ES2285118T3 - Un metodo de desarrollo molecular in vitro de una funcion de proteina. - Google Patents
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Abstract
Un método para generar una secuencia de polinucleótidos o población de secuencias desde las secuencias de polinucleótido de filamento simple codificando una o más proteinas causales, el método comprende los pasos de: a) suministrar una primera población de moléculas de polinucleótidos de filamento simple, la primera y segunda poblaciones juntas constituyen los filamentos positivos y negativos de la secuencia de polinucleótidos progenitores; b) realizar una reacción para la asimilación de las primera y segunda poblaciones de moléculas de polinucleótidos de filamento simple con una exonucleasa para generar las correspondientes poblaciones de fragmentos de polinucleótidos de filamento simple; c) contactar dichos fragmentos de polinucleótidos generados desde los filamentos positivos con fragmentos generados desde los filamentos negativos; y d) amplificar los fragmentos que templan a cada otro para generar al menos una secuencia de polinucleótidos codificando una o más proteínas causales que tienen características alteradas como se comparó con una o más proteinas causales codificadas por dichos polinucleótidos progenitores. en donde, en el paso (b), al menos un parámetro de la reacción usada para asimilación de la primera población de moléculas de polinucleótidos de filamento simple es diferente del parámetro(s) equivalente(s) usado(s) en la reacción para la asimilación de la segunda población de moléculas de polinucleótidos de filamento simple.
Description
Un método de desarrollo molecular in
vitro de una función de proteína.
La presente invención describe un método para el
desarrollo molecular in vitro de una función proteica, en
particular barajando segmentos de filamentos simples de DNA
obtenidos por el uso de una nucleasa.
La función proteica puede ser modificada y
perfeccionada in vitro por una variedad de métodos, que
incluyen la clonación combinatoria de mutagénesis controlada en un
sitio (Alber et al., Nature, 5;
330(6143):41-46, 1987) (Huse et al.,
Science, 246:1275-1281, 1989; Marks et al.,
Biotechnology, 10: 779-783, 1992) y mutagénesis
aleatoria combinada con sistemas apropiados de selección (Barbas
et al., PNAS. USA, 89: 4457-4461, 1992).
El método de mutagénesis aleatoria junto con la
selección ha sido usado en un número de casos para perfeccionar la
función proteica y existen dos estrategias diferentes. Primeramente,
la aleatorización de la secuencia genética completa en combinación
con la selección de una variante proteica (mutante) con las
características deseadas, seguida por un nuevo ciclo de mutagénesis
aleatoria y selección. Este método puede entonces ser repetido
hasta que una variante proteica es encontrada la cual es considerada
óptima (Schier R. et al., J. Mol. Biol. 1996 263 (4):
551-567). Aquí, la ruta tradicional para introducir
mutaciones es por medio de la tendencia al error PCR (Leung et
al., Technique, 1: 11-15, 1989) con un índice de
mutación de aproximadamente 0.7%. En segundo lugar, las regiones
definidas del gen puede ser mutagenizada con degradaciones de bases,
que permiten índices de mutación de hasta el 100% (Griffiths et
al., EMBO. J, 13: 3245-3260, 1994; Yang et
al., J. Mol. Biol. 254: 392-403, 1995). A más
alto índice de mutación usado, más limitada la región del gen que
puede ser sometida a mutaciones.
La mutación aleatoria ha sido usada
extensivamente en el campo de la ingeniería de anticuerpos. Los
genes anticuerpos formados in vivo pueden ser clonados in
vitro (Larrick et al., Biochem. Biophys. Res. Commun.
160: 1250-1256, 1989) y las combinaciones aleatorias
de los genes que codifican la variable de genes pesados y ligeros
pueden ser sometidas a la selección (Marks et al.,
Biotechnology, 10: 779-783, 1992). Los fragmentos
de anticuerpos funcionales seleccionados pueden ser además
perfeccionados por el uso de mutagénesis aleatoria y ciclos
adicionales de selección (Schier R. et al., J. Mol. Biol.
1996 263 (4): 551-567).
La estrategia de la mutagénesis aleatoria es
seguida por la selección. Las variantes con características
interesantes pueden ser seleccionadas y las regiones de ADN mutadas
de diferentes variantes, cada cual con características
interesantes, son combinadas dentro de una secuencia de codificación
(Yang et al., J. Mol. Biol. 254: 392-403,
1995). Este es un proceso secuencial de múltiples pasos, y los
efectos sinergéticos potenciales de las diferentes mutaciones
pueden perderse, ya que ellos no están sometidos a la selección en
combinación. Así, estas dos estrategias no incluyen la mutagénesis
simultánea de regiones definidas y la selección de una combinación
de estas regiones.
Otro proceso implica el pareo combinatorio de
genes los cuales pueden ser usados para perfeccionar, por ejemplo.
laafinidad de anticuerpo (Marks et al., Biotechnology, 10:
779-783, 1992). Aquí, las tres regiones CDR en cada
gen variable están fijas y esta tecnología no permite barajar los
segmentos del gen individual en el gen por el dominio variable,
por ejemplo, incluyendo las regiones CDR, entre clones.
El concepto de barajar el DNA (Stemmer,
Nature 370: 389-391, 1994) utiliza la fragmentación
aleatoria del DNA y el ensamblaje de los fragmentos en una
secuencia de codificación funcional. En este proceso, es posible
introducir secuencias de DNA sintetizadas químicamente y de esta
manera la variación objetivo para definir los lugares en el gen
cuya secuencia DNA es conocida (Crameri et al.,
Biotechniques, 18: 194-196, 1995). Stemmer y
colaboradores desarrollaron este método in vitro que se
asemeja al proceso de evolución normal de la proteína en la
naturaleza. El barajar el DNA genera diversidad por recombinación,
combinando mutaciones útiles de genes individuales. Ha sido
utilizado exitosamente para la evolución artificial de diferentes
proteínas, por ejemplo, enzimas y citoquinas (Chang et al.
Nature Biotech 17, 793-797, 1999; Zhang et
al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94,
4504-4509,1997; Christians et al. Nature
Biotech. 17, 259-264, 1999). Los genes son
fragmentados aleatoriamente usando ADNasa I y entonces reensamblados
por recombinación con cada otro. El material de partida puede ser o
un gen simple (mutado primero aleatoriamente usando la tendencia al
error (PCR) o secuencias homólogas que surgen naturalmente (también
llamadas barajeo de familia). La ADNasa I hidroliza el DNA
preferentemente en los sitios adyacentes a los nucleótidos
pirimidina, por lo tanto es una selección adecuada para la
fragmentación aleatoria del DNA. Sin embargo, la actividad es
dependiente de los iones Mg o Mn, los iones Mg restringen el
tamaño del fragmento a 50 bp, mientras que los iones Mn darán
tamaños de fragmentos menores que 50 bp. Por lo tanto, para obtener
todos los tamaños posibles para la recombinación el gen en cuestión
necesita ser tratado al menos dos veces con ADNasa I en presencia de
cualquiera de los dos iones diferentes, seguida por la remoción de
esos mismos iones.
Un método adicional para generar una colección
de DNA recombinante, usando fragmentos de DNA de filamento simple
unidireccional, se describe en WO 02/38757.
En teoría, es posible barajar DNA entre
cualquiera de los clones. Sin embargo, si el gen barajado
resultante debe ser funcional con respecto a expresión y actividad,
los clones a ser barajados tienen que ser preferiblemente
relacionados o hasta idénticos, con la excepción de un bajo nivel de
mutaciones aleatorias. Barajar el DNA entre clones genéticamente
diferentes producirá generalmente genes no funcionales. Sin embargo,
ha sido comprobado por la metodología ITCHY que las colecciones de
fusión inter-especie pueden ser creadas entre
fragmentos de la E. coli y los genes humanos transformilasa
ribonucleótido glicinamida, los cuales tienen solamente el 50% de
identidad en el nivel de DNA (Ostermeier et al., Nat
Biotechnol 17, 1205-9, 1999).
Una recombinación exitosa de dos genes
diferentes requiere la formación de moléculas
hetero-dobles. En algunos casos de familias
barajadas casi solamente forman homo-dúplex como
resultado de una recombinación de baja frecuencia. Este problema
puede ser dirigido por el uso de DNA de filamento simple asimilado
por ADNasa I (Kikuchi et al. Gene
243,133-137 2000).
El DNA de filamento simple puede ser obtenido
usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, las bases
biotinilatadas pueden ser usadas en las reacciones PCR en
combinación con, por ejemplo, Dynabeads (Dynal, Norway) or
AffiniTip Streptavidin Capture Micro-columns
(Genosys Biotechnologies Inc., The Woodlands, USA).
Alternativamente, el DNA de filamento simple puede ser obtenido
por la utilización de bacteriófagos que son capaces de empacar el
DNA de filamento simple (Viruses and Related Entities in Modem
Microbiology, Principles and Applications pp.
171-192, Ed. E.A. Birge, Wm. C. Brown Publishers
1992; Sambrook et al. Molecular Cloning, A laboratory manual
2nd edition. Cold Spring Habor Laboratory Press, 1989). En adición,
pueden ser usados los métodos asimétricos de PCR (ver Ejemplo
1).
La selección de enzimas con propiedades
alteradas y perfeccionadas está a menudo basada en la función real
de la enzima. Por ejemplo, el incremento de la termo estabilidad de
una enzima puede ser seleccionada por medio de la incubación de
colonias transformadas a temperaturas que causan inactivación de
tipos de enzimas descontroladas. En adición, la actividad
perfeccionada de \beta-glucosidasa puede ser
identificada por el uso de PNPG como el sustrato (Arrizubieta
et al J Biol Chem Jun 27, 2000).
La selección de proteínas funcionales desde las
colecciones moleculares ha sido revolucionada por el desarrollo de
la tecnología de exposición de bacteriofagia (Parmley et
al., Gene, 73: 305-391 1988; McCafferty et
al., Nature, 348: 552-554, 1990; Barbas et
al., PNAS. USA, 88: 7978-7982, 1991). Aquí, el
fenotipo (proteína) está directamente vinculado a su
correspondiente genotipo (DNA) y esto permite controlar la clonación
del material genético, el cual puede entonces ser sometido a
modificaciones adicionales para perfeccionar la función proteica.
La bacterofagia ha sido usada para clonar bandas funcionales de una
variedad de colecciones moleculares con hasta 1011 transformaciones
en tamaño (Griffiths et al., EMBO. J. 13:
3245-3260, 1994). De esta forma, la bacterofagia
puede ser usada para clonar directamente bandas funcionales de
colecciones moleculares, y puede ser usada para perfeccionar además
los clones originalmente seleccionados. Otro tipo de virus que han
sido usados para la expresión de superficie de colecciones de
proteínas y las selecciones de las mismas son baculovirus (Boublik
et al Biotechnol 13:1079-1084. 1995;
Mottershead et al Biochem Biophys Res Com
238:717-722, 1997; Grabherr et al
Biotechniques 22:730-735, 1997) y retrovirus
(Buchholz et al Nature Biotechnol
16:951-954, 1998).
La selección de proteínas funcionales de las
colecciones moleculares puede también ser realizada por medio de
la exposición de la superficie de la célula. También aquí, el
fenotipo está directamente vinculado a su correspondiente genotipo.
La exhibición de la superficie de la célula bacteriana ha sido usada
para, por ejemplo, el filtrado de las variantes perfeccionadas de
la celulasa carboximetil (CMCase) (Kim et al Appl Environ
Microbiol 66:788-93, 2000). Otras células que
pueden ser usadas para este propósito son las células de levadura
(Boder and Wittrup Nat. Biotechnol 15:553-557,
1997), células COS (Higuchi et al J Immunol Meth
202:193-204, 1997) y células de insectos (Granzerio
et al J Immunol Meth 203:131-139, 1997; Ernst
et al Nucleic Acids Res 26:1718-1723,
1998).
La combinación aleatoria de DNA de diferentes
clones mutados en combinación con la selección de la función
deseada es una forma más eficiente para buscar a través de espacio
de secuencia comparada a la selección secuencial y combinación de
los clones seleccionados.
La presente invención busca facilitar métodos
perfeccionados para el desarrollo in vitro de la proteína.
En particular, la invención apunta a facilitar una más eficiente
recombinación y métodos de barajar, los cuales darán lugar a más
moléculas alteradas y por ello mejorar la probabilidad de encontrar
moléculas con las propiedades deseables.
De acuerdo a un primer aspecto de la presente
invención, se ha facilitado un método para la generación de una
secuencia polinucleótida o una población de secuencias de secuencias
progenitoras polinucleótidas de filamento simple (ss) codificando
una o más proteínas causales, que comprende los pasos de:
a) facilitar una primera población de moléculas
polinucleótidas de filamento simple y una segunda población de
moléculas polinucleótidas de filamento simple, la primera y la
segunda poblaciones juntas constituyen filamentos positivos y
negativos de las secuencias polinucleótidas progenitoras;
b) llevar a cabo una reacción para asimilar la
primera y la segunda poblaciones de moléculas polinucleótidas de
filamento simple con una exonucleasa para generar las
correspondientes poblaciones de fragmentos de polinucleótidos de
filamento simple;
c) conectar dichos fragmentos generados desde
los filamentos positivos con los fragmentos generados desde los
filamentos negativos y opcionalmente, adicionar las secuencias bases
que se templan a los extremos 3' y 5' de al menos uno de los
polinucleótidos progenitores bajo condiciones de templado;
d) amplificar los fragmentos que se templan uno
a otro para generar al menos una secuencia polinucleótida
codificando una o más proteínas causales que tienen características
alteradas comparadas a una o más proteínas causales codificadas por
dicho polinucleótido progenitor,
en donde, en el paso (b), al menos un parámetro
de la reacción usada para la asimilación de la primera población de
moléculas polinucleótidas de filamento simple es diferente de los
parámetros equivalentes usados en la reacción para la asimilación
de la segunda población de moléculas polinucleótidas de filamento
simple.
