ES2305849T3 - Procedimiento para la produccion de l-lisina o l-treonina utilizando la bacteria escherichia que presenta actividad de la enzima malica atenuada. - Google Patents

Abstract

Procedimiento para producir L-lisina o L-treonina, que comprende el cultivo de una bacteria en un medio para producir y segregar dicha L-lisina o L-treonina, y recoger la L-lisina o L-treonina del medio, en el que dicha bacteria es una bacteria Escherichia que tiene capacidad para producir L-lisina o L-treonina, y en el que dicha bacteria se modifica de manera que se elimina una enzima málica o se reduce la actividad de una enzima málica en comparación con una cepa no modificada, en el que el gen que codifica dicha enzima de ácido málico comprende sfcA y/o b2463.

Description

Procedimiento para la producción de L-lisina o L-treonina utilizando la bacteria Escherichia que presenta actividad de la enzima málica atenuada.

Campo técnico

La presente invención se refiere a un procedimiento para la producción de L-lisina o L-treonina utilizando la bacteria Escherichia. La L-lisina y la L-treonina son conocidas como aminoácidos esenciales y son útiles como componentes en las composiciones farmacéuticas y diversas mezclas nutritivas, tales como aditivos en piensos para animales.

Antecedentes de la técnica

Los L-aminoácidos, tales como L-treonina y L-lisina, se producen a escala industrial por fermentación utilizando bacterias productoras de L-aminoácidos, tal como las bacterias corineformes o Escherichia que tienen capacidad para producir L-aminoácidos. Para mejorar la productividad, se ha utilizado una cepa aislada de la naturaleza, un mutante artificial de la misma o un recombinante en los que se ha utilizado la actividad enzimática biosintética del L-aminoácido aumenta por recombinación genética como bacteria productora de L-aminoácidos. El procedimiento para producir L-lisina ha sido ejemplificado en los documentos 1 a 4 de la patente. El procedimiento para producir L-treonina se ha puesto como ejemplo en los documentos 5 a 8 de la patente.

Los procedimientos para aumentar la capacidad para producir aminoácidos tales como la L-treonina y la L-lisina incluyen un procedimiento para aumentar la eficacia energética modificando una serie de reacciones de la cadena respiratoria (documento de patente 13) y un procedimiento para aumentar la capacidad para producir el fosfato del dinucleótido nicotinamida-adenina ampliando una nucleótido nicotinamida transdeshidrogenasa (documento de patente 9), así como un procedimiento para aumentar una cantidad de expresión de una enzima de la serie de reacciones endógenas biosintéticas.

Además, son conocidos los procedimientos para modificar series de reacciones habituales de los sistemas biosintéticos de aminoácidos e incluyen modificar la serie de reacciones anapleróticas de las bacterias productoras de L-aminoácidos, tal como una bacteria corineforme productora de L-lisina en la que aumenta una actividad de piruvato-carboxilasa (documento 10 de la patente), una bacteria Escherichia productora de L-lisina carece de piruvato cinasa (documento de patente 11) y una bacteria corineforme productora de L-lisina que carece de malato quinina oxidorreductasa (documento de patente 12).

Una enzima málica es la de las enzimas de la serie de reacciones anapleróticas. Es sabido que en las bacterias Escherichia, cada uno de los genes sfcA y b2463 codifica la enzima málica (documento 9 no de la patente). Sin embargo, no se ha descrito si la disminución de actividad de las enzimas málicas codificada por los genes sfcA y b2463 es o no eficaz para aumentar la producción de L-lisina o L-treonina.

Un análisis de flujo metabólico, que se denomina también análisis de equilibrio del flujo, es una técnica para prever las distribuciones intracelulares del flujo metabólico mediante la construcción de un modelo estequiométrico de reacciones bioquímicas intracelulares y optimización lineal. Esta técnica se ha utilizado en investigación dentro de las capacidades de los sistemas de reacción bioquímicos en microorganismos o para predecir las distribuciones intracelulares del flujo metabólico en diferentes condiciones externas (documentos 1, 2 y 3 no de la patente). Se ha publicado también que se construyó un modelo estequiométrico para Escherichia coli (documentos 4 y 5 no de patente). También es conocido un ejemplo de utilización de dicho modelo estequiométrico en ingeniería metabólica para la producción de lisina para Corynebacterium glutamicum, que se utiliza en la producción de aminoácidos (documento 6 no de patente). Además, se ha descrito un gran número de procedimientos teóricos o experimentales para los análisis de flujo metabólico y sus aplicaciones (documentos 7, 8 no de patente, documentos 14, 15 y 16 de patente). El documento 14 de patente da a conocer un procedimiento para predecir un gen requerido para el crecimiento basado en un modelo estequiométrico. El documento de patente 15 da a conocer una técnica para cambiar desde un punto de vista genético y evolutivo las células para proporcionar funciones óptimas a las células. Además, el documento 16 de patente da a conocer un procedimiento para aplicar limitaciones de información cinética cualitativa, limitaciones de información de control cualitativo y limitaciones basadas en datos experimentales de la microrred de ADN en diferentes condiciones para un modelo estequiométrico. Aunque todos estos son procedimientos para predecir distribuciones de flujo metabólico intracelulares más deseables, no se ha dado a conocer ningún método para predecir teóricamente un flujo específico como diana para mejorar directamente la producción de la sustancia celular.

<Documento 1 de patente>

Solicitud de patente japonesa abierta al público nº 10-16580

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<Documento 2 de patente>

Solicitud de patente japonesa abierta al público nº 11-192088

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<Documento 3 de patente>

Solicitud de patente japonesa abierta al público nº 2000-253879

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<Documento 4 de patente>

Solicitud de patente japonesa abierta al público nº 2001-57896

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<Documento 5 de patente>

Solicitud de patente japonesa abierta al público nº 5-304969

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<Documento 6 de patente>

Publicación internacional nº WO 98-04715

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<Documento 7 de patente>

Solicitud de patente japonesa abierta al público nº 5-227977

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<Documento 8 de patente>

Solicitud de patente japonesa abierta al público nº 2002-0110876

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<Documento 9 de patente>

Patente japonesa nº 2817400

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<Documento 10 de patente>

Solicitud de patente japonesa abierta al público nº 2002-508921

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<Documento 11 de patente>

Publicación internacional nº WO 03/008600

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<Documento 12 de patente>

Publicación de la solicitud de patente nº 2003-0044943

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<Documento 13 de patente>

Solicitud de patente japonesa abierta al público nº 2002-17363

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<Documento 14 de patente>

Publicación internacional nº WO 00/46405

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<Documento 15 de patente>

Publicación internacional nº WO 02/061115

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<Documento 16 de patente>

Publicación internacional nº WO 02/055995

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<Documento 1 no de patente>

Varma, A. y Palsson, B.O., Appl. Environ. Microbiol. 60:3724-3731, 1994

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<Documento 2 no de patente>

Schilling, C.H. et al., Biotechnol. Prog., 15:288-295, 1999

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<Documento 3 no de patente>

Schilling, C.H. et al., Biotechnol. Prog., 15:296-303, 1999

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<Documento 4 no de patente>

Pramanik, J. y Keasling, J.D., Biotechnol. Bioeng., 56:398-421, 1997

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<Documento 5 no de patente>

Ibarra, R.U. et al., Nature, 420:186-189, 2002

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<Documento 6 no de patente>

Vallino, J.J. y Stephanopoulos, G., Biotechnol. Bioeng., 41:633-646, 1993

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<Documento 7 no de patente>

Wiechert, W., Journal of Biotechnology, 94:37-63, 2002

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<Documento 8 no de patente>

Wiechert, W., Metabolic Engineering, 3:195-205, 2001

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<Documento 9 no de patente>

Van der Rest, M.E., Frank C., Molenaar, D.J., J. Bacteriol., 182(24):6892-6899, 2000

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Exposición de la invención

La presente invención proporciona un procedimiento para producir L-lisina o L-treonina que utiliza una bacteria Escherichia que presenta una capacidad mejorada para producir L-lisina o L-treonina.

Los inventores de la presente invención estudiaron con perseverancia resolver el problema y como resultado, descubrieron que la producción de un flujo metabólico que afecta la producción de la sustancia podría determinarse (1) seleccionando el mismo número de flujos libres que el grado de libertad de una matriz estequiométrica calculada basándose en las fórmulas de las reacciones bioquímicas de un sustrato mediante una sustancia producida deseada, (2) calculando las distribuciones de flujo metabólico de combinaciones aleatorias de los flujos libres en número suficiente para un análisis estadístico basado en la matriz estequiométrica, y (3) obteniendo una ecuación de regresión que incluya un número mínimo de flujos libres que se correlacionen con la producción del sustrato de las distribuciones de flujo metabólico calculadas basándose en el análisis estadístico.

La determinación de los flujos metabólicos de una bacteria productora de L-lisina o L-treonina por este procedimiento ha puesto de manifiesto una modificación de modo que una enzima málica que no funciona normalmente es eficaz para aumentar la productividad de la bacteria. La presente invención se llevó a cabo basándose en los descubrimientos mencionados anteriormente, y proporciona lo que sigue a continuación:

(1) Un procedimiento para producir L-lisina o L-treonina, que comprende el cultivo de una bacteria en un medio para producir y segregar dicha L-lisina o L-treonina y recoger la L-lisina o L-treonina del medio, en el que dicha bacteria es una bacteria Escherichia que tiene capacidad para producir L-lisina o L-treonina, y en el que dicha bacteria está modificada de modo que se elimina una enzima málica o se reduce la actividad de una enzima málica en comparación con una cepa inalterada, en el que el gen que codifica dicha enzima de ácido málico comprende sfcA y/o b2463.

(2) El procedimiento de (1), en el que dicha bacteria está modificada de modo que la actividad de la enzima málica se reduce no más del 50% por célula en comparación con la cepa no modificada.

(3) El procedimiento según (1) ó (2), en el que se muta un gen que codifica dicha enzima málica del cromosoma bacteriano y/o se muta una secuencia de control de la expresión del mismo de modo que se elimina la enzima málica o se reduce la actividad de la enzima málica en comparación con una cepa no modificada.

(4) El procedimiento según (1) ó (2), en el que se realiza la rotura de un gen que codifica dicha enzima málica en el cromosoma bacteriano.

(5) El procedimiento según cualquiera de (1) a (4), en el que dicha enzima málica se selecciona de entre el grupo constituido por:

(A)

una proteína que presenta la secuencia de aminoácidos representada en la SEC. ID. nº: 6, y

(B)

una proteína que presenta una secuencia de aminoácidos que comprende la sustitución, eliminación, inserción o adición de uno o varios restos de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos representada en la SEC. ID. nº: 6, y presenta una actividad de una enzima málica.

(6) El procedimiento según cualquiera de (1) a (4), en el que dicha enzima málica se selecciona de entre el grupo constituido por:

(C)

una proteína con la secuencia de aminoácidos representada en la SEC. ID. nº: 8, y

(D)

una proteína que presenta una secuencia de aminoácidos que comprende la sustitución, eliminación, inserción o adición de uno o varios restos de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos representada en la SEC. ID. nº: 8, y presenta una actividad de una enzima málica.

(7) El procedimiento según cualquiera de (1) a (4), en el que el gen que codifica dicha enzima málica es un ADN seleccionado de entre el grupo constituido por:

(a)

un ADN que tiene una secuencia nucleotídica representada en la SEC. ID. nº: 5,

(b)

un ADN que se hibrida con la secuencia nucleotídica representada en la SEC. ID. nº: 5, o una sonda que puede prepararse a partir de la secuencia nucleotídica, en la que dicha hibridación se produce en condiciones severas, y en la que dicho ADN codifica una proteína que presenta actividad de una enzima málica.

(8) El procedimiento según cualquiera de (1) a (4), en el que el gen que codifica dicha enzima málica es un ADN seleccionado de entre el grupo constituido por:

(c)

un ADN que tiene una secuencia nucleotídica representada en la SEC. ID. nº: 7, y

(d)

un ADN que se hibrida con la secuencia nucleotídica representada en la SEC. ID. nº: 7, o una sonda que puede prepararse a partir de la secuencia nucleotídica, en la que dicha hibridación se produce en condiciones severas, y en la que dicho ADN codifica una proteína que presenta actividad de una enzima málica.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 es un gráfico que presenta la producción de lisina en función de diferentes valores de estos flujos libres utilizando una serie de datos de 5.000 distribuciones de flujo aleatorias. Los rendimientos de lisina se presentan para (a) flujo de isocitrato-liasa, (b) flujo de enzima málica y (c) flujo de PEP-carboxilasa.

