MX2008000223A - Composiciones y metodos para complejos proteina-lipido menos inmunogenos - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona composiciones y métodos para reducir la inmunogenicidad y aumentar el tiempo de permanencia en circulación de proteínas terapéuticas tales como el Factor VIII. Las composiciones contienen estructuras lípidas tales como liposomas, micelos y cocleados que contienen un lípido cargado negativamente yfosfatidil etanolamina derivada con polietilenglicol.

Description

COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA COMPLEJOS PROTEINA- LÍPIDO MENOS INMUNÓGENOS Esta solicitud reclama prioridad respecto a la solicitud provisional estadounidense número 60/695,080 presentada el 29 de junio de 2006, cuya descripción está incorporada aquí mediante referencia. Este trabajo fue apoyado por fondos del gobierno de Estados Unidos de América bajo la subvención N° R01 HL-70227 del Instituto Nacional de Salud (National Institutes of Health). El gobierno de Estados Unidos de América tiene algunos derechos sobre la invención. Campo de la invención Esta invención se refiere en general a medios para reducir la inmunogenicidad de sustancias terapéuticas y más particularmente proporciona composiciones y métodos para reducir la inmunogenicidad del Factor VI I I . Antecedentes de la invención La hemofilia A es un trastorno hereditario de la sangre caracterizado por la deficiencia o insuficiencia del factor VII I (FVI II). El FVI I I sirve como un co-factor crítico en la ruta intrínseca de la cascada de coagulación. La terapia de reemplazo con FVII I humano recombinante (rFVI II) o FVI I I derivado de plasma es la terapia más comúnmente empleada para controlar los episodios de sangramiento. Sin embargo, la inducción de anticuerpos neutralizantes contra la proteína administrada en aproximadamente 15-30% de los pacientes es una complicación principal en la terapia [1-3]. Los anticuerpos neutralizantes frecuentemente apuntan al dominio C2, el cual también está involucrado en la fijación a los fosfolípidos in vivo. El FVIII es una glicoproteína con múltiples dominios grande, constituida por los dominios A1, A2, B, A3, C1 y C2 [4,5]. Los estudios de mapeo de epítopos sistemáticos han revelado que los anticuerpos anti-FVIII principalmente son regiones definidas objetivo en los dominio A2 (cadena pesada), A3 y C2 (cadena ligera) de FVIII [6,7]. El epítopo determinante dentro del dominio A2 ha sido mapeado hasta los residuos Arg484-lle-508 [8,9]. Se ha demostrado que los anticuerpos que apuntan a esta región inhiben la forma activada del FVIII (FVIIIa) bloqueando la interacción del dominio A2 con el factor IXa (FlXa) [10]. El epítopo determinante principal dentro del dominio A3 está constituido por residuos 1811-1818 y los anticuerpos contra esta región también evitan la interacción del FVIII con el FlXa lo que da como resultado la pérdida de la actividad del co-factor [11]. Los determinantes de epítopo dentro del dominio C2 han sido mapeados hasta los residuos 2181-2312 [12,13] los cuales comprenden los epítopos inmunodominantes, universales, CD4+ 2191-2210, 2241-2290, 2291-2330 [14,15]. Los anticuerpos contra el dominio C2 interfieren con la fijación del FVIII a la superficie de la membrana de plaquetas rica en fosfatidilserina (PS) que es esencial para la amplificación de la cascada de coagulación. Debido a la respuesta inmunitaria generada contra el Factor Vl l ll administrado, hay una necesidad de identificar formulaciones en las cuales la inmunogenicidad del Factor VII I sea reducida preferiblemente sin afectar adversamente la permanencia en la circulación. Breve descripción de la invención Investigamos si el uso de liposomas y otras estructuras lípidas que incluyen lípidos cargados negativamente (tales como fosfolípidos incluyendo fosfatidilserina) y fosfolípidos derivados de PEG pueden mejorar la inmunogenicidad de proteínas tales como el Factor VI II . En un ejemplo, la inmunogenicidad de rFVIII asociada con liposomas que contienen PS y PE derivados de PEG y/o incorporada en ellos, fue evaluada en un modelo múrido con respecto a la hemofilia A. Los animales tratados con estas composiciones tuvieron menores concentraciones e anticuerpos anti-rFVI II totales e inhibidores, en comparación con los animales tratados con rFVI II solo. El índice de estimulación media de células de bazo aisladas de animales que recibieron composiciones de la presente invención fue menor que el de animales que recibieron rFVII I solo. El análisis de citocina sugirió que la reducción en inmunogenicidad del rFVI I I administrado en la presencia de estas composiciones liposómicas puede ser mediado, en parte, por la producción reducida de IL-10. Estudios farmacocinéticos después de administración intravenosa (i.v.) indicaron que la permanencia en la circulación del rFVI II usando estas composiciones aumentaba. De acuerdo con esto, aquí se proporciona composiciones en las cuales la imunogenicidad de la proteína es reducida sin comprometer la permanencia en circulación. Las composiciones contienen liposomas y/u otras estructuras lípidas que incluyen lípidos cargado negativamente, lípidos anfifáticos derivados con PEG, y la proteína, tal como FVIII . Los liposomas u otras estructuras lípidas que contienen PEG como se describe aquí, se denominan en esta solicitud como "PEGilados". También se proporciona métodos para la preparación y uso de las composiciones. Las abreviaturas que se utilizan aquí son: APTT, tiempo parcial de tromboplastina activada; ACD, ácido-citrato-dextrosa; BPS, foafatidilserina cerebral; BSA, albúmina de suero bovina; DMPC, dimiristoilfosfatidilcolina; DMPE-PEG20oo. 1 ,2-dimiritsoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-2000]; ELISA, análisis inmunoabsorbente ligado a enzima; FVI I Ia, FVII I activado; FDCa, factor Ka; Ig, inmunoglobulina; KO, inactivación genética ("knockout"); PB, regulador fosfato; PBA, regulador fosfato con contenido de albúmina; PBT, regulador fosfato con contenido de Tween; PA, ácido fosfatídico; PC, fosfatidilcolina; PS, fosfatidilserina; rFVIIa, factor recombinante Vi lla; rFVIII , factor VI I I humano recombinante; RES, sistema reticuloendotelial; TB, amortiguador Tris. Breve descripción de los dibujos Figura 1 : Estructura terciaria de rFVII I en la presencia y en la ausencia de liposomas PEGilados. El espectro de emisión de fluorescencia se obtuvo en el rango de 300 - 400 nm. El monocromador de excitación fue establecido a 280 nm. La concentración de proteína utilizada fue ~ 4 µg/mL. Figuras 2 A y 2B: (A) títulos de anticuerpo anti-FVI I I totales y (B) anticuerpos anti-rFVIII inhibidores en ratones hemofílicos después de la administración de rFVIII en la ausencia y en la presencia de liposomas PEGilados constituidos por DMPC:BPS (70:30) al final de 6 semanas. Cada punto