De esta forma, la invención facilita un método
para generar una variante de polinucleótidos o una población de
variantes de las secuencias de polinucleótidos de filamento simple
progenitoras.
El uso de diferentes parámetros de la reacción
usada para la asimilación de la primera y la segunda poblaciones
de moléculas de polinucleótidos de filamento simple facilitan la
ventaja de la variabilidad incrementada en la variante de
polinucleótidos producida por el método de la invención.
Preferiblemente, las moléculas polinucleótidas
del paso (a) son moléculas de DNA.
Por "correspondientes poblaciones de
fragmentos de polinucleótidos de filamento simple" queremos
decir la población de fragmentos producidas por la asimilación de
la primera y segunda poblaciones de moléculas de polinucleótidos
de filamento simple con una exonucleasa.
Por "parámetro equivalente" queremos decir
el mismo parámetro usado en la reacción para asimilación de la otra
población de moléculas polinucleótidas de filamento simple. Por
ejemplo, la exonucleasa usada para la asimilación de la primera
población de moléculas de polinucleótidos de filamento simple puede
diferir de la exonucleasa usada para la asimilación de la segunda
población de moléculas de polinucleótidos de filamento simple.
Por "exonucleasa" queremos decir un
polipéptido, por ejemplo, enzima o fragmento de ella, que tiene
actividad exonucleótica. Preferiblemente, la actividad
exonucleótica del polipéptido es mayor que la actividad
endonucleótica del polipéptido. Más preferiblemente, el polipéptido
tiene actividad exonucleótica pero es substancialmente libre de
actividad endonucleótica.
Ventajosamente, el parámetro de la reacción de
asimilación que difiere es seleccionado del tipo exonucleasa, de
la concentración de exonucleasa, del volumen de reacción, de la
duración de la reacción de asimilación, de la temperatura de la
mezcla de reacción, del pH de la mezcla de reacción, de la longitud
de las secuencias de los polinucleótidos de filamento simple de los
progenitores, de la cantidad de moléculas polinucleótidas de
filamento simple y de la composición de amortiguación de la mezcla
de reacción.
En una realización preferida del método del
primer aspecto de la invención, la exonucleasa usada para la
asimilación de la primera población de moléculas de polinucleótidos
de filamento simple es diferente de la exonucleasa usada para la
asimilación de la segunda población de moléculas de polinucleótidos
de filamento simple. Preferiblemente, la exonucleasa usada para la
asimilación de la primera población de moléculas de polinucleótidos
de filamento simple es una exonucleasa 3' (o sea el cual
preferencialmente o exclusivamente remueve nucleótidos del terminal
3' de polinucleótidos ss) y la exonucleasa usada para la asimilación
de la segunda población de moléculas polinucleótidas de filamento
simple es una exonucleasa 5' (o sea la cual preferencialmente o
exclusivamente remueve nucleótidos del terminal 5' de los
polinucleótidos ss).
En una realización ulterior del método del
primer aspecto de la invención, la concentración de exonucleasa
usada para la asimilación de la primera población de moléculas de
polinucleótidos de filamento simple es diferente de la
concentración de exonucleasa usada para la asimilación de la segunda
población de moléculas de polinucleótidos de filamento simple.
En una realización ulterior del método del
primer aspecto de la invención, el volumen de reacción usado para
la asimilación de la primera población de moléculas de
polinucleótidos de filamento simple es diferente del volumen de
reacción usado para la asimilación de la segunda población de
moléculas de polinucleótidos de filamento
simple.
simple.
En una realización ulterior del método del
primer aspecto de la invención, la duración de la reacción de
asimilación usada para la asimilación de la primera población de
moléculas de polinucleótidos de filamento simple es diferente de la
duración de la reacción de asimilación usada para la asimilación de
la segunda población de moléculas de polinucleótidos de filamento
simple.
En una realización ulterior del método del
primer aspecto de la invención, la temperatura de la mezcla de
reacción usada para la asimilación de la primera población de
moléculas de polinucleótidos de filamento simple es diferente de la
temperatura de la mezcla de reacción usada para la asimilación de la
segunda población de moléculas de polinucleótidos de filamento
simple.
En una realización ulterior del método del
primer aspecto de la invención, el pH de la mezcla de reacción
usada para la asimilación de la primera población de moléculas de
polinucleótidos de filamento simple es diferente del pH de la
mezcla de reacción usada para la asimilación de la segunda población
de moléculas de polinucleótidos de filamento simple.
En una realización ulterior del método del
primer aspecto de la invención, la longitud de los polinucleótidos
de la primera población de moléculas de polinucleótidos de
filamento simple es diferente de la longitud de la segunda
población de polinucleótidos de filamento simple.
En una realización del método del primer aspecto
de la invención, la composición de amortiguación de la mezcla de
reacción usada para la asimilación de la primera población de
moléculas de polinucleótidos de filamento simple es diferente de la
composición de amortiguación de la mezcla de reacción usada para
la asimilación de la segunda población de moléculas de
polinucleótidos de filamento simple.
En una realización ulterior del método del
primer aspecto de la invención, la cantidad de moléculas de
polinucleótidos de filamento simple en la primera población de
moléculas de filamento simple es diferente de la cantidad de
moléculas de polinucleótidos de filamento simple en la segunda
población de moléculas de polinucleótidos de filamento simple.
En una realización ulterior del método del
primer aspecto de la invención, la primera población de moléculas
de polinucleótidos de filamento simple constituye los filamentos
positivos de la secuencia de polinucleótidos progenitores y la
segunda población de moléculas de polinucleótidos de filamentos
simples constituye los filamentos negativos de la secuencia de
polinucleótidos progenitores.
Convenientemente, el paso c) además comprende el
engrosamiento de las primeras secuencias que se templan a las
terminaciones 3' y/o 5' de al menos uno de los polinucleótidos
progenitores bajo condiciones de templado.
De esa manera, la invención facilita un método
para combinar fragmentos de polinucleótidos para generar una
secuencia de polinucleótidos o poblaciones de secuencias de las
características deseadas, cuyo método comprende los pasos de:
a) la asimilación lineal de un polinucleótido de
filamento simple progenitor codificando una o más proteínas
causales con una nucleasa distinta de la ADNasa I para generar una
población de fragmentos de filamento simple de variadas
longitudes;
b) el ensamblaje de una secuencia de
polinucleótidos de las secuencias derivadas del paso (a).
Preferentemente el método además comprende el
paso (c) que expresa la proteína codificada resultante de la
secuencia de polinucleótidos ensamblada y d) filtrado de la
proteína para las características deseadas.
Por el control de los parámetros de la reacción
de asimilación de la exonucleasa, el tamaño de los fragmentos de
polinucleótidos puede ser controlado. La determinación de las
longitudes de los fragmentos de los polinucleótidos en esta forma
evita la necesidad de tener que proporcionar un paso más tal como la
purificación de fragmentos de la longitud deseada de un gel.
Con el propósito de generar una secuencia de
polinucleótidos de características deseadas los polinucleótidos
progenitores que codifican una o más proteínas causales pueden ser
sometidas a mutagénesis para crear una pluralidad de diferentes
derivados mutados de lo mismo. De igual modo, un polinucleótido
progenitor puede ser ya obtenido codificando una plularidad de
variantes de proteínas causales de secuencia desconocida.
La mutación aleatoria puede ser realizada por
cualquier método convencional como se describió con anterioridad,
pero un método conveniente es el de con tendencia al error
PCR.
Es preferible usar la tecnología PCR para
ensamblar los fragmentos de polinucleótidos de filamento simple en
una secuencia de polinucleótidos de filamentos dobles (ds).
La secuencia de polinucleótidos es
preferiblemente de DNA aunque puede ser usada de RNA. Para
simplificar el término polinucleótido será usado de ahora en
adelante en el texto en relación con el DNA pero se apreciará que
la presente invención es aplicable a ambos RNA y DNA.
Preferiblemente, cualquier exonucleasa que
asimile polinucleótidos desde el terminal primario 5' al terminal
primario 3', desde el terminal 3' hasta el terminal 5' o desde ambos
terminales 3' y 5' pueden ser usados. Ejemplos de exonucleasas
apropiadas que pueden ser usadas de acuerdo con la presente
invención incluyen BAL 31, exonucleasa I, exonucleasa V,
exonucleasa VII, exonucleasa T7 gen 6, bacteriófago lambda
exonucleasa y exonucleasa Rec Jf.
El uso de la nucleasa BAL 31 en el proceso de
barajar el DNA de la invención facilita un sistema rápido, fácil y
controlable. Esta enzima puede dar todos los tamaños de fragmentos
de gen y la actividad de la enzima puede ser fácilmente controlada
deteniendo la asimilación en varios puntos temporales. BAL 31 es
predominantemente una exonucleasa primaria 3' que remueve
mononucleótidos de ambos terminales 3' de los dos filamentos de un
DNA lineal. BAL 31 es también una endonucleasa; así el DNA de
filamento simple generado por la actividad de la exonucleasa
primaria 3' es degradado por la endonucleasa. La actividad de la
exonucleasa primaria 3' de la enzima trabaja alrededor de 20 veces
más eficientemente que la endonucleasa. Las concentraciones de
enzimas son por eso importantes para los fragmentos de DNA
obtenidos. La alta concentración de enzima favorece el DNA sin
puntas ya que a bajas concentraciones los terminales de DNA de
filamento simple pueden ser muy largos. BAL 31 consiste de dos
formas de la enzima cinéticamente distintas, una forma rápida (F) y
una forma lenta (S). La forma S es un producto de degradación
proteolítica de la forma F. Además, BAL 31 trabaja asincrónicamente,
generando una población de moléculas de DNA cuyos terminales han
sido resecados a varias extensiones y cuyas colas de filamento
simple varían en longitud. Ambas formas pueden actuar sobre el ssADN
en forma exonucleolítica de una manera altamente progresiva. La
dirección del ataque es desde el terminal 5', en contraste con el
modo de asimilación del DNA doble. Ha sido sugerido que las
moléculas de nucleasa son no productivamente separadas de los
terminales 5' y experimentan una difusión facilitada y para producir
complejos de sustratos de enzimas (Lu T and Gray jr. HB Biochimica
et Biophysica Acta 1995, vol. 1251, p125-138). La
enzima usa Ca^{2+} como un cofactor que puede ser ligado en un
compuesto con EGTA (Ethylene Glycol bis
(\beta-amino ethyl Ether) N,N,N',N' - ácido tetra
acético). Las secuencias de DNA lineal son asimiladas con BAL31 y la
reacción detenida a diferentes puntos temporales por la adición de
EGTA.
Los fragmentos individuales asimilados son
purificados, mezclados y reensamblados con tecnología PCR. El gen
ensamblado (reconstituido) puede ser entonces clonado en un vector
de expresión para expresar la proteína. La proteína puede entonces
ser analizada para mejorar las características.
El método de la presente invención facilita
varias ventajas sobre las técnicas de barajar conocidas, incluyendo
índices incrementados de recombinación, variablidad incrementada y
control del tamaño del fragmento.
El método de la presente invención produce un
conjunto de fragmentos de DNA progresivamente acortados para cada
punto temporal en que una muestra de DNA es tomada del tratamiento
BAL 31. Las muestras de DNA pueden ser recolectadas y combinadas u,
opcionalmente, las muestras individuales pueden ser seleccionadas y
usadas en el método. De esta forma la presente invención permite
una selección de cuáles muestras serán usadas en el sistema de
recombinación y por ello ofrece un adicional grado de control.
El método de la presente invención puede ser
realizado sobre cualquier polinucleótido que codifique para un
producto particular, por ejemplo cualquier proteína que tenga
propiedades de enlace o catalíticas por ejemplo, anticuerpos o
partes de anticuerpos, enzimas o receptores. Además, cualquier
polinucleótido que tiene una función que puede ser alterada, tal
como el DNA catalítico, puede ser barajado de acuerdo a la presente
invención. Es preferible que el polinucleótido progenitor que
codifica una o más proteínas causales sea de al menos 12
nucleótidos en longitud, más preferiblemente de más de 50
nucleótidos en longitud. Los polinucleótidos que sean de al menos
de 100 nucleótidos en longitud o incluso de al menos 200 nucleótidos
en longitud pueden ser usados. Donde los polinucleótidos
progenitores son usados que codifiquen proteínas extensas tales como
las enzimas o los anticuerpos, estos pueden ser muchos cientos o
miles de bases en longitud. La presente invención puede ser
realizada sobre cualquier tamaño de polinucleótido progenitor.
La presente invención también suministra
secuencias de polinucleótidos generadas por el método descrito
anteriormente que tienen las características deseadas. Estas
secuencias pueden ser usadas para la generación de vectores de
terapia de gen y la replicación de constructores de gen defectuoso o
vectores de vacunación para vacunaciones basadas en DNA. Además,
las secuencias de polinucleótidos pueden ser usadas como
herramientas de investigación.
La presente invención también suministra una
colección de secuencias de polinucleótidos generadas por el método
descrito anteriormente desde el cual un polinucleótido puede ser
seleccionado el cual codifica una proteína que tiene las
características deseadas. Es preferible que la colección de
polinucleótidos sea una colección de DNA o cDNA.
La presente invención también suministra
proteínas tales como enzimas, anticuerpos, y receptores que tienen
características diferentes a aquéllas de tipo descontrolado
producidas por el método descrito anteriormente. Estas proteínas
pueden ser usadas individualmente o dentro de un portador
farmacéuticamente aceptable como las vacunas o medicamentos para
terapia, por ejemplo, como los inmunógenos, los antígenos o en caso
contrario en la obtención de anticuerpos específicos. Ellos pueden
ser usados también como herramientas de investigación.
