65, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 65 o una variante del SEQ ID NO: 65 que comprende la clase de estructura canónica de 1, la CDRH1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 74, una variante del SEQ ID NO: 74, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 74 o una variante del SEQ ID NO: 74 que comprende la clase de estructura canónica de 1; la CDRH2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 83, una variante del SEQ ID NO: 83, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 83 o una variante del SEQ ID NO: 83 que comprende la clase de estructura canónica de 3A, la CDRH3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 92, una variante del SEQ ID NO: 92, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 92 o una variante del SEQ ID NO: 92 que comprende la clase de estructura canónica de 12.
Se describen anticuerpos de mamíferos (incluidos los anticuerpos caninizados) en donde la CDRL1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 48, una variante del SEQ ID NO: 48, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 48 o una variante del SEQ ID NO: 48 que comprende la clase de estructura canónica de 2A; la CDRL2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 57, una variante del SEQ ID NO: 57, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 57 o una variante del SEQ ID NO: 57 que comprende la clase de estructura canónica de 1; la CDRL3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 66, una variante del SEQ ID NO: 66, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 66 o una variante del SEQ ID NO: 66 que comprende la clase de estructura canónica de 1, la CDRH1 comprende la secuencia de aminoácidos de s Eq ID NO: 75, una variante del SEQ ID NO: 75, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 75 o una variante del SEQ ID NO: 75 que comprende la clase de estructura canónica de 1; la CDRH2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 84, una variante del SEQ ID NO: 84, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 84 o una variante del SEQ ID NO: 84 que comprende la clase de estructura canónica de 2A, la CDRH3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 93, una variante del SEQ ID NO: 93, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 93 o una variante del SEQ ID NO: 93 que comprende la clase de estructura canónica de 7.
Se describen anticuerpos de mamíferos (incluidos los anticuerpos caninizados) en donde la CDRL1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 49, una variante del SEQ ID NO: 49, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 49 o una variante del SEQ ID NO: 49 que comprende la clase de estructura canónica de 4; la CDRL2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 58, una variante del SEQ ID NO: 58, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 58 o una variante del SEQ ID NO: 58 que comprende la clase de estructura canónica de 4; la CDRL3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 67, una variante del SEQ ID NO: 67, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 67 o una variante del SEQ ID NO: 67 que comprende la clase de estructura canónica de 1, la CDRH1 comprende la secuencia de aminoácidos de s Eq ID NO: 76, una variante del SEQ ID NO: 76, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 76 o una variante del SEQ ID NO: 76 que comprende la clase de estructura canónica de 1; la CDRH2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 85, una variante del SEQ ID NO: 85, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 85 y una variante del SEQ ID NO: 85 que comprende la clase de estructura canónica de 2B, la CDRH3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 94, una variante del SEQ ID NO: 94, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 94 o una variante del SEQ ID NO: 94 que comprende la clase de estructura canónica de 15. Se describen anticuerpos de mamíferos (incluidos los anticuerpos caninizados) en donde la CDRL1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 51, una variante del SEQ ID NO: 51, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 51 o una variante del SEQ ID NO: 51 que comprende la clase de estructura canónica de 3; la CDRL2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 60, una variante del SEQ ID NO: 60, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 60 o una variante del SEQ ID NO: 60 que comprende la clase de estructura canónica de 1; la CDRL3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 69, una variante del SEQ ID NO: 69, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 69 o una variante del SEQ ID NO: 69 que comprende la clase de estructura canónica de 1, la CDRH1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 78, una variante del SEQ ID NO: 78, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 78 o una variante del SEQ ID NO: 78 que comprende la clase de estructura canónica de 1; la CDRH2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 87, una variante del SEQ ID NO: 87, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 87 y una variante del SEQ ID NO: 87 que comprende la clase de estructura canónica de 1, la CDRH3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 96, una variante del SEQ ID NO: 96, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 96 o una variante del SEQ ID NO: 96 que comprende la clase de estructura canónica de 15.
Se describen anticuerpos de mamíferos (incluidos los anticuerpos caninizados) en donde la CDRL1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 52, una variante del SEQ ID NO: 52, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 52 o una variante del SEQ ID NO: 52 que comprende la clase de estructura canónica de 2A; la CDRL2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 61, una variante del SEQ ID NO: 61, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 61 o una variante del SEQ ID NO: 61 que comprende la clase de estructura canónica de 1; la CDRL3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 70, una variante del SEQ ID NO: 70, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 70 o una variante del SEQ ID NO: 70 que comprende la clase de estructura canónica de 1, la CDRH1 comprende la secuencia de aminoácidos de s Eq ID NO: 79, una variante del SEQ ID NO: 79, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 79 o una variante del SEQ ID NO: 79 que comprende la clase de estructura canónica de 1; la CDRH2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 88, una variante del SEQ ID NO: 88, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 88 y una variante del SEQ ID NO: 88 que comprende la clase de estructura canónica de 2B, la CDRH3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 97, una variante del SEQ ID NO: 97, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 97 o una variante del SEQ ID NO: 97 que comprende la clase de estructura canónica de 6.
Se describen anticuerpos de mamíferos (incluidos los anticuerpos caninizados) en donde la CDRL1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 53, una variante del SEQ ID NO: 53, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 53 o una variante del SEQ ID NO: 53 que comprende la clase de estructura canónica de 6; la CDRL2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 62, una variante del SEQ ID NO: 62, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 62 o una variante del SEQ ID NO: 62 que comprende la clase de estructura canónica de 1; la CDRL3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 71, una variante del SEQ ID NO: 71, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 71 o una variante del SEQ ID NO: 71 que comprende la clase de estructura canónica de 1, la CDRH1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 80, una variante del SEQ ID NO: 80, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 80 o una variante del SEQ ID NO: 80 que comprende la clase de estructura canónica de 1; la CDRH2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 89, una variante del SEQ ID NO: 89, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 89 y una variante del SEQ ID NO: 89 que comprende la clase de estructura canónica de 2B, la CDRH3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 98, una variante del SEQ ID NO: 98, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 98 o una variante del SEQ ID NO: 98 que comprende la clase de estructura canónica de 4.
Se describen anticuerpos de mamíferos (incluidos los anticuerpos caninizados) en donde la CDRL1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 54, una variante del SEQ ID NO: 54, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 54 o una variante del SEQ ID NO: 54 que comprende la clase de estructura canónica de 1; la CDRL2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 63, una variante del SEQ ID NO: 63, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 63 o una variante del SEQ ID NO: 63 que comprende la clase de estructura canónica de 1; la CDRL3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 72, una variante del SEQ ID NO: 72, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 72 o una variante del SEQ ID NO: 72 que comprende la clase de estructura canónica de 1, la CDRH1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 81, una variante del SEQ ID NO: 81, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 81 o una variante del SEQ ID NO: 81 que comprende la clase de estructura canónica de 1; la CDRH2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 90, una variante del SEQ ID NO: 90, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 90 y una variante del SEQ ID NO: 90 que comprende la clase de estructura canónica de 1, la CDRH3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 99, una variante del SEQ ID NO: 99, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 99 o una variante del SEQ ID NO: 99 que comprende la clase de estructura canónica de 13. En una descripción particular de este tipo, cuando el anticuerpo (o fragmento de unión a antígeno del mismo) se une al receptor a de la interleucina 4 canina (IL-4Ra) el anticuerpo se une al menos a un resto de aminoácido, preferentemente de dos a cinco restos de aminoácidos y/o más preferentemente de tres a ocho restos de aminoácidos o más dentro de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 157 o SEQ ID NO: 158 o dentro del SEQ ID NO: 157 y el SEQ ID NO: 158.
Se describen anticuerpos de mamíferos (incluidos los anticuerpos caninizados) en donde la CDRL1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 55, una variante del SEQ ID NO: 55, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 55 o una variante del SEQ ID NO: 55 que comprende la clase de estructura canónica de 2A; la CDRL2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 64, una variante del SEQ ID NO: 64, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 64 o una variante del SEQ ID NO: 64 que comprende la clase de estructura canónica de 1; la CDRL3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 73, una variante del SEQ ID NO: 73, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 73 o una variante del SEQ ID NO: 73 que comprende la clase de estructura canónica de 1, la CDRH1 comprende la secuencia de aminoácidos de s Eq ID NO: 82, una variante del SEQ ID NO: 82, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 82 o una variante del SEQ ID NO: 82 que comprende la clase de estructura canónica de 1; la CDRH2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 91, una variante del SEQ ID NO: 91, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 91 o una variante del SEQ ID NO: 91 que comprende la clase de estructura canónica de 2A, la CDRH3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 100, una variante del SEQ ID NO: 100, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 100 o una variante del SEQ ID NO: 100 que comprende la clase de estructura canónica de 6.
Se describen anticuerpos de mamíferos (incluidos los anticuerpos caninizados) en donde la CDRL1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 129, una variante del SEQ ID NO: 129, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 129 o una variante del SEQ ID NO: 129 que comprende la clase de estructura canónica de 6; la CDRL2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 132, una variante del SEQ ID NO: 132, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 132 o una variante del SEQ ID NO: 132 que comprende la clase de estructura canónica de 1; la CDRL3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 135, una variante del SEQ ID NO: 135, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 135 o una variante del SEQ ID NO: 135 que comprende la clase de estructura canónica de 1, la CDRH1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 140, una variante del SEQ ID NO: 140, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 140 o una variante del SEQ ID NO: 140 que comprende la clase de estructura canónica de 1; la CDRH2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 144, una variante del SEQ ID NO: 144, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 144 o una variante del SEQ ID NO: 144 que comprende la clase de estructura canónica de 3A, la CDRH3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 149, una variante del SEQ ID NO: 149, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 149 o una variante del SEQ ID NO: 149 que comprende la clase de estructura canónica de 15. En una descripción particular de este tipo, cuando el anticuerpo (o fragmento de unión a antígeno del mismo) se une al receptor a de la interleucina 4 canina (IL-4Ra) el anticuerpo se une al menos a un resto de aminoácido, preferentemente de dos a cinco restos de aminoácidos y/o más preferentemente de tres a ocho restos de aminoácidos o más dentro de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 127 o SEQ ID NO: 128 o dentro del SEQ ID NO: 127 y el SEQ ID NO: 128.
Se describen anticuerpos de mamíferos (incluidos los anticuerpos caninizados) en donde la CDRL1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 130, una variante del SEQ ID NO: 130, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 130 o una variante del SEQ ID NO: 130 que comprende la clase de estructura canónica de 6; la CDRL2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 133, una variante del SEQ ID NO: 133, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 133 o una variante del SEQ ID NO: 133 que comprende la clase de estructura canónica de 1; la CDRL3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 136, una variante del SEQ ID NO: 136, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 136 o una variante del SEQ ID NO: 136 que comprende la clase de estructura canónica de 1, la CDRH1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 141, una variante del SEQ ID NO: 141, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 141 o una variante del SEQ ID NO: 141 que comprende la clase de estructura canónica de 1; la CDRH2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 145, una variante del SEQ ID NO: 145, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 145 o una variante del SEQ ID NO: 145 que comprende la clase de estructura canónica de 2A, la CDRH3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 150, una variante del SEQ ID NO: 150, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 150 o una variante del SEQ ID NO: 150 que comprende la clase de estructura canónica de 10. En una descripción particular de este tipo, cuando el anticuerpo (o fragmento de unión a antígeno del mismo) se une al receptor a de la interleucina 4 canina (IL-4Ra) el anticuerpo se une al menos a un resto de aminoácido, preferentemente de dos a cinco restos de aminoácidos y/o más preferentemente de tres a ocho restos de aminoácidos o más dentro de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 158 o SEQ ID NO: 162 o dentro del SEQ ID NO: 158 y el SEQ ID NO: 162.
Se describen anticuerpos de mamíferos (incluidos los anticuerpos caninizados) en donde la CDRL1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 129, una variante del SEQ ID NO: 129, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 129 o una variante del SEQ ID NO: 129 que comprende la clase de estructura canónica de 6; la CDRL2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 134, una variante del SEQ ID NO: 134, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 134 o una variante del SEQ ID NO: 134 que comprende la clase de estructura canónica de 1; la CDRL3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 137, una variante del SEQ ID NO: 137, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 137 o una variante del SEQ ID NO: 137 que comprende la clase de estructura canónica de 1, la CDRH1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 140, una variante del SEQ ID NO: 140, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 140 o una variante del SEQ ID NO: 140 que comprende la clase de estructura canónica de 1; la CDRH2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 146, una variante del SEQ ID NO: 146, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 146 o una variante del SEQ ID NO: 146 que comprende la clase de estructura canónica de 3A, la CDRH3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 151, una variante del SEQ ID NO: 151, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 151 o una variante del SEQ ID NO: 151 que comprende la clase de estructura canónica de 15. En una descripción particular de este tipo, cuando el anticuerpo (o fragmento de unión a antígeno del mismo) se une al receptor a de la interleucina 4 canina (IL-4Ra) el anticuerpo se une al menos a un resto de aminoácido, preferentemente de dos a cinco restos de aminoácidos y/o más preferentemente de tres a ocho restos de aminoácidos o más dentro de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 125 o SEQ ID NO: 126 o dentro del SEQ ID NO: 125 y el SEQ ID NO: 126.
En una realización de anticuerpos caninizados, la CDRL1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 131; la CDRL2 comprende la secuencia de aminoácidos de s Eq ID NO: 60; la CDRL3 comprende la secuencia de aminoácidos de Se Q ID NO: 138; la CDRH1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 142; la CDRH2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 147; la CDRH3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 152. En una descripción particular de este tipo, cuando el anticuerpo (o fragmento de unión a antígeno del mismo) se une al receptor a de la interleucina 4 canina (IL-4Ra) el anticuerpo se une al menos a un resto de aminoácido, preferentemente de dos a cinco restos de aminoácidos y/o más preferentemente de tres a ocho restos de aminoácidos o más dentro de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 154 o SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 156 o cualquier combinación de las mismas.
Se describen más anticuerpos de mamíferos (incluidos los anticuerpos caninizados) en donde la CDRL1 comprende la secuencia de aminoácidos de una variante del SEQ ID NO: 131, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 131 o una variante del SEQ ID NO: 131 que comprende la clase de estructura canónica de 3; la CDRL2 comprende la secuencia de aminoácidos de una variante del SEQ ID NO: 60, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 60 o una variante del SEQ ID NO: 60 que comprende la clase de estructura canónica de 1; la CDRL3 comprende la secuencia de aminoácidos de una variante del SEQ ID NO: 138, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 138 o una variante del SEQ ID NO: 138 que comprende la clase de estructura canónica de 3, la CDRH1 comprende la secuencia de aminoácidos de una variante del s Eq ID NO: 142, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 142 o una variante del SEQ ID NO: 142 que comprende la clase de estructura canónica de 1; la CDRH2 comprende la secuencia de aminoácidos de una variante del SEQ ID NO: 147, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 147 o una variante del SEQ ID NO: 147 que comprende la clase de estructura canónica de 3A, la CDRH3 comprende la secuencia de aminoácidos de una variante del SEQ ID NO: 152, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 152 o una variante del SEQ ID NO: 152 que comprende la clase de estructura canónica de 9. En una descripción particular de este tipo, cuando el anticuerpo (o fragmento de unión a antígeno del mismo) se une al receptor a de la interleucina 4 canina (IL-4Ra) el anticuerpo se une al menos a un resto de aminoácido, preferentemente de dos a cinco restos de aminoácidos y/o más preferentemente de tres a ocho restos de aminoácidos o más dentro de la secuencia de aminoácidos de SEQ iD NO: 154 o SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 156 o cualquier combinación de las mismas.
Se describen anticuerpos de mamíferos (incluidos los anticuerpos caninizados) en donde la CDRL1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 129, una variante del SEQ ID NO: 129, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 129 o una variante del SEQ ID NO: 129 que comprende la clase de estructura canónica de 6; la CDRL2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID n O: 132, una variante del SEQ ID NO: 132, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 132 o una variante del SEQ ID NO: 132 que comprende la clase de estructura canónica de 1; la CDRL3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 139, una variante del SEQ ID NO: 139, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 139 o una variante del SEQ ID NO: 139 que comprende la clase de estructura canónica de 1, la CDRH1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ iD NO: 143, una variante del SEQ ID NO: 143, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 143 o una variante del SEQ ID NO: 143 que comprende la clase de estructura canónica de 1; la CDRH2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 148, una variante del SEQ ID NO: 148, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 148 o una variante del SEQ ID NO: 148 que comprende la clase de estructura canónica de 3A, la CDRH3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 153, una variante del SEQ ID NO: 153, una variante modificada de manera conservadora del SEQ ID NO: 153 o una variante del SEQ ID NO: 153 que comprende la clase de estructura canónica de 13. En una descripción particular de este tipo, cuando el anticuerpo (o fragmento de unión a antígeno del mismo) se une al receptor a de la interleucina 4 canina (IL-4Ra) el anticuerpo se une al menos a un resto de aminoácido, preferentemente de dos a cinco restos de aminoácidos y/o más preferentemente de tres a ocho restos de aminoácidos o más dentro de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 159 o SEQ ID NO: 160 o SEQ ID NO: 161 o cualquier combinación de las mismas.
La presente invención incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen al receptor a de la interleucina 4 canina (IL-4Ra) con especificidad. En particular, los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos se unen al IL-4Ra canino y bloquean la unión del IL-4Ra canino a la IL-4 y/o IL-13 canina. Como se ha indicado anteriormente, los anticuerpos de mamífero aislados o los fragmentos de unión a antígeno de los mismos son anticuerpos caninizados o fragmentos de unión a antígeno de los mismos caninizados. Los anticuerpos caninizados aislados o fragmentos de unión a antígenos de los mismos caninizados pueden ser anticuerpos murinos o fragmentos de unión a antígenos de los mismos murinos.
Los anticuerpos caninizados o los fragmentos de unión a antígeno de los mismos caninizados de la presente invención pueden comprender una región bisagra. En una realización particular de este tipo, la región bisagra comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 101. En otra realización, la región de bisagra comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 102. En otra realización más, la región bisagra comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 103. En aún otra realización más, la región bisagra comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 104.
El anticuerpo caninizado o el fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la invención puede comprender una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 164. Se describe además que la cadena pesada puede estar codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 163. El anticuerpo caninizado o el fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la invención, puede comprender una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 166. Se describe además que la cadena pesada puede estar codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 165. El anticuerpo caninizado o el fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la invención, puede comprender una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 168. Se describe además que la cadena pesada puede estar codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 167. En descripciones específicas, cuando el anticuerpo caninizado (o fragmento de unión a antígeno del mismo) se une al receptor a de la interleucina 4 canina (IL-4Ra) el anticuerpo se une al menos a un resto de aminoácido, preferentemente de dos a cinco restos de aminoácidos y/o más preferentemente de tres a ocho restos de aminoácidos o más dentro de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 154 o SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 156 o cualquier combinación de las mismas.
El anticuerpo caninizado o el fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la invención, puede comprender una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 170. Se describe además que la cadena ligera puede estar codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 169. El anticuerpo caninizado o el fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la invención, puede comprender una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 172. Se describe además que la cadena ligera puede estar codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 171.
El anticuerpo caninizado o el fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la invención, puede comprender una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 174. Se describe además que la cadena ligera puede estar codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 173. En descripciones particulares, cuando el anticuerpo caninizado (o fragmento de unión a antígeno del mismo) se une al receptor a de la interleucina 4 canina (IL-4Ra) el anticuerpo se une al menos a un resto de aminoácido, preferentemente de dos a cinco restos de aminoácidos y/o más preferentemente de tres a ocho restos de aminoácidos o más dentro de la secuencia de aminoácidos de Se Q ID NO: 154 o SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 156 o cualquier combinación de las mismas.
La presente invención proporciona además anticuerpos que comprenden una combinación de dichas cadenas pesadas y cadenas ligeras. De acuerdo con la invención, la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 164 y la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 170. Se describe además que la cadena pesada está codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 163 y la cadena ligera está codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 169. De acuerdo con la invención, la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 166 y la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 172. Se describe además que la cadena pesada está codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 165 y la cadena ligera está codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 171. De acuerdo con la invención, la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 168 y la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 174. Se describe además que la cadena pesada está codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 167 y la cadena ligera está codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 173.
Se describe además que la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 164 y la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 172. Se describe además que la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 164 y la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 174. Se describe además que la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 166 y la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 170. Se describe además que la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 166 y la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 174. Se describe además que la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 168 y la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 170. Se describe además que la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 168 y la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 172.
En descripciones particulares, cuando el anticuerpo caninizado (o fragmento de unión a antígeno del mismo) se une al receptor a de la interleucina 4 canina (IL-4Ra ) el anticuerpo se une al menos a un resto de aminoácido, preferentemente de dos a cinco restos de aminoácidos, y/o más preferentemente de tres a ocho o más restos de aminoácidos dentro de la secuencia de aminoácidos de Se Q ID No : 154 o SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 156 o cualquier combinación de las mismas.
Se describe además que los anticuerpos de mamífero aislados o los fragmentos de unión a antígeno de los mismos (incluidos los anticuerpos caninizados o los fragmentos de unión a antígeno de los mismos ) que se unen al receptor a de interleucina 4 canina (IL-4Ra ) con especificidad, y cuando se une al IL-4Ra canino el anticuerpo se une a al menos un resto de aminoácido, preferentemente de dos a cinco restos de aminoácidos, y/o más preferentemente de tres a ocho restos de aminoácidos o más dentro de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 125 o SEQ ID NO: 126 o SEQ ID NO: 127 o SEQ ID NO: 128 o SEQ ID NO: 154 o SEQ ID NO: 155 o SEQ ID NO: 156 o SEQ ID NO: 157 o SEQ ID NO: 158 o SEQ ID NO: 159 o SEQ ID NO: 160 o SEQ ID NO: 161 o SEQ ID NO: 162 o cualquier combinación de las mismas.
De acuerdo con la invención, el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo se une al IL-4Ra canino y bloquea la unión del IL-4Ra canino a la interleucina 4 canina.
La presente invención proporciona además anticuerpos caninizados o fragmentos de unión a antígeno caninizados de los mismos que se unen al IL-4Ra canino con una constante de disociación (Kd) que es inferior (por ejemplo, 1 * 10 ' 13 M, o inferior) a 1 * 10' 12 M. En realizaciones particulares, los anticuerpos caninizados o los fragmentos de unión a antígeno caninizados de los mismos se unen al IL-4Ra canino con una constante de disociación de 1 * 10' 5 M hasta 1 * 10' 12 M. En realizaciones más particulares, los anticuerpos caninizados o los fragmentos de unión a antígeno caninizados de los mismos se unen al IL-4Ra canino con una constante de disociación de 1 * 10' 7 M hasta 1 * 10' 11 M. En realizaciones aún más particulares, los anticuerpos caninizados o los fragmentos de unión a antígeno caninizados de los mismos se unen al IL-4Ra canino con una constante de disociación de 1 * 10' 8 M hasta 1 * 10' 11 M. En realizaciones todavía más particulares, los anticuerpos caninizados o los fragmentos de unión a antígeno caninizados de los mismos se unen al IL-4Ra canino con una constante de disociación de 1 * 10' 8 M hasta 1 * 10' 10 M. La presente invención también proporciona anticuerpos caninizados o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen al IL-4Ra canino con una velocidad de asociación (kon) que es superior a 1 * 107 M' V 1. En realizaciones particulares, los anticuerpos caninizados o los fragmentos de unión a antígeno de los mismos caninizados se unen al IL-4Ra canino con una velocidad de asociación 1 * 102 M' V 1 hasta 1 * 107 M' V 1. En realizaciones más particulares, los anticuerpos caninizados o los fragmentos de unión a antígeno de los mismos caninizados se unen al IL-4Ra canino con una velocidad de asociación 1 * 103 M-1s-1 hasta 1 * 106 M-1s-1. En realizaciones aún más particulares, los anticuerpos caninizados o los fragmentos de unión a antígeno de los mismos caninizados se unen al IL-4Ra canino con una velocidad de asociación 1 * 103 M' V 1 hasta 1 * 105 M' V 1. En realizaciones todavía más particulares, los anticuerpos caninizados o los fragmentos de unión a antígeno de los mismos caninizados se unen al IL-4Ra canino con una velocidad de asociación 1 * 104 M' V 1 hasta 1 * 105 M' V 1.
La presente invención también proporciona anticuerpos caninizados o fragmentos de unión a antígeno de los mismos caninizados que se unen al IL'4Ra canino con una velocidad de disociación (kf inferior a 1 * 10' 7 s' 1. En realizaciones particulares, los anticuerpos caninizados o los fragmentos de unión a antígeno de los mismos caninizados se unen al IL'4Ra canino con una velocidad de disociación de 1 * 10' 3 s' 1 hasta 1 * 10' 8 s' 1. En realizaciones más particulares, los anticuerpos caninizados o los fragmentos de unión a antígeno de los mismos caninizados se unen al IL'4Ra canino con una velocidad de disociación de 1 * 10' 4 s' 1 hasta 1 * 10' 7 s' 1. En realizaciones todavía más particulares, los anticuerpos caninizados o los fragmentos de unión a antígeno de los mismos caninizados se unen al IL'4Ra canino con una velocidad de disociación de 1 * 10' 5 s' 1 hasta 1 * 10'7 s' 1.
El anticuerpo caninizado de la presente invención bloquea la unión de la IL'4 canina con el IL'4Ra . En realizaciones más particulares, el anticuerpo bloquea la unión de la iL'4 canina con el IL'4Ra con una CE50 mínima de 1 * 10' 8 M a 1 * 10' 9 M o incluso una concentración inferior. En realizaciones aún más particulares, la CE50 es 5 * 10' 9 M hasta 5 * 10' 13 M. En todavía realizaciones más particulares, la CE50 está entre 5 * 10' 9 M y 5 * 10' 11 M.
En realizaciones relacionadas, los anticuerpos caninizados o los fragmentos de unión a antígeno de los mismos caninizados atenúan de manera negativa, por ejemplo, inhiben, la(s) vía(s) de señalización celular mediada por la unión de la IL'4 y/o la IL'13 a receptores de la IL'4 de tipo I y/o de tipo II. En realizaciones particulares, los anticuerpos caninizados o los fragmentos de unión a antígeno de los mismos mejoran una enfermedad cutánea inflamatoria pruriginosa, por ejemplo, dermatitis atópica, en un sujeto animal. En realizaciones más específicas, el sujeto animal es un canino. En una realización relacionada, el sujeto animal es un felino.
