ES2284275T3

ES2284275T3 - Nuevos pseudodipeptidos acilados, su procedimientos de preparacion y las composiciones farmaceuticas que los incluyen.

Info

Publication number: ES2284275T3
Application number: ES99957636T
Authority: ES
Inventors: Jacques Bauer; Olivier Richard Martin
Original assignee: OM Pharma SA
Current assignee: OM Pharma SA
Priority date: 1998-06-30
Filing date: 1999-06-23
Publication date: 2007-11-01
Anticipated expiration: 2019-06-23
Also published as: KR100766016B1; AU761396B2; US20060148678A1; US7157092B1; EE04489B1; CN1168702C; EP1091928A1; AR029877A1; KR20010083078A; CZ20004893A3; DK1091928T3; ATE355266T1; JP2002519338A; HUP0102475A3; HUP0102475A2; CA2337807A1; DE69935330T2; PL345040A1; WO2000000462A1; BR9911329A

Abstract

Los compuestos de fórmula general I: en la cual: - R1 y R2 representan cada uno un grupo acilo derivado de un ácido carboxílico que tiene de 2 a 24 átomos de carbono, saturado o insaturado, lineal o ramificado, no sustituido o que lleva uno o más substituyentes seleccionados entre el grupo formado por hidroxilo, alquilo, alcoxilo, acil-oxilo, amino, acil-amino, aciltio y (alquil C1-C24)-tio el descriptor m tiene un valor que oscila entre 1 y 4, - el descriptor n tiene el valor de 0, - el descriptor p tiene el valor 3 ó 4 y q tiene un valor de 1 - X e Y representan cada uno un hidrógeno o un grupo fosfono, con la limitación de que uno al menos de los substituyentes X e Y representa un grupo fosfono.

Description

Nuevos pseudodipéptidos acilados, su procedimiento de preparación y las composiciones farmacéuticas que los incluyen.

La presente invención se refiere al ámbito de la química y más particularmente al ámbito de la química terapéutica. La misma tiene más particularmente por objeto pseudodipéptidos derivados de ácidos aminados hidroxilados, cuyas funciones amina libres se amidifican mediante ácidos grasos.

La invención tiene específicamente por objeto los pseudodipéptidos N-acilados de los cuales al menos un grupo hidroxilo es esterificado por un grupo ácido en forma neutra o cargada, que responde a la fórmula general I.

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en la cual:

-: R_{1} y R_{2} representan cada uno un grupo acilo derivado de un ácido carboxílico que tiene de 2 a 24 átomos de carbono, saturado o insaturado, lineal o ramificado, no sustituido o que lleva uno o más substituyentes seleccionados entre los hidroxilo, alquilo, alcoxilo, acil-oxilo, amino, acil-amino, aciltio y (alquil C_{1}-C_{24})-tio

-: el descriptor m- tiene un valor que oscila entre 1 y 4.

-: el descriptor n tiene el valor de 0

-: el descriptor p tiene el valor 3 ó 4 y q es igual a 1

-: X e Y representan cada uno un hidrógeno o un grupo fosfórico en forma neutra o cargada,

con la limitación de que uno al menos de los substituyentes X e Y representa un grupo ácido en forma neutra o cargada.

Cuando los substituyentes X y/o Y representan un grupo ácido en forma neutra, se trata de la forma fosfórica libre. Cuando se trata de un grupo ácido en forma cargada se trata de la forma fosfórica salificada, particularmente mediante adición de una base mineral u orgánica, de preferencia terapéuticamente compatible. Cuando las bases no son terapéuticamente compatibles, las mismas pueden servir de medio de identificación, de purificación o de desdoblamiento.

Entre las bases salificantes terapéuticamente compatibles se citarán particularmente las bases alcalinas como los hidróxidos de sodio, de potasio, de litio, las sales de amonio; las bases alcalinotérreas como los hidróxidos de calcio o de estroncio, las sales de magnesio, las sales de metales ferrosos y similares, las bases orgánicas como las derivadas de aminas primarias, secundarias o terciarias como la metil-amina, la dietil-amina, la monoetanol-amina, la dietanol-amina, la bencil-amina, la N-metil-bencil-amina, la veratril-amina, la trimetoxi-bencil-amina, aminoácidos de reacción básica como la lisina o la ornitina o azúcares aminados.

Bases no utilizables terapéuticamente son por ejemplo la brucina, la estricnina, la agmatina, la homarina, la glucosamina, la N-metil-glucosamina o la N-metil-morfolina. Como se ha indicado anteriormente las sales resultantes servirán como medio de separación o de identificación.

-: Cuando m es igual a 1 y n es igual a 0, la molécula se deriva de la serina.

-: Cuando m es igual a 2 y n es igual a 0, la molécula se deriva de la homoserina.

-: Cuando m es igual a 3 y n es igual a 0, se trata de un derivado de la pentahomoserina.

-: Cuando m es igual a 4 y n es igual a 0, se trata de un derivado de la hexahomoserina.

-: Cuando p es igual a 3 y q es igual a 1, puede tratarse de un derivado de la citrulina o de la ornitina o de la arginina.

-: Cuando p es igual a 4 y q es igual a 1, puede tratarse de un derivado de la homoarginina o de la lisina.

Entre los pseudodipéptidos objeto de la invención, se retendrán particularmente como compuestos actualmente preferidos:

-: los 1 y/o 10-di-bifosfato de 3-(3-dodecanoiloxi-tetradecanoil-amino)-9-(3-hidroxi-tetradecanoil-amino)-4-oxo-5-azadecano-1,10-dioles y sus sales de adición con una base mineral u orgánica.

-: el 1,10-bis-(di-bifosfato) de 3-(3-dodecanoiloxi-tetradecanoil-amino)-9-(3-hidroxi-tetradecanoil-amino)-4-oxo-5-azadecano-1,10-diol y sus sales de adición con una base mineral u orgánica.

-: el 1,10-bis-(di-bifosfato) de 3-(3-hidroxi-tetradecanoil-amino)-9-(3-dodecanoiloxi-tetradecanoil-amino)-4-oxo-5-azadecano-1,10-diol y sus sales de adición con una base mineral u orgánica.

-: el 1-di-bifosfato de 3-(3-dodecanoiloxi-tetradecanoil-amino)-9-(3-hidroxi-tetradecanoil-amino)-4-oxo-5-azadecano-1,10-diol y sus sales de adición con una base mineral u orgánica.

-: el 1-di-bifosfato de 3-(3-hidroxi-tetradecanoil-amino)-9-(3-dodecanoiloxi-tetradecanoil-amino)-4-oxo-5-azadecano-1,10-diol y sus sales de adición con una base mineral u orgánica.

-: el 10-di-bifosfato de 3-(3-hidroxi-tetradecanoil-amino)-9-(3-dodecanoiloxi-tetradecanoil-amino)-4-oxo-5-azadecano-1,10-diol y sus sales de adición con una base mineral u orgánica.

La definición de R_{1} y R_{3} abarca los derivados acilados con cadena de longitud variable, idénticos o diferentes, ramificados o de cadena lineal, saturados o insaturados, que pueden llevar uno o varios substituyentes seleccionados entre el grupo formado por un alquilo, amino, acil-amino, hidroxilo, alcoxilo, acil-oxilo, aciltio y alquiltio.

Ejemplos de tales derivados acilados sustituidos, son el radical ricinoleilo, 12-hidroxi-estearoilo, 2-hidroxi-3-metil-butiroilo, 3-hidroxi-2-amino-pentanoilo, palmitoleilo, elaidilo, eleoestearoilo, araquidoilo, araquidonilo, gadoleilo, behenilo, erucilo, 8-metil-decanoilo, 9-metil-decanoilo, docosahexaenoilo o eicosapentaenoilo.

Entre los grupos acilo en cuestión, el ácido 3-hidroxi-mirístico y el ácido 3-lauriloxi-mirístico son los actualmente preferidos.

Los compuestos de fórmula general I y especialmente los compuestos mono- y difosforilados designados bajo el nombre de código OM-294-MP (MP) y OM-294-DP (DP), respectivamente, se distinguen por propiedades farmacológicas interesantes, particularmente inmunomoduladoras. Encuentran un interés particular en la terapéutica de las enfermedades relacionadas con una deficiencia de las defensas inmunitarias o con una exageración de las respuestas inmunitarias, según las dosis utilizadas.

La invención tiene por consiguiente por objeto pseudodipéptidos derivados de ácidos aminados hidroxilados, cuyas funciones amina libres se amidifican mediante ácidos grasos y que presentan propiedades biológicas, particularmente inmunomoduladoras mejoradas con relación a la técnica anterior.

La presente invención tiene precisamente por objeto los pseudodipéptidos concebidos como análogos de lípidos A. Los lípidos A son entidades moleculares de tipo glicolípido que forman la fijación lipídica del lipopolisacárido (LPS) en la membrana celular de las bacterias Gram(-). Estas son responsables de la muy fuerte actividad inmunoestimuladora del LPS (Rietschel et al. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1996, 216, 39; Zaehringer, U et al. Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 1994, 50, 211). Los lípidos A y sus análogos presentan actividades biológicas interesantes como inmunomoduladores y anticancerosos (Shiba & Kotani, (Daiichi Seiyaku Co.), patente JP 61 227 586 A; Hasegawa et al. (Toho Pharmaceutical Industries) patente EP 224.260; Kodama et al. (Suntory Ltd), patente EP 688 289) pero se caracterizan generalmente por una fuerte endotoxicidad. El derivado de lípidos A conocido bajo el nombre de código OM-174 (lípido A de E. Coli des O-acilado) es de un interés particular debido a su muy baja toxicidad y a las actividades inmunomoduladora, antitumoral y como adyuvante importantes (Davies, Bauer, Hirt, Schulthess (Laboratoires OM S.A.) patente WO 95 14026). La complejidad de los lípidos A y su toxicidad han estimulado la investigación de análogos sintéticos simplificados como por ejemplo los compuestos híbridos O-glicosil-aminoácidos N- y O-acilados descritos por Achiwa et al. (Chem. Pharm. Bull. 1994, 42, 2526; 1997, 45, 312; 1997, 45, 1089). Los pseudodipéptidos N-acilados de la invención constituyen una familia nueva de análogos sintéticos de lípidos A desprovistos de toxicidad y presentando un grado elevado de propiedades inmunomoduladoras.

Es importante a este respecto señalar el papel importante que juega el óxido nítrico (NO) y las especies oxigenadas reactivas tales como el anión superóxido en la regulación de los fenómenos inmunológicos. Estas actividades han sido ya ampliamente descritas en la literatura (Bogdan, C. Nature Immunol. 2001, 2, 907-916 y ref. citadas).

El óxido nítrico induce múltiples efectos moduladores sobre la inflamación y sobre las respuestas inmunitarias.

-: En los tejidos animales, NO es generado por sintaxis (NOS) que oxidan la L-arginina en L-citrulina. Existen diferentes isoformas de NOS, de las cuales la NOS inductible (iNOS ó NOSII) presenta en los macrófagos, los monocitos y otros tipos celulares que participan en la inflamación. El inductor de NOS es el LPS.

-: La interacción de los Lipopolisacáridos (LPS) con su receptor TLR4 desencadena una cascada de acontecimientos que llevan a la activación de NFkB, que es responsable de la transcripción del enzima iNOS. El óxido nítrico NO producido por los macrófagos activados inmunológica o químicamente, presenta una actividad antimicrobiana, igualmente atribuida a la formación de peroxi-nitrito (ONOO).

Además de su papel de actuador directo, NO sirve de potente factor inmuno-regulador. Se describe principalmente como inhibidor de la expresión de genes implicados en la proliferación celular y, en particular, del subtipo Th1 de células T de ayuda (T Helper cells). NO inhibiría también la secreción de citoquinas por estos linfocitos T en los procesos inflamatorios.

Una revisión general ha sido publicada por JW. Coleman (International Immunopharmacology 2001, 2, 1397-1406). La misma hace referencia a publicaciones anteriores al depósito de la presente solicitud de patente y particularmente a:

-: Wink (Curr. Top. Cell. Regul. 1996, 34, 159-87).

-: Taylor-Robinson (Eur. J. Immunol. 1994, 24, 980-4).

-: Bauer H (Immunology 1997, 90, 205-11).

-: Fehsel K (J. Immunol. 1995, 155, 2858-65).

Debido, en particular, a su actividad estimuladora de la producción de NO. Los compuestos de la presente solicitud deben considerarse como agentes capaces de modular la respuesta inmunitaria del organismo y es en este ámbito cuando los compuestos de la invención encuentran una utilización como medicamento.

La invención se refiere a un procedimiento de obtención de los fosfo-pseudodipéptidos de fórmula general I.

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en la cual:

-: R_{1} y R_{2} representan cada uno un grupo acilo derivado de un ácido carboxílico que tiene de 2 a 24 átomos de carbono, saturado o insaturado, lineal o ramificado, no sustituido o que lleva uno o varios substituyentes hidroxilo, alquilo, alcoxilo, acil-oxilo, amino, acil-amino, aciltio y (alquil C_{1}-C_{24})-tio

-: el descriptor m toma un valor que oscila entre 1 y 4

-: el descriptor n toma el valor de 0

-: el descriptor p presenta un valor igual a 3 ó 4 y q es igual a 1

-: en la cual X e Y representan cada uno un hidrógeno o un grupo dihidroxi-fosforilo

que consiste en que se bloquean las funciones amina en posición (q+1) y en \omega de un ácido diaminado de fórmula H_{2}N(CH_{2})_{p}CHNH_{2}(CH_{2})_{q-1}COOH mediante reactivos de bloqueo lábiles por acidolisis y/o hidrogenolísis, respectivamente, se somete la función carboxílica que queda libre a la acción de un agente reductor para formar el alcohol correspondiente, se libera la función amina en (q+1) que se acila con la ayuda de un derivado funcional de un ácido carboxílico de fórmula R_{2}OH en la cual R_{2} se define como anteriormente, luego se libera la función amina terminal mediante hidrogenolísis para obtener el amino alcohol de fórmula general II:

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en la cual:

-: R_{2} representa un grupo acilo derivado del ácido carboxílico que tiene de 2 a 24 átomos de carbono, saturado o no saturado, no sustituido o que lleva uno o varios substituyentes definidos como anteriormente,

-: p presenta un valor de 3 ó 4 y q es igual a 1,

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que se condensa en presencia de un agente de condensación peptídico en un disolvente inerte con un derivado funcional de \omega-hidroxi aminoácido de fórmula general III:

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en la cual:

-: R_{1} es un grupo acilo derivado de un ácido carboxílico que tiene de 2 a 24 átomos de carbono, saturado o no saturado, no sustituido o que lleva uno o varios substituyentes

-: m es un número entero que varía de 1 a 4,

-: n es un número igual a 0

-: y X es un radical diariloxi-fosforilo de fórmula:

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\quad: en la cual R es un radical arilo lábil por hidrogenolísis para formar el pseudodipéptido de fórmula general IV:

6

\quad: en la cual los substituyentes R_{1}, R_{2} y los descriptores m, n, p y q están definidos como anteriormente, y R es un radical lábil por hidrogenolísis, definido como anteriormente,

del cual se puede -si se desea- fosforilar la otra función alcohol mediante un agente de fosforilación en presencia de un agente de copulación, si es necesario, y someter a una hidrogenación catalítica por una parte para desbloquear la función alcohol eventualmente presente en el grupo acilo R_{2} y por otra parte liberar la función fosfato y luego desbloquear por hidrogenolísis la segunda función fosfato eventualmente presente, con el fin de obtener el derivado de fórmula general V

7

\quad: en la cual Y representa bien sea un hidrógeno o un grupo fosfono

y si se desea, se realiza la etapa suplementaria de salificación con la ayuda de una base mineral u orgánica.

La estereoquímica de los centros portadores de grupos acil-amino redetermina por la configuración de los ácidos aminados de partida y la de los grupos acil-amino por la configuración de los ácidos grasos de partida. Se puede partir de un diaminoácido de configuración L ó D o racémico. Se puede partir de un ácido aminado hidroxilado de configuración L, D o racémico. Todos estos estereoisómeros o diastereoisómeros forman parte de la invención. El procedimiento según la invención puede también definirse por las modalidades de realización siguientes, actualmente preferidas representadas en los Esquemas de síntesis 1 y 2:

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-: El bloqueo de la función amina en \omega en la cadena de un derivado de ornitina se realiza mediante N-benciloxi-carbonilación después de la reacción inicial de la función ácida con una sal de cobre, en medio alcalino, reacción de este carboxilato de cobre con cloro-formiato de bencilo y liberación de la función carboxílica por quelación del cobre en medio ácido, para obtener el derivado N-benciloxi-carbonilado, según un método descrito en "Organic Preparations and Procedures Internacional 23 (1992) 191-194".

-: El bloqueo de la función amina en \alpha del carboxilo del derivado de ornitina se realiza por t-butiloxi-carbonilación por medio de un pirocarbonato de alquilo como el pirocarbonato de t-butilo en medio básico. El pirocarbonato de t-butilo reacciona con la función amina proximal para formar el derivado \omega-benciloxi-carbonil-amino \alpha-t-butiloxi-carbonil-amino-carboxílico.

-: La conversión de la función carboxílica en función alcohol primario se realiza aplicando el método descrito en Tetrahedron Letters 32 (1991)-923-926 que consiste en que se hace reaccionar el derivado carboxílico con un cloro-formiato de alquilo, como el cloro-formiato de isobutilo, para formar un anhídrido mixto que se reduce por medio de un borohidruro de metal alcalino o alcalinotérreo, para conducir al derivado hidroxilado correspondiente, portador de una función alcohol primario.

-: La eliminación del grupo t-butiloxi-carbonilo en \alpha se realiza por la acción del ácido trifluoro-acético que conduce al mismo tiempo a la formación del trifluoro-acetato de la función amina.

-: La acilación de la función amina en \alpha de la función alcohol se realiza al inicio de la sal trifluoro-acética por medio de un anhídrido mixto preparado a partir del ácido R_{2}OH y de un cloro-formiato de alquilo.

-: La liberación de la función amina terminal se realiza por hidrogenolísis en presencia de un catalizador a base de metal noble como el paladio sobre carbón o el iridio.

-: La copulación peptídica entre el compuesto aminado de fórmula II y el derivado fosforilado de fórmula III se realiza en presencia de un agente de copulación tal como la 1-isobutiloxi-2-isobutiloxi-carbonil-1,2-dihidroquinoleína en un disolvente inerte tal como un disolvente halogenado, o utilizando una carbodiimida. Se obtiene así un pseudodipéptido de fórmula general (V) cuya función hidroxilo eventualmente llevada por el grupo acilo R_{2}, es bloqueada.

-: La liberación de la función hidroxilo del grupo acilo R_{2} interviene por hidrogenolísis en presencia de un metal noble como el paladio sobre carbón.

-: La liberación del grupo fosfórico X se realiza por hidrogenación catalítica en presencia de óxido de metal noble como el óxido de platino.

