BRPI0409424B1

BRPI0409424B1 - Composição farmacêutica para administração parenteral, e, usos de uma partícula coloidal e de partículas coloidais e uma proteína ou um polipeptídeo

Info

Publication number: BRPI0409424B1
Application number: BRPI0409424-7A
Authority: BR
Inventors: Baru Moshe; Carmel-Goren Lea
Original assignee: Cantab Biopharmaceuticals Patents Limited
Priority date: 2003-04-15
Filing date: 2004-04-15
Publication date: 2018-05-02
Also published as: US20070167359A1; MXPA05010926A; CN1774281A; PT1633440E; ATE395101T1; EP1633440A1; CA2522179C; AU2004229253B2; PL1633440T3; DK1633440T3; JP2006523683A; WO2004091723A1; DE602004013769D1; BRPI0409424B8; AU2004229253A1; CN1774281B; ES2307009T3; BRPI0409424A; EP1633440B1; CA2522179A1

Abstract

"composição farmacêutica para admimstração parenteral, método de tratamento de um paciente sofrendo de hemofilia, uso de uma partícula coloidal, e, método de tratamento de um paciente sofrendo de uma doença". uma composição farmacêutica para administração parenteral compreendendo uma quantidade terapeuticamente efetiva de uma proteína ou um polipeptídeo e partículas coloidais. as partículas compreendem aproximadamente 1-20 porcento em mol de um lipídeo anfipático derivado com um polímero hidrofílico biocompatível. a proteína ou o polipeptídeo é selecionada(o) do grupo consistindo de: (a) proteínas ou polipeptídeos capazes de se ligar externamente nas citadas partículas coloidais; (b) proteínas ou polipeptídeos capazes de se ligar em polímeros de famílias de poli(alquiléter), poli(ácido lático) e poli(ácido glicólico); e (c) proteínas ou polipeptídeos que incluem uma seqüência de consenso de s/t-x/i/v-i/v/q/ss/t-x-x-x-e, na qual x pode ser qualquer aminoácido, e s, t, l, i, e, e q possuem os significados padrão. a proteína ou o polipeptídeo não é fator viii (fviii) e não está encapsulada(o) nas partículas coloidais.

Description

(54) Título: COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA PARA ADMINISTRAÇÃO PARENTERAL, E, USOS DE UMA PARTÍCULA COLOIDAL E DE PARTÍCULAS COLOIDAIS E UMA PROTEÍNA OU UM POLIPEPTÍDEO (73) Titular: CANTAB BIOPHARMACEUTICALS PATENTS LIMITED, Pessoa Jurídica. Endereço: PALAZZO PIETRO STIGES, 103 STRAIT STREET, VALLETTA, VLT1436, MALTA, MALTA(MT), Maltesa (72) Inventor: MOSHE BARU; LEA CARMEL-GOREN

Código de Controle: 22635BF19AE0D044 E8C675342693CFE6

Prazo de Validade: 10 (dez) anos contados a partir de 02/05/2018, observadas as condições legais

Expedida em: 02/05/2018

Assinado digitalmente por:

Júlio César Castelo Branco Reis Moreira

Diretor de Patente “COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA PARA ADMINISTRAÇÃO PARENTERAL, E, USOS DE UMA PARTÍCULA COLOIDAL E DE PARTÍCULAS COLOIDAIS E UMA PROTEÍNA OU UM POLIPEPTÍDEO”

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a uma formulação farmacêutica para as estabilidade, eficácia e meia-vida aumentadas de várias proteínas e de vários polipeptídeos.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Hemofilia A é um dos distúrbios de coagulação herdados freqüentemente mais ocorrentes. Pacientes com hemofilia A são propensos a hemorragias freqüentes como um resultado de uma ou mais más funções do sistema de coagulação. Uma das causas da hemofilia é uma carência de concentrados de Fator VIII. Contudo, em cerca de 15% dos pacientes a ocorrência resulta de anticorpos neutralizadores de Fator VIII, os denominados inibidores, de acordo com o qual uma terapia com concentrados de Fator VIII é dificilmente possível.

Têm sido descritas duas abordagens básicas na literatura para proteger FVIII da inativação por inibidores.

WO/80/01456 de Hemker descreve uma composição farmacêutica adequada para administração oral compreendendo FVIII incorporado dentro de lipossomos de 0,5-1,0 mícrons formados de fosfolipídios. Os fosfolipídios possuem uma carga líquida, e o FVIII está incorporado entre as camadas do lipossomo. É reivindicado que os níveis de FVIII no plasma permaneceram acima de cerca de 5% do valor normal por um período de 50 horas.

US 4.348.384 de Horikoshi enuncia que uma composição como descrita em Hemker foi preparada, mas não deu resultados satisfatórios.

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Portanto, Horikoshi incorpora um inibidor de protease no lipossoma juntamente com FVIÍI, com o propósito de protegê-lo da proteólise. 3% Dos níveis plásmicos normais de FVIII foram obtidos durante um período de 6 horas.

US 5.013.556 de Woodle descreve uma composição de lipossomo para uso na liberação de várias drogas vía a corrente sanguínea. O íípossomo contém entre 1 porcento em mol e 20 porcento em mol de um lipideo anfipático derivado com um poli(alquil-éter). Aqui também, o composto de droga esta aprisionado dentro do lipossomo. As composições de lipossomo estão comercialmente disponíveis sob o nome comercial de vesículas Stealth® (SÜV’s, veiculas unilamelares pequenas compreendidas de fosfolipídio e polietileno glicol (PEG) covalentemente ligado no fosfolipídio).

Um outro problema com esta abordagem é que os lipossomos possuindo um diâmetro grande possuem uma meia-vída curta. Portanto, os lipossomos têm que ser diminuídos em tamanho sob pressão alta, o que pode afetar as atividades de proteína como em fatores de coagulação V e VIII.

Em uma segunda abordagem, Barrowcliffe, T. W., et al. (1983) J. Lab. Clin. Med. 101:34-43 ensinam que misturação de FVIII com fosfolipídio extraído de cérebro animal e/ou humano confere proteção significativa ao FVIII in vitro. Nesta abordagem, o fosfolipídio está ligado em FVIÍI em vez de encapsulado. Kemball-Cook, G. e Barrowcliffe, T. W. (1992) Thromb. Res. 67:57-71, ensinam que uma superfície de fosfolipídio negativamente carregada é necessária para ligação de FVIII. Foi verificado que ácido fosfatídico e fosfatidil-serina negatívamente carregados são elevadamente ativos na ligação de FVIII, enquanto que fosfatidilcolina foi inativa. Contudo, fosfolípídios negativamente carregados são tóxicos, e aqueles derivados de tecido cerebral podem trazer agentes patogênicos.

