ES2255501T3 - Lipopolimeros neutros y composiciones liposomicas que los contienen. - Google Patents
Lipopolimeros neutros y composiciones liposomicas que los contienen.Info
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Abstract
Lipopolímero neutro de fórmula: en la que: cada R1 y R2 es independientemente un grupo alquilo o alquenilo que tiene entre 8 y 24 átomos de carbono; n = 100 a 300, Z se selecciona de entre el grupo constituido por hidroxi, alcoxi, benciloxi, éster carboxílico, éster sulfónico, carbonato de alquilo o arilo, amino y alquilamino; y L es ¿X-(C=O)-Y-CH2-, en la que X e Y se seleccionan independientemente de entre oxígeno y NH.
Description
Lipopolímeros neutros y composiciones liposómicas
que los contienen.
La presente invención se refiere a lipopolímeros
neutros sustituidos con PEG y a su utilización en liposomas con
tiempo de circulación prolongado. Los liposomas que contienen estos
lipopolímeros proporcionan tiempos de circulación sanguínea
similares en comparación con los liposomas que incorporan
fosfolípidos convencionales sustituidos con PEG cargados
negativamente.
Los liposomas se utilizan para varios fines
terapéuticos, y en particular, para transportar agentes terapéuticos
a las células diana mediante la administración generalizada de
formulaciones liposómicas de estos agentes. Las formulaciones
farmacéuticas de liposomas ofrecen ventajosamente el potencial de
mejores propiedades de administración farmacéutica, que incluyen,
por ejemplo, la liberación controlada del fármaco. con frecuencia se
necesita un tiempo de circulación prolongado para que los liposomas
alcancen una zona, célula o punto diana. En particular, esto es
necesario cuando la zona, célula o punto diana no está situado cerca
del punto de inyección. Por ejemplo, cuando los liposomas se
administran por vía general, es deseable recubrir los liposomas con
un agente hidrófilo, por ejemplo, un recubrimiento de cadenas de
polímero hidrófilas tales como polietilenglicol (PEG) para prolongar
la duración de los liposomas en la circulación sanguínea. Dichos
liposomas modificados en la superficie se denominan normalmente
liposomas de "circulación prolongada" o "estéricamente
estabilizados".
La modificación superficial más frecuente en un
liposoma es el acoplamiento de cadenas de PEG, que tienen
específicamente un peso molecular desde aproximadamente 1.000
daltons (Da) hasta aproximadamente 5.000 Da, para aproximadamente el
5 por ciento (%) en moles de los lípidos que constituyen los
liposomas (véase, por ejemplo, Stealth Liposomes, CRC Press,
Lasic, D. y Martin, F., eds., Boca Ratón, FL (1995)) y las
referencias citadas en la misma. Las farmacocinéticas presentadas
por dichos liposomas se caracterizan por una reducción independiente
de la dosis de la absorción de los liposomas por el hígado y el bazo
a través del sistema de fagocitos mononucleares (MPS) y por la
duración en la circulación sanguínea significativamente prolongada,
en comparación con los liposomas no modificados en superficie, que
tienden a ser rápidamente eliminados de la sangre y acumulados en el
hígado y
el bazo.
el bazo.
Los fosfolípidos sustituidos con PEG utilizados
más frecuentemente y comercialmente disponibles se basan en
fosfatidiletanolamina (PE), normalmente DSPE
(distearoilfosfatidiletanolamina) que está cargada negativamente en
el grupo polar de cabeza. La carga superficial negativa en un
liposoma puede ser ventajosa en algunos aspectos, p. ej., en
interacciones con células (véase, por ejemplo, Miller et al.,
Biochemistry, 34: 12875-12883 (1998)),
y en la administración de fármacos catiónicos, donde puede
producirse la fuga del fármaco (véase, por ejemplo, Webb et
al., Biochim. Biophys. Acta,
1372:272-282 (1998)).
Por consiguiente sería beneficioso proporcionar
lípidos no cargados derivados de PEG que se incorporen eficazmente
en las bicapas de lípido y proporcionen tiempos prolongados en la
circulación sanguínea a los liposomas. Teóricamente, dichos lípidos
son de baja toxicidad y producidos fácilmente.
En un aspecto, la presente invención incluye una
composición liposómica que tiene desde aproximadamente 1 por ciento
en moles hasta aproximadamente 10 por ciento en moles de un
lipopolímero neutro en la que el lipopolímero neutro está
representado por la fórmula:
en la
que:
cada R^{1} y R^{2} es independientemente una
cadena con alquilo o alquenilo que tiene entre 8 átomos de carbono y
24 átomos de carbono;
n está comprendida entre 10 y 300,
Z se selecciona de entre el grupo constituido por
hidroxi, alcoxi, benciloxi, éster carboxílico, éster sulfónico,
carbonato de alquilo o arilo, amino y alquilamino; y
L es
-X-(C=O)-Y-CH_{2}-,
en la que X e Y se seleccionan independientemente
de entre oxígeno y NH.
Preferentemente, la composición incluye desde
aproximadamente 3 por ciento en moles a aproximadamente 6 por ciento
en moles del lipopolímero neutro.
En otro aspecto, L es un enlace hidrolizable tal
como un enlace carbamato, o un enlace carbonato. En otro aspecto
aún, Z es hidroxi o metoxi. Preferentemente, R^{1} y R^{2} no
están ramificados. En otro aspecto, R^{1} y R^{2} son ambos
grupos estearilo (C_{17}H_{35}). En otro aspecto, el valor de n
está comprendido preferentemente entre 20 y 115, de modo que el
peso molecular del grupo PEG está comprendido aproximadamente entre
1.000 Da y aproximadamente 5.000 Da.
La invención proporciona también un método para
aumentar el tiempo en la circulación sanguínea de un liposoma que
contiene lípidos formadores de vesículas, incorporando en el
liposoma aproximadamente 1 por ciento en moles a aproximadamente 10
por ciento en moles de un lipopolímero neutro que tiene la fórmula
presentada anteriormente. La invención proporciona además los
lipopolímeros representados por esta fórmula.