Las características deseadas de un
polinucleótido generado por la presente invención o una proteína
codificada por un polinucleótido generado por la presente invención
pueden ser cualquier variación o alteración en la actividad normal
de un polinucleótido de tipo descontrolado (progenitor) o el
polipéptido, la proteína, o las proteínas causales que codifica.
Por ejemplo, puede ser deseable reducir o incrementar la actividad
catalítica de una enzima, o mejorar o reducir la especificidad de
enlace de un anticuerpo. Además, si la proteína o el polinucleótido
es un inmunógeno, puede ser deseable reducir o incrementar su
habilidad para obtener anticuerpos específicos contra él.
El polinucleótido progenitor preferiblemente
codifica una o más proteínas causales. Éstas son definidas como
regiones o elementos de secuencia polinucleótida que codifican una
secuencia polipéptida (o sea, amino ácido) la cual tiene, o
potencialmente tiene, función proteica característica. Por ejemplo,
una proteína causal puede definir una porción de una proteína
completa, tales como un epitope, un sitio de hendidura o un sitio
catalítico, etc. Sin embargo, dentro del alcance de la presente
invención, una proteína causal expresada no tiene que mostrar
actividad, o ser "correctamente" duplicada.
Varias bases de datos explorables de proteínas
causales y potenciales proteínas causales están disponibles, tales
como MOTIF, PROSITE, SMART y BLOCKS
(www.blocks.fhcrc.org).
Puede ser deseable modificar una proteína así
como alterar la conformación de ciertos epitopes, de ese modo
mejorando su antigenicidad y/o reduciendo su reactividad cruzada.
Por ejemplo, debería tal proteína ser usada como un antígeno, la
modificación puede reducir cualquier reacción cruzada de anticuerpos
surgidos con proteínas similares.
Aunque el término "enzima" es usado, este
debe ser interpretado como también incluyendo cualquier polipéptido
que tenga actividad como enzima, o sea, una función catalítica. Por
ejemplo, los polipéptidos que forman parte de una enzima pueden
todavía poseer función catalítica. Además, las proteínas tales como
el interferón y las citoquinas están incluidas. De igual modo, el
término "anticuerpo" debe ser interpretado como cubriendo
cualquier sustancia aglutinante que tiene un dominio aglutinante
con la especificidad requerida. Esto incluye fragmentos de
anticuerpos, derivados, equivalentes funcionales y homólogos de
anticuerpos, incluyendo moléculas sintéticas y moléculas cuyas
formas semejan esas de anticuerpo habilitándolas para enlazar un
antígeno o epitope. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo, capaces
de enlazar un antígeno u otra pareja de enlace son los fragmentos
Fab que consisten de los dominios VL, VH, Cl y CH1, el fragmento Fd
que consiste de los dominios VH y CH1; el fragmento Fv que consiste
de los dominios VL y VH de un brazo simple de un anticuerpo; el
fragmento dAb el cual consiste del dominio VH; las regiones
aisladas CDR y fragmentos F(ab')2, un fragmento bivalente
que incluye dos fragmentos Fab enlazados por un puente de disulfida
en la región de vínculo. Fragmentos Fv de cadena simple están
también incluidos.
Con el objeto de obtener expresiones de la
secuencia polinucleótida generada, la secuencia puede ser
incorporada en un vector que tiene secuencias de control
operablemente enlazadas a la secuencia polinucleótida para controlar
su expresión. Los vectores pueden incluir otras secuencias tales
como promotoras o aceleradores para conducir la expresión de la
secuencia polinucleótida insertada, ulteriores secuencias
polinucleótidas de tal forma que la proteína codificada por el
polinucleótido es producida como una fusión y/o señales de secreción
codificadora de ácido nucleico de tal forma que la proteína
producida en la célula hospedera es secretada desde la célula. La
proteína codificada por la secuencia polinucleótida puede ser
entonces obtenida por la transformación de los vectores dentro de
las células hospederas en las cuales el vector es funcional,
cultivando las células hospederas de modo que la proteína es
producida y recuperando la proteína de las células hospederas o del
medio circundante. Las células procarióticas y eucarióticas son
usadas para este propósito en la técnica, incluyendo cadenas de
E. coli, levadura, y células eucarióticas tales como las
células COS o CHO. La selección de la célula hospedera puede ser
usada para controlar las propiedades de la proteína expresada en
esas células, por ejemplo, controlando donde la proteína es
depositada en las células hospederas o afectando propiedades tales
como su gicosilación.
La proteína codificada por la secuencia de
polinucleótidos puede ser expresada por métodos bien conocidos en
la técnica. Convenientemente, la expresión puede ser obtenida por el
crecimiento de una célula hospedera en cultivo, que contiene tal
vector, bajo condiciones apropiadas la cual causa o permite la
expresión de la proteína.
Los sistemas para clonación y expresión de una
proteína en una variedad de diferentes células hospederas son bien
conocidos. Las células hospederas adecuadas incluyen bacterias,
células eucarióticas tales como las mamíferas y levaduras, y
sistemas de baculovirus. También, la utilización del sistema de
retrovirus para la clonación y expresión es una buena alternativa,
ya que este virus puede ser usado junto con un número de tipos de
células. Las líneas de células de mamíferos disponibles en la
técnica para expresión de un polipéptido heterólogo incluye
células de ovarios de hamsters chinos, células HeLa, células de
riñón de crías de hamster, células COS y muchas otras. Un común,
preferido hospedero bacterial es E. coli.
Los vectores adecuados pueden ser escogidos o
construidos, conteniendo las apropiadas secuencias regulatorias,
incluyendo secuencias promotoras, fragmentos exterminadores,
secuencias de poliadenilación, secuencias aceleradoras, genes
marcadores y otras secuencias apropiadas. Para más detalles ver, por
ejemplo, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 3rd edition,
Sambrook and Russell, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Muchas técnicas conocidas y protocolos para la manipulación de
secuencias polinucleótidas, por ejemplo, en la preparación de
construcciones polinucleótidas, mutagénesis, secuenciación,
introducción de DNA dentro de las células y expresión de gen, y el
análisis de proteínas, son descritos en detalle en Current Protocols
in Molecular Biology, Ausubel et al. eds., John Wiley &
Sons, 1992.
El sistema puede ser usado para la creación de
colecciones de DNA que abarcan secuencias variables las cuales
pueden ser filtradas para la función proteica deseada en un número
de maneras. La función enzima puede ser filtrada para con métodos
específicos para la función enzima real por ejemplo, actividad
CMCase, actividad \beta-glucosidasa, y también
termoestabilidad. Además, la exhibición de bacteriófago y la
exhibición de la superficie de la célula pueden ser usadas para
filtrar por la función enzima (Crameri A. et al., Nature
1998 15; 391 (6664): 288-291; Zhang J. H. et
al., PNAS. USA 1997 94 (9): 4504-4509; Warren
M.S. et al., Biochemistry 1996, 9; 35(27):
8855-8862; Kim et al., Appl Environ Microbiol
66:788-93, 2000) así como por las propiedades de
enlace alteradas de, por ejemplo, de anticuerpos(Griffith
et al., EMBO J. 113: 3245-3260, 1994).
Una proteína suministrada por la presente
invención puede ser usada en el filtrado de moléculas que afectan o
modulan su actividad o función. Tales moléculas pueden ser útiles
en un contexto (posiblemente incluyendo profiláctico)
terapéutico.
La presente invención también suministra
vectores que abarcan secuencias polinucleótidas generadas por el
método descrito anteriormente.
La presente invención también suministra
composiciones que abarcan cualesquiera secuencias polinucleótidas,
vectores que abarcan secuencias polinucleótidas o proteínas
generadas por el método descrito anteriormente y un portador
aceptable farmacéuticamente o un portador adecuado para propósitos
de investigación.
La presente invención además suministra un
método que abarca, siguiendo la identificación del polinucleótido o
polipéptido que tiene las características deseadas por el método
descrito anteriormente, la fabricación de ese polipéptido o
polinucleótido completo o en parte, opcionalmente en conjunto con
polipéptidos o polinucleótidos adicionales.
De esta manera, un aspecto adicional de la
invención suministra un método de creación de un polipéptido que
tiene las propiedades deseadas, el método abarca los siguientes
pasos:
(a) la generación de formas variantes de un
polinucleótido progenitor usando un método de acuerdo al primer
aspecto de la invención;
(b) la expresión de los polinucleótidos
variantes producidos en el paso (a) para producir polipéptidos
variantes;
(c) el filtrado de polipéptidos variantes para
las propiedades deseadas y
(d) la selección de un polipéptido que tiene las
propiedades deseadas de polipéptidos variantes.
La invención además suministra un polipéptido
obtenido por el método anterior.
Siguiendo la identificación de un
polinucleótido o polipéptido que tiene las características deseadas,
éstos pueden ser creados para suministrar mayores números por las
bien conocidas técnicas tales como PCR, clonación y expresión
dentro de una célula hospedera.
Los polipéptidos o polinucleótidos resultantes
pueden ser usados en la preparación de enzimas industriales, por
ejemplo, enzimas detergentes de lavandería donde una actividad
incrementada es preferible a bajas temperaturas. Alternativamente,
el polinucleótido o polipéptido creado puede ser usado como una
herramienta de investigación, o sea, los anticuerpos pueden ser
usados en inmunoensayos, y los polinucleótidos pueden ser usados
como sensores de hibridización o bases. Alternativamente, los
polipéptidos o polinucleótidos resultantes pueden ser usados en la
preparación de medicamentos para uso diagnóstico, el uso
farmacéutico, la terapia, etc., como es abordado como sigue.
Los polipéptidos o polinucleótidos generados por
los métodos de la invención e identificados como que tienen las
características deseables pueden ser formulados en composiciones
farmacéuticas. Estas composiciones pueden abarcar, además de una de
las sustancias anteriores, un excipiente aceptable
farmacéuticamente, un portador, un amortiguador, un estabilizador u
otros materiales bien conocidos por aquéllos expertos en la técnica.
Tales materiales deben ser no tóxicos y no deben interferir con la
eficacia del ingrediente activo. La naturaleza precisa del portador
u otro material puede depender de la ruta de administración, por
ejemplo, las rutas oral, intravenosa, cutánea o subcutánea, nasal,
intramuscular e intraperitoneal.
Las composiciones farmacéuticas para la
administración oral pueden ser en tableta, cápsula, forma de polvo
o líquida. Una tableta puede incluir un portador sólido tal como la
gelatina o un ayudante. Las composiciones farmacéuticas líquidas
generalmente incluyen un portador líquido tal como el agua, el
petróleo, los aceites animales o vegetales, el aceite mineral o el
aceite sintético. La solución salina fisiológica, la dextrosa u
otra solución sacárida o los glicoles tales como el etilen glicol,
el propilen glicol o el polietilen glicol pueden ser incluidos.
Para la inyección intravenosa, cutánea o
subcutánea, o la inyección en el sitio de la afección, el
ingrediente activo será en forma de una solución acuosa aceptable
parenteralmente la cual está libre de pirógeno y tiene pH,
isotonicidad y estabilidad aceptables. Aquellos relevantes expertos
en la técnica están bien capacitados para preparar soluciones
adecuadas usando, por ejemplo, vehículos isotónicos tales como la
Inyección de Cloruro de Sodio, la Inyección Ringer, la Inyección
Lactato de Ringer. Los preservativos, los estabilizadores, los
amortiguadores, los antioxidantes y/o otros aditivos pueden ser
incluidos como se requieran.
De esta forma, la invención además suministra un
polipéptido producido por los métodos de la invención para uso en
medicina y el uso suministra un polipéptido producido por los
métodos de la invención en la preparación de un medicamento para
uso en el tratamiento, la terapia y/o el diagnóstico de una
enfermedad.
Si es un polipéptido, por ejemplo, un anticuerpo
o un fragmento del mismo, una enzima, un polinucleótido, o una
molécula de ácido nucleico, identificado siguiendo la generación por
la presente invención que es para ser dado a un individuo, la
administración es preferiblemente en una "cantidad efectiva
profilácticamente" o en una "cantidad efectiva
terapéuticamente" (como el caso puede ser, aunque la profilaxis
puede ser considerada terapia), siendo esto suficiente para
evidenciar beneficio al individuo. La cantidad real administrada, y
el índice y el tiempo de curso de la administración, dependerán de
la naturaleza y la severidad de lo que está siendo tratado. La
prescripción del tratamiento, por ejemplo, las decisiones de la
dosificación, etc., están dentro de la responsabilidad de los
médicos generales y otros doctores en medicina, y típicamente toman
en cuenta la enfermedad a ser tratada, la condición del paciente
individual, el sitio de entrega, el método de administración y
otros factores conocidos por los médicos. Ejemplos de las técnicas
y protocolos mencionados anteriormente pueden ser encontrados en
Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed),
1980.
Alternativamente, las terapias de objetivo
pueden ser usadas para entregar el agente activo más específicamente
a ciertos tipos de células, por el uso de sistemas destinados tales
como el anticuerpo o las coordinaciones específicas celulares. El
objetivo puede ser deseable por una variedad de razones, por
ejemplo, si el agente es inaceptablemente tóxico, o si de otra
forma requeriría una dosificación demasiado alta, o si de otra forma
no sería capaz de entrar en las células objetivo.
En vez de administrar estos agentes
directamente, ellos podrían ser producidos en las células objetivo
por expresión desde un gen codificado introducido en las células,
por ejemplo, en un vector viral (una variante de la técnica VDEPT,
o sea, el agente activante, por ejemplo, una enzima, es producida en
un vector por expresión desde una codificación de DNA en un vector
viral). El vector puede ser destinado a las células específicas
para ser tratadas, o podría contener elementos regulatorios los
cuales son intercambiados con más o menos selectividad por las
células objetivo.
