JP2005525820A - タンパク質機能をインヴィトロで分子進化させる方法 - Google Patents

タンパク質機能をインヴィトロで分子進化させる方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、以下の工程を含む、１つまたは２つ以上のタンパク質モチーフをコードする親の一本鎖ポリヌクレオチド配列からポリヌクレオチド配列または配列集団を作製する方法を提供する：
ａ）一本鎖ポリヌクレオチド分子の第一の集団および一本鎖ポリヌクレオチド分子の第二の集団を提供し、前記第一および第二の集団は共同して親のポリヌクレオチド配列のプラス鎖およびマイナス鎖を構成し；
ｂ）前記一本鎖ポリヌクレオチド分子の第一および第二の集団をエキソヌクレアーゼで消化する反応を実施して、対応する一本鎖ポリヌクレオチドフラグメント集団を作製し；
ｃ）前記プラス鎖から生じたフラグメントを前記マイナス鎖から生じたフラグメントと接触させ、場合によって親のポリヌクレオチドの少なくとも１つの3'末端および5'末端とアニーリング条件下でアニールするプライマー配列を添加し；
ｄ）互いにアニールするフラグメントを増幅して、前記親ポリヌクレオチドによってコードされる１つまたは２つ以上のタンパク質モチーフと比較したとき改変された特徴を有する１つまたは２つ以上のタンパク質モチーフをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を作製し；
前記方法の工程（ｂ）で、一本鎖ポリヌクレオチド分子の第一の集団の消化に用いられる反応の少なくとも１つのパラメーターは、一本鎖ポリヌクレオチド分子の第二の集団の消化反応に用いられる同等のパラメーターとは異なっている。
好ましくは、前記反応パラメーターは、エキソヌクレアーゼのタイプ、エキソヌクレアーゼの濃度、反応容積、消化反応の持続時間、反応混合物の温度、反応混合物のpH、親の一本鎖ポリヌクレオチド配列の長さ、一本鎖ポリヌクレオチド分子の量および反応混合物の緩衝液組成から選択される。

Description

本発明は、タンパク質機能を、特にヌクレアーゼを用いて得た一本鎖DNAセグメントをシャッフリングすることによってインヴィトロ（in vitro)で分子進化させる方法に関する。
（発明の背景）
タンパク質機能は、多様な方法［位置特異的突然変異誘発（Albert et al., Nature, 5:330(6143):41-46(1987)）、順列組合せクローニング（Huse et al., Science, 246:1275-1281(1989)）および適切な選別系と組み合わせたランダム突然変異誘発（Barbas et al., PNAS, USA, 89:4457-4461(1992)）を含む］によってインヴィトロで改変および改良することができる。
選別を併用するランダム突然変異誘発の方法は多数の事例で用いられタンパク質機能を改良してきたが、2つの異なる方法が存在する。先ず初めに、所望の特徴をもつ変種（変異体）タンパク質の選別と組み合わせて全遺伝子配列を任意抽出し、ランダム突然変異誘発と選別の新たな過程がさらに続く。前記方法は、最適と考えられるタンパク質変種が見出されるまで繰り返すことができる（R. Schier et al., J. Mol. Biol. 263(4):551-567(1996)）。ここで突然変異を導入する伝統的な手段は、約0.7％の変異率をもつエラー誘発ＰＣＲ（error prone PCR）（Leung et al., Technique, 1:11-15, 1989）による。第二には、遺伝子の限定領域を縮退プライマーにより突然変異させることができる。前記は100％の突然変異率を可能にする（Griffiths et al., EMBO J., 13:3245-3260(1994; Yang et al., J. Mol. Biol. 254:392-403(1995))。用いられる変異率が高ければ高いほど、変異を受ける遺伝子の領域はより限定される。
ランダム突然変異誘発は抗体のエンジニアリング領域で広範囲に用いられてきた。in vivoで形成された抗体遺伝子をインヴィトロでクローニングし（Larrick et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 160:1250-1256(1989)）、さらに可変重鎖および軽鎖遺伝子をコードする遺伝子のランダムな組合せを選別に付すことができる（Marks et al., Biotechnology, 10:779-783(1992)）。選別した機能的抗体フラグメントをさらにランダム突然変異誘発および更なる選別過程を用いて改良することができる（R. Schier et al., J. Mol. Biol. 263(4):551-567(1996)）。
前記ランダム突然変異誘発手段に続いて選別が実施される。問題の特徴を有する変種を選別し、種々の変種（各々は問題の特徴を有する）に由来する変異ＤＮＡ領域を１つのコード配列にまとめることができる（Yang et al., J. Mol. Biol. 254:392-403(1995)）。前記は多段工程の連続プロセスであり、種々の領域中の種々の変異による潜在的な相乗作用は失われるであろう（なぜならば前記は組合せ状態で選別に付されていないからである）。したがって、前記２つの手段は限定された領域の同時突然変異誘発およびそれら領域の組合せの選別を含まない。
また別のプロセスは順列組合せ遺伝子対形成を必要とする。前記プロセスを用いて例えば抗体親和性を改善することができる（Marks et al., Biotechnology, 10:779-783(1992)）。ここでは各可変遺伝子内の3つのＣＤＲ領域が固定され、前記技術では、クローン間における可変ドメイン（例えばＣＤＲ領域を含む）に対する遺伝子内の個々の遺伝子セグメントのシャッフリングが可能ではない。
ＤＮＡシャッフリングの概念（Stemmer, Nature 370:389-391,1994））は、ＤＮＡのランダムなフラグメント化およびフラグメントの機能的なコード配列へのアッセンブリーを利用する。シャッフリングの過程で、化学的に合成されたＤＮＡ配列の導入が可能で、前記のようにしてＤＮＡ配列が公知である遺伝子内の限定場所に対して標的の変型が得られる（Crameri et al., Biotechniques, 18:194-196(1995)）。Stemmerとその共同研究者らはこのインヴィトロ方法を開発した。前記は自然界のタンパク質の通常の進化プロセスと類似する。ＤＮＡシャッフリングは、組換え、個々の遺伝子由来の有用な変異の組合せによって多様性を生じる。前記を用いて種々のタンパク質（例えば酵素およびサイトカイン）の人工的な進化を成功させることができた（Chang et al., Nature Biotech. 17:793-797(1999); Zhang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504-4509(1997); Christians et al., Nature Biotech. 17:259-264(1999)）。遺伝子はＤＮアーゼＩを用いてランダムにフラグメント化し、続いて互いに再組換えにより再アッセンブリングさせる。出発材料は単一遺伝子（エラー誘発ＰＣＲを用いて最初にランダムに変異させる）でも天然に存在する相同配列（いわゆるファミリーシャッフリング）でもよい。ＤＮアーゼＩはピリミジンヌクレオチド近くの部位で優先的にＤＮＡを加水分解し、したがってＤＮＡのランダムなフラグメント化には適切な選択である。しかしながら前記活性はＭｇまたはＭｎイオンに依存し、Ｍｇイオンはフラグメントサイズを50bpに制限し、一方、Mnイオンは50bp未満のフラグメントサイズを与えるであろう。したがって、全ての可能な組換えのためのサイズをもつために、問題の遺伝子は、２つの異なるイオンのどちらかの存在下で少なくとも２回ＤＮアーゼＩで処理し、続いて前記の酵素を除去する必要がある。
理論的には、任意のクローン間でＤＮＡをシャッフリングすることが可能である。しかしながら、シャッフリングされた遺伝子が、発現および活性について機能をもつためには、シャッフリングされるべきクローンは好ましくは近縁であるか、または低レベルのランダム変異を除き同一である必要がある。遺伝的に異なるクローン間のＤＮＡシャッフリングは、一般的に機能をもたない遺伝子を生じるであろう。しかしながら、種間融合ライブラリーを大腸菌（E. coli）およびグリシンアミドリボヌクレオチドトランスフォーミラーゼ遺伝子のフラグメント（前記はＤＮＡレベルでわずかに50％の同一性しかもたない）間で作製できることがＩＴＣＨＹによる方法で証明された（Ostermeier et al., Nat. Biotechnol. 17:1205-9(1999)）。
２つの異なる遺伝子の組換えの成功にはヘテロデュープレックス分子の形成が要求される。いくつかの事例では、ファミリーシャッフリングはほぼホモデュープレックスのみを形成し、組換え頻度は低い。前記の問題はＤＮアーゼＩ消化一本鎖ＤＮＡを用いて強調された（Kikuchi et al., Gene 243:133-137(2000)）。
一本鎖ＤＮＡは当該技術分野で公知の方法を用いて得ることができる。例えば、ダイナビーズ（Dynabeads; Dynal, Norway）またはアフィニチップ・ストレプトアビジン捕捉マイクロカラム（AffniTip Streptavidin Capture Micro-column; Genosys Biotechnologies Inc., The Woodlands, USA）と併用しながら、例えばビオチン付加プライマーをＰＣＲ反応で用いることができる。また別には、一本鎖ＤＮＡをパッケージすることができるバクテリオファージを利用することにより一本鎖ＤＮＡを得ることができる（Viruses and Related Entities in Modern Microbiology, Principles and Applications pp.171-192, Ed. E.A. Birge, Wm. C. Brown Publishers 1992; Sambrook et al., Molecular Cloning, A laboratory manual 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）。さらにまた、不整ＰＣＲ法を用いてもよい（実施例１参照）。
改変および改善特性をもつ酵素の選別はしばしば実際の酵素機能を基にしている。例えば、酵素の耐熱性の強化は、野生型酵素の不活化をもたらす温度で形質転換コロニーをインキュベートすることによって選別することができる。さらにまた、β-グルコシダーゼ活性の改善は基質としてＰＮＰＧを用いることにより特定することができる（Arrizubieta et al., J. Biol. Chem. Jun 27, 2000）。
分子ライブラリーから機能的タンパク質の選別は、ファージディスプレー技術によって飛躍的な進歩を遂げた（Parmley et al., Gene 73:305-391(1988); McCafferty et al., Nature, 348:552-554(1990); Barbas et al., PNAS, USA 88:7978-7982(1991)）。ここでは、表現型（タンパク質）がその対応する遺伝子型（ＤＮＡ）に直接連結されてあり、それによって遺伝物質の直接クローニングが可能になる。前記遺伝物質は、続いてタンパク質機能の改善のために更なる改変に付すことができる。ファージディスプレーは、サイズとして1011個の形質転換体を含む多様な分子ライブラリーから機能的結合物質をクローニングするために用いられてきた（Griffiths et al., EMBO J. 13:3245-3260(1994)）。したがって、ファージディスプレーを用いて、分子ライブラリーから機能的結合物質を直接クローニングすることができ、さらにまた最初に選別したクローンの改善にも用いることができる。タンパク質ライブラリーの表面発現およびその選別のために用いられたその他のタイプのウイルスは、バキュロウイルス（Boublik et al., Biotechnol. 13:1079-1084(1995); Mottershead et al., Biochem. Biophys. Res. Com. 238:717-722(1997); Grabherr et al., Biotechniques 22:730-735(1997)）およびレトロウイルス（Buchholz et al., Nature Biotechnol. 16:951-954(1998)）である。
分子ライブラリーから機能的タンパク質の選別はまた細胞表面ディスプレーによって実施することもできる。ここでもまた、表現型はその対応する遺伝子型と直接連結している。細菌の細胞表面は、例えばカルボキシメチルセルラーゼ（CMCアーゼ）の改良変種のスクリーニングに用いられた（Kim et al., Appl. Environ Microbiol. 66:788-93(2000)）。前記目的に用いることができるその他の細胞は、酵母細胞（Boder and Wittrup, Nat. Biotechnol. 15:553-557(1997)）、ＣＯＳ細胞（Higuchi et al., J. Immunol. Meth. 202:193-204(1997)）および昆虫細胞である（Granzerio et al., J. Immunol. Meth. 203:131-139(1997); Ernst et al., Nucleic Acids Res. 26:1718-1723(1998)）。
