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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur molekularen
in vitro-Evolution von Proteinfunktion, insbesondere durch Mischen
(engl.: shuffling) von Einzelstrang-DNS-Segmenten, die unter Verwendung einer
Nuklease erhalten werden.
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Proteinfunktion
kann in vitro durch eine Vielzahl von Verfahren modifiziert und
verbessert werden, einschließlich
platzgerichteter Mutationserzeugung (Albe et al., Nature, 5; 330(6143):
41-46, 1987), kombinatorisches Klonieren (Huse et al., Science, 246:
1275-1281, 1989; Marks et al., Biotechnology, 10: 779-783, 1992)
und zufällige
Mutationserzeugung kombiniert mit geeigneten Auswahlsystemen (Barbas
et al., PNAS. USA, 89: 4457-4461, 1992).
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Das
Verfahren der zufälligen
Mutationserzeugung zusammen mit Selektion ist in einer Anzahl von
Fällen
verwendet worden, um Proteinfunktion zu verbessern, und zwei unterschiedliche
Strategien existieren. Zum Einen handelt es sich um die Zufallsverteilung
der der gesamten Gensequenz in Kombination mit der Selektion einer
Proteinvariante (eines Proteinmutanten) mit den gewünschten
Eigenschaften gefolgt von einer neuen Runde der zufälligen Mutationserzeugung
und Selektion. Dieses Verfahren kann dann wiederholt werden, bis
eine Proteinvariante gefunden ist, die als optimal betrachtet wird
(Schier R. et al., J. Mol. Biol. 1996 263 (4): 551-567). Hierbei ist
die traditionelle Route, Mutationen durch fehlerbehaftete PKR mit
einer Mutationsrate von ungefähr 0,7%
einzuführen
(Leung et al., Technique, 1: 11-15, 1989). Zum Anderen können definierte
Regionen des Gens mit degenerierten Primern mutiert werden, was Mutationsraten
von bis zu 100% erlaubt (Griffiths et al., EMBO. J, 13: 3245-3260,
1994; Yang et al., J. Mol. Biol. 254: 392-403, 1995). Je höher die
angewendete Mutationsrate ist, desto stärker ist der Bereich des Gens
beschränkt,
das der Mutationen unterworfen werden kann.
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Zufällige Mutation
ist umfangreich auf dem Gebiet des Antikörperengineering verwendet worden.
In vivo-gebildete Antikörpergene
können
in vitro kloniert werden (Larrick et al., Biochem. Biophys. Res.
Commun. 160: 1250-1256, 1989), und zufällige Kombinationen der Gene,
die die variablen schweren und leichten Gene kodieren, können einer
Selektion unterworfen werden (Marks et al., Biotechnology, 10: 779-783,
1992). Ausgewählte
funktionale Antikörperfragmente
können
dann unter Anwendung von zufälliger
Mutationserzeugung und zusätzlichen
Selektionsrunden verbessert werden (Schier R. et al., J. Mol. Biol.
1996 263 (4): 551-567).
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Der
Strategie der zufälligen
Mutationserzeugung folgt die Selektion. Varianten mit interessanten Eigenschaften
können
ausgewählt
werden, und die mutierten DNS-Regionen von unterschiedlichen Varianten,
jeweils mit interessanten Eigenschaften, werden zu einer kodierenden
Sequenz kombiniert (Yang et al., J. Mol. Biol. 254: 392-403, 1995).
Dies ist ein sequenzieller Prozess aus vielen Schritten, und potentielle
synergistische Effekte von unterschiedlichen Mutationen in unterschiedlichen
Regionen können verlorengehen,
da sie der Selektion nicht in Kombination unterworfen werden. Somit
umfassen diese beiden Strategien keine simultane Mutationserzeugung von
definierten Regionen und Selektion einer Kombination dieser Regionen.
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Ein
anderer Prozess bezieht das kombinatorische Paaren von Genen ein,
das verwendet werden kann, um z. B. Antikörperaffinität zu verbessern (Marks et al.,
Biotechnology, 10: 779-783,
1992). Hier sind die drei CDR-Regionen in jedem variablen Gen fest,
und diese Technologie erlaubt es nicht, individuelle Gensegmente
in den Genen für
die variable Domaln, zum Beispiel einschließlich der CDR-Regionen, zwischen
Klonen zu mischen.
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Das
Konzept des DNS-Mischens (engl.: DNA shuffling) (Stemmer, Nature
370: 389-391, 1994) wendet die zufällige Fragmentierung von DNS und
den Zusammenbau von Fragmenten zu einer funktionalen kodierenden
Sequenz an. Bei diesem Prozess ist es möglich, chemisch synthetisierte DNS-Sequenzen
einzuführen
und auf diese Weise eine Variation auf definierte Plätze in dem
Gen zu richten, dessen DNS-Sequenz bekannt ist (Crameri et al.,
Biotechniques, 18: 194-196, 1995). Stemmer und Mitarbeiter entwickelten
dieses in vitro-Verfahren, das den normalen Evolutionsprozess von
Protein in der Natur nachbildet. Das DNS-Mischen erzeugt Diversität durch
Rekombination, wobei nützliche
Mutationen von individuellen Genen kombiniert werden. Es ist erfolgreich
für die
künstliche
Evolution von unterschiedlichen Proteinen angewendet worden, z.
B. von Enzymen und Cytokinen (Chang et al., Nature Biotech 17, 793-797, 1999; Zhang
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 4504-4509, 1997; Christians
et al., Nature Biotech. 17, 259-264, 1999). Die Gene werden unter
Verwendung von DNase I zufällig
fragmentiert und dann durch Rekombination miteinander wieder zusammengebaut.
Das Ausgangsmaterial kann entweder ein einzelnes Gen sein (das zuerst zufällig unter
Anwendung fehlerbehafteter PKR mutiert wird) oder natürlich auftretende
homologe Sequenzen (sogenanntes Familienmischen (engl.: family shuffling)).
DNase I hydrolysiert DNS vorzugsweise an Plätzen benachbart von Pyrimidinnukleotiden, deshalb
ist sie eine geeignete Wahl für
die zufällige Fragmentierung
von DNS. Jedoch ist die Aktivität
abhängig
von Mg- oder Mn-Ionen, wobei Mg-Ionen die Fragmentgröße auf 50bp
beschränken,
während
die Mn-Ionen Fragmentgrößen kleiner
als 50bp ergeben. Deshalb muss das in Frage stehende Gen, um alle möglichen
Größen für Rekombinationen
zu haben, mindestens zweimal mit DNase I in der Anwesenheit von
jeweils einem der zwei unterschiedlichen Ionen behandelt werden,
gefolgt von Entfernen eben dieser Ionen.
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Ein
weiteres Verfahren zum Erzeugen einer rekombinanten DNS-Bibliothek
unter Verwendung von unidirektionalen Einzelstrang-DNS-Fragmenten ist
in der WO 02/38757 beschrieben.
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In
der Theorie ist es möglich,
DNS zwischen jeglichen Klonen zu mischen. Wenn jedoch das resultierende
gemischte Gen bezüglich
Expression und Aktivität
funktional sein soll, müssen
die zu mischenden Klone vorzugsweise verwandt oder mit der Ausnahme
eines geringen Maßes
an zufälligen
Mutationen sogar identisch sein. DNS-Mischen zwischen genetisch
unterschiedlichen Klonen wird allgemein nichtfunktionale Gene erzeugen.
Es ist jedoch durch die ITCHY-Methodik bewiesen worden, dass Interspeziesfusionsbibliotheken
zwischen Fragmenten des E. coli- und des humanen Glycinamidribonukleotidtransformylasegens
erzeugt werden können,
die auf DNS-Niveau nur eine 50%ige Identität aufweisen (Ostermeier et
al., Nat Biotechnol 17, 1205-9, 1999).
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Eine
erfolgreiche Rekombination von zwei unterschiedlichen Genen erfordert
die Ausbildung von Hetero-Duplex-Molekülen. In einigen Fällen bildet
das Familienmischen nahezu nur Homo-Duplexe aus, was in eine niedrige Rekombinationsfrequenz resultiert.
Diesem Problem ist durch Verwendung von DNase 1-aufgeschlossener
Einzelstrang-DNS begegnet worden (Kikuchi et al., Gene 243, 133-137, 2000).
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Einzelstrang-DNS
kann unter Verwendung von Verfahren erhalten werden, die im Stand
der Technik bekannt sind. Zum Beispiel können bei den PKR-Reaktionen
biotinylierte Primer in Kombination mit z. B. Dynabeads (Dynal,
Norwegen) oder AffiniTip Streptavidin Capture Micro-Säulen (Genosys Biotechnologies
Inc., The Woodlands, USA) verwendet werden. Alternativ kann Einzelstrang-DNS
durch Verwenden von Bakteriophagen erhalten werden, die in der Lage sind,
Einzelstrang-DNS zu packen (Viruses and Related Entities in Modern
Microbiology, Principles and Applications pp. 171-192, Ed. E. A.
Birge, Wm. C. Brown Publishers, 1992; Sambrook et al., Molecular
Cloning, A laboratory manual 2nd edition. Cold
Spring Habor Laboratory Press, 1989). Zusätzlich können asymmetrische PKR-Verfahren
angewendet werden (siehe Beispiel 1).
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Die
Auswahl von Enzymen mit geänderten und
verbesserten Eigenschaften wird oft auf die tatsächliche Funktion des Enzyms
gestützt.
Zum Beispiel kann nach erhöhter
Thermostabilität
eines Enzyms durch Inkubieren transformierter Kolonien bei Temperaturen
selektiert werden, die eine Deaktivierung von Enzym des Wildtyps
verursachen können. Zusätzlich kann
verbesserte β-Glucosidaseaktivität durch
Verwenden von PNPG als Substrat identifiziert werden (Arrizubieta
et al., J Biol Chem Jun 27, 2000).
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Die
Selektion von funktionalen Proteinen aus Molekularbibliotheken ist
durch die Entwicklung der Phagen-Display-Technologie revolutioniert
worden (Parmley et al., Gene, 73: 305-391, 1988; McCafferty et al.,
Nature, 348: 552-554, 1990; Barbas et al., PNAS. USA, 88: 7978-7982,
1991). Hier wird der Phenotyp (das Protein) direkt mit seinem entsprechenden
Genotyp (DNS) verknüpft;
und dies erlaubt ein direktes Klonieren des genetischen Materials, das
dann weiteren Modifikationen unterworfen werden kann, um die Proteinfunktion
zu verbessern. Phagen-Display
ist angewendet worden, um funktionale Bindeglieder aus einer Vielzahl
von Molekularbibliotheken mit einer Größe von bis zu 1011 Transformanten
zu klonieren (Griffiths et al., EMBO. J. 13: 3245-3260, 1994). Somit
kann Phagen-Display angewendet werden, um funktionale Binder direkt
aus molekularen Bibliotheken zu klonieren, und auch um die ursprünglich ausgewählten Klone
zu verbessern. Andere Typen von Viren, die für die Oberflächenexpression
von Proteinbibliotheken und die Selektionen daraus verwendet worden
sind, sind Baculovirus (Boublik et al., Biotechnol 13: 1079-1084.
1995; Mottershead et al., Biochem Biophys Res Com 238: 717-722,
1997; Grabherr et al., Biotechniques 22: 730-735, 1997) und Retrovirus
(Buchholz et al., Nature Biotechnol 16: 951-954, 1998).
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Eine
Auswahl von funktionalen Proteinen aus Molekularbibliotheken kann
auch durch Zelloberflächen-Display
durchgeführt
werden. Auch hier ist der Phenotyp direkt mit dem entsprechenden
Genotyp verknüpft.
Bakterielles Zelloberflächen-Display
ist z. B. zum Screenen von verbesserten Varianten von Carboxymethylcellulase
(CMCase) verwendet worden (Kim et al., Appl Environ Microbiol 66:
788-93, 2000). Andere Zellen, die zu diesem Zweck verwendet werden
können,
sind Hefezellen (Boder und Wittrup Nat. Biotechnol 15: 553-557,
1997), COS-Zellen
(Higuchi et al., J Immunol Meth 202: 193-204, 1997) und Insektenzellen
(Granzerio et al., J Immunol Meth 203: 131-139, 1997; Ernst et al.,
Nucleic Acids Res 26: 1718-1723, 1998).
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Die
zufällige
Kombination von DNS von unterschiedlichen mutierten Klonen in Kombination
mit der Selektion von gewünschter
Funktion ist ein verglichen mit der sequenziellen Selektion und
Kombination von selektierten Klonen effizienterer Weg, um den Sequenzraum
zu durchsuchen.
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Die
vorliegende Erfindung strebt danach, verbesserte Verfahren für die in
vitro-Proteinevolution bereitzustellen. Insbesondere zielt die Erfindung darauf
ab, effizientere Rekombinations- und Mischverfahren bereitzustellen,
die stärker
veränderte
Moleküle
ergeben und dadurch die Wahrscheinlichkeit verbessern, Moleküle mit wünschenswerten
Eigenschaften zu finden.
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Gemäß einem
ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum
Erzeugen einer Polynukleotidsequenz oder einer Population von Sequenzen
aus einer Einzelstrangausgangspolynukleotidsequenz, die ein oder
mehrere Proteinmotive kodiert, bereit gestellt, das die Schritte
aufweist:
- a) Bereitstellen einer ersten Population
von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen und einer zweiten Population
von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen, wobei die erste und die
zweite Population zusammen Plus- und Minusstränge von Ausgangspolynukleotidsequenzen
ausbilden;
- b) Durchführen
einer Reaktion zum Aufschließen der
ersten und der zweiten Population von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen mit
einer Exonuklease zum Erzeugen entsprechender Populationen von Einzelstrangpolynukleotidfragmenten;
- c) Kontaktieren der Polynukleotidfragmente, die von den Plussträngen erzeugt
wurden, mit Fragmenten, die von den Minussträngen erzeugt wurden;
- d) Verstärken
der Fragmente, die aneinander hybridisieren, um mindestens eine
Polynukleotidsequenz zu erzeugen, die ein oder mehrere Proteinmotive
mit verglichen mit dem einen oder mehreren Proteinmotiven, die durch
die Ausgangspolynukleotide codiert werden, geänderten Eigenschaften codiert,
wobei
in Schritt (b) mindestens ein Parameter der Reaktion, die zum Aufschluss
der ersten Population an Einzelstrangpolynukleotidmolekülen verwendet wird,
anders als die äquivalenten Parameter
ist, wie sie bei der Reaktion zum Aufschluss der zweiten Population
von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen verwendet werden.
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Somit
stellt die Erfindung ein Verfahren zum Erzeugen einer Polynukleotidsequenzvariante
oder einer Population von Varianten von Einzelstrangpolynukleotidsequenzen
bereit.
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Die
Verwendung von unterschiedlichen Reaktionsparametern, die für die Aufschluss
der ersten und zweiten Population von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen verwendet
werden, stellt den Vorteil von erhöhter Variabilität bei den
Polynukleotidvarianten bereit, die durch das erfindungsgemäße Verfahren erzeugt
werden.
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Vorzugsweise
sind die Polynukleotidmoleküle
von Schritt (a) DNS-Moleküle.
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Mit "entsprechenden Populationen
von Einzelstrangpolynukleotidfragmenten" meinen wir die Population von Fragmenten,
die durch Aufschluss der ersten und zweiten Population von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen mit
einer Exonuklease erzeugt wird.
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Mit "äquivalentem Parameter" meinen wir denselben
Parameter, der bei der Reaktion zum Aufschluss der anderen Population
von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen verwendet wird. Zum Beispiel mag
sich die Exonuklease, die für
den Aufschluss der ersten Population von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen verwendet
wird, von der Exonuklease unterscheiden, die für den Aufschluss der zweiten
Population von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen verwendet wird.