La Fig. 2 es un gráfico que presenta la producción de lisina en función de los valores en la ecuación 2 para una serie de datos para 5.000 distribuciones de flujo aleatorias. El valor de entrada es un flujo en mmoles/h basado en 10 mmoles/h de flujo de glucosa.

La Fig. 3 presenta las estructuras de pMW118-attL-Tc-attR y pMW118-attL-Cm-attR.

La Fig. 4 presenta la estructura de pMW-intxis-ts.

Mejor modo de poner en práctica la invención

A continuación, la presente invención se explica con más detalle.

<1> Bacteria Escherichia utilizada en el procedimiento de la presente invención

La bacteria Escherichia utilizada en el procedimiento de la presente invención es una bacteria que pertenece al genero Escherichia que tiene capacidad para producir L-lisina o L-treonia y que se modifica para que no funcione normalmente una enzima málica. La bacteria Escherichia utilizada en el procedimiento de la presente invención puede tener capacidad para producir L-lisina o L-treonina, o puede tener capacidad para producir tanto L-lisina como L-treonina.

Una cepa progenitora que pertenece al genero Escherichia que se utiliza para obtener la bacteria Escherichia utilizada en el procedimiento de la presente invención incluye, pero no se limita a las descritas en el libro escrito por Neidhardt et al., (Neidhardt, F. C. et al., Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D. C., 1029, tabla 1). Por ejemplo, la cepa progenitora puede ser Escherichia coli. La Escherichia coli puede ser Escherichia coli W3110 (ATCC 27325) o Escherichia coli MG1655 (ATCC 47076), que proceden ambas de la cepa K12 prototipo natural.

Estas cepas pueden conseguirse en la American Type Culture Collection (Dirección: 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, Estados Unidos de América), por ejemplo. Se asignan números de registro a las cepas, respectivamente. Es posible solicitar la cepa deseada por su número de registro. Los números de registro que corresponden a las cepas están listados en el catálogo de la American Type Culture Collection.

<1>-1. Aporte de capacidad para producir L-lisina o L-treonina

A continuación se describe un procedimiento para proporcionar la capacidad para producir L-lisina o L-treonina a la bacteria Escherichia. La frase "capacidad para producir L-lisina" tal como se utiliza en la presente memoria significa la capacidad para producir y ocasionar la acumulación de L-lisina en un medio, o de segregar la misma, es decir L-lisina extracelular libre, cuando se cultiva la bacteria en el medio. En particular, la frase "capacidad para producir L-lisina" significa una capacidad para producir acumulación de más L-lisina en comparación con una cepa natural o progenitora.

La frase "capacidad para producir L-treonina" tal como se utiliza en la presente memoria significa la capacidad para producir y ocasionar la acumulación de L-treonina en un medio, o de segregar la misma, es decir L-treonina extracelular libre, cuando se cultiva la bacteria en el medio. En particular, esta frase significa una capacidad para producir acumulación de más L-treonina en comparación con una cepa natural o progenitora.

Para proporcionar capacidad de producción de L-lisina o L-treonina, pueden utilizarse los procedimientos convencionales para cultivar bacterias Escherichia y bacterias corineformes, tales como los procedimientos para obtener cepas mutantes auxótrofas, cepas resistentes a análogos o cepas mutantes de control metabólico que tienen capacidad para producir L-lisina o L-treonina y procedimientos para producir cepas recombinantes en los que las actividades enzimáticas biosintéticas de L-lisina o L-treonina están aumentadas. En el cultivo de las bacterias productoras de L-lisina o L-treonina, las características tales como el auxotrofismo, resistencia análoga y mutaciones de control metabólico pueden proporcionarse solas o en combinación.

La actividad enzimática biosintética incrementada de L-lisina o L-treonina puede ser sola o en combinación. Además, la comunicación de características tales como el auxotrofismo, la resistencia análoga y las mutaciones de control metabólico pueden combinarse con el incremento de la actividad enzimática de la biosíntesis de L-lisina y/o L-treonina.

Ejemplos de procedimientos para proporcionar o aumentar la capacidad para producir L-lisina o L-treonina aumentando la actividad enzimática biosintética de L-lisina o L-treonina se describen a continuación. El aumento de la actividad enzimática puede realizarse, por ejemplo, introduciendo una mutación en un gen que codifica la enzima o ampliando el gen de modo que aumente la actividad intracelular de la enzima. Esto puede realizarse por recombinación génica.

Los genes que codifican las enzimas biosintéticas de L-treonina incluyen, pero no se limitan al gen de la aspartocinasa III (lysC), al gen de la aspartato semialdehído deshidrogenasa (asd), a la aspartocinasa I codificada por el operón thr (thrA), al gen de la homoserina cinasa (thrB) y al gen de la treonina sintasa (thrC). El símbolo abreviado del gen se muestra entre paréntesis. Pueden introducirse dos o más de estos genes. El gen de la enzima biosintética de L-treonina puede introducirse en una bacteria de Escherichia cuya degradación de la treonina está suprimida. Una bacteria Escherichia cuya degradación de la treonina está suprimida a título de ejemplo es la cepa TDH6, que carece de la actividad de la treonina-deshidrogenasa (solicitud de patente japonesa abierta al público nº 2001-346578).

Los genes que codifican las enzimas biosintéticas de L-lisina incluyen, pero no se limitan a las enzimas de las series de reacciones de diaminopimelato, tal como el gen de la dihidrodipicolinato-sintasa (dapA), el gen de la aspartocinasa (lysC), el gen de la reductasa dihidropicolinatada (dapB), el gen de la diaminopimelato-descarboxilasa (lysA), el gen de la diaminopimelato-deshidrogenasa (ddh) (todos los anteriores; publicación internacional nº 96/40934), el gen de la fosfoenolpiruvato-carboxilasa (solicitud de patente japonesa abierta al público nº 60-87788), el gen de la aspartato-aminotransferasa (aspC) (publicación de patente japonesa nº 6-102028), el gen de la diaminopimelato-epimerasa (dapF) (solicitud de patente japonesa abierta al público nº 2003-135066), y el gen de la aspartato semilaldehído deshidrogenasa (asd) (publicación internacional nº 00/61723) y las enzimas de la serie de reacciones del aminoadipato, tal como el gen de la homoaconitrato-hidratasa (solicitud de patente japonesa abierta al público nº 2000-157276).

Además, la bacteria utilizada en el procedimiento de la presente invención puede tener actividad disminuida de una enzima que cataliza una reacción para generar un compuesto aparte de la L-lisina mediante ramificación de la serie de reacciones biosintéticas de L-lisina o puede carecer de dicha enzima. Las enzimas que catalizan una reacción para generar un compuesto distinto de la L-lisina por ramificación de la serie de reacciones biosintéticas de la L-lisina incluyen la homoserina-deshidrogenasa y la lisina-descarboxilasa. en los documentos WO 95/23864 y WO 96/178930 se describen las cepas con actividades disminuidas de las enzimas.

Aumentando la actividad de la enzima codificada por el gen puede conseguirse ampliar el gen biosintético de L-lisina o L-treonina con un plásmido replicable de forma autónoma en la bacteria Escherichia, por ejemplo. El gen biosintético puede integrarse en el cromosoma bacteriano. Puede conseguirse también introduciendo un gen que incluya una mutación que de lugar a que aumente la actividad de la enzima codificada por el gen. Ejemplos de dicha mutación incluyen la mutación de una secuencia promotora, de modo que la cantidad de transcripción del gen aumenta, y la mutación en la zona de codificación del gen, de modo que aumenta la actividad específica de la proteína enzimática.

Aparte de la ampliación génica descrita anteriormente, la expresión del gen puede ampliarse sustituyendo una secuencia de control de expresión, tal como un promotor del gen en el ADN cromosómido o plásmido, por uno más potente (publicación internacional nº WO 00/18935). Los promotores potentes son conocidos e incluyen, por ejemplo, el promotor lac, el promotor trp, el promotor trc, el promotor tac y el promotor P_{R} del fago lambda. La expresión del gen puede aumentarse sustituyendo el promotor endógeno en el cromosoma o el plásmido por el uno más potente o modificando el promotor endógeno. Modificando la secuencia de control de expresión puede combinarse aumentando el número de copias del gen.

A continuación se presentan ejemplos de bacterias Escherichia a las que se proporciona capacidad para producir L-lisina o L-treonina, que pueden utilizarse en la presente invención. Sin embargo, la bacteria de la presente invención no se limita a estos ejemplos, sino que comprende cualquier bacteria que tiene capacidad para producir L-lisina o L-treonina.

Ejemplos específicos de cepas resistentes a cepas mutantes de control análogas o metabólicas que tienen capacidad para producir L-lisina incluyen la AJ11442 de Escherichia coli (FERM BP-1543, NRRL B-12185; la solicitud de patente japonesa abierta al público nº 56-18596 y la patente US nº 4.346.170) y la VL611 de Escherichia coli. Puede utilizarse la cepa WC196 como bacteria productora de L-lisina de Escherichia coli (publicación internacional nº WO 96/17930). La cepa WC196 se cultivó proporcionando resistencia a AEC (S-(2-aminoetil)cisteína) a la cepa W3110, que procede de la K-12 de Escherichia coli. Esta cepa se denominó AJ13069 de Escherichia coli y se depositó en el National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology (actualmente National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, depositario del organismo de patentes internacional, Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japón) el 6 de dic. de 1994 y recibió un número de registro P-14690 del FERM. Se convirtió en un depósito internacional bajo las estipulaciones del Tratado de Budapest de 29 de sep. de 1995 y recibió un número de registro BP-5252 del FERM.

Ejemplos de bacterias de Escherichia que tienen capacidad para producir L-treonina incluyen la cepa mutante productora de L-treonina que es resistente a la 6-dimetilamino-purina (solicitud de patente japonesa abierta al público nº 5-304969), cepas recombinantes de Escherichia coli tal como una cepa en la que el gen biosintético de treonina que tiene una mutación introducida que da lugar a exceso de producción de enzima biosintética de L-treonina se amplía en un plásmido (publicación de patente japonesa nº 1-29559 y solicitud de patente japonesa abierta al público nº 5-227977), una cepa en la que un operón de treonina se amplía en un plásmido (solicitud de patente japonesa abierta al público nº 2-109985) y una cepa en la que se amplían los genes que codifican la piruvato carboxilasa y la nicotinamida nucleótido transhidrogenasa (solicitud de patente japonesa abierta al público nº 2002-51787).

La B-3996 de la VKPM de Escherichia coli (patente US nº 5.175.107) está comprendida también en la presente invención. La cepa B-3996 de la VKPM se depositó en la Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNII (Genetika) el 19 de noviembre de 1987 y recibió un número de registro B-3996 de la VKPM. La B-3996 de la VKPM alberga el plásmido pVIC40 (publicación internacional nº WO 90/04636) que se produce insertando genes biosintéticos de treonina (operón de treonina: thrABC) en un vector hospedador de amplio intervalo, por ejemplo, el plásmido pAYC32 (Chistoserdov, A. Y., Tsygankov, Y. D., Plasmid, 1986, 16, 161-167). En el pVIC40, la inhibición de la retroalimentación por L-treonina de aspartocinasa I-homoserina deshidrogenasa I codificado por thrA en el operón de treonina está desensibilizada.

Además, la B-5318 de Escherichia coli (patente europea nº 0593792) está comprendida en la presente invención. La cepa B-5318 se depositó en la Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNII (Genetika) el 19 de noviembre de 1987 y recibió un número de registro B-5318 de la VKPM. La B-5318 de la VKPM es protótrofa con respecto a la isoleucina y alberga un ADN plásmido recombinante. Este plásmido se construye de modo que el operón de treonina, que incluye los genes biosintéticos de treonina, carece de una zona de atenuación, por ejemplo, la zona de regulación de transcripción endógena. El operón está colocado corriente abajo del represor C1 sensible a la temperatura del fago lambda, el promotor P_{R} y el terminal N de la proteína Cro y se construye de modo que la expresión de los genes biosintéticos de treonina está bajo control de un represor y promotor del fago
lambda.

