WO2001046127A1 - Pseudodipeptides acyles porteurs d'un bras auxiliaire fonctionnalise - Google Patents

Pseudodipeptides acyles porteurs d'un bras auxiliaire fonctionnalise Download PDF

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WO2001046127A1
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Olivier Richard Martin
Sylvain Rodriguez
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    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to the field of chemistry, and more particularly to that of peptide chemistry. More specifically, it relates to bioconjugates of peptide derivatives with a functionalized auxiliary arm.
  • Bioconjugation involves the coupling of two or more chemical entities to form a new molecular complex with properties different from those of its individual components. Natural or synthetic products with their own pharmacological properties can thus be combined with one another to create new entities with original or improved physicochemical and pharmacological properties compared to the starting compounds.
  • the applications of bioconjugation affect all areas of human, veterinary medicine and diagnostic methods.
  • a hapten-adjuvant conjugate could prove to be very effective as a vaccination adjuvant.
  • Ikeda et al. [(1999) Chem. Pharm. Bull., 47 (4), 563-568] have presented a synthesis between a structural analogue of Lipid A and a tumor antigen of peptide nature and demonstrated in vitro mitogenic activity.
  • a more specific subject of the invention is pseudodipeptides derived from functionalized amino acids, the free amino functions of which are amidified by fatty acids and one of the ends of which carries a functionalized auxiliary arm. It specifically relates to pseudodipeptides N-acylated carriers' of an acid group in neutral form or charged at one of the ends 1 of the pseudodipeptide and carriers at the other end of a functionalized auxiliary arm, corresponding to the general formula I.
  • Ri and R 2 each represent an acyl group derived from a carboxylic acid having from 2 to 24 carbon atoms, saturated or unsaturated, linear or branched, unsubstituted or carrying one or more substituents chosen from hydroxyl, alkyl groups , aikoxy, acyloxy, amino, acylamino, acylthio and (C 1 -C 24 alkyl) thio the descriptors m, n which can take a value varying from 0 to 10 the descriptors p, q which can take a value varying from 1 to 10 X and Z represent an acid group in neutral or charged form or a functionalized auxiliary arm, with the limitation that at least one of the substituents X or Z represents a functionalized auxiliary arm, Y represents
  • the acid group X or Z will preferably be chosen from the groups:
  • auxiliary group in X or Z will be of general formula (II)
  • A can be O, S or NH
  • the descriptor r can take a value of 0 or 1
  • the descriptor s can take a value varying from 1 to 10
  • W can preferably be chosen from groups:
  • the substituents X or Z represent an acid group in neutral form, it is the carboxylic, sulfonic, phosphonic or free phosphoric form.
  • it is an acid group in charged form it is the carboxylic, sulfonic, phosphonic or phosphoric form salified, in particular by addition of an inorganic or organic base, preferably therapeutically compatible.
  • the bases are not therapeutically compatible, they can be used as a means of identification, purification or duplication.
  • alkaline bases such as sodium, potassium and lithium hydroxides, ammonium salts
  • alkaline earth bases such as calcium or strontium hydroxides, magnesium salts, ferrous metal salts and the like
  • organic bases such as those derived from primary, secondary or tertiary amines of basic amino acids such as lysine or ornithine or amino sugars.
  • Bases which cannot be used therapeutically are, for example, brucine, strychnine, N-methylglucosamine or N-methylmorpholine. As indicated above, the resulting salts will serve as a means of separation or identification.
  • the molecule can be derived from serine or aspartic acid.
  • the molecule can be derived from homoserine or glutamic acid
  • the descriptor s can take a value varying from 1 to 10, but more particularly 4, 5 or 6
  • W will preferably be chosen from groups: - formyl
  • the compounds of general formula IV are particularly preferred as currently preferred compounds:
  • Ri and R 2 each represent an acyl group derived from a carboxylic acid having from 2 to 24 carbon atoms, saturated or unsaturated, linear or branched, unsubstituted or carrying one or more substituents chosen from the group consisting of hydroxyl , alkyl, aikoxy, acyloxy, amino, acylamino, acylthio and (C 1 -C 24 alkyl) thio the descriptors m, n which can take a value varying from 0 to 10 the descriptors p, q which can take a value varying from 1 to 10 and in which X is a carboxyl or a dihydroxyphosphoryloxy radical or a carboxy [(C ⁇ -C 5 ) alkoxy] or carboxy group [(C ⁇ -C 5 ) alkylthio] and in which Z is a 6-aminohexanoyloxy radical, a 6- radical oxohexanoyloxy, a 6-hydroxy
  • the invention relates in particular as currently preferred compounds: - N - [(R) -3-dodecanoyloxytetradecanoylamino] -D-aspartic acid, ⁇ -N - ⁇ (4R) -5- hydroxy-4 - [(R) -3-hydroxytetra-decanoylamino] pentyljamide and its salts addition with a mineral or organic base
  • Ri and R 2 includes acyl derivatives with a chain of variable length ranging from 2 to 24 carbon atoms, identical or different, branched or in a straight chain, saturated or unsaturated, which can carry one or more substituents chosen from the group formed by an alkyl, amino, acylamino, hydroxyl, aikoxy, acyloxy, acylthio and alkylthio.
  • acyl groups concerned those derived from lauric acid, 3-hydroxymyristic acid, 3-lauryloxymyristic acid, acid 3-myristyloxymyristic and 3-palmityloxymyristic acid are those currently preferred.
  • Y NH
  • Z auxiliary 6-oxohexanoyl'pxy
  • R1 3-lauryloxy-myristyle
  • R2 3-hydroxymyristyle
  • Y NH
  • Z 6-amino-hexanoyloxy auxiliary
  • R1 3-lauryloxymyristyle
  • R2 3-hydroxymyristyle
  • Y NH
  • Z 6-oxohexanoyloxy auxiliary
  • R1 3-lauryloxymyristyle
  • R2 3-hydroxymyristyle
  • Y NH
  • Z 6-hydroxyhexanoyloxy auxiliary
  • R1 3-lauryloxymyristyle
  • R2 3-hydroxymyristyle
  • Y O
  • Z auxiliary (6-ox (Dhexyl) arriino
  • R1 3-lauryloxymyristyle
  • R2 3-hydroxymyristyle
  • Y NH
  • Z 6-oxohexanoyloxy auxiliary
  • R1 3-lauroyloxymyristyle
  • R2 3-hydroxymyristyle
  • These compounds are distinguished by interesting pharmacological properties, in particular immunomodulatory. They find particular interest in the preparation of vaccine compositions as covalently conjugated with antigens of polypeptide or polysaccharide nature or on compounds consisting of polypeptides conjugated to polysaccharides. They can be used in particular in the prevention of infections of viral, microbial and protozoal origin or in the therapy of certain autoimmune diseases.
  • the molecules can be used alone or in covalent association or not with a molecule of therapeutic interest by incubation extratemporarily ex vivo with blood cells in order to make the cells immunocompetent before re-inoculating them in vivo by parenteral route.
  • the molecules show similar properties, as adjuvants of the immune system used for example for vaccination, in covalent association or not with the appropriate antigens, against diseases of viral, parasitic origin, microbial and fungal. These molecules, conjugated or not, can also be used in the therapy of certain autoimmune diseases.
  • some of the compounds according to the invention show different properties in their capacity to induce the production of cytokines or the maturation of the immunocompetent stem cells originating from the hematopoietic and lymphoid organs.
  • Some of the compounds according to the invention promote the maturation and differentiation of monocytes into functional dentritic cells, in the presence or in the absence of the appropriate antigen and thus contribute to strengthening humoral and cellular immunity.
  • the compounds according to the invention are particularly advantageous d j made of! their low toxicity. They are used in covalent association or not with antigens in the prevention or therapy of infectious diseases in humans and in animals at doses which vary from 0.005 mg to 100 mg per unit dose and from 0.005 to 200 mg per day as indicated.
  • the present invention also relates to a process for obtaining N-acylated pseudodipeptides carrying an acid group in neutral form or charged at one end of the pseudodipeptide and carrying at the other end a functionalized auxiliary, corresponding to the general formula I, which consists in blocking the amino functions in position (q + 1) and YH in position ⁇ of an amino acid ⁇ -functionalized by orthogonal blocking reagents, the carboxylic function remained free to the action of a reducing agent to rmer the corresponding alcohol, the amino function is released in position (q + 1) which is acylated using a functional derivative of a carboxylic acid of formula R 2 OH in which R2 is defined as above, then releases the terminal function to obtain the functionalized amino alcohol of general formula V
  • Y represents HO or preferably NH 2
  • R 2 represents an acyl group derived from carboxylic acid having from 2 to 24 carbon atoms, saturated or unsaturated, unsubstituted or bearing one or more substituents defined as above
  • p and q each represent a whole number varying from 1 to 10 which is condensed in the presence of a peptide condensing agent in an inert solvent, with a derivative of a ⁇ -functionalized amino acid of general formula VI
  • Ri is an acyl group derived from a carboxylic acid having from 2 to 24 carbon atoms, saturated or unsaturated, unsubstituted or bearing one or more substituents defined as above
  • m and n is an integer varying from 0 to 10
  • X is an acid group defined as above which can be in esterified form to form the pseudodipeptide of general formula VII
  • A- (CO) r (CH 2 ) s -W (VIII) A can be a leaving group, an OH, SH or NH2 function, the descriptor r preferably being 1, but can also take a value of O the descriptor s preferably being between 2 and 6, but may take a value varying from 1 to 10
  • W being preferably chosen from the groups, -formyl, -acetyl, -cyano, - halo, -amino, -bromo or iodoacetamido, -acylamido, -diacylimido, -sulfhydryl, - alkylthio, -hydroxyl, -acyloxy, -vinyl, -ethynyl, -carboxyl free or present in the form of ester, mixed anhydride, amide or hydrazide, -azido, -thiocyano or their precursors.
  • the invention also relates to a process for obtaining phosphopseudodipeptides of general formula IV
  • Ri and R 2 each represent an acyl group derived from a carboxylic acid having from 2 to 24 carbon atoms, saturated or unsaturated, linear or branched, unsubstituted or carrying one or more substituents chosen from the group consisting of hydroxyl , alkyl, aikoxy, acyloxy, amino, acylamino, acylthio and (C1-C24 alkyl) thio the descriptors m, p and q which can take a value ranging from 1 to 10 the descriptor n which can take a value ranging from 0 to 10 in which X and Z each represent an acid group or a functionalized auxiliary, characterized in that the amino functions are blocked in position (q + 1) and in ⁇ of a diamine acid of formula H 2 N (CH 2 ) p CHNH 2 (CH 2 ) q - ⁇ COOH by labile blocking reagents by acidolysis and hydrogenolysis, respectively, subjects the carboxylic function remaining free
  • R 2 represents an acyl group derived from carboxylic acid having from 2 to 24 carbon atoms, saturated or unsaturated, unsubstituted or bearing one or more substituents defined as above
  • p and q represent a number integer varying from 1 to 10 which is condensed in the presence of a peptide condensing agent in an inert solvent with a ⁇ -hydroxylated amino acid derivative of general formula VI
  • Ri is an acyl group derived from a carboxylic acid having from 2 to 24 carbon atoms, saturated or unsaturated, unsubstituted or bearing one or more substituents
  • m is an integer varying from 1 to 10
  • n is a number integer varying from 0 to 10
  • X is a dialkyloxy- or diaryloxy-phosphoryloxy group of formula (RO) 2 P-0 i O to form the pseudodipeptide of general formula X
  • R is a radical labile by hydrogenolysis, which one can - if desired - substitute, alkylate or acylate the free terminal alcohol function with a substitution, alkylation or acylation reagent of general formula VIII,
  • A can be a leaving group, an OH, SH or NH function, the descriptor r being preferably 1, but which can also take a value of O, the descriptor s preferably being between 2 and 6, but which can take a value varying from 1 at 10
  • W being preferably chosen from the groups, -formyl, -acetyl, -cyano, - halo, -amino, -bromo or iodoacetamido, -acylamido, -diacylimido, -sulfhydryl, - alkylthio ,, -hydroxyl, -acyloxy, -vinyl , -ethynyl, -carboxyl free or in the form of an ester, mixed anhydride, amide or hydrazide, -azido, -thiocyano or their precursors, if necessary in the presence of a coupling agent, and the subject to catalytic hydrogenation or other deprotection process so as to obtain the derivative of general formula XI
  • the invention also relates to a process for obtaining phosphopseudodipeptides of general formula XII
  • Ri and R 2 each represent an acyl group derived from a carboxylic acid having from 2 to 24 carbon atoms, saturated or unsaturated, linear or branched, unsubstituted or carrying one or more substituents chosen from the group consisting of hydroxyl , alkyl, aikoxy, acyloxy, amino, acylamino, acylthio and (C 1 -C 24 alkyl) thio the descriptors m, p and q which can take a value ranging from 1 to 10 the descriptor n which can take a value ranging from 0 to 10 in which X and Z each represent an acid group or a functionalized auxiliary which consists in blocking the amino functions in position (q + 1) and in ⁇ of a diamine acid of formula H 2 N (CH 2 ) p CHNH 2 (CH 2 ) q- ⁇ COOH by labile blocking reagents by acidolysis and hydrogenolysis, respectively, subjects the carboxylic function remaining free to
  • R 2 represents an acyl group derived from carboxylic acid having from 2 to 24 carbon atoms, saturated or unsaturated, unsubstituted or bearing one or more substituents defined as above
  • p and q represent a whole number varying from 1 to 10
  • the descriptor s preferably being between 2 and 7, but which can take a value varying from 1 to 10 which is condensed in the presence of a condensing agent in an inert solvent with an amino acid derivative ⁇ -hydroxylated of general formula VI
  • Ri is an acyl group derived from a carboxylic acid having from 2 to 24 carbon atoms, saturated or unsaturated, unsubstituted or bearing one or more substituents
  • m is an integer varying from 1 to 10
  • n is a number integer varying from 0 to 10
  • X is a dialkyloxy- or diaryloxy-phosphoryloxy group of formula (RO) 2 P-0 i
  • the derivative of general formula XV W being preferably chosen from the groups, -formyl, -acetyl, -cyano, - halo, -bromo or iodoacetamido, -acylamido, -diacylimido, -acyloxy, -vinyl, - ethynyl, -carboxyl free or in the form of ester , mixed anhydride, amide or hydrazide, -azido, -thiocyano or their precursors.
  • the invention also relates to a process for obtaining the carboxypseudodipeptides of general formula IV X- (CH 2 ) m-CH- (CH 2 ) n-CO-NH- (CH 2 ) p-CH- (CH 2 ) q - Z (IV)
  • Ri and R 2 each represent an acyl group derived from a carboxylic abide having from 2 to 24 carbon atoms, saturated or unsaturated, linear or branched, unsubstituted or carrying one or more substituents chosen from the group consisting of hydroxyl , alkyl, aikoxy, acyloxy, amino, acylamino, acylthio and (C1-C-24 alkyl) thio the descriptors m, p and q which can take a value ranging from 1 to 10 the descriptor n which can take a value ranging from 0 to 10 in which X and Z each represent an acid group or a functionalized auxiliary which consists in blocking the amino functions in position (q + 1) and in ⁇ of a diamine acid of formula H 2 N (CH 2 ) p CHNH 2 (CH 2 ) q . ⁇ COOH by labile blocking reagents by acidolysis and hydrogenolysis, respectively, subjects the carboxylic function remaining free to
  • R 2 represents an acyl group derived from carboxylic acid having from 2 to 24 carbon atoms, saturated or unsaturated, unsubstituted or bearing one or more substituents defined as above
  • p and q represent a whole number varying from 1 to 10 which is condensed in the presence of a peptide condensing agent in an inert solvent with a functional derivative of carb-carboxy amino acid of general formula VI
  • Ri is an acyl group derived from a carboxylic acid having from 2 to 24 carbon atoms, saturated or unsaturated, unsubstituted or bearing one or more substituents
  • m is an integer varying from 1 to 10
  • n is a number integer varying from 0 to 10
  • X is a radical RO-CO- to form the pseudodipeptide of general formula XVI
  • R is a labile group by hydrogenolysis, such as for example the benzyl group, which may, if desired, be substituted, alkylated or acylated the free terminal alcohol function with a substitution, alkylation or acylation reagent of general formula VIII,
  • an OH, SH or NH 2 function an OH, SH or NH 2 function, the descriptor r being preferably 1, but which can also take a value of O, the descriptor s preferably being between 2 and 6, but which can take a value varying from 1 at 10
  • W being preferably chosen from the groups, -formyl, -acetyl, -cyano, - halo, -amino, -bromo or iodoacetamido, -acylamido, -diacylimido, -sulfhydryl, - alkylthio, -hydroxyl, -acyloxy, -vinyl, -ethynyl, -carboxyl free or in the form of ester, mixed anhydride, amide or hydrazide, -azido, -thiocyano or their precursors, if necessary in the presence of a coupling agent, and to submit it to a catalytic hydrogenation or to another deprotection process so as to obtain the derivative of general formula XVII
  • the stereochemistry of the centers carrying acylamino groups is determined by the configuration of the starting amino acids and that of the acylamino groups by the starting fatty acid configuration.
  • the compounds of the invention are prepared by the coupling between the acid function of an ⁇ -functionalized N-acylated amino acid and the amino function of an amino alcohol resulting from the reduction of the carboxyl of a diamine acid mono-N- acylated, then O-acylation or -alkylation of the alcohol function remained free in order to introduce a functionalized auxiliary, which can be optionally modified after attachment in order to expose a reactive function. Deprotection of the final product releases an acid function.
  • the ⁇ -functionalized amino acid is an ⁇ -amino ⁇ -hydroxylated acid such as serine or homoserine, which is subjected to a sequence of N-protection reactions (for example in the form of t-butoxycarbonyl derivative), formation of a benzyl ester by O-alkylation of the carboxylate and phosphorylation of the OH function in order to introduce a protected phosphate group.
  • N-protection reactions for example in the form of t-butoxycarbonyl derivative
  • Typical protecting groups for phosphates can be phenyl, benzyl or o-xylyl. Phenyl is the currently preferred group.
  • the amino function is then released by elimination of the protective group (for example by treatment of the t-butoxycarbonyl derivative with trifluoroacetic acid), then acylated with an activated derivative of a fatty acid, preferably a derivative of acid 3 -hydroxytétradécanoique such as 3- dodecanoyioxytetradécanoique acid.
  • the activated form can be an acyl chloride, an activated ester, a mixed anhydride or any other species allowing the formation of the amide bond.
  • the benzyl ester is then removed by selective hydrogenolysis to give a carboxylic acid carrying an acylamido group in the ⁇ position and a (RO) 2 P (0) 0- group in the ⁇ position.
  • the partner of the peptide coupling reaction is preferably obtained from an ⁇ , ⁇ -diamino acid such as ornithine or lysine by a sequence of reactions for selective protection of the amino function in position ⁇ , for example under the form benzyloxycarbonyl derivative, through a copper complex according to a method described in [Organic Preparations and Procedures International (1992), 23, 191-194], elimination of the copper complex and protection of the amino function in the ⁇ position , for example in the form of a t-butoxycarbonyl derivative.
  • Other protecting groups can be used.
  • the free carboxylic function is reduced to primary alcohol by using for example the borane-dimethylsulfide complex or by the treatment of a mixed anhydride preformed with sodium borohydride, according to a method described in [Tetrahedron Letters (1991), 32, 923- 92].
  • the amino function in position ⁇ is released (for example by treatment with trifluoroacetic acid), then N-acylated with an activated derivative of a fatty acid, preferably a derivative of 3-hydroxytetradecanoic acid such as acid 3- benzyloxytetradecanoic. If necessary, the free OH function is protected at this stage, for example in the form of benzyloxymethyl ether.
  • the ⁇ -amino function is released by treatment with a reagent compatible with the other protective groups present, for example by selective hydrogenolysis in a hydroxylic solvent containing triethylamine if the protective group is a benzyloxycarbonyl.
  • the amine thus obtained is coupled with the ⁇ -acylamine ⁇ -phosphorylated carboxylic acid prepared as described above in the presence of IIDQ or another peptide coupling reagent, to give a phosphorylated pseudodipeptide protected.
  • This product is O-acylated on the hydroxyl function which has remained free with a ⁇ -functionalized acid such as 6-heptenoic acid in the presence of EDCI or another esterifying agent. ( Figure 4).
  • the alkenyl function of this ester is subjected to a dihydroxylation reaction in the presence of osmium tetroxide in catalytic or stoichiometric quantity, then the protective groups for the phosphate and for the hydroxyl function optionally present in the form of benzyl ether, are eliminated by hydrogenolysis in the presence of an appropriate catalyst.
  • the vicinal diol is subjected to periodic oxidation to expose an aldehyde function.
  • the peptide coupling product is O-acylated with a derivative of a ⁇ -aminoalkanoic acid, such as 6-benzyloxycarbonylaminohexanoic acid ( Figure 10).
  • a derivative of a ⁇ -aminoalkanoic acid such as 6-benzyloxycarbonylaminohexanoic acid ( Figure 10).
  • the product thus obtained is subjected to a complete deprotection reaction by hydrogenolysis in the presence of suitable catalysts which provides a pseudodipeptide carrying an aminoalkanoyl auxiliary.
  • the acid partner of the peptide coupling reaction is derived from aspartic acid or possibly glutamic acid ( Figure 2).
  • the aspartic acid derivative is obtained by N-acylation of the amine function of the ⁇ -benzyl ester of this amino acid with a fatty acid, preferably a derivative of a 3-hydroxylated fatty acid such as 3-dodecanoyloxytetradecanoic acid , in the presence of an acylating agent.
  • This product is coupled with the amino alcohol of the type described above, then the pseudodipeptide thus obtained is subjected to a hydrogenolysis reaction in the presence of palladium carbon or another catalyst to give the pseudodipeptide carrying a carboxylic acid function.
  • the hydroxyl function of the pseudodipeptide obtained in the previous paragraph is acylated with a ⁇ -functionalized acid.
  • this acid is a ⁇ -alkenoic acid or a ⁇ -aminoalkanoic acid.
  • the pseudodipeptide leads to the O-heptenoyl derivative which is successively subjected to dihydroxylation reactions in the presence of osmium tetroxide, then deprotection and periodic oxidation.
  • the amino alcohol obtained from; Ornithine or lysine as described above is alkylated with an ⁇ -alkenyl triflate, preferably hept-6-enyl triflate (Fig. 14).
  • a secondary amine preferably hept-6-enyl triflate
  • Fig. 14 The coupling of this amino alcohol carrying a secondary amine with the ⁇ -acylamine ⁇ -phosphorylated acid described above in the presence of EDCI or of another acylating agent provides an ester.
  • the alkenyl group is then subjected to a dihydroxylation reaction in the presence of osmium tetroxide, then the protective groups are removed by hydrogenolysis in the presence of suitable catalysts, and the vicinal diol function oxidized by sodium periodate to expose a reactive aldehyde function .
  • an N-protected derivative of serine for example the p-methoxybenzyloxycarbonyl derivative prepared according to a method described in [Synthesis (1989), 36-37] is O-alkylated with benzyl bromoacetate.
  • the protective group for the amine function is removed, for example by treatment with trifluoroacetic acid in dichloromethane, and the amine function is N-acylated, preferably with a derivative of a 3-hydroxylated fatty acid such as l 3-dodecanoyloxytetradecanoic acid, in the presence of an acylating agent or using acid chloride or any other activated form of fatty acid.
  • the derivative of serine for example the p-methoxybenzyloxycarbonyl derivative prepared according to a method described in [Synthesis (1989), 36-37] is O-alkylated with benzyl bromoacetate.
  • the protective group for the amine function is removed, for example by treatment with triflu
  • N-acylated O-alkylated serine thus obtained is coupled with the amino alcohol described above ( Figure 1) in the presence of a peptide coupling agent such as IIDQ, then the free OH function is acylated with an alkanoic acid ⁇ -functionalized in the presence of a reagent such as a carbodiimide.