La Figura 1 presenta un esquema de la síntesis
para la preparación de un lipopolímero no cargado ligado al
carbamato, denominado en la presente memoria
PEG-c-DS;
las Figuras 2A-2D presentan los
esquemas de la síntesis para la preparación de lipopolímeros no
cargados ligados a éter, éster, amida y ceto;
las Figuras 3A-3C son gráficos
que presentan la biodistribución de liposomas HSPC/Chol que
contienen 3 por ciento en moles de
PEG-c-DS (A); 5 por ciento en moles
de PEG-DSPE (B); o 5 por ciento en moles de
PEG-c-DS (C) en la sangre, hígado y
bazo;
la Figura 4 es gráfico que presenta la retención
en la sangre de liposomas exentos de HSPC PEG 2:1 (cruces), es
decir, sin PEG, 5 por ciento en moles de PEG-DSPE
(triángulos) y 5 por ciento en moles de
PEG-c-DS (círculos); y
la Figura 5 es un gráfico que presenta la
retención en la sangre de liposomas con PHEPC que contienen 5 por
ciento en moles de PEG-c-DS
(círculos) y 5 por ciento en moles de
PEG-c-DSPE (cuadrados).
Tal como se utiliza en la presente memoria el
término lipopolímero "neutro" se refiere a un lipopolímero que
está descargado, es decir, que no tiene carácter iónico.
"Lípidos formadores de vesículas" se refiere
a los lípidos anfóteros que tienen restos hidrófobos y del grupo con
cabeza polar. Dichos lípidos formadores de vesículas pueden formarse
espontáneamente en las vesículas bicapa en agua como se ejemplifica
mediante los fosfolípidos, o pueden incorporarse establemente en las
bicapas de lípido, en las que el grupo hidrófobo está en contacto
con el interior, es decir, una zona hidrófoba de la membrana bicapa
y el resto del grupo de cabeza polar está orientado hacia el
exterior, es decir, la superficie polar de la membrana. Una clase de
lípidos formadores de vesículas de este tipo incluye específicamente
una o dos cadenas hidrocarbonadas de acilo hidrófobo o un grupo
esteroide y pueden contener un grupo químicamente reactivo (tal como
una amina, ácido, éster, aldehído o alcohol) en el grupo con cabeza
polar. En esta clase se incluyen los fosfolípidos, tal como la
fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE), ácido fosfatídico
(PA), fosfatidilinositol (PI) y esfingomielina (SM), en los que las
dos cadenas hidrocarbonadas son normalmente de aproximadamente 14
hasta aproximadamente 22 átomos de carbono de longitud y tienen
varios grados de insaturación. Otros lípidos formadores de vesículas
incluyen los glicolípidos, tal como los cerebrósidos y los
gangliósidos, y los esteroles, tal como el colesterol. Para las
composiciones descritas en la presente memoria, los fosfolípidos,
tales como PC y PE, colesterol y los lipopolímeros neutros descritos
en la presente memoria son los componentes preferidos.
"Alquilo" se refiere a un radical
monovalente totalmente saturado que contiene carbono e hidrógeno,
que puede ser una cadena ramificada o lineal. Ejemplos de grupos
alquilo son metilo, etilo, n-butilo,
t-butilo, n-heptilo e isopropilo.
"Alquilo inferior" se refiere a un radical alquilo desde
aproximadamente uno a aproximadamente seis átomos de carbono,
ejemplificados por metilo, etilo, n-butilo,
i-butilo, t-butilo, isoamilo,
n-pentilo e isopentilo.
"Alquenilo" se refiere a un radical
monovalente que contiene carbono e hidrógeno, que puede estar
ramificado o ser una cadena lineal y contiene por lo menos un doble
enlace.
Abreviaturas: PEG: polietilenglicol; mPEG:
polietilenglicol terminado en metoxi; Chol: colesterol; PC:
fosfatidilcolina; PHPC: fosfatidilcolina parcialmente hidrogenada;
PHEPC: fosfatidilcolina de huevo parcialmente hidrogenada; HSPC:
fosfatidilcolina de soja hidrogenada; DSPE:
diasteroilfosfatidiletanolamina; DSP o
PEG-c-DS: diastearoil PEG (ligado a
carbamato); APD:
1-amino-2,3-propanodiol;
DTPA: ácido dietilentetraminpentaacético; Bn: bencilo.
Los lipopolímeros neutros sustituidos con PEG de
la invención tienen la estructura presentada a continuación:
en la
que:
cada R^{1} y R^{2} es independientemente una
cadena con alquilo o alquenilo que tiene entre 8 y 24 átomos de
carbono;
n está comprendida entre 10 y 300,
Z se selecciona de entre el grupo constituido por
hidroxi, alcoxi, benciloxi, éster carboxílico, éster sulfónico,
carbonato de alquilo o arilo, amino y alquilamino; y
L es
-X-(C=O)-Y-CH_{2}-,
en la que X e Y se seleccionan independientemente
de entre oxígeno y NH.
Los lipopolímeros incluyen un enlace neutro (L)
en lugar del enlace fosfato con carga de
PEG-fosfolípidos, tal como PEG-DSPE,
que se emplea frecuentemente en los liposomas estéricamente
estabilizados. Este enlace neutro se selecciona de entre un
carbamato, un carbonato y una urea. En las aplicaciones en las que
sea deseable eliminar las cadenas de PEG tras un tiempo de
circulación dado in vivo se prefieren los enlaces
hidrolizables o si no escindibles, tal como los carbamatos y los
carbonatos. Esta característica puede ser útil en la liberación del
fármaco o para facilitar la absorción en las células una vez que el
liposoma ha alcanzado su objetivo (Martin et al., patente US
nº 5.891.468; Zalipsky et al., publicación PCT nº WO 98/18813
(1998)).
El grupo PEG unido al grupo de enlace
preferentemente tiene un peso molecular desde aproximadamente 1.000
Da hasta aproximadamente 15.000 Da; esto es, en el que n está
comprendido entre 20 y 340. Más preferentemente, el peso molecular
es de 1.000 Da a 12.000 Da (n = 20 a 275) y más preferentemente
entre 1.000 Da a 5.000 Da
(n = 20 a 115). R^{1} y R^{2} están comprendidos entre 8 átomos de carbono y 24 átomos de carbono y preferentemente están comprendidos entre 16 y 20 átomos de carbono de longitud. Más preferentemente, R^{1}=R^{2}=G_{17}H_{35} de modo que COOR es un grupo estearilo.