EP 689.428 descreve uma composição de lipossomo compreendendo lipossomos possuindo uma camada de superfície externa de

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.! <.....‘ cadeias poliméricas hidrofílicas. Uma molécula efetora de polissacarídeo ou polípeptídeo é covalentemente ligada nas extremidades distais das cadeias poliméricas pela ativação da âncora lipídica antes da acoplamento do efetor.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Um objetivo da presente invenção é proporcionar uma composição farmacêutica compreendendo uma proteína ou um polípeptídeo para tratamento terapêutico.

* Um outro objetivo da presente invenção é proporcionar uma proteína ou um polípeptídeo em uma forma possuindo uma meia-vida prolongada na corrente sanguínea.

Ainda outro objetivo da presente invenção é proporcionar um método para tratar pacientes sofrendo de distúrbios de coagulação sanguínea, particularmente hemofilia.

Em um aspecto da invenção, é proporcionada uma composição 15 farmacêutica para administração parenteral compreendendo uma quantidade terapeuticamente efetiva de uma proteína ou um polípeptídeo e partículas coloidais. As partículas compreendem aproximadamente 1-20 porcento em mol de um lipídeo anfipático derivado com um polímero hidrofílico biocompatível, na qual a citada proteína ou o citado polípeptídeo é selecionada(o) do grupo consistindo de: (a) proteínas ou polipeptídeos capazes de se ligar externamente nas citadas partículas coloidais; (b) proteínas ou polipeptídeos capazes de se ligar em polímeros de famílias de poli(alquiléter), poli(ácido lático) e poli(ácido glicólico); e (c) proteínas ou polipeptídeos que incluem uma seqüência de consenso de S/T-X/I/V-I/V/Q/S25 S/T-X-X-E, na qual X pode ser qualquer aminoácido, e S, T, L, I, E, e Q possuem os significados padrão. A proteína ou o polípeptídeo não está encapsulada(o) nas citadas partículas coloidais.

Em uma modalidade preferida, as partículas coloidais são substancialmente neutras e o polímero transporta substancialmente nenhuma

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* ik¢- 4 ffi ^!-í «» ííf r* carga líquida. No presente relatório descritivo, os termos substancialmente neutras e substancialmente nenhuma carga líquida significam não positiva nem negativamente carregado. Contudo, uma carga medida muito baixa de zero dentro do erro experimental está incluída dentro do significado dos termos acima.

A presente invenção baseia-se na descoberta inesperada e surpreendente de que lipossomos contendo lipídeos anfipáticos derivados com um polímero hidrofílico biocompatível podem ser usados para ligar proteínas ou polípeptídeo, intensificar seus parâmetros farmacocinéticos (meia-vida e área sob a curva) e protegê-los de inibidores na corrente sanguínea. Isto proporciona uma vantagem significativa sobre as composições da arte anterior, visto que lipídeos anfipáticos usados são sintéticos e não-tóxicos, e podem ser portanto utilizados in vivo para tratamento terapêutico. Ainda mais, o lipossomo não encapsula as proteínas ou os polipeptídeos de modo que lipossomos de tamanho menor podem ser empregados os quais possuem uma meia-vida mais longa in vivo, porque não são removidos pelo sistema reticuloendotelial (RES) e a atividade das proteínas ou dos polipeptídeos formuladas(os) não é prejudicada (atividade total verificada in vitro e imediatamente após injeção in vivo). Como será descrito abaixo com mais detalhe, as proteínas ou os polipeptídeos interagem não-covalentemente com as cadeias poliméricas sobre a superfície externa dos lipossomos, e nenhuma reação química é realizada para ativar as cadeias poliméricas, diferentemente da composição descrita em EP 689.428.

O termo proteínas ou polipeptídeos capazes de se ligar externamente nas citadas partículas coloidais inclui proteínas tais como fator Vila (FVIIa), fator V (FV), fator IX (FIX) e fator X (FX), fator estimulante de crescimento de granulócito (G-SCF), fator estimulante de colônia de macrófago / granulócito (GM-CSF), Interferon-γ e Peptídeo 1 semelhante a Glucagon (GLP-1), Interferon-γ e Peptídeo 1 semelhante a

Glucagon (GLP-1), e um copolímero (acetato de glatiramer, Teiva, Israel) composto de repetições de 4 aminoácidos (L-ala, L-glu, L-lys e L-tyr). A identidade destas proteínas pode ser verificada empiricamente como é sabido pelo homem experiente na arte.

A composição farmacêutica da invenção pode ser usada para tratar várias doenças, como é sabido pelo homem experiente na arte. Por exemplo, uma composição compreendendo acetato de glatiramer pode ser utilizada para proteger as células do sistema nervoso central (SNC) da toxidade de glutamato e para tratar lesão ou doença causada ou exacerbada pela toxicidade de glutamato. A composição também pode ser usada para tratar esclerose múltipla, neuropatia diabética, demência senil, mal de Alzheimer, Mal de Parkinson, paralisia de nervo facial (de Bell), glaucoma, coréia de Huntington, esclerose lateral amiotrófica, estado epiléptico, neuropatia óptica não-arterial, ou deficiência de vitamina, como descrito no

Pedido de Patente U.S. de No. 20020037848.

O termo proteínas ou polipeptídeos capazes de se ligar em polímeros de famílias de poli(alquil-éter), poli(ácido lático) e poli(ácido glicólico) incluem proteínas e pobpeptídeos que se ligam em polímeros de famílias de pob(alquil-éter), pob(ácido lático) e poli(ácido gbcólico) ou seus derivados por qualquer um mecanismo não-covalente, tal como interações iônicas, interações hidrofóbicas, ligações de hidrogênio e atrações de Van der Waals (Arakawa, T. e Timasheff, S. N. (1985) Biochemistry 24:6756-6762; Lee, J. C. e Lee, L. L. Y. (1981) J. Biol. Chem. 226:625-631). Um exemplo preferido de um tal polímero é pobetileno gbcol (PEG).