  • this functionalized acid is a ⁇ -alkenoic acid or a derivative of a ⁇ -aminoalkanoic acid.
  • the pseudodipeptide leads to the O- (6-heptenoyl) derivative which is successively subjected to dihydroxylation reactions in the presence of osmium tetroxide, then depotection by hydrogenolysis and oxidation periodic.
  • the starting amino acid is cysteine or homocysteine ( Figure 17).
  • cysteine is S-alkylated with p-methoxybenzyl bromoacetate, then N-acylated, preferably with a derivative of a 3-hydroxylated fatty acid such as 3-tetradecanoyloxytetradecanoic acid, in the presence of an agent acylation or using acid chloride or any other activated form of the fatty acid.
  • the S-alkylated and N-acylated derivative of cysteine thus obtained is coupled with 5-amino-2 - [(R) -3-hydroxytétradécanoylamino] pentan-1-ol in the presence of IIDQ or another coupling agent peptide.
  • the primary OH free function is then O-acylated with a ⁇ -functionalized alkanoic acid, used in the form of an activated ester such as an O-benzotriazolyl ester.
  • this acid is a ⁇ -aminoalkanoic acid such as 7- (p-methoxybenzyloxycarbonylamino) heptanoic acid.
  • the product thus obtained is subjected to a complete deprotection reaction in aqueous acid medium, which provides a pseudodipeptide carrying a 7-aminoheptanoyl auxiliary.
  • aqueous acid medium which provides a pseudodipeptide carrying a 7-aminoheptanoyl auxiliary.
  • Figure 18 the Np-methoxybenzyloxycarbonyl derivative of serine is O-alkylated with dibenzyl methylenemalonate in an alkaline medium.
  • the protective group of the amine is removed by treatment with an acid, then the amine function thus released is N-acylated, preferably with a derivative of a 3-hydroxylated fatty acid such as 3-dodecanoyloxytetradecanoic acid, in the presence of an acylating agent or using acid chloride or any other activated form of the fatty acid.
  • the O-alkylated N-acylated derivative of the serine thus obtained is coupled with the amino alcohol described above ( Figure 1) in the presence of IIDQ or any other peptide coupling agent.
  • the pseudodipeptide is then O-acylated on the free OH function with a ⁇ -functionalized alkanoic acid.
  • this acid is a ⁇ -alkenoic acid or a derivative of a ⁇ -aminoalkanoic acid.
  • the pseudodipeptide leads to the O- ( ⁇ -heptenoyl) derivative which is successively subjected to dihydroxylation reactions in the presence of osmium tetroxide, then deprotection by hydrogenolysis and oxidation periodic, to lead to the derivative carrying a 6-oxohexanoyl auxiliary and a malonyl group.
  • the 6-aminohexanoyl derivative described above FIG.
  • the benzyl ester of O-phosphorylated homoserine (see Figure 1) is N-acylated with 3-benzyloxytetradecanoic acid, preferably using the mixed anhydride prepared from l 3- benzyloxytetradecanoic acid and isobutyl chloroformate. The benzyl ester is then selectively hydrogenolized as described above.
  • the ⁇ -N- benzyloxycarbonyl derivative of the diamino alcohol derived from ornithine is N ⁇ - acylated with 3-dodecanoyloxytetradecanoic acid, in the presence of a coupling agent or by using an activated ester or another activated form of fatty acid, and the ⁇ -amino function is released by selective hydrogenolysis.
  • This amine is coupled with the N- (3-benzyloxytetradecanoyl) O- (diphenyl-oxyphosphoryl) derivative of homoserine in the presence of IIDQ or another peptide coupling agent.
  • the pseudodipeptide thus obtained is O-acylated with a ⁇ -functionalized alkanoic acid, for example in the presence of a carbodiimide.
  • this acid is a ⁇ -alkenoic acid or a derivative of a ⁇ -aminoalkanoic acid.
  • the pseudodipeptide leads to the 0- (6-heptenoyl) derivative which is successively subjected to dihydroxylation reactions in the presence of tetroxide osmium, then deprotection by hydrogenolysis in the presence of suitable catalysts and periodic oxidation, to lead to the derivative carrying a 6-oxohexanoyl auxiliary.
  • the invention also relates to the intermediate products of general formula V, VI, IX, XIII, in enantiomerically pure form or in the form of a mixture of stereoisomers.
  • the invention also relates to pharmaceutical compositions containing as active ingredient at least one compound of general formula I, in neutral or charged form, in combination or in mixture with an inert, non-toxic, pharmaceutically acceptable excipient or vehicle.
  • the invention relates more particularly to pharmaceutical compositions containing, as active principle, at least one salt of a compound of general formula I, with a therapeutically compatible mineral or organic base.
  • the invention also relates to pharmaceutical compositions based on a compound of general formula I, in enantiomerically pure form or in the form of a mixture of stereoisomers, in combination or in mixture with an excipient or a pharmaceutical carrier.
  • the compounds according to the invention can be grafted onto an antigen to modulate the immune response or also be grafted onto a pharmacophore to improve its therapeutic action or its targeting and be used by the injectable route in the form of conjugates in the form of solutions or of aqueous suspensions, possibly neutralized by an amine or a hydroxyaikylamine.
  • the purple solid is dissolved in a mixture of 1 N NaOH (40 ml) and dioxane (70 ml).
  • the reaction mixture is cooled in an ice-water bath and then benzyl chloroformate (5.14 ml; 36 mmol) is added.
  • the purple precipitate is recovered by filtration and then washed successively with 95% EtOH! (40 ml), H 2 0 (50 ml) and EtOH (60 ml).
  • the precipitate is dried in an oven (T ⁇ 45 ° C, under vacuum); the yield in two stages is 8.27 g, ie 93% compared to the theory (Reference: Organic Preparations and procedures international 23 (1992) 191-194).
  • IIDQ (2-isobutoxy-1-isobutoxycarbonyl-1, 2-dihydroquinoline) (364 mg; 1.2 mmol; 1.2éq) is added to an acid solution (2RS) -4- (diphenyloxyphosphoryloxy) -2- [(R) -3-dodécanoyloxytétradécanoylamino] butanoic acid (850 mg; 1.0 mmol; 1 eq) in anhydrous CH 2 Cl 2 (20 ml) at room temperature and under argon.
  • a periodic oxidation reaction is carried out with the addition of 1.86 ml Nal0 4 0.1 M (39.62 mg, 20 eq.) To 10 mg (9.28 ⁇ mol, 1 eq.) Of the deprotected triol prepared above. above in an isopropanol-water mixture (1: 1). The reaction is followed by LC / UV and shows a quantitative conversion of the diol function into an aldehyde, after two hours. The molecular ion m / z 1046.8 observed on the ES / MS spectrum after the periodic oxidation step ( Figure 6) attests to the expected reaction.
  • EDCI 200 mg, 1.04 mmol, 5.2 eq
  • DMAP 13 mg; 0.10 mmol; 0.5 eq
  • the reaction mixture is stirred for 30 minutes at 0 ° C., then 4 hours at room temperature.
  • the organic phase is separated and washed successively with H 2 0, 1 N HCl, H 2 0.
  • the organic phase is then dried over MgSO 4 , then evaporated at 40 ° C under vacuum.
  • the solution is diluted with H 2 0 (2 ml) and THF (2 ml) then stirred for 5 minutes at room temperature.
  • the solution is concentrated, diluted with CH 2 CI 2 and H 2 0, neutralized with a 1 M HCl solution and then the separated phases.
  • the organic phase is dried over MgSO 4 , filtered and evaporated. Purification by Flash chromatography on silica gel (elution CH 2 CI 2 / Acetone 4/1) allows the reduction product (387 mg; 46%) to be collected in the form of a white crystalline solid.
  • This product is subjected to a hydrolysis reaction of the benzyloxymethyl acetal in an aqueous THF-HCl medium, which provides the (3S, 9R) -3 - [(R) -3-dodecanoyl-oxytetradecanoylamino] -4-oxo-5. -aza-9 - [(R) -3-benzyloxytétradécanoylamino] -décane- 1, 10-diol 1-dibenzylphosphate.
  • the product obtained above is O-acylated in position 10 with hept-6-enoic acid in the presence of EDCI in dichloromethane at 0 ° C in the presence of DMAP (see section 2.2.1).
  • This heptenoic ester is then subjected to a hydroxylation reaction in the presence of osmium tetroxide (catalytic) and of N-methylmorpholine oxide (see section 2.2.2), which provides the corresponding diol (ester 6,7- dihydroxyheptanoique).
  • This product is deprotected by hydrogenolysis in ethanol under atmospheric pressure of hydrogen in the presence of palladium carbon (see section 2.2.3).
  • the deprotected diol obtained above is subjected to a periodic oxidation reaction in an isopropanol-water mixture (see section 2.2.4).
  • the 6-oxohexanoic derivative obtained above is subjected to a brief treatment with NaBH 4 in an isopropanol-water mixture at 0 ° C., to give the 6-hydroxyhexanoic derivative.
  • ES / MS m / z 1048.5 [M + H] + ; 950.5 [M + H- (HO) 2 OPOH] + ( Figure 13). 2.5.
  • Triflic anhydride Tf 2 0 ((CF 3 S0 2 ) 2 0.11 ml; 6.76 mmol) is added dropwise at -15 ° C to a solution of hept-6-en-1-ol (515 mg; 4.51 mmol) and Et 3 N (627 ⁇ l; 4.51 mmol) in CH 2 CI 2 (10 ml) and the mixture is stirred for 30-45 minutes at -15 ° C until the alcohol disappears. After returning to ambient temperature, the medium is diluted with CH 2 CI 2 and washed successively with H 2 0, with a saturated aqueous solution of NaHCO 3, a saturated aqueous solution of NaCl.
  • D-serine is protected in the form of an N- derivative (p-methoxybenzyloxycarbonyl) [Ref: Chen and Wang, Synthesis (1989), 36-37], then the OH function alkylated with benzyl bromoacetate in the presence of NaH (2 equiv.).
  • the amine function is released by treatment with trifluoroacetic acid in dichloromethane, then acylated with (R) -3-dodecanoyloxytetradecanoic acid chloride in the presence of triethylamine.
  • the double bond of the auxiliary ester is hydroxylated with the osmium tetroxide (catalytic, in the presence of N-methylmorpholine N-oxide), then the diol deprotected by hydrogenolysis in the presence of palladium on carbon in ethanol.
  • the product OM-112-FV-7 is obtained by treatment with sodium periodate in an isopropanol-water mixture. MM: 1010.45.
  • D-cysteine is S-alkylated with p-methoxybenzyl bromoacetate in the presence of sodium carbonate in THF-water medium.
  • the S-benzyloxycarbonylmethyl cysteine thus obtained is N-acylated with (R) -3-tetradecanoyloxy-tetradecanoic acid chloride, then the S-alkylated N-acylated derivative of D-cysteine is coupled with the amine (2R ) -5-amino-2 - [(R) -3-hydroxytétradécanoylamino] pentan-1-ol ⁇ obtained by hydrogenolysis of (2R) -5-amino-2 - [(R) -3-benzyloxytétradécanoylamino] pentan-1 - ol, see 4.1.1 ⁇ in the presence of IIDQ.
  • the product thus obtained is O-acylated selectively in the primary position with the ester derived from HOBt and from 7- (p-methoxybenzyloxy-carbonylamino) heptanoic acid.
  • the two p-methoxybenzyl groups are then removed by treatment of the ester with aqueous trifluoroacetic acid.
  • N- (p-methoxybenzyloxycarbonyl) derivative of D-serine is O-alkylated with the
  • This product is O-acylated with hept-6-enoic acid in the presence of EDCI, then the heptenoyie ester subjected to hydroxylation with osmium tetroxide.
  • the benzyl groups are removed by hydrogenolysis in the presence of palladium on carbon in ethanol.
  • the product OM-312-FV-7 is obtained by treatment of the debenzyl product with sodium periodate in an isopropanol-water mixture.
  • the amide thus formed is O-acylated on the free OH function with 6-heptenoic acid in the presence of EDCI to give the corresponding ester.
  • the double bond of the auxiliary ester is subjected to a hydroxylation reaction with osmium tetroxide; the benzyl group is then removed by hydrogenolysis on palladium carbon and the phosphate released by hydrogenolysis on platinum black.
  • the diol function is subjected to a periodic oxidation reaction to generate the 6-oxohexanoyl derivative OM-512-FV7. C55H104N3O13P. MM: 1046.42.
  • the synthetic products and pseudopeptidolipids carrying a functionalized auxiliary arm are dissolved in a water - isopropanol mixture (1: 1 v / v).
  • the required amount of 2M ammonium bicarbonate is then added to reach a concentration of 50 mM.
  • the fractions containing the compounds of interest in the form of ammonium salt are combined and concentrated by adsorption on phase C18 Bondapack, 15-20 ⁇ m, 300 A, Waters.
  • the counter ion can then be exchanged by washing with an aqueous solution of an alkali metal salt (such as NaCI or KCI, for example) at 10 g / L in water - isopropanol (9: 1, v / v). After removing the excess salt by passing 5 volumes of a water-isopropanol mixture (9: 1, v / v) over the column, the compound is eluted with pure isopropanol. 2.11.2. Purification monitoring
  • TBAP tetrabutylammonium phosphate
  • HPLC chromatographs were used (HP1050 Ti series, HP1090 M series : LabChrpm- Shimadzu). The retention times depending on the system used can vary by about one minute for a given compound.
  • ES / MS spectra (positive and negative modes) were measured on mass spectrometers of different types (Finnigan LCQ, ion trap; Micromass Quattro II, triple stage quadrupole; Micromass Z-Bio-Q, triple stage quadrupole). Additional MS / MS type analyzes were also carried out.
  • LAL Limulus Amoebocyte Lysate
  • EU endotoxin unit
  • EC-6 international standard standard solution
  • the compounds tested have a low endotoxicity ( ⁇ 0.0005% of that of the reference LPS).
  • the grafting of different functionalized auxiliary arms onto the structure of the pseudopeptidolipids does not significantly modify the endotoxicity of these products.
  • a vicinal dihydroxylation reaction is carried out on pseudopeptidolipids carrying an auxiliary arm of olefinic type to lead to the formation of a function stable diol.
  • a periodic oxidation reaction is then carried out to create an aldehyde function on the auxiliary arm.
  • a reductive amination reaction can then be carried out to couple, for example, a small peptide such as FGFG (Phenylalanine-Glycine-Phenylalanine-Glycine, Sigma).
  • FGFG Phenylalanine-Glycine-Phenylalanine-Glycine, Sigma
  • the coupling reaction by reductive amination is carried out in aqueous solution while respecting an equal stoichiometry between the aldehyde functions (auxiliary arm of the pseudopeptidolipid) and the amino functions available on the peptide or protein to be coupled.
  • 2 mg of purified OM-197-FV7 (1.86 ⁇ mol, 1 eq) were added to a solution of 0.8 mg of FGFG (1.86 ⁇ mol, 1 eq) dissolved in 1 ml H 2 0 -MeCN (1: 1) The solution is stirred for 30 minutes at room temperature to form the imine.
  • the reduction step is then carried out by adding 92 ⁇ l of NaBH 3 CN 1M (5.77 mg, 50 eq) to form a particularly stable carbon-nitrogen bond (Figure 21).
  • the conjugate was first purified on a Vydac C 4 column to remove the unreacted peptide, then on the Bondapack C18 phase (Waters) to obtain the sodium salt (see paragraph: purification and analysis of the compounds according to invention).
  • the conjugate was then resolubilized in sterile H 2 0 0.01% triethanolamine (TEoA) to satisfy the conditions for biological activity tests.
  • TEoA triethanolamine
  • the ES / MS mass spectrum recorded after purification is presented in Figure 23 and shows a molecular ion [M + H] + at m / z 1457.4, indicating the expected coupling.
  • the visible ns between m / z 400 and 900 were identified by MS / MS analyzes as being fragments originating from the molecular peak of the conjugated peptide.
  • the ions corresponding to the initial FGFG peptide (m / z 427.1 [M + H] + , m / z 853.0 [2M + H] + , Figure 22) were not detected.
  • the compound OM-197-FV7 obtained by the synthetic scheme presented in FIG. 4 can be coupled, for example, to a peptide of pharmaceutical interest such as (NANP) 6 P 2 P 3 o [Valmori et al., 1992, J. immunol. 149, 717-721], the sequence of which is as follows:
  • the peptide (NANP) eP 2 P3o has four possible conjugation sites (terminal amine + three lysines). 5 mg of purified OM-197-FV7 (4.64 ⁇ mol, 4 eq) were added to a solution of 7.49 mg of (NANP) 6 P2 3 o (1.16 ⁇ mol, 1 eq) dissolved in 1 ml H 2 ⁇ -isopropanol (1: 1) The solution is stirred for 30 minutes at room temperature, then the reduction step is carried out by adding 230 ⁇ l of 1 M NaBHsCN (14.43 mg, 50 eq). ) The solution is stirred for two hours at room temperature.
  • reaction mixture is then dialyzed against H 2 O for 24 hours (3.5Kd dialysis cassette, Slide-A-Lyzer, Pierce).
  • LC / ES-MS analysis of reaction mixture shows the presence of three types of molecules, as shown by the chromatograms presented in Figure 24: The peaks corresponding to the free peptide (pic A), the monoconjugate peptide (pic B) and the biconjugue peptide (pic C) are clearly visible .
  • the ionic envelopes recorded for each of them are presented in Figures 25, 26 and 27 and attest to a covalent conjugation to one or two molecules of OM-197-FV for the monoconjugate and the biconjugue, respectively.
  • Figure 25 Peptide (NANP) 6 P 2 P 3 o (free peptide).
  • PM 6451 Ions at m / z 1076.2 (A6), 1291.2 (A5), 1613.7 (A4).
  • Figure 26 Monoconjugate OM-197-FV- (NANP) 6 P 2 P 3 o. PM: 7481 Ions at m / z 1247.8 (B6), 1497.4 (B5), 1871.2 (B4).
  • the P2P peptide 30 has five possible conjugation sites (terminal amine + four lysines) and a mass of 4200 uma (ES / MS spectra in Figures 31 and 34). Five equivalents of OM-197-FV7 were therefore engaged. The reaction conditions described above were applied. After dialysis against H 2 0 (3.5Kd dialysis cassette, Slide-A-Lyzer, Pierce), the mass spectra of the conjugates obtained were measured by LC / ES-MS and compared with those recorded for the free peptide. The ES / MS spectrum of the OM-197-FV-P 2 P 30 monoconjugate is presented in Figure 32.
  • the multiply charged ions m / z 872.8 (A6), 1047.1 (A5), 1308.6 (A4) and 1744.4 (A3) constitute the ionic envelope of a conjugate with a molecular mass of 5230 uma, corresponding to the grafting of a molecule! of OM-197- FV on a P 2 P 3 o peptide molecule by reductive amination.
  • the transformed mass spectrum particularly highlights the mass expected for the OM-197-FV-P 2 P 3 o monoconjugate ( Figure 35).
  • Proteins such as ovalbumin for example, lend themselves particularly well to coupling by reductive amination.
  • the numerous lysines present in the sequence (20 lysines for ovalbumin) are as many possible congailson sites for pseupeptidolipids carrying an auxiliary arm functionalized with an aldehyde group.
  • pseudopeptidolipid / protein ratio By varying the stoichiometry of the reductive amination reaction (pseudopeptidolipid / protein ratio), different degrees of conjugation can be obtained.
  • the hemagglutinin protein H1 N1 is also an example of choice to illustrate the coupling between molecules of type OM-197 and a protein type antigen.
  • the OM-197-FV-H1N1 conjugate was analyzed by SDS-PAGE under the conditions used for the OM-197-FV-ovalbumin conjugate (gradient 4-20% polyacrylamide).
  • the electrophoretic profiles obtained for the initial protein (line 6) and the conjugate before and after dialysis (lines 8 and 7, respectively) are presented in Figure 4).
  • the H1 N1 protein appears in the form of three bands, two of which correspond to the HA1 and HA2 subunits described in the literature (Swiss-Prot, Swiss Institute of Bioinformatics, Geneva).
  • a mass difference is observed for each of the bands, thus demonstrating the coupling of OM-197-FV molecules on the H1 N1 protein.
  • the endotoxicity was determined by the Limulus Amoebocyte Lysate chromogenic kinetic test (Charles River Endosafe product R1708K lot EK2251 E). This LAL test was used to demonstrate the low endotoxicity of the antigens coupled to the product of the invention. The biological principle of this test is based on initiation by; bacterial endotoxins of a proenzyme present in the lysate of Limulus amoebocytes (LAL) which activates a cascade of serine proteases.
  • LAL Limulus amoebocyte Lysate chromogenic kinetic test
  • the chromogenic kinetic test is based on the fact that the amount of endotoxin is inversely proportional to the time necessary to reach an optical density (O.D.) of 0.2.
  • the concentration is determined relative to a standard curve of 0.005 to 50 EU / ml.
  • the H1 N1 series products all have equivalent LAL activities.
  • the LAL results are very variable and differences between the groups of 3 to 4 x are not significant. Coupling has no effect on LAL activity.
  • the maximum LAL activity is 0.008 ng.
  • LPS equivalent per injection (5 ⁇ g / injection).
  • mice 6 week old male C57 / BL6 mice are sacrificed by inhalation of CO 2 .
  • the bones of the hind limbs, the hip, the tibia and the femur are removed.
  • the marrow is extracted from the bone lumen by injection of Eagle medium modified by Dulbecco (DH medium) through the ends which have been previously cut.
  • Stem cells are washed and resuspended in supplemented DH medium with 20% fetal calf serum (SVF). The cell concentration is adjusted to 500,000 cells / ml.
  • DH medium Eagle medium modified by Dulbecco
  • SVF fetal calf serum
  • the products in solution in the DH medium supplemented with 20% FCS, amino acids and antibiotics are diluted in series directly in the microplate.
  • the products are tested in triplicate and each microplate comprises a negative control composed of medium alone.
  • the final volume in each well is 100 ⁇ l.
  • the products in solution in isopropanol are diluted in the DH medium with 20% of FCS, brought to dryness by evaporation, and taken up in an equivalent volume of water.
  • 100 ⁇ l of cell suspension are added to the product dilutions and the cells are incubated for 7 days in an oven at 37 ° C., under 8% C0 2 , saturated with humidity.
  • Proliferation is determined by measuring the oxidation of a chromogenic substrate (XTT) in the mitochondria of living cells (Cell Proliferation kit II # 1465 015 Boehringer Mannheim). At the end of the incubation, 50 ⁇ l of the XTT substrate solution are added to each well. After 8 hours of incubation at 37 ° C under 8% CO 2 in an oven saturated with humidity, the microplates are read with a spectrophotometer at 492 nm against a reference at 690 nm. The results are expressed as an average ⁇ standard deviation in the form of a dose-response curve. The values of the negative control composed of DH medium (mean ⁇ standard deviation) are also indicated in graphical form.
  • XTT chromogenic substrate
  • Figure 44 presents the activity of the various products and shows the influence of the functionalized auxiliary arm on the NO activity measured in vitro.
  • the arm containing the aldehyde function (OM-197-FV7) has a weaker capacity to induce proliferation than those which contain an alcohol (OM-197-FV8) or diol (OM-197-FV6) function.
  • the maximum proliferation induction is offset compared to the other products (around 5 ⁇ g / ml).
  • the monophenylated pseudopeptidolipid carrying a Auxiliary arm diol (OM-197-FV6 monophenylphosphate) is very active in this in vitro model, much more than the non-phenyl equivalent (OM-197-FV6).
  • the compound comprising a positive charge on its functionalized arm (OM-287-AC5) has a different activity profile from the other compounds in the series. It begins by being inactive and has a maximum activity peak around 1 ⁇ g / ml. Its ability to induce the proliferation of stem cells is very important.