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Mit "Exonuklease" meinen wir ein Polypeptid, z.
B. ein Enzym oder Fragment davon, das exonukleolytische Aktivität aufweist.
Vorzugsweise ist die exonukleolytische Aktivität des Polypeptids größer als die
endonukleolytische Aktivität
des Polypeptids. Mehr bevorzugt weist das Polypeptid eine exonukleolytische
Aktivität
auf, ist aber im Wesentlichen frei von endonukleolytischer Aktivität.
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Vorteilhafterweise
ist der Parameter der Aufschlussreaktion, der sich unterscheidet,
ausgewählt aus
Exonukleasetyp, Exonukleasekonzentration, Reaktionsvolumen, Dauer
der Aufschlussreaktion, Temperatur der Reaktionsmischung, pH-Wert
der Reaktionsmischung, Länge
der Einzelstrangausgangspolynukleotidsequenzen, Menge an Einzelstrangpolynukleotidmolekülen und
Pufferzusammensetzung der Reaktionsmischung.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
des Verfahrens des ersten Aspekts der Erfindung unterscheidet sich
die Exonuklease, die für
den Aufschluss der ersten Population von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen verwendet
wird, von der Exonuklease, die für
den Aufschluss der zweiten Population von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen verwendet wird.
Vorzugsweise ist die Exonuklease, die für den Aufschluss der ersten
Population von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen verwendet wird, eine 3'-Exonuklease (d.
h. eine solche, die vorzugsweise oder exklusiv Nukleotide vom 3'-Terminus von Einzelstrangpolynukleotiden
enffernt), und die Exonuklease, die für den Aufschluss der zweiten
Population von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen verwendet wird, ist eine
5'-Exonuklease (d.
h. eine solche, die vorzugsweise oder exklusiv Nukleotide vom 5'-Terminus von Einzelstrangpolynukleotiden
entfernt).
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In
einer weiteren Ausführungsform
des Verfahrens des ersten Aspekts der Erfindung unterscheidet sich
die Exonukleasekonzentration, die für den Aufschluss der ersten
Population von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen verwendet wird, von der Exonukleasekonzentration,
die für
den Aufschluss der zweiten Population von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen verwendet
wird.
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In
einer weiteren Ausführungsform
des Verfahrens des ersten Aspekts der Erfindung unterscheidet sich
das Reaktionsvolumen, das für
den Aufschluss der ersten Population von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen verwendet
wird, von dem Reaktionsvolumen, das für den Aufschluss der zweiten
Population von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen verwendet wird.
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In
einer weiteren Ausführungsform
des Verfahrens des ersten Aspekts der Erfindung unterscheidet sich
die Dauer der Aufschlussreaktion, die für den Aufschluss der ersten
Population von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen verwendet wird, von der Dauer
der Aufschlussreaktion, die für
den Aufschluss der zweiten Population von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen verwendet
wird.
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In
einer weiteren Ausführungsform
des Verfahrens des ersten Aspekts der Erfindung unterscheidet sich
die Temperatur der Reaktionsmischung, die für den Aufschluss der ersten
Population von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen verwendet wird, von der
Temperatur der Reaktionsmischung, die für den Aufschluss der zweiten
Population von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen verwendet wird.
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In
einer weiteren Ausführungsform
des Verfahrens des ersten Aspekts der Erfindung unterscheidet sich
der pH-Wert der Reaktionsmischung, der für den Aufschluss der ersten
Population von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen verwendet wird, von dem
pH-Wert der Reaktionsmischung, der für den Aufschluss der zweiten
Population von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen verwendet wird.
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In
einer weiteren Ausführungsform
des Verfahrens des ersten Aspekts der Erfindung unterscheidet sich
die Länge
der Polynukleotide in der ersten Population von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen von
der Länge
der Polynukleotide in der zweiten Population von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen.
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In
einer weiteren Ausführungsform
des Verfahrens des ersten Aspekts der Erfindung unterscheidet sich
die Pufferzusammensetzung der Reaktionsmischung, die für den Aufschluss
der ersten Population von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen verwendet
wird, von der Pufferzusammensetzung der Reaktionsmischung, die für den Aufschluss
der zweiten Population von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen verwendet
wird.
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In
einer weiteren Ausführungsform
des Verfahrens des ersten Aspekts der Erfindung unterscheidet sich
die Menge an Einzelstrangpolynukleotidmolekülen in der ersten Population
von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen von der Menge an Einzelstrangpolynukleotidmolekülen in der
zweiten Population von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen.
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In
einer weiteren Ausführungsform
des Verfahrens des ersten Aspekts der Erfindung bildet die erste
Population von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen die Plusstränge der
Ausgangspolynukleotidsequenzen und die zweite Population von Einzelstrangpolynukleotidmolekülen die
Minusstränge
der Ausgangspolynukleotidsequenzen aus.
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In
geeigneter Weise weist Schritt (c) weiterhin das Zugeben von Primersequenzen
auf, die unter Hybridisierungsbedingungen an das 3'- und/oder 5'-Ende mindestens
eines der Ausgangspolynukleotide hybridisieren.
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So
stellt die Erfindung ein Verfahren zum Kombinieren von Polynukleotidfragmenten
zum Erzeugen einer Polynukleotidsequenz oder eine Population von
Sequenzen von gewünschten
Eigenschaften bereit, wobei das Verfahren die Schritte aufweist:
- a) Aufschließen eines linearen Einzelstrangausgangspolynukleotids,
das ein oder mehrere Proteinmotive kodiert, mit einer anderen Nuklease
als DNase I, um eine Population von Einzelstrangfragmenten variierender
Längen
zu erzeugen;
- b) Zusammenbauen einer Polynukleotidsequenz aus den Sequenzen,
die Schritt (a) erhalten werden.
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Vorzugsweise
weist das Verfahren weiterhin den Schritt (c) des Expressivierens
des resultierenden Proteins, das durch die zusammengebaute Polynukleotidsequenz
kodiert wird, und d) des Screenens des Proteins nach gewünschten
Eigenschaften auf.
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Durch
Kontrollieren der Parameter der Exonukleaseaufschlussreaktion kann
die Größe der Polynukleotidfragmente
gesteuert werden. Bestimmen der Länge von Polynukleotidfragmenten
auf diese Weise vermeidet die Notwendigkeit, einen weiteren Schritt
bereitzustellen, wie beispielsweise Aufreinigen der Fragmente gewünschter
Länge von
einem Gel.
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Um
eine Polynukleotidsequenz von gewünschten Eigenschaften zu erzeugen,
können
die Ausgangspolynukleotide, die ein oder mehrere Proteinmotive kodieren,
einer Mutationserzeugung unterworfen werden, um eine Vielzahl von
unterschiedlich mutierten Derivaten davon zu erzeugen. In gleicher
Weise kann ein Ausgangspolynukleotid erhalten werden, das bereits
eine Mehrzahl von Proteinmotiwarianten von unbekannter Sequenz kodiert.
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Zufällige Mutation
kann durch jedes konventionelle Verfahren bewirkt werden, wie es
oben beschrieben wurde, aber ein geeignetes Verfahren ist fehlerbehaftete
(engl.: error-prone) PKR.
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Es
ist bevorzugt, PKR-Technologie zum Zusammenbauen der Einzelstrangpolynukleotidfragmente
zu einer Doppelstrangpolynukleotidsequenz zu verwenden.
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Die
Polynukleotidsequenz ist vorzugsweise DNS, obwohl RNS verwendet
werden kann. Der Einfachheit halber wird der Begriff Polynukleotid
jetzt in dem folgenden Text in Bezug auf DNS verwendet werden, aber
es wird vorausgesetzt, dass die vorliegende Erfindung sowohl auf
RNS als auch auf DNS anwendbar ist.
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Vorzugsweise
kann jegliche Exonuklease, die Polynukleotide von dem 5'-Hauptende zu dem 3'-Hauptende hin, von dem 3'- zu dem 5'-Ende hin oder sowohl
von dem 3'- als
auch dem 5'-Ende
her aufschließt,
verwendet werden. Beispiele für
geeignete Exonukleasen, die gemäß der vorliegenden
Erfindung verwendet werden können,
umfassen BAL 31, Exonuklease I, Exonuklease V, Exonuklease VII, Exonuklease
T7 Gen 6, Bakteriophage lambda-Exonuklease und Exonuklease Rec Jf.
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Die
Verwendung von BAL 31-Nuklease bei dem DNS-Mischprozess der Erfindung
stellt ein schnelles, einfaches und kontrollierbares System bereit.
Dieses Enzym kann alle Größen von
Genfragmenten ergeben, und die Aktivität des Enzyms kann durch Stoppen
des Aufschlusses zu verschiedenen Zeitpunkten einfach gesteuert
werden. BAL 31 ist vornehmlich eine 3'-Hauptnuklease,
die Mononukleotide von beiden 3'-Termini
der beiden Stränge
von linearer DNS entfernt. BAL 31 ist auch eine Endonuklease; somit
wird die Einzelstrang-DNS, die durch die 3'-Hauptexonukleaseaktivität erzeugt
wird, durch die Endonuklease abgebaut. Die 3'-Hauptexonukleaseaktivität des Enzyms
arbeitet ungefähr
20-fach effizienter als die Endonuklease. Die Enzymkonzentrationen
sind deshalb entscheidend für
die erhaltenen DNS-Fragmente.
Eine hohe Enzymkonzentration favorisiert stumpf endende DNS, während bei
niedrigeren Konzentrationen die Einzelstrang-DNS-Termini sehr lang
sein können.
BAL 31 besteht aus zwei kinetisch unterschiedlichen Formen des Enzyms,
einer schnellen (engl.: fast = F) und einer langsamen (engl.: slow
= S) Form. Die S-Form ist ein proteolytisches Abbauprodukt der F-Form.
Weiterhin arbeitet BAL 31 asynchron, wobei eine Population von DNS-Molekülen erzeugt
wird, deren Termini in unterschiedlichen Umfängen beschnitten wurden und
deren Einzelstrangschwänze
in der Länge
variieren. Beide Formen wirken in einer exonukleolylischen Weise
mit hohem Umsatz auch auf Einzelstrang-DNS. Die Richtung des Angriffs
ist von dem 5'-Ende
aus, im Gegensatz zu dem Aufschlussmodus von Duplex-DNS. Es ist
gemutmaßt
worden, dass die Nukleasemoleküle
anfänglich
in nicht produktiver Weise weg von den 5'-Enden gebunden sind und eine erleichterte
Diffusion durchlaufen, um produktive (terminal gebundene) Enzym-Substrat-Komplexe
zu ergeben (Lu T und Gray jr. HB Biochimica et Biophysica Acta 1995,
vol. 1251, p 125-138). Das Enzym verwendet Ca2+ als
Cofaktor, der in Komplexen mit EGTA (Ethylenglykol-bis-(β-Aminehtylether)-N,N,N',N'-Tetraessigsäure) gebunden
werden kann. Lineare DNS-Sequenzen werden mit BAL 31 aufgeschlossen,
und die Reaktion wird durch Zugabe von EGTA zu unterschiedlichen
Zeitpunkten gestoppt.
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Die
einzelnen aufgeschlossenen Fragmente werden gereinigt, gemischt
und mit PKR-Technologie wieder
zusammengebaut. Die zusammengebauten (rekonstruierten) Gene können dann
für das
Expressivieren des Proteins in einen Expressionsvektor kloniert
werden. Das Protein kann dann auf verbesserte Eigenschaften analysiert
werden.
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Das
Verfahren der vorliegenden Erfindung bietet mehrere Vorteile gegenüber bekannten
Misch- (engl.: shuffling-)
Techniken, einschließlich
erhöhter Rekombinationsraten,
erhöhter
Variabilität
und Steuerung der Fragmentgröße.
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Das
Verfahren der vorliegenden Erfindung erzeugt für jeden Zeitpunkt, zu dem eine
DNS-Probe von der BAL 31 Behandlung genommen wird, einen Satz von
progressiv gekürzten
DNS-Fragmenten. Die
DNS-Proben können
gesammelt und zusammengefasst werden, oder optional können einzelne Proben
ausgewählt
und bei dem Verfahren verwendet werden. So erlaubt die vorliegende
Erfindung eine Auswahl der DNS-Proben, die bei dem Rekombinationssystem
zu verwenden sind, und bietet deshalb ein volles Maß an Kontrolle.
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Das
Verfahren der vorliegenden Erfindung kann an jeglichem Polynukleotid
ausgeführt
werden, das ein bestimmtes Produkt kodiert, zum Beispiel irgendein
Protein, das Bindungs- oder katalytische Eigenschaften aufweist,
z. B. Antikörper
oder Teile von Antikörpern,
Enzyme oder Rezeptoren. Weiterhin kann jedes Polynukleotid, das
eine Funktion aufweist, die geändert
werden kann, wie zum Beispiel katalytische RNS, gemäß der vorliegenden
Erfindung gemischt werden. Es ist bevorzugt, dass das Ausgangspolynukleotid,
das ein oder mehrere Proteinmotive kodiert, mindestens 12 Nukleotide
lang ist, mehr bevorzugt mindestens 20 Nukleotide lang, und noch
mehr bevorzugt mehr als 50 Nukleotide lang. Polynukleotide, die
mindestens 100 Nukleotide lang oder selbst mindestens 200 Nukleotide
lang sind, können
verwendet werden. Wo Ausgangspolynukleotide verwendet werden, die
große
Proteine kodieren, wie beispielsweise Enzyme oder Antikörper, können diese
viele hundert oder tausend Basen lang sein. Die vorliegende Erfindung
kann an Ausgangspolynukleotiden jeglicher Größe durchgeführt werden.
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Die
vorliegende Erfindung stellt auch Polynukleotidsequenzen bereit,
die durch das oben beschriebene Verfahren erzeugt wurden und gewünschte Eigenschaften
aufweisen. Diese Sequenzen können
zum Erzeugen von Gentherapievektoren und von replikationsdefekten
Gentherapiekonstrukten oder Impfvektoren für DNS-basierte Impfungen verwendet
werden. Zusätzlich
können
die Polynukleotidsequenzen als Forschungswerkzeuge verwendet werden.
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Die
vorliegende Erfindung stellt auch eine Polynukleotidbibliothek von
Sequenzen bereit, die durch das oben beschriebene Verfahren erzeugt
wurde und aus der ein Polynukleotid ausgewählt werden kann, das ein Protein
mit den gewünschten
Eigenschaften kodiert. Es ist bevorzugt, dass die Polynukleotidbibliothek
eine DNS- oder cDNS-Bibliothek ist.
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Die
vorliegende Erfindung stellt auch Proteine bereit, wie beispielsweise
Enzyme, Antikörper
und Rezeptoren, die andere Eigenschaften aufweisen als diejenigen
des Wildtyps und die durch das oben beschriebene Verfahren hergestellt
wurden. Diese Proteine können
einzeln oder innerhalb eines pharmazeutisch akzeptablen Trägers als
Impfstoffe oder Medikamente zur Therapie verwendet werden, zum Beispiel
als Immunreaktionen erzeugende Mittel, Antigene oder in anderer
Weise beim Erhalten spezifischer Antikörper. Sie können auch als Forschungswerkzeuge
verwendet werden.