所望機能の選別を併用する種々の変異クローン由来ＤＮＡのランダムな組合せは、逐次的に選別し選別クローンを組合せる方法と比較して配列スペース全体の検索により効率的な方法である。
本発明はインヴィトロのタンパク質進化のための改良方法を提供することを目的とする。特に本発明はより効率的な組換えおよびシャッフリング方法を提供することを目的とし、前記方法はより多くの改変をもつ分子を生じ、それによって所望の特性をもつ分子を見つける確率を改善するであろう。
（発明の要約）
本発明の第一の特徴にしたがえば、以下の工程を含む、１つまたは２つ以上のタンパク質モチーフをコードする親の一本鎖（ss）ポリヌクレオチド配列からポリヌクレオチド配列または配列集団を作製する方法が提供される：
ａ）一本鎖ポリヌクレオチド分子の第一の集団および一本鎖ポリヌクレオチド分子の第二の集団を提供し、前記第一および第二の集団は共同して親のポリヌクレオチド配列のプラス鎖およびマイナス鎖を構成し；
ｂ）前記一本鎖ポリヌクレオチド分子の第一および第二の集団をエキソヌクレアーゼで消化する反応を実施して、対応する一本鎖ポリヌクレオチドフラグメント集団を作製し；
ｃ）前記プラス鎖から生じたフラグメントを前記マイナス鎖から生じたフラグメントと接触させ、場合によって親のポリヌクレオチドの少なくとも１つの3'末端および5'末端とアニーリング条件下でアニールするプライマー配列を添加し；
ｄ）互いにアニールするフラグメントを増幅して、前記親ポリヌクレオチドによってコードされる１つまたは２つ以上のタンパク質モチーフと比較したとき改変された特徴を有する１つまたは２つ以上のタンパク質モチーフをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を作製し；
前記方法の工程（ｂ）で、一本鎖ポリヌクレオチド分子の第一の集団の消化に用いられる反応の少なくとも１つのパラメーターは、一本鎖ポリヌクレオチド分子の第二の集団の消化反応に用いられる同等のパラメーターとは異なっている。
したがって、本発明は、親の一本鎖ポリヌクレオチド配列から変種ポリヌクレオチド配列または変種の集団を作製する方法を提供する。
一本鎖ポリヌクレオチド分子の第一および第二の集団の消化に用いられる反応で異なるパラメーターを使用することによって、本発明の方法によって生成される変種ポリヌクレオチドの多様性が増加するという利点が提供される。
好ましくは、工程（ａ）のポリヌクレオチド分子はＤＮＡ分子である。
“一本鎖ポリヌクレオチドフラグメントの対応する集団”とは、一本鎖ポリヌクレオチド分子の第一および第二の集団のエキソヌクレアーゼによる消化によって生成されるフラグメント集団を意味する。
“同等のパラメーター”とは、一本鎖ポリヌクレオチド分子の他の集団の消化に用いられる同じパラメーターを意味する。例えば、一本鎖ポリヌクレオチド分子の第一の集団の消化に用いられるエキソヌクレアーゼは、一本鎖ポリヌクレオチド分子の第二の集団の消化に用いられるエキソヌクレアーゼと異なっていてもよい。
“エキソヌクレアーゼ”とは、エキソヌクレオリシス活性を有するポリペプチド（例えば酵素またはそのフラグメント）を意味する。好ましくは前記ポリペプチドのエキソヌクレオリシス活性は前記ポリペプチドのエンドヌクレオリシス活性よりも強い。より好ましくは、前記ポリペプチドはエキソヌクレオリシス活性を有するが、エンドヌクレオリシス活性は実質的に含まない。
有利には、相違する前記消化反応のパラメーターは、エキソヌクレアーゼのタイプ、エキソヌクレアーゼの濃度、反応容積、消化反応の持続時間、反応混合物の温度、反応混合物のpH、親の一本鎖ポリヌクレオチド配列の長さ、一本鎖ポリヌクレオチド分子の量および反応混合物の緩衝液組成から選択される。
本発明の第一の特徴の方法に関する好ましい実施態様では、一本鎖ポリヌクレオチド分子の第一の集団の消化に用いられるエキソヌクレアーゼは、一本鎖ポリヌクレオチド分子の第二の集団の消化に用いられるエキソヌクレアーゼと異なる。好ましくは、一本鎖ポリヌクレオチド分子の第一の集団の消化に用いられるエキソヌクレアーゼは3'エキソヌクレアーゼ（すなわち前記は優先的にまたはもっぱらssポリヌクレオチドの3'末端からヌクレオチドを取り除く）であり、さらに一本鎖ポリヌクレオチド分子の第二の集団の消化に用いられるエキソヌクレアーゼは5'エキソヌクレアーゼ（すなわち前記は優先的にまたはもっぱらssポリヌクレオチドの5'末端からヌクレオチドを取り除く）である。
本発明の第一の特徴の方法に関するさらに別の実施態様では、一本鎖ポリヌクレオチド分子の第一の集団の消化に用いられるエキソヌクレアーゼ濃度は、一本鎖ポリヌクレオチド分子の第二の集団の消化に用いられるエキソヌクレアーゼ濃度と異なる。
本発明の第一の特徴の方法に関するさらに別の実施態様では、一本鎖ポリヌクレオチド分子の第一の集団の消化に用いられる反応容積は、一本鎖ポリヌクレオチド分子の第二の集団の消化に用いられる反応容積と異なる。
本発明の第一の特徴の方法に関するさらに別の実施態様では、一本鎖ポリヌクレオチド分子の第一の集団の消化に用いられ消化反応の持続時間は、一本鎖ポリヌクレオチド分子の第二の集団の消化に用いられる消化反応の持続時間と異なる。
本発明の第一の特徴の方法に関するさらに別の実施態様では、一本鎖ポリヌクレオチド分子の第一の集団の消化に用いられる反応混合物の温度は、一本鎖ポリヌクレオチド分子の第二の集団の消化に用いられる反応混合物の温度と異なる。
本発明の第一の特徴の方法に関するさらに別の実施態様では、一本鎖ポリヌクレオチド分子の第一の集団の消化に用いられる反応混合物のpHは、一本鎖ポリヌクレオチド分子の第二の集団の消化に用いられる反応混合物のpHと異なる。
本発明の第一の特徴の方法に関するさらに別の実施態様では、一本鎖ポリヌクレオチド分子の第一の集団のポリヌクレオチドの長さは、一本鎖ポリヌクレオチド分子の第二の集団のポリヌクレオチドの長さと異なる。
本発明の第一の特徴の方法に関するさらに別の実施態様では、一本鎖ポリヌクレオチド分子の第一の集団の消化に用いられる反応混合物の緩衝液組成は、一本鎖ポリヌクレオチド分子の第二の集団の消化に用いられる反応混合物の緩衝液組成と異なる。
本発明の第一の特徴の方法に関するさらに別の実施態様では、一本鎖ポリヌクレオチド分子の第一の集団の一本鎖ポリヌクレオチド分子の量は、一本鎖ポリヌクレオチド分子の第二の集団の一本鎖ポリヌクレオチド分子の量と異なる。
本発明の第一の特徴の方法に関するさらに別の実施態様では、一本鎖ポリヌクレオチド分子の第一の集団は親のポリヌクレオチド配列のプラス鎖を構成し、さらに一本鎖ポリヌクレオチド分子の第二の集団は親のポリヌクレオチド配列のマイナス鎖を構成する。
便利には、工程（ｃ）はさらに、親のポリヌクレオチドの少なくとも１つの3'および／または5'末端とアニーリング条件下でアニールするプライマー配列の添加を含む。
したがって、本発明は、ポリヌクレオチドフラグメントを結合させて、所望の特徴をもつポリヌクレオチド配列または配列集団を作製する、以下の工程を含む方法を提供する：
ａ）１つまたは２つ以上のタンパク質モチーフをコードする直鎖状の親の一本鎖ポリヌクレオチドをＤＮアーゼI以外のヌクレアーゼで消化して多様な長さをもつ一本鎖フラグメント集団を作製し；
ｂ）工程ａ）に由来する配列からポリヌクレオチド配列をアッセンブリングする。
好ましくは、前記方法はさらに、前記アッセンブリングされたポリヌクレオチド配列によってコードされる生成タンパク質を発現する工程ｃ）および所望の特徴をもつタンパク質をスクリーニングする工程ｄ）を含む。
前記エキソヌクレアーゼ消化反応のパラメーターを制御することによって、前記ポリヌクレオチドフラグメントのサイズを制御することができる。このようにしてポリヌクレオチドフラグメントの長さを決定することによって、例えば所望の長さをもつフラグメントをゲルから精製するというような更なる工程を提供する必要性が回避される。
所望の特徴をもつポリヌクレオチドを作製するために、１つまたは２つ以上のタンパク質モチーフをコードする親のポリヌクレオチドを突然変異誘発に付し、複数の別個に変異させたその誘導体を作製することができる。同様に、既に複数の変種タンパク質モチーフをコードする未知の配列をもつ親のポリヌクレオチドを入手してもよい。
ランダムな突然変異誘発は、上記に述べたような任意の方法によって実施できるが、適切な方法はエラー誘発ＰＣＲである。
一本鎖ポリヌクレオチドフラグメントを二本鎖（ds）ポリヌクレオチド配列にアッセンブリングするためにＰＣＲ技術を用いるのが好ましい。
前記ポリヌクレオチド配列は好ましくはＤＮＡであるが、ただしＲＮＡも用いることができる。簡便なように、ポリヌクレオチドという用語は以下ではＤＮＡに関して用いるが、本発明はＲＮＡとＤＮＡの両方に適用できることは理解されよう。
好ましくは、5'プライム末端から3'プライムへ、3'から5'末端へ、または3'および5'の両末端からポリヌクレオチドを消化する任意のエキソヌクレアーゼを用いることができる。本発明で用いることができる適切なエキソヌクレアーゼの例には、BAL31、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＶ、エキソヌクレアーゼVII、エキソヌクレアーゼT7遺伝子6、バクテリオファージラムダエキソヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼRecJfが含まれる。
本発明のDNAシャッフリングプロセスでBAL31を用いることによって、迅速、容易および制御可能な系が提供される。前記酵素は全てのサイズの遺伝子フラグメントを提供することができ、さらに前記酵素活性は多様な時点で消化を停止させることによって容易に制御することができる。BAL31はもっぱら3'プライムエキソヌクレアーゼであり、前記は直鎖状DNAの２つの鎖の両3'末端からモノヌクレオチドを除去する。BAL31はまたエンドヌクレアーゼでもあり、したがって3'プライムエキソヌクレアーゼ活性によって生成された一本鎖DNAは前記エンドヌクレアーゼによって分解される。前記酵素の3'プライムエキソヌクレアーゼ活性は、前記エンドヌクレアーゼよりも約20倍効率的に作用する。酵素濃度はしたがって得られるDNAフラグメントのために重要である。高濃度の酵素は平滑端DNAに有利であり、一方、低濃度では一本鎖DNA末端は非常に長いであろう。BAL31は動力学的に別個の酵素型、高速（Ｆ）および低速（Ｓ）型からなる。Ｓ型はＦ型のタンパク分解生成物である。さらにまたBAL31は非同期的に作用して、その末端が種々の程度に切断され、その一本鎖テールの長さが多様なDNA分子集団を生じる。両型はまたエキソヌクレオリシス的態様でssDNAに対し強い前進性態様で機能する。攻撃の方向は、デュープレックスDNAの消化態様とは対照的に5'末端からである。前記ヌクレアーゼ分子は先ず初めに5'末端から外れて非生産的に結合し、さらに拡散が促進されて生産的な（末端に結合した）酵素‐基質複合体を生じると提唱されてきた（T. Lu and H.B. Gray Jr., Biochimica et Biophysica Acta 1251:125-138(1995)）。前記酵素は補助因子としてCa2+を利用し、前記イオンはEGTA（エチレングリコールビス(β‐アミノエチルエーテル)N,N,N',N'-テトラ酢酸）とともに複合体に結合することができる。直鎖状DNA配列をBAL31で消化し、前記反応を種々の時点でEGTAの添加により停止させる。
個々の消化フラグメントを精製し混合してPCR技術により再アッセンブリングさせる。続いて、アッセンブリングさせた（再構成させた）遺伝子をタンパク質の発現のために発現ベクターでクローニングする。前記タンパク質を続いて特徴の改善について分析することができる。
本発明の方法は既知のシャッフリング技術に較べて、組換え率の増加、多様性の増加およびフラグメントサイズの制御を含むいくつかの利点を提供する。
本発明の方法は、DNAサンプルがBAL31処理から取り出される各時点で次第に短縮されたDNAフラグメントセットを生じる。前記DNAサンプルを採集して一緒にプールするか、または場合によって個々のサンプルを選択して前記方法で用いてもよい。したがって、本発明はどのDNAサンプルを組換え系で用いるべきかの選択を可能にし、それによって更なる制御性を提供する。
本発明の方法は、具体的な生成物、例えば結合特性または触媒特性を有する任意のタンパク質（例えば抗体もしくは抗体の部分、酵素またはレセプター）について実施することができる。さらにまた、変更可能な機能をもつ任意のポリヌクレオチド（例えば触媒性RNA）を本発明にしたがってシャッフリングすることができる。１つまたは２つ以上のタンパク質モチーフをコードする親のポリヌクレオチドは長さが少なくとも12ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも20ヌクレオチド、さらに好ましくは長さが50を超えるヌクレオチドである。長さが少なくとも100ヌクレオチドまたは長さが少なくとも200ヌクレオチドであるポリヌクレオチドも用いることができる。大きなタンパク質（例えば酵素または抗体）をコードする親ポリヌクレオチドを用いる場合は、それらは長さが何百または何千もの塩基であろう。本発明は任意のサイズの親ポリヌクレオチドで実施することができる。
本発明はまた、上記で述べた方法によって作製された所望の特徴をもつポリヌクレオチド配列を提供する。これらの配列は、遺伝子療法ベクター、複製欠損遺伝子療法構築物またはDNA系ワクチン接種用ワクチンベクターの作製に用いることができる。さらにまた、前記ポリヌクレオチド配列は研究用ツールとしても用いることができる。
本発明はまた、上記で述べた方法によって作製された配列で構成されるポリヌクレオチドライブラリーを提供する。前記ライブラリーから所望の特徴をもつタンパク質をコードするポリヌクレオチドを選別することができる。前記ポリヌクレオチドライブラリーはDNAまたはcDNAライブラリーであることが好ましい。
