CN1774281A - 包含蛋白质和/或多肽以及胶体颗粒的药物组合物 - Google Patents

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Abstract

一种用于肠胃外给药的药物组合物，该药物组合物包含治疗有效量的蛋白质或多肽以及胶体颗粒。所述颗粒包含用生物相容性亲水聚合物衍生化的、约1摩尔％～20摩尔％的两亲性脂质。所述蛋白质或多肽选自：(a)能在外部结合所述胶体颗粒的蛋白质或多肽；(b)能结合聚烷基醚、聚乳酸和聚乙醇酸家族的聚合物的蛋白质或多肽；和(c)包含共有序列S/T－X/I/V－I/V/Q/S－S/T－X－X－X－E的蛋白质或多肽，其中X可以是任意氨基酸，且S、T、L、I、V、E以及Q具有它们的标准含义。所述蛋白质或多肽不是因子VIII(FVIII)，并且不是包埋于所述胶体颗粒中。

Description

包含蛋白质和/或多肽以及胶体颗粒的药物组合物
技术领域
本发明涉及用于提高多种蛋白质和多肽的半寿期、疗效和稳定性的药物制剂。
背景技术
甲型血友病是最常见的遗传性血凝固障碍病之一。作为血凝固***的一种或一种以上的功能障碍的结果，甲型血友病患者易于频繁地出血。血友病的一个原因是血液中因子VIII(FVIII)的不足。该疾病可以用因子VIII浓缩物进行治疗。然而，由于在约15％的患者中存在因子VIII中和抗体(所谓的抑制物)，由此使采用因子VIII浓缩物来治疗是几乎不可能的。
在文献中已经公开了两种基本方法以保护因子VIII免受抑制物的作用而失活。
Hemker在WO/80/01456中公开了适于口服的药物组合物，该药物组合物包含有掺入由磷脂形成的0.5-1.0微米的脂质体中的FVIII。磷脂具有净电荷，并且将FVIII掺入至脂质体层之间。据称在50小时期间，FVIII在血浆中的水平保持高于正常值的约5％。
Horikoshi在US 4,348,384中声称制备了如Hemker描述的组合物，但并没有得到满意的结果。因此，Horikoshi将蛋白酶抑制剂连同FVIII一起掺入脂质体中，以保护其免于蛋白水解。在6小时内，得到了3％的FVIII的正常血浆水平。
Woodle在US 5,013,556中公开了用于经由血流输送多种药物的脂质体组合物。该脂质体包含1摩尔％～20摩尔％的用聚烷基醚衍生化的两亲性脂质。这里该药物化合物也包埋在脂质体中。这些脂质体组合物是可商购的，名称为Stealth囊泡(SUV′s，由磷脂和与磷脂共价结合的聚乙二醇(PEG)组成的单层小脂质体)。
该方法带来的另一问题是直径较大的脂质体具有较短的半寿期。因此，脂质体必须在高压下缩小尺寸，这会影响蛋白质活性，对于凝血因子V和VIII即是如此。
在另一种方法中，Barrowcliffe，T.W.等人在(1983)J.Lab.Clin.Med.101：34-43中教导了将FVIII与从人和/或动物脑中提取的磷脂混合，这在在体外为FVIII提供了有效的保护。在该方法中，磷脂与FVIII结合而不包埋FVIII。Kemball-Cook，G.和Barrowcliffe，T.W.在(1992)Thromb.Res.67：57-71中教导了带负电荷的磷脂表面是FVIII结合所必需的。已发现带负电的磷脂酰丝氨酸和磷脂酸在与FVIII结合中活性非常高，而磷脂酰胆碱是无活性的。然而，带负电荷的磷脂是有毒的，而且来源于脑组织的磷脂可能携带有病原体。
EP 689,428公开了包含脂质体的脂质体组合物，所述脂质体具有亲水性聚合物链的外表层。在效应物偶联之前，通过脂质锚的激活，将多肽或多糖效应分子共价结合于聚合物链的远端。
发明内容
本发明的目的在于提供包含用于治疗的蛋白质或多肽的药物组合物。
本发明的另一目的在于提供在血流中具有延长的半寿期这种形式的蛋白质或多肽。
本发明的又一目的在于提供对患有血液凝固障碍病症，特别是血友病的患者进行治疗的方法。
在本发明的一个方面中，提供了用于肠胃外给药的药物组合物，该药物组合物包含治疗有效量的蛋白质或多肽以及胶体颗粒，所述颗粒包含用生物相容性亲水聚合物衍生化的、约1摩尔％～20摩尔％的两亲性脂质，其中所述蛋白质或多肽选自：(a)能在外部结合所述胶体颗粒的蛋白质或多肽；(b)能结合聚烷基醚、聚乳酸和聚乙醇酸家族的聚合物的蛋白质或多肽；或(c)包含共有序列S/T-X-L/I/V-I/V/Q/S-S/T-X-X-E的蛋白质或多肽，其中X是任意氨基酸，且S、T、L、I、V、E以及Q具有它们的标准含义。蛋白质或多肽不是包埋于所述的胶体颗粒中。
在优选的实施方案中，胶体颗粒是基本上中性的，聚合物是基本上不带净电荷的。在本文中，术语“基本上中性”和“基本上不带净电荷”是指既不带正电荷也不带负电荷。然而，在零的实验误差内所测得的非常低的电荷也包括在以上术语的含义中。