representa valores de ratones individuales que recibieron tratamiento, y la barra horizontal ilustra la media del anticuerpo total o títulos inhibidores. Para fines de comparación, también se muestran los datos obtenidos después de la administración de rFVII I en la presencia de liposoma DMPC:BPS no PEGilado. Se obtuvieron muestras de sangre 2 semanas después de la cuarta inyección. Los títulos de anticuerpo anti-FVI I I totales fueron determinados mediante ELISA y los títulos inhibidores fueron determinados mediante Análisis Bethesda. Se llevó a cabo un análisis estadístico como se describe en los ejemplos. Figuras 3 A y 3B: Respuesta a la proliferación de células T CD4+ de ratones hemofílicos, representada como el índice de estimulación, para rFVI II intacto (100 (3A) o 1000 ng/receptáculo (3B)), que porta múltiples epítopos inmunodominantes, después de dos dosis subcutáneas de 2µg de rFVI I I , rFVI I I liposómico no PEGilado, RFVI II liposómico PEGilado o RFVI I I liposómico libre de PS. El cálculo del índice de estimulación y el análisis estadístico están descritos en los ejemplos. Cada punto representa valores de animales individuales y la barra horizontal ilustra la media del índice de estimulación. Figura 4: secreción de IL-10 por las células T CD4+ expuestas al antígeno de animales a los cuales les fueron administradas dos dosis subcutáneas de 2 µg de rFVII I libre o RFVII I liposómico PEGilado. Se expuso células T CD4+ enriquecidas al rFVI I I (1000 ng/receptáculo). Cada punto representa valores de animales individuales, y la barra horizontal ilustra el nivel medio de IL-10 secretada en el medio de cultivo. Se llevó a cabo un análisis estadístico como se describe en los ejemplos. Figura 5: Actividad de rFVI I I en plasma contra perfiles de tiempo después de la administración de rFVI I I , RFVI II liposómico PEGilado o no PEGilado en ratones hemofílicos. Figura 6: Anticuerpos anti-rFVII I inhibidores en ratones hemofílicos después de la administración de rFVI I I en la ausencia y en la presencia de liposomas PEGilados de diversas composiciones lípidas al final de 6 semanas. Cada punto representa valores de ratones individuales que recibieron tratamiento y la barra horizontal ilustra la media del anticuerpo total o títulos inhibidores. Se obtuvieron muestras de sangre 2 semanas después de la cuarta inyección. Los títulos inhibidores fueron determinados mediante Análisis Bethesda. Se llevó a cabo un análisis estadístico como se describe en los ejemplos. Figura 7: Ejemplos de algunas composiciones liposómicas de la presente invención y su tamaño de liposoma, eficiencia de asociación de proteína e inmunogenicidad. Descripción de la invención La presente invención proporciona formulaciones de rFVI I I. Las formulaciones contienen liposomas y/u otras estructuras lípidas (tales como micelos o codeados) que incluyen un lípido cargado negativamente tal como PS o PA. Los liposomas también contienen un primer lípido anfifático derivado con PEG (tal como PE) y un segundo lípido anfifático tal como PC, PE (no derivado con PEG) o PG. Además del lípido cargado negativamente, los micelos pueden contener PC y/o PE no derivado de PEG. Además del lípido cargado negativamente, los codeados también pueden contener PC. Las composiciones de la presente invención son tales que el Factor VIII es menos inmunógeno y tiene mayor permanencia en la circulación que el Factor VII I libre. En particular, esta invención proporciona preparaciones de rFVII I lípidas en las cuales los epítopos inmunodominantes están protegidos. Debido a la baja inmunogenicidad y a la mayor permanencia en la circulación, la frecuencia de administración de la proteína puede ser reducida. Las composiciones de la presente invención contienen estructuras lípidas que incluyen un lípido cargado negativamente, un lípido anfifático derivado de PEG. Factor VI I I o se pueden asociar con otras proteínas o polipéptidos (es decir, pueden ser adsorbidos en la superficie) o pueden ser incorporados en estas estructuras. Se considera que las proteínas se asocian con los lípidos cargados negativamente, tales como PS o PA. Son ejemplos de lípidos anfifáticos: PC, PE y PG . Ejemplos de l ípido cargado negativamente son PS y PA. Un ejemplo de un lípido que puede ser derivado con PEG es el PE . Se debe notar que el PE se puede usar en las estructuras l ípidas por sí solo y/o como derivado con PEG. En una modalidad, la proteína es FVI I I . Los datos in vivo se presentan en un modelo múrido de hemofilia A. Los datos indican que la administración de PS que contienen RFVI I I liposómico PEGilado reduce la inmunogenicidad de la proteína y produce un aumento en el t1 2 del rFVI I I . Para los liposomas de la presente invención, la cantidad de los lípidos cargados negativamente está en el rango de 30 hasta 50 % molar. La cantidad de l ípidos anfifáticos está en el rango de 50 hasta 70 % molar. El PE derivado con PEG está entre 1 -1 5 % molar. Opcionalmente, los liposomas también pueden contener colesterol en el rango de 0-30 % molar. En una modalidad , la proporción de PC con respecto a PS está en el rango de 50:50 hasta 90: 1 0. En una modalidad , la proporción es 70:30. Hasta 20 % del PS o PC puede estar reemplazado por PE no derivado de PEG . Los fosfolípidos de la presente invención tienen dos cadenas acilo. La longitud de las cadenas acilo unidas a la estructura principal glicerol varía desde 12 hasta 22 átomos de carbono. Las dos cadenas acilo unidas a la estructura principal glicerol pueden ser las mismas o diferentes. Las cadenas acilo pueden ser saturadas o insaturadas. Algunos ejemplos no limitantes de cadenas acilo saturadas e insaturadas de 12 a 22 átomos de carbono se muestran en las Tablas 1 A y 1 B: Tabla 1 Tabla 1 B Las fosfatidilserinas de cadena corta (6-12 átomos de carbono) son lípidos únicos solubles en agua que pueden existir como micelos en concentraciones por encima de las concentraciones micelares críticas. Las fosfatidilserinas de cadena corta interactúan con el rFVTI I e influyen en la estabilidad, inmunogenicidad y parámetros farmacocinéticos del rFVI I I. Los PE derivados de PEG también se pueden utilizar en los micelos. Adicionalmente, también se puede preparar estructuras codeadas o cilindros que incluyen lípidos cargado negativamente y PE derivados de PEG. Estos pueden ser útiles como sistemas de suministro de fármacos. Para la preparación of codeados, se usan fosfolípidos de cadena larga (12-22 átomos de carbono). Los micelos pueden contener 100 % molar de PS y 1 -15 % molar de PE derivados de PEG. Opcionalmente, hasta 50 % de PS puede estar reemplazado por PC y/o hasta 5% de PS puede estar reemplazado por PE (no derivado con PEG). Para los micelos hasta 50 % de PS puede estar reemplazado por PC y/o hasta 5% por PE. Los codeados también pueden contener 100 % molar de PS.

