ES2255501T3

ES2255501T3 - Lipopolimeros neutros y composiciones liposomicas que los contienen.

Info

Publication number: ES2255501T3
Application number: ES00945341T
Authority: ES
Inventors: Samuel Zalipsky
Original assignee: Alza Corp
Current assignee: Alza Corp
Priority date: 1999-07-14
Filing date: 2000-07-12
Publication date: 2006-07-01
Anticipated expiration: 2020-07-12
Also published as: EP1198490B1; AU5930300A; PT1198490E; NO20020175L; DE60026030D1; HK1048484B; US6586001B1; IL147564A0; CA2379060A1; BR0012443A; DE60026030T2; HUP0202177A3; RU2250911C2; PL352711A1; KR100758158B1; MXPA02000402A; ZA200200303B; HUP0202177A2; KR20020012008A; HK1048484A1

Abstract

Lipopolímero neutro de fórmula: en la que: cada R1 y R2 es independientemente un grupo alquilo o alquenilo que tiene entre 8 y 24 átomos de carbono; n = 100 a 300, Z se selecciona de entre el grupo constituido por hidroxi, alcoxi, benciloxi, éster carboxílico, éster sulfónico, carbonato de alquilo o arilo, amino y alquilamino; y L es ¿X-(C=O)-Y-CH2-, en la que X e Y se seleccionan independientemente de entre oxígeno y NH.

Description

Lipopolímeros neutros y composiciones liposómicas que los contienen.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a lipopolímeros neutros sustituidos con PEG y a su utilización en liposomas con tiempo de circulación prolongado. Los liposomas que contienen estos lipopolímeros proporcionan tiempos de circulación sanguínea similares en comparación con los liposomas que incorporan fosfolípidos convencionales sustituidos con PEG cargados negativamente.

Antecedentes de la invención

Los liposomas se utilizan para varios fines terapéuticos, y en particular, para transportar agentes terapéuticos a las células diana mediante la administración generalizada de formulaciones liposómicas de estos agentes. Las formulaciones farmacéuticas de liposomas ofrecen ventajosamente el potencial de mejores propiedades de administración farmacéutica, que incluyen, por ejemplo, la liberación controlada del fármaco. con frecuencia se necesita un tiempo de circulación prolongado para que los liposomas alcancen una zona, célula o punto diana. En particular, esto es necesario cuando la zona, célula o punto diana no está situado cerca del punto de inyección. Por ejemplo, cuando los liposomas se administran por vía general, es deseable recubrir los liposomas con un agente hidrófilo, por ejemplo, un recubrimiento de cadenas de polímero hidrófilas tales como polietilenglicol (PEG) para prolongar la duración de los liposomas en la circulación sanguínea. Dichos liposomas modificados en la superficie se denominan normalmente liposomas de "circulación prolongada" o "estéricamente estabilizados".

La modificación superficial más frecuente en un liposoma es el acoplamiento de cadenas de PEG, que tienen específicamente un peso molecular desde aproximadamente 1.000 daltons (Da) hasta aproximadamente 5.000 Da, para aproximadamente el 5 por ciento (%) en moles de los lípidos que constituyen los liposomas (véase, por ejemplo, Stealth Liposomes, CRC Press, Lasic, D. y Martin, F., eds., Boca Ratón, FL (1995)) y las referencias citadas en la misma. Las farmacocinéticas presentadas por dichos liposomas se caracterizan por una reducción independiente de la dosis de la absorción de los liposomas por el hígado y el bazo a través del sistema de fagocitos mononucleares (MPS) y por la duración en la circulación sanguínea significativamente prolongada, en comparación con los liposomas no modificados en superficie, que tienden a ser rápidamente eliminados de la sangre y acumulados en el hígado y
el bazo.

Los fosfolípidos sustituidos con PEG utilizados más frecuentemente y comercialmente disponibles se basan en fosfatidiletanolamina (PE), normalmente DSPE (distearoilfosfatidiletanolamina) que está cargada negativamente en el grupo polar de cabeza. La carga superficial negativa en un liposoma puede ser ventajosa en algunos aspectos, p. ej., en interacciones con células (véase, por ejemplo, Miller et al., Biochemistry, 34: 12875-12883 (1998)), y en la administración de fármacos catiónicos, donde puede producirse la fuga del fármaco (véase, por ejemplo, Webb et al., Biochim. Biophys. Acta, 1372:272-282 (1998)).

Por consiguiente sería beneficioso proporcionar lípidos no cargados derivados de PEG que se incorporen eficazmente en las bicapas de lípido y proporcionen tiempos prolongados en la circulación sanguínea a los liposomas. Teóricamente, dichos lípidos son de baja toxicidad y producidos fácilmente.

Sumario de la invención

En un aspecto, la presente invención incluye una composición liposómica que tiene desde aproximadamente 1 por ciento en moles hasta aproximadamente 10 por ciento en moles de un lipopolímero neutro en la que el lipopolímero neutro está representado por la fórmula:

1

en la que:

cada R^{1} y R^{2} es independientemente una cadena con alquilo o alquenilo que tiene entre 8 átomos de carbono y 24 átomos de carbono;

n está comprendida entre 10 y 300,

Z se selecciona de entre el grupo constituido por hidroxi, alcoxi, benciloxi, éster carboxílico, éster sulfónico, carbonato de alquilo o arilo, amino y alquilamino; y

L es -X-(C=O)-Y-CH_{2}-,

en la que X e Y se seleccionan independientemente de entre oxígeno y NH.

Preferentemente, la composición incluye desde aproximadamente 3 por ciento en moles a aproximadamente 6 por ciento en moles del lipopolímero neutro.

