ES2307009T3

ES2307009T3 - Composicion farmaceutica que contiene proteinas y/o polipeptidos y particulas coloidales.

Info

Publication number: ES2307009T3
Application number: ES04727664T
Authority: ES
Inventors: Moshe Baru; Lea Carmel-Goren
Original assignee: Opperbas Holding BV
Current assignee: Opperbas Holding BV
Priority date: 2003-04-15
Filing date: 2004-04-15
Publication date: 2008-11-16
Anticipated expiration: 2024-04-15
Also published as: EP1633440A1; WO2004091723A1; AU2004229253A1; MXPA05010926A; DK1633440T3; DE602004013769D1; BRPI0409424B8; BRPI0409424A; PL1633440T3; JP2006523683A; ATE395101T1; CA2522179A1; CN1774281B; BRPI0409424B1; PT1633440E; US20070167359A1; EP1633440B1; CN1774281A; CA2522179C; AU2004229253B2

Abstract

Una composición farmacéutica para la administración parenteral que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína o polipéptido unido de manera no covalente a una partícula coloidal, comprendiendo dicha partícula aproximadamente 1 - 20 por ciento en moles de un lípido anfipático derivatizado con un polímero hidrófilo biocompatible, en la que dicha proteína o polipéptido se selecciona entre el grupo constituido por: (a) Factor VIIa, factor estimulador de la colonia de granulocitos (G-CSF), factor estimulador de la colonia de macrófagos de granulocitos (GM-CSF), Interferón gamma, péptido 1 de tipo glucagón (GLP-1) y Copaxone; y b) proteínas o polipéptidos que incluyen una secuencia de consenso de serina/treonina-X-leucina/isoleucina/valina-isoleucina/valina/glutamina/serina-serina/treonina-X- X-ácido glutámico, donde X puede ser un aminoácido; en la que dicha proteína o polipéptido no es Factor VIII (FVIII), y en la que dicha proteína o polipéptido no está encapsulada en dichas partículas coloidales.

Description

Composición farmacéutica que contiene proteínas y/o polipéptidos y partículas coloidales.

Antecedentes de la invención

La Hemofilia A es uno de los trastornos de coagulación hereditarios que más frecuentemente se producen. Los pacientes con hemofilia A son propensos a frecuentes hemorragias como resultado de una o más disfunciones del sistema de coagulación. Una de las causas de hemofilia es una falta del Factor VIII (FVIII) en la sangre. Este problema se puede tratar con concentrados de Factor VIII. Sin embargo, en aproximadamente el 15% de los pacientes, se produce la aparición de anticuerpos que neutralizan el Factor VIII, llamados inhibidores, por lo que una terapia con concentrados del Factor VIII es escasamente posible.

Se han descrito dos planteamientos en la bibliografía para proteger el FVIII de la inactivación por los inhibidores.

El documento WO/80/01456 de Hemker describe una composición farmacéutica adecuada para la administración oral que comprende FVIII incorporado con liposomas de 0,5 - 1,0 micrómetros formados a partir de fosfolípidos. Los fosfolípidos tienen una carga neta, y el FVIII se incorpora entre las capas del liposoma. Se reivindica que los niveles del FVIII en el plasma permanecían por encima de aproximadamente 5% del valor normal durante un período de 50 horas.

El documento US 4.348.384 de Horikoshi establece que una composición como se describe en Hemker se preparó, pero no proporcionó resultados satisfactorios. Por lo tanto, Horikoshi incorpora un inhibidor de proteasa en el liposoma junto con FVIII, con el fin de protegerlo de la proteolisis. El 3% de los niveles en plasma normales de FVIII se obtuvieron durante un período de 6 horas.

El documento US 5.013.556 de Woodle describe una composición de liposomas para uso en la administración de diversos fármacos por medio del torrente sanguíneo. El liposoma contiene entre 1 - 20 moles por ciento de un lípido anfipático derivatizado con un polialquiléter. Aquí también, el compuesto fármaco está atrapado dentro del liposoma. Estas composiciones de liposomas están disponibles comercialmente bajo el nombre de vesículas Stealth® (SUV's, pequeñas vesículas unilamelares que contienen fosfolípido y polietilenglicol (PEG) unido de manera covalente a fosfolípido).

Un problema adicional con este planteamiento es que los liposomas que tienen un gran diámetro tienen una corta semivida. Por lo tanto, los liposomas se deben reducir de tamaño bajo alta presión, que puede afectar a las actividades de las proteínas como en los factores V y VIII. de coagulación.

En un segundo planteamiento, Barrowcliffe, T.W., et al. (1983) J. Lab. Clin. Med. 101: 34 - 43 enseña que la mezcla de FVIII con el fosfolípido extraído de cerebro humano y/o animal imparte una protección significativa al FVIIII in vitro. En este planteamiento el fosfolípido está unido al FIII mejor que encapsulado. Kemball-Cook, G. y Barrowcliffe, T.W. (1992) Thromb. Res. 67: 57-71, enseña que una superficie de fosfolípido cargado negativamente es necesario para la unión a FIII. La fosfatidil serina cargada negativamente y ácido fosfatídico se encontraron que era altamente active en la unión al FVIII, mientras que la fosfatidilcolina estaba inactiva. Sin embargo, los fosfolípidos cargados negativamente son tóxicos, y los derivados de tejido cerebral puede llevar agentes patógenos.