<2> Construcción de la bacteria Escherichia utilizada en el procedimiento de la presente invención

La bacteria Escherichia utilizada en el procedimiento de la presente invención es una bacteria que pertenece al género Escherichia que tiene capacidad para producir L-lisina o L-treonina y que está modificada de modo que la enzima málica no funciona normalmente.

Durante el cultivo de la bacteria Escherichia utilizada en el procedimiento de la presente invención, proporcionar capacidad para producir L-lisina o L-treonina, o puede realizarse inicialmente la mutación en la que la enzima málica (EC 1.1.1.38, EC 1.1.1.40) no funciona normalmente. Asimismo, una bacteria Escherichia con capacidad para producir L-lisina o L-treonina puede modificarse de modo que la enzima málica no funcione normalmente y la capacidad para producir L-lisina o L-treonina puede proporcionarse a una bacteria Escherichia en la que la enzima málica no ha funcionado normalmente todavía.

La frase "actividad de una enzima málica" significa una actividad para catalizar una reacción reversible para producir dioxido de carbono y piruvato a partir del malato. Las enzimas málicas que utilizan NAD (EC 1.1.1.38) y NADP (EC 1.1.1.40) como coenzimas son conocidas. (EC 1.1.1.38 (S)-malato + NAD+ = piruvato + CO_{2} + NADH + H^{+}) (EC 1.1.1.40 (S)-malato + NADP^{+} = piruvato + CO_{2} + NADPH + H^{+}). La enzima málica se denomina también "malato-deshidrogenasa" o "malato-oxidorreductasa".

La frase "modificado de modo que la enzima málica no funciona normalmente en una célula" significa que está modificada de modo que la función de la enzima málica estaría eliminada o la actividad de la enzima málica estaría reducida o atenuada en comparación con una cepa inalterada tal como una cepa natural (progenitora). El estado en el que la enzima málica no funciona normalmente puede ser, por ejemplo, un estado en el que la transcripción o traducción del gen que codifica la enzima málica está inhibido, y por consiguiente el producto génico de la misma, la enzima málica no se produce o la producción reducida, o un estado en el que el gen que codifica dicha enzima málica del cromosoma bacteriano está mutado y/o una secuencia de control de expresión del mismo está mutada, y por lo tanto la actividad de la enzima málica se reduce o elimina. Ejemplo de bacteria Escherichia en la que la enzima málica no funciona normalmente incluye, típicamente, una cepa con el gen destruido en el que el gen que codifica la enzima málica en el cromosoma bacteriano se realiza la rotura mediante la técnica de recombinación genética y una cepa mutante en la que una secuencia reguladora de la expresión o una zona de codificación del gen de la enzima málica está mutada, y por consiguiente ya no se produce una enzima málica funcional.

La frase "modificada de modo que una actividad de una enzima málica está atenuada" significa que la actividad de la enzima málica está reducida en comparación con la de una cepa inalterada, por ejemplo, una cepa natural (progenitora) de la bacteria Escherichia. La actividad de la enzima málica preferentemente se reduce no más del 50%, más preferentemente no más del 30%, aún más preferentemente no más del 10% por célula en comparación con la cepa inalterada.

Ejemplos de bacteria Escherichia que pueden actuar como referencia incluyen la W3110 de Escherichia coli (ATCC 27325) y la MG1655 de Escherichia coli (ATCC 47076). Estas cepas naturales proceden del prototipo K12 de cepa natural. La actividad de la enzima málica, utilizando NAD como coenzima, puede determinarse según el procedimiento de Korkes, S., et al. (Korkes, S. et al., (1950) J. Biol. Chem. 187, 891-905). La actividad de la enzima málica utilizando NADP como coenzima puede determinarse según el procedimiento de Ochoa, S. (Ochoa, S. et al. (1947) J. Biol. Chem. 167, 871-872).

El término "atenuación" incluye, pero no se limita a, la eliminación completa de la actividad. La actividad de la enzima málica utilizando NAD o NADP como coenzimas puede atenuarse cada una individualmente o en conjunto. Es suficiente para la presente invención que la bacteria Escherichia tenga actividad de enzima málica atenuada en comparación con una cepa natural o inalterada. Sin embargo, resulta preferido que la bacteria Escherichia de la presente invención también tenga capacidad aumentada para producir acumulación o segregar L-lisina o L-treonina en comparación con la cepa natural o inalterada y/o productividad mejorada de L-lisina o L-treonina a causa del buen crecimiento, o sea rendimiento del sustrato celular mejorado.

La enzima málica utilizada en el procedimiento de la presente invención incluye la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos representada en la SEC. ID. nº: 6 o nº: 8. La enzima málica puede ser una variante de la secuencia de aminoácidos representada en la SEC. ID. nº: 6 o nº: 8 en la que puede incluir la sustitución, deleción, inserción o adición de uno o varios restos de aminoácido en la secuencia de aminoácidos representada en la SEC. ID. nº: 6 o nº: 8, con la condición de que tenga actividad de enzima málica. "Varios" tal como se utiliza en la presente invención, significa, por ejemplo, 2 a 20, preferentemente 2 a 10, más preferentemente 2 a 5.

La sustitución, eliminación, inserción o adición de uno o varios restos de aminoácido debería ser una(s) mutación o mutaciones conservadora(s) de modo que la actividad de la enzima málica se mantenga. La mutación conservadora representativa es una sustitución conservadora. Los ejemplos de sustituciones conservadoras incluyen la sustitución de Ser o Thr por Ala, la sustitución de Gln, His o Lys por Arg, la sustitución de Glu, Gln, Lys, His o Asp por Asn, la sustitución de Asn, Glu o Gln por Asp, la sustitución de Ser o Ala por Cys, la sustitución de Asn, Glu, Lys, His, Asp o Arg por Gln, la sustitución de Asn, Gln, Lys o Asp por Glu, la sustitución de Pro por Gly, la sustitución de Asn, Lys, Gln, Arg o Tyr por His, la sustitución de Leu, Met, Val o Phe por Ile, la sustitución de Ile, Met, Val o Phe por Leu, la sustitución de Asn, Glu, Gln, His o Arg por Lys, la sustitución de Ile, Leu, Val o Phe por Met, la sustitución de Trp, Tyr, Met, Ile o Leu por Phe, la sustitución de Thr o Ala por Ser, la sustitución de Ser o Ala por Thr, la sustitución de Phe o Tyr por Trp, la sustitución de His, Phe o Trp por Tyr y la sustitución de Met, Ile o Leu por Val.

La frase "modificada de modo que una enzima málica no funcione normalmente" puede significar aumentar el número de moléculas de enzima málica por célula y disminuir la actividad de la enzima málica por molécula. Específicamente, la modificación puede realizarse construyendo un gen que codifica la enzima málica en el cromosoma deficitario o modificando una secuencia de control de expresión tal como un promotor o la secuencia de Shine-Dalgarno (SD). También, puede realizarse la modificación introduciendo la sustitución de un aminoácido (mutación sin sentido invertida), o un codón de terminación (mutación sin sentido) por una zona de codificación, o introduciendo la inserción o eliminación de 1 a 2 bases en una zona de codificación (mutación por desplazamiento del marco) o eliminando parte del gen (Journal of Biological Chemistry 272:8611-8617 (1997)).

Un gen de la enzima málica (gen mez) en el cromosoma incluye el gen sfcA, tal como un ADN que presenta la secuencia de nucleótidos representada en la SEC. ID. nº: 5. Este ADN codifica la enzima que utiliza NAD como coenzima. El otro gen es el gen b2463, tal como un ADN que presenta la secuencia nucleotídica representada en la SEC. ID. nº: 7. Este ADN codifica la enzima que utiliza NADP como coenzima.

El gen mez puede ser un ADN que se hibrida con la secuencia nucleotídica representada en la SEC. ID. nº: 5 o nº: 7 o una sonda que puede prepararse a partir de la secuencia nucleotídica en condiciones severas, con la condición de que codifique una proteína que tenga actividad de la enzima málica. "Condiciones severas" comprenden las que se forma un híbrido específico y no se forma un híbrido no específico. Por ejemplo, las condiciones severas se ejemplifican lavando una vez, preferentemente dos o tres veces a una concentración salina correspondiente a 1\times SSC, SDS al 0,1%, preferentemente 0,1\times SSC, SDS al 0,1% a 60ºC. La longitud de la sonda puede seleccionarse de manera adecuada dependiendo de las condiciones de hibridación y normalmente es de 100 bp a 1 kbp.

El gen que codifica la enzima málica (sfcA, b2643) puede obtenerse por PCR utilizando el cromosoma de Escherichia coli como plantilla y los oligonucleótidos sintetizados basándose en las secuencias siguientes de Escherichia coli registradas en el GenBank como cebadores: sfcA: AAC74552, malato unido a NAD... [gi:1787754], complemento de AE000245.1:1208..2932, b2643: AAC75516. supuesto multimod...[gi:1788806], complemento de AE000333.1:141..
2420.

Puede prepararse ADN cromosómico a partir de una bacteria para su utilización como donante de ADN, por ejemplo, por el método de Saito y Miura (referencia a H. Saito y K. Miura, Biochem. Biophys. Acta, 72, 619 (1963), Text for Bioengineering Experiments, editado por la Society for Bioscience and Bioengineering, Japón, págs. 97-98, Baifukan, 1992) o similares.

El gen sfcA o b2643 preparado como se describió anteriormente, o una parte del mismo, puede utilizarse para la rotura génica. El gen utilizado para la rotura génica es suficiente si presenta un grado de homología que permita la recombinación homologa con el gen sfcA o b2463 en el cromosoma de la bacteria Escherichia. Por consiguiente, puede utilizarse dicho gen homólogo. El grado de homología que permitiría la recombinación homóloga es preferentemente del 70% o más, más preferentemente del 80% o más, todavía más preferentemente del 90% o más y particularmente preferentemente del 95% o más. Asimismo, la recombinación homóloga puede producirse si se utiliza un ADN que es hibridable con el gen en condiciones severas. Las "condiciones severas" son condiciones bajo las que se forma un híbrido específico, y no se forma un híbrido no específico. Por ejemplo, las condiciones severas están ejemplificadas lavando una vez, preferentemente dos o tres veces a una composición salina correspondiente a 1\times SSC, SDS al 0,1%, preferentemente 0,1\times SSC, SDS al 0,1%, a 60ºC.

El gen sfcA o el b2463 puede destruirse, por ejemplo, preparando, a partir del gen como se describió anteriormente, un gen sfcA o b2463 de tipo eliminación en el que se elimina una secuencia parcial de modo que no se produce la enzima málica que funciona normalmente. Este gen de tipo eliminación, o un ADN que incluye el gen, puede transformarse entonces en una bacteria Escherichia, y producirse la recombinación entre el gen de tipo eliminación y el gen en el cromosoma. La rotura del gen mediante la subestación génica que utiliza recombinación homóloga ha sido ya creada y se ejemplifica utilizando un ADN lineal representado por el método desarrollado por Datsenko K. A., y Wanner B. L. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97, 6640-6645) denominado también "integración dirigida por el rojo" y un procedimiento que utiliza un plásmido que alberga un origen de replicación sensible a la temperatura (patente US nº 6.303.383 y solicitud de patente japonesa abierta al público nº 5-7491). La rotura génica por la subestación génica que utiliza recombinación homóloga puede realizarse también utilizando un plásmido que no tiene capacidad de replicación en un hospedador.

Además, puede utilizarse un procedimiento basado en una combinación del procedimiento denominado "integración dirigida por el rojo" y un sistema de escisión procedente del fago lambda (J. Bacteriol. sep. de 2002; 184(18): 5200-3). Pueden utilizarse interacciones entre la integrasa y la escisionasa en el complejo de nucleoproteína escindida del fago lambda (Cho EH, Gumport RI, Gardner JF) como procedimiento para disgregar un gen en un cromo-
soma.