(n = 20 a 115). R^{1} y R^{2} están comprendidos entre 8 átomos de carbono y 24 átomos de carbono y preferentemente están comprendidos entre 16 y 20 átomos de carbono de longitud. Más preferentemente, R^{1}=R^{2}=G_{17}H_{35} de modo que COOR es un grupo estearilo.
Como se indicó anteriormente, la incorporación de
un lípido sin carga en un liposoma puede presentar ventajas
significativas, tal como la pérdida reducida de un fármaco catiónico
encapsulado. Además, otra ventaja es una mayor flexibilidad de la
modulación de las interacciones de la superficie liposómica con las
células diana y con el RES (Miller et al.,
Biochemistry, 37:12875-12883 (1998)).
Se han utilizado ceramidas sintéticas sustituidas con PEG como
componentes sin carga de liposomas estéricamente estabilizados (Webb
et al., Biochim. Biophys. Acta. 1372:
272-282 (1998)); sin embargo, estas moléculas son
complejas y costosas de preparar y generalmente no se llenan en el
interior de la bicapa de fosfolípido así como en los
glicerofosfolípidos de diacilo.
Los lipopolímeros pueden prepararse utilizando
métodos de síntesis habituales. Por ejemplo, el compuesto unido al
carbamato (L =
-O-(C=O)-NH-CH_{2}-) se prepara,
como se muestra en la Fig. 1, haciendo reaccionar el hidróxido
terminal de mPEG (metoxi-PEG) con cloroformato de
p-nitrofenilo para proporcionar el carbonato de
p-nitrofenilo. Este producto se hace reaccionar a
continuación con
1-amino-2,3-propanodiol
para dar el carbamato intermedio. Los grupos hidroxilo del diol se
acilan para dar el producto final. Una síntesis similar, utilizando
glicerol en lugar de
1-amino-2,3-propanodiol,
puede utilizarse para producir un producto unido al carbamato (L =
-O-(C=O)-O-CH_{2}-). La
preparación de un diaesteroílo unido al carbamato y de lipopolímeros
de diecosanoílo se describe también en el Ejemplo 1.
Como se presenta en la Fig. 2A, un lipopolímero
unido a éter (L = -O-CH_{2}-) que no forma parte
de la presente invención se prepara haciendo reaccionar el hidroxilo
terminal de mPEG-OH con cloruro de glicidilo,
hidrolizando el epóxido resultante y acilando el diol resultante.
Los lipopolímeros unidos a éster que no forma parte de la presente
invención (L = -O-(C=O)- o -O-(C=O)-CH_{2}-)
pueden prepararse, por ejemplo, como se muestra en la Fig. 2B,
haciendo reaccionar mPEG-OH con un derivado activado
de acetonida de ácido glicérido (ácido
2,2-dimetil-1,3-dioxolano-4-carboxílico)
o el homólogo del carbono cuatro, ácido
2,2-dimetil-1,3-dioxolano-4-acético.
El diol se desprotege a continuación y se acila.
Las reacciones correspondientes que utilizan
mPEG-NH_{2}, preparadas según el método descrito
en Zalipsky et al., publicación PCT nº WO 98/18813 (1998), en
lugar de mPEG-OH, pueden utilizarse para preparar
lipopolímeros con enlaces amida, urea o amina (es decir, en los que
L = -NH-(C=O)-NH-,
-NH-(C=O)-CH_{2}-,
-NH-(C=O)-NH-CH_{2}-, o
-NH-CH_{2}-), estando el enlace urea comprendido
dentro del alcance de la presente invención.
Los compuestos que no forman parte de la presente
invención en los que L es -X-(C=O)-, en la que X es O o NH, pueden
prepararse mediante la reacción de un PEG terminado en carboxilo
activado (preparado por oxidación de PEG terminado en hidroxilo y
activación del grupo carboxilo, por ejemplo, por conversión en el
éster de nitrofenilo o reacción con DCC) con
1,2,3-propanotriol o
1-amilo-2,3-propanodiol,
respectivamente (Fig. 2C). Un compuesto unido a ceto (es decir, en
el que X es un enlace directo) que no forma parte de la presente
invención puede prepararse por condensación de PEG terminado en
aldehído (preparado por oxidación suave de PEG terminado en
hidroxilo), por ejemplo, con el reactivo de Grignard de
1-bromo-2,3-propanodiol
acetonida (Fig. 2D), seguido de oxidación a la cetona, en
condiciones no ácidas e hidrólisis de la acetonida al diol. En cada
caso, el diol se acila a continuación como es habitual.
El terminal del oligómero PEG no unido al grupo
glicerol (terminal \alpha; grupo Z anterior) es normalmente
hidroxi o metoxi, pero puede estar funcionalizado, según los métodos
conocidos en la materia, para facilitar el acoplamiento de varias
moléculas al lipopolímero neutro y/o para su utilización en el
direccionamiento de los liposomas a una célula o tipo de tejido
determinados o si no facilitar la administración del fármaco. Las
moléculas que deben unirse pueden incluir, por ejemplo, proteínas,
péptidos, sacáridos, anticuerpos o vitaminas. Los ejemplos 2 y 3
describen las etapas de la preparación de lipopolímeros
funcionalizados en \alpha siguiendo vías similares a las descritas
anteriormente, pero se preparan con oligómeros de PEG disponibles
en el mercado en los que el terminal \alpha está sustituido por un
grupo, tal como éter t-butílico o éter bencílico,
que se transforma fácilmente en hidroxilo tras la síntesis de la
porción lipídica de la molécula. Este terminal se activa a
continuación, en este caso, mediante conversión a un carbonato
de
p-nitrofenilo.
p-nitrofenilo.
Los liposomas de circulación prolongada se forman
incorporando desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 10% en
moles, y más preferentemente desde aproximadamente 3 hasta
aproximadamente 6% en moles, de un lipopolímero neutro en los
liposomas compuestos de lípidos formadores de vesículas. Para
ilustrar, los liposomas que se incorporan desde aproximadamente 3
hasta aproximadamente 5% en moles de
mPEG_{2000}-DSPE (diasteroilfosfatidiletanolamina)
o lipopolímero unido al carbamato, se prepararon
mPEG_{2000}-DS como se describe en el Ejemplo 4.