Alternativamente, el agente podría ser
administrado en una forma precursora, para la conversión a la forma
activa por un agente activante producido en, o destinado a, las
células a ser tratadas. Este tipo de aproximación es a veces
conocido como ADEPT o VDEPT; la antigua implica destinar el agente
activante a las células por la conjugación a un anticuerpo celular
específico, mientras que la más reciente implica la producción del
agente activante, por ejemplo, una enzima, en un vector por
expresión desde la codificación de DNA en un vector viral (ver por
ejemplo, EP-A-415731 y WO
90/07936).
Una composición puede ser administrada sola o en
combinación con otros tratamientos, ambos simultáneamente o
secuencialmente en dependencia de la condición a ser tratada.
Como una alternativa adicional, el
polinucleótido identificado como que tiene las características
deseables siguiendo la generación por el método de la presente
invención podría ser usado en un método de terapia de gen, para
tratar a un paciente que no es capaz de sintetizar el polipéptido
activo codificado por el polinucleótido o no es capaz de
sintetizarlo a un nivel normal, por esa razón causando el efecto
deparado por la proteína de tipo descontrolado.
Vectores tales como vectores virales han sido
usados en la técnica anterior para introducir polinucleótidos
dentro una amplia variedad de diferentes células objetivo.
Típicamente los vectores son expuestos a las células objetivo de
modo tal que la transfección puede tomar lugar en una proporción de
células para suministrar una terapéutica útil o efecto profiláctico
desde la expresión del polipéptido deseado. El ácido nucleico
transfectado puede ser permanentemente incorporado dentro del
genoma de cada célula tumoral objetivo, causando un efecto
duradero, o alternativamente el tratamiento puede tener que ser
repetido periódicamente.
Una variedad de vectores, tanto vectores virales
como vectores plásmidos, son conocidos en la técnica, ver US Patent
No. 5,252,479 y WO93/07282. En particular, un número de virus han
sido usados como vectores de transferencia de gen, incluyendo
papovavirus, tales como el SV40, el vaccinia virus, el herpes virus,
incluyendo HSV y EBV, y el retrovirus. Muchos protocolos de terapia
de genes en la técnica anterior han usado los retrovirus
murina
deshabilitados.
deshabilitados.
Como una alternativa para el uso de vectores
virales los métodos conocidos de introducción de ácido nucleico
dentro de las células incluyen la electroporación, la
co-precipitación de fosfato de calcio, las técnicas
mecánicas tales como la microinyección, la trasferencia mediada por
liposomas y la incorporación directa de DNA y la transferencia de
DNA receptor-mediado.
Como se mencionó anteriormente, el propósito de
la terapia de gen usando ácido nucleico que codifica a un
polipéptido, o una porción activa del mismo, es incrementar la
cantidad de la expresión producto del ácido nucleico en las células
en las cuales el nivel de polipéptido del tipo descontrolado está
ausente o presente solamente en niveles reducidos. Tal tratamiento
puede ser terapéutico en el tratamiento de células las cuales son
ya cancerosas o profiláctico en el tratamiento de individuos
conocidos a través del filtrado que tienen una susceptibilidad
alela y por lo tanto una predisposición a, por ejemplo, el
cáncer.
La presente invención también proporciona un
equipo para generar una secuencia polinucleótida o una población de
secuencias de características deseadas que abarcan reactivos para la
preparación de ssADN, una exonucleasa y componentes para realizar
una técnica PCR, por ejemplo, DNA termoestable (nucleótidos) y
dispositivo de detención, por ejemplo, EGTA.
Como se esbozó anteriormente la presente
invención convenientemente facilita para la creación de secuencias
de gen enzima mutado y sus combinaciones aleatorias a enzimas
funcionales que tienen características deseables. Como un ejemplo
de este aspecto de la invención, los genes enzimas son mutados por
tendencia al error PCR la cual resulta en un índice de mutación de
aproximadamente el 0.7%. El conjunto resultante de genes enzima
mutados son entonces asimilados con una exonucleasa, por ejemplo,
BAL 31, y la reacción inhibida por la adición de EGTA o por
inactivación por calor a diferentes puntos de tiempo, resultando en
un conjunto de fragmentos de DNA de diferentes tamaños. Estos
pueden ser entonces ser sometidos a reagrupación basada en PCR como
se describió anteriormente. Los fragmentos de DNA reagrupados
resultantes son entonces clonados y una colección de genes se
construye. Los clones pueden entonces ser seleccionados de esta
colección y secuenciados.
Una aplicación adicional de esta tecnología es
la generación de una población de secuencias de DNA variables la
cual pueden ser usadas para selecciones y análisis adicionales. Por
otra parte la codificación de proteínas más grandes, por ejemplo,
fragmentos de anticuerpos y enzimas, el DNA puede codificar péptidos
donde las características funcionales pueden ser usadas para el
diseño de diferentes sistemas de selección. La selección de
secuencias DNA recombinado que codifican péptidos ha sido
previamente descrita (Fisch et al., PNAS. USA 1996 Jul 23;
93 (15): 7761-7766). Además, la población variable
de DNA puede ser usada para producir una población de moléculas RNA
con, por ejemplo, actividades catalíticas. Vaish et al.,
(PNAS. USA 1998 Mar 3; 95 (5): 2158-2162)
demostraron el diseño de sistemas funcionales para la selección de
RNA catalítico y Eckstein F (Ciba Found. Symp. 1997; 209;
207-212) ha esbozado las aplicaciones del RNA
catalítico en las células. El sistema puede ser usado para la
investigación adicional a través de espacio de secuencia en la
selección de péptidos/moléculas con actividades catalíticas basadas
en las secuencias de DNA recombinado.
Los aspectos y realizaciones de la presente
invención serán ahora ilustrados, por medio del ejemplo, con
referencia a las figuras acompañantes. Los aspectos y las
realizaciones adicionales serán apreciables para los expertos en la
técnica.
La Figura 1 muestra el principio del método
desde la molécula plantilla a la molécula perfeccionada.
La Figura 2 muestra los principales pasos en la
preparación de DNA de filamento simple usando biotina.
La Figura 3 muestra los principales pasos en la
preparación de DNA de filamento simple usando bacteriófago.
La Figura 4 muestra los principales pasos para
la generación de fragmentos de DNA de filamento simple usando
tratamiento con exonucleasa.
La Figura 5 muestra los principales pasos para
el ensamblaje de fragmentos de DNA de filamento simple usando
PCR.
La Figura 6 muestra el % de recombinantes
formados que tienen una subsiguiente asimilación cruzada de dsADN
con 20 U/ml de BAL 31 para períodos variables de tiempo.
La Figura 7 muestra el % de recombinantes
formados que tienen dos subsiguientes asimilaciones cruzadas de
dsADN con 20 U/ml de BAL 31 para períodos variables de tiempo.
La Figura 8 muestra el % de recombinantes
formados que tienen una subsiguiente asimilación cruzada de ssADN
con 1.25 U/ml de BAL 31 para períodos variables de tiempo.
La Figura 9 muestra el % de recombinantes
formados que tienen dos subsiguientes asimilaciones cruzadas de
ssADN con 1.25 U/ml de BAL 31 para períodos variables de tiempo.
La Figura 10 muestra el % de recombinantes
formados que tienen una subsiguiente asimilación cruzada de ssADN
con 11 U/ml de BAL 31 para períodos variables de tiempo.
La Figura 11 muestra el % de recombinantes
formados que tienen dos subsiguientes asimilaciones cruzadas de
ssADN con 11 U/ml de BAL 31 para períodos variables de tiempo.
La Figura 12 muestra una imagen de
electroforesis en gel de agar de fragmentos generados por la
subsiguiente asimilación de 300 ng de ssADN con BAL 31 para 50
minutos (carril 1), 30 minutos (carril 2) y 10 minutos (carril 3).
El ssADN no tratado se muestra en el carril 4. Los marcadores del
peso molecular son mostrados en el carril 5.
La Figura 13 muestra los cromatogramas de gel
correspondientes para el carril 4 en la Figura 12.
La Figura 14 muestra los cromatogramas de gel
correspondientes para el carril 3 en la Figura 12.
La Figura 15 muestra los cromatogramas de gel
correspondientes para el carril 2 en la Figura 12.
La Figura 16 muestra una imagen de
electroforesis en gel de agar de fragmentos generados por la
subsiguiente asimilación de 300 ng de ADN con exonucleasa VII para
10 minutos (carril 3), 20 minutos (carril 4) y 30 minutos (carril
5).). El ssADN no tratado se muestra en el carril 2. Los marcadores
del peso molecular son mostrados en el carril 1.
La Figura 17 muestra una imagen de
electroforesis en gel de agar de fragmentos generados por la
subsiguiente asimilación de 300 ng de ADN con exonucleasa Rec Jf (9
U/mg de ssADN) para 10 minutos (carril 2), 20 minutos (carril 3) y
30 minutos (carril 4). El ssADN no tratado se muestra en el carril
1. Los marcadores del peso molecular son mostrados en el carril
5.
La Figura 18 muestra una imagen de
electroforesis en gel de agar de fragmentos generados por la
subsiguiente asimilación de 300 ng de ADN con exonucleasa Rec Jf
(36 U/mg de ssADN) para 10 minutos (carril 3), 20 minutos (carril
4) y 30 minutos (carril 5). El ssADN no tratado se muestra en el
carril 2. Los marcadores del peso molecular son mostrados en los
carriles 1 y 6.
La Figura 19 muestra una imagen de
electroforesis en gel de agar de fragmentos generados por la
subsiguiente asimilación de 300 ng de ADN con ADNasa I (0.15 U
enzima/mg de DNA). Los carriles de muestreo fueron como sigue:
- Carril 1:
- Marcadores de peso molecular
- Carril 2:
- ssADN no tratado en amortiguador de Mg
- Carril 3:
- ssADN fragmentado con ADNasa I en amortiguador de Mg
- Carril 4:
- ssADN no tratado en amortiguador Mn
- Carril 5:
- ssADN fragmentado con ADNasa I en amortiguador de Mn
- Carril 6:
- (vacío)
- Carril 7:
- (vacío)
La Figura 20 muestra una imagen de
electroforesis en gel de agar de fragmentos generados por la
subsiguiente asimilación de 300 ng de DNA con ADNasa I. Los
carriles de muestreo fueron como sigue:
- Carril 1:
- Marcadores de peso molecular
- Carril 2:
- dsDNA no tratado en amortiguador de Mg
- Carril 3:
- dsDNA no tratado en amortiguador de Mg
- Carril 4:
- ssADN no tratado (filamento anterior) en amortiguador de Mg
- Carril 5:
- ssADN no tratado (filamento anterior) en amortiguador de Mg
- Carril 6:
- ssADN no tratado (filamento posterior) en amortiguador de Mg
- Carril 7:
- ssADN no tratado (filamento posterior) en amortiguador de Mg
- Carril 8:
- dsDNA fragmentado con ADNasa I (0.24 U enzima/mg de DNA) en amortiguador de Mg
- Carril 9:
- dsDNA fragmentado con ADNasa I (1.3 U enzima/mg de DNA) en amortiguador de Mg
- Carril 10:
- ssADN no tratado (filamento anterior) con ADNasa I (0.24 U enzima/mg de DNA) en amortiguador de Mg
- Carril 11:
- ssADN no tratado (filamento anterior) con ADNasa I (1.3 U enzima/mg de DNA) en amortiguador de Mg
- Carril 12:
- ssADN no tratado (filamento posterior) con ADNasa I (0.24 U enzima/mg de DNA) en amortiguador de Mg
- Carril 13:
- ssADN no tratado (filamento posterior) con ADNasa I (1.3 U enzima/mg de DNA) en amortiguador de Mg
La Figura 21 muestra los cromatogramas de gel
correspondientes para el carril 6 en la Figura 20.
La Figura 22 muestra los cromatogramas de gel
correspondientes para el carril 12 en la Figura 20.
La Figura 23 muestra los cromatogramas de gel
correspondientes para el carril 13 en la Figura 20.
La Figura 24 muestra una imagen de
electroforesis en gel de agar de fragmentos generados por la
subsiguiente asimilación de 300 ng de DNA con nucleasa de frijol
Mung.
Los carriles de muestreo fueron como sigue:
- Carril 1:
- ssADN no tratado en amortiguador de Mg
- Carril 2:
- ssADN fragmentado con nucleasa de frijol Mung por 10 minutos
- Carril 3:
- Marcadores de peso molecular
La Figura 25 muestra el efecto de la duración de
la fragmentación sobre la frecuencia de recombinación de genes
tet-resistentes siguiendo la fragmentación de DNA de
filamento simple con (a) BAL 31, (b) Exo I, (c) T7gene 6 y (d) Exo
V combinado con Exo I.
La Figura 26 muestra el porcentaje de múltiples
cruzamientos generados después del tratamiento con diferentes
exonucleasas. La frecuencia de recombinación fue evaluada para a)
Exo I tratado ssADN, b) Exo I (10 min tratado ssADN combinado con
Exo VII tratado DNA, c) Exo I (10 min tratado ssADN combinado con
Exo VII tratado ssADN, y d) Exo I (10 min) tratado ssADN combinado
con Exo V y Exo VII tratado ssADN.
La Figura 27 muestra una comparación de los
números de recombinaciones observadas subsiguientes a las
fragmentaciones de ssADN con una exonucleasa y la fragmentación de
dsDNA con una endonucleasa.
El procedimiento de barajar el DNA puede ser
ilustrado mediante los pasos mostrados en las Figuras 1 a 5. El
gen que codifica la proteína de interés (X) en el plasmídeo
pFab5chis es usado en este ejemplo. Las mutaciones aleatorias son
introducidas por tendencia al error PCR. El DNA de filamento simple
es preparado. Esto puede ser realizado por cualesquiera de las
bases biotiniladas o por el uso de un bacteriófago capaz de
empaquetar DNA de filamento simple, como se discutió arriba. La
codificación y la decodificación de filamentos ssADN son preparadas
en diferentes reacciones (A y B). Los filamentos de ssADN de
cualesquiera reacciones son sometidas a tratamientos enzimáticos
diferentes usando, por ejemplo, BAL 31. Por la mezcla de dos
conjuntos de fragmentos de DNA de filamento simple en cantidades
equimolares el gen puede ser reensamblado en una naturaleza barajada
y en muchas versiones por el uso de dos reacciones PCR
subsecuentes, donde la primera reacción no contiene bases. Después
de clonar esta colección de genes reensamblados en pY, las
selecciones pueden realizarse para lograr la molécula de interés
perfeccionada.
