JP2009106304A - 亜硫酸水素塩処理のための改善された方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】核酸が脱アミノ工程および/または脱スルホン化工程中に固相に結合されていることを特徴とする、核酸中のシトシン塩基のウラシル塩基への変換方法、核酸中のシトシン塩基が亜硫酸水素イオンの存在下でウラシル塩基に変換される反応の脱アミノ工程および/または脱スルホン化工程における固相の使用、ならびに亜硫酸水素イオンを含む溶液および固相を含んでなる亜硫酸水素塩反応を実施するためのキット。
【選択図】なし
Description
(1)核酸が脱アミノ工程および/または脱スルホン化工程中に固相に結合されていることを特徴とする、核酸中のシトシン塩基のウラシル塩基への変換方法、
(2)a)核酸を固相に結合する工程、
b)亜硫酸水素イオンの存在下で固相結合核酸をインキュベートし、それにより核酸が脱アミノされる工程、
c)脱アミノ固相結合核酸を任意に洗浄する工程、
d)アルカリ条件下で脱アミノ固相結合核酸をインキュベートし、それにより脱アミノ核酸が脱スルホン化される工程、
e)脱アミノ脱スルホン化固相結合核酸を任意に洗浄する工程、および
f)固相から脱アミノ脱スルホン化核酸を任意に溶出する工程
を含む、前記(1)記載の核酸中のシトシン塩基のウラシル塩基への変換方法、
(3)a)亜硫酸水素イオンの存在下で核酸をインキュベートし、それにより核酸が脱アミノされる工程、
b)脱アミノ核酸を固相に結合する工程、
c)脱アミノ固相結合核酸を任意に洗浄する工程、
d)アルカリ条件下で脱アミノ固相結合核酸をインキュベートし、それにより脱アミノ核酸が脱スルホン化される工程、
e)脱アミノ脱スルホン化固相結合核酸を任意に洗浄する工程、および
f)固相から脱アミノ脱スルホン化核酸を任意に溶出する工程
を含む、前記(1)記載の核酸中のシトシン塩基のウラシル塩基への変換方法、
(4)a)核酸を固相に結合する工程、
b)亜硫酸水素イオンの存在下で固相結合核酸をインキュベートし、それにより核酸が脱アミノされる工程、
c)固相結合核酸を任意に洗浄する工程、
d)固相から脱アミノ核酸を溶出する工程、および
e)アルカリ条件下で脱アミノ核酸をインキュベートし、それにより脱アミノ核酸が脱スルホン化される工程
を含む、前記(1)記載の核酸中のシトシン塩基のウラシル塩基への変換方法、
(5)固相がシリカまたはガラスを含む材料であることを特徴とする前記(1)〜(4)いずれか記載の方法、
(6)固相がガラスフリースまたはガラス膜であることを特徴とする前記(1)〜(5)いずれか記載の方法、
(7)固相が磁性ガラス粒子であることを特徴とする前記(1)〜(5)いずれか記載の方法、
(8)磁性ガラス粒子が0.5μm〜5μmの平均直径を有することを特徴とする前記(7)記載の方法、
(9)磁性ガラス粒子が5〜500nmの直径を有する磁性物体を含むことを特徴とする前記(7)または(8)記載の方法、
(10)磁性ガラス粒子が23nmの平均直径を有する磁性物体を含むことを特徴とする前記(9)記載の方法、
(11)磁性ガラス粒子がゾル−ゲル法により製造されることを特徴とする前記(7)〜(10)いずれか記載の方法、
(12)前記ゾル−ゲル法が
a)ゾル中で磁性物体を懸濁する工程、
b)該ゾルを加水分解して磁性物体をゲルで覆う工程、
c)ツーノズル噴霧乾燥機中でゲルで覆われた磁性物体を噴霧乾燥する工程、および
d)噴霧乾燥粉末を焼結して磁性物体を覆うゲルからガラスを形成する工程
を含む、前記(11)記載の方法、
(13)核酸中のシトシン塩基が亜硫酸水素イオンの存在下でウラシル塩基に変換される反応の脱アミノ工程および/または脱スルホン化工程における固相の使用、
(14)固相がシリカまたはガラスを含む材料である前記(13)記載の使用、
(15)固相がガラスフリースまたはガラス膜である前記(13)または(14)記載の使用、
(16)固相が磁性ガラス粒子である前記(13)または(14)記載の使用、
(17)亜硫酸水素イオンを含む溶液および固相を含んでなる亜硫酸水素塩反応を実施するためのキット、