O termo quantidade terapeuticamente efetiva é para ser entendido como se referindo a uma quantidade de proteína ou de pobpeptídeo que resulta em um nível de proteína ou de pobpeptídeo na corrente sanguínea possuindo um efeito terapêutico desejado. Uma tal quantidade pode ser experimentalmente determinada pela administração de composições

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compreendendo quantidades diferentes da proteína ou do poiipeptídeo e mensuração do nível no sangue em vários tempos após a administração.

O lipídeo anfipático usado para preparar as partículas coloidais pode ser obtido de fontes quer naturais quer sintéticas. Lipídeos mais preferidos incluem fosfolipídios tais como fosfatidilcolina e fosfatidiletanolamina, e lipopolímeros não carregados ligados em carbamato tal como aminopropanodiol diestearoíla (DS). O propósito do polímero hidrofílico biocompatível é estabilizar estericamente as SUVs, prevenindo assim a fusão das vesículas in vitro, e permitindo que as vesículas escapem da adsorção pelo RES in vivo. O polímero preferivelmente possuirá um peso molecular de entre cerca de 500 daltons e cerca de 5.000 dal tons, mais preferivelmente de aproximadamente 2.000 daltons.

As partículas coloidais preferivelmente possuirão um diâmetro de partícula médio de entre cerca de 0,03 mícrons e cerca de 0,4 mícrons, mais preferivelmente de cerca de 0,1 mícrons. Isto é para aumentar seu tempo de circulação in vivo e prevenir sua adsorção pelo RES. O lipídeo anfipático compreende aproximadamente 0,5% em mol a cerca de 20% em mol das partículas, preferivelmente aproximadamente 1-6%, mais preferivelmente 3%.

Uma variedade de reações de copulação conhecidas pode ser usada para preparar os lipídeos formadores de vesícula com polímeros hidrofílicos. Por exemplo, um polímero (tal como PEG) pode ser derivado em um lipídeo tal como fosfatidiletanolamina (PE) por meio de um grupo de cloreto cianúrico. Altemativamente, um PEG bloqueado pode ser ativado com um reagente de acoplamento carbonil-diimidazol, para formar um composto de imidazol ativado. Ura composto ligado em carbamato pode ser preparado pela reação da hidroxila terminal de MPEG (metóxiPEG) com cloroformíato de p-nitro-fenila para dar um carbonato de p-nitro-fenila. Este produto é então reagido com l-amino-2,3-propanodiol para dar o carbamato intermediário. Os grupos hidroxila do diol são acilados para dar o produto final. Uma síntese

semelhante, usando glicerol no lugar de l-amino-2,3-propanodiol, pode ser empregada para produzir um produto ligado em carbamato, como descrito em WO 01/05873. Outras reações são bem conhecidas e são descritas, por exemplo, na Patente U.S. 5.013.556 acima mencionada, cujo conteúdo é aqui incorporada como referência. j f

A composição da invenção pode ser administrada por injeção, I t

preferivelmente iv, sc ou im. As composições da arte anterior foram &

intencionadas apenas para uso oral, devido aos efeitos colaterais causados durante a injeção pela composição de lipossomo. A composição da invenção, ;

I por outro lado, é atóxica por injeção, aparentemente devido ao tamanho J pequeno e à falta de fosfolipídios tóxicos. Estudos de toxicologia de 1 lipossomos PEGuilados e FVIII em ratos têm sido realizados - nenhuma j toxicidade foi verificada em doses de 500 unidades/kg. Quantidades de até 0,5 1 mg/kg de peso corporal de partículas coloidais de acordo com a invenção têm f sido injetadas sem sintomas tóxicos detectáveis. Embora a forma livre das j

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proteínas e dos polipeptídeos usados na invenção possua uma meia-vida curta no sistema vascular, é esperado que a administração deles na composição da invenção aumente sua meia-vida em pelo menos 1,5 vezes. É esperado que a composição da invenção seja efetiva em tratamento profilático e de imediato de pacientes. {

Em outro aspecto da invenção, tem sido verificado que é uma | sequência de consenso de 8 aminoácidos localizados dentro das proteínas que | se liga nos lipossomos da invenção mas está ausente nas proteínas que não se | ligam nos lipossomos. Esta seqüência de consenso é S/T-X/I/V-I/V/Q/S-S/T- |

X-X-E, na qual X pode ser qualquer aminoácido, e S, T, L, I, E, E e Q / i

possuem os significados padrão.

Em outro aspecto da invenção, tem sido verificado que injeção / de lipossomos PEGuilados separadamente da injeção de proteína aumenta a í meia-vida e a eficácia de longa duração da proteína. I

* ΙΚ·

Em um outro aspecto da invenção, colesterol é suplementado à composição farmacêutica.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Com o objetivo de entender a invenção e de ver como ela pode 5 ser realizada na prática, uma modalidade preferida será agora descrita, por meio de exemplo não-limitante, com referência aos desenhos acompanhantes, nos quais:

Fig. 1 ilustra uma interação em tempo real de lipossomas

PEGuilados em FVIII imobilizado, a, lipossomos PEGuilados, mas não 10 lipossomos POPC de controle (PC) e lipossomos POPC:DSPE (PC:PE), se j ligam em rFVIII imobilizado, b, Lipossomos PEGuilados se ligam em rFVIII j imobilizado (FVIII) mas não em HSA imobilizada, c, Lipossomos 1

PEGuilados se ligam em rFVIII imobilizado na ausência ou na presença ( (Inibidores) de um soro diluído (xlOO) de um paciente com hemofilia A que j desenvolve anticorpos anti-FVIII (título de 20 unidades Bethesda/mL). u

Resposta é indicada em Unidades de Ressonância (RU). Resposta em a-c é !corrigida para ligação não-específica em canal revestido com HSA, que foi menor do que interação em tempo real de 5% dos lipossomos PEGuilados em canais revestidos com FVIII imobilizado. I

Fig. 2. Interação em tempo real de lipossomos PEGuilados em

FIX imobilizado, a, Lipossomos PEGuilados se ligam em FIX imobilizado mas não em HSA imobilizada, b, Lipossomos PEGuilados, mas não lipossomos POPC de controle, se ligam em FIX imobilizado. Resposta é indicada em Unidades de Ressonância (RU). Resposta é corrigida para ligação não-específica em canal revestido com HSA, que foi menor do que interação em tempo real de 5% dos lipossomos PEGuilados em FIX imobilizado em relação à ligação em canais revestidos com FIX.