-: La fosforilación del derivado pseudodipéptico IV se realiza en dos etapas (Helv. Chim. Acta 70 (1987), 175). En una primera etapa el compuesto IV se somete a la acción de una N,N-dialquil-fosforamidita de dialquilo o de diarilo, en presencia de un agente de copulación tal como el [1H]-tetrazol en un disolvente polar tal como el tetrahidro-furano; el fosfito así formado se oxida seguidamente en fosfato con la ayuda de un ácido peroxi-carboxílico aromático como por ejemplo el ácido peroxi-ftálico, el ácido m-cloro-perbenzoico o el ácido nitro-perbenzoico. La liberación del grupo fosfórico Y se realiza por hidrogenación catalítica en presencia de un metal noble como el paladio sobre carbón.

-: La fosforilación del derivado de la homoserina se realiza con la ayuda de un halogenuro de difenil-fosforilo en presencia de piridina y de una N,N-dialquil-amino-piridina (Helv. Chim. Acta 58 (1975), 518), después del bloqueo de la función amina por t-butoxi-carbonilación por medio del pirocarbonato de t-butilo en medio básico y bloqueo de la función carboxilo después de la formación de una sal de cesio, y bencilación con la ayuda de un halogenuro de bencilo en la dimetil-formamida o la dimetil-acetamida.

-: La acilación del nitrógeno del derivado de homoserina se realiza después de la desprotección de la función amina mediante el ácido trifluoro-acético para obtener la sal trifluoro-acética de la amina, y reacción con un anhídrido mixto resultante de la reacción entre el ácido carboxílico R_{1}OH y un cloro-formiato de alquilo en presencia de una amina reactiva tal como la N-metil-morfolina.

La invención se refiere también a los productos intermediarios de fórmula general II, y de fórmula general III, en forma enantioméricamente pura o en forma racémica.

La invención se refiere también a las composiciones farmacéuticas que incluyen a título de principio activo al menos un compuesto de fórmula general I, como se ha definido anteriormente, en forma neutra o cargada, en asociación o en mezcla con un excipiente o un vehículo inerte, no tóxico, farmacéuticamente aceptable.

La invención se refiere más particularmente a las composiciones farmacéuticas que incluyen a título de principio activo al menos una sal de un compuesto de fórmula general I, con una base mineral u orgánica terapéuticamente compatible.

La invención se refiere también a las composiciones farmacéuticas a base de un compuesto de fórmula general I, en forma enatioméricamente pura o en forma racémica, en asociación o en mezcla con un excipiente o un vehículo farmacéutico.

Entre las formas farmacéuticas consideradas se podrán citar las que son adecuadas para la vía digestiva, parenteral, por inhalación, por vía tópica, transdérmica o permucosa, como por ejemplo los comprimidos, las grageas, las cápsulas, los solutos o suspensiones inyectables, los aerosoles, los geles, los emplastos o los solutos penetrantes.

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Las composiciones farmacéuticas según la invención encuentran una utilización como vector de molécula de interés terapéutico por sus propiedades de asociación no-covalente de naturaleza hidrófila e hidrófoba. Su carácter anfifilo favorece las formulaciones y el transporte de las moléculas de interés terapéutico hacia los receptores membranares, así como hacia las paredes y el citoplasma celulares. Pueden ser utilizados solos o en asociación con una molécula de interés terapéutico por vía oral, parenteral, rectal, tópica, percutánea, o permucosa. Pueden ser utilizados solos o en asociación con una molécula de interés terapéutico por incubación extratemporáneamente ex vivo con células sanguíneas con el fin de hacer las células inmunocompetentes, antes de reinocularlas in-vivo por vía parenteral.

-: Las moléculas MP y DP muestran las propiedades similares, como adyuvantes del sistema inmunitario utilizado por ejemplo para la vacunación, en asociación con los antígenos apropiados, contra enfermedades de origen viral, parasitario, microbiano o fúngico. Por el contrario, los compuestos según la invención muestran propiedades fundamentalmente diferentes en su capacidad para inducir la producción de citoquinas o la maduración de las células cepa inmunocompetentes procedentes de los órganos hematopoyéticos y linfoides.

-: El compuesto MP favorece la maduración y la diferenciación de los monocitos en células dendríticas funcionales, en presencia o en ausencia del antígeno apropiado y contribuye así a reforzar la inmunidad humoral y celular. El compuesto DP muestra por su parte propiedades anti-tumorales.

-: Las composiciones según la invención son particularmente interesantes debido a su baja toxicidad. Las mismas se utilizan en terapéutica humana o animal en dosis que varían de 1 a 100 mg de principio activo por toma unitaria y de 1 a 300 mg de principio activo por día.

Los ejemplos siguientes ilustran la invención sin limitarla sin embargo. Están presentes en los esquemas de síntesis 1 a 6.

Ejemplo I

Ácido 4-(difeniloxi-fosforiloxi)-2-[(R)-3-dodecanoiloxi-tetradecanoil-amino]-butanoico 1. N_{\alpha}-t-butiloxi-carbonil-DL-homoserina

Se disolvieron 2 g de homoserina (16,78 mmoles) en 20 ml de agua y se adicionaron a esta solución 16,78 ml de NaOH 1M y 3,006 g de carbonato de cesio (9,23 mmoles). Después de 5 minutos de agitación, la solución se dejó enfriar en un baño de agua y de hielo. Se añadieron entonces 60 ml de dioxano y pirocarbonato de t-butilo. La mezcla de reacción se mantuvo bajo agitación en un baño de agua helada durante una hora y luego a temperatura ambiente durante 5 horas. El disolvente se eliminó seguidamente a vacío. El residuo seco se utilizó directamente para la etapa siguiente.

2. N_{\alpha}-t-butiloxi-carbonil-DL-homoserinato de bencilo

Al residuo de la fase 1, se añadieron 20 ml de dimetil-formamida y se realizó la evaporación a sequedad y luego se adicionaron al medio de reacción 60 ml de dimetil-formamida y 4,5 ml de bromuro de bencilo (20,13 mmoles). Se formó entonces un precipitado blanco. La mezcla se mantuvo bajo agitación durante 16 horas. El disolvente fue seguidamente eliminado a vacío. El residuo se agotó con 2 veces 20 ml de acetato de etilo. La fase orgánica se lavó con agua (20 ml) luego con una solución salina (20 ml) respectivamente, y luego se secó sobre sulfato de magnesio anhidro. El disolvente se evaporó y el residuo se utilizó tal cual para la etapa siguiente.

3. N_{\alpha}-t-butiloxi-carbonil-O-(difeniloxi-fosforil)-DL-homoserinato de bencilo

El residuo de la etapa precedente se secó a vacío impulsado y luego se disolvió en cloruro de metileno (60 ml). Se añadieron entonces 4,11 g de 4-dimetil-amino-piridina (33,56 mmoles) en la solución, la mezcla de reacción se agitó durante 10 minutos, y se añadieron entonces 12 ml de piridina y 6,95 ml de cloro-fosfato de difenilo (33,56 mmoles). La solución se agitó a temperatura ambiente durante 18 horas y luego se lavó con ácido clorhídrico N (5 x 20 ml), agua (30 ml) y mediante una solución salina (30 ml). La fase orgánica se secó sobre sulfato de magnesio anhidro, el disolvente se eliminó a vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía instantánea (hexano/acetato de etilo = 4 : 1). La fracción principal se concentró y el residuo se cristalizó. Se obtuvieron así 7,49 g de producto fosforilado o sea un rendimiento de un 82,4%. Punto de fusión : 63,5/64,0ºC.

4. O-(difeniloxi-fosforil)-DL-homoserinato de bencilo

El producto fosforilado de la etapa precedente (7,88 g o sea 15,4 mmoles) se disolvió en 15 ml de ácido trifluoro-acético y la solución se mantuvo bajo agitación a temperatura ordinaria durante 2,5 horas. El disolvente se eliminó entonces bajo vacío impulsado, el residuo seco se purificó por cromatografía instantánea (MeOH/CH_{2}Cl_{2} = 10 : 1). La fracción principal se concentró y el residuo se cristalizó a temperatura ordinaria. Se obtuvieron así 7,17 g de producto fosforilado (rendimiento 88,9%). Se utilizó sin otra purificación para la etapa siguiente.

5. 2-[(R)-3-dodecanoiloxi-tetradecanoil-amino]-4-(difeniloxi-fosforiloxi)-butanoato de bencilo

4,284 g (10,07 mmoles) de ácido (R) 3-dodecanoiloxi-tetradecanoico preparado según el método descrito en Bull. Chem. Soc. Jpn 60 (1987), 2205-2214 se disolvieron en 30 ml de tetrahidro-furano y la solución se puso a refrigerar hasta -15ºC en un baño de salmuera helada. Se añadieron entonces 1,108 ml (10,07 mmoles de N-metil-morfolina y 1,31 ml (10,07 mmoles) de cloro-formiato de isobutilo. Se continuó la agitación durante 30 minutos. Se añadieron entonces a la mezcla de reacción 5,724 g (10,07 mmoles) de O-(difeniloxi-fosforil)-DL-homoserinato de bencilo en una mezcla de 30 ml de tetrahidro-furano y 5 ml de trietil-amina. Después de agitación durante una noche a temperatura ambiente, el disolvente se eliminó a vacío y se añadieron 20 ml de agua al residuo. La mezcla se agotó seguidamente con acetato de etilo (2 x 30 ml). Las fases orgánicas se combinaron, se lavaron sucesivamente con agua (20 ml) y con salmuera (20 ml) y se secaron sobre sulfato de magnesio. El disolvente se evaporó y el residuo se purificó por cromatografía instantánea (hexano/acetato de etilo 2:1, Rf = 0,29); rendimiento 7,455 g o sea un 87,1%. PF = 31,0º/32,1ºC. ^{1}H-RMN (CDCl_{3}, 250 MHz), \delta en ppm: 7,4-7,1 (m, 15H), 6,90 (2d, 1H, ^{3}J=7,6 Hz, NH), 5,3-5,1 (m, 3H), 4,7 (m, 1 H), 4,35 (m, 2H), 2,45 (m, 2H), 2,4-2,1 (m, 4H), 1,6 (m, 4H), 1,4-1,1 (m, 34H), 0,9 (t, 6H). ^{13}C-RMN (CDCl_{3}, 63 MHz), \delta en ppm: 173,01, 171,08, 169,66, 150,18 (d, ^{2}J_{P,C}=7,1 Hz), 135,01, 129,60, 128,33, 128,14, 127,96, 125,21, 119,80 (d, ^{3}J_{P.C}=5,0 Hz), 70,69, 67,05, 65,19 (d, ^{2}J_{P.C}=5,6 Hz), 49,13, 40,97, 40,77 (2 diast.), 34,20, 33,98, 33,82, 31,70, 29,42, 29,34, 29,14, 28,94, 25,01, 24,77, 22,47, 13,91.

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6. Ácido 4-(difeniloxi-fosforiloxi)-2-[(R)-3-dodecanoiloxi-tetradecanoil-amino]-butanoico

Se preparó una solución del éster bencílico obtenido en la etapa 5 (2,23 g o sea 2,6 mmoles) en 300 ml de metanol HPLC en un matraz de tres bocas y se añadió 1,0 g de carbón paladiado al 10% de paladio. Se purgó el contenido del matraz para eliminar al aire, a vacío, y luego el matraz se cargó con hidrógeno a presión atmosférica. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora, el catalizador se eliminó seguidamente rápidamente por filtración sobre membrana y el filtrado se concentró para proporcionar un jarabe incoloro. Este es homogéneo en cromatografía en capa fina y en RMN, y se utilizó directamente sin purificación suplementaria para la etapa de copulación, Rf = 0,75 (diclorometano/metanol/trietil-amina, 10:1:0,5). ^{1}H-RMN (CDCl_{3}, 250 MHz), \delta en ppm: 7,4-7,1 (m, 10H), 6,85 (d, 1H, NH), 5,15 (m, 1H), 4,6 (m, 1H), 4,35 (m, 2H), 2,45 (m, 2H), 2,4-2,15 (m, 4H), 1,6 (m, 4H), 1,4-1,1 (m, 34H), 0,9 (t, 6H). ^{13}C-RMN (CDCl_{3}, 63 MHz), \delta en ppm: 173,35, 173,30 (2 diast.), 172,75, 170,37, 150,0 (d, ^{2}J_{P.C}=7,5 Hz), 129,55, 125,28, 119,71 (d, ^{3}J_{P.C}=4,4 Hz), 70,78, 65,65 (d, ^{2}J_{P.C}=5,9 Hz), 49,00, 40,77, 40,63 (2 diast.), 34,13, 33,86, 33,76, 31,59, 29,31, 29,25, 29,03, 28,82, 24,88, 24,68, 22,36, 13,76.

El ácido 4-(difeniloxi-fosforiloxi)-2-[(R)-3-benciloxi-tetradecanoil-amino]-butanoico puede ser obtenido por la misma secuencia de reacciones sustituyendo en la etapa 5 del ejemplo 1, el ácido (R)-3-dodecanoiloxi-tetradecanoico por el ácido (R)-3-benciloxi-tetradecanoico.

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Ejemplo II

(2R)-5-amino-2-[(R)-3-benciloxi-tetradecanoil-amino]-pentan-1-ol 1. Sal de cobre de la D-ornitina

A una solución de D-ornitina (5,25 g o sea 30 mmoles) en 30 ml de hidróxido sódico M, se añadieron 50 ml de una solución de sulfato cuproso pentahidratado (3.814 g o sea 15,3 mmoles) en agua. La agitación se continuó durante 2 horas. Se evaporó entonces el disolvente a sequedad. Se añadieron 60 ml de metanol para formar un sólido de color púrpura que se separó, se lavó con dioxano y con metanol respectivamente.

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2. (2R)-2-amino-5-(benciloxi-carbonil-amino)-pentanoato de cobre

El sólido púrpura se disolvió en 40 ml de sosa M y 70 ml de dioxano, la solución se dejó enfriar en un baño de agua helada y se añadieron 5,14 ml (o sea 36 mmoles) de cloro-formiato de bencilo. La agitación se continuó en un baño de agua helada durante 3 horas y seguidamente a temperatura ordinaria durante 15 horas. El precipitado púrpura se juntó y luego se lavó con etanol al 95% (40 ml), con agua (50 ml) y con etanol (60 ml) respectivamente. El precipitado se secó en estufa (T<45ºC, a vacío); el rendimiento en dos etapas fue de 8,27 g, o sea un 93% con relación a la
teoría.

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3. Ácido (2R)-5-(benciloxi-carbonil-amino)-2-(t-butiloxi-carbonil-amino)-pentanoico

La sal de cobre obtenida en la fase 2 se disolvió en ácido clorhídrico 2M (400 ml) y se añadió el EDTA (8,15 g, 27,8 mmoles). Se agitó la mezcla durante 2,5 horas, y luego se neutralizó a un pH de 7 añadiéndola sosa 5M (aproximadamente 160 ml). Se formó un precipitado blanco. La mezcla se agitó durante 2,5 horas en un baño de agua helada. El precipitado se filtró, se lavó con agua fría hasta que el efluente se volvió incoloro, y luego se secó en estufa por debajo de 60ºC. Este sólido se disolvió en 156 ml de NaOH M y la solución se dejó enfriar en baño de agua helada. A esta solución se añadieron 7,7 g (35,2 mmoles) de pirocarbonato de t-butilo en dioxano (160 ml). La mezcla de reacción se agitó a 0ºC durante 45 minutos y luego durante 16 horas a temperatura ambiente. El disolvente orgánico se evaporó y se añadieron al residuo 70 ml de acetato de etilo. Se aciduló seguidamente la fase acuosa añadiendo ácido clorhídrico 2N hasta un pH de \sim3. La capa acuosa se agotó todavía una vez con 100 ml de acetato de etilo. Las fases orgánicas se combinaron y lavaron con agua (30 ml) y con una solución salina (30 ml). El disolvente se eliminó a vacío con el fin de proporcionar un aceite incoloro después de la purificación por cromatografía instantánea (Rdto.: 8,42 g en dos etapas o sea un 76,7% de la teoría) (Rf=0,19, diclorometano/MeOH 20 : 1).

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4. (2R)-5-(benciloxi-carbonil-amino)-2-(t-butiloxi-carbonil-amino)-pentan-1-ol

A una solución fría (-15ºC) del derivado del ácido diamino-pentanoico obtenido en la fase 3 (5,45 g o sea 14,8 mmoles) en 60 ml de THF, se añadieron 1.654 ml (o sea 14,8 mmoles) de N-metil-morfolina y 9,6 ml (o sea 14,8 mmoles) de cloro-formiato de isobutilo (IBCF). La solución se agitó a -15ºC durante 1 minuto y luego se añadió una solución de borohidruro sódico (5,104 g, o sea 44,6 mmoles) en 10 ml de agua. La agitación se mantuvo a -15º durante todavía 10 minutos y luego se añadieron 400 ml de agua para detener la reacción. La solución se agotó con acetato de etilo (100 ml x 2). Las fases orgánicas se combinaron y lavaron con 50 ml de agua y con 60 ml de solución salina y luego se secaron sobre sulfato de magnesio anhidro. El disolvente se eliminó y el residuo se cristalizó de la mezcla de acetato de etilo/hexano (4,94 g, rendimiento 94,9%) PF = 47,5/48ºC.

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5. Desbloqueo del derivado del 2,5-diamino-pentan-1-ol

Se disolvieron 6,32 g (18 mmoles) de (2R)-5-(benciloxi-carbonil-amino)-2-(t-butiloxi-carbonil-amino)-pentan-1-ol obtenido en la fase 4 en 25 ml de ácido trifluoro-acético y luego se agitaron durante 2,5 horas a temperatura ambiente. El disolvente se evaporó seguidamente y el residuo se purificó mediante cromatografía instantánea (MeOH/CH_{2}Cl_{2} = 10:1). Se obtuvo así una masa vítrea incolora que funde a temperatura ambiente. El rendimiento es de 5,45 g de sal trifluoro-acética (rendimiento = 82,7%). El clorhidrato funde a 133,0/134.3ºC (recristalización del meta-
nol).