El equilibrio de los lípidos consistía en HSPC y colesterol en una
relación molar 1,5:1. Se cargaron los liposomas con el marcador
^{125}I-tiraminilinulina. Se inyectó una muestra
de cada preparación en la vena de la cola de los ratones y se
determinó la distribución del tejido en varios puntos de tiempo,
como se describe en el Ejemplo 4. Las concentraciones presentes en
la sangre, hígado y bazo se presentan en las Tablas
1-3 y se muestran gráficamente en las Figs.
3A-3C. Los datos demuestran que las farmacocinéticas
de los liposomas que contienen
PEG-c-DS fueron muy similares a la
de los liposomas que contienen PEG-DSPE.
\vskip1.000000\baselineskip
Punto de tiempo | % en dosis inyectada | ||
A | B | C | |
30 min | - - | 94,8 \pm 3,99 | 89,7 \pm 6,94 |
2 h | 85,1 \pm 1,99 | 79,8 \pm 3,42 | 73,0 \pm 17,4 |
6 h | 67,1 \pm 6,25 | 54,5 \pm 3,05 | 55,3 \pm 2,51 |
12 h | 54,9 \pm 6,04 | 39,7 \pm 2,52 | 44,4 \pm 2,52 |
24 h | 14,8 \pm 2,81 | 12,4 \pm 2,34 | 16,6 \pm 2,38 |
Punto de tiempo | % en dosis inyectada | ||
A | B | C | |
30 min | - - | 2,27 \pm 0,13 | 3,14 \pm 0,95 |
2 h | 8,76 \pm 2,01 | 9,42 \pm 1,24 | 11,7 \pm 1,74 |
6 h | 21,7 \pm 2,55 | 19,3 \pm 1,37 | 20,8 \pm 0,86 |
12 h | 26,6 \pm 0,51 | 26,4 \pm 1,99 | 30,4 \pm 1,28 |
24 h | 43,9 \pm 2,7 | 36,6 \pm 2,25 | 42,6 \pm 0,48 |
Punto de tiempo | % en dosis inyectada | ||
A | B | C | |
30 min | - - | 0,09 \pm 0,06 | 0,23 \pm 0,08 |
2 h | 0,96 \pm 0,16 | 0,99 \pm 0,09 | 1,08 \pm 0,09 |
6 h | 1,94 \pm 0,07 | 1,96 \pm 0,29 | 2,12 \pm 0,13 |
12 h | 3,15 \pm 0,31 | 3,13 \pm 0,12 | 3,35 \pm 0,22 |
24 h | 4,69 \pm 0,37 | 3,91 \pm 0,31 | 4,56 \pm 0,29 |
Un estudio similar comparó el rendimiento de
ambos lípidos con PEG frente a una formulación de referencia que no
contenía lípido con PEG. La Figura 4 presenta la retención en la
sangre de HSPC/liposomas 2:1 que no contienen lípido con PEG
(cruces), 5% en moles de PEG_{2000}-DSPE
(triángulos) o 5% en moles de
PEG_{2000}-c-DS (círculos).
Se realizaron más estudios utilizando liposomas
que contienen mPEG_{2000}-c-DS:
PHPC:Chol en una relación molar 5:55:40. Se marcaron los liposomas
mediante incorporación de un complejo de indio-DTPA.
Se determinó el porcentaje de dosis inyectada en la sangre y en
varios tejidos a las 24 horas. Los resultados se presentan en las
tablas 4 a 6. De nuevo, los liposomas presentaron farmacocinéticas
típicas de circulación prolongada, con una retención media superior
al 70% en la dosis inyectada después de 4 horas y superior al 30%
después de 24 horas.
Animal nº | 0,0 h | 0,5 h | 1,0 h | 2,0 h | 4,0 h | 24 h |
Rata 1 | 103,7 | 91,2 | 82,5 | 73,8 | 72,0 | 33,1 |
Rata 2 | 97,7 | 87,7 | 79,4 | 78,7 | 74,4 | 30,7 |
Rata 3 | 95,1 | 83,1 | 77,8 | 68,6 | 64,4 | 29,8 |
Rata 4 | 91,9 | 85,4 | 78,5 | 75,6 | 72,6 | 33,2 |
Promedio | 97,1 | 86,8 | 79,6 | 74,2 | 70,9 | 31,7 |
Desv. tip. | 5,0 | 3,4 | 2,1 | 4,2 | 4,4 | 1,7 |
Tejido | Rata nº 1 | Rata nº 2 | Rata nº 3 | Rata nº4 | Promedio | Desv. típ. |
Hígado | 7,5 | 6,9 | 6,7 | 7,2 | 7,1 | 0,3 |
Bazo | 4,9 | 5,4 | 5,6 | 4,8 | 5,2 | 0,4 |
Corazón | 0,4 | 0,5 | 0,5 | 0,6 | 0,5 | 0,1 |
Riñones | 1,2 | 1,2 | 1,0 | 1,2 | 1,1 | 0,1 |
Pulmón | 0,7 | 0,7 | 0,7 | 0,8 | 0,7 | 0,1 |
Piel | 0,1 | 0,3 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,1 |
Huesos | 0,3 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 |
Músculo | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,2 | 0,1 | 0,4 |
Orina* | 11,2 | 13,4 | 5,7 | 12,3 | 10,7 | 3,4 |
Tejido | Rata nº 1 | Rata nº 2 | Rata nº 3 | Rata nº4 | Promedio | Desv. std. |
Hígado | 0,7 | 0,7 | 0,7 | 0,7 | 0,7 | 0,3 |
Bazo | 7,3 | 6,9 | 8,2 | 5,9 | 7,1 | 0,9 |
Corazón | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,4 |
Riñones | 0,6 | 0,6 | 0,5 | 0,6 | 0,6 | 0,6 |
Pulmón | 0,6 | 0,5 | 0,5 | 0,6 | 0,5 | 0,6 |
Piel | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 |
Huesos | 0,4 | 0,4 | 0,4 | 0,4 | 0,4 | 0,3 |
Músculo | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,2 |
Orina* | 0,6 | 0,6 | 0,3 | 0,8 | 0,6 | 0,2 |
* Porcentaje de dosis inyectada por ml. |
Por último, los liposomas que contienen 5% en
moles de mPEG_{2000}-c-DS o
mPEG_{2000}-DSPE y el PHEPC restante, se
compararon con el porcentaje que permanece en la sangre hasta 24
horas después de la administración. Como se muestra en la Figura 4,
las farmacocinéticas eran prácticamente idénticas, con
aproximadamente el 40% en retención tras 24 horas.