El documento EP 689.428 describe una composición de liposomas que comprende los liposomas que tienen una capa de superficie exterior de cadenas de polímeros hidrófilos. Una molécula efectora de polipéptido o polisacárido está unida de manera covalente a los extremos distales de las cadenas de polímero mediante la activación del anclaje de lípido antes del acoplamiento del efector.

Sumario de la invención

Un objeto de la presente invención es proporcionar una composición farmacéutica que comprende una proteína o polipéptido para tratamiento terapéutico.

Un objeto adicional de la presente invención es proporcionar una proteína o polipéptido en una forma que tiene una semivida prolongada en el torrente circulatorio.

En un aspecto de la invención, se proporciona una composición farmacéutica para la administración parenteral que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína o polipéptido y partículas coloidales, dichas partículas que comprenden aproximadamente 1 - 20 por ciento en moles de un lípido anfipático derivatizado con un polímero hidrófilo biocompatible, en el que dicha proteína o polipéptido se selecciona entre el grupo constituido por (a) proteínas o polipéptidos capaces de unirse externamente a dichas partículas coloidales; (b) proteínas o polipéptidos capaces de unirse a polímeros de las familias polialquiléter, ácido poliláctico y poliglicólico; y (c) proteínas o polipéptidos que incluyen una secuencia de consenso de B/T-X- LJIfV-I/V/Q/S-S/T-X-X-E, donde X puede ser cualquier aminoácido, y S, T, L, I, V, E y Q tienen sus medios convencionales. La proteína o polipéptido no está encapsulado en dichas partículas coloidales.

En una realización preferida, las partículas coloidales son sustancialmente neutras y el polímero no lleva sustancialmente ninguna carga. En la presente memoria descriptiva, los términos "sustancialmente neutra" y "sustancialmente sin carga neta" significan ni positiva ni negativamente cargada. Sin embargo, una carga medida muy baja con error experimental de cero se incluye dentro del significado de los términos anteriores.

La presente invención se basa en el hallazgo sorprendente e inesperado de que los liposomas que contienen lípidos anfipáticos derivatizados con un polímero hidrófilo biocompatible se puede usar para unir proteínas o polipéptidos, potencian sus parámetros farmacocinéticas (semivida y área bajo la curva) y les protege de los inhibidores en el torrente sanguíneo. Esto proporciona una ventaja significativa sobre las composiciones de la técnica anterior, ya que los lípidos anfipáticos usados son sintéticos y no tóxicos, y se pueden por lo tanto usar in vivo para tratamiento terapéutico. Además, el liposoma no encapsula las proteínas o polipéptidos de manera que los liposomas de tamaño más pequeño se pueden usar para que tengan una semivida más larga in vivo, ya que no se eliminan por el sistema del retículo endotelial (RES) y la actividad de las proteínas o polipéptidos formulados no se altera (actividad completa encontrada in vivo e inmediatamente después de la inyección in vivo). Como se describirá más adelante en mayor detalle, las proteínas o polipéptidos interactúan de manera no covalente con las cadenas de polímero sobre la superficie externa de los liposomas, y no se lleva a cabo ninguna reacción química para activar las cadenas de polímero, a diferencia de la composición descrita en el documento EP 689.428.

El término "proteínas o polipéptidos capaces de unirse externamente a dichas partículas coloidales" incluyen proteínas tales como el factor VIIa (FVIIa), factor V (FV), factor IX (FIX) y factor X (FX) de coagulación, factor estimulante de la colonia de granulocitos (G-CSF), factor estimulante de la colonia de macrófagos de granulocitos (GM-CSF), Interferón \gamma y Péptido 1 de tipo Glucagón (GLP-1), Interferón- \gamma y Péptido 1 de tipo Glucagón (GLP-1), y un copolímero (Copaxone, Teva, Israel) compuesto de repeticiones de 4 aminoácidos (L-ala, L-glu, L-lys y L-tyr). La identidad de estas proteínas se puede determinar de manera empírica como conocen los expertos en la técnica.

La composición farmacéutica de la invención se puede usar para tratar diversas enfermedades, como conocen los expertos en la técnica. Por ejemplo, una composición que comprende Copaxone se puede usar para proteger las células del sistema nervioso central de la toxicidad de glutamato y para tratar lesión o enfermedad provocada o exacerbada por la toxicidad de glutamato. La composición también se puede usar para tratar esclerosis múltiple, neuropatía diabética, demencia senil, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, parálisis del nervio facial (De Bell), glaucoma, corea de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica, estado epiléptico, neuropatía óptica no arterítica, o deficiencia de vitaminas, como se describe en la Solicitud de Patente de estados unidos Nº 20020037848.

El término "proteínas o polipéptidos capaz de unirse a polímeros de las familias de polialquiléter, ácido poliláctico y poliglicólico" incluye proteínas y polipéptidos que se unen a polímeros de las familias de polialquiléter, ácido poliláctico y poliglicólico o sus derivados mediante cualquier mecanismo no covalente, tales como interacciones iónicas, interacciones hidrófobas enlaces de hidrógeno y atracciones de Van der Waals (Arakawa, T. y Timasheff, S.N. (1985) Biochemistry 24: 6756 - 6762; Lee, J.C. y Lee, L.L.Y (1981) J. Biol. Chem. 226: 625 - 631). Un ejemplo preferido de tal polímero es polietilen glicol. (PEG).

El término "cantidad terapéuticamente eficaz" se ha de entender como referencia a una cantidad de proteína o polipéptido que da como resultado un nivel de la proteína o polipéptido en el torrente sanguíneo que tiene un efecto terapéutico deseado. Tal cantidad se puede determinar experimentalmente mediante la administración de composiciones que comprenden diferentes cantidades de la proteína o polipéptido y midiendo el nivel en la sangre en diversos momentos después de la administración.