  • OM-197-MC comprising a negative charge with the carbonyl function is also very active in this model, with a maximum of activity at around 10 ⁇ g / ml.
  • mice 6 week old male C57 / BL6 mice are sacrificed by CO 2 inhalation.
  • the bones of the hind limbs, the hip, the tibia and the femur are removed.
  • the marrow is extracted from the bone lumen by injection of Eagle medium modified by Dulbecco (DH medium) through the ends which have been previously cut.
  • the stem cells are washed and resuspended (cell concentration around 40,000 cells / ml) in DH medium supplemented with 20% horse serum (SH) and 30% L929 supernatant.
  • L929 are a line of murine fibroblasts whose supernatant is rich in growth factor for macrophages (M-CSF).
  • M-CSF growth factor for macrophages
  • the stem cells After 8 days the stem cells have differentiated into mature macrophages.
  • the macrophages are detached by cold passage, washed and resuspended in DH medium supplemented with 5%> fetal calf serum (SF), amino acids and antibiotics.
  • SF fetal calf serum
  • the cell concentration is adjusted to 700,000 cells per ml.
  • the products in solution in the DH medium supplemented with 5% of FCS, amino acids and antibiotics, are diluted in series directly in the microplate.
  • the products are tested in triplicate and each microplate comprises a negative control composed of medium alone.
  • the final volume in each well is 100 ⁇ l.
  • the products in solution in isopropanol are diluted in the DH medium with 5% of FCS, brought to dryness by evaporation, and taken up in an equivalent volume of water (results in FIG. 41).
  • 100 ⁇ l of cell suspension are added to the product dilutions and the cells are incubated for 22 hours in an oven at 37 ° C., under 8% CO 2 , saturated with humidity.
  • 100 ⁇ l of supernatant are removed and the nitrite concentration is determined by the Griess reaction.
  • Figure 46 presents the activity of the various products and shows the influence of the functionalized auxiliary arm on the NO activity measured in vitro.
  • the arm containing the aldehyde function (OM-197-FV7) has a weaker activity than those which contain an alcohol (OM-197-FV8) or diol function (OM-197-FV6).
  • OM-197-FV7 has a weaker activity than those which contain an alcohol (OM-197-FV8) or diol function
  • An interaction of the aldehyde of compound OM-197-FV7 with the proteins present in the culture medium could explain the activity of this product.
  • the phenyl compound also appears to be less active than the non-phenyl compound (OM-197-FV6). The lower solubility of the phenyl compound could explain this drop in activity.
  • the compound comprising a positive charge on its functionalized auxiliary arm (OM-287-AC5) has a different activity profile from the other compounds in the series. It begins by being inactive and has a maximum activity peak around 1 ⁇ g / ml. OM-197-MC including a negative charge with the carbonyl function is very active in this model.
  • FIG. 47 presents a comparison of the NO activity of the pseudopeptidolipids with respect to the LPS used as positive control. Although inducing significant NO activity, a higher concentration than that of the positive control (100 x) is necessary for the pseudopeptidolipids to start inducing NO activity. The maximum amplitude is also much lower than that induced by the LPS of E. coli.
  • the capacity of the products of the invention to induce the maturation of pre-dendritic cells into dendritic cells was evaluated. The following parameters were measured: the incorporation of Dextran-FITC and the expression of the surface molecules CD83, CD86. 4.4.1. Experimental protocol
  • Peripheral blood mononuclear cells are isolated from "buffy coats" from healthy donors.
  • the adhesively purified monocytes are resuspended in RPMI-1640 medium (Sigma-AIdrich, St-Louis, MO, USA) containing 10% fetal calf serum, GM-CSF (10 ng / ml; IM-HGM1 , Immungenex Corp, Los Angeles, CA, USA) and IL-4 (10 ng / ml; No 204-IL, R&D System, Minneapolis, MN, USA) at a rate of 1 x 10 6 cells / ml.
  • the cells are distributed in petri dishes (P10, Falcon, Becton Dickinson, Plymouth ,!
  • predendritic cells (DC-6).
  • the maturation of predendritic cells into mature dendritic cells is carried out by incubation with dilutions of products or LPS (positive control) for 3 additional days (see by-products).
  • LPS positive control
  • the cells are harvested, and the various parameters indicative of the maturation of the dendritic cells: the surface molecules CD83, CD86 as well as the capacity to incorporate Dextran-FITC are evaluated.
  • the expression of surface molecules is expressed as a% of the average fluorescence of cells stimulated by LPS (positive control); the incorporation of Dextran is calculated relative to that of the cells maintained in the medium and is expressed in%.
  • OM-197-MC, OM-197-FV6, and OM-287-AC5 are prepared at 0.5 mg / ml in 0.9% NaCl / water, added with 0.1% triethanolamine.
  • the solutions are incubated at 37 ° C for 20 min, shaken vigorously for 3 min and then diluted to 100 ⁇ g / ml in RPMI 1640 culture medium and used in dilution from 10 ⁇ g / ml to 0.03 ⁇ g / ml.
  • E. coli lipopolysaccharide LPS, DIFCO, Detroit, Ml, USA
  • An intermediate solution is prepared for 100 ⁇ g / ml in RPM1 1640 culture medium. The concentrations tested are dilutions from 1 ⁇ g / ml to 0.03 ⁇ g / ml.
  • Immature dendritic cells resulting from the differentiation of monocytes, by the combined effect of GM-CSF and IL-4, are capable of incorporating Dextran-FITC.
  • cells lose the ability to incorporate Dextran-FITC.
  • the analyzes are carried out at the DC-9 differentiation stage.
  • the expression of costimulatory surface molecules is another criterion for maturing DCs.
  • the increase in expression of CD83 and CD86 ( Figures 49 and 50) was tested. The results are expressed as a% of the average fluorescence relative to the expression of these markers induced by LPS. These results perfectly corroborate those obtained from phagocytosis.
  • LOM-287-AC5 induces an increase in the expression of surface molecules from 0.1 ⁇ g / ml, whereas it takes at least 1 ⁇ g / ml for OM-197-MC to begin, to increase the expression of CD83 and CD86.
  • LOM-197-FV6 has no effect on the expression of surface molecules characteristic of dendritic cells.
  • LOM-287-AC5 shows an exceptional capacity to induce a differentiation of DC-6 cells into DC-9 already from 0.1 ⁇ g / ml, whereas concentrations greater than 1 ⁇ g / ml are required for OM- 197-MC begins to induce this differentiation, and that IOM-197-FV6 is totally devoid of this type of activity.
  • NANP 6 P2P3o comprises the repeated sequence (NANP) of Plasmodium falciparum and two sequences of tetanus toxin (P 2 : 830-843 and P 3 o: 947-967)
  • This peptide is known as an epitope T-helper and has demonstrated its ability to induce a long-lasting high immune response in the presence of conventional adjuvants.
  • the peptide was obtained by synthesis according to the method described in the literature (Valmori et al., 1992, J. immunol. 149, 717-721).
  • the stock solution of the antigen is prepared at 0.4 mg / ml in 0.9% NaCl / water at pH 8.0.
  • Adjuvants the stock solutions of the pseudopeptidolipids (OM-197-MP, OM-197-FV6 and OM-197-MC) are prepared at 1 mg / ml in 0.9% NaCl / water, added with 0.1%, triethanolamine.
  • the positive control is constituted by the incomplete Freund's adjuvant (IFA from Difco, Detroit, Ml, U.S.A.) and the negative control is a 0.9% NaCl / water solution.
  • the adjuvant and the antigen are formulated in the form of a mixture or of conjugates described above.
  • mice 6-week-old female BALB / c mice (6 mice per group) are immunized twice, by subcutaneous injection at the base of the tail of 0.1 ml.
  • the amounts administered are 20 ⁇ g of antigen and 50 ⁇ g of adjuvant during the first injection and 10 ⁇ g of antigen and 50 ⁇ g of adjuvant during the second.
  • the antigen part is decisive for the calculation of the injected dose.
  • Obtaining serum blood samples are taken at times 0 and 5 weeks. The blood is left to stand for 60 min at 37 ° C., then placed overnight at 4 ° C. The serum is then frozen at -80 ° C until the antibody dosage. 5.1.2.
  • the assay of the IgG antibodies directed specifically against the antigen (NANP) 6 P2P 3 o is carried out by ELISA.
  • the antigen is fixed in a 96-well microplate (Maxisorp F 96, Nunc, DK) by overnight incubation in a humid chamber at 4 ° C with in each well 0.1 ml of PBS (phosphate buffered saline) containing 0.001 mg / ml of antigen (NANP) ⁇ P2P3o.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the saturation of the microplate is carried out with PBS containing 1% bovine serum albumin (BSA, Fluka, CH).
  • the plates are washed with PBS containing 0.05% of Tween 20 (Sigma, Saint-Louis, MO, USA).
  • the sera collected at 5 weeks are diluted in series with the dilution buffer (PBS containing 2.5% defatted milk powder and 0.05%> of Tween 20), then transferred to the microplate and left for 1 h at room temperature (RT). The plates are then washed with PBS.
  • the dilution solution containing the mouse anti-immunoglobulin G polyclonal antibody conjugated with alkaline phosphatase (Sigma, Saint-Louis, MO, USA) is added to the plates and incubated for 1 h at RT.
  • the plates are washed with PBS and the specific antibodies demonstrated by colorimetric reaction with the substrate of alkaline phosphatase, p-nitrophenylphosphate (Sigma, Saint-Louis, MO, USA.).
  • the absorbance at 405 nm is measured with a microplate reader (Dynatech 25000 ELISA reader, Ashford, Middlesex, UK), each condition is determined in duplicate. The results presented are the average of the absorbances measured at 405 nm obtained for the mice of each group.
  • NANP anti-IgG antibodies
  • eP2P3o The specific production of anti-IgG antibodies (NANP) eP2P3o determined by ELISA, is presented graphically for the mice having received two immunizations (FIG. 51).
  • Two injections of an antigen + adjuvant mixture (OM-197-FV6 or OM-197-MC) induce a serological response far superior to that observed during the injection of the antigen alone.
  • Immunization with the monoconjugate OM-197-FV- (NANP) 6 P2P3o induces a slightly IgG antibody response greater than that obtained with the antigen + OM-197-FV6 mixture.
  • a higher degree of conjugation (OM-197-FV) ⁇ , 2 , 3 - (NANP) 6 P 2 P 3 o does not improve the serological response against this antigen.
  • the mixture of the adjuvant OM-197-MP and the monoconjugate OM-197-FV- (NANP) 6 P 2 P3o significantly increases the serological response to this antigen and exceeds the values obtained with the positive control consisting of the mixture ( NANP) 6 P 2 P3o + IFA.
  • Ovalbumin immunization group determination of specific antibodies generated in mice after 1 and 2 subcutaneous administrations.
  • mice i BALB / c females, 8 weeks of age at the start of treatment were divided into the following 3 groups: Solutions:
  • Group A the mother solution of antigen alone (ovalbumin, Fluka AG, Buchs, Switzerland) was prepared at a concentration of 125 ⁇ g / ml in H 2 0 + 0.01% thiomersal.
  • Group B the stock solution of the antigen + adjuvant mixture (ovalbumin + OM-197-MP) contains 125 ⁇ g / ml of ovalbumin and 250 ⁇ g / ml of OM-197-MP in H 2 0 + 0.01% thiomersal.
  • Group C the mother solution of the conjugate OM-197-FV-ovalbumin is at the concentration of 125 ⁇ g / ml of protein in H 2 0+ 0.01% thiomersal.
  • each stock solution is incubated for 15 minutes at 37 ° C, then in each case an adequate volume of NaCl (14%) is added to each solution to obtain an isotonic solution (0.9%, NaCl). The whole is vortexed for 3 minutes.
  • Immunizations the injections took place on days 0 and 14. The solutions are administered subcutaneously (100 ⁇ l at 2 different sites, in total 200 ⁇ l per animal). The blood samples were taken on days 14 and 28 (retro-orbital puncture).
  • the specific IgG1, IgG2a and IgM for ovalbumin are incubated for 30 minutes at 37 ° C with 100 ⁇ l of antibodies (anti-mouse rat) anti-IgG1 conjugated with peroxidase (Serotec, Oxford, UK), IgG2a conjugated. with peroxidase (Pharmingen, San Diego, CA, USA) and IgM conjugated with biotin (Pharmingen, San Diego, CA, USA), previously diluted in PBS / BSA Tween buffer (dilutions: 250, 1000, and 500 times respectively).
  • a 3 rd incubation was required (30 min at 37 ° C) with a 1/100 solution of streptavidin conjugated to peroxidase (Dako, Glostrup, DK).
  • the aim of this study is to compare the serological response induced by the injection of an adjuvant + antigen (OM-197-MP + H1N1) mixture with that elicited by a conjugate with this same antigen (OM-197-FV-H1 N1).
  • OM-197-MP + H1N1 an adjuvant + antigen
  • OM-197-FV-H1 N1 an adjuvant + antigen
  • Group A the mother solution of H1N1 (hemagglutinin A / Beijing 262/95, Solvay Duphar, Weesp, NL) was prepared at the concentration of 25 ⁇ g / ml in H 2 0.
  • Group B the mother solution H1N1 + OM-197-MP contains 25 ⁇ g / ml of H1 N1 and 500 ⁇ g / ml of OM-197-MP in H 2 0.
  • the injections took place on days 0 and 14.
  • the solutions are administered subcutaneously (50 ⁇ l at 2 different sites, in total 100 ⁇ l per animal).
  • the blood samples were taken on day 14 (retro-orbital puncture).
  • the specific IgMs for H1N1 were determined in duplicates by ELISA. Briefly, microwell plates (NUNC Immunoplate, Roskilde, DK) were incubated (coated overnighf) at 4 ° C with 100 ⁇ l of H1 N1 (0.5 ⁇ g) in a bicarbonate buffer (pH 9.6). After washing with 0.5% Tween-20 (Merck, Hohenbrunn, D) the sera were diluted 50, 200 and 800 times (dilution solution: phosphate buffered saline (PBS) + 1% bovine serum albumin (BSA, Sigma, St. Louis, Mo, USA) + 0.02% Tween- 20)). 100 ⁇ l of each of the diluted sera was added to the wells. This incubation lasted 45 minutes at 37 ° C.
  • PBS phosphate buffered saline
  • BSA bovine serum albumin
  • the specific IgMs for H1N1 are incubated for 30 minutes at 37 ° C. with 100 ⁇ l of anti-mouse IgG antibodies (anti-mouse rat) conjugated with biotin (Pharmingen, San Diego, CA, USA), diluted beforehand in Tween buffer (dilution: 500 times). After an additional wash, a third incubation (30 min at 37 ° C) was carried out with a 1/100 solution of streptavidin conjugated to peroxidase (Dako, Glostrup, DK).
  • TMB 3 ', 3', 5 ', 5'-tetramethylbenzidine solution
  • the results of each measurement at 490 nm are expressed in Arbitrary Units (AU) per ml. This was possible by comparing each sample with a reference prepared from dilutions of a pool of samples at 28 days from group A (animals injected with H1N1 alone). By definition, the sample pool diluted 50 times is at the concentration of 1000 AU / ml. The individual results were then corrected according to the corresponding dilution factor (50, 200, or 800 times) and are presented in Figure 56: the solid circles correspond to the 28-day average.
  • mice immunized with the OM-197-FV-H1 N1 conjugate show an anti-H1N1 IgM antibody titer greater than that of the control constituted by the H1N1 antigen alone, as well as that of the OM-197-MP + mixture. H1 N1.

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Abstract

L'objet de l'invention concerne spécifiquement des pseudodipeptides qui dérivent d'acides aminés fonctionnalisés, comportant des chaînes d'acides gras fixées sous forme d'amide sur les fonctions amine du pseudodipeptide et dont l'une des extrémités est porteuse d'un bras auxiliaire fonctionnalisé, l'autre extrémité étant un groupement acide sous forme neutre ou chargée. Les composés de la présente invention possèdent des propriétés immunomodulatrices per se comme adjuvants, en agissant comme activateurs des cellules présentatrices d'antigènes comme les macrophages et les cellules dendritiques et comme inducteurs de la différenciation des cellules dendritiques. Les composés de l'invention peuvent en outre être greffés sur un antigène pour moduler la réponse immunitaire ou être également greffés sur un pharmacophore pour améliorer son action thérapeutique ou son ciblage. Les composés de l'invention trouvent de ce fait une utilisation en médecine humaine et vétérinaire comme agents immunisants et comme outil diagnostic.

Description

PSEUDODIPEPTIDES ACYLES PORTEURS D'UN BRAS AUXILIAIRE FONCTIONNALISE
INTRODUCTION
La présente invention se rapporte au domaine de la chimie, et plus particulièrement à celui de la chimie des peptides. Elle a plus précisément pour objet des bioconjugués de dérivés peptidiques avec un bras auxiliaire fonctionnalisé. La bioconjugaison implique le couplage de deux ou plusieurs entités chimiques pour former un nouveau complexe moléculaire possédant des propriétés différentes de celles de ses composants individuels. Des produits naturels ou synthétiques, dotés de propriétés pharmacologiques propres, peuvent ainsi être combinés entre eux pour créer de nouvelles entités aux propriétés physicochimiques et pharmacologiques originales ou améliorées par rapport aux composés de départ. Les applications de la bioconjugaison touchent tous les domaines de la médecine humaine, vétérinaire et les méthodes de diagnostic.
De nombreux agents de couplage de type homo- ou hétérobifonctionnels ont déjà été décrits et peuvent être appliqués à la conjugaison de molécules aussi diverses que des acides aminés, des peptides, des protéines, des sucres, des oligosaccharides, des polysaccharides, des acides nucléiques, des oligonucléotides, des polynucléotides, des lipides, et à pratiquement toute molécule porteuse d'un groupe fonctionnel susceptible de former une liaison. Un effort considérable a été consacré ces dernières années à la synthèse de constructions antigéniques composées de deux molécules porteuses de messages différents. Good et al. [(1987), Science 235, 1059-1062], ont par exemple synthétisé un peptide contenant des epitopes reconnus à la fois par les lymphocytes T auxiliaires et par les lymphocytes B. Bessler et Jung [(1992) Res. Immunol. 5, 548-553] ont décrit des conjugués composés d'un peptide et d'un immunostimulant. Hoffmann et al. [(1997) FEMS Immunol. Med. Microbiol. Microbiology 17, 225-234] ont décrit des conjugués entre un lipopeptide et un peptide synthétique de la melittine. Ulrich et Myers [(1995) Vaccine Design, Plénum Press, New York, 495-524], ont observé que la réponse immunitaire n'était efficace que i l'haptène et l'adjuvant PL (Monophosphoryl Lipid A) se trouvaient dans le même liposome. Ils ont discuté de la possibilité d'une liaison l covalente entre l'adjuvant MPL et l'haptène. En effet un conjugué haptène-adjuvant pourrait s'avérer être très efficace comme adjuvant de vaccination. Ikeda et al. [(1999) Chem. Pharm. Bull., 47(4), 563-568] ont présenté une synthèse entre un analogue structurel du Lipid A et un antigène tumoral de nature peptidique et démontré in vitro une activité mitogénique.
Ce concept de conjugaison pourrait être valable aussi pour des protéines ou même des couples protéines-polysaccharides. En effet, il est connu que des polysaccharides utilisés seuls comme vaccin, n'induisent qu'une réponse immunologique faible chez les enfants de moins de 5 ans, parce que la réponse ne dépend pas des cellules T [Gotschlich et al., (1977) ; Antibodies in Human Diagnosis and Therapy, Peltola et al., (1977), Pediatrics 60, 730-737]. Au contraire, des polysaccharides liés aux protéines vecteurs (carrier) donnent une réponse immunologique beaucoup plus forte. Ce phénomène a été découvert en 1931 par Avery et Goebel [(1931), J. Exp. Med. 54, 437-447]. Divers vaccins développés ces dernières années témoignent du progrès dans ce domaine. On mentionnera en particulier les vaccins contre Haemophilus influenzae et divers sérotypes de Streptococcus pneumoniae [Powell et Newman, (1995), Vaccine Design Plénum Press, New York]. Pour ces derniers, un vaccin multivalent a été développé [Sood et Fattom, (1998), Exp. Opin. Invest. Drugs 7 (3), 333-347].
Des perspectives nouvelles s'ouvrent avec un complexe composé d'un adjuvant lié à l'unité polysaccharide-protéine. La technologie de synthèse chimique de bioconjugués est bien développée et permet aujourd'hui de réaliser une multitude de projets inconcevables il y a quelques années, en utilisant les nombreux réactifs homo- ou hétérobifonctionnels disponibles et les procédures de conjugaison décrites dans une vaste littérature [Hermanson, (1996), Bioconjugate Techniques, Académie Press, New York]. C'est ainsi que par exemple on pourrait citer la méthode de l'aminatjon réductrice [Roy et al., (1984), Canad. J. Biochem. Cell. Biol. 62, 270-279; Hermanson, (1995), p.472] permettant la conjugaison d'une molécule porteuse d'une fonction aldéhyde, avec une aminé primaire présente sur un peptide ou une protéine, avec un conjugué protéine-polysaccharide ou avec un pharmacophore. Cette réaction conduit à la formation d'une dialkylamine très stable.
DESCRIPTION DE L'INVENTION
L'invention a plus précisément pour objet des pseudodipeptides dérivés d'acides aminés fonctionnalisés, dont les fonctions aminé libres sont amidifiées par des acides gras et dont l'une des extrémités est porteuse d'un bras auxiliaire fonctionnalisé. Elle a spécifiquement pour objet des pseudodipeptides N-acylés borteurs 'd'un groupement acide sous forme neutre ou chargée à l'une des extrémités1 du pseudodipeptide et porteurs à l'autre extrémité d'un bras auxiliaire fonctionnalisé, répondant à la formule générale I.
X-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-Y-(CH2)p-CH-(CH2)q-Z I I (I)
Figure imgf000004_0001
dans laquelle Ri et R2 représentent chacun un groupe acyle dérivé d'un acide carboxylique ayant de 2 à 24 atomes de carbone, saturé ou insaturé, linéaire ou ramifié, non-substitué ou portant un ou des substituants choisis parmi les groupes hydroxyle, alkyle, aikoxy, acyloxy, amino, acylamino, acylthio et (alkyle en Ci - C24) thio les descripteurs m, n pouvant prendre une valeur variant de 0 à 10 les descripteurs p, q pouvant prendre une valeur variant de 1 à 10 X et Z représentent un groupe acide sous forme neutre ou chargée ou un bras auxiliaire fonctionnalisé, avec la limitation que l'un au moins des substituants X ou Z représente un bras auxiliaire fonctionnalisé, Y représente O ou NH,
Le groupe acide X ou Z sera choisi de préférence parmi les groupements :
-carboxyle
-carboxy [(Cι-C5)alkoxy] -carboxy [(Cι-C5)alkylthio]
-phosphono [(CrC5)alkoxy]
-phosphono [(CrC5)alkylthio]
-dihydroxyphosphoryloxy [(Cι-Cs)alkoxy]
-dihydroxyphosphoryloxy -hydroxysulfonyloxy
-hydroxysulfonyl [(Cι-Cs)alkoxy]
-hydroxysulfonyl [(Cι-C5)alkylthio]
-hydoxysulfonyloxy [(CrC5)alkoxy]
-hydoxysulfonyloxy [(C-i-CsJalkylthio]
Le groupe auxiliaire en X ou Z sera de formule générale (II)
A-(CO)r(CH2)s-W (II)
A pouvant être O, S ou NH le descripteur r pouvant prendre une valeur de 0 ou de 1 le descripteur s pouvant prendre une valeur variant de 1 à 10
W pouvant être choisi de préférence parmi les groupements :
-formyle -acétyle
-cyano
-halogéno -amino
-bromo ou iodo-acétamido
-acylamido -diacylimido
-sulfhydryle
-alkylthio
-hydroxyle -acyloxy -vinyle -éthynyle
-carboxyle libre ou sous forme d'ester, d'anhydride mixte, d'amide ou d'hydrazide -azido -thiocyano
Lorsque les substituants X ou Z représentent un groupe acide sous fdrme neutre, il s'agit de la forme carboxylique, sulfonique, phosphonique ou phosphorique libre. Lorsqu'il s'agit d'un groupe acide sous forme chargée il s'agit de la forme carboxylique, sulfonique, phosphonique ou phosphorique salifiée, notamment par addition d'une base minérale ou organique, de préférence thérapeutiquement compatible. Lorsque les bases ne sont pas thérapeutiquement compatibles, elles peuvent servir de moyen d'identification, de purification ou de dédoublement.