Una más detallada descripción de ejemplos de la
presente invención está dada debajo.
Ejemplo
1
La polimerasa AmpliTaq® fue adquirida de
Perkin-Elmer Corp., el dNTPs de Boehringer Mannheim
Biochemica (Mannheim, Germany), y la nucleasa BAL 31 de New England
Biolabs Inc. (Beverly, USA). Todas las enzimas de restricción
fueron adquiridas de New England Biolabs Inc. (Beverly, USA). El
bromuro de etidio fue adquirido de Bio-Rad
Laboratories (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA,
USA). La ligasa T4 DNA fue adquirida de New England Biolabs Inc.
(Beverly, USA). EDTA y EGTA fueron adquiridas de Kebo Lab
(Sweden).
Todas las bases fueron diseñadas en el
laboratorio y obtenidas de Life Technologies (Täby, Sweden) y SGSDNA
(Köping, Sweden).
Todas las Reacciones en Cadena de Polimerasa
(PCR) fueron realizadas en un termociclador automático
(Perkin-Elmer Cetus 480, Norwalk, CT, USA). Las
técnicas PCR para la amplificación de ácido nucleico están descritas
en US Patent No. 4,683,195. Las referencias para el uso general de
las técnicas PCR incluyen Mullis et al., Cold Spring Harbor
Symp. Quant. Biol., 51:263, (1987), Ehrlich (ed), PCR technology,
Stockton Press, NY, 1989, Ehrlich et al., Science,
252:1643-1650, (1991), "PCR protocols; A Guide to
Methods and Applications", Eds. Innis et al., Academic
Press, New York, (1990).
Todas las construcciones han sido secuenciadas
por el uso del equipo BigDye Terminator Cycle Sequencing
(Perkin-Elmer, US Patent No. 4,683,195 Elmervill,
CA, USA). La secuenciación ha sido realizada en un Secuenciador ABI
Prism 377 DNA.
La electroforesis de agar de DNA fue realizada
con el 2% de geles de agar (AGAROSE (FMC Bioproducts, Rockland, ME,
USA)) con 0.25 \mug/ml de bromuro de etidio en un amortiguador
Tris-acetato (TAE-buffer 0.04M
Tris-acetate, 0.001M EDTA). Las muestras para la
electroforesis fueron mezcladas con un amortiguador que carga un
antiséptico filtrado compuesto de 25% de Ficoll y Bromfenólico azul
y cargado dentro de pozos en un 2% de gel de agar. La
electroforesis fue activada a 90 V por 45 minutos a menos que de
otro modo esté indicado en el amortiguador
Tris-acetato con 0.25 \mug/ml de bromuro de
etidio. Las bandas de tamaño apropiado fueron purificadas con gel
usando el Qiaquick Gel Extraction Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Germany)
cuando fue necesario. Como marcador de peso molecular estándar, la
escala de 1 kb (Gibco BRL) de marcador de peso molecular de DNA fue
usada. La concentración de DNA de los productos extraídos de gel
fueron estimados usando un espectrofotómetro.
\vskip1.000000\baselineskip
La cepa TOP10F' de Escherichia coli fue
usada como hospedero bacteriano para las transformaciones. Las
células químicamente competentes de esta cepa fueron producidas
básicamente como está descrito en Hanahan, D. 1983; Studies on
transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol.
Biol. 166: 557-580; Electrocompetent cells of this
bacterial strain were produced (Dower, W.J., J. F. Miller and C.W.
Ragsdale. 1988; High efficiency transformation of E. coli by
high voltage electroporation. Nucleic Acids Res. 16:6127).
\vskip1.000000\baselineskip
Todas las manipulaciones genéticas fueron
realizadas en pFab5cbis de acuerdo a Molecular cloning; a laboratory
manual (Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
Este vector es diseñado para albergar cualquier gen scFv insertado
entre los sitios SfiI y NotI. El sitio SfiI está localizado en el
peIB líder y el sitio NotI está localizado justo después de la
región VL, tal que el
VH-conectador-VL es insertado. En
este caso, un anticuerpo tendente a CD40 fue usado.
\vskip1.000000\baselineskip
Las dos bases biotiniladas que rodean el gen
anticuerpo de pFab5chis fueron diseñadas con las secuencias
siguientes incluyendo los sitios de restricción única designados:
base anterior 1736 SfiI:
y 1735 NotI base
posterior:
5'-TTA GAG CCT GCG GCC GCC TTG
TCA TCG TCG TCC TT
Las dos bases biotiniladas que rodean el gen
anticuerpo de pFab5chis fueron diseñadas con las secuencias
siguientes incluyendo los sitios de restricción única designados:
base anterior 1664 SfiI:
y la base posterior 1635
NotI:
5'-TTA GAG CCT GCG GCC GCC TTG
TCA TCG TCG TCC TT
\vskip1.000000\baselineskip
Las reacciones PCR estándar fueron realizadas a
25 ciclos consistiendo en el perfil siguiente: desnaturalización
(94ºC, 1 minuto), templado de base (55ºC; 1 minuto) y extensión
(72ºC, 3 minutos). Cada reacción PCR contenía 10 mM de
Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM de KCl, 1.5 mM de
MgCl_{2}, 200 \muM de dNTP, 1\muM de base anterior, 1\muM
de base posterior, 1.25 U de polimerasa DNA termoestable AmpliTaq®
(Perkin-Elmer Corp.), y 50 ng como diseño básico en
un volumen de 100 ml.
\vskip1.000000\baselineskip
Las reacciones con tendencia al error PCR fueron
realizadas en un amortiguador 10 X que contiene 500 mM de NaCl, 100
mM de Tris-HCl, pH 8.8, 5 mM de MgCl_{2}, 100
\mug de gelatina (de acuerdo con con Kuipers et al.,
Nucleic Acids Res. 1991, Aug 25;19 (16):4558 pero con una
concentración de MgCl_{2} incrementada de 2 mM a 5 mM.
Para cada 100 \mul de reacción se mezcló lo
siguiente:
dATP 5 mM | 5 \mul | |
dGTP 5 mM | 5 \mul | |
dTTP 10 mM | 10 \mul | |
dCTP 10 mM | 10 \mul | |
20 mM 3' base | 1.5 \mul | |
20 mM 5' base | 1.5 \mul | |
IOx Kuipers amortiguador | 10 \mul | |
antiséptico mp H_{2}O | 46.3 \mul |
\vskip1.000000\baselineskip
El diseño básico en el vector pFab5chis fue
añadido a una cantidad de 50 ng. 10 ml de 10 mM de MnCl_{2}
fueron añadidos y el tubo fue chequeado para que no ocurriera
ninguna precipitación de MnO_{2}. Al menos 5 Unidades de enzima
Taq fueron añadidos. La tendencia al error PCR fue realizada a las
siguientes temperaturas para 25 ciclos sin un arranque caliente:
94ºC 1', 45ºC 1', 7ºC 1', 72ºC para 7 minutos. El producto
resultante fue una tendencia al error insertada sobre la proteína de
aproximadamente 750 bp. Este inserto fue purificado con el equipo
de purificación Gibco PCR, antes del tratamiento ulterior.
\vskip1.000000\baselineskip
El fragmento de interés fue amplificado por dos
reacciones PCR separadas. Estas reacciones pueden ser PCR estándar
como está descrito arriba o tendencia al error PCR también como se
describe arriba. Las bases deben ser diseñadas tal que en una
reacción la base anterior es biotinilada y en la otra reacción la
base posterior es biotinilada. Por ejemplo, las reacciones PCR con
A) bases 1736 y 1635 y B) las bases 1664 y 1735, con el perfil
mencionado arriba fueron realizadas por 25 ciclos con anticuerpo
pFab5chis como diseño básico. Estos productos PCR producidos de
aproximadamente 750 bp donde en A el filamento superior fue
biotinilado y en B el filamento inferior fue biotinilado.
Los filamentos no biotinilados fueron
recuperados por purificación usando una matriz solidamente revestida
con estreptavidina, por ejemplo, Dynabeads. Las cuentas magnéticas
son lavadas y equilibradas con PBS/1% BSA y amortiguador B&W
conteniendo 5 mM Tris pH 7.5, 1 M de NaCl, y 0.5 mM de EGTA. 100
\mul de cada producto de PCR es mezclado con 100 \mul de
cuentas disueltas en amortiguador de 2 x B&W e incubado con
rotación a la temperatura ambiente, por 15 minutos. Los productos
PCR desligados son removidos mediante un cuidadoso lavado doble
con B&W. Los filamentos no biotinilados del DNA capturado es
extraído por desnaturalización alcalina para dejar incubar el DNA
con 25 \mul 0.1 M de NaOH por 10 minutos a la temperatura
ambiente. La solución es separada de las cuentas y neutralizadas
con 7.5 \mul 0.33 M de HCl y 2.5 \mul 1 M Tris pH 8.
\vskip1.000000\baselineskip
El fragmento de interés fue clonado dentro de
vectores bacteriófagos M 13, M13mp18 y M13mp19 usando enzimas de
restricción PstI/HinIII. El bacteriófago fue propagado usando
filamento Escherichia coli-strain TOP10F' de
acuerdo a los métodos convencionales. El filamento simple de DNA
para el filamento superior fue preparado del vector bacteriófago
M13mp18 y el filamento simple de DNA para el filamento inferior fue
preparado del vector bacteriófago M13mp19. Brevemente, 1,5 ml de un
cultivo bacteriano infectado fue centrifugado a 12 000 g durante
5 minutos a 4ºC. El flotante fue precipitado con 200 \mul al 20%
de PEG8000/2.5 M de NaCl. El bacteriófago granulado fue
resuspendido en 100 \mul de TE. 50 \mul de fenol equilibrado
con la adición de Tris-Cl (pH 8.0) y la muestra
fue puesta a girar rápido. Después de la centrifugación a 12 000 g
por 1 minuto a RT la fase superior, que contenía el DNA, fue
transferido y precipitado con etanol. El gránulo de DNA fue
disuelto en 50 \mul de TE (pH 8.0) y almacenado a -20ºC. (Sambrook
et al. Molecular Cloning, A laboratory manual 2nd edition.
Cold Spring Habor Laboratory Press. 1989, chapter 4). El DNA de
filamento simple preparado del bacterífago es circular y debe se
abierto con anterioridad al tratamiento con BAL 31. Esto puede
ser realizado con una endonucleasa capaz de dividir el DNA de
filamento simple.
\vskip1.000000\baselineskip
Los productos PCR son purificados usando una
columna giratoria para remover el exceso de bases de los PCR
previos. 150 ng de productos purificados son usados como diseño
básico en una amplificación linear realizada en 100 \mul de
amortiguador 1xGeneAmp® 10 x PCR que contiene 1.5 nM de MgCl_{2}
(Applied Biosystems), 200 nM de cada dNTP (New England BioLabs), y
10 nM de una base simple. Las condiciones de ciclo de PCR son:
desnaturalización a 94ºC por 1 minuto, 35 ciclos de 94ºC por 30
segundos, 55ºC por 30 segundos, 72ºC por 1 minuto seguidos por la
extensión a 72ºC por 7 minutos.
Los productos asimétricos PCR son separados por
tamaño desde el diseño de base filamentado sobre gel de agar al 1%
y purificados usando el equipo Qiaquick Gel Extraction (Qiagen).
Los filamentos de ssADN (que contienen
filamentos superiores e inferiores, respectivamente) fueron
sometidos a tratamiento enzimático separado usando, por ejemplo,
BAL 31. Cada reacción de asimilación contenía 0.02 \mug/\mul de
ssADN, 600 mM de NaCl, 20 mM de Tris-HCl, 12 mM de
CaCl_{2}, 12 mM de MgCl_{2}, 1 mM de EDTA pH 8.0 y BAL 31 a
varias concentraciones de enzima en el rango de
0.1-5 U/ml. Las reacciones fueron incubadas a 30ºC
y las fracciones del ssADN asimiladas fueron recolectadas
secuencialmente a 10, 30, 60 y 120 segundos no más. Las reacciones
fueron detenidas por adición de EDTA y tratamiento de calor a 65ºC
por 10 minutos. Los fragmentos de ssADN fueron purificados por
extracción de fenol/cloroformo y etanol precipitado. Los ssADN son
resuspendidos en 10 mM de Tris pH 8.0.
Los patrones de asimilación fueron evaluados por
electroforesis de gel de agar al 1%.
Los fragmentos de DNA asimilados fueron
purificados por la extracción de fenol/cloroformo/isoamilo/alcohol.
50 \mul de amortiguador de fenol fueron añadidos a cada tubo de
100 \mul de la muestra junto con 50 \mul de una mezcla de
cloroformo e isoamiloalcohol (24:1). Los tubos fueron puestos a
girar rápido por 30 segundos y entonces centrifugados por 1 minuto
en una microcentrífuga a 14 000 r.p.m. La fase superior fue
entonces recogida y mezclada con 2.5 volúmenes de etanol al 99.5%
(1/10 fue de 3M de Acetato de Sodio, pH 5.2). El DNA fue
precipitado por una hora a -80ºC. El DNA fue entonces granulado por
centrifugación durante 30 minutos en una microcentrífuga a 14.000
r.p.m. Los gránulos fueron lavados una vez con etanol al 70% y
entonces vueltos a disolver en 10 \mul de agua estéril.