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Die
gewünschten
Eigenschaften eines Polynukleotids, das durch die vorliegende Erfindung
erzeugt wurde, oder eines Proteins, das durch ein Polynukleotid
kodiert wird, das durch die vorliegende Erfindung erzeugt wurde,
kann jegliche Variation oder Änderung
bei der normalen Aktivität
des (Ausgangs-)Polynukleotids vom Wildtyp oder des von ihm kodierten
Polypeptids, Proteins oder Proteinmotivs sein. Zum Beispiel kann
es wünschenswert
sein, die katalytische Aktivität
eines Enzyms zu reduzieren oder zu erhöhen oder die Bindungsspezifizität eines Antikörpers zu
verbessern oder zu reduzieren. Weiterhin mag es, falls das Protein
oder Polynukleotid ein Immunreaktionen erzeugendes Mittel ist, wünschenswert
sein, seine Fähigkeit,
spezifische Antikörper
gegen es zu erhalten, zu reduzieren oder zu erhöhen.
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Das
Ausgangspolynukleotid kodiert vorzugsweise ein oder mehrere Proteinmotive.
Diese sind als Regionen oder Elemente der Polynukleotidsequenz definiert,
die eine Polypeptid-(d. h. Aminosäure-)Sequenz kodieren, welche
charakteristische Proteinfunktion aufweist oder potentiell aufweist.
Zum Beispiel kann ein Proteinmotiv einen Bereich eines ganzen Proteins
definieren, wie beispielsweise ein Epitop, einen Spaltungsplatz
oder einen katalytischen Platz usw. Innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung
muss ein expressiviertes Proteinmotiv jedoch keine Aktivität zeigen
oder "korrekt" gefaltet sein.
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Verschiedene
recherchierbare Datenbanken von Proteinmotiven und potentiellen
Proteinmotiven sind verfügbar,
wie beispielsweise MOTIF, PROSITE, SMART und BLOCKS (www.blocks.fhcrc.org).
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Es
mag wünschenswert
sein, ein Protein zu modifizieren, um so die Konformation bestimmter Epitope
zu ändern
und dadurch seine Antigenizität
zu verbessern und/oder seine Kreuzreaktivität zu reduzieren. Zum Beispiel
kann die Modifikation, sollte solch ein Protein als Antigen verwendet
werden, jegliche Kreuzreaktion der gezogenen Antikörper mit ähnlichen
Proteinen reduzieren.
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Obwohl
der Begriff "Enzym" verwendet wird, ist
dieser so zu interpretieren, dass er auch jegliches Polypeptid einschließt, das
enzymartige Aktivität,
d. h. eine katalytische Funktion, aufweist. Zum Beispiel können Polypeptide,
die Teil eines Enzyms sind, immer noch katalytische Funktion besitzen.
Weiterhin sind Proteine, wie beispielsweise Interferone und Cytokine,
eingeschlossen. In gleicher Weise sollte der Begriff "Antikörper" so ausgelegt werden,
dass er jegliche bindende Substanz abdeckt, die eine bindende Domäne mit der
erforderlichen Spezifizität
aufweist. Dies umfasst Antikörperfragmente,
Derivate, funktionale Äquivalente
und Homologe von Antikörper,
einschließlich
synthetischer Moleküle
und Moleküle,
deren Form diejenige eines Antikörpers
nachbildet, was sie in die Lage versetzt, an ein Antigen oder Epitop
zu binden. Beispiele für
Antikörperfragmente,
die in der Lage sind, ein Antigen oder einen anderen Bindungspartner
zu binden, sind das Fab-Fragment, das aus den VL-, VH-, C1- und
CH1-Domänen
besteht, das Fd-Fragment, das aus den VH- und CH1-Domänen besteht;
das Fv-Fragment, das aus den VL- und VH-Domänen eines einzelnen Arms eines
Antikörpers
besteht; das dAb-Fragment, das aus einer VH-Domäne besteht; isolierte DCR-Regionen
und F(ab')2-Fragmente,
ein bivalentes Fragment, das zwei durch eine Disulphidbrücke in der Übergangsregion
verbundene Fab-Fragmente umfasst. Einzelketten-Fv-Fragmente sind
ebenfalls eingeschlossen.
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Um
Expression der erzeugten Polynukleotidsequenz zu erhalten, kann
die Sequenz in einen Vektor eingebaut werden, der Kontrollsequenzen
aufweist, welche funktional mit der Polynukleotidsequenz verbunden
sind, um ihre Expression zu steuern. Die Vektoren können andere
Sequenzen, wie beispielsweise Promotoren und Verstärker, um
die Expression der eingesetzten Polynukleotidsequenz anzutreiben,
weitere Polynukleotidsequenzen, so dass das durch das Polynukleotid
kodierte Protein als Fusion produziert wird, und/oder Nukleinsäure umfassen,
die Sekretionssignale kodiert, so dass das Protein, das in der Wirtszelle
produziert wird, aus der Zelle sekretiert wird. Das durch die Polynukleotidsequenz
kodierte Protein kann dann durch Transformieren des Vektors in Wirtszellen,
in denen der Vektor funktional ist, Kultivieren der Wirtszellen,
so dass das Protein produziert wird, und Bergen des Proteins von den
Wirtszellen oder dem umgebenden Medium erhalten werden. Prokaryotische
und eukaryotische Zellen werden zu diesem Zweck im Stand der Technik
verwendet, einschließlich
Stämmen
von E. coli, Hefe und eukaryotischen Zellen, wie beispielsweise COS-
oder CHO-Zellen.
Die Wahl der Wirtszelle kann verwendet werden, um die Eigenschaften
des diesen Zellen expressivierten Proteins zu steuern, um z. B. zu
steuern, wo das Protein in den Wirtzellen abgelagert wird, oder
um Eigenschaften wie beispielsweise seine Glykosylierung zu beeinflussen.
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Das
Protein, das durch die Polynukleotidsequenz kodiert wird, kann durch
im Stand der Technik wohlbekannte Verfahren expressiviert werden.
Geeigneter Weise kann die Expression durch Ziehen einer Wirtszelle
in Kultur, die solch einen Vektor enthält, unter geeigneten Bedingungen
erreicht werden, die die Expression des Proteins verursachen oder
erlauben.
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Systeme
zum Klonieren und zur Expression eines Proteins in einer Vielzahl
von unterschiedlichen Wirtszellen sind gut bekannt. Geeignete Wirtszellen umfassen
Bakterien, eukaryotische Zellen, wie beispielsweise Säugetierzellen
und Hefe, und Baculovirussysteme. Auch die Verwendung des Retrovirussystems
zum Klonieren und zur Expression ist eine gute Alternative, da dieser
Virus zusammen mit einer Anzahl von Zelltypen verwendet werden kann.
Säugetierzelllinien,
die im Stand der Technik zur Expression eines heterologen Polypeptids
verfügbar
sind, umfassen Eierstockzellen des Chinesischen Hamsters, HeLa-Zellen,
Babyhamsternierenzellen, COS-Zellen und viele andere. Ein üblicher
bevorzugter bakterieller Wirt ist E. coli.
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Geeignete
Vektoren können
ausgewählt oder
konstruiert werden, wobei sie nach Bedarf passende regulative Sequenzen,
einschließlich
Promotorsequenzen, Terminatorfragmente, Polyadenylierungssequenzen,
Verstärkersequenzen,
Markergene und andere Sequenzen enthalten. Vektoren können Plasmid-,
Virus-, z. B. Phagen-, oder Phagemidvektoren sein, so wie es passt.
Für weitere
Detalls siehe zum Beispiel Molecular Cloning: a Laboratory Manual:
3. Auflage, Sambrook und Russell, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory
Press. Viele bekannte Techniken und Protokolle zur Manipulation
von Polynukleotidsequenzen, zum Beispiel bei der Präparation
von Polynukleotidkonstrukten, Mutationserzeugung, Sequenzieren,
Einführen
von DNS in Zellen und Genexpression, und Analyse von Proteinen sind detallliert
in Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., Hrgs.,
John Wiley & Sons,
1992 beschrieben.
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Das
System kann für
die Erzeugung von DNS-Bibliotheken verwendet werden, die variable Sequenzen
aufweisen und die nach gewünschter Proteinfunktion
auf eine Vielzahl von Wegen gescreent werden können. Nach Enzymfunktion kann mit
Verfahren gescreent werden, die spezifisch für die konkrete Enzymfunktion
sind, z. B. CMCase-Aktivität, β-Glucosidaseaktivität und auch
thermische Stabilität.
Weiterhin können
Phagen-Display und Zelloberflächen-Display
zum Screenen nach Enzymfunktion verwendet werden (Crameri A. et
al., Nature 1998 15; 391 (6664):288-291; Zhang J. H. et al., PNAS.
USA 1997 94 (9): 4504-4509; Warren M. S. et al., Biochemistry 1996,
9; 35 (27): 8855-8862; Kim et al., Appl Environ Microbiol 66: 788-93,
2000) sowie nach geänderten
Bindungseigenschaften von z. B. Antikörpern (Griffith et al., EMBO
J. 113: 3245-3260, 1994).
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Ein
Protein, das durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt wird,
kann beim Screenen nach Molekülen
verwendet werden, die seine Aktivität oder Funktion beeinflussen
oder modulieren. Solche Moleküle
können
in einem therapeutischen (möglicherweise
einschließlich
prophylaktischen) Kontext nützlich
sein.
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Die
vorliegende Erfindung stellt auch Vektoren bereit, die Polynukleotidsequenzen
aufweisen, die durch das oben beschriebene Verfahren erzeugt wurden.
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Die
vorliegende Erfindung stellt auch Zusammensetzungen bereit, die
entweder Polynukleotidsequenzen, Vektoren, die die Polynukleotidsequenzen aufweisen,
oder Proteine, die durch das oben beschriebene Verfahren erzeugt
wurden und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger oder einen für Forschungszwecke
akzeptablen Träger
aufweisen.
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Die
vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren bereit, das
nach der Identifikation des Polynukleotids oder Polypeptids, das
gewünschte
Eigenschaften aufweist, durch das oben beschriebene Verfahren die
Herstellung des Polypeptids oder Polynukleotids als Ganzes oder
in Teilen optional in Verbindung mit zusätzlichen Polypeptiden oder
Polynukleotiden aufweist.
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Somit
stellt ein weiterer Aspekt der Erfindung ein Verfahren zum Herstellen
eines Polypeptids mit gewünschten
Eigenschaften bereit, wobei das Verfahren die folgenden Schritte
aufweist:
- (a) Erzeugung von Formvarianten eines
Ausgangspolynukleotids unter Verwendung eines Verfahrens gemäß dem ersten
Aspekt der Erfindung;
- (b) Expressivieren der Polynukleotidvariante, das in Schritt
(a) erzeugt wurde, um Polypeptidvarianten zu erzeugen;
- (c) Screenen der Polypeptidvarianten nach gewünschten
Eigenschaften; und
- (d) Selektieren eines Polypeptids mit gewünschten Eigenschaften aus den
Polypeptidvarianten.
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Die
Erfindung stellt weiterhin ein Polypeptid bereit, das durch das
obige Verfahren erhalten wurde.
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Nach
der Identifikation eines Polynukleotids oder Polypeptids mit gewünschten
Eigenschaften können
diese dann durch wohlbekannte Techniken, wie beispielsweise PKR,
Klonieren und Expression innerhalb einer Wirtszelle, hergestellt
werden, um größere Zahlen
bereitzustellen.
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Die
resultierenden Polypeptide und Polynukleotide können bei der Erzeugung von
industriellen Enzymen verwendet werden, z. B. von Waschmittelenzymen,
wobei eine erhöhte
Aktivität
bei tieferen Temperaturen bevorzugt ist. Alternativ können die hergestellten
Polynukleotide oder Polypeptide als Forschungswerkzeug verwendet
werden, d. h. Antikörper
können
in Immuntests verwendet werden und Polypeptide können als Hybridisierungssonden
oder -primer verwendet werden. Alternativ können die resultierenden Polypeptide
oder Polynukleotide bei der Erzeugung von Medikamenten zu diagnostischen Zwecken,
zu pharmazeutischen Zwecken, zur Therapie usw. verwendet werden,
wie im Folgenden diskutiert wird.
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Die
Polypeptide oder Polynukleotide, die durch die Verfahren der Erfindung
erzeugt und als wünschenswerte
Eigenschaften aufweisend identifiziert wurden, können in pharmazeutische Zusammensetzungen
formuliert werden. Diese Zusammensetzungen können zusätzlich zu einer der obigen Substanzen
ein pharmazeutisch akzeptables Streckungsmittel, einen pharmazeutisch
akzeptablen Träger,
Pufferstabilisator oder andere Materialen aufweisen, die dem Fachmann
gut bekannt sind. Solche Materialien sollten nicht toxisch sein
und sollten nicht die Wirksamkeit des aktiven Inhaltsstoffs stören. Die präzise Natur
des Trägers
oder der anderen Materialien kann von der Verabreichungsroute abhängen, z. B.
der oralen, intravenösen,
kutanen oder subkutanen, nasalen, intramuskulären, intraperitonealen Route.
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Pharmazeutische
Zusammensetzungen für die
orale Verabreichung können
in Tabletten-, Kapsel-, Pulver oder flüssiger Form vorliegen. Eine
Tablette kann einen festen Träger aufweisen,
wie beispielsweise Gelatine, oder einen Hilfsstoff. Flüssige pharmazeutische
Zusammensetzungen umfassen allgemein einen flüssigen Träger, wie beispielsweise Wasser,
Petroleum, tierische oder pflanzliche Öle, Mineralöl oder synthetische Öle. Physiologische Salzlösung, Dextrose
oder andere Saccharidlösungen
oder Glykole, wie beispielsweise Äthylenglykol, Propylenglykol
oder Polyäthylenglykol
können
eingeschlossen sein.
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Für die intravenöse, kutane
oder subkutane Injektion oder Injektion am Behandlungsort wird der aktive
Inhaltsstoff die Form einer parenteral akzeptablen wässrigen
Lösung
haben, die keimfrei ist und einen geeigneten pH-Wert, geeignete
Isotonizität und
geeignete Stabilität
aufweist. Die Fachleute sind gut in der Lage, unter Verwendung von
zum Beispiel isotonischen Vehikeln, wie beispielsweise Natriumchloridinjektionslösung, Ringer-Injektionslösung, laktierter
Ringer-Injektionslösung, geeignete
Lösungen zu
präparieren.
Konservierungsmittel, Stabilisatoren, Puffer, Antioxidantien und/oder
andere Additive können
eingeschlossen werden, wie dies erforderlich ist.
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So
stellt die Erfindung weiterhin ein Polypeptid, das durch die Verfahren
der Erfindung hergestellt wurde, zur Verwendung in der Medizin und
die Verwendung eines Polypeptids, das durch die Verfahren der Erfindung
hergestellt wurde, bei der Zubereitung eines Medikaments zur Verwendung
bei der Behandlung, Therapie und/oder Diagnose einer Krankheit bereit.
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Ob
es sich um ein Polypeptid, z. B. einen Antikörper oder ein Fragment davon,
ein Enzym, ein Polynukleotid oder ein Nukleinsäuremolekül handelt, das nach Erzeugung
durch die vorliegende Erfindung identifiziert wurde und das an ein
Individuum verabreicht wird, die Verabreichung erfolgt vorzugsweise
in einer "prophylaktisch
wirksamen Menge" oder
einer "therapeutisch
wirksamen Menge" (je
nach Fall, obwohl Prophylaxe als Therapie angesehen werden kann),
wobei diese ausreichend ist, um für das Individuum Nutzen zu
zeigen. Die tatsächlich
verabreichte Menge und die Rate und der Zeitverlauf der Verabreichung
werden von der Natur und der Ernsthaftigkeit dessen abhängen, was
behandelt wird. Verschreibung der Behandlung, z. B. Entscheidungen
bezüglich
der Dosierung usw., liegt innerhalb der Verantwortung des Allgemeinmediziners
und anderer Mediziner und berücksichtigt
typischerweise die zu behandelnde Störung, den Zustand des einzelnen
Patienten, den Austragungsort, das Verfahren der Verabreichung und
andere Faktoren, die dem praktischen Arzt bekannt sind. Beispiel
für die
Techniken und Protokolle, die oben erwähnt sind, können gefunden werden in Remington's Pharmaceutical
Sciences, 16. Auflage, Osol, A. (Hrsg.), 1980.