本発明はまた、上記で述べた方法によって作製された、野生型の特徴とは相違する特徴を有するタンパク質（例えば酵素、抗体およびレセプター）を提供する。これらのタンパク質は、ワクチンまたは治療用医薬として（例えば免疫原、抗原または特定の抗体を得る場合に）それぞれ個々に用いるか、または医薬的に許容できる担体中で用いることができる。前記はまた研究用ツールとしても用いることができる。
本発明によって作製されたポリヌクレオチドまたは本発明によって作製されたポリヌクレオチドによってコードされたタンパク質の所望の特徴は、野生型（親）ポリヌクレオチドまたは前記によってコードされるポリペプチド、タンパク質もしくはタンパク質モチーフの正常な活性における任意の変動または変更であろう。例えば、ある酵素の触媒活性を低下または増加させることを所望することができ、またはある抗体の結合特異性を改善または低下させることを所望することもできる。さらにまた、前記タンパク質またはポリヌクレオチドが免疫原の場合、前記に対し特異的抗体を得るその能力を低下または強化させることを所望することができる。
好ましくは、前記親のポリヌクレオチドは１つまたは２つ以上のタンパク質モチーフをコードする。前記タンパク質モチーフは、特徴的なタンパク質機能をもつ（または潜在的にもつ）ポリペプチド（すなわちアミノ酸）配列をコードするポリヌクレオチド配列の領域またはエレメントと定義される。例えばタンパク質モチーフは完全なタンパク質の一部分（例えばエピトープ、切断部位または触媒部位など）の範囲を明示することができる。しかしながら、本発明の範囲では、発現されたタンパク質モチーフは活性を示す必要は無く、または“正確に”折り畳まれている必要はない。
タンパク質モチーフおよび潜在的タンパク質モチーフに関するいくつかのデータベース、例えばMOTIF、PROSITE、SMARTおよびBLOCKS（www.blocks.fhcrc.org）が利用可能である。
一定のエピトープの構造を改変し、それによって前記エピトープの抗原性を改良することができるように、および／または交差反応性を減少させることができるようにタンパク質を改変することを所望することができる。例えば、そのようなタンパク質を抗原として用いる場合は、得られる抗体の類似のタンパク質との交差反応性はいずれも前記改変によって減少するであろう。
“酵素”という用語が用いられるが、前記は酵素様活性（すなわち触媒機能）をもつ任意のポリペプチドを含むと解釈されるべきである。例えば、１つの酵素の部分であるポリペプチドはなお触媒機能を有することができる。さらにまた、インターフェロンおよびサイトカインのようなタンパク質も含まれる。同様に、“抗体”という用語は、必要な特異性をもつ結合ドメインを有する任意の結合物質を包含すると解されるべきである。前記には抗体フラグメント、抗体の誘導体、機能的等価物および同族体が含まれる。前記同族体は、合成分子およびその形状が抗体のそれに類似し抗原またはエピトープとの結合を可能にする分子を含む。抗原または他の結合パートナーと結合することができる抗体フラグメントの例は、VL、VH、C1およびCH1ドメインからなるFabフラグメント、VHおよびCH1ドメインからなるFdフラグメント、抗体の単腕のVLおよびVHドメインからなるFvフラグメント、VHドメインからなるdAbフラグメント、単離CDR領域およびF(ab')2フラグメントである。F(ab')2フラグメントは、ジスルフィド結合によってヒンジ領域で連結された２つのFabフラグメントを含む二価フラグメントである。
生成されたポリヌクレオチド配列を発現させるために、前記配列は、その発現の制御のために制御配列が前記ポリヌクレオチド配列に機能的に連結されたベクターに取り込ませることができる。前記ベクターは他の配列を含んでいてもよい。前記他の配列は、例えば挿入したポリヌクレオチド配列の発現を駆動するプロモーターまたはエンハンサー、前記ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質を融合物として生成させるための別の更なるポリヌクレオチド配列、および／またはホスト細胞で生成されたタンパク質を前記細胞から分泌させることができる分泌シグナルをコードする核酸である。続いて前記ポリヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質は、前記ベクターでホスト細胞を形質転換し（前記ホスト細胞でベクターは機能を有する）、前記タンパク質が産生されるように前記ホスト細胞を培養し、さらに前記ホスト細胞からまたは周囲の培養液から前記タンパク質を回収することによって得ることができる。原核細胞および真核細胞が前記の目的のために当技術分野では用いられる（大腸菌（E. coli）株、酵母およびCOSまたはCHO細胞のような真核細胞を含む）。ホスト細胞を選択して、それら細胞で発現されるタンパク質の特性を制御することができる（例えばタンパク質がホスト細胞内に沈積される場合、またはタンパク質の糖化のような特性に影響する場合の制御）。
前記ポリヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質は当分野で周知の方法によって発現させることができる。便利には、発現は、前記のようなベクターを含むホスト細胞を、前記タンパク質の発現をもたらすかまたは発現を許容する適切な条件下で培養で増殖させることによって達成することができる。
種々の多様なホスト細胞でのクローニングおよびタンパク質発現系は周知である。適切なホスト細胞には、細菌、真核細胞（例えば哺乳類および酵母）およびバキュロウイルス系が含まれる。さらにまた、クローニングおよび発現のためにレトロウイルス系を利用することはまた別の優れた選択肢である。なぜならば、レトロウイルスは多数の細胞タイプとともに用いることができるからである。異種ポリペプチドの発現に当分野で利用可能な哺乳類細胞系には、チャイニーズハムスター卵巣細胞、HeLa細胞、ベビーハムスター腎細胞、COS細胞および多くの他の細胞が含まれる。一般的で好ましい細菌ホストは大腸菌である。
適切なベクターは選択または構築することができる。前記は適切な調節配列（プロモーター配列、ターミネーターフラグメント、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列を含む）、マーカー遺伝子および場合に応じて他の配列を含む。ベクターは、場合に応じてプラスミドでもウイルス（例えばファージ）でもファージミドでもよい。さらに詳しくは、例えば以下の文献を参照されたい：Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., Sambrook and Russel, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press。例えばポリヌクレオチド構築物の調製、突然変異誘発、配列決定、DNAの細胞内への導入、および遺伝子の発現におけるポリヌクレオチド配列のマニピュレーション、およびタンパク質の分析のために多くの公知の技術およびプロトコルが詳細に以下の文献に記載されている：Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, 1992。
所望のタンパク質機能について多数の方法でスクリーニングすることができる多様な配列を含むDNAライブラリーの作製に前記系を用いることができる。酵素機能は、目下の酵素機能（例えばCMCアーゼ活性、β‐グルコシダーゼ活性）に固有の方法および耐熱性を用いてスクリーニングすることができる。さらにまた、ファージディスプレーおよび細胞表面ディスプレーは、酵素機能のスクリーニングのために（A. Crameri et al., Nature 15;391(6664):288-291(1998); J.H. Zhang et al., PNAS, USA, 94(9):4504-4509(1997); M.S. Warren et al., Biochemistry 35(27):8855-8862(1996); Kim et al., Appl. Environ Microbiol. 66:788-93(2000)、さらにまた例えば抗体の結合特性の変化のスクリーニングのために（Griffith et al., EMBO J. 113:3245-3260(1994)）用いることができる。
本発明によって提供されるタンパク質は、その活性または機能に影響を与えるかまたは調節する分子のスクリーニングに用いることができる。そのような分子は治療的な意味で（おそらく予防的意味を含む）有用であろう。
本発明はまた、上記で述べた方法によって作製されたポリヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。
本発明はまた、ポリヌクレオチド配列、前記ポリヌクレオチド配列を含むベクター、または上記の方法によって作製されたタンパク質および医薬的に許容される担体もしくは研究目的に適した担体を含む組成物を提供する。
本発明はさらに、所望の特徴をもつポリヌクレオチドまたはポリペプチドの上記方法による特定に続いて、前記ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの全体もしくは部分（場合によってさらに別の付加的ポリペプチドまたはポリヌクレオチドと結合させて）の製造を含む方法を提供する。
したがって、本発明のさらに別の特徴は、以下の工程を含む、所望の特性をもつポリペプチドの製造方法を提供する：
（ａ）本発明の第一の特徴の方法を用いて親ポリヌクレオチドの変種型を作製し；
（ｂ）工程（ａ）で作製した変種ポリヌクレオチドを変種ポリペプチドの製造のために発現させ；
（ｃ）所望の特性について前記変種ポリペプチドをスクリーニングし；さらに
（ｄ）所望の特性をもつ変種ポリペプチドを前記変種ポリペプチドから選別する。
本発明はさらに上記の方法によって得られたポリペプチドを提供する。
所望の特徴をもつポリヌクレオチドまたはポリペプチドの特定に続いて、前記を周知の技術、例えばPCR、クローニングおよびホスト細胞内での発現によって製造して大量に提供することができる。
得られたポリペプチドまたはポリヌクレオチドを工業用酵素（例えば低温での活性の増加が好ましい洗濯洗剤酵素）の製造で用いることができる。また別には、製造されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドは研究用ツールとして用いることができる。すなわち抗体は免疫アッセイで用いることができ、ポリヌクレオチドはハイブリダイゼーションプローブまたはプライマーとして用いることができる。また別には、得られたポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、下記で考察されるように診断、医薬、治療などに使用される医薬の製造で用いることができる。
本発明の方法によって作製され、所望の特徴を有すると特定されたポリペプチドまたはポリヌクレオチドは医薬組成物として製剤化することができる。前記組成物は、上記物質の他に医薬的に許容できる賦形剤、担体、緩衝剤、安定化剤または当業者に周知の他の物質を含むことができる。そのような物質は毒性がなく、さらに活性成分の有効性に干渉するべきではない。前記担体または他の物質の正確な性質は投与ルート（例えば経口、静脈内、皮内もしくは皮下、経鼻、筋肉内、腹腔内ルート）に左右される。
経口投与用医薬組成物は錠剤、カプセル、散剤または液状形であろう。錠剤は固形の担体、例えばゼラチンまたはアジュバントを含むことができる。液状医薬組成物は一般的には液状担体、例えば水、ワセリン、動物もしくは植物油、鉱物油または合成油を含むことができる。生理的食塩水溶液、デキストロースまたは他の糖類溶液またはグリコール（例えばエチレングリコール、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコール）を含むことができる。
静脈内、皮内もしくは皮下注射または患部への注射の場合、活性成分は非経口的に許容できる水溶液の形態であろう。前記水溶液は発熱物質を含まず、適切なpH、等張性および安定性を有する。当業者は、例えば等張な担体溶媒（例えば塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、乳酸リンゲル液）を用いて適切な溶液を調製することができよう。保存料、安定剤、緩衝剤、抗酸化剤および／または他の添加物も必要に応じて含まれる。
したがって本発明はさらに、医薬として使用される本発明の方法によって製造されるポリペプチドを提供し、さらに疾患の処置、治療および／または診断で使用される医薬の製造における本発明の方法によって製造されるポリペプチドの使用を提供する。
各個体に投与されるべきものが本発明によって作製され続いて特定されたポリペプチド（例えば抗体、そのフラグメント、酵素）であれ、ポリヌクレオチドまたは核酸分子であれ、好ましくは、投与は“予防的に有効な量”または“治療的に有効な量”（事例に応じて（ただし予防も治療と考えられるが））で実施され、前記は前記個体に利益を示すために十分な量である。投与される実際の量並びに投与の割合およびタイムコースは治療されるべき事象の性質および重篤度に左右されるであろう。治療の指示（例えば投薬量の決定など）は一般開業医および他の専門医の責任の範囲内であり、典型的には治療されるべき疾患、個々の患者の状態、デリバリー部位、投与方法および医師に公知の他の要因が考慮される。上記に記載した技術およびプロトコルの例は以下の文献に記載されている：Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed., A. Osol(ed), 1980。