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6. (2R)-5-(benciloxi-carbonil-amino)-2-[(R)-3-benciloxi-tetradecanoil-amino]-pentan-1-ol

Se añadieron 5,27 g (15,8 mmoles) a una solución refrigerada a -15ºC de ácido (R)-3-benciloxi-tetradecanoico (Bull. Chem. Soc. Jpn, 60 (1987), 2197-2204) en 30 ml de tetrahidro-furano, 1,89 ml (15,8 mmoles) de N-metil-morfolina y 2,21 ml de IBCF (15,8 mmoles). La mezcla de reacción se mantuvo bajo agitación a -15ºC durante 30 minutos. Se añadieron entonces 5,25 g de sal trifluoro-acética del ejemplo precedente (14,4 mmoles) en 30 ml de tetrahidro-furano y 1,44 ml de trietil-amina a la solución. La agitación se continuó a temperatura ambiente durante 16 horas y luego se añadieron 30 ml de agua y 60 ml de acetato de etilo; la fase orgánica se separó y la fase acuosa se agotó una vez todavía con acetato de etilo (60 ml). Las fases orgánicas se combinaron y lavaron con agua (30 ml) y con una solución salina (30 ml) y luego se secaron sobre sulfato de magnesio anhidro. El disolvente se evaporó y el residuo se recristalizó de una mezcla de acetato de etilo/hexano (5,824 g, o sea un rendimiento del 71,2%), PF = 117,5º/118ºC. Rf = 0,32, acetato de etilo/éter de petróleo 3:1. ^{1}H-RMN (CDCl_{3}, 250 MHz), \delta en ppm: 7,4-7,2 (m, 10H), 6,5 (d, 1H, NH), 5,1 (s, 2H), 4,9 (m, 1H, NH), 4,5 (2d, AB, 2H), 3,8 (m, 2H), 3,5 (m, 2H), 3,1 (m, 2H), 2,4 (m, 2H), 1,6-1,4 (m, 6H), 1,4-1,2 (m, 18H), 0,9 (t, 3H). ^{13}C-RMN (CDCl_{3}, 63 MHz), \delta en ppm: 172,24, 156,49, 138,06, 136,53, 128,46, 128,04, 127,87, 76,76, 71,39, 66,60, 65,44, 51,54, 41,43, 40,65, 33,76, 31,87, 29,61, 29,30, 28,01, 26,47, 25,05, 22,65, 14,09.

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7. (2R)-5-amino-2-[(R)-3-benciloxi-tetradecanoil-amino]-pentan-1-ol

En un matraz de tres bocas, se añadieron 150 mg de paladio sobre carbón al 20% a la solución de (2R)-5-(benciloxi-carbonil-amino)-2-[(R)-3-benciloxi-tetradecanoil-amino]-pentan-1-ol (3,0 g, o sea 5,27 mmoles) y 6 ml de trietil-amina en 300 ml de etanol HPLC. Se eliminó el aire mediante la puesta a vacío y luego el matraz se cargó con hidrógeno. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas y luego el catalizador se separó por filtración sobre membrana y el filtrado se concentró para proporcionar un sólido de color blanco homogéneo en CCM, se utilizó tal cual para la fase siguiente sin otra purificación. Rf = 0,2, diclorometano/metanol/trietil-amina 5:1:0,5, PF = 47/48ºC.

^{1}H-RMN (CDCl_{3}, 250 MHz) \delta en ppm: 7,4-7,2 (m, 5H), 6,75 (d, 1H, NH), 4,5 (2d, AB, 2H), 3,9 (m, 2H), 3,5 (m, 2H), 2,3/2,6 (m, 7H), 1,7-1,2 (m, 24H), 0,9 (t, 3H). ^{13}C-RMN (CDCl_{3}, 63 MHz), \delta en ppm: 171,86, 138,13, 128,37, 127,87, 127,75, 76,81, 71,50, 64,57, 51,38, 41,51, 41,17, 33,89, 31,82, 29,26, 28,57, 28,03, 25,07, 22,60, 14,04.

El (2R)-5-amino-2-[(R)-3-dodecanoiloxi-tetradecanoil-amino]-pentan-1-ol puede obtenerse por la misma secuencia de reacciones sustituyendo en la etapa 6 del ejemplo II, el ácido (R)-3-benciloxi-tetradecanoico por el ácido (R)-3-dodecanoiloxi-tetradecanoico.

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Ejemplo III

3-[(R)-3-dodecanoiloxi-tetradecanoil-amino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-hidroxi-tetradecanoil-amino-decano-1,10-diol-1- di-bifosfato 1. Copulación peptídica

Se dispersó en una solución de ácido (2RS)-4-(difeniloxi-fosforiloxi)-2-[(R)-3-dodecanoiloxi-tetradecanoil-amino]-butanoico (1,0 mmoles) obtenido en el ejemplo I, disuelto en 20 ml de cloruro de metileno, 363,6 mg (1,2 mmoles) de IIDQ (1-isobutiloxi-2-isobutiloxi-carbonil-1,2-dihidroquinoleína). Se añadió después de 15 minutos de agitación 1,0 mmol de (2R)-5-amino-2-[(R)-benciloxi-tetradecanoil-amino]-pentan-1-ol obtenido en el ejemplo II, disuelto en 10 ml de cloruro de metileno y la mezcla de reacción se mantuvo bajo agitación durante 4h.

La solución se concentró y el residuo se purificó por cromatografía instantánea (CH_{2}Cl_{2}/acetona = 5:2, Rf 0,23). El disolvente se eliminó y se obtuvo así un jarabe incoloro (0,620 g o sea un rendimiento del 52,7%) de pseudodipéptido fosforilado. Rf=0,49, diclorometano/metanol/trietil-amina, 10:1:0,5. ^{1}H-RMN (CDCl_{3}, 250 MHz), \delta en ppm: 7,40-7,15 (m, 15H), 7,00 (m, 1H), 6,90 y 6,80 (2d, 2 diast, 1H), 6,65 (d, 1H) (3 x NH), 5,15 (m, 1H), 4,50 (m, 3H), 4,30 (m, 2H), 3,85 (m, 2H), 3,45 (m, 2H), 3,15 (m, 2H), 2,41-2,14 (m, 8H), 1,6-1,4 (m, 8H), 1,4-1,1 (m, 54H), 0,9 (t, 9H, 3CH_{3}). ^{13}C-RMN (CDCl_{3}, 63 MHz), \delta en ppm: 173,11, 171,68, 170,52 (2 diast.), 169,94 (2 diast.), 150,0 (d, ^{2}J_{P.C}=7,2 Hz), 138,20 (2 diast.), 129,58, 127,99, 127,49, 127,26, 125,24, 119,73 (t, ^{3}J_{P.C}: 5,0 Hz), 76,48, 71,12, 70,71, 65,86 (ensanchado), 64,22, 50,96, 49,71 (ensanchado), 41,46, 41,05, 39,07, 34,13, 34,00, 32,70, 31,61, 29,34, 29,06, 28,87, 27,98, 25,25, 24,92, 24,72, 22,38, 13,80.

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2. 1-(difeniloxi-fosforiloxi)-3-[(R)-3-dodecanoiloxi-tetradecanoil-amino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hidroxi-tetradeca- noil-amino]-decan-10-ol

La solución de pseudodipéptido fosforilado (488 mg o sea 0,42 mmoles) obtenido anteriormente y de ácido acético (1,9 ml) en 65 ml de etanol HPLC se colocó en un matraz de tres bocas y se añadieron 200 mg de paladio sobre carbón al 10% de Pd. Se purgó el aire mediante la puesta bajo vacío y luego el matraz se cargó con hidrógeno. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2h, y luego el catalizador se separó por filtración sobre membrana, el disolvente se eliminó a vacío, lo cual proporcionó el producto bruto con un rendimiento del 92%. Una muestra de producto se purificó por cromatografía instantánea (CH_{2}Cl_{2}/acetona 5:4, Rf = 0,24). Se obtuvo así un sólido vítreo. Rf = 0,68, cloruro de metilo/metanol 5:2. ^{13}C-RMN (CDCl_{3}, 63 MHz), \delta en ppm (algunas señales desdobladas por la presencia de diastereoisómeros): 173,60, 173,15, 170,67, 170,60, 170,27, 170,07, 150,24 (d), 129,92, 125,66, 120,05, y 119,90 (2d), 71,11, 71,05, 68,83, 66,21 (ensanchado), 64,71, 51,38, 50,32, 50,12, 43,25, 43,12, 41,66, 41,57, 39,30, 37,26, 34,45, 32,84, 31,86, 29,62, 29,5, 29,29, 29,13, 28,08, 25,57, 25,19, 24,97, 22,62, 14,03.

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3. 3-[(R)-3-dodecanoiloxi-tetradecanoil-amino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hidroxi-tetradecanoil-amino]-decan-1,10-diol-1-di-bifosfato

En un matraz de tres bocas, se preactivó óxido de platino (137 mg) en etanol absoluto (5 ml) con hidrógeno durante 10 min. Se añadió seguidamente la solución de 1-(difeniloxi-fosforiloxi)-3-[(R)-3-dodecanoiloxi-tetradecanoil-amino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hidroxi-tetradecanoil-amino)-decan-10-ol (411 mg o sea 0,38 mmoles) en etanol absoluto (20 ml). Se eliminó el aire por la puesta a vacío impulsado, y luego el matraz se cargó con hidrógeno. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 a 3 h, el catalizador se separó por filtración sobre membrana, el disolvente se eliminó a vacío. Se obtuvo finalmente el producto bruto en forma de un sólido blanco (rendimiento bruto del 98%). Rf = 0,50, cloroformo/metanol/agua, 6:4:0,6.

El 3-[(R)-3-hidroxi-tetradecanoil-amino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-dodecanoiloxi-tetradecanoil-amino]-decan-1,10-
diol-1-di-bifosfato puede ser obtenido a partir del ácido 4-(difeniloxi-fosforiloxi)-2-[(R)-3-benciloxi-tetradecanoil-amino]-butanoico y del (2R)-5-amino-2-[(R)-3-dodecanoiloxi-tetradecanoil-amino]-pentan-1-ol por la misma secuencia de reacciones (Esquema 3) (Fig. 35).

Alternativamente, el 3[(R)-3-dodecanoiloxi-tetradecanoil-amino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hidroxi-tetradecanoil-amino]-decan-1,10-diol-1-di-bifosfato se obtuvo a partir del ácido aspártico por la secuencia de reacciones siguientes (Esquemas de síntesis 1, 5 y 6) (Fig. 33, 37 y 38): protección de la función OH libre del (2R)-5-(benciloxi-carbonil-amino)-2-[(R)-3-benciloxi-tetradecanoil-amino]-pentan-1-ol por un grupo benciloxi-metilo, liberación de la función 5-amino de este compuesto por hidrogenolísis, copulación peptídica de esta amina con un derivado monoesterificado del ácido D ó L-aspártico que lleva en su función amina bien sea un grupo protector o un grupo (R)-3-dodecanoiloxi-tetradecanoilo, liberación y reducción de la función carboxílica terminal por mediación de un anhídrido mixto, desprotección si es necesario de la función amina procedente del ácido aspártico y luego N-acilación con un derivado del ácido (R)-3-dodecanoiloxi-tetradecanoico, fosforilación de la función hidroxilo en C-1, y finalmente desbloqueo de las funciones fosfato e hidroxilo por hidrogenolísis.

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Ejemplo IV

Preparación del 3-[(R)-3-dodecanoiloxi-tetradecanoil-amino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hidroxi-tetradecanoil-amino]- decano-1,10-diol, 1,10-bis-(di-bifosfato)

El 1-(difeniloxi-fosforiloxi)-3-[(R)-3-dodecanoiloxi-tetradecanoil-amino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-benciloxi-tetradecanoil-amino]-decan-10-ol (985 mg o sea 0,84 mmoles) se trató con N,N-dietil-fosforamidita de dibencilo (0,58 ml, pureza 85%), en presencia de [1 H]-tetrazol (182 mg) en tetrahidro-furano (35 ml) durante 30 min. a temperatura ambiente. El fosfito intermediario se oxidó mediante adición de una solución de ácido m-cloro-peroxi-benzoico (535 mg) en 25 ml de cloruro de metileno entre 0º y -20ºC. Después de 20 min, se añadió una solución de Na_{2}S_{2}O_{3} (20 ml) para destruir el exceso de oxidante, y luego se diluyó la fase orgánica con éter. La fase orgánica se separó, se lavó sucesivamente con una solución acuosa de Na_{2}S_{2}O_{3} (5 x 20 ml), luego una solución de NaHCO_{3} (2 x 20 ml), y luego con ácido clorhídrico acuoso (20 ml), se secó sobre MgSO_{4} y se concentró. El producto bruto se purificó mediante cromatografía instantánea sobre gel de sílice (CH_{2}Cl_{2}/acetona 10:3). El derivado difosforilado protegido así obtenido (900 mg, rendimiento 75%)(Rf 0,64, diclorometano/acetona 5:2) se sometió a una hidrogenación catalítica en metanol HPLC (100 ml) en presencia de paladio sobre carbón al 10% de paladio (300 mg) bajo presión atmosférica, durante 4h a temperatura ambiente. El catalizador se eliminó por filtración sobre membrana y el filtrado se concentró a presión reducida, lo cual proporcionó el 10-(dihidroxi-fosforiloxi)-1-(difeniloxi-fosforiloxi)-3-[(R)-3-dodecanoiloxi-tetradecanoil-amino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hidroxi-tetradecanoil-amino]-decano bruto (Rf=0,63, cloroformo-metanol-agua 6:4:0,6) con un rendimiento del 89%. Este producto se sometió seguidamente a una hidrogenación catalítica sobre óxido de platino (380 mg) en etanol HPLC (130 ml) durante 24 h a temperatura ambiente, bajo presión atmosférica. El catalizador se eliminó por filtración sobre membrana y el filtrado se concentró para proporcionar compuesto bis di-bifosfato libre (Rf=0,20, cloroformo/MeOH/agua, 6:4:0,6).

El 3-[(R)-3-hidroxi-tetradecanoil-amino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-dodecanoiloxi-tetradecanoil-amino]-decan-1,10-
diol-1,10-bis-(di-bifosfato) puede obtenerse a partir del ácido 4-(difeniloxi-fosforiloxi)-2-[(R)-benciloxi-tetradecanoil-amino]-butanoico y del (2R)-5-amino-2-[(R)-3-dodecanoiloxi-tetradecanoil-amino]-pentan-1-ol por la misma secuencia de reacciones (Esquema 3) (Fig. 35).

Alternativamente, el 3-[(R)-3-(R)-3-dodecanoiloxi-tetradecanoil-amino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hidroxi-tetradecanoil-amino]-decan-1,10-diol-1,10-bis-(di-bifosfato) se obtuvo a partir del ácido aspártico por la secuencia de reacciones siguientes (Esquemas de síntesis 1, 4 y 6): liberación de la función 5-amino del (2R)-5-(benciloxi-carbonil-amino)-2-[(R)-3-benciloxi-tetradecanoil-amino]-pentan-1-ol por hidrogenolísis, copulación peptídica de esta amina con un derivado monoesterificado del ácido D ó L-aspártico que lleva sobre su función amina bien sea un grupo protector o un grupo (R)-3-dodecanoiloxi-tetradecanoilo, liberación y reducción de la función carboxílica terminal por mediación de un anhídrido mixto, desprotección, si es necesario, de la función amina procedente del ácido aspártico y luego N-acilación con un derivado del ácido (R)-3-dodecanoiloxi-tetradecanoico, fosforilación de las funciones hidroxilo en C-1 y en C-10, y por último desbloqueo de las funciones fosfato e hidroxilo por hidrogenolísis.

Ejemplo V

Purificación y análisis de los compuestos según la invención 1. Purificación de los compuestos monofosforilado y difosforilado

Los productos de síntesis monofosforilado y difosforilado se solubilizaron en una mezcla de agua-isopropanol (1:1 v/v) con 0,1% de trietil-amina para obtener un pH entre 8 y 9. La cantidad necesaria de bicarbonato de amonio 2M se añadió seguidamente para alcanzar una concentración de 25 mM.

La purificación se realizó mediante HPLC preparativa en fase inversa en las condiciones siguientes:

Columna:: Bondapack C18 PrepPak, 40 x 200 mm, 15-20 \mum, 300 \ring{A}. Waters

Fase móvil:: A: isopropanol/agua (1:1, v/v), 50 mM bicarbonato de amonio

\quad: B: isopropanol/agua (2:8, v/v) 50 mM bicarbonato de amonio

Caudal:: 40 ml/min

Elución:: Adsorción isocrática en la columna: 40% B (60% A), 10 minutos

\quad: Gradiente A:B: 40 a 80% B en 10 minutos

\quad: Elución isocrática al 80% B, 30 minutos

\quad: Lavado: 100% B, 10 minutos

Detección:: UV, 210 nm

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En estas condiciones de elución, el tiempo de retención del compuesto monofosforilado se encuentra comprendido entre 25 y 30 min y el del compuesto difosforilado entre 18 y 25 minutos. En el caso en que la presencia de productos monofenilados fuese observada (desprotección incompleta en la desfenilación final), debe realizarse una purificación más fina. Esta purificación suplementaria se realizó en las condiciones siguientes:

Columna:: Kromasil C18, 21 x 250 mm, 5 \mum, 100 \ring{A}. Macherey-Nagel

Fase móvil:: A: isopropanol/agua (1:1, v/v), 50 mM bicarbonato de amonio

\quad: B: isopropanol/agua (2:8, v/v) 50 mM bicarbonato de amonio

Caudal:: 10 ml/min

Elución:: Adsorción isocrática en la columna: 40% B (60% A), 10 minutos

\quad: Elución isocrática:

\quad: compuesto monofosforilado: 80% B 30 minutos

\quad: compuesto difosforilado: 74% B, 30 minutos

\quad: Lavado: 100% B, 10 minutos

Detección:: UV, 210 y 254 nm

Las fracciones que contienen los compuestos monofosforilado o difosforilado en forma de sal de amonio se juntan y concentran por adsorción en fase C18 Bondapack, 15-20 \mum, 300 \ring{A}, Waters. La sal de sodio de los compuestos monofosforilado o difosforilado se obtuvo por lavado por medio de una solución de 10 g/l NaCl en agua isopropanol (9:1, v/v). Después de la eliminación del excedente de NaCl por paso de 5 volúmenes de una mezcla de agua/isopropanol (9:1, v/v) por la columna, el compuesto se eluyó con isopropanol puro. Este disolvente se evaporó seguidamente a sequedad en Rotavapor. Se realizó una solubilización final en el volumen necesario de agua (adicionada con 0,1% de trietanol-amina en el caso del compuesto monofosforilado) para alcanzar una concentración blanco de 2 mg/ml. Seguidamente se realizó una filtración esterilizante sobre filtro 0,2 \mum, Express Membrane, Millipore (si el volumen es inferior a 50 ml: sistema Steriflip, si el volumen es superior a 50 ml: sistema Steritop).

En el caso del compuesto monofosforilado, se realizó una sonicación de la solución (3 veces 10 segundos) a temperatura ambiente antes de la filtración esterilizante.

2. Seguimiento y rendimiento de la purificación

Después de cada etapa, las fracciones se analizaron por cromatografía analítica HPLC en fase inversa según las condiciones siguientes:

Columna:: Supercosil C18, 3 \mum, 4,6 x 150 mm, 100 \ring{A}. Supelco

Fase móvil:: A: agua/acetonitrilo (1:1, v/v), 5mM TBAP

\quad: B: agua/isopropanol (1:9, v/v) 5 mM TBAP

Caudal:: 1 ml/min

Elución:: Gradiente A:B (75:25 a 0:100) en 37,5 minutos

Detección:: UV, 210 y 254 nm

En estas condiciones cromatográficas, los tiempos de retención observados para los compuestos mono- y difosforilados son de 25,5 \pm 0,5 y 20,8 \pm 0,5 minutos, respectivamente. Los rendimientos de purificación obtenidos varían entre 57 y 94% para el compuesto monofosforilado y entre 71 y 92% para el compuesto difosforilado. Se produjeron 311 mg y 189 mg de compuestos mono y difosforilado, respectivamente.