本发明基于令人惊奇并意想不到的发现：含有用生物相容性亲水聚合物衍生化的两亲性脂质的脂质体可用于结合蛋白质或多肽、增强它们的药物动力学参数(半寿期和曲线下的面积)以及保护它们不受血流中抑制物的影响。由于所用的两亲性脂质是人工合成和无毒的，所以本发明显著优于现有技术的组合物，并因此可用于体内治疗。此外，由于脂质体不包埋蛋白质或多肽，所以可以使用小尺寸的脂质体，而由于小尺寸的脂质体不能被网状内皮***(RES)除去并且所制备的蛋白质或多肽的活性不会被减弱(体外发现的所有活性以及体内注射后的早期活性)，所以它们在体内具有较长的半寿期。与EP 689,428中公开的组合物不同，如将在以下更加详细地描述那样，所述蛋白质或多肽在脂质体的外表面与聚合物链非共价相互作用，并且没有进行化学反应以激活聚合物链。
术语“能在外部结合所述胶体颗粒的蛋白质或多肽”包括诸如凝血因子VIIa(FVIIa)、凝血因子V(FV)、凝血因子IX(FIX)和凝血因子X(FX)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、γ干扰素和胰高血糖素样肽1(GLP-1)、γ干扰素和胰高血糖素样肽1(GLP-1)以及由4个氨基酸(L-ala、L-glu、L-lys和L-tyr)重复组成的共聚物(克帕松(Copaxone)，Teva，以色列)。如本领域技术人员所知，可凭经验确定这些蛋白质的同一性。
正如本领域技术人员所知，本发明的药物组合物可用于治疗多种病症。例如，包含克帕松的组合物可用于保护中枢神经***(CNS)细胞免受谷氨酸毒性的影响并治疗由谷氨酸毒性导致或加重的损伤或病症。如美国申请专利20020037848中所描述，该组合物也可用于治疗多发性硬化症、糖尿病性神经病变、老年性痴呆、阿尔茨海默氏病、帕金森氏症、面神经(Bell′s)麻痹、青光眼、亨廷顿氏舞蹈病、肌萎缩性侧索硬化、癫痫持续状态、非动脉炎性视神经病变，或维生素缺乏症。
术语“能结合聚烷基醚、聚乳酸和聚乙醇酸家族的聚合物的蛋白质或多肽”包括通过任何非共价机理，例如离子相互作用、疏水性相互作用、氢键和范德华引力(Arakawa，T.和Timasheff，S.N.(1985)Biochemistry24：6756-6762；Lee，J.C.和Lee，L.L.Y(1981)J.Biol.Chem.226：625-631)，能结合聚烷基醚、聚乳酸和聚乙醇酸家族的聚合物或其衍生物的蛋白质和多肽。该聚合物的优选实例是聚乙二醇(PEG)。
术语“治疗有效量”可以理解为导致蛋白质或多肽水平在血流中具有所需疗效的蛋白质或多肽的量。所述的量可通过施用包含不同量的蛋白质或多肽的组合物以及施用后在不同时间测量血液中的水平而用实验确定。
用于制备胶体颗粒的两亲性脂质可从天然的或人造的来源获得。最优选的脂质包括磷脂，例如磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺，和氨基甲酸酯(carbamate)连接的例如二硬酯酰氨基丙二醇(DS)的不带电的脂聚合物。生物相容性亲水聚合物的作用是在空间上稳定SUVs，从而防止体外囊泡的融合，并使得囊泡避免体内RES的吸附。聚合物的分子量优选为约500道尔顿至约5000道尔顿，最优选为约2000道尔顿。
胶体颗粒的平均粒径优选为约0.03微米至约0.4微米，最优选为约0.1微米。这将增加它们的体内循环时间以及避免受到RES的吸附。两亲性脂质包括大约0.5摩尔％至约20摩尔％的颗粒，优选大约1％～6％，最优选3％。
各种已知的偶联反应可用于制备形成囊泡的脂质，该脂质是用亲水性聚合物衍生化的。例如，聚合物(如PEG)可通过氰尿酰氯基团衍生化成诸如磷脂酰乙醇胺(PE)的脂质。或者，加帽的PEG可通过羰基二咪唑偶联剂得以活化，以形成活化的咪唑化合物。氨基甲酸酯连接的化合物可通过以下方法制备：将MPEG(甲氧基PEG)的末端羟基与对硝基苯基氯甲酸酯反应，以生产对硝基苯基碳酸酯。然后将该产物与1-氨基-2，3-丙二醇反应以生成氨基甲酸酯中间物。将二醇的羟基酰化，以生成终产物。如WO 01/05873所述，利用甘油代替1-氨基-2，3-丙二醇进行类似的合成，可用于生产碳酸酯连接的产物。其它反应也是熟知并在例如上述的US 5,013,556进行了描述，其内容在此引用作为参考。
本发明的组合物通过注射得以施用，优选(iv)静脉注射、(sc)皮下注射或(im)肌肉注射。由于注射时脂质体组合物引起的副作用，现有技术的组合物仅仅供口服使用。但是，本发明的组合物显而易见由于尺寸小和有毒的磷脂较少，所以进行注射是无毒性的。已在大鼠中进行了PEG化的脂质体和FIII的毒理学研究一在500单位/Kg的剂量下未发现毒性。注射直到0.5g/Kg体重的量的本发明的胶体颗粒，没有可察觉的中毒症状。尽管本发明中使用的游离形式的蛋白质和多肽在血管***中具有较短的半寿期，但是将它们在本发明的组合物中进行施用预计可以将它们的半寿期提高至少1.5倍。可预见本发明的组合物在“根据需求施用”和患者的预防性治疗中是有效的。