また別には、標的照準系（例えば抗体または細胞特異的リガンド）を用いて標的照準療法により、活性物質を一定の細胞タイプに更に特異的にデリバーすることができる。標的照準は種々の理由から好ましいであろう。例えば、前記物質が許容不能なほど毒性をもつ場合、またはそうでなければ極めて高い投与量が要求される場合、またはそうでなければ標的細胞に侵入できない場合である。
前記物質を直接投与する代わりに、細胞内に導入した、例えばウイルスベクター中のコード遺伝子から発現させることによって標的細胞内で前記物質を産生させてもよい［前記はVDEPT技術の変法である。すなわち、活性化物質（例えば酵素）をウイルスベクター中のコードDNAから発現させることによってベクター内で生成される］。前記ベクターは治療されるべき特異的細胞に誘導されるか、または前記ベクターは調節エレメントを含み、前記エレメントは多かれ少なかれ前記標的細胞に選択的にスイッチを入れられる。
また別には、前記物質は前駆体形で投与され（または標的細胞に誘導され）、治療されるべき細胞内で活性化物質によって活性な形態に変換させることができる。このタイプのアプローチはときにADEPTまたはVDEPTとして知られている。前者は細胞特異的抗体の結合により活性化物質を細胞に誘導する工程を必要とし、一方後者は、ウイルスベクター中のコードDNAから発現させることにより活性化物質（例えば酵素）をベクターで生成することを必要とする（例えば欧州特許公開EP-A-415731号明細書およびPCT国際公開公報WO90/07936号を参照されたい）。
組成物は単独で投与してもよく、または他の処置と併用して（治療されるべき症状に応じて同時にまたは連続して）投与してもよい。
さらに別の選択肢として、本発明の方法によって所望の特徴を有すると特定されたポリヌクレオチドを遺伝子療法で用いて、前記ポリヌクレオチドによってコードされる活性なポリペプチドを合成することができないか、または正常なレベルで前記を合成することができない患者を治療し、それによって対応する野生型タンパク質により提供される効果を提供することができる。
従来技術では種々の多様な標的細胞にポリヌクレオチドを導入するためにベクター（例えばウイルスベクター）が用いられてきた。典型的にはベクターは標的細胞に暴露され、それによりトランスフェクションが十分な割合の細胞で発生して有用な治療的または予防的効果が所望のポリペプチドの発現により提供される。前記トランスフェクトされた核酸は、標的とされた腫瘍細胞の各々のゲノムに永久的に取り込まれ、長期間持続する作用を提供することができる。また別には前記治療は周期的に繰り返す必要があってもよい。
多様なベクター（ウイルスベクターおよびプラスミドベクターの両者）が当分野で公知であり、米国特許第5,252,479号明細書およびPCT国際公開公報WO93/07282号を参照されたい。特に多数のウイルスが遺伝子伝達ベクターとして用いられてきた。前記には例えばSV40、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス（HSVおよびEBVを含む）およびレトロウイルスが含まれる。従来の多くの遺伝子療法プロトコルでは、損傷をもつネズミレトロウイルスが用いられてきた。
ウイルスベクター使用の代替として、核酸を細胞に導入する他の公知の方法には、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム共沈澱、機械的技術（例えばマイクロインジェクション）、リポソーム仲介およびDNA直接取り込みによる伝達、並びにレセプター仲介DNA伝達が含まれる。
上記で述べたように、ポリペプチドまたはその活性な部分をコードする核酸を用いる遺伝子療法の目的は、前記核酸の発現生成物の量を細胞内で増加させることである（前記細胞内の野生型ポリペプチドレベルは皆無か、または低レベルで存在するのみである）。前記のような処置は既に癌性である細胞の処置では治療的であり、スクリーニングにより感受性対立遺伝子をもち、したがって例えば癌の素因をもつことが発見された個体の処置では予防的であろう。
本発明はまた、所望の特徴をもつポリヌクレオチド配列または配列集団を作製するためのキットを提供する。前記キットは、ssDNAの調製用試薬、エキソヌクレアーゼおよびPCRを実施するための成分（例えば耐熱性DNA（ヌクレオチド））および停止装置（例えばEGTA）を含む。
上記に概略したように、本発明は、突然変異が誘発された酵素遺伝子配列の作製および所望の特徴を有する機能的な酵素を目的とするそれら配列のランダムな組合せを簡便に提供する。本発明のこの特徴の例として、約0.7％の変異率をもたらすエラー誘発PCRによって酵素遺伝子の突然変異が誘発される。得られた変異酵素遺伝子プールを続いてエキソヌクレアーゼ（例えばBAL31）で消化する。前記反応は種々の時点でEGTAの添加または熱不活化によって抑制され、種々のサイズをもつDNAフラグメントセットが得られる。続いて前記を上記の記載のようにDNAフラグメントをPCRによる再アッセンブリーに付す。得られた再アッセンブリングされたDNAフラグメントを続いてクローニングし遺伝子ライブラリーを構築する。続いてこのライブラリーからクローンを選別し配列を決定する。
本技術のさらに別の応用は、更なる選別および分析に用いることができる多様なDNA配列集団の作製である。大きなタンパク質（例えば抗体フラグメントおよび酵素）をコードする他に、前記DNAはペプチドをコードし、この場合、機能的な特徴をもつ分子を種々の選別系のデザインに用いることができる。ペプチドをコードする組換えDNA配列の選別は以前に報告された（Fisch et al., PNAS. USA, (1996, Jul., 23), 93(15):7761-7766）。さらにまた、前記多様なDNA集団を用いて、例えば触媒活性を有するRNA分子集団を生成することができる。Vaishら（PNAS. USA, (1998, Mar. 3), 95(5):2158-2162）は、触媒性RNAの選別のために機能する系のデザインを示し、さらにF. Eckstein（Ciba Found. Symp. 209:207-212(1997)）は、触媒性RNAの細胞への特異的導入による触媒性RNAの利用を概略した。前記の系を用いて、組換えDNA配列を基に触媒活性をもつ機能的ペプチドおよび／または分子の選別における更なる検索を配列スペースにより実施することができる。
本発明の特徴および実施態様を添付の図面を参考にこれから実施例として例示する。更なる特徴および実施態様が当業者には明白であろう。
実施例
DNAシャッフリング方法は図１から図５に示した工程によって示すことができる。プラスミドpFab5chis中の問題のタンパク質（X）をコードする遺伝子を本実施例で用いる。ランダム突然変異をエラー誘発PCRによって導入する。一本鎖DNAを調製する。前記は、上記で考察したように、ビオチン付加プライマーまたは一本鎖DNAをパッケージすることができるファージの使用のどちらかによって実施できる。コードまたは非コードssDNA鎖を別個の反応（AおよびB）で調製する。どちらかの反応に由来するssDNAを例えばBAL31を用いて別々の酵素処理に付す。等モル量の一本鎖DNAフラグメントの２つのプールを混合し、２つの連続するPCR反応（第一の反応はプライマーを含まない）を使用することによって、前記遺伝子をシャッフリングされた状態で再アッセンブリーさせる。再アッセンブリーされた遺伝子のこのライブラリーをpYでクローニングした後、選別を実施して問題の分子の改良を達成することができる。
本発明の実施例のさらに詳細な記載は下記に示す。
実施例１
試薬：アンプリタック（AmpliTaq（登録商標））ポリメラーゼはパーキンエルマー社（Perkin-Elmer Corp.）から、dNTPはベーリンガー・マンハイム・バイオケミカ（Boehringer Mannheim Biochemica, Mannheim, Germany）から、さらにBAL31ヌクレアーゼはニューイングランド・バイオラブ社（New England Biolabs Inc., Beverly, USA）から購入した。全ての制限酵素はニューイングランド・バイオラブ社（New England Biolabs Inc., Beverly, USA）から購入した。臭化エチジウムは、バイオラド・ラボラトリーズ（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA）から購入した。T4DNAリガーゼは、ニューイングランド・バイオラブ社（New England Biolabs Inc., Beverly, USA）から購入した。EDTAおよびEGTAはケボ・ラブ（Kebo Lab, Sweden）から購入した。
全てのプライマーは本研究室でデザインし、ライフ・テクノロジーズ（Life Technologies, Taeby, Sweden）およびSGS-DNA（Koeping, Sweden）から入手した。
PCR：すべてのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は自動サーモサイクラー（Perkin-Elmer Cetus 480, Norwalk, CT, USA）で実施した。核酸増幅のためのPCR技術は米国特許第4,683,195号明細書に記載されている。PCR技術の一般的な使用についての参考文献は以下の文献に含まれている：Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51:263(1987); Ehrlich (ed), PCR technology, Stockton Press, NY, 1989; Ehrlich et al., Science 252:1643-1650(1991); "PCR protocols; A Guide to Methods and Applications", Eds. Innis et al., Academic Press, New York, 1990。
配列決定：全ての構築物は、ビッグダイ・ターミネーターサイクル配列決定キット（BigDye Terminator Cycle Sequencing kit, Perkin-Elmer, Elmervill, CA, USA）を使用して配列が決定された。配列決定はABIプリズム（Prism）377DNAシークェンサーで実施した。
アガロース電気泳動：DNAのアガロース電気泳動は、0.25μg/ｍLの臭化エチジウムを用い２％アガロースゲル（AGAROSE, FMC Bioproducts, Rockland, ME, USA）でトリス酢酸緩衝液（TAE緩衝液、0.04Mトリス酢酸、0.001MのEDTA）中で実施した。電気泳動用サンプルは、25％フィコールおよびブロモフェノールブルーを含む滅菌ろ過ローディング緩衝液と混合し、２％アガロースゲルのウェルにロードした。電気泳動は、特に記載がなければ、0.25μg/ｍLの臭化エチジウムとともにトリス酢酸緩衝液中で90V、45分泳動させた。必要な場合は、適切なサイズのバンドをキアクィック・ゲル・エキストラクションキット（Qiaquick Gel Extraction Kit, Qiagen GmbH, Hilden, Germany）を用いてゲル精製した。分子量標準物として、DNA分子量マーカー１kbラダー（Gibco BRL）を用いた。ゲルから抽出した生成物のDNA濃度は分光光度計を用いて概算した。
細菌株：大腸菌株TOP10F'を形質転換用の細菌ホストとして用いた。前記株の化学的にコンピテントな細胞を基本的に文献（D. Hanahan, 1983, Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166:557-580）に記載されたように作製した。前記細胞株の電気的にコンピテントな細胞を作製した（W.J. Dower, J.F. Miller and C.W. Ragsdale, 1988: High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation. Nucleic Acids Res. 16:6127）。
プラスミド：全ての遺伝子操作は文献（Molecular cloning; a laboratory manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）にしたがってpFab5chisで実施した。前記ベクターは、SfiIおよびNotI部位に挿入された任意のscFv遺伝子を繋留するためにデザインされている。SfiIはpelBリーダー内に位置し、NotI部位は、VH-リンカーVLが挿入できるようにVL領域の真後ろに位置している。本事例では、CD40に対して誘導した抗体が用いられた。
プライマー：
pFab5chisの抗体遺伝子を取囲む２つのビオチン付加プライマーを、指定の固有制限部位を含む以下の配列を用いてデザインした：
1736SfiIフォワードプライマー：および
5'-ATT ACT CGC GGC CCA GCC GGC CAT GGC CCA CAG GTC AAG CTC GA
1735Notiリバースプライマー：
5'-TTA GAG CCT GCG GCC GCC TTG TCA TCG TCG TCC TT
pFab5chisの抗体遺伝子を取囲む２つの非ビオチン付加プライマーを、指定の固有制限部位を含む以下の配列を用いてデザインした：
1664SfiIフォワードプライマー：および
5'-ATT ACT CGC GGC CCA GCC GGC CAT GGC CCA CAG GTC AAG CTC GA
1635NotIリバースプライマー：
5'-TTA GAG CCT GCG GCC GCC TTG TCA TCG TCG TCC TT。