3. Dosificado y análisis de pureza de los productos finales

El dosificado y control de pureza de los productos obtenidos se realizaron por HPLC/UV en las condiciones cromatográficas descritas anteriormente. Según estos análisis las purezas obtenidas para los diferentes lotes de compuestos mono- y difosforilados producidos varían entre el 99 y el 100%. Con el fin de evidenciar la presencia de impurezas inactivas en UV, se realizaron análisis LC/ES-MS (ionización de tipo electrospray, modo positivo). Para estos últimos, se sustituyó el fosfato de tetrabutil-amonio (5 mM) por el acetato de amonio (25 mM) para cumplir con las condiciones de ionización de superficie intermedia electrospray.

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Métodos alternativos de dosificado de las soluciones finales fueron utilizados. Se citarán por ejemplo el análisis cuantitativo de los fosfatos totales (adaptación de Ames, B.N., Methods in Enzymology VII (1966), 115-117), aminoácidos (adaptación de Hughes et al., J. Chromatogr. 389 (1987), 327-333) y cadenas acilos (adaptación de Miller, L.T., Hewlett-Packard Application Note (1984), 228-237).

4. Análisis espectroscópicos 4.1 Espectrometría de masa

Los espectros ES-MS (modos positivo y negativo) de los compuestos mono- y difosforilados fueron medidos en tres tipos de espectrómetros de masa (Finnigan LCQ, ion trap; Micromass Quattro II, triple stage quadrupole; Hewlett-Packard MSD, single quadrupole). Análisis complementarios de tipo MS/MS fueron igualmente realizados. Los espectros que testimonian la identidad y la pureza de los productos se adjuntan en anexo.

Espectros ES-MS (modo positivo)

Compuesto difosforilado:

(Micromas Quattro II: Espectro 1; HP-MSD : Espectro 3) (Fig. 39 y 41)

Se observó en baja energía, un ión pseudomolecular mayoritario en m/z 1014.6 [M+H]^{+}. Fueron igualmente visibles, aductos de sodio en m/z 1036.6 [M+Na]^{+}, 1058.6 [MH+2Na]^{+} y 1080.5 [M-2H+3Na]^{+}.

Según el grado de fragmentación elegido, se observaron dos fragmentos en m/z 916.5 [M-98+H]^{+} y 818.6 [M+98+
H]^{+}, testimoniando la presencia de dos grupos fosforilados en la molécula. Como lo muestra el espectro 3 (Fig 41), la intensidad relativa de los iones observados varía considerablemente en función de la energía aplicada.

Compuesto monofosforilado:

(Micromass Quattro II: Espectro 2) (Fig. 40)

Un esquema de ionización un poco diferente se obtuvo para el compuesto monofosforilado debido a la presencia de trietanol-amina (TeoA) en las soluciones analizadas. Se observó un ión pseudomolecular mayoritario en m/z 934.4 [M+H]^{+} así como aductos de sodio [M+Na]^{+} y de potasio [M+K]^{+} en m/z 956.3 y 972.3, respectivamente. Un segundo grupo de aductos en m/z 1083.4 [M+TeoA+H]^{+} y m/z 1121.3 [M+TeoA+K]^{+} es igualmente observable. La presencia de un grupo fosforilado en la molécula se confirma por un fragmento observado con energía elevada en m/z 836.4 [M-98+H]^{+}.

Espectros ES-MS (modo negativo)

Los iones observados sobre los espectros ES-MS de los compuestos mono- y difosforilados en la modalidad negativa están completamente de acuerdo con los resultados obtenidos en la modalidad positiva.

Análisis en ionización FAB (modo positivo) fueron igualmente realizados. En baja resolución, los compuestos mono- y difosforilados presentan aductos de sodio [M+Na^{+}] en m/z 956.5 y 1036.5, respectivamente.

En alta resolución (matriz de alcohol 3-nitro bencílico), un pico en m/z 956.667 se observó para el monofosfato, lo cual corresponde a la fórmula bruta C_{49}H_{96}O_{11}N_{3}PNa esperada (masa calculada: 956.668 uma).

Para el difosfato, se midió un pico en m/z 1036.635, lo cual corresponde a la fórmula bruta C_{49}H_{97}O_{14}N_{3}P_{2}Na esperada (masa calculada: 1036.634 uma).

Todos los análisis MS evidenciaron el elevado grado de pureza de los productos obtenidos.

4.2 Resonancia magnética nuclear

Los espectros ^{1}H-RMN y ^{13}C-RMN de los compuestos mono- y difosforilados fueron medidos en aparatos de tipo Bruker DPX de 250.13 y 62.89 MHz, respectivamente, y Varian Unity Inova 500 a 499,87 y 125.7 MHz, respectivamente. Los espectros ^{31}P-RMN fueron registrados a 121.6 MHz (Bruker DPX). Los espectros que testimonian la identidad y la pureza de los productos se adjuntan en anexo.

Espectros ^{1}H-RMN (Espectros 4 y 5) (Fig 42 y 43).

-: compuesto monofosforilado: sobre el espectro registrado en CDCl_{3} + 0,1% trietanol-amina (TEoA) (Espectro 4), se observaron las señales que corresponden a los tres protones llevados por los átomos de nitrógeno N(5), N(2a) y N(2b) entre 7 y 9,5 ppm (ver ampliación de la ventana espectral). Las señales atribuidas a H-N(2a) y H-N(2b) aparecen en forma de dos dobletes que evidencian la presencia de una mezcla de estereoisómeros. Se observa igualmente una predominancia de uno de los diastereoisómeros (consecuencia de las diferentes etapas de purificación).

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-: compuesto difosforilado: en el espectro registrado en CDCl_{3}-CD_{3}OD (3:1, v/v) (Espectro 5), las señales correspondientes a H-N(5), H-N(2a) y H-N(2b) no se observan ya como consecuencia de un intercambio en presencia de CD_{3}OD. Informaciones suplementarias para la atribución de las diferentes señales se obtuvieron mediante ensayos de correlaciones homo- y heteronucleares (^{1}H-^{1}H-RMN: COSY, ^{1}H-^{13}C-RMN: HSQC y HMBC).

Espectros ^{13}C-RMN (Espectros 6 y 7) (Fig. 44 y 45)

El registro de espectros ^{13}C-RMN se hizo particularmente difícil por la solubilidad relativamente baja de los compuestos mono- y difosforilados.

Espectros ^{31}P-RMN (Espectros 8 y 9) (Fig. 46 y 47)

Para los dos compuestos mono- y difosforilados, se observó un único pico.

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Ejemplo V

Estudios farmacológicos de los compuestos según la invención 1. Determinación de la endotoxicidad por el ensayo cromogénico del Limulus

La endotoxicidad se determinó por el ensayo Limulus Amoebocyte Lysate cromogénico (LAL-Chromogénique de Charles River Endosafe, lot # EK4121E, Charleston, USA). Este ensayo se basó en la activación por el lipopolisacárido (LPS) o los productos de estructura comparable, de una cascada enzimática presente en el LAL. Esta activación enzimática se puso en evidencia por la escisión de un cromógeno unido a un péptido por la proteasa, en el extremo de la cadena de la cascada enzimática según la reacción siguiente:

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8

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La reacción enzimática se realizó a 37ºC y la formación del cromógeno en el transcurso del tiempo se midió a 405 nm. En este método cinético en punto final, el tiempo necesario para alcanzar 0,2 unidades de DO fue registrado y la actividad endotóxica calculada con relación a un patrón de LPS (curva standard).

Los resultados se expresaron en EU (Endotoxin Unit) con relación a una preparación estandarizada de lipopolisacárido de E. coli. Para esta serie de dosificado 1 EU corresponde a 0,08 mg de equivalente LPS.

Los resultados presentan una variabilidad relativamente importante pero normal para este tipo de dosificado cuantitativo que proporciona sobre todo un orden de magnitud. El ensayo LAL se utilizó sobre todo para demostrar la ausencia de pirógeno (límite superior de la concentración en endotoxina) en preparaciones farmacéuticas. El dosificado cuantitativo del contenido en pirógeno debe imperativamente compararse en una misma serie de ensayos bien estandarizados.

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Resultados

Los resultados (medias \pm diferencia-tipo) obtenidos para los productos de la invención se indican en la tabla (a):

TABLA (a) Activación del limulus amebocyte lysat (LAL)

9

Los compuestos según la invención son 10^{6} veces menos activos que el LPS en el ensayo LAL. El OM-294-DP y el OM-294-MP son por consiguiente productos particularmente interesantes debido a su baja toxicidad, asociada con su capacidad para inducir actividades biológicas inmunomoduladoras (in vivo e in vitro).

2. Determinación de la proliferación de las células cepas de la médula ósea de ratón estimuladas mediante LPS o por los compuestos de la invención Protocolo

Se sacrificaron 2 ratones macho C57/BL6 de 6 semanas mediante inhalación de CO_{2} seguida de una dislocación de las cervicales. Los ratones se lavaron con alcohol, y la piel de los miembros posteriores se retiró completamente. Las ancas, los fémures y las tibias se extirparon a nivel de las articulaciones. Las carnes se eliminaron toscamente con un escalpelo. Los huesos se limpiaron y los extremos de los huesos se cortaron con tijeras. La médula se extractó del orificio óseo mediante inyección en 3 veces de 1 ml de medio Eagle modificado por Dulbecco (medio DH) por los extremos que han sido cortados con tijeras. Las células se pusieron de nuevo en suspensión en el medio DH y se centrifugaron durante 5 minutos a 300 x g. El sobrenadante fue eliminado y las células cepas se pusieron de nuevo en suspensión en el medio DH completado con un 20% de suero fetal (FCS). La concentración celular se ajustó en 500.000 células por ml.

Los productos en solución en el medio DH suplementado con el FCS, los ácidos aminados y los antibióticos se diluyeron en serie, directamente en la microplaca de 96 pocillos. Se realizaron 9 diluciones con un factor de 3.16. Los productos se sometieron a ensayo por sextuplicado y cada microplaca comprende un testigo negativo compuesto por el medio solo. El volumen final en cada pocillo es de 100 \mul. Las microplacas se incubaron durante 1 hora a 37ºC bajo un 8% de CO_{2} en una estufa saturada de humedad para tamponar el medio. Después de 1 hora, se añadieron 100 \mul de la suspensión celular a los productos y se continuó la incubación durante 7 días.

La proliferación se determinó por la medición de la oxidación de un sustrato cromogénico (XTT) en las mitocondrias de las células vivas.

Después de 7 días las microplacas se centrifugaron 5 minutos a 400 x g, y 100 \mul de sobrenadante se extractaron y eliminaron. Se añadieron 50 \mul de una solución a 1 mg/ml de XTT 3-[1-fenil-amino-carbonil)-3,4-tetrazolil]-bis-[(4-metoxi-6-nitro)-benceno]sulfonato-sódico y 0,008 mg/ml PMS ((N-metil dibenzopirazina, metil-sulfato) en medio RPMI a cada pocillo. Después de 8 horas de incubación a 37ºC bajo un 8% de CO_{2} en una estufa saturada de humedad, las microplacas fueron leídas con el espectrofotómetro a 490 nm contra una referencia a 690 nm. Los resultados se expresaron por término medio (\pm diferencia tipo) en forma de una curva dosis/respuesta. Los valores del control negativo compuesto del medio DH (media \pm diferencia tipo de todos los ensayos)se indican igualmente en forma gráfica.

En este ensayo los compuestos según la invención inducen una proliferación significativa de las células cepa de médula de ratón. Esta es casi tan importante como la inducida por el LPS de E. coli, pero la concentración mínima necesaria para inducir una respuesta significativa es superior. El producto monofosforilado induce una respuesta más baja que la del producto difosforilado. La figura 1 representa un ensayo representativo obtenido de un conjunto de 3 ensayos independientes obtenidos a partir de preparaciones celulares diferentes.

3. Determinación de la producción de óxido nítrico en los sobrenadantes de macrófagos Protocolo

Se sacrificaron dos ratones C57/BL6 macho de 6 semanas mediante inhalación de CO_{2} seguida de una dislocación de las cervicales. Los ratones se lavaron con alcohol, y la piel de los miembros posteriores se retiró completamente. Las ancas, los fémures y las tibias se extirparon a nivel de las articulaciones. Las carnes se eliminaron toscamente con un escalpelo. Los huesos se limpiaron y los extremos de los huesos se cortaron con tijeras. La médula se extractó mediante inyección de 3 veces 1 ml de medio Eagle modificado por Dulbecco (medio DH) en el orificio óseo. Las células se pusieron de nuevo en suspensión en el medio DH y se centrifugaron durante 5 minutos a 300 x g. El sobrenadante fue eliminado y las células se pusieron de nuevo en suspensión a la concentración de 40.000 células/ml en medio DH completado con un 20% de suero de caballo (HS) y 30% de sobrenadante de L929. Los L929 son una familia de fibroblastos murinos cuyo sobrenadante es rico en factor de crecimiento para los macrófagos (M-CSF). La suspensión celular se distribuyó mediante 12 ml en cajas de Petri que se incubaron durante 8 días a 37ºC bajo un 8% de CO_{2} en una estufa saturada en humedad. Después de 8 días, las células-cepa se diferenciaron en macrófagos maduros. Los macrófagos se liberaron mediante una incubación de 45 minutos a 4ºC en PBS frío. Después de la centrifugación y eliminación, las células se pusieron de nuevo en suspensión en medio DH completado con un 5% de suero fetal (FCS), glutamina, asparragina, arginina, ácido fólico, mercapto-etanol y antibióticos (penicilina y estreptomicina). Las células cepa se juntaron y la concentración celular se ajustó en 700.000 células por ml.

Los productos puestos en solución en el medio DH suplementado con FCS, los ácidos aminados y los antibióticos se diluyeron en serie directamente en la microplaca de 96 pocillos. Se efectuaron de 9 a 10 diluciones según los productos con un factor de 3.16. Los productos se sometieron a ensayo por triplicado y cada microplaca comprende un testigo negativo compuesto por medio solo. El volumen final en cada pocillo es de 100 \mul. Las microplacas se incubaron durante 1 hora a 37ºC bajo un 8% de CO_{2} en una estufa saturada de humedad para tamponar el medio. Después de 1 hora, se añadieron 100 \mul de la suspensión celular a los productos y la incubación se continúo durante 22 horas.

Después de 22 horas las microplacas se centrifugaron, 5 minutos a 400 x g y 100 \mul de sobrenadante se extrajeron y transfirieron a una microplaca. Se añadieron 100 \mul de reactivo de Griess [5 mg/ml de sulfanil-amida + 0,5 mg/ml de clorhidrato de N-(1-naftil-etileno diamina)] en ácido fosfórico al 2,5% acuoso, a cada pocillo. Las microplacas se leyeron en el espectrofotómetro a 562 nm contra una referencia de 690 nm. La concentración en nitrilo es proporcional a la del óxido nítrico. La concentración en nitrito se determinó con relación a una curva Standard, lineal de 1 a 25 \muM de nitrito.

Los resultados se expresaron después de la resta del testigo negativo, por término medio \pm diferencia tipo en forma de una curva dosis/respuesta.

En este ensayo los compuestos según la invención inducen una producción de óxido nítrico por los macrófagos murinos con una curva efecto-dosis. El producto difosforilado induce una proliferación más importante que la inducida por el LPS de E. coli, pero la concentración mínima necesaria para inducir una respuesta significativa es superior. El producto monofosforilado induce una respuesta más baja que la del producto difosforilado y que la del LPS de E. coli. La figura 2 representa un ensayo representativo obtenido de un conjunto de 3 ensayos independientes obtenidos a partir de preparaciones celulares diferentes.

4. Determinación de la capacidad de los compuestos según la invención para activar la producción de TNF-\alpha de macrófagos alveolares humanos Protocolo

Obtención de macrófagos alveolares: Los macrófagos alveolares humanos fueron obtenidos por lavado broncoalvelolar (BAL) de pulmones de pacientes aquejados de cáncer de pulmón. El BAL se realizó inmediatamente después de la cirugía sobre tejido pulmonar procedente de las partes sanas del lóbulo pulmonar. Los lavados se realizaron con NaCl 0,9% con la ayuda de una jeringa de 50 ml. Las células obtenidas están constituidas por >85% de macrófagos, siendo las demás células principalmente linfocitos. Después de la centrifugación, las células se pusieron de nuevo en suspensión con el medio RPMI y los glóbulos rojos se eliminaron por centrifugación sobre Ficoll Paque (Research Grade). Los macrófagos se lavaron 3 veces con HBSS e implantaron en microplacas en 24 pocillos, a razón de 1 ml por pocillo conteniendo un total de 1.000.000 de células. Después de una hora de incubación a 37ºC, los macrófagos son adherentes y los pocillos se lavaron en 3 tomas con 1 ml de HBSS con el fin de eliminar las células no adherentes. Después de los lavados, se añadió 1 ml de RPMI en cada uno de los pocillos que contienen los macrófagos.

Incubación con los productos y dosificado del TNF-\alpha: los macrófagos alveolares se incubaron a 37ºC y un 5% de CO_{2} con concentraciones de 0,1 \mug/ml y 10 \mug/ml de los productos siguientes:

-: testigo negativo: RPMI

-: testigo positivo: LPS de E. coli (serotipo O5:B5, Difco, Detroit, U.S.A.)

-: compuesto monofosforilado según la invención (OM-294-MP)

-: compuesto difosforilado según la invención (OM-294-DP)

Los sobrenadantes de los cultivos se recogieron después de 24 horas y se analizaron para su contenido en TNF-\alpha (kit Bio-Source Cytoscreen, Camarillo, CA, U.S.A. con un límite de detección de 1 pg/ml.

Resultados

Los derivados monofosforilado y difosforilado según la invención inducen una producción moderada de TNF-\alpha a partir de 10 \mug/ml. El derivado monofosforilado según la invención induce una producción de TNF-\alpha superior a la del derivado difosforilado. El control positivo LPS induce en las 3 concentraciones sometidas a ensayo a una producción elevada de TNF-\alpha. Los resultados se presentan en la Tabla (a).

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TABLA (a) Inducción mediante OM-294-MP y el OM-294-DP de la producción de TNF-\alpha mediante macrófagos alveolares humanos

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5. Determinación de la capacidad de los compuestos según la invención en la inhibición de la producción de TNF-\alpha de macrófagos alveolares humanos, inducida por el lipopolisacárido de E. coli (LPS) Protocolo

Obtención de macrófagos alveolares: Los macrófagos alveolares humanos se obtuvieron por lavado broncoalveolar (BAL) de pulmones de pacientes aquejados de cáncer de pulmón. El BAL se realizó inmediatamente después de la cirugía sobre tejido pulmonar procedente de las partes sanas del lóbulo pulmonar. Los lavados se realizaron con NaCl al 0,9% con la ayuda de una jeringa de 50 ml. Las células obtenidas están constituidas por >85% de macrófagos, siendo las demás células principalmente linfocitos. Después de la centrifugación, las células se pusieron de nuevo en suspensión con medio RPMI y los glóbulos rojos se eliminaron por centrifugación en Ficoll Paque (Research Grade). Los macrófagos se lavaron 3 veces con HBSS e implantaron en microplacas de 24 pocillos, a razón de 1 ml por pocillo conteniendo un total de 1.000.000 de células. Después de una hora de incubación a 37ºC, los macrófagos son adherentes y los pocillos se lavaron en 3 tomas con 1 ml de HBSS con el fin de eliminar las células no adherentes. Después de los lavados, se añadió 1 ml de RPMI a cada uno de los pocillos que contienen los macrófagos.