Fig. 3. Interação em tempo real de lipossomos PEGuilados em G-CSF imobilizado, a, Lipossomos PEGuilados se ligam em G-CSF 'WS!· W ί/9 ·ί·^:, ΐ· 1'Υ '-f f ·^;ΐ^:ί> <<.‘ .:? Φ rj- ,_;;ΕΪ.·,™, .......

ΕΑΑ / imobilizado mas não em HSA imobilizada, b, Lipossomos PEGuilados, mas não lipossomos POPC de controle, se ligam em G-CSF imobilizado. Resposta é corrigida para ligação não-específica em canal revestido com HSA, que foi menor do que interação em tempo real de 5% dos lipossomos PEGuilados em

G-CSF imobilizado em relação à ligação em canais revestidos com G-CSF.

Fig. 4. Interação em tempo real de lipossomos PEGuilados em

GM-CSF imobilizado, a, Lipossomos PEGuilados se ligam em GM-CSF imobilizado mas não em HSA imobilizada, b, Lipossomos PEGuilados, mas não lipossomos POPC de controle, se ligam em GM-CSF imobilizado.

Resposta é corrigida para ligação não-específica em canal revestido com

HSA, que foi menor do que interação em tempo real de 5% dos lipossomos Í PEGuilados em GM-CSF imobilizado em relação à ligação em canais revestidos com GM-CSF.

Fig. 5. Interação em tempo real de lipossomos PEGuilados em

Interferon-γ imobilizado, a, Lipossomos PEGuilados se ligam em IFN-γ ί imobilizado mas não em HSA imobilizada, b, Lipossomos PEGuilados, mas não lipossomos POPC de controle, se ligam em IFN-γ imobilizado. Resposta j é corrigida para ligação não-específica em canal revestido com HSA, que foi menor do que interação em tempo real de 5% dos lipossomos PEGuilados em } 20 IFN-γ imobilizado em relação à ligação em canais revestidos com IFN-γ.

Fig. 6. Interação em tempo real de lipossomos PEGuilados em

GLP-1 imobilizado, a, Lipossomos PEGuilados se ligam em GLP-1 imobilizado mas não em HSA imobilizada, b, Lipossomos PEGuilados, mas f não lipossomos POPC de controle, se ligam em GLP-1 imobilizado. Resposta é corrigida para ligação não-específica em canal revestido com HSA, que foi i menor do que interação em tempo real de 5% dos lipossomos PEGuilados em

GLP-1 imobilizado em relação à ligação em canais revestidos com GLP-1.

I Fig. 7. Lipossomos PEGuilados se ligam em FIX imobilizado na ausência ou presença (Anticorpos) de um anticorpos policlonais de coelho

anti-FX humano diluídos (xlO) (Sigma).

Fig. 8. Sítios de ligação de FVIII e seqüência de consenso para lipossomos PEGuilados. a, Seqüência de consenso para ligar lipossomos PEGuilados em várias proteínas. Aminoácidos conservados são mostrados em vermelho enquanto que aminoácidos não conservados são mostrados em azul. b, Estrutura de domínio de FVIII Humano. Estrutura de domínio discreto de FVIII humano como deduzida de sua estrutura primária. Sítios de ligação de lipossomo estão representados como quadrados pretos. Setas vermelhas indicadas com T representam sítios de ativação de trombina. c, Ligação de lipossomos PEGuilados ou lipossomos POPC (PC) em um peptídeo derivado de seqüência de FVIII (1783-1796 aminoácidos) imobilizado em uma pastilha sensora CM5. Resposta é indicada em Unidades de Ressonância (UR).

Fig. 9. Interação em tempo real de lipossomos PEGuilados em acetato de glatiramer imobilizado, a, Lipossomos PEGuilados se ligam em acetato de glatiramer imobilizado mas não em HSA imobilizada, b, Lipossomos PEGuilados, mas não lipossomos POPC de controle, se ligam em acetato de glatiramer imobilizado. Resposta é corrigida para bgação não-específica em canal revestido com HSA, que foi menor do que interação em tempo real de 5% dos bpossomos PEGuilados em acetato de glatiramer imobibzado em relação à bgação em canais revestidos com acetato de glatiramer.

Fig. 10. Sobrevivência de camundongos hemofílicos após cortes na cauda. Plotagens de Kaplan-Meierb são mostradas para camundongos hemofílicos injetados com FVIII (Kogenate-FS, Bayer) ou FVIII e bpossomos PEGuilados (injetados uma hora mais tarde). Anábse estatística de teste T indica diferenças estatisticamente significativas entre os grupos (P<0,05).

Fig. 11. Interação em tempo real de bpossomos PEGuilados compostos de POPC:DSPE-PEG 2000 (bpídeos de Genzyme Pharmaceuticals, Liestal, Suíça) com razão molar de 97:3, respectivamente, e

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,ü ΐ >» « «ii - i» · * ' '* * * * : : : “** .»/ : l.- * lipossomos PEGuilados compostos de POPC:DS-c-PEG 2000 (lipídeos de Genzyme Pharmaceuticals, Liestal, Suíça) com razão molar de 97:3, respectivamente, em FVIII imobilizado.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO 5 1. Exemplos 1»8

1,1 Materiais & Métodos

Preparação de lipossomo. Lipossomos compostos de palmitoil-oleoil-fosfatidilcolina (POPC) e diestearoil-fosfatidiletanolaminametil-polietileno glicol 2000 (DSPE-PEG 2000) (Genzyme Pharmaceuticals,

Liestal, Suíça) (razão molar de 97:3, respectivamente), POPC e diestearoilfosfatidiletanolamina (DSPE) (Aventi Polar Lipids, Alabaster, AL, USA) (razão molar de 97:3, respectivamente) foram preparados como segue: lipídeos foram dissolvidos para 10% p/v em terc-butanol (Reidel-de-Haen, Seelze, Alemanha), congelados e a solução foi liofilizada. O pó lipídico seco resultante foi ressuspenso para 2-13% (p/v) em um tampão de citrato de sódio 50 mM, pH 7,0, para formar lipossomos. Os lipossomos foram filtrados usando aparelhagem extrusora LiposoFast™-100 (Aventin Inc., Ottawa, Canadá) através de filtros de policarbonato de 1,2 pm, 0,2 pm, 0,1 pm e 0,05 pm em tamanho (Poetics Corp., Livermore, CA, USA) para formar lipossomos no tamanho de 80-110 nm. A solução de lipossomo foi então passada através de um filtro esterilizador de acetato de celulose de 0,2 pm (Sterivex™, Millipore Corporation, Bedford, MA, USA) e armazenada a 28°C.