在本发明的另一个方面，发现有8个氨基酸的共有序列，该共有序列位于与本发明的脂质体结合的蛋白质的内部，但在不结合脂质体的蛋白质中则没有。该共有序列是S/T-X-L/I/V-I/V/Q/S-S/T-X-X-E，其中X可以是任意氨基酸，且S、T、L、I、V、E以及Q具有它们的标准含义。
在本发明的另一个方面，发现与注射蛋白质分开进行PEG化的脂质体的注射可提高蛋白质的半寿期并延长疗效。
在本发明的另一方面，药物组合物中添加有胆固醇。
附图说明
为了理解本发明并了解如何在实践中实施，现参考附图仅通过非限制性实施例来描述优选的实施方案，其中：
图1显示了PEG化的脂质体对固定化的FVIII的实时相互作用。a.PEG化的脂质体结合固定化的rFVIII，但对照POPC脂质体(PC)以及POPC∶DSPE脂质体(PC∶PE)不结合固定化的rFVIII。b.PEG化的脂质体结合固定化的rFVIII(FVIII)但不结合固定化的HSA。c.在缺乏或存在已产生抗FVIII抗体(20Bethesda单位/ml的效价)的甲型血友病患者的稀释的(×100)血清(抑制物)时，PEG化的脂质体结合固定化的rFVIII。反应以共振单位(RU)显示。对a～c中的反应进行对HSA包被的孔道的非特异结合的校正，该非特异结合低于PEG化的脂质体对固定化的FVIII包被的孔道的实时相互作用达到5％。
图2.PEG化的脂质体对固定化的FIX的实时相互作用。a.PEG化的脂质体结合固定化的FIX但不结合固定化的HSA。b.PEG化的脂质体结合固定化的FIX，但对照POPC脂质体不结合固定化的FIX。反应以共振单位(RU)表示。对反应进行对HSA包被的孔道的非特异结合的校正，相对于对FIX包被的孔道的结合，该非特异结合低于PEG化的脂质体对固定化的FIX的实时相互作用的5％。
图3.PEG化的脂质体对固定化的G-CSF的实时相互作用。a.PEG化的脂质体结合固定化的G-CSF但不结合固定化的HSA。b.PEG化的脂质体结合固定化的G-CSF，但对照POPC脂质体不结合固定化的G-CSF。反应以共振单位(RU)表示。对反应进行对HSA包被的孔道的非特异结合的校正，相对于的G-CSF包被的孔道的结合，所述非特异性结合低于PEG化的脂质体对固定化的G-CSF的实时相互作用的5％。
图4.PEG化的脂质体对固定化的GM-CSF的实时相互作用。a.PEG化的脂质体结合固定化的GM-CSF但不结合固定化的HSA。b.PEG化的脂质体结合固定化的GM-CSF，但对照POPC脂质体不结合固定化的GM-CSF。反应以共振单位(RU)表示。对反应进行对HSA包被的孔道的非特异结合的校正，相对于对G-CSF包被的孔道的结合，所述非特异性结合低于PEG化的脂质体对固定化的GM-CSF的实时相互作用的5％。
图5.PEG化的脂质体对固定化的γ干扰素的实时相互作用。a.PEG化的脂质体结合固定化的γ干扰素但不结合固定化的HSA。b.PEG化的脂质体结合固定化的γ干扰素，但对照POPC脂质体不结合固定化的γ干扰素。反应以共振单位(RU)表示。对反应进行对HSA包被的孔道的非特异结合的校正，相对于对γ干扰素包被的孔道的结合，所述非特异结合低于PEG化的脂质体对固定化的γ干扰素的实时相互作用的5％。
图6.PEG化的脂质体对固定化的GLP-1的实时相互作用。a.PEG化的脂质体结合固定化的GLP-1但不结合固定化的HSA。b.PEG化的脂质体结合固定化的GLP-1，但对照POPC脂质体不结合固定化的GLP-1。反应以共振单位(RU)表示。对反应进行对HSA包被的孔道的非特异结合的校正，相对于对GLP-1包被的孔道的结合，所述非特异结合低于PEG化的脂质体对固定化的GLP-1的实时相互作用的5％。
图7.在缺乏或存在稀释的(×10)兔多克隆抗人FIX抗体(Sigma)(抗体)时，PEG化的脂质体结合固定化的FIX。
图8.用于结合PEG化的脂质体的共有序列和FVIII结合位点。a.在各种蛋白质中结合PEG化的脂质体的共有序列。保守氨基酸用红色标记而非保守氨基酸用蓝色标记。b.人FVIII的结构域结构。从它的一级结构推导出的人FVIII的不连续结构域结构。黑色方框代表脂质体结合位点。用T显示的红色箭头代表凝血酶激活位点。c.PEG化的脂质体或POPC脂质体(PC)与衍生自FVIII序列(1783～1796位氨基酸)的肽的结合，所述肽固定在CM5传感器芯片上。反应以共振单位(RU)表示。
图9.PEG化的脂质体对固定化的克帕松的实时相互作用。a.PEG化的脂质体结合固定化的克帕松但不结合固定化的HSA。b.PEG化的脂质体结合固定化的克帕松，但对照POPC脂质体不结合固定化的克帕松。反应以共振单位(RU)表示。对反应进行对HSA包被的孔道的非特异结合的校正，相对于对克帕松包被的孔道的结合，所述非特异性结合低于PEG化的脂质体对固定化的克帕松的实时相互作用的5％。