Incubación con los productos y dosificado del TNF-\alpha: los macrófagos alveolares se incubaron a 37ºC y un 5% de CO_{2} con LPS de E. coli (serotipo O5:B5, Difco, Detroit, U.S.A.) en 1 \mug/ml adicionado simultáneamente a los productos siguientes a las concentraciones de 10 \mug/ml:

-: testigo negativo : RPMI

-: compuesto monofosforilado según la invención (OM-294-MP)

-: compuesto difosforilado según la invención (OM-294-DP)

Los sobrenadantes de los cultivos se recogieron después de 24 horas y se analizaron para su contenido en TNF-\alpha (Kit Bio-Source Cytoscreen, Camarillo, CA, U.S.A.) con un límite de detección de 1 pg/ml.

Resultados

El derivado difosforilado inhibe de forma importante la producción de TNF-\alpha normalmente inducida por el LPS. El derivado monofosforilado inhibe parcialmente la producción de TNF-\alpha inducida por el LPS. Los resultados han sido presentados en la Tabla (a).

TABLA (a) Inhibición por el OM-294-MP y OM-294-DP de la producción de TNF-\alpha inducida sobre macrófagos alveolares humanos por el LPS

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6. Efecto de los productos OM-294-MP y OM-294-DP sobre la maduración de las células dendríticas humanas

Se evaluó la capacidad de los productos OM-294-MP y OM-294-DP en la inducción de la maduración de las células pre-dendríticas en células dendríticas. Se midieron los parámetros siguientes: incorporación del Dextran.FITC y expresión de las moléculas de superficie CD40, CD80, CD83, CD86.

Protocolo

Células: las células mononucleadas de la sangre periférica se separaron de los "buffy coats" de 6 donantes sanos. Los donantes no experimentaron ningún tratamiento antes de la donación de sangre.

Preparación de las células: los monocitos purificados por adherencia se pusieron de nuevo en suspensión en medio RPMI-1640 (Sigma-Aldrich, St-Louis, MO, U.S.A.) conteniendo un 10% de suero de ternera fetal, GM-CSF (10 ng/ml; IM-HGM1, Immungenex Corp., Los Angeles, CA, U.S.A.) e IL-4 (10 ng/ml; No. 204-IL, R&D System, Minneapolis, MN, USA) a razón de 1 x 10^{6} células/ml y distribuidos en cajas de Petri de 10 cm de diámetro (P10, Falcon, Becton Dickinson, Plymouth, UK) (10 x 10^{6} células por caja P10) durante 6 días (con un cambio de medio después de 3 días). Estas células se denominan células predendríticas (DC-6). La maduración de las células predendríticas en células dendríticas maduras se realizó por incubación con OM-294-MP, OM-294-DP o LPS durante 3 días más a las concentraciones indicadas a continuación bajo Productos. Al 9º día (DC-9), las células se recogieron para analizar los diferentes parámetros indicadores de la maduración de las células dendríticas: se evaluaron las moléculas de superficie CD40, CD80, CD83, CD86 así como la capacidad de incorporar Dextran-FITC. Todos estos parámetros se analizaron mediante FACS EPICS-XL-MCL (Coulter Immunology, Hialeah, Finlandia).

Lanzavecchia et al., J. Exp. Med 179 (1994) 1109; Lanzavecchia et al., J. Exp. Med 182 (1995) 389.

Evaluación de los resultados: la expresión de las moléculas de superficie se expresó en % de la fluorescencia media de las células estimuladas por LPS (testigo positivo); la incorporación del Dextran se calculó con relación a la de las células mantenidas en el medio y se expresó en %. El análisis estadístico por el ensayo t-student comparó los valores obtenidos en los diferentes ensayos con los valores del testigo positivo. Los valores de p<0,05 se consideraron como significativos. Productos: las soluciones madre de =M-294-DP y OM-294-MP se prepararon en 1 mg/ml en 0,9% de NaCl/agua, adicionada con 0,1% de trietil-amina para OM-294-MP. Las soluciones se incubaron a 37ºC durante 20 min, se agitaron vigorosamente durante 3 min y luego se diluyeron en 100 \mug/ml en medio de cultivo RPMI 1640 y se utilizaron bien sea en 10 \mug/ml (Fig. 3, 6, 7, 8) o en concentraciones comprendidas entre 0,02 y 25 \mug/ml (Fig. 4, 5).

Producto de referencia: lipopolisacárido de E. coli (LPS, DIFCO, Detroit, MI, U.S.A.), solución stock 5 mg/ml en PBS. Se preparó una solución intermediaria de 100 \mug/ml en medio de cultivo RPMI 1640. Las concentraciones sometidas a ensayo son bien sea de 10 \mug/ml (Fig. 3, 6, 7, 8) o sea valores de 0,02 a 10 \mug/ml (Fig. 4, 5).

Resultados

Las células dendríticas inmaduras (DC-6) procedentes de la diferenciación de los monocitos, por el efecto conjugado de GM-CSF y de IL-4, son capaces de incorporar el Dextran-FITC. En el transcurso del proceso de maduración, las células pierden la capacidad de incorporar el Dextran-FITC. Los análisis se realizaron en la fase de diferenciación DC-9. Los resultados se expresan en % de la incorporación del Dextran-FITC observada en las células no estimuladas (medio) Fig. (3). Las células tratadas con LPS u OM-294-MP solo mantienen respectivamente el 10% y 19% de fagocitosis, mientras que las células estimuladas por OM-294-DP mantienen la totalidad de su capacidad de incorporar el Dextran (98 y 99%). Una curva dosis respuesta indica que el OM-294-MP muestra capacidades excepcionales en la inducción de una diferenciación de las células DC-6 en DC-9 en concentraciones que van de 0,02 \mug a más de 25 \mug por ml, ver Fig. (4) bajas concentraciones y Fig. (5) concentraciones más elevadas.

La expresión de las moléculas de superficie coestimuladoras es otro criterio de maduración de los DC. La expresión de los CD40, CD80, CD83, CD86 fue comprobada. Los resultados se expresan en % de la media de fluorescencia con relación a la expresión de estos marcadores inducida por el LPS.

El OM-294-MP aumenta la expresión de todas las moléculas de superficies analizadas: CD40 (39%), CD80 (62%), CD83 (60%), CD86 (77% ver Fig. 6, 7, 8, 9).

El OM-294-DP muestra un efecto similar al del medio de cultivo sobre la expresión de los marcadores estudiados. Este efecto no sobrepasa el 20% del efecto del LPS.

7. Efecto de los productos OM-294-MP y OM-294-DP sobre la producción de TNF-\alpha y de IL-12 p70 por monocitos y células predendríticas en la fase DC-6

Células DC-6 (5 x 10^{5}/500 \mul del medio) se estimularon durante 4h, 6h y 24h, o sea por el LPS (10 \mug/ml) o por el OM-294-MP (10 \mug/ml) o el OM-294-DP (10 \mug/ml).

Protocolo

Condiciones experimentales in vitro : Las células mononucleadas de la sangre periférica se separaron de los "buffy coats" de 6 donantes sanos (los donantes no experimentaron ningún tratamiento antes de la donación de sangre). Los monocitos se separaron en un gradiente de Ficoll y luego se purificaron por adherencia. Los monocitos adherentes de una forma suelta se recogieron seguidamente y una parte de las células guardadas como monocitos. Los monocitos purificados se pusieron de nuevo en suspensión en medio RPMI-1640 conteniendo un 10% de FCS, a razón de 1 x 10^{6} células/ml y distribuidos en cajas Petri de 10 cm de diámetro (P10/Falcon, Becton Dickinson, Plymouth, UK) a razón de 10 x 10^{6} células/caja P10. Las células se pusieron en cultivo en el medio RPMI 1640 completo conteniendo GM-CSF (10 ng/ml) e IL-4 (10 ng/ml) durante 6 días. Al 6º día, las células se recogieron, se lavaron 3 veces con HBSS y se repartieron en una placa de 24 pocillos a razón de 5 x 10^{5} células por pocillo en 500 \mul del medio RPMI completo y estimuladas con LPS (10 \mug/ml), OM-294-MP (10 \mug/ml) u OM-294-DP (10 \mug/ml).

El TNF\alpha así como el IL-12 p70 se dosificaron mediante ELISA en los sobrenadantes de los cultivos que se recogieron después de 4, 6 y 24 horas.

Productos: los productos OM-294-MP y OM-294-DP (solución stock de 1 mg/ml en agua estéril) se incubaron a 37ºC durante 20 minutos y se agitaron fuertemente durante 3 minutos y luego se diluyeron en 100 \mug/ml y se utilizaron a la concentración final de 10 \mug/ml en medio de cultivo RPMI 1640.

Producto de referencia: lipopolisacárido de E. coli (LPS, DIFCO, Detroit, MI, U.S.A.), solución stock 5 mg/ml en PBS, solución intermediaria en el medio de cultivo: 100 \mug/ml, utilizado a la concentración final de 10 \mug/ml.

Dosificado del TNF-\alpha y del IL-12 p70: Kit TNF-\alpha Biosource KHC3012, lote PP003-J061703 (Biosource International, Camarillo, CA, U.S.A.). Protocolo ELISA según nota del kit del proveedor. El IL-12 p70 se dosifica en los sobrenadantes de los cultivos mediante ELISA utilizando para ello el kit para IL-12 humano (No D1200, lote 990 6232, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA).

Resultados TNF-\alpha

El OM-294-MP estimula la producción de TNF-\alpha por las células DC-6 de forma similar a la del LPS tanto desde el punto de vista de la cinética de producción como de la concentración de TNF-\alpha (Fig. (10)). El pico de TNF-\alpha se situó para los dos productos entre 6 h y 24 h. El OM-294-DP solo estimula marginalmente la producción de TNF-\alpha por las células DC-6.

IL-12 p70

De una manera general, el IL-12 es inducido en presencia de IFN-\gamma (LPS+IFN-\gamma, OM-294-MP + IFN-\gamma) en los monocitos (Fig. (12)) y los DC-6 (Fig. (11)). La citoquina aparecía más bien en los DC que en los monocitos.

8. Evaluación de las propiedades adyuvantes de OM-294-DP y OM-294-MP en un modelo de inmunización de los ratones con un péptido sintético (Pb CS His_{6}-242-310) de la región C terminal de la proteína de superficie del circumesporozoito de Plasmodium berghei Protocolo

Antígeno: el péptido Pb CS (HHHHHHGGMN NKNNNNDDSY IPSAEKILEF VKQIRDSITE EWSQCNVTCG SGIRVRKRKG SNKKAEDLTL EDIDTEI), denominado a continuación His_{6}-242-310, que corresponde a la secuencia de los aminoácidos 242 a 310 de la proteína del circumesporozoito de Plasmodium berghei cepa ANKA adicionada en la parte N-terminal de 6 residuos histidina, de 2 glicinas y de una metionina se obtuvo por síntesis según el método de Merrifield y Atherton (Atherton et al., Bioor. Chem. 8 (1979) 350-351). El polipéptido se preparó sobre resina p-alcoxi-bencil-alcohol (resina de Wang) con un grado de sustitución de 0,4 mmoles/g. Un exceso molar de 10x de los derivados F-moc de los ácidos aminados se utilizó con un tiempo de copulación de 30 min. El péptido se purificó por cromatografía de exclusión de tamaño (Sephadex G25, Pharmacia, S), y luego por cromatografía sobre fase inversa (W-Porex 5 C-4, 250 x 10 mm, Phenomenex, Torrance, CA, U.S.A.), con un gradiente, en 40 min, que va de una mezcla de 10 a 50% de acetonitrilo en 0,1% de ácido trifluoro-acético/agua (v/v), caudal 3 ml/min. La composición en ácidos aminados del péptido purificado se determinó según Knecht y Chang (Anal. Chem. 58 (1986) 2373-2379), y el peso molecular se confirmó por espectrometría de masa en Voyager-DE (Perseptive Biosystem, Framingham, MA, U.S.A.). La solución madre del antígeno se preparó en 0,4 mg/ml al 0,9% de NaCl/agua a un pH de 8,0.

Adyuvantes: las soluciones madre de OM-294-DP y OM-294-MP se prepararon a 1 mg/ml al 0,9% de NaCl/agua, adicionada con 0,1% de trietil-amina para el OM-294-MP. El testigo positivo está constituido por el adyuvante incompleto de Freund (IFA de Difco, Detroit, MI, U.S.A.) y el testigo negativo es una solución del 0,9% de NaCl.

Mezcla antígeno-adyuvante: un volumen de antígeno y un volumen de adyuvante se mezclaron 3 min por Vortex.

Inmunización: ratones hembras BALB/c con edades de 6 semanas (6 ratones por grupo) se inmunizaron con tres tomas, por inyección subcutánea en la base de la cola de 0,1 ml de las mezclas siguientes:

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Esquema de inmunización y de extracciones

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Extracciones de sangre y de los órganos linfoides

Obtención del suero: se realizaron extracciones de sangre al cabo de 0, 3, 7 y 9 semanas. La sangre se dejó reposar 60 min a 37ºC, luego se colocó durante una noche a 4ºC. El suero se congeló seguidamente a -80ºC hasta dosificado de los anticuerpos.

Extirpación de los ganglios inguinales y del bazo: algunos animales de cada grupo se sacrificaron después de 4 o respectivamente 9 semanas. Los ganglios inguinales y el bazo se extirparon quirúrgicamente.

Determinación del título de anticuerpos anti-Pb CS His_{6} 242-310

El dosificado del título de anticuerpos dirigido específicamente contra el antígeno Pb CS His_{6} 242-310 se realizó mediante ELISA. La fijación del antígeno se realizó en microplaca de 96 pocillos (Maxisorp F 96, Nunc, DK) por incubación durante una noche en cámara húmeda a 4ºC con en cada pocillo 0,1 ml de PBS (phosphate buffered saline) conteniendo 0,001 mg/ml de antígeno Pb CS His_{6}-242-310. La saturación de la microplaca se realizó con PBS conteniendo un 1% de albúmina sérica bovina (BSA, Fluka, CH). Las placas se lavaron con PBS conteniendo un 0,05% de Tween 20 (Sigma, Saint-Louis, MO, U.S.A.). Los sueros obtenidos al cabo de 0, 3, 7 y 9 semanas se diluyeron en serie con el tampón de dilución (PBS conteniendo un 2,5% de leche en polvo desgrasada y 0,05% de Tween 20), y luego se transfirieron a la microplaca y se dejaron 1 h a temperatura ambiente (TA). Las placas se lavaron seguidamente con PBS, conteniendo la solución de dilución el anticuerpo policlonal anti-inmunoglobulina de ratón conjugado con la fosfatasa alcalina (Sigma, Saint-Louis, MO, U.S.A.) se añadió a las placas y se incubó 1 h a TA. Las placas se lavaron con PBS y los anticuerpos específicos puestos en evidencia por reacción colorimétrica con el substrato de la fosfatasa alcalina, el p-nitrofenil-fosfato (Sigma, Saint-Louis, MO, U.S.A.). La absorbancia a 405 nm se midió con un lector de microplaca (Dynatech 25000 ELISA reader, Ashford, Middlesex, UK), cada suero se determinó por duplicado. Los resultados presentados son la media de los valores obtenidos para los ratones de cada grupo. El título de anticuerpos se determinó por la última dilución induciendo una respuesta positiva significativa, es decir con un valor de densidad óptica superior al valor del ruido de fondo adicionado de 3 diferencias tipo.

Dosificados ELISPOT

Los anticuerpos específicos anti-interferón-\gamma de ratón (O1E703B2) se fijaron mediante incubación durante una noche a 4ºC en cámara húmeda, de una solución de anticuerpos de 50 \mug/ml en una microplaca ELISPOT cuyo fondo de los pocillos se cubre con nitrocelulosa (Millipore, Molsheim, F). La etapa de saturación se realizó por aporte de DMEM (Life Technologies, Grand Island, NY, U.S.A.) conteniendo un 10% de suero de ternera fetal (FCS, Fakola, CH) durante 2 horas a 37ºC. Las células obtenidas a partir de los órganos linfoides (ganglios inguinales y bazo) se pusieron en cultivo en las microplacas con 200.000 células por pocillo, y luego se co-cultivaron durante 24h a 37ºC con 100.000 células P815 impulsadas o no con el péptido corto Pb CS 245-252. Después de la incubación, las células se eliminaron y después del lavado, se añadió un segundo anticuerpo anti-IFN-\gamma de ratón biotinilado (ANI, 2 \mug/ml en PBS con un 1% de BSA) durante 2 h. Se añadió la estreptavidina conjugada con fosfatasa alcalina (Boehringer Mannheim, Mannheim, RFA) e incubó 1 h a 37ºC, se efectuaron 3 lavados con PBS conteniendo 0,05% de Tween 20, seguido de 3 lavados con PBS. La presencia de complejos inmunes anti-IFN-\gamma se puso en evidencia mediante el aporte del sustrato BCIP/NBT (Sigma, St-Louis, MO, U.S.A.). La reacción se detuvo mediante lavado con agua corriente. Los puntos positivos en IFN-\gamma se contaron entonces al microscopio binocular. Los puntos específicos corresponden a la diferencia entre el número de puntos contados en presencia de las células impulsadas con el péptido y el número de puntos contados en ausencia de péptido. Los resultados que representan son la media de los valores obtenidos para los ratones de cada grupo. Se expresan en número de puntos por millón de células cultivadas.

Resultados

Respuesta anticuerpos: la producción específica de anticuerpos anti-Pb CS His_{6}-242-310, determinada por ELISA se presenta gráficamente para los ratones que han recibido una, dos y tres inmunizaciones. El control realizado con una sola inyección del antígeno solo proporciona un título de anticuerpos muy bajo. El título de anticuerpos alcanzado con una sola inyección del antígeno mezclado con el OM-294-MP o respectivamente el OM-294-DP es ya prácticamente tan elevado como con el adyuvante de Freund incompleto (IFA) mezclado con el mismo antígeno (Fig. (13)). Después de dos inyecciones, los adyuvantes OM-294-MP y OM-294-DP son capaces de proporcionar una respuesta serológica respectivamente superior o igual a la del IFA (Fig. (14)). Después de tres inyecciones los adyuvantes OM-294-MP y OM-294-DP son capaces de proporcionar una respuesta serológica superior a la del IFA (Fig. (15)).

Fig. (13) ELISA, efectuada 3 semanas después de la primera inmunización,

Fig. (14) ELISA, efectuada 4 semanas después de la segunda inmunización,

Fig. (15) ELISA, efectuada 2 semanas después de la tercera inmunización.

Fig. (16) Título de anticuerpos antes y después de una, dos y tres inmunizaciones.

