ES2232953T3 - Un metodo para la evolucion molecular en vitro de la funcion de proteina. - Google Patents
Un metodo para la evolucion molecular en vitro de la funcion de proteina.Info
- Publication number
- ES2232953T3 ES2232953T3 ES98930871T ES98930871T ES2232953T3 ES 2232953 T3 ES2232953 T3 ES 2232953T3 ES 98930871 T ES98930871 T ES 98930871T ES 98930871 T ES98930871 T ES 98930871T ES 2232953 T3 ES2232953 T3 ES 2232953T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- sequence
- polynucleotide
- fragments
- mother
- template
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
- C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
- C40B40/02—Libraries contained in or displayed by microorganisms, e.g. bacteria or animal cells; Libraries contained in or displayed by vectors, e.g. plasmids; Libraries containing only microorganisms or vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
- C12N15/1027—Mutagenizing nucleic acids by DNA shuffling, e.g. RSR, STEP, RPR
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1037—Screening libraries presented on the surface of microorganisms, e.g. phage display, E. coli display
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6811—Selection methods for production or design of target specific oligonucleotides or binding molecules
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6858—Allele-specific amplification
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
La presente invención se refiere a un procedimiento que permite la evolución in vitro de una función proteica. En particular, este procedimiento se refiere ala redisposición de segmentos nucleotidicos obtenidos por digestión por exonucleasa. Según la presente invención, se ha demostrado que los fragmentos polinucleotídicos derivados de una secuencia polinucleotídica genitor diferida por una exonucleasa pueden recombinarse para generar una secuencia polinucleotídica que codifica un polipéptido que presenta las propiedades deseadas. Este procedimiento puede aplicarse útilmente en la generación de nuevos anticuerpos, o partes de anticuerpos, que presentan propiedades modificadas respecto del anticuerpo genitor.
Description
Un método para la evolución molecular en
vitro de la función de proteína.
La presente invención se refiere a un método para
la evolución molecular en vitro de la función de proteína, en
particular para resolver los segmentos de ADN obtenidos usando una
exonucleasa.
La función de proteína puede ser modificada y
mejorada in vitro por una variedad de métodos,
incluyendo la mutagénesis dirigida al sitio (Alber et al,
Nature, 5; 330(6143):41-46,
1987) clonación combinatoria (Huse et al, Science,
246:1275-1281, 1989; Marks et al,
Biotechnology, 10: 779-783, 1992) y
mutagénesis aleatoria combinada con la selección apropiada de los
sistemas (Barbas et al, PNAS. USA, 89:
4457-4461, 1992).
El método de mutagénesis aleatoria junto con
selección ha sido usado en varios casos para mejorar la función de
proteína y existen estas dos estrategias diferentes. En primer
lugar, la aleatorización de la secuencia entera del gen en
combinación con la selección de una proteína variante (mutante) con
características deseadas, seguido por un nuevo pase de mutagénesis
aleatoria y selección. Este método luego puede ser repetido hasta
que sea encontrada una variante de proteína que sea considerada
óptima (Schier R. et al, J. Mol. Biol. 1996 263
(4): 551-567. Aquí, la ruta tradicional para
introducir las mutaciones es por PCR prono de error (Leung et al,
Technique, 1:11-15, 1989) con una
velocidad de mutación = 0,7%. En segundo lugar, las regiones
definidas del gen pueden ser mutagenizadas con plantillas
degeneradas, las cuales dejan velocidades de mutación hasta 100%
(Griffiths et al, EMBO. J, 13:
3245-3260, 1994; Yang et al, J. Mol. Biol.
254: 392-403, 1995). Mientras más alta sea la
velocidad de mutación usada, más limitada será la región del gen
que pueda ser sometida a mutaciones.
La mutación aleatoria ha sido usada
exhaustivamente en el campo de la ingeniería de anticuerpos. Genes
de anticuerpo formados in vivo pueden ser clonados
in vitro (Larrick et al, Biochem. Biophys. Res.
Commun. 160: 1250-1256, 1989) y pueden
ser sometidas a selección las combinaciones aleatorias de los genes
que codifican los genes pesados y ligeros variables (Marks et al,
Biotechnology, 10: 779-783, 1992). Los
fragmentos funcionales seleccionados de anticuerpos pueden ser
mejorados usando mutagénesis aleatoria y pases adicionales de
selecciones adicionales (Schier R. et al, J. Mol. Biol. 1996
263 (4): 551-567).
La estrategia de mutagénesis aleatoria es seguida
por la selección. Pueden ser seleccionadas las variantes con
características interesantes y las regiones mutadas de ADN de
variantes diferentes, cada una con características interesantes, son
combinadas en una secuencia de codificación (Yang et al, J. Mol.
Biol. 254: 392-403, 1995). Éste es un
proceso secuencial de múltiples pasos, y pueden ser perdidos los
potenciales efectos sinergísticos de las diferentes mutaciones en
regiones diferentes, ya que no son sometidas a selección en la
combinación. Por lo tanto, estas dos estrategias no incluyen
mutagénesis simultánea de regiones definidas y selección de una
combinación de estas regiones. Otro proceso involucra el
emparejamiento combinatorio de genes que pueden ser usados para
mejorar, por ejemplo, la afinidad de anticuerpos (Marks et al,
Biotechnology, 10: 779-783, 1992). Aquí,
las tres regiones CDR en cada gen variable son arregladas y esta
tecnología no permite resolver los segmentos génicos individuales en
el gen para el dominio variable, por ejemplo, incluyendo las
regiones CDR, entre clones.
El concepto de resolución de ADN (Stemmer,
Nature 370: 389-391, 1994) utiliza la
fragmentación aleatoria de ADN y el ensamblaje de fragmentos en una
secuencia funcional de codificación. En este proceso es posible
presentar las secuencias de ADN químicamente sintetizadas y de este
modo dirigir la variación hacia sitios definidos en el gen cuya
secuencia de ADN es conocida (Crameri et al, Biotechniques,
18: 194-196, 1995). En teoría, es también
posible resolver ADN entre cualesquiera clones. Sin embargo, si el
gen resuelto resultante va a ser funcional con respecto a expresión
y actividad, los clones que deben ser resueltos tienen que estar
relacionados o aún idénticos con la excepción de un bajo patrón de
mutaciones aleatorias. La resolución de ADN entre clones
genéticamente diferentes en general producirá genes no
funcionales.
El documento
WO-A-97/20078 revela los métodos de
resolución de ADN que tratan de maximizar el grado de variación
introducida en los polinucleótidos para producir bibliotecas grandes
de polinucleótidos variantes. Este objetivo es direccionado por
ciclos repetidos de fragmentación de un polinucleótido madre de
doble hebra, denaturizando los fragmentos de doble hebra, y
permitiendo fusionarse los fragmentos resultante de una sola
hebra.
La selección de proteínas funcionales de
bibliotecas moleculares ha sido revolucionada por el desarrollo de
la tecnología de visualización de fagos (Parmley et al, Gene,
73: 305-391 1988; McCafferty et al,
Nature, 348: 552-554, 1990; Barbas et
al, PNAS. USA, 88: 7978-7982, 1991).
Aquí, el fenotipo (proteína) está directamente vinculado a su
genotipo correspondiente (ADN) y esto permite directamente clonar el
material genético, que luego puede ser sometido a modificaciones
adicionales para mejorar la función de la proteína. La visualización
de fagos ha sido usada para clonar ligantes funcionales de una
variedad de bibliotecas moleculares con hasta 10^{11}
transformantes en tamaño (Griffiths et al, EMBO. J.
13: 3245-3260, 1994). Así, la visualización
de fagos puede ser usada directamente para clonar ligantes
funcionales de bibliotecas moleculares, y además también puede ser
usada para mejorar los clones originalmente seleccionados.
La combinación aleatoria de ADN de diferentes
clones mutados en combinación con la selección de la función deseada
es una manera más eficiente de buscar a través del espacio de
secuencias al comparar una selección secuencial y una combinación de
clones seleccionados.
Según un aspecto de la presente invención, se
proporciona un método para generar una secuencia o población de
polinucleótidos a partir de una secuencia de polinucleótido madre
que codifica uno o más motivos de proteína, que comprende los pasos
de:
a) Digerir la secuencia de polinucleótido madre
con una exonucleasa para generar una población de fragmentos.
b) Poner en contacto dichos fragmentos con una
secuencia de polinucleótido de plantilla en condiciones de
fusión.
c) Amplificar los fragmentos que se fusionan a la
plantilla en el paso b) para generar al menos una secuencia de
polinucleótidos que codifique uno o más motivos de proteína habiendo
modificado las características si se las compara con uno o más
motivos de proteína codificados por dicho polinucleótido madre.
El polinucleótido madre preferentemente es de
doble hebra y el método comprende adicionalmente el paso de generar
la secuencia de polinucleótidos de una sola hebra a partir de dichos
fragmentos de doble hebra antes del paso b). Adicionalmente, el
polinucleótido de plantilla es preferentemente la secuencia de
polinucleótido madre o por lo menos una secuencia de polinucleótidos
que tendrá en común una secuencia con la secuencia de polinucleótido
madre con el propósito de que los fragmentos se hibridicen con la
plantilla bajo las condiciones de fusión. Por ejemplo, si el
polinucleótido madre es un anticuerpo, la plantilla podría ser un
anticuerpo diferente que tendría dominios o regiones de base
constantes en común.
Por tanto, típicamente, se proporciona un método
de combinar fragmentos de polinucleótidos para generar una secuencia
o población de secuencias de polinucleótidos de las características
deseadas, método que comprende los pasos de:
a) digerir a un polinucleótido lineal madre de
doble hebra, que codifica uno o más motivos de proteína, con una
exonucleasa para generar una población de fragmentos de doble hebra
de longitudes diferentes;
b) obtener polinucleótidos de una sola hebra a
partir de dichos fragmentos de doble hebra; y
c) ensamblar una secuencia de polinucleótidos de
las secuencias derivadas del paso (b).
Preferentemente el método comprende
adicionalmente el paso de: (d) expresar la proteína resultante
codificada por la secuencia ensamblada de polinucleótidos y cribar
la proteína por las características deseadas.
Antes de ensamblar la secuencia de
polinucleótidos en el paso (c), las secuencias de doble hebra
preferentemente son purificadas y luego mezcladas para facilitar el
ensamblado. Controlando el tiempo de reacción de la exonucleasa,
puede ser determinado el tamaño de los fragmentos de
polinucleótidos. Determinar de este modo las longitudes de los
fragmentos de polinucleótidos evita la necesidad de tener que
proporcionar un paso adicional como es el purificar los fragmentos
de la longitud deseada a partir de un gel.
Adicionalmente, como algunas exonucleasas
digieren secuencias de polinucleótidos tanto de los extremos 3' y 5'
de los fragmentos seleccionados, podría digerirse en el medio de la
secuencia génica si esta región especial de la secuencia es la
deseada. Esta secuencia del medio de un gen podría ser mutada al
azar, por ejemplo, por PCR prono de error y deseable para el proceso
de resolución.
Sin embargo, en algunos casos puede ser deseable
no resolver la secuencia a partir del medio del gene. Esto puede ser
prevenido escogiendo fragmentos largos después del tratamiento de la
exonucleasa. A la inversa, si es deseable resolver el medio de la
secuencia génica pueden ser usados fragmentos cortos del tratamiento
con la exonuclea-
sa.
sa.
Para generar una secuencia de polinucleótidos de
las características deseadas, el polinucleótido madre de doble hebra
que codifica uno o más motivos de proteína puede ser sometido a
mutagénesis para crear una pluralidad de sus derivados mutados de
manera diferente. Igualmente, puede ser obtenido ya un
polinucleótido madre de doble hebra codificando una pluralidad de
motivos variantes de proteína de secuencia desconocida.
La mutación aleatoria puede ser lograda por
cualquier método convencional como se describe arriba, pero un
método apropiado es PCR prono de error.
Es preferible usar tecnología PCR para ensamblar
los fragmentos de polinucleótidos de una sola hebra en la secuencia
de polinucleótidos de doble hebra.
La secuencia de polinucleótidos es
preferentemente del ADN aunque puede ser usada del ARN. Para su
sencillez, el término polinucleótido ahora será usado en el texto a
continuación en relación con al ADN, pero será apreciado que la
presente invención es aplicable ambos, al ARN y a ADN.
Puede ser usada cualquier exonucleasa que digiera
polinucleótidos del extremo principal 3' al extremo principal 5' o
de ambos extremos 3' y 5'. Ejemplos de exonucleasas apropiadas que
pueden ser usadas en conformidad con la presente invención incluyen
BAL31 y Exonucleasa III.