图10.尾部切除后的血友病小鼠的存活情况。Kaplan-Meierb图表示使用FVIII(Kogenate-FS，Bayer)或FVIII和PEG化的脂质体(1小时后注射)注射血友病小鼠。T检验统计分析表明各组之间具有统计学上的显著差异(P＜0.05)。
图11.PEG化的脂质体对固定化的FVIII的实时相互作用，所述的脂质体是由POPC∶DSPE-PEG 2000(来自Genzyme Pharmaceuticals的脂质，Liestal，瑞士)分别以97∶3的摩尔比组成的PEG化的脂质体，以及是由POPC∶DS-c-PEG 2000(来自Genzyme Pharmaceuticals的脂质，Liestal，瑞士)分别以97∶3的摩尔比组成的PEG化的脂质体。
具体实施方式
1.实施例1～8
1.1材料和方法
脂质体的制备。脂质体由棕榈酰-油酰磷脂酰基-胆碱(POPC)和二硬脂酰磷脂酰-乙醇胺甲基聚乙二醇2000(DSPE-PEG 2000)(GenzymePharmaceuticals，Liesatal，瑞士)(摩尔比分别为97∶3)组成，和由POPC和二硬脂酰磷脂酰-乙醇胺(DSPE)(Aventi Polar Lipids，Alabaster AL，美国)(摩尔比分别为97∶3)组成，并按如下进行制备：将脂质溶于叔丁醇(Reidel-de Haen，Seelze，德国)直至10％w/v(重量/体积)，冷冻并使溶液冻干。将得到的脂质干粉重悬于50mM的柠檬酸钠缓冲液(pH 7.0)直至2％～13％(w/v)，以形成脂质体。使用LiposoFastTM-100挤压设备(Aventin Inc.，Ottawa，加拿大)，使脂质体通过1.2μm、0.2μm和0.05μm大小的聚碳酸酯过滤器(Poetics Corp.，Livermore CA，美国)进行过滤，以形成大小为80nm～110nm的脂质体。然后使脂质体溶液穿过0.2μm的醋酸纤维素无菌过滤器(SterivexTM，Millipore Corporation，Bedford MA，美国)，并在2℃～8℃储存。
实时相互作用——表面等离振子共振分析。使用BiacoreTM 2000生物传感仪器(Biacore AB，Uppsala，瑞典)进行结合研究。根据供应商描述，将下列蛋白质通过胺偶联试剂盒以1500RU(约1.5ng/mm2)固定于CM5-传感器芯片(Biacore AB，Uppsala，瑞典)上：FVIII(Kogenate-FS，Bayer，Berkley CA，美国)、FIX(Benefix，Genetics Institute，Cambridge MA，美国)、G-CSF、GM-CSF、IFN-γ(γ干扰素)、红细胞生成素、人生长激素、α干扰素2a、α干扰素2b(ProSpec-Tany TechnoGene Ltd，Nes Ziona，以色列)、GLP-1、胰岛素(Sigma)、克帕松(Teva Pharm，以色列)、IgG以及HSA(Omrix，Tel-Aviv，以色列)。25℃时，使用终浓度为0.2mM～2mM的PEG化的脂质体或对照脂质体，在50mM柠檬酸钠缓冲液(pH 7.0)中，以10μl/分钟的流速用4分钟进行SPR分析。用1mM的NaOH以10μl/分钟的流速将芯片洗涤1分钟进行传感器芯片表面的再生。用BIA评价软件(Biacore AB，Uppsala，瑞典)来分析SPR数据的缔合常数、离解常数、亲合常数。
多重比对——使用MUSCA软件( http：//cbcsrv.watson.ibm.com)进行多重序列比对。下列Swiss-Prot数据库登录号码可用于多重比对：人(h)FVIII(P00451)、人FIX(P00740)、人G-CSF(P09919)、人GM-CSF(P04141)、人IFN-γ(P01579)以及人GLP-1(P01275)。
1.2结果：
蛋白质/肽对PEG化的脂质体的结合
我们通过表面等离振子共振(SPR)测量法使用Biacore仪器(Biacoe，Uppsala，瑞典)来分析蛋白质和肽对PEG化的脂质体的结合。我们将蛋白质/肽固定于CM5传感器芯片(Biacoe，Uppsala，瑞典)上，然后注射入相同大小(80nm～110nm)和浓度的PEG化的脂质体或对照脂质体，并测量和分析蛋白质/肽对流动的摄入脂质体的结合。
PEG化的脂质体由结合于FVIII的POPC和DSPE-PEG2000组成(图1a)。由于由POPC和POPC∶DSPE组成的两种类型的对照脂质体不结合于FVIII(图1a)，所以结合依赖于附着于DSPE脂质的PEG聚合物。此外，结合是FVIII特异性的，因为PEG化的脂质体不结合于人血清白蛋白(HSA)(图1b)。使用两个位点结合的模型，对代表性曲线的结合分析(图1a)表明PEG化的脂质体结合于FVIII上的两个位点，其中缔合速率常数(Kon)分别为3.83×105M-1S-1和3.37×106M-1S-1，解离速率常数(Koff)分别为1.72×10-3S-1和6.6×10-3S-1，以及亲合常数(Kd)值分别为1.96nM和4.5nM。