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Alternativ
können
zielgerichtete (engl.: targeting) Therapien verwendet werden, um
das aktive Agens durch die Verwendung von zielrichtenden Systemen,
wie beispielsweise von Antikörpern
oder zellspezifischen Liganden, spezifischer an bestimmte Zelltypen
auszutragen. Zielrichten kann aus einer Vielzahl von Gründen wünschenswert
sein; zum Beispiel falls das Mittel unakzeptabel toxisch ist oder falls
es anderenfalls eine zu hohe Dosierung erfordern würde oder
falls es anderenfalls nicht in der Lage wäre, in die Zielzellen einzutreten.
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Anstatt
diese Agenzien direkt zu verabreichen, könnten sie in den Zielzellen
durch Expression von einem kodierenden Gen produziert werden, das in
die Zellen eingeführt
wird, z. B. in einem Virusvektor (eine Variante der VDEPT-Technik,
d. h. das aktivierende Agens, z. B. ein Enzym, wird in einem Vektor
durch Expression von kodierender DNS in einem Virusvektor produziert).
Der Vektor könnte
auf die spezifischen Zellen, die zu behandeln sind, zielgerichtet
werden, oder er könnte
regulative Elemente enthalten, die mehr oder weniger selektiv durch
die Zielzellen eingeschaltet werden.
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Alternativ
könnte
das Agens in einer Vorform verabreicht werden zur Umwandlung in
die aktive Form durch ein aktivierendes Agens, das in den zu behandelnden
Zellen produziert oder auf diese zielgerichtet wird. Diese Art von
Ansatz ist manchmal bekannt als ADEPT oder VDEPT; wobei der Erste
das Zielrichten des aktivierenden Agens auf die Zellen durch Konjugation
zu einem zellspezifischen Antikörper
einbezieht, während
der Letztere das Produzieren des aktivierenden Agens, z. B. eines
Enzyms, in einem Vektor durch Expression von kodierender DNS in
einem Virusvektor einbezieht (siehe zum Beispiel EP-A-415731 und
WO 90/07936).
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Eine
Zusammensetzung kann allein oder in Kombination mit anderen Behandlungen
verabreicht werden, entweder simultan oder sequenziell, abhängig von
dem zu behandelnden Zustand.
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Als
eine weitere Alternative könnte
das Polynukleotid, das nach der Erzeugung durch das Verfahren der
vorliegenden Erfindung als wünschenswerte Eigenschaften
aufweisend identifiziert wurde, in einem Gentherapieverfahren verwendet
werden, um einen Patienten zu behandeln, der unfähig ist, das aktive Polypeptid
zu synthetisieren, das durch das Polynukleotid kodiert wird, oder
der unfähig
ist, es auf dem normalen Niveau zu synthetisieren, wodurch der Effekt
bereitgestellt wird, der durch das entsprechende Wildtypprotein
bereitgestellt wird.
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Vektoren,
wie beispielsweise Virusvektoren, sind im Stand der Technik verwendet
worden, um Polynukleotide in eine große Vielfalt von unterschiedlichen
Zielzellen einzuführen.
Typischerweise werden die Vektoren den Zielzellen angeboten, so
dass bei einem ausreichenden Anteil der Zellen eine Transfektion
erfolgen kann, um einen nützlichen
therapeutischen oder prophylaktischen Effekt durch die Expression
des gewünschten
Polypeptids bereitzustellen. Die transfizierte Nukleinsäure kann
permanent in das Genom jeder der angezielten Tumorzellen eingebaut
werden, was einen lang andauernden Effekt bereitstellt, oder alternativ
kann die Behandlung periodisch zu wiederholen sein.
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Eine
Vielzahl von Vektoren, sowohl Virusvektoren als auch Plasmidvektoren,
sind im Stand der Technik bekannt, siehe US-Patent Nr. 5,252,479
und WO 93/07282. Insbesondere ist eine Anzahl von Viren als Gentransfervektoren
verwendet worden, einschließlich
Papovaviren, wie beispielsweise SV40, Vacciniavirus, Herpesvirus,
einschließlich
HSV und EBV, und Retroviren. Viele Gentherapieprotokolle im Stand
der Technik haben inaktivierte murine Retroviren verwendet.
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Als
eine Alternative zu der Verwendung von Virusvektoren umfassen andere
bekannte Verfahren zum Einführen
von Nukleinsäuren
in Zellen Elektroporation, Kalziumphosphatcopräzipitation, mechanische Techniken,
wie beispielsweise Mikroinjektion, durch Liposome und direkte DNS-Aufnahme
vermittelten Transfer und Rezeptor-vermittelten DNS-Transfer.
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Wie
oben erwähnt
ist, ist das Ziel von Gentherapie, die Nukleinsäure verwendet, welche ein Polypeptid
oder einen aktiven Bereich davon kodiert, die Menge an Expressionsprodukt
der Nukleinsäure
in Zellen zu erhöhen,
in denen das Niveau des Wildtyppolypeptids fehlt oder nur auf reduzierten
Niveaus vorliegt. Solche Behandlung kann therapeutisch bei der Behandlung
von Zellen sein, die bereits krebsartig sind, oder prophylaktisch
bei der Behandlung von Individuen, die durch Screenen dahingehend
bekannt sind, dass sie Suszeptibilitätsallele und entsprechend eine
Prädisposition
für zum
Beispiel Krebs aufweisen.
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Die
vorliegende Erfindung stellt auch ein Kit zum Erzeugen einer Polynukleotidsequenz
oder einer Population von Sequenzen mit gewünschten Eigenschaften bereit,
das Reagenzien für
Einzeltrang-DNS-Zubereitung, eine Exonulease und Komponenten für das Durchführen einer
PKR-Technik, zum Beispiel thermostabile DNS (Nukleotide) und eine
Stoppeinrichtung, zum Beispiel EGTA, aufweist.
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Wie
oben dargelegt wurde, sorgt die vorliegende Erfindung in geeigneter
Weise für
die Erzeugung von mutierten Enzymgensequenzen und deren zufällige Kombination
zu funktionalen Enzymen mit gewünschten
Eigenschaften. Als Beispiel dieses Aspekts der Erfindung werden
die Enzymgene durch fehlerbehaftete PKR mutiert, die in eine Mutationsrate
von ungefähr
0,7% resultiert. Der resultierende Pool von mutierten Enzymgenen
wird dann mit einer Exonuklease aufgeschlossen, z. B. BAL31, und
die Reaktion wird durch die Zugabe von EGTA oder durch Wärmeaktivierung
zu unterschiedlichen Zeitpunkten inhibiert, was in einen Satz von
DNS-Fragmenten von unterschiedlicher Größe resultiert. Diese können dann
einem PKR-basierten Wiederzusammenbau unterworfen werden, wie oben
beschrieben wurde. Die resultierenden wieder zusammengebauten DNS-Fragmente
werden dann kloniert, und eine Genbibliothek wird konstruiert. Aus
dieser Bibliothek können
dann Klone selektiert und sequenziert werden.
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Eine
weitere Anwendung dieser Technologie ist die Erzeugung einer Population
von variablen DNS-Sequenzen, die für weitere Selektionen und Analysen
verwendet werden können.
Neben der Kodierung größerer Proteine,
z. B. von Antikörperfragmenten
und Enzymen, kann die DNS Peptide kodieren, bei denen die funktionalen
Moleküleigenschaften
für die
Entwicklung verschiedener Selektionssysteme verwendet werden können. Die
Selektion von rekombinierten DNS-Sequenzen, die Peptide kodieren,
ist zuvor beschrieben worden (Fisch et al., PNAS. USA 1996 Jul 23;
93 (15): 7761-7766). Zusätzlich
kann die variable DNS-Population verwendet werden, um eine Population
von RNS-Molekülen
mit z. B. katalytischen Aktivitäten
herzustellen. Valsh et al., (PNAS. USA 1998 Mar 3; 95 (5): 2158-2162)
demonstrierten die Konstruktion eines funktionalen Systems für die Selektion
von katalytischer RNS, und Eckstein F (Ciba Found. Symp. 1997; 209;
207-212) hat die Anwendungen von katalytischer RNS durch die spezifische
Einführung
von katalytischer RNS in Zellen dargelegt. Das System kann verwendet
werden, um den Sequenzraum bei der Selektion von funktionalen Peptiden/Molekülen mit
katalytischen Aktivitäten
basierend auf rekombinierten DNS-Sequenzen weiter zu durchsuchen.
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Aspekte
und Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung werden jetzt beispielhaft unter Bezugnahme
auf die beigefügten
Figuren illustriert werden. Weitere Aspekte und Ausführungsformen
werden dem Fachmann ersichtlich sein.
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1 zeigt
das Prinzip des Verfahrens von einem Vorlagemolekül zu einem
verbesserten Molekül.
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2 zeigt
die prinzipiellen Schritte bei der Präparation von Einzelstrang-DNS
unter Verwendung von Biotin.
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3 zeigt
die prinzipiellen Schritte bei der Präparation von Einzelstrang-DNS
unter Verwendung von Phage.
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4 zeigt
die prinzipiellen Schritte beim Erzeugen von Einzelstrang-DNS-Fragmenten
unter Verwendung von Exonukleasebehandlung.
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5 zeigt
die prinzipiellen Schritte für
den Zusammenbau von Einzelstrang-DNS-Fragmenten unter Verwendung
von PKR.
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6 zeigt
den Prozentsatz von Rekombinanten mit einer Überkreuzung, die nach Aufschluss von
Doppelstrang-DNS mit 20 U/ml BAL31 für unterschiedliche Zeiträume ausgebildet
wurden.
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7 zeigt
den Prozentsatz von Rekombinanten mit zwei Überkreuzungen, die nach Aufschluss
von Doppelstrang-DNS mit 20 U/ml BAL31 für verschiedene Zeiträume ausgebildet
wurden.
-
8 zeigt
den Prozentsatz von Rekombinanten mit einer Überkreuzung, die nach Aufschluss von
Einzelstrang-DNS mit 1,25 U/ml BAL31 für verschiedene Zeiträume ausgebildet
wurden.
-
9 zeigt
den Prozentsatz von Rekombinanten mit zwei Überkreuzungen, die nach Aufschluss
von Einzelstrang-DNS mit 1,25 U/ml BAL31 für variierende Zeiträume ausgebildet
wurden.
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10 zeigt
den Prozentsatz von Rekombinanten mit einer Überkreuzung, die nach Aufschluss von
Einzelstrang-DNS mit 11 U/ml BAL31 für variierende Zeiträume ausgebildet
wurden.
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11 zeigt
den Prozentsatz von Rekombinanten mit zwei Überkreuzungen, die nach Aufschluss
von Einzelstrang-DNS mit 11 U/ml BAL31 für variierende Zeiträume ausgebildet
wurden.
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12 zeigt
ein Agaroseelektrophoresegelbild von Fragmenten, die nach Aufschluss
von 300 ng Einzelstrang-DNS mit BAL31 für 50 Minuten (Spur 1), 30 Minuten
(Spur 2) und 10 Minuten (Spur 3) erzeugt wurden. Unbehandelte Einzelstrang-DNS
ist in Spur 4 gezeigt. Molekulargewichtsmarker sind in Spur 5 gezeigt.
-
13 zeigt
die entsprechenden Gelchromatogramme für Spur 4 in 12.
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14 zeigt
die entsprechenden Gelchromatogramme für Spur 3 in 12.
-
15 zeigt
die entsprechenden Gelchromatogramme für Spur 2 in 12.
-
16 zeigt
ein Agaroseelektrophoresegelbild von Fragmenten, die nach Aufschluss
von 300 ng DNS mit Exonuklease VII für 10 Minuten (Spur 3), 20 Minuten
(Spur 4) und 30 Minuten (Spur 5) erzeugt wurden. Unbehandelte Einzelstrang-DNS
ist in Spur 2 gezeigt. Molekulargewichtsmarker sind in Spur 1 gezeigt.
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17 zeigt
ein Agaroseelektrophoresegelbild von Fragmenten, die nach Aufschluss
von 300 ng DNS mit Exonuklease Rec Jf (9
U/mg Einzelstrang-DNS) für
10 Minuten (Spur 2), 20 Minuten (Spur 3) und 30 Minuten (Spur 4)
erzeugt wurden. Unbehandelte Einzelstrang-DNS ist in Spur 1 gezeigt.
Molekulargewichtsmarker sind in Spur 5 gezeigt.
-
18 zeigt
ein Agaroseelektrophoresegelbild von Fragmenten, die nach Aufschluss
von 300 ng DNS mit Exonuklease Rec Jf (36
U/mg Einzelstrang-DNS) für
10 Minuten (Spur 3), 20 Minuten (Spur 4) und 30 Minuten (Spur 5)
erzeugt wurden. Unbehandelte Einzelstrang-DNS ist in Spur 2 gezeigt.
Molekulargewichtsmarker sind in den Spuren 1 und 6 gezeigt.
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19 zeigt
ein Agaroseelektrophoresegelbild von Fragmenten, die nach Aufschluss
von 300 ng DNS mit DNase I (0,15 U Enzym/mg DNS) erzeugt wurden.
Die Proben in den Spuren waren wie folgt:
- Spur 1: Molekulargewichtsmarker
- Spur 2: Unbehandelte Einzelstrang-DNS in Mg-Puffer
- Spur 3: Einzelstrang-DNS mit DNase I fragmentiert in Mg-Puffer
- Spur 4: Unbehandelte Einzelstrang-DNS in Mn-Puffer
- Spur 5: Einzelstrang-DNS mit DNase I fragmentiert in Mn-Puffer
- Spur 6: (leer)
- Spur 7: (leer)
-
20 zeigt
ein Agaroseelektrophoresegelbild von Fragmenten, die nach Aufschluss
von 300 ng DNS mit DNase I erzeugt wurden. Die Proben in den Spuren
waren wie folgt:
- Spur 1: Molekulargewichtsmarker
- Spur 2: Unbehandelte Doppelstrang-DNS in Mg-Puffer
- Spur 3: Unbehandelte Doppelstrang-DNS in Mg-Puffer
- Spur 4: Unbehandelte Einzelstrang-DNS (Vorwärtsstrang) in Mg-Puffer
- Spur 5: Unbehandelte Einzelstrang-DNS (Vorwärtsstrang) in Mg-Puffer
- Spur 6: Unbehandelte Einzelstrang-DNS (Rückwärtsstrang) in Mg-Puffer
- Spur 7: Unbehandelte Einzelstrang-DNS (Rückwärtsstrang) in Mg-Puffer
- Spur 8: Doppelstrang-DNS mit DNase I (0,24 U Enzym/μg DNS) fragmentiert
in Mg-Puffer
- Spur 9: Doppelstrang-DNS mit DNase I (1,3 U Enzym/μg DNS) fragmentiert
in Mg-Puffer
- Spur 10: Einzelstrang-DNS (Vorwärtsstrang) mit DNase I (0,24
U Enzym/μg
DNS) fragmentiert in Mg-Puffer
- Spur 11: Einzelstrang-DNS (Vorwärtsstrang) mit DNase I (1,3
U Enzym/μg
DNS) fragmentiert in Mg-Puffer
- Spur 12: Einzelstrang-DNS (Rückwärtsstrang)
mit DNase I (0,24 U Enzym/μg
DNS) fragmentiert in Mg-Puffer
- Spur 13: Einzelstrang-DNS (Rückwärtsstrang)
mit DNase I (1,3 U Enzym/μg
DNS) fragmentiert in Mg-Puffer
-
21 zeigt
die entsprechenden Gelchromatogramme für Spur 6 in 20.