La BAL31 es una exonucleasa que digiere y
retira bases de nucleótidos de ambos extremos 3' y 5' de una
molécula lineal de polinucleótidos. La enzima usa el Ca^{2+} como
un cofactor que puede ser incluido en complejo con EGTA (ácido
etilenglicol bis (\beta-amino-éter etílico)
N,N,N',N'-tetraacético). El EGTA no liga Mg^{2+}
el cual es necesario para el posterior proceso PCR. Las secuencias
lineales de ADN son digeridas con BAL31 y la reacción se
detiene a diferentes intervalos de tiempo junto con adición de EGTA.
Los fragmentos individuales digeridos son purificados, mezclados y
reensamblados con tecnología PCR. El gen (reconstituido) ensamblado
puede ser clonado en un vector de expresión para luego expresar la
proteína. La proteína puede entonces ser analizada por sus
características mejoradas.
La técnica PCR usa una plantilla, que puede ser
la secuencia de tipo natural o una secuencia reconstituida de
conformidad con la presente invención. Los fragmentos hibridizan con
la plantilla en las regiones apropiadas (i.e., en donde la homología
entre las dos hebras está en lo más alto) y la secuencia remanente
es generada por alargamiento del fragmento usando la plantilla de
conformidad con la técnica PCR.
El método de la presente invención proporciona
diversas ventajas sobre las técnicas conocidas de resolución. Por
ejemplo, en otras técnicas de resolución de ADN el proceso mismo
introduce las mutaciones sobre la secuencia entera del gen. La
presente invención permite la concentración de mutaciones en: i) las
regiones de los flancos, después de la recombinación de los
fragmentos de tipo natural sea en una plantilla recombinada, ya
creada por el método de la presente invención, o ii) la región del
medio después de la recombinación de los fragmentos mutados creados
por el método de la presente invención sobre una plantilla de tipo
natural.
En otras palabras, si es deseable proporcionar un
gen que tenga mutaciones concentradas en sus regiones de los
flancos, para el proceso PCR puede ser usado un fragmento de tipo
natural que se relacione con la región media de un gen en conjunción
con una secuencia de plantilla reconstituida y/o mutada. De este
modo, el proceso PCR genera una secuencia complementaria al
reconstituir/mutar la secuencia de la plantilla cuando alarga el
fragmento de tipo natural. Por lo tanto, la secuencia resultante
tendrá esencialmente una región media correspondiente a la secuencia
de tipo natural y a las regiones de los flancos con las mutaciones
incluidas.
A la inversa, si es deseable proporcionar un gen
que tenga mutaciones concentradas en su región del medio, en el
proceso PCR puede ser usado un fragmento reconstruido y/o mutado que
corresponda a la región génica del medio en conjunción con una
plantilla del tipo natural. De este modo, el proceso PCR, alargando
el fragmento mutado usando la plantilla de tipo natural, genera una
secuencia que tiene esencialmente una región del medio mutada y
regiones de los flancos del tipo natural.
Adicionalmente, el método de la presente
invención produce un juego de fragmentos de ADN progresivamente
acortados para que a cada intervalo de tiempo sea tomada una muestra
de ADN del tratamiento con BAL31. Las muestras de ADN pueden
ser recogidas y juntadas u, opcionalmente, las muestras individuales
pueden ser escogidas y usadas en el método. Por tanto, la presente
invención permite una selección de las muestras de ADN que sean
usadas en el sistema de recombinación y así brinda un grado
adicional de control.
El método de la presente invención puede ser
llevado a cabo sobre cualquier polinucleótido que codifique un
producto en particular, por ejemplo, cualquier proteína que tenga
propiedades ligantes o catalíticas, por ejemplo, anticuerpos o
partes de anticuerpos, enzimas o receptores. Adicionalmente,
cualquier polinucleótido que tenga una función que pueda ser
modificada, por ejemplo, ARN catalítico puede ser resuelto de
conformidad con la presente invención. Es preferible que el
polinucleótido madre, el cual codifica uno o más motivos de
proteína, sea al menos, de 12 nucleótidos en longitud, más
preferentemente al menos de 20 nucleótidos en longitud, aún más
preferentemente más de 50 nucleótidos en longitud. Pueden ser usados
polinucleótidos al menos de 100 nucleótidos en longitud o incluso al
menos de 200 nucleótidos de longitud. Cuando se usen polinucleótidos
madre que codifiquen proteínas grandes como enzimas o anticuerpos,
éstos podrían ser de muchos cientos o miles de bases en longitud. La
presente invención puede ser llevada sobre cualquier tamaño de
polinucleótido madre.
La presente invención también proporciona
secuencias de polinucleótidos generadas por el método arriba
descrito que tengan las características deseadas. Estas secuencias
pueden ser usadas para generar vectores de terapia génica, y
constructores de terapia de replicación de gen defectuoso, o
vectores de vacunación para las vacunaciones basadas en ADN.
Adicionalmente, las secuencias de polinucleótidos pueden ser usadas
como herramientas de investigación.
La presente invención también proporciona una
biblioteca de polinucleótidos de secuencias generadas por el método
descrito más arriba, a partir de cual puede ser seleccionado un
polinucleótido que codifica una proteína que tenga las
características deseadas. Es preferible que la biblioteca de
polinucleótidos sea una biblioteca de ADN o cDNA.
La presente invención proporciona también
proteínas como anticuerpos, enzimas y receptores que tengan
diferentes características de calidad a las del tipo natural
producido por el método descrito arriba. Estas proteínas pueden ser
usadas por separado o dentro de un portador aceptable farmacéutico
como vacunas o medicamentos para terapia, por ejemplo, como
inmunogenes, antígenos, o de otra manera, en la obtención de
anticuerpos específicos. También pueden ser usadas como herramientas
de investigación.
Las características deseadas de un polinucleótido
generado por la presente invención, o de una proteína codificada por
un polinucleótido generado por la presente invención, podrían ser
cualquier variación en la actividad normal del polinucleótido de
tipo natural (madre), o del polipéptido, proteína o de los motivos
que codifica la proteína. Por ejemplo, puede ser deseable reducir o
incrementar la actividad catalítica de una enzima, mejorar o reducir
la especificidad enlazante de un anticuerpo. Adicionalmente, si la
proteína o el polinucleótido es un inmunogen, puede ser deseable
reducir o incrementar su habilidad para obtener anticuerpos
específicos contra éste. El polinucleótido madre codifica
preferentemente uno o más motivos de proteína. Éstos son definidos
por regiones de la secuencia de polinucleótidos, que codifica la
secuencia de polipéptidos que tiene o potencialmente puede tener la
función característica de la proteína. Por ejemplo, un motivo de la
proteína puede definir una parte de una proteína entera, i.e., un
epítope, un sitio de escisión o un sitio catalítico, etc. Sin
embargo, dentro del alcance de la presente invención, un motivo
expresado de proteína no tiene por que exhibir actividad, o estar
"correctamente" doblado.
Puede ser deseable modificar una proteína para
alterar la conformación de ciertos epítopes, mejorando así su
antigenicidad y/o reduciendo su reactividad cruzada. Por ejemplo, si
tal proteína se usa como antígeno, la modificación puede reducir
cualquier reacción cruzada de anticuerpos levantados con proteínas
similares.
Aunque el término usado es "enzima", esto es
para interpretar como que también incluye cualquier polipéptido que
tenga actividad semejante a una enzima, i.e., una función
catalítica. Por ejemplo, los polipéptidos que son partes de una
enzima todavía podrían poseer una función catalítica. Igualmente, el
término "anticuerpo" debe ser interpretado como que abarca
cualquier sustancia de conexión que tenga un dominio enlazante con
la especificidad requerida. Esto incluye fragmentos de anticuerpos,
derivados funcionales equivalentes y homólogos de anticuerpos,
incluyendo moléculas sintéticas y moléculas cuya forma imita a las
de un anticuerpo, que le permite unir un antígeno o epítope.
Ejemplos de fragmentos de anticuerpos, capaces de unir un antígeno u
otra pareja enlazante es el fragmento Fab que consta de los dominios
VL, VH, CI y CH1, el fragmento Fd que consta de los dominios VH y
CH1; el fragmento Fv que consta de los dominios VL y VH de un solo
brazo de un anticuerpo; el fragmento dAB que consta de un dominio
VH; las regiones aisladas CDR y los fragmentos F(ab')2, un
fragmento bivalente incluyendo dos fragmentos Fab vinculados junto a
un puente de disulfuro en la región de bisagra. Los fragmentos Fv de
cadena simple están también incluidos.
Para obtener la expresión de la secuencia
generada de polinucleótido, la secuencia puede ser incluida en un
vector que tiene secuencias de control operablemente vinculadas con
la secuencia de polinucleótido para controlar su expresión. Los
vectores podrían incluir otras secuencias como promotores o
realzadores para conducir la expresión de la secuencia de
polinucleótidos insertada, secuencias adicionales de polinucleótidos
de forma que la proteína codificada junto al polinucleótido sea
producido como señales de de fusión y/o de secreción de codificación
de ácido nucleico con el propósito de que la proteína producida en
la célula hospedante sea segregada de la células. La proteína
codificada por la secuencia del polinucleótido puede entonces ser
obtenida, transformando los vectores en células hospedante en las
cuales el vector es funcional, cultivando las células hospedantes
con el propósito de que la proteína sea producida y recuperando la
proteína de las células hospedante o del entorno circundante.
Células procarióticas y eucarióticas son usadas para este propósito
en la técnica, incluyendo las variedades E. Coli, levadura y
células eucarióticas como las células COS o CHO. La
elección de la célula hospedante puede ser usada para el control de
las propiedades de la proteína expresada en estas células, por
ejemplo, controlar en donde la proteína es depositada en las células
hospedantes o afectar las propiedades como su glicosilación.
La proteína codificada por la secuencia de
polinucleótidos puede ser expresada por los métodos conocidos en la
técnica. Convenientemente, la expresión puede ser conseguida
haciendo crecer una célula hospedante en el cultivo que contiene tal
vector, bajo las condiciones apropiadas que produzcan o admitan la
expresión de la proteí-
na.
na.
Son conocidos los sistemas para la clonación y la
expresión de una proteína en una variedad de diferentes células
hospedantes. Las células hospedantes apropiadas incluyen bacterias,
células eucarióticas como de mamíferos y levaduras, y sistemas de
baculovirus. Las líneas de células de mamíferos disponibles
en la técnica para la expresión de un polipéptido heterólogo
incluyen células de ovarios de hámster chino, células HeLa, células
de riñón de crías de hámster, células COS y muchas otras. Un
hospedante bacteriano común y preferido es E. Coli.
Los vectores apropiados pueden ser escogidos o
construidos, conteniendo las secuencias reguladoras apropiadas,
incluyendo las secuencias promotoras, fragmentos terminadoras,
secuencias de poliadenilación, las secuencias realzadoras, genes
marcadores y otras secuencias como sea apropiado. Los vectores
podrían ser plásmidos, virales, por ejemplo. 'Fagos, o fagomidos,
como sea apropiado. Para detalles adicionales véase, por ejemplo:
Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2nd edición, Sambrook
et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Muchas
técnicas y protocolos conocidos para la manipulación de las
secuencias de polinucleótidos, por ejemplo, en la preparación de
constructores de polinucleótidos, mutagénesis, secuenciación,
introducción de ADN dentro de la expresión de células y genes, y
análisis de las proteínas, son descritos en detalle en "Current
Protocols in Molecular Biology", Ausubel et al. eds., John
Wiley & Sons, 1992.
El sistema FIND puede ser usado para la creación
de bibliotecas de ADN que comprendan secuencias variables, las que
pueden ser cribadas para la función deseada de proteína de varias
maneras. La visualización de Fago puede ser usada para seleccionar
el enlace (Griffith et al., EMBO J. 113:
3245-3260, 1994); cribar en busca de la función de
enzima (Crameri A. et al, Nature 1998 15; 391 (6664):
288-291; Zhang J. H. et al, PNAS. USA 1997
94 (9): 4504-4509; Warren M.S. et al,
Biochemistry 1996, 9; 35(27):
8855-8862).
Una proteína proporcionada por la presente
invención puede ser usada en cribar en busca de moléculas que
afecten o modulen su actividad o función. Tales moléculas podrían
ser útiles en un contexto terapéutico (posiblemente, incluyendo el
profiláctico).
La presente invención también proporciona
vectores que comprendan secuencias de polinucleótidos generadas por
el método descrito arriba.
La presente invención también proporciona
composiciones que comprenden sea secuencias de polinucleótidos,
vectores que comprenden secuencias de polinucleótidos, o proteínas
generadas por el método descrito arriba, y un portador farmacéutico
aceptable o un portador apropiado para los propósitos de
investigación.