(18)固相がシリカまたはガラスを含む物質である前記(17)記載のキット、
(19)固相がガラスフリースまたはガラス膜である前記(17)または(18)記載のキット、
(20)固相が磁性ガラス粒子である前記(17)または(18)記載のキット、ならびに
(21)核酸中のシトシン塩基が亜硫酸水素イオンの存在下でウラシル塩基に変換される反応のための前記(17)〜(20)いずれか記載のキットの使用
に関する。
a)核酸を固相に結合する工程、
b)亜硫酸水素イオンの存在下で固相結合核酸をインキュベートし、それにより核酸が脱アミノされる工程、
c)脱アミノ固相結合核酸を任意に洗浄する工程、
d)アルカリ条件下で脱アミノ固相結合核酸をインキュベートし、それにより脱アミノ核酸が脱スルホン化される工程、
e)脱アミノ脱スルホン化固相結合核酸を任意に洗浄する工程、ならびに
f)固相から脱アミノ脱スルホン化核酸を任意に溶出する工程
を含む、核酸中のシトシン塩基、好ましくは、複数のシトシン塩基のウラシル塩基、好ましくは、複数のウラシル塩基への変換(「亜硫酸水素塩反応」)、それにより、好ましくは、5−メチルシトシン塩基は有意に変換されない方法が開示されている。
a)亜硫酸水素イオンの存在下で核酸をインキュベートし、それにより核酸が脱アミノされる工程、
b)脱アミノ核酸を固相に結合する工程、
c)脱アミノ固相結合核酸を任意に洗浄する工程、
d)アルカリ条件下で脱アミノ固相結合核酸をインキュベートし、それにより脱アミノ核酸が脱スルホン化される工程、
e)脱アミノ脱スルホン化固相結合核酸を任意に洗浄する工程、ならびに
f)固相から脱アミノ脱スルホン化核酸を任意に溶出する工程
を含む、核酸中のシトシン塩基、好ましくは複数のシトシン塩基のウラシル塩基、好ましくは複数のウラシル塩基への変換(「亜硫酸水素塩反応」)、それにより、5−メチルシトシン塩基は有意に変換されない方法が開示されている。
a)核酸を固相に結合する工程、
b)亜硫酸水素イオンの存在下で固相結合核酸をインキュベートし、それにより核酸が脱アミノされる工程、
c)固相結合核酸を任意に洗浄する工程、
d)固相から脱アミノ核酸を溶出する工程
e)アルカリ条件下で脱アミノ核酸をインキュベートし、それにより脱アミノ核酸が脱スルホン化される工程
を含む、核酸中のシトシン塩基、好ましくは複数のシトシン塩基のウラシル塩基、好ましくは複数のウラシル塩基への変換(「亜硫酸水素塩反応」)、それにより、5−メチルシトシン塩基は有意に変換されない方法が開示されている。
−ゾル中に磁性物体を懸濁する工程;
−ゾルを加水分解して磁性物体をゲルで被覆する工程;
−ゲルで被覆された磁性物体を2ノズル噴霧ドライヤーで噴霧乾燥する工程;および
−噴霧乾燥した粉末を焼結して磁性物体を被覆するゲルからガラスを形成する工程;
を含む。
a)核酸と他の生物学的化合物との混合物を提供する工程;
b)核酸を固相に結合し、任意に他の生物学的化合物を除去し、そして任意に固相結合核酸を洗浄する工程;
c)亜硫酸水素イオンの存在下、固相結合核酸をインキュベートして、それにより核酸が脱アミノされる工程;
d)任意に脱アミノされた固相結合核酸を洗浄する工程;
e)アルカリ条件下で脱アミノされた固相結合核酸をインキュベートして、それにより脱アミノされた核酸が脱スルホン化される工程;
f)任意に脱アミノされ、そして脱スルホン化された固相結合核酸を洗浄する工程;ならびに
g)任意に脱アミノされ、そして脱スルホン化された核酸を固相から溶出する工程
を含み、核酸中のシトシン塩基、好ましくは複数のシトシン塩基をウラシル塩基、好ましくは複数のウラシル塩基に変換し、それにより好ましくは5−メチルシトシン塩基が有意には変換されない方法(「亜硫酸水素塩反応」または「亜硫酸水素塩処理」)が提供される。
a)核酸と他の生物学的化合物との混合物を提供する工程;
b)核酸を固相に結合し、任意に他の生物学的化合物を除去し、任意に固相結合核酸を洗浄し、そして固相から核酸を溶出する工程;
c)亜硫酸水素イオンの存在下、溶出された核酸をインキュベートして、それにより核酸が脱アミノされる工程;
d)脱アミノされた核酸を固相に結合する工程;