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22 zeigt
die entsprechenden Gelchromatogramme für Spur 12 in 20.
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23 zeigt
die entsprechenden Gelchromatogramme für Spur 13 in 20.
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24 zeigt
ein Agaroseelektrophoresegelbild von Fragmenten, die nach Aufschluss
von 300 ng DNS mit Mungobohnennuklease erzeugt wurden. Die Proben
in den Spuren waren wie folgt:
- Spur 1: Unbehandelte Einzelstrang-DNS
in Mg-Puffer
- Spur 2: Einzelstrang-DNS mit Mungobohnennuklease für 10 Minuten
fragmentiert
- Spur 3: Molekulargewichtsmarker
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25 zeigt
den Effekt der Dauer der Fragmentierung auf die Rekombinationsfrequenz
von tet-Beständigkeitsgenen
nach Fragmentierung von Einzelstrang-DNS mit (a) BAL 31, (b) ExoI,
(c) T7 gene6 und (d) Exo V kombiniert mit ExoI.
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26 zeigt den Prozentsatz von mehrfachen Überkreuzungen,
die nach Behandlung mit unterschiedlichen Nukleasen erzeugt wurden.
Die Rekombinationsfrequenz wurde ausgewertet für a) ExoI-behandelte Einzelstrang-DNS,
b) ExoI (10 min)-behandelte Einzelstrang-DNS kombiniert mit ExoVII-behandelter
DNS, c) ExoI (10 min)-behandelte Einzelstrang-DNS kombiniert mit
ExoV-behandelter Einzelstrang-DNS und d) ExoI (10 min)-behandelte
Einzelstrang-DNS kombiniert mit ExoV- und ExoVII-behandelter Einzelstrang-DNS.
-
27 zeigt
einen Vergleich der Anzahl von Rekombinationen, die nach Fragmentierung
von Einzelstrang-DNS mit einer Exonuklease und Fragmentierung von
Doppelstrang-DNS mit einer Endonuklease beobachtet werden.
-
BEISPIELE
-
Die
DNS-Mischprozedur kann durch die in den 1 bis 5 gezeigten
Schritte illustriert werden. Das Gen, das das Protein von Interesse
(X) in dem Plasmid pFab7chis kodiert, wird in diesem Beispiel verwendet.
Zufällige
Mutationen werden durch fehlerbehaftete PKR eingeführt. Einzelstrang-DNS wird
präpariert.
Dies kann durchgeführt
werden entweder durch biotinylierte Primer oder durch die Verwendung
von Phage, die in der Lage ist, Einzelstrang-DNS zu packen, wie
oben diskutiert wurde. Die kodierenden und die nichtkodierenden
Einzelstrang-DNS-Stränge werden
in unterschiedlichen Reaktionen (A und B) präpariert. Die Einzelstrang-DNS-Stränge von
beiden Reaktionen werden separater enzymatischer Behandlung unter
Verwendung von z. B. BAL 31 unterworfen. Durch Mischen der zwei
Poole von Einzelstrang-DNS-Fragmenten
in equimolaren Mengen kann das Gen in einer gemischten (engl.: shuffled)
Weise und in vielen Versionen durch die Anwendung von zwei aufeinander
folgenden PKR-Reaktionen
wieder zusammengebaut werden, wobei die erste Reaktion keine Primer
enthält.
-
Nach
Klonieren dieser Bibliothek von wieder zusammengebauten Genen in
pY können
Selektionen durchgeführt
werden, um die interessierenden verbesserten Moleküle zu erhalten.
-
Eine
detallliertere Beschreibung der Beispiele der vorliegenden Erfindung
wird unten gegeben.
-
Beispiel 1
-
Reagenzien
-
AmpliTag®-Polymerase
wurde von Perkin-Elmer Corp., dNTP von Boehringer Mannheim Biochemica
(Mannheim, Deutschland) und BAL31-Nuklease von New England Biolabs
Inc. (Beverly, USA) gekauft. Alle Restriktionsenzyme wurden von
New England Biolabs Inc. (Beverly, USA) gekauft. Ethidiumbromid
wurde von Bio-Rad Laboratories (Bio-Rad Laboratories, Hercules,
CA, USA) gekauft. T4-DNS-Ligase wurde von New England Biolabs Inc.
(Beverly, USA) gekauft. EDTA und EGTA wurden von Kebo Lab (Schweden)
gekauft.
-
Alle
Primer wurden im Labor konstruiert und von Life Technologies (Täby, Schweden)
und SGS-DANN (Köping,
Schweden) erhalten.
-
PKR
-
Alle
Polymerasekettenreaktionen (PKR) wurden in einem automatischen Thermocycler
(Perkin-Elmer Cetus
480, Norwalk, CT, USA) durchgeführt.
PKR-Techniken für
die Vervielfältigung
von Nukleinsäure
sind in dem US-Patent Nr. 4,683,195 beschrieben. Quellen zur grundsätzlichen
Verwendung von PKR-Techniken umfassen Mullis et al., Cold Spring
Harbor Symp. Quant. Biol., 51: 263, (1987), Ehrlich (Hrsg.), PCR
technology, Stockton Press, NY, 1989, Ehrlich et al., Science, 252:
1643-1650, (1991), "PCR
protocols; A Guide to Methods and Applications", Hrsg. Innis et al., Academic Press,
New York, (1990).
-
Sequenzieren
-
Alle
Konstrukte sind durch die Verwendung eines BigDye Terminator Cycle
Sequencing Kits (Perkin-Elmer, Elmervill, CA, USA) sequenziert worden.
Das Sequenzieren wurde auf einem ABI Prism 377 DNS-Sequenzierer
durchgeführt.
-
Agaroseelektrophorese
-
Agaroseelektrophorese
von DNS wurde mit 2% Agarosegelen (AGAROSE (FMC Bioproducts, Rockland,
ME, USA)) mit 0,25 μg/ml
Ethidiumbromid in Tris-Acetat-Puffer (TAE-Puffer 0,04 M Tris-Acetat, 0,001
M EDTA) durchgeführt.
Proben für
die Elektrophorese wurden mit einem sterilen filtrierten Ladepuffer
gemischt, der aus 25% Ficoll und Bromphenolblau zusammengesetzt
war, und in die Löcher
in einem 2% Agarosegel geladen. Die Elektrophorese lief bei 90 V
für 45
Minuten in Tris-Acetat-Puffer mit 0,25 μg/ml Ethidiumbromid, soweit
nichts anderes angegeben ist. Bänder
von angemessener Größe wurden unter
Verwendung des Qiaquick Gel Extraction Kits (Qiagen GmbH, Hilden,
Germany) Gel-gereinigt, wenn es nötig war. Als Molekulargewichtsstandard wurde
die 1 kb DNS-Molekulargewichtsleiter (Gibco BRL) verwendet. Die
DNS-Konzentration der Gel-extrahierten Produkte wurde unter Verwendung
eines Sprektrophotometers abgeschätzt.
-
Bakterienstämme
-
Der
Escherichia coli-Stamm TOP10F' wurde als
bakterieller Wirt für
Transformationen verwendet. Chemisch kompetente Zellen dieses Stamms
wurden grundsätzlich
so produziert, wie beschrieben ist von Hanahan, D. 1983: Studies
on transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol.
166: 557-580. Elektrokompetente Zellen dieses Bakterienstamms wurden
produziert (Dower, W. J., J. F. Miller und C. W. Ragsdale. 1988:
High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation. Nucleic
Acids Res. 16: 6127).
-
Plasmide
-
Alle
genetischen Manipulationen wurden bei pFab5chis gemäß Molecular
cloning; a laboratory manual (2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press,
1989) durchgeführt.
Dieser Vektor ist konstruiert, um jegliches scFv-Gen aufzunehmen,
das zwischen den SfiI- und NotI-Plätzen eingesetzt wird. Der SfiI-Platz
ist in der pe1B-Führersequenz
angeordnet, und der Not1-Platz ist direkt nach der VL-Region angeordnet,
so dass VH-Linker-VL eingesetzt wird. In diesem Fall wurde ein Antikörper, der
gegen CD40 gerichtet war, verwendet.
-
Primer
-
Zwei
biotinylierte Primer, die das Antikörpergen von pFab5chis umgeben,
wurden mit den folgenden Sequenzen einschließlich bestimmter einzigartiger
Restriktionsplätze
konstruiert:
- 1736 SfiI-Vorwärtsprimer:
- 5'-ATT ACT CGC
GGC CCA GCC GGC CAT GGC CCA CAG GTC AAG CTC GA
- und 1735 NotI-Rückwärtsprimer:
- 5'-TTA GAG CCT
GCG GCC GCC TTG TCA TCG TCG TCC TT
-
Zwei
nicht-biotinylierte Primer, die das Antikörpergen von pFab5chis umgeben,
wurden mit den folgenden Sequenzen konstruiert, die bestimmte einmalige
Restriktionsplätze
umfassen:
- 1664 SfiI-Vorwärtsprimer:
- 5'-ATT ACT CGC
GGC CCA GCC GGC CAT GGC CCA CAG GTC AAG CTC GA
- und 1635 NotI-Rückwärtsprimer:
- 5'-TTA GAG CCT
GCG GCC GCC TTG TCA TCG TCG TCC TT
-
Standard-PKR
-
Standard-PKR-Reaktionen
liefen 25 Zyklen bestehend aus dem folgenden Profil: Denaturierung (94°C, 1 Minute),
Primerhybridisierung (55°C,
1 Minute) und Verlängerung
(72°C, 3
Minuten). Jede PKR-Reaktion enthielt 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 50 mM
KCl, 1,5 mM MgCl2, 200 μM dNTP, 1 μM Vorwärtsprimer, 1 μM Rückwärtsprimer,
1,25 U thermostabile DNS-Polymerase AmpliTaq® (Perkin-Elmer
Corp.) und 50 ng Vorlage in einem Endvolumen von 100 μl.
-
Fehlerbehaftete PKR
-
Die
fehlerbehafteten PKR-Reaktionen wurden einem 10 × -Puffer durchgeführt, der
500 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl, pH 8,8, 5 mM MgCl2,
100 μg Gelatine
enthielt (gemäß Kuipers
et al., Nucleic Acids Res. 1991, Aug 25; 19 (16): 4558 aber mit
von 2 mM auf 5 mM angehobener MgCl2-Konzentration).
-
Für jede 100 μl Reaktion
wurde das Folgende gemischt:
dAPT
5 mM | 5 μl |
dGTP
5 mM | 5 μl |
dTTP
10 mM | 10 μl |
dCTP
10 mM | 10 μl |
20 μM 3'-Primer | 1,5 μl |
20 μM 5'-Primer | 1,5 μl |
10 × Kuipers-Puffer | 10 μl |
steriles
mp H2O | 46,3 μl |
-
Die
Vorlage in pFab5chis-Vektor wurde in einer Menge von 50 ng zugegeben.
10 μl 10
mM MnCl2 wurden zugegeben, und das Rohr
wurde darauf überprüft, dass
kein Niederschlag von MnO2 auftrat. Mindestens
5 Einheiten Taq-Enzym wurden zugegeben. Die fehlerbehaftete PKR
lief bei den folgenden Temperaturen für 25 Zyklen ohne heißen Start:
94°C 1 Minute,
45°C 1 Minute,
72°C 1 Minute
und 72°C
7 Minuten. Das resultierende Produkt war ein fehlerbehafteter Einsatz über das
Protein von ungefähr
750 bp. Dieser Einsatz wurde vor weiterer Behandlung mit dem Gibco
PKR Reinigungskit gereinigt.
-
Erzeugung von Einzelstrang-DNS
durch biotonylierte Primer
-
Das
interessierende Fragment wurde durch zwei separate PKR-Reaktionen
vervielfacht. Diese Reaktionen können
Standard-PKR wie oben beschrieben oder fehlerbehaftete PKR wie ebenfalls oben
beschrieben sein. Die Primer sollten so ausgelegt sein, dass in
einer Reaktion der Vorwärtsprimer biotinyliert
und in der anderen Reaktion der Rückwärtsprimer biotinyliert ist.
-
Zum
Beispiel wurden PKR-Reaktionen mit A) Primern 1736 und 1635 und
B) Primern 1664 und 1735 mit dem oben erwähnten Profil für 25 Zyklen
mit pFab5chis-Antikörper
als Vorlage durchgeführt.
Dies ergab PKR-Produkte von ungefähr 750 bp, wobei bei A der
obere Strang und bei B der untere Strang biotinyliert war.
-
Die
nichtbiotinylierten Stränge
wurden durch Reinigung unter Verwendung einer festen Matrix beschichtet
mit Streptavidin, z. B. Dynabeads, erhalten. Die magnetischen Perlen
werden gewaschen und mit PBS/1% BSA und B&W-Puffer, der 5 mM Tris pH 7,5, 1
M NaCl und 0,5 mM EGTA enthielt, eingestellt. 100 μl jedes PKR-Produkts
werden mit 100 μl
Perlen aufgelöst
in 2 × B&W-Puffer gemischt
und für
15 Minuten unter Rotation bei Raumtemperatur inkubiert. Ungebundene
PKR-Produkte werden durch zweimaliges vorsichtiges Waschen mit B&W entfernt. Der
nichtbiotinylierte Strang der eingefangenen DNS wird durch alkalische
Denaturierung eluiert, indem das DNS-Inkubat mit 25 μl 0,1 M NaOH
für 10
Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen wird. Die Lösung wird von
den Perlen separiert und mit 7,5 μl
0,33 M HCl und 2,5 μl
1 M Tris pH 8 neutralisiert.
-
Erzeugung von Einzelstrang-DNS
unter Verwendung von Phage
-
Das
Fragment von Interesse wurde unter Verwendung von PstI/HindIII-Restriktionsenzymen
in Bakteriophage M13-Vektoren M13mp18 und M13mp19 kloniert. Die
Bakteriophage wurde unter Verwendung des Escherichia coli-Stamms
TOP10F' gemäß einem
konventionellen Verfahren vermehrt. Einzelstrang-DNS führ den oberen
Strang wurde von dem Bakteriophagevektor M13mp18 präpariert,
und Einzelstrang-DNS für
den unteren Strang wurde von dem Bakteriophagevektor M13mp19 präpariert.
Kurz gesagt wurden 1,5 ml einer infizierten Bakterienkultur bei
12000 g für
5 Minuten bei 4°C
zentrifugiert. Der Überstand
wurde mit 200 μl
20% PEG8000/2,5 M NaCl präzipitiert.
Die pelletierte Bakteriophage wurde in 100 μl TE resuspendiert. 50 μl Phenol
eingestellt mit Tris-Cl (pH 8,0) wurden zugegeben, und die Probe
wurde gevortext. Nach Zentrifugieren bei 12000 g für 1 Minute
bei Raumtemperatur wurde die obere Phase, die die DNS enthielt, überführt und
mit Ethanol präzipitiert.
Das DNS-Pellet wurde in 50 μl
TE (pH 8,0) aufgelöst
und bei -20°C
gelagert. (Sambrook et al., Molecular Cloning, A laboratory manual
2. Aufl. Cold Spring Habor Laboratory Press. 1989, Kapitel 4). Von
Phage präparierte
Einzelstrang-DNS ist ringförmig
und muss vor der BAL31-Behandlung geöffnet werden. Dies kann durch
eine Endonuklease durchgeführt
werden, die in der Lage ist, Einzelstrang-DNS zu spalten.