Interações em tempo real -Análise de Ressonância de

Plasmon de Superfície. Estudos de ligação foram realizados usando um instrumento biossensor Biacore™ 2000 (Biacore AB, Uppsala, Suécia). As seguintes proteínas foram imobilizadas em uma pastilha de sensor-CM5 (Biacore AB, Uppsala, Suécia) a 1.500 RU (~1,5 ng/mm²), pelo kit de acoplamento de amina como prescrito pelo fornecedor: FVIII (Kogenate-FS,

Bayer, Berkley, CA, USA) FIX (Benefix, Genetics Institute, Cambridge, MA, USA), G-CSF, GM-CSF, IFN-γ, Eritropoietina, Hormônio de Crescimento Humano, Interferon-alfa 2a, Interferon-alfa 2b (ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., Nes Ziona, Israel), GLP-1, Insulina (Sigma), acetato de glatiramer (Teva

Pharm, Israel), IgG e HSA (Omrix, Tel-Aviv, Israel). Análise de SPR foi avaliada em tampão de citrato de sódio 50 mM (pH 7,0) a 25°C com uma vazão de fluxo de 10 gL/min por 4 min usando quer lipossomos PEGuilados quer lipossomos de controle em uma concentração final de 0,2-2 mM. Regeneração da superfície da pastilha de sensor foi realizada pela lavagem da pastilha com NaOH 1 mM por 1 min em uma vazão de fluxo de 10 gL/min. Análise dos dados de SPR para constantes de associação, de dissociação e de afinidade foi realizada por programa de computador de avaliação BIA (Biacore, AB, Uppsala, Suécia).

Alinhamentos Múltiplos - Alinhamento múltiplo de seqüências foi realizado usando o programa de computador MUSCA (http://cbcsrv:watson.ibm.com). Os seguintes números de acesso de banco de dados Swiss-Pot foram usados para alinhamentos múltiplos: FVIII Humano (h) (P00451), hFIX (P00740), hG-CSF (P09919), hGM-CSF (P04141), hlFNγ(Ρ01579), e hGLP-1 (P01275).

1.2 Resultados

Ligação de proteínas/peptídeos em lipossomos PEGuilados

Analisamos a ligação de proteínas e de peptídeos em lipossomos PEGuilados por medição por Ressonância de Plasmon de Superfície (SPR) usando um instrumento Biacore (Biacore, Uppsala, Suécia), então injetamos lipossomos PEGuilados ou lipossomos de controle de concentrações e tamanhos iguais (80-110 nm) e medimos e analisados a ligação de proteína/peptídeo nos lipossomos intactos fluídos.

Lipossomos PEGuilados compostos de POPC e de DSPEPEG2000 se ligam em FVIII (Fig. la). A ligação foi dependente do polímero

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PEG ligado em lipídeo DSPE porque dois tipos de lipossomos de controle de POPC e POPC.DSPE não se ligam em FVIII (Fig. la). Em adição, a ligação foi específica para FVIII, porque os lipossomos PEGuilados não se ligam em albumina de soro humana (HSA) (Fig. lb). Análise de ligação de uma curva representativa (Fig. la) utilizando um modelo de ligação de dois sítios indica que os lipossomos PEGuilados se ligam em dois sítios sobre FVIII com j ' valores de constantes de velocidade de associação (k_on) de 3,83x10⁵ M^s'¹ e 3,37x10⁶ M^s¹, de constantes de velocidade de dissociação de 1,72x10’³ί· s'¹ e 6,6x10‘³ s'¹ e de constante de afinidade (K_d) de 1,96 nM e 4,5 nM respectivamente (Tabela 1).

Anticorpos policlonais anti-fator VÍII humano [soro de um paciente que desenvolveu anticorpos (inibidores) contra FVIII] competem com a ligação dos lipossomos PEGuilados em ambos os sítios (Fig. lc).

} Experimento de controle indica que imunoglobulina G (IgG) humana total / .

não competiu com a ligação de FVIII em lipossomos PEGuilados (dados não ; mostrados). Isto indica que os lipossomos PEGuilados se ligam

J especificamente nos mesmos domínios de proteína que os anticorpos antij fator VIII humano.

Medições de SPR foram realizadas com várias proteínas

I20 purificadas e recombinantes adicionais. Foi verificado que as seguintes ! proteínas se ligam em lipossomos PEGuilados: Fator IX (FIX), fator ?í í estimulante de colônia de granulócito (G-CSF), fator estimulante de colônia j de macrófago / granulócito (GM-CSF), Interferon-γ e Peptídeo 1 semelhante a | Glucagon (GLP-1) (Fig. 2-6). Em adição, verificamos que as seguintes

25 proteínas não se ligam nos lipossomos PEGuilados: HSA, IgG, Insulina, ínterferon-α, 2a, Interferon-a 2b, hormônio de crescimento humano e f Eritropoietina.

Em adição, anticorpos policlonais anti-fator IX (Sigma) ^:S competem com a ligação dos lipossomos PEGuilados em ambos os sítios

I (Fig. 7). Isto indica que os lipossomos PEGuilados especificamente se ligam nos mesmos domínios de proteína como os anticorpos anti-fator IX humano.

Análise de seqüência de aminoácidos indica que há uma seqüência de consenso de 8 aminoácidos (S/T-X/I/V-I/V/Q/S-S/T-X-X-E) localizada dentro das proteínas que se liga nos lipossomos PEGuilados (Fig. 8a) mas está ausente nas proteínas que não se ligam em lipossomos PEGuilados. Para testar a seqüência de consenso e os sítios de ligação identificados em FVIII, sintetizamos um peptídeo derivado de aminoácidos 1783-1796 de FVIII e medimos sua ligação em lipossomos PEGuilados. O peptídeo se liga em lipossomos PEGuilados, mas não em lipossomos POPC de controle, com uma K_d de 2,25 nM (Fig. 8c) que é semelhante aos valores de Kd de FVIII e de lipossomos PEGuilados que foram previamente verificados (Tabela 1).

Um sumário de valores de k_on, k_Off e de Kd de várias proteínas e peptídeo é mostrado na Tabela 1.

Contudo, acetato de glatiramer (Teva, Israel), um copolímero aleatório sintético composto de repetições de 4 aminoácidos (L-ala, L-glu,Llys e L-tyr) mas que não contém a seqüência de consenso, também se liga em lipossomos PEGuilados (Fig. 9).