e)任意に脱アミノされた固相結合核酸を洗浄する工程;
f)アルカリ条件下で脱アミノされた固相結合核酸をインキュベートして、それにより脱アミノされた核酸が脱スルホン化される工程;
g)任意に脱アミノされ、そして脱スルホン化された固相結合核酸を洗浄する工程;ならびに
h)任意に脱アミノされ、そして脱スルホン化された核酸を固相から溶出する工程;
を含み、核酸中のシトシン塩基、好ましくは複数のシトシン塩基をウラシル塩基、好ましくは複数のウラシル塩基に変換し、それにより好ましくは5−メチルシトシン塩基が有意には変換されない方法(「亜硫酸水素塩反応」または「亜硫酸水素塩処理」)が提供される。
a)核酸と他の生物学的化合物との混合物を提供する工程;
b)核酸を固相に結合し、任意に他の生物学的化合物を除去し、そして任意に固相結合核酸を洗浄する工程;
c)亜硫酸水素イオンの存在下、固相結合核酸をインキュベートして、それにより核酸が脱アミノされる工程;
d)任意に固相結合核酸を洗浄する工程;
e)脱アミノされた核酸を固相から溶出する工程;
f)アルカリ条件下で脱アミノされた核酸をインキュベートして、それにより脱アミノされた核酸が脱スルホン化される工程;
を含み、核酸中のシトシン塩基、好ましくは複数のシトシン塩基をウラシル塩基、好ましくは複数のウラシル塩基に変換し、それにより好ましくは、5−メチルシトシン塩基が有意には変換されない方法(「亜硫酸水素塩反応」または「亜硫酸水素塩処理」)が提供される。
1.実施例1:亜硫酸水素塩処理DNAに特異的なLC−PCRの確立
1.1 一般論
亜硫酸水素塩反応が作用し、そして非メチル化シトシンをウラシルに変換するという事実は、ポリメラーゼ連鎖反応により実証され、ここで非メチル化シトシンがウラシルに変換されている核酸配列の領域に特異的であるプライマーを使用する、すなわちプライマーのアデニン塩基は非メチル化シトシンからの亜硫酸水素塩反応生成物であるウラシルと向かい合っている。不完全な変換の場合、プライマーのアデニン塩基に対合しないシトシンがあるので、プライマーはこの領域にハイブリダイズできない。これはPCR生成物が得られるという効果を有する。
以下の実験は記載したLightCycler(登録商標)装置での記載されたPCRを亜硫酸水素塩処理DNAの評価手段として用いることができることを実証する。設計されたプライマー/プローブ組み合わせにより、亜硫酸水素塩処置の後のDNAのみで陽性の結果が得られる。亜硫酸水素塩処理DNA(この場合、亜硫酸水素塩DNAを実施例2に記載するプロトコルに従って処理した)および未処理DNAを同一の鋳型濃度(PCRあたり20ngおよび1ng)を用いて平行して増幅した。
1.3.1 マスターミックスの組成
LS FastStart DNA Master HybridizationProbe 1x、2mM MgCl2、0.5μM フォワードプライマー、0.5μM リバースプライマー、250nM ドナープローブ、250nM アクセプタープローブ、鋳型10μl、全PCR容量20μl。
変性 10分/95℃
55サイクル 95℃/10秒
65℃/10秒 −シグナル獲得
72℃/10秒 ランプ時間 20℃/秒
2.1.1 DNAの変性
メチル化されたDNA(Intergen、Serologicals Corporation, Norcross, GA, USAより提供;Cat S 7821)希釈物(30ngおよび6ng/hDNA 1000ngバックグラウンドでスパイクしたアッセイ、Rocheカタログ番号1691112;濃度あたり10複製)100μlおよび2M NaOH 12μlを混合し、そして37℃で15分間インキュベートする。
変性DNA 112μlを亜硫酸水素塩試薬(2.5M 亜硫酸水素ナトリウム、125mM ヒドロキノン、pH5.0)200μlと混合物し、50℃で16時間インキュベートする。