En consecuencia, cualquiera de los anticuerpos de la presente invención puede presentar una, dos, tres, cuatro o todas estas propiedades, es decir, las constantes de disociación mencionadas anteriormente con el IL-4Ra canino, las velocidades de asociación para la unión mencionadas anteriormente con IL-4Ra canino, las velocidades de disociación para disociarse del complejo de unión anticuerpo-IL-4Ra canino mencionadas anteriormente, la inhibición de la(s) vía(s) de señalización celular mediada por la unión de la IL-4 y/o la IL-13 a los receptores de la IL-4 de tipo I y/o de tipo II o la mejora de una enfermedad cutánea inflamatoria pruriginosa, por ejemplo, dermatitis atópica, en un sujeto animal.
Como se ha indicado anteriormente, los anticuerpos (y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos) de la presente invención, que incluyen los anticuerpos antes mencionados (y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos), pueden ser anticuerpos monoclonales (y fragmentos de unión a antígeno de los mismos), anticuerpos de mamífero (y fragmentos de unión a antígeno de los mismos), por ejemplo, anticuerpos murinos (de ratón) (y fragmentos de unión a antígeno de los mismos) que incluyen anticuerpos murinos caninizados (y fragmentos de unión a antígeno de los mismos), y, en determinadas realizaciones, se aíslan los anticuerpos (y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos).
La presente invención proporciona además ácidos nucleicos (incluidos ácidos nucleicos aislados) que codifican una cualquiera de las cadenas ligeras de los anticuerpos caninizados de la presente invención. De forma similar, la presente invención proporciona ácidos nucleicos aislados que codifican una cualquiera de las cadenas pesadas del anticuerpo caninizado de la presente invención.
La presente invención proporciona además vectores de expresión que comprenden uno o más de los ácidos nucleicos (incluyendo ácidos nucleicos aislados) de la presente invención. La presente invención proporciona además células hospedadoras que comprenden uno o más vectores de expresión de la presente invención.
En realizaciones particulares, el anticuerpo es un anticuerpo recombinante o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En realizaciones relacionadas, el dominio variable de cadena pesada y el dominio variable de cadena ligera están conectados por un enlazador flexible para formar un anticuerpo monocatenario.
En realizaciones particulares, el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno es un fragmento Fab.
En otras realizaciones, el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno es un fragmento Fab'. En otras realizaciones, el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno es un fragmento (Fab')2. En otras realizaciones más, el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno es un diacuerpo. En realizaciones particulares, el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno es un anticuerpo de dominio. En realizaciones particulares, el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno es un anticuerpo de dominio único.
En realizaciones particulares, un anticuerpo murino caninizado anti-IL-4Ra canino o un fragmento de unión al antígeno atenúa de manera negativa la(s) vía(s) de señalización celular mediada por la unión de la IL-4 y/o la IL-13 a los receptores de la IL-4 de tipo I y/o de tipo II en un sujeto animal (por ejemplo, canino) que está siendo tratado. En realizaciones más particulares, la administración de un anticuerpo murino caninizado anti-IL-4Ra canino o un fragmento de unión a antígeno de la presente invención sirve para mejorar uno o más síntomas de dermatitis atópica en el sujeto animal (por ejemplo, canino) que se está tratando.
La presente invención proporciona además ácidos nucleicos aislados que codifican anticuerpos murinos caninizados anti-IL-4Ra canino o porciones de los mismos. En realizaciones relacionadas, dichos anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno se pueden utilizar para la preparación de un medicamento para tratar la dermatitis atópica en un sujeto canino. Como alternativa, o en conjunto, la presente invención proporciona el uso de cualquiera de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos de la presente invención para uso diagnóstico. En otras realizaciones adicionales, se proporciona un kit que comprende cualquiera de los anticuerpos caninizados o fragmentos de unión a antígeno divulgados en el presente documento.
En otras realizaciones adicionales, se proporciona un vector de expresión que comprende un ácido nucleico aislado que codifica cualquiera de los anticuerpos murinos caninizados anti-IL-4Ra canino o fragmentos de unión a antígeno de la invención. La invención también se refiere a una célula hospedadora que comprende cualquiera de los vectores de expresión descritos en el presente documento. En realizaciones particulares, estos ácidos nucleicos, los vectores de expresión o polipéptidos de la invención son útiles en los métodos para preparar un anticuerpo.
Se describen péptidos adicionales (incluidos péptidos antigénicos aislados) que consisten en 80 o menos restos de aminoácidos que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 125, o SEQ ID NO: 126, o SEQ ID NO: 127, o SEQ ID NO: 128, o SEQ ID NO: 154, o SEQ ID NO: 155, o SEQ ID NO: 156, o SEQ ID NO: 157, o SEQ ID NO: 158, o SEQ ID NO: 159, o SEQ ID NO: 160, o SEQ ID NO: 161, o SEQ ID NO: 162. También se describen péptidos (incluidos péptidos antigénicos aislados) que consisten en 60 o menos restos de aminoácidos que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 125, o SEQ ID NO: 126, o SEQ ID NO: 127, o SEQ ID NO.: 128, o SEQ ID NO: 154, o SEQ ID NO: 155, o SEQ ID NO: 156, o SEQ ID NO: 157, o SEQ ID NO: 158, o SEQ ID NO: 159, o SEQ ID NO: 160, o SEQ ID NO: 161, o SEQ ID NO: 162. Además, se describen péptidos (incluidos péptidos antigénicos aislados) que consisten en 10 a 45 restos de aminoácidos que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 125, o SEQ ID NO: 126, o SEQ ID NO: 127, o SEQ ID NO: 128, o SEQ ID NO: 154, o SEQ ID NO: 155, o SEQ ID NO: 156, o SEQ ID NO: 157, o SEQ ID NO: 158, o SEQ ID NO: 159, o SEQ ID NO: 160, o SEQ ID NO: 161, o SEQ ID NO: 162. Se describen péptidos adicionales (incluidos péptidos antigénicos aislados) que consisten en 5 a 25 restos de aminoácidos de, o que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 125, o SEQ ID NO: 126, o SEQ ID NO: 127, o SEQ ID NO: 128, o SEQ ID NO: 154, o SEQ ID NO: 155, o SEQ ID NO: 156, o SEQ ID NO: 157, o SEQ ID NO: 158, o SEQ ID NO: 159, o SEQ ID NO: 160, o SEQ ID NO: 161, o SEQ ID NO: 162.
De manera adicional, se describen péptidos antigénicos (incluidos péptidos aislados) que consisten en 80 o menos restos de aminoácidos que comprenden una secuencia de aminoácidos que es el 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 125, o SEQ ID NO: 126, o SEQ ID NO: 127, o SEQ ID NO: 128, o SEQ ID NO: 154, o SEQ ID NO: 155, o SEQ ID NO: 156, o SEQ ID NO: 157, o SEQ ID NO: 158, o SEQ ID NO: 159, o SEQ ID NO: 160, o SEQ ID NO: 161, o SEQ ID NO: 162 y se une a un anticuerpo de mamífero aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención. También se describen péptidos antigénicos (incluidos péptidos antigénicos aislados) que consisten en 60 o menos restos de aminoácidos que comprenden una secuencia de aminoácidos que es el 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 125, o SEQ ID NO: 126, o SEQ ID NO: 127, o SEQ ID NO: 128, o SEQ ID NO: 154, o SEQ ID NO: 155, o SEQ ID NO: 156, o SEQ ID NO: 157, o SEQ ID NO: 158, o SEQ ID NO: 159, o SEQ ID NO: 160, o SEQ ID NO: 161, o SEQ ID NO: 162 y se une a un anticuerpo de mamífero aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo. Se describen otros péptidos que consisten en 5 a 25 restos de aminoácidos de, o que comprenden una secuencia de aminoácidos que es del 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 125, o SEQ ID NO: 126, o SEQ ID NO: 127, o SEQ ID NO: 128, o SEQ ID NO: 154, o SEQ ID NO: 155, o SEQ ID NO: 156, o SEQ ID NO: 157, o SEQ ID NO: 158, o SEQ ID NO: 159, o SEQ ID NO: 160, o SEQ ID NO: 161, o SEQ ID NO: 162 y se une a un anticuerpo de mamífero aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo. Se describe un anticuerpo de mamífero que comprende las CDR de 4D8. Se describe un anticuerpo de mamífero que comprende las CDR de 11H2. El anticuerpo de mamífero de la presente invención comprende las CDR de 4H3. Se describe un anticuerpo de mamífero que comprende las CDR de 11B6. Se describe un anticuerpo de mamífero que comprende las CDR de 2E2. Se describe un anticuerpo de mamífero que comprende las CDR de 6C12.
La presente invención describe además proteínas de fusión que comprenden cualquiera de los péptidos mencionados anteriormente. En una descripción particular, la proteína de fusión comprende tal péptido antigénico y una región Fc de un anticuerpo IgG de mamífero no canino. En una descripción más particular, la proteína de fusión comprende una región Fc de un anticuerpo IgG de mamífero no canino. En determinadas descripciones, el anticuerpo IgG de mamífero no canino es una IgG murina. En descripciones alternativas, el anticuerpo IgG de mamífero no canino es una IgG humana. En otras descripciones, el anticuerpo IgG de mamífero no canino es una IgG equina. En otras descripciones más, el anticuerpo IgG de mamífero no canino es una IgG porcina. En todavía otras descripciones, el anticuerpo IgG de mamífero no canino es una IgG bovina.
En descripciones particulares, el anticuerpo IgG de mamífero no canino es una IgG1. En otras descripciones, el anticuerpo IgG de mamífero no canino es una IgG2a. En otras descripciones más, el anticuerpo IgG de mamífero no canino es una IgG3. En aún otras descripciones, el anticuerpo IgG de mamífero no canino es una IgG4. En otras descripciones, la proteína de fusión comprende cualquiera de los péptidos antigénicos mencionados anteriormente y proteína de unión a maltosa. En aún otras descripciones, la proteína de fusión comprende cualquiera de los péptidos antigénicos antes mencionados y p-galactosidasa. En todavía otras descripciones, la proteína de fusión comprende cualquiera de los péptidos antigénicos antes mencionados y glutatión S-transferasa. En aún otras descripciones, la proteína de fusión comprende cualquiera de los péptidos antigénicos antes mencionados y tiorredoxina. En otras descripciones más, la proteína de fusión comprende cualquiera de los péptidos antigénicos antes mencionados y Gro EL. En otras descripciones más, la proteína de fusión comprende cualquiera de los péptidos antigénicos antes mencionados y NusA.
La presente invención describe además ácidos nucleicos (incluidos ácidos nucleicos aislados) que codifican los péptidos antigénicos y las proteínas de fusión correspondientes de la presente invención. La presente invención también describe vectores de expresión que comprenden estos ácidos nucleicos y células hospedadoras que comprenden uno o más vectores de expresión de la presente invención.
De manera adicional, la presente invención incluye composiciones farmacéuticas que comprenden anticuerpos anti-IL-4Ra canino o fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la presente invención, ácidos nucleicos (incluidos ácidos nucleicos aislados) que codifican los fragmentos antigénicos de la presente invención, los vectores de expresión que comprenden dichos ácidos nucleicos, o cualquier combinación de los mismos, y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
De manera adicional, la presente invención proporciona métodos para atenuar de manera negativa la actividad de la IL-4 y/o la IL-13 que comprenden administrar a un sujeto animal que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de dichas composiciones farmacéuticas. En determinadas realizaciones, el método se utiliza para el tratamiento de la dermatitis atópica en un canino.
Estos y otros aspectos de la presente invención se comprenderán mejor en referencia a la siguiente breve descripción de los dibujos y a la descripción detallada.
Breve descripción de los dibujos
En la figura 1 se muestra la reactividad de los anticuerpos monoclonales (AcM) de ratón anti-IL-4Ra canino purificados contra el dominio extracelular del IL-4Ra canino. Se probaron varios AcM de ratón para determinar su unión al dominio extracelular del IL-4Ra canino mediante ELISA. Los AcM probados se denominan como: 1A3 (•), 1A9 (■), 1B12 (A), 10C12 (▼), 10F2 (♦), 10E10 (•), 10 G8 (■), 11B6 (A), 11D3 (▼) y el anticuerpo de control (♦). La abscisa representa la concentración logarítmica del AcM (nM) que se añade, la ordenada representa la densidad óptica obtenida mediante ELISA.
En la figura 2A se muestra la curva de respuesta a la dosis para la unión de la IL-4 canina al IL-4Ra canino expresada en la superficie de las células CHO, utilizando un ensayo de unión de CHO-cIL-4Ra basado en células. La abscisa representa la concentración logarítmica de la IL-4 que se añade, la ordenada representa la intensidad media de fluorescencia (IMF) empleando FACS.
En la figura 2B se muestran las curvas de respuesta a la dosis para CHO-cIL-4Ra mediante los anticuerpos monoclonales (AcM) de ratón anti-IL-4Ra canino: 11B6 (•), 4D8 (■), 4H3 (A), 2E2 (▼), 11H2 (♦ ) y 6C12 (0) La abscisa representa la concentración logarítmica del AcM (nM) que se añade, la ordenada representa la intensidad media de fluorescencia (IMF) empleando FACS. Las concentraciones eficaces semimáximas (CE50) para cada uno de los anticuerpos se proporcionan en la tabla 2 a continuación.
En las figuras 3A y 3B se muestran los resultados de la adición de los anticuerpos monoclonales (AcM) de ratón individuales anti-IL-4Ra canino diluidos de manera sucesiva sobre la unión de la IL-4 con el CHO-cIL-4Ra basado en células. En la figura 3A se representa la capacidad dependiente de la concentración de los anticuerpos monoclonales 11B6 (♦), 4D8 (■), 4H3 (A), 2E2 (▼) y 11H2 (♦ ) para bloquear de manera individual la unión de la IL-4 con el CHO-cIL-4Ra basado en células. En la figura 3B se representa la capacidad dependiente de la concentración de los anticuerpos monoclonales 11H2 (♦ ) y 6C12 (■) para bloquear de manera individual la unión de la IL-4 con el CHO-cIL-4Ra basado en células. La abscisa representa la concentración logarítmica del AcM (nM) que se añade, la ordenada representa la intensidad media de fluorescencia (IMF) empleando FACS.
En la figura 4 se representa la unión de anticuerpos monoclonales quiméricos y caninizados al IL-4Ra canino evaluada mediante ELISA. La reactividad dependiente de la dosis de los anticuerpos monoclonales caninizados contra la cadena a del receptor de la IL-4 canina es la siguiente: 4H3 M-C (•); 2G9 M-C (O); c4H3 H1-L1 (■); c4H3 H2-L2 (A); c4H3 H3-L3 (o).
Descripción detallada
En la actualidad, se están investigando diversos enfoques para el tratamiento de la DA humana en muchos ensayos clínicos [revisado en Malajian et al., New pathogenic and therapeutic paradigms in atopic dermatitis Cytokine, (2014)]. Algunos de estos enfoques tienen como objetivo interferir con una o más de las moléculas/eventos de señalización que conducen al desarrollo y activación de los linfocitos Th2. Una línea de investigación en esta área abarca enfoques para el bloqueo de las acciones de los impulsores clave de la interleucina de la vía Th2. Basado en las observaciones de que la DA es en gran parte una enfermedad dominada por Th2 y la acumulación de datos que respalda un papel clave para las acciones combinadas de la IL-4 y la IL-13 como impulsores clave del desarrollo de linfocitos Th2, y basado en los datos que indican que la cadena a del receptor de la IL-4 es un receptor necesario para la señalización de ambas citocinas, la presente invención describe la generación y caracterización de anticuerpos monoclonales que bloquean la unión de la IL-4 canina y la IL-13 canina a los receptores de la IL-4 de tipo I y de tipo II y posteriormente inhiben la señalización tanto de la IL-4 como de la IL-13 canina. Estos anticuerpos tienen utilidad en el tratamiento de la dermatitis atópica y otras enfermedades en animales de compañía como se divulga en el presente documento.
Abreviaturas
A lo largo de la descripción detallada y de los ejemplos de la invención, se utilizarán las siguientes abreviaturas:
ADCC Citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos
CDC Citotoxicidad dependiente del complemento
CDR Región determinante de la complementariedad en las regiones variables de inmunoglobulina, definidas mediante el sistema de numeración de Kabat
CHO Ovario de hámster chino
CE50 concentración que da como resultado una eficacia o unión del 50 %
ELISA Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas
FR Región marco del anticuerpo: las regiones variables de inmunoglobulina excluyendo las regiones CDR. HRP Peroxidasa de rábano picante
IFN interferón
CI50 concentración que da como resultado una inhibición del 50 %
IgG Inmunoglobulina G
Kabat Un sistema de alineamiento y numeración de inmunoglobulinas liderado por Elvin A. Kabat [Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]
AcM Anticuerpo monoclonal (también acM o Acm)
MES ácido 2-(A/-morfolin)etanosulfónico
MDA Mecanismo de acción
SHN Suero humano normal
PCR Reacción en cadena de la polimerasa
FC Farmacocinética
EBS Enterotoxina B de Staphylococcus
TT Toxoide tetánico
Región V El segmento de cadenas de IgG que es variable en secuencia entre diferentes anticuerpos. Se extiende hasta el resto 109 en la cadena ligera y hasta el 113 en la cadena pesada de Kabat.
VH Región variable de cadena pesada de inmunoglobulina
VL Región variable de cadena ligera de inmunoglobulina
VK Región variable de la cadena ligera k de inmunoglobulina
Definiciones
Para que la invención se entienda más fácilmente, a continuación se definen específicamente determinados términos técnicos y científicos. A menos que se defina específicamente en otra parte del presente documento, todos los demás términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el significado comprendido habitualmente por un experto en la materia a la que pertenece la presente invención.
Como se utiliza en el presente documento, incluyendo las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares de palabras tales como "un", "uno/una", "el" y "la", incluyen sus referencias plurales correspondientes a menos que el contexto dicte claramente lo contrario.
"Activación", de la manera en la que se aplica a células o a receptores, se refiere a la activación o al tratamiento de una célula o de un receptor con un ligando, a menos que el contexto indique lo contrario o explícitamente. "Ligando" abarca ligandos naturales y sintéticos, por ejemplo, citocinas, variantes de citocinas, análogos, muteínas y compuestos de unión procedentes de anticuerpos. "Ligando" también abarca moléculas pequeñas, por ejemplo, miméticos peptídicos de citocinas y miméticos peptídicos de anticuerpos. "Activación" puede referirse a la activación celular regulada por mecanismos internos así como por factores externos o ambientales.
La "actividad" de una molécula puede describir o referirse a la unión de la molécula con un ligando o con un receptor, a la actividad catalítica; a la capacidad de estimular la expresión génica o la señalización celular, diferenciación o maduración; a la actividad antigénica, a la modulación de las actividades de otras moléculas, y similares. La "actividad" de una molécula también puede referirse a la actividad para modular o conservar interacciones entre células, por ejemplo, adhesión o actividad en la conservación de la estructura de una célula, por ejemplo, membranas celulares o citoesqueleto. "Actividad" también puede significar actividad específica, por ejemplo, [actividad catalítica]/[mg de proteína] o [actividad inmunológica]/[mg de proteína], concentración en un compartimento biológico, o similar. "Actividad" puede referirse a la modulación de componentes de los sistemas inmunitarios innato o adaptativo.
La "administración" y el "tratamiento", como se aplica a un animal, por ejemplo, un sujeto experimental canino, célula, tejido, órgano o líquido biológico, se refiere al contacto de un agente farmacéutico exógeno, terapéutico, de diagnóstico o composición con el animal, por ejemplo, un sujeto canino, célula, tejido, órgano o líquido biológico. El tratamiento de una célula abarca el contacto de un reactivo con la célula, así como el contacto de un reactivo con un líquido, en que el líquido está en contacto con la célula. "Administración" y "tratamiento" también significa tratamientos in vitro y ex vivo, por ejemplo, de una célula, mediante un reactivo, diagnóstico, compuesto de unión, o por otra célula. El término "sujeto" incluye cualquier organismo, preferentemente un animal, más preferentemente un mamífero (por ejemplo, canino, felino o ser humano) y lo más preferentemente un canino.
Como se utiliza en el presente documento, una "sustitución de un resto de aminoácido" por otro resto de aminoácido en una secuencia de aminoácidos de un anticuerpo, por ejemplo, es equivalente a "reemplazar un resto de aminoácido" con otro resto de aminoácido e indica que un resto de aminoácido particular en una posición específica en la secuencia de aminoácidos ha sido reemplazado (o sustituido) por un resto de aminoácido diferente. Dichas sustituciones se pueden diseñar particularmente, es decir, reemplazar intencionalmente una alanina con una serina en una posición específica en la secuencia de aminoácidos mediante, por ejemplo, la tecnología del ADN recombinante. Como alternativa, un resto de aminoácido particular o una cadena de restos de aminoácidos de un anticuerpo se puede reemplazar por uno o más restos de aminoácidos a través de procesos de selección más naturales, por ejemplo, basados en la capacidad del anticuerpo producido por una célula para unirse a una región determinada de ese antígeno, por ejemplo, uno que contiene un epítopo o una porción del mismo, y/o que el anticuerpo comprenda una CDR particular que conserva la misma estructura canónica que la CDR que está sustituyendo. Tales sustituciones/reemplazos pueden llevar a "variantes" de CDR y/o a variantes de anticuerpos.
"Tratar" o "tratamiento" significa administrar un agente terapéutico, tal como una composición que contiene cualquiera de los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de la presente invención, de manera interna o externa a un sujeto o paciente que tiene uno o más síntomas de enfermedad, o que se sospecha que tiene una enfermedad, para la cual el agente tiene actividad terapéutica.
Normalmente, para aliviar y/o mejorar uno o más síntomas de enfermedad en el sujeto tratado o en la población tratada, el agente se administra en una cantidad eficaz, ya sea induciendo la regresión del avance de dicho(s) síntoma(s) o inhibiendo su avance en cualquier grado clínicamente medible. La cantidad de un agente terapéutico que es eficaz para aliviar cualquier síntoma de enfermedad en particular (también denominada "cantidad terapéuticamente eficaz") puede variar según factores tales como la patología de la enfermedad, la edad y el peso del paciente (por ejemplo, canino), y de la capacidad de la composición farmacéutica para provocar una respuesta deseada en el sujeto. El alivio o la mejora de un síntoma de la enfermedad se puede evaluar mediante cualquier medida clínica utilizada normalmente por los veterinarios u otros proveedores de atención médica capacitados para evaluar la gravedad o el estado de avance de ese síntoma. Aunque una realización de la presente invención (p. ej., un método de tratamiento o un artículo de fabricación) puede que no sea eficaz para aliviar el síntoma o los síntomas de la enfermedad diana en cada sujeto, debería aliviar el síntoma o los síntomas de la enfermedad diana en un número estadísticamente significativo de sujetos como se determina por cualquier prueba estadística conocida en la materia, tal como la prueba t de Student, la prueba x2 , la prueba U de acuerdo con Mann y Whitney, la prueba de Kruskal-Wallis (prueba H), la prueba de Jonckheere-Terpstra y la prueba de Wilcoxon.
"Tratamiento", como se aplica a un ser humano, veterinario (por ejemplo, canino) o sujeto de investigación, se refiere a un tratamiento terapéutico, así como a aplicaciones de investigación y diagnóstico. "Tratamiento" como se aplica a un ser humano, veterinario (por ejemplo, canino) o sujeto de investigación, o una célula, un tejido o un órgano, abarca el contacto de los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de la presente invención con un sujeto canino u otro animal, una célula, tejido, compartimento fisiológico o líquido fisiológico.
Como se utiliza en el presente documento, el término "canino" incluye todos los perros domésticos, Canis lupus familiaris o Canis familiaris, a menos que se indique otra cosa.
Como se utiliza en el presente documento, el término "felino" se refiere a cualquier miembro de la familia Felidae. Los miembros de esta familia incluyen miembros silvestres, zoológicos y domésticos, tal como cualquier miembro de las subfamilias Felinae, por ejemplo, gatos, leones, tigres, pumas, jaguares, leopardos, leopardos de las nieves, panteras, leones de montaña de América del Norte, guepardos, linces, gatos monteses, caracales o cualquier cruce de los mismos. Los gatos también incluyen gatos domésticos, gatos de compañía de raza pura y/o mestizos, gatos de espectáculos, gatos de laboratorio, gatos clonados y gatos silvestres o asilvestrados.
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "marco canino" se refiere a la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada y la cadena ligera de un anticuerpo canino distinto de los restos de la región hipervariable definidos en el presente documento como restos de CDR. Con respecto a un anticuerpo caninizado, en la mayoría de las realizaciones, las secuencias de aminoácidos de las CDR caninas nativas se reemplazan con las c Dr extrañas correspondientes (por ejemplo, las de un anticuerpo de ratón) en ambas cadenas. Opcionalmente, las cadenas pesadas y/o ligeras del anticuerpo canino pueden contener algunos restos extraños no de CDR, por ejemplo, para conservar la conformación de las CDR extrañas dentro del anticuerpo canino y/o modificar la función Fc, tal como se ejemplifica a continuación.
Se ha encontrado que el IL-4Ra canino comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 [SEQ ID NO: 4, sin la secuencia de señal]. En una realización específica, el IL-4Ra canino está codificado por un ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 [SEQ ID NO: 3, sin la secuencia de señal]. Las secuencias del IL-4Ra canino pueden diferir por tener, por ejemplo, variaciones conservadas en regiones no conservadas, pero el IL-4Ra canino tendrá de manera sustancial la misma función biológica que el IL-4Ra canino que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 [SEQ ID NO: 4, sin la secuencia de señal].
Las citocinas IL-4 e IL-13 están implicadas en la patogenia de varias enfermedades alérgicas en seres humanos y animales, que incluyen asma y dermatitis atópica. Debido a que la cadena a del receptor de la IL-4 es un receptor necesario para la señalización de cualquiera de estas citocinas, la presente invención describe la generación y caracterización de anticuerpos monoclonales que bloquean la unión de la IL-4 canina y la IL-13 canina al IL-4Ra y, por lo tanto, inhiben la señalización tanto de la IL-4 como de la IL-13 canina. Por tanto, estos anticuerpos tienen utilidad en el tratamiento de la dermatitis atópica y otras enfermedades en animales de compañía como se divulga en el presente documento. De manera adicional, una función biológica del IL-4Ra canino puede tener, por ejemplo, un epítopo en el dominio extracelular que está unido de manera específica mediante un anticuerpo de la presente divulgación.