Según el procedimiento de integración dirigido por el rojo, puede construirse una cepa disgregadora del gen en una etapa utilizando un producto de PCR, que se obtiene utilizando oligonucleótidos sintéticos como cebadores que se diseñan para que comprenda parte de un gen dirigido a su terminal 5', y parte de un gen con resistencia antibiótica en su terminal 3'. Además, puede eliminarse el gen con resistencia al antibiótico integrada introduciendo attL y attR, que son puntos de acoplamiento del fago lambda y el producto de PCR y combinando el sistema de escisión procedente del fago lambda con el procedimiento de integración dirigido por el rojo.

Específicamente, puede obtenerse una cepa en la que se realiza la rotura del gen dirigido y se elimina el gen con resistencia al antibiótico por el procedimiento siguiente.

Se prepara inicialmente un casete de ADN lineal que comprende un gen con resistencia al antibiótico, puntos de acoplamiento del fago lambda y un gen diana. Este se prepara normalmente por PCR utilizando una plantilla preparada de manera adecuada.

Como plantilla del casete del ADN lineal se utiliza una plantilla en la que attL y attR (SEC. ID. nº: 9 (nº de registro M12458 en el GenBank y SEC. ID. nº: 10 (nº de registro M12459 en el GenBank)) que son puntos de acoplamiento del fago lambda, se insertan en las terminales respectivas de un gen con resistencia a antibióticos. La plantilla puede ser un plásmido, un gen insertado en un cromosoma o un oligonucleótido sintético. Mientras que el gen con resistencia al antibiótico es preferentemente un gen con resistencia al cloranfenicol, un gen con resistencia a la estreptomicina o un gen con resistencia a la ampicilina, cualquier gen con resistencia a antibióticos puede utilizarse con la condición de que el gen funcione como gen con resistencia a antibióticos en la bacteria Escherichia y sea diferente de un gen marcador que puede estar contenido en dos plásmidos cooperadores como se describe a continuación Para confirmar fácilmente la adquisición de la resistencia a antibióticos, el gen con resistencia a antibióticos que se emplea puede ser aquel con el que la cantidad de expresión aumenta sustituyendo una secuencia promotora y similares, o aquel en el que se introduce una mutación en su secuencia génica estructural de modo que se aumenta la actividad enzimática. El casete del ADN lineal se prepara en el orden siguiente a partir del terminal 5':

(secuencia en 5' del gen dirigido)-(attL)-(gen con resistencia a antibiótico)-(attR)-(secuencia 3' del gen dirigido).

El casete de ADN lineal está integrado en el cromosoma. Como plásmido cooperador para integrar el casete del ADN lineal en los cromosomas, puede utilizarse pKD46 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97, 6640-6645). pKD46 presenta replicación sensible a la temperatura y resistencia a la ampicilina e incluye un fragmento de ADN de 2.154 nt del fago lambda (nº de registro en GenBank/EMBL J02459, 31088-33241), que contiene los genes (genes \gamma, \beta y exo) que codifican la recombinasa roja del sistema de recombinación homólogo \lambda rojo y que está bajo el control del promotor P_{araB} inducible por arabinosa.

El pKD46 puede introducirse en un hospedador por electroporación. La cepa ampliada con pKD46 se cultiva con arbinosa. El casete del ADN lineal se introduce en la fase de crecimiento logarítmico y se incuba a alta temperatura para obtener una cepa disgregada por el gen que es resistente a un antibiótico mediante el gen con resistencia al antibiótico en la casete del ADN lineal. La confirmación de la rotura del gen puede realizarse por PCR o medición de la concentración de L-lisina o L-treonina producida por la cepa.

A continuación se introduce un plásmido cooperador para escindir el gen con resistencia al antibiótico. El plásmido cooperador alberga un gen que codifica la integrasa (Int) (SEC. ID. nº: 13, nº de registro en el GenBank J02459. B [gi:215104]) y un gen que codifica la excisionasa (Xis) (SEC. ID. nº: 15, nº de registro J02459 en el GenBank [gi:215104]) del fago lambda y presenta replicación sensible a la temperatura. Mediante la introducción del plásmido cooperador, se produce la recombinación debido al reconocimiento de attL (SEC. ID. nº: 11) y attR (SEC. ID. nº: 12) en el cromosoma. El gen con resistencia al antibiótico entre attL y attR se escinde y como resultado, permanece en el cromosoma una estructura que contiene solamente la secuencia attL o attR. Incubando a alta temperatura, se pierde el plásmido cooperador. De este modo puede obtenerse una cepa en la que se realiza la rotura del gen dirigido y se elimina el gen antibiótico.

Además de los procedimientos de ingeniería genética, el procedimiento para modificar la bacteria de modo que una enzima málica no funcione normalmente puede ejemplificarse mediante un procedimiento de tratamiento de una bacteria Escherichia con irradiación UV o un agente mutágeno utilizado normalmente para la mutagénesis, tal como N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina y ácido nítrico, seguido de selección de la bacteria con actividad atenuada de la enzima málica.

La presente invención se ha conseguido basándose en la información del flujo metabólico. Esta información se calculó mediante el procedimiento siguiente para la determinación del flujo metabólico que afecta la producción de la sustancia que utilizan las células. Sin embargo, la presente invención no se limita al procedimiento para obtener dicha información, esto es, al procedimiento de determinación.

El procedimiento para determinar una producción de la sustancia que afecta al flujo metabólico, incluye las etapas siguientes:

1) crear una matriz estequiométrica basada en las fórmulas de las reacciones bioquímicas de un sustrato mediante una sustancia deseada,

2) seleccionar el mismo número de flujos metabólicos independientes a partir de todos los flujos metabólicos como grado de libertad de la matriz estequiométrica como flujos libres,

3) crear un número suficiente de combinaciones aleatorias de los flujos libres para un análisis estadístico y calcular una distribución de flujo metabólico en cada combinación creada basándose en la matriz estequiométrica,

4) obtener una ecuación de regresión, que incluye un número mínimo de flujos libres que presenta una correlación con producción de sustancia a partir de las distribuciones del flujo metabólico calculadas mediante un análisis estadístico multivariante, y

5) determinar por lo menos un flujo metabólico que afecta la producción de la sustancia basándose en un coeficiente en la ecuación de regresión obtenida.

El flujo metabólico utilizado en la presente invención se expresa como velocidad de reacción metabólica (flujo) procedente de un modelo estequiométrico de reacciones bioquímicas intracelulares y la ley de acción de masas entre metabolitos; en tanto que, la distribución de flujo metabólico utilizada en la presente memoria está constituida por todos los flujos metabólicos en los que cada flujo metabólico se asigna a cada reacción bioquímica.

En la primera etapa del procedimiento de determinación, se crea una matriz estequiométrica basada en las fórmulas de reacción bioquímicas de un sustrato mediante un producto de la sustancia deseada.

Las reacciones bioquímicas se refieren a un procedimiento en el que los metabolitos intracelulares son convertidos por reacciones enzimáticas en la célula y que han sido recopilados en varias bases de datos según el tipo de organismo. Por ejemplo, puede accederse a la Kyoto Enciclopedia of Genes and Genomes (KEGG, www.genome.ad.jp/kegg/) para referencia.

El sustrato es una sustancia utilizada normalmente por la célula como fuente de carbono, y ejemplos de la misma incluyen la glucosa, sacarosa, fructosa y así sucesivamente.

El producto de la sustancia incluye no solamente un solo tipo de metabolito, sino también un agregado de metabolitos, tal como biomasa (cuerpo celular). La producción de la sustancia se evalúa normalmente como una velocidad de producción de una sustancia. En particular, cuando la sustancia deseada es una biomasa, se evalúa como rendimiento en biomasa. El rendimiento en biomasa representa la eficacia de la conversión en sustratos tales como glucosa en los componentes de la célula tal como proteína, carbohidrato, ácido nucleico o lípido.

La matriz estequiométrica es una matriz utilizada normalmente en un análisis de flujo metabólico, y puede crearse listando las fórmulas de reacciones bioquímicas de un sustrato mediante una sustancia del producto deseado por procedimientos típicos utilizados en un análisis de flujo metabólico. Dichos procedimientos, suponiendo un estado casi estacionario de un producto intermedio metabólico intracelular, son conocidos generalmente (Savinell, J.M. y Palsson, B.O.J., Theor. Biol., 154:421-454, 1992; Vallino, J.J. y Stephanopoulos, G., Biotechnol. Bioeng., 41:633-646, 1993). Cuando se listan fórmulas de reacción, las series de reacciones pueden simplificarse suponiendo una serie de reacciones sin ramificación como una reacción, o suponiendo metabolitos convertidos mediante una reacción a una velocidad metabólica elevada antes y después de la reacción como un metabolito y así sucesivamente. Cuando el producto de la sustancia es la biomasa, puede describirse una matriz estequiométrica listando las reacciones bioquímicas que conducen a componentes celulares.

En la segunda etapa del procedimiento de determinación, se seleccionan como flujos libres el mismo número de flujos metabólicos independientes que el grado de libertad de la matriz estequiométrica mencionada anteriormente, a partir de todos los flujos metabólicos.

Los flujos independientes son una serie de flujos que deberían especificarse para definir el flujo únicamente en el sistema de red de metabolismo definido por una ecuación estequiométrica.

El procedimiento para ajustar los flujos libres no está limitado específicamente a condición de que pueda seleccionarse el mismo número de flujos metabólicos independientes que el grado de libertad del sistema que debe analizarse. Aunque puede confirmarse la independencia de los flujos seleccionados de manera arbitraria, puede utilizarse también la matriz SIMS (matriz metabólica-estequiométrica interna en estado estacionario) propuesta por Reder (Reder, C.J., Theor. Biol., 135:175-201, 1988). En este procedimiento, se determinan grupos específicos de flujos metabólicos en el mismo número que el grado de libertad de la matriz estequiométrica mencionada anteriormente entre los grupos de flujo metabólico determinados basándose en las fórmulas de reacción bioquímica mencionadas anteriormente, y se selecciona un flujo metabólico como flujo libre a partir de cada grupo de flujo metabólico determinado. La determinación de los grupos específicos entre los grupos de flujo asegura que cualquier flujo en un grupo puede cambiarse sin afectar el flujo en demás grupos. Por consiguiente, es posible seleccionar un flujo de cada grupo como flujo libre independiente. Cuando se selecciona un flujo libre a partir de un grupo de flujos, un grupo próximo al punto de ramificación se selecciona preferentemente.

En la tercera etapa del procedimiento de determinación, se crean las combinaciones de flujos libres en número suficiente para un análisis estadístico, y se calcula la distribución de flujo metabólico de cada combinación creada basándose en la matriz estequiométrica mencionada anteriormente.

Pueden crearse combinaciones aleatorias de los flujos libres dando valores aleatorios a los flujos libres seleccionados en la etapa previa para crear una serie de datos de combinaciones de diferentes distribuciones de flujo. El procedimiento para dar valores aleatorios a los flujos libres no se limita específicamente a condición de que se seleccione un procedimiento que genera combinaciones de flujos libres dentro de un límite específico. Dicho límite específico se fija para dar valores biológicamente viables en los últimos cálculos. Si el número de flujos libres es el mismo que el grado de libertad de la matriz estequiométrica especificada, puede resolverse una distribución de flujo metabólico única. Para la solución, una operación de la matriz que utiliza una matriz inversa se ejecuta normalmente, y todos los flujos se normalizan preferentemente, por ejemplo, en determinadas cantidades de sustrato. Cuando el sustrato es la glucosa, pueden representarse todos los valores del flujo, por ejemplo, con valores de 10 mmoles de absorción de glucosa. Las soluciones de distribuciones de flujo metabólico obtenidas a partir de los valores de flujo libre aleatorios como se ha descrito anteriormente deben ser biológicamente significativas. Es decir, todos los flujos de reacciones no reversibles deben ser 0 o más, y los flujos que forman biomasa deben ser 0 o más. Para obtener combinaciones de flujos libres más deseables, pueden añadirse también las condiciones basadas en el conocimiento teórico y/o empírico en la producción de la sustancia que utilizan las células. El número de combinaciones que debe crearse, es decir, el número de distribuciones de flujo biológicamente significativas que se ha de calcular, no está específicamente limitado siempre que sea suficiente para un análisis estadístico. Normalmente se utilizan tres de cada cinco valores para cada flujo libre. Por consiguiente, cuando hay n flujos libres, existen aproximadamente la potencia enésima del número de los valores para un flujo libre de combinaciones. Por ejemplo, cuando se utilizan tres valores para un flujo libre, existen 3 a la enésima potencia (3^{n}) de combinaciones. Es decir, pueden utilizarse aproximadamente 2.200 combinaciones para siete flujos libres (n=7). Alternativamente, ya que el número de valores para cada flujo libre en la serie de datos de distribuciones de flujo biológicamente significativas puede cambiar dependiendo de los flujos libres seleccionados o de las condiciones adicionales, el número de combinaciones que puede utilizarse es aproximadamente 3 a aproximadamente a la enésima potencia (3^{n}), o a aproximadamente 5 a aproximadamente la enésima potencia (5^{n}) en total para n de flujos libres. Para obtener soluciones de distribuciones de flujo biológicamente significativas en dicho número, es típico partir de combinaciones de flujos libres aleatorios utilizando de 6 a 10 valores por cada flujo libre, es decir, combinaciones de flujos libres de seis a la enésima potencia (6^{n}) o 10 a la enésima potencia (10^{n}).