En otro aspecto, L es un enlace hidrolizable tal como un enlace carbamato, o un enlace carbonato. En otro aspecto aún, Z es hidroxi o metoxi. Preferentemente, R^{1} y R^{2} no están ramificados. En otro aspecto, R^{1} y R^{2} son ambos grupos estearilo (C_{17}H_{35}). En otro aspecto, el valor de n está comprendido preferentemente entre 20 y 115, de modo que el peso molecular del grupo PEG está comprendido aproximadamente entre 1.000 Da y aproximadamente 5.000 Da.

La invención proporciona también un método para aumentar el tiempo en la circulación sanguínea de un liposoma que contiene lípidos formadores de vesículas, incorporando en el liposoma aproximadamente 1 por ciento en moles a aproximadamente 10 por ciento en moles de un lipopolímero neutro que tiene la fórmula presentada anteriormente. La invención proporciona además los lipopolímeros representados por esta fórmula.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 presenta un esquema de la síntesis para la preparación de un lipopolímero no cargado ligado al carbamato, denominado en la presente memoria PEG-c-DS;

las Figuras 2A-2D presentan los esquemas de la síntesis para la preparación de lipopolímeros no cargados ligados a éter, éster, amida y ceto;

las Figuras 3A-3C son gráficos que presentan la biodistribución de liposomas HSPC/Chol que contienen 3 por ciento en moles de PEG-c-DS (A); 5 por ciento en moles de PEG-DSPE (B); o 5 por ciento en moles de PEG-c-DS (C) en la sangre, hígado y bazo;

la Figura 4 es gráfico que presenta la retención en la sangre de liposomas exentos de HSPC PEG 2:1 (cruces), es decir, sin PEG, 5 por ciento en moles de PEG-DSPE (triángulos) y 5 por ciento en moles de PEG-c-DS (círculos); y

la Figura 5 es un gráfico que presenta la retención en la sangre de liposomas con PHEPC que contienen 5 por ciento en moles de PEG-c-DS (círculos) y 5 por ciento en moles de PEG-c-DSPE (cuadrados).

Descripción detallada de la invención I. Definiciones

Tal como se utiliza en la presente memoria el término lipopolímero "neutro" se refiere a un lipopolímero que está descargado, es decir, que no tiene carácter iónico.

"Lípidos formadores de vesículas" se refiere a los lípidos anfóteros que tienen restos hidrófobos y del grupo con cabeza polar. Dichos lípidos formadores de vesículas pueden formarse espontáneamente en las vesículas bicapa en agua como se ejemplifica mediante los fosfolípidos, o pueden incorporarse establemente en las bicapas de lípido, en las que el grupo hidrófobo está en contacto con el interior, es decir, una zona hidrófoba de la membrana bicapa y el resto del grupo de cabeza polar está orientado hacia el exterior, es decir, la superficie polar de la membrana. Una clase de lípidos formadores de vesículas de este tipo incluye específicamente una o dos cadenas hidrocarbonadas de acilo hidrófobo o un grupo esteroide y pueden contener un grupo químicamente reactivo (tal como una amina, ácido, éster, aldehído o alcohol) en el grupo con cabeza polar. En esta clase se incluyen los fosfolípidos, tal como la fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE), ácido fosfatídico (PA), fosfatidilinositol (PI) y esfingomielina (SM), en los que las dos cadenas hidrocarbonadas son normalmente de aproximadamente 14 hasta aproximadamente 22 átomos de carbono de longitud y tienen varios grados de insaturación. Otros lípidos formadores de vesículas incluyen los glicolípidos, tal como los cerebrósidos y los gangliósidos, y los esteroles, tal como el colesterol. Para las composiciones descritas en la presente memoria, los fosfolípidos, tales como PC y PE, colesterol y los lipopolímeros neutros descritos en la presente memoria son los componentes preferidos.

"Alquilo" se refiere a un radical monovalente totalmente saturado que contiene carbono e hidrógeno, que puede ser una cadena ramificada o lineal. Ejemplos de grupos alquilo son metilo, etilo, n-butilo, t-butilo, n-heptilo e isopropilo. "Alquilo inferior" se refiere a un radical alquilo desde aproximadamente uno a aproximadamente seis átomos de carbono, ejemplificados por metilo, etilo, n-butilo, i-butilo, t-butilo, isoamilo, n-pentilo e isopentilo.

"Alquenilo" se refiere a un radical monovalente que contiene carbono e hidrógeno, que puede estar ramificado o ser una cadena lineal y contiene por lo menos un doble enlace.

Abreviaturas: PEG: polietilenglicol; mPEG: polietilenglicol terminado en metoxi; Chol: colesterol; PC: fosfatidilcolina; PHPC: fosfatidilcolina parcialmente hidrogenada; PHEPC: fosfatidilcolina de huevo parcialmente hidrogenada; HSPC: fosfatidilcolina de soja hidrogenada; DSPE: diasteroilfosfatidiletanolamina; DSP o PEG-c-DS: diastearoil PEG (ligado a carbamato); APD: 1-amino-2,3-propanodiol; DTPA: ácido dietilentetraminpentaacético; Bn: bencilo.

II. Lipopolímeros neutros

Los lipopolímeros neutros sustituidos con PEG de la invención tienen la estructura presentada a continuación:

2

en la que:

cada R^{1} y R^{2} es independientemente una cadena con alquilo o alquenilo que tiene entre 8 y 24 átomos de carbono;

n está comprendida entre 10 y 300,

L es -X-(C=O)-Y-CH_{2}-,

en la que X e Y se seleccionan independientemente de entre oxígeno y NH.