スタンダードPCR：スタンダードPCR反応は以下のプロフィルからなる25サイクルで実施した：変性（94℃、１分）、プライマーアニーリング（55℃、１分）および伸長（72℃、３分）。各PCR反応は最終容積100μL中に以下を含んでいた：10ｍMトリス塩酸（pH8.3）、50mMのKCl、1.5mMのMgCl2、200μMのdNTP、1μMのフォワードプライマー、1μMのリバースプライマー、1.25Uのアンプリタック（AmpliTaq（登録商標））耐熱性DNAポリメラーゼ（Perkin-Elmer Corp.）、および50ngの鋳型。
エラー誘発PCR：エラー誘発PCR反応は、500mMのNaCl、100mMのトリス塩酸（pH8.8）、5mMのMgCl2、100μgのゼラチンを含む10倍緩衝液［Kuipersら（Nucleic Acids Res. 19(16):44558(1991, Aug25)）にしたがったがMgCl2濃度は2mMから5mMに増加させた］で実施した。
各々100μLの反応に以下を混合した：
dATP 5mM 5μL
dGTP 5mM 5μL
dTTP 10mM 10μL
dCTP 10mM 10μL
20μMの3'プライマー 1.5μL
20μMの5'プライマー 1.5μL
10倍のクィパース（Kuipers）緩衝液 10μL
滅菌mpH2O 46.3μL
Fab5chisベクター中の鋳型は50ngの量で添加された。10ｍMのMnCl2を10μL添加し、前記試験管にMnO2の沈澱が発生していないことをチェックした。最後にタック（Taq）酵素5単位を添加した。エラー誘発PCRは、ホットスタートを実施せずに以下の温度で25サイクル実施した：94℃で1分：45℃で1分；72℃で1分、さらに72℃で7分。得られた生成物は、タンパク質全体にエラーを起しやすい約750bpの挿入物であった。前記挿入物を更なる処理の前にギブコ（Gibco）のPCR精製キットを用いて精製した。
ビオチン付加プライマーによる一本鎖DNAの生成：問題のフラグメントを２つの別々のPCR反応によって増幅させた。これらの反応は上記に記載したスタンダードPCRでも、同じく上記に記載したエラー誘発PCRでもよい。プライマーは、一方の反応ではフォワードプライマーがビオチン付加され、他方の反応ではリバースプライマーがビオチン付加されるようにデザインされねばならない。例えば、（A）プライマー1736および1635、並びに（B）プライマー1664および1735を用いる上記のプロフィルによるPCR反応は、鋳型としてpFab5chis抗体を用い25サイクルを実施した。前記反応によって約750bpのPCR生成物が得られ、この場合Aでは上方鎖がビオチン化され、Bでは下方鎖がビオチン化された。
非ビオチン化鎖はストレプトアビジンで被覆した固相マトリックス（例えばダイナビーズ）を用いる精製によって回収した。磁性ビーズは、PBS/1％BSAおよびB&W緩衝液（5mMトリス（pH7.5）、１MのNaClおよび0.5mMのEGTAを含む）で洗浄および平衡化させた。各PCR生成物100μLを2倍のB&W緩衝液に溶解させた100μLのビーズと混合し、室温で15分回転させながらインキュベートした。未結合のPCR生成物をB&Wで注意深く2回洗浄することによって取り除いた。捕捉されたDNAの非ビオチン化鎖を、前記DNAを0.1MのNaOH（25μL）とともに10分室温でインキュベートしてアルカリ変性させることにより溶出させた。前記溶液をビーズから分離し、0.33MのHCｌ（7.5μL）および1Mトリス（pH8）で中和した。
ファージによる一本鎖DNAの生成：問題のフラグメントをバクテリオファージM13ベクター、M13mp18およびM13mp19でPstI/HindIII制限酵素を用いてクローニングした。前記バクテリオファージは大腸菌株TOP10F'を用いて通常の方法により増殖させた。上方鎖に対する一本鎖DNAはバクテリオファージベクターM13mp18から調製し、下方鎖に対する一本鎖はバクテリオファージベクターM13mp19から調製した。簡単に記せば、感染させた細菌の培養1.5ｍLを12000g、5分、4℃で遠心した。上清を200μLの20％PEG8000/2.5MNaClで沈澱させた。沈澱したバクテリオファージを100μLのTEに再懸濁させた。50μLのフェノール（トリス塩酸（pH8.0）で平衡化）を添加し、サンプルをヴォーテックスミキサーで攪拌した。室温で12000g、1分遠心後、上層（DNAを含む）を取り出し、エタノールで沈澱させた。DNAペレットを50μLのTE（pH8.0）に溶解させ、-20℃で保存した（Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989, chapter 4）。ファージから調製した一本鎖DNAは環状で、BAL31処理の前に開環しなければならない。前記開環は一本鎖DNAを切断することができるエンドヌクレアーゼにより実施した。
不整PCRによる一本鎖DNAの生成：PCR生成物はスピンカラムを用いて精製し、過剰のプライマーを先のPCRから除去した。150ngの精製生成物を鋳型としてリニアアンプリフィケーションで用いた。前記リニアアンプリフィケーションは、100μLの１倍ジーンアンプ（GeneAmp（登録商標））、10倍のPCR緩衝液で実施し、前記緩衝液は以下を含んでいた：1.5mMのMgCl2（Applied Biosystems）、200μMの各ｄNTP（New England Biolabs）、1.25Uのアンプリタック（AmpliTaq（登録商標））DNAポリメラーゼ（Applied Biosystems）および1.0μMの単一プライマー。PCRサイクル条件は以下のとおりである：94℃で1分の変性、94℃30秒、55℃30秒、72℃1分の35サイクル、続いて72℃で7分の伸長。
不整PCR生成物を二本鎖鋳型から1％アガロースゲルでサイズ分離し、さらにキアクィックゲル抽出キット（Qiagen）を用いて精製した。
BAL31による一本鎖フラグメント化DNAの作製：ssDNA鎖（それぞれ上方鎖および下方鎖を含む）を例えばBAL31を用いて別々に酵素処理した。各消化反応は以下を含んでいた：0.02μg/μLのssDNA、600mMのNaCl、20mMのトリス塩酸、12ｍMのCaCl2、12mMのMgCl2、1mMのEDTA（pH8.0）および0.1から5U/mLの範囲にある種々の酵素濃度のBAL31。前記反応物を30℃でインキュベートし、消化されたssDNA部分を10、30、60および120秒またはそれ以上の時間で連続的に採集した。反応はEDTAの添加および65℃で10分の熱処理によって停止させた。ssDNAフラグメントをフェノール/クロロフォルム抽出およびエタノール沈澱によって精製した。前記ssDNAを10mMのトリス（pH8.0）に再懸濁させる。
消化パターンは１％アガロースゲル電気泳動によって調べた。
消化により生成されたフラグメントの精製：消化されたDNAフラグメントをフェノール/クロロフォルム/イソアミルアルコール抽出によって精製した。50μLの緩衝化フェノールをクロロフォルムとイソアミルアルコール（24：1）の混合物50μLとともに100μLのサンプルの各試験管に加えた。前記試験環をヴォルテックスミキサーで30秒攪拌し、続いてマイクロフュージで14000rpm、１分遠心した。続いて上層を採集し、2.5容の99.5％エタノールと混合した（1/10は3Mの酢酸ナトリウム（pH5.2）であった）。前記DNAを‐80℃で1時間沈澱させた。続いて前記DNAをマイクロヒュージで14000rpm、30分遠心して沈澱させた。ペレットを70％のエタノールで1回洗浄し、続いて10μLの滅菌水に再溶解させた。
精製した消化生成フラグメントのアガロースゲルでの分析：ブランクおよび各時点で得られた溶解ペレットの5μLを2.5μLのローディング緩衝液（25％フィコールおよびブロモフェノールブルー）と混合し、2％アガロースゲルのウェルにロードした。種々の時点の電気泳動は上記のように実施した。
完全長フラグメントの再アッセンブリー：ssDNAフラグメントの再アッセンブリーは2つの連続PCR反応によって達成される。第一のPCR反応は以下を含む：10ｍMトリス塩酸（pH8.3）、50ｍMのKCｌ、1.5mMのMgCl2、200μMのｄNTP、0.3Uのタック（Taq）ポリメラーゼおよび2μLのBALB31処理サンプル。前記反応は全て最終容積25μLで以下のプロフィルの5サイクルに付された：94℃で1分、50℃で1分および72℃で2分＋72℃で5分。第二のPCR反応は以下を含む：10ｍMトリス塩酸（pH8.3）、50ｍMのKCｌ、1.5mMのMgCl2、200μMのｄNTP、0.6Uのタック（Taq）ポリメラーゼ、1μMのフォワードプライマー、1μMのリバースプライマーおよび第一のPCR反応のサンプル（5μL）。前記反応は全て最終容積50μLで以下のプロフィルの15サイクルに付した：94℃で1分、55℃で1分および72℃で2分＋72℃で7分。得られた生成物はアガロースゲル電気泳動で調べることができる。
再アッセンブリングしたフラグメントおよびプラスミドのSfiIおよびNotIによる制限消化：再アッセンブリングしたフラグメントおよびプラスミドpFab5chisをBSAおよび11U酵素/μgDNAを含むNEB緩衝液２を用いて先ずSfiIで切断した。前記反応は50℃で4時間実施した。その後、前記DNAを変換緩衝液および6U酵素/μgDNAを添加することによってNotIで切断した。前記反応は37℃で一晩実施した。
制限消化ベクターおよび制限消化再アッセンブリングフラグメントのゲル精製：前記切断反応物を１％アガロースゲルで分析した。制限消化された挿入物は約750bpの切断生成物を示した。これは予想サイズとよく一致する。切断挿入物およびプラスミドのバンドを切り出し、以前に記載されたようにゲル抽出した。
制限消化した再アッセンブリングフラグメントと制限消化pFab5chisの連結：精製した切断pFab5chisを精製した制限消化再アッセンブリングフラグメントと12℃の水浴中で16時間連結した。50μLのベクターを50μLの挿入物および15μLの10倍緩衝液（酵素とともに供給される）、7.5μLのリガーゼ（5U/μL）および滅菌水と150μLの最終容積で混合した。挿入物のない制限消化pFab5chisの連結もまた同じ態様で実施した。
化学的にコンピテントな大腸菌TOP10F'の連結再アッセンブリングさせた挿入物およびpFab5chisによる形質転換：連結反応物は上記に述べたようにフェノール/クロロフォルム抽出によって精製した。抽出物の上層を採集し、2.5容の99.5％エタノールと混合した（1/10は3Mの酢酸ナトリウム（pH5.2）であった）。前記DNAを‐80℃で1時間沈澱させた。続いて前記DNAをマイクロヒュージで14000rpm、30分遠心して沈澱させた。ペレットを70％のエタノールで1回洗浄し、続いて10μLの滅菌水に再溶解させた。各連結物の5μLをそれぞれ別個に95μLの化学的にコンピテントな大腸菌TOP10F'と混合し、氷上で1時間インキュベートし、続いて形質転換させた（Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989）。1時間増殖させた後、2つの形質転換物に由来する細菌をアンピシリン含有寒天平板（100μg/ｍL）上にスプレッドした。前記平板をさかさまにして37℃のインキュベーターで14時間増殖させた。
実施例２
組換え頻度；dsDNAおよびssDNAの比較
更なる比較実験で、3つのscFv抗体フラグメントをdsDNAまたはssDNAのどちらかとして組換え実験に用いた。
dsDNA：3つのscFv遺伝子をフォワードおよびリバースプライマー並びにスタンダードPCR方法を用いてそれぞれ増幅させた。バンドのサイズをアガロース電気泳動で確認し、増幅PCR生成物の残りをコンサート（Concert）PCR精製キット（Gibco）を用いて精製した。前記3つのscFv由来のdsDNAを等モル量で混合し、BAL31で処理した。各消化反応物は、0.02μg/μL反応容積の濃度のdsDNA、600mMのNaCl、20mMのトリス塩酸、12ｍMのCaCl2、12mMのMgCl2、1mMのEDTA（pH8.0）および種々の酵素濃度（4、20または100U酵素/mL反応容積を用いた）のBAL31を含んでいた。前記反応物を30℃でインキュベートし、消化されたdsDNAの部分を10、30および50分で連続的に採集した。反応はEDTAおよび熱処理によって停止させ（また場合によってEDTAを含まない熱不活化プロトコルを用いてもよい、下記を参照されたい）、さらにフェノール/クロロフォルム抽出およびエタノール沈澱を用いて精製した。前記dsDNAを10mMのトリス（pH8.0）に再懸濁させた。
各時点を別個に保持し、サンプルをプロトコルにしたがって再アッセンブリーPCR（この再アッセンブリーに60ngのDNAを用いる）および増幅PCRに付し、さらにｐGEM（製品番号A362A、Promega, Madison, USA）でクローニングした。各時点について18個のクローンの配列を決定し、組換えの数および頻度を決定した。
エキソヌクレアーゼ消化の熱不活化：EDTAを用いないでBAL31反応を停止させるプロトコルが確立されている。この熱不活化プロトコルによって、健康に問題を生じさらに材料の損失を招くフェノール/クロロフォルム抽出の使用が回避される。
簡単に記せば、サンプルを95℃で10分インキュベートし、続いて直ぐに氷中に入れて酵素反応を停止させる。この後直ぐにサンプルをエタノールを用いて沈澱させることができる。