Los Ejemplos siguientes ilustran pero no
pretenden limitar en modo alguno la invención.
Se secó azeotrópicamente en tolueno (50 ml,
120ºC) una solución de mPEG_{2000} (20 g, 10 moles). Una vez que
la temperatura de la solución anterior alcanzó 25ºC, se trató con
cloroformato de nitrofenilo (3,015 g, 15 moles) seguido de TEA (2,01
ml, 15 moles). Esta mezcla se dejó reaccionar durante 1 ½ h. La sal
TEA se filtró y se eliminó el disolvente para dar el cloroformato de
mPEG_{2000}-nitrofenilo en bruto al que se añadió
una solución de aminopropanodiol
(3 g, 30 moles) en acetonitrilo (50 ml). Esta mezcla se agitó durante la noche a temperatura ambiente. Se eliminaron los insolubles por filtración y se evaporó el disolvente. Se recristalizó dos veces el producto en isopropanol. Rendimiento: 13,7 g, 65%. ^{1}HRMN: (300 MHz, DMSO-D_{6}) \delta 3,23 (s, OCH_{3}, 3 H), 3,65 (s, PEG, 180 H), 4,05 (t, uretano CH_{2}, 2 H), 4,42 (t, 1º OH, 1 H), 4,57 (d, 2º OH, 1 H).
(3 g, 30 moles) en acetonitrilo (50 ml). Esta mezcla se agitó durante la noche a temperatura ambiente. Se eliminaron los insolubles por filtración y se evaporó el disolvente. Se recristalizó dos veces el producto en isopropanol. Rendimiento: 13,7 g, 65%. ^{1}HRMN: (300 MHz, DMSO-D_{6}) \delta 3,23 (s, OCH_{3}, 3 H), 3,65 (s, PEG, 180 H), 4,05 (t, uretano CH_{2}, 2 H), 4,42 (t, 1º OH, 1 H), 4,57 (d, 2º OH, 1 H).
El producto, mPEG_{2000} aminopropanodiol (2,3
g, 1,08 moles, 2,17 meq de OH), se disolvió en tolueno (30 ml) y se
secó azeotrópicamente, eliminando aproximadamente 10 ml de la
solución. Se dejó enfriar la solución a temperatura ambiente. Se
añadió piridina (4 ml, 20%) con una pipeta, seguido de la adición de
cloruro de estearoílo (1 g,
4,3 moles). Se formó inmediatamente un precipitado blanco. La mezcla de reacción se calentó a reflujo durante la noche a 120ºC y se dejó enfriar. Cuando la temperatura del matraz de reacción alcanzó aproximadamente 40ºC, se filtró la sal de piridina. Se evaporó el filtrado. Se purificó el producto (PEG_{2000}-c-DS) recristalizando dos veces en isopropanol (2 \times 30 ml) y se secó al vacío sobre P_{2}O_{5}.
4,3 moles). Se formó inmediatamente un precipitado blanco. La mezcla de reacción se calentó a reflujo durante la noche a 120ºC y se dejó enfriar. Cuando la temperatura del matraz de reacción alcanzó aproximadamente 40ºC, se filtró la sal de piridina. Se evaporó el filtrado. Se purificó el producto (PEG_{2000}-c-DS) recristalizando dos veces en isopropanol (2 \times 30 ml) y se secó al vacío sobre P_{2}O_{5}.
Rendimiento: 2,26 g, 80%. TLC
(cloroformo:metanol, 90:10): mPEG aminopropanodiol R_{f}=0,266;
PEG-c-DS
R_{f} = 0,533. ^{1}HRMN: (300 MHz, DMSO-D_{6}) \delta 0,89 (t, CH_{3}, 6 H), 1,26 (s, CH_{2}, 56 H), 1,50 (2t, 2CH_{2}, 4 H), 2,24 (t, CH_{2}CH_{2} C=O, 4 H), 3,23 (s, OCH_{3}, 3 H), 3,50 (s, PEG, 180 H), 4,00 (dd, CH_{2} de APD, 1 H), 4,02 (t, CH_{2}OC=O-N, 2 H), 4,20 (dd, CH_{2} de APD, 1 H), 4,98 (m, CHOC(O), 1 H), 7,34 (m, NH, 1 H).
R_{f} = 0,533. ^{1}HRMN: (300 MHz, DMSO-D_{6}) \delta 0,89 (t, CH_{3}, 6 H), 1,26 (s, CH_{2}, 56 H), 1,50 (2t, 2CH_{2}, 4 H), 2,24 (t, CH_{2}CH_{2} C=O, 4 H), 3,23 (s, OCH_{3}, 3 H), 3,50 (s, PEG, 180 H), 4,00 (dd, CH_{2} de APD, 1 H), 4,02 (t, CH_{2}OC=O-N, 2 H), 4,20 (dd, CH_{2} de APD, 1 H), 4,98 (m, CHOC(O), 1 H), 7,34 (m, NH, 1 H).