脱アミノDNA 312μlを結合バッファー(MagNaPure DNA単離キットI、Rocheカタログ番号3003990)600μlおよび磁性ガラス粒子溶液(MagNaPure DNA単離キットI)75μlと混合し、そして絶えず攪拌しながら室温で15分間インキュベートする。その後、磁性ガラス粒子を70% エタノール1mlで3回洗浄する。磁気選別機(Rocheカタログ番号1641794)で結合していないものを分離する。その後、90% EtOH/20mM NaOH 250μlをMGPに結合しているDNAに添加することにより脱スルホン化を行い;混合物を混合しながら室温で10分間インキュベートする。その後MGPを90% エタノールで2回洗浄する。エタノールの残りを除去するために、ふたを開けたサーモミキサー中で15分/60℃でMGPを加熱した。その後、10mM Tris/0.1mM EDTA pH7.5(15分/60℃)50μlでDNAを溶出する。溶出したDNA 10μlを次のPCR分析で用いる。
メチル化したDNA(Intergen、Serologicals Corporation, Norcross, GA, USAより提供;カタログ番号S7821)30ngおよび6ngをIntergen CpGenome DNA修飾キット(Intergen、Serologicals Corporation, Norcross, GA, USAより提供;カタログ番号S7820)の包装折り込みに記載されている方法に従って処理した(濃度あたり10複製)。溶出されたDNA 10μlを次のPCR分析に用いる。
2.4.1 マスターミックスの組成
LightCycler(登録商標) FastStart DNA Master HybridizationProbe 1x(Roche2239272)、2mM MgCl2、0.5μM フォワードプライマー、0.5μM リバースプライマー、250nM ドナープローブ、250nM アクセプタープローブ、鋳型10μl、全PCR容量20μl。
変性 10分/95℃
55サイクル 95℃/10秒
65℃/10秒 −シグナル獲得
72℃/10秒 ランプ時間 20℃/秒
MGP亜硫酸水素塩処理およびIntergen亜硫酸水素塩処理からのサンプルをLightCycler(登録商標)装置の同一の作用で平行して作用させた。
3.1 亜硫酸水素塩反応の性能
3.1.1 DNAの変性
メチル化されたDNA(Intergen、Serologicals Corporation, Norcross, GA, USAより提供;カタログ番号S7821)希釈物(50ng/アッセイ)20μl、ポリ(dA)溶液(濃度250ng/μl)4μlおよび2M NaOH 2.6μlを混合し、そして37℃で10分間インキュベートする。
変性DNA 26μlを亜硫酸水素塩試薬(2.5M 亜硫酸水素ナトリウム、125mM ハイドロキノン、pH5.0)220μlと混合し、50℃で4時間インキュベートする。
脱アミノDNA 250μlを結合バッファー(MagNaPure DNA単離キットI、Roche, Mannheim, Germany)600μlおよび磁性ガラス粒子溶液(MagNaPure DNA単離キットI、Roche, Mannheim, Germany)75μlと混合し、そして絶えず攪拌しながら室温で15分間インキュベートする。その後、磁性ガラス粒子を70% エタノール1mlで3回洗浄する。その後、90% EtOH/20mM NaOH 250μlをMGPに結合しているDNAに添加することにより脱スルホン化を行い;混合物を混合しながら室温で10分間インキュベートする。その後MGPを90% エタノールで2回洗浄し、10mM Tris/0.1mM EDTA pH7.5(7分/80℃)50μlで溶出する。
3.1.4.1 マスターミックスの組成
LightCycler(登録商標) FastStart DNA Master HybridizationProbe 1x、2mM MgCl2、0.5μM フォワードプライマー、0.5μM リバースプライマー、250nM ドナープローブ、250nM アクセプタープローブ、鋳型5μl、全PCR容量20μl。
変性 10分/95℃
55サイクル 95℃/10秒
65℃/10秒 −シグナル獲得
72℃/10秒 ランプ時間20℃/秒
4.1 DNAの変性