多克隆抗人因子VIII抗体[产生抗FVIII抗体(抑制物)的患者的血清]与PEG化的脂质体竞争结合这两个位点(图1c)。对照实验表明人总免疫球蛋白G(IgG)不与FVIII竞争结合PEG化的脂质体(数据未显示)。这表明PEG化的脂质体与抗人因子VIII抗体特异性结合相同的蛋白质结构域。
使用另外几个纯化的重组蛋白质进行SPR测量。发现下列蛋白质结合PEG化的脂质体：因子IX(FIX)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、γ干扰素和胰高血糖素样肽1(GLP-1)(图2-6)。此外，我们发现下列蛋白质不结合PEG化的脂质体：HSA、IgG、胰岛素、α干扰素2a、α干扰素2b、人生长激素和红细胞生成素。
此外，多克隆抗人因子IX抗体(Sigma)与PEG化的脂质体竞争结合两个位点(图7)。这表明PEG化的脂质体与抗人因子IX抗体特异性结合相同的蛋白质结构域。
氨基酸序列分析表明8个氨基酸(S/T-X-L/I/V-I/V/Q/S-S/T-X-X-E)的共有序列位于结合PEG化的脂质体的蛋白质内部(图8a)，但在不结合PEG化的脂质体的蛋白质内部则不存在。为检验共有序列和FVIII上所鉴定的结合位点，我们合成了衍生于FVIII的1783～1796位氨基酸的肽，并测量其对PEG化的脂质体的结合。该肽结合PEG化的脂质体，并具有2.25nM的Kd(图8c)，其类似于先前发现的FVIII和PEG化的脂质体的Kd值(表1)，但该肽不结合对照POPC脂质体。
表1显示了多种蛋白质和肽的Kon、Koff以及Kd值的汇总表。
然而，克帕松(Teva，以色列)是由4种氨基酸(L-ala、L-glu、L-lys和L-tyr)重复随机合成的共聚物，其并不含有共有序列，但也可结合PEG化的脂质体(图9)。
表1：蛋白质/肽对PEG化的脂质体的结合的动力学参数。
  蛋白质/肽   Kon(s-1)   Koff(M-1s-1)   Kd(M)
  因子VIII(1)(2)   3.83×105，3.37×106   1.72×10-3，6.6×10-3   1.96×10-9，4.5×10-9
  因子IX   3.33×106   0.021   6.3×10-9
  G-CSF   4.04×105   0.0137   3.39×10-8
  GM-CSF   8.5×105   0.0103   1.21×10-8
  INF-γ   1.44×106   4.16×10-3   2.88×10-9
  GLP-1   1.16×105   2.2l×10-4   1.91×l0-9
如“材料和方法”中所述，评估多种蛋白质和肽对PEG脂质体的缔合作用和解离作用。对于FVIII、FIX、G-CSF、GM-CSF、INF-γ(γ干扰素)，所测试的PEG脂质体浓度是18.355nM；对于GLP-1，所测试的PEG脂质体浓度为183.55pM。通过BIA评估软件，分析所有蛋白质的所得数据以计算缔合速率常数(kon)、解离速率常数(koff)以及亲合常数(Kd)。
2.实施例9～10
2.1材料和方法
PEG化的脂质体FIX以及PEG化的脂质体和G-CSF的配制。具有FIX(Octanine，Octapharma)或G-CSF(ProSpec-Tany TechnoGene Ltd，NesZiona，以色列)的PEG化的脂质体可以通过将所述蛋白质与脂质体溶液一起溶解(1ml脂质体溶液/200单位的FIX，以及1ml脂质体溶液/10μg的G-CSF)而进行配制。在室温(20℃～25℃)将小瓶在以33转/分钟、16mm的振幅旋转的SRTl旋转式混合器(Stuart Scientific，Redhill，英国)中温育10分钟(G-CSF)或60分钟(FIX)。
在小鼠中脂质体配制的G-CSF和游离的G-CSF的药物动力学。对两组C57黑鼠进行皮下(s.c.)注射：a)用PEG化的脂质体(10μg/ml)配制的50μl的G-CSF；b)溶于50mM柠檬酸钠缓冲液(10μg/ml)的50μl的G-CSF。注射后在不同时间将小鼠从后眼窝窦取血并放入含有柠檬酸钠(20mM终浓度)的微型离心管中，并在4℃通过2,700×g离心10分钟来分离血浆。根据制造商的说明书，通过ELISA(G-CSF DouSet ELISA试剂盒，R&D)测量小鼠血浆中的G-CSF浓度。
血友病小鼠中PegLip-FIX和游离的FIX的药物动力学。将50μl的以下物质IV(静脉注射)到三组C57BL小鼠的尾静脉中：a)200单位/ml的PegLip-FIX；b)未配制的FIX；c)缓冲液。注射后在不同时间将小鼠从后眼窝窦取血并放入含有柠檬酸钠(20mM终浓度)的微型离心管中，并在4℃通过2,700×g离心10分钟来分离血浆。根据制造商的说明书，通过一期凝血测定法(使用Stago试剂和ST4凝固仪)测量小鼠血浆中的FIX活性。由于C57BL小鼠在其血浆中具有内源性FIX活性，所以在处理组中从各个时间点所测量的活性中减去该内源性活性(如在对照小鼠中测量的)。