Los lipopolímeros incluyen un enlace neutro (L) en lugar del enlace fosfato con carga de PEG-fosfolípidos, tal como PEG-DSPE, que se emplea frecuentemente en los liposomas estéricamente estabilizados. Este enlace neutro se selecciona de entre un carbamato, un carbonato y una urea. En las aplicaciones en las que sea deseable eliminar las cadenas de PEG tras un tiempo de circulación dado in vivo se prefieren los enlaces hidrolizables o si no escindibles, tal como los carbamatos y los carbonatos. Esta característica puede ser útil en la liberación del fármaco o para facilitar la absorción en las células una vez que el liposoma ha alcanzado su objetivo (Martin et al., patente US nº 5.891.468; Zalipsky et al., publicación PCT nº WO 98/18813 (1998)).

El grupo PEG unido al grupo de enlace preferentemente tiene un peso molecular desde aproximadamente 1.000 Da hasta aproximadamente 15.000 Da; esto es, en el que n está comprendido entre 20 y 340. Más preferentemente, el peso molecular es de 1.000 Da a 12.000 Da (n = 20 a 275) y más preferentemente entre 1.000 Da a 5.000 Da
(n = 20 a 115). R^{1} y R^{2} están comprendidos entre 8 átomos de carbono y 24 átomos de carbono y preferentemente están comprendidos entre 16 y 20 átomos de carbono de longitud. Más preferentemente, R^{1}=R^{2}=G_{17}H_{35} de modo que COOR es un grupo estearilo.

Como se indicó anteriormente, la incorporación de un lípido sin carga en un liposoma puede presentar ventajas significativas, tal como la pérdida reducida de un fármaco catiónico encapsulado. Además, otra ventaja es una mayor flexibilidad de la modulación de las interacciones de la superficie liposómica con las células diana y con el RES (Miller et al., Biochemistry, 37:12875-12883 (1998)). Se han utilizado ceramidas sintéticas sustituidas con PEG como componentes sin carga de liposomas estéricamente estabilizados (Webb et al., Biochim. Biophys. Acta. 1372: 272-282 (1998)); sin embargo, estas moléculas son complejas y costosas de preparar y generalmente no se llenan en el interior de la bicapa de fosfolípido así como en los glicerofosfolípidos de diacilo.

Los lipopolímeros pueden prepararse utilizando métodos de síntesis habituales. Por ejemplo, el compuesto unido al carbamato (L = -O-(C=O)-NH-CH_{2}-) se prepara, como se muestra en la Fig. 1, haciendo reaccionar el hidróxido terminal de mPEG (metoxi-PEG) con cloroformato de p-nitrofenilo para proporcionar el carbonato de p-nitrofenilo. Este producto se hace reaccionar a continuación con 1-amino-2,3-propanodiol para dar el carbamato intermedio. Los grupos hidroxilo del diol se acilan para dar el producto final. Una síntesis similar, utilizando glicerol en lugar de 1-amino-2,3-propanodiol, puede utilizarse para producir un producto unido al carbamato (L = -O-(C=O)-O-CH_{2}-). La preparación de un diaesteroílo unido al carbamato y de lipopolímeros de diecosanoílo se describe también en el Ejemplo 1.

Como se presenta en la Fig. 2A, un lipopolímero unido a éter (L = -O-CH_{2}-) que no forma parte de la presente invención se prepara haciendo reaccionar el hidroxilo terminal de mPEG-OH con cloruro de glicidilo, hidrolizando el epóxido resultante y acilando el diol resultante. Los lipopolímeros unidos a éster que no forma parte de la presente invención (L = -O-(C=O)- o -O-(C=O)-CH_{2}-) pueden prepararse, por ejemplo, como se muestra en la Fig. 2B, haciendo reaccionar mPEG-OH con un derivado activado de acetonida de ácido glicérido (ácido 2,2-dimetil-1,3-dioxolano-4-carboxílico) o el homólogo del carbono cuatro, ácido 2,2-dimetil-1,3-dioxolano-4-acético. El diol se desprotege a continuación y se acila.

Las reacciones correspondientes que utilizan mPEG-NH_{2}, preparadas según el método descrito en Zalipsky et al., publicación PCT nº WO 98/18813 (1998), en lugar de mPEG-OH, pueden utilizarse para preparar lipopolímeros con enlaces amida, urea o amina (es decir, en los que L = -NH-(C=O)-NH-, -NH-(C=O)-CH_{2}-, -NH-(C=O)-NH-CH_{2}-, o -NH-CH_{2}-), estando el enlace urea comprendido dentro del alcance de la presente invención.

Los compuestos que no forman parte de la presente invención en los que L es -X-(C=O)-, en la que X es O o NH, pueden prepararse mediante la reacción de un PEG terminado en carboxilo activado (preparado por oxidación de PEG terminado en hidroxilo y activación del grupo carboxilo, por ejemplo, por conversión en el éster de nitrofenilo o reacción con DCC) con 1,2,3-propanotriol o 1-amilo-2,3-propanodiol, respectivamente (Fig. 2C). Un compuesto unido a ceto (es decir, en el que X es un enlace directo) que no forma parte de la presente invención puede prepararse por condensación de PEG terminado en aldehído (preparado por oxidación suave de PEG terminado en hidroxilo), por ejemplo, con el reactivo de Grignard de 1-bromo-2,3-propanodiol acetonida (Fig. 2D), seguido de oxidación a la cetona, en condiciones no ácidas e hidrólisis de la acetonida al diol. En cada caso, el diol se acila a continuación como es habitual.