-
Erzeugung von Einzelstrang-DNS
unter Verwendung asymmetrischer PKR
-
PKR-Produkte
werden unter Verwendung einer Spin-Säule gereinigt, um überschüssige Primer von
der vorherigen PKR zu entfernen. 150 ng des gereinigten Produkts
werden als Vorlage bei einer linearen Vervielfachung verwendet,
die in 100 μl
1 × GeneAmp® 10 × PKR-Puffer,
der 1,5 mM MgCl2 (Applied Biosystems), 200 μM von jedem
dNTP (New England BioLabs), 1,25 U AmpliTaq®-DNS-Polymerase
(Applied Biosystems) und 1,0 μM
eines einzelnen Primers enthält.
Die PKR-Zyklusbedingungen sind: Denaturierung bei 94°C für 1 Minute,
35 Zyklen von 94°C
für 30
Sekunden, 55°C
für 30
Sekunden, 72°C für 1 Minute,
gefolgt von Verlängerung
bei 72°C
für 7 Minuten.
-
Asymmetrische
PKR-Produkte werden von der Doppelstrangmatrize auf einem 1% Agarosegel der
Größe nach
getrennt und unter Verwendung des Qiaquick Gel Extraction Kits (Qiagen)
gereinigt.
-
Erzeugung von fragmentierter Einzelstrang-DNS
unter Verwendung von BAL 31
-
Die
Einzelstrang-DNS-Stränge
(die obere bzw. untere Stränge
enthielten) wurden einer separaten enzymatischen Behandlung unter
Verwendung von z. B. BAL 31 unterworten. Jede Aufschlussreaktion
enthielt 0,02 μg/μl Einzelstrang-DNS,
600 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 12 mM CaCl2,
12 mM MgCl2, 1 mM EDTA pH 8,0 und BAL 31
in verschiedenen Enzymkonzentrationen, die von 0,1-5 U/ml reichten.
Die Reaktionen wurden bei 30°C
inkubiert und Fraktionen von aufgeschlossener Einzelstrang-DNS wurden nacheinander
bei 10, 30, 60 und 120 Sekunden oder mehr gesammelt. Die Reaktionen
wurden durch Zugabe von EDTA und Wärmebehandlung bei 65°C für 10 Minuten
gestoppt. Die Einzelstrang-DNS-Fragmente wurden durch Phenol-/Chloroformextraktion gereinigt
und mit Ethanol präzipitiert.
Die Einzelstrang-DNS wurden in 10 mM Tris pH 8,0 resuspendiert.
-
Das
Aufschlussmuster wurde durch 1% Agarosegelelektrophorese ausgewertet.
-
Reinigung von durch Aufschluss erzeugten
Fragmenten:
-
Aufgeschlossene
DNS-Fragmente wurden durch Phenol-/Chloroform-/Isoamylalkoholextraktion gereinigt.
50 μl gepuffertes
Phenol wurden zu jedem Rohr von 100 μl Probe zusammen mit 50 μl einer Mischung
von Chloroform und Isoamylalkohol (24:1) hinzugegeben. Die Rohre wurden
für 30
Sekunden gevortext, und dann für
1 Minute in einer Mikrofuge bei 14000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert.
Die obere Phase wurde dann gesammelt und mit 2,5 Volumen von 99,5%
Ethanol gemischt (1/10 war 3M Natriumacetat, pH 5,2). Die DNS wurde
für 1 Stunde
bei -80°C
präzipitiert.
Die DNS wurde dann durch Zentrifugieren für 30 Minuten in einer Mikrofuge
bei 14000 Umdrehungen pro Minute pelletiert. Das Pellet wurde einmal
mit 70% Ethanol gewaschen und dann erneut in 10 μl sterilem Wasser aufgelöst.
-
Analyse
von durch Aufschluss erzeugten gereinigten Fragmenten auf Agarosegel
5 μl des
aufgelösten
Pellets von jedem Zeitpunkt und von der Leerprobe wurden mit 2,5 μl Ladepuffer
(25% Ficoll und Bromphenol blau) gemischt und in Löcher in
einem 2% Agarosegel geladen. Die Elektrophoresen der unterschiedlichen
Zeitpunkte wurden wie oben durchgeführt.
-
Wiederzusammenbau von Fragmenten
voller Länge
-
Der
Wiederzusammenbau der Einzelstrang-DNS-Fragmente wird durch zwei
sequenzielle PKR-Reaktionen
erreicht. Die erste PKR-Reaktion sollte 10 mM Tris-HCl, pH 8,3,
50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 200 μM dNTP, 0,3
U Taq-Polymerase und 2 μl BAL31-behandelte
Probe enthalten, alles in einem Endvolumen von 25 μl, und 5
Zyklen mit dem folgenden Profil unterworfen werden: 94°C für 1 Minute, 50°C für 1 Minute
und 72°C
für 2 Minuten
+ 72°C für 5 Minuten.
Die zweite PKR-Reaktion sollte 10 mM Tris-HCl, ph 8,3. 50 mM KCl,
1,5 mM MgCl2, 200 μM dNTP, 0,6 U Taq-Polymerase,
1 μM Vorwärtsprimer, 1 μM Rückwärtsprimer
und 5 μM
Probe von der ersten PKR-Reaktion enthalten, alles in einem Endvolumen
von 50 μl,
und 15 Zyklen mit dem folgenden Profil unterworfen werden: 94°C für 1 Minute,
55°C für 1 Minute
und 72°C
für 2 Minuten
+ 72°C für 7 Minuten. Die
resultierenden Produkte können
durch Agarosegelelektrophorese ausgewertet werden.
-
Restriktionsaufschluss von wieder zusammengebautem
Fragment und Plasmid mit SfiI und NotI
-
Das
wieder zusammengesetzte Fragment und das Plasmid pFab5chis wurden
zuerst unter Verwendung von NEB-Puffer 2, der BSA und 11 U Enzym/μg DNS enthielt,
mit SfiI gespalten. Die Reaktion wurde für 4 Stunden bei 50°C durchgeführt. Danach wurde
die DNS durch Zugabe von Umwandlungspuffer und 6 U Enzym/μg DNS mit
NotI gespalten. Diese Reaktion wurde bei 37°C über Nacht durchgeführt.
-
Gelreinigung von restriktionsaufgeschlossenem
Vektor und restriktionsaufgeschlossenem wieder zusammengesetztem
Fragment
-
Die
Spaltungsreaktion wurde auf einem 1% Agarosegel analysiert. Der
restriktionsaufgeschlossene Einsatz zeigte ein Spaltungsprodukt
von ungefähr
750 bp. Dies entspricht gut der erwarteten Größe. Das Band des gespaltenen
Einsatzes und des Plasmids wurden ausgeschnitten und gelextrahiert, wie
zuvor beschrieben wurde.
-
Ligatierung von wieder zusammengesetztem
restriktionsaufgeschlossenem Fragment mit restriktionsaufgeschlossenem
pFab5chis
-
Gereinigter
gespaltener pFab5chis wurde mit gereinigtem wieder zusammengesetztem,
restriktionsaufgeschlossenem Fragment bei 12°C Wasserbad für 16 Stunden
ligatiert. 50 μl
des Vektors wurden mit 50 μl
des Einsatzes und 15 μl
von 10 × Puffer
(angereichert mit dem Enzym), 7,5 μl Ligase (5 U/μl) und sterilem
Wasser bis auf ein Endvolumen von 150 μl gemischt. Eine Ligatierung
des restriktionsaufgeschlossenen pFab5chis ohne jeglichen Einsatz
wurde ebenfalls in derselben Weise durchgeführt.
-
Transformation von chemisch kompetentem
E coli TOP10F' mit
dem ligatierten wieder zusammengesetzten Einsatz und pFab5chis
-
Die
Ligatierungsreaktionen wurden durch Phenol-/Chloroformextraktion
wie oben beschrieben gereinigt. Die obere Phase von der Extraktion
wurde gesammelt und mit 2,5 Volumen 99,5 Ethanol gemischt (1/10
war 3M Natriumacetat, pH 5,2). Die DNS wurde für 1 Stunde bei -80°C präzipitiert.
Die DNS wurde dann durch Zentrifugieren für 30 Minuten in einer Mikrofuge
bei 14000 Umdrehungen pro Minute pelletiert. Das Pellet wurde einmal
mit 70% Ethanol gewaschen und dann erneut in 10 μl sterilem Wasser aufgelöst. 5 μl von jeder
Ligatierung wurden separat mit 95 μl chemisch kompetentem E coli-TOP10F' gemischt, für 1 Stunde
auf Eis inkubiert und dann transformiert (Sambrook et al., Molecular
Cloning, A laboratory manual 2. Aufl. Cold Spring Habor Laboratory Press,
1989). Nach einer Stunde Wachstum wurden die Bakterien von den zwei
Transformationen auf Ampicillin enthaltende Agarplatten (100 μg/ml) ausgebreitet.
Die Platten wurden kopfüber
für 14
Stunden in einem 37°C
Inkubator gezogen.
-
Beispiel 2 – Rekombinationsfrequenzen;
Vergleich von Doppelstrang-DNS und Einzelstrang-DNS
-
In
weiteren vergleichbaren Experimenten wurden drei scFv-Antikörperfragmente
in Rekombinationsexperimenten verwendet, entweder als Doppelstrang-DNS
oder als Einzelstrang-DNS.
-
Doppelstrang-DNS
-
Die
drei scFv-Gene wurden jeweils unter Verwendung von Vorwärts- und
Rückwärtsprimern und
einer Standard-PKR-Prozedur durch PKR vervielfacht. Die Größe der Bänder wurde
durch Agaroseelektrophorese bestätigt,
und der Rest der verstärkten
PKR-Produkte wurde unter Verwendung des Concert PKR-Reinigungskits
(Gibco) gereinigt. Die Doppelstrang-DNS von den drei scFv wurden
in equimolaren Mengen gemischt und mit BAL31 behandelt. Jede Aufschlussreaktion
enthielt Doppelstrang-DNS in einer Konzentration von 0,02 μg/μl Reaktionsvolumen,
600 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 12 mM CaCl2, 12
mM MgCl2, 1 mM EDTA pH 8,0 und BAL31 in
unterschiedlichen Enzymkonzentrationen (unter Verwendung von 4,
20 oder 100 U Enzym/ml Reaktionsvolumen). Die Reaktionen wurden
bei 30°C
inkubiert und Fraktionen von aufgeschlossener Doppelstrang-DNS wurden
der Reihe nach bei 10, 30 und 50 Minuten gesammelt. Die Reaktionen
wurden mit EDTA und Wärmebehandlung
gestoppt (alternativ kann ein EDTA-freies Wärmedeaktivierungsprotokoll verwendet
werden; siehe unten) und unter Verwendung von Phenol-/Chloroformextraktion
und Ethanolpräzipitation
gereinigt. Die Doppelstrang-DNS-Proben wurden in 10 mM Tris pH 8,0
resuspendiert.
-
Unter
Getrennthalten jedes Zeitpunkts wurden die Proben Wiederzusammenbau-PKR
(für diesen
Wiederzusammenbau wurden 60 ng DNS verwendet) und Verstärkungs-PKR
gemäß dem Protokoll
unterworfen und in pGEM (Produkt Nr. A362A, Promega, Madison, USA)
kloniert. Achtzehn Klone von jedem Zeitpunkt wurden sequenziert,
und die Anzahl und Frequenz von Rekombinationen wurden bestimmt.
-
Wärmedeaktivierung von Exonukleaseaufschlüssen
-
Ein
Protokoll, um die BAL31-Reaktion ohne Verwendung von EDTA zu stoppen,
wurde aufgestellt. Dieses Wärmedeaktivierungsprotokoll
vermeidet die Verwendung von Phenol-/Chloroformextraktion, die gesundheitsgefährlich ist
und auch einen Materialverlust verursacht.
-
Kurz
gesagt wird die Probe für
10 Minuten bei 95°C
inkubiert und dann direkt auf Eis gegeben, um die enzymatische Reaktion
zu stoppen. Danach kann die Probe unter Verwendung von Ethanol direkt präzipitiert
werden.
-
Einzelstrang-DNS
-
Die
drei scFv-Gene wurden jeweils in zwei PKR-Reaktionen unter Verwendung
von Primerpaaren Vorwärts/Rückwärts-Biotin
und Vorwärts-Biotin/Rückwärts unter
Verwendung von Standard-PKR-Prozedur vervielfacht. Die Größe der Bänder wurde
durch Agaroseelektrophorese bestätigt, und
der Rest des verstärkten
PKR-Produkts wurde unter Verwendung des Concert PKR-Reinigungskits (Gibco)
gereinigt. Einzelstrang-DNS wurde unter Verwendung von magnetischen
Perlen gemäß dem Protokoll
erhalten, wodurch drei Sense-Stränge
und drei Antisense-Stränge
erreicht wurden. Die Sense-Stränge
bzw. die Antisense-Stränge
von den drei scFv wurden in equimolaren Mengen gemischt und gemäß dem Protokoll
mit BAL31 behandelt (unter Verwendung von 1,25 oder 11 U Enzym/ml
Reaktionsvolumen und Einzelstrang-DNS in einer Konzentration von
0,015 μg/μl Reaktionsvolumen),
und Proben wurden nach 0 (d. h. unaufgeschlossen), 10, 30 und 50
Minuten genommen. Die Reaktionen wurden mit EDTA und Wärmebehandlung
gestoppt und unter Verwendung von Phenol-/Chloroform-Extraktion und Ethanolpräzipitation
gereinigt. Unter getrennt Halten der einzelnen Zeitpunkte, aber
unter Mischen der Sense- und Antisense-Stränge wurden die Proben Wiederzusammenbau-PKR
(für diesen
Wiederzusammenbau wurden 60 ng DNS verwendet) und Verstärkungs-PKR
gemäß dem Protokoll
unterworfen und in pGEM kloniert. Achtzehn Klone von jedem Zeitpunkt
wurden sequenziert, und die Anzahl und Frequenz von Rekombinationen
wurde bestimmt.
-
Resultate
-
Die
höchste
Rekombinationsfrequenz unter Verwendung von Doppelstrang-DNS wurde
unter Verwendung von 20 U Enzym/ml Reaktionsvolumen (das 0,02 μg/μl DNS enthielt)
und Behandeln für
10 Minuten erreicht. Dies ergab 39% der Klone mit einer Überkreuzung
(6) und 17% der Klone mit zwei Überkreuzungen (7).
Verwendung von 4 U Enzym/ml ergab keine Überkreuzungen unabhängig von
der Dauer der Fragmentierung, und 100 U Enzym/ml resultierten in
eine vollständige
Fragmentierung in sehr kleine Fragmente, wie durch das Scheitern
angezeigt wird, während
des Wiederzusammenbaus das Gen voller Länge zurückzugewinnen.
-
Die
Resultate der Experimente unter Verwendung von Einzelstrang-DNS
sind in den 8 bis 10 gezeigt. 8 zeigt
1,25 U/ml BAL31 und Klone mit einer Überkreuzung, 9 zeigt
1,25 U/ml BAL31 und Klone mit zwei Überkreuzungen. 10 zeigt
11 U/ml BAL31 und Klone mit einer Überkreuzung, und 11 zeigt
11 U/ml BAL31 und Klone mit zwei Überkreuzungen.
-
Die
höchste
Frequenz von Rekombinationen, die eine Überkreuzung unter Verwendung
von Einzelstrang-DNS ergaben, wurde unter Verwendung von 11 U Enzym/ml
und Behandeln für
10 Minuten erreicht (10). 59% der Klone wiesen eine Überkreuzung
auf. Die höchste
Frequenz von Rekombinationen, die zwei Überkreuzungen unter Verwendung
von Einzelstrang-DNS
ergaben, wurde unter Verwendung von 1,25 U Enzym/ml und Behandeln
für 30
Minuten erreicht (9). 20% der Klone wiesen zwei Überkreuzungen
auf.