Se utilizó un procedimiento similar para preparar
mPEG-c-DS utilizando polímeros de
mPEG de peso molecular 750, 5.000 y 12.000. Se verificaron las
estructuras por ^{1}H-RMN y espectrometría de
masas. Los pesos moleculares determinados por MALDI
(desorbción/ionización con láser asistida por la matriz) se
proporcionan a conti-
nuación:
nuación:
Conjugado | PM por MALDI |
mPEG(750)-c-DS | 1.426 |
mPEG(2000)-c-DS | 2.892 |
mPEG(5000)-c-DS | 5.816 |
mPEG(12000)-c-DS | 12.729 |
En un matraz de fondo redondo de 100 ml, se
disolvió ácido ecosanoico (500 mg, 1,6 mmoles) en tolueno
(20 ml) y se añadió con una pipeta cloruro de oxalilo (147 \mul, 1,68 mmoles). A la reacción en agitación, se añadió DMF al 1%. Durante la adición de DMF, se liberó gas. Debe evitarse todo contacto con este gas. Tras 10 minutos, se evaporó el tolueno y se añadieron 20 ml más de tolueno y se evaporó hasta eliminar cualquier exceso de cloruro de oxalilo. Se redisolvió el residuo en 10 ml de tolueno. Se añadió mPEG-aminopropanodiol, preparado como se describió anteriormente, (1,19 g, 0,56 mmoles) a la solución, se unió un condensador de reflujo y la mezcla se calentó a reflujo durante la noche. El análisis por TLC (metanol y cloroformo, 9:1) demostró que la reacción era completa. Una vez enfriada la mezcla de reacción, se filtró el material no disuelto y el filtrado se llevó a sequedad. Se purificó el producto recristalizando tres veces en isopropanol y se secó al vacío sobre P_{2}O_{5}. Rendimiento: 1,0 mg, 70%. ^{1}HRMN: (360 MHz, DMSO-D_{6}) \delta 0,89 (t, CH_{3}, 6 H), 1,26 (s, CH_{2}, 66 H de lípido), 1,50 (t, 2CH_{2}, 4 H), 2,24 (t, CH_{2}CH_{2} C=O, 4 H), 3,23 (s, OCH_{3}, 3 H), 3,50 (s, PEG, 180 H), 4,00 (dd, CH_{2} de APD, 1 H), 4,05 (t, CH_{2}^{j}CH_{2}C+O, 4 H), 3,23 (s, OCH_{3}, 3 H, 3,50 (s, PEG, 180 H), 4,00 (dd, CH_{2} de APD, 1 H), 4,05 (t, CH_{2}OC=O-N, 2 H), 4,20 (dd, CH_{2} de APD, 1 H), 4,98 (m, CHOC(O), 1 H), 7,34 (m, NH, 1 H) ppm.
(20 ml) y se añadió con una pipeta cloruro de oxalilo (147 \mul, 1,68 mmoles). A la reacción en agitación, se añadió DMF al 1%. Durante la adición de DMF, se liberó gas. Debe evitarse todo contacto con este gas. Tras 10 minutos, se evaporó el tolueno y se añadieron 20 ml más de tolueno y se evaporó hasta eliminar cualquier exceso de cloruro de oxalilo. Se redisolvió el residuo en 10 ml de tolueno. Se añadió mPEG-aminopropanodiol, preparado como se describió anteriormente, (1,19 g, 0,56 mmoles) a la solución, se unió un condensador de reflujo y la mezcla se calentó a reflujo durante la noche. El análisis por TLC (metanol y cloroformo, 9:1) demostró que la reacción era completa. Una vez enfriada la mezcla de reacción, se filtró el material no disuelto y el filtrado se llevó a sequedad. Se purificó el producto recristalizando tres veces en isopropanol y se secó al vacío sobre P_{2}O_{5}. Rendimiento: 1,0 mg, 70%. ^{1}HRMN: (360 MHz, DMSO-D_{6}) \delta 0,89 (t, CH_{3}, 6 H), 1,26 (s, CH_{2}, 66 H de lípido), 1,50 (t, 2CH_{2}, 4 H), 2,24 (t, CH_{2}CH_{2} C=O, 4 H), 3,23 (s, OCH_{3}, 3 H), 3,50 (s, PEG, 180 H), 4,00 (dd, CH_{2} de APD, 1 H), 4,05 (t, CH_{2}^{j}CH_{2}C+O, 4 H), 3,23 (s, OCH_{3}, 3 H, 3,50 (s, PEG, 180 H), 4,00 (dd, CH_{2} de APD, 1 H), 4,05 (t, CH_{2}OC=O-N, 2 H), 4,20 (dd, CH_{2} de APD, 1 H), 4,98 (m, CHOC(O), 1 H), 7,34 (m, NH, 1 H) ppm.
Se secó azeotrópicamente
tBu-O-PEG-2000
de Polymer Labs (10 g, 5 mmoles) disolviendo en 120 ml de tolueno y
eliminando aproximadamente 20 ml del disolvente, recogiendo
cualquier vestigio de agua en una trampa Dean Stark.
La solución se enfrió a temperatura ambiente y se
añadió fosgeno (15 ml). Se dejó reaccionar la mezcla durante la
noche a temperatura ambiente. Una vez terminada la reacción, se
eliminó el disolvente en un evaporador rotativo. Se añadieron
aproximadamente 50 ml de tolueno reciente y se eliminó en el
evaporador rotativo. Se disolvió el residuo en tolueno anhidro (30
ml) y cloruro de metileno (10 ml). A esta solución, se añadieron
N-hidroxisuccinimida
(1,7 g, 14,8 mmoles) y trietilamina (2,1 ml, 14,9 mmoles) y se dejó reaccionar la mezcla durante la noche a temperatura ambiente, tras lo cual se completó la reacción por TLC.
(1,7 g, 14,8 mmoles) y trietilamina (2,1 ml, 14,9 mmoles) y se dejó reaccionar la mezcla durante la noche a temperatura ambiente, tras lo cual se completó la reacción por TLC.
Compuesto | R_{f}(CHCl_{3}:CH_{3}OH, 90:10) |
t-Bu-O-PEG-OH | 0,44 |
t-Bu-O-PEG-OSc | 0,51 |
Se filtró la sal procedente de la mezcla de
reacción, se eliminó el disolvente por evaporación y se recristalizó
dos veces el sólido en alcohol isopropílico y se secó sobre
P_{2}O_{5}. Rendimiento: 9,2, 85%. ^{1}HRMN: (CDCl_{3}, 360
MHz) \delta 1,25 (s, t-Bu, 9 H), 2,82 (s, CH_{2}CH_{2},
4 H), 3,60 (s, PEG, 180 H), 4,45 (t, CH_{2}OCONH, 2 H) ppm.
A una solución de aminopropanodiol (300 mg, 3,2
mmoles) en DMF (10 ml), se añadió
t-Bu-PEG-OSc (5 g,
2,29 mmoles) y se dejó reaccionar durante la noche. Se consumió todo el éster de NHS, dando una mezcla que presenta una mancha en TLC.
2,29 mmoles) y se dejó reaccionar durante la noche. Se consumió todo el éster de NHS, dando una mezcla que presenta una mancha en TLC.