Parmi les bases salifiantes thérapeutiquement compatibles on citera notamment les bases alcalines comme les hydroxydes de sodium, de potassium, de lithium, les sels d'ammonium ; les bases alcalino-terreuses comme les hydroxydes de calcium ou de strontium, les sels de magnésium, les sels de métaux ferreux et similaires, les bases organiques comme celles dérivées d'aminés primaires, secondaires ou tertiaires des aminoacides à réaction basique comme la lysine ou l'ornithine ou des sucres aminés.
Des bases non utilisables thérapeutiquement sont par exemple la brucine, la strychnine, la N-méthylglucosamine ou la N-méthylmorpholine. Comme indiqué ci- dessus les sels en découlant serviront comme moyen de séparation ou d'identification.
Lorsque m est égal à 1 et n est égal à 0, la molécule peut dériver de la serine ou de l'acide aspartique. Lorsque m est égal à 2 et n est égal à 0, la molécule peut dériver de l'homosérine ou de l'acide glutamique
Lorsque Y = NH, p est égal à 3 et q est égal à 1 , il peut s'agir d'u dérivé de la citrulline ou de l'ornithine ou de l'arginine. Lorsque p est égal à 4 et q est égal à 1 , il peut s'agir d'un dérivé de l'|homoarginine ou de la lysine Lorsque le substituant X ou Z représente le groupe auxiliaire de forrhule générale
(III) 0-CO-(CH2)s-W (III)
le descripteur s pouvant prendre une valeur variant de 1 à 10, mais plus particulièrement 4, 5 ou 6
W sera choisi de préférence parmi les groupements : - formyle
- amino
- hydroxyle
Parmi les pseudodipeptides objet de l'invention, on retiendra particulièrement comme composés actuellement préférés les composés de formule générale IV:
X-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-NH-(CH2)p-CH-(CH2)q-Z
I I (iv)
NHRi NHR2
dans laquelle Ri et R2 représentent chacun un groupe acyle dérivé d'un acide carboxylique ayant de 2 à 24 atomes de carbone, saturé ou insaturé, linéaire ou ramifié, non-substitué ou portant un ou plusieurs substituants choisis dans le groupe formé de hydroxyle, alkyle, aikoxy, acyloxy, amino, acylamino, acylthio et (alkyl en Ci - C24) thio les descripteurs m, n pouvant prendre une valeur variant de 0 à 10 les descripteurs p, q pouvant prendre une valeur variant de 1 à 10 et dans laquelle X est un carboxyle ou un radical dihydroxyphosphoryloxy ou un groupe carboxy [(Cι-C5)alkoxy] ou carboxy [(Cι-C5)alkylthio] et dans laquelle Z est un radical 6-aminohexanoyloxy, un radical 6-oxohexanoyloxy, un radical 6- hydroxyhexanoyloxy ou un radical 6,7-dihydroxyheptanoyloxy
L'invention concerne en particulier à titre de composés actuellement préférés : - l'acide N-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoylamino]-D-aspartique, α-N-{(4R)-5- hydroxy-4-[(R)-3-hydroxytétra-decanoylamino] pentyljamide et ses sels d'addition avec une base minérale ou organique
- le 3-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hydroxytétra décanoylamino]-décan-1 ,10-diol 1-dihydrogénophosphate 10-(6-oxohexanoate) et ses sels d'addition avec une base minérale ou organique
l'acide N-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoylamino]~D-aspartique, α-N-{(4R)- 5-hydroxy-4-[(R)-3-hydroxytétra-decanoylamino] pentyl}amide 5-0-(6-oxohexanoate) et ses sels d'addition avec une base minérale ou organique
- le 3-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hydroxytétra- décanoylamino]-décan-1 ,10-diol 1-dihydrogéno-phosphate (6-aminohexanoate) et ses sels d'addition avec une base minérale ou organique
- le 3-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hydroxytétra décanoylamino]-décan-1 ,10-diol 1-dihydrogéno-phosphate 10-(6-hydroxyhexanoate) et ses sels d'addition avec une base minérale ou organique
le 2-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoylamino]-4-(dihydroxyphosphoryloxy) butanoate de {2-[(R)-3-hydroxyoxytétradécanoylamino]-5-(6-oxohexyl)amino}pentyle et ses sels d'addition avec une base minérale ou organique
La définition de Ri et R2 englobe des dérivés acyles à chaîne de longueur variable allant de 2 à 24 atomes de carbone, identiques ou différents, ramifiés ou en chaîne droite, saturés ou insaturés, pouvant porter un ou plusieurs substituants choisis dans le groupe formé par un alkyle, amino, acylamino, hydroxyle, aikoxy, acyloxy, acylthio et alkylthio.
Parmi les groupements acyle concernés, ceux dérivés de l'acide laurique, de l'acide 3-hydroxymyristique, de l'acide 3-lauryloxymyristique, de l'acide 3-myristyloxymyristique et de l'acide 3-palmityloxymyristique sont ceux actuellement préférés.
Les composés suivants de formule générale I sont porteurs d'un bras auxiliaire et sont désignés sous le nom de code suivant:
OM-197-FV7: X = dihydroxyphosphoryloxy, Y = NH, Z = auxiliaire 6-oxohexanoyl'pxy,
R1 = 3-lauryloxy-myristyle, R2 = 3-hydroxymyristyle, m = 2, n= 0, p = 3, ,q = 1
OM-287-AC5: X = dihydroxyphosphoryloxy, Y = NH, Z = auxiliaire 6-amino- hexanoyloxy, R1 = 3-lauryloxymyristyle, R2 = 3-hydroxymyristyle, m = 2, n= 0, p = 3, q = 1
OM-197-MC-FV6: X = carboxyle, Y = NH, Z = auxiliaire 6-oxohexanoyloxy, R1 = 3-lauryloxymyristyle, R2 = 3-hydroxymyristyle, m = 1 , n = 0, p = 3, q = 1
OM-197-FV8: X = dihydroxyphosphoryloxy, Y = NH, Z = auxiliaire 6-hydroxyhexanoyloxy, R1 = 3-lauryloxymyristyle, R2 = 3-hydroxymyristyle, m = 2, n = 0, p = 3, q = 1
OM-144-FP9: X = dihydroxyphosphoryloxy, Y = O, Z = auxiliaire (6-ox(Dhexyl)arriino,
R1 = 3-lauryloxymyristyle, R2 = 3-hydroxymyristyle, m = 2, n= 0, p = 1 , q = 3
OM-112-FV7: X = carboxyméthoxy, Y = NH, Z = auxiliaire 6-oxohexanoyloxy, R1 = 3-lauroyloxymyristyle, R2 = 3-hydroxymyristyle, m = 1 , n= 0, p = 3, q = 1
OM-212-AH1 : X = carboxyméthylthio, Y = NH, Z = auxiliaire 7-aminoheptanoyloxy, R1 = 3-myristoyloxymyristyle, R2 = 3-hydroxymyristyle, m =1 , n = 0, p = 3, q = 1
OM-312-FV7: X = -0-CH2-CH(COOH)2, Y = NH, Z = auxiliaire 6-oxohexanoyloxy, R1 = 3-lauryloxymyristyle, R2 = 3-hydroxymyristyle, m = 1 , n = 0, p = 3, q =; 1 OM-412-BA7: X = dihydroxyphosphoryloxy, Y = NH, Z = auxiliaire 6-(bromoacétamido)hexanoyloxy, R1 = 3-lauryloxymyristyle! R2 = 3-hydroxymyristyle, m = 2, n = 0, p = 3, q = 1
OM-512-FV7: X = dihydroxyphosphoryloxy, Y = NH, Z = auxiliaire 6-oxohexanoyloxy, R1 = 3-hydroxymyristyle, R2 = 3-lauryloxymyristyle, m = 2, n = 0, p = 3, q = 1
Ces composés, se distinguent par des propriétés pharmacologiques intéressantes, notamment immunomodulatrices. Ils trouvent un intérêt particulier dans la préparation de compositions vaccinales en tant que conjugués de manière covalente avec des antigènes de nature polypeptidique ou polysaccharidique ou sur des composés constitués de polypeptides conjugués à des polysaccharides. Ils peuvent être utilisés notamment dans la prévention des infections d'origine virale, microbienne et protozoaires ou dans la thérapie de certaines maladies autoimmunes.
Ils trouvent également une utilisation comme vecteur de molébule d'intérêt thérapeutique par leurs propriétés d'association non-covalente selon le caractère plus ou moins hydrophile ou hydrophobe de leur bras auxiliaire. Leur propriétés chimiques qui permettent de les coupler chimiquement avec des molécules d'intérêt thérapeutique, de même que leur caractère amphiphile favorise les formulations et le transport des molécules qui leur sont associées vers les récepteurs membranaires, ainsi que vers les parois et le cytoplasme cellulaires.
Ils peuvent être utilisés également seuls ou en association covalente ou non avec une molécule d'intérêt thérapeutique par voie orale, parentérale, rectale, topique, percutanée ou permuqueuse.
Ils peuvent être utilisés seuls ou en association covalente ou non avec une molécule d'intérêt thérapeutique par incubation extratemporanément ex vivo avec des cellules sanguines afin de rendre les cellules immunocompétentes avant de les réinoculer in vivo par voie parentérale. Les molécules montrent des propriétés semblables, en tant qu'adjuvants du système immunitaire utilisés par exemple pour la vaccination, en association covalente ou non avec les antigènes appropriés, contre des maladies d'origine virale, parasitaire, microbienne et fongique. Ces molécule conjuguées ou non peuvent être en outre utilisées dans la thérapie de certaines maladies autoimmunes.
Par contre, certains des composés selon l'invention montrent des propriétés différentes dans leur capacité à induire la production de cytokines ou la maturation des cellules souches immunocompetentes provenant des organes hematopoietiques et lymphoides.
Certains des composés selon l'invention favorisent la maturation et la différenciation des monocytes en cellules dentritiques fonctionnelles, en présence ou en absence de l'antigène approprié et contribuent ainsi à renforcer l'immunité humorale et cellulaire. '
I Les composés selon l'invention sont particulièrement intéressants d j fait de ! leur faible toxicité. Ils sont utilisés en association covalente ou non avec des antigènes dans la prévention ou la thérapie de maladies infectieuses chez l'homme et chez l'animal à des doses qui varient de 0.005 mg à 100 mg par prise unitaire et de 0.005 à 200 mg par jour selon les indications.
La présente invention a également pour objet un procédé d'obtention des pseudodipeptides N-acylés porteurs d'un groupement acide sous forme neutre ou chargée à l'une des extrémités du pseudodipeptide et porteurs à l'autre extrémité d'un auxiliaire fonctionnalisé, répondant à la formule générale I, qui consiste en ce qu'on bloque les fonctions aminé en position (q+1) et YH en position ω d'un acide aminé ω-fonctionnalisé par des réactifs de blocage orthogonaux, on soumet la fonction carboxylique restée libre à l'action d'un agent réducteur pour rmer l'alcool correspondant, on libère la fonction aminé en position (q+1) que l'on acyle à l'aide d'un dérivé fonctionnel d'un acide carboxylique de formule R2OH dans laquelle R2 est défini comme précédemment, puis libère la fonction terminale pour obtenir l'amino alcool fonctionnalisé de formule générale V
Y-(CH2)P-CH-(CH2)q-OH (V)
I NHR2
dans laquelle Y représente HO ou préférablement NH2, R2 représente un groupe acyle dérivé d'acide carboxylique ayant de 2 à 24 atomes de carbone, saturé ou non-saturé, non-substitué ou portant un ou plusieurs substituants définis comme ci-dessus, p et q représentent chacun un nombre entier variant de 1 à 10 que l'on condense en présence d'un agent de condensation peptidique dans un solvant inerte, avec un dérivé d'un acide aminé ω-fonctionnalisé de formule générale VI
X-(CH2)m-CH-(CH2)n-COOH (VI)
NHR-,
dans laquelle Ri est un groupe acyle dérivé d'un acide carboxylique ayant de 2 à 24 atomes de carbone, saturé ou non-saturé, non-substitué ou portant un ou plusieurs substituants définis comme précédemment, m et n est un nombre entier variant de 0 à 10 et X est un groupe acide défini comme précédemment qui peut être sous forme estérifiée pour former le pseudodipeptide de formule générale VII
X-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-Y-(CH2)p-CH(CH2)q-OH
I I (VII)
NHR-, NHR2
dans laquelle les substituants R-i, R2, et les descripteurs m, n, p et q sont définis comme précédemment, dont on peut -si désiré- substituer, alkyler ou acyler la fonction alcool terminal libre par un réactif de substitution, d'alkylation ou d'acylation de formule générale VIII,
A-(CO)r(CH2)s-W (VIII) A pouvant être un groupe partant, une fonction OH, SH ou NH2 le descripteur r étant de préférence 1 , mais pouvant prendre également une valeur de O le descripteur s étant compris de préférence entre 2 et 6, mais pouvant prendre ιune valeur variant de 1 à 10
W étant choisi de préférence parmi les groupements, -formyle, -acétyle, -cyano, - halogéno, -amino, -bromo ou iodoacétamido, -acylamido, -diacylimido, -sulfhydryle, - alkylthio, -hydroxyle, -acyloxy, -vinyle, -ethynyle, -carboxyle libre ou présent sous forme d'ester, d'anhydride mixte, d'amide ou d'hydrazide, -azido, -thiocyano ou leurs précurseurs.
X-(CH2)m-CH-(CH2)nCO-Y-(CH2)p-CH-(CH2)q-Z (I)
I I NH NH
Ri R2
dans laquelle et les substituants X, Y, Z, Ri, R2, n, m, p et q ont les significations fournies antérieurement, si nécessaire en présence d'un agent de couplage, et de le soumettre à une hydrogénation catalytique ou à un autre processus de déprotection de façon à obtenir le dérivé de formule générale I
L'invention concerne aussi un procédé d'obtention des phosphopseudodipeptides de formule générale IV
X-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-NH-(CH2)p-CH-(CH2)q-Z (IV)
I I
NHR-, NHR2
dans laquelle Ri et R2 représentent chacun un groupe acyle dérivé d'un acide carboxylique ayant de 2 à 24 atomes de carbone, saturé ou insaturé, linéaire ou ramifié, non-substitué ou portant un ou plusieurs substituants choisis dans le groupe formé de hydroxyle, alkyle, aikoxy, acyloxy, amino, acylamino, acylthio et (alkyl en C1-C24) thio les descripteurs m, p et q pouvant prendre une valeur allant de 1 à 10 le descripteur n pouvant prendre une valeur allant de 0 à 10 dans laquelle X et Z représentent chacun un groupement acide ou un auxiliaire fonctionnalisé, caractérisé en ce qu'on bloque les fonctions aminé en position (q+1) et en ω d'un acide diaminé de formule H2N(CH2)pCHNH2(CH2)q-ιCOOH par des réactifs de blocage labiles par acidolyse et hydrogénolyse, respectivement, soumet la fonction carboxylique restée libre à l'action d'un agent réducteur pour former l'alcool correspondant, libère la fonction aminé en (q+1) que l'on acyle à l'aide d'un dérivé fonctionnel d'un acide carboxylique de formule R2OH dans laquelle R2 est défini comme précédemment, puis libère la fonction aminé terminale par Hydrogénolyse pour obtenir l'amino alcool de formule générale IX
H2N-(CH2)p-CH-(CH2)q-OH (IX)
I
NHR2 dans laquelle R2 représente un groupe acyle dérivé d'acide carboxylique ayant de 2 à 24 atomes de carbone, saturé ou non-saturé, non substitué ou portant un ou plusieurs substituants définis comme ci-dessus, p et q représentent un nombre entier variant de 1 à 10 que l'on condense en présence d'un agent de condensation peptidique dans un solvant inerte avec un dérivé d'acide aminé ω-hydroxylé de formule générale VI
X-(CH2)m-CH-(CH2)n-COOH (VI)
I
Figure imgf000014_0001
dans laquelle Ri est un groupe acyle dérivé d'un acide carboxylique ayant de 2 à 24 atomes de carbone, saturé ou non-saturé, non substitué ou portant un ou plusieurs substituants m est un nombre entier variant de 1 à 10 n est un nombre entier variant de 0 à 10 et X est un groupe dialkyloxy- ou diaryloxy-phosphoryloxy de formule (RO)2 P-0 i O pour former le pseudodipeptide de formule générale X
(RO)2PO-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-NH-(CH2)p-CH-(CH2)q-OH (X) i I I O NHR NHR2
dans laquelle les substituants Ri, R2 et les descripteurs m, n, p et jq sont définis comme précédemment, et R est un radical labile par hydrogénolyse, dont on peut -si désiré- substituer, alkyler ou acyler la fonction alcool terminal libre par un réactif de substitution, d'alkylation ou d'acylation de formule générale VIII,
A-(CO)r-(CH2)s-W (VIII)
A pouvant être un groupe partant, une fonction OH, SH ou NH le descripteur r étant de préférence 1 , mais pouvant prendre également une valeur de O le descripteur s étant compris de préférence entre 2 et 6, mais pouvant prendre une valeur variant de 1 à 10
W étant choisi de préférence parmi les groupements, -formyle, -acétyle, -cyano, - halogéno, -amino, -bromo ou iodoacétamido, -acylamido, -diacylimido, -sulfhydryle, - alkylthio,, -hydroxyle, -acyloxy, -vinyle, -ethynyle, -carboxyle libre ou sous forme d'ester, d'anhydride mixte, d'amide ou d'hydrazide, -azido, -thiocyano ou leurs précurseurs, si nécessaire en présence d'un agent de couplage, et de le soumettre à une hydrogénation catalytique ou à un autre processus de déprotection de façon à obtenir le dérivé de formule générale XI
(HO)2 P-0-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-NH-(CH2)p-CH-(CH2)q-O-(CO)r(CH2)s-W i I I
O NH NH (XI) I I
Figure imgf000015_0001
dans laquelle les substituants W, R-i, R2, m, n, p, q, r, s ont les significations fournies antérieurement.
L'invention concerne aussi un procédé d'obtention des phosphopseudodipeptides de formule générale XII
X-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-0-(CH2)q-CH-(CH2)p-Z (XII)
I I
NHR-, NHR2
dans laquelle Ri et R2 représentent chacun un groupe acyle dérivé d'un acide carboxylique ayant de 2 à 24 atomes de carbone, saturé ou insaturé, linéaire ou ramifié, non-substitué ou portant un ou plusieurs substituants choisis dans le groupe formé de hydroxyle, alkyle, aikoxy, acyloxy, amino, acylamino, acylthio et (alkyl en Ci - C24) thio les descripteurs m, p et q pouvant prendre une valeur allant de 1 à 10 le descripteur n pouvant prendre une valeur allant de 0 à 10 dans laquelle X et Z représentent chacun un groupement acide ou un auxiliaire fonctionalisé qui consiste en ce qu'on bloque les fonctions aminé en position (q+1) et en ω d'un acide diaminé de formule H2N(CH2)pCHNH2(CH2)q-ιCOOH par des réactifs de blocage labiles par acidolyse et hydrogénolyse, respectivement, soumet la fonction carboxylique restée libre à l'action d'un agent réducteur pour former l'alcool correspondant, libère la fonction aminé en (q+1) que l'on acyle à l'aide d'un dérivé fonctionnel d'un acide carboxylique de formule R2OH dans laquelle R2 est défini comme précédemment, libère la fonction aminé terminale par hydrogénolyse puis alkyle la fonction aminé avec un triflate d'alkyle ω-fonctionnalisé pour obtenir l'amino alcool de formule générale XIII
W-(CH2)sNH-(CH2)P-CH-(CH2)q-OH (XIII) |
NHR2 dans laquelle R2 représente un groupe acyle dérivé d'acide carboxylique ayant de 2 à 24 atomes de carbone, saturé ou non-saturé, non substitué ou portant un ou plusieurs substituants définis comme ci-dessus, p et q représentent un nombre entier variant de 1 à 10 le descripteur s étant compris de préférence entre 2 et 7, mais pouvant prendre une valeur variant de 1 à 10 que l'on condense en présence d'un agent de condensation dans un solvant inerte avec un dérivé d'acide aminé ω-hydroxylé de formule générale VI
X-(CH2)m-CH-(CH2)n-COOH (VI)
NHR-i
dans laquelle Ri est un groupe acyle dérivé d'un acide carboxylique ayant de 2 à 24 atomes de carbone, saturé ou non-saturé, non substitué ou portant un ou plusieurs substituants m est un nombre entier variant de 1 à 10 n est un nombre entier variant de 0 à 10 et X est un groupe dialkyloxy- ou diaryloxy-phosphoryloxy de formule (RO)2 P-0 i
O pour former le pseudodipeptide de formule générale XIV
(RO)2PO-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-0-(CH2)q-CH-(CH2)p-NH-(C(H2)sW (ΛiV) i l I
O NHR-, NHR2
dans laquelle les substituants Ri, R2 et les descripteurs m, n, p, q et s sont définis comme précédemment, et R est un radical labile par hydrogénolyse,
puis le soumettre à une hydrogénation catalytique ou à un autre processus de déprotection de façon à obtenir le dérivé de formule générale XV W étant choisi de préférence parmi les groupements, -formyle, -acétyle, -cyano, - halogéno, -bromo ou iodoacétamido, -acylamido, -diacylimido, -acyloxy, -vinyle, - ethynyle, -carboxyle libre ou sous forme d'ester, d'anhydride mixte, d'amide ou d'hydrazide, -azido, -thiocyano ou leurs précurseurs.
(HO)2 P-0-(CH2)m-CH-(CH2)nCO-0-(CH2)q-CH-(CH2)P-NH-(CI-t2)s-W - I I (XV)
O NH Ri NHR2
dans laquelle les substituants W, Ri, R2, m, n, p, q, r, et s ont les significations fournies antérieurement.