El lípido anfipático usado para preparar las partículas coloidales se pueden obtener a partir de fuentes o bien naturales o sintéticas. Los lípidos más preferidos incluyen fosfolípidos tales como fosfatidilcolina y fosfatidiletanolamina, y liposomas no cargados unidos a carbamato tal como aminopropanodiol diestearoil (DS). El propósito del polímero hidrófilo biocompatible es esterificar de manera estable los SUV, de este modo previniendo la fusión de las vesículas in vitro, y permitiendo que las vesículas se escapen de la adsorción mediante el RES in vivo. El polímero tendrá preferiblemente un peso molecular de entre aproximadamente 500 y aproximadamente 5000 daltons, lo más preferiblemente aproximadamente 2000 daltons.

Las partículas coloidales preferiblemente tendrán un diámetro medio de partícula de entre aproximadamente 0,03 y aproximadamente 0,4 micrómetros, lo más preferiblemente aproximadamente 0,1 micrómetros. Esto es para incrementar su tiempo de circulación in vivo y evitan su adsorción por el RES. El lípido anfipático comprende aproximadamente 0,5 y aproximadamente 20% de moles de las partículas, preferiblemente aproximadamente 1 - 6%, lo más preferiblemente 3%.

Se puede usar una diversidad de reacciones de acoplamiento conocidas para preparar las vesículas que forman los lípidos derivatizados con polímeros hidrófilos. Por ejemplo, un polímero (tal como PEG) se pueden derivatizar a un lípido tal como fosfatidiletanolamina (PE) mediante un grupo de cloruro cianúrico. Como alternativa, un PEG bloqueado se puede activar con un reactivo de acoplamiento de carbonil diimidazol, para formar un compuesto de imidazol activado. Un compuesto unido a carbamato se puede preparar haciendo reaccionar el hidroxilo terminal de MPEG (metoxi PEG) con cloroformiato de p-nitrofenilo para producir un carbonato de p-nitrofenilo. Este producto después se hace reaccionar con 1-amino-2,3-propanodiol para producir el carbamato intermedio. Los grupos hidroxilo del diol se acilan para producir el producto final. Una síntesis similar, que usa glicerol en lugar de 1-amino-2,3-propanodiol, se puede usar para producir un producto unido a carbonato, como se describe en el documento WO 01/05873.Otras reacciones se conocen bien y se describen, por ejemplo, en el documento anteriormente mencionado U.S. 5.013.556.

La composición de la invención se puede administrar mediante inyección, preferiblemente iv, sc o im. Las composiciones de la técnica anterior se propusieron para uso oral solamente, debido a los efectos secundarios provocados durante la inyección por la composición de liposomas. La composición de la invención, por otra parte, no es tóxica por inyección, aparentemente debido al tamaño pequeño y carece de fosfolípidos tóxicos. Los estudios de toxicología de los liposomas PEGilados y FVIII en ratas han demostrado que no se encontró ninguna toxicidad a las dosis de 500 unidades/kg. Cantidades de hasta 0,5 gm/kg de peso corporal de partículas coloidales de acuerdo con la invención se han inyectado sin síntomas tóxicos detectables. Aunque la forma libre de las proteínas y polipéptidos usados en la invención tienen una semivida corta en el sistema vascular, uno de ellos en las composiciones de la invención se espera que incremente su semivida en al menos 1,5 veces. La composición de la invención se espera que sea eficaz en el tratamiento profiláctico y "tras demanda" de los pacientes.

En otro aspecto de la invención, se ha encontrado que existe una secuencia de consenso de 8 aminoácidos localizada dentro de las proteínas que se unen a los liposomas de la invención pero está ausente en las proteínas que no se unen a los liposomas. Esta secuencia de consenso es S/T-X-LXV- I/V/Q/S-S/T-X-X-E, donde X puede ser un aminoácido, y S, T, L, I, V, E y Q tienen los significados convencionales.

En otro aspecto de la invención, se ha encontrado que la inyección de liposomas PEGilados de forma separada a la inyección de la proteína aumenta la semivida de la proteína y la eficacia a largo plazo.

En otro aspecto de la invención, el colesterol se suplementa con la composición farmacéutica.

Breve descripción de los dibujos

Con el fin de entender la invención y para ver cómo se puede llevar a cabo en la práctica, se describirá ahora una realización preferida, a modo de ejemplo con referencia a los dibujos acompañantes, en los que:

Fig. 1 ilustra una interacción a tiempo real de liposomas PEGilados para inmovilizar FVIII. a, liposomas PEGilados, pero sin control de liposomas POPC (PC) y liposomas POPC:DSPE (PC:PE), unidos a rFVIII inmovilizado. b, liposomas PEGilados se unen a rFVIII (FVIII) inmovilizado pero no a HSA inmovilizado. c, Liposomas PEGilados se unen a rFVIII en ausencia o presencia (inhibidores) de un suero diluido (x 100) de un paciente de hemofilia A que desarrolló anticuerpos anti FVIII (título de 20 unidades Bethesda/ml). La respuesta se indica en Unidades de Resonancia (RU). La respuesta en a- c se corrige para la unión no específica a canal revestido por HSA, que era menos del 5% de la interacción de tiempo real de Liposomas PEGilados con relación con los canales revestidos por FVIII inmovilizado.