Hasta 30 % molar del PS puede estar reemplazado por PC. Las composiciones del presente método se pueden preparar mediante varios métodos. Por ejemplo en una modalidad, el método incluye preparar liposomas que contienen PS, PC y/o PE, asociando y/o incorporando FVI I I en los liposomas y añadiendo PE derivados de PEG a los liposomas con FVII I asociado o incorporado. Para la incorporación de PE derivados de PEG en los liposomas, es preferible tener los PE derivados de PEG en una concentración menor que la Concentración Micelar Crítica (CMC), de tal forma que preferiblemente no se formen los micelos. Generalmente la formación de micelos hará más lento el proceso de incorporación de PE derivados de PEG en los liposomas. En otra modalidad , se usa PC (y opcionalmente PE), PS y PE derivados de PEG para liposomas preparados, y luego se les añade FVI I I de tal forma que se asocien con los liposomas y/o se incorporen en ellos. En otra modalidad , la incorporación de cantidades variables de PEG puede lograrse incluyendo cantidades variables de PE activado (activado por medio de grupos amino, carboxilo o tiol) y después de la incorporación de FVI I I el PE activado puede ser unido covalentemente al PEG activado. Se ha demostrado que la presencia del PE mejora las propiedades de fijación del FVI I I con PS. En una variación de esta modalidad , se puede usar un separador entre el PE y el PEG . Un separador apropiado tiene entre 6 y 1 2 átomos de carbono. Se puede usar otros separadores que tengan la misma longitud de 6 a 12 átomos de carbono. En una modalidad adicional , los liposomas de las estructuras lípidas también pueden contener colesterol . Para esta modalidad , se añade colesterol en el paso de elaborar los liposomas o las otras estructuras lípidas. Los liposomas de la presente invención están entre 80 y 500 nm . En una modalidad , los liposomas tienen desde 1 00 hasta 200 nm de diámetro. La proporción molar de proteína con respecto a lípido está entre 1 : 1000 y 1 :20,000. Los codeados generalmente se forman en amortiguadores con alta viscosidad y tienen un rango medio que varía entre 150 y 300 nm. Los micelos están en el rango de 70 a 90 nm. El polietilen glicol útil en la presente invención puede tener pesos moleculares de entre 700 y 30,000. Los ejemplos de pesos moleculares útiles para PEG son 750, 1000, 2000, 3000, 5000, 20000, 30000 Da. Se conoce una variedad de métodos para derivar PEG en un lípido. Por ejemplo, la derivación puede hacerse mediante un grupo cloruro cianúrico o usando un reactivo para acoplamiento carbonil diimidazol. Se puede encontrar más detalles en la patente estadounidense número 5,013,556. Una variedad de lípidos PE derivados de PEG están disponibles comercialmente. Los ejemplos incluyen, sin limitarse a ellos, DMPE-PEG, DPPE-PEG y DSPE-PEG. La derivación de PE con PEG es mediante un enlace covalente. Los ejemplos de composiciones liposómicas útiles y sus propiedades se presentan en la Tabla 2 (Figura 7). Los siguientes ejemplos se presentan para ilustrar la invención. Éstos no pretenden ser limitantes. Ejemplo 1 Este ejemplo describe la preparación de PC que contienen liposomas. En este ejemplo, la proteína primero se asoció con PS que contienen liposomas y luego se les añadió PEG. Materiales Se usó rFVI I I (Baxter Biosciences, Carlsband, CA) como antígeno. Se compró plasma de control con coagulación normal y plasma deficiente en FVII I para el análisis de actividad , en Trinity Biotech (Co Wicklow, Irlanda). Se obtuvo fosfatidilserina cerebral (BPS), dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC) y 1 ,2-dimiritsoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-2000] (DMPE-PEG20oo) disuelta en cloroformo, en Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL), se almacenó a -70 °C y se usó sin purificación adicional. Se adquirió agua estéril libre de pirógenos en Henry Schein Inc. (Melville, NY). La inmunoglobulina anti-ratón de cabra (Ig, IgM + lgG + lgA, H + L) conjugada con fosfatasa alcalina fue de Southern Biotechnology Associates, Inc. (Birmingham, Alabama). Se obtuvo anticuerpo monoclonal ESH 8 en American Diagnostica Inc, (Greenwich, CT). Se obtuvo albúmina de suero bovina (BSA) libre de IgG, dietanolamina y acetona en Sigma (Saint Louis, MO). Se compró sal disódica de fosfato de p-Nitrofenilo en Pierce (Rockford, IL). Se obtuvo 1 ,6-difenil-1 ,3,5-hexatrieno (DPH), medio de cultivo RPMI-1640, penicilina, estreptomicina, L-Glutamina, 2-mercaptoetanol y Polimixina B, todas en Invitrogen Corp., (Carlsband, CA). Se obtuvo 3H-timidina en Perkin Elmer Inc. (Boston, MA). Todas las otras sales amortiguadoras utilizadas en el estudio se obtuvieron en Fisher Scientific (Fairlawn, NJ) y se usaron sin purificación. Determinación de la Concentración Micelar Crítica (CMC) de Se determinó la CMC de DMPE-PEG20oo usando la sonda de fluorescencia DPH como se describió previamente [16]. Brevemente, se le añadió solución de DPH (2 µL, [DPH] = 30 µM en acetona) a diversas concentraciones de 1 mL de DMPE-PEG20oo seguido por incubación a 37°C durante 2 h. La intensidad de la fluorescencia de las dispersiones se midió usando un fluorómetro PTI (Photon Technology International , Lawrenceville, NJ) equipado con una lámpara con arco de xenón. La longitud de onda de excitación (Ex) de la sonda se estableció en 360 nm y se vigiló la emisión (Em) a 430 nm. La concentración de la dispersión en donde la intensidad de la fluorescencia aumentó abruptamente fue definida como la CMC y se encontró que era de -100 µM . Preparación de liposomas de polietilenglicol - PS (PEGilado) Metodología de transferencia de PEG Se disolvieron las cantidades requeridas de DMPC (TC~23°C) y BPS (TC~6-8°C) en cloroformo, y se evaporó el solvente usando un evaporador rotativo (Buchi-R200, Fisher Scientific) para formar una película delgada en las paredes de un matraz con fondo redondo. Cualquier solvente residual fue eliminado de la muestra bajo una corriente de nitrógeno seco. Los liposomas fueron formados rehidratando la pel ícula lípida delgada en amortiguador Tris (TB, NaCI 300 mM, Tris 25mM , CaCI2.2H2O 5mM , pH = 7.0, preparado en agua estéril libre de pirógenos) a 37°. Las proporciones molares de los l ípidos usadas en el presente estudio fueron DM PC: BPS (70: 30 mol%). Los liposomas fueron extruidos a través de una membrana de policarbonato de 200 nm varias veces, usando una extrusora de alta presión (Mico, Inc. , Middleton, Wl ) a una presión de ~ 1379 - 1724 kPa (200-250 psi). Los liposomas fueron esterilizados por filtración a través de una unidad de filtro Millex™-GP de 0.22 µm (Millipore Corporation, Bedford, MA). Se estimó la recuperación de lípidos mediante determinación del contenido de fósforo por el método de Bartlett [17]. La distribución de tamaño de los liposomas se determinó usando un analizador de tamaño de partículas Nicomp Modelo CW 380 (Particle Sizing Systems, Santa Barbara, CA) como se describió previamente [18]. Los liposomas medidos fueron asociados con la cantidad apropiada de rFVIII mediante incubación a 37°C con agitación suave durante ~30 minutos. La PEGilación de la mezcla de proteína-liposoma se logró mediante la adición de la mezcla de proteína-liposoma a una película seca de DMPE- PEG20oo-Se tuvo cuidado de que el volumen de mezcla de proteína-liposoma añadida a la película PEG seca no produjera la formación de micelos de PEG. La incorporación de PEG fue confirmada mediante MALDI-TOF (no se muestran datos). El % molar final de PEG en la preparación fue de 4 mol % del lípido total. La proporción molar entre la proteína y el lípido se mantuvo en 1 : 10,000 para todos los experimentos. Para estimar la cantidad de proteína asociada con liposomas PEGilados, se separó proteína libre de la proteína asociada con liposoma PEGilado usando la técnica de centrifugación con gradiente de densidad dextrán discontinuo [19]. El porcentaje de proteína activa asociada se determinó mediante el análisis APTT de una etapa [20]. Se estimó que el porcentaje de asociación era de ~ 27.6 ± 9.6 % (+ Error Estándar de la Media (E.E.M), n =5). Las preparaciones se utilizaron inmediatamente después de la preparación.