La secuencia de aminoácidos del IL-4Ra canino particular será generalmente al menos un 90 % idéntica a la del IL-4Ra canino que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. En determinados casos, un IL-4Ra canino, puede ser al menos un 95 % o incluso al menos un 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico al IL-4Ra canino que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. En determinadas realizaciones, la secuencia de aminoácidos de un IL-4Ra canino no mostrará más de 10 diferencias de aminoácidos con respecto al IL-4Ra canino que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. En determinadas realizaciones, la secuencia de aminoácidos del IL-4Ra canino puede mostrar no más de 5, o incluso no más de 4, 3, 2 o 1 diferencia de aminoácidos con respecto al IL-4Ra canino que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. El porcentaje de identidad se puede determinar tal como se describe en el presente documento a continuación.
La expresión "respuesta inmunitaria" se refiere a la acción de, por ejemplo, linfocitos, células presentadoras de antígenos, células fagocíticas, granulocitos y macromoléculas solubles producidas por las células anteriores o el hígado (incluyendo anticuerpos, citocinas, y complemento) que da como resultado un daño selectivo, destrucción o eliminación del cuerpo de los mamíferos (por ejemplo, cuerpo canino) de células cancerosas, células o tejidos infectados con patógenos o patógenos invasores.
Anticuerpos anti-IL-4Ra canino
La presente invención proporciona anticuerpos caninizados aislados (de manera particular anticuerpos murinos anti-IL-4Ra canino y anticuerpos caninizados de los mismos) o fragmentos de unión a antígeno caninizados de los mismos que se unen a IL-4Ra canino y los usos de dichos anticuerpos o fragmentos de los mismos. En realizaciones específicas, se proporcionan CDR de murino anti-IL-4Ra canino de anticuerpos murinos anti-IL-4Ra canino que se ha demostrado que se unen al IL-4Ra canino y que bloquean la unión del IL-4Ra canino a uno o más de sus ligandos, la IL-4 o la IL-13 canina. Estas CDR se insertan en un marco canino modificado de un anticuerpo canino para generar un anticuerpo murino caninizado anti-IL-4Ra canino.
Como se utiliza en el presente documento, un "anticuerpo anti-IL-4Ra canino" se refiere a un anticuerpo que se generó contra el IL-4Ra canino (por ejemplo, en un mamífero tal como un ratón o un conejo) y que se une de manera específica al IL-4Ra canino. Un anticuerpo que "se une de manera específica al IL-4Ra canino", y en particular al IL-4Ra canino, o un anticuerpo que "se une de manera específica a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos del IL-4Ra canino", es un anticuerpo que presenta unión preferencial con el lL-4Ra canino en comparación con otros antígenos, pero esta especificidad no requiere una especificidad de unión absoluta. Un anticuerpo anti-IL-4Ra canino se considera "específico" para el IL-4Ra canino si su unión es determinante de la presencia de del IL-4Ra canino en una muestra, o si es capaz de alterar la actividad del IL-4Ra canino sin interferir indebidamente con la actividad de otras moléculas en una muestra canina, por ejemplo, sin producir resultados no deseados tales como falsos positivos en un contexto de diagnóstico o efectos secundarios en un contexto terapéutico. El grado de especificidad necesario para un anticuerpo anti-IL-4Ra canino puede depender del uso pretendido del anticuerpo y, en cualquier caso, se define por su idoneidad para su uso para un propósito pretendido. El anticuerpo, o compuesto de unión procedente del sitio de unión a antígeno de un anticuerpo, del método contemplado, se une a su antígeno, o una variante o muteína del mismo, con una afinidad que es al menos dos veces mayor, preferentemente al menos diez veces mayor, más preferentemente al menos 20 veces mayor y, lo más preferentemente, al menos 100 veces mayor, que la afinidad con cualquier otro antígeno.
Como se utiliza en el presente documento, se dice que un anticuerpo se une de manera específica a un polipéptido que comprende una secuencia de antígeno determinada (en este caso, una parte de la secuencia de aminoácidos del IL-4Ra canino) si se une a polipéptidos que comprenden la parte de la secuencia de aminoácidos del IL-4Ra canino, pero no se une a otras proteínas caninas que carecen de esa parte de la secuencia del IL-4Ra canino. Por ejemplo, un anticuerpo que se une de manera específica a un polipéptido que comprende el IL-4Ra canino, puede unirse a una forma de IL-4Ra canino marcada con f La G®, pero no se unirá a otras proteínas caninas marcadas con FLAG®. Un anticuerpo, o compuesto de unión procedente del sitio de unión a antígeno de un anticuerpo, se une a su antígeno canino, o una variante o muteína del mismo, "con especificidad" cuando tiene una afinidad por ese antígeno canino o una variante o muteína del mismo que es al menos diez veces mayor, más preferentemente al menos 20 veces mayor, e incluso más preferentemente al menos 100 veces mayor que su afinidad por cualquier otro antígeno canino ensayado.
Como se utiliza en el presente documento, el término "anticuerpo" se refiere a cualquier forma de anticuerpo que muestre la actividad biológica deseada. Por lo tanto, se utiliza en el sentido más amplio y cubre específicamente, pero sin limitación, anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), anticuerpos canonizados, anticuerpos completamente caninos, anticuerpos quiméricos y anticuerpos camelizados de dominio único. Los "anticuerpos precursores" son anticuerpos obtenidos mediante la exposición de un sistema inmunitario a un antígeno antes de la modificación de los anticuerpos para un uso previsto, tal como la caninización de un anticuerpo para su uso como anticuerpo terapéutico canino.
Como se utiliza en el presente documento, a menos que se indique de otro modo, "fragmento de anticuerpo" o "fragmento de unión a antígeno" se refiere a fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos, es decir, fragmentos de anticuerpos que conservan la capacidad de unirse específicamente al antígeno unido por el anticuerpo de longitud completa, p. ej., fragmentos que conservan una o más regiones CDR. Los ejemplos de fragmentos de unión a antígeno incluyen, pero sin limitación, Fab, Fab', F(ab')2 y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo monocatenario, por ejemplo, sc-Fv; nanocuerpos y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.
Un "fragmento Fab" comprende una cadena ligera y las regiones Ch 1 y variable de una cadena pesada. La cadena pesada de una molécula Fab no puede formar un enlace disulfuro con otra molécula de cadena pesada. Un "fragmento Fab" puede ser el producto de la escisión con papaína de un anticuerpo.
Una región de "fragmento cristalizable" ("Fc") comprende dos fragmentos de cadena pesada que comprenden los dominios Ch 3 y Ch 2 de un anticuerpo. Los dos fragmentos de la cadena pesada se mantienen unidos mediante dos o más enlaces disulfuro y mediante interacciones hidrófobas de los dominios Ch 3.
Un "fragmento Fab'" contiene una cadena ligera y una porción o un fragmento de una cadena pesada que contiene el dominio Vh y el dominio Ch 1 y también la región entre los dominios Ch 1 y Ch 2, de manera que puede formarse un enlace disulfuro intercatenario entre las dos cadenas pesadas de dos fragmentos Fab' para formar una molécula de F(ab')2.
Un "fragmento F(ab')2" contiene dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas que contienen una porción de la región constante entre los dominios Ch 1 y Ch 2, de tal forma que se forma un enlace disulfuro intercadena entre las dos cadenas pesadas. Por tanto, un fragmento F(ab')2 está compuesto por dos fragmentos Fab' que se mantienen unidos mediante un enlace disulfuro entre las dos cadenas pesadas. Un "fragmento F(ab')2" puede ser el producto de la escisión con pepsina de un anticuerpo.
Como se describe en el presente documento, la "región Fv" comprende las regiones variables de las cadenas tanto pesada como ligera, pero carece de las regiones constantes.
Como se describe en el presente documento, la expresión anticuerpo "Fv de cadena sencilla" o "scFv" se refiere a fragmentos de anticuerpos que comprenden los dominios Vh y Vl de anticuerpos, en donde estos dominios están presentes en una única cadena polipeptídica. En general, el polipéptido Fv comprende además un enlazador polipeptídico entre los dominios Vh y Vl lo que permite que el scFv forme la estructura deseada para la unión con el antígeno. [Véase, Pluckthun, THE PHARMACOLOGY OF MONOCLONAL ANTIBODIES, vol. 113 Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, Nueva York, págs. 269-315 (1994); los documentos WO 88/01649; y US 4.946.778 y US 5.260.203].
Como se describe en el presente documento, la expresión "estructura canónica" se refiere a la conformación local que puede ser adoptada por cada una de las regiones hipervariables de la cadena pesada y ligera de un anticuerpo dentro del marco en el que residen. Para cada región hipervariable, hay una pequeña cantidad de estructuras canónicas (generalmente denotadas por números enteros simples como 1 o 2, etc.), que se puede predecir con gran precisión a partir de las secuencias de aminoácidos de la región hipervariable correspondiente (de manera particular dentro del contexto de la secuencia de aminoácidos de su marco, como se indica a continuación para los correspondientes dominios variables anti-IL-4Ra canino (véase la tabla 3 a continuación)]. Estas estructuras canónicas pueden ser determinantes con respecto a si una modificación de la secuencia de aminoácidos de una CDR determinada dará como resultado la conservación o la pérdida de la capacidad de unirse a su miembro de unión al antígeno [Véase, Chothia y Lesk, Canonical Structures for the hypervariable regions of immunoglobulins, J. Mol. Biol. 196:901-917(1987); Chothia et al., Conformation of immunoglobulin hypervaribale regions, Nature, 34:877-883(1989); y Al-Lazikani et al., Standard Conformations for the canonical structures of immunoglobulins, J. Mol. Biol. 273:927-948 (1997)].
Como se describe en el presente documento, un "anticuerpo de dominio" es un fragmento de inmunoglobulina inmunitariamente funcional que contiene únicamente la región variable de una cadena pesada o la región variable de una cadena ligera. En algunos casos, dos o más regiones Vh se unen covalentemente con un enlazador peptídico para crear un anticuerpo de dominio bivalente. Las dos regiones Vh de un anticuerpo de dominio bivalente pueden dirigirse al mismo antígeno o a antígenos diferentes.
Un "anticuerpo bivalente" comprende dos sitios de unión a antígeno. En algunos casos, los dos sitios de unión tienen las mismas especificidades antigénicas. Sin embargo, los anticuerpos bivalentes pueden ser biespecíficos (véase más adelante).
En determinadas realizaciones, los anticuerpos monoclonales en el presente documento también incluyen anticuerpos de dominio único camelizados. [Véase, por ejemplo, Muyldermans et al., Trends Biochem. Sci. 26:230 (2001); Reichmann et al., J. Immunol. Methods 231:25 (1999); los documentos WO 94/04678; WO 94/25591; US 6.005.079]. En una realización, la presente invención proporciona anticuerpos de dominio único que comprenden dos dominios Vh con modificaciones tales que se forman anticuerpos de dominio único.
Como se utiliza en el presente documento, el término "diacuerpos" se refiere a fragmentos de anticuerpos pequeños con dos sitios de unión a antígeno, comprendiendo dichos fragmentos un dominio variable de cadena pesada (Vh ) conectado con un dominio variable de cadena ligera (Vl ) en la misma cadena polipeptídica (Vh-Vl o Vl-Vh ). Usando un enlazador que sea demasiado corto como para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, se obliga a los dominios a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión a antígeno. [Véanse, los documentos EP 0404097 B1; WO 93/11161; y Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)]. Para una revisión de variantes de anticuerpos genomodificadas véase, en general, Holliger and Hudson Nat. Biotechnol. 23:1126-1136 (2005)].
Normalmente, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la invención conserva al menos un 10% de su actividad de unión al IL-4Ra canino (cuando se compara con el anticuerpo precursor) cuando esa actividad se expresa sobre una base molar. Preferentemente, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la invención conserva al menos el 20 %, 50 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 100 % o más de la afinidad de unión a IL-4Ra como el anticuerpo originario. También se describe que un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la invención pueda incluir sustituciones de aminoácidos conservativas o no conservativas (denominadas "variantes conservativas o "variantes de función conservada" del anticuerpo) que no alteren sustancialmente su actividad biológica.
"Anticuerpo aislado" se refiere al estado de purificación y en dicho contexto significa que la molécula carece sustancialmente de otras moléculas biológicas tales como ácidos nucleicos, proteínas, lípidos, hidratos de carbono u otros materiales, tales como restos celulares y medios de crecimiento. En general, el término "aislado" no pretende referirse a una ausencia total de dicho material o una ausencia de agua, tampones o sales, a menos que estén presentes en cantidades que interfieran sustancialmente con el uso experimental o terapéutico del compuesto de unión como se describe en el presente documento.
Como se utiliza en el presente documento, un "anticuerpo quimérico" es un anticuerpo que tiene el dominio variable de un primer anticuerpo y el dominio constante de un segundo anticuerpo, donde el primer y segundo anticuerpos son de diferentes especies. [Documento U.S. 4.816.567; y Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855 (1984)]. Normalmente, los dominios variables se obtienen de un anticuerpo de un animal experimental (el "anticuerpo originario"), tal como un roedor, y las secuencias de dominio constante se obtienen de los anticuerpos del sujeto animal, por ejemplo, ser humano o canino, de modo que sea menos probable que el anticuerpo quimérico resultante provoque una respuesta inmunitaria adversa en un sujeto canino o ser humano respectivamente, que el anticuerpo originario (por ejemplo, de roedor).
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "anticuerpo caninizado" se refiere a formas de anticuerpos que contienen secuencias de anticuerpos tanto caninos como no caninos (por ejemplo, anticuerpos murinos). En general, el anticuerpo caninizado comprenderá de manera sustancial la totalidad de al menos uno o, normalmente, dos dominios variables en los que todos o de manera sustancial todos los bucles hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no canina (por ejemplo, que comprende 6 CDR murinas anti-lL-4Ra canino como se ejemplifica a continuación), y todas o de manera sustancial todas las regiones marco (FR) (y normalmente todas o sustancialmente todo el marco restante) son las de una secuencia de inmunoglobulina canina. Como se ejemplifica en el presente documento, un anticuerpo caninizado comprende las tres CDR de cadena pesada y las tres CDR de cadena ligera de un anticuerpo murino anti-IL-4Ra canino junto con un marco canino o un marco canino modificado. Un marco canino modificado comprende uno o más cambios de aminoácidos tal como se ejemplifica en el presente documento que optimizan aún más la eficacia del anticuerpo caninizado, por ejemplo, para aumentar su unión al IL-4Ra canino y/o su capacidad para bloquear la unión de la IL-4 canina y/o la IL-13 canina a los receptores de la IL-4 de tipo I y/o de tipo II.
La expresión "anticuerpo completamente canino" se refiere a un anticuerpo que comprende solo secuencias de proteína de inmunoglobulina canina. Un anticuerpo completamente canino puede contener cadenas de hidratos de carbono murinos si se produce en un ratón, en una célula de ratón o en un hibridoma procedente de una célula de ratón. De forma similar, "anticuerpo de ratón" se refiere a un anticuerpo que comprende solamente secuencias de inmunoglobulina de ratón. Como alternativa, un anticuerpo completamente canino puede contener cadenas de hidratos de carbono de rata si se produce en una rata, en una célula de rata o en un hibridoma procedente de una célula de rata. De forma similar, "anticuerpo de rata" se refiere a un anticuerpo que comprende solamente secuencias de inmunoglobulina de rata.
Hay cuatro subtipos de cadenas pesadas de IgG conocidas de IgG de perro y se las conoce como IgG-A, IgG-B, IgG-C e IgG-D. Los dos subtipos de cadenas ligeras conocidos se denominan A y k.
Las regiones variables de cada par de cadena ligera/pesada forman el sitio de unión del anticuerpo. Por lo tanto, en general, un anticuerpo intacto tiene dos sitios de unión. Excepto en anticuerpos bifuncionales o biespecíficos, los dos sitios de unión son, en general, iguales.
Normalmente, los dominios variables de las cadenas tanto pesada como ligera comprenden tres regiones hipervariables, también denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), localizadas dentro de regiones marco (FR) relativamente conservadas. Las CDR están normalmente alineadas mediante las regiones marco, lo que permite la unión a un epítopo específico. En general, desde el extremo N al extremo C, los dominios variables de las cadenas tanto ligera como pesada comprenden FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. La asignación de aminoácidos a cada dominio es, en general, de acuerdo con las definiciones de Sequences of Proteins of Immunological Interest, Kabat, et al.; National Institutes of Health, Bethesda, Md. ; 5.a ed.; NIH Publ. N.° 91-3242 (1991); Kabat, Adv. Prot. Chem. 32:1-75 (1978); Kabat, et al., J. Biol. Chem. 252:6609-6616 (1977); Chothia, et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987) o Chothia, et al., Nature 342:878-883 (1989)].
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "región hipervariable" se refiere a los restos de aminoácidos de un anticuerpo que son responsables de la unión al antígeno. La región hipervariable comprende restos de aminoácidos de una "región determinante de la complementariedad" o "CDR" (es decir, CDRL1, CDRL2 y CDRL3 en el dominio variable de cadena ligera y CDRH1, CDRH2 y CDRH3 en el dominio variable de cadena pesada). [Véase Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991) que define las regiones CDR de un anticuerpo por secuencia; véase también Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987) que define las regiones CDR de un anticuerpo por estructura]. Como se utiliza en el presente documento, la expresión restos de la "región marco" o de "FR" se refiere a los restos de dominio variable distintos de los restos de la región hipervariable definidos en el presente documento como restos de CDR.
Además de unirse y activar las células inmunitarias caninas, un anticuerpo canino o caninizado contra el IL-4Ra óptimamente tiene dos atributos:
1. Falta de funciones efectoras tales como la citotoxicidad dependiente de anticuerpos (ADCC) y la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), y
2. purificarse fácilmente a gran escala utilizando tecnologías estándar de la industria, tales como la basada en la cromatografía de la proteína A.
Ninguno de los isotipos de IgG canina de origen natural satisface ambos criterios. Por ejemplo, la IgG-B se puede purificar utilizando proteína A, pero tiene un elevado nivel de actividad ADCC. Por otro lado, la IgG-A se une débilmente a la proteína A, pero muestra una actividad ADCC no deseada. Además, ni IgG-C ni IgG-D se pueden purificar en columnas de proteína A, aunque IgG-D no muestra actividad ADCC. (IgG-C tiene una actividad ADCC considerable). Una forma en que la presente invención supera esta dificultad es proporcionando anticuerpos IgG-B caninos mutantes específicos para el IL-4Ra; dichos anticuerpos carecen de funciones efectoras tales como ADCC y se pueden purificar fácilmente utilizando cromatografía de proteína A estándar de la industria.
"Homología" se refiere a la similitud de secuencia entre dos secuencias de polinucleótidos o entre dos secuencias de polipéptidos cuando están alineadas de manera óptima. Cuando en las dos secuencias comparadas, una posición está ocupada por la misma base o subunidad monomérica de aminoácidos, por ejemplo, si en cada una de las dos moléculas de ADN, una posición está ocupada por adenina, entonces las moléculas son homólogas en esa posición. El porcentaje de homología es el número de posiciones homólogas compartidas por las dos secuencias dividido entre el número total de posiciones comparadas * 100. Por ejemplo, si en dos secuencias, 6 de 10 de las posiciones coinciden o son homólogas cuando las secuencias están alineadas de manera óptima, entonces las dos secuencias son 60 % homólogas. En general, la comparación se hace cuando dos secuencias se alinean para proporcionar el máximo porcentaje de homología.
"Molécula de ácido nucleico aislada" significa un ADN o ARN de origen genómico, ARNm, ADNc de origen sintético o alguna combinación de los mismos que no está asociado a todo o a una parte de un polinucleótido en el que el polinucleótido aislado se encuentra en la naturaleza, o está unido a un polinucleótido al que no está unido en la naturaleza. A efectos de la presente divulgación, ha de entenderse que "una molécula de ácido nucleico que comprende" una secuencia de nucleótidos particular, no abarca cromosomas intactos. Las moléculas de ácido nucleico aisladas "que comprenden" secuencias específicas de un ácido nucleico pueden incluir, además de las secuencias especificadas, secuencias codificantes para hasta diez o incluso hasta veinte o más proteínas distintas o porciones o fragmentos de las mismas, o pueden incluir secuencias reguladoras unidas operativamente que controlan la expresión de la región codificante de las secuencias de un ácido nucleico citadas y/o pueden incluir secuencias de vector.
La expresión "secuencias de control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificante unida operativamente en un organismo hospedador particular. Las secuencias de control que son adecuadas para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora y un sitio de unión al ribosoma. Se sabe que las células eucariotas usan promotores, señales de poliadenilación y potenciadores.
Un ácido nucleico está "unido operativamente" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN de una presecuencia o líder de secreción está unido operativamente con ADN de un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está unido operativamente con una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión al ribosoma está unido operativamente con una secuencia codificante si se coloca de manera que facilite la traducción. En general, "unido operativamente" significa que las secuencias de ADN que se unen son contiguas y, en el caso de un líder de secreción, son contiguas y están en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen que estar contiguos. La unión se realiza mediante conexión en sitios de restricción convenientes. Si no existen dichos sitios, se usan adaptadores o enlazadores oligonucleotídicos sintéticos de acuerdo con la práctica convencional.
Como se utiliza en el presente documento, las expresiones "célula", "línea celular", y "cultivo celular", se pueden utilizar indistintamente y todas estas denominaciones incluyen la descendencia. Por lo tanto, las palabras "transformantes" y "células transformadas" incluyen la célula objeto primaria y cultivos procedentes de la misma sin tener en cuenta el número de transferencias. También se entiende que no toda la descendencia tendrá un contenido de ADN exactamente idéntico, debido a mutaciones deliberadas o involuntarias. Se incluye descendencia mutante que tiene la misma función o actividad biológica que la explorada en la célula transformada originalmente. Cuando se pretenda hacer denominaciones distintas, estas quedaran claras a partir del contexto.
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "secuencia de la línea germinal" se refiere a una secuencia de secuencias de ADN de inmunoglobulina no reordenadas. Se puede usar cualquier fuente adecuada de secuencias de inmunoglobulina no reordenadas. Se pueden obtener secuencias de la línea germinal humana, por ejemplo, de las bases de datos de la línea germinal JOINSOLVER® en el sitio web del National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases de los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos. Se pueden obtener secuencias de la línea germinal de ratón, por ejemplo, tal como se describe en Giudicelli et al. [Nucleic Acids Res. 33:D256-D261 (2005)].
Propiedades de los anticuerpos murinos anti-IL-4R a canino y murinos caninizados anti-IL-4R a canino
La presente invención proporciona anticuerpos murinos aislados anti-IL-4Ra canino y anticuerpos caninizados de los mismos, métodos de uso de los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos en el tratamiento de enfermedades, por ejemplo, el tratamiento de la dermatitis atópica en caninos. En canino, hay cuatro cadenas pesadas de IgG denominadas A, B, C y D. Estas cadenas pesadas representan cuatro subclases diferentes de IgG de perro, que se conocen como IgGA, IgGB, IgGC e IgGD. Cada una de las dos cadenas pesadas consta de un dominio variable (VH) y tres dominios constantes denominados CH-1, CH-2 e CH-3. El dominio CH-1 está conectado al dominio CH-2 a través de una secuencia de aminoácidos denominada "bisagra" o, como alternativa, "región de bisagra".
Las secuencias de ADN y aminoácidos de estas cuatro cadenas pesadas fueron identificadas por primera vez por Tang et al. [Vet. Immunol. Immunopathol. 80: 259-270 (2001)]. Las secuencias de aminoácidos y ADN de estas cadenas pesadas también están disponibles en las bases de datos de GenBank. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de IgGA tiene el número de referencia AAL35301.1, IgGB tiene el número de referencia AAL35302.1, IgGC tiene el número de referencia AAL35303.1 e IgGD tiene el número de referencia (AAL35304.1). Los anticuerpos caninos también contienen dos tipos de cadenas ligeras, k y A. El ADN y la secuencia de aminoácidos de estas cadenas ligeras se pueden obtener de las bases de datos de GenBank. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera k tiene el número de registro ABY 57289.1 y la cadena ligera A tiene el número de registro ABY 55569.1.
En la presente invención, la secuencia de aminoácidos para cada uno de los cuatro fragmentos Fc de IgG canina se basa en el límite identificado de los dominios CH1 y CH2 según lo determinado por Tang et al, citado anteriormente. Los anticuerpos murinos caninizados anti-IL-4Ra canino que se unen al IL-4Ra canino incluyen, aunque no de forma limitativa: anticuerpos que comprenden cadenas pesadas de IgG-A, IgG-B e IgG-D caninas y/o cadenas ligeras k caninas junto con CDR murinas anti-IL-4Ra canino. En consecuencia, la presente invención proporciona anticuerpos murinos aislados anti-IL-4Ra canino y/o anticuerpos murinos caninizados anti-IL-4Ra canino o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen al IL-4Ra canino y bloquean la unión de la IL-4 canina y la IL-13 canina a los receptores de la IL-4 de tipo I o de tipo II.
La presente invención proporciona además cadenas pesadas caninas de longitud completa que se pueden combinar con las cadenas ligeras correspondientes para producir un anticuerpo caninizado. En consecuencia, la presente invención proporciona además anticuerpos murinos caninizados anti-antígeno canino (incluidos anticuerpos murinos caninizados aislados anti-IL-4Ra canino) y métodos de uso de los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos en el tratamiento de enfermedades, por ejemplo, el tratamiento de la dermatitis atópica en caninos.
La presente invención también proporciona anticuerpos murinos caninizados anti-IL-4Ra canina que comprenden una región cristalizable de fragmentos caninos (región cFc) en la que el cFc se ha modificado genéticamente para disminuir o eliminar una o más funciones efectoras. En un aspecto de la presente invención, el cFc modificado genéticamente disminuye o elimina una o más funciones efectoras. En determinadas realizaciones, la región cFc modificada genéticamente es una región Fc de IgGB canina modificada genéticamente. También se divulga una región Fc de IgGC canina modificada genéticamente. En una realización particular, la función efectora es la citotoxicidad dependiente de anticuerpos (ADCC) que está disminuida o eliminada. En otra realización, la función efectora es la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) que está disminuida o eliminada. En otra realización más, la región cFc se ha modificado genéticamente para disminuir o eliminar tanto la ADCC como la CDC.