En la cuarta etapa del procedimiento de determinación, a partir de las distribuciones de flujo metabólico (serie de datos de distribuciones de flujo metabólico) se obtiene una ecuación de regresión que incluye un número mínimo de flujos libres que presenta una correlación con producción de sustancia mediante un análisis estadístico multivariable.

Al realizar un análisis estadístico multivariable para la serie de datos de distribuciones de flujo calculado a partir de las combinaciones aleatorias de los flujos obtenidos en la etapa previa, puede obtenerse una ecuación de regresión que incluye un número mínimo de flujos libres que presenta una correlación con producción de sustancia. El análisis estadístico multivariable (incluyendo el análisis por regresión no lineal multivariable y el análisis por regresión lineal multivariable) puede realizarse utilizando cualquier técnica siempre que se seleccione una técnica que pueda examinar las correlaciones de combinaciones de flujo libre con producción de sustancia. Sin embargo, se describe un procedimiento, por ejemplo, en Kachigan, S.K., capítulo 4, Regression Analysis in Multivariate Statistical Analysis 2ª ed., Radius Press, New York, págs. 160-193.

La expresión "presenta una correlación con producción de sustancia" significa que el coeficiente de terminación es significativamente grande, y "que es significativamente grande" significa normalmente que el coeficiente de terminación R^{2} es 0,8 o superior, preferentemente 0,9 o superior.

Puede obtenerse una ecuación de regresión, que incluye un número mínimo de flujos libres (términos) que presenta una correlación con producción de sustancia, cambiando sucesivamente el número de términos para obtener una ecuación de regresión. Dicha ecuación que presenta el coeficiente mayor de determinación, incluyendo cada número de términos, y permite seleccionar una ecuación de regresión que incluye un número mínimo de términos que presenta un coeficiente significativamente grande de determinación. Alternativamente, puede obtenerse una ecuación de regresión con los términos totales excepto para un término para examinar el grado de disminución del coeficiente de determinación debido a la exclusión del término. El mismo procedimiento puede repetirse con los términos excepto para el término que presenta disminución en un grado pequeño del coeficiente de determinación, como términos totales; y cuando una ecuación de regresion que presenta una correlación con producción de sustancia ya no puede obtenerse, puede seleccionarse la ecuación de regresión obtenida inmediatamente antes de ésta.

Aunque estos procedimientos matemáticos pueden programarse individualmente, pueden ejecutarse fácilmente utilizando programas informáticos matemáticos disponibles en el mercado tales como MatLab® (denominación comercial, MathWorks) y Matemática® (denominación comercial, Wolfram Research).

En la quinta etapa del procedimiento de determinación, se determina un flujo metabólico que afecta la producción de sustancia basándose en los coeficientes en la ecuación de regresión obtenida.

Pueden determinarse las contribuciones de los flujos libres a la producción de sustancia que utiliza células tales como microorganismos, en particular, el rendimiento de biomasa o el rendimiento de sustancia producto, que son importantes en la producción de sustancia, utilizando la ecuación de regresión obtenida en la etapa anterior. Es decir, pueden determinarse los flujos libres que aparecen en la ecuación de regresión ya que estos afectan a la producción de sustancia. Además, como los coeficientes en la ecuación de regresión representan la magnitud de contribución, los flujos libres que tienen un coeficiente sustancialmente grande (cuando se normalizan los flujos, los flujos libres que tienen un gran valor absoluto de coeficiente relativo) pueden determinarse como flujos metabólicos que afectan en gran medida a la producción de sustancia.

El procedimiento de determinación de la presente invención puede proporcionar información que es importante para mejorar las cepas bacterianas, es decir, qué flujo libre influye en gran medida en la producción de una sustancia diana, y si un flujo libre tiene efecto positivo o negativo sobre la producción de una sustancia diana. Un flujo que necesita ser cambiado para afectar de manera favorable al rendimiento y productividad de un producto diana también puede preverse.

Por ejemplo, como se muestra en los ejemplos descritos en la presente memoria, cabe esperar que las cepas bacterianas con capacidad mejorada para producir lisina puedan crearse aumentando la actividad de la fosfoenolpiruvato-carboxilasa en la producción de lisina utilizando Escherichia coli. La publicación internacional nº WO 01/53459 da a conocer un ejemplo de mejora de la producción de lisina aumentando la actividad de la fosfoenolpiruvato-carboxilasa. Por consiguiente, se ha comprobado que puede crearse una cepa bacteriana con capacidad de producción de sustancia basándose en el procedimiento de determinación.

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<3> Procedimiento de producción para producir L-lisina o L-treonina

El procedimiento de la presente invención es un procedimiento para producir L-lisina o L-treonina, cuyo procedimiento comprende las etapas de cultivar la bacteria con capacidad para producir L-lisina o L-treonina en un medio, para dar lugar a la acumulación de L-lisina o L-treonina en el medio o las células de la bacteria y para recoger L-lisina o L-treonina del medio o de las células.

El medio de cultivo utilizado en la presente invención puede ser un medio utilizado por lo general para la producción de fermentación de L-lisina o L-treonina utilizando un microorganismo. Si es necesario puede utilizarse un medio corriente que incluye una fuente de carbono, una fuente de carbono, iones inorgánicos y otros componentes orgánicos. Como fuente de carbono, pueden utilizarse varios sacáridos tales como glucosa, sacarosa, lactosa, galactosa, fructosa e hidrolizado de almidón, varios alcoholes tales como glicerol y sorbitol y varios ácidos orgánicos tal como ácido fumárico, ácido cítrico y ácido succínico. Como fuente de nitrógeno pueden utilizarse varias sales de amonio inorgánicas tales como sulfato amónico, cloruro amónico y fosfato amónico, nitrógeno orgánico tales como hidrolizado de soja, gas amoniaco y amoniaco acuoso y similares. Como nutriente orgánico en trazas, es deseable añadir sustancias requeridas tales como vitamina B_{1}, homoserina o extracto de levadura y similares. Además, debe añadirse una cantidad en trazas de fosfato potásico, sulfato magnésico, ión hierro, ión manganeso. El medio utilizado para el cultivo puede ser un medio sintético o un medio natural, con la condición de que el medio incluya una fuente de carbono y una fuente de nitrógeno e iones inorgánicos y, si es necesario, nutrientes orgánicos en trazas.

El cultivo se realiza preferentemente en condiciones aeróbicas durante uno a siete días a una temperatura entre 24º a 37ºC y a un pH entre 5 y 9. El pH del cultivo puede ajustarse con un ácido inorgánico u orgánico o una sustancia alcalina, por ejemplo, gas amoniaco y similares. La recogida de L-lisina o L-treonina del medio de cultivo puede realizarse por los procedimientos habituales, tales como el procedimiento de resina de intercambio iónico, precipitación y otros procedimientos conocidos, y combinaciones de los mismos. Cuando la L-lisina o la L-treonina se acumula en las células, la L-lisina o la L-treonina puede recogerse por el procedimiento de resina de intercambio iónico o similar a partir de un sobrenadante obtenido descomponiendo las células por ultrasonidos o similares y eliminando los residuos celulares por centrifugación.

Ejemplos

La presente invención se describe con mayor detalle haciendo referencia a los ejemplos.

Ejemplo 1 Determinación del flujo metabólico con respecto a la L-lisina (1) Creación de la matriz estequiométrica

Se construyó una ecuación estequiométrica para calcular un flujo metabólico suponiendo un estado casi estacionario de intermedios metabólicos intracelulares (Savinell, J.M. y Palsson, B.O.J., Theor. Biol., 154:421-454, 1992; Vallino, J.J. y Stephanopoulos, G., Biotechnol. Bioeng., 41:633-646, 1993). Las fórmulas de reacción incluidas en este modelo se presentan en la Tabla 2. Las descripciones de las abreviaturas utilizadas en la presente invención se relacionan en la Tabla 1. Se consolidaron algunas reacciones sin ramificación para simplificar las fórmulas. Dado que la serie de reacciones del fosfato de pentosa son complicadas, se representaron mediante dos fórmulas. Se utilizaron los datos publicados para la relación del componente de la biomasa (Neidhardt, F.C. et al., Physiology of the Bacterial Cell., Sinauer Associates, Massachussets, 1990) y se representó la biomasa utilizando la fórmula de reacción [68]. El grado de libertad de la matriz estequiométrica en este modelo fue 7.

TABLA 1

1

TABLA 1 (continuación)

2

TABLA 2 Lista de fórmulas de reacción utilizadas. Las reacciones reversibles están marcadas con r

4

TABLA 2 (continuación)

5

TABLA 2 (continuación)

6

(2) Selección de flujos libres y creación de sus combinaciones aleatorias

Se determinaron grupos de flujo específico según el procedimiento de Reder (Reder, C.J., Theor. Biol., 135:175-201, 1988). De cada grupo se seleccionó un flujo próximo a un punto de ramificación. En la Tabla 3 se presentan siete flujos libres seleccionados. Una única solución para un balance de flujo puede obtenerse especificando estos 7 flujos.

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TABLA 3 Lista de flujos libres para obtener la distribución de flujo aleatoria

7

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De las aproximadamente 300.000 combinaciones de valores para 7 flujos libres aleatorios, las que infringen alguna limitación que concierne a la reactividad inversa y las que presentan valores tanto para la lisina como para la biomasa que no exceden los niveles umbral fijadas en el 20% de cada valor máximo se excluyeron. Como resultado, se creó una serie de datos de 5.000 distribuciones de flujo metabólico en una zona específica biológicamente significativa. Los resultados se representaron por valores basados en la absorción de 10 mmoles de glucosa, y se creó una matriz con 5.000 filas correspondiente a las distribuciones de flujo aleatorias y 68 columnas cada una de las cuales corresponde a un flujo de reacción.

(3) Análisis de correlación mediante análisis multivariable y determinación de flujos metabólicos que afectan a la producción de sustancia

Se realizó la regresión lineal multivariable de una matriz condensada que incluye puntuaciones de Z de sólo las columnas que corresponden a 7 flujos libres. Se utilizó la función de regresión paso a paso de la caja de herramientas estadística MatLab para la regresión lineal multivariable. Mediante esta técnica, puede derivarse la producción de biomasa o de lisina con una función lineal de 7 flujos libres. La identificación de estos 7 flujos produce una única definición del estado del sistema. Por consiguiente, si los 7 términos se utilizan como parámetros, el coeficiente de correlación es 1, lo que indica un ajuste completo. Sin embargo, normalmente es posible obtener un ajuste relativamente favorable con un número menor de términos que en la ecuación. Para probar varias combinaciones de términos, una ecuación que presenta el mejor ajuste para cada número de términos contenidos se seleccionó utilizando la función paso a paso del programa MatLab. Como para el rendimiento de biomasa, un ajuste de R^{2} = 0,980 se obtuvo solamente con 4 términos, isocitrato liasa (ICL), enzima málica (MEZ), PEP carboxilasa (PEPC) y ATPasa. Cuando el número de términos está más disminuido, el valor R^{2} disminuye notablemente y no podía obtenerse cualquier ajuste razonable. Cuando los flujos de reacción están normalizados a un valor por 10 mmoles de glucosa y se utilizan como entrada, se representó una ecuación precisa de la manera siguiente:

Ecuación 1)

\quad

Rendimiento de biomasa = 1,552 - 0,194 (ICL) + 0,184 (MEZ) - 0,194 (PEPC) - 0,011 (ATPasa)

El rendimiento en lisina pudo ajustarse con un modelo que incluye los mismos 4 parámetros y se obtuvo el resultado de R^{2} = 0,997. Además, aun cuando el término para la ATPasa se excluyo, R^{2} disminuía solamente hasta 0,856, y el ajuste fue todavía favorable. Por consiguiente, se utilizaron los 3 parámetros siguientes para el modelo de lisina.