Consideraciones teóricas para la incorporación de polietilen glicol (PEG) en liposomas : En este ejemplo, se incorporó PEG en los liposomas después de la asociación de la proteína sobre la superficie de los liposomas en lugar de incorporar el PEG durante la preparación de la pel ícula lípida. Se considera que este método de incorporación de PEG reducirá la posibilidad de que el PEG interfiera con la capacidad de la proteína de asociarse con liposomas como resultado de impedimentos estéricos. Creemos que la siguientes consideraciones teóricas son argumentos en contra de la posibilidad de que la presencia de proteína en la superficie de los liposomas comprometa la eficiencia de inserción del PEG. El diámetro medio de los liposomas utilizados en el estudio fue de 200 nm. Bajo el supuesto de que el espesor de la bicapa sea de 40 Á y el área ocupada por cada molécula de fosfolípido es de 70 A2, se estimó que la cantidad de vesículas/µmol de fosfolípido era de -1 .8 x 1 01 2 vesículas. Para los estudios de inmunización , se administró 2µg de proteína por animal y con base en el exceso molar de proteína con respecto a lípido utilizado (1 : 10,000), cada animal recibió -71 .4 nmoles de lípido. La estructura tridimensional de la membrana unida a FVI I I derivada por cristalografía electrónica reveló que los dominios FVI I I tienen un arreglo compacto en el cual el dominio C2 de la proteína interactúa con los fosfol ípidos [21 ]. Con base en la dimensión de la célula unitaria para el mapa bidimensional y el área superficial total de los liposomas de diámetro medio de 200 nm, estimamos que la cantidad máxima de moléculas de FVI I I que podrían estar empacadas en la superficie de los liposomas es - 2400. Sin embargo, dado que se proyectó que la cantidad máxima de las moléculas de proteína / vesícula sería de -33 con base en la proporción de proteína con respecto a lípido empleada en nuestros estudios, la estimación teórica anterior revela que la mayor parte de la superficie de los liposomas todavía está desocupada y está disponible para recubrimiento por PEG. Ejemplo 2 Este ejemplo describe las características de los liposomas preparados en el Ejemplo 1 . Espectroscopia por fluorescencia Se obtuvieron los espectros de emisión de rFVII I y rF VI 11 asociados con liposomas PEGilados usando un fluorómetro PTI (Quanta Master, Photon Technology International, Lawrenceville, NJ). Las muestras fueron excitadas a 280 nm y el espectro de emisión fue obtenido de 300-400 nm. Se usó una corrida con ancho de ranura de 4 tanto en la ruta de excitación como en la de emisión. La concentración de proteína fue de -4 µg/mL y se usó una cubeta con longitud de ruta variable para reducir al mínimo los efectos del filtro interior. Se investigaron los cambios estructurales terciarios en la proteína mediante espectroscopia por fluorescencia (Figura 1 ). El espectro de emisión de FVI II libre mostró un máximo de emisión de 333 nm. La proteína asociada con liposomas PEGilados presentó un cambio significativo azul en la emisión máxima a 325 nm y estuvo acompañado por un gran aumento en la intensidad (no se muestran datos). El cambio pronunciado azul en la emisión máxima sugiere la posibilidad de intercalación o encapsulación sustancial de dominios hidrofóbicos de rFVIII en la bicapa liposómica. Esto en contraste con los cambios modestos en el espectro de emisión que se observó después de la asociación de la proteína a los liposomas que carecen de PEG. En la ausencia de PEG, los datos solamente indicaron cambios conformacionales mínimos, y la mayoría de la proteína en la forma unida a la membrana estaba en la superficie de los liposomas. Creemos que el cambio en la longitud de onda es el resultado del cambio en la constante dieléctrica en el microambiente de los residuos de triptófano (Trp) que participan en la fijación a la membrana debido a la presencia de PEG en la superficie de los liposomas o a la accesibilidad reducida de las moléculas de solvente para los residuos de Trp debido al efecto estérico del PEG. Los cambios en la constante dieléctrica del solvente circundante han demostrado que influyen en el cambio de avivamiento de una fluorófora alterando la organización de las moléculas de solvente alrededor del estado excitado de la fluorófora [25]. Ejemplo 3 Este ejemplo describe la preparación de PS que contienen micelos. Se prepararon películas lípidas constituidas por dicaproil fosfatidilserina (DCPS) y dicaproil fosfatidiltioetanol (DCPSE) (proporción molar 97:3, lípido total 5 µmoles) a partir de una solución madre de cloroformo evaporando el solvente en un evaporador rotativo. Las películas fueron reconstituidas con 1 mL de amortiguador Tris (CaCI2 5 mM, Tris 25 mM y NaCI 300 mM , pH = 7) sometiéndolas a un vórtice para obtener soluciones