La presente invención también proporciona un
método que comprende, posterior a la identificación del
polinucleótido o polipéptido que tiene las características deseadas
por el método descrito arriba, la fabricación de ese polipéptido o
polinucleótidos en su totalidad o en parte, opcionalmente en
conjunción con polipéptidos adicionales o polinucleótidos.
Luego de la identificación de un polinucleótido o
polipéptido que tenga las características deseadas, éstos pueden ser
fabricados para proporcionar mayores números por técnicas conocidas
como PCR, clonando entonces una expresión dentro de una célula
hospedante. Los polipéptidos o polinucleótidos resultantes pueden
ser usados en la preparación de medicamentos para uso diagnóstico,
uso farmacéutico, terapia, etc. Esto se discute adicionalmente más
abajo. Por otra parte, el polinucleótido, polipéptido fabricado
puede ser usado como una herramienta de investigación, i.e., los
anticuerpos pueden ser usados en ensayos inmunológicos, los
polinucleótidos pueden ser usando unas pruebas o plantillas de
hibridaciones.
Los polipéptidos o polinucleótidos generados por
el método de la invención e identificados, como que tienen las
características deseables, pueden ser formulados en composiciones
farmacéuticas. Estos compuestos podrían comprender un excipiente,
portador, búfer, estabilizador farmacéutico aceptable u otros
materiales bien conocidos para los expertos en la técnica. Tales
materiales no deben ser tóxicos y no deben obstruir la eficacia del
ingrediente activo. La naturaleza precisa del portador o de otro
material podría depender de la ruta de administración, por ejemplo,
rutas oral, intravenosa, cutánea o subcutánea, nasal, intramuscular,
intraperitoneal.
Las composiciones farmacéuticas para la
administración oral pueden estar en forma de tableta, cápsula, polvo
o líquido. Una tableta podría incluir un portador sólido como
gelatina o un adyuvante. Los compuestos farmacéuticos líquidos
incluyen a un portador líquido como agua, petróleo, aceites animales
o vegetales, en general, aceite mineral o aceite sintético. Pueden
ser incluidas solución salina fisiológica, dextrosa u otra solución
de sacáridos o glicoles como etilenglicol, propilenglicol o
polietilenglicol.
Para inyección intravenosa, cutánea o subcutánea,
o inyección en el sitio de aflicción, el ingrediente activo estará
en forma de una solución parenteral acuosa aceptable que esté libre
de material pirógeno y tenga un pH, isotonicidad y estabilidad
apropiadas. Los expertos relevantes en la técnica bien pueden
preparar las soluciones apropiadas usando, por ejemplo, vehículos
isotónicos como inyección de cloruro de sodio, inyección de Ringer,
inyección de Lactated Ringer. Pueden ser incluidos
preservantes, estabilizadores, búferes, antioxidantes y/o otros
aditivos, como se requiera.
Ya sea que un polipéptido, por ejemplo, un
anticuerpo o su fragmento, una enzima, un polinucleótido o molécula
de ácido nucleico, identificado luego de la generación por la
presente invención, que es para ser dada a una persona individual,
la administración estará preferentemente en una "cantidad
profiláctica eficaz " o una "cantidad terapéutica eficaz "
(cuando el caso lo puede ser, aunque la profilaxis también puede ser
considerada terapia), esto será suficiente para mostrar un beneficio
a la persona individual. La cantidad administrada, velocidad y
tiempo-curso de la administración, dependerán de la
naturaleza y la gravedad de lo que estar siendo tratado.
Prescripciones del tratamiento, por ejemplo, las decisiones en la
dosificación, etc., estarán dentro de la responsabilidad de los
médicos generales y otros médicos, y típicamente toma en cuenta el
trastorno a ser tratado, la condición del paciente individual, el
sitio de entrega, el método de administración y otros factores
conocidos por los profesionales. Los ejemplos de las técnicas y las
protocolos mencionados arriba pueden ser encontrados en
Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A.
(ed), 1980.
Por otra parte, las terapias dirigidas pueden ser
usadas para entregar el agente activo más específicamente a ciertos
tipos de células, por el uso de sistemas dirigidos como los
anticuerpos o células ligandos específicas. El direccionamiento
puede ser deseable por una variedad de razones; por ejemplo, si el
agente es de manera inaceptable tóxico, o por lo demás, si se
requiriese una dosis demasiado alta o si no se podría de otra forma
entrar en las células objetivo.
En vez de administrar estos agentes directamente,
podrían ser producidos en las células objetivo por la expresión de
un gen de codificación introducido dentro de las células, por
ejemplo, en un vector viral (una variante de la técnica
VDEPT). El vector podría ser dirigido a las células
específicas que deben ser tratadas, o podía contener elementos
reguladores que son transformados más o menos de forma selectiva por
las células objetivo.
Por otra parte, el agente podría ser administrado
en forma de un precursor, para su conversión a la forma activa por
un agente de activación producido en, o dirigido a, las células a
ser tratadas. Este tipo de enfoque es conocido a veces como
ADEPT o VDEPT; el anterior que supone dirigir al
agente de activación a las células por la conjugación con un
anticuerpo específico a una célula, mientras que el último supone
producir un agente de activación, por ejemplo, una enzima, en un
vector por la expresión de ADN de codificación en un vector viral
(véase, por ejemplo, EP-A- 415731 y WO
90/07936).
Una composición puede ser administrada individual
o conjuntamente con otros tratamientos, simultánea o secuencialmente
dependiendo de la condición a ser tratada.
Como una alternativa adicional, el polinucleótido
identificado como el que tiene características deseables,
posteriormente a la generación por el método de la presente
invención, podría ser usado en un método de terapia por genes,
tratar a un paciente que es incapaz de sintetizar el polipéptido
activo codificado por el polinucleótido o incapaz de sintetizarlo en
el patrón normal, proveyendo así el efecto proporcionado por la
proteína del tipo natural correspondiente.
Los vectores como los vectores virales han sido
usado en el estado anterior de la técnica para introducir
polinucleótidos en una gran variedad de diferentes células objetivo.
Típicamente, los vectores son expuestos a las células objetivo con
el propósito de que la transfección pueda tener sitio en una
proporción suficiente de las células para proporcionar un efecto
terapéutico o profiláctico útil de la expresión del polipéptido
deseado. El ácido nucleido transfectado puede ser incluido
permanentemente en el genoma de cada una de las células de tumor
señaladas para proporcionar un efecto de larga duración, o por otra
parte el tratamiento puede tener que ser repetido
periódicamente.
Una variedad de vectores, tantos vectores virales
como los vectores de plásmido, son conocidos en la técnica, véase
patente de los EE.UU. Nº 5.252.479 y WO 93/07282. En particular,
varios virus han sido usados como vectores de transferencia de
genes, incluyendo papovavirus, como SV40,
vacciniavirus,, herpesvirus, incluyendo HSV y EBV, y
retrovirus. Muchos protocolos de terapia génica en el estado
anterior de la técnica han usado retrovirus murine
deshabilitados.
Como una alternativa para el uso de vectores,
otros métodos virales conocidos de introducir el ácido nucleico
dentro de células incluyen la electroporación, coprecipitación con
fosfato de calcio, técnica mecánicas como microinyección,
transferencia mediada por liposomas, consumo directo de ADN y
transferencia de ADN mediada por receptores.
Como se dijo anteriormente, el objetivo de la
terapia génica que usa el ácido nucleico codificando un polipéptido,
o una parte activa de éste, es incrementar la cantidad del producto
de expresión del ácido nucleido en células, en las que está ausente
el patrón del polipéptido del tipo natural o presente solamente a
patrones reducidos. Tal tratamiento podría ser terapéutico en el
tratamiento de células que ya son cancerosas, o profilácticas en el
tratamiento de personas individuales conocidas a través de un
cribado que tienen una susceptibilidad alelomorfa y por lo tanto una
predisposición, por ejemplo, al cáncer.
La presente invención también proporciona un
equipo para generar una secuencia de polinucleótidos o población de
secuencias de las características deseadas que comprenden una
exonucleasa y componentes para llevar una técnica PCR, por ejemplo,
ADN termoestable (nucleótidos) y un dispositivo de parada, por
ejemplo, EGTA.
Los presentes solicitantes han denominado la
tecnología descrita más arriba como FIND por las siglas de la
expresión inglesa, Fragment Induced Nucleotide
Diversity).
Como se describió en general más arriba, el
programa FIND, de conformidad con la presente invención proporciona
las secuencias génicas y su combinación aleatoria para la creación
de anticuerpos mutados convenientemente a anticuerpos funcionales
que tienen las características deseadas. Como un ejemplo de este
aspecto de la invención, los genes de anticuerpos son mutados por
PCR prono de error, que da como resultado una tasa de mutación de
aproximadamente 0,7%. La mezcla resultante de genes de anticuerpos
mutados es digerida entonces con una exonucleasa, preferentemente
BAL31, y la reacción es inhibida por la adición de EGTA a
diferentes intervalos de tiempo, resultando en un juego de
fragmentos de ADN de tamaños diferentes. Éstos pueden luego ser
sometidos al reensamblaje basado en PCR como se describió
anteriormente. Los fragmentos reensamblados de ADN resultantes son
reproducidos entonces y construido una biblioteca de genes. Los
clones pueden luego ser escogidos de esta biblioteca y sometidos a
una secuenciación.
Una aplicación adicional de la tecnología FIND es
la generación de una población de secuencias de ADN variables que
pueden ser usadas para selecciones y análisis adicionales. Además de
codificar las proteínas más grandes, por ejemplo, los fragmentos de
anticuerpo y enzimas, el ADN puede codificar péptidos en los que las
características funcionales de las moléculas pueden ser usadas para
el diseño de diferentes sistemas de selección. La selección de
secuencias de ADN recombinadas que codifican péptidos ha sido
descrita antes (Fisch et al PNAS. USA 1996 Jul 23; 93
(15): 7761-7766). En adición, la población de
ADN variable puede ser usada para producir una población de
moléculas de ARN, por ejemplo, con actividades catalíticas. Vaish
et al (PNAS. USA 1998 Mar 3; 95(5):
2158-2162) mostraron el diseño de sistemas
funcionales para la selección de ARN catalítico y Eckstein F
(Ciba Found. Symp. 1997; 209; 207-212)
ha dado una idea general de las aplicaciones del ARN catalítico por
la introducción específica de ARN catalítico en células. El sistema
FIND puede ser usado adicionalmente para buscar en el espacio de
secuencias en la selección de péptidos/moléculas funcionales con
actividades catalíticas sobre la base de secuencias de ADN
recombinadas.
Los aspectos y las realizaciones de la presente
invención serán ahora ilustradas, por medio de ejemplos, con
referencia a las figuras de acompañamiento. Los aspectos y las
realizaciones adicionales serán evidentes para los expertos en la
técnica. Todos los documentos mencionados en este texto son
incluidos en la presente solicitud como referencias.
La Figura 1 indica los pasos de principios en la
resolución de las secuencias específicas de ADN entre los diferentes
clones.
La Figura 2 indica los pasos de principios en el
alargamiento PCR en las secuencias de genes tratados con
exonucleasa.
La Figura 3 indica los pasos de principios en el
alargamiento PCR de fragmentos largos de secuencias de genes
tratados con exonucleasa. El uso de fragmentos largos da como
resultado que la región génica del medio no sea recombinada. Esta
región podría, sin embargo, contener mutaciones aleatorias y el
medio de la secuencia génica podría, por lo tanto, ser diferente a
otros clones. La región génica del medio de la secuencia podría ser
diferente en longitud, pero usando plantillas más largas la región
del medio podría ser abarcada.
La Figura 4 indica los pasos de principios en el
alargamiento PCR de fragmentos pequeños de secuencias de genes
tratadas con exonucleasa. El uso de fragmentos pequeños da como
resultado que la región génica del medio sea recombinada. Si es
usado un tiempo de reacción más largo para la digestión por
exonucleasa, es producido un juego de fragmentos de diferentes
longitudes. Si los fragmentos son pequeños, algunos fragmentos serán
ubicados fuera de la región del medio de la secuencia del gen lo que
permitirá así la recombinación de la secuencia del medio.
La Figura 5 indica la apariencia de ADN a
diferentes intervalos fijos de tiempo después de la digestión con
nucleasa BAL31. El ADN fue mezclado con la enzima e incubado
a 30ºC. A diferentes intervalos de tiempo fueron retiradas las
muestras y detenida la actividad enzimática por la adición de 20 mM
de EGTA. Las muestras a diferentes intervalos de tiempo fueron
purificadas y analizadas sobre un gel al 2% de agarosa. Las muestras
se indican de la siguiente manera: 1 Kb = marcador molecular de ADN
1; 2-10 m = 2-10 minutos de
incubación de muestras de BAL31;
La Figura 6 indica A) la Inserción teórica
después de la digestión de restricción del fragmento que resulta de
la primera combinación de FIND 1, plantilla pBR322 Nhel - directa -
STOP con plantilla pBR322 - Eagl inversa. Esto es denominado
de FIND 1 e ID de SEQ Nº 5; y B) la Inserción teórica después de la
digestión de restricción del fragmento que resulta de la combinación
de la plantilla pBR322 Hindlll directa y la plantilla pBR322 Sall
inversa stop. Esto es denominado FIND 3 e ID de SEQ Nº 6.