ssDNA：3つのscFv遺伝子をプライマー対、フォワード/リバース‐ビオチンおよびフォワード‐ビオチン/リバース並びにスタンダードPCR方法を用いて2つのPCRによりそれぞれ増幅させた。バンドのサイズをアガロース電気泳動で確認し、増幅PCR生成物の残りをコンサート（Concert）PCR精製キット（Gibco）を用いて精製した。一本鎖DNAはプロトコルにしたがって磁性ビーズを用いて得られ、3つのセンス鎖および3つのアンチセンス鎖を得た。それぞれ3つのscFvに由来するセンス鎖およびアンチセンス鎖を等モル量で混合し、BAL31でプロトコルにしたがって処理し（1.25または11U酵素/mL反応容積および0.015μg/μL反応容積の濃度のssDNAを用いる）、サンプルを0（すなわち未消化）、10、30および50分で取り出した。反応はEDTAおよび熱処理によって停止させ、さらにフェノール/クロロフォルム抽出およびエタノール沈澱を用いて精製した。各時点を別個に保持し（ただしセンス鎖およびアンチセンス鎖を混合する）、サンプルをプロトコルにしたがって再アッセンブリーPCR（この再アッセンブリーに60ngのDNAを用いる）および増幅PCRに付し、さらにｐGEMでクローニングした。各時点について18個のクローンの配列を決定し、組換えの数および頻度を決定した。
結果
20U/mL反応容積（0.02μg/μLDNAを含む）を用いて10分処理することによってdsDNAで最高頻度の組換えが達成された。前記によって39％のクローンが1回の交差を示し（図6）、17％のクローンが2回の交差を示した（図7）。4U酵素/mLを使用した場合、フラグメント化の時間にかかわらず交差は生じず、100U酵素/mLは完全なフラグメント化をもたらし非常に小さなフラグメントを生じ、このことは再アッセンブリー時に完全長遺伝子を得ることができないことによって示唆された。
ssDNAを用いた実験結果は図8から図10に示されている。図8は1.25U/mLBAL31および1回交差をもつクローンを示し、図9は1.25U/mLBAL31および2回交差をもつクローンを示している。図10は11U/mLBAL31および1回交差をもつクローンを示し、図11は11U/mLBAL31および2回交差をもつクローンを示している。
11U酵素/mLを用いて10分処理することによってssDNAの1回酵素をもたらす最高頻度の組換えが達成された（図10）。59％のクローンが1回の交差を示した。1.25U酵素/mLを用いて30分処理することによって2回酵素をもたらす最高頻度の組換えが達成された（図9）。20％のクローンが2回の交差を示した。
結論および考察
これらのデータは、より高い組換え頻度はssDNAを用いて達成されることを明瞭に示している。使用した3つのscFvは同じフレームワークの配列をもち、報告した交差の回数は、配列の相違を生じない領域の交差のために高くなっていることを示唆している。3つの全ての分子から得られる全ての鎖を混合したので、ssDNAを用いたこれらの実験は、最大組換えを示すために非最適態様で実施された。1つのscFv由来のセンス鎖を別のscFv由来のアンチセンス鎖と混合することによってより高い交差頻度が得られるであろう（下記実施例3参照）。さらにまた、各々の時点はここでは別々に保持されており、種々の時点（すなわち種々のフラグメントサイズ）を混合した場合、交差頻度の概算値は増加すると考えるのは論理的であろう。
実施例３
組換え頻度；ssDNAを用いた相同性依存
交差を達成するために必要な相同性を調べるために、以下のように種々の相同性を有する3つのペアを構成する4つのscFv（SMUC159、CT17、AE11およびMO152と称する）の組換え実験を設定した：
SNUC159−CT17 92％
SMUC159−AE11 70%
SMUC159−MO152 60%
前記4つのscFv遺伝子はそれぞれ、プライマー対、フォーワード/リバース-ビオチンおよびフォワード-ビオチン/リバースおよびスタンダードPCR法を用いて2つのPCR反応で増幅させた。バンドのサイズをアガロース電気泳動で確認し、増幅PCR生成物の残りをコンサート（Concert）PCR精製キット（Gibco）を用いて精製した。一本鎖DNAは磁性ビーズを用い前記プロトコルにしたがって得られ、4つのセンス鎖および4つのアンチセンス鎖が生成された。各鎖を前記プロトコルにしたがってBAL31で処理し（4.2または12.5U酵素/mLを使用）、サンプルは0、10、30および50分、または0、15、30、45および60分で採取した。反応はEDTAおよび熱処理によって停止させ、さらにフェノール/クロロフォルム抽出およびエタノール沈澱を用いて精製した。各時点を別個に保持したが、上記に示したようにセンス鎖およびアンチセンス鎖を混合して対を形成させ、サンプルを前記プロトコルにしたがって再アッセンブリーPCRおよび増幅PCRに付し、さらにｐGEMでクローニングした。各時点について15個のクローンの配列を決定し、組換えの数および頻度を決定した。
結果
交差はscFvの全ての組合せで特定され、60％の低い相同性が組換えの発生に十分であることが示された。
実施例４
エキソヌクレアーゼを用いたフラグメントサイズ制御の改善
（A）エキソヌクレアーゼ
我々は、本発明の方法におけるフラグメント化のために、例えば以下のエキソヌクレアーゼを用いた：BAL31、エキソヌクレアーゼI、エキソヌクレアーゼＶ、エキソヌクレアーゼVII、エキソヌクレアーゼT7遺伝子6、バクテリオファージラムダエキソヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼRecJf。前記の酵素は一度に1つのヌクレオチドを5'末端からまたは3'末端からまたは両端から切断除去する。反応は、使用した酵素に応じてEDTAおよび熱処理（上記参照）によって停止させることができる。このことは、ただ１つのヌクレオチドが異なる全ての可能なサイズのフラグメントを得ることができることを意味する。
以下の実施例は、エキソヌクレアーゼ消化が、使用条件に応じて種々の制御可能なサイズのフラグメントの生成をどのように可能にするかを示す。
BAL31：実施例１のプロトコルにしたがい、4.2U/mL反応容積の酵素濃度および0.008μg/μL反応容積のssDNA濃度で一本鎖DNAをBAL31で消化した。
典型的な実験では、約300ngのDNAをBAL31処理の各時点で単離した。図12はそのような実験のアガロース電気泳動ゲル像を示し、未処理ssDNAはレーン4に、処理ssDNAの10分はレーン3に、30分はレーン2に、さらに50分はレーン1に示されている。レーン5は分子量（MW）標準物である。
図13から15はそれぞれ対応するレーンのゲルクロマトグラフィー図を示している。図13は未処理材料で多数のピークは種々のssDNAの構成を示している。図14はレーン3に対応し、材料は10分処理された。前記材料は熱処理して酵素反応を停止させ、したがって異なる構成を解析して明白に区別される１つのピークが示されている。図15はレーン2に対応し材料は30分処理された。
ここではより大きなフラグメントに対応するピークが減少し、より小さなDNAフラグメントのピークが出現したのが明瞭である。
エキソヌクレアーゼVII：7.7U/mL反応容積の酵素濃度および0.008μg/μL反応容積のssDNA濃度を用いて一本鎖DNAをエキソヌクレアーゼVIIで消化した。前記反応緩衝液は、67ｍMのリン酸カリウム（pH7.9）、10mMのメルカプトエタノール、6.7mMのMgCl2、および8.3ｍMのEDTAを含んでいた。
前記反応は、熱不活性化（95℃、5分）によって停止させる前に37℃で10、20および30分進行させた。
図16にエキソヌクレアーゼVIIを用いたフラグメント化パターンが示されている。レーン1はMW標準物、レーン2は未処理ssDNA、レーン3はエキソヌクレアーゼVIIで10分フラグメント化したssDNA、レーン4はエキソヌクレアーゼVIIで20分フラグメント化したssDNA、さらにレーン5はエキソヌクレアーゼVIIで30分フラグメント化したssDNAである。前記は、フラグメントサイズは時間にしたがって減少することを示している。
エキソヌクレアーゼRecJ f ：0.36U酵素/μgDNAおよび1.4U酵素/μgDNAのそれぞれに対して、2.5U/mL反応容積または10U/mL反応容積のどちらかの酵素濃度および0.007μg/μL反応容積のssDNA濃度を用いてエキソヌクレアーゼRecJfで一本鎖DNAを消化した。前記反応緩衝液は、50ｍMのNaCl、10mMのトリス塩酸、10mMのMgCl2、および1mMのジチオスレイトールを含んでいた（pH7.9）。
前記反応は、熱不活性化（95℃、5分）によって停止させる前に37℃で10、20および30分進行させた。
図17には0.36U/μg・ssDNAのエキソヌクレアーゼRecJfを用いたフラグメント化パターンが示されている。レーン1は未処理ssDNA、レーン2はエキソヌクレアーゼRecJfで10分フラグメント化したssDNA、レーン3はエキソヌクレアーゼRecJfで20分フラグメント化したssDNA、さらにレーン4はエキソヌクレアーゼRecJfで30分フラグメント化したssDNAである。前記はフラグメントサイズが時間にしたがって減少することを示している。図18では酵素濃度は4倍増加し（1.4U/μg・ssDNA）、図17と比較してより高度のフラグメント化を示す0から30分のフラグメント化が示されている。前記は、時間および酵素濃度の両方をフラグメント化の制御に用いることができることを示している。
（B）エンドヌクレアーゼ
通常のDNAシャッフリング方法は典型的にはフラグメント化のためにDNアーゼIを用いる（例えば以下を参照されたい：Stemmer, 1994, Nature 370:389-391）。DNアーゼIは、ピリミジンの近傍部位でエンドヌクレアーゼ的態様によりDNAを切断する。結果として全ての可能なフラグメントサイズが得られるというわけではない。
さらにまた、反応緩衝液中でマグネシウムを使用することによって、モノマーおよびオリゴマーの均質混合物が得られる。したがって種々のサイズのフラグメントを単離するために種々の方法（例えばアガロース電気泳動精製またはゲルろ過）を用いる必要がある。小さなサイズのフラグメントまたは大小フラグメントの混合物が最適な組換えのためにはしばしば要求される。しかしながら、前記の精製方法は二本鎖PCR生成物に一本鎖の切れ目を導入する。ゲルで精製された特定のサイズのフラグメントはしたがって、変性に際して多くのより小さなフラグメントを生じることとなる大量の一本鎖の切れ目を含むdsDNAからなるであろう。このことは、変性に際して生じる一本鎖フラグメントの多くは、アニーリング中に短すぎてプライマーとして機能できず生成物の非常な損失をもたらすことを意味する。
反応緩衝液でマンガンを使用することによって、50bpより小さいサイズのフラグメントが生成され、ゲル精製は不要である。しかしながら、この場合小さなフラグメントしか使用できず、それらフラグメントは大きなフラグメント（おそらく組換え頻度を高めるもの）と混合できない。
エンドヌクレアーゼの使用に伴う問題は以下の実験で示される。
DNアーゼI：DNAを0.15U/μgDNAの濃度でDNアーゼIで5分消化した。
マグネシウムおよびマンガン緩衝液をDNアーゼIによるフラグメント化時に比較し、結果を図19に示した。レーン1はMW標準物、レーン2はMg緩衝液中の未処理ssDNA、レーン3は文献（Stemmer, 1994, Nature 370:389-391）にしたがってMg緩衝液中でDNアーゼIによりフラグメント化したssDNA、レーン4はMn緩衝液中の未処理ssDNA、レーン5は文献（Kikuchi et al., 2000, Gene 243:133-137）にしたがってMn緩衝液中でDNアーゼIによりフラグメント化したssDNAである。Mgおよび上掲書（StemmerおよびKikuchi）の条件を用いたとき、フラグメント化は生じないことは図19から明瞭である。さらにまた、Mnおよび上掲書（StemmerおよびKikuchi）の条件を用いたとき、全ての材料はわずか数分以内に完全にフラグメント化される。
種々のサイズのフラグメントを得るために、我々はMg緩衝液を用い、酵素濃度を増加させることにした。図20はDNアーゼIを用いたそのような実験のアガロース電気泳動ゲル画像を示している。レーン1はMW標準物、レーン6は未処理ssDNA、レーン12は上掲書（Stemmerおよびkikuchi）にしたがって処理したssDNA（0.15U酵素/μgDNAを使用）、さらにレーン13は1U酵素/μgDNA（すなわち6倍の酵素）で処理した同じ材料である。
図21から23は対応するクロマトグラフィー図である。未処理のssDNAは熱処理され、したがって図21ではただ1つのピークが出現する（矢印で表示）。図22では、上掲書（Stemmerおよびkikuchi）の量のDNアーゼIを用いたとき、未処理のssDNAのピーク（矢印で表示）はいくぶん減少するが、フラグメント化されたDNAの明瞭なピークは認められない（単なるスメアとして認められる）。6倍の酵素を用いたとき、未処理ssDNAは完全に破壊され（図23）、ここでもフラグメントのピークは全く認められない。
マングビーン（Mung bean）ヌクレアーゼ：DNAを0.375U/mL反応容積の酵素濃度および0.007μg/μL反応容積のssDNAを用いてマングビーンヌクレアーゼで消化した。反応緩衝液は50mMの酢酸ナトリウム、30mMのNaCl、1mMのZnSO4を含んでいた（pH5.0）。
前記反応は、熱不活性化（95℃、5分）によって停止させる前に25℃で10分進行させた。
図24はまた別のエンドヌクレアーゼ、マングビーン（Mung bean）ヌクレアーゼを用いたフラグメント化を示している。レーン1は未処理ssDNA、レーン2は10分処理した同じ材料、レーン3はMW標準物である。
結果は、マングビーンヌクレアーゼ（レーン2を参照）により（製造元の推奨する濃度よりも低い濃度の酵素を用いたにもかかわらず）、わずか10分の消化後に全てのDNAが完全にフラグメント化されることを示している。
結論および考察
