DE10224088A1

DE10224088A1 - Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung coryneformer Bakterien die ein abgeschwächtes mez-Gen enthalten

Info

Publication number: DE10224088A1
Application number: DE10224088A
Authority: DE
Inventors: Brigitte Bathe; Mike Farwick; Achim Marx; Walter Pfefferle
Original assignee: Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2002-05-31
Filing date: 2002-05-31
Publication date: 2003-12-11
Also published as: US20040009578A1; DE60312592D1; EP1367130B1; EP1367130A1; ATE357532T1; DE60312592T2

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren, bei dem man folgende Schritte durchführt: DOLLAR A a) Fermentation der die gewünschte L-Aminosäure produzierenden coryneforme Bakterien, in denen man zumindest das für das Malat-Enzym kodierende Gen abschwächt; DOLLAR A b) Anreicherung der gewünschten L-Aminosäure im Medium oder in den Zellen der Bakterien und DOLLAR A c) Isolierung der L-Aminosäure, DOLLAR A und gegebenenfalls Bakterien einsetzt, in denen man zusätzlich weitere Gene des Biosyntheseweges der gewünschten L-Aminosäure verstärkt, oder Bakterien einsetzt, in denen die Stoffwechselwege zumindest teilweise ausgeschaltet sind, die die Bildung der gewünschten L-Aminosäure verringern.

Description

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren, insbesondere L-Lysin und L-Methionin, unter Verwendung coryneformer Bakterien, in denen das mez- Gen, das für das Malat-Enzym (malic enzyme, EC:1.1.1.40) kodiert, abgeschwächt ist.

Stand der Technik

L-Aminosäuren, insbesondere L-Lysin und L-Methionin, finden in der Humanmedizin und in der pharmazeutischen Industrie, in der Lebensmittelindustrie und ganz besonders in der Tierernährung Anwendung.

Es ist bekannt, dass Aminosäuren durch Fermentation von Stämmen coryneformer Bakterien, insbesondere Corynebacterium glutamicum, hergestellt werden. Wegen der großen Bedeutung wird ständig an der Verbesserung der Herstellverfahren gearbeitet. Verfahrensverbesserungen können fermentationstechnische Maßnahmen, wie zum Beispiel Rührung und Versorgung mit Sauerstoff, oder die Zusammensetzung der Nährmedien, wie zum Beispiel die Zuckerkonzentration während der Fermentation, oder die Aufarbeitung zur Produktform durch zum Beispiel Ionenaustauschchromatographie oder die intrinsischen Leistungseigenschaften des Mikroorganismus selbst betreffen.

Zur Verbesserung der Leistungseigenschaften dieser Mikroorganismen werden Methoden der Mutagenese, Selektion und Mutantenauswahl angewendet. Auf diese Weise erhält man Stämme, die resistent gegen Antimetabolite, wie zum Beispiel das Lysin-Analogon S-(2-Aminoethyl)-Cystein oder auxotroph für regulatorisch bedeutsame Metabolite sind und L- Aminosäuren produzieren.

Seit einigen Jahren werden ebenfalls Methoden der rekombinanten DNA-Technik zur Stammverbesserung L- Aminosäure produzierender Stämme von Corynebacterium glutamicum eingesetzt, indem man einzelne Aminosäure- Biosynthesegene amplifiziert und die Auswirkung auf die L- Aminosäure-Produktion untersucht.

Aufgabe der Erfindung

Die Erfinder haben sich die Aufgabe gestellt, neue Grundlagen für verbesserte Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren, insbesondere L-Lysin und L- Methionin, mit coryneformen Bakterien bereitzustellen.

Beschreibung der Erfindung

Werden im folgenden L-Aminosäuren oder Aminosäuren erwähnt, sind damit eine oder mehrere Aminosäuren einschließlich ihrer Salze, ausgewählt aus der Gruppe L-Asparagin, L- Threonin, L-Serin, L-Glutamat, L-Glycin, L-Alanin, L- Cystein, L-Valin, L-Methionin, L-Isoleucin, L-Leucin, L- Tyrosin, L-Phenylalanin, L-Histidin, L-Lysin, L-Tryptophan und L-Arginin gemeint. Besonders bevorzugt sind L-Lysin und L-Methionin.

Wenn im Folgenden L-Lysin oder Lysin erwähnt werden, sind damit nicht nur die Basen, sondern sind auch die Salze wie z. B. Lysin-Monohydrochlorid oder Lysin-Sulfat gemeint.