La Figura 7 indica las secuencias determinadas
experimentalmente de los 2 primeros clones de FIND después de la
secuenciación automática. A) Muestra la secuencia FIND 1 con el
codón de STOP mostrado en negrita (ID de SEQ Nº 7); y B) muestra la
secuencia FIND 3 con el codón STOP mostrado en texto subrayado (ID
de SEQ Nº 8).
La Figura 8 muestra la secuencia de pEXmide
V (4055bp), los sitios Ncol- y Sal I- son señalados en el texto
en forma subrayada (ID de SEQ Nº 9).
Un aspecto del procedimiento de resolución de ADN
puede ser ilustrado por los pasos mostrados en la Figura 1. En este
ejemplo es usado el gen que codifica la resistencia a la
tetraciclina (Tet-R) en el pBR322 plásmido. Dos
clones fueron generados por mutagénesis dirigida al sitio: uno con
un codón stop por ingeniería cerca al término 5' y uno con un codón
stop cerca del término 3' del gen Tet-R. El fenotipo
de estos dos genes es sensitivo a la tetraciclina. Mezclando los dos
clones en cantidades equimolares y digiriendo con BAL31, fueron
seleccionados los revertantes. Después de clonar los genes
reensamblados (con la combinación entre los dos genes llevando los
dos codones stop) fueron detectados revertantes con una frecuencia
de 16%, i.e., 16% de los clones eran resistentes a la tetraciclina.
El experimento usó la resistencia a la ampicilina para la selección
principal en pBR322, luego fueron evaluados clones individuales de
Amp-R bajo la selección de tetraciclina (ver el
enfoque general en la Fig. 1 y el enfoque teórico en la Fig. 2).
Una descripción más detallada de ejemplos de la
presente invención es dada a continuación.
La polimerasa AmpliTaq® fue comprada de
Perkin-Elmer Corp., dNTP de Boehringer
Mannheim Biochemica (Mannheim, Alemania), y la Nucleasa BAL31 de
Biolabs Inc de New England. (Beverly, USA). La enzima Klenow
fue comprada de Amersham. Todas las enzimas de restricción
fueron compradas de Boehringer Mannheim Biochemica (Mannheim,
Alemania). El bromuro de etidio fue comprado de
Bio-Rad laboratories (Bio-Rad
laboratories, Hercules, CA, USA). La Ligasa T4 de ADN fue comprada
de Appligene Inc. (Pleasanton, CA, USA).
Todas las plantillas fueron diseñadas en el
laboratorio y sintetizadas con un sintetizador 391 de ADN Applied
Biosystems 391.
Todas las reacciones en cadena de polimerasa
(PCR, por las siglas de su expresión inglesa, Polymerase Chain
Reactions) fueron llevados en un aparato automático
Termocycler (Perkin-Elmer Cetus 480, Norwalk,
CT, USA). Las técnicas de PCR para la amplificación de ácido
nucleico son descritas en la patente de los EE.UU. Nº 4.683.195. Las
reacciones PCR fueron llevadas a cabo a diferente cantidad de ciclos
que consisten en el siguiente perfil: denaturación (94ºC, 1 minuto),
fusión de plantillas (55ºC, 1 minuto) y extensión (72ºC, 1 minuto)
usando una rampa de 1 segundo de tiempo. Las reacciones PCR
contenían, a menos que se indique lo contrario, 5 \muI de cada
plantillas (20 \muM), 8 \muI de dNTP (1,25 mM de cada dTTP,
dATP, dCTP y dGTP), 10 \muI de búfer de reacción de 10x, 0,5
\mul polimerasa AmpliTaq® de ADN termoestable (5U/\mul)
(Perkin-Elmer Corp.), y agua para un volumen final
de hasta 100 \mul. En todos los experimentos PCR fueron usados
estos parámetros y fue variado el número de los ciclos de reacción.
Las referencias para el uso general de las técnica de PCR incluyen a
Mullis et al, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol.,
51:263, (1987), Ehrlich (ed), PCR technology, Stockton
Press, NY, 1989, Ehrlich et al, Science,
252:1643-1650, (1991), "PCR protocols; A
Guide to Methods and Applications", Eds. Innis et al,
Academic Press, New York, (1990).
Todos los constructores han sido sometidos a
secuenciación por el uso de un equipo de secuenciación cíclica
Taq Dyedeoxy^{TM} Terminator. La secuenciación fue llevada
a cabo en un ABI Prism 373 DNA Sequencer.
La electroforesis por agarosa de ADN fue llevada
a cabo con geles al 2% de agarosa compuesto de 1% de NuSieve®
GTG® Low Melting AGAROSE (FMC Bioproducts, Rockland, ME,
USA) y 1% de AMRESCO® Agarose (AMRESCO, SOLON, OH,
USA) con 0,25 \mug/ml de bromuro de etidio en búfer de
Tris-acetato (búfer TAE 0,04 M de Tris-acetato 0,001 M
de EDTA). Las muestras para electroforesis fueron mezcladas con un
búfer de carga filtrado estéril compuesto de Ficoll 25% y Bromo
fenol azul, y cargado en viales en el gel de agarosa al 2%. La
electroforesis se llevó a cabo a 90 V durante 45 minuto, a menos que
se diga lo contrario, en búfer de Tris-acetato con
bromuro de etidio a 0,25 \mug/ml. Las bandas del tamaño apropiado
se purificaron con el gel, usando el equipo de extracción
Qiaquick Gel Extraction Kit (Qiagen GmbH, Hilden,
Germany). Como patrón de peso molecular, fue usado el marcador 1 de
peso molecular de ADN (Boehringer GmbH de Mannheim,
Alemania). La concentración de ADN en los productos extraídos del
gel fue calculada usando un espectrofotómetro (véase Fig. 5).
La cepa de Escherichia coli, E coli
BMH71-18 (supE thi \Delta
(lac-proAB) F'[proAB^{+} lacl^{q}
\Delta(lacZ)M15]), fue usada como hospedante
bacteriano para las transformaciones. Células competentes
químicamente de esta cepa fueron producidas básicamente como
describe Hanahan, D. 1983. "Studies on transformation of
Escherichia coli with plasmids" J. Mol. Biol.
166: 557-580. Fueron producidas células
electro competentes de esta cepa bacteriana (Dower, W.J.; J. F.
Miller, and C.W. Ragsdale. 1988: High efficiency transformation of
E. coli by high voltage electroporation. Nucleic Acids Res.
16:6127).
La resistencia del gen pBR322 a la
tetraciclina es de longitud 1191 bp (por el término inglés,
basepairs). Una variante de resistencia del gen a la
tetraciclina eliminada de pBR322 plásmido fue formulada partiendo
del plásmido con las enzimas de restricción Sall y
BamHl. Esto resultó en el retiro de un fragmento de 276 bp
dentro del gen de tetraciclina. Una reacción de escisión con
Hindlll y Eagl y el plásmido eliminado en teoría
resultaría en un producto de escisión de 634 bp, mientras que un
producto de pBR322 de tipo natural escindido con estas
enzimas produciría un producto de 910 bp. Los salientes resultantes
de una sola hebra sobresaliendo sobre el plásmido eliminado después
de la escisión fueron tratados con la enzima de Klenow para
generar extremos de doble hebra a ambos extremos del plásmido. Estos
extremos fueron entonces ligados con terminaciones embotadas según
Molecular cloning; A LABORATORY MANUAL (Second Edition, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, 1989). El plásmido resultante fue
transformado en la E coli químicamente competente
BMH71-18 y colocado en placas conteniendo ampilicina
(de 100 \mug/ml). Cuando se volvieron a colocar en placas
conteniendo agar y tetraciclina (de 10 \mug/ml) las colonias
resultaron sensitivas a la tetraciclina.
Fueron diseñadas dos plantillas externas que
rodean al gen de la tetraciclina de pBR322 con las siguientes
secuencias incluyendo sitios únicos de restricción designados:
Plantilla directa HindIII de pBR322:
Plantilla inversa 322 -Eagl:
Para demostrar que las dos plantillas externas
abarcan las partes funcionales del gene de la tetraciclina, fue
usada una reacción PCR con el perfil arriba mencionado para unos 30
ciclos de PCR con pBR322 (250 ng) como plantilla y las
plantillas externas descritas más arriba. Esto produjo un producto
de PCR de 910 bp después de la escisión siguiente con Hindlll y
Eagl. Cuando este producto de restricción fue clonado en un plásmido
igual de pBR322 digerido por restricción, el plásmido codificó un
fenotipo resistente a la tetraciclina. Esto fue detectado después de
la transformación de una ligadura de plásmido y producto PCR de 910
bp en el hospedante de E. coli BMH 7118 colocadas en placas
conteniendo agar-tetraciclina (de 10 g
\mu/ml).
Fueron construidas dos plantillas directas
mutagénicas de pBR322 y dos plantillas inversas de pBR322 que
contenían sitios únicos restricción y un codón STOP cada en sitios
varios. Éstas fueron:
STOP directa de NheI pBR322:
STOP inversa de Sall pBR322:
Fueron formuladas cuatro variantes diferentes del
gen de tetraciclina. Fue usada una combinación mutada directa o
inversa con la correspondiente plantilla directa externa o plantilla
inversa en reacciones PCR para generar insertos mutados. Fue usado
plásmido pBR322 como una plantilla (250 ng) en 40 ciclos de PCR. Los
fragmentos resultantes de restricción digeridos fueron reproducidos
luego en pBR322 con tetraciclina eliminada, y los clones resultantes
fueron denominados FIND 1 y FIND 3.
Fueron usadas las siguientes combinaciones de
plantillas: FIND 1, plantilla pBR322 Nhel - directa - STOP
con plantilla pBR322 - Eagl - inversa. Esta combinación dio
la inserción después de la digestión de restricción como se muestra
en la Figura 6A; y FIND 3, plantilla pBR322 Hindll directa y
plantilla pBR322 Sall inversa STOP. Esta combinación dio la
inserción después de la digestión de como se muestra en la Fig.
6B.
Los productos de PCR amplificados fueron
analizados sobre un gel de agarosa al 2%. La electroforesis fue
realizada a 90V durante 40 minutos como se describe arriba. Bandas
de tamaño apropiado (1000bp), si se compara con el peso molecular
patrón, fueron cortadas y purificadas por gel usando el equipo de
extracción de gel Qiaquick. Las cuatro diferentes inserciones
conteniendo STOP fueron escindidas luego con las enzimas de
restricción designadas en las plantillas anteriores. Para cada
Inserción fue escindida una combinación de plásmido pBR322 con las
mismas enzimas, y estas cuatro combinaciones fueron luego ligadas y
transformadas E. coli BMH 71-18 químicamente
competente, según el protocolo modificado de Detlef (Modified
Hanahan, revised M. Scott, F. Hochstenbach and D. Gussow 1989). Los
transformantes fueron colocados en placas de agar conteniendo
ampicilina (50 \mug/ml). Cuando se colocaron de nuevo en las
placas en placas de agar conteniendo tetraciclina (10 \mug/ml) no
sobrevivió ninguna colonia, confirmando el efecto funcional del STOP
- codón introducido en el gene tetraciclina. Plásmidos de los cuatro
FIND - clones diferentes fueron preparados con el juego Qiagen
Plasmid Midi Kit (Qiagen Inc., Chatsworth, CA, USA). Los
plásmidos de los cuatro clones fueron secuenciados usando un equipo
de secuenciación cíclica Taq DyedeoxyTM Terminator Cycle. La
secuenciación fue llevada a cabo en un secuenciador de ADN ABI
Prism 373 DNA Sequencer. Los codones STOP fueron confirmados y
la inserción resulto correcta.
Experimento FIND
I
Fueron generados fragmentos PCR de FIND 1 y FIND
3, llevando a cabo reacciones PCR con plásmidos de FIND 1 y FIND 3
como plantillas (500 ng) y con las dos plantillas externas, la
plantilla pBR322 Hindll directa y plantilla pBR322 -
Eagl - inversa. Los ciclos de PCR fueron como se describen arriba en
30 ciclos. Los productos PCR amplificados fueron mezclados con 20
\mul de búfer de carga (Ficoll 25% y Bromo fenol azul y analizado
en un gel de agarosa al 2%. La electroforesis fue realizada a 90V
durante 35 minutos como ya previamente se describió. Bandas del
tamaño apropiado fueron cortadas y purificadas en gel usando el
equipo de extracción por gel Qiaquick Gel Extraction Kit. La
concentración de ADN fue calculada en 112,25 \mug/ml para el
fragmento PCR FIND-1 y de 110 \mug/ml para el
fragmento PCR de FIND-3.