Tabela 1: Parâmetros cinéticos para a ligação de proteínas/peptídeo em lipossomos PEGuilados

Proteína/peptídeo	kon (S )	kHM-V)	Xd(M)
Fator Vin(l) (2)	3,83 x 10⁵’ 3,37 x 10⁶	1,72 x IO ³’ 6,6 x 10³	1,96 x IO^9, 4,5 x IO’⁹
Fator IX	3,33 x 10⁶	0,021	6,3 x IO’⁹
G-CSF	4,04 x 10⁵	0,0137	3,39 x 10’⁸
GM-CSF	8,5 x 10⁵	0,0103	1,21 x 10⁸
INF-γ	1,44 x 10⁶	4,16 x 10³	2,88 x IO’⁹
GLP-1	1,16 x 10⁵	2,21 x 10⁴	1,91 x 10⁹

Associação e dissociação de várias proteínas e um peptídeo em lipossomos PEGuilados foram avaliadas, como descrito em material e métodos. As concentrações de PEG-lipossomo testadas foram 18,355 nM

Petição 870170082599, de 27/10/2017, pág. 17/24

Ί r q, ._hl I», „ i» * I» * * »' * * * * l J ,h * «I, * * »' ” » ^J| * « *^? * * ^a tf tf tf * * ·=: '1!' '* * r IP· <> *· * * * ·· Ml· tf ir 1' # * * *· ^:l '* é -ü, IIP >W Ί|| ώ tf * *1 * * para FVIII, FIX, G-CSF, GM-CSF, INF-γ e de 183,55 pM para GLP-1. Os dados obtidos para todas as proteínas foram analisados para calcular as constantes de velocidade de associação (k_on), as constantes de velocidade de dissociação (£^) e as constantes de afinidade (Kj) por programa de computador de avaliação BIA.

2. Exemplos 9-10

2.1 Materiais & Métodos

Formulação de FIX e de G-CSF com lipossomos PEGuilados

Lipossomos PEGuilados foram formulados quer com FIX 10 (Octanine, Octapharma) quer com G-CSF (ProSpec-Tany TecbnoGene Ltd., Nes Ziona, Israel) pela dissolução da proteína com solução de lipossomo (um mL de solução de lipossomo / 200 unidades de FIX e 1 mL de solução de lipossomo / 10 pg de G-CSF). O frasco foi incubado em um misturador de rolo SRT1 girando a 33 rpm, amplitude de 16 mm (Stuart Scientific, Redhill,

UK) por 10 minutos (G-CSF) ou 60 minutos (FIX), na temperatura ambiente (20-25°C).

Farmacocinética de G-CSF formulado com lipossomo e de G-CSF livre em camondongos

Dois grupos de camundongos pretos C57 foram 20 subcutaneamente (s.c.) injetados com: a) 50 pL de G-CSF formulado com lipossomos PEGuilados (10 pg/mL); b) 50 pL de G-CSF dissolvido em tampão de citrato de sódio 50 mM (10 pg/mL). Os camundongos foram sangrados do sinus retro-orbital para dentro de tubos de microcentrífuga contendo citrato de sódio (concentração final de 20 mM) em vários tempos após a injeção e plasma foi separado por centrifugação a 2.700 x g por 10 minutos a 4°C. Concentrações de G-CSF em plasma de camundongo foram medidas por ELISA (G-CSF DouSet ELISA kit, R&D) de acordo com a instrução do fabricante.

Farmacocinética de PegLip-FIX e de FIX livre em camundongos £:

¥.

hemofílicos

Três grupos de camundonhos C57BL foram injetados IV na veia da cauda com 50 pL de: a) 200 unidades/mL de PegLip-FIX; b) FIX não formulado; c) tampão. Os camundongos foram sangrados do sinus retro- ,!

orbital para dentro de tubos de microcentrífuga contendo citrato de sódio (concentração final de 20 mM) em vários tempos após a injeção e plasma foi separado por centrifugação a 2.700 x g por 10 minutos a 4°C. Atividade de FIX em plasma de camundongo foi medida por ensaio de coagulação de um j estágio (usando reagentes Stago e máquina de coagulação ST4) de acordo | com a instrução do fabricante. Visto que os camundongos C57BL possuem 1 atividade de FIX endógena em seu plasma, esta atividade endógena (conforme medida nos camundongos de controle) foi subtraída da atividade I medida em cada instante de tempo nos grupos tratados. í

Análise de farmacocinética j %

Os parâmetros farmacocinêticos (meia-vida e AUC) foram j analisados por programa de computador (RSTRIP, MicroMath Inc.). j

Análise estatística J í

Teste-t de Student. 5

2.2 Resultados l ·&,

Farmacocinética de proteínas formuladas com lipossomo em j camundongos I

Parâmetros farmacocinêticos de G-CSF e de FIX livres e j formulados com lipossomo foram medidos em camundongos. Os resultados J apresentados nas Tabelas 2-3 indicam que a meia-vida e a área sob a curva t das proteínas formuladas com lípossomos PEGuilados foram maiores do que | aquelas de proteínas livres.

Tabela 2: Parâmetros farmacocinêticos após injeção SC de G-CSF formulado com lipossomo (PegLip-G-CSF) ou G-CSF livre em camundongos } ·:ί A ^; ί^!Γ>ν-'· ΐ^·¥^ΐ+*-^;·'η·ίγ->.+ΐ··¥ Wr^1|!^,|l'+''!P = 71». ,1- Λ'· ·(,!' = -|„· - (»-’ ,.| « I» « «. .? * * « ’ “* » '* *

0« Φ » * * ^ν ·' * κι . -.> (ι β*a a.. #,,¾.