Werden im folgenden L-Methionin oder Methionin erwähnt, sind damit auch die Salze, wie z. B. Methionin-Hydrochlorid oder Methionin-Sulfat, gemeint.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren, unter Verwendung von coryneformen Bakterien, in denen man zumindest die für das Malat-Enzym (malic enzyme) kodierende Nukleotidsequenz (mez-Gen) abschwächt, insbesondere ausschaltet oder auf niedrigem Niveau exprimiert.

Das Malat-Enzym katalysiert die oxidative Decarboxylierung von Malat zu Pyruvat unter Abspaltung eines Moleküls Kohlendioxid.

Gegenstand dieser Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren, in dem folgende Schritte durchführt werden:

a) Fermentation der L-Aminosäure produzierenden, coryneformen Bakterien, in denen zumindest die für das Malat-Enzym kodierende Nukleotidsequenz abgeschwächt, insbesondere ausgeschaltet oder auf niedrigem Niveau exprimiert wird;
b) Anreicherung der L-Aminosäuren im Medium oder in den Zellen der Bakterien und
c) Isolierung der gewünschten L-Aminosäuren, wobei gegebenenfalls Bestandteile der Fermentationsbrühe und/oder der Biomasse in Anteilen oder ihren Gesamtmengen (0 bis 100) im Endprodukt verbleiben.

Die eingesetzten Stämme produzieren bevorzugt bereits vor der Abschwächung des mez-Gens L-Aminosäuren, insbesondere L-Lysin und L-Methionin.

Bevorzugte Ausführungsformen finden sich in den Ansprüchen.

Der Begriff "Abschwächung" bzw. "Abschwächen" beschreibt in diesem Zusammenhang die Verringerung oder Ausschaltung der intrazellulären Aktivität oder Konzentration eines oder mehrerer Enzyme bzw. Proteine in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise einen schwachen Promotor verwendet oder ein Gen bzw. Allel verwendet, das für ein entsprechendes Enzym mit einer niedrigen Aktivität kodiert bzw. das entsprechende Gen oder Enzym bzw. Protein inaktiviert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.

Durch die Maßnahmen der Abschwächung wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Proteins im allgemeinen auf 0 bis 75%, 0 bis 50%, 0 bis 25%, 0 bis 10% oder 0 bis 5% der Aktivität oder Konzentration des Wildtyp- Proteins, beziehungsweise der Aktivität oder Konzentration des Proteins im Ausgangs-Mikroorganismus, herabgesenkt.

Die Mikroorganismen, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, können Aminosäuren aus Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke, Cellulose oder aus Glycerin und Ethanol herstellen. Es kann sich um Vertreter coryneformer Bakterien insbesondere der Gattung Corynebacterium handeln. Bei der Gattung Corynebacterium ist insbesondere die Art Corynebacterium glutamicum zu nennen, die in der Fachwelt für ihre Fähigkeit bekannt ist, L-Aminosäuren zu produzieren.

Geeignete Stämme der Gattung Corynebacterium, insbesondere der Art Corynebacterium glutamicum, sind besonders die bekannten Wildtypstämme:
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium melassecola ATCC17965
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 und
Brevibacterium divaricatum ATCC14020
und daraus hergestellte L-Aminosäuren produzierende Mutanten bzw. Stämme
wie beispielsweise die L-Lysin produzierenden Stämme
Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709
Brevibacterium flavum FERM-P 1708
Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464 und
Corynebacterium glutamicum DSM 5715
oder wie beispielsweise der L-Methionin produzierende Stamm
Corynebacterium glutamicum ATCC21608.

Es wurde gefunden, dass coryneforme Bakterien nach Abschwächung des mez-Gens in verbesserter Weise L- Aminosäuren produzieren.

Die Nukleotidsequenz des für das Malat-Enzym von Corynebacterium glutamicum kodierenden Gens kann der Patentanmeldung EP 1108790 als Sequenz Nr. 3328 sowie als Sequenz Nr. 7069 entnommen werden. Weiterhin kann sie der Patentanmeldung WO 0100844 aus Sequenz Nr. 577 unter dem Identification Code RXN10148 entnommen werden.

Die Nukleotidsequenz ist ebenfalls in der Datenbank des National Center for Biotechnology Information (NCBI) der National Library of Medicin (Bethesda, MD, USA) unter der Accession Number AX123412, unter der Accession Number AX127153 und unter der Accession Number AX065451 hinterlegt.