Fueron mezclados 5 \mug de cada fragmento PCR,
FIND 1 y FIND 3, (Fig. 7 A y B) en cantidades equimolares con 100
\mul de búfer 2x BAL31 y 10 \mul de agua estéril hasta un
volumen final de 200 \mul. Se preparó un volumen más pequeño de
22,5 \mul para ser usado como un blanco sin tratar por vía
enzimática. Esto consistió en 4,5 \mul de fragmento FIND 1 y 4,5
\mul de FIND 3, 11,25 \mul de búfer de nucleasa 2x BAL31
y 2,25 \mul agua estéril. Fueron preincubados tubos de eppendorf
estériles de 1,5 \mul con ADN y búfer de nucleasa 2x BAL31
en un baño de agua a 30ºC como fue descrita, en un cuarto frío a
-4ºC durante 10 minutos. Mientras tanto, cinco tubos Eppendorf
estériles fueron preparados con 4 \mul cada uno de una solución
con 200 mM de EGTA. Éstos fueron marcados a 1-9
minutos. Del mismo modo, un tubo con 2,5 \mu y 200 mM de EGTA fue
preparado para un blanco de una solución de ADN sin tratar. La
concentración de trabajo de EGTA fue 20 mM. Después de una
preincubación de 10 minutos fue añadida la nucleasa BAL31 al
tubo con un volumen más grande a una concentración final de 1
unidad/\mug de ADN (10 \muI de 1U/\mul de solución). Después
de t = 1, 3, 5, 7 y 9 minutos en los que el tubo fue mezclado y
muestras de 36 \mul fueron mezcladas y añadidas a los tubos con 4
\mul de EGTA y fueron puestas en hielo. Al mismo tiempo, fue
retirado el volumen en blanco de 22,5 \mul y añadido a los 2,5
\mul preparados de EGTA y también fue puesto sobre hielo. Los
tubos fueron puestos en un baño de agua a 65ºC para la desactivación
de la enzima al calor y luego fue reemplazados sobre hielo.
Los volúmenes en los tubos fueron corregidos a
100 \mul cada uno y se llevó a cabo una extracción en
fenol/clorofor-
mo/alcohol isoamílico. 50 \mul de fenol con búfer se añadió junto con 50 \mul de una mezcla de cloroformo y alcohol isoamílico (24:1) a cada tubo. Los tubos fueron agitados durante 30 segundos y luego centrifugados durante 1 minuto en una ultracentrífuga a 14000 r.p.m. La fase superior fue entonces recogida y mezclada con 2,5 volúmenes de etanol al 99,5% (1/10 acetato de sodio 3M; pH 5,2). El ADN fue precipitado durante 1 hora a 80ºC. El ADN fue peletizado por centrifugación, luego durante 30 minutos en una ultracentrífuga a 14.000 r.p.m. La pastilla fue lavada una vez con etanol al 70% y luego redisuelta en 10 \mul de agua estéril.
mo/alcohol isoamílico. 50 \mul de fenol con búfer se añadió junto con 50 \mul de una mezcla de cloroformo y alcohol isoamílico (24:1) a cada tubo. Los tubos fueron agitados durante 30 segundos y luego centrifugados durante 1 minuto en una ultracentrífuga a 14000 r.p.m. La fase superior fue entonces recogida y mezclada con 2,5 volúmenes de etanol al 99,5% (1/10 acetato de sodio 3M; pH 5,2). El ADN fue precipitado durante 1 hora a 80ºC. El ADN fue peletizado por centrifugación, luego durante 30 minutos en una ultracentrífuga a 14.000 r.p.m. La pastilla fue lavada una vez con etanol al 70% y luego redisuelta en 10 \mul de agua estéril.
5 \mul de la pastilla disuelta para cada
intervalo de tiempo y el blanco fueron mezclados con 2,5 \mul de
búfer cargado (Ficoll 25% y Bromo fenol azul) y cargada en viales en
un gel de agarosa al 2%. La posterior electroforesis y extracción en
gel a diferentes intervalos de tiempo fueron llevadas a cabo como se
indicó más arriba.
Los 5 \mul remanentes de los pelets disueltos
en cada intervalo de tiempo después de la extracción con fenol y la
precipitación fueron mezclados en un reensamblaje de PCR sin
plantillas. Una parte de los 5 \mul del blanco sin tratar fue
añadida como si fuera la plantilla para hacer posible el generar
fragmentos de longitud normal. Se llevaron a cabo 40 ciclos de PCR
con el perfil de PCR y la mezcla de reacción como se describió más
arriba, pero sin plantilla alguna.
50 \mul del producto PCR reensamblado fue
mezclado con reactivos PCR incluyendo las dos plantillas externas
como fue descrito anteriormente para generar 100 \mul de una
reacción PCR. Este PCR fue realizado en 25 ciclos con el perfil
descrito anteriormente. El producto PCR amplificado fue analizado en
un gel de agarosa. Una banda de aproximadamente 1000 bp fue visible
en el gel después del segundo PCR con las dos plantillas externas.
Los 50 \mul remanente del primer PCR de reensamblaje, mostró
solamente una mancha de bandas abarcando todo el intervalo del
marcador de pesos moleculares. El fragmento de 1000 bp después del
segundo PCR fue recortado y purificado en gel como fue descrito
antes.
10 \mug de pBR322 con tetraciclina eliminada
(10 \mul) fueron escindidos con 2 \mul de cada una de las
enzimas Hindlll (10 U/\mul) y Eagl (10U/\mul) (4U de
enzima/\mug de vector) en una mezcla con 10 \mul de 10x buffer B
(suministrado con las enzimas) y agua hasta 100 \mul. Todos los
fragmentos FIND reensamblados purificados con agarosa fueron
escindidos con las mismas enzimas en 100 \mul de una mezcla de
reacción similar. Los tubos fueron incubados en un baño de agua a
37ºC durante 14 horas.
Las reacciones de escisión fueron mezcladas y
fueron analizadas en un gel de agarosa al 2%. El pBR322 de
restricción digerido con tetraciclina eliminada ha mostrado un
producto de escisión de aproximadamente 600 bp. Esto bien
corresponde con el tamaño esperado de 635 bp. La banda del plásmido
escindido fue cortada y extraída en gel como ya fue descrito antes.
El producto FIND escindido reensamblado era aproximadamente de 1000
bp en longitud y fue extraído en gel de la misma manera como el
plásmido.
Las estimaciones espectrofotométricas del
plásmido de restricción digerido y del fragmento FIND dieron las
siguientes indicaciones de concentraciones de ADN: plásmido 13,5
\mug/ml; fragmento FIND reensamblado 77,3 \mug/ml.
9,6 \mug de pBR322 purificado con el escindido
gen eliminado resistente a la tetraciclina fue ligado con 2,76
\mug de fragmento de restricción reensamblado digerido FIND en
baño de agua a 12ºC durante 16 horas. 50 \mul del vector se
mezclaron con 60 \mul de la inserción y 15 \muI de 10x búfer
(suministrado con la enzima) 7,5 \mu de ligasa ( 5 U/\mul) y
agua estéril para un volumen final de 150 \mul. Una ligadura fue
también llevada a cabo de la misma manera de 2 \mug de pBR322 de
restricción digerido con gen resistente a la tetraciclina eliminado
sin ninguna inserción.
Las reacciones de ligadura fueron purificadas por
extracción fenol/cloroformo como ya fue descrito anteriormente. La
fase superior de la extracción fue recogida y mezclada con 2,5
volúmenes de etanol al 99,5% (1/10 fue acetato de sodio 3M, pH 5,2).
El ADN fue precipitado durante 1 hora a 80ºC. El ADN fue peletizado
luego por centrifugación durante 30 minutos en una ultracentrífuga a
14.000 r.p.m. El pelet fue lavado una vez con etanol al 70% y luego
redisuelto en 10 \mul de agua estéril. 5 \mul de cada ligadura
por separado fueron mezclados con 95 \mul de BMH
71-18 E coli químicamente competente,
incubado sobre hielo durante 1 hora y luego transformado según el
protocolo modificado de Detlef (Modified Hanahan, revised M. Scott,
F. Hochstenbach and D. Gussow 1989). Después del crecimiento durante
una hora las bacterias de las dos transformaciones fueron difundidas
en placas de agar conteniendo ampicilina (100 \mug/ml). Las placas
fueron cultivadas a la inversa en una incubadora a 37ºC durante 14
horas.
La transformación con el fragmento FIND
reensamblado y pBR322 de tetraciclina eliminada dio 122
transformantes resistentes a la ampicilina. El pBR322 religado
escindido eliminado de tetraciclina dio 100 transformantes. Los
transformantes de ambas categorías fueron trasladadas con picos
estériles escogiendo uno a la vez a placas de agar conteniendo
tetraciclina (10 \mug/ml) y a placas conteniendo ampicilina al
mismo tiempo, y a las ubicaciones correspondientes. Estas placas
fueron incubadas a 37º durante 14 horas.
Las colonias sobre ambas, las placas de
tetraciclina como las placas de ampicilina, fueron contadas al día
siguiente para ambos transformantes.
Experimento FIND
II
Los métodos descritos anteriormente fueron usados
para un segundo tratamiento de Nucleasa BAL31 con una mezcla
de 5 \mug de FIND 1 y 5 \mug de FIND 3 como ya fue descrito
anteriormente, y en la visión general en la Fig. 1. Esta vez habían
sido generado nuevos fragmentos PCR con concentraciones aproximadas
de 192,25 \mug/ml para FIND 1 y 231,5 \mug/ml para FIND 3. Fue
usada la siguiente mezcla de reacción: 26 \mul de FIND 1, 21,6
\mul de FIND 3, 100 \mul de búfer de exonucleasa 2x
BAL31, 9,9 \mul BAL31 y agua hasta un volumen de 200
\muI. También fue preparado un blanco con 13 \mul de FIND 1 y
10,8 \mu de FIND 3, 36 \mul de búfer de exonucleasa 2x
BAL31, 0 \muI de Nucleasa BAL31 y agua hasta un volumen
de 72 \mul
La digestión de BAL31 fue llevada a cabo como fue
descrito en el experimento previo y las muestras fueron retiradas a
los mismos intervalos de tiempo a tubos con 200 mM de EGTA para
conseguir una concentración final de 20 mM de EGTA. La exonucleasa
en las muestras resultantes fue desactivada con calor, como fue
descrito anteriormente, y los fragmentos fueron extraídos, se
precipitaron y 50% fue cargado en gel de agarosa. Después de que se
estableció la misma apariencia anterior del gel, las muestras fueron
purificadas, y fueron llevadas a cabo 2 reacciones PCR secuenciales,
como antes se describió. El fragmento PCR extremo fue clonado a
pBR322 de tetraciclina eliminada en las mismas condiciones
anteriores. La ligadura fue luego sometida a electroporación en las
células electro competentes como fue descrita (Dower, W.J., J. F.
Miller, and C.W. Ragsdale. 1988: High efficiency transformation of
E. coli by high voltage electroporation. Nucleic Acids
Res. 16:6127.) y colocada sobre placas de agar con
ampicilina como las descritas anteriormente. Fueron conseguidos
varios miles de transformantes. 397 de éstos fueron trasladados al
mismo tiempo a placas de agar con tetraciclina, y a placas de agar
con ampicilina, como las descritas anteriormente. La cantidad de
revertantes de tetraciclina fue contada al día siguiente después de
la incubación en una incubadora a 37ºC durante 14 horas.
Los recombinantes de tetraciclina fueron entonces
colocados en placas para separar las colonias en nuevas placas de
tetraciclina. Fueron inoculadas entonces colonias distintas con
cultivos líquidos con medios 1x TB (Terrific Broth; Molecular
cloning; A LABORATORY MANUAL, Second Edition, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 1989) con glucosa al 1% y tanto ampicilina como
tetraciclina con las concentraciones señaladas más arriba y crecidas
para preparación de plásmido con Qiagen Plasmid Midi Kit
(Qiagen Inc., Chatsworth, CA, USA). Fueron preparados existencias en
glicerol de estos cultivos, dejados durante la noche para mezclado
de 500 \muI de cultivo bacteriano con 215 \muI de glicerol al
50% y conservar estas mezclas a 80ºC.