Ecuación 2)

\quad

Rendimiento de lisina = -1,694 + 1,176 (ICL) - 1,095 (MEZ) + 1,162 (PEPC)

Por último, el rendimiento en carbono total (átomos de C) definido por el número total de átomos de carbono que se dirigen a biomasa y lisina no pudo fijarse con R^{2} = 0,956 utilizando solamente el término para la ATPasa con la siguiente ecuación:

Ecuación 3)

\quad

átomos de C = 34,3 - 0,314 (ATPasa)

Estos resultados pusieron de manifiesto que el rendimiento de biomasa se correlacionó de forma positiva con el flujo de la enzima málica y esta producción de lisina se correlacionó positivamente con los flujos de PEP carboxilasa e isocitrato de liasa (ciclo del glioxilato). La utilidad de este análisis de regresión puede presentarse en las Figs. 1 y 2. Cuando los flujos de isocitrato-liasa y de enzima málica se consideran por separado, no se observa ninguna correlación con la producción de lisina como se muestra en la Fig. 1, (a) y (b). Sin embargo, cuando estos flujos se consideran como parte de la ecuación de regresión 2), puede observarse una correlación como la representada en la Fig. 2 y se aclara el efecto. De este modo, una relación invisible entre los flujos metabólicos puede ponerse de manifiesto con esta técnica. El rendimiento de un producto diana puede mejorarse aumentando una actividad responsable de un flujo que presenta una correlación positiva y atenuando una actividad responsable de un flujo que presenta una correlación negativa. Es decir, a partir de este resultado, pudo obtenerse una directriz para mejorar las cepas bacterianas y la mejora de la actividad o atenuación de la PEP carboxilasa o de la isocitrato-liasa de la actividad de la enzima málica que presenta una correlación negativa es eficaz para la producción de lisina. De hecho, un ejemplo de creación de una cepa bacteriana que presenta una capacidad de producción de lisina mejorada mejorando la actividad de la PEP carboxilasa en la producción de lisina que utiliza Escherichia coli se dio a conocer en la Publicación Internacional nº WO 01/53459, y de este modo se ha dado soporte a la utilidad de la presente invención.

Ejemplo 2 Determinación del flujo metabólico con respecto a L-treonina

Por el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1, se seleccionó una ecuación que presenta el mejor ajuste para cada número de términos contenido con respecto a L-treonina. Como para el rendimiento en biomasa, un ajuste de R^{2} = 0,896 se obtuvo con sólo 4 términos, isocitrato liasa (ICL), enzima málica (MEZ), PEP carboxilasa (PEPC) y ATPasa.

Ecuación 4)

\quad

Rendimiento en biomasa = 1,260 - 0,101 (ICL) + 0,093 (MEZ) - 0,101 (PEPC) - 0,009 (ATPasa)

El rendimiento en treonina pudo ajustarse con un modelo que incluye los mismos 3 parámetros y se obtuvo el resultado de R^{2} = 0,937.

Ecuación 5)

\quad

Rendimiento en treonina = -1,432 + 1,090 (ICL) - 1,080 (MEZ) + 1,087 (PEPC)

Estos resultados pusieron de manifiesto que el rendimiento en biomasa se correlacionó positivamente con el flujo de enzima málica, y esta producción de treonina se correlacionó positivamente con los flujos de PEP carboxilasa e isocitrato-liasa (ciclo del glioxilato). Por consiguiente, con respecto a la producción de treonina, pudo obtenerse también una directriz para mejorar las cepas bacterianas, y la mejora de la actividad de la PEP carboxilasa o de la isocitrato liasa o la atenuación de la actividad de la enzima málica que presenta una correlación negativa es eficaz para la producción de lisina.

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Ejemplo 3 Construcción de la bacteria productora de L-lisina que carece de enzima málica

Se utilizó la cepa WC196 como cepa productora de L-lisina de Escherichia coli que es resistente a AEC (S-(2-aminoetil)cisteína) (Publicación Internacional nº WO 96/17930).

La enzima málica de Escherichia coli incluye una que utiliza NAD como coenzima (EC 1.1.1.38) y la que utiliza NADP como coenzima (EC 1.1.1.40). Estas enzimas están codificadas por los genes sfcA y b2463, respectivamente.

Los genes sfcA y b2463 se eliminan mediante una combinación del procedimiento de "integración conducida por el rojo", que fue desarrollada originalmente por Datsenko y Wanner (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97, 6640-6645), y el procedimiento del sistema de escisión, derivado del fago lambda (J. Bacteriol. sep. de 2002; 184(18): 5200-3. Según el procedimiento de integración dirigido por el rojo, una cepa con el gen destruido puede construirse en una etapa utilizando el producto de PCR obtenido utilizando los cebadores oligonucleotídicos sintéticos diseñados para que comprendan una parte de un gen dirigido a su terminal 5' y una parte de un gen con resistencia a antibióticos en su terminal 3'. Además, el gen con resistencia a antibióticos puede eliminarse combinando además el sistema de escisión procedente del fago lambda con el procedimiento de integración dirigido por el rojo.

(1) Rotura del gen sfcA

Como plantilla de PCR, se utilizó el plásmido pMW118-attL-Cm-attR (su preparación se describe a continuación). El pMW118-attL-Cm-attR es un plásmido obtenido insertando los genes attL y attR que son los puntos de acoplamiento del fago lambda y un gen cat que es el gen con resistencia a antibióticos para pMW118 (TaKaRa Bio). Los genes se insertan en el orden de attL-cat-attR. La secuencia attL se muestra en la SEC. ID. nº: 11 y la secuencia attR se presenta en la SEC. ID. nº: 12.

La PCR se realizó utilizando cebadores representados en las SEC. ID. nº: 1 y nº: 2 y con las secuencias correspondientes a sus extremos del terminal 3' de attL y attR y las secuencias correspondientes a las partes del gen sfcA y su terminal 5', respectivamente.

Se purificó el producto de PCR ampliado en un gel de agarosa y se introdujo en WC196 de Escherichia coli que contiene el plásmido pKD46 que presenta la replicación sensible a la temperatura, por electroporación. El pKD46 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 6640-6645) incluye un fragmento de ADN de 2.154 nt del fago lambda (nº de registro J02459, 31088-33241 de GenBank/EMBL) que contiene los genes (genes \gamma, \beta y exo) que codifican la recombinasa roja del sistema de recombinación homólogo \lambda-rojo bajo el control del promotor P_{araB} inducible por la arabinosa. El pKD46 es necesario para integrar el producto de PCR en el cromosoma de la cepa WC196.

Se prepararon células competentes para la electroporación de la manera siguiente. La WC196 de Escherichia coli se cultivó durante la noche a 30ºC en medio LB que contiene 100 mg/l de ampicilina, se diluyó 100 veces con 5 ml de medio SOB (Sambrook, J. et al., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) que contiene ampicilina (50 mg/l) y L-arabinosa (1 mM). El producto diluido se cultivó a 30ºC con aireación hasta que la OD_{600} fue aproximadamente 0,6 y a continuación se concentró 100 veces. Se lavaron las células tres veces con 10% de glicerol para preparar células listas para la electroporación. La electroporación se realizó con 70 \mul de células competentes y aproximadamente 100 ng del producto de PCR. Se añadió 1 ml de medio SOC (Sambrook, J. et al., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) a las células sometidas a electroporación. Se cultivaron las células a 37ºC durante 2,5 horas y a continuación se cultivaron en placa en medio L-agar-agar que contenía 25 mg/l de Cm (cloranfenicol) a 37ºC para seleccionar un recombinante resistente a Cm. A continuación, para perder el plásmido pKD46, se subcultivaron las células dos veces a 42ºC en medio L-agar-agar que contenía Cm. En las colonias obtenidas se probó la resistencia a la ampicilina. Se obtiene una cepa sensible a la ampicilina con pKD46.

La deleción del gen sfcA del mutante identificado por el gen con resistencia al cloranfenicol fue confirmada por PCR. La cepa con sfcA insuficiente se denominó WC196\DeltasfcA::att-cat.

\newpage

Para eliminar el gen att-cat que se había integrado en el gen sfcA, se utilizó el plásmido cooperador pMW-intxis-ts (su preparación se describe a continuación). El pMW-intxis-ts alberga un gen que codifica la integrasa (Int) (SEC. ID. nº: 13) y un gen que codifica la excisionasa (Xis) (SEC. ID. nº: 15) del fago lambda y presenta replicación sensible a la temperatura. Mediante la introducción del pMW-intxis-ts, se produce la recombinación debido al reconocimiento de attL (SEC. ID. nº: 11) y attR (SEC. ID. nº: 12) en el cromosoma, y se escinde el gen con resistencia a antibióticos entre attL y attR, dando como resultado una estructura mediante la cual solamente la secuencia de attL o attR permanece en el cromosoma.

Las células competentes de la cepa WC196\DeltasfcA::att-cat se prepararon según el procedimiento habitual, se transformaron con el plásmido cooperador pMW-intxis-ts y se cultivaron en placa a 30ºC en un medio de L-agar-agar que contenía 50 ml/l de ampicilina para seleccionar una cepa resistente a la ampicilina.

Para perder el plásmido pMW-intxis-ts, se subcultivaron las células dos veces a 42ºC en medio de L-agar-agar. En las colonias obtenidas se probó la resistencia a la ampicilina y la resistencia al cloranfenicol. Se obtuvo una cepa con resistencia a la ampicilina y al cloranfenicol sin att-cat ni pMW-intxis-ts. Esta cepa se denominó WC196\DeltasfcA.

(2) Descomposición del gen b2463

Se realizó la eliminación del gen b2463 en cepas WC196 y WC196\DeltasfcA según el procedimiento de (1) excepto los cebadores de las SEC. ID. nº: 3 y nº: 4 se utilizaron como cebadores para disgregar b2463. De este modo, se obtuvieron las cepas WC196\Deltab2463 y WC196\DeltasfcA\Deltab2463. La cepa obtenida WC196\DeltasfcA\Deltab2463 se denominó WC196\Deltamez.