Para generar variantes de IgG canina que carecen de funciones efectoras, se generaron varias cadenas pesadas de IgGB canina mutantes. Estas variantes pueden incluir una o más de las siguientes sustituciones únicas o combinadas en la porción Fc de la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada: P4A, D31A, N63A, G64P, T65A, A93G e P95A. Las cadenas pesadas variantes (es decir, que contienen dichas sustituciones de aminoácidos) se clonaron en plásmidos de expresión y se transfectaron en células HEK 293 junto con un plásmido que contenía el gen que codifica una cadena ligera. Los anticuerpos intactos expresados y purificados a partir de células HEK 293 se evaluaron para determinar su unión a FcyRI y C1q para evaluar su potencial para la mediación de las funciones efectoras inmunitarias.
[véanse, la solicitud de patente provisional de EE.Uu . n.° 62/030.812, presentada el miércoles, 30 de julio de 2014 y la solicitud provisional de patente n.° 62/092.496, presentada el martes, 16 de diciembre de 2014].
La presente invención también proporciona IgGD caninas modificadas que, en lugar de su región de bisagra de IgGD natural, comprenden una región de bisagra de:
IgGA: FNECRCTDTPPCPVPEP, SEQ ID NO: 101;
IgGB: PKRENGRVPRPPDCPKCPAPEM, SEQ ID NO: 102; o
IgGC: AKECECKCNCNNCPCPGCGL, SEQ ID NO: 103.
Como alternativa, la región de bisagra de la IgGD se puede modificar genéticamente mediante la sustitución de un resto de serina con un resto de prolina, es decir, PKe St CKCIPPCPVPES, SEQ ID NO: 104 (con el resto de prolina (P) subrayado y en negrita sustituyendo el resto de serina de origen natural). Tales modificaciones pueden llevar a una IgGD canina que carece de intercambio de brazo fab. Las IgGD caninas modificadas se pueden construir utilizando métodos estándar de tecnología del ADN recombinante [por ejemplo, Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1982)]. Para construir estas variantes, los ácidos nucleicos que codifican la secuencia de aminoácidos de la IgGD canina se pueden modificar de modo que codifique las IgGD modificadas. Las secuencias de ácido nucleico modificadas se clonan luego en plásmidos de expresión para la expresión de proteínas.
El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une al IL-4Ra canino puede comprender seis de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) del anticuerpo murino anti-canino como se describe en el presente documento. En una realización adicional, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno del mismo que se une al IL-4Ra canino comprende una cadena ligera k de anticuerpo canino que comprende una CDR-1, CDR-2 y/o CDR-3 de cadena ligera murina y una IgG de cadena pesada de anticuerpo canino que comprende una CDR-1, c DR-2 y/o CDR-3 de cadena pesada murina.
En otras descripciones, los anticuerpos o los fragmentos de unión a antígeno de los mismos se unen de manera específica al IL-4Ra y tienen cadena ligeras k de anticuerpos caninos que comprenden de una a seis CDR diferentes que comprenden al menos el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72 y/o 73 e IgG de cadena pesada de anticuerpos caninos que comprenden de una a seis CDR diferentes que comprenden al menos el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, y/o 100, sin dejar de presentar las propiedades aglutinantes y funcionales deseadas. En otra descripción, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la presente invención comprende un marco canino que comprende una combinación de secuencia de cadena pesada de la IgG con una cadena ligera k que tiene una o más de las secuencias de aminoácidos de las CDR mencionadas anteriormente con 0, 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones de aminoácidos conservativas o no conservativas, sin dejar de presentar las propiedades aglutinantes y funcionales deseadas.
La identidad de secuencia se refiere al grado en el que los aminoácidos de dos polipéptidos son iguales en posiciones equivalentes cuando las dos secuencias están alineadas de manera óptima. Como se usa en el presente documento, una secuencia de aminoácidos es 100 % "idéntica" a una segunda secuencia de aminoácidos cuando los restos de aminoácidos de ambas secuencias son idénticos. En consecuencia, una secuencia de aminoácidos es un 50 % "idéntica" a una segunda secuencia de aminoácidos cuando el 50 % de los restos de aminoácidos de las dos secuencias de aminoácidos son idénticos. La comparación de la secuencia se lleva a cabo sobre un bloque contiguo de restos de aminoácidos comprendido por una proteína dada, por ejemplo, una proteína, o una porción del polipéptido que se está comparando. En una realización particular, se tienen en cuenta las deleciones o inserciones seleccionadas que podrían alterar de otra manera la correspondencia entre las dos secuencias de aminoácidos.
La similitud de secuencia incluye restos idénticos y aminoácidos bioquímicamente relacionados no idénticos. Se analizan los aminoácidos bioquímicamente relacionados que comparten propiedades similares y que pueden ser intercambiables.
"Variantes modificadas de manera conservadora" o "sustitución conservativa" se refiere a sustituciones de aminoácidos en una proteína por otros aminoácidos que tienen características similares (por ejemplo, carga, tamaño de la cadena lateral, hidrofobia/hidrofilia, conformación y rigidez de la cadena principal, etc.), de tal manera que pueden realizarse cambios con frecuencia sin alterar la actividad biológica de la proteína. Los expertos en esta materia reconocen que, en general, las sustituciones de aminoácidos individuales en regiones no esenciales de un polipéptido no alteran sustancialmente la actividad biológica [véase, por ejemplo, Watson et al., Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., pág. 224 (4.a Ed.; 1987)]. De manera adicional, las sustituciones de aminoácidos estructural o funcionalmente similares tienen menos probabilidades de alterar la actividad biológica. En la tabla 1 a continuación se exponen sustituciones conservativas ilustrativas.
TABLA 1
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En la presente invención también se contemplan variantes de función conservativa de los anticuerpos de la invención. "Variantes de función conservativa", como se utiliza en el presente documento, se refiere a anticuerpos o a fragmentos en los que se han cambiado uno o más restos de aminoácidos sin alterar una propiedad deseada, tal como una afinidad y/o especificidad del antígeno. Dichas variantes incluyen, pero sin limitación, el remplazo de un aminoácido por uno que tiene propiedades similares, tal como las sustituciones de aminoácidos conservativas de la tabla 1 anterior.
Ácidos nucleicos
La presente invención comprende además los ácidos nucleicos que codifican las cadenas de inmunoglobulina de anticuerpos murinos caninizados anti-IL-4Ra canino y fragmentos de unión a antígeno de los mismos divulgados en el presente documento (véanse los ejemplos a continuación).
También se describen en el presente documento los ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de inmunoglobulina que comprenden secuencias de aminoácidos que son al menos aproximadamente un 70 % idénticas, preferentemente al menos aproximadamente un 80 % idénticas, más preferentemente al menos aproximadamente un 90 % idénticas y lo más preferentemente al menos aproximadamente un 95 % idénticas (por ejemplo, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, el 100%) a las secuencias de aminoácidos de las CDR y anticuerpos proporcionados en el presente documento cuando la comparación se realiza mediante un algoritmo BLAST en el que los parámetros del algoritmo se seleccionan para dar la mayor coincidencia entre las respectivas secuencias en toda la longitud de las respectivas secuencias de referencia. Se describen otros ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de inmunoglobulina que comprenden secuencias de aminoácidos que son al menos aproximadamente un 70 % similares, preferentemente al menos aproximadamente un 80 % similar, más preferentemente al menos aproximadamente un 90 % similar y lo más preferentemente al menos aproximadamente un 95 % similar (por ejemplo, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 100 %) a cualquiera de las secuencias de aminoácidos de referencia cuando la comparación se realiza con un algoritmo BLAST, en donde los parámetros del algoritmo se seleccionan para dar la mayor coincidencia entre las respectivas secuencias en toda la longitud de las respectivas secuencias de referencia.
Como se utiliza en el presente documento, el porcentaje de identidad del nucleótido y la secuencia de aminoácidos se puede determinar usando C, MacVector (MacVector, Inc. Cary, NC 27519), Vector NTI (Informax, Inc. MD), Oxford Molecular Group PLC (1996) y el algoritmo Clustal W con los parámetros por defecto de la alineación, y los parámetros por defecto para la identidad. Estos programas comercialmente disponibles también se pueden usar para determinar la similitud de secuencia usando los mismos o análogos parámetros por defecto. Como alternativa, se puede usar una búsqueda Advanced Blast bajo las condiciones de filtro por defecto, por ejemplo, usando el GCG (Manual del Programa Genetics Computer Group, para el paquete de GCG, Versión 7, Madison, Wisconsin) usando los parámetros por defecto del programa de acumulación.
Las siguientes referencias se refieren a algoritmos BLAST que se utilizan con frecuencia para el análisis de secuencias: ALGORITMOS BLAST: Altschul, S.F., et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990); Gish, W., et al., Nature Genet. 3:266-272 (1993); Madden, T.L., et al., Meth. Enzymol. 266:131-141(1996); Altschul, S.F., et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997); Zhang, J., et al., Genome Res. 7:649-656 (1997); Wootton, J.C., et al., Comput. Chem. 17:149-163 (1993); Hancock, J.M. et al., Comput. Appl. Biosci. 10:67-70 (1994); SISTEMAS DE PUNTUACIÓN DE ALINEACIÓN: Dayhoff, M.O., et al., "A model of evolutionary change in proteins" en Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, supl. 3. M.O. Dayhoff (ed.), págs. 345-352, (1978); Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D. C.; Schwartz, R.M., et al., "Matrices for detecting distant relationships" en Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, supl. 3." (1978), M. O. Dayhoff (ed.), págs. 353-358 (1978), Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D. C.; Altschul, S.F., J. Mol. Biol.
219:555-565 (1991); States, D.J., et al., Methods 3:66-70(1991); Henikoff, S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919 (1992); Altschul, S.F., et al., J. Mol. Evol. 36:290-300 (1993); DATOS ESTADÍSTICOS DE ALINEACIÓN: Karlin, S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268 (1990); Karlin, S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877 (1993); Dembo, A., et al., Ann. Prob. 22:2022-2039 (1994); y Altschul, S.F. "Evaluating the statistical significance of multiple distinct local alignments" en Theoretical and Computational Methods in Genome Research (S. Suhai, ed.), págs. 1-14, Plenum, Nueva York (1997).
La presente invención también proporciona vectores de expresión que comprenden los ácidos nucleicos aislados de la invención, en donde el ácido nucleico está unido operativamente a secuencias de control que son reconocidas por una célula hospedadora cuando la célula hospedadora se transfecta con el vector. También se proporcionan células hospedadoras que comprenden un vector de expresión de la presente invención y métodos para producir el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se divulgan en el presente documento que comprenden cultivar en un medio de cultivo una célula hospedadora que lleva un vector de expresión que codifica el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno y aislar el antígeno o fragmento de unión a antígeno del mismo de la célula hospedadora o del medio de cultivo.
Unión de epítopos y afinidad de unión
La presente invención describe además anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen a restos de aminoácidos del mismo epítopo de IL-4Ra canino como los anticuerpos murinos anti-IL-4Ra canino divulgados en el presente documento. En descripciones particulares del mismo, los anticuerpos murinos anti-IL-4Ra canino o los fragmentos de unión a antígeno de los mismos también son capaces de inhibir/bloquear la unión de la IL-4 canina y la IL-13 canina a los receptores de la IL-4 de tipo I y/o de tipo II.
Un anticuerpo murino caninizado anti-IL-4Ra canino se puede producir de forma recombinante mediante métodos que se conocen en el campo. En la materia se conocen bien líneas celulares de mamífero disponibles como hospedadores para la expresión de los anticuerpos o de los fragmentos divulgados en el presente documento e incluyen muchas líneas celulares inmortalizadas disponibles en la colección americana de cultivos tipo (American Type Culture Collection, ATCC). Estas incluyen, entre otros, células de ovario de hámster chino (CHO), NSO, células SP2, células HeLa, células de riñón de cría de hámster (BHK), células de riñón de mono (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2), células A549, células 3T3, células HEK-293 y un número de otras líneas celulares. Las células hospedadoras de mamífero incluyen de seres humanos, ratón, rata, perro, mono, cerdo, cabra, bovina, células de caballo y hámster. Las líneas celulares de preferencia particular se seleccionan determinando qué líneas celulares tienen altos niveles de expresión. Otras líneas celulares que pueden usarse son líneas celulares de insecto, tales como células Sf9, células de anfibios, células bacterianas, células vegetales y células fúngicas. Cuando los vectores de expresión recombinante codifican la cadena pesada o la parte de unión al antígeno o un fragmento de la misma, la cadena ligera y/o el fragmento de unión a antígeno de la misma se introducen en células hospedadoras de mamífero, los anticuerpos se producen mediante el cultivo de las células hospedadoras durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en las células hospedadoras o, más preferentemente, la secreción del anticuerpo en el medio de cultivo en donde crecen las células hospedadoras.
Los anticuerpos pueden recuperarse del medio de cultivo usando métodos de purificación de proteínas convencionales. Además, usando diversas de técnicas conocidas, puede potenciarse la expresión de los anticuerpos de la invención (u otras fracciones de los mismos) a partir de líneas celulares de producción. Por ejemplo, el sistema de expresión del gen de la glutamina sintetasa (el sistema GS) es una estrategia habitual para potenciar la expresión en determinadas condiciones. El sistema GS se analiza, total o parcialmente, en relación con las patentes europeas N. ° 0216846, 0256055 y 0323997 y con la solicitud de patente europea N.° 89303964.4.
En general, las glucoproteínas producidas en una línea celular o animal transgénico particular tendrán un patrón de glucosilación que es característico de las glucoproteínas producidas en la línea celular o animal transgénico. Por consiguiente, el patrón de glucosilación particular de un anticuerpo dependerá de la línea celular o animal transgénico particular usado para producir el anticuerpo. Sin embargo, todos los anticuerpos codificados por las moléculas del ácido nucleico proporcionadas en el presente documento, o que comprenden las secuencias de aminoácidos proporcionadas en el presente documento, constituyen la presente invención, independiente del patrón de glucosilación que puedan tener los anticuerpos. De forma similar, en realizaciones particulares, pueden ser ventajosos anticuerpos con un patrón de glucosilación que comprende solamente W-glucanos no fucosilados, debido a que se ha demostrado que estos anticuerpos presentan normalmente una eficacia más potente que sus homólogos fucosilados tanto in vitro como in vivo [Véase, por ejemplo, Shinkawa et al., J. Biol. Chem. 278: 3466-3473 (2003); las patentes de EE. UU. N.° 6.946.292 y 7.214.775].
La presente invención incluye además fragmentos de anticuerpos de los anticuerpos murinos anti-IL-4Ra canino divulgados en el presente documento. Los fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos F(ab)2, que pueden producirse por escisión enzimática de una IgG mediante, por ejemplo, pepsina. Los fragmentos Fab pueden producirse por, por ejemplo, reducción de F(ab)2 con ditiotreitol o mercaptoetilamina. Un fragmento Fab es una cadena Vl-Cl unida a una cadena Vh -Ch i mediante un puente disulfuro. Un fragmento F(ab)2 está constituido por dos fragmentos Fab que, a su vez, están unidos por dos puentes disulfuro. La porción Fab de una molécula F(ab)2 incluye una porción de la región Fc entre la que se encuentran los puentes disulfuro. Un fragmento Fv es una región Vl o Vh .
El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende una región constante de cadena pesada, por ejemplo, una región constante canina, tal como la región constante de cadena pesada canina de IgG-A, IgG-B, IgG-C e IgG-D y una región constante de cadena ligera, por ejemplo, una región constante de cadena ligera canina, tal como la región de la cadena ligera A o k canina. A modo de ejemplo, y sin limitación, la región constante de cadena pesada canina puede ser de IgG-B y la región constante de cadena ligera canina puede ser de k.
Anticuerpo genomanipulado
Los anticuerpos murinos caninizados anti-IL-4Ra canino de la presente invención se pueden genomanipular para incluir modificaciones en el marco canino y/o en los restos del marco canino dentro de los dominios variables de un anticuerpo monoclonal originario (es decir, canino), por ejemplo, para mejorar las propiedades del anticuerpo.
Usos experimentales y de diagnóstico
Los anticuerpos murinos anti-IL-4Ra canino y/o los anticuerpos murinos caninizados anti-IL-4Ra canino o los fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la presente invención también pueden ser útiles en ensayos de diagnóstico para la proteína del IL-4Ra canino, por ejemplo, mediante la detección de su expresión en conjunto y/o en relación con la dermatitis atópica.
Por ejemplo, dicho un método comprende las siguientes etapas:
(a) recubrir un sustrato (por ejemplo, la superficie de un pocillo de una placa de microtitulación, por ejemplo, una placa de plástico) con un anticuerpo murino anti-IL-4Ra canino o un fragmento de unión a antígeno del mismo; (b) aplicar al sustrato una muestra para analizar la presencia del IL-4Ra canino;
(c) lavar la placa, de modo que se elimine el material no unido de la muestra;
(d) aplicar anticuerpos marcados de manera detectable (por ejemplo, anticuerpos ligados a enzimas) que también son específicos del antígeno IL-4Ra ;
(e) lavar el sustrato, para que se eliminen los anticuerpos marcados no unidos;
(f) si los anticuerpos marcados están ligados a enzimas, aplicar una sustancia química que la enzima convierta en una señal fluorescente; y
(g) detectar la presencia del anticuerpo marcado.
En una realización adicional, el anticuerpo marcado está marcado con peroxidasa que reacciona con ABTS [por ejemplo, ácido 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico)] o 3,3',5,5'-tetrametilbencidina, para producir un cambio de color que sea detectable. Como alternativa, el anticuerpo marcado está marcado con un radioisótopo detectable (por ejemplo, 3H) que puede detectarse mediante un contador de centelleo en presencia de un centelleante. Los anticuerpos murinos anti-IL-4Ra canino de la invención se pueden utilizar en un procedimiento de transferencia Western o inmunotransferencia de proteínas.
Dicho procedimiento forma parte de la presente invención e incluye, por ejemplo:
(i) poner en contacto una membrana u otro sustrato sólido para analizar la presencia de IL-4Ra canino unido o un fragmento del mismo con un anticuerpo murino anti-IL-4Ra canino o un fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención. Dicha membrana puede tomar la forma de una membrana de nitrocelulosa o basada en vinilo [por ejemplo, fluoruro de polivinilideno (PVDF)] a la que se han transferido las proteínas que se van a probar para determinar la presencia de IL-4Ra canino en un gel de PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida) no desnaturalizante o en un gel de SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico) (por ejemplo, después de la separación electroforética en el gel). Antes del contacto de la membrana con el anticuerpo murino anti-lL-4Ra canino o el fragmento de unión a antígeno del mismo, opcionalmente se bloquea la membrana, por ejemplo, con leche en polvo desnatada o similar para unir sitios de unión a proteínas inespecíficos en la membrana.
(ii) lavar la membrana una o más veces para eliminar el anticuerpo murino anti-IL-4Ra canino no unido o un fragmento de unión a antígeno del mismo y otras sustancias no unidas; y
(iii) detectar el anticuerpo murino anti-IL-4Ra canino unido o el fragmento de unión a antígeno del mismo.
La detección del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno unido se puede realizar mediante la unión del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno con un anticuerpo secundario (un anticuerpo antiinmunoglobulina) que está marcado de manera detectable y, a continuación, detectar la presencia del anticuerpo secundario.
Los anticuerpos murinos anti-IL-4Ra canino y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos divulgados en el presente documento también se pueden utilizar para inmunohistoquímica. Dicho método forma parte de la presente invención y comprende, por ejemplo, (1) poner en contacto una célula para analizar la presencia de IL-4Ra canino con un anticuerpo murino anti-IL-4Ra canino o un fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención; y (2) detectar el anticuerpo o fragmento sobre o en las células. Si el anticuerpo o el propio fragmento de unión a antígeno está marcado de manera detectable, puede detectarse directamente. Como alternativa, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que se detecta puede unirse mediante un anticuerpo secundario marcado de manera detectable.
Las técnicas de obtención de imágenes incluyen imágenes SPECT (por sus siglas en inglés) (tomografía de emisión monofotónica) o imágenes PET (por sus siglas en inglés) (tomografía de emisión positrónica). Los marcadores incluyen, p. ej., yodo-123 (123I) y tecnecio 99m (99mTc), p. ej., junto con obtención de imágenes por SPECT u 11C, 13N, 15O o 18F, por ejemplo, junto con imágenes de PET o ind io-l1 l [Véase, por ejemplo, Gordon et al., International Rev. Neurobiol. 67:385-440 (2005)].
Anticuerpos de bloqueo cruzado
Además, un anticuerpo anti-IL-4Ra canino o un fragmento de unión a antígeno del mismo como se describe en el presente documento divulga un anticuerpo o fragmentos de unión a antígeno del mismo que se une al mismo epítopo en el IL-4Ra canino al que se unen los anticuerpos y fragmentos analizados en el presente documento y cualquier anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que se bloquea de forma cruzada ( parcial o totalmente) o está bloqueado de forma cruzada (parcial o totalmente) por un anticuerpo o fragmento analizado en el presente documento para la unión a IL-4Ra canino; así como cualquier variante de los mismos.
Los anticuerpos de bloqueo cruzado y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos analizados en el presente documento se pueden identificar en función de su capacidad para competir de forma cruzada con los anticuerpos divulgados en el presente documento (sobre la base de las CDR que se proporcionan a continuación en el ejemplo 5), es decir, 1A3, 1A9, 1B12, 10C12, 10F2, 10E10, 10G8, y/o 11D3; o más particularmente, 11B6 y/o 6C12; e incluso más particularmente 4D8, 4H3, 2E2 y/o 11H2, en ensayos de unión estándar (por ejemplo, BIACore®, ELISA, como se ejemplifica a continuación, o citometría de flujo). Por ejemplo, se pueden utilizar ensayos ELISA convencionales en los que se inmoviliza una proteína del IL-4Ra canino recombinante sobre la placa, se marca fluorescentemente uno de los anticuerpos y se evalúa la capacidad de los anticuerpos no marcados para competir por la unión del anticuerpo marcado. Además o como alternativa, se puede usar el análisis BIAcore® para evaluar la capacidad de los anticuerpos para competir de manera cruzada. La capacidad de un anticuerpo de prueba para inhibir la unión de, por ejemplo, 1A3, 1A9, 1B12, 10C12, 10F2, 10E10, 10G8, y/o 11D3; o más particularmente, 11B6 y/o 6C12; e incluso más particularmente 4D8, 4H3, 2E2 y/o 11H2, a IL-4Ra canino demuestra que el anticuerpo de prueba puede competir con 1A3, 1A9, 1B12, 10C12, 10F2, 10E10, 10G8, 11D3, 11B6, 6C12, 4D8, 4H3, 2E2 y/o 11H2 para unirse a IL-4Ra canino y, por lo tanto, puede, en algunos casos, unirse al mismo epítopo en IL-4Ra canino como 1A3, 1A9, 1B12, 10C12, 10F2, 10E10, 10G8, 11D3, 11B6, 6C12, 4D8, 4H3, 2E2 y/o 11H2.
Composiciones farmacéuticas y administración
Para preparar composiciones farmacéuticas o estériles de un anticuerpo murino caninizado anti-IL-4Ra canino o un fragmento de unión a antígeno del mismo, se puede mezclar con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. [Véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences and U.S. Pharmacopeia: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, PA (1984)].
Las formulaciones de agentes terapéuticos y de diagnóstico se pueden preparar mediante la mezcla con vehículos, excipientes o estabilizantes aceptables en forma de, por ejemplo, polvos liofilizados, suspensiones acuosas, soluciones acuosas o suspensiones [véanse, por ejemplo, Hardman, et al. (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, Nueva York, Nueva York; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams y Wilkins, Nueva York, Nueva York; Avis, et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, Nueva York; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, Nueva York; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, Nueva York; Weiner y Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, NY]. En una realización, los anticuerpos anti-IL-4Ra de la presente invención se diluyen a una concentración apropiada en una solución de acetato de sodio a pH 5 a 6, y se añade NaCl o sacarosa para tonicidad. Los agentes adicionales, tales como polisorbato 20 o polisorbato 80, se pueden añadir para mejorar la estabilidad.
La toxicidad y eficacia terapéutica de las composiciones de anticuerpos, administrados solos o en combinación con otro agente, se puede determinar mediante procedimientos farmacéuticos convencionales en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, para determinar la DL50 (la dosis letal para el 50 % de la población) y la DE50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50 % de la población). La relación de dosis entre efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico (DL50/DE50). En aspectos particulares, son deseables anticuerpos que presenten índices terapéuticos altos. Los datos obtenidos de estos ensayos de cultivo celular y estudios en animales se pueden usar en la formulación de un intervalo de dosificación para su uso en caninos. La dosificación de dichos compuestos se encuentra preferentemente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la DE50 con poca o ninguna toxicidad. La dosis puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada y de la vía de administración.
El modo de administración puede variar. Las vías de administración adecuadas incluyen, rectal, transmucosa, intestinal, parenteral; intramuscular, subcutánea, intradérmica, intramedular, intratecal, intraventricular directa, intravenosa, intraperitoneal, intranasal, intraocular, inhalación, insuflación, tópica, cutánea, transdérmica o intraarterial. En realizaciones particulares, el anticuerpo murino anti-IL-4Ra canino o el fragmento de unión a antígeno del mismo se puede administrar mediante una vía invasiva tal como mediante inyección. En otras realizaciones de la invención, un anticuerpo murino anti-IL-4Ra canino o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o una composición farmacéutica del mismo, se administra por vía intravenosa, subcutánea, intramuscular, intraarterial o mediante inhalación, administración por aerosol. La administración por vías no invasivas (por ejemplo, por vía oral; por ejemplo, en una píldora, cápsula o comprimido) también está dentro del alcance de la presente invención.
Las composiciones se pueden administrar con dispositivos médicos conocidos en la materia. Por ejemplo, una composición farmacéutica de la invención se puede administrar mediante inyección con una aguja hipodérmica, que incluye, por ejemplo, una jeringa precargada o un autoinyector. Las composiciones farmacéuticas divulgadas en el presente documento también se pueden administrar con un dispositivo de inyección hipodérmica sin aguja; tal como los dispositivos divulgados en las patentes de EE.UU. n.°: 6.620.135; 6.096.002; 5.399.163; 5.383.851; 5.312.335; 5.064.413; 4.941.880; 4.790.824 o 4.596.556.