药物动力学分析
通过计算机软件(RSTRIP，MicroMath Inc.)分析药物动力学参数(半寿期和AUC)。
统计学分析
Student′s t检验。
2.2结果
小鼠中脂质体配制的蛋白质的药物动力学
测量小鼠中游离的与脂质体配制的FIX和G-CSF的药物动力学参数。表2-3中所示的结果表明用PEG化的脂质体配制的蛋白质的半寿期和曲线下的面积大于游离的蛋白质的半寿期和曲线下的面积。
表2：将脂质体配制的G-CSF(PegLip-G-CSF)或游离的G-CSF皮下注射到小鼠中后的药物动力学参数
  T＝1.75小时   T＝3.75小时   T＝5.75小时   T＝7.75小时   T＝9.33小时   HL(小时)   AUC(pg*h/ml)
 PegLip-G-CSF   58150.72±6299.95   56023.32±7372.35   48901.71±8991.09   24318.43±6512.68   14006.75±4278.52   5.0380.896   434386.17±55926.46
  T＝2小时   T＝4小时   T＝6小时   T＝8小时   T＝9.58小时
 G-CSF   62419.23±5212.47   50556.82±6928.12   37141.44±6068.82   12705.32±2780.72   5735.84±284.49   3.181±0.354   420746.83±40361.42
G-CSF用50mM柠檬酸钠缓冲液pH 7重建或用PEG化的脂质体配制，并皮下注射(50μl)到小鼠中(每组6只小鼠)。通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)测量血浆中的人G-CSF浓度(pg/ml)。计算每只小鼠的药物动力学参数。数值以平均值±标准偏差表示。对PegLip-G-CSF和G-CSF的半寿期进行Student′st检验，P＜0.002。
表3：将因子IX或PEG化的脂质体配制的因子IX(PegLip-FIX)静脉注射到小鼠中后的药物动力学参数
  T＝10分钟   T＝4.83小时   T＝19.83小时   HL(小时)   AUC(pg*h/ml)
  PegLip-FIX   3.78±0.51   0.77±0.41   0.092±0.1   11.72   2.02
  T＝10分钟   T＝5小时   T＝29小时
  FIX   3.85±0.39   0.63±0.31   0.081±0.078   10.96   1.85
计算每只小鼠的药物动力学参数。数值以平均值±标准偏差表示。对PegLip-FIX和FIX的半寿期进行Student′s t检验，P＜0.15。
3.实施例11
3.1 在体内用PEG化的脂质体配制的FVIII在血友病小鼠中的药物 动力学和生物活性
测量血友病小鼠中的因子VIII的药物动力学和生物活性，所述因子VIII在注射未配制的因子VIII 1小时之后，通过注射脂质体而用PEG化的脂质体在体内进行配制。对血友病小鼠注射：a)游离的(未配制的)FVIII；b)游离的FVIII，并且1小时后再注射PEG化的脂质体。注射后在多个时间对小鼠放血，并通过凝血法测量FVIII活性。为了检验脂质体配制的FVIII在抑制出血方面的体内功效，以及将其与游离的FVIII的功效进行比较，在注射后几个时间切去被注射小鼠的尾部，并测量被注射小鼠的存活情况。
表4和图10所示的结果表明用PEG化的脂质体在体内配制的凝血因子VIII的半寿期和曲线下的面积，高于游离的FVIII的值。因此，注射FVIII并于1小时后注射脂质体的小鼠存活率明显更高。
表4：对血友病小鼠注射FVIII后或注射FVIII 1小时后注射PEG化的脂质体后，因子VIII的活性(IU/ml)和药物动力学参数
 注射的物质   注射后时间  T＝10分钟   T＝4.6小时   T＝8.3小时   T＝24.6小时   T＝28.8小时   半寿期   曲线下的面积
 FVIII和脂质体(1小时后注射)   平均值(U/ml)   2.03   1.35   0.975   0.66   0.61   14.5   28.8
 FVIII   平均值(U/ml)   2.17   1.4   0.95   0.46   0.41   9.3   24.0
用水使重组的FVIII(Kogenate-FS，Bayer)重建，并将其注射(40μl)到血友病小鼠(每组10只小鼠)的尾静脉中。1小时后，将PEG化的脂质体(9％脂质，w/v)静脉注射(40μl)到其中一组小鼠中。通过一期凝血法测量混合血浆样品在各个时间点的FVIII活性。药物动力学参数(半寿期和AUC)通过计算机程序(RSTRIP，MicroMath Inc.)进行分析。