lípidas 5mM. Se diluyó solución madre de rF VI 11 concentrada, con la solución lípida 5mM y se incubó a 37 °C durante 30 minutos. El enfoque de PEGilación es similar a la PEGilación de los liposomas preformados usando moléculas de PEG activadas. La PEGilación se logró activando una molécula de PEG activada (mPEG maleimida lineal o ramificada) para el grupo tiol presente en el grupo principal fosfolípido (DCPSE). Ejemplo 4 Este ejemplo describe la preparación de PS que contienen estructuras codeadas o cilindros. Se prepararon liposomas medidos de 100 nm o menos que contenían foafatidilserina cerebral (BPS) pura y dioleoil fosfatidiltioetanolamina (DOPSE) (proporción molar 99: 1 ) en un amortiguador Tris libre de Ca2+. Se generó el complejo de liposoma rFVI II incubando soluciones concentradas de rFVI I I en la presencia los liposomas medidos, durante 30 minutos a 37 °C. Se aumentó la viscosidad del complejo liposómico rFVII I añadiendo solución de dextrán (20% p/v) hasta lograr una concentración final de dextrán de 5 o 10% p/v. El crecimiento controlado de cilindros codeados se inicia añadiendo iones de Ca2+ en la solución (concentración final 5mM) e incubando la mezcla a menor temperatura durante 30 minutos. Se logró la PEGilación acoplando una molécula de PEG activada (mPEG maleimida lineal o ramificada) con el grupo tiol libre presente en el grupo principal fosfolípido (DOPSE). Además, la PEGilación de cilindros nano codeados se puede llevar a cabo diseñando un enlace covalente entre moléculas PEG activadas (éster N-hidroxisuccinimídico de ácidos carboxílicos PEG (PEG-NHS)) y grupo amino libre presente en el grupo principal BPS. La PEGilación directa de rFVI I I mediante el reactivo PEG-NHS es muy improbable, con base en una gran cantidad en exceso de grupos amino presentes en el grupo principal PS. Ejemplo 5 Este ejemplo describe la formación del complejo liposómico rFVII I con PEG mediante la tecnología con PEG activado. Se prepararon liposomas DMPC:BPS:dioleoilfosfatidiltioetanol (DOPSE) (proporción molar 70:25:5) como se describe más adelante. Las cantidades requeridas de DMPC, BPS y DOPSE se disolvieron en cloroformo. Se formó una capa lípida delgada en las paredes de un tubo de vidrio, eliminando el solvente en un evaporador rotativo Buchi-R200 (Fisher Scientific). Los liposomas fueron preparados mediante rehidratación de la película lípida con amortiguador Tris (TB 25mm Tris, NaCI 300 mM, CaCI2 5mM; pH =7.4) a 37°C. Los liposomas fueron extruidos ocho veces mediante membranas de policarbonato de 100 nm usando una extrusora de alta presión (Lipex Biomembranes, Inc.) a una presión de -1379 kPa (-200 psi). La distribución de tamaño de las partículas se vigiló usando un analizador de tamaño Nicomp modelo CW380 (Particle Sizing System). Preparación de proteína liposómica La asociación de la proteína con los liposomas preformados se logró incubando la proteína en la presencia de los liposomas a 37°C durante 30 minutos removiendo suavemente de manera ocasional. La proporción molar de proteína se mantuvo igual para toda la preparación (1 : 10,000). Se puede lograr la PEGilación diseñando un enlace covalente entre un grupo tiol libe presente en el grupo principal del lípido DOPSE y un derivado de PEG, activado. Este derivado puede ser representado por mPEG-maleimida o PEG maleimida ramificada. Otros derivados de PEG activados que apuntan a un grupo tiol libre son igualmente apropiados para formar un enlace covalente entre el liposoma y la fracción PEG. La ventaja de este método es que los grupos tiol están presentes con menor frecuencia en la superficie de las moléculas de proteína. Por ello, se espera que el gran exceso de lípidos (la proporción de proteína:lípido es de 1 : 10000, en donde 5% de los lípidos son DOPSE) reduzca la fijación de PEG activado al rFVII I y disminuya su actividad. Ejemplo 6 Este ejemplo describe estudios in vivo usando las composiciones descritas en el Ejemplo 1 . Se usó una colonia de ratones hemofílicos (con una deleción objetivo en el exón 16 del gen FVI I I) [22], cantidades iguales de ratones machos y hembras adultos, de 8 a 12 semanas de edad, dado que los estudios de las características de su respuesta inmunitaria al rFVI I I han demostrado ser comparables [23]. Se obtuvieron muestras de sangre mediante punción cardiaca y se añadieron en una proporción de 10:1 (v/v) al ácido-citrato-dextrosa (ACD, que contiene citrato de sodio 85 mM , D-glucosa 1 10 mM y ácido cítrico 71 mM). Se separó el plasma mediante centrifugación y se almacenaron muestras a -80 °C hasta su análisis. Se realizaron estudios de AU de acuerdo con los lineamientos del Comité para el cuidado y uso institucional de animales (Institutional Animal Care y Use Committee (IACUC)) en la Universidad en Buffalo.