Los títulos de anticuerpos de los animales de cada grupo antes de la inmunización y después de una, dos y tres inmunizaciones se presentan como media (Fig. (16)).

Respuesta CTL: el reconocimiento del epitopo T Pb CS 245-252 presente en el péptido PB CS His_{6} -242-310 que ha servido para la inmunización es evidenciado por el ensayo de ELISPOT. La respuesta de los linfocitos T procedentes de los animales inmunizados (ganglios inguinales y bazo, extirpados una semana después de la segunda inyección y respectivamente dos semanas después de la tercera inyección) se evidenció por un aumento del número de puntos positivos para el interferón \gamma (IFN-\gamma). Los resultados presentados en las Fig. (17, 18, 19, 20) son las medias de los valores obtenidos en cada dilución y para los ratones de cada grupo. Se expresan en número de puntos por millón de células cultivadas. Los dos adyuvantes OM-294-MP y OM-294-DP aumentan de forma muy significativa la respuesta CTL de los linfocitos procedentes del bazo y de los ganglios inguinales. Las respuestas del bazo son superiores a las de los ganglios inguinales. Los adyuvantes OM-294-MP y OM-294-DP inducen una actividad CTL claramente superior a la de IFA.

9. Evidencia de la asociación no-covalente OM-294/antígeno por electroforesis capilar

La electroforesis capilar se utilizó en este ejemplo para evidenciar una asociación no covalente entre el OM-294-DP y el péptido Pb CS His_{6}-242-310 en la formulación de la preparación vaccínea.

Protocolo

Método de análisis:

-: Tampón 20 mM borato sódico (tetraborato de di-sodio decahidratado, Merck Nº 6306) pH ajustado en 7,4 con NaOH 1N (Fluka Nº 72072)

-: Capilar de zona (no injertado), longitud 30 cm, diámetro 50 \mum.

-: Detección en 200 nm en aparato Beckman PACE MDQ (Beckman, Brea, CA, U.S.A.).

Condiciones de separación

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Antígenos: Péptido sintético Pb CS His_{6}-242-310 a 1 mg/ml en H_{2}O

Adyuvante: OM-294-DP a 1 mg/ml en H_{2}O

Mezcla antígeno/adyuvante: 250 \mug/ml + 250 \mug/ml.

Resultados

La asociación antígeno/adyuvante de esta formulación de una preparación vaccínea se evidenció en el electroferograma por la desaparición del pico del adyuvante y el desplazamiento del pico del antígeno en beneficio de un nuevo pico específico de la asociación (Fig. (21)).

10. Tratamiento de una carcinomatosis peritoneal inducida por la inyección de células de la clase tumoral singénica PROb en la rata BDIX

El objetivo de este ensayo es evidenciar un efecto antitumoral del OM-294-DP administrado por vía parenteral i.v. repetida en las ratas portadoras de tumores macroscópicos de algunos mm.

Protocolo

Los animales: la estirpe de ratas BDIX consanguíneas fue establecida en 1937 por H. Druckrey. Una pareja de ratas procedente del Max Planck Institut de Fribourg (RFA) fue el origen de la colonia mantenida desde 1971 en el animalario del laboratorio por el sistema de raza única. Según este sistema, en cada generación, una sola pareja hermano-hermana es elegida para proporcionar los descendientes de la generación siguiente. Las ratas utilizadas para este trabajo proceden del Centre d'Elevage des Animaux de Laboratoire d'Iffa-Credo (el Arbresle, F) a quien el laboratorio ha confiado la cría de la estirpe. Las ratas utilizadas son machos con edades de 3 meses \pm 1 semana.

Inducción de tumores por inyección de células PROb

Origen de las células PROb: un injerto de un fragmento de carcinoma cólico inducido en una rata BDIX consanguínea por la 1,2-dimetil-hidrazina es el origen de la clase celular DHD/K12. Esta clase de células adherentes se subdividió en dos subclases en función de la sensibilidad de las células a la tripsina, y se denominaron DHD/K12-TR desprendiéndose difícilmente las células. Las células DHD/K12-TR inyectadas a ratas BDIX singénicas inducen tumores progresivos. Esta clase se clonó, solo el clon DHD/K12-TRb designado ulteriormente por PROb fue utilizado para este trabajo.

Condiciones de cultivo: las células PROb, adherentes, se cultivaron en frascos de cultivo cerrados (Falcon, Becton Dickinson, New-Jersey, USA), a 37ºC en medio completo compuesto por el medio F10 de Ham (Bio-Whittaker, Walkersville, USA) al cual se añadió un 10% de suero de ternera fetal (FCS, Anval, Betton, F). Este medio de cultivo se cambió cada 3 días. En esta confluencia, las células se desprendieron de su soporte mediante 2 ml de una solución de EDTA/tripsina en 3 a 5 min, esto después de 3 aclarados con 2 ml de la misma solución durante 2 a 3 min; las células se recuperaron mediante medio completo, bloqueando el FCS la acción de la tripsina. La ausencia de contaminación de las células por micoplasmas y bacterias se comprobó regularmente por coloración del ADN con el fluoro-cromo Hoechst 33258 (Aldrich Chimie, Steinheim, RFA).

Inducción de la carcinomatosis peritoneal: las células PROb se desprendieron de su soporte como se ha indicado en el párrafo "condiciones de cultivo" y se contaron en una solución de azul tripano, colorante que permite apreciar la viabilidad celular. Las células se pusieron en suspensión en el medio F10 de Ham. Las carcinomatosis peritoneales se indujeron por inyección intraperitoneal (i.p.) de 10^{6} células PROb viables a una rata BDIX singénica anestesiada con éter. El día D0 corresponde al día de inyección de las células tumorales. En estas condiciones, todas las ratas desarrollan una carcinomatosis peritoneal con producción de ascitis hemorrágica y mueren entre la 6ª y la 12ª semana después de la inyección de las células.

Tratamiento de las carcinomatosis peritoneales: el tratamiento comenzó 13 días después de la inyección de las células tumorales cuando las carcinomatosis están constituidas por nódulos de algunos mm de diámetro. Consiste en 10 inyecciones i.v. de OM-294-DP a la dosis de 1 mg/kg y a la concentración de 0,6 mg/ml disuelto en NaCl 0,9%. Las inyecciones se realizaron 3 veces por semana (lunes, miércoles y viernes) en la vena del pene. El grupo testigo se trató con el vehículo solo NaCl al 0,9%.

Evaluación de la eficacia del tratamiento: al día 42, 6 semanas después de la inyección de las células tumorales, las ratas se sacrificaron y se les practicó la autopsia, las carcinomatosis se evaluaron a ciegas. No es posible medir el volumen de una carcinomatosis, por el contrario es posible clasificar las carcinomatosis en diferentes categorías. Se definieron cinco clases en función del número y del diámetro de los nódulos:

-: Clase 0: ningún nódulo es visible

-: Clase 1: nódulos de 0,1 a 0,2 cm de diámetro pueden ser contados

-: Clase 2: numerosos nódulos de 0,1 a 0,5 cm que no pueden ser contados

-: Clase 3: los nódulos, de los cuales algunos alcanzan un cm de diámetro, invaden la cavidad peritoneal

-: Clase 4: la cavidad está completamente invadida por masas tumorales de varios cm.

Evolución del volumen de la ascitis y del peso de los animales: el volumen de ascitis se midió por doble pesado de las ratas. Un grupo de ratas testigo, que no han tenido ningún tratamiento pero si inyecciones de NaCl al 0,9%, permitió apreciar la evolución normal de la carcinomatosis y evaluar el efecto del tratamiento.

Determinación de la eficacia del tratamiento: el tiempo de vida de las ratas de los grupos tratados se comparó con el del grupo testigo; el volumen de las carcinomatosis y de las ascitis de ratas de los grupos tratados se compararon con los de las ratas del grupo testigo.

Estudio estadístico: El significado estadístico del efecto de la inmunoterapia se determinó por un ensayo de Kruskal-Wallis para la clasificación de las carcinomatosis, un ensayo de análisis de variancia para el volumen de ascitis, un ensayo de log rank para las supervivencias.

Resultados

Carcinomatosis: el OM-294-DP muestra una actividad antitumoral notable en esta modalidad. Esta actividad se evidencia más particularmente por el número de animales sin tumores (clase 0) y la diferencia con el testigo NaCl es significativa (p<0;05) para el volumen tumoral. El impacto del tratamiento con OM-294-DP sobre el volumen de ascitis es también significativo (p<;0,05).

TABLA (a) Clase de carcinomatosis y volumen de ascitis

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Supervivencia

Los animales se sacrificaron el D42. La supervivencia se determinó al 42º día después de la inyección de las células tumorales, el 90% de los animales tratados con OM-294-DP han supervivido, mientras que en el grupo sin tratar solo el 20% de los animales se encontraban aún con vida. El OM-294-DP prolonga de forma significativa la supervivencia de las ratas (p<0,001).

Peso

El OM-294-DP no tiene efecto significativo sobre la evolución del peso con relación a los animales que han recibido el NaCl solo como lo indican los valores de la tabla (b).

TABLA (b) Evolución de los pesos de las ratas (medias ^{+} diferencia-tipo)

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11. Evaluación de las propiedades del adyuvante OM-294-DP en un modelo de inmunización en el ratón por vía nasal con la subunidad B de la ureasa de Helicobacter pylori

Se ha demostrado que los ratones pueden ser protegidos de una infección por Helicobacter pylori inmunizándolos por vía oral o nasal con la subunidad B de la ureasa de Helicobacter pylori (UreB) en presencia del adyuvante cholera toxin (CT) Corthésy-Teulaz I. et al, Gastroenterology 109 (1995) 115.; Michetti P et al, Gastroenterology 116 (1999) 804; Saldinger P.F. et al, Gastroenterology 115 (1998) 891. Esta respuesta humoral anti-UreB medida en el suero de los ratones inmunizados es principalmente del tipo IgG1 (respuesta Th2). El efecto adyuvante del OM-294-DP se evaluó en ratones BALB/c (n=6) inmunizados 4 veces con una semana de intervalo por vía nasal con la subunidad B de la ureasa de Helicobacter pylori recombinante (UreB) en presencia del adyuvante OM-294-DP. Ratones BALB/c testigos se inmunizaron con el adyuvante OM-294-DP solo. Dos semanas después de la última inmunización, se extrajo sangre de cada ratón y se efectuó el dosificado por ELISA de inmunoglobulinas anti-UreB en el suero (IgG totales, IgG1 e IgG2a).

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Protocolo

Animales: Ratones BALB/c/Ola/HsD (Harland, Horst, Holanda): 24 ratones

Antígeno: HpUreB 1-569, expresada como proteína recombinante en E. coli (cepa M15, Qiagen, Hilden, D) según el protocolo anteriormente descrito (Michetti et al, Gastroenterology 107 (1994) 1002).

Adyuvante: OM-294-DP (solución stock a 2,2 mg/ml)

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Protocolo de inmunización

Se formaron cuatro grupos de 6 ratones:

- Grupo A:: 6 ratones BALB/c se inmunizaron 4 veces por vía nasal con 25 \mug OM-294-DP solo (25 \mul por dosis) una vez por semana durante 4 semanas consecutivas.

- Grupo B:: 6 ratones BALB/c se inmunizaron 4 veces por vía nasal con 50 \mug UreB 1-569 + 25 \mug OM-294-DP (25 \mul por dosis) una vez por semana durante 4 semanas consecutivas.

Dos semanas después de la última inmunización nasal, se extractó sangre de cada ratón de los grupos A y B por la cola.

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Dosificado de los IgG en el suero

Tampón de recubrimiento (pH 9,6): para 1 litro, Na_{2}CO_{3} (15 mM, 1,59 g), NaHCO_{3} (34,8 mM, 2,93 g), Thimerosal (0,01%);

Tampon PBS-Tween pH 7,4: para 1 litro, NaCl (137 mM, 8,0 g), KH_{2}PO_{4} (1,5 mM, 0,2 g), Na_{2}HPO_{4} (8,0 mM, 1,15 g), KCl (2,7 mM, 0,2 g), Tween 20 (0,1%, 1 ml);

Tampón citrato/fosfato pH 5,0: para 1 litro, ácido cítrico (44,4 mM, 9,32 g), Na_{2}HPO_{4} (103 mM, 14,6 g);

Solución sustrato (O-fenil diamina = OPD) 10 x conc: OPD (10 mg/ml en tampón citrato);

Solución de aciduro de sodio: 1%;

Solución stop: 0,01% de aciduro de sodio en tampón citrato/fosfato 0,1 M pH 5,0.

Método: se preparó una solución de antígeno (UreB 1-569 del 26.05.1999, solución stock 0,5 mg/ml) a la concentración de 5 \mug/ml en el tampón de recubrimiento pH 9,6 (para 50 ml de tampón, 500 \mul de la solución de UreB). Se pipetaron 100 \mul por pocillo en 3 placas de 96 pocillos con fondos redondos (0,5 \mug de UreB por pocillo). Se dejaron incubar las placas 2 horas a 37ºC. Se eliminó el sobrenadante de las placas. Se saturaron los pocillos añadiéndoles 100 \mul de una solución de PBS-Tween 0,1% + 5% leche en polvo por pocillo. Se incubaron las placas durante 30 minutos a 37ºC. Se eliminó la solución de saturación y se lavaron 3 veces los pocillos con 100 \mul de PBS-Tween. Se eliminó el sobrenadante. Se preparó una dilución de 1:200 de cada suero de ratón a someter a ensayo en tampón PBS-Tween 0,1% (5 \mul de suero en 1 ml de tampón PBS-Tween). Los sueros (100 \mul) se repartieron por duplicado en las 3 placas (1 placa para detectar los IgG totales, 1 placas para detectar los IgG1 y 1 placa para detectar los IgG2a). Se incubaron toda la noche a 4ºC. Se lavaron los pocillos 3 veces con 100 \mul de PBS-Tween. Se preparó una dilución 1 : 500 de las soluciones de anticuerpos anti-IgG totales acoplada a la biotina (Amersham, Cat #RPN 1177), anticuerpo anti-IgG1 (Amersham Cat # RPN 1180) y anticuerpos anti-IgG2a (Pharmingen Cat #02012D) en el tampón PBS-Tween. Se añadieron 100 \mul de la solución de anticuerpos anti-IgG totales a la placa nº 1, 100 \mul de la solución de anticuerpos anti-IgG1 a la placa nº 2 y 100 \mul de la solución de anticuerpos anti-IgG2a a la placa nº 3. Se incubó 1 hora a 37ºC. Se lavaron los pocillos 3 veces con PBS-Tween. Se preparó una dilución 1/1000 de estreptavidina-HRP (Dako, Cat # p0397) en el tampón PBS-Tween y se añadieron 100 \mul por pocillo. Se incubaron 30 minutos a 37ºC. Se lavaron los pocillos 3 veces con 100 \mul de tampón PBS-Tween. Se preparó la solución de sustrato diluyendo 1/10 la solución de OPD (10X) en el tampón citrato/fosfato 0,1M. Se añadió 1 \mul por ml de H_{2}O_{2} en la solución de OPD diluida. Se añadieron 50 \mul de la solución sustrato a cada pocillo. Se esperó de 10 a 20 minutos a que la coloración se desarrolle. Se detuvo la reacción añadiendo 50 \mul de tampón stop. La absorbancia fue leída a 492 nm (con 620 nm de referencia de lectura) utilizando el testigo negativo como cero.

Estadísticas: Los resultados se presentan como media \pm SD (n=6). Los valores de p se calcularon por el ensayo de Student. Los valores de p < 0,05 se consideraron como significativos.

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Resultados

Los ratones inmunizados por vía nasal con UreB 1-569+OM-294-DP desarrollan una inmunidad humoral anti-UreB: presencia de anticuerpos IgG1 anti-UreB 1-569 en la sangre.

La presencia de anticuerpos específicos contra la UreB de Hp en el suero de los ratones se midió mediante ELISA. La UreB (0,5 \mug/pocillo) se depositó en placas de 96 pocillos con fondos redondos en un tampón carbonato a un pH de 9,6. Los anticuerpos específicos se detectaron con la ayuda de anticuerpos de conejo anti-.IgG totales, IgG1 e IgG2a. Los resultados se facilitan en densidad óptica (OD) medidos a 492 nm. Los valores de OD 3 veces superiores a los valores medidos en el suero de los ratones no experimentados se consideraron como positivos. Ningún anticuerpo anti-UreB se detectó en el suero de los ratones inmunizados por OM-294-DP solo. Los ratones inmunizados por UreB+OM 294-DP desarrollan igualmente anticuerpos IgG totales anti-UreB (OD = 0,274 \pm 0,130, p<0,05) e IgG1 anti-UreB (OD=0,212 \pm 0,128, p<0,05), pero no desarrollan anticuerpos IgG2a anti-UreB (OD = 0,008 \pm 0,005, ns).

Ratones BALB/c inmunizados por vía nasal con la subunidad B de la ureasa de Helicobacter pylori (UreB) + OM-294-DP desarrollan, una respuesta humoral anti-UreB mayoritariamente de tipo IgG1. El OM-294-DP puede por consiguiente actuar como adyuvante por vía nasal y ayudar a desarrollar una inmunidad humoral de tipo Th2.

12. OM-294-MP y OM-294-DP combinados con el antígeno H1N1: determinación de anticuerpos específicos generados en el ratón después de 1 ó 2 administraciones por vía subcutánea

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Protocolo

El fin de este estudio es demostrar el efecto adyuvante del OM-294-MP y OM-294-DP para el antígeno gripal H1N1 (haemagglutinine A/Beijing 262/95, Solvay Duphar, Weesp, NL). Para ello 60 ratones BALB/c (hembras, de 8 semanas de edad al comienzo del tratamiento) se repartieron en los 6 grupos siguientes:

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Antígeno: la solución madre de H1N1 se preparó a la concentración de 24 \mug/ml en 0,9% de NaCl.

Adyuvantes: las soluciones madre de OM-294-DP y OM-294 MP se prepararon a 1 mg/ml en agua para inyección, adicionada con un 0,1% de trietanol-amina para el OM-294-MP- El testigo negativo está constituido por una solución del 0,9% de NaCl sin antígeno.

Mezcla de antígeno-adyuvante: los adyuvantes se colocaron 20 minutos a 37ºC antes de ser sometidos a vorticidad durante 3 minutos. Luego el antígeno y el NaCl (0,9%) se añadieron como se ha indicado en la tabla dada anteriormente, y la mezcla de antígeno/adyuvante se realizó una vorticidad brevemente antes de ser puesta en un agitador rotativo durante 15 minutos a temperatura ambiente, y luego se realizó una vorticidad de todo durante 3 minutos.

Inmunizaciones: las inyecciones tuvieron lugar en los días 0 y 14. Las mezclas indicadas en la tabla precedente se administraron por vía subcutánea (75 \mul por flanco, con un total de 150 \mul por animal). Las tomas de sangre tuvieron lugar en los días 14 y 28 (punción orbital).