上記の実施例はエキソヌクレアーゼを用いてフラグメントサイズをどのように制御できるか、および反応条件（すなわち時間、反応容積、酵素濃度）をどのように変更できるかを示している。種々のピークはゲル画像のクロマトグラフィー図を用いて可視化させた。
対照的にエンドヌクレアーゼ（例えばDNアーゼI）の使用は制御困難な反応をもたらす。文献に示された条件を用いたとき、MgまたはMn含有緩衝液はどちらも典型的には全てがフラグメント化するか全くフラグメント化しない状態を生じる（特に図20を参照されたい）。別のエンドヌクレアーゼ（マングビーンヌクレアーゼ）を用いた実験によって前記の観察が確認された。
実施例５
一本鎖DNA出発材料亜集団の種々のエキソヌクレアーゼによる消化
更なる実験では、一本鎖DNA出発材料を2つの集団に分割し、続いてそれらを種々のエキソヌクレアーゼを用いて消化した。
材料および方法
プラスミド：プラスミドｐBR322のテトラサイクリン欠損変種をSalIおよびBamHI（Roche, Basel, Switzerland）並びにクレノー処理（Amersham Biosciences AB, Uppsala, Sweden）による切断並びに平滑端連結（New England Biolabs, MA, USA）によって構築した。得られたプラスミドをテトラサイクリン感受性についてチェックし、ｐBR322dtetと称した。
pBR322stop1およびpBR322stop3を、固有のプライマー（表1）を用いてｐBR322のテトラサイクリン遺伝子のPCR増幅によって作製した。変異した各テトラサイクリン遺伝子をpBR322でクローニングした。
表１：プライマー配列
pBR322 NheIフォワードストップ：
5'-CACTATGGCGTGCTGCTAGCGCTATATGCGTTGATGCAATTTCT ATGAGCACCCGTTCT-3'
pBR322 EagIリバース：
5'-CGTAGCCCAGCGCGTCGGCCGCCATGCCGGCGATAATG-3'
pBR322 HindIIIフォワード：
5'-CAGCTTATCATCGATAAGCTTTAATGCGGTAGTTTAT-3'
pBR322 SalIリバースstop
5'-TCTCAAGGGCATCGGTCGACGCTCTCCCTTATGCGACTCCTGCATTAGGAATCAGCCCAGTAGTA-3'。
PCR：別に記載がなければ、PCR反応は、4μMの各プライマー、160μMのdNTP（Roche, Basel, Switzerland）、1倍のアンプリタック（AmpliTaq）反応緩衝液、2.5Uのアンプリタック耐熱性DNAポリメラーゼ（Applied Biosystems, CA, USA）を含む。
FIND PCR１：94℃30秒、50℃45秒、72℃1分の5サイクルまたは25サイクル、さらに続いて72℃7分、外部プライマーは入れなかった。
FIND PCR2：94℃30秒、55℃45秒、72℃1分の15、25または50サイクル、さらに続いて72℃7分、外部プライマーを加えた。
一本鎖DNA調製：問題の遺伝子（すなわちtet-r）を固有のプライマー（前記プライマーの１つはビオチン化された）を用いて増幅させた。センスおよびアンチセンス株由来のssDNAをストレプトアビジン-磁性ビーズ（下記のいずれかから購入：Dynal AS, Oslo, NorwayまたはMiltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany）を用い製造元の推奨にしたがって精製した。前記のようにして得たssDNAをさらにエタノール沈澱によるかまたはレコチップ（recochip; TaKaRa, Shiga, Japan）を製造元の推奨にしたがって用いることによって精製した。
FIND実験：FIND実験はDNAをエキソヌクレアーゼで消化することによって開始した。前記DNAは一本鎖（上記のように調製）であり、複製起点はテトラサイクリン耐性遺伝子であった（pBR322stop1またはpBR322stop3, 945bp）。エキソヌクレアーゼはBAL31(0.08−1U/μgDNA、New England Biolabs, MA, USA)、エキソヌクレアーゼI(100U/μgDNA、New England Biolabs, MA, USA)、T7遺伝子6エキソヌクレアーゼ(320U/μgDNA、USB, Cleveland, Ohio, USA)およびエキソヌクレアーゼV(12.5U/μgDNA、USB, Cleveland, Ohio, USA)であった。消化時間は2−90分の範囲であった。消化反応はEDTAを最終濃度20mMで添加するか、および／または65℃もしくは95℃で10分の熱不活化によって停止させた。DNAのフラグメント化の停止にEDTAを用いたときは、DNAはさらにフェノール/クロロフォルム抽出およびエタノール沈澱によって精製した。前記フラグメントは、5または25サイクルのFIND PCR1反応で組換えを実施し、さらに前記材料を15、25または50サイクルのFIND PCR2反応で増幅させた。最後に完全長の遺伝子を機能評価のためにｐBR322dtetでHindIIIおよびEagI（New England Biolabs, MA, USA）でクローニングするか、または配列決定のためにｐGEM（Promega, Madison, WI, USA）でクローニングした。
テトラサイクリンクローンの機能性の評価：pBR322dtetに導入したクローンで化学的にコンピテントなTG1大腸菌を形質転換し、1μg/mLのアンピシリンを含むLB寒天平板に播種した。続いて100から200個のクローンを50μg/mLのテトラサイクリン含有LB寒天平板に移し、テトラサイクリン耐性クローンの頻度を計算することができた。
結果
上記に示したように、FIND方法でフラグメント化にssDNAを用いてより高頻度の組換えを達成することができた。エキソヌクレアーゼBAL31は主として、直鎖状の二本鎖DNAの二本の鎖の両3'末端からモノヌクレオチドを除去するエキソヌクレアーゼである。しかしながら、BAL31はまた、二本鎖DNAに対する3'エキソヌクレアーゼ活性によって生成された一本鎖DNA末端を分解することができる。ssDNAに対するBAL31の活性は5'末端側からのみモノヌクレオチドを除去する活性である。ssDNAのフラグメント化のためにBAL31を用い、続いて完全長遺伝子に再アッセンブリーすることによって、理論的には1遺伝子当たり1回の交差を生じるであろう。したがって、ssDNAのフラグメント化について種々のエキソヌクレアーゼの試験を実施した。エキソヌクレアーゼIは3'活性のみを有するが、BAL31、T7遺伝子6およびRecJエキソヌクレアーゼは5'活性のみを有する。エキソヌクレアーゼVおよびエキソヌクレアーゼVIIは両端（5'および3'）の活性を有する。これらのエキソヌクレアーゼをFIND実験のフラグメント化工程で用い、機能的な組換えが生じた遺伝子を生成することができることを示すために、テトラサイクリン耐性遺伝子によるモデル系を用いた。
エキソヌクレアーゼI（図25b）およびT７遺伝子6エキソヌクレアーゼ（図25c）と同様にBAL31（図25a）は全てFIND方法で良好に働き、フラグメント化時間に対する組換え頻度依存性が観察された。
ただ1つの末端からssDNAを消化するただ1つのエキソヌクレアーゼのみを用いるならば、理論的にただ1つの交差が達成できるであろう。しかしながら、異なるエキソヌクレアーゼ処理から生じるDNAフラグメントが結合された場合、更なる交差が生じることが判明した。エキソヌクレアーゼVおよびVIIの処理は5'および3'末端をもたない小さなフラグメントを生じるであろう。これらの末端は、最後のPCR反応で組換えが生じた材料を増幅するために必要である。したがってこれらのDNAフラグメントは5'または3'末端から消化されたDNAと組合せを作ることができる。前記のような組合せの結果は図25dで見ることができる。前記では、エキソヌクレアーゼIで10分処理されたssDNAは、エキソヌクレアーゼVで40および50分処理されたssDNAと組合せを生じた。同じ系でただ1つの酵素を用いて達成された最大25％と比較して、40%もの機能的クローンが得られた（図25a−c）。エキソヌクレアーゼIおよびエキソヌクレアーゼVII処理に由来するフラグメント、およびT7遺伝子6エキソヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼVII処理に由来するフラグメントもまた種々の時点で組み合わされ、機能的な組換えクローンを得ることができた（データは示されていない）。
実施例６
一本鎖DNA出発物質の亜集団の種々のエキソヌクレアーゼによる消化（更なる実験）
別個の実験で、エキソヌクレアーゼIで一本鎖DNAを消化して得たフラグメントを、エキソヌクレアーゼVおよび／またはエキソヌクレアーゼVIIで一本鎖DNAを消化して得たフラグメントと組み合わせることによって多数の交差を作製した。
エキソヌクレアーゼI（Exo1）は3'活性のみを有するが、エキソヌクレアーゼV（ExoV）およびエキソヌクレアーゼVII（ExoVII）は両端（5'および3'）の活性を有する。したがって、ExoVおよびExoVII処理は5'および3'末端をもたない小さなフラグメントを生じるであろう。これらの末端は、最後のPCR反応で組換えを生じた材料を増幅させるために必要である。これらのDNAフラグメントはしたがって5'または3'末端のみから消化されたDNAと組み合わせを生じることができる。
3つのscFv遺伝子の等モル混合物をExoI、ExoVおよびExoVIIによるフラグメント化で用いた。フラグメント化した材料の種々の組合せを混合しPCRで完全長遺伝子に再アッセンブリーし、最後に配列を決定した（図26a−d）。ExoIはBAL31と同様な態様を示し1回の交差をもつ40％ものクローンが生成された（図26a）。ExoIとExoVまたはExoVIIの組合せは交差の数を5回組換えまで増加させた（それぞれ図26aおよびc）。ExoVIIはExoVよりも効率が高いように思われ、ExoI/ExoVIIの組合せは75％を超えるクローンで組換えを生じた。最後に、3つの酵素全てから得られたフラグメント化したDNAの組合せを混合した。前記はほぼ全てのクローンで組換えを生じ（1回から4回）、クローンのわずか７％が野生型遺伝子であった。さらにまた、フラグメント化の時間が長い方が効率が極めて高かった（図26d）。この特定の事例では、scFv遺伝子は完全な相同性をもつ広い領域（フレームワーク領域）からなり、このことは特定された組換えの数（4回まで）は特定可能な組換えの数であることを意味する（すなわち実際の組換えの数ははるかに大きいであろう）。
実施例７
エキソヌクレアーゼによるssDNAの消化の効果とエンドヌクレアーゼによるdsDNAの消化の効果との比較
図27の実験は、ssDNAおよびエキソヌクレアーゼ処理またはdsDNAおよびエンドヌクレアーゼ処理のどちらかを用い、3つの異なるscFvをコードする遺伝子を組換えることによって実施した。
dsDNAのエンドヌクレアーゼ消化は、文献（Stemmer, 1994, Nature 370:389-391）に記載されたようにDNアーゼIを用いて実施した。ssDNAのエキソヌクレアーゼ消化はExoI、ExoVおよびExoVIIを用いて実施し、組換え反応には、ExoI（10の反応時間）、ExoV（30分の反応時間）およびExoVII（30分の反応時間）で得たフラグメントの等モル混合物を用いた。
組換えの数は配列決定を用いて調べた。結果は、ssDNA／エキソヌクレアーゼ消化はより少ない野生型クローンとより多くの組換えを生じることを示している。
鋳型分子から改良された分子を作製する方法の原理を示す。 ビオチンを用いて一本鎖DNAを調製する基本的工程を示す。 ファージを用いて一本鎖DNAを調製する基本的工程を示す。 エキソヌクレアーゼ処理を用いて一本鎖DNAフラグメントを作製する基本的工程を示す。 PCRを用いて一本鎖DNAフラグメントをアッセンブリングする基本的工程を示す。 20U/mLのBAL31で種々の時間dsDNAを消化した後１回のクロスオーバーで形成されたリコンビナントの％を示す。 20U/mLのBAL31で種々の時間dsDNAを消化した後２回のクロスオーバーで形成されたリコンビナントの％を示す。 1.25U/mLのBAL31で種々の時間ssDNAを消化した後１回のクロスオーバーで形成されたリコンビナントの％を示す。 1.25U/mLのBAL31で種々の時間ssDNAを消化した後２回のクロスオーバーで形成されたリコンビナントの％を示す。 11U/mLのBAL31で種々の時間ssDNAを消化した後１回のクロスオーバーで形成されたリコンビナントの％を示す。 11U/mLのBAL31で種々の時間ssDNAを消化した後２回のクロスオーバーで形成されたリコンビナントの％を示す。 BAL31で300ngのssDNAを50分（レーン１）、30分（レーン２）および10分（レーン３）消化した後に生成されたフラグメントのアガロース電気泳動ゲル像を示す。未処理のssDNAはレーン4に示されている。分子量マーカーはレーン５に示されている。 図１２のレーン４に対応するゲルクロマトグラフィー図を示す。 図１２のレーン３に対応するゲルクロマトグラフィー図を示す。 図１２のレーン２に対応するゲルクロマトグラフィー図を示す。 エキソヌクレアーゼVIIで300ngのDNAを10分（レーン３）、20分（レーン４）および30分（レーン５）消化した後に生成されたフラグメントのアガロース電気泳動ゲル像を示す。未処理のssDNAはレーン２に示されている。分子量マーカーはレーン１に示されている。 エキソヌクレアーゼRecJf（9U/mgssDNA）で300ngのDNAを10分（レーン２）、20分（レーン３）および30分（レーン４）消化した後に生成されたフラグメントのアガロース電気泳動ゲル像を示す。