Die Nukleotidsequenz des Gens malE aus Corynebacterium melassecola, das für das Malat-Enzym kodiert, ist in der Datenbank des National Center for Biotechnology Information (NCBI) der National Library of Medicin (Bethesda, MD, USA) unter der Accession Number AF234535 hinterlegt.

Diese Sequenz wird in der Patentanmeldung FR 2796080 zur Verstärkung des Malat-Enzyms in Corynebacterium glutamicum ATCC17965 eingesetzt, wodurch eine erhöhte Produktion von Aminosäuren, insbesondere Lysin, des Organismus C. glutamicum ATCC17965 erreicht wird.

Es wurde im Gegensatz zum Stand der Technik (FR 2796080) gefunden, dass coryneforme Bakterien nach Abschwächung des mez-Gens in verbesserter Weise L-Aminosäuren produzieren.

Die Sequenz des mez-Gens aus Corynebacterium glutamicum ATCC13032, welche für das Malat-Enzym kodiert, ist in der SEQ ID No. 1 dargestellt und kann erfindungsgemäß verwendet werden. Die Aminosäuresequenz des Proteins ist in SEQ ID No. 2 dargestellt.

Die in SEQ ID No. 1 dargestellte Nukleotidsequenz des mez- Gens aus Corynebacterium glutamicum unterscheidet sich von der in der Patentanmeldung FR 2796080 beschriebenen Nukleotidsequenz an den Positionen 138, 186, 351, 477, 483, 603, 606, 609, 612, 624, 627, 654, 657, 666, 719, 831, 837, 846, 849, 850, 1014, 1029, 1052 und 1111. Die Nukleobasen- Unterschiede an Position 719 und an Position 850 der Nukleotidsequenz führen zu Austauschen in der Aminosäuresequenz; an Position 240 der Aminosäuresequenz befindet sich anstelle von Alanin Aspartat und an Position 284 der Aminosäuresequenz befindet sich anstelle von Glutamat Glutamin.

Weiterhin können Allele des Malat-Enzyms verwendet werden, die sich aus der Degeneriertheit des genetischen Codes oder durch funktionsneutrale Sinnmutationen ("sense mutations") ergeben.

Zur Erzielung einer Abschwächung können entweder die Expression des mez-Gens oder die katalytischen Eigenschaften der Genprodukte herabgesetzt oder ausgeschaltet werden. Gegebenenfalls werden beide Maßnahmen kombiniert.

Die Genexpression kann durch geeignete Kulturführung oder durch genetische Veränderung (Mutation) der Signalstrukturen der Genexpression verringert werden. Signalstrukturen der Genexpression sind beispielsweise Repressorgene, Aktivatorgene, Operatoren, Promotoren, Attenuatoren, Ribosomenbindungsstellen, das Startkodon und Terminatoren. Angaben hierzu findet der Fachmann z. B. in der Patentanmeldung WO 96/15246, bei Boyd und Murphy ("Journal of Bacteriology", 170: 5949 (1988)), bei Voskuil und Chambliss ("Nucleic Acids Research", 26: 3548 (1998), bei Jensen und Hammer ("Biotechnology and Bioengineering", 58: 191 (1998)), bei Pátek et al. ("Microbiology", 142: 1297 (1996)) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie, wie z. B. dem Lehrbuch von Knippers ("Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme-Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995) oder dem von Winnacker ("Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990).

Eine weitere Methode zur spezifischen Verringerung der Genexpression ist die Antisense-Technik, wobei kurze Oligodesoxyukleotide oder Vektoren zur Synthese längerer Antisense-RNA in die Zielzellen gebracht werden. Die Antisense-RNA kann dort an komplementäre Abschnitte spezifischer mRNAs binden und deren Stabilität verringern oder die Translatierbarkeit blocken. Ein Beispiel hierzu findet der Fachmann bei Srivastava et al. ("Applied Environmental Microbiology", 2000 Oct.; 66 (10): 4366-4371).

Mutationen, die zu einer Veränderung bzw. Herabsetzung der katalytischen Eigenschaften von Enzymproteinen führen, sind aus dem Stand der Technik bekannt; als Beispiele seien die Arbeiten von Qiu und Goodman ("Journal of Biological Chemistry", 272: 8611-8617 (1997)), Sugimoto et al. ("Bioscience Biotechnology and Biochemistry", 61: 1760-1762 (1997)) und Möckel ("Die Threonindehydratase aus Corynebacterium glutamicum: Aufhebung der allosterischen Regulation und Struktur des Enzyms", Berichte des Forschungszentrums Jülich, Jül-2906, ISSN09442952, Jülich, Deutschland, 1994) genannt. Zusammenfassende Darstellungen können bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie, wie z. B. dem von Hagemann ("Allgemeine Genetik", Gustav Fischer-Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden.