Dosificado de las inmunoglobulinas anti-H1N1: las inmunoglobulinas séricas específicas para H1N1 siguientes se determinaron por duplicado mediante ELISA : IgG1, IgG2a, e IgM. En resumen, placas de micropocillos (NUNC Immunoplate, Roskilde, DK) se incubaron (coating overnight) a 4ºC con 100 \mul de H1N1 (0,5 \mug) en un tampón de bicarbonato (pH 9,6). Después del lavado con 0,5% Tween-20 (Merk, Hohenbrunn, D), los sueros se diluyeron 50, 200 y 800 veces (solución de dilución: phosphate buffered saline (PBS) + 1% de albúmina sérica bovina (BSA, Sigma, St. Louis, Mo. U.S.A.) + 0,02% Tween 20)). Se añadieron 100 \mul de cada uno de los sueros diluidos a los pocillos. Esta incubación duró 45 minutos a 37ºC.

Después de un segundo lavado, los IgG1, IgG2a e IgM específicos para H1N1 se incubaron 30 minutos a 37ºC con 100 \mul de los anticuerpos (rata anti-ratón) anti-IgG1 conjugados con peroxidasa (Serotec, Oxford, UK.), IgG2a conjugados con la peroxidasa (Pharmingen, San Diego, CA, U.S.A.) e IgM conjugados con biotina (Pharmingen San Diego, CA, U.S.A.), previamente diluidos en tampón PBS/BSA/Tween (diluciones: 250 1000, y 500 veces respectivamente). Para los IgM después de un lavado suplementario, una 3ª incubación fue necesario (30 min a 37ºC) con una solución 1/100 de estreptavidina conjugada con la peroxidasa (Dako, Glostrup, DK).

Después del lavado, 100 \mul de una solución de fenilén-1,2-diamina (OPD, Merck, Darmstad, RFA) se añadieron para detectar la peroxidasa conjugada con los anticuerpos secundarios anti-IgG1 y anti-IgG2a (mientras que para los IgM, el reactivo utilizado es el 3',3',5',5'-tetrametil-bencidina (TMB, Sigma, St. Louis, Mo, U.S.A.). Después de una incubación de 20 minutos a temperatura ambiente, la reacción se detuvo mediante aporte de 100 \mul de 2N H_{2}SO_{4}. Las absorbancias se midieron a 490 nm con un lector de placas Bio Rad 3550.

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Resultados

Los resultados de cada medición a 490 nm se expresaron en Unidades Arbitrarias (U.A) por ml. Esto es posible por la comparación de cada muestra con una referencia preparada a partir de diluciones de un conjunto de muestras de 28 días procedentes del grupo B (animales inyectados con H1N1 solo). Por definición el conjunto de muestras diluido 50 veces a la concentración de 1000 U.A./ml. Los resultados individuales se corrigieron seguidamente según el factor de dilución correspondiente (50, 200, u 800 veces). Aquí solo se indica la media de cada grupo y la diferencia standard (SD).

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TABLA a) Inmunoglobulinas específicas contra H1N1 de la subclase IgG1 (Unidades arbitrarias/ml +SD, ** P<0,01 (tests Anova + Dunnetss (two sided))

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TABLA b) Inmunoglobulinas específicas contra H1N1 de la sub-clase IgG2a (Unidades arbitrarias/ml + SD, ** P<0,01 (tests Anova + Dunnetts test (two sided))

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TABLA c) Inmunoglobulinas específicas contra H1N1 de la sub-clase IgM (Unidades arbitrarias/ml + SD, * P<0,05 y ** P<0,01(Anova + Dunnetts (two sided))

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Estos resultados indican que los adyuvantes OM-294-MP y OM-294-DP son activos en el modelo estudiado, ya que aumentan a menudo de forma significativa después de una o dos inyecciones (ver figuras 22, 23, 24) los anticuerpos específicos anti-H1N1 producidos por el ratón, esto sea cual fuere la subclase de inmunoglobulina analizada (IgG1, IgG2a, e IgM).

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13. El OM-294-MP y OM-294-DP combinados con el antígeno ovalbúmina: determinación de anticuerpos específicos generados en el ratón después de 1 ó 2 administraciones por vía subcutánea Protocolo

El fin de este estudio es mostrar el efecto adyuvante del OM-294-MP y del OM-294-DP para el antígeno ovalbúmina (Fluka Chemie, Buchs, CH). Para ello se repartieron 50 ratones BALB/c (hembras, de 8 semanas de edad al comienzo del tratamiento) en los cinco grupos siguientes:

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Antígeno: la solución madre de ovalbúmina se preparó a la concentración de 0,5 mg/ml en 0,9% de NaCl.

Adyuvantes: las soluciones madre de OM-294-DP y OM-294-MP se prepararon a 1 mg/ml en agua para inyección, adicionada con un 0,1% de trietanol-amina para el OM-294-MP. El testigo negativo está constituido por una solución de un 0,9% de NaCl sin antígeno.

Mezcla de antígeno-adyuvante: los adyuvantes se colocaron 20 minutos a 37ºC antes de ser sometidos a vorticidad durante 3 minutos. Luego se añadieron el antígeno y el NaCl (0,9%) como se ha indicado en la tabla dada anteriormente, y la mezcla de antígeno/adyuvante se sometió a vorticidad antes de ser puesta en un agitador rotativo durante 15 minutos a temperatura ambiente, y luego se sometió a vorticidad durante 3 minutos.

Inmunizaciones: las inyecciones tuvieron lugar en los días 0 y 14. Las mezclas indicadas en la tabla precedente se administraron por vía subcutánea (75 \mul por flanco, en total 150 \mul por animal). Las tomas de sangre tuvieron lugar en los días 14 y 28 (punción orbital).

Dosificado de las inmunoglobulinas anti-ovalbúmina: las inmunoglobulinas séricas siguientes específicas para la ovalbúmina se determinaron por duplicado mediante ELISA: IgG1, IgG2a, e IgM. En resumen, se incubaron placas de micropocillos (NUNC Immunoplate, Roskilde, DK) (coating overnight) a 4ºC con 100 \mul de ovalbúmina (0,5 \mug) en un tampón bicarbonato (pH 9,6). Después del lavado con un 0,5% de Tween-20 (Merck, Hohenbrunn, D) los sueros se diluyeron 50, 200 y 800 veces (solución de dilución: phosphate buffered saline (PBS) + 1% de albúmina sérica bovina (BSA, Sigma, St. Louis, MO, U.S.A.) + 0,02% Tween-20). Se añadieron a los pocillos 100 \mul de cada uno de los sueros diluidos. Esta incubación duró 45 minutos a 37ºC.

Después de un segundo lavado, los IgG1, IgG2a e IgM específicos para la ovalbúmina se incubaron 30 minutos a 37ºC con 100 \mul de los anticuerpos (rata anti-ratón) anti-IgG1 conjugados con la peroxidasa (Serotec, Oxford, UK), IgG2a conjugados con la peroxidasa (Pharmingen, San Diego, CA, U.S.A.) e IgM conjugados con la biotina (Pharmingen, San Diego, CA, U.S.A.), previamente diluidos en el tampón PBS/BSAT/Tween (diluciones: 250, 1000 y 500 veces respectivamente). Para los IgM, después de un lavado suplementario, fue necesario una 3ª incubación (30 min a 37ºC con una solución 1/100 de estreptavidina conjugada con la peroxidasa (Dako, Glostrup, DK).

Después del lavado, se añadieron 100 \mul de una solución de fenilén-1,2-diamina (OPD, Merck, Darmstad, RFA) para detectar la peroxidasa conjugada con los anticuerpos secundarios anti-IgG1 y anti-IgG2a (mientras que para los IgM, el reactivo utilizado es la 3',3',5',5'-tetrametil-bencidina (TMB, Sigma, St. Louis, MO, U.S.A.). Después de una incubación de 20 minutos a temperatura ambiente (40 minutos para el TMB), la reacción se detuvo mediante el aporte de 100 \mul de 2N H_{2}SO_{4}. Las absorbancias se midieron a 490 nm con un lector de placas Bio Rad 3550.

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Resultados

Los resultados de cada medición a 490 nm se expresaron en Unidades Arbitrarias (U.A.) por ml. Esto es posible por comparación de cada muestra con una referencia preparada a partir de diluciones de un conjunto de muestras de 28 días procedentes del grupo B (animales inyectados con ovalbúmina sola). Por definición el conjunto de muestras diluido 50 veces se encuentra a la concentración de 1000 U.A./ml. Los resultados individuales se corrigieron seguidamente según el factor de dilución correspondiente (50, 200, u 800 veces). Se indica aquí solo la media de cada grupo y la diferencia standard (SD).

TABLA (a) Inmunoglobulinas específicas contra ovalbúmina de la subclase IgG1 (Unidades arbitrarias/ml ^{+} SD, ** P<0,01 (test Anova + Dunnetts (two sided))

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TABLA (b) Inmunoglobulinas específicas contra ovalbúmina de la subclase IgG2 (Unidades arbitrarias/ml ^{+} SD, ** P<0,05 (test Anova + Dunnetts (two sided))

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TABLA (c) Inmunoglobulinas específicas contra ovalbúmina de la subclase IgM (Unidades arbitrarias/ml ^{+} SD)

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Estos resultados indican que los adyuvantes OM-294-MP y OM-294-DP son activos en el modelo estudiado, ya que aumentan significativamente (para las subclases IgG1 e IgG2a) después de 1 ó 2 inyecciones (ver figuras 25, 26, 27) los anticuerpos específicos anti-ovalbúmina producidos por el ratón.

14. OM-294-MP y OM-294-DP combinados con el antígeno TT (Tetanus Toxoid): determinación de anticuerpos específicos generados en el ratón después de 1 ó 2 administraciones por vía subcutánea Protocolo

El fin de este estudio es mostrar el efecto adyuvante de OM-294-MP y de OM-294-DP para el antígeno TT (Massachusetts Biologic Laboratories, MA, U.S.A.). Para ello se repartieron 40 ratones BALB/c (hembras, de 8 semanas de edad al comienzo del tratamiento) en los 4 grupos siguientes:

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Antígeno: Se preparó la solución madre de TT a la concentración de 0,2 mg/ml en 0,9% de NaCl

Adyuvantes: se prepararon las soluciones madre de OM-294-DP y de OM-294-MP a 1 mg/ml en agua para inyección, adicionada con 0,1% de trietanol-amina para el OM-294-MP. El testigo negativo está constituido por una solución de 0,9% de NaCl sin antígeno.

Mezcla de antígeno-adyuvante: los adyuvantes se colocaron 20 minutos a 37ºC antes de ser sometidos a vorticidad durante 3 minutos. Luego se añadieron el antígeno y el NaCl (0,9%) como se ha indicado en la tabla anteriormente citada, y la mezcla de antígeno/adyuvante se sometió a vorticidad antes de ser puesta en un agitador rotativo durante 15 minutos a temperatura ambiente, luego todo se sometió a vorticidad durante 3 minutos.

Inmunizaciones: las inyecciones tuvieron lugar en los días 0 y 14. Las mezclas indicadas en la tabla precedente se administraron por vía subcutánea (75 \mul por flanco, en total 150 \mul por animal) Las tomas de sangre tuvieron lugar en los días 14 y 28 (punción orbital).

Dosificado de las inmunoglobulinas anti-TT: las inmunoglobulinas séricas específicas para TT siguientes se determinaron por duplicado mediante ELISA: IgG1, IgG2a, e IgM. Placas de micropocillos (NUNC Immunoplate, Roskilde, DK) se incubaron (coating overnight) a 4ºC con 100 \mul de TT (0,5 \mug) en un tampón bicarbonato (pH 9,6). Después del lavado con 0,5% de Tween-20 (Merck, Hohenbrunn, RFA) los sueros se diluyeron 50, 200 y 800 veces (solución de dilución: phosphate buffered saline (PBS) + 1% de albúmina sérica bovina (BSA, Sigma, St. Louis, MO, U.S.A.) + 0,02% Tween-20)). Se añadieron 100 \mul de cada uno de los sueros diluidos a los pocillos. Esta incubación duró 45 minutos a 37ºC.

Después de un segundo lavado, los IgG1, IgG2a e IgM específicos para TT se incubaron 30 minutos a 37ºC con 100 \mul de los anticuerpos (rata anti-ratón) anti-IgG1 conjugados con peroxidasa (Serotec, Oxford, UK,), IgG2a conjugados con peroxidasa (Pharmigen, San Diego, CA, U.S.A.) e IgM conjugados con la biotina (Pharmingen, San Diego, CA, U.S.A.), previamente diluidos en el tampón PBS/BSA/Tween (diluciones: 250, 1000, y 500 veces respectivamente). Para los IgM, después de un lavado suplementario, una 3ª incubación fue necesaria (30 min a 37ºC con una solución 1/100 de estreptavidina conjugada con peroxidasa (Dako, Glostrup, DK).

Después del lavado, se añadieron 100 \mul de una solución de fenilén-1,2-diamina (OPD, Merck, Darmstad, RFA) para detectar la peroxidasa conjugada con los anticuerpos secundarios anti-IgG1 y anti-IgG2a (mientras que para los IgM, el reactivo utilizado es la 3', 3', 5', 5'-tetrametil-bencidina (TMB, Sigma, St. Louis, Mo)). Después de una incubación de 20 minutos a temperatura ambiente (40 minutos para el TMB), la reacción se detuvo mediante aporte de 100 \mul de 2N H_{2}SO_{4}. Las absorbancias se midieron a 490 nm con un lector de placas Bio Rad 3550.

Resultados

Los resultados de cada medición para la inmunoglobulina IgG1 e IgG2a a 490 nm se expresaron en Unidades Arbitrarias (U.A.) por ml. Esto es posible comparando cada muestra con una referencia preparada a partir de diluciones de un conjunto de muestras a los 28 días procedente del grupo B (animales inyectados con TT solo). Por definición el conjunto de muestras diluido 50 veces se encuentra a la concentración de 1000 U.A./ml. Los resultados individuales son corregidos según el factor de dilución correspondiente (50, 200, u 800 veces). Aquí solo se indica la media de cada grupo y la diferencia standard (SD).

En lo que respecta a la determinación de los IgM específicos para TT, como el "ruido de fondo" de la medición es demasiado elevado, ninguna diferencia clara entre el grupo B (TT solo) y los grupos C y D (TT con adyuvantes) puede descubrirse midiendo los IgM específicos de la misma forma que los IgG1 y los IgG2a. Por el contrario, se ha podido medir el título de los IgM específicos, utilizando diluciones sucesivas de cada muestra (más bien que las U.A. descritas anteriormente), y se ha tomado en consideración para cada muestra, la dilución máxima que proporciona una absorbancia superior a la media + 3 SD de las absorbancias del grupo A (NaCl). El título así obtenido indica el número de veces que una muestra de suero puede diluirse antes de que la absorbancia obtenida a 490 nm se confunda con el ruido de fondo. Es esta dilución a la que se refiere en la Tabla (c) IgM indicada a continuación.

TABLA (a) Inmunoglobulinas específicas contra TT de la subclase IgG1 (Unidades arbitrarias/ml ^{+} SD, ** P<0,01 (Anova + Dunnetts test (two sided))

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TABLA (b) Inmunoglobulinas específicas contra TT de la subclase IgG2 (Unidades arbitrarias/ml ^{+} SD, ** P<0,01 (Anova + Dunnetts Test (two sided))

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TABLA (c) Título de las Inmunoglobulinas específicas contra TT de la subclase IgM (diluciones para cada muestra proporcionando una señal a 490 nm superior a la de la media + 3 SD de la del grupo A)

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Estos resultados indican que los adyuvantes OM-294-MP y OM-294-DP son activos en el modelo estudiado, ya que aumentan a menudo de forma significativa después de 1 ó 2 inyecciones (ver figuras 28, 29) los anticuerpos específicos IgG1 e IgG2a anti-TT, producidos por el ratón. Por el contrario solo algunos animales han producido IgM específicos contra TT.

15. Evaluación de las propiedades del adyuvante OM-294-MP en un modelo de inmunización en el ratón CBA por vía s.c. con el antígeno de Leishmania gp63 Protocolo

Ratones CBA recibieron en la cola con 8 días de intervalo dos inyecciones subcutáneas de 2 \mug de gp63. El adyuvante OM-294-MP se mezcló con las dos dosis de antígeno, el BCG se mezcló solamente con la primera. Cada ratón recibió 2 x 50 \mug de OM-294-MP o 200 \mug de BCG. Un grupo testigo se inyectó con el antígeno solo (sin adyuvante). Diez días después de la segunda inyección, las células de los ganglios linfáticos inguinales y periaórticos (grupos de 3 ratones) se pusieron en cultivo y la respuesta proliferativa al antígeno purificado gp63 evaluada por medición de la incorporación de timidina (^{3}H-TdR). La producción de las citoquinas IFN-\gamma e IL-4 in vitro por los linfocitos ganglionares reestimulados in vitro por el antígeno de gp63 ha sido igualmente determinada mediante ELISA (kits IFN-\gamma MIF00 e IL-4 M4000, R&D Systems Europe Ltd, Abingdon, UK) de una extracción de cada uno de los sobrenadantes de los cultivos de los linfocitos ganglionares antes del aporte de ^{3}H-TdR.

Los valores indicados en las tablas representan para la incorporación de ^{3}H-TdR, la media aritmética \pm la diferencia standard (triplicados) expresada en cpm y para las citoquinas en los sobrenadantes, la media aritmética \pm la diferencia standard (triplicados) expresada en pg por ml.

Antígeno: la solución madre de gp63 se preparó a la concentración de 40 \mug/ml en 0,9% de NaCl.

Adyuvantes: la solución madre de OM-294-MP se preparó a 1 mg/ml en agua para inyección adicionada con un 0,1% de trietanol-amina. El control negativo está constituido por una solución de PBS sin antígeno.

Mezcla de antígeno-adyuvante: los adyuvantes se colocaron 10 minutos a 37ºC antes de ser sometidos a vorticidad durante 3 minutos. Luego el antígeno (1 volumen) y el adyuvante (1 volumen) se mezclaron y sometieron a vorticidad brevemente antes de ser puestos a incubación durante 20 minutos a 37ºC, luego todo se sometió a vorticidad durante 3 minutos.

Resultados

En ratones inmunizados con el antígeno gp63, el adyuvante OM-294-MP induce una mejor respuesta de proliferación linfocitaria (Tabla (a) y Fig. 30 (a)) que el BCG. En efecto, con relación a los cultivos procedentes de animales inmunizados sin adyuvante, el aumento de la proliferación se encuentra comprendido entre 3.1 y 6 para el producto OM-294-MP mientras que la misma no sobrepasa un 3,5 en el caso del BCG (2,6 a 3,5).

En estos mismos cultivos linfocitarios, la producción de citoquinas se midió en el sobrenadante (Tabla (b) y Fig 30 (b)). Se observó que el antígeno gp63 induce la secreción de IFN-\gamma en cantidades equivalentes cuando los ratones son tratados mediante el adyuvante OM-294-MP o por el BCG. Por el contrario, el adyuvante OM-294-MP parece predisponer los linfocitos inmunes (anti-gp63) a secretar cantidades importantes de IL-4, mientras que los linfocitos de ratones tratados por el BCG secretan cantidades bajas, incluso indetectables de esta citoquina.