L'invention concerne aussi un procédé d'obtention des carboxypseudodipeptides de formule générale IV X-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-NH-(CH2)p-CH-(CH2)q-Z (IV)
I I
NHRi NHR2
dans laquelle Ri et R2 représentent chacun un groupe acyle dérivé d'un abide carboxylique ayant de 2 à 24 atomes de carbone, saturé ou insaturé, linéaire ou ramifié, non-substitué ou portant un ou plusieurs substituants choisis dans le groupe formé de hydroxyle, alkyle, aikoxy, acyloxy, amino, acylamino, acylthio et (alkyl en C1-C-24) thio les descripteurs m, p et q pouvant prendre une valeur allant de 1 à 10 le descripteur n pouvant prendre une valeur allant de 0 à 10 dans laquelle X et Z représentent chacun un groupement acide ou un auxiliaire fonctionnalisé qui consiste en ce qu'on bloque les fonctions aminé en position (q+1) et en ω d'un acide diaminé de formule H2N(CH2)pCHNH2(CH2)q.ιCOOH par des réactifs de blocage labiles par acidolyse et hydrogénolyse, respectivement, soumet la fonction carboxylique restée libre à l'action d'un agent réducteur pour former l'aijcool correspondant, libère la fonction aminé en (q+1) que l'on acyle à l'aie e d'un dérivé fonctionnel d'un acide carboxylique de formule R2OH dans laquelle R2 est défini comme précédemment, puis libère la fonction aminé terminale par hydrogenojyse pour obtenir l'amino alcool de formule générale IX
H2N-(CH2)p-CH-(CH2)q-OH (IX) I
NHR2
dans laquelle R2 représente un groupe acyle dérivé d'acide carboxylique ayant de 2 à 24 atomes de carbone, saturé ou non-saturé, non substitué ou portant un ou plusieurs substituants définis comme ci-dessus, p et q représentent un nombre entier variant de 1 à 10 que l'on condense en présence d'un agent de condensation peptidique dans un solvant inerte avec un dérivé fonctionnel d'ω-carboxy amino acide de formule générale VI
X-(CH2)m-CH-(CH2)n-COOH (Vl)
I
NHRT
dans laquelle Ri est un groupe acyle dérivé d'un acide carboxylique ayant de 2 à 24 atomes de carbone, saturé ou non-saturé, non substitué ou portant un ou plusieurs substituants m est un nombre entier variant de 1 à 10 n est un nombre entier variant de 0 à 10 et X est un radical RO-CO- pour former le pseudodipeptide de formule générale XVI
RO-CO-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-NH-(CH2)p-CH-(CH2)q-OH (XVI)
I I
Figure imgf000019_0001
dans laquelle les substituants R-i, R2 et les descripteurs m, n, p et q sont définis comme précédemment, et R est un groupe labile par hydrogénolyse comme par exemple le groupe benzyle, dont on peut -si désiré- substituer, alkyler ou acyler la fonction alcool terminal libre par un réactif de substitution, d'alkylation ou d'acylation de formule générale VIII,
A-(CO)r(CH2)s-W (VIII)
A être un groupe partant, une fonction OH, SH ou NH2 le descripteur r étant de préférence 1 , mais pouvant prendre également une valeur de O le descripteur s étant compris de préférence entre 2 et 6, mais pouvant prendre une valeur variant de 1 à 10
W étant choisi de préférence parmi les groupements, -formyle, -acétyle, -cyano, - halogéno, -amino, -bromo ou iodoacétamido, -acylamido, -diacylimido, -sulfhydryle, - alkylthio, -hydroxyle, -acyloxy, -vinyle, -ethynyle, -carboxyle libre ou sous forme d'ester, d'anhydride mixte, d'amide ou d'hydrazide, -azido, -thiocyano ou leurs précurseurs, si nécessaire en présence d'un agent de couplage, et de le soumettre à une hydrogénation catalytique ou à un autre processus de déprotection de façon à obtenir le dérivé de formule générale XVII
HO-CO-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-NH-(CH2)p-CH-(CH2)q-0-(CO)r(CH2)s-W
I I NH NH (XVII)
! I
Ri R2
dans laquelle les substituants W, R-i, R2, m, n, p, q, r, s ont les significations fournies antérieurement.
La stéréochimie des centres porteurs de groupes acylamino est déterminée par la configuration des acides aminés de départ et celle des groupes acylamino par la configuration des acides gras de départ. On peut partir d'un diamino acide de configuration L ou D ou racémique. On peut partir d'un acide aminé hydroxyle de configuration L, D ou racémique. Tous ces stéréoisomères ou diastéréoisomères des composés de formule générale I ou IV ou XII, font partie de l'invention.
De façon générale, les composés de l'invention sont préparés par le couplage entre la fonction acide d'un acide aminé N-acylé ω-fonctionnalisé et la fonction aminé d'un amino alcool résultant de la réduction du carboxyle d'un acide diaminé mono-N- acylé, puis de la O-acylation ou -alkylation de la fonction alcool restée libre afin d'introduire un auxiliaire fonctionnalisé, qui peut être éventuellement modifié après accrochage afin d'exposer une fonction réactive. La déprotection du produit final libère une fonction acide.
Dans une méthode actuellement préférée pour préparer les composés de l'invention (Figure 1), l'acide aminé ω-fonctionnalisé est un acide α-aminé ω-hydroxylé tel que la serine ou l'homoserine, qui est soumis à une séquence de réactions de N-protection (par exemple sous la forme de dérivé t-butoxycarbonyle), formation d'un ester benzylique par O-alkylation du carboxylate et phosphorylation de la fonction OH afin d'introduire un groupe phosphate protégé. Les groupes protecteurs typiques des phosphates peuvent être des groupes phényle, benzyle ou o-xylyle. Le phényle est le groupe actuellement préféré. La fonction aminé est ensuite libérée par élimination du groupe protecteur (par exemple par traitement du dérivé t-butoxycarbonyle avec de l'acide trifluoroacétique), puis acylée avec un dérivé activé d'un acide gras, de préférence un dérivé de l'acide 3-hydroxytétradécanoique tel que l'acide 3- dodecanoyioxytetradécanoique. La forme activée peut être un chlorure d'acyle, un ester activé, un anhydride mixte ou tout autre espèce permettant la formation de la liaison amide. L'ester benzylique est ensuite éliminé par hydrogénolyse sélective pour donner un acide carboxylique portant un groupe acylamido en position α et un groupe (RO)2P(0)0- en position ω.
Le partenaire de la réaction de couplage peptidique est obtenu de préférence à partir d'un α,ω-diaminoacide tel que l'ornithine ou la lysine par une séquence de réactions de protection sélective de la fonction aminé en position ω, par exemple sous la forme de dérivé benzyloxycarbonyle, par l'intermédaire d'un complexe de cuivre selon une méthode décrite dans [Organic Préparations and Procédures International (1992), 23, 191-194], élimination du complexe de cuivre et protection de la fonction aminé en position α, par exemple sous forme de dérivé t-butoxycarbonyle. D'autres groupes protecteurs peuvent être utilisés. La fonction carboxylique libre est réduite en alcool primaire en utilisant par exemple le complexe borane-dimethylsulfure ou par le traitement d'un anhydride mixte préformé par le borohydrure de sodium, selon une méthode décrite dans [Tetrahedron Letters (1991), 32, 923-92]. La fonction aminé en position α est libérée (par exemple par traitement avec l'acide trifluoroacétique), puis N-acylée avec un dérivé activé d'un acide gras, de préférence un dérivé de l'acide 3-hydroxytétradécanoique tel que l'acide 3- benzyloxytétradécanoique. Si nécessaire, la fonction OH libre est protégée à ce stade, par exemple sous forme d'éther de benzyloxyméthyle. La fonction ω-amino est libérée par traitement avec un réactif compatible avec les autres groupes protecteurs présents, par exemple par hydrogénolyse sélective dans un solvant hydroxylique contenant de la triéthylamine si le groupe protecteur est un benzyloxycarbonyle.
Dans la méthode de synthèse actuellement préférée, l'aminé ainsi obtenue est couplée avec l'acide carboxylique α-acylaminé ω-phosphorylé préparé comme décrit plus haut en présence de IIDQ ou d'un autre réactif de couplage peptidique, pour donner un pseudodipeptide phosphorylé protégé. Ce produit est O-acylé sur la fonction hydroxyle restée libre avec un acide ω-fonctionnalisé tel que l'acide 6- hepténoique en présence de EDCI ou d'un autre agent d'esterification. (Figure 4). La fonction alcenyle de cet ester est soumis à une réaction de dihydroxylation en présence de tétroxyde d'osmium en quantité catalytique ou stoechiométrique, puis les groupes protecteurs du phosphate et de la fonction hydroxyle éventuellement présente sous forme d'éther de benzyle, sont éliminés par hydrogénolyse en présence d'un catalyseur approprié. Dans la dernière étape, le diol vicinal est soumis à une oxydation périodique pour exposer une fonction aldéhyde.
Alternativement, le produit de couplage peptidique est O-acylé avec un dérivé d'un acide ω-aminoalkanoique, tel que l'acide 6-benzyloxycarbonylaminohexanoique (Figure 10). Le produit ainsi obtenu est soumis à une réaction de déprotection complète par hydrogénolyse en présence de catalyseurs appropriés ce qui fournit un pseudodipeptide portant un auxiliaire aminoalkanoyle.
Dans une seconde méthode préférée, le partenaire acide de la réaction de couplage peptidique est dérivé de l'acide aspartique ou éventuellement de l'acide glutamique (Figure 2). Le dérivé de l'acide aspartique est obtenu par N-acylation de la fonction amine du β-benzyl ester de cet acide aminé avec un acide gras, préférablement un dérivé d'un acide gras 3-hydroxylé tel que l'acide 3-dodécanoyloxytétradécanoique, en présence d'un agent d'acylation. Ce produit est couplé avec l'amino alcool du type décrit ci-dessus, puis le pseudodipeptide ainsi obtenu est soumis à une réaction d'hydrogénolyse en présence de charbon palladié ou un autre catalyseur pour donner le pseudodipeptide portant une fonction acide carboxylique.
Alternativement, la fonction hydroxyle du pseudodipeptide obtenu dans le paragraphe précédent est acylée avec un acide ω-fonctionnalisé. Préférablement, cet acide est un acide ω-alcénoique ou un acide ω-aminoalkanoique. Avec l'acide hepténoique (Figure 7), le pseudodipeptide conduit au dérivé O-hepténoyle qui est soumis successivement aux réactions de dihydroxylation en présence de tétroxyde d'osmium, puis de déprotection et d'oxydation périodique.
Dans une troisième méthode préférée, l'amino alcool obtenu à partir de; l'ornithine ou de la lysine comme décrit plus haut, est alkyle avec un triflate d'ω-alcényle, préférablement le triflate de hept-6-ényle (Figue 14). Le couplage de cette amino alcool portant une amine secondaire avec l'acide α-acylaminé ω-phosphorylé décrit plus haut en présence de EDCI ou d'un autre agent d'acylation fournit un ester. Le groupe alcenyle est ensuite soumis à une réaction de dihydroxylation en présence de tétroxyde d'osmium, puis les groupes protecteurs sont éliminés par hydrogénolyse en présence de catalyseurs appropriés, et la fonction diol vicinal oxydée par le periodate de sodium pour exposer une fonction aldéhyde réactive.
Dans une quatrième méthode préférée (Figure 16), un dérivé N-protégé de la serine, par exemple le dérivé p-methoxybenzyloxycarbonyle préparé selon une méthode décrite dans [Synthesis (1989), 36-37], est O-alkylé avec le bromoacétate de benzyle. Le groupe protecteur de la fonction amine est éliminé, par exemple par i traitement avec de l'acide trifluoroacétique dans le dichlorométhane, jet la fonction j amine est N-acylée, préférablement avec un dérivé d'un acide gras 3-hydroxylè tel que l'acide 3-dodécanoyloxytétradécanoique, en présence d'un agent d'acylation ou en utilisant le chlorure d'acide ou toute autre forme activée de l'acide gras. Le dérivé
N-acylé O-alkylé de la serine ainsi obtenu est couplé avec l'amino alcool décrit plus haut (Figure 1) en présence d'un agent de couplage peptidique tel que le IIDQ, puis la fonction OH libre est acylée avec un acide alkanoique ω-fonctionnalisé en présence d'un réactif comme un carbodiimide. Préférablement, cet acide fonctionnalisé est un acide ω-alcénoique ou un dérivé d'un acide ω-aminoalkanoique. Par exemple, avec l'acide hept-6-énoique, le pseudodipeptide conduit au dérivé O- (6-hepténoyle) qui est soumis successivement aux réactions de dihydroxylation en présence de tétroxyde d'osmium, puis de dépotection par hydrogénolyse et d'oxydation périodique.
Dans une cinquième méthode actuellement préférée, l'acide aminé de départ est la cystéine ou l'homocystéine (Figure 17). Par exemple, la cystéine est S-alkylée avec le bromoacétate de p-méthoxybenzyle, puis N-acylée, préférablement avec un dérivé d'un acide gras 3-hydroxylé tel que l'acide 3-tetradécanoyloxytétradêcanoique, en présence d'un agent d'acylation ou en utilisant le chlorure d'acide ou toute autre forme activée de l'acide gras. Le dérivé S-alkylé et N-acylé de la cystéine ainsi obtenu est couplé avec le 5-amino-2-[(R)-3-hydroxytétradécanoylamino]pentan-1-ol en présence de IIDQ ou d'un autre agent de couplage peptidique. La fonction libre OH primaire est ensuite O-acylée avec un acide alkanoique ω-fonctionnalisé, utilisé sous la forme d'un ester activé comme un ester O-benzotriazolyle. Préférablement, cet acide est un acide ω-aminoalkanoique tel que l'acide 7-(p- methoxybenzyloxycarbonylamino)heptanoique. Le produit ainsi obtenu est soumis à une réaction de déprotection complète en milieu acide aqueux ce qui fournit un pseudodipeptide portant un auxiliaire 7-aminoheptanoyle. Dans un autre méthode préférée (Figure 18), le dérivé N-p- méthoxybenzyloxycarbonyle de la serine est O-alkylé avec le méthylènemalonate de dibenzyle en milieu alcalin. Le groupe protecteur de l'aminé est éliminé par traitement avec un acide, puis la fonction amine ainsi libérée est N-acylée, préférablement avec un dérivé d'un acide gras 3-hydroxylé tel que l'acide 3- dodécanoyloxytétradécanoique, en présence d'un agent d'acylation ou en utilisant le chlorure d'acide ou toute autre forme activée de l'acide gras. Le dérivé N-acylé O- alkylé de la serine ainsi obtenu est couplé avec l'amino alcool décrit plus haut (Figure 1) en présence de IIDQ ou de tout autre agent de couplage peptidique. Le pseudodipeptide est ensuite O-acylé sur la fonction OH libre avec un acide alkanoique ω-fonctionnalisé. Préférablement, cet acide est un acide ω-alcénoique ou un dérivé d'un acide ω-aminoalkanoique. Par exemple, avec l'acide hept-6-énoique, le pseudodipeptide conduit au dérivé O-(δ-hepténoyle) qui est soumis successivement aux réactions de dihydroxylation en présence de tétroxyde d'osmium, puis de déprotection par hydrogénolyse et d'oxydation périodique, pour conduire au dérivé portant un auxiliaire 6-oxohexanoyle et un groupe malonyle. Dans une méthode alternative également préférée (Figure 19), le dérivé 6- aminohexanoyle décrit plus haut (Figure 10) est N-acylé avec un groupe bromoacetamido en utilisant par exemple l'ester O-succinimidyl de l'acide bromoacétique comme agent d'acylation. Cette réaction fournit un dérivé portant un auxiliaire 6-(bromoacétamido)hexanoyle.
Dans une huitième méthode préférée (Figure 20), l'ester benzylique de l'homoserine O-phosphorylée (voir Figure 1) est N-acylé avec l'acide 3-benzyloxytétradécanoique, préférablement en utilisant l'anhydride mixte préparé à partir de l'acide 3- benzyloxytétradécanoique et du chloroformiate d'isobutyle. L'ester de benzyle est ensuite hydrogénolyse de façon sélective comme décrit plus haut. Le dérivé ω-N- benzyloxycarbonyle du diamino alcool dérivé de l'ornithine (voir Figure 1) est Nα- acylé avec l'acide 3-dodécanoyloxytétradécanoique, en présence d'un agent de couplage ou en utilisant un ester activé ou une autre forme activée de T'acide gras, et la fonction ω-amino est libérée par hydrogénolyse sélective. Cette amin;e est couplée avec le dérivé N-(3-benzyloxytétradécanoyl) O-(diphényl-oxyphosphoryl) de l'homoserine en présence de IIDQ ou d'un autre agent de couplage peptidique. Le pseudodipeptide ainsi obtenu est O-acylé avec un acide alkanoique ω-fonctionnalisé par exemple en présence d'un carbodiimide. Préférablement, cet acide est un acide ω-alcénoique ou un dérivé d'un acide ω-aminoalkanoique. Par exemple, avec l'acide hept-6-énoique, le pseudodipeptide conduit au dérivé 0-(6-hepténoyle) qui est soumis successivement aux réactions de dihydroxylation en présence de tétroxyde d'osmium, puis de déprotection par hydrogénolyse en présence de catalyseurs appropriés et d'oxydation périodique, pour conduire au dérivé portant un auxiliaire 6- oxohexanoyle.
L'invention concerne encore les produits intermédiaires de formule générale V, VI, IX, XIII, sous forme énantiomériquement pure ou sous forme de mélange de stéréoisomères.
L'invention concerne encore les compositions pharmaceutiques renfermant à titré de principe actif au moins un composé de formule générale I, sous forme neutre ou chargée, en association ou en mélange avec un excipient ou un véhicule inerte, non toxique, pharmaceutiquement acceptable.
L'invention concerne plus particulièrement les compositions pharmaceutiques renfermant à titre de principe actif au moins un sel d'un composé de formule générale I, avec une base minérale ou organique thérapeutiquement compatible.
L'invention concerne encore les compositions pharmaceutiques à base d'un composé de formule générale I, sous forme énantiomériquement pure ou sous forme de mélange de stéréoisomères, en association ou en mélange avec up excipient ou un véhicule pharmaceutique.
Parmi les formes pharmaceutiques envisagées on pourra citer celles qui conviennent pour la voie digestive, parentérale, par inhalation, topique, transdermique ou permuqueuse comme par exemple les comprimés, les dragées, les gélules, les solutés ou suspensions injectables, les aérosols, les gels, les emplâtres ou les solutés pénétrants.
De préférence les composés selon l'invention peuvent être greffés sur un antigène pour moduler la réponse immunitaire ou être également greffés sur un pharmacophore pour améliorer son action thérapeutique ou son ciblage et être utilisés par la voie injectable sous forme de conjugués sous forme de solutions ou de suspensions aqueuses, éventuellement neutralisées par une amine ou une hydroxyaikylamine.
Les exemples suivants, présentés dans les Figures 1 à 56, illustrent l'ihvention sans toutefois la limiter.
EXEMPLE 1
PREPARATION DES INTERMEDIAIRES DE SYNTHESE
1.1. 1-(Dîphényloxyphosphoryloxy)-3~[(R)-3-dodécanoyloxytétra- décanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3~benzyloxytétradécanoylamino]~ décan-10-ol (Figure 1).
1.1.1. Acide 4-(diphényloxyphosphoryloxy)-2-[(R)3-dodécanoyloxytétra- décanoylamino] butanoïque
a. N - TerbutvIoxycarbonyl-DL-homosérine A une solution de bromohydrate d'homosérine (2 g ; 16.78 mmol) dans H20 (20 ml) sont additionnés une solution de NaOH 1M (16.78 ml) puis du carbonate de césium (3.01 mg ; 9.23 mmol). Après 5 minutes d'agitation, la solution est refroidie dans un bain d'eau et de glace. Sont alors ajoutés du dioxane (60 ml) et du pyrocarbonate de terbutyle. Le mélange réactionnel est maintenu sous agitation dans un bain d'eau glacée pendant 1 heure puis à température ambiante pendant 5 heures. Le solvant est évaporé sous vide et le résidu sec est employé directement pour l'étape suivante.
b. N - TerbutvIoxycarbonvI-DL-homosérinate de benzyle Au résidu obtenu ci-dessus est ajouté diméthylformamide (20 ml) et on effectue une évaporation à siccité. Sont ensuite ajoutés au mélange réactionnel du diméthylformamide (60 ml) et du bromure de benzyle (4.5 ml ; 20.13 mmol). Il se forme alors un précipité blanc. Le mélange est maintenu sous agitation pendant 16 heures. Le solvant est évaporé sous vide et le résidu est épuisé avec de l'acétate d'éthyle (2x20 ml). La phase organique est lavée avec H20 (20 ml) puis avec une solution saline (20 ml). Après séchage sur MgS04, le solvant est évaporé et le résidu est utilisé tel quel pour l'étape suivante. c. N - Terbutyloxycarbonyl-0-(diphényloxyphosphoryl)-DL-homosérinate de benzyle A une solution du résidu sec de l'étape précédente dans CH2CI2 (60 ml) est ajouté le 4-(N,N-Diméthylamino)pyridine (DMAP) (4.11 g ; 33.56 mmol). Le mélange réactionnel est agité pendant 10 minutes. Sont alors ajoutés la pyridine (12 ml) et le chlorophosphate de diphényle (6.95 ml ; 33.56 mmol). La solution est agitée à température ambiante pendant 18 heures puis lavée avec HCI 1 N (5 X 20 ml), H20 (30 ml) puis avec une solution saline (30 ml). La phase organique est séchéei sur MgS04, le solvant est évaporé sous vide. Une purification par chromatographie Flash sur gel de silice (élution hexane/acétate d'éthyle 4/1) permet de recueillir le produit phosphorylé (7.49 g ; 82.4%) sous forme d'un solide cristallin. PF: 63.5-64.0 °C.
d. 0-(Diphényloxyphosphoryl)-DL-homosérinate de benzyle, sel trifluoroacétique. Une solution du produit phosphorylé de l'étape précédente (7.88 g ; 15.4 mmol) dans l'acide trifluoroacétique (15 ml) est agitée à température ambiante pendant 2.5 heures. Le solvant est évaporé sous vide poussé et une purification par chromatographie Flash sur gel de silice (élution Me0H/CH2CI2 10/1) permet de recueillir le sel trifluoroacétique de l'aminé déprotégée (7.17 g ; 88.9%) sous forme d'un solide cristallin. PF = 73.0-73.5°C.
e. 2-[(R)-3-Dodécanoyloxytétradécanoylamino1-4-(diphényloxyphosphbryloxy)- butanoate de benzyle
Une solution de l'acide (R)-3-dodécanoyloxytétradécanoïque (4.284 g ; 10.07 mmol ; 1éq) obtenu selon la méthode décrite dans [Bull. Chem. Soc. Jpn 60 (1987), 2205- 2214], dans du THF (30 ml) est préparée et est refroidie jusqu'à -15°C . Sont alors ajoutés la N-méthylmorpholine (1.108 ml ; 10.07 mmol ; 1éq) et le chloroformiate d'isobutyle (1.31 ml ; 10.07 mmol ; 1éq). Le mélange réactionnel est agité pendant 30 minutes à -15°C. Est ensuite ajoutée une solution de O-(diphényloxyphosphoryl)- DL-homosérinate de benzyle (5.724 g, 10.07 mmol ; 1éq) dans un mélange THF/Et3N (30 ml/5 ml). Après agitation pendant 18 heures à température ambiante, le solvant est évaporé sous vide. Le résidu est dilué avec H20 (20 ml) et est extrait avec de l'acétate d'éthyle (2 x 30 ml). Les phases organiques sont combinées, lavées successivement avec de l'eau (20 ml) et avec de la saumure! (20 ml), puis séchées sur MgS04 avant d'être évaporées. Une purification par chromatographie Flash sur gel de silice (élution hexane/acétate d'éthyle 2/1) permet de recueillir l'ester benzylique attendu (7.455 g ; 87%) sous forme d'un solide cristallin. PF = 31.0° - 32.1 °C. 1H-RMN (CDCI3, 250 MHz), δ en ppm : 7.4-7,1 (m, 15H) ; 6.90 (2d, 1H, 3J = 7.6 Hz, NH) ; 5.3-5.1 (m, 3H) ; 4.7 (m, 1 H) ; 4.35 (m, 2H) ; 2.45 (m, 2H) ; 2.4-2.1 (m, 4H) ; 1.6 (m, 4H) ; 1.4-1.1 (m, 34H) ; 0.9 (t, 6H). 13C-RMN (CDCI3, 63 MHz), δ en ppm : 173.01 ; 171.08 ; 169.66 ; 150.18 (d, 2JP,C=7.1 Hz) ; 135.01 129.60 ; 128.33 ; 128.14 ; 127.96 ; 125.21 ; 119.80 (d, 3JP)C=5.0 Hz) ; 70.69 ; 67.05 65.19 (d, 2JP,c=5.6 Hz) ; 49.13 ; 40.97 ; 40.77 (2 diast.) ; 34.20 ; 33.98 ; 33.82 31.70 ; 29.42 ; 29.34 ; 29.14 ; 28.94 ; 25.01 ; 24.77 ; 22.47 ; 13.91.
f. Acide 4-(diphényloxyphosphoryloxy)-2-f(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoylamino] butanoïque
Une solution de l'ester benzylique obtenu précédemment (2.23 g ; 2.6 mmol) dans du MeOH qualité HPLC (300 ml), dans un ballon à trois tubulures, est hydrogénée en présence de 10% Pd sur charbon (1 g) à température ambiante et sous pression atmosphérique d'hydrogène pendant 1 heure. Le catalyseur est éliminé par filtration, et le filtrat est évaporé pour fournir un sirop incolore. Celui-ci est homogène en chromatographie sur couche mince et en RMN, et a été utilisé directement sans purification supplémentaire pour l'étape de couplage; Rf = 0.75 (CH2Cl2/MeOH/Et3N 10/1/0.5). 1H-RMN (CDCI3, 250 MHz), δ en ppm : 7.4-7.1 (m, 10H) ; 6.85 (d, 1 H, NH) ; 5.15 (m, 1 H) ; 4.6 (m, 1H) ; 4.35 (m, 2H) ; 2.45 (m, 2H) ; 2.4-2.15 (m, 4H) ; 1.6 (m, 4H) ; 1.4-1.1 (m, 34H) ; 0.9 (t, 6H). 13C-RMN (CDCI3, 63 MHz), δ en ppm 173.35 ; 173.30 (2 diast) ; 172.75 ; 170.37 ; 150.0 (d, 2JP,C=7.5 Hz) ; 129.55 125.28 ; 119.71 (d, 3JP,C=4.4 Hz) ; 70.78 ; 65.65 (d, 2JP,C=5.9 Hz) ; 49.00 ; 40.77 40.63 (2 diast.) ; 34.13 ; 33.86 ; 33.76 ; 31.59 ; 29.31 ; 29.25 ; 29.03 ; 28.82 ; 24.88 24.68 ; 22.36 ; 13.76.