Fig. 2. Interacción a tiempo real de liposomas PEGilados con FIX inmovilizado. a, Liposomas PEGilados se unen a FIX inmovilizado pero no a HSA inmovilizado. b, Liposomas PEGilados, pero no liposomas POPC de control, se unen a FIX inmovilizado. La respuesta se indica en Unidades de Resonancia (RU). La respuesta se corrige para la unión no específica a canal revestido por HSA, que era menos del 5% de la interacción de tiempo real de Liposomas PEGilados con FIX inmovilizado con relación a la unión a los canales revestidos por FIX.

Fig. 3. Interacción a tiempo real de liposomas PEGilados con G-CSF inmovilizado. a, Liposomas PEGilados se unen a G-CSF inmovilizado pero no a HSA inmovilizado. b, Liposomas PEGilados, pero no liposomas POPC de control, se unen a G-CSF inmovilizado. La respuesta se indica en Unidades de Resonancia (RU). La respuesta se corrige para la unión no específica a canal revestido por HSA, que era menos del 5% de la interacción de tiempo real de Liposomas PEGilados con G-CSF inmovilizado con relación a la unión a los canales revestidos por G-CSF.

Fig. 4. Interacción a tiempo real de liposomas PEGilados con GM-CSF inmovilizado. a, Liposomas PEGilados se unen a GM-CSF inmovilizado pero no a HSA inmovilizado. b, Liposomas PEGilados, pero no liposomas POPC de control, se unen a GM-CSF inmovilizado. La respuesta se indica en Unidades de Resonancia (RU). La respuesta se corrige para la unión no específica a canal revestido por HSA, que era menos del 5% de la interacción de tiempo real de Liposomas PEGilados con GM-CSF inmovilizado con relación a la unión a los canales revestidos por GM-CSF.

Fig. 5. Interacción a tiempo real de liposomas PEGilados con Interferón \gamma inmovilizado. a, Liposomas PEGilados se unen a INF-\gamma inmovilizado pero no a HSA inmovilizado. b, Liposomas PEGilados, pero no liposomas POPC de control, se unen a INF-\gamma inmovilizado. La respuesta se indica en Unidades de Resonancia (RU). La respuesta se corrige para la unión no específica a canal revestido por HSA, que era menos del 5% de la interacción de tiempo real de Liposomas PEGilados con INF-\gamma inmovilizado con relación a la unión a los canales revestidos por INF-\gamma.

Fig. 6. Interacción a tiempo real de liposomas PEGilados con GLP-1 inmovilizado. a, Liposomas PEGilados se unen a GM-CSF inmovilizado pero no a HSA inmovilizado. b, Liposomas PEGilados, pero no liposomas POPC de control, se unen a GLP-1 inmovilizado. La respuesta se indica en Unidades de Resonancia (RU). La respuesta se corrige para la unión no específica a canal revestido por HSA, que era menos del 5% de la interacción de tiempo real de Liposomas PEGilados con GLP-1 inmovilizado con relación a la unión a los canales revestidos por GLP-1.

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Fig. 7. Liposomas PEGilados se unen a FIX inmovilizado en ausencia o presencia de anticuerpos) de anticuerpos FIX anti humanos policlonales de conejo diluidos (x10) (Sigma).

Fig 8. Secuencia de consenso y sitios de unión a FVIII para liposomas PEGilados. a, Secuencia de consenso para la unión a Liposomas PEGilados en diversas proteínas. Los aminoácidos conservados se muestran en rojo mientras que los aminoácidos no conservados se muestran en azul. b, estructura del dominio FVIII humano. Estructura del dominio discreto de FVIIT humano como se deduce de su estructura primaria. Los sitios de unión a liposomas se representan en forma de cuadrados negros. Las flechas rojas indicadas con T representan sitios de activación por trombina. c, Unión de Liposomas PEGilados o liposomas POPC (PC) a un péptido derivado de la secuencia FVIII (aminoácidos 1783 - 1796) inmovilizado a un procesador sensor CM5. La respuesta se indica en Unidades de Resonancia (RU).

Fig. 9. Interacción de tiempo real de Liposomas PEGilados con Copaxone inmovilizado. a, Liposomas PEGilados se unen a Copaxone inmovilizado pero no a HSA inmovilizado. b, Liposomas PEGilados, pero no liposomas POPC de control, se unen a Copaxone inmovilizado. La respuesta se indica en Unidades de Resonancia (RU). La respuesta se corrige para la unión no específica a canal revestido por HSA, que era menos del 5% de la interacción de tiempo real de Liposomas PEGilados con Copaxone inmovilizado con relación a la unión a los canales revestidos por Copaxone.

Fig. 10. Supervivencia de ratones hemofílicos. Las representaciones gráficas de Kaplan-Meierb se muestran ara ratones hemofílicos inyectados con FVIII (Kogenate-FS, Bayer) o FVIII y Liposomas PEGilados (inyectados durante 1 hora más tarde). El análisis estadístico del ensayo de T indica diferencias estadísticamente significativas entre los grupos (P < 0,05).

Fig. 11. Interacción de tiempo real de Liposomas PEGilados compuestos por POPC:DSPE-PEG 2000 (lípidos de Genzyme Pharmaceuticals, Liestal, Suiza) con relación molar 97:3, respectivamente, y Liposomas PEGilados compuestos de POPC:DS-c-PEG2000 (lípidos de Genzyme Pharmaceuticals, Liestal, Suiza) con relación molar de 97:3, respectivamente, con FVIII inmovilizado.