El terminal del oligómero PEG no unido al grupo glicerol (terminal \alpha; grupo Z anterior) es normalmente hidroxi o metoxi, pero puede estar funcionalizado, según los métodos conocidos en la materia, para facilitar el acoplamiento de varias moléculas al lipopolímero neutro y/o para su utilización en el direccionamiento de los liposomas a una célula o tipo de tejido determinados o si no facilitar la administración del fármaco. Las moléculas que deben unirse pueden incluir, por ejemplo, proteínas, péptidos, sacáridos, anticuerpos o vitaminas. Los ejemplos 2 y 3 describen las etapas de la preparación de lipopolímeros funcionalizados en \alpha siguiendo vías similares a las descritas anteriormente, pero se preparan con oligómeros de PEG disponibles en el mercado en los que el terminal \alpha está sustituido por un grupo, tal como éter t-butílico o éter bencílico, que se transforma fácilmente en hidroxilo tras la síntesis de la porción lipídica de la molécula. Este terminal se activa a continuación, en este caso, mediante conversión a un carbonato de
p-nitrofenilo.

III. Farmacocinética del liposoma

Los liposomas de circulación prolongada se forman incorporando desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 10% en moles, y más preferentemente desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 6% en moles, de un lipopolímero neutro en los liposomas compuestos de lípidos formadores de vesículas. Para ilustrar, los liposomas que se incorporan desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 5% en moles de mPEG_{2000}-DSPE (diasteroilfosfatidiletanolamina) o lipopolímero unido al carbamato, se prepararon mPEG_{2000}-DS como se describe en el Ejemplo 4. El equilibrio de los lípidos consistía en HSPC y colesterol en una relación molar 1,5:1. Se cargaron los liposomas con el marcador ^{125}I-tiraminilinulina. Se inyectó una muestra de cada preparación en la vena de la cola de los ratones y se determinó la distribución del tejido en varios puntos de tiempo, como se describe en el Ejemplo 4. Las concentraciones presentes en la sangre, hígado y bazo se presentan en las Tablas 1-3 y se muestran gráficamente en las Figs. 3A-3C. Los datos demuestran que las farmacocinéticas de los liposomas que contienen PEG-c-DS fueron muy similares a la de los liposomas que contienen PEG-DSPE.

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TABLA 1 Distribución de liposomas en la sangre

Punto de tiempo	% en dosis inyectada
	A	B	C
30 min	- -	94,8 \pm 3,99	89,7 \pm 6,94
2 h	85,1 \pm 1,99	79,8 \pm 3,42	73,0 \pm 17,4
6 h	67,1 \pm 6,25	54,5 \pm 3,05	55,3 \pm 2,51
12 h	54,9 \pm 6,04	39,7 \pm 2,52	44,4 \pm 2,52
24 h	14,8 \pm 2,81	12,4 \pm 2,34	16,6 \pm 2,38

TABLA 2 Distribución de liposomas en el hígado

Punto de tiempo	% en dosis inyectada
	A	B	C
30 min	- -	2,27 \pm 0,13	3,14 \pm 0,95
2 h	8,76 \pm 2,01	9,42 \pm 1,24	11,7 \pm 1,74
6 h	21,7 \pm 2,55	19,3 \pm 1,37	20,8 \pm 0,86
12 h	26,6 \pm 0,51	26,4 \pm 1,99	30,4 \pm 1,28
24 h	43,9 \pm 2,7	36,6 \pm 2,25	42,6 \pm 0,48

TABLA 3 Distribución de liposomas en el bazo

Punto de tiempo	% en dosis inyectada
	A	B	C
30 min	- -	0,09 \pm 0,06	0,23 \pm 0,08
2 h	0,96 \pm 0,16	0,99 \pm 0,09	1,08 \pm 0,09
6 h	1,94 \pm 0,07	1,96 \pm 0,29	2,12 \pm 0,13
12 h	3,15 \pm 0,31	3,13 \pm 0,12	3,35 \pm 0,22
24 h	4,69 \pm 0,37	3,91 \pm 0,31	4,56 \pm 0,29

Un estudio similar comparó el rendimiento de ambos lípidos con PEG frente a una formulación de referencia que no contenía lípido con PEG. La Figura 4 presenta la retención en la sangre de HSPC/liposomas 2:1 que no contienen lípido con PEG (cruces), 5% en moles de PEG_{2000}-DSPE (triángulos) o 5% en moles de PEG_{2000}-c-DS (círculos).

Se realizaron más estudios utilizando liposomas que contienen mPEG_{2000}-c-DS: PHPC:Chol en una relación molar 5:55:40. Se marcaron los liposomas mediante incorporación de un complejo de indio-DTPA. Se determinó el porcentaje de dosis inyectada en la sangre y en varios tejidos a las 24 horas. Los resultados se presentan en las tablas 4 a 6. De nuevo, los liposomas presentaron farmacocinéticas típicas de circulación prolongada, con una retención media superior al 70% en la dosis inyectada después de 4 horas y superior al 30% después de 24 horas.