1.1.2. (2R)-5-Amino-2-f(R)-3-benzyloxytétradécanoylamino1-pentanr1-ol
a. Sel de cuiyre de la D-omithine
A une solution de D-ornithine (5,25 g ;30 mmol) dans du NaOH 1 N (30 ml), est ajoutée une solution de sulfate cuivrique pentahydraté (3.814 g ; 15.3 mmol) dans H 0 (50 ml). Après 2 heures d'agitation à température ambiante, le solvant est évaporé à siccité. Du méthanol (60 ml) est alors additionné au résidu pour former un solide de couleur pourpre qui est séparé, puis lavé successivement au dioxane et au méthanol pour être utilisé directement dans l'étape suivante
b. (2R)-2-Amino-5-(benzyloxycarbonylamino)-pentanoate de cuiyre
Le solide pourpre est dissout dans un mélange de NaOH 1 N (40 ml) et de dioxane (70 ml). Le mélange réactionnel est refroidie dans un bain d'eau glacée et on ajoute ensuite le chloroformiate de benzyle (5.14 ml ; 36 mmol). Après 3 heures d'agitation dans un bain d'eau glacée, puis 15 heures à température ambiante, le précipité pourpre est récupéré par filtration puis lavé successivement avec EtOH à 95 %! (40 ml), H20 (50 ml) et EtOH (60 ml). Le précipité est séché à l'étuve (T< 45° C, sous vide); le rendement en deux étapes est de 8.27 g, soit 93 % par rapport à la théorie (Référence : Organic Préparations and procédures international 23 (1992) 191-194).
c. Acide (2R)-5-(benzyloxycarbonylamino)-2-(terbutyloxycarbonylamino)pentanoïque Le sel de cuivre obtenu précédemment est dissout dans une solution de HCI 2N (400 ml), puis est ajouté l'acide éthylènediaminotétraacétique (EDTA) (8.15 g ; 27.8 mmol). Après 2.5 heures d'agitation, le pH est neutralisé à 7 en ajoutant du NaOH 5N (environ 160 ml). Il se forme un précipité blanc. Le mélange est alors agité pendant 2 heures 30 dans un bain d'eau glacée. Le précipité est filtré, lavé à l'eau froide jusqu'à ce que l'effluant soit incolore, puis séché à l'étuve en dessous de 60°. Ce solide est dissout dans du NaOH 1 N (156 ml) et la solution refroidie au bain d'eau glacée. Est ensuite ajouté à cette solution du pyrocarbonate de terbutyle (7.7g ; 35.2 mmol) dans le dioxane (160 ml). Le mélange réactionnel est agité à 0° C pendant 45 minutes puis pendant 16 heures à température ambiante. Le solvant organique est évaporé et le résidu est dissout dans de l'acétate d'éthyle (70 ml). La phase aqueuse est ensuite acidifiée par addition d'HCI 2N jusqu'à pH ~3, lavée avec AcOEt (100 ml). Les phases organiques sont combinées et lavées avec H2O (30 ml) et avec une solution saline (30 ml), puis évaporées sous vide. Une purification par chromatographie Flash sur gel de silice (élution CH CI2/MeOH 20/1) permet de recueillir le produit attendu sous forme d'une huile incolore (Rdt : 8.42g en deux étapes soit 76.7 % de la théorie) (Rf = 0.19 CH2CI2/MeOH 20/1). d. (2R)-5-(Benzyloxycarbonylamino)-2-(terbutyloxycarbonylamino)pentan-1-ol A une solution froide (-15° C) du dérivé de l'acide diamino pentanoïque obtenu ci- dessus, (5.45 g ; 14.8 mmol) dans du THF (60 ml), sont ajoutés la N- méthylmorpholine (1.65 ml ; 14.8 mmol) et le chloroformiate d'isobutyle (9.6ml ;14.8 mmol). Le mélange réactionnel est agité à -15°C pendant 1 minute puis est ajoutée une solution de borohydrure de sodium (5.1 g ; 44.6 mmol) dans 10 m d'eau. Après une agitation à -15° C pendant 10 minutes H2O (400 ml) est additionnés au mélange pour arrêter la réaction. La solution est ensuite lavée avec AcOEt (100 ml X 2). Les phases organiques sont combinées et lavées avec H20 (50 ml), une solution saline (60 ml), puis séchées sur MgS04. Le solvant est évaporé et le résidu est cristallisé dans un mélange AcOEt/hexane pour conduire au produit cristallin attendu (4.94 g ; 94.9 %). PF = 47.5 - 48° C.
e. (2R)-5-(Benzyloxycarbonylamino)-2-amino-pentan-1-ol, sel trifluoroacétique
Une solution du (2R)-5-(benzyloxycarbonylamino)-2-(terbutyloxycarbonylamino)- pentan-1-ol obtenu ci-dessus (6.32 g ; 18 mmol) dans l'acide trifluoroacétique (25 ml) est préparée puis agitée pendant 2.5 heures à température ambiante. Le solvant est ensuite évaporé et une purification par chromatographie Flash sur gel de silice (élution MeOH/CH2CI2 10/1) permet de recueillir le sel trifluoroacétique sous forme d'une huile (5.45 g ; 82.7 %). Le chlorhydrate fond à 133.0 134.3° C (recristallisation du méthanol).
f. (2R)-5-(Benzyloxycarbonylamino)-2-r(R)-3-benzyloxytétradecanoylaminolpentan- oi
A une solution refroidie à -15° C d'acide (R)-3-benzyloxytétradécanoïque (5.27 g ; 15.8 mmol) [Bull. Chem. Soc. Jpn, 60 (1987), 2197-2204] dans le THF (30 ml), sont ajoutés la N-méthylmorpholine (1.89 ml ; 15.8 mmol) et le chloroformiate d'isobutyle (2.21 ml ; 15.8 mmol). Après agitation à -15° C pendant 30 minutes, est additionnée une solution du sel trifluoroacétique obtenu précédemment (15.25 g ; 14.4 mmol) dans un mélange THF/Et3N (30 ml/1.44 ml). L'agitation est poursuivie à température ambiante pendant 16 heures puis le mélange réactionnel est dilué avec H2O (30 ml) et AcOEt (60 ml). La phase organique est séparée et la phase aqueuse lavée avec AcOEt (60 ml). Les phases organiques sont combinées et lavées avec H2O (30 ml) et avec une solution saline (30 ml) puis séchées sur MgS04 avant d'ê re évaporées sous vide Le résidu est recristallisé dans un mélange AcOEt/hexane pour fournir le produit attendu sous forme cristalline (5.8 g ; 71.2 %). PF = 117.5°- 118° C. Rf = 0.32, AcOEt/éther de pétrole 3/1. 1H-RMN (CDCI3, 250 MHz), δ en ppm : 7.4-7.2 (m, 10H) ; 6.5 (d, 1 H, NH) ; 5.1 (s, 2H) ; 4.9 (m, 1H, NH) ; 4.5 (2d, AB, 2H) ; 3.8 (m, 2H) ; 3.5 (m, 2H) ; 3.1 (m, 2H) ; 2.4 (m, 2H) ; 1.6-1.4 (m, 6H) ; 1.4-1.2 (m, 18H) ; 0.9 (t, 3H). 13C-RMN (CDCI3, 63 MHz), δ en ppm : 172.24 ; 156.49 ; 138.06 ; 136.53 ; 128.46 ; 128.04 ; 127.87 ; 76.76 ; 71.39 ; 66.60 ; 65.44 ; 51.54 ; 41.43 ; 40.65 ; 33.76 ; 31.87 ; 29.61 ; 29.30 ; 28.01 ; 26.47 ; 25.05 ; 22.65 ; 14.09.
g. (2R)-5-Amino-2-r(R)-3-benzyloxytétradecanoylamino]pentan-1-ol
Dans un ballon à trois tubulures, le catalyseur (Pd/C 20 %, 150 mg) est ajouté à la solution de (2R)-5-(benzyloxycarbonylamino)-2-[(R)-3-benzyloxy-tétradécanoyl- amino] pentan-1-ol (3.0 g ; 5.27 mmol) dans un mélange EtOH qualité HPLC/Et3N (300 ml/6 ml). On a chassé l'air par mise sous vide puis le ballon la été chargé d'hydrogène. Le mélange réactionnel est ainsi hydrogéné pendant 2 heures à température ambiante. Le catalyseur est éliminé par filtration et le filtrat est concentré pour fournir le produit attendu sous forme d'un solide blanc. Rf = 0.2 ; CH2CI2/MeOH/Et3N 5/1/0.5. PF = 47 - 48°C.
1H-RMN (CDCI3, 250 MHz), δ en ppm: 7.4-7.2 (m, 5H) ; 6.75 (d, 1H, NH) ; 4.5 (2d, AB, 2H) ; 3.9 (m, 2H) ; 3.5 (m, 2H) ; 2.3 - 2.6 (m, 7H) ; 1.7-1.2 (m, 24H) ; 0.9 (t, 3H). 13C-RMN (CDCI3, 63 MHz), δ en ppm: 171.86 ; 138.13 ; 128.37 ; 127.87 ; 127.75 ; 76.81 ; 71.50 ; 64.57 ; 51.38 ; 41.51 ; 41.17 ; 33.89 ; 31.82 ; 29.26 ; 28.57 ; 28.03 ; 25.07 ; 22.60 ; 14.04.
1.1.3. 1-(Diphényloxyphosphoryloxy)-3-f(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoyl- amino]-4-oxo-5-aza-9-f(R)-3-benzyloxytétra-décanoylamino1-décan-10-ol
IIDQ (2-isobutoxy-1-isobutoxycarbonyl-1 ,2-dihydroquinoléine) (364 mg ; 1.2 mmol ; 1.2éq) est additionné à une solution d'acide (2RS)-4-(diphényloxyphosphoryloxy)-2- [(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoylamino]butanoïque (850 mg; 1.0 mmol ; 1 éq) dans du CH2CI2 anhydre (20 ml) à température ambiante et sous argon. Le mélange réactionnel est agité 15 minutes puis une solution de (2R)-5-amino-2-[(R)-3- benzyloxy-tétradécanoylamino]pentan-1-ol (757 mg ; 1.0 mmol, 1éq) dans du CH2CI2 anhydre (10 ml) est additionnée. Après 4 heures d'agitation, la solution est évaporée à sec. Une purification par chromatographie Flash sur gel de silice (élution CH2CI2 Acétone 5/2) permet de recueillir le pseudopeptide phosphorylé (620 mg ; 53%) sous forme d'un solide amorphe (Rf = 0.49, dans CH2Cl2/MeOH/Et3N 10/1/0.5). 1H-RMN (CDCI3, 250 MHz), δ en ppm: 7.40-7.15 (m, 15H), 7.00 (m, 1H), 6.90 et 6.80 (2d, 2 diast, 1 H), 6.65 (d, 1 H) (3 x NH), 5.15 (m, 1 H), 4.50 (m, 3H), 4.30 (m, 2H), 3.85 (m, 2H), 3.45 (m, 2H), 3.15 (m, 2H), 2.41-2.14 (m, 8H), 1.6-1.4 (m, 8H), 1.4-1.1 (m, 54H), 0.9 (t, 9H, 3CH3). 13C-RMN (CDCI3, 63 MHz), δ en ppm : 173.11 , 171.68, 170.52 (2 diast.), 169.94 (2 diast.), 150.0 (d, 2JP,C=7.2 Hz), 138.20 (2diasl), 129.58, 127J.99, 127.49, 127.26, 125.24, 119.73 (t, 3JP)C: 5.0 Hz), 76.48, 71.12, 70.71 , 65.86 (élargi), 64.22, 50.96, 49.71 (élargi), 41.46, 41.05, 39.07, 34.13, 34.00, 32.70, 31.61 , 29.34, 29.06, 28.87, 27.98, 25.25 24.92, 24.72, 22.38, 13.80.
1.2 Acide N-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoylamino]-D~aspartique, a-
N-{(4R)-5-hydroxy-4-[(R)-3-hydroxytétra-decanoylamino] pentyl}amide (≈OM-197-MC) (Figure 2)
1.2.1. Acide N-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoylamino]-D-aspartique, β-benzyl ester
A une solution d'acide (R)-3-dodécanoyloxytétradécanoïque (3.35 g ; 7.85 mmol) dans du THF anhydre (25 ml) à -15°C et sous argon sont ajoutés successivement la Λ/-méthylmorpholine (0.86 ml ; 7.85 mmol ; 1éq) et l'isobutyl chloroformate (1.02 ml ; 7.85 mmol ; 1éq). On observe rapidement un précipité de chlorhydrate de N- méthylmorpholine. Après 30 minutes d'agitation à -15°C, une solution de H-D- Asp(OBn)-OH commercial (Senn Chemicals AG, CH-Dielsdorf) (1.75g ; 7.85 mmol ; 1éq) dans un mélange CH3CN/H20 3.5/1 (85 ml) contenant Et3N (3.7 ml) est alors ajoutée. Le mélange réactionnel est ensuite agité une nuit à température ambiante. Le solvant organique est ensuite évaporé puis la phase aqueuse refroidie à 0°C, acidifiée avec une solution aqueuse d'acide citrique à 10% jusqu'à pH=3 et extraite avec AcOEt (2x). La phase organique est séchée sur MgS04, filtrée et évaporée. Une purification par chromatographie Flash sur gel de silice (élution éther de pétrole/AcOEt 2/1 contenant 2% d'acide acétique) suivi d'une coévaporation au toluène permet de recueillir le β-benzyl ester de l'acide N-[(R)-3- dodécanoyloxytétradécanoylamino]-D-aspartique, (4.00g ; 81 %) sous forme d'un solide cristallin blanc (Rf=0.42 dans éther de pétrole/EtOAc 1/1 contenant 2% d'acide acétique ; révélateurs U.V. et phosphomolybdique). PF= 67-69°C.
1.2.2. Acide N-r(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoylamino]-D-aspartique, α-N- ((4R)-5-hvdroxy-4-r(R)-3-benzyloxytétradecanoylamino1 pentvDamide β- benzyl ester
IIDQ (2-isobutoxy-1-isobutoxycarbonyl-1 ,2-dihydroquinoline) (1.5 g ; 4.99 mmol ; 1.2 éq) est additionné à une solution du β-benzyl ester obtenu ci-dessus (2.63 g ; 4.16 i mmol) dans du CH2CI2 anhydre (200 ml) à température ambiante et sόus argon. Le mélange réactionnel est agité 15 minutes puis une solution de (2R)-5 amino-2-[(R)-
3-benzyloxy-tétradécanoylamino]pentan-1-ol (Figure 1) (2.0 g ; 4.58 mmol ; 1.1 éq) dans du CH2CI2 anhydre (85 ml) est additionnée. Après 3 heures (d'agitation, la solution est évaporée à sec. Une purification par chromatographie Fla[sh sur gel de silice (élution CH2CI2/ Acétone 4/1 puis CH2CI2/ Acétone 2/1) permet de recueillir le produit de couplage (3.75g ; 86%) sous forme d'un solide cristallin blanc (Rf≈0.27 dans CH CI2/ Acétone 5/1 ; révélateurs U.V. et phosphomolybdique). PF = 106- 108°C ; [α]D +5° (c = 1.14 ; CHCI3) ; 13C-RMN (62.89 MHz, CDCI3), δ en ppm 173.66 ; 172.09 ; 171.73 ; 170.33 ; 170.12 ; 138.23 ; 135.28 ; 128.53 ; 128.37 128.13 ; 127.81 ; 127.71 ; 125.81 ; 76.71 ; 71.40 ; 71.16 ; 66.77 ; 65.01 ; 51.36 49.39 ; 41.66 ; 39.25 ; 34.40 ; 33.98 ; 31.85 ; 29.58 ; 29.47 ; 29.29 ; 29.11 ; 28.00 25.57 ; 25.17 ; 25.08 ; 24.94 ; 22.62 ; 14.05.
1.2.3. Acide N-f(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoylamino]-D-aspartique, α-N- l(4R)-5-hvdroxy-4-r(R)-3-hvdroxytétradecanoylamino] pentvDamide (=OM-197-MC)
Une solution du β-benzyl ester de l'acide N-[(R)-3-dodécanoyloxytétra- décanoylamino]-D-aspartique, α-N-{(4R)-5-hydroxy-4-[(R)-3-benzyloxytétradécanoyl- amino] pentyljamide (417 mg ; 0.40 mmol) dans un mélange MeOH/EtOAc 1/1 (36 ml) est hydrogénée en présence de 10% Pd sur charbon (20 mg) à température ambiante et sous pression atmosphérique d'hydrogène pendant 3 heures. Le catalyseur est éliminé par filtration, lavé avec un mélange CH2CI2/MeOH 4/1 (50 ml) et le filtrat évaporé à sec puis séché à la pompe à palettes pour donner l'acide libre (345 mg ; 100%.) sous forme d'un solide cristallin blanc (Rf=0.30 dans CH2CI2/ MeOH 9/1 contenant 0.5% d'acide acétique; révélateur phosphomolybdique). PF = 135- 137°C. ES/MS: m/z 868.7 [M+H]+, 890.7 [M+Na]+, 868.7 [M+K]+, 912.7 [M-H+2Na]+ (Figure 3). EXEMPLE 2
PREPARATION DES PSEUDODIPEPTIDES PORTEURS D'UN BRAS AUXILIAIRE FONCTIONNALISE
2.1. 3-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3- hydroxytétradécanoylamino]-décan-1,10-diol 1-dihydrogéno- phosphate 10-(6-oxohexanoate) (=OM-197-FV7) (Figure 4)
2.1.1. 1-(Diphényloxyphosphoryloxy)-3-f(R)-3-dodécanoyloxytétra- décanoylamino1-4-oxo-5-aza-9-f(R)-3-benzyloxytétradécanoylamino1- décan-10-ol (6-hepténoate)
A une solution de 1-(diphényloxyphosphoryloxy)-3-[(R)-3-dodécanoyloxytétra- décanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-benzyloxytétradécanoylamino] -10-ol (Figure 1) (875 mg ; 0.74 mmol) dans du CH2CI2 anhydre (25 ml), est ajouté l'acide 6- heptenoïque (141 μl ; 1.04 mmol ; 1.4éq). La solution est refroidie à 0°C. Sont ensuite ajoutés le EDCI (64 mg ; 0.33 mmol ; 1.4éq) et la DMAP (41 mg ; 0.33 mmol ; 0.14 éq). Le mélange réactionnel est agité 30 minutes à 0°C, puis 3 heures à température ambiante. Après une dilution au CH2CI2, la phase organique est lavée successivement avec H20, une solution de HCI 1 N et H20. La phase organique est ensuite séchée sur MgS04, puis évaporée à 40°C sous vide. Une purification! par chromatographie Flash sur gel de silice (élution éther de pétrole/AcOEt 1/1) permet de recueillir le 1-(diphényloxyphosphoryloxy)-3-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoyl- amino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-benzyloxytétradécanoylamino]-10-ol 6-hepténoate (820 mg, 85%) sous forme d'une mousse blanche (Rf= 0.18 dans éther de pétrole/AcOEt 1/1 ; révélateur phosphomolybdique). 13C-RMN (62.89 MHz, CDCI3), δ en ppm 173.30 ; 171.18 ; 170.42 ; 169.91 ; 169.73 ; 150.10 ; 138.21 ; 138.14 ; 129.77 128.25 ; 127.49 ; 125.44 ; 119.88 ; 114.56 ; 76.48 ; 71.11 ; 70.90 ; 66.01 ; 65.52 49.90 ; 47.80 ; 41.34 ; 39.07 ; 33.92 ; 33.76 ; 33.69 ; 33.61 ; 33.17 ; 31.75 ; 29.47 29.19 ; 29.00 ; 28.46 ; 28.11 ; 25.34 ; 25.05 ; 24.85 ; 22.52 ; 13.96. 2.1.2. 1-(Diphényloχyphosphoryloxy')-3-r(R)-3-dodécanoyloxytétra- décanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-f(R)-3-benzyloxytétradécanoylaminoM0-ol (6,7-dihvdroxyheptanoate)
A une solution contenant K3Fe(CN)6 (373 mg ; 1.13 mmol ;3 éq), K2C03 (157 mg ; 1.13 mmol ;3 éq), et 1 ,4-diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO) (10.7 mg ; 0.095 mmol ; 0.25éq) dans un mélange t-butanol/eau (5 ml/5 ml) est ajoutée le composé obtenu ci-dessus (486 mg, 0.38 mmol), puis le tétroxyde d'osmium en solution dans le t- butanol à 2.5%) (48 μl ; 4.75 μmol ; 0.0125 éq). Le milieu réactionnel est vigoureusement agité pendant 16 heures à température ambiante (27°C). Du Na2S205 (60 mg) est additionné et l'agitation est poursuivie pendant environ 1 heure jusqu'à ce que le milieu devienne brun puis vert ou bleuâtre. Le mélange réactionnel est dilué à l'éther et la phase organique est séparée. La phase aqueuse est abondamment lavée à l'éther et les phases organiques sont rassemblées, séchées sur MgS04, puis évaporées à 40°C sous vide. Le diol attendu brut est ainsi obtenu sous forme d'une huile verte. Une purification par chromatographie Flash sur gel de silice (élution CH2CI2/Acétone 5/2) permet de recueillir le 1-(diphényl-
I oxyphosphoryloxy)-3-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-
3-benzyloxytétradécanoylamino]-10-ol 6,7- dihydroxyheptanoate pur (1|98 mg ; 40%) i sous forme d'un solide amorphe (Rf= 0.24 dans CH2CI2/Acétone 5/2 ; révélateur phosphomolybdique). 13C-RMN (62.89 MHz, CDCI3), δ en ppm : 173.46 ; 173.33 ;
171.34 ; 170.58 ; 170.02 ; 150.13 ; 138.23 ; 129.80 ; 128.26 ; 127.87 ; 127.54 ;
125.50 ; 120.01 ; 119.80 ; 71.79 ; 71.23 ; 70.97 ; 66.63 ; 66.03 ; 65.54 ; 49.93 ;
47.90 ; 41.46 ; 39.17 ; 33.98 ; 33.79 ; 32.86 ; 32.45 ; 31.77 ; 29.49 ; 29.21 ; 29.03 ; 28.51 ; 25.50 ; 25.07 ; 24.87 ; 24.77 ; 24.66 ; 22.54 ; 13.99. HPLC (210 nm) : TR =
32.535 min. ES/MS: m/z 1343.0 (M+Na+) ; 1321.0 (M+H+) ; 1071.0 (M+H+ monophényl phosphate).