Fue llevado a cabo un cribado PCR bacteriano con
las dos plantillas externas mencionadas anteriormente de 40 de las
colonias sensitivas a la tetraciclina para calcular la frecuencia
del vector religado vacío entre estos transformantes. Esto fue
realizado con mezcla PCR mencionada antes, escalado a reacciones de
25 \muI. Éstas fueron inoculadas con una colonia bacteriana
sensitiva cada una y el perfil PCR para 30 ciclos resultó como el
anterior. Los fragmentos PCR resultantes fueron analizados en gel
como ya fue descrito anteriormente.
| Experimento FIND I | |
| Nº de transformantes FIND resistentes a amp. | Nº de transformantes FIND resistentes a tet |
| 122 | 19 |
| Frecuencia de recombinantes: 16% | |
| Nº de Vector. Relig. sensitivo resistente a amp. | Nº de Vector. Relig. resistente a tet. |
| 100 | 0 |
| Frecuencia de recombinantes: 0% | |
| Experimento FIND II | |
| Nº de transformantes FIND resistentes a amp. | Nº de transformantes FIND resistentes a tet |
| 397 | 22 |
| Frecuencia de recombinantes: 5,5% |
2 de los 40 clones sensitivos bacterianos PCR
con búfer fueron el vector religado vacío. Este haría el 5% del
número total de transformantes entonces. Por lo tanto, 20 de los 397
fue el vector vacío. Esto incrementó el número de recombinantes a
5,8%.
FIND Experimento
III
El procedimiento FIND no está restringido al uso
en genes de tetraciclina, pero puede ser aplicado a cualquier tipo
de genes que codifican un motivo de la proteína o la proteína. Esto
es ejemplificado creando un nuevo repetoir de fragmentos de
anticuerpos con las mutaciones uniformemente difundidas sobre los
genes variables enteros de anticuerpos después del tratamiento de
FIND.
Las mutaciones de una sola pareja base fueron
introducidas dentro de las regiones VL y VH del fragmento B11 del
anticuerpo scFv anti- FITC (Kobayashi et al.,
Biotechniques 1997 Sep; 23(3):
500-503) por el uso de PCR prono de error según
Kuipers et al., (Nucleic Acids Res 1991 Aug 25;
19(16): 4558) excepto un aumento en la concentración
de MgCI_{2} de 2 mM a 5 mM. Este fragmento de anticuerpo scFv FITC
fue construido por el uso de PCR de extensión traslapo, y el
procedimiento de extensión traslapo ha sido usado previamente para
la combinación aleatoria de la variación de ADN (Soderlind et al.
Gene 1995 Jul 28; 160(2):
269-272).
Los productos mutados fueron luego sometidos a
degradación controlada con exonucleasa BAL31 que podía ser usada
para retirar nucleótidos de los términos de ADN de hebra doble en
una manera controlada. Es predominantemente una exonucleasa 3'
(Sambrook et al., Sambrook, J., Fritsch E.F. and Mantiatis T.
Molecular Cloning a laborator.y Manual Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 2nd edition, 1989) y retira mono nucleótidos de
ambos términos de las dos hebras de ADN lineal de 3. Adicionalmente,
también actúa como una endonucleasa degradando el ADN generado por
la actividad de la exonucleasa. La degradación está totalmente en
función de la presencia de calcio y la reacción puede ser detenida
en etapas diferentes añadiendo el agente quelante EGTA de calcio.
Ba131 trabaja asincrónicamente en una combinación de moléculas de
ADN, generando una población de ADN de tamaños diferentes cuyos
términos han sido digeridas en varias extensiones y de cuya cola de
ADN solo una hebra varía en su longitud. El ADN de interés es
digerido con BAL31 y las muestras son retiradas a tiempos diferentes
y puestas en una solución con EGTA, que no interfiere en la
actividad de polimerasa Taq. Por lo tanto, el reensamblaje basado
en PCR es posible directamente después del procedimiento de
digestión. La longitud media de colas de solo una hebra creada por
la digestión de ADN lineal está en función tanto del tiempo de
tratamiento con Ba131, como de la concentración de la enzima. Altas
concentraciones de enzima de 2-5 U/ml producen un
promedio de 5 nucleótidos de ADNss por término, mientras que
0,1-0,2 U/ml pueden producir ADNss más largo.
Después del tratamiento de BAL31, la mezcla de
fragmentos de ADN generados de diferentes tamaños, que fueron
reensamblado como previamente se ha descrito, en genes de scFv de
longitud completa. Los genes resultantes fueron clonados en vector
fagómido pEXmide5 dy, el tamaño de la biblioteca resultante
después de la transformación de ADN fue de
5,7x10^{4}cfu/\mug.
Clones solos de la biblioteca fueron secuenciados
para calcular la variabilidad genética en la biblioteca. Las
frecuencias de las mutaciones encontradas, distribuidas en la región
VL-VH de longitud 782 bp del anticuerpo scFv, se
extendieron entre 1-56 (Tabla 1). Esto es una
velocidad de mutación que se extiende entre 0,13% a 7,16%, mientras
que la velocidad de mutación para PCR prono de error ha sido
señalada como 0,7% (Kuipers et al., Nucleic Acids Res 1991
Aug 25;19(16):4558). Este resultado demuestra el
efecto de las mutaciones recombinantes en un juego de genes, dando
como resultado una población génica variada que puede ser usada en
las selecciones/cribado de proteínas con funciones nuevas y
modificadas.
La polimerasa AmpliTaq® fue comprada de
Perkin-Elmer Corp., los DNTPs de
Boehringer Mannheim Biochemica (Mannheim, Alemania), y la
Nucleasa BAL 31 de New England Biolabs Inc. (Beverly,
EE.UU.). Todas las enzimas de restricción fueron compradas de
Boehringer Mannheim Biochemica (Mannheim, Alemania). El
bromuro de etidio fue comprado de Bio-Rad
Laboratories (Bio-Rad Laboratories, Hercules,
CA, EE.UU.). La Ligasa T4ADN fue comprada de Boehringer Mannheim
Biochemica (Mannheim, Alemania).
Todas las plantillas fueron diseñadas y
sintetizadas en el departamento con un sintetizador
DNA-Synthesiser 391 de Applied
Biosystems. Los sitios de restricción introducidos en cada
plantilla están subrayados.
Para PCR prono de error y PCR de reamplificación
después del tratamiento de Ba131:
pEXmida V: los sitios 4055 bp Ncol- y Sall- están
señalados en forma de texto subrayado como están indicados en la
Figura 8.
Las reacciones de PCR prono de error fueron
llevadas a cabo en un búfer de 10 x conteniendo 500 mM NaCl, 100 mM
de Tris-HCI, pH 8,8, 5 \mug de gelatina, 100 mM de
MgCI_{2} (según Kuipers et al Nucleic Acids Res. 1991, Aug
25; 19 (16): 4558) menos un aumento en la concentración de
MgCI_{2} de 2 mM a 5 mM).
Para cada 100 \mul de reacción fue mezclado lo
siguiente:
dATP 5 mM 5 \mul
dGTP 5 mM 5 \mul
dTTP 10 mM 10 \mul
dCTP 10 mM 10 \mul
20 \muM plantilla 3' 1,5 \mul
20 \muM plantilla 5' 1,5 \mul
10x búfer Kuipers 10 \mul
H_{2}O mp estéril 46,3 \mul
La plantilla scFv FITC B11 en el vector pEXmida V
(24,5 ng/\mul) fue añadida en una cantidad de 42 ng. Fueron
añadidos 10 \mul de 10 mM de MnCI_{2} y se verificó que en el
tubo no ocurría ninguna precipitación de MnO_{2}. Al final fueron
añadidas 5 unidades de la enzima Taq. El PCR prono de error fue
realizado a las siguientes temperaturas durante 25 ciclos sin un
comienzo con calentamiento: de 94ºC 1', 45ºC 1', 72ºC 1', usando un
segundo de tiempo para la rampa, seguido por un enfriamiento rápido
hasta 4ºC. El producto resultante fue una inserción de prono de
error en el scFv FITC de 782 bp. Este Inserción fue purificada con
equipo de purificación de PCR de Qiaqucik, antes del
tratamiento de Nucleasa BAL 31.
La inserción purificada sometida a prono de error
fue digerida con 0,5 U de enzima BAL 31/\mug de inserción de ADN.
Tubos de Eppendorf 1.5 ml estériles con ADN, búfer de Nucleasa 2x
BAL31 y agua fueron preincubados a 30ºC durante 10 minutos. Después
de esta preincubación, fue añadida Nucleasa BAL31 excepto a un tubo
de control hasta una concentración final de 0,5 Unidad/\mug de
ADN. El tubo de control, por lo tanto, contenía solamente búfer de
ADN y agua. Después de t = 2', 4', 6', 8' y definitivamente 10
minutos, el tubo fue mezclado y las muestras fueron retiradas y
añadidas a los tubos con EGTA, y puestas sobre hielo. La
concentración de trabajo de EGTA fue 20mM. Al mismo tiempo, el
volumen de control fue retirado del baño de agua y esta muestra
también fue mezclada con EGTA y puesta sobre hielo. Los tubos fueron
puestos en un baño de agua a 65ºC para la desactivación con calor de
la enzima y luego reubicados sobre hielo.
El reensamblaje de las mezclas de fragmentos
generados fue llevado a cabo como fue descrito antes en dos
reacciones subsiguientes de PCR. La primera reacción PCR fue llevada
a cabo sin adición de cualquier plantilla externa mezclando
cantidades iguales de las mezclas de tiempos diferentes en una
reacción de PCR patrón. La reacción PCR se llevo a cabo en 40 ciclos
que consistía en el siguiente perfil: denaturación (94ºC por 1
minuto), fusión de plantilla (55ºC por 1 minuto) y extensión (72ºC
por 1 minuto) usando un tiempo de rampa de 1 segundo. Las reacciones
PCR contenían, a menos que se indique lo contrario, 5 \mul de cada
plantilla (20 \muM), 16 \mul de una mezcla de dNTP (1,25 mM de
cada dTTP, dATP, dCTP y dGTP), 10 \mul de búfer 10x de reacción
proporcionado con la enzima, 0,5 \mul de polimerasa ADN
AmpliTaq® termoestable (5U/\mul)
(Perkin-Elmer Corp.) y agua hasta un volumen final
de 100 \mul.
Los productos reensamblados fueron luego
reamplificados con un PCR conteniendo las plantillas externas 3'- y
5'- para generar una Inserción del tamaño correcto y así también
introducir los sitios de restricción Ncol y Sall para
la clonación en el vector pEXmida V. La reacción PCR se llevo a cabo
en 25 ciclos que consistían en el siguiente perfil: denaturación
(94ºC por 1 minuto), fusión de plantilla (55ºC por 1 minuto) y
extensión (72ºC por 1 minuto) usando un tiempo de rampa de 1
segundo. Las reacciones PCR contenían, 5 \mul de cada plantilla
(20 \muM), 16 \mul de una mezcla de dNTP (1,25 mm de cada dTTP,
dATP, dCTP y dGTP), 10 \mul de 10x búfer de reacción proporcionado
con la enzima, 0,5 \mul de polimerasa ADN AmpliTaq®
termoestable (5U/\mul) (Perkin-Elmer Corp.) y
agua para un volumen final de 100 \mul . La inserción subsiguiente
fue purificada en un gel de agarosa al 2% usando el equipo de
extracción de gel Qiaquick (Kobayashi et al.,
Biotechniques 1997 Sep;
23(3):500-503).
\newpage
La inserción y vector fueron digeridos con las
enzimas Ncol y Sall de Boehringer Mannheim. La
inserción fue escindida con 10 U enzima/\mug de ADN y el vector
con 4 U/\mug de ADN La inserción fue luego purificada en gel como
fue descrito anteriormente y el vector fue purificado usando los
microconcentradores de Microcon 100 (Amicon, Inc.,
Beverly, MA 01915, EE.UU.). El vector fue escindido entonces con una
tercera enzima, la enzima de Pst I, cuyo sitio de restricción está
ubicado entre las primeras dos enzimas. El vector fue purificado en
gel con el equipo de extracción de gel Qiaquick (Qiagen GmbH,
Hilden, Alemania). La inserción y el vector purificado fueron
ligados con 25 U de ligasa T4 ADN/\mug de ADN (Boehringer
Mannheim) en un vector para una proporción de inserción de 590
ng de vector a 240 ng de inserción (la proporción molar fue de 12:1)
durante 14 horas a 12ºC. Las reacciones de ligadura fueron
purificadas por extracción con cloroformo-fenol y
precipitación con etanol y posteriormente transformadas en células
bacterianas electro competentes Top 10 F'. El tamaño de la
biblioteca fue determinado en 5,7 x 10^{4} cfu/\mug de ADN.