TABLA 4 Porcentaje de dosis de indio inyectada en la sangre

Animal nº	0,0 h	0,5 h	1,0 h	2,0 h	4,0 h	24 h
Rata 1	103,7	91,2	82,5	73,8	72,0	33,1
Rata 2	97,7	87,7	79,4	78,7	74,4	30,7
Rata 3	95,1	83,1	77,8	68,6	64,4	29,8
Rata 4	91,9	85,4	78,5	75,6	72,6	33,2
Promedio	97,1	86,8	79,6	74,2	70,9	31,7
Desv. tip.	5,0	3,4	2,1	4,2	4,4	1,7

TABLA 5 Porcentaje de dosis inyectada en tejidos a las 24 horas

Tejido	Rata nº 1	Rata nº 2	Rata nº 3	Rata nº4	Promedio	Desv. típ.
Hígado	7,5	6,9	6,7	7,2	7,1	0,3
Bazo	4,9	5,4	5,6	4,8	5,2	0,4
Corazón	0,4	0,5	0,5	0,6	0,5	0,1
Riñones	1,2	1,2	1,0	1,2	1,1	0,1
Pulmón	0,7	0,7	0,7	0,8	0,7	0,1
Piel	0,1	0,3	0,2	0,2	0,2	0,1
Huesos	0,3	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
Músculo	0,1	0,1	0,1	0,2	0,1	0,4
Orina*	11,2	13,4	5,7	12,3	10,7	3,4

TABLA 6 Porcentaje de dosis por gramo inyectada en tejidos a las 24 horas

Tejido	Rata nº 1	Rata nº 2	Rata nº 3	Rata nº4	Promedio	Desv. std.
Hígado	0,7	0,7	0,7	0,7	0,7	0,3
Bazo	7,3	6,9	8,2	5,9	7,1	0,9
Corazón	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,4
Riñones	0,6	0,6	0,5	0,6	0,6	0,6
Pulmón	0,6	0,5	0,5	0,6	0,5	0,6
Piel	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1
Huesos	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,3
Músculo	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,2
Orina*	0,6	0,6	0,3	0,8	0,6	0,2
* Porcentaje de dosis inyectada por ml.

Por último, los liposomas que contienen 5% en moles de mPEG_{2000}-c-DS o mPEG_{2000}-DSPE y el PHEPC restante, se compararon con el porcentaje que permanece en la sangre hasta 24 horas después de la administración. Como se muestra en la Figura 4, las farmacocinéticas eran prácticamente idénticas, con aproximadamente el 40% en retención tras 24 horas.

Los Ejemplos siguientes ilustran pero no pretenden limitar en modo alguno la invención.

Ejemplo 1A Síntesis de mPEG-c-DS (mPEG aminopropanodiol diastearoílo; carbamato de \alpha-metoxi-\omega-2,3-di(estearoiloxi)propilo poli(óxido de etileno))

Se secó azeotrópicamente en tolueno (50 ml, 120ºC) una solución de mPEG_{2000} (20 g, 10 moles). Una vez que la temperatura de la solución anterior alcanzó 25ºC, se trató con cloroformato de nitrofenilo (3,015 g, 15 moles) seguido de TEA (2,01 ml, 15 moles). Esta mezcla se dejó reaccionar durante 1 ½ h. La sal TEA se filtró y se eliminó el disolvente para dar el cloroformato de mPEG_{2000}-nitrofenilo en bruto al que se añadió una solución de aminopropanodiol
(3 g, 30 moles) en acetonitrilo (50 ml). Esta mezcla se agitó durante la noche a temperatura ambiente. Se eliminaron los insolubles por filtración y se evaporó el disolvente. Se recristalizó dos veces el producto en isopropanol. Rendimiento: 13,7 g, 65%. ^{1}HRMN: (300 MHz, DMSO-D_{6}) \delta 3,23 (s, OCH_{3}, 3 H), 3,65 (s, PEG, 180 H), 4,05 (t, uretano CH_{2}, 2 H), 4,42 (t, 1º OH, 1 H), 4,57 (d, 2º OH, 1 H).

El producto, mPEG_{2000} aminopropanodiol (2,3 g, 1,08 moles, 2,17 meq de OH), se disolvió en tolueno (30 ml) y se secó azeotrópicamente, eliminando aproximadamente 10 ml de la solución. Se dejó enfriar la solución a temperatura ambiente. Se añadió piridina (4 ml, 20%) con una pipeta, seguido de la adición de cloruro de estearoílo (1 g,
4,3 moles). Se formó inmediatamente un precipitado blanco. La mezcla de reacción se calentó a reflujo durante la noche a 120ºC y se dejó enfriar. Cuando la temperatura del matraz de reacción alcanzó aproximadamente 40ºC, se filtró la sal de piridina. Se evaporó el filtrado. Se purificó el producto (PEG_{2000}-c-DS) recristalizando dos veces en isopropanol (2 \times 30 ml) y se secó al vacío sobre P_{2}O_{5}.

Rendimiento: 2,26 g, 80%. TLC (cloroformo:metanol, 90:10): mPEG aminopropanodiol R_{f}=0,266; PEG-c-DS
R_{f} = 0,533. ^{1}HRMN: (300 MHz, DMSO-D_{6}) \delta 0,89 (t, CH_{3}, 6 H), 1,26 (s, CH_{2}, 56 H), 1,50 (2t, 2CH_{2}, 4 H), 2,24 (t, CH_{2}CH_{2} C=O, 4 H), 3,23 (s, OCH_{3}, 3 H), 3,50 (s, PEG, 180 H), 4,00 (dd, CH_{2} de APD, 1 H), 4,02 (t, CH_{2}OC=O-N, 2 H), 4,20 (dd, CH_{2} de APD, 1 H), 4,98 (m, CHOC(O), 1 H), 7,34 (m, NH, 1 H).