Als Mutationen kommen Transitionen, Transversionen, Insertionen und Deletionen in Betracht. In Abhängigkeit von der Wirkung des Aminosäureaustausches auf die Enzymaktivität wird von Fehlsinnmutationen ("missense mutations") oder Nichtsinnmutationen ("nonsense mutations") gesprochen. Insertionen oder Deletionen von mindestens einem Basenpaar in einem Gen führen zu Rasterverschiebungsmutationen ("frame shift mutations"), in deren Folge falsche Aminosäuren eingebaut werden oder die Translation vorzeitig abbricht. Deletionen von mehreren Kodonen führen typischerweise zu einem vollständigen Ausfall der Enzymaktivität. Anleitungen zur Erzeugung derartiger Mutationen gehören zum Stand der Technik und können bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie, wie z. B. dem Lehrbuch von Knippers ("Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme-Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995), dem von Winnacker ("Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990) oder dem von Hagemann ("Allgemeine Genetik", Gustav Fischer-Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden.

Eine gebräuchliche Methode, Gene von C. glutamicum zu mutieren, ist die von Schwarzer und Pühler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991)) beschriebene Methode der Gen-Unterbrechung ("gene disruption") und des Gen-Austauschs ("gene replacement").

Bei der Methode der Gen-Unterbrechung wird ein zentraler Teil der Kodierregion des interessierenden Gens in einen Plasmidvektor kloniert, der in einem Wirt (typischerweise E. coli), nicht aber in C. glutamicum replizieren kann. Als Vektoren kommen beispielsweise pSUP301 (Simon et al., "Bio/Technology" 1, 784-791 (1983)), pK18mob oder pK19mob (Schäfer et al., "Gene", 145, 69-73 (1994)), pK18mobsacB oder pK19mobsacB (Jäger et al., "Journal of Bacteriology", 174: 5462-65 (1992)), pGEM-T (Promega Corporation, Madison, WI, USA), pCR2.1-TOPO (Shuman (1994). Journal of Biological Chemistry 269: 32678-84; US-Patent 5,487,993), pCR®Blunt (Firma Invitrogen, Groningen, Niederlande; Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)) oder pEM1 (Schrumpf et al. 1991, Journal of Bacteriology 173: 4510-4516) in Frage: Der Plasmidvektor, der das zentrale Teil der Kodierregion des Gens enthält, wird anschließend durch Konjugation oder Transformation in den gewünschten Stamm von C. glutamicum überführt. Die Methode der Konjugation ist beispielsweise bei Schäfer et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 756-759 (1994)) beschrieben. Methoden zur Transformation sind beispielsweise bei Thierbach et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)), Dunican und Shivnan (Bio/Technology 7, 1067-1070 (1989)) und Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters 123, 343-347 (1994)) beschrieben. Nach homologer Rekombination mittels eines "cross-over"- Ereignisses wird die Kodierregion des betreffenden Gens durch die Vektorsequenz unterbrochen und man erhält zwei unvollständige Allele, denen jeweils das 3'- bzw. das 5'- Ende fehlt. Diese Methode wurde beispielsweise von Fitzpatrick et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 42, 575-580 (1994)) zur Ausschaltung des recA-Gens von C. glutamicum verwendet.

Bei der Methode des Genaustausches ("gene replacement") wird eine Mutation wie z. B. eine Deletion, Insertion oder Basenaustausch in dem interessierenden Gen in vitro hergestellt. Das hergestellte Allel wird wiederum in einen für C. glutamicum nicht replikativen Vektor kloniert und dieser anschließend durch Transformation oder Konjugation in den gewünschten Wirt von C. glutamicum überführt. Nach homologer Rekombination mittels eines ersten, Integration bewirkenden "cross-over"-Ereignisses und eines geeigneten zweiten, eine Exzision bewirkenden "cross-over"-Ereignisses im Zielgen bzw. in der Zielsequenz erreicht man den Einbau der Mutation bzw. des Allels. Diese Methode wurde beispielsweise von Peters-Wendisch et al. (Microbiology 144, 915-927 (1998)) verwendet, um das pyc-Gen von C. glutamicum durch eine Deletion auszuschalten.

In das mez-Gen kann auf diese Weise eine Deletion, Insertion oder ein Basenaustausch eingebaut werden.