Descripción detallada de la invención

1. Ejemplos 1 - 8

1.1 Materiales y procedimientos

Preparación de Liposomas. Liposomas compuestos de panitoil-oleoil fosfatidil-colina (POPC) y diestearoil fosfatidil-etanolamina metil polietilen glicol 2000 (DSPE-PEG 2000) (Genzyme Pharmaceuticals, Liesatal, Suiza) (relación molar 97:3, respectivamente), POPC y diestearoil fosfatidiletanolamina (DSPE) (Aventi Polar Lipids, Alabaster AL, Estados Unidos) (relación molar 97:3, respectivamente) se prepararon como sigue: los lípidos se disolvieron hasta 10% p/v en terc-butanol (Reidel-de Haen, Seelze, Alemania), se congelaron y se liofilizó la solución. El polvo de lípido seco resultante se volvió a suspender hasta 2 - 13% (p/v) en una solución de 50 mM de tampón citrato, pH 7,0 para formar liposomas. Los liposomas se filtraron usando un aparato extrusor LiposoFast^{TM}100 (Aventin Inc., Ottawa, Canadá) a través de filtros de policarbonato de 1.2 \mum, 0,2 \mum, 0,1 \mum y 0,05 \mum de tamaño (Poetics Corp., Livermore CA, Estados Unidos) formando liposomas en el tamaño de 80 - 110 nm. La solución de liposomas después se pasó a través de un filtro esterilizante de acetato de celulosa de 0,2 \mum (Sterivex^{TM}, Millipore Corporation, Bedford MA, Estados Unidos) y se almacenaron a 2 - 8ºC.

Interacciones de tiempo real - Análisis de Resonancia de Plasmón Superficial. Se realizaron los estudios de unión usando un instrumento biosensor Biacore^{TM} 2000 (Biacore AB, Uppsala, Suecia). Se inmovilizaron las siguientes proteínas sobre un procesador sensor CM5 (Biacore AB, Uppsala, Suecia) a 1500RU (\sim 1,5 ng/mm^{2}), mediante el kit de acoplamiento de aminas prescrito por el proveedor: FVIII (Kogenate-FS, Bayer, Berkley CA, Estados Unidos), FIX (Benefix, Genetics Institute, Cambridge MA, Estados Unidos), GCSF, GM-CSF, IFN-\gamma, Eritropoyetina, Hormona de Crecimiento Humana, Interferón-alfa 2a, Interferón-alfa 2b (ProSpec-Tany TechnoGene Ltd, Nes Ziona, Israel), GLP-1, Insulin (Sigma), Copaxone (Teva Pharm, Israel), IgG y HSA (Omrix, Tel-Aviv, Israel). Se evaluó el análisis SPR en 50 mM de tampón citrato de Na (pH 7,0) a 25ºC con un caudal de 10 \mul/min durante 4 min usando o bien liposomas PEGilados o liposomas control en una concentración final de 0,2 - 2 mM. La regeneración de la superficie del procesador sensor se realizó mediante lavado del procesador con 1 mM de NaOH durante 1 min a un caudal de 10 \mul/min. Se llevó a cabo el análisis de los datos de SPR para las constantes de asociación, disociación y afinidad mediante el software de evaluación BIA (Biacore AB, Uppsala, Suecia).

Alineaciones Múltiples - La alineación de la secuencia múltiple se llevó a cabo usando el software MUSCA (http://cbcsrv.watson.ibm.com). Se usaron los siguientes números de acceso de base de datos Swiss-Prot para las alineaciones múltiples: Human (h) FVIII (P00451), hFIX (P00740), hG-CSF (P09919), hGM-CSF (P04141), hIFN-\gamma (P01579), y hGLP-1 (P01275).

1.2 Resultados Unión de proteínas/péptidos a liposomas PEGilados

Los inventores analizaron la unión de proteínas a liposomas PEGilados mediante medición de Resonancia de Plasmón Superficial (SPR) usando un instrumento Biacore (Biacoe, Uppsala, Suecia). Los inventores inmovilizaron proteínas/péptidos sobre un procesador sensor CM5 (Biacoe, Uppsala, Suecia), después se inyectaron Liposomas PEGilados o liposomas de control del mismo tamaño (80 - 110 nm) y concentración y se midió y se analizó la unión de la proteína/péptido a los liposomas de incorporación que fluían.

Los liposomas PEGilados compuestos de POPC y DSPE-PEG2000 se unen a FVIII (Fig. 1a). La unión era dependiente del polímero PEG unido al lípido DSPE ya que dos tipos de de liposomas de control compuestos de POPC y POPC:DSPE no se unián a FVIII (Fig. 1a). Además, la unión era específica a FVIII, ya que los liposomas PEGilados no se unían a albúmina sérica bovina (HSA) (Fig. 1b). El análisis de unión de una curva representativa (Fig. 1a) que usa un modelo de unión de dos sitios indica que los Liposomas PEGilados se unen a dos sitios sobre FVIII con constantes de velocidad de asociación (K_{on}) de 3,83 x 10^{5} y 3,37 x 10^{6} M-1 S-1, constantes de velocidad de disociación (K_{off}) de 1,72 x 10^{-3} y 6,6 x 10^{-3} S-1 y valores de constante de afinidad (Kd) de 1,96 nM y 4,5 nM respectivamente (Tabla 1).