5 \mul de los gránulos disueltos para cada
punto de tiempo y del espacio vacío fueron mezcladas con 2.5
\mul del amortiguador de carga (25% Ficoll y Bromphenolic azul) y
cargados dentro de pozos de gel de agar al 2%. La electroforesis
de los diferentes puntos de tiempo fueron realizados como fue citado
anteriormente.
La reagrupación de los fragmentos de ssADN es
lograda por dos reacciones PCR consecutivas. La primera reacción
PCR debe contener 10 mM de Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM
de KCl, 1.5 mM de MgCl_{2}, 200 \muM de dNTP, 0.3 U de
polimerasa rotulada y 2 \mul de BAL31 de la muestra tratada, todo
en un volumen final de 25 \mul, y sometido a 5 ciclos con el
perfil siguiente: 94ºC por 1 minuto, 50ºC por 1 minuto y 72ºC por 2
minutos + 72ºC por 5 minutos. La segunda reacción PCR debe
contener 10 mM de Tris-HC1, pH 8.3, 50 mM de KCl,
1.5 mM de MgCl_{2}, 200 \muM de dNTP, 0.6 U de polimerasa
rotulada, 1 \muM de la base anterior, 1 \muM de la base
posterior y 5 \mul de muestra de la primera reacción de PCR, todo
en un volumen final de 50 \mul, y sometido a 15 ciclos con el
perfil siguiente: 94ºC por 1 minuto, 55ºC por 1 minuto y 72ºC por 2
minutes + 72ºC por 7 minutos. Los productos resultantes pueden ser
evaluados por electroforesis de gel de agar.
El fragmento reensamblado y el plásmido
pFab5chis fueron primero divididos con SfiI por medio del uso del
amortiguador NEB 2 que incluye BSA y 11 U de enzima/\mug de DNA.
La reacción fue realizada durante 4 horas a 50ºC. Después de
esto el DNA fue dividido con NotI añadiéndole amortiguador de
conversión y 6 U de enzima/\mug de DNA. Esta reacción fue
realizada a 37ºC durante toda la noche.
Las reacciones divididas fueron analizadas sobre
un gel de agar al 1%. La restricción inserción de la asimilación
mostró un producto divido de aproximadamente 750 bp. Esto se
corresponde bien con el tamaño esperado. La banda de la inserción
dividida y de plásmido fue cortada y extraída con el gel como se
describió previamente. La inserción asimilada de restricción mostró
un producto divido de alrededor de 750 bp. Esto corresponde bien
con el tamaño esperado. La banda del inserto dividido y el plásmido
fue cortada y se le extrajo el gel como se describió
previamente.
La división purificada pFab5chis fue ligada con
el fragmento asimilado de la restricción reensamblada en baño de
Maria a 12ºC por 16 horas. 50 \mul del vector fue mezclado con 50
\mul de la inserción y 15 \mul de amortiguador IOx
(suministrado con la enzima), 7.5 \mul de ligasa (5 U/\mul) y
agua estéril para un volumen final de 150 \mul. Una ligadura de
restricción asimilada pFab5chis sin ninguna inserción fue también
realizada en la misma forma.
Las reacciones de ligaduras fueron purificadas
por extracción de fenol/cloroformo como fue descrito anteriormente.
La fase superior de la extracción fue recogida y mezclada con 2.5
volúmenes de etanol al 99.5% (1/10 fue de 3 M de Acetato de Sodio,
pH 5.2). El DNA fue precipitado por 1 hora a -80ºC. El DNA fue
entonces granulado por centrifugación por 30 minutos en una
microcentrífuga a 14.000 r.p.m. El granulado fue lavado una vez
con etanol al 70% y entonces redisuelto en 10 \mul de agua
estéril. 5 \mul de cada ligadura fue separadamente mezclada con
95 \mul químicamente competente de E coli TOP10F' incubada
en hielo durante 1 hora y entonces transformada (Sambrook et
al. Molecular Cloning, A laboratory manual 2nd edition. Cold
Spring Habor Laboratory Press, 1989). Después de una hora de
crecimiento la bacteria procedente de las dos transformaciones fue
esparcida en ampicillín que contiene láminas de agar (100
\mug/ml). Las láminas fueron cultivadas boca abajo en una
incubadora a 37ºC durante
14 horas.
14 horas.
Ejemplo
2
En ulteriores experimentos comparables, tres
fragmentos de anticuerpo scFy fueron usados en experimentos de
recombinación, tanto como dsDNA o como ssADN.
Los tres genes scFv fueron cada uno amplificados
en PCR usando bases anteriores y posteriores y un procedimiento PCR
estándar El tamaño de las bandas fueron confirmados con
electroforesis de del de agar y el resto de los productos PCR
amplificados fueron purificados usando el equipo de purificación
Concert PCR (Gibco). El dsDNA de los tres scFy fue mezclado en
cantidades equimolares y tratados con BAL 31. Cada reacción de dsDNA
contenía una concentración de 0.02 \mug/\mul de volumen de
reacción de 600 mM de NaCl, 20 mM de Tris-HCl, 12 mM
de CaCl_{2}, 12 mM de MgCl_{2}, 1 mM de EDTA pH 8.0 y BAL31 a
varias concentraciones de enzimas (usando 4, 20 o 100 U enzima/ml
de volumen de reacción). Las reacciones fueron incubadas a 30ºC y
las fracciones del dsDNA fueron recogidas secuencialmente a 10, 30
y 50 minutos. Las reacciones fueron detenidas con EDTA y
tratamiento de calor (alternativamente, un protocolo de inactivación
sin calor de EDTA puede ser usado, ver más adelante) y purificadas
usando extracción de fenol/cloroformo y precipitación de etanol. Las
muestras de dsDNA fueron resuspendidas en 10 mM Tris pH 8.0.
Manteniendo cada punto de tiempo separado, las
muestras fueron sometidas a reagrupación de PCR (para esta
reagrupación 60 ng de DNA fueron usados) y amplificación de PCR de
acuerdo al protocolo, y clonadas en pGEM (Product No A362A,
Promega, Madison, USA). Dieciocho clones de cada punto de tiempo
fueron secuenciados y el número y frecuencia de las recombinaciones
fueron determinados.
Un protocolo para detener la reacción de BAL 31
sin usar EDTA ha sido establecido. Este protocolo de inactivación
por calor evita el uso de la extracción fenol/cloroformo, la cual es
dañina a la salud y también causa pérdidas de material.
En resumen, la muestra es incubada por 10
minutos a 95ºC y entonces puesta directamente en hielo, para detener
la reacción enzimática. Después de esto la muestra puede ser
directamente precipitada usando etanol.
Los tres genes scFv fueron cada uno amplificados
en dos reacciones PCR usando pares de bases anterior/biotina
posterior y biotina anterior/posterior usando el procedimiento PCR
estándar Los tamaños de las bandas fueron confirmados con
electroforesis de agar y el resto de los productos PCR amplificados
fueron purificados usando el equipo de purificación Concert PCR
(Gibco). El DNA de filamento simple fue obtenido usando cuentas
magnéticas de acuerdo con el protocolo, logrando tres filamentos
sensitivos y tres filamentos antisensitivos. El filamento sensitivo
y el filamento antisensitivo, respectivamente, de los tres scFy
fueron mezclados en cantidades equimolares y tratados con BAL 31 de
acuerdo con el protocolo (usando 1.25 o 11 U enzima/ml de volumen de
reacción y sdDNA a una concentración de 0.015 mg/ml de volumen de
reacción) y las muestras fueron retiradas a 0 (i.e. no
asimilada), 10, 30 y 50 minutos. Las reacciones fueron detenidas con
EDTA y tratamiento de calor y purificadas usando extracción
fenol/cloroformo y precipitación de etanol. Manteniendo cada punto
de tiempo separado, pero mezclando los filamentos sensitivos y
antisensitivos, las muestras fueron sometidas a PCR reagrupado (para
esta reagrupación 60 ng de DNA es usado) y amplificación PCR de
acuerdo con el protocolo, y clonados en pGEM. Dieciocho clones de
cada punto de tiempo fueron secuenciados y el número y la frecuencia
de las recombinaciones fueron determinados.
La frecuencia más alta de combinación usando el
dsDNA fue lograda usando de un volumen de reacción de 20 U de
enzima/ml (que contiene 0.02 \mug/\mul de DNA y tratado durante
10 minutos. Esta dio el 39% de los clones con un cruzamiento
(Figura 6) y el 17% de los clones con dos cruzamientos (Figura 7).
Usando 4 U de enzima/ml dio ningún cruzamiento independiente del
tiempo para la fragmentación y 100 U de enzima/ml resultaron en
completa fragmentación de muy pequeños fragmentos, como fue indicado
por el fracaso de recobrar el gen de longitud completa durante la
reagrupación.
Los resultados de los experimentos usando ssADN
son mostrados en las Figuras 8 a 10. La Figura 8 muestra 1.25 U/ml
de BAL 31 y clones con un cruzamiento, la Figura 9 muestra 1.25 U/ml
de BAL 31 y clones con dos cruzamientos. La Figura 10 muestra 11
U/ml y clones con un cruzamiento y la Figura 11 muestra 11 U/ml de
BAL 31 y clones con dos cruzamientos.
La frecuencia de recombinación más alta dando un
cruzamiento usando ssADN fue lograda usando 11 U de enzima/ml y
tratando durante 10 minutos (Figura 10). El 59% de los clones
tuvieron un cruzamiento. La frecuencia de recombinación más alta
dando dos cruzamientos usando ssADN fue lograda usando 1.25 U de
enzima/ml y tratando durante 30 minutos (Figura 9). El 20% de los
clones tuvieron dos cruzamientos.
Estos datos claramente muestran que una mayor
frecuencia de recombinación es lograda usando ssADN. Los tres scFv
usados tienen las mismas secuencias de montaje, indicando que el
número de cruzamientos reportados pueden ser superiores debido a
los cruzamientos en regiones donde ninguna diferencia de frecuencias
resultará. Estos experimentos usando ssADN fueron realizados de
manera no óptima para mostrar máxima recombinación, ya que todos
los filamentos de todas las tres moléculas fueron mezclados. La
mezcla de filamento de un scFv con el filamento antisensitivo de
otro scFv producirían frecuencias superiores de cruzamiento, ver el
Ejemplo 3 más adelante. También, cada punto de tiempo fue aquí
mantenido separado y sería lógico estimar la frecuencia de los
cruzamientos para incrementar si puntos de tiempo diferentes, por
ejemplo, diferentes tamaños de fragmentos son mezclados.
Ejemplo
3
Para investigar la homología requerida para
lograr el cruzamiento establecemos experimentos para recombinar
cuatro scFv (designados SMUC159, CT17, AE11 y MO152) hacemos tres
pares con diferentes homologías, como sigue:
SMUC159-CT17 | 92% | |
SMUC159-AE11 | 70% | |
SMUC159-MO152 | 60% |
Los cuatro genes scFv fueron cada uno
amplificados en dos reacciones PCR usando pares de bases
anterior/biotina posterior y biotina anterior/posterior usando el
procedimiento PCR estándar Los tamaños de las bandas fueron
confirmados con electroforesis de agar y el resto de los productos
PCR amplificados fueron purificados usando el equipo de
purificación Concert PCR (Gibco). El DNA de filamento simple fue
obtenido usando cuentas magnéticas de acuerdo con el protocolo,
logrando cuatro filamentos sensitivos y cuatro filamentos
antisensitivos. Cada filamento fue tratado con BAL 31 de acuerdo
con el protocolo (usando 4.2 o 12.5 U de enzima/ml) y las muestras
fueron retiradas a los 0, 10, 30 y 50 minutos, ó 0, 15, 30, 45 y 60
minutos. Las reacciones fueron detenidas con EDTA y tratamiento de
calor y purificadas usando extracción fenol/cloroformo y
precipitación de etanol. Manteniendo cada punto de tiempo separado,
pero mezclando los filamentos sensitivos y antisensitivos para
formar pares como se indica arriba, las muestras fueron sometidas al
PCR reagrupado y a la amplificación de PCR de acuerdo con el
protocolo y clonadas en pGEM. Quince clones de cada punto de tiempo
fueron secuenciados y el número y la frecuencia de las
recombinaciones fueron determinados.
Los cruzamientos fueron identificados en todas
las combinaciones de scFv, indicando que una homología tan baja
como el 60% es suficiente para lograr la recombinación.
Ejemplo
4
Usamos las exonucleasas, por ejemplo, BAL31,
exonucleasa I, exonucleasa V, exonucleasa VII, exonucleasa T7 gen
6, bacteriófago lambda exonucleasa, y exonucleasa y Rec Jf para la
fragmentación en los métodos de la presente invención. Estas
enzimas dividen un nucleótido por vez, lo mismo desde el terminal 5'
o desde el terminal 3' o desde ambos terminales. La reacción puede
ser detenida usando EDTA o inactivación por calor (ver arriba), en
dependencia de la enzima usada. Esto significa que los fragmentos de
todos los tamaños posibles, que difieren con sólo un nucleótido,
pueden ser obtenidos.
Los siguientes ejemplos demuestran cómo la
asimilación exonucleasa permite la creación de fragmentos de varios
y controlables tamaños dependiendo de las condiciones usadas.
El DNA de filamento simple fue asimilado con BAL
31 de acuerdo con el protocolo en el Ejemplo 1, con una
concentración de enzima de un volumen de reacción de 4.2 U/ml y una
concentración de ssADN de volumen de reacción de 0.008
\mug/\mul.
En un experimento típico, alrededor de 300 ng de
DNA son aislados en cada punto de tiempo del tratamiento de BAL 31.
La Figura 12 muestra una imagen de electroforesis de gel de agar de
un experimento con ssADN no tratado en el carril 4 y ssADN
tratado durante 10 minutos en el carril 3, durante 30 minutos en el
carril 2 y durante 50 minutos en el carril 1. El carril 5 es el
peso molecular estándar (MW).