メチル化されたDNA(Intergen、Serologicals Corporation, Norcross, GA, USAより提供;カタログ番号S7821)希釈物(30ngおよび6ng/アッセイ、各濃度当たり10複製)100μlを2M NaOH 12μlと混合し、そして37℃で15分間インキュベートする。
変性DNA 112μlを亜硫酸水素塩試薬(2.5M 亜硫酸水素ナトリウム、125mM ハイドロキノン、pH5.0)200μlとともに絶えず混合しながら16時間/50℃でインキュベートする。
・脱アミノDNA312μlをキットからの結合バッファー200μlおよびイソプロパノール100μlと混合し、そしてガラスフリースを伴うカラムにピペッティングする。次いでカラムをエッペンドルフ・テーブルトップ遠心機で遠心分離する(1分/8000rpm)。
・その後、カラムを80% エタノール500μlで各々3回洗浄する(遠心分離10秒/12000rpm)。
・脱スルホン化のために試薬(38% エタノール/100mM NaCl/200mM NaOH)250μlをカラムに加える。5分/室温のインキュベーションの後、遠心分離1分/800rpm。
・その後、カラムを80% エタノール500μlで各々2回洗浄する(遠心分離10秒/12000rpm)。
・最後に、予め加温した(70℃)溶出バッファー(10mM Tris/0.1mM EDTA pH7.5)50μlを加えることにより結合しているDNAを溶出し、遠心分離1分/800rpm。
4.4.1 マスターミックスの組成
LightCycler(登録商標) FastStart DNA Master HybridizationProbe 1x(Roche 2239272)、2mM MgCl2、0.5μM フォワードプライマー、0.5μM リバースプライマー、250nM ドナープローブ、250nM アクセプタープローブ、鋳型10μl、全PCR容量20μl。
変性 10分/95℃
55サイクル 95℃/10秒
65℃/10秒 −シグナル獲得
72℃/10秒 ランプ時間20℃/秒
5.1 DNAのガラスフリースへの結合
DNA(hDNA(Roche)1μgおよびメチル化DNA(Intergen、Serologicals Corporation, Norcross, GA, USAより提供;カタログ番号S7821)100ngの混合物)100μlを結合バッファー(ハイピュアPCR鋳型調製キット、Rocheカタログ番号1796828)200μlおよびイソプロパノール100μlと混合物する。混合物をキットからのカラムにピペッティングする。次いでカラムをエッペンドルフ・テーブルトップ遠心機で遠心分離する(1分/8000rpm)。フリースをキットからの洗浄バッファーで2回洗浄する(洗浄工程あたり500μl)。
38% EtOH/100mM NaOH/200mM NaCl 200μlをガラスフリースにピペッティングし、室温で10分間双方をインキュベートすることにより変性をさせる。
脱アミノ溶液(6.25M 尿素/2M 亜硫酸水素ナトリウム/pH5.0)200μlを、DNAを伴うフリースにピペッティングし、続いて水浴中50℃で16時間インキュベートする。
脱スルホン化のために試薬(90% エタノール/20mM NaOH)250μlをカラムに加える。15分/室温のインキュベーションの後、カラムを1分/8000rpmで遠心分離する。その後、カラムを各々80% エタノール500μlで2回洗浄する(10秒/12000rpm遠心分離)。
最後に、予め加温した(70℃)溶出バッファー(10mM Tris/0.1mM EDTA pH7.5)50μlを加えることにより結合しているDNAを溶出し、遠心分離1分/8000rpm。
5.6.1 マスターミックスの組成
LightCycler(登録商標) FastStart DNA Master HybridizationProbe 1x(Roche 2239272)、2mM MgCl2、0.5μM フォワードプライマー、0.5μM リバースプライマー、250nM ドナープローブ、250nM アクセプタープローブ、鋳型10μl、全PCR容量20μl。
変性 10分/95℃