Los anticuerpos policlonales del factor VIII humano [suero de un paciente que desarrolló anticuerpos anti FVIII (inhibidores)] compiten con la unión de los Liposomas PEGilados a ambos sitios (Fig. 1c). El experimento de control indica que la immunoglobulina G (IgG) humana no competía con la unión de FVIII a Liposomas PEGilados (datos no mostrados). Esto indica que los Liposomas PEGilados se unen de manera específica a los mismos dominios de proteína como anticuerpos del facto VIII anti humanos.

Las mediciones de SPR se realizaron con varias proteínas adicionales recombinantes y purificadas. Las siguientes proteínas se encontró que se unen a Liposomas PEGilados: Factor IX (FIX), factor de estimulación de las Colonias de granulocitos (G-CSF), factor de estimulación de colonias de macrófagos de granulocitos (GM-CSF), Interferón \gamma y Péptido 1 de tipo Glucagón (GLP-1) (Fig 2 - 6). Además, los inventores encontraron que las siguientes proteínas no se unen a los Liposomas PEGilados: HSA, IgG Insulin, Interferón \gamma 2a, Interferón \gamma 2b, Hormona de Crecimiento Humana y Eritropoyetina.

Además, los anticuerpos del factor IX anti humanos policlonales (Sigma) compiten con la unión de los liposomas PEGilados a ambos sitios (Fig. 7). Esto indica que los Liposomas PEGilados se unen de manera específica a los mismos dominios de proteína que los anticuerpos del factor IX anti humanos.

El análisis de la secuencia de aminoácidos indica que existe una secuencia de consenso de 8 aminoácidos (S/T X-L/I/VI/V/Q/S-S/T-X-X-E) localizada dentro de de las proteínas que se unen e los Liposomas PEGilados (Fig. 8a) pero no está en las proteínas que no se unen a los Liposomas PEGilados. Para ensayar la secuencia de consenso y los sitios de unión identificados sobre FVIII, los autores sintetizaron un péptido derivado de los aminoácidos 1783 - 1796 de FVIII y se midió su unión a los Liposomas PEGilados. El péptido se une a los Liposomas PEGilados, pero no a los liposomas de control POPC, con un valor de Kd de 2,25 nM (Fig. 8c) que es similar a los valores de Kd de FVIII y los Liposomas PEGilados que se habían encontrado previamente (Tabla 1).

Un resuman de los valores de Kon Koff y Kd de las diversas proteínas y péptido se muestra en la Tabla 1.

Sin embargo, Copaxone (Teva, Israel), un copolímero aleatorios sintético compuesto de 4 aminoácidos (Lala, L-glu, L-lys y L-tyr) pero no contiene la secuencia de consenso, también se une a los Liposomas PEGilados (Fig. 9)

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TABLA 1 Parámetro cinético para la unión de proteínas/péptido a Liposomas PEGilados

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Se determinaron la asociación y disociación de diversas proteínas y un péptido a PEGliposomas, como se describe en "material y procedimientos". La concentración de PEGliposomas ensayadas eran 18,355 nM para FVIIII, FIX, G-CSF, GM-CSF, INF-\gamma y 183,55 pM para GLP-1. Los datos obtenidos para todas las proteínas se analizaron para calcular las constantes de velocidad de asociación (k_{on}), constantes de velocidad de disociación (k_{off}) constantes de afinidad (K_{d}) mediante el software BIAevaluation.

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2. Ejemplos 9-10

2.1 Material y Procedimientos

Formulación de FIX y G-CSF con los Liposomas PEGilados. Liposomas PEGilados se formularon con o bien FIX (Octanine, Octapharma) o G-CSF (ProSpec-Tany TechnoGene Ltd; Nes Ziona, Israel) mediante la disolución de la proteína con solución de liposomas (un ml de solución de liposomas/200 unidades de FIX y 1 ml de solución de liposomas/10 \mug de G-CSF). El vial se incubó sobre un mezclador giratorio haciendo girar a 33 rpm, amplitud 16 mm (Stuart Scientific, Redhill, UK) durante 10 minutos (G-CSF) o 60 minutos (FIX), a temperatura ambiente (20 -
25ºC).

Farmacocinética de G-CSF formulados con liposomas y G-CSF sin liposomas en ratones. Dos grupos de ratones negros negros C57 se inyectaron por vía subcutánea (s.c.) con: a) 50 \mul de G-CSF formulados con Liposomas PEGilados (10 \mug/ml). b) 50 \mul de G-CSF disueltos en 50 mM de tampón citrato de Na (10 \mug/ml). A los ratones se les extrajo sangre del seno retro orbital en tubos de microcentrífuga que contenían citrato de sodio (20 mM de concentración final) a diversos momentos después de la inyección y se separó el plasma mediante centrifugación 2.700 x g durante 10 minutos a 4ºC. Se midieron las concentraciones de G-CSF en el plasma de ratón mediante ELISA (kit G-CSF DouSet ELISA, R&D) de acuerdo con la instrucción del fabricante.

Farmacocinética de PegLip-FIX y FIX sin PegLip en ratones hemofílicos. Se inyectaron tres grupos de ratones C57BL por vía IV en la vena de la cola con 50 \mul de: a) 200 unidades/ml de PegLip-FIX. b) FIX no formulado. c) tampón. A los ratones se les extrajo sangre del seno retro orbital en tubos de microcentrífuga que contenían citrato de sodio (20 mM de concentración final) a diversos momentos después de la inyección y se separó el plasma mediante centrifugación 2.700 x g durante 10 minutos a 4ºC. Se midió la actividad de FIX en el plasma de los ratones mediante un ensayo de coagulación de una fase (usando reactivos Stago y máquina de coagulación ST4) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Ya que los ratones C57BL tienen actividad endógena de FIX en su plasma, esta actividad endógena (como se mide en los ratones de control) se sustrajo de la actividad medida en cada instante en los grupos tratados.