4.实施例12
通过实时相互作用分析法，将FVIII对由POPC和氨基甲酸酯连接的不带电荷的脂聚合物组成的脂质体的结合，与FVIII对由POPC和DSPE-PEG组成的脂质体的结合进行比较。以下显示了氨基甲酸酯连接的不带电荷的脂聚合物：mPEG二硬酯酰氨基丙二醇(DS-c-PEG)和1，2-二硬酯酰-sn-甘油基-3-磷脂酰乙醇胺-N-甲氧基聚乙二醇(DSPE-PEG)的示意性结构图。
结果如图11所示，并表明两种类型的脂质体可以与FVIII相互作用。
5.实施例13
凝血因子VIIa通常用于治疗具有抑制物的血友病患者以及用于抑制创伤性出血(如，战争伤害、车祸)。在大鼠中测量了用PEG化的脂质体配制的因子VIIa的药物动力学。对Sprague Dawley(SD)大鼠(180g)注射36μg/只大鼠的游离的(未配制的)FVIIa(Nova Nordisk)或用PEG化的脂质体配制的FVIIa。注射后在不同时间对大鼠放血，并通过凝血测定法(Stago)测量FVIIa活性。表5和表6所示的结果表明，用PEG化的脂质体在体内配制的因子VIIa的半寿期和曲线下的面积，高于游离的FVIIa半寿期和曲线下的面积。
表5：将FVIIa或用PEG化的脂质体配制的FVIIa注射入大鼠后，凝血因子VIIa的活性(IU/ml)和药物动力学
  注射的物质   注射后时间   T＝10分钟   T＝3小时   T＝7小时   T＝24小时   T＝30小时   半寿期(HL)(小时)   曲线下的面积(AUC)
  PEGLip-rFVIIa(n＝4)   平均值(U/ml)±SD   573±255   38±8   7±1   1.6±1   0.5±0.2   3.08   2013
  rFVIIa(n＝4)   平均值(U/ml)±SD   706±45   45±3   4.6±1   0.1±0.1   0   1.86   1411
表6：将FVIIa或用PEG化的脂质体配制的FVIIa注射到大鼠中后(混合样品)，因子VIIa的活性(IU/ml)和药物动力学
  注射的物质   T～10分钟   T～3小时   T～7小时   T～23小时   T～31小时   半寿期(HL)(小时)   曲线下的面积(AUC)
  PEGLip-rFVIIa(n＝3)   287   22.6   8.7   1.6   1.2   3.84   1019
  rFVIIa(n＝3)   319   27   5   0   0   1.15   513

Claims (27)

1.一种用于肠胃外给药的药物组合物，该药物组合物包含治疗有效量的蛋白质或多肽以及胶体颗粒，所述颗粒包含用生物相容性亲水聚合物衍生化的、约1摩尔％～20摩尔％的两亲性脂质，
其中所述蛋白质或多肽选自：
(a)能在外部结合所述胶体颗粒的蛋白质或多肽；
(b)能结合聚烷基醚、聚乳酸和聚乙醇酸家族的聚合物的蛋白质的多肽；或
(c)包含共有序列S/T-X-L/I/V-I/V/Q/S-S/T-X-X-E的蛋白质或多肽，其中X可以是任意氨基酸，且S、T、L、I、V、E以及Q具有它们的标准含义；
其中所述蛋白质或多肽不是因子VIII(FVIII)，
以及其中所述蛋白质或多肽不是包埋于所述胶体颗粒中。
2.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述的胶体颗粒是基本上中性的，所述的聚合物基本上不带净电荷。
3.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述的胶体颗粒具有约0.03微米至约0.4微米的平均粒径。
4.如权利要求3所述的药物组合物，其中所述的胶体颗粒具有约0.1微米的平均粒径。
5.如权利要求1～4任一项所述的药物组合物，其中所述的两亲性脂质是来自天然或人造来源的磷脂。
6.如权利要求5所述的药物组合物，其中所述的两亲性脂质是磷脂酰乙醇胺(PE)。
7.如权利要求1～4任一项所述的药物组合物，其中所述的两亲性脂质是氨基甲酸酯连接的不带电荷的脂聚合物。
8.如权利要求7所述的药物组合物，其中所述的两亲性脂质是二硬酯酰氨基丙二醇(DS)。
9.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述的胶体颗粒还包含从天然或人造来源获得的第二两亲性脂质。
10.如权利要求9所述的药物组合物，其中所述的第二两亲性脂质是磷脂酰胆碱。
11.如权利要求9所述的药物组合物，该药物组合物中添加有胆固醇。
12.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述的生物相容性亲水聚合物选自聚烷基醚、聚乳酸以及聚乙醇酸家族。
13.如权利要求12所述的药物组合物，其中所述的生物相容性亲水聚合物是聚乙二醇。