Las composiciones farmacéuticas divulgadas en el presente documento también se pueden administrar mediante infusión. Los ejemplos de implantes y módulos bien conocidos para la administración de composiciones farmacéuticas incluyen: la patente de EE.UU N.° 4.487.603, que divulga una bomba de microinfusión implantable para dispensar un medicamento a una velocidad controlada; la patente de EE.UU N.° 4.447.233, que divulga una bomba de infusión de medicamentos para suministrar un medicamento a una velocidad de infusión precisa; la patente de EE.UU N. ° 4.447.224, que divulga un aparato de infusión implantable de flujo variable para la liberación continua de fármacos; la patente de EE.UU. N.° 4.439.196, que divulga un sistema de suministro osmótico de fármacos que tiene compartimentos multicámara. Muchos otros de estos implantes, sistemas de administración y módulos son bien conocidos por los expertos en la materia.
Como alternativa, se puede administrar un anticuerpo murino anti-canino o un anticuerpo murino caninizado anti-IL-4Ra canino de manera local en lugar de sistémica, por ejemplo, mediante inyección del anticuerpo directamente en una articulación artrítica o una lesión inducida por patógeno caracterizada por inmunopatología, con frecuencia en una formulación en depósito o de liberación sostenida. Además, se puede administrar el anticuerpo en un sistema de administración de fármaco dirigido, por ejemplo, en un liposoma recubierto con un anticuerpo específico de tejido, que se dirige, por ejemplo, a la articulación artrítica o la lesión inducida por patógeno caracterizada por inmunopatología. Los liposomas se dirigirán a y se captarán de manera selectiva por el tejido afectado.
El régimen de administración depende de varios factores, incluyendo la tasa de renovación en suero o en el tejido del anticuerpo terapéutico, el nivel de los síntomas, la inmunogenia del anticuerpo terapéutico y la accesibilidad de las células diana en la matriz biológica. Preferentemente, el régimen de administración proporciona suficiente anticuerpo terapéutico para conseguir una mejora en la patología diana, al mismo tiempo que minimiza los efectos secundarios no deseados. En consecuencia, la cantidad de producto biológico administrado depende en parte del anticuerpo terapéutico en particular y de la gravedad de la afección que se trate. Se dispone de orientación para seleccionar las dosis apropiadas de anticuerpos terapéuticos [véase, por ejemplo, Wawrzynczak Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, RU (1996); Kresina (ed.) Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, Nueva York, NY (1991); Bach (ed.) Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, Nueva York, NY (1993); Baert, et al. New Engl. J. Med. 348:601-608 (2003); Milgrom et al. New Engl. J. Med. 341:1966-1973 (1999); Slamon et al. New Engl. J. Med. 344:783-792 (2001); Beniaminovitz et al. New Engl. J. Med. 342:613-619 (2000); Ghosh et al. New Engl. J. Med. 348:24-32 (2003); Lipsky et al. New Engl. J. Med. 343:1594-1602 (2000)].
El veterinario realiza la determinación de la dosis adecuada, por ejemplo, utilizando parámetros o factores que se sabe o se sospecha en la materia que afectan al tratamiento. En general, la dosis comienza con una cantidad algo menor que la dosis óptima y a continuación se incrementa en pequeños incrementos hasta que se logra el efecto deseado u óptimo en relación con cualquier efecto secundario negativo. Las medidas de diagnóstico importantes incluyen las de síntomas de, por ejemplo, la inflamación o el nivel de citocinas inflamatorias producidas.
Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos divulgados en el presente documento se pueden proporcionar mediante infusión continua, o mediante dosis administradas, por ejemplo, diariamente, 1 a 7 veces a la semana, semanalmente, quincenalmente, mensualmente, bimensualmente, trimestralmente, cada seis meses, anualmente, etc. Se pueden proporcionar dosis, por ejemplo, por vía intravenosa, subcutánea, tópica, oral, nasal, rectal, intramuscular, intracerebral, intramedular o por inhalación. Una dosis semanal total es generalmente de al menos 0,05 pg/kg de peso corporal, más generalmente al menos 0,2 pg/kg, 0,5 pg/kg, 1 pg/kg, 10 pg/kg, 100 pg/kg, O, 25 mg/kg, 1,0 mg/kg, 2,0 mg/kg, 5,0 mg/ml, 10 mg/kg, 25 mg/kg, 50 mg/kg o más [véase, por ejemplo, Yang, et al. New Engl. J. Med. 349:427-434 (2003); Herold, et al. New Engl. J. Med. 346:1692-1698 (2002); Liu, et al. J. Neurol.
Neurosurg. Psych. 67:451-456 (1999); Portielji, et al. Cáncer Immunol. Immunother. 52:133-144 (2003)]. También se pueden proporcionar dosis para lograr una concentración diana determinada previamente de un anticuerpo murino caninizado anti-IL-4Ra canino en el suero del sujeto, tal como 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30, 100, 300 pg/ml o más. En otras realizaciones, un anticuerpo murino caninizado anti-IL-4Ra canino de la presente invención se administra por vía subcutánea o intravenosa, en una semana, quincenal, "cada 4 semanas", mensualmente, bimestral o trimestralmente a 10, 20, 50, 80, 100, 200, 500, 1000 o 2500 mg/sujeto.
Los péptidos antigénicos reconocidos por AcM anti-IL-4Ra canino también pueden utilizarse como vacunas para provocar anticuerpos que bloqueen la unión de la IL-4 canina y la IL-13 canina a los receptores de la IL-4 de tipo I y de tipo II. Dichas vacunas pueden ser útiles como vacunas terapéuticas para enfermedades tales como la dermatitis atópica. Para utilizar estos péptidos antigénicos como vacunas, uno o más de estos péptidos se pueden acoplar químicamente o mediante técnicas de tecnología de ADN recombinante a otra proteína transportadora para potenciar la inmunogenia de estos péptidos y provocar anticuerpos específicos de péptidos. Los expertos en la materia conocen técnicas para acoplar péptidos a proteínas transportadora. Las vacunas peptídicas se pueden utilizar para vacunar animales por vía intramuscular, S/C, oral, mediante pulverizador o en el óvulo. Las vacunas peptídicas se pueden utilizar como proteínas subunitarias expresadas a partir de sistemas bacterianos, víricos, de levaduras o de virus baculovirus. Como alternativa, dichas vacunas peptídicas se pueden administrar después de la administración de varios vectores víricos o bacterianos que expresan dichas vacunas peptídicas que se pueden poner en práctica mediante métodos conocidos por los expertos en la materia. Las vacunas peptídicas se pueden administrar en dosis de 1 a 1000 pg y pueden contener opcionalmente un adyuvante y un vehículo farmacéutico aceptable.
Como se utiliza en el presente documento, "inhibir" o "tratar" o "tratamiento" incluye un aplazamiento del desarrollo de los síntomas asociados a un trastorno y/o una reducción en la gravedad de los síntomas de dicho trastorno. Los términos incluyen además mejorar los síntomas no deseados o incontrolados existentes, prevenir síntomas adicionales y aliviar o prevenir las causas subyacentes de dichos síntomas. Por lo tanto, los términos indican que se ha conferido un resultado beneficioso a un sujeto vertebrado con un trastorno, enfermedad o síntoma, o con el potencial de desarrollar tal trastorno, enfermedad o síntoma.
Como se utiliza en el presente documento, las expresiones "cantidad terapéuticamente eficaz", "dosis terapéuticamente eficaz" y "cantidad eficaz" se refieren a una cantidad de un anticuerpo murino caninizado anti-IL-4Ra canino o un fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención que, cuando se administra solo o en combinación con un agente terapéutico adicional a una célula, tejido, o sujeto, es eficaz para provocar una mejora medible en uno o más síntomas de una enfermedad o afección o la progresión de dicha enfermedad o afección. Una dosis terapéuticamente eficaz se refiere además a la cantidad de compuesto de unión suficiente para producir al menos una mejora parcial de los síntomas, por ejemplo, tratamiento, curación, prevención o alivio de la afección médica relevante, o aumentar la tasa de tratamiento, curación, prevención o alivio de dichas afecciones. Cuando se aplica a un principio activo individual administrado solo, una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a ese ingrediente solo. Cuando se aplica a una combinación, una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a cantidades combinadas de los principios activos que dan como resultado el efecto terapéutico, ya se administren en combinación, en serie o de manera simultánea. Una cantidad eficaz de un agente terapéutico dará como resultado una mejora de una medida o parámetro de diagnóstico en al menos un 10%; habitualmente en al menos un 20%; preferentemente al menos aproximadamente un 30 %; más preferentemente al menos un 40 % y lo más preferentemente al menos un 50 %. Una cantidad eficaz también puede dar como resultado una mejora en una medida subjetiva en los casos en que se utilizan medidas subjetivas para evaluar la gravedad de la enfermedad.
Otras terapias combinadas
Como se ha descrito anteriormente, un anticuerpo murino caninizado anti-IL-4Ra canino o un fragmento de unión a antígeno del mismo y/o un péptido antigénico de la presente invención pueden administrarse de manera conjunta con uno u otros agentes terapéuticos (tales como un inhibidor como se describe en el siguiente párrafo) y/o un anticuerpo murino anti-TSLP canino [véase, el documento US 8.791.242]. El o los antibióticos pueden unirse al agente (como un inmunocomplejo) y/o pueden administrarse por separado del agente u otro anticuerpo. En el último caso (administración separada), el anticuerpo se puede administrar antes, después o simultáneamente con el agente o puede administrarse de manera conjunta con otras terapias conocidas.
Kits
Se proporcionan además kits que comprenden uno o más componentes que incluyen, pero sin limitación, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, tal como se analiza en el presente documento, que se une de manera específica al IL-4Ra (por ejemplo, un anticuerpo murino caninizado anti-IL-4Ra canino o un fragmento de unión a antígeno del mismo) en asociación a uno o más componentes adicionales que incluyen, pero sin limitación, un vehículo farmacéuticamente aceptable y/o un inhibidor tal como un inhibidor de la cinasa Janus (JAK), por ejemplo, oclacitinib [véase, el documento WO 2013/040241], un inhibidor de la tirosina cinasa del bazo (SYK) [véase, por ejemplo, el documento US 8.759.366], o un antagonista de una molécula homóloga de receptor quimioatrayente expresada en linfocitos Th2 [véase, por ejemplo, los documentos WO 2010/099039; WO 2010/031183; y US 8.546.422]. La composición de unión y/o un inhibidor, como se describe directamente arriba, se puede formular como una composición pura o en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable, en una composición farmacéutica.
En una realización, el kit incluye una composición de unión de la presente invención (por ejemplo, un anticuerpo murino caninizado anti-IL-4Ra canino o una composición farmacéutica del mismo en un recipiente (por ejemplo, en un frasco estéril de vidrio o plástico) y una composición farmacéutica del mismo y/o un inhibidor como se describe anteriormente en otro recipiente (por ejemplo, en un frasco estéril de vidrio o plástico).
Si el kit incluye una composición farmacéutica para administración parenteral a un sujeto, el kit también puede incluir un dispositivo para realizar dicha administración. Por ejemplo, el kit puede incluir una o más agujas hipodérmicas u otros dispositivos de inyección como se analiza anteriormente. El kit también puede incluir un prospecto que incluya información sobre las composiciones farmacéuticas y las formas de dosificación del kit. En general, dicha información ayuda a los dueños de mascotas y a los veterinarios a usar las composiciones farmacéuticas y formas de dosificación adjuntas de manera eficaz y segura. Por ejemplo, la siguiente información sobre una combinación de la invención se puede proporcionar en el prospecto: farmacocinética, farmacodinámica, estudios clínicos, parámetros de eficacia, indicaciones y uso, contraindicaciones, advertencias, precauciones, reacciones adversas, sobredosis, dosis y administración adecuadas, cómo suministrarlo, condiciones adecuadas de almacenamiento, referencias, información sobre el fabricante/distribuidor e información sobre patentes.
Por cuestiones de conveniencia, un anticuerpo o agente de unión específico divulgado en el presente documento se puede proporcionar en un kit, es decir, una combinación envasada de reactivos en cantidades predeterminadas con instrucciones para realizar el ensayo de diagnóstico o detección. Cuando el anticuerpo está marcado con una enzima, el kit incluirá sustratos y cofactores requeridos por la enzima (p. ej., un precursor de sustrato que proporciona el cromóforo o fluoróforo detectable). De manera adicional, pueden incluirse otros aditivos tales como estabilizadores, tampones (p. ej., un tampón de bloqueo o tampón de lisis) y similares. Las cantidades relativas de los diversos reactivos pueden variarse ampliamente para proporcionar unas concentraciones en solución de los reactivos que optimicen sustancialmente la sensibilidad del ensayo. Particularmente, los reactivos pueden proporcionarse en forma de polvos secos, habitualmente liofilizados, incluyendo excipientes que, en disolución, proporcionarán una solución de reactivos que tiene la concentración apropiada.
Ejemplos
EJEMPLO 1
IDENTIFICACIÓN Y CLONACIÓN DEL RECEPTOR DE CADENA a DEL RECEPTOR DE LA IL-4 CANINA
El ADNc que codifica la cadena a del receptor de la IL-4 canina de longitud completa predicho (SEQ ID NO: 1) se identificó mediante una búsqueda en la base de datos de Genbank (n.° de registro XM_547077.4; véase también, el documento US 7.208.579 B2). Este ADNc predicho codifica 823 aminoácidos (SEQ ID NO: 2) que incluye una secuencia líder de 25 aminoácidos y se identifica como número de registro XP_547077.3. La proteína madura de la cadena a del receptor de la IL-4 canina predicha (SEQ ID NO: 4) comparte el 65 % de identidad con la cadena a del receptor de la IL-4 humana (número de registro NP_000409.1) y el 70 % de identidad con la cadena a del receptor de la IL-4 porcina (número de registro NP_999505.1). La proteína madura de la cadena a del receptor de la IL-4 canina predicha está codificada por la secuencia de nucleótidos identificada como SEQ ID NO: 3. La comparación de la cadena a del receptor de la IL-4 madura predicha con las secuencias conocidas de la cadena a del receptor de la IL-4 humana identificó el dominio extracelular (DEC) de la proteína madura de la cadena a del receptor de la IL-4 canina y se denomina como SEQ ID NO: 6. La secuencia de ADN que codifica el DEC de la cadena a del receptor de la IL-4 canina madura se identifica como el SEQ ID NO: 5.
ADN de longitud completa de la cadena a del receptor de la IL-4 canina con secuencia señal (SEQ ID NO: 1): atgggcagactgtgcagcggcctgaccttccccgtgagctgcctggtgctggtgtgggtggccagcagcggcagcgtg aaggtgctgcacgagcccagctgcttcagcgactacatcagcaccagcgtgtgccagtggaagatggaccaccccacc aactgcagcgccgagctgagactgagctaccagctggacttcatgggcagcgagaaccacacctgcgtgcccgagaac agagaggacagcgtgtgcgtgtgcagcatgcccatcgacgacgccgtggaggccgacgtgtaccagctggacctgtgg gccggccagcagctgctgtggagcggcagcttccagcccagcaagcacgtgaagcccagaacccccggcaacctgacc gtgcaccccaacatcagccacacctggctgctgatgtggaccaacccctaccccaccgagaaccacctgcacagcgag ctgacctacatggtgaacgtgagcaacgacaacgaccccgaggacttcaaggtgtacaacgtgacetacatgggcccc accctgagactggccgccagcaccctgaagagcggcgccagctacagcgccagagtgagagcctgggcccagacctac aacagcacctggagcgactggagccccagcaccacctggctgaactactacgagccctgggagcagcacctgcccctg ggcgtgagcatcagctgcctggtgatcctggccatctgcctgagctgctacttcagcatcatcaagatcaagaagggc tggtgggaccagatccccaaccccgcccacagccccctggtggccatcgtgatccaggacagccaggtgagcctgtgg ggcaagagaagcagaggccaggagcccgccaagtgcccccactggaagacctgcctgaccaagctgctgccctgcctg ctggagcacggcctgggcagagaggaggagagccccaagaccgccaagaacggccccctgcagggccccggcaagccc gcctggtgccccgtggaggtgagcaagaccatcctgtggcccgagagcatcagcgtggtgcagtgcgtggagctgagc gaggcccccgtggacaacgaggaggaggaggaggtggaggaggacaagagaagcctgtgccccagcctggagggcagc ggcggcagcttccaggagggcagagagggcatcgtggccagactgaccgagagcctgttcctggacctgctgggcggc gagaacggcggcttctgcccccagggcctggaggagagctgcctgcccccccccagcggcagcgtgggcgcccagatg ccctgggcccagttccccagagccggccccagagccgcccccgagggccccgagcagcccagaagacccgagagcgcc ctgcaggccagccccacccagagcgccggcagcagcgccttccccgagcccccccccgtggtgaccgacaaccccgcc tacagaagcttcggcagcttcctgggccagagcagcgaccccggcgacggcgacagcgaccccgagctggccgacaga cccggcgaggccgaccccggcatccccagcgccccccagccccccgagccccccgccgccctgcagcccgagcccgag agctgggagcagatcctgagacagagcgtgctgcagcacagagccgcccccgcccccggccccggccccggcagcggc tacagagagttcacctgcgccgtgaagcagggcagcgcccccgacgccggcggccccggcttcggccccagcggcgag gccggctacaaggccttctgcagcctgctgcccggcggcgccacctgccccggcaccagcggcggcgaggccggcagc ggcgagggcggctacaagcccttccagagcctgacccccggctgccccggcgcccccacccccgtgcccgtgcccctg ttcaccttcggcctggacaccgagccccccggcagcccccaggacagcctgggcgccggcagcagccccgagcacctg ggcgtggagcccgccggcaaggaggaggacagcagaaagaccctgctggcccccgagcaggccaccgaccccctgaga gacgacctggccagcagcatcgtgtacagcgccctgacctgccacctgtgcggccacctgaagcagtggcacgaccag gaggagagaggcaaggcccacatcgtgcccagcccctgctgcggctgctgctgcggcgacagaagcagcctgctgctg agccccctgagagcccccaacgtgctgcccggcggcgtgctgctggaggccagcctgagccccgccagcctggtgccc agcggcgtgagcaaggagggcaagagcagccccttcagccagcccgccagcagcagcgcccagagcagcagccagacc cccaagaagctggccgtgctgagcaccgagcccacctgcatgagcgccagc
Proteína de longitud completa del receptor a de la IL-4 canina con secuencia señal en negrita (SEQ ID NO: 2).
MGRLCSGLTFPVSCLVLVWVASSGSVKVLHEPSCFSDYISTSVCQWKMDHPTNCSAELRLSYQLDFMGSENHTCVPEN REDSVCVCSMPIDDAVEADVYQLDLWAGQQLLWSGSFQPSKHVKPRTPGNLTVHPNISHTWLLMWTNPYPTENHLHSE LTYMVNVSNDNDPEDFKVYNVTYMGPTLRLAASTLKSGASYSARVRAWAQTYNSTWSDWSPSTTWLNYYEPWEQHLPL GVSISCLVILAICLSCYFSIIKIKKGWWDQIPNPAHSPLVAIVIQDSQVSLWGKRSRGQEPAKCPHWKTCLTKLLPCL LEHGLGREEESPKTAKNGPLQGPGKPAWCPVEVSKTILWPESISWQCVELSEAPVDNEEEEEVEEDKRSLCPSLEGS GGSFQEGREGIVARLTESLFLDLLGGENGGFCPQGLEESCLPPPSGSVGAQMPWAQFPRAGPRAAPEGPEQPRRPESA LQASPTQSAGSSAFPEPPPWTDNPAYRSFGSFLGQSSDPGDGDSDPELADRPGEADPGIPSAPQPPEPPAALQPEPE SWEQILRQSVLQHRAAPAPGPGPGSGYREFTCAVKQGSAPDAGGPGFGPSGEAGYKAFCSLLPGGATCPGTSGGEAGS GEGGYKPFQSLTPGCPGAPTPVPVPLFTFGLDTEPPGS PQDSLGAGSS PEHLGVEPAGKEEDSRKTLLAPEQATDPLR DDLASSIVYSALTCHLCGHLKQWHDQEERGKAHIVPSPCCGCCCGDRSSLLLSPLRAPNVLPGGVLLEASLSPASLVP SGVSKEGKSSPFSQPASSSAQSSSQTPKKLAVLSTEPTCMSAS
Proteína de longitud completa madura del receptor de la IL-4 canina sin secuencia señal (SEQ ID NO: 4)
VKVLHEPSCFSDYISTSVCQWKMDHPTNCSAELRLSYQLDFMGSENHTCVPENREDSVCVCSMPIDDAVEADVYQLDL WAGQQLLWSGSFQPSKHVKPRTPGNLTVHPNISHTWLLMWTNPYPTENHLHSELTYMVNVSNDNDPEDFKVYNVTYMG
PTLRLAASTLKSGASYSARVRAWAQTYNSTWSDWS PSTTWLNYYEPWEQHLPLGVSISCLVILAICLSCYFSIIKIKK GWWDQIPNPAHS PLVAIVIQDSQVSLWGKRSRGQEPAKCPHWKTCLTKLLPCLLEHGLGREEESPKTAKNGPLQGPGK PAWCPVEVSKTILWPESISWQCVELSEAPVDNEEEEEVEEDKRSLCPSLEGSGGSFQEGREGIVARETESLFLDLLG GENGGFCPQGLEESCLPPPSGSVGAQMPWAQFPRAGPRAAPEGPEQPRRPESALQASPTQSAGSSAFPEPPPWTDNP AYRSFGSFLGQSSDPGDGDSDPELADRPGEADPGIPSAPQPPEPPAALQPEPESWEQILRQSVLQHRAAPAPGPGPGS GYREFTCAVKQGSAPDAGGPGFGPSGEAGYKAFCSLLPGGATCPGTSGGEAGSGEGGYKPFQSLTPGCPGAPTPVPVP LFTFGLDTEPPGSPQDSLGAGSSPEHLGVEPAGKEEDSRKTLLAPEQATDPLRDDLASSIVYSALTCHLCGHLKQWHD QEERGKAHIVPSPCCGCCCGDRSSLLLSPLRAPNVLPGGVLLEASLSPASLVPSGVSKEGKSSPFSQPASSSAQSSSQ TPKKLAVLSTEPTCMSAS
ADN de longitud completa maduro del receptor de la IL-4 canina sin secuencia señal (SEQ ID NO: 3) gtgaaggtgctgcacgagcccagctgcttcagcgactacatcagcaccagcgtgtgccagtggaagatggaccacccc accaactgcagcgccgagctgagactgagctaccagctggacttcatgggcagcgagaaccacacctgcgtgcccgag aacagagaggacagcgtgtgcgtgtgcagcatgcccatcgacgacgccgtggaggccgacgtgtaccagctggacctg tgggccggccagcagctgctgtggagcggcagcttccagcccagcaagcacgtgaagcccagaacccccggcaacctg accgtgcaccccaacatcagccacacctggctgctgatgtggaccaacccctaccccaccgagaaccacctgcacagc gagctgacctacatggtgaacgtgagcaacgacaacgaccccgaggacttcaaggtgtacaacgtgacetacatgggc cccaccctgagactggccgccagcaccctgaagagcggcgccagctacagcgccagagtgagagcctgggcccagacc tacaacagcacctggagcgactggagccccagcaccacctggctgaactactacgagccctgggagcagcacctgccc ctgggcgtgagcatcagctgcctggtgatcctggccatctgcctgagctgctacttcagcatcatcaagatcaagaag ggctggtgggaccagatccccaaccccgcccacagccccctggtggccatcgtgatccaggacagccaggtgagcctg tggggcaagagaagcagaggccaggagcccgccaagtgcccccactggaagacctgcctgaccaagctgctgccctgc ctgctggagcacggcctgggcagagaggaggagagccccaagaccgccaagaacggccccctgcagggccccggcaag cccgcctggtgccccgtggaggtgagcaagaccatcctgtggcccgagagcatcagcgtggtgcagtgcgtggagctg agcgaggcccccgtggacaacgaggaggaggaggaggtggaggaggacaagagaagcctgtgccccagcctggagggc agcggcggcagcttccaggagggcagagagggcatcgtggccagactgaccgagagcctgttcctggacctgctgggc ggcgagaacggcggcttctgcccccagggcctggaggagagctgcctgcccccccccagcggcagcgtgggcgcccag atgccctgggcccagttccccagagccggccccagagccgcccccgagggccccgagcagcccagaagacccgagagc gccctgcaggccagccccacccagagcgccggcagcagcgccttccccgagcccccccccgtggtgaccgacaacccc gcctacagaagcttcggcagcttcctgggccagagcagcgaccccggcgacggcgacagcgaccccgagctggccgac agacccggcgaggccgaccccggcatccccagcgccccccagccccccgagccccccgccgccctgcagcccgagccc gagagctgggagcagatcctgagacagagcgtgctgcagcacagagccgcccccgcccccggccccggccccggcagc ggctacagagagttcacctgcgccgtgaagcagggcagcgcccccgacgccggcggccccggcttcggccccagcggc gaggccggctacaaggccttctgcagcctgctgcccggcggcgccacctgccccggcaccagcggcggcgaggccggc agcggcgagggcggctacaagcccttccagagcctgacccccggctgccccggcgcccccacccccgtgcccgtgccc ctgttcaccttcggcctggacaccgagccccccggcagcccccaggacagcctgggcgccggcagcagccccgagcac ctgggcgtggagcccgccggcaaggaggaggacagcagaaagaccctgctggcccccgagcaggccaccgaccccctg agagacgacctggccagcagcatcgtgtacagcgccctgacctgccacctgtgcggccacctgaagcagtggcacgac caggaggagagaggcaaggcccacatcgtgcccagcccctgctgcggctgctgctgcggcgacagaagcagcctgctg ctgagccccctgagagcccccaacgtgctgcccggcggcgtgctgctggaggccagcctgagccccgccagcctggtg cccagcggcgtgagcaaggagggcaagagcagccccttcagccagcccgccagcagcagcgcccagagcagcagccag acccccaagaagctggccgtgctgagcaccgagcccacctgcatgagcgccagc
Dominio proteico extracelular de la cadena a del receptor de la IL-4 canina sin la secuencia señal (SEQ ID NO: 6):
VKVLHEPSCFSDYISTSVCQWKMDHPTNCSAELRLSYQLDFMGSENHTCVPENREDSVCVCSMPIDDAVEADVYQLDL WAGQQLLWSGSFQPSKHVKPRTPGNLTVHPNISHTWLLMWTNPYPTENHLHSELTYMVNVSNDNDPEDFKVYNVTYMG PTLRLAASTLKSGASYSARVRAWAQTYNSTWSDWS PSTTWLNYYEPWEQHLP
Dominio de ADN extracelular de la cadena a del receptor de la IL-4 canina sin la secuencia señal (SEQ ID NO: 5):
gtgaaggtgctgcacgagcccagctgcttcagcgactacatcagcaccagcgtgtgccagtggaagatggaccacccc accaactgcagcgccgagctgagactgagctaccagctggacttcatgggcagcgagaaccacacctgcgtgcccgag aacagagaggacagcgtgtgcgtgtgcagcatgcccatcgacgacgccgtggaggccgacgtgtaccagctggacctg tgggccggccagcagctgctgtggagcggcagcttccagcccagcaagcacgtgaagcccagaacccccggcaacctg
accgtgcaccccaacatcagccacacctggctgctgatgtggaccaacccctaccccaccgagaaccacctgcacagc gagctgacctacatggtgaacgtgagcaacgacaacgaccccgaggacttcaaggtgtacaacgtgacetacatgggc cccaccctgagactggccgccagcaccctgaagagcggcgccagctacagcgccagagtgagagcctgggcccagacc tacaacagcacctggagcgactggagccccagcaccacctggctgaactactacgagccctgggagcagcacctgccc
Dominio extracelular de la cadena a del receptor de la IL-4 canina con un marcador HIS 8 carboxiterminal (SEQ ID NO: 8):
VKVLHEPSCFSDYISTSVCQWKMDHPTNCSAELRLSYQLDFMGSENHTCVPENREDSVCVCSMPIDDAVEADVYQLDL WAGQQLLWSGSFQPSKHVKPRTPGNLTVHPNISHTWLLMWTNPYPTENHLHSELTYMVNVSNDNDPEDFKVYNVTYMG PTLRLAAS TLKSGASYSARVRAWAQT YNSTWSDWSPSTTWLNYYE PWEQHLPHHHHHHHH
Dominio de ADN extracelular de la cadena a del receptor de la IL-4 canina con un marcador HIS 8 carboxiterminal (SEQ ID NO: 7):
gtgaaggtgctgcacgagcccagctgcttcagcgactacatcagcaccagcgtgtgccagtggaagatggaccacccc accaactgcagcgccgagctgagactgagctaccagctggacttcatgggcagcgagaaccacacctgcgtgcccgag aacagagaggacagcgtgtgcgtgtgcagcatgcccatcgacgacgccgtggaggccgacgtgtaccagctggacctg tgggccggccagcagctgctgtggagcggcagcttccagcccagcaagcacgtgaagcccagaacccccggcaacctg accgtgcaccccaacatcagccacacctggctgctgatgtggaccaacccctaccccaccgagaaccacctgcacagc gagctgacctacatggtgaacgtgagcaacgacaacgaccccgaggacttcaaggtgtacaacgtgacctacatgggc cccaccctgagactggccgccagcaccctgaagagcggcgccagctacagcgccagagtgagagcctgggcccagacc tacaacagcacctggagcgactggagccccagcaccacctggctgaactactacgagccctgggagcagcacctgccc caccaccaccaccaccaccaccac
Dominio extracelular de la cadena a del receptor de la IL-4 canina más Fc de IgG1 humana (SEQ ID NO: 10):
VKVLHEPSCFSDYISTSVCQWKMDHPTNCSAELRLSYQLDFMGSENHTCVPENREDSVCVCSMPIDDAVEADVYQLDL WAGQQLLWSGSFQPSKHVKPRTPGNLTVHPNISHTWLLMWTNPYPTENHLHSELTYMVNVSNDNDPEDFKVYNVTYMG PTLRLAASTLKSGASYSARVRAWAQTYNSTWSDWSPSTTWLNYYEPWEQHLEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYK CKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Dominio de ADN extracelular de la cadena a del receptor de la IL-4 canina más Fc de IgG1 humana (SEQ ID NO: 9):
gtgaaggtgctgcacgagcccagctgcttcagcgactacatcagcaccagcgtgtgccagtggaagatggaccacccc accaactgcagcgccgagctgagactgagctaccagctggacttcatgggcagcgagaaccacacctgcgtgcccgag aacagagaggacagcgtgtgcgtgtgcagcatgcccatcgacgacgccgtggaggccgacgtgtaccagctggacctg tgggccggccagcagctgctgtggagcggcagcttccagcccagcaagcacgtgaagcccagaacccccggcaacctg accgtgcaccccaacatcagccacacctggctgctgatgtggaccaacccctaccccaccgagaaccacctgcacagc gagctgacctacatggtgaacgtgagcaacgacaacgaccccgaggacttcaaggtgtacaacgtgacctacatgggc cccaccctgagactggccgccagcaccctgaagagcggcgccagctacagcgccagagtgagagcctgggcccagacc tacaacagcacctggagcgactggagccccagcaccacctggctgaactactacgagccctgggagcagcacctggag cccaagagctgcgacaagacccacacctgccccccctgccccgcccccgagctgctgggcggccccagcgtgttcctg ttcccccccaagcccaaggacaccctgatgatcagcagaacccccgaggtgacctgcgtggtggtggacgtgagccac gaggaccccgaggtgaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcacaacgccaagaccaagcccagagaggag cagtacaacagcacctacagagtggtgagcgtgctgaccgtgctgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaag tgcaaggtgagcaacaaggccctgcccgcccccatcgagaagaccatcagcaaggccaagggccagcccagagagccc caggtgtacaccctgccccccagcagagacgagctgaccaagaaccaggtgagcctgacctgcctggtgaagggcttc taccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaacggccagcccgagaacaactacaagaccaccccccccgtgctg gacagcgacggcagcttcttcctgtacagcaagctgaccgtggacaagagcagatggcagcagggcaacgtgttcagc tgcagcgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagagcctgagcctgagccccggcaag
EJEMPLO 2
ANTICUERPOS MURINOS ANTICADENA a DEL RECEPTOR DE LA IL-4 CANINA
Generación de anticuerpos monoclonales anticadena a del receptor de la IL-4 canina:
Se inmunizó un total de tres ratones Balb/c varias veces (con 10 ^g cada vez) durante un período de 17 días. El antígeno inmunizante fue la proteína de fusión de dominio extracelular (DEC) de la cadena a del IL-4 R canina-Fc humana. Después de la inmunización, se recogió suero de cada ratón y se analizó la reactividad con la proteína del DEC de la cadena a del receptor de IL-4 canina marcada con HIS. Las células del bazo del ratón con el valor más elevado de suero anti-DEC la cadena a del receptor de la IL-4 se fusionaron con la línea celular de mieloma P3X63Ag8.653. Aproximadamente 2 semanas después de la fusión, el sobrenadante de las supuestas células de hibridoma se analizaron mediante ELISA para determinar su reactividad con la proteína de DEC de la cadena a del receptor de la IL-4 marcada con His. Los hibridomas que producían fuertes señales positivas en el ELISA se subclonaron mediante dilución limitante y se analizaron de nuevo para determinar la reactividad con la proteína del DEC de la cadena a del receptor de la IL-4 canina marcada con HIS.