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Análisis de farmacocinética

Parámetros de farmacocinética (semivida y AUC) se analizaron mediante software de ordenador (RSTRIP, MicroMath Inc.).

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Análisis estadístico

Ensayo de t de Student

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2.2 Resultados Farmacocinética de las proteínas formuladas con liposomas en ratones

Se midieron en los ratones los parámetros farmacocinéticos de FIX y G- CSF formulados con y sin liposomas. Los resultados presentados en las Tablas 2 - 3 indican que la semivida y área bajo la curva de las proteínas formuladas con Liposomas PEGilados eran mayores que los de las proteínas sin.

TABLA 2 Parámetros de farmacocinética después de la inyección por vía SC de G-CSF formulados con liposomas (PegLip-G-CSF o G-CSF sin en ratones

2

G-CSF se reconstituyó con 50 mM de tampón de citrate de Na pH 7 o se formuló con Liposomas PEGilados y se inyectaron (50 \mul) por vía s. c. en ratones (6 ratones en un grupo). Se midió la concentración en el plasma de G-CSF humanos (Pg/ml) mediante Ensayo Inmunoabsorbente Ligado a Enzimas (Elisa). Se calcularon los parámetros farmacocinéticos para cada ratón. Los valores son medias \pm desviación estándar. Análisis de ensayo de t de student para la semivida de PegLip-G-CSF frente a G-CSF, P < 0,002.

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TABLA 3 Parámetros de farmacocinética después de la inyección por vía IV de Factor IX o Factor IX formulado con liposomas PEGilados (PegLip-FIX) en ratones

3

Se calcularon los parámetros farmacocinéticos para cada ratón. Los valores son medias \pm desviación estándar. Análisis de ensayo de t de student para la semivida de PegLip-FIX frente a FIX, P < 0,15.

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3. Ejemplo 11

3.1 Farmacocinética y actividad biológica de FVIII formulado in vivo con Liposomas PEGilados en ratones hemofílicos

La farmacocinética y actividad biológica del Factor VIII que se formuló in vivo con Liposomas PEGilados mediante la inyección de liposomas 1 hora después la inyección de Factor VIII no formulado, se midió en ratones hemofílicos: los ratones hemofílicos se inyectaron con: a) sin (no formulado) FVIII. b) Sin FVIII y una hora más tarde una segunda inyección de Liposomas PEGilados. Se extrajo sangre a los ratones en varios momentos después de la inyección. Se midió la actividad de FVIII mediante ensayo de coagulación.

Con el fin de ensayar la eficacia in-vivo de FVIII formulados con liposomas en la detención de la hemorragia y compararla con la de sin FVIII las colas de los ratones inyectados se cortaron varias veces después de la inyección y se midió la supervivencia de los ratones inyectados.

Los resultados presentados en la Tabla 4.y Figura 10 indican que la semivida y área bajo la curva del factor VIII que se formuló in-vivo con Liposomas PEGilados eran mayores que los de sin FVIII. De acuerdo con lo anterior, la supervivencia de los ratones inyectados con FVIII y 1 hora más tarde con liposomas eran significativamente
mayores.

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TABLA 4 Actividad del Factor VIII (IU/ml) y parámetros de farmacocinética después de la inyección de FVIII o FVIII y 1 hora más tarde con Liposomas PEGilados en ratones hemofílicos

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4

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FVIII recombinante (Kogenate-FS, Bayer) se reconstituyó con agua y se inyectó (40 \mul) en la vena de la cola de ratones hemofílicos (10 ratones en cada grupo). Una hora más tarde, Liposomas PEGilados (9% lípidos, p/v) se inyectaron por vía i.v. (40 \mul) en un grupo de ratones. Se midió la actividad de FVIII sobre la combinación de muestras de sangre de cada instante mediante un ensayo de coagulación de una fase. Los parámetros farrmacocinéticos (semivida y AUC) se analizaron mediante un programa de ordenador (RSTRIP, MicroMath Inc.).

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4. Ejemplo 12

La unión de FVIII a liposomas compuestos por POPC y lipopolímero no cargado unido a carbamato se comparó con la unión de FVIII a liposomas compuestos de POPC y DSPE-PEG mediante análisis de interacción a tiempo real. La estructura esquemática de lipopolímero no cargado unido a carbamato : mPEG aminopropanodiol diestearoil (DS-c-PEG) y 1,2 diestearoil-sn-glicero- 3-fosfatidiletanolamina-N-metoxi polietilen glicol (DSPE-PEG) se muestran a continuación

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5

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6

Los resultados se presentan en la Fig. 11 y muestran que ambos tipos de liposomas interactúan con FVIII.

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5. Ejemplo 13

El factor VIIa de coagulación se usa generalmente para tratar pacientes de hemofilia con inhibidores y para detener la hemorragia por trauma (por ejemplo, lesiones de guerra, accidentes de coche). Se midió en ratas la farmacocinética del factor VIIa, formulada con Liposomas PEGilados. Ratas Sprague Dawley (SD) (180 g) se inyectaron con 36 \mug/rata de sin (no formulado) FVIIa (Nova Nordisk) o FVIIa formulado con Liposomas PEGilados. Se extrajo sangre en diversos momentos después de la inyección y se midió la actividad de FVIIa mediante ensayo de coagulación (Stago). Los resultados presentados en las Tablas 5 y 6 indican que la semivida y área bajo la curva del factor VIIa que se formuló in-vivo con Liposomas PEGilados eran mayores que la de sin FVIIa.