	T=l,75h	T=3,75h	T=5,75h	T=7,75h	T-9,33h	HL(h)	AUC(pg*h/ml)
PegLip-	58150,72	56023,32	48901,71	24318,43	14006,75	5,038	434386,17
G-CSF	±6299,95	±7372,35	±8991,09	±6512,68	±4278,52	±0,896	±55926,46
	T-2h	T~4h	T=6h	T~8h	T-9,58h		-
G-CSF	62419,23	50556,82	37141,44	12705,32	5735,84	3,181	420746,83
	±5212,47	±6928,12	±6068,82	±2780,72	±284,49	±0,354	±40361,42

G-CSF foi reconstituído com tampão de citrato de Na 50 mM de pH 7 ou formulado com lipossomos PEGuilados e injetado (50 pL) s.c. em camundongos (6 camundongos em um grupo). Concentração de G-CSF humano (pg/mL) no plasma foi medida por um Ensaio Imunoabsorvente

Ligado à Enzima (Elisa). Parâmetros farmacocinéticos foram calculados para cada camundongo. Valores são médias ± desvio padrão. Análise de teste-t de Student para meia-vida de PEG-Lip-G-CSF versus G-CSF, P < 0,002.

| Tabela 3: Parâmetros farmacocinéticos após injeção IV de Fator IX ou f

de Fator IV formulado com lipossomo PEGuilado (PegLip-FIX) em j 10 camundongos

	TMOmin	T=4,83h	T=19,83h	HL(h)	AUC(pg*h/ml)
PegLip-FIX	3,78±0,51	0,77±0,41	0,092±0,l	11,72	2,02
	T=10min	T=5h	T-29h
G-CSF	3,85±0,39	0,63±0,31	0,081±0,078	10,96	1,85

$

Parâmetros farmacocinéticos foram calculados para cada camundongo. Valores são médias ± desvio padrão. Análise de teste-t de Student para meia-vida de PEG-Lip-G-CSF versus G-CSF, P < 0,15.

3. Exemplo 11

3.1 Farmacocinética e atividade biológica de FVIII formulado in vivo com lipossomos PEGuilados em camundongos hemofílicos

Farmacocinética e atividade biológica de Fator VIII, que foi formulado in vivo com lipossomos PEGuilados por injeção de lipossomos 1 hora após a injeção de fator VIII não formulado, foram medidas em

I» « -l|i » s * ϊΐ W camundongos hemofílicos. Camundongos hemofílicos foram injetados com;

a) FVIII livre (não formulado); b) FVIII livre e uma hora mais tarde uma segunda injeção de lipossomos PEGuilados. Os camundongos foram sangrados em vários tempos após a injeção e a atividade de FVIII foi medida por um ensaio de coagulação. Com o objetivo de testar a eficácia in vivo do FVIII formulado com lipossomo na interrupção do sangrarnento e compará-la com aquela de FVIII livre, as caudas dos camundongos injetados foram cortadas várias vezes após as injeções e a sobrevivência dos camundongos injetados foi medida.

Os resultados apresentados na Tabela 4 e na Figura 10 indicam que a meia-vida e a área sob a curva do fator VIII que foi formulado in vivo com lipossomos PEGuilados foram maiores do que aquelas do FVIII livre. Consequentemente, a sobrevivência dos camundongos injetados com FVIII e 1 hora mais tarde com lipossomos foi significativamente maior.

Tabela 4: Atividade de fator VIII (IU/mL) e parâmetros farmacocinéticos após injeção de FVIII e 1 hora mais tarde de lipossomos PEGuilados em camundongos hemofílicos • ..

Material de injeção	Tempo de pósinjeção	T = 10 min	T=4,6 h	T=8,3 h	T=24,6 h	T=28,8 h	Meia- vida	Área sob a curva
FVIII e lipossomos (injetados 1 hora mais tarde)	Média (u/mL)	2,03	1,35	0,975	0,66	0,61	14,5	28,8
FVIII	Média (u/mL)	2,17	1,4	0,95	0,46	0,41	9,3	24,0

FVIII recombinante (Kogenate-FS, Bayer) foi reconstituído com água e injetado (40 pL) na veia da cauda de camundongos hemofílicos (10 camundongos em cada grupo). Um hora mais tarde, lipossomos PEGuilados (9% de lipídeos, p/v) foram injetados i.v. (40 pL) em um grupo de camundongos. Atividade de FVIII foi medida na amostra de plasma reunido de cada instante de tempo por um ensaio de coagulação de um estágio. Parâmetros farmacocinéticos (meia-vida e AUC) foram analisados por um programa de computador (RSTRIP, MicroMath Inc.).

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4. Exemplo 12

A ligação de FVIII em lipossomas compostos de POPC e lipopolímero não-carregado ligado em carbamato foi comparada com a ligação de FVIII em lipossomos compostos de POPC e DSPE-PEG por análise de interação em tempo real. As estruturas esquemáticas de lipopolímero não-carregado ligado em carbamato; mPEG-amino-propanodioldiestearoil (DS-c-PEG) e l,2-diestearoil-s«-glicero-3-fosfatidil-dietanolamina-N-metóxi-polietileno glicol (DSPE-PEG) são mostradas abaixo.

DSPE-PEG

Os resultados são apresentados na Fig. 11 e mostram que ambos os tipos de lipossomos interagem com FVIII.

5. Exemplo 13

Fator de coagulação Vila é em geral usado para tratar pacientes hemofílicos com inibidores e para interromper o sangramento traumático (por exemplo, lesões de guerra, acidentes de carro).

Farmacocinética de fator Vila, formulado com lipossomos PEGuilados, foi medida em ratos. Ratos Sprague Dawley (SD) (180 g) foram injetados com 36 pg/rato de FVIIa livre (não formulado) (Nova Nordisk) ou com FVIIa formulado com lipossomos PEGuilados. Os ratos foram sangrados em vários tempos após a injeção e a atividade de FVIIa foi medida por um ensaio de coagulação (Stago). Os resultados apresentados nas Tabelas 5 e 6 indicam que a meia-vida e a área sob a curva do fator Vila que foi formulado in vivo com

ζ4..

... -. i.·:

Π Π · * ν * ♦ ί ® * · · · * ’ ’ » 3 # * * * ifÈ 4 * <«!'* *· * * - f¹ * * * * * ⁴ * * ΐ ϊ* Ί .$ ji. ih *· ^Λ * 4» '* W * lipossomos PEGuilados foram maiores do que aquelas de FVIÍa livre.