2.1.3. 1-(Diphényloxyphosphoryloxy)-3-[(R)-3-dodécanoyloxytétra- décanoylaminol-4-oxo-5-aza-9-[(R')-3-hvdroxytétradécanoylamino1-10-ol
(6,7-dihvdroxyheptanoate) Une solution du diol obtenu ci-dessus (198 mg ; 0.15 mmol) dans un mélange EtOH qualité HPLC (20 ml) / AcOEt (1.4 ml) est hydrogénée en présence de 10% Pd sur i charbon (70 mg) à température ambiante et sous pression atmosphérique d'hydrogène pendant 2.5 heures. Le catalyseur est éliminé par filtration. Le filtrat est évaporé à sec puis le résidu est séché à la pompe à palettes pour obtenir le produit débenzylé brut (168 mg ; 91%) sous forme d'un solide amorphe. 13C-RMN (62.89 MHz, CDCI3), δ en ppm : 173.15 ; 173.51 ; 172.82 ; 171.04 ; 170.49 ; 170.35 ; 150.05 ; 129.79 ;129.42 ; 125.53 ; 119.91 ; 119.83 ; 119.72 ; 71.80 ; 70.93 ; 68.58 ; 66.47 ; 65.94 ; 65.52 ; 50.02 ; 48.12 ; 42.59 ; 41.26 ; 39.13 ; 36.92 ; 34.29 ; 33.85 ; 32.32 ; 31.74 ; 29.50 ; 29.18 ; 29.00 ; 28.15 ; 25.47 ; 25.07 ; 24.85 ; 24.73 ; 24.56 ; 22.51 ; 13.99. HPLC (210 nm) : TR = 30.7 min. ES/MS: m/z 1253.0 [M+Naf ; 1231.0 [M+H]+.
2.1.4. 3-r(R)-3-Dodécanoyloxytétradécanoylamino1-4-oxo-5-aza-9-f(R)-3- hvdroxytétradécanoylamino]-décan-1 ,10-diol-1-dihvdroqénophosphate 10-
(6.7-dihvdroxyheptanoate) (=OM-197-FV6)
A une suspension d'oxyde de platine Pt02 (91 mg) dans l'éthanol (qualité HPLC) (1 ml) (préalablement activé en noir de platine sous atmosphère d'hydrogène pendant 10 minutes) est additionnée une solution du triol obtenu ci-dessus (168 mg ; 0,14 mmol) dans un mélange EtOH qualité HPLC (8 ml) / AcOEt (8 ml). La solution est hydrogénée à température ambiante (27°C), sous pression atmosphérique d'hydrogène pendant 24 heures. Le catalyseur est éliminé par filtration. Le filtrat est évaporé à sec puis le résidu est séché à la pompe à palettes pour obtenir le phosphate brut (130 mg, 88%). HPLC (210 nm): TR = 23.6 min. ES/MS: m/z 1078.9 [M+H]+, 1100.8 [M+Na]+ ,1116.8 [M+K]+ (Figure 5).
2.1.5. 3-[(R)-3-Dodécanoyloxytétradécanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-f R)-3- hvdroxytétradécanoylamino]-décan-1 ,10-diol 1-dihvdroqénophosphate 10- (6-oxohexanoate) (=OM-197-FV7)
Une réaction d'oxydation périodique est réalisée avec en ajoutant 1.86 ml Nal04 0.1 M (39.62 mg , 20 éq.) à 10 mg (9.28 μmol, 1 éq.) du triol déprotégé préparé ci- dessus dans un mélange isopropanol-eau (1 :1). La réaction est suivie par LC/UV et montre une conversion quantitative de la fonction diol en aldéhyde, après deux heures. L'ion moléculaire m/z 1046.8 observé sur le spectre ES/MS après l'étape d'oxydation périodique (Figure 6) atteste de la réaction attendue. Sur ce spectre, des adducts de sodium à m/z 1068.8 ([M+Na]+) et de potassium à m/z 1084.8 ([M+K]+) sont visibles, ainsi qu'un fragment correspondant à la perte du groupe phosphorylé à m/z 948.8. La réaction est stoppée par l'adjonction de 1-2 gouttes d'éthylène glycol.
2.2. Acide N-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoylamino]-D~aspartιque, a-N-{(4R)-5-hydroxy-4-[(R)-3-hydroxytétra-decanoylamino] pentyl}amide 5-0-(6-oxohexanoate) (=OM-197-MC-FV6) (Figure 7)
2.2.1. Acide N-r(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoylamino]-D-aspartique, α-N- {(4R)-5-hvdroxy-4-f(R)-3-benzyloxytétradécanoylamino]pentyl}amide-β- benzyl ester. 5-Q-(6-heptènoate)
A une solution de l'acide N-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoylamino]-D-aspartique, α-N-{(4R)-5-hydroxy-4-[(R)-3-benzyloxytétradécanoylamino]pentyl}amide β-benzyl ester (Figure 2) (122 mg ; 0.116 mmol) dans du dichlorométhane anhyjdre (5ml), est ajouté l'acide 6-heptènoïque (22 μl ; 0.160 mmol ; 1.4 éq). La solution est refroidie à 0°C. Sont ensuite ajoutés le EDCI (49.3 mg ; 0.25 mmol ; 2.1 éq) et la DMAP (5.6 mg ; 0.046 mmol ; 0.4 éq). Le mélange réactionnel est agité 30 minutes à 0°C, puis 6 heures à température ambiante. Après une dilution au CH2CI2, la phase organique est lavée successivement avec H20, HCI 1N (2x), NaHC03 (2x) et H20 (2x). L'ester heptenoïque attendu est ainsi obtenu pur (119 mg ; 89%) sous forme d'un solide blanc (Rf = 0.62 dans CH2CI2/Acétone 5/1 ; révélateur phosphomolybdique). 13C- RMN (62.89 MHz, CDCI3), δ en ppm : 173.63 ; 173.38 ; 171.72 ; 171.11 ; 170.08 138.14 ; 135.28 ; 128.46 ; 128.34 ; 128.24 ; 128.05 ; 127.64 ; 127.53 ; 114.62 76.49 ; 71.14 ; 71.02 ; 66.66 ; 65.49 ; 49.17 ; 47.79 ; 41.69 ; 41.35 ; 39.09 ; 35.46 34.33 ; 33.80 ; 33.65 ; 33.21 ; 31.79 ; 29.52 ; 29.23 ; 29.06 ; 28.46 ; 28.16 ; 22.56 14.00. HPLC (210 nm): TR = 36.9 min. ES/MS: m/z 1159.0 [M+H]+ ; 1176.0 [M+NH4]+. PF = 81.5 - 84°C. [α]D 20 = +7.3 ( CHCI3).
2.2.2. Acide N-f(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoylamino1-D-aspartique, α-N- {(4R)-5-hvdroxy-4-r(R)-3-benzyloxytétradécanoylamino]pentyl>amide β- benzyl ester, 5-0-(6,7-dihvdroxyheptanoate)
A une solution de l'ester heptenoïque obtenu ci-dessus (60 mg ; 0.052 mmol) dans un mélange H20/Acétone (5/3 ml) sont ajoutés l'oxide de N-méthylmorpholine (9 mg ; 0.076 mmol ; 1.5 éq), puis la solution d'Os04 dans le t-butanol à 2.5% (123 μl ; 0.012 mmol ; 0.23 éq) goutte à goutte. Le mélange réactionnel est agité pendant 24 heures à température ambiante. Du Na2S20s (20 mg) est ajouté à la réaction qui est alors agitée pendant 1 h à 2h à température ambiante. La solution est alors extraite à l'éther plusieurs fois, puis les phases organiques sont rassemblées, séchées sur MgS04 et concentrées. Une purification par chromatographie Flash sur gel de silice (élution CH2CI2/Acétone 5/2) permet de recueillir le diol attendu pur (35 mg ; 57%) sous forme d'un solide blanc (Rf= 0.15 dans CH2CI2/Acétone 5/1 ; révélateur phosphomolybdique). 13C-RMN (62.89 MHz, CDCI3), δ en ppm : 173 .67 ; 173.39
171.81 ; 171.34 ; 170.27 ; 170.01 ; 138.18 ; 135.27 ; 128.56 ; 128 42 ; 128.18 127.50 ; 127.68 ; 76.68 ; 71.82 ; 71.37 ; 71.17 ; 66.85 ; 66.74 ; 65.66 ; 49.27 ; 47.99 41.88 ; 41.51 ; 39.31 ; 35.60 ; 34.42 ; 33.95 ; 33.51 ; 31.80 ; 29.60 ; 29.49 ; 29.30 28.55 ; 25.65 ; 25.60 ; 25.19 ; 25.12 ; 24.97 ; 24.77 ; 24.14 ; 22.65 ; 14.08. HPLC (210 nm) : TR = 34.16 min. ES/MS: m/z 1193.0 [M+H+] ; 1212.0 [M+NH4f.
2.2.3. Acide N-r(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoylamino]-D-aspartique, α-N- {(4R)-5-hvdroxy-4-f(R)-3-hvdroxytétradécanoylamino]pentyl>amide- β- benzyl ester. 5-Q-(6. 7-dihvdroxyheptanoate) f=OM-197-MC-FV5)
Une solution du diol obtenu ci-dessus (35 mg ; 0,029 mmol) dans un mélange MeOH qualité HPLC (2 ml) / AcOEt (2 ml) est hydrogénée en présence de 10% Pd sur charbon (10 mg) à température ambiante et sous pression atmosphérique d'hydrogène pendant 2,5 heures. Le catalyseur est éliminé par filtration. Le filtrat est évaporé à sec puis le résidu est séché à la pompe à palettes pour obtenir l'acide N- [(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoylamino]-D-aspartique, α-N-{(4R)-5-hydroxy-4-[(R)- 3-hydroxytétradécanoylamino]pentyl}amide 5-0-(6,7-dihydroxyheptanoate) brut (26 mg ; 88%) sous forme d'un solide blanc. HPLC (210 nm) : TR = 26.90 minPF = 94- 97°C. [α]D 20 = +11.1 (CHCI3/MeOH = 1 :0.1). ES/MS: m/z 1012.7 [M+H]+ ; 1034.7 [M+Na]+, 1050.7 [M+K]+ (Figure 8).
2.2.4. Acide N-r(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoylamino]-D-aspartique, α-N- {(4R)-5-hydroxy-4-r(R)-3-hydroxytétradecanoylamino1 pentyl}amide 5-0- f 6-oxohexanoate) (=OM-197-MC-FV6)
1.98 ml Nal04 0.1 M (42.25 mg , 20 éq.) sont ajoutés à 10 mg (9.88 μ ol, 1 éq.) du triol déprotégé préparé ci-dessus dans un mélange isopropanol-eau (1 :1). La solution est agitée pendant deux heures à température ambiante. La réaction est stoppée par l'adjonction de 1-2 gouttes d'éthylène glycol. Après cette étape d'oxydation périodique, un ion moléculaire [M+H]+ à m/z 980.6 est observé sur le spectre ES/MS (Figure 9), attestant de la présence d'une fonction aldéhyde. Les pics correspondants aux adducts de sodium à m/z 1002.8 ([M+Na]+) et de potassium à m/z 1018.6 ([M+K]+) sont également visibles.
2.3. 3-[(R)-3-Dodécanoyloxytétradécanoylamino]'4-oxo-5-aza-9-[(R)-3- hydroxytétra-décanoylamino]-décan-1, 10-diol 1-dihydrogéno- phosphate (6-aminohexanoate) (=OM-287-AC5) (Figure 10)
2.3.1. 1-(Diphényloxyphosphoryloxy)-3-f(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoyl- amino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-benzyloxytétradécanoylamino]-décan-10-ol (6-benzyloxycarbonylaminohexanoate)
A une solution de 1-(diphényloxyphosphoryloxy)-3-[(R)-3~dodécanoyloxytétra- décanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-benzyloxytétradécanoylamino]-10-décan-10-ol (Figure 1) (230 mg ; 0.20 mmol) dans le CH2CI2 anhydre (8 ml), est ajouté l'acide 6- benzyloxycarbonylaminohexanoïque (88 mg ; 0.33 mmol ; 1.65éq). La solution est refroidie à 0°C. Sont ensuite ajoutés le EDCI (200 mg, 1.04 mmol, 5.2 éq) et la DMAP (13 mg ; 0.10 mmol ; 0.5 éq). Le mélange réactionnel est agité 30 minutes à 0°C, puis 4 heures à température ambiante. Après une dilution au CH2CI2, la phase organique est séparée et lavée successivement avec H20, HCI 1 N, H20. La phase organique est ensuite séchée sur MgS04, puis évaporée à 40°C sous vide. Une purification par chromatographie Flash sur gel de silice (élution CH2CI2/Acétone 7/1.2 permet de recueillir l'ester pur (115 mg ; 41%) sous forme d'un solide smorphe (Rf = 0.77 dans CH2CI2/Acétone 5/2 ; révélateur phosphomolybdique). 13C-RMN (62.89 MHz, CDCI3), δ en ppm : 173.27 ; 171.20 ; 170.34 ; 169.88 ; 156 36 ; 150.16 150.13 ; 138.28 ; 136.56 ; 129.80 ; 128.35 ; 128.26 ; 127.90 ; 127.51 ; 125.45 119.97 ; 119.83 ; 71.05 ; 66.37 ; 65.97 ; 65.61 ; 49.94 ; 47.81 ; 41.39 ; 40.66 ; 39.09 34.32 ; 34.25 ; 33.95 ; 33.65 ; 31.78 ; 29.50 ; 29.38 ; 29.22 ; 29.03 ; 28.55 ; 28.44 25.95 ; 25.06 ; 24.87 ; 24.26 ; 22.55 ; 14.00. HPLC (210 nm) : TR = 33.497 min. ES/MS : m/z 1424.0 [M+H]+ ; 1174.0 [M+H-(PhO)2OPOH]+.
2.3.2. 1-(Diphényloxyphosphoryloxy)-3-f(R)-3-dodécanoyloxytétra- décanoylamino1-4-oxo-5-aza-9-f(R)-3-hvdroxytétradécanoylamino]-décan- 10-ol 10-(6-aminohexanoate)
Une solution du produit obtenu ci-dessus (115 mg ; 81 μmol) dans un mélange EtOH qualité HPLC (15 ml)/acide acétique glacial (0,4 ml) est hydrogénée en présence de palladium (10% sur charbon) (80 mg) à température ambiante et sous pression atmosphérique d'hydrogène pendant 4 heures. Le catalyseur est éliminé par filtration. Le filtrat est évaporé à sec puis le résidu est séché à la pompe à palettes pour obtenir le produit débenzylé (90 mg ; 97%) sous forme d'un solide amorphe. HPLC (210 nm) : TR = 29.185 min. ES/MS : m/z 1200.0 [M+H]+ ; 952.0 [M+H- (PhO)2OPOH]+. 2.3.3. 3-f(R)-3-Dodécanoyloxytétradécanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-f(R)-3- hvdroxytétradécanoylamino'1-1 , 10-diol-1 -dihvdrogénophosphate 10-(6- aminohexanoate =OM-287-AC5)
A une solution d'oxyde de platine Pt02 (30 mg) dans l'éthanol (qualité HPLC) (1 ml) (préalablement activé en noir de platine sous atmosphère d'hydrogène pendant 10 minutes) est additionnée une solution de Pamino-alcool obtenu ci-dessus (90 mg, 75 μmol) dans un mélange mélange EtOH qualité HPLC (5 ml)/HCI 1N (0.1 ml). La solution est hydrogénée à température ambiante, sous pression atmosphérique d'hydrogène pendant 24 heures. Le catalyseur est éliminé par filtration. Le filtrat est évaporé à sec puis le résidu est séché à la pompe à palettes pour obtenir l'amino phosphate attendu (60 mg ; 79%). HPLC (210 nm): TR = 28.51 min. ES/MS: m/z 1047.5 [M+H]+; 1069.6 (M+Na+), 949.6 [M+H-(HO)2OPOH] + (Figure 11 ).
2.4. 3-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3- hydroxytétradécanoylamino]-décan-1, 10-diol 1-dihydrogeno- phosphate 10-(6-hydroxyhexanoate) (-OM-197-FV8) (Figure 12)
2.4.1. (2R)-5-(Amino')-2-r(R)-3-benzyloxytétradecanoylamino1-pentan-1-ol benzyloxymethyl ether
A une solution de (2R)-5-(benzyloxycarbonylamino)-2-[(R)-3-benzyloxy- tétradécanoylamino]pentan-1-ol (Figure 1)) (2.05 g ; 3.60 mmol) dans du CH2CI2 anhydre (40 ml) à température ambiante et sous argon sont ajoutés successivement BOMCI (benzyl chlorométhyl éther) (qualité technique 60%, 1.25 ml ; 5.41 mmol ; 1.5éq) et la diisopropyléthylamine (942 μl ; 5.41 mmol ; 1.5 éq). Le mélange réactionnel est ensuite agité une nuit à température ambiante puis évaporé à sec. Une purification par chromatographie Flash sur gel de silice (élution éther de pétrole/ EtOAc 2/1) permet de recueillir le dérivé O-benzyloxyméthyl (2.28 g ; 92%) sous forme d'un solide cristallin blanc. (Rf=0.70 dans éther de pétrole/EtOAc 1/3; révélateur U.V. et phosphomolybdique). PF= 97-100°C. Une solution de ce produit (2.00 g ; 2.90 mmol) dans EtOH de qualité HPLC (220 ml) contenant Et3N (4 ml) est hydrogénée en présence de 20% Pd(OH)2 sur charbon (200 mg) à température ambiante et sous pression atmosphérique d'hydrogène pendant 3 heures. Le catalyseur est éliminé par filtration. Le filtrat est évaporé à sec puis le résidu est séché à la pompe à palettes pour obtenir l'aminé libre (1.58 g ; 98%) sous forme d'un solide amorphe. [α]D -1° (C=1.20 ; CHCI3) ; 1H-RMN (250 MHz, CDCI3), δ en ppm : 7.45-7.21 (m, 10H, Ar), 6.52 (d, 1H, NH), 4.80-4.45 (m, 6H, 2 x CH∑-ph, O- CH2-O), 4.10 (m, 1H, H-3'), 3.83 (m, 1 H, H-2), 3.62 (dd, 1H, H-1), 3.47 (dd, 1H, H-1), 2.65 (t, 2H, 2 x H-5), 2.40 (m, 2H, 2 x H-2'), 1.80-1.40 (m, 8H, 2 x H-4, 2 x H-3, 2 x H-4', NH2), 1.40-1.20 (m, 18H, 9 x CH2), 0.88 (t, 3H, CH3) ; 13C-RMN (62.89 MHz, CDCI3), δ en ppm : 170.78 ; 138.24 ; 137.63 ; 128.38 ; 128.32 ; 127.66 ; 127.62 ; 94.82 ; 76.70 ; 71.26 ; 69.63 ; 69.44 ; 48.48 ; 41.82 ; 41.47 ; 33.83 ; 31.84 ; 29.88 ; 29.58 ; 29.56 ; 29.51 ; 29.27 ; 29.04 ; 25.11 ; 22.62 ; 14.06.
2.4.2. Acide N-f(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoylamino1-L-aspartiαue, α-N- •{"(4R)- 5-(benzyloxymethoxy)-4-r(R)-3-benzyloχytétradecanoylaminol- pentvDamide β-benzyl ester
L'aminé préparée comme décrit ci-dessus est couplée avec le β-benzyl ester de l'acide N-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoylamino]-L-aspartique (préparé à partir du β-benzyl ester de l'acide L-aspartique, voir section 1.2.1) en présence de IIDQ dans les mêmes conditions que celles décrites dans la section 1.2.2. La purification du produit sur gel de silice (éther de pétrole/EtOAc 2:1 puis 1 :1) permet de recueillir l'amide correspondante avec un rendement de 65%. ES/SM: m/z 1169.7 ([M+H]+).
2.4.3 (3S. 9R)-3-r(R)-3-Dodécanoyloxytétradécanoylamino1-4-oxo-5-aza-9-r(R)-
3-benzyloxytétradécanoylamino]-décane-1.10-diol 1 -dibenzylphosphate
Une solution du produit de couplage obtenu ci-dessus (1.05 g ; 0.90 mmol) dans un mélange EtOH/EtOAc 1/1 (65 ml) contenant Et3N (1.5 ml) est hydrogénée en présence de 10% Pd sur charbon (50 mg) à température ambiante et sous pression atmosphérique d'hydrogène pendant 1 heure. Le catalyseur est éliminé par filtration et le filtrat évaporé à sec puis séché à la pompe à palettes. Le résidu est ensuite mis en solution dans un mélange /-PrOH/CH2CI2 1/1 (50 ml) et agité pendant 10 minutes à température ambiante avec une résine Amberlite IR-120 (H+) (3 ml). La résine est éliminée par filtration et le filtrat évaporé à sec pour donner l'acide libre (956 mg ; 99%,) sous forme d'un solide cristallin blanc.
A une solution de l'acide obtenu ci-dessus (855 mg ; 0.79 mmol) dans du THF anhydre (5 ml) à 0°C et sous argon sont additionnés la Λ/-méthylmorpholine (87 μl ; 0.79 mmol ; 1 éq) puis l'isobutyl chloroformate (103 μl ; 0.79 mmo ; 1 éq). On observe rapidement un précipité de chlorhydrate de /V-méthylmorpho ne. Après 30 minutes d'agitation à température ambiante, le mélange réactionnel est porté à 0°C puis une solution de NaBH4 (60 mg ; 1.58 mmol ; 2 éq) dans H2O (2 ml) est rapidement additionnée. Dès la fin du dégagement gazeux (5 minutes), la solution est diluée avec H20 (2 ml) et THF (2 ml) puis agitée 5 minutes à température ambiante. La solution est concentrée, diluée avec du CH2CI2 et H20, neutralisée avec une solution de HCI 1 M puis les phases séparées. La phase organique est séchée sur MgS04, filtrée et évaporée. Une purification par chromatographie Flash sur gel de silice (élution CH2CI2/ Acétone 4/1) permet de recueillir le produit de réduction (387 mg ; 46%) sous forme d'un solide cristallin blanc. A une solution de cet alcool (313 mg ; 0.29 mmol) et de 1H-tétrazole (62 mg ; 0.88 mmol ; 3 éq) dans du THF anhydre (12 ml) à température ambiante et sous argon est additionné le dibenzyl-diéthyl phosphoramidite à 85% (267 μl ; 0.67 mmol ;* 2.3 éq). On observe rapidement la formation de cristaux blancs dans le milieu réactionnel. Après 30 minutes d'agitation, le mélange réactionnel est porté à -20°C puis une solution de mCPBA (57-86%, ; 187 mg ; 1 ,08 mmol ; 3.7 éq) dans du CH2CI2 (8 ml) est additionnée. On observe la disparition des cristaux. Après 45 minutes d'agitation à température ambiante, une solution de Na2S203 saturée (5 ml) est ajoutée puis le mélange réactionnel est agité 10 minutes. La solution est ensuite diluée à l'éther, puis la phase organique est séparée et lavée avec une solution de Na2S203 saturée (5x), une solution de NaHC0 saturée (2x) et une solution de HCI 1M (1x). La phase organique est séchée sur MgS04, filtrée et évaporée. Une purification par chromatographie Flash sur gel de silice (élution CH2CI2/ acétone 8/1 puis 5/1) permet de recueillir le phosphotriester (361 mg ; 93%) sous forme d'un solide amorphe. Ce produit est soumis à une réaction d'hydrolyse de l'acétal benzyloxyméthyl en milieu THF-HCI aqueux ce qui fournit le (3S, 9R)-3-[(R)-3-dodécanoyl- oxytétradécanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-benzyloxytétradécanoylamino]-décane- 1 ,10-diol 1-dibenzylphosphate.