Se utilizó un procedimiento similar para preparar mPEG-c-DS utilizando polímeros de mPEG de peso molecular 750, 5.000 y 12.000. Se verificaron las estructuras por ^{1}H-RMN y espectrometría de masas. Los pesos moleculares determinados por MALDI (desorbción/ionización con láser asistida por la matriz) se proporcionan a conti-
nuación:

Conjugado	PM por MALDI
mPEG(750)-c-DS	1.426
mPEG(2000)-c-DS	2.892
mPEG(5000)-c-DS	5.816
mPEG(12000)-c-DS	12.729

Ejemplo 1B Síntesis de PEG-c-DE (mPEG aminopropanodiol diecosanoil; carbamato de \alpha-metoxi-\omega-2,3-di(ecosanoiloxi)propilo poli(óxido de etileno))

En un matraz de fondo redondo de 100 ml, se disolvió ácido ecosanoico (500 mg, 1,6 mmoles) en tolueno
(20 ml) y se añadió con una pipeta cloruro de oxalilo (147 \mul, 1,68 mmoles). A la reacción en agitación, se añadió DMF al 1%. Durante la adición de DMF, se liberó gas. Debe evitarse todo contacto con este gas. Tras 10 minutos, se evaporó el tolueno y se añadieron 20 ml más de tolueno y se evaporó hasta eliminar cualquier exceso de cloruro de oxalilo. Se redisolvió el residuo en 10 ml de tolueno. Se añadió mPEG-aminopropanodiol, preparado como se describió anteriormente, (1,19 g, 0,56 mmoles) a la solución, se unió un condensador de reflujo y la mezcla se calentó a reflujo durante la noche. El análisis por TLC (metanol y cloroformo, 9:1) demostró que la reacción era completa. Una vez enfriada la mezcla de reacción, se filtró el material no disuelto y el filtrado se llevó a sequedad. Se purificó el producto recristalizando tres veces en isopropanol y se secó al vacío sobre P_{2}O_{5}. Rendimiento: 1,0 mg, 70%. ^{1}HRMN: (360 MHz, DMSO-D_{6}) \delta 0,89 (t, CH_{3}, 6 H), 1,26 (s, CH_{2}, 66 H de lípido), 1,50 (t, 2CH_{2}, 4 H), 2,24 (t, CH_{2}CH_{2} C=O, 4 H), 3,23 (s, OCH_{3}, 3 H), 3,50 (s, PEG, 180 H), 4,00 (dd, CH_{2} de APD, 1 H), 4,05 (t, CH_{2}^{j}CH_{2}C+O, 4 H), 3,23 (s, OCH_{3}, 3 H, 3,50 (s, PEG, 180 H), 4,00 (dd, CH_{2} de APD, 1 H), 4,05 (t, CH_{2}OC=O-N, 2 H), 4,20 (dd, CH_{2} de APD, 1 H), 4,98 (m, CHOC(O), 1 H), 7,34 (m, NH, 1 H) ppm.

Ejemplo 2 Preparación de t-Bu-O-PEG-aminopropanodiol a través de t-Bu-O-PEG-O-succinimida A.t-Bu-O-PEG-O-succinimida

Se secó azeotrópicamente tBu-O-PEG-2000 de Polymer Labs (10 g, 5 mmoles) disolviendo en 120 ml de tolueno y eliminando aproximadamente 20 ml del disolvente, recogiendo cualquier vestigio de agua en una trampa Dean Stark.

La solución se enfrió a temperatura ambiente y se añadió fosgeno (15 ml). Se dejó reaccionar la mezcla durante la noche a temperatura ambiente. Una vez terminada la reacción, se eliminó el disolvente en un evaporador rotativo. Se añadieron aproximadamente 50 ml de tolueno reciente y se eliminó en el evaporador rotativo. Se disolvió el residuo en tolueno anhidro (30 ml) y cloruro de metileno (10 ml). A esta solución, se añadieron N-hidroxisuccinimida
(1,7 g, 14,8 mmoles) y trietilamina (2,1 ml, 14,9 mmoles) y se dejó reaccionar la mezcla durante la noche a temperatura ambiente, tras lo cual se completó la reacción por TLC.

Compuesto	R_{f}(CHCl_{3}:CH_{3}OH, 90:10)
t-Bu-O-PEG-OH	0,44
t-Bu-O-PEG-OSc	0,51

Se filtró la sal procedente de la mezcla de reacción, se eliminó el disolvente por evaporación y se recristalizó dos veces el sólido en alcohol isopropílico y se secó sobre P_{2}O_{5}. Rendimiento: 9,2, 85%. ^{1}HRMN: (CDCl_{3}, 360 MHz) \delta 1,25 (s, t-Bu, 9 H), 2,82 (s, CH_{2}CH_{2}, 4 H), 3,60 (s, PEG, 180 H), 4,45 (t, CH_{2}OCONH, 2 H) ppm.

B.t-Bu-O-PEG-aminopropanodiol

A una solución de aminopropanodiol (300 mg, 3,2 mmoles) en DMF (10 ml), se añadió t-Bu-PEG-OSc (5 g,
2,29 mmoles) y se dejó reaccionar durante la noche. Se consumió todo el éster de NHS, dando una mezcla que presenta una mancha en TLC.

Compuesto	R_{f}(CHCl_{3}:CH_{3}OH, 90:10)
t-Bu-O-PEG-OSc	0,51
t-Bu-O-PEG-APD	0,35

Se añadió una resina de intercambio iónico ácida lavada previamente (\sim 1 g) a la mezcla de reacción y se eliminó por filtración después de 30 minutos. Se eliminó el disolvente y se recristalizó el residuo en 200 ml de alcohol isopropílico. Se recogió el sólido y se secó sobre P_{2}O_{5}. Rendimiento: 4,2, 85%. ^{1}HRMN: (D6-DMSO, 360 MHz) \delta 1,25 (s, t-Bu, 9 H), 3,68 (s, PEG, 180 H), 4,03 (t, CH_{2}OCONH, 2 H), 4,43 (t, 1º OH, 1 H), 4,55 (d, 2º OH, 1 H), 6,98 (t, NH, 1 H) ppm.