TABLA 5 Actividad del Factor VIIa (IU/ml) y farmacocinética después de la inyección de VIIa o VIIa formulado con Liposomas PEGilados en ratas

7

TABLA 6 Actividad del Factor VIIa (IU/ml) y farmacocinética después de la inyección de VIIa o VIIa formulado con Liposomas PEGilados en ratas (muestras combinadas)

8

Claims

1. Una composición farmacéutica para la administración parenteral que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína o polipéptido unido de manera no covalente a una partícula coloidal, comprendiendo dicha partícula aproximadamente 1 - 20 por ciento en moles de un lípido anfipático derivatizado con un polímero hidrófilo biocompatible,

en la que dicha proteína o polipéptido se selecciona entre el grupo constituido por: (a) Factor VIIa, factor estimulador de la colonia de granulocitos (G-CSF), factor estimulador de la colonia de macrófagos de granulocitos (GM-CSF), Interferón \gamma, péptido 1 de tipo glucagón (GLP-1) y Copaxone; y b) proteínas o polipéptidos que incluyen una secuencia de consenso de serina/treonina-X-leucina/isoleucina/valina-isoleucina/valina/glutamina/serina-serina/treonina-X-X-ácido glutámico,

donde X puede ser un aminoácido;

en la que dicha proteína o polipéptido no es Factor VIII (FVIII),

y en la que dicha proteína o polipéptido no está encapsulada en dichas partículas coloidales.

2. La composición farmacéutica de la reivindicación 1 en la que dichas partículas coloidales son sustancialmente neutras y dicho polímero no lleva sustancialmente carga neta.

3. La composición farmacéutica de la reivindicación 1 o Reivindicación 2 en la que dicho lípido anfipático es un fosfolípido de fuentes natural o sintética.

4. La composición farmacéutica de la reivindicación 3 en la que dicho lípido anfipático es fosfatidiletanolamina (PE).

5. La composición farmacéutica de la reivindicación 1 o Reivindicación 2 en la que dicho lípido anfipático es un lipopolímero no cargado unido a carbamato.

6. La composición farmacéutica de la reivindicación 5 en la que dicho lípido anfipático es aminopropanodiol diestearoil (DS).

7. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones precedentes en la que dichas partículas coloidales además comprenden un segundo lípido anfipático obtenido de fuentes o bien naturales o sintéticos.

8. La composición farmacéutica de la reivindicación 7 en la que dicho segundo lípido anfipático es fosfatidilcolina.

9. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones precedentes en la que dicho polímero hidrófilo es polietilen glicol.

10. La composición farmacéutica de la reivindicación 9 en la que el polietilen glicol tiene un peso molecular de entre aproximadamente 500 y aproximadamente 5000 daltons.

11. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones precedentes 1 a 10 en la que el polipéptido es Copaxone y la composición se puede usar para el tratamiento de una enfermedad seleccionada entre esclerosis múltiple, neuropatía diabética, demencia senil, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, parálisis del nervio facial (De Bell), glaucoma, corea de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica, estado epiléptico, neuropatía óptica no arterítica, o deficiencia de vitaminas.

12. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 1, a 10 en la que el polipéptido es Factor VIIa y la composición se puede usar en pacientes de hemofilia con inhibidores y para el tratamiento de hemorragia por trauma.

13. Uso de una partícula coloidal en la preparación de una composición farmacéutica para la administración parenteral para el tratamiento de un paciente que sufre una enfermedad, comprendiendo dicha composición una

cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína o polipéptido unido de manera no covalente a una particular coloidal, comprendiendo dicha partícula coloidal aproximadamente 1 - 20 por ciento en moles de un lípido anfipático derivatizado con un polímero hidrófilo biocompatible,

donde X puede ser un aminoácido;

en la que dicha proteína o polipéptido no es Factor VIII (FVIII),

14. El uso de la reivindicación 13 en la que dicha enfermedad es hemofilia.

15. El uso de la reivindicación 13 o Reivindicación 14 en el que la partícula coloidal es un liposoma.

16. Uso de partículas coloidales y una proteína o polipéptido en la preparación de una composición farmacéutica para la administración parenteral para el tratamiento de un paciente que sufre una enfermedad, en el que dicha composición farmacéutica comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína o polipéptido unido y las partículas coloidales, comprendiendo las partículas coloidales aproximadamente 1 - 20 por ciento en moles de un lípido anfipático derivatizado con un polímero hidrófilo biocompatible, en el que dicha proteína o polipéptido se selecciona entre el grupo constituido por:

(a) proteínas o polipéptidos capaces de unirse externamente a dichas partículas coloidales;

(b) proteínas o polipéptidos capaces de unirse a polímeros de las familias de polialquiléter, ácido poliláctico y ácido poliglicólico; y

(c) proteínas o polipéptidos que incluyen una secuencia de consenso de serina/treonina-X-leucina/isoleucina/valina-isoleucina/valina/gutamina-serina- serina/treonina-X-X-ácido glutámico, donde X puede ser un aminoácido;

en el que la proteína o polipéptido no está encapsulado en las partículas coloidales,

y en el que las partículas coloidales y la proteína o polipéptido están separadas.

17. El uso de la reivindicación 16 en el que la proteína o polipéptido no es Factor VIII (FVIII).