La inmunización de ratones con FVIII inactivado genéticamente (n = 12) consistió en cuatro inyecciones subcutáneas (s.c.) de liposomas PEGilados con rFVI I I o rFVII I (2 µg) en intervalos semanales. Se obtuvieron muestras de sangre al final de las 6 semanas. Mediciones de anticuerpos Detección de Anticuerpos anti-rFVIII totales Se determinaron los títulos de anticuerpo anti-rFVM I mediante ELISA. Brevemente, placas de 96 receptáculos Nunc-Maxisorb fueron recubiertas con 50 µL de 2.5 µg/mL de rFVI I I en amortiguador carbonato (0.2M , pH=9.4) y se incubaron a 4 °C durante la noche. Luego se lavaron las placas 6 veces con 100 µL de regulador fosfato (PB; Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 1 .8 mM, NaCI 14 mM , KCI 2.7 mM) que contenía Tween 20 al 0.05% (PBT). Se bloquearon sitios de fijación de proteínas no específicas en la superficie adsorciva del plástico incubando 200 µL de amortiguador PB que contenía albúmina de suero bovina al 1 % (PBA), durante 2 horas a temperatura ambiente. Se lavaron las placas 6 veces con PBT y luego se les añadió 50 µL de diversas soluciones de muestras de plasma de ratón en PBA, y se incubaron a 37°C durante 1 hora. Se lavaron las placas 6 veces con PBT y se incubaron con 50 µL de dilución 1 : 1000 de Ig anti-ratón de cabra conjugado con fosfatasa alcalina en PBA, a temperatura ambiente durante 1 hora. Se lavaron las placas 6 veces con PBT y 100 µL de 1 mg/mL solución de fosfato de p-nitrofenilo en amortiguador dietanolamina (consistente en dietanolamina 1 M , MgCI2 0.5 mM). Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos y se extinguió la reacción añadiendo 100 µL de NaOH 3N . El producto de la reacción de fosfatasa alcalina se determinó mediante absorbencia a 405 nm usando un lector de placas Spectramax (Molecular Devices Corporation, Sunnyvale, CA). Los resultados de inmunogenicidad fueron expresados como sigue: se realizó regresión lineal sobre los valores de absorbencia obtenidos con anticuerpo anti-FVI II humano de IgG monoclonal de múrido, ESH8 que se fija al dominio C2. Se calculó la mitad de la diferencia entre la absorbencia máxima y mínima predicha como el factor específico para placa (PSF). Se usó una regresión lineal del gráfico de valores de absorbencia de diversas diluciones (1 : 100 hasta 1 :40,000) contra el log de la dilución para calcular la dilución que daba una densidad óptica igual al PSF. La dilución así obtenida se consideró el título de anticuerpo de la muestra. Detección de Anticuerpos inhibidores anti-rFVIII Se detectaron los anticuerpos inhibidores anti-rFVI I I usando la modificación Nijmegen del Análisis Bethesda [24]. Se midió la actividad residual de rFVII I usando el análisis APTT de una sola etapa [20]. Cada dilución se sometió a prueba por duplicado. Una unidad Bethesda (BU) es la actividad inhibidora que produce 50% inhibición de actividad de rFVI II. El punto de 50% de inhibición se determinó mediante regresión lineal de los puntos de datos que caen al menos dentro del rango de 20-80% de inhibición. Estudios de proliferación de células T Se inmunizó a ratones hemofílicos hembra, de 8-12 semanas de edad , usando dos inyecciones subcutáneas (s.c.) de rFVI I I o rFVII I liposómicos PEGilados (2 µg de proteína por inyección) en intervalos semanales. Los ratones de control no recibieron rFVI I I . Los animales fueron sacrificados tres días después de la segunda inyección, y se recolectó el bazo como una fuente de células T. Las células de bazo fueron vaciadas de células CD8+ usando perlas magnéticas recubiertas con un anticuerpo monoclonal anti-ratón de rata para el antígeno de membrana Lyt 2 (Dynal Biotech, Oslo, Noruega) expresado en células CD8, usando el procedimiento del fabricante. Las células restantes (2 x 105 células/ 200 µL) fueron cultivadas en placas de fondo plano de 96 receptáculos con rFVI I I (100 ng/receptáculo o 1000 ng/receptáculo) en medio de cultivo RPM I-1 640 completo, que contenía 1 0,000 U/mL de penicilina, 1 0 mg/mL de estreptomicina, piruvato de sodio 2.5 mM , L-Glutamina 4 mM , 2-mercaptoetanol 0.05 mM , 2 mg/mL de Polimixina B y suero de ratón hemofílico inactivado por calor al 0.5% . Se añadió un µCi/receptáculo de 3H-timidina (6.7 Ci/mmol) después de 72 h de cultivo a 37°C. Al final de 1 6 h, las células fueron cosechadas usando una recolectora Micromate Harvester (Packard , Meriden, CT) y se midió la incorporación de 3H-timidina usando un contador de destello y luminiscencia de microplacas TopCount™ (Packard Instrument Company, Meriden, CT). Los grupos de tratamiento estuvieron constituidos por 3 animales en réplica, y las células de cada ratón individual fueron sometidas a prueba por cuadruplicado para determinar la proliferación dependiente del antígeno. Los datos se reportan como un índice de estimulación (SI ), que es la proporción de la incorporación promedio de 3H-timidina en la presencia del antígeno con respecto a la incorporación promedio en la ausencia del antígeno. Este enfoque normalizó los datos de cada experimento y permite la comparación de experimentos llevados a cabo en momentos diferentes. Análisis de citocina Después de 72 h de incubación, se recolectaron los supernadantes de células T estimuladas con antígeno y se almacenaron a -70 °C hasta su análisis posterior. Se analizó el supernadante mediante ELISA de captura de anticuerpos (R&D systems, Minneapolis, MN). Se midió el I FN-? como una citocina Th 1 representativa y se midió la IL-10 como una citocina Th2 representativa. Estudios farmacocinéticos Veintisiete ratones hemofílicos machos (20-26g, 8-12 semanas de edad) recibieron 400 lU/kg de rFVI I I o rFVII I liposómicos PEGilados como una sola inyección i.v. en bolo en la vena del pene.