Confirmación de la reactividad de los anticuerpos monoclonales contra la cadena a del receptor de la IL-4 canina:
La reactividad de los anticuerpos secretados por los hibridomas al DEC de la cadena a del receptor de la IL-4 canina se confirmó mediante ELISA. Las células de hibridoma se cultivaron usando biorreactores CELLine (Integrabiosciences) durante 10-30 días. Las células se mantuvieron inicialmente en DMEM complementado con L-glutamina 4 mM y suero bovino fetal (FBS) de IgG ultrabaja al 10 % de Gibco. Las células de hibridoma se sembraron en cámaras de células del biorreactor CELLine a una densidad celular de aproximadamente 2 * 106 células/ml en 15 ml del mismo medio con la concentración de FBS aumentada al 20 %. La cámara exterior se llenó con 1 litro de medio nutritivo (DMEM con L-glutamina 4 mM y FBS estándar al 2 %). Las células de hibridoma en la cámara celular se expandieron a aproximadamente 2,5 x 107 células/ml durante 3-7 días. A continuación, se recogieron 10 ml de suspensión celular de la cámara celular y se reemplazaron con medio fresco para permitir la reexpansión de las células y las posteriores recolecciones. Este procedimiento se repitió según fue necesario para obtener cantidades adecuadas de AcM de cada clon de hibridoma. Las suspensiones de células recolectadas se centrifugaron y los sobrenadantes se filtraron a través de membranas de filtro de 0,2 micrómetros. Para la purificación de anticuerpos, el sobrenadante de cada clon se purificó usando una columna de 5 ml de flujo rápido de proteína G Sepharose 4 (GE Healthcare) mediante flujo por gravedad. Después de lavar con tampón Tris-EDTA (TE) a pH 8,0, los anticuerpos unidos se eluyeron usando tampón de glicina 0,1 M, pH 2,7, seguido de la neutralización del pH con Tris 1 M, pH 8,0. Los anticuerpos se concentraron y se intercambió el tampón en solución salina tamponada con fosfato (PBS) usando unidades de filtro centrífugo Centriprep YM-10kDa NMWL (Millipore). Las concentraciones de anticuerpos se cuantificaron mediante espectrofotometría. Se analizó la reactividad de los AcM anticadena a del receptor de la IL-4 canina purificados con el dominio DEC marcado con HIS de la cadena a del receptor de la IL-4 canina mediante ELISA de la siguiente manera: La proteína de cadena a del receptor de la IL-4 canina marcada con HIS se diluye a 10|jg/ml en tampón de recubrimiento (carbonato/bicarbonato pH 9,0) y se dispensa a 100 jl/pocillo en placas ELISA de fondo plano de 96 pocillos (NUNC). Las placas se incuban a 4 °C durante una noche. A continuación, las placas se lavan tres veces con solución salina tamponada con fosfato que contiene Tween-20 (PBST) al 0,05 %. A continuación, se añaden 200 j l de tampón de bloqueo (leche desnatada al 5 % en PBST) a cada pocillo y las placas se incuban a 37 °C durante 60 minutos. Después, las placas se lavan tres veces con PBST. A continuación, se añaden 100 j l de AcM de prueba diluidos en tampón de bloqueo a los primeros pocillos de las columnas correspondientes. A continuación, los AcM de prueba se diluyen tres veces hasta la posición adecuada de la placa. Después de la incubación de las placas a 37 °C durante 60 minutos, las placas se lavan tres veces con PBST. A continuación, se añaden a las placas 100 j l por pocillo de una dilución 1:2000 de una IgG de cabra anti-ratón (KPL) conjugada con peroxidasa de rábano picante, que después se incuba a 37 °C durante 60 minutos. A continuación, las placas se lavan tres veces con PBST y se añaden a las placas 100 jl/pocillo de sustrato de 3,3',5,5' tetrametilbencidina (TMB) (de KPL). Se deja que se desarrolle la reacción de color durante 5 a 20 minutos a 37 °C antes de medir la absorbencia a 650 nm.
Varios anticuerpos monoclonales (AcM) de ratón anti-IL-4Ra canino se analizaron mediante ELISA para determinar su capacidad para unirse al dominio extracelular del IL-4Ra canino. Como se muestra en la figura 1, la mayoría de estos AcM presentan una unión dependiente de la dosis positiva.
EJEMPLO 3
IDENTIFICACIÓN DEL ADN Y LAS SECUENCIAS DE PROTEÍNA PREDICHAS DE LOS DOMINIOS VARIABLES DE CADENAS PESADAS Y LIGERAS DE LOS ANTICUERPOS MONOCLONALES ANTI-CADENA a DEL RECEPTOR DE LA IL-4 CANINA
La secuencia de ADN de las cadenas VH y VL de ratón se identifica después del aislamiento del ARNm de cada hibridoma usando métodos estándar de biología molecular. Las SEQ ID NO. del ADN y las secuencias de aminoácidos predichas de VH y VL de estos hibridomas se enumeran a continuación. El ADN que codifica la secuencia señal y los aminoácidos correspondientes a la secuencia señal predicha están subrayados, los correspondientes a las CDR están en negrita, y los FR no están subrayados ni en negrita (es decir, secuencia señal-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4).
AcM 1A3
Cadena pesada: Secuencia de ADN (SEQ ID NO: 11):
ATGGACTCCAGGCTCAATTTAGTTTTCCTTGTCCTTATTTTAAAAGGTGTCCGGTGTGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCT GGGGGAGACTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTGACTTTGGA ATGCACTGGGTTCGTCAGGCTCCAGAGAAGGGGCTGGGGTGGGTTGCATACATTAGTAGTGGCAGTGGTACCATCTAC TATGCAGACACAGTGAGGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGTCAAGAACACCCTGTTCCTGCAAATGACCAGT
CTGAGGTCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTGTAAGGGGGGACCTTTACTACGGTAGTAGTTTCGATGCTTATTGG
GGCCGAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA
Cadena pesada: Secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 12):
MDSRLNLVFLVLILKGVRCEVQLVESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFTFSDFGMHWVRQAPEKGLGWVAYISSGSGTIY YADTVRGRFTISRDNVKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCVRGDLYYGSSFDAYWGRGTLVTVSA
C a d e n a ligera : S e cu e n c ia de A D N (S E Q ID NO: 13):
ATGGATTTTCAAGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCTTCAGTCATAATGTCCAGAGGACAAATTGTTCTC TCCCAGTCTCCAGCAATCCTGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACAATGACTTGCAGGGCCAGCTCAAGTGTAAGT TTCATGTTCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGATCCTCCCCCAAACCCTGGATTTATGACACATCCAACCTGGCTTCTGGA GTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAAGATGCT GCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTAGTAACCCACTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA
Cadena ligera: Secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 14):
MDFQVQIFSFLLISASVIMSRGQIVLSQS PAILSASPGEKVTMTCRASSSVSFMFWYQQKPGSSPKPWIYDTSNLASG VPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELK
AcM 1A9
Cadena pesada: Secuencia de ADN (SEQ ID NO: 15):
ATGGAATGGCCTTGTATCTTTCTCTTCCTCCTGTCAGTAACTGAAGGTGTCCACTCCCAGGTTCCGCTGCAGCAGTCT GGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGATTTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACGCATTCAGTAGCTCCTGG ATGAACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGAAAGGGTCTTGAGTGGATTGGACGGATTTATCCTGGAGATGGAGATACTAAG TACAAT GGGAAGTTCAAGGGC AAGGCCACAC TGACTGCAGACAAAT CCTCCAGCACAGC CTACATGCAAC TCAGCAGC CTGACATCGGAGGACTCTGCGGTTTACTTCTGTGCAAGAGATGATTACGACGAGGCTTCCTGGGGCCAAGGGACTCTG GTCACTGTCTCTGCA
Cadena pesada: Secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 16):
MEWPCIFLFLLSVTEGVHSQVPLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYAFSSSWMNWVKQRPGKGLEWIGRIYPGDGDTK YNGKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARDDYDEASWGQGTLVTVSA
Cadena ligera: Secuencia de ADN (SEQ ID NO: 17):
ATGGGCATCAAGATGGAGTTTCAGACCCAGGTCTTTGTATTCGTGTTGCTCTGGTTGTCTGGTGTTGATGGAGACATT GTGATGACCCAGTCTCAAAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCATCACCTGCAAGGCCAGTCAGAAT GTTCGTTCTGCTGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGGCAGTCTCCTAAATCACTGATTTACTTGGCATCCAACCGG CACACTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATTAGCAATGTGCAATCT GAAGACCTGGCAGATTATTTCTGTCTGCAACATTGGAATTATCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATA AAA
Cadena ligera: Secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 18):
MGIKMEFQTQVFVFVLLWLSGVDGDIVMTQSQKFMSTSVGDRVSITCKASQNVRSAVAWYQQKPGQSPKSLIYLASNR HTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLADYFCLQHWNYPFTFGSGTKLEIK
AcM 1B12
Cadena pesada: Secuencia de ADN (SEQ ID NO: 19):
ATGGGATGGAGCTGGATCTTTCTCTTTCTCCTGTCAGGAACTGCAGGTGTCCTCTCTGAGGTCCAGCTGCAACAAT CT GGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATATCCTGTAAGGCTTCTGGATACACGTTCACTGACTATTAC ATGAACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGAGACATTATTCCTAGCAATGGTGGTACTAGC TACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGTAGACAAGTCCTCCAGCGCAGCCTACATGGAGCTCCGCAGC
CTGACAT CTGAGGACTCTG CAGTCTATTACTGTG CAAGAGGGATCAGC TACTATGGTAAC CGATATTAC TTTACTATG GACTATTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA
Cadena pesada: Secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 20):
MGWSWIFLFLLSGTAGVLSEVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFTDYYMNWVKQSHGKSLEWIGDIIPSNGGTS YNQKFKGKATLTVDKSSSAAYMELRSLTSEDSAVYYCARGISYYGNRYYFTMDYWGQGTSVTVSS
C a d e n a ligera : S e cu e n c ia de A D N (S E Q ID NO: 21):
ATGAGGTGCCTAGCTGAGTTCCTGGGGCTGCTTGTGCTCTGGATCCCTGGAGCCATTGGGGATATT GT GATGACTCAG GCTGCACCCTCTGTACCTGTCACTCCTGGAGAGTCAGTATCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTCCTGCATAGT AATGGCAACACTTACTTGTTTTGGTTCGTGCAGAGGCCAGGCCAGTCTCCTCAGCTCCTGATATATCGGATGTCCAAC CTTGCCTCAGGAGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCAGGAACTGCTTTCACACTGAGAATCAGTAGAGTGGAG GCTGAGGATGTGGGTGTTTATTACTGTATGCAACATCTAGAATATCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAC ATAAAA
Cadena ligera: Secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 22):
MRCLAEFLGLLVLWIPGAIGDIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCRSSKSLLHSNGNTYLFWFVQRPGQSPQLLIYRMSN LASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPFTFGSGTKLDIK
AcM 10C12
Cadena pesada: Secuencia de ADN (SEQ ID NO: 23):
ATGGAATGGAGCTGGATCTTTCTCTTCCTCCTGTCAGTAACTGCAGGTGTCCAATCCCAGGTTCAACTGCAGCAGTCT GGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCGGGCTACACATTTACTGACTATGAA ATGCACTGTGTGAAGCAGACACCTGTGCACGGCCTGGAATGGATTGGAGCTATTGATCCTGAAACTTGTGGTACTGCC TACAAT CAGAAGTTCAAGGGCAAG GCCACAC TGACTGCAGACAAAT CCTCCAGCACAG CCTACATGGAG CTCCGCAGC CTGACATCTGAGGACTCTGCCGTCTATTACTGTACAAGATCGAAACTGGGACGAGGGTGGTACTTCGATGTCTGGGGC ACAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
Cadena pesada: Secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 24):
MEWSWIFLFLLSVTAGVQSQVQLQQSGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTDYEMHCVKQTPVHGLEWIGAIDPETCGTA YNQKFKGKATLTADKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCTRSKLGRGWYFDVWGTGTTVTVSS
Cadena ligera: Secuencia de ADN (SEQ ID NO: 25):
ATGGAATCACAGACCCAGGTCCTCATGTTTCTTCTGCTCTGGGTATCTGGTGCCTGTGCAGACATT GT GATGACACAG TCTCCATCCTCCCTGGCTATGTCAGTAGGACAGAAGGTCACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGAGCCTTTTAAATAGT AGCAATCAAAAGAACTATTTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGTCTCCTAAACTTCTGGTATACTTTGCATCC ACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCATAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTTACCATCAGCAGTGTG CAGGCTGAAGACCTGGCAGATTACTTCTGTCAGCAACATTATAGCACTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTG GAAATAAAA
Cadena ligera: Secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 26):
MESQTQVLMFLLLWVSGACADIVMTQSPSSLAMSVGQKVTMSCKSSQSLLNSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLVYFAS TRESGVPDRFIGSGSGTDFTLTISSVQAEDLADYFCQQHYSTPYTFGGGTKLEIK
AcM10F2
Cadena pesada: Secuencia de ADN (SEQ ID NO: 27):
ATGGCTGTCCTGGCACTGCTCCTCTGCCTGGTGACATTCCCAAACTGTGTCCTGTCCCAGGTGCACCT GAAGGAGTCA GGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCATCACATGCACTGTCTCAGGGTTCTCTTTAACCAGCTATGGT GTAAGCTGGGTTCGCCAGCCTCCAGGAGAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTGACGGGAGCACATATTTT CATTCAGCTCTCATATCCAGACTGAGCATCAGCAAGGATGACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAATTGAACAGTCTA CAAACTGATGACACAGCCACGTACTACTGTGCCAAACAAGGGACGATCTATGATGGTTACTACAACTATGCTATGGAC TACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA
Cadena pesada: Secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 28):
MAVLALLLCLVTFPNCVLSQVHLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTSYGVSWVRQPPGEGLEWLGVIWGDGSTYF HSALISRLSISKDDSKSQVFLKLNSLQTDDTATYYCAKQGTIYDGYYNYAMDYWGQGTSVTVSS
C a d e n a ligera : S e cu e n c ia de A D N (S E Q ID NO: 29):
ATGGATTCACAGGCCCAGGTTCTTATGTTACTGCTGCTATGGGTATCTGGTACCTGTGGGGACATT GTGATGTCACAG TCTCCATCCTCCCTAACTGTGTCAGTTGGAGAGAAGGTTACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGAACCTTTTATATGGT GGCAATCAAAAGAACTACTTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGTCTCCTAAACTGCTGATTTACTGGGCATCC ACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTGTG AGGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGCAATATTATGACTATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTG GAAATAAAA
Cadena ligera: Secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 30):
MDSQAQVLMLLLLWVSGTCGDIVMSQSPSSLTVSVGEKVTMSCKSSQNLLYGGNQKNYIAWYQQKPGQSPKLLIYWAS TRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVRAEDLAVYYCQQYYDYPYTFGGGTKLEIK
AcM 10E10
Cadena pesada: Secuencia de ADN (SEQ ID NO: 31):
ATGGGATGGAGCTGGATCTTTCTCTTCCTCCTGTCAGGAACTGCAGGTGTCCACTCCCAGGTT CAGCTGCAGCAGTCT GGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGTTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACAACCTACGAT ATACACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGGCAGGGCCTTGAGTGGATTGGATGGATTTATCCTAGAGATGGTCGTACTACT TACAATGAGAAGTTCAAGGCCAAGGCCACATTGACTGTAGACACATCCTCCACCACAGCGTACATGGAGCTCCACAGC CTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCGAGAAGTAGCCCCTTTGGCTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTC ACAGTCTCCTCA
Cadena pesada: Secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 32):
MGWSWIFLFLLSGTAGVHSQVQLQQSGPELVKPGASVKLSCKASGYTFTTYD1HWVKQRPGQGLEWIGWIYPRDGRTT YNEKFKAKATLTVDTSSTTAYMELHSLTSEDSAVYFCARSSPFGYWGQGTTLTVSS
Cadena ligera: Secuencia de ADN (SEQ ID NO: 33):
ATGAAGTTTCCTTCTCAACTTCTGCTCTTCCTGCTGTTCAGAATCACAGGCATAATATGTGACATC CAGATGACACAA TCTTCATCCTACTTGTCTGTATCTCTAGGAGGCAGAGTCACCATTACTTGCAAGGCAAGTGACCACATTAATAATTGG TTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGAAATGCTCCTAGGCTCTTAATATCTGGTGCAACCAGTTTGGAAACTGGGGTT CCTTCAAGATTCAGTGGCAGTGGATCTGGAAAGGATTACACTCTCAGCATTACCAGTCTTCAGACTGAAGATGCTGCT ACTTATCACTGTCACCAGTATTGGAGTATTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGGTGGAAATAAAA
Cadena ligera: Secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 34):
MKFPSQLLLFLLFRITGIICDIQMTQSSSYLSVSLGGRVTITCKASDHINNWLAWYQQKPGNAPRLLISGATSLETGV PSRFSGSGSGKDYTLSITSLQTEDAATYHCHQYWSIPYTFGGGTKVEIK
AcM 10G8
Cadena pesada: Secuencia de ADN (SEQ ID NO: 35):
ATGGÁATGGAGCTGGGTCTTTCTCTTCCTCCTGTCAGTAATTGCAGGTGTCCAATCCCAGGTTCAACTGCAGCAGTCT GGGGCTGAGCTGGTGGGGCCTGGGGCTTCAGTGACGCTGTCCTGCAAGGCTTCGGGCTACACATTTACTGACTATGAA ATGCACTGGGTGAAGCAGACACCTGTGCATGGCCTGGAATGCATTGGAGCTATTGATCCTGAAACTGGTGGTACTGCC TACAATCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCATACTGACTGCAGACAAATCCTCTAGCACAGCCTACATGGAGCTCCGCAGC CTGACATCTGAGGACTCTGCCGTCTATTACTGTCTAACTGGGTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTC TCCTCA
Cadena pesada: Secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 36):
MEWSWVFLFLLSVIAGVQSQVQLQQSGAELVGPGASVTLSCKASGYTFTDYEMHWVKQTPVHGLECIGAIDPETGGTA YNQKFKGKAILTADKSSSTAYMELRSLT SEDSAVYYCLTGFDYWGQGTTLTVSS
Cadena ligera: Secuencia de ADN (SEQ ID NO: 37):
ATGGATTTTCAGGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGTCTCAGTCATAATGTCCAGAGGACAAATTGTTCTC ACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCTGGGGAGAAGGTCACCTTGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTGAAT TCCAGCTACTTGTACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGATCCTCCCCCAAACTCTGGATTTATAGCACATCCAACCTGGCT TCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAA GATGCTGCCTCTTATTTCTGCCATCAGTGGAGTAGTTACCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA C a d e n a ligera : S e cu e n c ia de a m in o á c id o s (S E Q ID NO: 38):
MDFQVQIFSFLLISVSVIMSRGQIVLTQSPAIMSASPGEKVTLTCSASSSVNSSYLYWYQQKPGSSPKLWIYSTSNLA SGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAASYFCHQWSSYPYTFGGGTKLEIK
AcM11B6
Cadena pesada: Secuencia de ADN (SEQ ID NO: 39): ATGATGGTGTTAAGTCTTCTGTACCTGTTGACAGCCCTTCCGGGTATCCTGTCAGAGGTGCAGCTTCAGGAGTCAGGA CCTGGCCTGGCAAAACCTTCTCAGACTCTGTCCCTCACCTGTTCTGTCACTGGCTACTCCATCACCAGTGATTACTGG AACTG GATCCGGAAATT CCCAGGGAATAAAC TTGAATACAT GGGGTACATAAAC TACAGTGGTAACAC TTACTACAAT CCATCTCTCAAAAGTCGAATCTCCATAACTCGAGACACATCCAAGAACCAGTATTACCTGCAATTGAATTCTGTGACT ACTGAGGACACAGCCACGTATTACTGTGCAAGATATGGGGGATTACGACAGGGTTCCTGGCACTTCGATGTCTGGGGC CCAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
Cadena pesada: Secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 40): MMVLSLLYLLTALPGILSEVQLQESGPGLAKPSQTLSLTCSVTGYSITSDYWNWIRKFPGNKLEYMGYINYSGNTYYN PSLKSRISITRDTSKNQYYLQLNSVTTEDTATYYCARYGGLRQGSWHFDVWGPGTTVTVSS
Cadena ligera: Secuencia de ADN (SEQ ID NO: 41): ATGGATTTTCAGGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCCTCAGTCATAATGTCCAGAGGACAAATTGTTCTC ACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATATCCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAGT TACATGTACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGATCCTCCCCCAAACCCTGGATTTATCGCACATCCAACCTGGCTTCTGGA GTCCCTGCGCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCT GCCACTTATTACTGCCAGCAGTATCATAGTTACCCAGCGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA
Cadena ligera: Secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 42): MDFQVQIFSFLLISASVIMSRGQIVLTQSPAIMSASPGEKVTISCSASSSVSYMYWYQQKPGSSPKPWIYRTSNLASG VPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQYHSYPATFGGGTKLEIK
AcM11D3
Cadena pesada: Secuencia de ADN (SEQ ID NO: 43): ATGGGTTGGCTGTGGAACTTGCTATTCCTGATGGCAGCTGCCCAAAGTGCCCAAGCACAGATCCAGTTGGTACAGTCT GGACCTGAGCTGAAGAAGCCTGGAGAGACAGTCAAGATCTCCTGCAAGGCTTCTGGGTATATCTTCACAACCTATGGA ATGTACTGGGTGAAACAGGCTCCAGGAAAGGGTTTAAAGTGGATGGGCTGGATAAACACCTACTCTGGAGTGCCAACA TATGTTGATGACTTCAAGGGACGGTTTGCCTTCTCTTTGGAAACATCTGCCAGCACTGCCTATTTGCAGATCAACAAC CTCAAAAATGAGGACACGGCTACATATTTCTGTGTAGTTGCCGGGTGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTC ACTGTCTCTGCA
Cadena pesada: Secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 44): MGWLWNLLFLMAAAQSAQAQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYIFTTYGMYWVKQAPGKGLKWMGWINTYSGVPT YVDDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCWAGWFAYWGQGTLVTVSA
Cadena ligera: Secuencia de ADN (SEQ ID NO: 45): ATGGACATGAGGACCCCTGCTCAGTTTCTTGGAATCTTGTTGCTCTGGTTTCCAGGTATCAAATGTGACATCAAGATG ACCCAGTCTCCATCTTCCATGTATGCATCTCTAGGAGAGAGAGTCACTATCACTTGCAAGGCGAGTCAGGACATTAAG AGCTATTTAAGCTGGTTCCAGCAGAAACCAGGGAAATCTCCTAAGACCCTGATCTATCGTGCAAATATATTGATAGAT GGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGCAAGATTATTCTCTCACCATCAGCAGCCTGGAGTATGAAGAT ATGGGAATTTATTATTGTCTACAATATGATGAGTTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA
Cadena ligera: Secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 46):