-
Schlussfolgerungen und Kommentare
-
Diese
Daten zeigen deutlich, dass eine höhere Rekombinationsfrequenz
unter Verwendung von Einzelstrang-DNS erreicht wird. Die drei verwendeten
scFv haben dieselben Grundgerüstsequenzen, was
darauf hinweist, dass die berichtete Anzahl von Überkreuzungen aufgrund von Überkreuzungen
in Regionen, wo kein Sequenzunterschied resultieren wird, höher sein
mag. Diese Experimente unter Verwendung von Einzelstrang-DNS wurden
in einer nicht-optimalen Weise durchgeführt, um maximale Rekombination
zu zeigen, da alle Stränge
von allen drei Molekülen
gemischt wurden. Mischen des Sense-Strangs von einem scFv mit dem
Antisense-Strang
von einem anderen scFv würde
höhere Frequenzen
an Überkreuzungen
erzeugen, siehe das Beispiel 3, unten. Außerdem wurde hier jeder Zeitpunkt
separat gehalten, und es wäre
logisch, die Frequenz von Überkreuzungen
als ansteigend abzuschätzen,
falls unterschiedliche Zeitpunkte, d. h. unterschiedliche Fragmentgrößen, gemischt
würden.
-
Beispiel 3 – Rekombinationsfrequenzen;
Homologieabhängigkeit
unter Verwendung von Einzelstrang-DNS
-
Um
die Homologie zu untersuchen, die erforderlich ist, um Überkreuzungen
zu erreichen, stellten wir Experimente an, um vier scFv (als SMUC159, CT17,
AE11 und MO152 bezeichnet) zu rekombinieren, die wie folgt drei
Paare mit unterschiedlichen Homologien ausbilden:
SMUC159-CT17 | 92% |
SMUC159-AE11 | 70% |
SMUC159-MO152 | 60% |
-
Die
vier scFv-Gene wurden jeweils in zwei PKR-Reaktionen unter Verwendung
von Primerpaaren Vorwärts/Rückwärts-Biotin
und Vorwärts-Biotin/Rückwärts unter
Anwendung von Standard-PKR-Prozedur vervielfacht. Die Größe der Bänder wurde
mit Agaroseelektrophorese bestätigt,
und der Rest des verstärkten
PKR-Produkts wurde unter Verwendung des Concert PKR-Reinigungskits
(Gibco) gereinigt. Einzelstrang-DNS wurde unter Verwendung von magnetischen
Perlen gemäß dem Protokoll erhalten,
was vier Sense-Stränge
und vier Antisense-Stränge
ergab. Jeder Strang wurde gemäß dem Protokoll
(unter Verwendung von 4,2 oder 12,5 U Enzym/ml) mit BAL31 behandelt,
und Proben wurden nach 0, 10, 30 und 50 Minuten oder 0, 15, 30,
45 und 60 Minuten entnommen. Die Reaktionen wurden mit EDTA und
Wärmebehandlung
gestoppt und unter Verwendung von Phenol-/Chloroformextraktion und Ethanolpräzipitation
gereinigt. Unter getrennt Halten jedes Zeitpunkts, aber unter Mischen
der Sense- und Antisense-Stränge,
die die oben angegebenen Paare bilden, wurden die Proben Wiederzusammenbau-PKR
und Vervielfachungs-PKR gemäß dem Protokoll
unterworfen und in pGEM kloniert. Fünfzehn Klone von jedem Zeitpunkt
wurden sequenziert, und die Anzahl und Frequenz der Rekombinationen
wurde bestimmt.
-
Resultate
-
Überkreuzungen
wurden in allen Kombinationen von scFv identifiziert, was darauf
hinweist, dass eine so niedrige wie 60%ige Homologie ausreichend ist,
um Rekombinationen zu erreichen.
-
Beispiel 4 – Verbesserte Steuerung der
Fragmentgröße unter
Verwendung von Exonukleasen
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(A) Exonukleasen
-
Wir
verwenden bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung Exonukleasen,
z. B. BAL31, Exonuklease I, Exonuklease V, Exonuklease VII, Exonuklease
T7 Gen 6, Bakteriophage lambda-Exonuklease und Exonuklease Rec Jf für
die Fragmentierung. Diese Enzyme spalten zu einem Zeitpunkt ein
Nukleotid ab, entweder von dem 5' Ende
oder dem 3' Ende oder
von beiden Enden. Die Reaktion kann unter Verwendung von EDTA oder
durch Hitzedeaktivierung (siehe oben) gestoppt werden, abhängig von
dem verwendeten Enzym. Dies bedeutet, dass Fragmente von allen möglichen
Größen, die
sich um nur ein Nukleotid unterscheiden, erhalten werden können.
-
Die
folgenden Beispiele demonstrieren, wie Exonukleaseaufschluss abhängig von
den verwendeten Bedingungen die Erzeugung von Fragmenten von verschiedenen
und steuerbaren Größen erlaubt.
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BAL31
-
Einzelstrang-DNS
wurde mit BAL31 gemäß dem Protokoll
in Beispiel 1 aufgeschlossen, mit einer Enzymkonzentration von 4,2
U/ml Reaktionsvolumen und einer Einzelstrang-DNS-Konzentration von 0,008 μg/μl Reaktionsvolumen.
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In
einem typischen Experiment werden ungefähr 300 ng DNS zu jedem Zeitpunkt
der BAL31-Behandlung
isoliert. 12 zeigt ein Agaroseelektrophoresegelbild
von solch einem Experiment mit unbehandelter Einzelstrang-DNS in
Spur 4 und mit für
10 Minuten behandelter Einzelstrang-DNS in Spur 3, mit für 30 Minuten behandelter Einzelstrang-DNS
in Spur 2 und mit für 50
Minuten behandelter Einzelstrang-DNS in Spur 1. Spur 5 ist der Molekulargewichts-(MW-)
Standard.
-
Die 13 bis 15 zeigen
die entsprechenden Gelchromatogramme der jeweiligen Spuren. 13 ist
das unbehandelte Material, und die mehreren Peaks beziehen sich
auf unterschiedliche Konformationen der Einzelstrang-DNS. 14 entspricht
Spur 3 und dem für
10 Minuten behandelten Material. Das Material wurde wärmebehandelt,
um die enzymatische Reaktion zu stoppen, und somit wurden die unterschiedlichen
Konformationen aufgelöst,
und nur ein Peak einer ausgeprägten
Größe ist gezeigt. 15 entspricht
Spur 2 und dem für
30 Minuten behandelten Material.
-
Hier
ist es klar, dass der Peak, der größeren Fragmenten entspricht,
abnimmt, und ein Peak von kleineren DNS-Fragmenten aufscheint.
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Exonuklease VII
-
Einzelstrang-DNS
wurde mit Exonuklease VII unter Verwendung einer Enzymkonzentration
von 7,7 U/ml Reaktionsvolumen und einer Einzelstrang-DNS-Konzentration
von 0,008 μg/μl Reaktionsvolumen
aufgeschlossen. Der Reaktionspuffer wies 67 mM Kaliumphosphat (pH
7,9), 10 mM Mercaptoethanol, 6,7 mM MgCl2 und
8,3 mM EDTA auf.
-
Der
Reaktion wurde es erlaubt, bei 37°C
für 10,
20 und 30 Minuten vorzuschreiten, bevor sie durch Wärmedeaktivierung
(95°C für 5 Minuten)
gestoppt wurde.
-
In 16 ist
das Fragmentierungsmuster unter Verwendung von Exonuklease VII gezeigt. Spur
1 ist MW-Standard, Spur 2 ist unbehandelte Einzelstrang-DNS, Spur
3 ist Einzelstrang-DNS
fragmentiert mit Exonuklease VII für 10 Minuten, Spur 4 ist Einzelstrang-DNS
fragmentiert mit Exonuklease VII für 20 Minuten, und Spur 5 ist
Einzelstrang-DNS fragmentiert mit Exonuklease VII für 30 Minuten.
Dies zeigt, dass die Fragmentgrößen mit
der Zeit abnehmen.
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Exonuklease Rec Jf
-
Einzelstrang-DNS
wurde mit Exonuklease Rec Jf unter Verwendung
einer Enzymkonzentration von entweder 2,5 U/ml Reaktionsvolumen
oder 10 U/ml Reaktionsvolumen und Einzelstrang-DNS in einer Konzentration von 0,007 μg/μl Reaktionsvolumen,
entsprechend 0,36 U Enzym/μg DNS
bzw. 1,4 U Enzym/μg
DNS, aufgeschlossen. Der Reaktionspuffer wies 50 mM NaCl, 10 mM
Tris-HCl, 10 mM MgCl2 und 1 mM Dithiothreitol
bei pH 7,9 auf.
-
Der
Reaktion wurde es erlaubt, bei 37°C
für 10,
20 und 30 Minuten fortzuschreiten, bevor sie durch Wärmedeaktivierung
(95°C für 5 Minuten)
gestoppt wurde.
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In 17 ist
das Fragmentierungsmuster unter Verwendung von Exonuklease Rec Jf bei 0,36 U/Mikrogramm Einzelstrang-DNS
gezeigt. Spur 1 ist unbehandelte Einzelstrang-DNS, Spur 2 ist Einzelstrang-DNS
fragmentiert mit Exonuklease Rec Jf für 10 Minuten,
Spur 3 ist Einzelstrang-DNS fragmentiert mit Exonuklease Rec Jf für
20 Minuten, und Spur 4 ist Einzelstrang-DNS fragmentiert mit Exonuklease
Rec Jf für
30 Minuten. Dies zeigt, dass die Fragmentgrößen mit der Zeit abnehmen.
In 18 ist die Enzymkonzentration 4-fach erhöht (1,5
U/Mikrogramm Einzelstrang-DNS), und das Fragmentierungsmuster ist von
0 bis 30 Minuten gezeigt, was verglichen mit 17 ein
höheres
Maß an
Fragmentierung zeigt. Dies zeigt, dass sowohl Zeit als auch Enzymkonzentration
verwendet werden können,
um die Fragmentierung zu steuern.
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(B) Endonukleasen
-
Konventionelle
DNS-Mischverfahren verwenden typischerweise DNase I für die Fragmentierung
(siehe zum Beispiel Stemmer, 1994, Nature 370: 389-391). DNase I
spaltet DNS in einer endonukleolytischen Weise an Plätzen benachbart
zu Pyrimidinen. Konsequenterweise können nicht alle möglichen
Fragmentgrößen erhalten
werden.
-
Darüber hinaus
wird unter Verwendung von Magnesium in dem Reaktionspuffer eine
homologe Mischung von Mono- und Oligomeren erhalten. So müssen unterschiedliche
Verfahren, wie beispielsweise Gelagaroseelektrophoreseaufreinigung
oder Gelfiltration verwendet werden, um Fragmente von unterschiedlichen
Größen zu isolieren.
Oft sind Fragmente von kleinerer Größe oder eine Mischung von kleinen
und größeren Fragmenten
erwünscht,
um die Rekombination zu optimieren. Diese Reinigungsverfahren führen jedoch
einzelstrangige Ausbrüche
in die doppelstrangigen PKR-Produkte ein. Fragmente einer bestimmten
Größe gereinigt
auf einem Gel würden
somit aus Doppelstrang-DNS mit einer großen Anzahl von einzelstrangigen
Ausbrüchen
bestehen, was bei der Denaturierung zu vielen kleineren Fragmenten
führen
würde.
Dies bedeutet, dass viele der Einzelstrangfragmente, die bei der
Denaturierung erzeugt werden, zu kurz wären, um während der Hybridisierung als
Primer zu funktionieren, was in einen großen Produktverlust resultiert.
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Die
Verwendung von Mangan in dem Reaktionspuffer erzeugt Fragmente von
Größen kleiner
als 50 bp, und keine Gelreinigung wird benötigt. Jedoch ist man hier auf
die Verwendung nur kleiner Fragmente beschränkt, und diese können nicht
mit größeren Fragmenten
gemischt werden, etwas, was die Rekombinationsfrequenz möglicherweise
erhöhen würde.
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Die
mit der Verwendung von Endonukleasen verbundenen Probleme werden
in den folgenden Experimenten demonstriert:
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DNase I
-
DNS
wurde für
5 Minuten mit DNase I bei einer Konzentration von 0,15 U/μg DNS aufgeschlossen.
-
Magnesium-
und Mangan-Puffer wurden beim Fragmentieren mit DNase I verglichen,
und die Resultate sind in 19 gezeigt.
Spur 1 ist MW-Standard, Spur 2 ist unbehandelte Einzelstrang-DNS
in Mg-Puffer, Spur 3 ist Einzelstrang-DNS fragmentiert mit DNase
1 in Mg-Puffer gemäß Stemmer
(1994) Nature 370: 389-391, Spur 4 ist unbehandelte Einzelstrang-DNS
in Mn-Puffer und Spur 5 ist Einzelstrang-DNS fragmentiert mit DNase I
in Mn-Puffer gemäß Kikuchi
et al. (2000) Gene 243: 133-137. Aus 19 ist
klar, dass dann, wenn Mg-Puffer und Bedingungen gemäß den Papern
von Stemmer und Kikuchi verwendet werden, keine Fragmentierung auftritt.
Darüber
hinaus wird dann, wenn Mn-Puffer und Bedingungen gemäß den Papern
von Stemmer und Kikuchi verwendet werden, alles Material vollständig binnen
nur weniger Minuten fragmentiert.
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In
einem Versuch, Fragmente von unterschiedlichen Größen zu erhalten,
entschieden wir, Mg-Puffer
zu verwenden und die Enzymkonzentration zu erhöhen. 20 zeigt
ein Agaroseelektrophoresegelbild von solch einem Experiment unter
Verwendung von DNase I. Spur 1 ist MW-Standard. Spur 6 ist unbehandelte
Einzelstrang-DNS. Spur 12 ist Einzelstrang-DNS behandelt gemäß den Papern von Stemmer und
Kikuchi unter Verwendung von 0,15 U Enzym/Mikrogramm DNS, und Spur
13 ist dasselbe Material behandelt mit 1 U Enzym/Mikrogramm DNS (d.
h. sechsmal mehr Enzym).
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Die 21 bis 23 zeigen
die entsprechenden Chromatogramme. Die unbehandelte Einzelstrang-DNS
ist wärmebehandelt
worden, deshalb erscheint nur ein Peak in 21 (mit
einem Pfeil bezeichnet). In 22 ist
deutlich, dass bei Verwendung der Menge an DNase I gemäß den Papern
von Stemmer und Kikuchi der Peak für unbehandelte Einzelstrang-DNS
etwas reduziert ist (bezeichnet durch den Pfeil), aber kein ausgeprägter Peak
für die
fragmentierte DNS sichtbar ist, nur ein Rauschen. Unter Verwendung
von sechsmal mehr Enzym ist die unbehandelte Einzelstrang-DNS vollständig abgebaut (23),
noch gibt es hier irgendeinen sichtbaren Peak der Fragmente.