Las figuras 13 y 15 muestran los
correspondientes cromatogramas de los carriles, respectivamente. La
Figura 13 es el material no tratado y los picos múltiples se
refieren a las diferentes conformaciones del ssADN. La Figura 14
corresponde al carril 3 y al material tratado durante 10 minutos. El
material fue tratado con calor para detener la reacción
enzimática, y de esa manera resolver las diferentes conformaciones,
y un pico de distinto tamaño es mostrado. La Figura 15 corresponde
al carril 2 y al material tratado durante 30 minutos.
Aquí está claro que el pico correspondiente a
los fragmentos más grandes es decreciente y un pico de fragmentos
más pequeños de DNA ha aparecido.
El DNA de filamento simple fue asimilado con
exonucleasa VII usando una concentración de enzimas de un volumen
de reacción de 7.7 U/ml y una concentración de volumen de reacción
de 0.008 \mug/\mul. La reacción de amortiguación abarca 67 mM
de fosfato de potasio (pH 7.9), 10 mM de mercaptoetanol, 6.7 mM
de MgCl_{2} y 8.3 mM de EDTA.
La reacción fue permitida para proceder a 37ºC
durante 10, 20 y 30 minutos, antes de ser detenida por inactivación
de calor (95ºC por 5 minutos).
En la Figura 16 el patrón de fragmentación
usando exonucleasa VII es mostrado. El carril 1 es estándar de MW,
el carril 2 es ssADN no tratado, el carril 3 es ssADN fragmentado,
el carril 2 es ssADN no tratado, el carril 3 es ssADN fragmentado
con exonucleasa VII por 10 minutos, el carril 4 es ssADN
fragmentado con exonucleasa VII por 20 minutos y el carril 5 es
ssADN fragmentado con exonucleasa VII por 30 minutos. Esto muestra
que los tamaños de los fragmentos son reducidos por el tiempo.
El DNA de filamento simple fue asimilado con
exonucleasa Rec Jf usando una concentración de enzima lo mismo de
una reacción de volumen de 2.5 U/ml que una reacción de volumen de
10 U/ml y ssADN a una concentración de 0.007 \mug/\mul,
correspondiendo a 0.36 U/enzima/\mug de DNA y 1.4 U/enzima/\mug,
respectivamente. La reacción de amortiguación abarca 50 mM de NaCl,
10 mM de Tris-HCl, 10 mM de MgCl_{2} y 1 mM de
ditiotreitol, a pH 7.9
La reacción fue permitida para proceder a 37ºC
durante 10, 20 y 30 minutos, antes de ser detenida por inactivación
de calor (95ºC por 5 minutos).
En la Figura 17 el patrón de fragmentación
usando exonucleasa Rec Jf a 0.36 U/\mug de ssADN es mostrado. El
carril 1 es ssADN no tratado, el carril 2 es ssADN fragmentado con
exonucleasa Rec Jf por 10 minutos, el carril 3 es ssADN fragmentado
con exonucleasa Rec Jf por 20 minutos y el carril 4 es ssADN
fragmentado con exonucleasa Rec Jf or 30 minutos. Esto muestra que
los tamaños de los fragmentos son reducidos por el tiempo. En la
Figura 18 la concentración de enzima es incrementada 4 veces (1.4
U/\mug de ssADN) y el patrón de fragmentación es mostrado de 0 a
30 minutos, mostrando un grado mayor de fragmentación como es
comparado con la Figura 17. Esto muestra que tanto el tiempo y la
concentración de enzima pueden ser usados para controlar la
fragmentación.
fragmentación.
Los métodos de barajar el DNA convencional
típicamente usan ADNasa I para la fragmentación (por ejemplo, ver
Stemmer, 1994, Nature 370:389-391). La ADNasa
I corta el DNA en una forma endonucleolítica en sitios adyacentes a
las pirimidinas. Consecuentemente, no todos los posibles tamaños de
fragmentos pueden ser obtenidos.
Por otra parte, usando magnesio en la reacción
de amortiguación, una mezcla homóloga de mono- y oligómeros es
obtenida. Por lo tanto, diferentes métodos tales como la
purificación por electroforesis de gel de agar o filtración de gel
necesitan ser usados para aislar los fragmentos de diferentes
tamaños. A menudo fragmentos de tamaño pequeño o una mezcla de
pequeños y largos fragmentos son deseados para optimizar la
recombinación. Sin embargo, estos métodos de purificación
introducen muescas en los productos PCR de filamento doble. Los
fragmentos de un particular tamaño purificados sobre un gel deberían
así consistir de dsDNA con un gran número de muescas de filamento
simple, que darían un aumento a demasiados pequeños fragmentos
generados por encima de la desnaturalización. Esto significa que
muchos de los fragmentos de filamento simple generados sobre al
desnaturalización debían ser demasiado cortos para funcionar como
bases durante el recocido, resultando en una gran pérdida de
producto.
El uso de manganeso en la reacción de
amortiguación crea fragmentos de tamaños más pequeños que 50 bp y
ningún gel de purificación es necesario. Sin embargo, aquí Ud. está
restringido a usar sólo fragmentos pequeños y estos no pueden ser
mezclados con fragmentos mayores, algo que probablemente
incrementaría la frecuencia de recombinación.
Los problemas asociados con el uso de
endonucleasas son demostrados en los siguientes experimentos:
\vskip1.000000\baselineskip
El DNA fue asimilado por 5 minutos con ADNasa I
a una concentración de 0.15 U/\mug de DNA.
Los amortiguadores de magnesio y de manganeso
fueron comparados cuando la fragmentación con ADNasa I y el
resultado son mostrados en la Figura 19. El carril 1 es MW estándar,
el carril 2 es ssADN no tratado en amortiguador de Mg, el carril 3
es ssADN fragmentado con ADNasa I en amortiguador de Mg de acuerdo
con Stemmer (1994) Nature 370:389-391, el
carril 4 es ssADN no tratado en amortiguador de Mn de acuerdo con
Kikuchi et al. (2000) Gene
243:133-137. Está claro de la Figura 19 que, cuando
se usa el amortiguador de Mg y las condiciones de acuerdo con los
artículos de Stemmer y Kikuchi, ninguna fragmentación ocurre. Por
otra parte, cuando se usa el amortiguador de Mn y las condiciones
de acuerdo con los artículos de Stemmer y Kikuchi, todo el material
es totalmente fragmentado dentro de unos pocos minutos
solamente.
En un intento de obtener fragmentos de
diferentes tamaños decidimos usar el amortiguador de Mg e
incrementar la concentración de enzimas. La Figura 20 muestra una
imagen de electroforesis de gel de agar de un tal experimento
usando ADNasa I. El carril 1 es MW estándar El carril 6 es ssADN no
tratado. El carril 12 es ssADN tratado de acuerdo con los artículos
de Stemmer and Kikuchi, usando 0.15 U/enzima/\mug de DNA y el
carril 13 es el mismo material tratado con 1 U/enzima/\mug de DNA
(por ejemplo, seis veces más enzima).
Las figuras 21 a 23 muestran los
correspondientes cromatogramas. El ssADN no tratado ha sido tratado
con calor, por esto sólo un pico aparece en la Figura 21 (indicado
por una flecha). El la Figura 22, es apreciable que el uso de una
cantidad de ADNasa I de acuerdo con los artículos de Stemmer y
Kikuchi el pico de ssADN no tratado es un tanto reducido (indicado
por una flecha) pero ningún pico distinguible es visible para el DNA
fragmentado, sólo una mancha. Usando 6 veces más enzima el ssADN no
tratado es totalmente suprimido (Figura 23) y ni aquí hay un pico
visible de los fragmentos.
\vskip1.000000\baselineskip
El DNA de filamento simple fue asimilado con
nucleasa de frijol de Mung (Product No. MO250S, New England
Biolabs) usando una concentración de enzima de ambos 0.375 U/ml de
reacción de volumen y DNA a una concentración 0.007 \mug/\mul
de reacción de volumen. La reacción de amortiguación abarca 50 nM de
acetato de sodio, 30 mM de ZnSO_{4,} a pH 5.0.
La reacción fue permitida para proceder a 25ºC
por 10 minutos, antes de ser detenida por inactivación de calor
(95ºC por 5 minutos).
La Figura 24 muestra la fragmentación usando
otra nucleasa, la nucleasa de frijol Mung. El carril 1 es el ssADN
no tratado, el carril 2 es el mismo material tratado por 10 minutos.
El carril 3 es el MW estándar
Los resultados indican que todo el DNA fue
totalmente fragmentado después de sólo 10 minutos de asimilación
con la nucleasa de frijol de Mung (ver carril 2), a pesar de usar la
enzima a una concentración inferior que aquélla recomendada por el
fabricante.
\vskip1.000000\baselineskip
Los ejemplos anteriores muestran como los
tamaños de los fragmentos pueden ser controlados usando exonucleasas
y alterando las condiciones de la reacción, por ejemplo, el
tiempo, el volumen de reacción, la concentración de enzimas. Los
diferentes picos son visualizados usando cromatogras de imagen de
gel.
En contraste, usando endonucleasas, tal como la
ADNasa I, da una reacción la cual es difícil de controlar. Usando
condiciones como las referidas en la literatura, lo mismo usando
amortiguadores que contienen Mg o Mn típicamente da una situación
cuando lo mismo todo o nada es fragmentado, ver especialmente la
Figura 20. Un experimento usando otra endonucleasa (nucleasa de
frijol de Mung) confirma estas observaciones.
\newpage
Ejemplo
5
En experimentos adicionales, el material de
inicio de DNA de filamento simple fue dividido en dos poblaciones,
las cuales fueron entonces asimiladas usando diferentes
exonucleasas.
Una variante de tetraciclina suprimida de
plásmido pBR322 fue construída por división con tratamiento SalI and
BamHI (Roche, Basel, Switzerland) Klenow (Amersham Biosciences AB,
Uppsala, Sweden) y ligazón de terminal romo (New England Biolabs,
MA, USA). El plásmido resultante fue chequeado para la sensibilidad
a la tetraciclina y es llamado pBR322dtet.
El PBR322stop1 y el pBR322stop3 fueron creados
por amplificación PCR del gen de tetraciclina pBR322 usando bases
específicas (Tabla 1). Cada gen de tetraciclina fue clonado en
pBR322.
A menos que de otra forma las reacciones PCR
notorias contenidas en 4 \muM de cada base, 160 \muM de dNTP
(Roche, Basel, Switzerland), 1x AmpliTaq de reacción amortiguadora,
2.5 U de polimerasa de DNA termoestable AmpliTaq (Applied
Biosystems, CA, USA).
FIND PCR 1: 5 o 25 ciclos de 94ºC por 30 seg,
50ºC por 45 seg, 72ºC por 1 minuto y entonces 72ºC por 7 minutos,
ningunas bases externas fueron incluidas.
FIND PCR 2: 15, 25 o 50 ciclos de 94ºC por 30
seg, 55ºC por 45 seg, 72ºC por 1 minuto y entonces 72ºC por 7
minutos con bases externas incluidas.
El gen de interés, o sea, tet-r,
fue amplificado usando bases específicas, una de las bases fue
biotinilada. El ssADN de los filamentos sensitivos y antisensitivos
fue purificado usando cuentas magnéticas de estreptavidina
(adquiridas de cualesquiera Dynal AS, Oslo, Norway o Miltenyi
Biotec, Bergisch Gladbach, Germany) de acuerdo a las
recomendaciones de los fabricantes. El ssDA por este medio obtenido
fue más adelante purificado lo mismo por precipitación de etanol o
por el uso de recochip (TaKaRa, Shiga, Japan) de acuerdo a las
recomendaciones de los fabricantes.
Los experimentos FIND fueron iniciados por la
asimilación de DNA con una exonucleasa. El DNA era de filamento
simple (preparado como lo anterior) y originado del gen resistente a
la tetraciclina (pBR322stop1 o pBR322stop3, 945 bp). La
exonucleasa era BAL 31 (0.08-1 U/\mug DNA, New
England Biolabs, MA, USA), exonucleasa I (100 U/\mug DNA, New
England Biolabs, MA, USA), T7 gen 6 exonucleasa (320 U/\mug DNA,
USB, Cleveland Ohio, USA) y exonucleasa V (12.5 U/\mug DNA, USB,
Cleveland Ohio, USA). El tiempo de asimilación estuvo en el rango
de 2 - 9 minutos. Las reacciones de asimilación fueron detenidas por
la adición de EDTA a una concentración final de 20 mM y/o
inactivación de calor a 65 o 95ºC durante 10 minutos. Cuando la EDTA
fue usada para detener la fragmentación de DNA, el DNA fue además
purificado por la extracción de fenol/cloroformo y la precipitación
de etanol. Los fragmentos fueron recombinados en una reacción FIND
PCR1 por 15, 25 o 50 ciclos. Finalmente los genes de longitud
total fueron clonados dentro de pBR322dtet por el uso de HindIII y
EagI (New England Biolabs, MA, USA) para la evaluación de la
funcionabilidad o dentro de pGEM (Promega, Madison, WI, USA) para
la secuenciación.
Los clones introducidos dentro de pBR322dtet
fueron transformados en competentes químicos E. coli TG y
colocado en placas de agar LB conteniendo 1 \mug/ml de
ampicillina. De cien a doscientos clones fueron entonces
trasladados a placas de agar LB conteniendo 50 \mug/ml de
tetraciclina y la frecuencia de clones resistentes a la
tetraciclina podría ser calculada.