14.如权利要求13所述的药物组合物，其中所述的聚乙二醇具有约500道尔顿至约5000道尔顿的分子量。
15.如权利要求14所述的药物组合物，其中所述聚乙二醇具有约2000道尔顿的分子量。
16.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述的蛋白质或多肽选自凝血酶原、因子VIIa、因子X、因子V、因子IX(FIX)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、γ干扰素、胰高血糖素样肽1(GLP-1)或克帕松。
17.如权利要求16所述的药物组合物，其中所述的多肽是克帕松，并且所述的组合物用于治疗选自以下的疾病：多发性硬化症、糖尿病性神经病变、老年性痴呆、阿尔茨海默氏病、帕金森氏症、面神经(Bell′s)麻痹、青光眼、亨廷顿氏舞蹈病、肌萎缩性侧索硬化、癫痫持续状态、非动脉炎性视神经病变或维生素缺乏症。
18.如权利要求16所述的药物组合物，其中所述的多肽是因子VIIa，并且所述的组合物用于治疗具有抑制物的血友病患者以及用于治疗创伤性出血。
19.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述的蛋白质或多肽包含氨基酸共有序列S/T-X-L/I/V-I/V/Q/S-S/T-X-X-E，其中X是任意的氨基酸。
20.治疗血友病患者的方法，该方法包括对患者施用用于肠胃外给药的药物组合物，该药物组合物包含有效治疗血友病的治疗有效量的蛋白质或多肽以及胶体颗粒，所述颗粒包含用生物相容性亲水聚合物衍生化的、约1摩尔％～20摩尔％的两亲性脂质，
其中所述蛋白质或多肽选自：
(a)能在外部结合所述胶体颗粒的蛋白质或多肽；或
(b)能结合聚烷基醚、聚乳酸和聚乙醇酸家族的聚合物的蛋白质的多肽；或
(c)包含共有序列S/T-X-L/I/V-I/V/Q/S-S/T-X-X-E的蛋白质或多肽，其中X可以是任意氨基酸，且S、T、L、I、V、E以及Q具有它们的标准含义；
其中所述蛋白质或多肽不是因子VIII(FVIII)，
以及其中所述蛋白质或多肽不是包埋于所述胶体颗粒中。
21.如权利要求20的方法，其中所述的患者已经产生了针对所述蛋白质或多肽的抑制物抗体。
22.胶体颗粒在制备用于治疗血友病患者的肠胃外给药的药物组合物中的用途，该药物组合物包含治疗有效量的蛋白质或多肽以及胶体颗粒，所述颗粒包含用生物相容性亲水聚合物衍生化的、约1摩尔％～20摩尔％的两亲性脂质，
其中所述蛋白质或多肽选自：
(a)能在外部结合所述胶体颗粒的蛋白质或多肽；或
(b)能结合聚烷基醚、聚乳酸和聚乙醇酸家族的聚合物的蛋白质的多肽；或
(c)包含共有序列S/T-X-L/I/V-I/V/Q/S-S/T-X-X-E的蛋白质或多肽，其中X可以是任意氨基酸，且S、T、L、I、V、E以及Q具有它们的标准含义；
其中所述蛋白质或多肽不是凝血因子VIII(FVIII)，
以及其中所述蛋白质或多肽不是包埋于所述胶体颗粒中。
23.如权利要求22所述的用途，其中所述的患者已经产生了针对所述蛋白质或多肽的抑制物抗体。
24.胶体颗粒在制备用于肠胃外给药的药物组合物中的用途，所述药物组合物包含治疗有效量的蛋白质或多肽以及胶体颗粒，所述颗粒包含用生物相容性亲水聚合物衍生化的、约1摩尔％～20摩尔％的两亲性脂质，
其中所述蛋白质或多肽选自：
(a)能在外部结合所述胶体颗粒的蛋白质或多肽；或
(b)能结合聚烷基醚、聚乳酸和聚乙醇酸家族的聚合物的蛋白质的多肽；或
(c)包含共有序列S/T-X-L/I/V-I/V/Q/S-S/T-X-X-E的蛋白质或多肽，其中X可以是任意氨基酸，且S、T、L、I、V、E以及Q具有它们的标准含义；
其中所述的蛋白质或多肽不是因子VIII(FVIII)，
以及其中所述蛋白质或多肽不是包埋于所述胶体颗粒中。
25.治疗患有疾病的患者的方法，该方法包括对所述患者施用用于肠胃外给药的药物组合物，该药物组合物包含有效治疗疾病的治疗有效量的蛋白质或多肽以及胶体颗粒，所述颗粒包含用生物相容性亲水聚合物衍生化的、约1摩尔％～20摩尔％的两亲性脂质，
其中所述蛋白质或多肽选自：
(a)能在外部结合所述胶体颗粒的蛋白质或多肽；或
(b)能结合聚烷基醚、聚乳酸和聚乙醇酸家族的聚合物的蛋白质的多肽；或
(c)包含共有序列S/T-X-L/I/V-I/V/Q/S-S/T-X-X-E的蛋白质或多肽，其中X可以是任意氨基酸，且S、T、L、I、V、E以及Q具有它们的标准含义；
其中分开施用所述的胶体颗粒和所述的蛋白质或多肽，
以及其中所述蛋白质或多肽不是包埋于所述的胶体颗粒中。
26.如权利要求25的方法，其中所述的蛋白质或多肽不是因子VIII(FVIII)。
27.如权利要求25的方法，其中所述的胶体颗粒是脂质体，所述的蛋白质或多肽是因子VIII(FVIII)。
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