Compuesto | R_{f}(CHCl_{3}:CH_{3}OH, 90:10) |
t-Bu-O-PEG-OSc | 0,51 |
t-Bu-O-PEG-APD | 0,35 |
Se añadió una resina de intercambio iónico ácida
lavada previamente (\sim 1 g) a la mezcla de reacción y se eliminó
por filtración después de 30 minutos. Se eliminó el disolvente y se
recristalizó el residuo en 200 ml de alcohol isopropílico. Se
recogió el sólido y se secó sobre P_{2}O_{5}. Rendimiento: 4,2,
85%. ^{1}HRMN: (D6-DMSO, 360 MHz) \delta 1,25
(s, t-Bu, 9 H), 3,68 (s, PEG, 180 H), 4,03 (t, CH_{2}OCONH,
2 H), 4,43 (t, 1º OH, 1 H), 4,55 (d, 2º OH, 1 H), 6,98 (t, NH, 1 H)
ppm.
Se secó azeotrópicamente
Bn-O-PEG-2000 de
Shearwater Polymers (Huntsville, LA; 5 g, 2,41 mmoles) disolviendo
en 120 ml de tolueno y eliminando aproximadamente 20 ml del
disolvente, recogiendo cualquier vestigio de agua en una trampa Dean
Stark. Se enfrió la solución a temperatura ambiente y se evaporó el
disolvente restante a presión reducida.
Se disolvió el residuo en 30 ml de cloruro de
metileno/acetato de etilo (60:40) y se añadieron cloroformato
de
p-nitrofenio (729 mg, 3,6 mmoles) y trietilamina (1 ml, 7,2 mmoles). La reacción se llevó a 4ºC durante 8 a 16 horas. Este método ralentiza la reacción pero elimina la formación de bis PEG-carbonato. Una mancha visible al UV en placa de sílice GF indicó la terminación de la reacción.
p-nitrofenio (729 mg, 3,6 mmoles) y trietilamina (1 ml, 7,2 mmoles). La reacción se llevó a 4ºC durante 8 a 16 horas. Este método ralentiza la reacción pero elimina la formación de bis PEG-carbonato. Una mancha visible al UV en placa de sílice GF indicó la terminación de la reacción.
Se trató la mezcla de reacción con resina de
intercambio iónico ácida y básica previamente lavada durante 30
minutos, se filtró y se llevó a sequedad completa. Se recristalizó
el producto en alcohol isopropílico y se secó sobre P_{2}O_{5}.
Rendimiento: 4,4 g, 80%.
A una solución de aminopropanodiol (260 mg, 1,9
mmoles) en DMF (10 ml), se añadió
Bn-PEG-NPC, preparado anteriormente
(4,3 g, 2,9 mmoles) y se dejó reaccionar durante 5 horas. Se
consumió todo el Bn-PEG-NPC, dando
la mezcla de reacción una mancha en TLC (cloroformo:metanol:agua
90:18:2).
Se trató la mezcla de reacción con 5 g de resina
de intercambio iónico ácida previamente lavada durante 30 minutos,
se filtró y se llevó a sequedad completa. Se recristalizó el
producto en alcohol isopropílico y se secó sobre P_{2}O_{5}.
Rendimiento: 3,8 g, 91%.
Una solución de
Bn-O-PEG-aminopropanodiol
(3 g, 1,36 mmoles), ácido esteárico (1,94 g, 6,79 mmoles) y DPTS
(4-toluensulfonato de
4-(dimetilamino)piridinio) como catalizador (408 mg, 1,36
mmoles) se agitó a temperatura ambiente durante 20 minutos. Se
añadió con pipeta diisopropilcarbodiimida (1,28 ml, 8,16 mmoles) y
se dejó la mezcla reaccionar durante la noche. TLC
(cloroformo:metanol, 90:10) presentó la reacción completa del
diol.
Se añadió resina de intercambio iónico básica
(\sim 5 g) a la mezcla de reacción. Tras 30 minutos de agitación,
se filtró la resina y el filtrado se llevó a sequedad. Se
recristalizó el residuo en isopropanol (100 ml) y se secó sobre
P_{2}O_{5}. Rendimiento: 4 g, 80%.
Se siguieron dos métodos diferentes para la
desprotección del grupo bencilo de
Bn-O-PEG-c-DS.
Método
1
A una solución de
Bn-O-PEG-c-DS
(218 mg, 0,08 mmoles) en 5 ml de metanol, se añadieron Pd al
10%/C
(110 mg) y formato amónico (107 mg, 0,8 mmoles) y se dejó reaccionar la mezcla a temperatura ambiente durante la noche. Se eliminó el Pd/C por filtración sobre Celite® y el filtrado se llevó a sequedad. Se disolvió el residuo en cloroformo y se secó tres veces con NaCl saturado. Se recogió la fase de cloroformo, se secó con MgSO_{4}, se filtró y se concentró. El residuo sólido se liofilizó en tBuOH y se secó el polvo resultante sobre P_{2}O_{5}. Rendimiento: 80%,
175 mg.
(110 mg) y formato amónico (107 mg, 0,8 mmoles) y se dejó reaccionar la mezcla a temperatura ambiente durante la noche. Se eliminó el Pd/C por filtración sobre Celite® y el filtrado se llevó a sequedad. Se disolvió el residuo en cloroformo y se secó tres veces con NaCl saturado. Se recogió la fase de cloroformo, se secó con MgSO_{4}, se filtró y se concentró. El residuo sólido se liofilizó en tBuOH y se secó el polvo resultante sobre P_{2}O_{5}. Rendimiento: 80%,
175 mg.
Método
2
Se enfrió en un baño con hielo durante 5 minutos
una solución de
Bn-O-PEG-c-DS
(1,18 g, 0,43 mmoles) en cloruro de metileno (10 ml). Se transfirió
el tetracloruro de titanio (3 ml, 21,5 moles, en exceso) mediante
una jeringuilla secada en la estufa en un matraz de reacción
sellado. Después de 5 minutos, se retiró el baño de hielo y se
realizó la reacción de desprotección durante la noche a temperatura
ambiente. La desprotección completa se demostró mediante una mancha
inferior desplazada (en comparación con el material de partida) en
una placa TLC de sí-
lice GF.
lice GF.