MDMRTPAQFLGILLLWFPGIKCDIKMTQS PSSMYASLGERVTITCKASQDIKSYIiSWFQQKPGKS PKTLIYRANILID GVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLEYEDMGIYYCLQYDEFPYTFGGGTKLEIK
AcM 11H2
C a d e n a pesada: S e cu e n c ia de A D N (S E Q ID NO: 105)
ATGAACTTGGGGCTCAGCTTGATTTTCCTTGTCCTTGTTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGACGTGAAGCTGGTGGAGTCT GGGGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGG ATTCACTTTCAGTGACTATTACATGTATTGGGTTCGCCAGACTCCAGAGAAGAGACTGGAGTGGGTCGCATATGTTAG TAGTGGTGGTGGTAGTATCTAT TATCCAGACACTGTAAAGGGCC GATTCACCAT CT CCAGAGACAATGCCAAGAACACCCTGTATTTGCAAATGAGCCGTCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTG CAAGGCATGGGTCCCCCTTCGGTAGTAGCCGAGGGGCCTGGTTTGCTTACTGGGGC CAGGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA
Cadena pesada: Secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 106)
MNLGLSLIFLVLVLKGVQCDVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCAAS GFTFSDYYMYWVRQT PEKRLEWVAYVS SGGGSIY YPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSRLKSEDTAMYYCARHGSPFGSSRGAWFAYWG QGTLVTVSA
Cadena ligera: Secuencia de ADN (SEQ ID NO: 107)
ATGAGTGTGCCCACTCAGGTCCTGGGGTTGCTGCTGCTGTGGCTTACAGGTGCCAGATGTGACATC CAGATGACTCAG TCTCCAGCCTCCCTGTCTGCATCTGTGGGAGAAACTGTCACCATCACATGTCGAGC AAGTGAGAATATTTACAGTTATTTAGCATGGTATCAGCAGAAACAGGGAAAATCTCCTCAGCTCCTGGTCTATAATGC AAAAACCTTAGCAGAGGGTGTGCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACAC AGTTTTCTCTGAAGATCAACAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGGGAATTATTACTGTCAACATTATGATGGTTTTCCGT TCACGTTCGGTGGTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA
Cadena ligera: Secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 108)
MSVPTQVLGLLLLWLTGARCDIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLAEGV PSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGNYYCQHYDGFPFTFGGGTKLELK
AcM 6C12
Cadena pesada: Secuencia de ADN (SEQ ID NO: 109)
ATGGOTTGCCTGTGfiAAGTTCCTATT CCTCATCGCAGC 7GCGCAAAGTGCGCAAGCAC AGATCCAGTTGATACA GTCT GGACCT GAGCTGAAGAAGC CCGGAGAGACAGT CAAGATCTCCTGCAAGGCT TCTGGGTATAC CTTCACAAjCCTTTGGA ATGAGCI'GGGTGAAACAGGCTCCAGGAAAGGGTTTAAAGTGGATGGGCTGGATAAGCACCTACTCTGGAGTGCCAACA TATGCT GATGACTTCAAGGGACG GTTTGCCTT CTCTTTGGAAACC TCTGCCAGCACTG CCTATTTGCAGAT CAACAAC CTCAAAAATGAGGACACGGCTTCATATTTCTGTGCAAGACACACCTTCCAAAGTCGCGGGTTGGCTTACTGGGGCCAA GC-GACTCTGGTCACTGT CICTC-CA
Cadena pesada: Secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 110)
MGWLWNLLFLMAAAQSAQAQIQLÍQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTTFGMSWVKQAPGKGLKWMGWISTYSGVPT YADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTASYFCARHTFQSRGLAYWGQGTLVTVSA
Cadena ligera: Secuencia de ADN (SEQ ID NO: 111)
ATGGGCATCAAAATGGAGTCACAGATTCAGGTCTTTGTATTCGTGTTTCTCTGGTTGTCTGGTGTTGACGGAGACATt GTGATGACCCAGTCTCACAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCATCACCTGCAAGGCCAGTCAGGAT GTGATTACTACTGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGACAATCTCCTAAACTACTGATTTACTCGGCATCCTACCGG TACACTGGAGTCCCTGATCGCTTCACTGGCAGTGGATCTGGGACGGATTTCACTTTCACCATCACCAGTGTGCAGACT GAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGCAACATTATAGTACTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATC AAA
Cadena ligera: Secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 112)
MGIKMESQIQVFVFVFLWLSGVDGDIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVITTVAWYQQKPGQS PKLLIYSASYRYTGVPDRFTGSGSGTDFTFTITSVQTEDLAVYYCQQHYSTPWTFGGGTKLEIK AcM 4H3
C a d e n a pesada: S e cu e n c ia de A D N (S E Q ID NO: 113)
ATGGGATGGAGCTGTATCATGCTCTTCTTGGCAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCCAGGTCCAACTGCAGCAGCCT GGGGCTGAGCTTGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAACTACTGG ATACACTGGATGAAGCAGAGGCCTGGACGAGGCCTTGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTAATAGTGGTGGTACTAAG TACAAT GAGAAGTTCAAGAGCAAG GCCACAC TGACTGTCGACAAAC CCTCCAT CACAGCCTACAT GCAGCTCAGCAG C CTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTATTGTGCAGCATTCGGTAGTACCTACGGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGG ACTCTGGTCACTGTCTCTGCA
Cadena pesada: Secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 114)
MGWSCIMLFLAATATGVHSQVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTNYW1HWMKQRPGRGLEWIGRIDPNSGGTK YNEKFKSKATLTVDKPSITAYMQLSSLTSEDSAVYYCAAFGSTYGFAYWGQGTLVTVSA
Cadena ligera: Secuencia de ADN (SEQ ID NO: 115)
ATGGATTCACAGGCCCAGGTTCTTATATTGCTGCTGCTATGGGTATCTGGTACCTGTGGGGACATT GTGATGTCACAG TCTCCATCCTCCCTGGCTGTGTCAGCAGGAGAGAAGGTCACTATGAGTTGCAAATCCAGTCAGAGTCTGCTCAACAGT AGAACCCGAAAGAACTACTTGGCTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGTCTCCTAAACTGCTGATCTACTGGGCATCC ACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTGTG CAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGCAAGCAATCTTATAATCTGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAA ATAAAA
Cadena ligera: Secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 116)
MDSQAQVLILLLLWVSGTCGDIVMSQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWAS TRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCKQSYNLYTFGGGTKLEIK
AcM 4D8
Cadena pesada: Secuencia de ADN (SEQ ID NO: 117)
ATGAACTTGGGGCTCAGCTTGATTTTCCTTGTCCTTGTTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAAGTGACGCTGGTGGAGTCT GGGGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTGACTATTAC ATGTATTGGGTTCGCCAGACTCCAGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCATACATTAGTCCTGGTGGTGGTAGCACCTAT TATCCGGACAC TATAAAGGGC CGATTCAC CATCTCCAGAGACAAT GCCAAGAACAC CCTGTACCTG CAAATGAGCC GT CTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTACAAGACATGGGTCCCCCTACGGTAGTAGTCGAGGGGCCTGGTTT GCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA
Cadena pesada: Secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 118)
MNLGLSLIFLVLVLKGVQCEVTLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSDYYMYWVRQTPEKRLEWVAYISPGGGSTY YPDTIKGRFTISRDNAKNTLYLQMSRLKSEDTAMYYCTRHGSPYGSSRGAWFAYWGQGTLVTVSA
Cadena ligera: Secuencia de ADN (SEQ ID NO: 119)
ATGAGTGTGCCCACTCAGGTCCTGGGGTTGCTGCTGCTGTGGCTTACAGGTGCCAGATGTGACATC CAGATGACTCAG TCTCCAGCCTCCCTATCTGCATCTGTGGGAGAAACTGTCACCATCACATGTCGAGCAAGTGAGAATATTTACAGTTAT TTAGCATGGTATCAGCAGAAACAGGGAAAATCTCCTCAGCTCCTGGTCTATAATGGAAAAACCTTAGCAGAAGGTGTG CCAGCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACACAGTTTTCTCTGAAGATCAACAGCCTACAGCCTGAAGATTTTGGG AGTTATTACTGTCAACATCATGATGGTATTCCGGTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA
Cadena ligera: Secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 120)
MSVPTQVLGLLLLWLTGARCDIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSYLAWYQQKQGKSPQLLVYNGKTLAEGV PARFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYCQHHDGIPVTFGAGTKLELK
AcM 2E2
Cadena pesada: Secuencia de ADN (SEQ ID NO: 121)
ATGAACTTGGGGCTCAGCTTGATTTTCCTTGTCCTTGTTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAAGTGAAGC
TGGTGGAGTCGGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGTAGCCTCTGG ATTCACTTTCAGTGACTATCACATGCATTGGGTTCGCCAGACTCCAGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTC GCATACATTAGTAAAGGTGGTGGTAGCACCTATTATCCAGACACTGAAAAGGGC CGAT TCACCAT CT CCAGAGACAATGC CAAGAATAC CCT GTAC CTGCAAAT GAGCC GTCTGAAGT CTGAGGACACAGCCAT GTATTACTGTGCAAGATCCCCCGGCCCTAGTAGCTTCTACTGGTACTTCGATGTCTGGGGCACAGGG ACCACGGTCACCGTCTCCTCA
C a d e n a p e s a d a : S e c u e n c i a d e a m i n o á c i d o s ( S E Q I D N O : 122 )
MNLGLSLIFLYLVLKGVQCEVKLVES GGGLVQPGGSLKLSCVAS GFT FSDYHMHWVRQ TPEKRL EWV AYISKGGGSTYYPDTEKGRFTISRDNAKNTLYLQMSRLKSEDTAMYYCARSPGPSSFYWYFDVWGTG TTVTVSS
C a d e n a l i g e r a : S e c u e n c i a d e A D N ( S E Q I D N O : 123 )
ATGAGTGTGCCCACTCAGGTCCTGGGGTTGCTGCTGCTGTGGCTTACAGGTGCCAGATGTGACATC C AGATGACTCAGTCTCCAGCCTCCCTATCTGCATCTGTGGGAGAAACTGTCACCATCACATGTCGAGC AAGTGAGAATATTTACAGTTATTTAGCATGGTATCAGCAGAAACAGGGAAAATCTCCTCAGCTCCTG GTCTATAATGCAAAAACCTTAGCAGAAGGTGTGCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACAC AGTTTTCTCTGAAGATCAACAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGGGAGTTATTACTGTCAACATCATTA TGGTATTCCGGTCACGGTCGGTGTAGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA
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MSVPTQVLGLLLLWLTGARCDIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSYLAWYQQKQGKSPQLL VYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYCQHHYGIPVTVGVGTKLELK EJEMPLO 4
CONSTRUCCIÓN DE LA LÍNEA CELULAR CHO QUE EXPRESA LA CADENA a DEL RECEPTOR DE LA IL-4 CANINA Y USO EN ENSAYOS DE BLOQUEO DE LIGANDO
Figure imgf000043_0001
abajo, a partir de 50 |jg/ml.
5. Se transfirieron 50 j l de cada Ac diluido a la placa de células y después se incubaron en hielo durante 30 min.
6. Las células se lavaron dos veces con tampón FACS.
7. Las células se resuspendieron en 100 j l de IL-4 canina biotinilada a 0,32 jg/m l en tampón FACS y se incubaron en hielo durante 30 min.
8. Las células se lavaron dos veces con tampón FACS.
9. Las células se respondieron en 100 j l de estreptavidina conjugada con R-ficoeritina (dilución 1:1000) en tampón FACS y se incubaron en hielo durante 30 min.
10. Las células se lavaron dos veces con tampón FACS.
11. Las células se llevaron hasta 300 j l en tampón FACS.
12. Se leyeron 10.000 células para cada muestra mediante BD Accuri-C6.
13. La lectura resultante se analizó mediante FlowJo para obtener la intensidad media fluorescente (IMF).
Una curva de respuesta a la dosis para la unión de la IL-4 canina al IL-4Ra canino expresado en la superficie de las células CHO se obtuvo utilizando el ensayo de unión CHO-cIL-4Ra basado en células (véase la figura 2A). A partir de esta curva se determinó una concentración eficaz semimáxima (CE50) de 25 nM. A continuación, se obtuvieron las curvas de respuesta a la dosis para la unión de CHO-cIL-4Ra mediante los anticuerpos monoclonales (AcM) de ratón anti-IL-4Ra canino: 11B6, 4d 8, 4H3, 2E2, 11H2 y 6C12 (véase la figura 2B). Las concentraciones eficaces semimáximas (CE50) para cada uno de los anticuerpos se proporcionan en la tabla 2 a continuación.
Figure imgf000044_0001
Los anticuerpos monoclonales (AcM) de ratón anti-IL-4Ra canino se analizaron a continuación para determinar su capacidad para bloquear la unión de la IL-4 canina al CHO-cIL-4Ra de base celular. Como se muestra en la figura 3A, los cinco AcM, 11B6, 4D8, 4H3, 2E2 y 11H2 mostraron una capacidad de bloqueo significativa. En un estudio complementario, se probó un sexto AcM (6C12) y se comparó con uno de los cinco AcM probados (11H2) en la figura 3A. Como se desprende de la figura 3B y la tabla 2, el AcM 6C12 tiene una concentración inhibidora semimáxima (CI50) significativamente más elevada que los AcM 11H2. Cuatro de los anticuerpos monoclonales anti-cIL-4Ra, 4D8, 2E2, 4D8 y 11H2 mostraron una capacidad de bloqueo superior, como se puede observar en las figuras 3A y 3B, así como en la tabla 2.
EJEMPLO 5
SECUENCIAS DE AMINOÁCIDOS DE LAS CDR DE RATÓN
CDR de anticuerpos monoclonales de ratón de la cadena a del receptor de la IL-4 canina:
CDR-1 de VL SEQ ID NO: 1A3 Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Phe Met Phe 47 1A9 Lys Ala Ser Gln Asn Val Arg Ser Ala Val Ala 48 1B12 Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Phe 49 10C12 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala 50 10F2 Lys Ser Ser Gln Asn Leu Leu Tyr Gly Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala 51 10E10 Lys Ala Ser Asp His Ile Asn Asn Trp Leu Ala 52 10G8 Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn Ser Ser Tyr Leu Tyr 53 11B6 Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Tyr 54 11D3 Lys Ala Ser Gln Asp Ile Lys Ser Tyr Leu Ser 55 11H2 Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr Leu Ala 129 6C12 Lys Ala Ser Gln Asp Val Ile Thr Thr Val Ala 130 4D8 Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr Leu Ala 129 4H3 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala 131 2E2 Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr Leu Ala 129 CDR-2 de VL SEQ ID NO:
1A3 Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser 56 1A9 Leu Ala Ser Asn Arg His Thr 57 1B12 Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser 58 10C12 Phe Ala Ser Thr Arg Glu Ser 59 10F2 Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 60 10E10 Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr 61 10G8 Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser 62 11B6 Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser 63 11D3 Arg Ala Asn Ile Leu Ile Asp 64 11H2 Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu 132 6C12 Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr 133 4D8 Asn Gly Lys Thr Leu Ala Glu 134 4H3 Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 60 2E2 Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu 132
CDR-3 de VL SEQ ID NO:
1A3 Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr 65 1A9 Leu Gln His Trp Asn Tyr Pro Phe Thr 66 1B12 Met Gln His Leu Glu Tyr Pro Phe Thr 67 10C12 Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Tyr Thr 68 10F2 Gln Gln Tyr Tyr Asp Tyr Pro Tyr Thr 69 10E10 His Gln Tyr Trp Ser Ile Pro Tyr Thr 70 10G8 His Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Tyr Thr 71 11B6 Gln Gln Tyr His Ser Tyr Pro Ala Thr 72 11D3 Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr Thr 73 11H2 Gln His Tyr Asp Gly Phe Pro Phe Thr 135 6C12 Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Trp Thr 136 4D8 Gln His His Asp Gly Ile Pro Val Thr 137 4H3 Lys Gln Ser Tyr Asn Leu Tyr Thr 138 2E2 Gln His His Tyr Gly Ile Pro Val Thr 139
CDR-1 de VH SEQ ID NO:
1A3 Asp Phe Gly Met His 74 1A9 Ser Ser Trp Met Asn 75 1B12 Asp Tyr Tyr Met Asn 76 10C12 Asp Tyr Glu Met His 77 10F2 Ser Tyr Gly Val Ser 78 10E10 Thr Tyr Asp Ile His 79 10G8 Asp Tyr Glu Met His 80 11B6 Ser Asp Tyr Trp Asn 81 11D3 Thr Tyr Gly Met Tyr 82 11H2 Asp Tyr Tyr Met Tyr 140 6C12 Thr Phe Gly Met Ser 141 4D8 Asp Tyr Tyr Met Tyr 140 4H3 Asn Tyr Trp Ile His 142 2E2 Asp Tyr His Met His 143
CDR-2 de VH SEQ ID NO: 1A3 Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Gly Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Arg Gly 83 1A9 Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Lys Tyr Asn Gly Lys Phe Lys Gly 84 1B12 Asp Ile Ile Pro Ser Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly 85 10C12 Ala Ile Asp Pro Glu Thr Cys Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly 86 10F2 Val Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr Tyr Phe His Ser Ala Leu Ile Ser 87 10E10 Trp Ile Tyr Pro Arg Asp Gly Arg Thr Thr Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Ala 88 10G8 Ala Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly 89 11B6 Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 90 11D3 Trp Ile Asn Thr Tyr Ser Gly Val Pro Thr Tyr Val Asp Asp Phe Lys Gly 91 11H2 Tyr Val Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ile Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys Gly 144 6C12 Trp Ile Ser Thr Tyr Ser Gly Val Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys Gly 145 4D8 Tyr Ile Ser Pro Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Ile Lys Gly 146 4H3 Arg Ile Asp Pro Asn Ser Gly Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Ser 147 2E2 Tyr Ile Ser Lys Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Glu Lys Gly 148 CDR-3 de VH SEQ ID NO: 1A3 Gly Asp Leu Tyr Tyr Gly Ser Ser Phe Asp Ala Tyr 92 1A9 Asp Asp Tyr Asp Trp Ala Ser 93 1B12 Gly Ile Ser Tyr Tyr Gly Asn Arg Tyr Tyr Phe Thr Met Asp Tyr 94 10C12 Ser Lys Leu Gly Arg Gly Trp Tyr Phe Asp Val 95 10F2 Gln Gly Thr Ile Tyr Asp Gly Tyr Tyr Asn Tyr Ala Met Asp Tyr 96 10E10 Ser Ser Pro Phe Gly Tyr 97 10G8 Gly Phe Asp Tyr 98 11B6 Tyr Gly Gly Leu Arg Gln Gly Ser Trp His Phe Asp Val 99 11D3 Ala Gly Trp Phe Ala Tyr 100 11H2 His Gly Ser Pro Phe Gly Ser Ser Arg Gly Ala Trp Phe Ala Tyr 149 6C12 His Thr Phe Gln Ser Arg Gly Leu Ala Tyr 150 4D8 His Gly Ser Pro Tyr Gly Ser Ser Arg Gly Ala Trp Phe Ala Tyr 151 4H3 Phe Gly Ser Thr Tyr Gly Phe Ala Tyr 152 2E2 Ser Pro Gly Pro Ser Ser Phe Tyr Trp Tyr Phe Asp Val 153
TABLA
Figure imgf000046_0001
EJEMPLO 6
MAPEO DE EPÍTOPOS DE ANTICUERPOS MURINOS ANTIRRECEPTOR a DE LA IL-4 CANINA
La interacción de los anticuerpos con sus antígenos proteicos afines está mediada por la unión de aminoácidos específicos de los anticuerpos (parátopos) con aminoácidos específicos (epítopos) de los antígenos diana. Un epítopo es un determinante antigénico que provoca una reacción específica de una inmunoglobulina. Un epítopo consiste en un grupo de aminoácidos en la superficie del antígeno. Una proteína de interés puede contener varios epítopos que son reconocidos por diferentes anticuerpos. Los epítopos reconocidos por los anticuerpos se clasifican como epítopos lineales o conformacionales. Los epítopos lineales están formados por un tramo de una secuencia continua de aminoácidos en una proteína, mientras que los epítopos conformacionales están compuestos de aminoácidos que son discontinuos (por ejemplo, muy separados) en la secuencia de aminoácidos primaria, pero se juntan en el plegamiento proteico tridimensional.
El mapeo de epítopos se refiere al proceso de identificación de las secuencias de aminoácidos (es decir,, epítopos) que son reconocidos por anticuerpos en sus antígenos diana. La identificación de epítopos reconocidos por los anticuerpos monoclonales (AcM) en antígenos diana tiene aplicaciones importantes. Por ejemplo, puede ayudar en el desarrollo de nuevas terapias, diagnósticos y vacunas. El mapeo de epítopos también puede ayudar en la selección de AcM terapéuticos optimizados y ayudar a dilucidar sus mecanismos de acción. La información sobre el epítopo del receptor a de la IL-4 también puede dilucidar epítopos únicos y definir los efectos protectores o patógenos de las vacunas. La identificación del epítopo también puede conducir al desarrollo de vacunas de subunidades basadas en el acoplamiento químico o genético del epítopo del péptido identificado a una proteína transportadora u otros agentes inmunoestimulantes.
El mapeo de epítopos se puede llevar a cabo utilizando anticuerpos policlonales o monoclonales y se emplean varios métodos para la identificación de epítopos dependiendo de la naturaleza sospechosa del epítopo (es decir, lineal frente a conformacional). El mapeo de epítopos lineales es más sencillo y relativamente más fácil de realizar. Para este propósito, los servicios comerciales para el mapeo de epítopos lineales a menudo emplean el escaneo de péptidos. En este caso, un conjunto superpuesto de secuencias peptídicas cortas de la proteína diana se sintetiza químicamente y se prueba su capacidad para unirse a los anticuerpos de interés. La estrategia es rápida, de alto rendimiento y relativamente económica de realizar. Por otro lado, el mapeo de un epítopo discontinuo es más difícil desde el punto de vista técnico y requiere técnicas más especializadas, tales como la coradiocristalografía de un anticuerpo monoclonal junto con su proteína diana, el intercambio de hidrógeno y deuterio (H/D), la espectrometría de masas junto con la digestión enzimática, así como varios otros métodos conocidos por los expertos en la materia.