Ejemplo 3 Preparación de carbonato de p-nitrofenilo-PEG-c-DS A. Bn-O-PEG-carbonato de nitrofenilo (NPC)

Se secó azeotrópicamente Bn-O-PEG-2000 de Shearwater Polymers (Huntsville, LA; 5 g, 2,41 mmoles) disolviendo en 120 ml de tolueno y eliminando aproximadamente 20 ml del disolvente, recogiendo cualquier vestigio de agua en una trampa Dean Stark. Se enfrió la solución a temperatura ambiente y se evaporó el disolvente restante a presión reducida.

Se disolvió el residuo en 30 ml de cloruro de metileno/acetato de etilo (60:40) y se añadieron cloroformato de
p-nitrofenio (729 mg, 3,6 mmoles) y trietilamina (1 ml, 7,2 mmoles). La reacción se llevó a 4ºC durante 8 a 16 horas. Este método ralentiza la reacción pero elimina la formación de bis PEG-carbonato. Una mancha visible al UV en placa de sílice GF indicó la terminación de la reacción.

Se trató la mezcla de reacción con resina de intercambio iónico ácida y básica previamente lavada durante 30 minutos, se filtró y se llevó a sequedad completa. Se recristalizó el producto en alcohol isopropílico y se secó sobre P_{2}O_{5}. Rendimiento: 4,4 g, 80%.

B. Bn-O-PEG-aminopropanodiol

A una solución de aminopropanodiol (260 mg, 1,9 mmoles) en DMF (10 ml), se añadió Bn-PEG-NPC, preparado anteriormente (4,3 g, 2,9 mmoles) y se dejó reaccionar durante 5 horas. Se consumió todo el Bn-PEG-NPC, dando la mezcla de reacción una mancha en TLC (cloroformo:metanol:agua 90:18:2).

Se trató la mezcla de reacción con 5 g de resina de intercambio iónico ácida previamente lavada durante 30 minutos, se filtró y se llevó a sequedad completa. Se recristalizó el producto en alcohol isopropílico y se secó sobre P_{2}O_{5}. Rendimiento: 3,8 g, 91%.

C. Bn-O-PEG-c-diestearoílo

Una solución de Bn-O-PEG-aminopropanodiol (3 g, 1,36 mmoles), ácido esteárico (1,94 g, 6,79 mmoles) y DPTS (4-toluensulfonato de 4-(dimetilamino)piridinio) como catalizador (408 mg, 1,36 mmoles) se agitó a temperatura ambiente durante 20 minutos. Se añadió con pipeta diisopropilcarbodiimida (1,28 ml, 8,16 mmoles) y se dejó la mezcla reaccionar durante la noche. TLC (cloroformo:metanol, 90:10) presentó la reacción completa del diol.

Se añadió resina de intercambio iónico básica (\sim 5 g) a la mezcla de reacción. Tras 30 minutos de agitación, se filtró la resina y el filtrado se llevó a sequedad. Se recristalizó el residuo en isopropanol (100 ml) y se secó sobre P_{2}O_{5}. Rendimiento: 4 g, 80%.

D. HO-PEG-c-diestearoílo

Se siguieron dos métodos diferentes para la desprotección del grupo bencilo de Bn-O-PEG-c-DS.

Método 1

Hidrogenólisis: Desprotección mediante paladio sobre carbono

A una solución de Bn-O-PEG-c-DS (218 mg, 0,08 mmoles) en 5 ml de metanol, se añadieron Pd al 10%/C
(110 mg) y formato amónico (107 mg, 0,8 mmoles) y se dejó reaccionar la mezcla a temperatura ambiente durante la noche. Se eliminó el Pd/C por filtración sobre Celite® y el filtrado se llevó a sequedad. Se disolvió el residuo en cloroformo y se secó tres veces con NaCl saturado. Se recogió la fase de cloroformo, se secó con MgSO_{4}, se filtró y se concentró. El residuo sólido se liofilizó en tBuOH y se secó el polvo resultante sobre P_{2}O_{5}. Rendimiento: 80%,
175 mg.

Método 2

Desprotección mediante tetracloruro de titanio

Se enfrió en un baño con hielo durante 5 minutos una solución de Bn-O-PEG-c-DS (1,18 g, 0,43 mmoles) en cloruro de metileno (10 ml). Se transfirió el tetracloruro de titanio (3 ml, 21,5 moles, en exceso) mediante una jeringuilla secada en la estufa en un matraz de reacción sellado. Después de 5 minutos, se retiró el baño de hielo y se realizó la reacción de desprotección durante la noche a temperatura ambiente. La desprotección completa se demostró mediante una mancha inferior desplazada (en comparación con el material de partida) en una placa TLC de sí-
lice GF.

Se añadieron aproximadamente 40 ml de cloroformo a la mezcla de reacción y la mezcla se transfirió a un embudo separador que contenía 40 ml de NaHCO_{3} saturado. La mezcla se agitó suavemente (para impedir la formación de una emulsión) y se recogió la capa de cloroformo. Esta extracción se repitió 3 veces, y se recogió la fase de cloroformo y se extrajo una vez más con una fracción reciente de NaHCO_{3} saturado para asegurar la eliminación completa del TiCl_{4}. La fase de cloroformo recogida se secó con MgSO_{4}, se filtró y se concentró.