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Mungobohnennuklease
-
Einzelstrang-DNS
wurde mit Mungobohnennuklease (Produkt Nr. MO250S, New England Biolabs)
unter Verwendung einer Enzymkonzentration von 0,375 U/ml Reaktionsvolumen
und Einzelstrang-DNS in einer Konzentration von 0,007 μg/μl Reaktionsvolumen
aufgeschlossen. Der Reaktionspuffer wies 50 mM Natriumacetat, 30
mM NaCl, 1 mM ZnSO4, bei pH 5,0 auf.
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Der
Reaktion wurde es erlaubt, für
10 Minuten bei 25°C
fortzuschreiten, bevor sie durch Wärmedeaktivierung (95°C für 5 Minuten)
gestoppt wurde.
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24 zeigt
Fragmentierung unter Verwendung einer anderen Endonuklease, Mungobohnennuklease.
Spur 1 ist unbehandelte Einzelstrang-DNS, Spur 2 ist dasselbe Material
behandelt für
10 Minuten. Spur 3 ist der MW-Standard.
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Die
Resultate weisen darauf hin, dass die gesamte DNS vollständig nach
nur 10 Minuten Aufschluss mit Mungobohnennuklease fragmentiert war (siehe
Spur 2), trotz Verwendung des Enzyms in einer niedrigeren Konzentration
als durch der Hersteller empfohlen.
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Schlussfolgerungen und Kommentare
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Die
obigen Beispiele zeigen, wie die Fragmentgrößen unter Verwendung von Exonukleasen und Änderung
der Reaktionsbedingungen, d. h. Zeit, Reaktionsvolumen, Enzymkonzentration,
gesteuert werden können.
Die unterschiedlichen Peaks werden durch Gelbildchromatogramme visualisiert.
-
Im
Gegensatz dazu ergibt die Verwendung von Endonukleasen, wie beispielsweise
DNase I, eine schwer zu steuernde Reaktion. Die Verwendung von Bedingungen,
die in der Literatur angegeben sind, unter Verwendung von entweder
Mg- oder Mn-enthaltenden Puffern ergibt typischerweise eine Situation,
in der entweder alles oder nichts fragmentiert wird, siehe insbesondere 20.
Ein Experiment, das eine andere Endonuklease verwendet (Mungobohnennuklease),
bestätigt
diese Beobachtungen.
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Beispiel 5 – Aufschluss
von Unterpopulationen von Einzelstrang-DNS-Ausgangsmaterial mit
unterschiedlichen Exonuleasen
-
In
weiteren Experimenten wurde das Einzelstrang-DNS-Ausgangsmaterial
in zwei Populationen aufgespalten, die dann unter Verwendung unterschiedlicher
Exonukleasen aufgeschlossen wurden.
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Materialen und Verfahren
-
Plasmide
-
Eine
Tetrazyklin-zerstörte
Variante des Plasmids pBR322 wurde durch Spaltung mit SalI und BamHI
(Roche, Basel, Schweiz) Klenow-Behandlung (Amersham Biosciences
AB, Uppsala, Schweden) und Ligatierung am stumpfen Ende (New England
Biolabs, MA, USA) konstruiert. Das resultierende Plasmid wurde auf
Tetrazyklin-Empfindlichkeit überprüft und wird
pBR322dtet bezeichnet.
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PBR322stop1
und pBR322stop3 wurden durch PKR-Vervielfältigung des Tetrazyklin-Gens
von pBR322 unter Verwendung bestimmter Primer (Tabelle 1) erzeugt.
Jedes mutierte Tetrazyklin-Gen
wurde in pBR322 kloniert.
-
Tabelle 1
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Primersequenzen
-
- pBR322 NheI vorwärts
Stop:
- 5'-CACTATGGCGTGCTGCTAGCGCTATATGCGTTGATGCAATTTCT
ATGAGCACCCGTTCT-3'
- pBR322 EagI rückwärts:
- 5'-CGTAGCCCAGCGCGTCGGCCGCCATGCCGGCGATAATG-3'
- pBR322 HindIII vorwärts:
- 5'-CAGCTTATCATCGATAAGCTTTAATGCGGTAGTTTAT-3'
- pBR322 SalI rückwärts Stop:
- 5'-TCTCAAGGGCATCGGTCGACGCTCTCCCTTATGCGACTCCTGCATTAGGAATCAGCCCAGTAGTA-3'
-
PKR
-
Soweit
nichts anderes angegeben ist, enthielten die PKR-Reaktionen 4 μM jedes Primers,
160 μM dNTP
(Roche, Basel, Schweiz), 1 × AmpliTaq-Reaktionspuffer,
2,5 U thermostabile AmpliTaq-DNS-Polymerase (Applied Biosystemsm
CA, USA).
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FIND-PKR
1: 5 oder 25 Zyklen von 94°C
30 Sekunden, 50°C
45 Sekunden, 72°C
1 Minute und dann 72°C
für 7 Minuten,
es waren keine externen Primer enthalten.
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FIND-PKR
2: 15, 25 oder 50 Zyklen von 94°C 30
Sekunden, 55°C
45 Sekunden, 72°C
1 Minute und dann 72°C
für 7 Minuten
mit eingeschlossenen externen Primern.
-
Einzelstrang-DNS-Präparation
-
Das
Gen von Interesse, d. h. tet-r, wurde unter Verwendung von bestimmten
Primern vervielfacht, einer der Primer war biotinyliert. Einzelstrang-DNS
von den Sense- und Antisense-Strängen wurde
unter Verwendung von Streptavidin-Magnetperlen (entweder gekauft
von Dynal AS, Oslo, Norwegen oder Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Deutschland)
gemäß den Herstellerempfehlungen gereinigt.
Die dadurch erhaltene Einzelstrang-DNS wurde weiter entweder durch
Ethanolpräzipitation oder
unter Verwendung von Recochip (TaKaRa, Shiga, Japan) gemäß den Herstellerempfehlungen
gereinigt.
-
FIND-Experimente
-
Die
FIND-Experimente wurden durch Aufschließen von DNS mit einer Exonuklease
begonnen. Die DNS war einzelstrangig (präpariert wie oben) und stammte
von dem Tetrazyklin-resistenten Gen (pBR322stop1 oder pBR322stop3,
945 bp). Die Exonukleasen waren BAL31 (0,08-1 U/μg DNS, New England Biolabs,
MA, USA), Exonuklease I (100 U/μg DNS,
New England Biolabs, MA, USA), T7 Gen 6-Exunuklease (320 U/μg DNS, USB,
Cleveland Ohio, USA) und Exonuklease V (12,5 U/μg DNS, USB, Cleveland Ohio,
USA). Die Zeit für
den Aufschluss lag in dem Bereich von 2-90 Minuten. Die Aufschlussreaktionen
wurden durch Zugeben von EDTA auf eine Endkonzentration von 20 mM und/oder
Wärmedeaktivierung
bei 65 oder 95°C
für 10
Minuten gestoppt. Wenn EDTA verwendet wurde, um die DNS-Fragmentierung
zu stoppen, wurde die DNS weiter durch Phenol-/Chloroform-Extraktion
und Ethanolpräzipitation
gereinigt. Die Fragmente wurden in einer FIND-PKR1-Reaktion für 5 oder
25 Zyklen rekombiniert, und das Material wurde dann in einer FIND-PKR2-Reaktion
für 15,
25 oder 50 Zyklen vervielfacht. Letztlich wurden die Gene voller
Länge durch
die Verwendung von HindIII und EagI (New England Biolabs, MA, USA)
zur Funktionsauswertung in pBR322dtet oder zum Sequenzieren in pGEM
(Promega, Madison, WI, USA) kloniert.
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Auswertung der Funktionalität des Tetrazyklinklons
-
Die
Klone, die in pBR322dtet eingeführt
wurden, wurden in chemisch kompetente TG1-E. coli transformiert
und auf LB-Agarplatten, die 1 μg/ml
Ampicillin enthielten, plattiert. Ein- oder zweihundert Klone wurden
dann auf LB-Agarplatten, die 50 μg/ml
Tetrazyklin enthielten, überführt, und
die Frequenz der Tetrazyklin-resistenten Klone konnte berechnet
werden.
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Resultate
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Wie
oben gezeigt ist, konnten höhere
Rekombinationsfrequenzen unter Verwendung der FIND-Prozedur der vorliegenden
Erfindung unter Verwendung von Einzelstrang-DNS bei der Fragmentierung
erreicht werden. Die Exonuklease BAL31 ist vornehmlich eine 3'-Exonuklease, die
Mononukleotide von beiden der 3'-Termini
der beiden Stränge einer
linearen Doppelstrang-DNS
entfernt. Jedoch kann BAL31 auch die einzelstrangigen DNS-Enden abbauen,
die durch die 3'-Exonukleaseaktivität an der
Doppelstrang-DNS erzeugt werden. Die Aktivität von BAL31 auf Einzelstrang-DNS
ist die Entfernung von Mononukleotiden nur von den 5'-Termini. Die Verwendung
von BAL31 für
die Fragmentierung von Einzelstrang-DNS und das dann wieder Zusammensetzen
zu Genen voller Länge
resultiert theoretischerweise in eine Überkreuzung pro Gen. Experimente
wurden deshalb durchgeführt,
um unterschiedliche Exonukleasen für die Fragmentierung von Einzelstrang-DNS
zu testen. Exonuklease I weist nur 3'-Aktivität auf, während BAL31-, T7 Gen 6- und RecJ-Exonukleasen
nur 5'-Aktivität aufweisen.
Exonuklease V und Exonuklease VII haben Aktivität von beiden Enden (5' und 3'). Um zu zeigen,
dass diese Exonukleasen in dem Fragmentierungsschritt in einem FIND-Experiment
verwendet werden können und
funktionale rekombinierte Gene ergeben, wurde ein Modellsystem basierend
auf Tetrazyklinresistenzgenen verwendet.
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Es
wurde herausgefunden, dass BAL31 (25a)
sowie Exonuclease I (25b) und T7 Gen 6-Exonuklease
(25c) alle gut bei der FIND-Prozedur arbeiteten,
und eine Abhängigkeit der
Rekombinationsfrequenz von der Fragmentierungsdauer wurde beobachtet.
-
Wenn
nur eine Exonuklease, die Einzelstrang-DNS nur von einem Ende aufschließt, verwendet
wird, kann in der Theorie nur eine Überkreuzung erreicht werden.
Es wurde jedoch herausgefunden, dass weitere Überkreuzungen erhalten werden können, wenn
die DNS-Fragmente
von der Behandlung durch unterschiedliche Exonukleasen kombiniert
wurden. Exonuklease V- und Exonuklease VII-Behandlung resultieren
in kleinere Fragmente ohne die 5'- und 3'-Enden. Diese Enden
sind notwendig, um das rekombinierte Material in der letzten PKR-Reaktion zu vervielfachen.
Diese DNS-Fragmente können
deshalb mit der DNS kombiniert werden, die von den 5'- oder 3'-Enden aufgeschlossen wurde.
Das Resultat solch einer Kombination kann in 25d gesehen
werden, wo Einzelstrang-DNS behandelt mit Exonuklease I für 10 Minuten
mit Einzelstrang-DNS behandelt mit Exonuklease V für 40 und 50
Minuten kombiniert wurde. Funktionale Klone von bis zu 40% wurden
erhalten, ein Resultat, das mit dem Maximum von 25% verglichen werden
sollte, das bei demselben System unter Verwendung nur eines Enzyms
erreicht wird (25a-c). Es sind auch Fragmente
von der Exonuklease I- und Exonuklease VII-Behandlung kombiniert
worden, und Fragmente von der T7 Gen 6-Exonuklease- und Exonuklease VII-Behandlung,
zu unterschiedlichen Zeitpunkten, und funktionale rekombinierte
Klone konnten erhalten werden (Daten nicht gezeigt).
-
Beispiel 6 – Aufschluss von Unterpopulationen
von Einzelstrang-DNS-Ausgangsmaterial mit unterschiedlichen Exonukleasen
(weitere Experimente)
-
In
einem separaten Satz von Experimenten wurden Mehrfachüberkreuzungen
durch Kombinieren von Fragmenten, die durch Aufschließen von
Einzelstrang-DNS mit Exonuklease I erhalten wurden, mit Fragment,
das durch Aufschließen
von Einzelstrang-DNS mit Exonuklease V und/oder Exonuklease VII
erhalten wurde, produziert.
-
Exonuklease
I (ExoI) hat nur 3'-Aktivität, während Exonuklease
V (Exo V) und Exonuklease VII (Exo VII) Aktivität von beiden Enden (5' und 3') aufweisen. Somit
wird Exo V- und Exo VII-Behandlung
in kleinere Fragmente ohne 5'-
und 3'-Enden resultieren.
Diese Enden sind notwendig, um das rekombinierte Material in der
letzten PKR-Reaktion zu vervielfachen. Diese DNS-Fragmente können deshalb
mit DNS kombiniert werden, die nur vom 5'- oder 3'-Ende aufgeschlossen wurde.
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Eine
equimolare Mischung der drei scFv-Gene wurde bei der Fragmentierung
mit ExoI, ExoV und ExoVII verwendet. Unterschiedliche Kombinationen von
fragmentiertem Material wurden gemischt und durch PKR in Gene voller
Länger
wieder zusammengebaut und letztlich sequenziert (26a-d). ExoI verhielt sich ähnlich wie BAL31 mit bis zu
40% Klonen mit einer Rekombination (26a).
Die Kombination von ExoI mit ExoV oder ExoVII erhöhte die
Anzahl von Überkreuzungen
auf bis zu fünf
Rekombinationen (26a bzw. c). ExoVII scheint
effizienter als ExoV zu sein, die ExoI/ExoVII-Kombination erzeugte Rekombinationen
in über
75% der Klone. Letztlich wurde eine Kombination von fragmentierter
DNS von allen drei Enzymen gemischt, die Rekombinationen (1 bis
4) in nahezu allen Klonen erzeugte, nur 7 von ihnen waren Wildtypgene.
Weiterhin waren längere Fragmentierungszeiten
am effizientesten (26d). In diesem speziellen Fall
bestehen die scFv-Gene aus großen
Bereichen vollständiger
Homologie (Grundgerüstregionen),
was bedeutet, dass die Anzahl von identifizierten Rekombinationen
(bis zu 4) diejenigen waren, die identifiziert werden konnten, d. h.
die tatsächliche
Anzahl an Rekombinationen mag viel höher sein.
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Beispiel 7 – Vergleich der Effekte des
Aufschlusses von Einzelstrang-DNS mit einer Exonuklease mit den Effekten
des Aufschlusses von Doppelstrang-DNS mit einer Endonuklease
-
Die
Experimente in 27 wurden durchgeführt durch
Rekombinieren von Genen, die drei unterschiedliche scFv kodieren,
unter Verwendung von entweder Einzelstrang-DNS und Exonukleasebehandlung
oder Doppelstrang-DNS und Endonukleasebehandlung.
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Endonukleaseaufschluss
von Doppelstrang-DNS wurde durchgeführt unter Verwendung von DNase
I, wie in Stemmer et al., 1994, Nature 370: 389-391. Exonukleaseaufschluss
von Einzelstrang-DNS wurde durchgeführt unter Verwendung von ExoI,
ExoV und ExoVII, wobei equimolare Mischungen von Fragmenten von
ExoI (10 Minuten Reaktionszeit), ExoV (30 Minuten Reaktionszeit)
und ExoVII (30 Minuten Reaktionszeit) in Rekombinationsreaktionen
verwendet wurden.
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Die
Anzahl von Rekombinationen wurde unter Anwendung von Sequenzieren
ausgewertet. Das Resultat zeigt, dass der Einzelstrang-DNS/Exonukleaseaufschluss
weniger Wildtypklone und mehr Rekombinationen ergibt.