55サイクル 95℃/10秒
65℃/10秒 −シグナル獲得
72℃/10秒 ランプ時間20℃/秒
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Claims (21)
- 核酸が脱アミノ工程および/または脱スルホン化工程中に固相に結合されていることを特徴とする、核酸中のシトシン塩基のウラシル塩基への変換方法。
- a)核酸を固相に結合する工程、
b)亜硫酸水素イオンの存在下で固相結合核酸をインキュベートし、それにより核酸が脱アミノされる工程、
c)脱アミノ固相結合核酸を任意に洗浄する工程、
d)アルカリ条件下で脱アミノ固相結合核酸をインキュベートし、それにより脱アミノ核酸が脱スルホン化される工程、
e)脱アミノ脱スルホン化固相結合核酸を任意に洗浄する工程、および
f)固相から脱アミノ脱スルホン化核酸を任意に溶出する工程
を含む、請求項1記載の核酸中のシトシン塩基のウラシル塩基への変換方法。 - a)亜硫酸水素イオンの存在下で核酸をインキュベートし、それにより核酸が脱アミノされる工程、
b)脱アミノ核酸を固相に結合する工程、
c)脱アミノ固相結合核酸を任意に洗浄する工程、
d)アルカリ条件下で脱アミノ固相結合核酸をインキュベートし、それにより脱アミノ核酸が脱スルホン化される工程、
e)脱アミノ脱スルホン化固相結合核酸を任意に洗浄する工程、および
f)固相から脱アミノ脱スルホン化核酸を任意に溶出する工程
を含む、請求項1記載の核酸中のシトシン塩基のウラシル塩基への変換方法。 - a)核酸を固相に結合する工程、
b)亜硫酸水素イオンの存在下で固相結合核酸をインキュベートし、それにより核酸が脱アミノされる工程、
c)固相結合核酸を任意に洗浄する工程、
d)固相から脱アミノ核酸を溶出する工程、および
e)アルカリ条件下で脱アミノ核酸をインキュベートし、それにより脱アミノ核酸が脱スルホン化される工程
を含む、請求項1記載の核酸中のシトシン塩基のウラシル塩基への変換方法。 - 固相がシリカまたはガラスを含む材料であることを特徴とする請求項1〜4いずれか記載の方法。
- 固相がガラスフリースまたはガラス膜であることを特徴とする請求項1〜5いずれか記載の方法。
- 固相が磁性ガラス粒子であることを特徴とする請求項1〜5いずれか記載の方法。
- 磁性ガラス粒子が0.5μm〜5μmの平均直径を有することを特徴とする請求項7記載の方法。
- 磁性ガラス粒子が5〜500nmの直径を有する磁性物体を含むことを特徴とする請求項7または8記載の方法。
- 磁性ガラス粒子が23nmの平均直径を有する磁性物体を含むことを特徴とする請求項9記載の方法。
- 磁性ガラス粒子がゾル−ゲル法により製造されることを特徴とする請求項7〜10いずれか記載の方法。
- 前記ゾル−ゲル法が
a)ゾル中で磁性物体を懸濁する工程、
b)該ゾルを加水分解して磁性物体をゲルで覆う工程、
c)ツーノズル噴霧乾燥機中でゲルで覆われた磁性物体を噴霧乾燥する工程、および
d)噴霧乾燥粉末を焼結して磁性物体を覆うゲルからガラスを形成する工程
を含む、請求項11記載の方法。 - 核酸中のシトシン塩基が亜硫酸水素イオンの存在下でウラシル塩基に変換される反応の脱アミノ工程および/または脱スルホン化工程における固相の使用。
- 固相がシリカまたはガラスを含む材料である請求項13記載の使用。
- 固相がガラスフリースまたはガラス膜である請求項13または14記載の使用。
- 固相が磁性ガラス粒子である請求項13または14記載の使用。
- 亜硫酸水素イオンを含む溶液および固相を含んでなる亜硫酸水素塩反応を実施するためのキット。
- 固相がシリカまたはガラスを含む物質である請求項17記載のキット。
- 固相がガラスフリースまたはガラス膜である請求項17または18記載のキット。
- 固相が磁性ガラス粒子である請求項17または18記載のキット。
- 核酸中のシトシン塩基が亜硫酸水素イオンの存在下でウラシル塩基に変換される反応のための請求項17〜20いずれか記載のキットの使用。
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