(3) Preparación de la plantilla de PCR y del plásmido cooperador

La plantilla pMW118-attL-Cm-attR de PCR y el plásmido cooperador pMW-intxis-ts se prepararon de la manera siguiente:

(3-1) pMW118-attL-Cm-attR

Para la construcción del plásmido pMW118-attL-Cm-attR se utilizó el pMW118-attL-Tc-attR para empezar. Se ligaron cuatro fragmentos de ADN:

1)

BglII-EcoRI - se obtuvo el fragmento de ADN (120 bp) (SEC. ID. nº: 11) que lleva attL que se obtuvo por ampliación de PCR de la correspondiente secuencia de cromosoma W3350 de E. coli (que contenía el profago \lambda) utilizando los oligonucleótidos P1 y P2 (SEC. ID. nº: 17 y nº: 18) como cebadores (estos cebadores contenían las zonas de reconocimiento subsidiario para las endonucleasas BglII y EcoRI);

2)

PstI-HindII - el fragmento de ADN (182 bp) que lleva attR (SEC. ID. nº: 12) que se obtuvo por ampliación por PCR de la correspondiente secuencia del cromosoma W3350 (que contenía el profago \lambda) utilizando los oligonucleótidos P3 y P4 (SEC. ID. nº: 19 y nº: 20) como cebadores (estos cebadores contenían los puntos de reconocimiento subsidiarios para las endonucleasas PstI y HindIII);

3)

el fragmento BglII-HindIII grande (3916 bp) de pMW188-ter_rrnB. Se obtuvo pMW118-ter_rrnB por ligadura de tres fragmentos de ADN:

\bullet

\vtcortauna el fragmento grande (2359 bp) que lleva el fragmento AatII-EcoRIpol del pMW118, el pMW118 se digirió con la endonucleasa de restricción EcoRI, se trató con el fragmento de Klenow de la ADN polimerasa I y a continuación se digirió con la endonucleasa de restricción AatII;

\bullet

\vtcortauna el fragmento AatII-BglII pequeño (1194 bp) de pUC19 que lleva el gen bla para resistencia a la ampicilina (Ap^{R}) se obtuvo por ampliación por PCR de la secuencia correspondiente del plásmido pUC19 que utiliza los oligonucleótidos P5 y P6 (SEC. ID. nº: 21 y nº: 22) como cebadores (estos cebadores contenían los puntos de reconocimiento subsidiarios para las endonucleasas AatII y BglII);

\bullet

\vtcortauna el fragmento BglII-PstIpol pequeño (363 bp) del terminador ter_rrnB de transcripcion se obtuvo por ampliación por PCR de la zona correspondiente del cromosoma MG1655 de E. coli utilizando los oligonucleótidos P7 y P8 (SEC. ID. nº: 23 y nº: 24) como cebadores (estos cebadores contenían los puntos de reconocimiento subsidiarios para las endonucleasas BglII y PstI);

4)

el fragmento EcoRI-PstI pequeño (1388 bp) (SEC. ID. nº: 29) de pML-Tc-ter_thrL que incluye el gen para la resistencia a la tetraciclina y el terminador de transcripción ter_thrL, pML-Tc-ter_thrL se obtuvo de la siguiente manera:

\bullet

\vtcortauna el pML-MSC (2001 nº 5) se digirió con las endonucleasas de restricción XbaI y BamHI y a continuación el fragmento grande (3342 bp) se ligó con el fragmento XbaI-BamHI (68 bp) que lleva el terminador ter_thrL que se obtuvo por ampliación por PCR de la zona correspondiente del cromosoma MG1655 de E. coli utilizando los oligonucleótidos P9 y P10 (SEC. ID. nº: 25 y nº: 26) como cebadores (estos cebadores contenían los puntos de reconocimiento subsidiarios para las endonucleasas XbaI y BamHI), el producto de esta reacción fue el plásmido pML-ter_thrL;

\newpage

\bullet

\vtcortauna a continuación el pML-ter_thrL se digirió con las endonucleasas de restricción KpnI y XbaI a continuación se trató con el fragmento de Klenow de la ADN polimerasa I y a continuación se ligó con el fragmento pequeño EcoRI-Van91I (1317 bp) de pBR322 que incluye el gen para resistencia a la tetraciclina (el pBR322 se digirió con las endonucleasas de restricción EcoRI y Van91I a continuación que habían sido tratadas con el fragmento de Klenow de la ADN polimerasa I), el producto de esta reacción fue el plásmido pML-Tc-ter_thrL;

de este modo se obtuvo pMW118-attL-Tc-attR.

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Se construyó el pMW118-attL-Cm-attR por ligadura del fragmento BamHI-XbaI grande (4413 bp) del pMW118-attL-Tc-attR y BglII-XbaI fragmento de ADN artificial (1162 bp) que incluye el promotor P_{A2} (el promotor precoz del fago T7), el gen cat para resistencia al cloranfenicol (Cm^{R}), el terminador de transcripción ter_thrL y attR. El fragmento de ADN artificial (SEC. ID. nº: 30) se obtuvo de la siguiente manera:

1.

Se digirió el pML-MSC (2001 nº 5) con endonucleasas de restricción KpnI y XbaI y se ligó con el fragmento KpnI-XbaI pequeño (120 bp) que incluye el promotor P_{A2} (el promotor precoz del fago T7) obtenido por ampliación por PCR de la correspondiente zona del ADN del fago T7 ADN los oligonucleótidos P11 y P12 (SEC. ID. nº: 27 y nº: 28) como cebadores (estos cebadores contenían los puntos de reconocimiento subsidiarios para la endonucleasas KpnI y XbaI), el producto de esta reacción fue el plásmido pML-P_{A2}-MCS;

2.

a continuación se eliminó la secuencia XbaI del pML-P_{A2}-MCS, el producto de esta reacción fue el plásmido pML-P_{A2}-MCS (XbaI^{-});

3.

a continuación, el fragmento pequeño BglII-HindIII (928 bp) del pML-P_{A2}-MCS (XbaI^{-}) que incluye el promotor P_{A2} (el promotor precoz del fago T7) y el gen cat para resistencia al cloranfenicol (Cm^{R}) se ligó con el fragmento pequeño HindIII-HindIII (234 bp) de pMW118-attL-Tc-attR que incluye el terminador de transcripción ter_thrL y attR;

4.

se obtuvo el fragmento de ADN artificial requerido (1156 bp) por ampliación por PCR con la mezcla de reacción de ligadura utilizando los oligonucleótidos P9 y P4 (SEC. ID. nº: 25 y Nº: 20) como cebadores (estos cebadores contenían los puntos de reconocimiento subsidiarios para las endonucleasas HindIII y XbaI).

(3-2) pMW-intxis-ts

Inicialmente, se ampliaron dos fragmentos de ADN utilizando el ADN del fago \lambda ("Fermentas") como plantilla. El primero incluía la zona desde el nt 37168 al 38046 (SEC. ID. nº: 39) y también contenía el gen que codifica el represor cI, los promotores Prm y Pr y la secuencia principal del gen cro. Este fragmento se obtuvo utilizando los oligonucleótidos P1' y P2' (SEC. ID. nº: 31 y nº: 32) como cebadores. El segundo fragmento presentaba los genes xis-int del fago \lambda y comprendía la región desde el nt 27801 al 29100 (SEC. ID. nº: 40). Los oligonucleótidos P3' y P4' (SEC. ID. nº: 33 y nº: 34) se utilizaron como cebadores para su ampliación. Todos los cebadores contenían puntos de reconocimiento de endonucleasa apropiados.

El fragmento ampliado por PCR obtenido, que lleva el represor cI, se digirió con endonucleasa de restricción ClaI, se trató con el fragmento de Klenow de la ADN polimerasa I, y a continuación se digirió con la endonucleasa de restricción EcoRI. El segundo fragmento ampliado por PCR se digirió con las endonucleasas de restricción EcoRI y PstI. A continuación el plásmido pMWPlaclacI-ts se digirió con la endonucleasa BglII, se trató con el fragmento de Klenow de la ADN polimerasa I y a continuación se digirió con la endonucleasa de restricción PstI. Un fragmento del vector de pMWPlaclacI-ts se eluyó con el gel de agarosa y se ligó con los fragmentos ampliados por PCR digeridos.

El plásmido pMWPlaclacI-ts es un derivado de pMWPlaclacI constituido por las partes siguientes: 1) BglII-HindIII - fragmento de ADN artificial que incluye el gen lacI bajo el control del promotor P_{lacUV5} y RBS del gen 10 del bacteriófago T7; 2) AatII-BglII-fragmento de ADN que lleva el gen para resistencia a la ampicilina (AP^{R}) que se obtuvo por ampliación por PCR de la secuencia correspondiente del plásmido pUC19 utilizando los oligonucleótidos P5' y P6' (SEC. ID. nº: 35 y nº: 36) como cebadores (estos cebadores contenían los puntos de reconocimiento subsidiarios para las endonucleasas AatII y BglII); 3) AatII-HindIII-fragmento que comprende el fragmento AatII-PvuI del plásmido recombinante construido anteriormente - pMW118-ter_rrnB. Se construyó el plásmido último del siguiente modo: el fragmento de ADN PstI-HindIII que lleva el terminador ter_rrnB se obtuvo por ampliación por PCR de la zona correspondiente del cromosoma MG1655 de E. coli utilizando los oligonucleótidos P7' y P8' (SEC. ID. nº: 37 y nº: 38 que contienen los puntos de reconocimiento de la endonucleasa apropiados como cebadores. Antes de la ligadura, el plásmido pMW118 y el fragmento de ADN ter_rrnB (complemento, SEC. ID. nº: 41) fueron limitados con la endonucleasa PvuI o PstI respectivamente, tratadas con el fragmento de Klenow de la ADN polimerasa I para obtener los terminales truncados y a continuación se limitaron con endonucleasa AatII o HindIII. Para construir la variante pMWPlaclacI-ts el fragmento AatII-EcoRV del plásmido pMWPlaclacI se sustituyó por el fragmento AatII-EcoRV del plásmido pMAN997 que incluye los locus par, ori y el gen repA^{tg} del replicón pSC101.

Ejemplo 4 Construcción de la bacteria productora de L-treonina que carece de enzima málica

Las cepas que carecen de sfcA- y b2463 se construyeron a partir de la cepa B-5318 de la VKPM. La cepa B-5318 de la VKPM se depositó en la Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNII Genetika) el 19 de noviembre de 1987 y recibieron un número de registro B-5318 de la VKPM.

Una cepa que carecía de uno de los genes de la enzima málica (mez) (sfcA, b2463) se obtuvo de la misma forma que en el Ejemplo 3 utilizando el procedimiento de "integración dirigida por el rojo". Es decir, se llevó a cabo de la misma manera que utilizando el procedimiento de "integración dirigida por el rojo" en el Ejemplo 3 excepto que la cepa B-5318 se utilizó en lugar de la cepa WC196 para obtener la cepa que carece de sfcA^{-} o b2463^{-} o un mutante identificado en el gen con resistencia al cloranfenicol. La cepa B-5318 en la que se destruyó sfcA se denominó B-5318\Deltab2463. La cepa B-5318 en la que se disgregó b2463 se denominó B-5318\Deltab2463. Una cepa B-5318 con los genes sfcA y b2463 destruidos, la B-5318\DeltasfcA\Deltab2463 se obtuvo de la misma manera utilizando la "integración dirigida por el rojo" y el procedimiento del sistema de escisión como en el Ejemplo 3. La cepa B-5318\DeltasfcA\Deltab2463 se denominó B-5318\Deltamez.

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Ejemplo 5 Evaluación de la cepa que carece de enzima málica <5-1> Evaluación de la bacteria productora de L-treonina que es la cepa que carece de b2463

Las cepas B-5318\Deltab2463 y B-5318 se cultivaron cada una en medio LB agar-agar (10 g/l de triptón, 5 g/l de extracto de levadura, 5 g/l de NaCl y 15 g/l de agar-agar) que contenía 20 mg/ml de sulfato de estreptomicina y 25 mg/l de sulfato de kanamicina a 37ºC durante 24 horas y se tomaron las células bacterianas de una quinta parte de la placa y se inocularon en 50 ml de medio LB líquido (10 g/l de tripton, 5 g/l de extracto de levadura y 5 g/l de NaCl) que contenía 20 mg/l de sulfato de estreptomicina y 25 mg/ml de sulfato de kanamicina para preparar el precultivo a 40ºC y 144 rpm durante 3,5 horas.

Después de la terminación del precultivo, el caldo de precultivo se inoculó en 300 ml de un medio de cultivo principal contenido en un fermentador de jarra de 1 l de volumen en una cantidad del 10% del volumen del medio de cultivo principal para preparar el cultivo principal a 40ºC y pH 7,0. A continuación se presenta la composición del medio de cultivo principal.

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TABLA 4 Composición del medio de cultivo principal

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El pH durante el cultivo se ajustó a 7,0 añadiendo gas amoniaco.

Una vez consumido el azúcar añadido, se midió la cantidad de L-treonina por cromatografía líquida. Los resultados se presentan en la Tabla 5.

Cuando se utilizó la cepa B-5318\Deltab2463 que carece de b2463, el rendimiento en treonina aumentó en comparación con la cepa B-5318 de referencia.

TABLA 5

9

<5-2> Evaluación de la bacteria productora de L-treonina que es una cepa que carece de sfcA

Se cultivaron las cepas B-5318\DeltasfcA y B5318 de la misma manera que en <5-1>.

Una vez consumido el azúcar añadido, la cantidad de L-treonina se midió por cromatografía líquida. Los resultados se muestran en la Tabla 6.

Cuando se utilizó la cepa B-5318\DeltasfcA que carece de b2463, el rendimiento en treonina aumentó en comparación con la cepa B-5318 de referencia.