Mapeo de epítopos a del receptor a de la IL-4 canina mediante espectroscopia de masas:
Se empleó un método basado en la reticulación química y la detección por espectrometría de masas para identificar los epítopos reconocidos por los anticuerpos antirreceptor a de la IL-4 canina [CovalX Instrument Incorporated]. La aplicación de esta tecnología al mapeo de epítopos de la cadena a del receptor de la IL-4 canina dio como resultado la identificación de epítopos reconocidos por los AcM enumerados en la tabla 4.
Los resultados del mapeo de epítopos del receptor a de la IL-4 canina con los seis anticuerpos incluidos en la tabla 4, indica que los AcM reconocen epítopos peptídicos específicos que están presentes dentro del dominio extracelular del receptor a de la IL-4 canina. De manera notable, se identificaron de dos a tres epítopos para cada uno de los seis anticuerpos monoclonales (AcM) analizados. Cabe destacar que, se encontró que uno de los epítopos identificados para los AcM 2E2 tenía exactamente la misma secuencia de aminoácidos que para los AcM 11B6 (es decir, el SEQ ID NO: 158). Como se representa en la tabla 4 a continuación, los AcM: 4D8, 11H2 y 11B6 reconocen un epítopo, marcado con un "1" que es una porción de la misma secuencia lineal de aminoácidos; los AcM: 11H2, 4H3 y 2E2 reconocen un epítopo marcado con un "2" que es una porción de otra secuencia lineal de aminoácidos; y los AcM 4H3 y 2H2 reconocen un epítopo marcado con un "3" que es una porción de una tercera secuencia lineal de aminoácidos. Esta relativa coherencia en la identificación de los epítopos relevantes indica que estos seis anticuerpos monoclonales reconocen un número limitado de porciones del receptor a de la IL-4 canina dentro de su dominio extracelular.
TABLA 4
Figure imgf000047_0001
Junto con las CDR proporcionadas en el ejemplo 5 para los seis anticuerpos enumerados en la tabla 4 anterior, se define uno a uno una relación entre cada conjunto de CDR y sus epítopos correspondientes en la tabla 4. Esta relación permite un enlace definido entre el conjunto de 6 CDR del ejemplo 5 para cada uno de los seis anticuerpos de la tabla 4 y los epítopos correspondientes a los que se unen. En consecuencia, los anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos caninizados) con el conjunto definido de 6 CDR proporcionados en el ejemplo 5 que se unen a los epítopos correspondientes en la tabla 4 también son parte de la presente invención.
EJEMPLO 7
CONSTRUCCIÓN DE ANTICUERPOS MONOCLONALES CANINIZADOS ANTIRRECEPTOR a DE LA IL-4 CANINA
Para ejecutar el proceso de caninización, se determinó la secuencia de ADN que codifica las cadenas pesada y ligera de IgG canina. La secuencia de ADN y proteína de las cadenas ligera y pesada canina se conocen en la materia y se pueden obtener buscando en las bases de datos de genes y proteínas de NCBI. Como se ha indicado anteriormente, para los anticuerpos caninos hay cuatro subtipos de IgG conocidos: IgG-A, IgG-B, IgG-C e IgG-D, y dos tipos de cadenas ligeras, es decir, k y A. Sin quedar ligados a ninguna estrategia específica, el proceso general de producción de cadenas ligeras y pesadas caninizadas que se pueden mezclar en diferentes combinaciones para producir AcM caninizados antirreceptor a de la IL-4 canina implica el siguiente esquema:
i) Identificar la secuencia de ADN de los dominios VH y VL que comprenden las CDR de los AcM antirreceptor a de la IL-4 deseados
ii) Identificar las CDR de las cadenas H y L de los AcM antirreceptor de la IL-4 deseados
iii) Identificar una secuencia adecuada para la cadena H y L de la IgG canina
iv) Identificar la secuencia de ADN que codifica las CDR endógenas de las cadenas H y L de la IgG canina de la secuencia anterior.
v) Reemplazar la secuencia de ADN que codifica las CDR endógenas de las cadenas H y L caninas por secuencias de ADN que codifican las CDR del antirreceptor a de la IL-4 deseado. De manera adicional, opcionalmente se reemplazan algunos restos de marco canino con restos seleccionados de las regiones marco del AcM antirreceptor de la IL-4 deseado.
vi) Sintetizar el ADN de la etapa (v), clonarlo en un plásmido de expresión adecuado y transfectar los plásmidos que contienen las cadenas H y L caninizadas deseadas en células HEK 293.
vii) Purificar el anticuerpo caninizado expresado del sobrenadante de HEK 293.
viii) Analizar el anticuerpo caninizado purificado para determinar si se une a la cadena a del receptor de la IL-4 canina.
La aplicación de las etapas descritas anteriormente dio como resultado un conjunto de secuencias de cadenas H y L caninizadas para las que las SEQ ID NO. se enumeran en la tabla 5 a continuación.
TABLA 5
Figure imgf000048_0001
La presente invención proporciona anticuerpos caninizados formados mediante la combinación de varias cadenas pesadas y ligeras caninizadas enumeradas en la tabla 5 anterior; dichos anticuerpos tienen una unión particularmente estrecha con el receptor a de la IL-4 canina. En una realización particular, la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 164 y la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 170. En una realización más particular de este tipo, la cadena pesada está codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 163 y la cadena ligera está codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 169. En otra realización, la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 166 y la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 172. En una realización más particular de este tipo, la cadena pesada está codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 165 y la cadena ligera está codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 171. En aún otra realización, la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 168 y la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 174. En una realización más particular de este tipo, la cadena pesada está codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 167 y la cadena ligera está codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 173. Estudios de unión al receptor a de la IL-4 mediante estos anticuerpos caninizados se muestran en la Figura 4, como se describe en el ejemplo 8, a continuación.
Como se ha indicado anteriormente, la porción Fc de los anticuerpos caninizados se basa en secuencias modificadas de IgG-B canina para eliminar las funciones efectoras de ADCC y CDC. Las regiones Fc de estos anticuerpos pueden reemplazarse con un Fc modificado de otros isotipos de IgG canina y/o se pueden combinar con regiones de bisagra sustitutas como se mostró anteriormente, y se ejemplifica y describe en la solicitud provisional de EE.UU. 62/030.812 presentada el 30 de julio de 2014; en la solicitud provisional de EE.UU. 62/057.541, presentada el martes, 30 de septiembre de 2014; en la solicitud provisional de EE.UU. 62/092.496, presentada el martes, 16 de diciembre de 2014; en la solicitud provisional de EE.Uu . 62/172.511, presentada el lunes, 8 de junio de 2015; y el documento WO 2015/091910.
H3 CANINIZADO (vH1)
SEQ ID NO: 163
GAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGAGGCGACC.TGGTGAAACCCGGAGGC.AGCCTGAGACTGAGC.TGTGTGGCCAGC.GGC.T ACACCTTCACCAACTACTGGATTCATTGGGTGAGGCAGGCTCCCGGCAAAGGACTGCAGTGGGTGGCCAGGATTGATCC CAACAGCGGCGGCACCAAGTACAACGAGAAGTTCAAGAGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACGCCAAGAACACCCTC TACCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCACCAGGTTCGGCAGCACCTACGGCTTCG CCTACTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCTTCCACAACCGCGCCATCAGTCTTTCCGTTGGCCCCATC ATGCGGGTCGACGAGCGGATCGACTGTGGCCCTGGCGTGCTTGGTGTCGGGATACTTTCCCGAACCCGTCACGGTCAGC TGGAACTCCGGATCGCTTACGAGCGGTGTGCATACGTTCCCCTCGGTCTTGCAATCATCAGGGCTCTACTCGCTGTCGA GCATGGTAACGGTGCCCTCATCGAGGTGGCCCTCCGAAACGTTCACATGTAACGTAGCACATCCAGCCTCCAAAACCAA GGTGGATAAACCCGTGCCGAAAAGAGAGAATGGGCGGGTGCCTCGACCCCCTGATTGCCCCAAGTGTCCGGCTCCGGAA ATGCTCGGTGGACCCTCAGTGTTTATCTTCCCTCCGAAGCCCAAGGACACTCTGCTGATCGCGCGCACTCCAGAAGTAA CATGTGTAGTGGTGGCACTTGATCCCGAGGACCCCGAAGTCCAGATCTCCTGGTTTGTAGATGGGAAACAGATGCAGAC CGCAAAAACTCAACCCAGAGAGGAGCAGTTCGCAGGAACATACCGAGTGGTATCCGTCCTTCCGATTGGCCACCAGGAC TGGTTGAAAGGGAAGCAGTTTACGTGTAAAGTCAACAATAAGGCGTTGCCTAGCCCTATTGAGCGGACGATTTCGAAAG CTAGGGGACAGGCCCACCAGCCATCGGTCTATGTCCTTCCGCCTTCCCGCGAGGAGCTCTCGAAGAATACAGTGAGCCT TACATGCCTCATTAAGGATTTCTTCCCGCCTGATATCGACGTAGAGTGGCAATCAAACGGTCAACAGGAGCCGGAATCC AAGTATAGAACCACTCCGCCCCAGCTTGACGAGGACGGATCATACTTTTTGTATTCAAAACTGTCGGTGGATAAGAGCC GGTGGCAGAGAGGTGACACCTTCATCTGTGCGGTGATGCACGAAGCACTCCATAATCACTACACCCAAGAGAGCCTCTC GCATTCCCCCGGAAAG
SEQ ID NO: 164
EVQLVESGGDLVKPGGSLRLSCVASGYTFTNYWIHWVRQAPGKGLQWVARIDPNSGGTKYNEKFKSRFTISRDNAKNTL YLQMNSLRAEDTAVYYCTRFGSTYGFAYWGQGTLVTVSSASTTAPSVFPLAPSCGSTSGSTVALACLVSGYFPEPVTVS WNSGSLTSGVHTFPSVLQSSGLYSLSSMVTVPSSRWPSETFTCNVAHPASKTKVDKPVPKRENGRVPRPPDCPKCPAPE MLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVWALDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFAGTYRWSVLPIGHQD WLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPES KYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPGK
H3 CANINIZADO (vH2)
SEQ ID NO: 165
G A G G T G G A G G T G G T G G A G A G G G G n G G A G A T G T G G T G A A G G n n G G G G G A A G G G T G A G A G T G A G G T G T G T G G G r A G G G G G T ACACCTTCACCAACTACTGGATTCATTGGGTGAGACAGGCCCCTGGCAAGGGCCTGCAGTGGATCGGCAGGATCGACCC CAACAGCGGCG GCACCAAGTACAACGAGAAGTTCAAGAGCAAGGCCACCCT GAGCGTGGACAAGGCCAAGAACACCCTG TACCTGCAGATGAACTCCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCGCCTTTGGCAGCACCTACGGCTTCG CCTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCTTCCACAACCGCGCCATCAGTCTTTCCGTTGGCCCCATC ATGCGGGTCGACGAGCGGATCGACTGTGGCCCTGGCGTGCTTGGTGTCGGGATACTTTCCCGAACCCGTCACGGTCAGC
TGGAACTCCGGATCGCTTACGAGCGGTGTGCATACGTTCCCCTCGGTCTTGCAATCATCAGGGCTCTACTCGCTGTCGA GCATGGTAACGGTGCCCTCATCGAGGTGGCCCTCCGAAACGTTCACATGTAACGTAGCACATCCAGCCTCCAAAACCAA GGTGGATAAACCCGTGCCGAAAAGAGAGAATGGGCGGGTGCCTCGACCCCCTGATTGCCCCAAGTGTCCGGCTCCGGAA ATGCTCGGTGGACCCTCAGTGTTTATCTTCCCTCCGAAGCCCAAGGACACTCTGCTGATCGCGCGCACTCCAGAAGTAA CATGTGTAGTGGTGGCACTTGATCCCGAGGACCCCGAAGTCCAGATCTCCTGGTTTGTAGATGGGAAACAGATGCAGAC CGCAAAAACTCAACCCAGAGAGGAGCAGTTCGCAGGAACATACCGAGTGGTATCCGTCCTTCCGATTGGCCACCAGGAC TGGTTGAAAGGGAAGCAGTTTACGTGTAAAGTCAACAATAAGGCGTTGCCTAGCCCTATTGAGCGGACGATTTCGAAAG CTAGGGGACAGGCCCACCAGCCATCGGTCTATGTCCTTCCGCCTTCCCGCGAGGAGCTCTCGAAGAATACAGTGAGCCT TACATGCCTCATTAAGGATTTCTTCCCGCCTGATATCGACGTAGAGTGGCAATCAAACGGTCAACAGGAGCCGGAATCC AAGTATAGAACCACTCCGCCCCAGCTTGACGAGGACGGATCATACTTTTTGTATTCAAAACTGTCGGTGGATAAGAGCC GGTGGCAGAGAGGTGACACCTTCATCTGTGCGGTGATGCACGAAGCACTCCATAATCACTACACCCAAGAGAGCCTCTC GCATTCCCCCGGAAAG
SEQ ID NO: 166
EVQLVESGGDLVKPGGSLRLSCVASGYTFTNYWIHWVRQAPGKGLQWIGRIDPNSGGTKYNEKFKSKATLSVDKAKNTL YLQMNSLRAEDTAVYYCAAFGSTYGFAYWGQGTLVTVSSASTTAPSVFPLAPSCGSTSGSTVALACLVSGYFPEPVTVS WNSGSLTSGVHTFPSVLQSSGLYSLSSMVTVPSSRWPSETFTCNVAHPASKTKVDKPVPKRENGRVPRPPDCPKCPAPE MLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVWALDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFAGTYRWSVLPIGHQD WLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPES KYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPGK
H3 CANINIZADO (vH3):
SEQ ID NO: 167
GAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGCGGCGATCTGGTGAAGCCTGGCGGAAGCCTGAGACTGAGCTGCGTGGCCAGCGGCT ACACCTTCACCAACTACTGGATTCATTGGATGAGGCAGGCCCCTGGCAAGGGACTGCAGTGGATCGGCAGAATCGACCC CAACAG C G G C G G CAC CAAGTACAAC GAGAAG T T CAAGAG CAAG G C CAC C C T GAG C GT G GACAAG G C CAAGAACAC C G C C TACATGCAGCTGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCGCCTTTGGCAGCACCTACGGCTTCG CCTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCTTCCACAACCGCGCCATCAGTCTTTCCGTTGGCCCCATC ATGCGGGTCGACGAGCGGATCGACTGTGGCCCTGGCGTGCTTGGTGTCGGGATACTTTCCCGAACCCGTCACGGTCAGC TGGAACTCCGGATCGCTTACGAGCGGTGTGCATACGTTCCCCTCGGTCTTGCAATCATCAGGGCTCTACTCGCTGTCGA GCATGGTAACGGTGCCCTCATCGAGGTGGCCCTCCGAAACGTTCACATGTAACGTAGCACATCCAGCCTCCAAAACCAA GGTGGATAAACCCGTGCCGAAAAGAGAGAATGGGCGGGTGCCTCGACCCCCTGATTGCCCCAAGTGTCCGGCTCCGGAA ATGCTCGGTGGACCCTCAGTGTTTATCTTCCCTCCGAAGCCCAAGGACACTCTGCTGATCGCGCGCACTCCAGAAGTAA CATGTGTAGTGGTGGCACTTGATCCCGAGGACCCCGAAGTCCAGATCTCCTGGTTTGTAGATGGGAAACAGATGCAGAC CGCAAAAACTCAACCCAGAGAGGAGCAGTTCGCAGGAACATACCGAGTGGTATCCGTCCTTCCGATTGGCCACCAGGAC TGGTTGAAAGGGAAGCAGTTTACGTGTAAAGTCAACAATAAGGCGTTGCCTAGCCCTATTGAGCGGACGATTTCGAAAG CTAGGGGACAGGCCCACCAGCCATCGGTCTATGTCCTTCCGCCTTCCCGCGAGGAGCTCTCGAAGAATACAGTGAGCCT TACATGCCTCATTAAGGATTTCTTCCCGCCTGATATCGACGTAGAGTGGCAATCAAACGGTCAACAGGAGCCGGAATCC AAGTATAGAACCACTCCGCCCCAGCTTGACGAGGACGGATCATACTTTTTGTATTCAAAACTGTCGGTGGATAAGAGCC GGTGGCAGAGAGGTGACACCTTCATCTGTGCGGTGATGCACGAAGCACTCCATAATCACTACACCCAAGAGAGCCTCTC GCATTCCCCCGGAAAG
SEQ ID NO: 168
EVQLVESGGDLVKPGGSLRLSCVASGYTFTNYWIHWMRQAPGKGLQWIGRIDPNSGGTKYNEKFKSKATLSVDKAKNTA YMQLNSLRAEDTAVYYCAAFGSTYGFAYWGQGTLVTVSSASTTAPSVFPLAPSCGSTSGSTVALACLVSGYFPEPVTVS WNSGSLTSGVHTFPSVLQSSGLYSLSSMVTVPSSRWPSETFTCNVAHPASKTKVDKPVPKRENGRVPRPPDCPKCPAPE MLGGPSVFI FPPKPKDTLLIARTPEVTCVWALDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFAGTYRWSVLPIGHQD
WLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPES KYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPGK
H3 CANINIZADO (vL1)
SEQ ID NO: 169
GACATCGTGATGACCCAGACCCCTCTGAGCCTGTCCGTGAGCCCTGGCGAACCTGCCAGCATCAGCTGCAAGAGCAGCC AGAGCCTGCTGAACAG CAGGACCAGGAAGAACTACCTGGCCTGGTTCAGACAGAAG CCCGGCCAGAGCCCCCAGAGACT GATCTACTGGGCCAGCACCAGAGAGAGCGGCGTGCCTGACAGATTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACAGACTTCACCCTG AGGATCAGCAGAGTGGAGGCCGACGATGCCGGCGTGTACTACTGCAAGCAGAGCTACAACCTGTACACCTTCGGCCAGG GCACCAAGGTGGAGATCAAGAGGAACGACGCTCAGCCAGCCGTGTACCTCTTCCAGCCTTCGCCGGACCAGCTTCATAC GGGGTCAGCGTCGGTGGTGTGCCTGTTGAACTCGTTTTACCCCAAGGACATTAACGTGAAGTGGAAGGTAGACGGGGTA ATTCAAGACACTGGCATTCAAGAGTCCGTCACGGAACAAGACTCAAAAGACTCAACGTATTCACTGTCGTCAACCTTGA CGATGTCAAGCACCGAGTATCTTAGCCATGAGCTGTATTCGTGCGAGATCACCCACAAGTCCCTCCCCTCCACTCTTAT CAAATCCTTTCAGCGGTCGGAATGTCAGCGGGTCGAT
SEQ ID NO: 170
DIVMTQT PLSLSVSPGEPASISCKSSQSLLNSRTRKNYLAWFRQKPGQS PQRLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTL RISRVEADDAGVYYCKQS YNLYTFGQGTKVEI KRNDAQPAVYLFQPSPDQLHTGSASWCLLNS FYPKDINVKWKVDGV IQDTGIQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTMSSTEYLSHELYSCEITHKSLPSTLIKSFQRSECQRVD
4H3 CANINIZADO (vL2)
SEQ ID NO: 171 GACATCGTGATGACCCAGACCCCTCTGAGCCTGAGCGTGAGCCCTGGAGAGCCTGCCAGCATCAGCTGCAAGAGCAGCC AGAGCCTGCTGAACAGCAGGACCAGGAAGAACTACCTGGCCTGGTACAGGCAGAAGCCTGGCCAGAGCCCCCAGCTGCT GATCTACTGGGCCAGCACCAGAGAGAGCGGAGTGCCTGACAGGTTCAGCGGAAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTG AGGATCAGCAGAGTGGAGGCCGATGACGCCGGCGTGTACTACTGCAAGCAGAGCTACAACCTGTACACCTTCGGCCAGG GCACCAAGGTGGAGATCAAGAGGAACGACGCTCAGCCAGCCGTGTACCTCTTCCAGCCTTCGCCGGACCAGCTTCATAC GGGGTCAGCGTCGGTGGTGTGCCTGTTGAACTCGTTTTACCCCAAGGACATTAACGTGAAGTGGAAGGTAGACGGGGTA ATTCAAGACACTGGCATTCAAGAGTCCGTCACGGAACAAGACTCAAAAGACTCAACGTATTCACTGTCGTCAACCTTGA CGATGTCAAGCACCGAGTATCTTAGCCATGAGCTGTATTCGTGCGAGATCACCCACAAGTCCCTCCCCTCCACTCTTAT CAAATCCTTTCAGCGGTCGGAATGTCAGCGGGTCGAT SEQ ID NO: 172
DIVMTQTPLSLSVS PGEPASISCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYRQKPGQSPQLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTL RISRVEADDAGVYYCKQS YNLYTFGQGTKVEI KRNDAQPAVYLFQPS PDQLHTGSASWCLLNS FYPKDINVKWKVDGV IQDTGIQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTMSSTEYLSHELYSCEITHKSLPSTLIKSFQRSECQRVD
4H3 CANINIZADO (vL3)
SEQ ID NO: 173 GACATCGTGATGACCCAGACCCCTCTGAGCCTGAGCGTGAGCCCTGGAGAGCCTGCCAGCATCAGCTGCAAGAGCAGCC AGAGCCTGCTGAACAGCAGGACCAGGAAGAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCTGGCCAGAGCCCCCAGCTGCT GATCTACTGGGCCAGCACCAGAGAGAGCGGAGTGCCTGACAGGTTCAGCGGAAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTG AGGATCAGCAGAGTGGAGGCCGATGACGCCGGCGTGTACTACTGCAAGCAGAGCTACAACCTGTACACCTTCGGCCAGG GCACCAAGGTGGAGATCAAGAGGAACGACGCTCAGCCAGCCGTGTACCTCTTCCAGCCTTCGCCGGACCAGCTTCATAC GGGGTCAGCGTCGGTGGTGTGCCTGTTGAACTCGTTTTACCCCAAGGACATTAACGTGAAGTGGAAGGTAGACGGGGTA
ATTCAAGACACTGGCATTCAAGAGTCCGTCACGGAACAAGACTCAAAAGACTCAACGTATTCACTGTCGTCAACCTTGA CGATGTCAAGCACCGAGTATCTTAGCCATGAGCTGTATTCGTGCGAGATCACCCACAAGTCCCTCCCCTCCACTCTTAT CAAATCCTTTCAGCGGTCGGAATGTCAGCGGGTCGAT SEQ ID NO: 174 DIVMTQTPLSLSVSPGEPASISCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQSPQLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTL RISRVEADDAGVYYCKQSYNLYTFGQGTKVEIKRNDAQPAVYLFQPSPDQLHTGSASWCLLNSFYPKDINVKWKVDGV IQDTGIQESVTEQDSKDSTYSLS STLTMSSTEYLSHELYSCEITHKSLP STLIKSFQRSECQRVD EJEMPLO 8
REACTIVIDAD DE ANTICUERPOS CANINIZADOS CONTRA EL RECEPTOR a DE LA IL-4 CANINA
Se analizó la reactividad de los anticuerpos caninizados con el receptor a de la IL-4 canina como sigue:
1. Recubrir con 200 ng/pocillo de receptor a de la IL-4 una inmunoplaca e incubar la placa a 4 °C durante la noche.
2. Lavar la placa 3 veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contiene Tween 20 al 0,05 % (PBST).
3. Bloquear la placa con albúmina de suero bovino (BSA) al 0,5 % en PBS durante 45 a 60 min a temperatura ambiente.
4. Lavar la placa 3 veces con PBST.
5. Diluir tres veces el anticuerpo caninizado en cada columna o fila de la placa de dilución a partir de 0,3 |jg/ml.
6. Transferir el anticuerpo caninizado diluido a cada columna o fila de la inmunoplaca e incubar la placa durante 45 a 60 min a temperatura ambiente.
7. Lavar la placa 3 veces con PBST.
8. Añadir Fc anti-IgG canina marcado con peroxidasa de rábano picante diluido 1:4000 en cada pocillo de la placa

Claims (7)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo caninizado aislado o un fragmento de unión a antígeno caninizado que se unen al receptor a de la interleucina 4 canina (IL-4Ra) con una especificidad que comprende tres regiones determinantes de la complementariedad (Cd R) de la cadena ligera: una CDR ligera 1 (c Dr L1), una CDR ligera 2 (CDRL2) y una CDR ligera 3 (CDRL3); y tres c Dr de la cadena pesada: una CDR pesada 1 (CDRH1), una CDR pesada 2 (CDRH2) y una CDR pesada 3 (CDRH3);
(a) en donde la CDRL1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 131;
(b) en donde la CDRL2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 60;
(c) en donde la CDRL3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 138;
(d) en donde la CDRH1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 142;
(e) en donde la CDRH2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 147;
(f) en donde la CDRH3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 152; y
en donde el anticuerpo y el fragmento de unión a antígeno del mismo se unen al IL-4Ra canino y bloquean la unión del IL-4Ra canino a la interleucina 4 canina, en donde el anticuerpo caninizado o el fragmento de unión a antígeno caninizado comprenden una combinación de cadena pesada y cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 164 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 170, una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 166 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 172, y una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 168 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 174.
2. El anticuerpo caninizado de la reivindicación 1 o el fragmento de unión a antígeno caninizado del mismo, que comprenden una región de bisagra que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en el SEQ ID NO: 101, el SEQ ID NO: 102, el SEQ ID NO: 103 y el SEQ ID NO: 104.
3. Un ácido nucleico aislado que codifica la cadena ligera y la cadena pesada del anticuerpo caninizado o del fragmento de unión a antígeno del mismo de las reivindicaciones 1 o 2.
4. Un vector de expresión que comprende el ácido nucleico aislado de la reivindicación 3.
5. Una célula hospedadora que comprende el vector de expresión de la reivindicación 4.
6. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo caninizado de las reivindicaciones 1 o 2, o el ácido nucleico de la reivindicación 3, el vector de expresión de la reivindicación 4, o cualquier combinación de los mismos, y un vehículo o un diluyente farmacéuticamente aceptables.
7. La composición farmacéutica de la reivindicación 6 para su uso en un método para disminuir la actividad de una célula inmunitaria, que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición farmacéutica de la reivindicación 6, en donde dicho método se utiliza para:
(i) el tratamiento de la dermatitis atópica; o
(ii) el tratamiento del asma; o
(iii) el tratamiento de la dermatitis atópica y el tratamiento del asma.
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