TABLA (a) Efecto del adyuvante OM-294-MP sobre la respuesta inmunitaria contra el antígeno gp63, medida por la proliferación de linfocitos T murinos en respuesta al antígeno gp63 in vitro

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Los valores indicados en la Tabla (a) representan la media aritmética \pm la diferencia standard de la incorporación (cultivos por triplicado).

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TABLA (b) Efecto del adyuvante OM-294-MP administrado in vivo con el antígeno gp63 sobre la producción in vitro de citoquinas por los linfocitos ganglionares

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El adyuvante OM-294-MP potencializa en ratones CBA inmunizados con gp63 (un antígeno anfifilo del parásito Leishmania) una respuesta T específica evaluada in vitro por la medición de la proliferación linfocitaria y la producción de IFN-\gamma y de IL-4 inducida por el antígeno.

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16. Eficacia del adyuvante OM-294 MP en el transcurso de la respuesta primaria T anti-LmCPb en un modelo de inmunización en el ratón CBA por vía s.c. con el antígeno de Leishmania mexicana LmCPb Protocolo

Ratones CBA recibieron en la cola una sola inyección de 2 \mug de LmCPb con o sin 50 \mug del adyuvante OM-294-MP. Un grupo de control recibió una inyección de tampón fisiológico (no inmunizado). Once días más tarde, las células de los ganglios linfáticos inguinales y periaórticos (grupos de 3 ratones) se pusieron en cultivo y la respuesta proliferativa al antígeno purificado LmCPb, en una preparación total de amastigotes de Leishmania mexicana y en concanavalina A (Con A) se evaluó por medición de la incorporación de timidina tritiada (^{3}H-TdR). La producción de las citoquinas IFN-\gamma e IL-4 por los linfocitos ganglionares reestimulados in vitro por el antígeno LmCPb de Leishmania mexicana o por los amastigotes se determinó igualmente por ELISA (kits IFN-\gamma MIF00 e IL-4 M4000, R&D Systems Europe Ltd, Abingdon, UK) en una extracción de cada uno de los sobrenadantes de los cultivos de los linfocitos ganglionares antes del aporte de ^{3}H-TdR.

Antígeno: la solución madre de LmcPb se preparó a la concentración de 40 \mug/ml en el PBS dos veces concentrado.

Mezcla de antígeno-adyuvante: los adyuvantes se pusieron 10 minutos a 37ºC antes de ser sometidos a vortización durante 3 minutos. Luego el antígeno (1 volumen) y el adyuvante (1 volumen) se mezclaron y sometieron a vortización brevemente antes de ser puestos a incubación durante 20 minutos a 37ºC, y luego se sometió todo a vortización durante 3 minutos.

Resultados

En ausencia de cualquier estimulante añadido al medio de cultivo, el adyuvante OM-294-MP favorece el desarrollo de linfocitos que proliferan espontáneamente (Tabla (a) y Fig 31 (a)) y que secretan trazas de IFN-\gamma (Tabla (b) y Fig 31 (b)). Esta respuesta se potencializa fuertemente cuando el antígeno purificado LmCPb o un extracto total de parásitos se añade a los cultivos. En este ensayo, existe influencia clara del adyuvante sobre la inducción de linfocitos sensibilizados (anti-LmCPb) capaces de secretar cantidades importantes de IL-4 (Tabla (b) y Fig 31 (b)).

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TABLA (a) Respuesta proliferativa in vitro de células ganglionares inmunizadas in vivo con LmCPb: efecto del adyuvante OM-294-MP

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TABLA (b) Secreción in vitro de citoquinas por los linfocitos ganglionares inmunizados in vivo con LmCPb: Efecto del adyuvante OM-294-MP sobre la respuesta primaria

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El adyuvante OM-294-MP es también muy eficaz en el transcurso de la respuesta T primaria (a continuación de una sola inyección vaccínea). Las características del efecto adyuvante sobre esta respuesta (aumento de la proliferación linfocitaria, inducción de citoquinas) son similares a las observadas en la respuesta a dos inyecciones vaccíneas.

17. Evaluación de las propiedades de los adyuvantes OM-294-MP y OM-294-DP en un modelo de inmunización en el ratón CBA por vía s.c. con el antígeno de Leishmania mexicana LmCPb: comparación con el BCG Protocolo

Ratones CBA (8 ratones por grupo) recibieron en la cola con 8 días de intervalo dos inyecciones subcutáneas de 3 a 5 \mug de LmCPb purificado. Los adyuvantes OM-294-DP, OM-294-MP se mezclaron con las dos dosis de antígeno, mientras que el BCG se mezcló solamente con la primera. Cada ratón recibió 2 x 50 \mug de adyuvante OM o 200 \mug de BCG. Ocho días después de la segunda inyección se extirparon los ganglios linfáticos inguinales y periaórticos (3 ratones por grupo) y las células se pusieron en cultivo para determinar la respuesta proliferativa al antígeno purificado LmCPb, o respectivamente, la respuesta proliferativa a una preparación total de amastigotes Leishmania mexicana o a la concanavalina A (Con A). La respuesta proliferativa se evaluó por medición de la incorporación de timidina tritiada (^{3}H-TdR). La producción de las citoquinas IFN-\gamma e IL-4 por los linfocitos ganglionares reestimulados in vitro por el antígeno LmCPb de Leishmania mexicana o por los amastigotes o por la Con A se determinó mediante ELISA (kits IFN-\gamma MIF00 e IL-4 M4000, R&D Systems Europe Ltd., Abingdon, UK) en una extracción de cada uno de los sobrenadantes de los cultivos de los linfocitos ganglionares antes del aporte de
^{3}H-TdR.

Los valores indicados en las tablas representan para los títulos de anticuerpos, la media aritmética \pm la diferencia standard expresadas en % del standard, para la incorporación de ^{3}H-TdR, la media aritmética \pm la diferencia standard (triplicados) expresada en cpm y para las citoquinas en los sobrenadantes, la media aritmética \pm la diferencia standard (triplicados) expresada en pg por ml.

Antígeno: la solución madre de LmCPb se preparó a una concentración comprendida entre 60 y 100 \mug/ml en 0,9% de NaCl.

Adyuvantes: las soluciones madre de OM-294-DP y OM-294-MP se prepararon a 1 mg/ml en agua para inyección, adicionada con un 0,1% de trietanol-amina para el OM-294-MP. El testigo negativo está constituido por una solución de PBS sin antígeno.

Mezcla de antígeno-adyuvante: los adyuvantes se colocaron 10 minutos a 37ºC antes de ser sometidos a vortización durante 3 minutos. Luego el antígeno (1 volumen) y el adyuvante 0,9% (1 volumen) se mezclaron y sometieron a vortización breve antes de ser puestos a incubar durante 20 minutos a 37ºC, luego se sometió todo a vortización durante 3 minutos.

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Resultados

En los ratones inmunizados con el antígeno LmCPb (Tabla (a) y (b) y Fig 32 (a, b)), los productos OM-294-MP y OM-294-DP producen un efecto similar al que ha sido observado en los ratones que desarrollan una respuesta inmune contra gp63. Así, en presencia de LmCPb (15 \mug/ml), los cultivos provienen de los ratones inmunizados con el antígeno más los adyuvantes OM-294-MP y OM-294-DP presentan una proliferación respectivamente de 23 y 28 veces más intensa que los cultivos procedentes de ratones que han recibido el antígeno solo (sin adyuvante). La influencia del BCG en estas condiciones es menor, ya que el aumento de la proliferación es de 11 veces solamente. Efectos análogos encuentran de nuevo que los cultivos son estimulados con el antígeno purificado o con un extracto total del parásito Leishmania, y con todas las concentraciones de antígeno sometidas a ensayo.

La producción de IFN-\gamma en respuesta al antígeno LmCPb tiene tendencia a ser un poco más elevada con el producto OM-294-DP que con el BCG (Tabla (b) y Fig 32 (b)). Hay que notar que en este ensayo, los linfocitos proliferan y secretan cantidades importantes de IFN-\gamma incluso si no se ha añadido antígeno al medio de cultivo. En este caso también el adyuvante OM-294-DP tiende a ser un poco más eficaz que el BCG. Una diferencia clara entre los adyuvantes OM-294-MP, respectivamente OM-294-DP y el BCG aparecía como anteriormente por lo que respecta al desarrollo de linfocitos capaces de producir el IL-4. La cantidad de IL-4 producida bajo el efecto de los adyuvantes OM-294-MP y OM-294-DP es importante ya que la misma equivale a la cantidad secretada por linfocitos expuestos a la Con A, un potente estimulante no específico de los linfocitos (ver Tabla (a) y (b)).

TABLA (a) Respuesta proliferativa in vitro de células ganglionares procedentes de ratones inmunizados in vivo con LmCPb: efecto de diferentes adyuvantes

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Los valores indicados en la tabla representan la media aritmética \pm la diferencia standard de la incorporación (cultivos por triplicado).

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TABLA (b) Producción de citoquinas in vitro por linfocitos ganglionares de ratones inmunizados in vivo mediante el antígeno LmCPb: efecto de diferentes adyuvantes

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Los adyuvantes OM-294-MP y OM-294-DP potencializan de forma eficaz la respuesta inmune a un antígeno soluble de Leishmania, la proteasa LmCPb. Esto se marca in vitro por un aumento de la respuesta proliferativa seguida de la inducción de la producción de IFN-\gamma y de IL-4 en cantidades significativas.

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Ejemplo VI

Solución acuosa inyectable

Compuesto del ejemplo III	1 g
Polysorbate 80	0,2 g
Cloruro sódico	9 g
Agua destilada para inyección csp	1000 ml

La solución se ajustó a un pH de 7,4 con HCl 0,1M y luego la misma se esterilizó por filtración sobre membrana 0,22 \mu Steritop Express 1000 (membrana PES, 90 mm, SCGP T10 RE, Millipore Corporation, Bedford, MA, U.S.A.). La solución estéril se repartió en ampollas estériles de 1 ml.

Liofilizado

Compuesto del ejemplo IV	2 g
Polysorbate 80	0,2 g
Cloruro sódico	9 g
Manitol	10 g
Ácido ascórbico	0,1 g
Agua destilada para inyección csp	1000 ml

La solución se ajustó a un pH de 7,4 con HCl 0,1M, luego la misma se esterilizó por filtración sobre membrana 0,22 \mum Steritop Express 1000 (membrana PES, 90 mm, SCGP T10 RE. Millipore Corporation, Bedford, MA, U.S.A.). La solución estéril se repartió en frascos multidosis estériles a razón de 1 ml por frasco, luego la solución se liofilizó.

Claims

1. Los compuestos de fórmula general I:

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en la cual:

-: R_{1} y R_{2} representan cada uno un grupo acilo derivado de un ácido carboxílico que tiene de 2 a 24 átomos de carbono, saturado o insaturado, lineal o ramificado, no sustituido o que lleva uno o más substituyentes seleccionados entre el grupo formado por hidroxilo, alquilo, alcoxilo, acil-oxilo, amino, acil-amino, aciltio y (alquil C_{1}-C_{24})-tio el descriptor m tiene un valor que oscila entre 1 y 4,

-: el descriptor n tiene el valor de 0,

-: el descriptor p tiene el valor 3 ó 4 y q tiene un valor de 1

-: X e Y representan cada uno un hidrógeno o un grupo fosfono, con la limitación de que uno al menos de los substituyentes X e Y representa un grupo fosfono.

2. Un compuesto según la reivindicación 1, en el cual el o los grupo(s) fosfono es (son) salificado(s) por una base mineral u orgánica.

3. Un compuesto según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, a saber los 1 y/o 10-di-bifosfato de 3-(3-dodecanoiloxi-tetradecanoil-amino)-9-(3-hidroxi-tetradecanoil-amino)-4-oxo-5-azadecano-1,10-dioles y sus sales de adición con una base mineral u orgánica.

4. Un compuesto según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, elegido entre el 1,10-bis-(di-bifosfato) de 3-(3-dodecanoiloxi-tetradecanoil-amino)-9-(3-hidroxi-tetradecanoil-amino)-4-oxo-5-azadecano-1,10-diol y sus sales de adición con una base mineral u orgánica.

5. Un compuesto según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, seleccionado entre el 1,10-bis-(di-bifosfato) de 3-(3-hidroxi-tetradecanoil-amino)-9-(3-dodecanoiloxi-tetradecanoil-amino)-4-oxo-5-azadecano-1,10-diol y sus sales de adición con una base mineral u orgánica.

6. Un compuesto según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, seleccionado entre el 1-di-bifosfato de 3-(3-dodecanoiloxi-tetradecanoil-amino)-9-(3-hidroxi-tetradecanoil-amino)-4-oxo-5-azadecano-1,10-diol y sus sales de adición con una base mineral u orgánica.

7. Un compuesto según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, seleccionado entre el 1-di-bifosfato de 3-(3-hidroxi-tetradecanoil-amino)-9-(3-dodecanoiloxi-tetradecanoil-amino)-4-oxo-5-azadecano-1,10-diol y sus sales de adición con una base mineral u orgánica.

8. Un compuesto según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, a saber un compuesto seleccionado entre el 10-di-bifosfato de 3-(3-hidroxi-tetradecanoil-amina)-9-(3-dodecanoiloxi-tetradecanoil-amino)-4-oxo-5-azadecano-1,10-diol y sus sales de adición con una base mineral u orgánica.

9. Procedimiento de obtención de los fosfo-pseudodipéptidos de fórmula general I

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en la cual:

-: R_{1} y R_{2} representan cada uno un grupo acilo derivado de un ácido carboxílico que tiene de 2 a 24 átomos de carbono, saturado o insaturado, lineal o ramificado, no sustituido o que lleva uno o varios substituyentes seleccionados entre el grupo formado por hidroxilo, alquilo, alcoxilo, acil-oxilo, amino, acil-amino, aciltio y (alquil C_{1}-C_{24})-tio

-: el descriptor m toma un valor que oscila entre 1 y 4,

-: el descriptor n toma un valor de 0,

-: el descriptor p es igual a 3 ó 4 y el descriptor q tiene el valor de 1,

-: X e Y representan cada uno un hidrógeno o un grupo fosfono, con la limitación de que uno al menos de los substituyentes X e Y representa un grupo fosfono,

que consiste en que se bloquean las funciones amina en posición no terminal (q+1) y en posición terminal \omega de un ácido diaminado de fórmula H_{2}N(CH_{2})_{p}CHNH_{2}(CH_{2})_{q-1}COOH mediante reactivos de bloqueo lábiles por acidolisis y/o hidrogenolísis, respectivamente, se somete la función carboxílica que queda libre a la acción de un agente reductor para formar el alcohol correspondiente, se libera la función amina no terminal en (q+1) que se acila con la ayuda de un derivado funcional de un ácido carboxílico de fórmula R_{2}OH en la cual R_{2} se define como anteriormente, luego se libera la función amina terminal en m mediante hidrogenolísis para obtener el amino alcohol de fórmula general II:

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en la cual:

-: p toma el valor de 1, 3 ó 4

-: y q es igual a 1,

que se condensa en presencia de un agente de condensación peptídico en un disolvente inerte con un derivado funcional de \omega-hidroxi aminado de fórmula general III:

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en la cual:

-: R_{1} es un grupo acilo derivado de un ácido carboxílico que tiene de 2 a 24 átomos de carbono, saturado o no saturado, no sustituido o que lleva uno o varios substituyentes definidos como anteriormente

-: m es un número entero que varía de 1 a 4,

-: n es igual a 0,

-: y X es un radical dialquiloxi- o diariloxi-fosforilo de fórmula:

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para formar el pseudodipéptido de fórmula general IV:

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en la cual los substituyentes R_{1}, R_{2} y los descriptores m, n, p y q están definidos como anteriormente, y R es un radical lábil por hidrogenolísis,

del cual se puede -si se desea- fosforilar la otra función alcohol mediante un agente de fosforilación, si es necesario, en presencia de un agente de copulación, y someter a una hidrogenación catalítica por una parte para desbloquear la función alcohol eventualmente presente en el grupo acilo R_{2} y por otra parte liberar la función fosfato y luego desbloquear por hidrogenolísis la segunda función fosfato eventualmente presente, con el fin de obtener el derivado de fórmula general V

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en la cual Y representa bien sea un hidrógeno o un grupo fosfono y los descriptores m, n, p y q tienen los valores proporcionados anteriormente y si se desea, se realiza la etapa suplementaria de salificación con la ayuda de una base mineral u orgánica.

10. A título de intermediarios de la síntesis de los compuestos de fórmula I, los derivados funcionales de \omega-hidroxi aminoácido de fórmula III

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en la cual:

-: R_{1} es un grupo acilo derivado de un ácido carboxílico que tiene de 2 a 24 átomos de carbono, saturado o no saturado, no sustituido o que lleva uno o varios substituyentes definidos como anteriormente,

-: m es un número entero que varía de 1 a 4,

-: n es un número igual a 0

-: y X es un radical dialquiloxi- o diariloxi-fosforilo de fórmula:

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11. A título de intermediarios de la síntesis de los compuestos de fórmula I según la reivindicación 1, los pseudodipéptidos de fórmula general IV

46

en la cual los substituyentes R_{1}, R_{2} y los descriptores m, n, p y q están definidos como en la reivindicación 1, y R es un radical alquilo o arilo, lábil por hidrogenolísis.

12. A título de intermediarios de la síntesis de los compuestos de fórmula I según la reivindicación 1, los amino-alcoholes de fórmula general II

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en la cual:

-: p representa un número entero igual a 3 ó 4,

-: y q es igual a 1.

13. Las composiciones farmacéuticas de consideración inmunológica que incluyen, a título de principio activo, al menos un compuesto de fórmula general I según la reivindicación 1,

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en la cual:

-: R_{1} y R_{2} representan cada uno un grupo acilo derivado de un ácido carboxílico que tiene de 2 a 24 átomos de carbono, saturado o insaturado, lineal o ramificado, no sustituido o que lleva uno o varios substituyentes seleccionados entre el grupo formado por hidroxilo, alquilo, alcoxilo, acil-oxilo, amino, acil-amino, aciltio y (alquil C_{1}-C_{24})-tio,

-: el descriptor m toma un valor que oscila entre 1 y 4,

-: el descriptor n es igual a 0, p toma un valor de 3 ó 4 y q es igual a 1

-: X y/o Y representan cada uno un hidrógeno o un grupo fosfono en forma neutra o cargada con la limitación de que uno al menos de los substituyentes X e Y represente un grupo fosfono,

en asociación o en mezcla con un excipiente o un vehículo inerte, no tóxico, farmacéuticamente aceptable.

14. Composiciones farmacéuticas según la reivindicación 13, en las cuales el compuesto de fórmula I es uno de aquellos para los cuales X y/o Y representan un radical fosfono.

15. Composiciones farmacéuticas según la reivindicación 13, en las cuales el principio activo se encuentra en forma salificada con una base mineral u orgánica terapéuticamente compatible.

16. Composiciones farmacéuticas según una de las reivindicaciones 13 y 15, en las cuales el principio activo se encuentra en forma enantioméricamente pura o en forma de mezcla de estereoisómeros.