TABLA 6

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<5-3> Evaluación de la bacteria productora de L-lisina que es una cepa que carece de sfcA y b2463

Las cepas WC196, WC196\DeltasfcA y WC196\Deltab2463 se transformaron según un procedimiento ordinario utilizando un plásmido para la producción de lisina que albergaba los genes dapA, dapB y dapC, pCABD2 (publicación Internacional nº WO 01/53459) para obtener las cepas WC196/pCABD2, WC196\DeltasfcA/pCABD2 y WC196\Deltab2463/
pCABD2.

Las cepas WC196/pCABD2, WC196\DeltasfcA/pCABD2 y WC196\Deltab2463/pCABD2 se cultivaron a 37ºC en medio L (como se describe a continuación) que contenían 20 mg/l de estreptomicina hasta que la D.O._{600} del medio fue aproximadamente 0,6. A continuación, se añadió al cultivo una cantidad equivalente de solución de glicerol al 40%. Después de la agitación, la mezcla se distribuye en alícuotas apropiadas y se almacena a -80ºC. Las alícuotas almacenadas se denominan existencias de glicerol.

Las existencias de glicerol de las cepas se descongelaron, y cada 100 \mul se extendieron de forma uniforme en una placa L que contenía 20 mg/l de estreptomicina y se cultivaron a 37ºC durante 24 horas. Se tomaron células bacterianas de un octavo de la placa obtenida y se inocularon en 20 ml de medio de fermentación (como se describe a continuación) que contenía 20 mg/l de estreptomicina al cultivo a 37ºC durante aproximadamente 16 horas mediante un agitador de movimiento alternativo. Después del cultivo, las cantidades de lisina que se habían acumulado en el medio y la glucosa restante se midieron con el analizador AS210 de Biotech (Sakura Seiki).

Los resultados de la acumulación de L-lisina y el rendimiento de células sustraídas se presenta en la Tabla 7. El rendimiento de células sustraídas que es un rendimiento calculado sustrayendo la cantidad de azúcar utilizada para la formación de la célula bacteriana, se calcula basándose en la suposición de que el 50% del azúcar consumido se utiliza para la formación de células bacterianas. Como se aprecia en los resultados, los rendimientos de células sustraídas de las cepas WC196\DeltasfcA/pCABD2 y WC196\Deltab2463/pCABD2 aumentan en comparación con las de la cepa WC196/pCABD2 de referencia.

TABLA 7

11

A continuación se describen los medios utilizados para la evaluación de la cepa productora de L-lisina con sfcA o b2463. Los reactivos utilizados se obtuvieron en Wako Pure Chemicals o Nakarai Tesque a menos que se indique de otro modo. Las composiciones de los medios utilizados se presentan a continuación. El pH se ajustó con NaOH o HCl para todos los medios.

TABLA 8

12

Ejemplo 6 Evaluación de la cepa que carece de enzima málica (\Deltamez) <6-1> Evaluación de la bacteria productora de L-treonina que es la cepa que carece de enzima málica

Las cepas B-5318\Deltamez y B-5318 se cultivaron cada una en medio LB agar-agar (10 g/l de triptón, 5 g/l de extracto de levadura, 5 g/l de NaCl y 15 g/l de agar-agar) que contenía 20 mg/ml de sulfato de estreptomicina y 25 mg/l de sulfato de kanamicina a 37ºC durante 24 horas y se tomaron las células bacterianas de una de las placas y se pusieron en suspensión en 5 ml de medio LB líquido (10 g/l de tripton, 5 g/l de extracto de levadura y 5 g/l de NaCl). Se inocularon 0,5 ml de la suspensión en 50 ml de medio líquido LB que contenía 20 mg/l de sulfato de estreptomicina y 25 mg/ml de sulfato de kanamicina para preparar el precultivo a 39ºC y 144 rpm durante 4 horas.

Después de la terminación del precultivo, el caldo de precultivo se inoculó en 300 ml de un medio de cultivo principal contenido en un fermentador de jarra de 1 l de volumen en una cantidad del 10% del volumen del medio de cultivo principal para preparar el cultivo principal a 39ºC y pH 7,0. A continuación se presenta la composición del medio de cultivo principal.

TABLA 9 Composición del medio de cultivo principal

13

El pH durante el cultivo se ajustó a 7,0 añadiendo gas amoniaco.

Una vez consumido y agotado el azúcar añadido, se añadieron 600 mg/l de solución de glucosa sola.

Después de 24 de cultivo principal, se midió la cantidad de L-treonina por cromatografía líquida. Los resultados se presentan en la Tabla 10.

Cuando se utilizó la cepa B-5318\Deltamez que carece de enzima málica, el rendimiento en treonina aumentó en comparación con la cepa B-5318 de referencia.

TABLA 10

14

<6-2> Evaluación de la bacteria productora de L-lisina que es una cepa que carece de enzima málica

Se transformaron las cepas WC196 y WC196mez se transformaron según un procedimiento ordinario compuesto plásmido para la producción de lisina, pCABD2 (Publicación Internacional nº WO 01/53459) para obtener cepas WC196/pCABD2 y WC\Deltamez/pCABD2.

Se cultivaron las cepas WC196/pCABD2 y WC\Deltamez/pCABD2 a 37ºC con medio L (el mismo utilizado en el Ejemplo 5 <5-3>) que contenía 20 mg/l de estreptomicina hasta que la D.O._{600} en el medio fue de aproximadamente 0,6. A continuación, una cantidad equivalente al cultivo, de solución de glicerol al 40% se añadió al cultivo. Tras la agitación, la mezcla se distribuyó en alícuotas apropiadas y se almacenó a -80ºC. Las alícuotas almacenadas se denominaron existencias de glicerol.

Se descongelaron las existencias de glicerol de las cepas y cada 100 \mul se extendieron uniformemente en una placa L que contenía 20 mg/l de estreptomicina y se cultivaron a 37ºC durante 24 horas.

Se tomaron células bacterianas de un octavo de la placa obtenida y se inocularon en 20 ml de medio de fermentación ((el mismo utilizado en el Ejemplo 5 <5-3>) que contenía 20 mg/l de estreptomicina para cultivar a 37ºC durante aproximadamente 48 horas mediante un agitador de movimiento alternativo. Después del cultivo, las cantidades de lisina que se habían acumulado en el medio y la glucosa restante se midieron con el analizador AS210 de Biotech (Sakura Seiki).

Los resultados de la acumulación de L-lisina y el rendimiento de células sustraídas se presenta en la Tabla 11. El rendimiento de células sustraídas se calcula basándose en la suposición de que el 50% del azúcar consumido se utiliza para la formación de células bacterianas. Como se aprecia en los resultados, el rendimiento de células sustraídas de las cepas WC196\Deltamez/pCABD2 aumenta en comparación con las de la cepa WC196/pCABD2 de referencia.

TABLA 11

15

Aplicabilidad industrial

Según la presente invención, el rendimiento de la fermentación de L-lisina y/o L-treonina aumenta en un procedimiento para producir L-lisina o L-treonina por fermentación utilizando una bacteria Escherichia. Además, la presente invención puede utilizarse para cultivar bacterias productoras de L-lisina y/o L-treonina que pertenecen al género Escherichia.

\global\parskip0.000000\baselineskip

<110> Ajinomoto Co., Inc.

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\vskip0.400000\baselineskip

<120> Procedimiento para la producción de L-lisina o L-treonina utilizando la bacteria Escherichia que presenta actividad de la enzima málica atenuada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<130> C2710PC4106

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> JP 2003-202842

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 2003-07-29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

100

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

101

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

102

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

103

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1725

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Escherichia coli

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1725)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

16

17

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 574

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Escherichia coli

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

19

20

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2280

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Escherichia coli

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(2280)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

22

23

24

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 759

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Escherichia coli

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

26

27

28

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 101

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> fago lambda

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

29

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 172

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> fago lambda

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

30

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 120

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> fago lambda

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

31

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 184

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> fago lambda

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

32

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1071

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> fago lambda

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1071)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

33

34

35

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 356

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> fago lambda

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

36

37

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 219

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> fago lambda

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(219)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

38

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 72

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> fago lambda

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

39

40

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido P1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

104

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido P2

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

105

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido P3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

106

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido P4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

107

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido P5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

108

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido P6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

109

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido P7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

110

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido P8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

111

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido P9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

112

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido P10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

113

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido P11

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

114

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido P12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

115

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1388

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> fragmento de ADN clonado EcoRI-Pstl que comprende el gen para la resistencia a la tetraciclina (pequeño fragmento de EcoRI-Van911 de pBR322) y terminador de transcripción terthrL

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

41

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1162

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> fragmento de ADN clonado que contiene fragmento de ADN artificial que comprende el promotor PA2 (promotor precoz del tipo T7), gen cat para la resistencia al (CmR), terminador de transcripción ter-thrL y attR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

42

43

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido P1'

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

116

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido P2'

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

117

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido P3'

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

118

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido P4'

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

119

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido P5'

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

120

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido P6'

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

121

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido P7'

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

122

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido P8'

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

123

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 879

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> fragmento de ADN clonado que contiene el gen represor cl y regiones promotoras

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

44

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1290

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> fragmento de ADN clonado que contiene genes int-xis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

45

46

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 351

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> fragmento de ter_rrnB (complemento)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

47

Claims (8)

1. Procedimiento para producir L-lisina o L-treonina, que comprende el cultivo de una bacteria en un medio para producir y segregar dicha L-lisina o L-treonina, y recoger la L-lisina o L-treonina del medio, en el que dicha bacteria es una bacteria Escherichia que tiene capacidad para producir L-lisina o L-treonina, y en el que dicha bacteria se modifica de manera que se elimina una enzima málica o se reduce la actividad de una enzima málica en comparación con una cepa no modificada, en el que el gen que codifica dicha enzima de ácido málico comprende sfcA y/o b2463.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha bacteria está modificada de manera que la actividad de la enzima málica es reducida no más del 50% por célula en comparación con la cepa no modificada.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que un gen que codifica dicha enzima málica en el cromosoma bacteriano está mutado y/o una secuencia de control de la expresión del mismo está mutada de manera que la enzima málica se elimina o la actividad de la enzima málica se reduce en comparación con una cepa no modificada.

4. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que es realizada la rotura de un gen que codifica dicha enzima málica en el cromosoma bacteriano.

5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha enzima málica se selecciona de entre el grupo constituido por:

(A)

una proteína que presenta una secuencia de aminoácidos representada en la SEC. ID. nº: 6, y

(B)

una proteína que presenta una secuencia de aminoácidos que comprende la sustitución, la supresión, la inserción o la adición de uno o varios restos de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos representada en la SEC. ID. nº: 6, y presenta una actividad de la enzima málica.

6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha enzima málica se selecciona de entre el grupo constituido por:

(C)

una proteína que presenta una secuencia de aminoácidos representada en la SEC. ID. nº: 8, y

(D)

una proteína que presenta una secuencia de aminoácidos que comprende la sustitución, la supresión, la inserción o la adición de uno o varios restos de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos representada en la SEC. ID. nº: 8, y presenta una actividad de la enzima málica.

7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que un gen que codifica dicha enzima málica es un ADN seleccionado de entre el grupo constituido por:

(a)

un ADN que tiene una secuencia nucleotídica representada en la SEC. ID. nº: 5,

(b)

un ADN que se hibrida con la secuencia nucleotídica representada en la SEC. ID. nº: 5, o una sonda que puede prepararse a partir de la secuencia nucleotídica, en el que dicha hibridación se produce en condiciones severas, y en el que dicho ADN codifica una proteína que presenta actividad de la enzima málica.

8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que un gen que codifica la enzima málica es un ADN seleccionado de entre el grupo constituido por:

(c)

un ADN que tiene una secuencia nucleotídica representada en la SEC. ID. nº: 7, y

(d)

un ADN que se hibrida con la secuencia nucleotídica representada en la SEC. ID. nº: 7, o una sonda que puede prepararse a partir de la secuencia nucleotídica, en el que dicha hibridación se produce en condiciones severas, y en el que dicho ADN codifica una proteína que presenta una actividad de la enzima málica.