Se recolectaron muestras de sangre (-600 µL) a .08, 0.5, 1 , 2, 4, 8, 16, 24, 36 y 48 h después de la dosis mediante punción cardiaca (n = 2-3 ratones/punto de tiempo) y se le añadieron a ACD. Se separó el plasma y se almacenó a -70 °C hasta su análisis. Se analizaron las muestras de sangre para determinar la actividad de la proteína mediante el análisis cromogénico (Coamatic FVI I I , DiaPharma Group, West Chester, OH). Las actividades calculadas en cada punto de tiempo fueron utilizadas entonces para estimar los parámetros básicos farmacocinéticos mediante análisis no compartimental usando WinNonlin (Pharsight Corporation, Mountainview, CA). Análisis estadístico Se analizaron los datos mediante ANOVA usando la aplicación Analyst del SAS (SAS Institute Lie, Gary, NC) o Minitab (Minitab Inc. , State College, PA). Se usó la prueba de comparación múltiple de Dunnette post-hoc para detectar diferencias significativas (p<0.05).

Resultados En la Figura 2A se muestran los títulos de anticuerpo anti-rF VI 11 totales en la ausencia y en la presencia de liposomas PEGilados constituidos por DMPC y BPS. Los animales tratados con rFVII I liposómicos PEGilados mostraron un título de anticuerpo significativamente menor (1123.1 ± 189.5, + E.E.M ., n=12, valor p < 0.05) en comparación con los animales tratados con rFVI II (13, 166.7 ± 2042.2, ± E.E.M ., n=15). Estos resultados indican que la formación de anticuerpos se reduce en la presencia de liposomas PEGilados. Se detectaron los anticuerpos neutralizantes (es decir, anticuerpos específicos contra el Factor VII I), los cuales interfieren con la actividad de la proteína, usando el Análisis Bethesda. La figura 2B muestra los títulos de anticuerpo inhibidores, expresados en Unidades Bethesda (BU) después de los tratamientos con rFVI II y rFVI I I liposómicos PEGilados al final de las 6 semanas. Los datos indicaron que los anticuerpos neutralizantes fueron singificativamente menores en la presencia de liposomas PEGilados (73.65 ± 31 .25 BU/mL, ± E.E.M. , n=12, valor p < 0.05) en comparación con rFVI I I solo (689.7 ± 78.1 BU/mL, ± E. E.M., n=13). Estos resultados indicaron que liposomas PEGilados no sólo redujeron los títulos de anticuerpo anti-FVIII totales, sino que también disminuyeron los títulos de anticuerpos que inactivan la proteína. Para fines de comparación, los títulos de anticuerpo total e inhibidoras después de la administración de liposomas PC/PS no PEGilados también se muestran. Los datos indicaron que los títulos medios de anticuerpo total y anticuerpo inhibidor en la presencia de liposomas PEGilados fueron menores que los de los liposomas no PEGilados, si bien las diferencias no fueron diferentes estadísticamente (p > 0.05).

Para determinar si las células T específicas para FVI II fueron estimuladas in vivo después de la inmunización con rFVI I I liposómicos PEGilados, se evaluó la respuesta de proliferación de células T a la exposición al rFVIII in vitro. El índice de estimulación media de células de bazo aisladas de animales que recibieron tratamiento con rFVII I liposómicos PEGilados fue menor en comparación con animales que recibieron tratamiento con rFVI I I solo (Figura 3). Los datos sugieren posibles diferencias en los clones de células T que fueron activados para expansión clonal dependiendo de si los animales fueron expuestos a rFVII I en la presencia y en la ausencia de Liposomas que contienen PS PEGilados. Para determinar si la reducción en inmunogenicidad of rFVII I en la presencia de liposomas que contienen PS PEGilados fue un resultado de la secreción de IL-10 reducida, el análisis de citocina de células T estimuladas con antígeno se llevó a cabo después de la inmunización de animales con rFVIII libre o liposómico. Como se muestra en la Figura 4, el nivel de IL-10 medio secretado por las células T de animales a los que se les administró rFVI I I asociado con liposomas PEGilados fue menor que el nivel de los animales a los que se les suministró rFVIII solo. Se detectaron niveles insignificantes de I FN-? en el medio de cultivo para todos los grupos de tratamiento (no se muestran datos). Sobre todo, los datos sugieren que la reducción en inmunogenicidad del rFVI II administrado en la presencia de liposomas que contienen PS PEGilados puede ser mediada, en parte por la producción de IL-10 reducida. Adicionalmente, los datos sugieren que la reducción en inmunogenicidad no es el resultado de la polarización en la respuesta Th1 /Th2. Aún cuando no se pretende estar limitado por cualquier teoría particular, se cree que la inclusión de PS en los liposomas contribuye a la inmunomodulación. Considerando que la respuesta del anticuerpo al rFVIII es un proceso que depende de las células T, es posible que la reducción en la inmunogenicidad del rF VI 11 en la presencia de liposomas que contienen PS PEGilados puede ser el resultado de la represión de clones de células T específicos para rFVI I I in vivo. Además de la reducción en la inmunogenicidad del rFVI I I, la asociación del rFVI I I con PS que contienen liposomas también puede ampliar el tiempo de circulación del rFVI II in vivo y por ello reduce la frecuencia de administración de la proteína requerida para controlar la hemofilia A. Estudios farmacocinéticos (PK) sugieren que la permanencia en circulación (t1 2) de los rFVI I I liposómicos PEGilados aumentó en - 35% con relación al rFVII I solo (Tabla 1 ). La exposición sistémica entre los tratamientos fue similar (Figura 5 y Tabla 2). Tabla 2 Resumen de parámetros PK obtenidos luego de análisis no compartimental *, A 36 horas después de la administración, todos los animales tratados con complejo rFVI I I no PEGilado, tuvieron niveles de rFVI I I en plasma por debajo del límite de detección. Para la estimación del parámetro PK, los niveles en plasma del rFVI I I a las 36 horas se fijó igual al límite de detección (0.035 l U/mL). El AUC el área bajo la curva; Vss es el volumen de distribución en estado estable, y CL es la eliminación . Ejemplo 6 Este ejemplo proporciona un análisis comparativo de liposomas asociados con PEG preparados con o sin fosfolípidos cargados negativamente. Los títulos inhibidores se determinaron como se describe en el Ejemplo 5 para el rFVI I I libre, el FVI I I asociado con los liposomas preparados con PS o incorporado en ellos, y rFVI I I asociado con liposomas preparados sin PS o incorporado en ellos. Como se muestra en la Figura 6, los títulos de anticuerpo inhibidores de rFVI II asociado con liposomas preparados con PS o incorporados en ellos, son significativamente menores que los títulos para rFVI I I libre y para rFVI II asociado con liposomas preparados sin PS o incorporados en ellos. Las personas hábiles en la técnica pueden optimizar preparaciones individuales. Además, la observación de que la inmunogenicidad de PS que contienen rFVI II liposómicos PEGilados es mucho menor que el rFVI I I solo representa un avance significativo hacia el desarrollo de formulaciones que son menos inmunógenos.