Zusätzlich kann es für die Produktion von L-Aminosäuren vorteilhaft sein, zusätzlich zur Abschwächung des mez-Gens eines oder mehrere Enzyme des jeweiligen Biosyntheseweges, der Glykolyse, der Anaplerotik, des Zitronensäure-Zyklus, des Pentosephosphat-Zyklus, des Aminosäure-Exports und gegebenenfalls regulatorische Proteine zu verstärken, insbesondere überzuexprimieren.

Der Begriff "Verstärkung" bzw. "Verstärken" beschreibt in diesem Zusammenhang die Erhöhung der intrazellulären Aktivität oder Konzentration eines oder mehrerer Enzyme bzw. Proteine in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise die Kopienzahl des Gens bzw. der Gene erhöht, einen starken Promotor oder ein Gen bzw. Allel verwendet, das für ein entsprechendes Enzym bzw. Protein mit einer hohen Aktivität kodiert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.

Durch die Maßnahmen der Verstärkung, insbesondere Überexpression, wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Proteins im allgemeinen um mindestens 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% oder 500%, maximal bis 1000% oder 2000%, bezogen auf die des Wildtyp- Proteins beziehungsweise der Aktivität oder Konzentration des Proteins im Ausgangs-Mikroorganismus erhöht.

Die Verwendung endogener Gene wird im allgemeinen bevorzugt. Unter "endogenen Genen" oder "endogenen Nukleotidsequenzen" versteht man die in der Population einer Art vorhandenen Gene beziehungsweise Nukleotidsequenzen.

So kann für die Herstellung von L-Aminosäuren neben der Abschwächung des mez-Gens eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe:

- das für eine feed-back resistente Aspartatkinase kodierende Gen lysC (Accession No. P26512, EP-B-0387527; EP-A-0699759; WO 00/63388),
- das für die Dihydrodipicolinat-Synthase kodierende Gen dapA (EP-B 0 197 335),
- das für die Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase kodierende Gen gap (Eikmanns (1992). Journal of Bacteriology 174: 6076-6086),
- gleichzeitig das für die Pyruvat-Carboxylase kodierende Gen pyc (EP-A-1083225),
- das für die Malat : Chinon-Oxidoreduktase kodierende Gen mqo (Molenaar et al., European Journal of Biochemistry 254, 395-403 (1998); EP-A-1038969),
- das für die Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase kodierende Gen zwf (JP-A-09224661, WO 01/70995),
- gleichzeitig das für das Lysin-Export-Protein kodierende Gen lysE (DE-A-195 48 222),
- das für das Zwa1-Protein kodierende Gen zwa1 (EP-A-1111062)
- das für die Triosephosphat-Isomerase kodierende Gen tpi (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086), und
- das für die 3-Phosphoglycerat-Kinase kodierende Gen pgk (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086), verstärkt, insbesondere überexprimiert werden.

Weiterhin kann es für die Produktion von L-Aminosäuren vorteilhaft sein, zusätzlich zur Abschwächung des mez-Gens gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe:

- das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase kodierende Gen pck (EP-A-1094111),
- das für die Glucose-6-Phosphat-Isomerase kodierende Gen pgi (EP-A-1087015, WO 01/07626),
- das für die Pyruvat-Oxidase kodierende Gen poxB (EP-A-1096013)
- das für das Zwa2-Protein kodierende Gen zwa2 (EP-A-1106693),
- das für ein Katabolit-Kontroll-Protein A kodierende Gen ccpA1 (WO 02/18419)

abzuschwächen, insbesondere auszuschalten oder die Expression zu verringern.

Schließlich kann es für die Produktion von Aminosäuren, vorteilhaft sein, neben der Abschwächung des mez-Gens unerwünschte Nebenreaktionen auszuschalten (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982).

Die erfindungsgemäß hergestellten Mikroorganismen sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung und können kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch-Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed batch(Zulaufverfahren)- oder repeated fed batch-Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der Produktion von L-Aminosäuren kultiviert werden. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden ist im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer-Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg-Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.

Das zu verwendende Kulturmedium muss in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981) enthalten.

Als Kohlenstoffquelle können Zucker und Kohlehydrate, wie z. B. Glucose, Saccharose, Laktose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und Cellulose, Öle und Fette wie z. B. Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnußöl und Kokosfett, Fettsäuren wie z. B. Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole wie z. B. Glycerin und Ethanol und organische Säuren wie z. B. Essigsäure verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden.

Als Stickstoffquelle können organische, stickstoffhaltige Verbindungen, wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden.

Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium-haltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium muß weiterhin Salze von Metallen enthalten, wie z. B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe, wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden.

Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen, wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder saure Verbindungen, wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel, wie z. B. Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete, selektiv wirkende Stoffe, wie z. B. Antibiotika hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder Sauerstoffhaltige Gasmischungen, wie z. B. Luft in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 20°C bis 45°C und vorzugsweise bei 25°C bis 40°C. Die Kultur wird solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum des gewünschten Produktes gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.

Methoden zur Bestimmung von L-Aminosäuren sind aus dem Stand der Technik bekannt. Die Analyse kann so wie bei Spackman et al. ("Analytical Chemistry", 30, (1958), 1190) beschrieben durch Anionenaustauschchromatographie mit anschließender Ninhydrin-Derivatisierung erfolgen, oder sie kann durch reversed phase HPLC erfolgen, so wie bei Lindroth et al. ("Analytical Chemistry" (1979) 51: 1167-1174) beschrieben. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren durch Fermentation coryneformer Bakterien, dadurch gekennzeichnet, dass man Bakterien einsetzt, in denen man die für das Malat-Enzym kodierende Nukleotidsequenz (mez) abschwächt, insbesondere ausschaltet oder auf niedrigem Niveau exprimiert.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man L-Lysin herstellt.

3. Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren, insbesondere L-Lysin und L-Methionin, dadurch gekennzeichnet, dass man folgende Schritte durchführt:

a) Fermentation der die gewünschte L-Aminosäure produzierenden, coryneformen Bakterien, in denen man zumindest das für das Malat-Enzym kodierende Gen abschwächt,

b) Anreicherung des gewünschten Produkts im Medium oder in den Zellen der Bakterien und

c) Isolierung der gewünschten L-Aminosäuren, wobei gegebenenfalls Bestandteile der Fermentationsbrühe und/oder der Biomasse in Anteilen oder ihren Gesamtmengen (0 bis 100) im Endprodukt verbleiben.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass man Bakterien einsetzt, in denen man zusätzlich weitere Gene des Biosyntheseweges der gewünschten L-Aminosäure verstärkt.

5. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass man Bakterien einsetzt, in denen die Stoffwechselwege zumindest teilweise ausgeschaltet sind, die die Bildung der gewünschten L-Aminosäure verringern.

6. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass man die Expression des Polynukleotids, das für das Malat-Enzym kodiert, verringert.

7. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass man die katalytischen Eigenschaften des Polypeptids (Enzymproteins) verringert, für das das Polynukleotid mez kodiert.

8. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass man für die Herstellung von L-Lysin und L-Methionin coryneforme Mikroorganismen fermentiert, in denen man gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe:

1. 8.1 das für eine feed-back resistente Aspartatkinase kodierende Gen lysC,

2. 8.2 das für die Dihydrodipicolinat-Synthase kodierende Gen dapA,

3. 8.3 das für die Glyceraldehyd-3-Phosphat- Dehydrogenase kodierende Gen gap,

4. 8.4 das für die Pyruvat-Carboxylase kodierende Gen pyc,

5. 8.5 das für die Malat : Chinon-Oxidoreduktase kodierende Gen mqo,

6. 8.6 das für die Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase kodierende Gen zwf,

7. 8.7 gleichzeitig das für das Lysin-Export-Protein kodierende Gen lysE,

8. 8.8 das für das Zwa1-Protein kodierende Gen zwa1,

9. 8.9 das für die Triosephosphat-Isomerase kodierende Gen tpi und

10. 8.10 das für die 3-Phosphoglycerat-Kinase kodierende Gen pgk,

verstärkt, insbesondere überexprimiert.

9. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass man zur Herstellung von L-Aminosäuren coryneforme Mikroorganismen fermentiert, in denen man gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe:

1. 9.1 das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase kodierende pck-Gen,

2. 9.2 das für die Glucose-6-Phosphat-Isomerase kodierende pgi-Gen,

3. 9.3 das für die Pyruvat-Oxidase kodierende Gen poxB,

4. 9.4 das für das Zwa2-Protein kodierende Gen zwa2, oder

5. 9.5 das für ein Katabolit-Kontroll-Protein A kodierende Gen ccpA1,

abschwächt.

10. Verfahren gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man Mikroorganismen der Art Corynebacterium glutamicum einsetzt.

11. Coryneforme Bakterien, in denen zumindest das mez-Gen in abgeschwächter Form vorliegt.