未処理のssDNAはレーン１に示されている。分子量マーカーはレーン５に示されている。 エキソヌクレアーゼRecJf（36U/mgssDNA）で300ngのDNAを10分（レーン３）、20分（レーン４）および30分（レーン５）消化した後に生成されたフラグメントのアガロース電気泳動ゲル像を示す。未処理のssDNAはレーン２に示されている。分子量マーカーはレーン１および６に示されている。 DNアーゼI（0.15U酵素/mgDNA）で300ngのDNAを消化した後に生成されたフラグメントのアガロース電気泳動ゲル像を示す。レーンサンプルは以下のとおりである： レーン１：分子量マーカー、レーン２：Mg緩衝液中の未処理ssDNA、 レーン３：Mg緩衝液中でDNアーゼIによりフラグメント化されたssDNA、 レーン４：Mn緩衝液中の未処理ssDNA、 レーン５：Mn緩衝液中でDNアーゼIによりフラグメント化されたssDNA、 レーン６：（サンプル無し）、レーン７：（サンプル無し） DNアーゼIで300ngのDNAを消化した後に生成されたフラグメントのアガロース電気泳動ゲル像を示す。レーンサンプルは以下のとおりである： レーン１：分子量マーカー、レーン２：Mg緩衝液中の未処理dsDNA、 レーン３：Mg緩衝液中の未処理dsDNA、 レーン４：Mg緩衝液中の未処理ssDNA（フォワード鎖）、 レーン５：Mg緩衝液中の未処理ssDNA（フォワード鎖）、 レーン６：Mg緩衝液中の未処理ssDNA（リバース鎖）、 レーン７：Mg緩衝液中の未処理ssDNA（リバース鎖）、 レーン８：Mg緩衝液中でDNアーゼI（0.24U酵素/μgDNA）によりフラグメント化されたdsDNA、 レーン９：Mg緩衝液中でDNアーゼI（1.3U酵素/μgDNA）によりフラグメント化されたdsDNA、 レーン10：Mg緩衝液中でDNアーゼI（0.24U酵素/μgDNA）によりフラグメント化されたssDNA（フォワード鎖）、 レーン11：Mg緩衝液中でDNアーゼI（1.3U酵素/μgDNA）によりフラグメント化されたssDNA（フォワード鎖）、 レーン12：Mg緩衝液中でDNアーゼI（0.24U酵素/μgDNA）によりフラグメント化されたssDNA（リバース鎖）、 レーン13：Mg緩衝液中でDNアーゼI（1.3U酵素/μgDNA）によりフラグメント化されたssDNA（リバース鎖） 図20のレーン６に対応するゲルクロマトグラフィー図を示す。 図20のレーン12に対応するゲルクロマトグラフィー図を示す。 図20のレーン13に対応するゲルクロマトグラフィー図を示す。 マングビーン（Mung bean）ヌクレアーゼで300ngのDNAを消化した後に生成されたフラグメントのアガロース電気泳動ゲル像を示す。レーンサンプルは以下のとおりである： レーン１：Mg緩衝液中の未処理ssDNA、 レーン２：マングビーンヌクレアーゼで10分間フラグメント化されたssDNA、 レーン３：分子量マーカー Bal31、 ExoI、 T7遺伝子6および ExoIと組み合わせたExoVによる一本鎖DNAのフラグメント化後のtet-耐性遺伝子の組換え頻度に対するフラグメント化持続時間の影響を示す。 種々のエキソヌクレアーゼで処理した後に生じたマルチクロスオーバーのパーセンテージを示す。組換え頻度は以下について評価した：ExoI処理ssDNA； ExoVII処理DNAと組み合わせたExoI（10分）処理ssDNA； ExoV処理ssDNAと組み合わせたExoI（10分）処理ssDNA； ExoVおよびExoVII処理ssDNAと組み合わせたExoI（10分）処理ssDNA。 エキソヌクレアーゼによるssDNAのフラグメント化およびエンドヌクレアーゼによるdsDNAのフラグメント化の後で観察された組換え数の比較を示す。

Claims (35)

  1. 以下の工程を含む、１つまたは２つ以上のタンパク質モチーフをコードする親の一本鎖ポリヌクレオチド配列からポリヌクレオチド配列または配列集団を作製する方法：
    ａ）一本鎖ポリヌクレオチド分子の第一の集団および一本鎖ポリヌクレオチド分子の第二の集団を準備する工程と、ここで前記第一および第二の集団は共同して親のポリヌクレオチド配列のプラス鎖およびマイナス鎖を構成し；
    ｂ）前記一本鎖ポリヌクレオチド分子の前記第一および第二の集団をエキソヌクレアーゼで消化する反応を実施して、対応する一本鎖ポリヌクレオチドフラグメント集団を作製する工程と；
    ｃ）前記プラス鎖から生じた前記ポリヌクレオチドフラグメントを前記マイナス鎖から生じたフラグメントと接触させる工程と；
    ｄ）互いにアニールする前記フラグメントを増幅させて、前記親ポリヌクレオチドによってコードされる１つまたは２つ以上のタンパク質モチーフと比較したとき改変された特徴を有する１つまたは２つ以上のタンパク質モチーフをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を作製する工程とを含み、
    ここで、前記の工程（ｂ）において、前記一本鎖ポリヌクレオチド分子の前記第一の集団の消化に用いられる反応の少なくとも１つのパラメーターが、前記一本鎖ポリヌクレオチド分子の前記第二の集団の消化反応に用いられる同等のパラメーターとは異なっている。
  2. 前記反応のパラメーターが、エキソヌクレアーゼのタイプ、エキソヌクレアーゼの濃度、反応容積、消化反応の持続時間、反応混合物の温度、反応混合物のpH、親の一本鎖ポリヌクレオチド配列の長さ、一本鎖ポリヌクレオチド分子の量および反応混合物の緩衝液組成から選択される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記一本鎖ポリヌクレオチド分子の前記第一の集団の消化に用いられるエキソヌクレアーゼが、前記一本鎖ポリヌクレオチド分子の前記第二の集団の消化に用いられるエキソヌクレアーゼと異なる、請求項１または２のいずれか１項に記載の方法。
  4. 前記一本鎖ポリヌクレオチド分子の前記第一の集団の消化に用いられるエキソヌクレアーゼが3'エキソヌクレアーゼであり、さらに前記一本鎖ポリヌクレオチド分子の前記第二の集団の消化に用いられるエキソヌクレアーゼが5'エキソヌクレアーゼである、請求項３に記載の方法。
  5. 前記一本鎖ポリヌクレオチド分子の前記第一の集団の消化に用いられるエキソヌクレアーゼ濃度が、前記一本鎖ポリヌクレオチド分子の前記第二の集団の消化に用いられるエキソヌクレアーゼ濃度と異なる、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 前記一本鎖ポリヌクレオチド分子の前記第一の集団の消化に用いられる反応容積が、前記一本鎖ポリヌクレオチド分子の前記第二の集団の消化に用いられる反応容積と異なる、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 前記一本鎖ポリヌクレオチド分子の前記第一の集団の消化に用いられ消化反応の持続時間が、前記一本鎖ポリヌクレオチド分子の前記第二の集団の消化に用いられる消化反応の持続時間と異なる、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 前記一本鎖ポリヌクレオチド分子の前記第一の集団の消化に用いられる反応混合物の温度が、前記一本鎖ポリヌクレオチド分子の前記第二の集団の消化に用いられる反応混合物の温度と異なる、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 前記一本鎖ポリヌクレオチド分子の前記第一の集団の消化に用いられる反応混合物のpHが、前記一本鎖ポリヌクレオチド分子の前記第二の集団の消化に用いられる反応混合物のpHと異なる、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 前記一本鎖ポリヌクレオチド分子の前記第一の集団のポリヌクレオチドの長さが、前記一本鎖ポリヌクレオチド分子の前記第二の集団のポリヌクレオチドの長さと異なる、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 前記一本鎖ポリヌクレオチド分子の前記第一の集団の消化に用いられる反応混合物の緩衝液組成が、前記一本鎖ポリヌクレオチド分子の前記第二の集団の消化に用いられる反応混合物の緩衝液組成と異なる、請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 前記一本鎖ポリヌクレオチド分子の前記第一の集団の一本鎖ポリヌクレオチド分子の量が、前記一本鎖ポリヌクレオチド分子の前記第二の集団の一本鎖ポリヌクレオチド分子の量と異なる、請求項１から１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 前記一本鎖ポリヌクレオチド分子の前記第一の集団が親のポリヌクレオチド配列のプラス鎖を構成し、さらに前記一本鎖ポリヌクレオチド分子の前記第二の集団が親のポリヌクレオチド配列のマイナス鎖を構成する、請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 前記工程（ａ）のポリヌクレオチド分子が、DNA分子である、請求項１から１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 前記工程（ｃ）が、前記親のポリヌクレオチドの少なくとも１つの3'および／または5'末端とアニーリング条件下でアニールするプライマー配列を添加することを含む、請求項１から１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 前記一本鎖ポリヌクレオチド分子の前記第一および／または前記第二の集団の消化に用いられエキソヌクレアーゼが、BAL31、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＶ、エキソヌクレアーゼVII、エキソヌクレアーゼT7遺伝子6、バクテリオファージラムダエキソヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼRecJfからなる群から選択される、請求項１から１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. １つまたは複数の親のポリヌクレオチド配列が突然変異誘発に付されている、請求項１から１６のいずれか１項に記載の方法。
  18. 前記工程（ｂ）で作製された一方または両方のフラグメント集団が突然変異誘発に付される、請求項１から１７のいずれか１項に記載の方法。
  19. 前記突然変異誘発が、エラー誘発PCRである、請求項17または18のいずれか１項に記載の方法。
  20. 前記工程（ｂ）が、多様な長さの一本鎖フラグメント集団を作製するために実施される、請求項１から１９のいずれか１項に記載の方法。
  21. 前記工程（ｂ）が50ヌクレオチドより大きい平均の長さを有する一本鎖フラグメント集団を作製するために制御される、請求項20に記載の方法。
  22. 前記工程（ｄ）で作製された少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を発現させてコードされたポリペプチドを生成する工程を含む、請求項１から２１のいずれか１項に記載の方法。
  23. 前記コードされたポリペプチドを所望の特徴について検査する工程を含む、請求項22に記載の方法。
  24. 前記親のポリヌクレオチド配列が、抗体または前記抗体のフラグメントをコードする、請求項１から２３のいずれか１項に記載の方法。
  25. 前記親のポリヌクレオチド配列が、酵素をコードする、請求項１から２４のいずれか１項に記載の方法。
  26. 前記親のポリヌクレオチド配列が、抗原をコードする、請求項１から２５のいずれか１項に記載の方法。
  27. 以下の工程を含む、所望の特性をもつポリペプチドを製造する方法：
    ａ）請求項１から２６のいずれか1項に記載の方法を用いて親のポリヌクレオチドの変種型を作製する工程と；
    ｂ）工程ａ）で製造された変種ポリヌクレオチドを発現させる工程と；
    ｃ）前記変種ポリペプチドを所望の特性についてスクリーニングする工程と；
    ｄ）所望の特性を有するポリペプチドを前記変種ポリペプチドから選別する工程。
  28. 請求項２７に記載の方法によって得られるポリペプチド。
  29. 請求項２８に記載のポリペプチドと医薬として許容できる担体とを含む医薬組成物。
  30. 医薬として使用される、請求項28に記載のポリペプチド。
  31. 疾患の処置、治療および／または診断のための医薬の製造における、請求項２８に記載のポリペプチドの使用。
  32. 請求項１から２６のいずれか1項に記載の方法による所望の特徴を有するポリヌクレオチドおよび／またはコードされたポリペプチドの特定に続いて、前記ポリヌクレオチドおよび／またはコードされたポリペプチドを医薬として許容できる担体に添加する工程を含む医薬組成物の製造方法。
  33. 請求項１から２６のいずれか1項に記載の方法による所望の特徴を有するポリヌクレオチドおよび／またはコードされたポリペプチドの特定に続いて、前記ポリヌクレオチドおよび／またはコードされたポリペプチドの全体または一部の医薬としての使用を含む方法。
  34. 前記医薬としての使用が、疾患の処置、治療および／または診断に際して行われる、請求項３３に記載の方法。
  35. 請求項１から２６のいずれか1項に記載の方法による所望の特徴を有するポリヌクレオチドの特定に続いて、サンプル中の標的ポリヌクレオチドの検出および／または増幅で前記ポリヌクレオチドを使用する工程を含む方法。
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