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Claims (10)

REIVINDICACIONES

1 . Una composición farmacéutica que contiene liposomas que contienen: a. fosfatidil etanolamina (PE) derivado con polietilen glicol (PEG), b. un lípido anfifático seleccionado del grupo que consiste en fosfatidil colina, fosfatidilglicerol, y combinaciones de ellos, y opcionalmente, PE. c. un lípido cargado negativamente seleccionado del grupo que consiste en fosfatidilserina (PS), ácido fosfatídico (PA) y combinaciones de ellos; y d. Factor VII I, caracterizado porque la inmunogenicidad del Factor VI II es reducida con respecto a la inmunogenicidad de Factor VI I I libre.

2. La composición farmacéutica de la reivindicación 1 , caracterizada además porque la proporción del lípido anfifático con respecto al lípido cargado negativamente está entre 50:50 y 90: 10, y la cantidad de PE derivados de PEG es desde 1 % molar hasta 15 % molar.

3. La composición farmacéutica de la reivindicación 1 , caracterizada además porque el lípido anfifático es PC y el lípido cargado negativamente es PS.

4. La composición farmacéutica de la reivindicación 2, caracterizada además porque la proporción de PC con respecto a PS es 70:30.

5. La composición farmacéutica de la reivindicación 1 , caracterizada además porque el lípido anfifático es PC y PE y el lípido cargado negativamente es PS y la proporción de PC:PS:PE es de 80: 10: 10 o 70: 10:20.

6. La composición farmacéutica de la reivindicación 2, caracterizada además porque la proporción de PC:PS:PE derivado con PEG es 70:30: 15.

7. La composición farmacéutica de la reivindicación 1 , caracterizada además porque los liposomas además contienen PE que no está derivado con PEG en la cantidad de 1 -10%.

8. La composición farmacéutica de la reivindicación 1 , caracterizada además porque las dos cadenas acilo de los fosfolípidos tienen entre 12 y 22 átomos de carbono en cada cadena, caracterizada además porque las dos cadenas acilo tienen la misma o diferente cantidad de átomos de carbono.

9. La composición farmacéutica de la reivindicación 8, caracterizada además porque la cadena acilo se selecciona del grupo que consiste en ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico.

10. La composición farmacéutica de la reivindicación 1 , que además contiene 0.5-30 % molar de colesterol. 1 1 . La composición farmacéutica de la reivindicación 1 , caracterizada además porque hay un separador de 6-12 átomos de carbono entre las fracciones PE y PEG del PE derivado de PEG. 1 2. Un método para elaborar la composición de la reivindicación 1 que comprende los pasos de: a) preparar liposomas que contienen un l ípido anfifático y un l ípido cargado negativamente, b) añadir proteína de Factor VI I I a los liposomas para hacer que la proteína se asocie con los liposomas o se incorpore a ellos; y c) añadir lípido anfifático derivado con PEG a b) de tal forma que de 1 a 1 5 por ciento molar de PEG forme complejo con la proteína asociada a los liposomas o incorporada en ellos. 1 3. El método de la reivindicación 12, caracterizado además porque el lípido anfifático es PC, el lípido cargado negativamente es PS y el PEG es derivado en PE. 14. El método de la reivindicación 1 2, caracterizado además porque la proporción de PC:PS:PE es de 70:30: 15. 1 5. El método de la reivindicación 12, caracterizado además porque el PE se selecciona del grupo que consiste en DMPE, DPPE y DSPE . 16. El método de la reivindicación 1 2, caracterizado además porque los liposomas preparados en el paso a contienen un l ípido anfifático, un lípido cargado negativamente y colesterol. 1 7. Un método para elaborar la composición farmacéutica de la reivindicación 1 , que incluye: a) preparar liposomas que contienen un l ípido cargado negativamente, un lípido anfifático y PE derivado con PEG; y b) añadir Factor VI I I , para formar liposomas de tal forma que la inmunogenicidad de Factor VI I I se reduzca por encima de la inmunogenicidad del Factor VI I I libre. 1 8. El método de la reivindicación 1 7, caracterizado además porque el lípido cargado negativamente es PS y el lípido anfifático es PC. 1 9. El método de la reivindicación 1 7, caracterizado además porque el PE de los PE derivados de PEG se selecciona del grupo que consiste en DMPE, DPPE y DSPE. 20. El método de la reivindicación 1 7, caracterizado además porque los liposomas en el paso a, además contienen colesterol . 21 . Un método para elaborar la composición farmacéutica de la reivindicación 1 , que incluye: a) Preparar liposomas que contienen PC, PS y PE activado; b) añadir Factor VII I ; c) añadir PEG activado de tal forma que el PEG activado se una al PE activado 22. El método de la reivindicación 21 , caracterizado además porque un brazo separador que incluye 6-12 átomos de carbono está unido al PEG o PE. 23. Una composición farmacéutica que contiene micelos y/o estructuras codeadas que incluye: a) PE derivado con PEG, b) un lípido cargado negativamente seleccionado del grupo que consiste en PS, PA y combinaciones de ellos; c) opcionalmente un lípido anfifático seleccionado del grupo que consiste en PC, PE, PG y combinaciones de ellos, y d) Factor VIII , la cantidad de PE derivados de PEG es de 1 -15 % molar, en donde la inmunogenicidad del Factor VII I es reducida con respecto a la inmunogenicidad del Factor Vl ll l libre. 24. Un método para reducir la inmunogenicidad de una proteína de Factor VI I I que comprende los pasos de: preparar una formulación en donde la proteína está asociada con estructuras lípidas que incluyen liposomas, micelos y estructuras cocleares, o incorporada en ellas, en donde las estructuras lípidas contienen un lípido cargado negativamente y PE derivados de PEG; administrar la formulación a un individuo que sufre de un trastorno de pérdida de sangre, caracterizado además porque la inmunogenicidad de la proteína administrada es menor que la inmunogenicidad de la proteína libre de Factor VI II y caracterizado además porque la permanencia en circulación de la proteína administrada es más que la permanencia en circulación de proteína libre de Factor VII I .