El residuo anterior se disolvió en 1 ml de cloroformo y se añadió a una columna preparada de gel de sílice (200 a 400 mesh, 60 \ring{A}). La polaridad de la fase móvil (cloroformo) se incrementó mediante adiciones en incrementos del 2% en metanol hasta que el producto eluyó en 10% en metanol/90% en cloroformo. Se recogió el producto y se eliminó el disolvente en un evaporador rotativo. Se liofilizó el sólido en tBuOH y se secó sobre P_{2}O_{5}. Rendimiento: 70%,
800 mg.

E. Carbonato de p-nitrofenilo-PEG-c-DS

Antes del comienzo de la reacción, se secaron meticulosamente el matraz de reacción, la barra de agitación, las jeringuillas y el material de partida (HO-PEG-c-DS, preparado anteriormente).

A una solución de HO-PEG-c-DS (1,2 g, 0,45 mmoles) en 10 ml de cloruro de metileno/acetato de etilo (60:40), se añadieron carbonato de p-nitrofenilo (136 mg, 0,65 mmoles) y trietilamina (188 \mul, 1,35 mmoles). Se llevó la reacción a 4ºC (para eliminar la formación de carbonato de bisPEG) durante 8 a 16 horas, tras cuyo periodo la reacción se completó mediante TLC en gel de sílice GF.

Compuesto	R_{f}(CHCl_{3}: CH_{3}OH, 90:10)
HO-PEG-c-DS	0,40
NPC-PEG-c-DS	0,54

La mezcla de reacción se trató durante 30 minutos con resinas de intercambio iónico ácidas y básicas lavadas previamente y se filtró. Se llevó el filtrado a sequedad completa y se recristalizó el residuo en alcohol isopropílico. Se secó el sólido sobre P_{2}O_{5}. Rendimiento: 70%. ^{1}HRMN: (D_{6}-DMSO, 360 MHz) \delta 0,86 (t, CH_{3}, 6 H), 1,22 (s, DS, 56 H), 1,48 (m, CH_{2}CH_{2}(CO)), 4 H), 2,26 (2 xt, CH_{2}OCONH, 2 H), 4,03 y 4,22 (2 xd, CH_{2}CH de lípido, 2 H), 4,97 (M, CHCH_{2} de lípido), 6,98 (t, NH, 1 H), 7,55%, 8,32 (2 xd, aromático, 4 H) ppm.

Ejemplo 4 Estudios de preparación y biodistribución de liposomas que contienen PEG-DSPE y PEG-c-DS

Se formaron películas de lípidos, por disolución y eliminación del disolvente, a partir de mezclas de lípido HSPC:Chol:PEG en las relaciones siguientes:

: A: 58:39:3; lípido con PEG = PEG-c-DS

: B: 57:38:5; lípido con PEG = PEG-DSPE

: C: 57:38:5; lípido con PEG = PEG-c-DS

Se hidrataron las películas en ^{125}I-tiraminilinulina recién preparada en HEPES 25 mM que contenía NaCl 140 mM, pH 7,4 y se extruyeron para formar liposomas de 100 a 105 nm de diámetro. Se esterilizaron los liposomas mediante filtración a través de filtros acabados en jeringuilla con enlaces proteicos bajos de 0,22 \mum de Millipore (Millipore Corporation, Bedford, MA). Se hizo el recuento de alícuotas para determinar los recuentos de la inyección de ^{125}I. Se determinaron las concentraciones de lípidos analizando el contenido en fosfato de las preparaciones de liposoma y las preparaciones de liposomas se diluyeron en tampón esterilizado hasta una concentración final de 2,5 \mumoles/ml. Se inyectó a los ratones por vía iv en la vena de la cola con 0,2 ml de liposomas diluidos, de forma que cada ratón recibió 0,5 \mumoles de fosfolípido. En los diversos puntos de tiempo, se practicó la eutanasia a los ratones mediante anestesia con halotano seguida de dislocación cervical, se tomaron muestras de sangre mediante extracciones de sangre cardíacas y se analizaron la sangre y varios órganos por recuentos de ^{125}I.

Claims

1. Lipopolímero neutro de fórmula:

3

en la que:

cada R^{1} y R^{2} es independientemente un grupo alquilo o alquenilo que tiene entre 8 y 24 átomos de carbono;

n = 100 a 300,

L es -X-(C=O)-Y-CH_{2}-, en la que X e Y se seleccionan independientemente de entre oxígeno y NH.

2. Lipopolímero según la reivindicación 1, en el que X es oxígeno e Y es NH.

3. Lipopolímero según la reivindicación 1, en el que L es un enlace carbamato o un enlace carbonato.

4. Lipopolímero según la reivindicación 3, en el que L es -O-(C=O)-NH-CH_{2}- (un enlace carbamato).

5. Lipopolímero según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que Z es hidroxi o metoxi.

6. Lipopolímero según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que cada R^{1} y R^{2} es independientemente un grupo alquilo o alquenilo que tiene entre 8 y 24 átomos de carbono.

7. Lipopolímero según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que cada R^{1} y R^{2} es C_{17}H_{35}.

8. Lipopolímero según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que n está comprendida entre 20 y 115.

9. Composición liposómica que comprende desde sustancialmente 1 por ciento en moles hasta sustancialmente 10 por ciento en moles de un lipopolímero neutro como el definido en cualquiera de las reivindicaciones anteriores y lípidos formadores de vesículas.

10. Composición según la reivindicación 9, que comprende sustancialmente 3 por ciento en moles a sustancialmente 6 por ciento en moles del lipopolímero neutro.

11. Método de aumento del tiempo de circulación de un liposoma que comprende lípidos formadores de vesículas, comprendiendo el método:

incorporar en dicho liposoma, con los lípidos formadores de vesículas, un lipopolímero neutro según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.