Tabela 5: Atividade de fator Vila (lU/mL) e farmacocínética após injeção de FVIIa formulado com lipossomos PEGuilados em ratos

Material de injeção	Tempo de pósinjeçào	T- 10 min	T=3h	T=7 h	T=24 h	T=30 h	Meiavida (HL) (h)	Área sob a curva (AUC)
PEGLiprFVIIa (n=4)	Média (U/mL) ± SD	573+255	38+8	7±1	l,6±l	0,5+0,2	3,08	2013
rFVIIa (n=4)	Média (U/mL) ± SD	706±45	45±3	4,6±1	0,1+0,1	0	1,86	1411

Tabela 6: Atividade de fator Vila (IU/mL) e farmacocinética após injeção de FVIIa ou de FVIIa formulado com lipossomos PEGuilados era ratos (amostras reunidas)

Material de injeção	T ~ 10 min	T~3 h	T~7 h	T~23h	T~31 h	Meia- vida (HL)(h)	Área sob a curva (AUC)
PEGgLiprFVIIa (n=3)	287	22,6	8,7	1,6	1,2	3,84	1019
rFVIIa (n=4)	319	,27 I		0	0	1,15	513

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Composição farmacêutica para administração parenteral, caracterizada pelo fato de compreender uma quantidade terapeuticamente efetiva de uma proteína ou um polipeptídeo ligado de forma não covalente

5 ligado a uma partícula coloidal, as citadas partículas compreendendo aproximadamente 1-20 porcento em mol de um lipídeo anfipático derivado com um polímero hidrofílico biocompatível, na qual a citada proteína ou o citado polipeptídeo é selecionada(o) do grupo consistindo de:

10 (a) Fator Vila, fator estimulante de colônia de granulócito (GCSF), fator estimulante de colônia de macrófago/granulócito (GM-CSF), interferon-γ, peptídeo 1 semelhante a glucagon (GLP-1) e acetato de glatiramer; e (b) proteínas ou polipeptídeos que incluem uma sequência

15 consenso de serina/treonina-X-leucina/isoleucina/valina-isoleucina/valina/ glutamina/serina-serina/treonina-X-X-ácido glutâmico, em que X pode ser qualquer aminoácido;

na qual a citada proteína ou o citado polipeptídeo não é Fator

VIII (FVIII),

20 e na qual a citada proteína ou o citado polipeptídeo não está encapsulada(o) nas citadas partículas coloidais.
2. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que as partículas coloidais são substancialmente neutras e o polímero transporta substancialmente nenhuma carga líquida.

25
3. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o citado bpídeo anfipático é um fosfobpídio de fontes naturais ou sintéticas.
4. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o citado bpídeo anfipático é

Petição 870170082599, de 27/10/2017, pág. 18/24 fosfatidiletanolamina (PE).
5. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o citado lipídeo anfipático é um lipopolímero não-carregado ligado em carbamato.

5
6. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o citado lipídeo anfipático é aminopropanodiol diestearoíla (DS).
7. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que as citadas partículas

10 coloidais compreendem adicionalmente um segundo bpídeo anfipático obtido de fontes quer naturais quer sintéticas.
8. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o citado segundo lipídeo anfipático é fosfatidilcobna.

15
9. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que o citado polímero hidrofíbco biocompatível é pobetileno gbcol.
10. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o pobetileno glicol possui um peso

20 molecular de entre cerca de 500 daltons e cerca de 5.000 daltons.
11. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo é acetato de glatiramer e a composição pode ser usada para o tratamento de uma doença selecionada de esclerose múltipla, neuropatia diabética, demência

25 senil, mal de Alzheimer, mal de Parkinson, parabsia de nervo facial (de Bell), glaucoma, coréia de Huntington, esclerose lateral amiotrófica, estado epiléptico, neuropatia óptica não-arterial, ou deficiência de vitamina.
12. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo é

Petição 870170082599, de 27/10/2017, pág. 19/24

Fator Vila e a composição pode ser usada para tratar pacientes hemofílicos com inibidores e para tratar sangramento de trauma.
13. Uso de uma partícula coloidal, caracterizado pelo fato de ser na preparação de uma composição farmacêutica para administração

5 parenteral para tratamento de um paciente sofrendo de hemofiba, a citada composição compreendendo uma quantidade terapeuticamente efetiva de uma proteína ou de um pobpeptídeo ligado de forma não covalente a uma partícula coloidal, as citadas partículas coloidais compreendendo aproximadamente 120 porcento em mol de um bpídeo anfipático derivado com um polímero

10 hidrofflico biocompatível;

no qual a citada proteína ou o citado pobpeptídeo é selecionada(o) do grupo consistindo de:

(a) Fator Vila, fator estimulante de colônia de granulócito (GCSF), fator estimulante de colônia de macrófago/granulócito (GM-CSF), 15 interferon-γ, peptídeo 1 semelhante a glucagon (GLP-1) e acetato de glatiramer; e (b) proteínas ou pobpeptídeos que incluem uma sequência consenso de serina/treonina-X-leucina/isoleucina/vabna-isoleucina/valina/ glutamina/serina-serina/treonina-X-X-ácido glutâmico, em que X pode ser qualquer aminoácido;

20 no qual a citada proteína ou o citado pobpeptídeo não é Fator

VIII (FVIII), e no qual a citada proteína ou o citado pobpeptídeo não está encapsulada(o) nas citadas partículas coloidais.
14. Uso de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo 25 fato de que a partícula coloidal é um lipossomo.
15. Uso de partículas coloidais e uma proteína ou polipeptídeo, caracterizado pelo fato de ser na preparação de uma composição farmacêutica para administração parenteral para tratamento de um paciente sofrendo de uma doença, em que a citada composição farmacêutica compreende uma

Petição 870170082599, de 27/10/2017, pág. 20/24 quantidade terapeuticamente efetiva de uma proteína ou de um polipeptídeo e as partículas coloidais, as citadas partículas coloidais compreendendo aproximadamente 1-20 porcento em mol de um lipídeo anfipático derivado com um polímero hidrofílico biocompatível; no qual a citada proteína ou o

5 citado polipeptídeo é selecionada(o) do grupo consistindo de:

(a) proteínas ou polipeptídeos capazes de se ligar extemamente nas citadas partículas coloidais;

(b) proteínas ou polipeptídeos capazes de se ligar em polímeros de famílias de poli(alquil-éter), poli(ácido lático) e poli(ácido

10 glicólico); e (c) proteínas ou polipeptídeos que incluem uma sequência consenso de serina/treonina-X-leucina/isoleucina/valina-isoleucina/valina/ glutamina/serina-serina/treonina-X-X-ácido glutâmico, em que X pode ser qualquer aminoácido;

15 em que a proteína está encapsulada na citada partícula coloidal;

e em que as partículas coloidais e a proteína ou o polipeptídeo são separados.
16. Uso de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo 20 fato de que a proteína ou o polipeptídeo não é Fator VIII (FVIII).

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300 ί

2/11

Tempo (s)