Existencias de glicerina fueron producidas después de la
transformación según J. Engberg et al (Molecular
Biotechnology Vol 6, 1996 p287-310) y
almacenadas a 20ºC.
Se crecieron distintas colonias de la biblioteca
de existencias de glicerina y las preparaciones de plásmidos fueron
llevadas a cabo con "Promega Wizard Plus Minipreps DNA
Purification System" (Promega, Madison, WI USA). La
inserción VL y VH de estos plásmidos fue amplificada con un PCR
conteniendo las plantillas externas 3'- y 5'- para generar una
inserción del tamaño correcto. Estas inserciones fueron secuenciadas
entonces con juego de secuenciación cíclica Big Dye
DyedeoxyTM Terminator Kit. La secuenciación fue llevada a
cabo en un secuenciador ABI Prism 377 DNA Sequencer.
| Número de mutaciones en las secuencias scFv de longitud 782 bp después del tratamiento FIND | |
| Clon | Número de mutaciones |
| 1 | 1 |
| 2 | 5 |
| 3 | 8 |
| 4 | 23 |
| 5 | 50 |
| 6 | 56 |
| 7 | 10 |
| 8 | 26 |
| 9 | 38 |
| 10 | 18 |
Claims (26)
1. Un método para generar una secuencia o
población de secuencias de polinucleótidos a partir de una secuencia
de un polinucleótido madre que codifica uno o más motivos de
proteína, que comprende los pasos de:
- a)
- digerir la secuencia de polinucleótido madre con una exonucleasa para generar una población de fragmentos;
- b)
- poner en contacto dichos fragmentos con una secuencia de polinucleótido de plantilla en condiciones de fusión;
- c)
- ampliar los fragmentos que se fusionan a la plantilla en el paso b) para generar al menos una secuencia de polinucleótidos que codifica uno o más motivos de proteína que tienen una secuencia alterada si se compara con uno o más motivos de proteína codificados por dicho polinucleótido madre.
2. Un método como se reivindica en la
reivindicación 1, en el que la población de fragmentos en el paso
(a) comprende fragmentos de diferentes tamaños.
3. Un método como se reivindica en la
reivindicación 2, en el que las reacciones de digestión difieren en
la duración de la digestión por exonucleasa y/o en la concentración
de exonucleasa.
4. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que el polinucleótido madre es de
doble hebra y el método adicionalmente antes del paso b) comprende
el paso de generar la secuencia de polinucleótidos de una sola hebra
a partir de dichos fragmentos de doble hebra.
5. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que la secuencia de polinucleótidos de
plantilla es la secuencia del polinucleótido madre.
6. El método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha secuencia de polinucleótidos
de plantilla es una variante de la secuencia de polinucleótido
madre.
7. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha secuencia de polinucleótido
de plantilla es una secuencia de tipo natural.
8. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que dicha secuencia de polinucleótido
madre es variante de una secuencia de tipo natural.
9. Un método según cualquiera de las
reivindicación 1 a 5 u 8, en el que la secuencia de polinucleótido
madre ha sido sometida a mutagénesis.
10. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la población de fragmentos
generados en el paso b) se somete a mutagénesis.
11. Un método según la reivindicación 9 o la
reivindicación 10, en el que la mutagénesis es mutagénesis PCR prono
de error.
12. Un método para generar una secuencia o
población de polinucleótidos a partir de una secuencia de
polinucleótido madre, el que tiene secuencia alterada en sus
términos si se compara con dicha secuencia de polinucleótido madre,
que comprende los pasos de:
- a)
- digerir dicha secuencia de polinucleótido madre con una exonucleasa para generar una población de fragmentos;
- b)
- poner en contacto, en condiciones de fusión, dichos fragmentos con una secuencia de polinucleótidos de plantilla que es una variante de dicha secuencia de polinucleótido madre, en el que la secuencia de polinucleótidos de plantilla incluye una secuencia correspondiente a la región del medio del polinucleótido madre
- c)
- ampliar los fragmentos que se fusionan a la plantilla en el paso b) para generar al menos una secuencia de polinucleótidos que codifica uno o más motivos de proteína codificados por dicho polinucleótido madre.
13. Un método para generar una secuencia o
población de secuencias de polinucleótidos a partir de una secuencia
de polinucleótido madre que codifica uno o más motivos de proteína,
que comprende los pasos de:
- a)
- digerir una población de plinucléotidos variantes con una exonucleasa para generar una población de fragmentos, las variantes siendo variantes de la secuencia del polinucleótido madre;
\newpage
- b)
- poner en contacto en condiciones de fusión los fragmentos con una plantilla, siendo la plantilla la secuencia de polinucleótido madre
- c)
- ampliar los fragmentos que se fusionan a la madre en el paso b) para generar al menos una secuencia de polinucleótidos que codifica uno o más motivos de proteína codificados por dicho polinucleótido madre.
14. Un método como se reivindica en la
reivindicación 13, en el que la población de fragmentos en el paso
(a) comprende fragmentos de diferentes tamaños.
15. Un método como se reivindica en la
reivindicación 14, en el que las reacciones de digestión difieren en
la duración de la digestión por exonucleasa y/o la concentración de
exonucleasa.
16. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la exonucleasa es
BAL31.
17. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la secuencia de
polinucleótido madre codifica un anticuerpo o fragmento suyo.
18. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 16, en el que la secuencia de polinucleótido
madre codifica una enzima.
19. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes que adicionalmente comprende el paso de
cribar el al menos un polinucleótido generado en el paso c) por una
secuencia de nucleótido alterado si se compara con el polinucleótido
madre.
20. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes que adicionalmente comprende el paso de
expresar el al menos un polinucleótido generado en el paso c).
21. Un método según la reivindicación 20 que
adicionalmente comprende un paso, posterior a la expresión del al
menos un polinucleótido generado en el paso c), de cribar el
polipéptido resultante por una secuencia de aminoácido alterado si
se compara con el polipéptido codificado por el polinucleótido madre
comparando una actividad del polipéptido resultante con la actividad
correspondiente del polipéptido codificado por el polinucleótido
madre.
22. Un método según la reivindicación 21, en el
que la actividad se selecciona entre el grupo que consta de
actividad catalítica, especificidad enlazante, antigenicidad y
reactividad cruzada.
23. Un método según la reivindicación 19 que
comprende adicionalmente el paso de añadir el al menos un
polinucleótido, completa o parcialmente, opcionalmente en
conjunción con la secuencia de polinucleótido adicional, a un
portador farmacéutico aceptable.
24. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 20 a 22 que adicionalmente comprende el paso de
añadir el polipéptido resultante, completa o parcialmente,
opcionalmente en conjunción con polipéptidos adicionales, a un
portador farmacéutico aceptable.
25. Un método según la reivindicación 24, en el
que el polipéptido resultante es un anticuerpo o fragmento suyo.
26. Un método según la reivindicación 24, en el
que el polipéptido resultante es una enzima.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB9712512 | 1997-06-16 | ||
| GBGB9712512.4A GB9712512D0 (en) | 1997-06-16 | 1997-06-16 | A method for in vitro molecular evolution of protein function |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2232953T3 true ES2232953T3 (es) | 2005-06-01 |
Family
ID=10814243
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES98930871T Expired - Lifetime ES2232953T3 (es) | 1997-06-16 | 1998-06-16 | Un metodo para la evolucion molecular en vitro de la funcion de proteina. |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6159690A (es) |
| EP (1) | EP0990044B1 (es) |
| JP (1) | JP3486676B2 (es) |
| AT (1) | ATE277198T1 (es) |
| AU (1) | AU745150B2 (es) |
| CA (1) | CA2293819C (es) |
| DE (1) | DE69826465T2 (es) |
| DK (1) | DK0990044T3 (es) |
| ES (1) | ES2232953T3 (es) |
| GB (1) | GB9712512D0 (es) |
| PT (1) | PT990044E (es) |
| WO (1) | WO1998058080A1 (es) |
Families Citing this family (64)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6713279B1 (en) | 1995-12-07 | 2004-03-30 | Diversa Corporation | Non-stochastic generation of genetic vaccines and enzymes |
| US5830696A (en) | 1996-12-05 | 1998-11-03 | Diversa Corporation | Directed evolution of thermophilic enzymes |
| US6939689B2 (en) | 1995-12-07 | 2005-09-06 | Diversa Corporation | Exonuclease-mediated nucleic acid reassembly in directed evolution |
| US6740506B2 (en) | 1995-12-07 | 2004-05-25 | Diversa Corporation | End selection in directed evolution |
| US6352842B1 (en) | 1995-12-07 | 2002-03-05 | Diversa Corporation | Exonucease-mediated gene assembly in directed evolution |
| US6764835B2 (en) | 1995-12-07 | 2004-07-20 | Diversa Corporation | Saturation mutageneis in directed evolution |
| US6358709B1 (en) | 1995-12-07 | 2002-03-19 | Diversa Corporation | End selection in directed evolution |
| US7018793B1 (en) | 1995-12-07 | 2006-03-28 | Diversa Corporation | Combinatorial screening of mixed populations of organisms |
| US6361974B1 (en) | 1995-12-07 | 2002-03-26 | Diversa Corporation | Exonuclease-mediated nucleic acid reassembly in directed evolution |
| US6238884B1 (en) | 1995-12-07 | 2001-05-29 | Diversa Corporation | End selection in directed evolution |
| US6562594B1 (en) | 1999-09-29 | 2003-05-13 | Diversa Corporation | Saturation mutagenesis in directed evolution |
| US6537776B1 (en) | 1999-06-14 | 2003-03-25 | Diversa Corporation | Synthetic ligation reassembly in directed evolution |
| US8207093B2 (en) | 1997-01-21 | 2012-06-26 | The General Hospital Corporation | Selection of proteins using RNA-protein fusions |
| RU2233878C2 (ru) | 1997-01-21 | 2004-08-10 | Дзе Дженерал Хоспитал Корпорейшн | Способ отбора желательного белка и нуклеиновой кислоты, средства для его осуществления |
| US6261804B1 (en) | 1997-01-21 | 2001-07-17 | The General Hospital Corporation | Selection of proteins using RNA-protein fusions |
| GB9701425D0 (en) | 1997-01-24 | 1997-03-12 | Bioinvent Int Ab | A method for in vitro molecular evolution of protein function |
| GB9712512D0 (en) * | 1997-06-16 | 1997-08-20 | Bioinvent Int Ab | A method for in vitro molecular evolution of protein function |
| US7153655B2 (en) | 1998-06-16 | 2006-12-26 | Alligator Bioscience Ab | Method for in vitro molecular evolution of protein function involving the use of exonuclease enzyme and two populations of parent polynucleotide sequence |
| US6846655B1 (en) | 1998-06-29 | 2005-01-25 | Phylos, Inc. | Methods for generating highly diverse libraries |
| US6951719B1 (en) * | 1999-08-11 | 2005-10-04 | Proteus S.A. | Process for obtaining recombined nucleotide sequences in vitro, libraries of sequences and sequences thus obtained |
| US6602685B1 (en) | 1998-08-17 | 2003-08-05 | Phylos, Inc. | Identification of compound-protein interactions using libraries of protein-nucleic acid fusion molecules |
| US6438561B1 (en) * | 1998-11-19 | 2002-08-20 | Navigation Technologies Corp. | Method and system for using real-time traffic broadcasts with navigation systems |
| US6368861B1 (en) | 1999-01-19 | 2002-04-09 | Maxygen, Inc. | Oligonucleotide mediated nucleic acid recombination |
| US6376246B1 (en) | 1999-02-05 | 2002-04-23 | Maxygen, Inc. | Oligonucleotide mediated nucleic acid recombination |
| AU2415200A (en) * | 1999-01-18 | 2000-08-01 | Maxygen, Inc. | Methods of populating data structures for use in evolutionary simulations |