Como se mostró arriba, las recombinaciones de
frecuencias superiores usando el procedimiento FIND de la presente
invención podrían ser logrados usando ssADN en la fragmentación. La
exonucleasa BAL 31 es predominantemente exonucleasa 3' que remueve
los monocucleótidos de ambos terminales 3' de dos filamentos de un
DNA de doble filamento lineal. Sin embargo BAL 31 puede también
degradar los terminales de DNA de filamento simple generados por la
actividad de la exonucleasa 3' sobre el DNA de filamento doble. La
actividad de BAL 31 sobre el ssADN es removida de los
mononucleótidos de los terminales 5' solamente. El uso de BAL 31
para la fragmentación de ssADN y entonces el reagrupamiento de los
genes de longitud total será resultado teóricamente en un
cruzamiento por gen. Los experimentos fueron por consiguiente
realizados para probar diferentes exonucleasas para la fragmentación
de ssADN. La exonucleasa I tiene actividad 3' solamente siempre que
el BAL 31, el T7gene 6 y la exonucleasa RecJ tengan solamente
actividad 5'. La exonucleasa V y la exonucleasa VII tienen actividad
desde ambos terminales (5' y 3'). Para mostrar que estas
exonucleasas pueden ser usadas en el paso de fragmentación en un
experimento FIND y produce genes funcionalmente recombinados un
sistema modelo basado en los genes resistentes a la tetraciclina
fue usado.
Fue encontrado que BAL 31 (Figura 25a) así como
la exonucleasa I (Figura 25b) y la exonucleasa T7gene 6 (Figure
25c) todas trabajan bien en el procedimiento FIND y una dependencia
sobre el tiempo de fragmentación de la frecuencia de recombinación
fue observada.
Si solamente una exonucleasa, la cual asimila
ssADN desde sólo un terminal, es usado sólo un cruzamiento puede en
teoría ser logrado. Sin embargo, fue encontrado que cruzamientos
adicionales pueden ser obtenidos en fragmentos de DNA desde el
tratamiento por diferentes exonucleasas fueron combinadas. El
tratamiento de exonucleasa V y exonucleasa VII resultará en
pequeños fragmentos sin los terminales 5' y 3'. Estos terminales son
necesarios para amplificar el material recombinado en la última
reacción PCR. Estos fragmentos de DNA pueden por esto ser
combinados con DNA asimilado desde los terminales 5' o 3'. El
resultado de tal combinación puede ser visto el la Figura 25d donde
el ssADN tratado con exonucleasa I durante 10 minutos fue combinado
con ssADN tratado con exonucleasa V durante 40 a 50 minutos. Los
clones funcionales de hasta el 40% fueron obtenidos, un resultado
que debe ser comparado a un máximo del 25% logrado en el mismo
sistema usando sólo una enzima (Figura 25a-c). Los
fragmentos son también combinados desde el tratamiento de
exonucleasa I y exonucleasa VII, y los fragmentos de la exonucleasa
T7gene 6, y los fragmentos del tratamiento de exonucleasa T7gene 6 y
exonucleasa VII, en diferentes puntos de tiempo, y clones
recombinados funcionalmente podría ser obtenidos (no se muestran
datos).
Ejemplo
6
En un conjunto de experimentos separados,
múltiples cruzamientos fueron producidos por la combinación de
fragmentos obtenidos por la asimilación de DNA de filamento simple
con exonucleasa I con fragmento obtenido por la asimilación de
exonucleasa V DNA de filamento simple y/o exonucleasa VII.
La exonucleasa I (Exo I) tiene sólo actividad 3'
mientras que la exonucleasa V (Exo V) y la exonucleasa VII (Exo
VII) tienen actividad desde ambos terminales (5' y 3'). Por lo
tanto, los tratamientos de la Exo V y de la Exo VII resultarán en
pequeños fragmentos sin los terminales 5' y 3'. Estos terminales
son necesarios para amplificar el material recombinado en la última
reacción PCR. Estos fragmentos de DNA pueden por tanto ser
combinados con DNA asimilado desde los terminales 5' y 3'
solamente.
Una mezcla equimolar de los tres genes scFv fue
usada en la fragmentación con Exo I, Exo V y Exo VII. Diferentes
combinaciones de material fragmentado fue mezclado y reensamblado
con PCR dentro de los genes de longitud completa y finalmente
secuenciados (Figura 26a-d). Exo I se comportó
similar a BAL 31 con hasta el 40 de clones con una recombinación
(Figure 26a). La combinación de Exo I con Exo V o Exo VII incrementó
el número de cruzamientos hasta cinco recombinaciones (Figuras 26a
y c, respectivamente). Exo VII parece ser más eficiente que Exo V,
la combinación Exo I/Exo VII generó recombinaciones en sobre el 75%
de los clones. Finalmente, una combinación de DNA fragmentado desde
todas las tres enzimas fue mezclada la cual generó recombinaciones
(1 a 4) en casi todos los clones, solamente el 7% de ellos fueron
del tipo descontrolado de genes. Más aún, los mayores tiempos de
fragmentación fueron más eficientes (Figura 26d). En este caso
particular los genes scFv consistieron de amplias áreas de
homología completa (las regiones de montaje), significando que el
numero de las recombinaciones identificadas (hasta 4) son las
únicas que son posibles de identificar, o sea, el número real de
recombinaciones podría ser mucho más alto.
Ejemplo
7
Los experimentos en la Figura 27 fueron
realizados por la recombinación de genes codificando para tres
scFv's diferentes usando cualquier tratamiento de ssADN y
exonucleasa o dsDNA y endonucleasa.
La asimilación de dsDNA endonucleasa fue
realizada usando ADNasa I, como se describió en Stemmer et
al., 1994, Nature 370:389-91. La
asimilación de la ssADN exonucleasa fue realizada usando Exo I, Exo
V y Exo VII, con muestras equimolares de fragmentos de Exo I (10
minutos de tiempo de reacción), Exo V (30 minutos de tiempo de
reacción) y Exo VII (30 minutos de tiempo de reacción) siendo usados
en las reacciones de recombinación.
El número de recombinaciones fue evaluado por el
uso de la secuenciación. El resultado muestra que la asimilación de
ssADN/exonucleasa produce algunos clones de tipo descontrolado y más
recombinaciones.
Claims (28)
1. Un método para generar una secuencia de
polinucleótidos o población de secuencias desde las secuencias de
polinucleótido de filamento simple codificando una o más proteínas
causales, el método comprende los pasos de:
- a)
- suministrar una primera población de moléculas de polinucleótidos de filamento simple, la primera y segunda poblaciones juntas constituyen los filamentos positivos y negativos de la secuencia de polinucleótidos progenitores;
- b)
- realizar una reacción para la asimilación de las primera y segunda poblaciones de moléculas de polinucleótidos de filamento simple con una exonucleasa para generar las correspondientes poblaciones de fragmentos de polinucleótidos de filamento simple;
- c)
- contactar dichos fragmentos de polinucleótidos generados desde los filamentos positivos con fragmentos generados desde los filamentos negativos; y
- d)
- amplificar los fragmentos que templan a cada otro para generar al menos una secuencia de polinucleótidos codificando una o más proteínas causales que tienen características alteradas como se comparó con una o más proteínas causales codificadas por dichos polinucleótidos progenitores.
en donde, en el paso (b), al menos
un parámetro de la reacción usada para asimilación de la primera
población de moléculas de polinucleótidos de filamento simple es
diferente del parámetro(s) equivalente(s)
usado(s) en la reacción para la asimilación de la segunda
población de moléculas de polinucleótidos de filamento
simple.
2. Un método de acuerdo a la reivindicación 1,
en el que el parámetro de la reacción es seleccionado de un tipo
de exonucleasa, una concentración de exonucleasa, de un volumen de
reacción, la duración de la asimilación de la reacción, la
temperatura de la mezcla de la reacción, el pH de la mezcla de la
reacción, la longitud de las secuencias de polinucleótidos de
filamento simple de los progenitores, la cantidad de moléculas de
polinucleótidos de filamento simple y la composición amortiguadora
de la mezcla de la reacción.
3. Un método de acuerdo a la reivindicación 1 o
2, en el que la exonucleasa usada para la asimilación de la primera
población de moléculas de polinucleótidos de filamento simple es
diferente de la exonucleasa usada para la asimilación de la segunda
población de moléculas de polinucleótidos de filamento simple.
4. Un método de acuerdo a la reivindicación 3,
en el que la exonucleasa usada para la asimilación de la primera
población de moléculas de polinucleótidos de filamento simple es una
exonucleasa 3' y la exonucleasa usada para la asimilación de la
segunda población de moléculas de polinucléótidos de filamento
simple es una exonucleasa 5'.
5. Un método de acuerdo a una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la concentración de
exonucleasa usada para la asimilación de la primera población de
moléculas de polinucleótidos de filamento simple es diferente de la
concentración de exonucleasa usada para la asimilación de la segunda
población de moléculas de polinucleótidos de filamento simple.
6. Un método de acuerdo a una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que el volumen de reacción
usado para la asimilación de la primera población de moléculas de
polinucleótidos de filamento simple es diferente del volumen de
reacción usado para la segunda población de moléculas de
polinucleótidos de filamento
simple.
simple.
7. Un método de acuerdo a una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la duración de la reacción
de asimilación usada para la asimilación de la primera población de
moléculas de polinucleótidos de filamento simple es diferente de la
duración de la reacción de asimilación usada para la asimilación de
la segunda población de moléculas de polinucleótidos de filamento
simple.
8. Un método de acuerdo a una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la temperatura de la mezcla
de la reacción usada para la asimilación de la primera población de
moléculas de polinucleótidos de filamento simple es diferente de la
temperatura de la mezcla de la reacción usada para la asimilación de
la segunda población de moléculas de polinucleótidos de filamento
simple.
9. Un método de acuerdo a una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que el pH de la mezcla de la
reacción usada para la asimilación de la primera población de
moléculas de polinucleótidos de filamento simple es diferente del
pH de la mezcla de la reacción usada para la asimilación de la
segunda población de moléculas de polinucleótidos de filamento
simple.
10. Un método de acuerdo a una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la longitud de los
polinucleótidos en la primera población de moléculas de
polinucleótidos de filamento simple es diferente de la longitud de
los polinucleótidos en la segunda población de moléculas de
polinucleótidos de filamento simple.
11. Un método de acuerdo a una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la composición de
amortiguamiento de la mezcla de la reacción usada para la
asimilación de la primera población de moléculas de polinucleótidos
de filamento simple es diferente de la composición de
amortiguamiento de la mezcla de reacción usada para la asimilación
de la segunda población de moléculas de polinucleótidos de
filamento simple.
12. Un método de acuerdo a una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la cantidad de moléculas de
polinucleótidos de filamento simple en la primera población de
moléculas de polinucleótidos de filamento simple es diferente de la
cantidad de moléculas de polinucleótidos de filamento simple en la
segunda población de moléculas de polinucleótidos de filamento
simple.
13. Un método de acuerdo a una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la primera población de
moléculas de polinucleótidos de filamento simple constituye los
filamentos positivos de las secuencias de polinucleótidos
progenitores y la segunda población de moléculas de polinucleótidos
de filamento simple constituye los filamentos negativos de las
secuencias de polinucleótidos progenitores.
14. Un método de acuerdo a una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que las moléculas de
polinucleótido del paso (a) son moléculas de DNA.
15. Un método de acuerdo a una cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, en el que el paso c) además
abarca el engrosamiento de las secuencias base que templan a los
terminales 3' y/o 5' de al menos uno de los polinucleótidos
progenitores bajo condiciones de templado.
16. Un método de acuerdo a una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la exonucleasa usada para
asimilar la primera y/o la segunda población de moléculas de
polinucleótidos de filamento simple es seleccionada del grupo que
consiste de BAL 31, exonucleasa I, exonucleasa V, exonucleasa VII,
exonucleasa T7gene 6, exonucleasa lambda bacterófaga y exonucleasa
Rec Jf.
17. Un método de acuerdo a una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que una secuencia o secuencias
de polinucleótidos progenitores ha(n) sido
sometida(s) a autogénesis.
18. Un método de acuerdo a una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que una o ambas poblaciones de
fragmentos generados en el paso b) es(son) sometida(s)
a mutagénesis.
19. Un método de acuerdo a la reivindicación 17
o 18 donde la mutagénesis es una tendencia al error PCR.
20. Un método de acuerdo a una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que el paso b) es realizado
para generar poblaciones de fragmentos de filamento simple de
diversas longitudes.
21. Un método de acuerdo a la reivindicación 20
donde el paso b) es controlado para generar fragmentos de filamento
simple que tienen una longitud promedio de más que aproximadamente
50 nucleótidos.
22. Un método de acuerdo a una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes que además abarca el paso de expresar
in vitro al menos una secuencia de polinucleóticos generada
en el paso d) para producir el polipéptido codificado.
23. Un método de acuerdo a la reivindicación 22
que además abarca el paso de prueba del polipéptido codificado para
las características deseadas.
24. Un método de acuerdo a una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes en el que la secuencia de
polinucleótidos progenitor codifica un anticuerpo o fragmento del
mismo.
25. Un método de acuerdo a una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes en el que la secuencia de
polinucleótidos progenitor codifica una enzima.
26. Un método de acuerdo a una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes en el que la secuencia de
polinucleótidos progenitor codifica un antígeno.
27. Un método para hacer un polipéptido que
tiene las propiedades deseadas, el método abarca los pasos
siguientes:
- (a)
- generar formas variantes de un polinucleótido progenitor usando un método de acuerdo a una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26;
- (b)
- expresar los polinucleótidos variantes producidos en el paso (a) para producir varios polipéptidos;
- (c)
- filtrar los polipéptidos variantes para las propiedades deseadas; y
- (d)
- seleccionar un polipéptido que tiene las propiedades deseadas de los polipéptidos variantes.
28. Un método de acuerdo a una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 26 el cual abarca seguir la identificación de
un polinucleótido y/o codificar un polipéptido con las
características deseadas, añadir dicho polinucleótido y/o el
polipéptido codificado a un portador aceptable
farmacéuticamente.
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