Se añadieron aproximadamente 40 ml de cloroformo
a la mezcla de reacción y la mezcla se transfirió a un embudo
separador que contenía 40 ml de NaHCO_{3} saturado. La mezcla se
agitó suavemente (para impedir la formación de una emulsión) y se
recogió la capa de cloroformo. Esta extracción se repitió 3 veces, y
se recogió la fase de cloroformo y se extrajo una vez más con una
fracción reciente de NaHCO_{3} saturado para asegurar la
eliminación completa del TiCl_{4}. La fase de cloroformo recogida
se secó con MgSO_{4}, se filtró y se concentró.
El residuo anterior se disolvió en 1 ml de
cloroformo y se añadió a una columna preparada de gel de sílice (200
a 400 mesh, 60 \ring{A}). La polaridad de la fase móvil
(cloroformo) se incrementó mediante adiciones en incrementos del 2%
en metanol hasta que el producto eluyó en 10% en metanol/90% en
cloroformo. Se recogió el producto y se eliminó el disolvente en un
evaporador rotativo. Se liofilizó el sólido en tBuOH y se
secó sobre P_{2}O_{5}. Rendimiento: 70%,
800 mg.
800 mg.
Antes del comienzo de la reacción, se secaron
meticulosamente el matraz de reacción, la barra de agitación, las
jeringuillas y el material de partida
(HO-PEG-c-DS,
preparado anteriormente).
A una solución de
HO-PEG-c-DS (1,2 g,
0,45 mmoles) en 10 ml de cloruro de metileno/acetato de etilo
(60:40), se añadieron carbonato de p-nitrofenilo (136 mg,
0,65 mmoles) y trietilamina (188 \mul, 1,35 mmoles). Se llevó la
reacción a 4ºC (para eliminar la formación de carbonato de bisPEG)
durante 8 a 16 horas, tras cuyo periodo la reacción se completó
mediante TLC en gel de sílice GF.
Compuesto | R_{f}(CHCl_{3}: CH_{3}OH, 90:10) |
HO-PEG-c-DS | 0,40 |
NPC-PEG-c-DS | 0,54 |
La mezcla de reacción se trató durante 30 minutos
con resinas de intercambio iónico ácidas y básicas lavadas
previamente y se filtró. Se llevó el filtrado a sequedad completa y
se recristalizó el residuo en alcohol isopropílico. Se secó el
sólido sobre P_{2}O_{5}. Rendimiento: 70%. ^{1}HRMN:
(D_{6}-DMSO, 360 MHz) \delta 0,86 (t, CH_{3},
6 H), 1,22 (s, DS, 56 H), 1,48 (m,
CH_{2}CH_{2}(CO)), 4 H), 2,26 (2 xt,
CH_{2}OCONH, 2 H), 4,03 y 4,22 (2 xd, CH_{2}CH de
lípido, 2 H), 4,97 (M, CHCH_{2} de lípido), 6,98 (t, NH, 1
H), 7,55%, 8,32 (2 xd, aromático, 4 H) ppm.
Se formaron películas de lípidos, por disolución
y eliminación del disolvente, a partir de mezclas de lípido
HSPC:Chol:PEG en las relaciones siguientes:
- A: 58:39:3; lípido con PEG = PEG-c-DS
- B: 57:38:5; lípido con PEG = PEG-DSPE
- C: 57:38:5; lípido con PEG = PEG-c-DS
Se hidrataron las películas en
^{125}I-tiraminilinulina recién preparada en HEPES
25 mM que contenía NaCl 140 mM, pH 7,4 y se extruyeron para formar
liposomas de 100 a 105 nm de diámetro. Se esterilizaron los
liposomas mediante filtración a través de filtros acabados en
jeringuilla con enlaces proteicos bajos de 0,22 \mum de Millipore
(Millipore Corporation, Bedford, MA). Se hizo el recuento de
alícuotas para determinar los recuentos de la inyección de
^{125}I. Se determinaron las concentraciones de lípidos analizando
el contenido en fosfato de las preparaciones de liposoma y las
preparaciones de liposomas se diluyeron en tampón esterilizado hasta
una concentración final de 2,5 \mumoles/ml. Se inyectó a los
ratones por vía iv en la vena de la cola con 0,2 ml de liposomas
diluidos, de forma que cada ratón recibió 0,5 \mumoles de
fosfolípido. En los diversos puntos de tiempo, se practicó la
eutanasia a los ratones mediante anestesia con halotano seguida de
dislocación cervical, se tomaron muestras de sangre mediante
extracciones de sangre cardíacas y se analizaron la sangre y varios
órganos por recuentos de ^{125}I.
Claims (11)
1. Lipopolímero neutro de fórmula:
en la
que:
cada R^{1} y R^{2} es independientemente un
grupo alquilo o alquenilo que tiene entre 8 y 24 átomos de
carbono;
n = 100 a 300,
Z se selecciona de entre el grupo constituido por
hidroxi, alcoxi, benciloxi, éster carboxílico, éster sulfónico,
carbonato de alquilo o arilo, amino y alquilamino; y
L es
-X-(C=O)-Y-CH_{2}-, en la que X e
Y se seleccionan independientemente de entre oxígeno y NH.
2. Lipopolímero según la reivindicación 1, en el
que X es oxígeno e Y es NH.
3. Lipopolímero según la reivindicación 1, en el
que L es un enlace carbamato o un enlace carbonato.
4. Lipopolímero según la reivindicación 3, en el
que L es -O-(C=O)-NH-CH_{2}- (un
enlace carbamato).
5. Lipopolímero según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que Z es hidroxi o metoxi.
6. Lipopolímero según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que cada R^{1} y R^{2} es
independientemente un grupo alquilo o alquenilo que tiene entre 8 y
24 átomos de carbono.
7. Lipopolímero según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que cada R^{1} y R^{2} es
C_{17}H_{35}.
8. Lipopolímero según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que n está comprendida entre 20 y
115.
9. Composición liposómica que comprende desde
sustancialmente 1 por ciento en moles hasta sustancialmente 10 por
ciento en moles de un lipopolímero neutro como el definido en
cualquiera de las reivindicaciones anteriores y lípidos formadores
de vesículas.
10. Composición según la reivindicación 9, que
comprende sustancialmente 3 por ciento en moles a sustancialmente 6
por ciento en moles del lipopolímero neutro.
11. Método de aumento del tiempo de circulación
de un liposoma que comprende lípidos formadores de vesículas,
comprendiendo el método:
incorporar en dicho liposoma, con los lípidos
formadores de vesículas, un lipopolímero neutro según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 8.
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