| US6917882B2 (en) * | 1999-01-19 | 2005-07-12 | Maxygen, Inc. | Methods for making character strings, polynucleotides and polypeptides having desired characteristics |
| US7024312B1 (en) | 1999-01-19 | 2006-04-04 | Maxygen, Inc. | Methods for making character strings, polynucleotides and polypeptides having desired characteristics |
| US7702464B1 (en) | 2001-08-21 | 2010-04-20 | Maxygen, Inc. | Method and apparatus for codon determining |
| US7873477B1 (en) | 2001-08-21 | 2011-01-18 | Codexis Mayflower Holdings, Llc | Method and system using systematically varied data libraries |
| US6961664B2 (en) | 1999-01-19 | 2005-11-01 | Maxygen | Methods of populating data structures for use in evolutionary simulations |
| EP1072010B1 (en) | 1999-01-19 | 2010-04-21 | Maxygen, Inc. | Oligonucleotide mediated nucleic acid recombination |
| US20070065838A1 (en) * | 1999-01-19 | 2007-03-22 | Maxygen, Inc. | Oligonucleotide mediated nucleic acid recombination |
| US8457903B1 (en) | 1999-01-19 | 2013-06-04 | Codexis Mayflower Holdings, Llc | Method and/or apparatus for determining codons |
| AU3879300A (en) * | 1999-03-09 | 2000-09-28 | Diversa Corporation | End selection in directed evolution |
| EP1092041A4 (en) * | 1999-03-26 | 2001-09-19 | Diversa Corp | EXONUCLEASE-MEDIATED ASSEMBLY OF NUCLEIC ACIDS IN THE DIRECT EVOLUTION |
| US6440706B1 (en) | 1999-08-02 | 2002-08-27 | Johns Hopkins University | Digital amplification |
| US7430477B2 (en) | 1999-10-12 | 2008-09-30 | Maxygen, Inc. | Methods of populating data structures for use in evolutionary simulations |
| DE19953854C2 (de) * | 1999-11-09 | 2002-01-17 | Max Planck Gesellschaft | Verfahren zur Herstellung von Biopolymeren mit veränderten Eigenschaften |
| EP1250463B1 (en) | 2000-01-24 | 2006-04-05 | Compound Therapeutics, Inc. | Sensitive, multiplexed diagnostic assays for protein analysis |
| US7022479B2 (en) | 2000-01-24 | 2006-04-04 | Compound Therapeutics, Inc. | Sensitive, multiplexed diagnostic assays for protein analysis |
| US6479262B1 (en) * | 2000-05-16 | 2002-11-12 | Hercules, Incorporated | Solid phase enzymatic assembly of polynucleotides |
| US6994963B1 (en) | 2000-07-10 | 2006-02-07 | Ambion, Inc. | Methods for recombinatorial nucleic acid synthesis |
| AUPQ974900A0 (en) | 2000-08-29 | 2000-09-21 | Macquarie Research Limited | Degenerate oligonucleotide gene-shuffling |
| US6993458B1 (en) * | 2000-11-07 | 2006-01-31 | International Business Machines Corporation | Method and apparatus for preprocessing technique for forecasting in capacity management, software rejuvenation and dynamic resource allocation applications |
| AU3457202A (en) * | 2000-12-12 | 2002-06-24 | Bioinvent Int Ab | A method for in vitro molecular evolution of protein function |
| US6958213B2 (en) * | 2000-12-12 | 2005-10-25 | Alligator Bioscience Ab | Method for in vitro molecular evolution of protein function |
| GB2370038B (en) * | 2000-12-12 | 2003-03-26 | Bioinvent Int Ab | A method for in vitro molecular evolution of protein function |
| US20020086292A1 (en) | 2000-12-22 | 2002-07-04 | Shigeaki Harayama | Synthesis of hybrid polynucleotide molecules using single-stranded polynucleotide molecules |
| DK1409667T4 (da) * | 2001-07-23 | 2009-09-07 | Dsm Ip Assets Bv | Fremgangsm der til at fremstilling varierende polynucleotider |
| DE60210298T2 (de) * | 2001-07-23 | 2006-11-02 | Dsm Ip Assets B.V. | Verfahren zur herstellung von polynucleotidvarianten |
| WO2003048395A1 (en) * | 2001-12-03 | 2003-06-12 | Zymogenetics, Inc. | Methods for the selection and cloning of nucleic acid molecules free of unwanted nucleotide sequence alterations |
| IL164687A0 (en) * | 2002-05-02 | 2005-12-18 | Univ North Carolina | Cellular libraries and methods for the preparationthereof |
| GB2388604B (en) * | 2002-05-17 | 2005-01-26 | Alligator Bioscience Ab | A method for in vitro molecular evolution of protein function |
| DK1504098T4 (da) | 2002-05-17 | 2011-05-23 | Alligator Bioscience Ab | Fremgangsmåde til molekyulær udvikling in vitro af proteinfunktion |
| WO2004072245A2 (en) * | 2003-02-06 | 2004-08-26 | Rensselaer Polytechnic Institute | Polymerase-based protocols for the introductions of deletions and insertions |
| US20060134624A1 (en) * | 2003-02-06 | 2006-06-22 | Salerno John C | Polymerase-based protocols for the introductions of deletions and insertions |
| US20060257876A1 (en) * | 2003-02-06 | 2006-11-16 | Rensselaer Polytechnis Institute | Polymerase-based protocols for generating chimeric and combinatorial... |
| US20060228786A1 (en) * | 2003-02-06 | 2006-10-12 | Salerno John C | Polymerase-based protocols for the introduction of deletions and insertions |
| GB2432366B (en) * | 2005-11-19 | 2007-11-21 | Alligator Bioscience Ab | A method for in vitro molecular evolution of protein function |
| GB0607798D0 (en) | 2006-04-20 | 2006-05-31 | Alligator Bioscience Ab | Novel polypeptides and use thereof |
| EP2130918A1 (de) | 2008-06-05 | 2009-12-09 | C-Lecta GmbH | Verfahren zur Erzeugung einer Varianten-Bibliothek von DNA-Sequenzen |
| US20090312196A1 (en) * | 2008-06-13 | 2009-12-17 | Codexis, Inc. | Method of synthesizing polynucleotide variants |
| GB0905790D0 (en) | 2009-04-03 | 2009-05-20 | Alligator Bioscience Ab | Novel polypeptides and use thereof |
| DE102010056289A1 (de) * | 2010-12-24 | 2012-06-28 | Geneart Ag | Verfahren zur Herstellung von Leseraster-korrekten Fragment-Bibliotheken |
Family Cites Families (29)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4965188A (en) | 1986-08-22 | 1990-10-23 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme |
| EP0454781B1 (en) | 1989-01-23 | 1998-12-16 | Chiron Corporation | Recombinant cells for therapies of infection and hyperproliferative disorders and preparation thereof |
| US5043272A (en) | 1989-04-27 | 1991-08-27 | Life Technologies, Incorporated | Amplification of nucleic acid sequences using oligonucleotides of random sequence as primers |
| CA2016842A1 (en) | 1989-05-16 | 1990-11-16 | Richard A. Lerner | Method for tapping the immunological repertoire |
| US5023171A (en) | 1989-08-10 | 1991-06-11 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Method for gene splicing by overlap extension using the polymerase chain reaction |
| GB8919607D0 (en) | 1989-08-30 | 1989-10-11 | Wellcome Found | Novel entities for cancer therapy |
| WO1991006570A1 (en) | 1989-10-25 | 1991-05-16 | The University Of Melbourne | HYBRID Fc RECEPTOR MOLECULES |
| US5573907A (en) * | 1990-01-26 | 1996-11-12 | Abbott Laboratories | Detecting and amplifying target nucleic acids using exonucleolytic activity |
| AU7791991A (en) | 1990-04-24 | 1991-11-11 | Stratagene | Methods for phenotype creation from multiple gene populations |
| US5858725A (en) | 1990-10-10 | 1999-01-12 | Glaxo Wellcome Inc. | Preparation of chimaeric antibodies using the recombinant PCR strategy |
| WO1993000103A1 (en) | 1991-06-21 | 1993-01-07 | The Wistar Institute Of Anatomy And Biology | Chimeric envelope proteins for viral targeting |
| GB9115364D0 (en) | 1991-07-16 | 1991-08-28 | Wellcome Found | Antibody |
| WO1993006213A1 (en) | 1991-09-23 | 1993-04-01 | Medical Research Council | Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach |
| IL103059A0 (en) | 1991-09-30 | 1993-02-21 | Boehringer Ingelheim Int | Conjugates for introducing nucleic acid into higher eucaryotic cells |
| US5252479A (en) | 1991-11-08 | 1993-10-12 | Research Corporation Technologies, Inc. | Safe vector for gene therapy |
| GB9125979D0 (en) | 1991-12-06 | 1992-02-05 | Wellcome Found | Antibody |
| JP3431146B2 (ja) | 1992-01-30 | 2003-07-28 | ジェンザイム・リミテッド | 改変した酵素によるキラル合成 |
| GB9202796D0 (en) | 1992-02-11 | 1992-03-25 | Wellcome Found | Antiviral antibody |
| CA2131151A1 (en) | 1992-03-24 | 1994-09-30 | Kevin S. Johnson | Methods for producing members of specific binding pairs |
| CA2115346A1 (en) | 1992-06-15 | 1993-12-23 | John E. Shively | Chimeric anti-cea antibody |
| US6107062A (en) | 1992-07-30 | 2000-08-22 | Inpax, Inc. | Antisense viruses and antisense-ribozyme viruses |
| US5837821A (en) | 1992-11-04 | 1998-11-17 | City Of Hope | Antibody construct |
| ATE199392T1 (de) | 1992-12-04 | 2001-03-15 | Medical Res Council | Multivalente und multispezifische bindungsproteine, deren herstellung und verwendung |
| US5605793A (en) | 1994-02-17 | 1997-02-25 | Affymax Technologies N.V. | Methods for in vitro recombination |
| US6165793A (en) | 1996-03-25 | 2000-12-26 | Maxygen, Inc. | Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination |
| US6117679A (en) | 1994-02-17 | 2000-09-12 | Maxygen, Inc. | Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination |
| GB9701425D0 (en) * | 1997-01-24 | 1997-03-12 | Bioinvent Int Ab | A method for in vitro molecular evolution of protein function |
| US6153410A (en) | 1997-03-25 | 2000-11-28 | California Institute Of Technology | Recombination of polynucleotide sequences using random or defined primers |
| GB9712512D0 (en) | 1997-06-16 | 1997-08-20 | Bioinvent Int Ab | A method for in vitro molecular evolution of protein function |
-
1997
- 1997-06-16 GB GBGB9712512.4A patent/GB9712512D0/en active Pending
-
1998
- 1998-06-16 AT AT98930871T patent/ATE277198T1/de not_active IP Right Cessation
- 1998-06-16 CA CA002293819A patent/CA2293819C/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-06-16 JP JP50396899A patent/JP3486676B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1998-06-16 DE DE69826465T patent/DE69826465T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1998-06-16 AU AU81159/98A patent/AU745150B2/en not_active Ceased
- 1998-06-16 ES ES98930871T patent/ES2232953T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-06-16 WO PCT/GB1998/001757 patent/WO1998058080A1/en not_active Application Discontinuation
- 1998-06-16 DK DK98930871T patent/DK0990044T3/da active
- 1998-06-16 US US09/098,287 patent/US6159690A/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-06-16 PT PT98930871T patent/PT990044E/pt unknown
- 1998-06-16 US US09/445,649 patent/US6495321B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-06-16 EP EP98930871A patent/EP0990044B1/en not_active Revoked
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2293819A1 (en) | 1998-12-23 |
| EP0990044B1 (en) | 2004-09-22 |
| JP2002505584A (ja) | 2002-02-19 |
| JP3486676B2 (ja) | 2004-01-13 |
| DK0990044T3 (da) | 2004-12-06 |
| US6159690A (en) | 2000-12-12 |
| ATE277198T1 (de) | 2004-10-15 |
| DE69826465D1 (de) | 2004-10-28 |
| GB9712512D0 (en) | 1997-08-20 |
| AU8115998A (en) | 1999-01-04 |
| CA2293819C (en) | 2006-10-31 |
| EP0990044A1 (en) | 2000-04-05 |
| DE69826465T2 (de) | 2005-09-29 |
| WO1998058080A1 (en) | 1998-12-23 |
| US6495321B1 (en) | 2002-12-17 |
| PT990044E (pt) | 2005-01-31 |
| AU745150B2 (en) | 2002-03-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2232953T3 (es) | Un metodo para la evolucion molecular en vitro de la funcion de proteina. | |
| US7816085B2 (en) | Method for in vitro molecular evolution of protein function | |
| ES2395249T3 (es) | Un método para la evolución molecular in vitro de la función proteínica | |
| ES2285118T3 (es) | Un metodo de desarrollo molecular in vitro de una funcion de proteina. | |
| ES2244670T3 (es) | Metodo para la evolucion molecular in vitro de una funcion proteinica. | |
| AU2002234572A1 (en) | A method for in vitro molecular evolution of protein function | |
| US7153655B2 (en) | Method for in vitro molecular evolution of protein function involving the use of exonuclease enzyme and two populations of parent polynucleotide sequence | |
| AU777754B2 (en) | A method for in vitro molecular evolution of protein function | |
| US20220145323A1 (en) | Improved transposon insertion sites and uses thereof | |
| GB2370038A (en) | A method for in vitro molecular evolution of protein function | |
| GB2388604A (en) | Molecular evolution in vitro |