2.4.4 (3S,9R)-f(R)-3-Dodécanoyloxytétradécanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3- hydroxytétradécanoylaminol-décan-1 , 10-diol 1-dihydrogénophosphate 10- (6,7-dihvdroxyheptanoate)
Le produit obtenu ci-dessus est O-acylé en position 10 avec de l'acide hept-6- énoique en présence de EDCI dans le dichlorométhane à 0°C en présence de DMAP (voir section 2.2.1). Cet ester hepténoique est ensuit soumis à une réaction d'hydroxylation en présence de tétroxyde d'osmium (catalytique) et d'oxyde de N- méthylmorpholine (voir section 2.2.2), ce qui fournit le diol correspondant (ester 6,7- dihydroxyheptanoique). Ce produit est déprotégé par hydrogénolyse dans l'éthanol sous pression atmosphérique d'hydrogène en présence de charbon palladié (voir section 2.2.3).
2.4.5. (3S.9R)-3-r(R)-3-Dodécanoyloxytétradécanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-f(R)- 3-hvdroxytétradécanoylamino]-décan-1.10-diol 1 -dihydrogénophosphate
10-(6-oxohexanoate)
Le diol déprotégé obtenu ci-dessus est soumis à une réaction d'oxydation périodique dans un mélange isopropanol-eau (voir section 2.2.4).
2.4.6 (3S.9R)-3-r(R)-3-Dodécanoyloxytétradécanoylamino1-4-oxo-5-aza-9-f(R)-
3-hvdroxytétradécanoylamino]-décan-1 , 10-diol 1 -dihydrogénophosphate
10-(6-hvdroxyhexanoate) (=OM-197-FV8)
Le dérivé 6-oxohexanoique obtenu ci-dessus est soumis à un bref traitement avec NaBH4 dans un mélange isopropanol-eau à 0°C, pour donner le dérivé 6- hydroxyhexanoique. ES/MS: m/z 1048.5 [M+H]+; 950.5 [M+H-(HO)2OPOH]+ (Figure 13). 2.5. 2-[(R)-3-Dodécanoyloxytétradécanoylamino]-4-(diphényloxy- phosphoryloxy)butanoate de {2-[(R)-3-benzyioxytétradécanoyi- amino]-5-(6-oxohexyl)amino}pentyle (=OM-144-FP9) (Figure 14)
2.5.1. Trifluorométhanesulfonate de hept-6-ényle
L'anhydride triflique Tf20 ((CF3 S02)20, 11 ml ; 6.76 mmol) est ajouté goutte à goutte à -15°C à une solution de hept-6-èn-1-ol (515 mg ; 4.51 mmol) et de Et3N (627 μl ; 4.51 mmol) dans le CH2CI2 (10 ml) et le mélange est agité 30-45 minutes à -15°C jusqu'à disparition de l'alcool. Après retour à température ambiante,] le milieu est dilué au CH2CI2 et lavé successivement avec H20, avec une solution aqueuse saturée de NaHC03, une solution aqueuse saturée de NaCI. La phase organique ainsi obtenue est séchée sur MgS04 et concentrée sous vide pour conduire à un résidu qui est repris dans un mélange ethyl acetate/ether de pétrole (1/2) et filtré sur gel de silice (élimination des sels de triéthylamine formés lors de la réaction). Après evaporation du filtrat, le triflate attendu est obtenu avec un rendement de 87% (956 mg) et est utilisé dans l'étape suivante sans autre purification. Rf: 0.8 dans acétate d'éthyle/éther de pétrole, 1/2. 1H-RMN (CDCI3, 250 MHz); δ en ppm: 5.7 ; 5.0 ; 4.45 ; 2.0 ; 1.8 ; 1.4. 13C-RMN (CDCI3, 62.89 MHz); δ en ppm : 138.21 ; 114.95 ; 77.68 ; 33.40 ; 29.13 ; 28.10 ; 24.53.
2.5.2. 2(2R)-2-r(R)-3-benzyloxytétradécanoylamino1-5-(hept-6-énvhamino- pentan-1-ol
Une solution du triflate fraîchement préparé ci-dessus (956 mg, 3.88 mmol), dans du CH2CI2 (10 ml) est additionnée goutte à goutte à une solution de (2R)-5-amino-2- [(R)-3-benzyloxytétradécanoylamino]pentan-1-ol (Figure 1) (1.69 g ; 3.88 mmol) dans du CH2CI2 (10 ml) et le mélange est agité 4 heures à température ambiante sous argon. Après dilution au CH2CI2, le milieu réactionnel est lavé avec une solution aqueuse saturée en NaHC03 puis avec H2O. La phase organique ainsi obtenue est séchée sur MgS04 et concentrée sous vide. Une purification par chromatographie Flash sur gel de silice (élution avec CH2CI2/MeOH 15/1) permet de recueillir l'aminé secondaire attendue (862 mg ; 43%). Rf : 0,3 (CH2CI2/MeOH 8/1). ES/MS : m/z 532.0 [M+H]+. RMN 1H (CDCI3, 250 MHz); δ en ppm : 7.2-7.4 ; 7.1 ; 5.8 ; 5.0 ; 4.6 ; 3.95 ; 3.5 ; 2.9 ; 2.5 ; 2.1 ; 1.9-1.5 ; 1.5-1.2 ; 0.9. RMN 3C (CDCI3, 62.89 MHz); δ en ppm : 172.17 ; 138.28 ; 138.21 ; 128.39 ; 127.96 ; 127.71 ; 114.82 ; 76.80 ; 71.40 ; 63.81 ; 50.87 ; 48.30 ; 47.75 ; 41.57 ; 34.10 ; 33.39 ; 31.89 ; 29.66 ; 29.62 ; 29.33 ; 28.19 ; 28.03 ; 25.21 ; 26.11 ; 25.78 ; 22.82 ; 22.66 ; 14.10. RMN 1H (CDCI3, 250 MHz); δ en ppm : 7.2-7.4 ; 6.75 ; 5.8 ; 5.0 ; 4.5 ; 3.9 ; 3.5 ; 2.5 ; 2.0 ; j2.1 ; 1.7-1.2 0.9. RMN 13C (CDCI3, 62.89 MHz); δ en ppm : 171.77 ; 138.68 ; 138.14 ; 128.23 127.72 ; 127.56 ; 114.22 ; 76.64 ; 71.37 ; 64.58 ; 51.45 ; 49.79 ; 49.37 ; 41.53 33.90 ; 33.53 ; 31.77 ; 29.65 ; 29.20 ; 28.64 ; 28.57 ; 25.00 ; 26.68 ; 25.93 ; 22.53 13.98 (spectres du sel d'ammonium et de la base libre, respectivement).
2.5.3. 2-r(R)-3-Dodécanoyloxytétradécanoylamino]-4-(diphényloxyphosphoryl- oxy)butanoate de {2-f(R)-3-benzyloxytétradécanoylamino1-5-(hept-6-ényl) amino}pentyle
A une solution de l'aminé secondaire obtenue ci-dessus (163 mg ; 0.307 mmol ; 1éq) et d'acide 4-(diphényloxyphosphoryloxy)-2-[(R)3-dodécanoyloxytétradécanoyl- amino]butanoïque (Figure 1) (278 mg ; 0.368 mmol ; 1.2 éq) dans du CH2CI2 (25 ml) est ajouté la N,N~diisopropyléthylamine (DIEA) (54 μl; 1 éq). Le milieu! est refroidi à 0°C et on ajoute ensuite de l'EDCI (71 mg ; 1.2 éq) et du 1-hydroxy-7- azabenzotriazole (HOAt) (41 mg ; 1 éq). Le mélange réactionnel est agité 2 heures à 0°C puis 90 heures à température ambiante. La solution est alors lavée avec H20 et la phase organique est séchée sur MgS04 puis évaporée sous vide à 40°C. Une purification par chromatographie Flash sur gel de silice (élution CH2CI2/Me0H 15/1) permet de recueillir le produit de O-acylation (126 mg ; 32%). 2.5.4. 2-[(R)-3-Dodécanoyloxytétradécanoylamino]-4-(diphényloxyphosphoryl- i oxy)butanoate de {2-[(R)-3-benzyloxytétradécanoylamino]-5-(6.7- dihvdroxyheptvDaminotoentyle
Une solution fraîchement préparée d'Os04 à 2.5%, dans la pyridine (1.1 ml ; 1.9 éq) est ajoutée goutte à goutte à 25°C à une solution du produit de O-acylation obtenu ci-dessus (70 mg ; 0.055 mmol) dans de la pyridine anhydre (5 ml). Le mélange est agité de 24 à 48 heures à température ambiante puis est traité par addition de Na2S2θ5 et enfin dilué au CH2CI2, lavé successivement avec H20, avec une solution aqueuse HCI 1 N et à nouveau avec H20. La phase organique résultante est séchée sur MgS04, filtrée, évaporée et le résidu obtenu est soumis à une purification par chromatographie Flash sur gel de silice (élution CH2CI2/MeOH 15/1 à 10/1) qui permet de recueillir le diol attendu (27 mg ; 38%). HPLC (210 nm) : TR = 37.25 min. ES/MS : m/z 1307.0 [M+H]+.
2.5.5. 2-[(R)-3-Dodécanoyloxytétradécanoylamino]-4-(dihvdroxy- phosphoryloxy)butanoate de {2-[(R)-3-hvdroxytétradécanoylamino]-5-(6,7- dihvdroxyheptvDaminotoentvIe (=OM-144-FP8)
a. Débenzylation
A une solution du diol obtenu ci-dessus (50 mg, 0.038 mmol) dans un mélange MeOH qualité HPLC/AcOH (5/0.2 ml) est ajouté le catayseur (Pd/C 10%) (10 mg). Le mélange réactionnel est agité 4 heures sous H2 (pression atmosphérique) à température ambiante. Le catalyseur est éliminé par filtration sur filtre millipores et le filtrat évaporé pour conduire, sans autre purification, au produit débenzyle (46 mg ; 99%). HPLC (210 nm) : TR = 35.13 et 35.51 min (observation des deux diastéréoisomères). ES/MS : m/z 1217.0 [M+H]+.
b. Déphénylation : Le catalyseur (Pt02) (25 mg ; 3.8 eq) en suspension dans EtOH qualité HPLC (0.5 ml) est préactivé sous H2 pendant 10 minutes. Une solution, préalablement dégazée sous argon, du produit débenzyle obtenu ci-dessus (35 mg, 0.029 mmol) dans EtOH qualité HPLC (2 ml) est ajoutée à la suspension de catalyseur. Le mélange réactionnel est alors agité pendant 2 heures sous H2 à température ambiante. Le catalyseur est filtré sur filtre millipores et le filtrat évaporé pour conduire, sans autre purification, à l'ester phosphate attendu (26 mg, 87%). HPLC (210 nm) : TR = 29.3 et 30.9 min (observation des deux diastéréoisomères). ES/MS : m/z 1064.8 [M+H]+, 1086.8 [M+Na]+, 1108.8 [M-H+2Na]+ (Figure 15).
2.5.6. 2-r(R)-3-Dodécanoyloxytétradécanoylamino1-4-(dihvdroxy-phosphoryloxy) butanoate de (2-[(R)-3-hvdroxytétradécanoylamino1-5-(6-oxohexyl)amino> pentyle (=OM-144-FP9)
1.87 ml Nal04 0.1 M (40.17 mg , 20 éq.) sont ajoutés à 10 mg (9.39 μmol, 1 éq.) du produit déprotégé préparé ci-dessus dans un mélange isopropanol-eau (1 :1). La solution est agitée pendant deux heures à température ambiante. La réaction est stoppée par l'adjonction de 1-2 gouttes d'éthylène glycol. TR = 30.0 et 31.5 min (observation de deux diastéréoisomères). ES/MS : m/z 1032.8 [M+H]\ 1054.8 [M+Na]+.
2.6. (2R, 8R)-2~[(R)-3-Dodécanoyloxytétradécanoylamino]-3-oxo-4-aza-8'
[(R)-3-hydroxytétradécanoylamino]-nonane-1,9-diol 1-O-carboxy- méthyl éther 9-0-(6-oxohexanoate) (=OM-112-FV7) (Figure 16)
La D-serine est protégée sous forme de dérivé N-(p-methoxybenzyloxycarbonyl) [Ref: Chen et Wang, Synthesis (1989), 36-37], puis la fonction OH alkylée avec le bromoacétate de benzyle en présence de NaH (2 equiv.). La fonction amine est libérée par traitement avec de l'acide trifluoroacétique dans le dichlorométhane, puis acylée avec le chlorure de l'acide (R)-3-dodécanoyloxytétradécanoique en présence de triéthylamine. Le dérivé de la serine ainsi obtenu est couplé avec l'aminé (2R)-5- amino-2-[(R)-3-benzyloxytétradécanoylamino]pentan-1-ol (voir 4.1.1) en présence de IIDQ pour donner le (2R, 8R)-2-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoylamino]-3-oxo-4~ aza-8-[(R)-3-benzyloxytétradécanoylamino]nonane-1 ,9-diol 1-O-benzyloxycarbonyl- méthyl éther. Ce produit est ensuite O-acylé avec l'acide hept-6-ènoique en présence de EDCI. La double liaison de l'ester auxiliaire est hydroxylée avec le tétroxyde d'osmium (catalytique, en présence de N-méthylmorpholine N-oxyde), puis le diol déprotégé par hydrogénolyse en présence de palladium sur charbon dans l'éthanol. Le produit OM-112-FV-7 est obtenu par traitement avec du periodate de sodium dans un mélange isopropanol-eau.
Figure imgf000052_0001
MM: 1010.45.
2.7. (2S,8R)-1-(Carboxyméthyl)thio-2-[(R)-3-tétradécanoyloxytétra- décanoylamino]-3-oxo-4-aza-8-[(R)-3-hydroxytétradécanoy-lamino]~ nonan-9-ol 9-0-(7-amino-heptanoate) (-OM-212-A 1) (Figure 17)
La D-cystéine est S-alkylée avec le bromoacétate de p-méthoxybenzyle en présence de carbonate de sodium en milieu THF-eau. La S-benzyloxycarbonylmethyl cystéine ainsi obtenue est N-acylée avec le chlorure de l'acide (R)-3-tétradécanoyloxy- tétradécanoique, puis le dérivé S-alkylé N-acylé de la D-cystéine est couplé avec l'aminé (2R)-5-amino-2-[(R)-3-hydroxytétradécanoylamino]pentan-1-ol {obtenue par hydrogénolyse de la (2R)-5-amino-2-[(R)-3-benzyloxytétradécanoylamino]pentan-1- ol, voir 4.1.1} en présence de IIDQ. Le produit ainsi obtenu est O-acylé sélectivement en position primaire avec l'ester dérivé de HOBt et de l'acide 7-(p- methoxybenzyloxy-carbonylamino)heptanoique. Les deux groupes p- méthoxybenzyle sont ensuite éliminés par traitement de l'ester avec de l'acide trifluoroacétique aqueux. C59H112N4O10S. MM : 1069.64.
2.8. (2R, 8R)-2-[(R)-3-Dodécanoyloxytétradécanoylamino]~3-oxo-4-aza-8- [(R)-3-hydroxytétradécanoylamino]-nonane-1,9-diol 1-0-(2,2-di- carboxyéthyl) éther 9-0-(6-oxohexanoate) (=OM-312~FV7) (Figure 18)
Le dérivé N-(p-methoxybenzyloxycarbonyl) de la D-serine est O-alkylé avec le
I methylènemalonate de dibenzyle en présence de NaH. La fonction amine est libérée par traitement avec de l'acide trifluoroacétique dans le dichlorométhane, puis acylée avec le chlorure de l'acide (R)-3-dodéca-noyloxytétradécanoique eni présence de triéthylamine. Le dérivé de la serine ainsi obtenu est couplé avec l'aminé (2R)-5- amino-2-[(R)-3-benzyloxytétradécanoylamino]pentan-1-ol (voir 4.1.1) en présence de IIDQ pour donner le (2R, 8R)-2-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoylamino]-3-oxo-4- aza-8-[(R)-3-benzyloxytétradécanoylamino]nonane-1 ,9-diol 1-0-[2,2-bιs-(benzyloxy- carbonyl)ethyl] éther. Ce produit est O-acylé avec l'acide hept-6-énoique en présence de EDCI, puis l'ester heptenoyie soumis à une hydroxylation avec le tétroxyde d'osmium. Les groupes benzyles sont éliminés par hydrogénolyse en présence de palladium sur charbon dans l'éthanol. Le produit OM-312-FV-7 est obtenu par traitement du produit débenzyle avec du periodate de sodium dans un mélange isopropanol-eau. C58H105N3O14. MM: 1068.49.
2.9. 3-[(R)-3-Dodécanoyioxytétradécanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3- hydroxytétradécanoylamino]-1,10-diol-1 -dihydrogénophosphate 10- (6-bromoacetamidohexanoate) (≈OM-412-BA7) (Figure 19)
Le 3-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hydroxytétra- décanoylamino]-1 ,10-diol-1 -dihydrogénophosphate 10-(6-aminohexanoate) (voir 4.2.3.3) est soumis à une réaction de bromoacétylation avec l'ester succinimidyloxy de l'acide bromoacétique dans un milieu eau-DMF en présence de triéthylamine. Le produit final est purifié par HPLC. C57Hιo8BrN4013P. MM: 1168.4.
2.10. (3RS, 9R)-3-[(R)-3-Hydroxytétradécanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3- dodécanoyloxytétradécanoylamino]-décane-1, 10-diol 1 -dihydrogénophosphate 10-O-(6-oxohexanoate) (OM-512-FV7) (Figure 20)
L'acide 2-[(R)-3-benzyloxytétradécanoylamino]-4-diphényloxyphosphoryloxy-buta- noique [obtenu par N-acylation du sel trifluoroacétique de l'0-(diphényl- oxyphosphoryl)-DL-homosérinate de benzyle avec le chlorure de l'acide (R)-3- benzyloxytétradécanoique, puis coupure de l'ester de benzyle par hydrogénolyse dans l'éthanol en présence de triéthylamine et de charbon palladié] est couplé avec le (2R)-5-amino-2-[(R)-3-dodécanoyl-oxytétradécanoylamino]pentan-1-ol [obtenu par N-acylation du sel trifluoro-acétique du (2R)-5-(benzyloxycarbonylamino)-2-amino- pentan-1-ol avec le chlorure de l'acide (R)-3-dodécanoyloxytétradécanoique, puis déprotection du groupe amino en C-5 par hydrogénolyse dans l'éthanol en présence de triéthylamine et de charbon palladie] en présence de IIDQ. L'amide ainsi formé est O-acylé sur la fonction OH libre avec l'acide 6-hepténoique en présence de EDCI pour donner l'ester correspondant. La double liaison de l'ester auxiliaire est soumise à une réaction d'hydroxylation avec le tétroxyde d'osmium ; le groupe benzyle est ensuite éliminé par hydrogénolyse sur charbon palladie et le phosphate libéré par hydrogénolyse sur noir de platine. Le fonction diol est soumise à une réaction d'oxydation périodique pour générer le dérivé 6-oxohexanoyle OM-512-FV7. C55H104N3O13P. MM: 1046.42.
2.11. Purification et analyse des composées selon l'invention
Les produits de synthèse et des pseudopeptidolipides portant un bras auxiliaire fonctionnalisé sont solubilisés dans un mélange eau - isopropanol (1:1 v/v). La quantité nécessaire de bicarbonate d'ammonium 2M est ensuite ajoutée pour atteindre une concentration de 50 mM.
2.11.1. Purification
La purification est effectuée par HPLC préparative en phase inverse dans les conditions suivantes :
Colonne: Bondapack C18 PrepPak, 40 x 200 mm, 15-20 μm, 300 A, Waters
Phase mobile: A: isopropanol - eau (9:1 , v/v), 50mM bicarbonate d'ammonium B: isopropanol - eau (2:8, v/v), 50mM bicarbonate d'ammonium Débit: 40 ml/min Elution: Adsorption isocratique sur la colonne : 40% B (60% A), 10 minutes
Gradient A:B : 40 à 80% B en 10 minutes
Elution isocratique 80% B, 30 minutes
Lavage : 100% B, 10 minutes
Détection: UV, 210 nm
Au cas où la présence de produits aromatiques serait observée (étape de déprotection incomplète), une purification plus fine doit être effectuée. Cette purification supplémentaire est réalisée dans les conditions suivantes :
Colonne: Kromasil C18, 21 x 250 mm, 5 μm, 100 A, Macherey-Nagel Phase mobile: A: isopropanol - eau (9:1 , v/v), 50mM bicarbonate d'ammonium
B: isopropanol - eau (2:8, v/v), 50mM bicarbonate d'ammonium Débit: 5 ml/min Elution: Adsorption isocratique sur la colonne: 40% B (60% A), 10 minutes
Elution isocratique : 84% B, 30 minutes
Lavage : 100% B, 10 minutes
Détection: UV, 210 Système : Waters 2000
Les fractions contenant les composés d'intérêt sous forme de sel d'ammonium sont rassemblées et concentrées par adsorption sur phase C18 Bondapack, 15-20 μm, 300 A, Waters. Le contre ion peut ensuite être échangé par lavage au moyen d'une solution aqueuse d'un sel de métal alcalin (tel que NaCI ou KCI, par exemple) à 10 g/L dans l'eau - isopropanol (9:1 , v/v). Après élimination de l'excédent de sel par passage de 5 volumes d'un mélange eau - isopropanol (9:1 , v/v) sur la colonne, le composé est élue avec de l'isopropanol pur. 2.11.2. Suivi de la purification
Après chaque étape, les fractions sont analysées par chromatographie analytique HPLC en phase inverse selon les conditions suivantes :
Colonne: Supelcosil C18, 3 μm, 4.6 x 150mm, 100 A, Supelco Phase mobile: A: eau - acétonitrile (1 :1 , v/v), 5mM TBAP
B: eau - isopropanol (1 :9, v/v), 5mM TBAP
TBAP : phosphate de tétrabutylammonium
Débit: 1 ml/min
Elution: Gradient A:B (75:25 à 0:100) en 37.5 minutes
Détection: UV, 210 et 254 nm
Chromatographe: Pour ces analyses, différents chromatographes HPLC ont été utilisés (HP1050 Ti séries, HP1090 séries M: LabChrpm- Shimadzu). Les temps de rétention selon le système utilisé peut varier d'environ une minute pour un composé donné.
2.11.3. Dosage et analyse de pureté des produits finaux
Le dosage et le contrôle de pureté des produits obtenus sont réalisés par HPLC/UV dans les conditions chromatographiques décrites ci-dessus. Selon ces analyses les puretés obtenues des produits varient entre 97 et 100%,. Afin de mettre en évidence la présence d'impuretés inactives en UV, des analyses LC/ES-MS ont été réalisées (ionisation de type electrospray, mode positif). Pour satisfaire aux conditions d'ionisation, les conditions chromatographiques suivantes ont été utilisées :
Colonne: Vydac C4, 5 μm, 4.6 x 150mm, 300 A Phase mobile: A: eau - acétonitrile (1:1 , v/v), 0.05% TFA
B: eau - isopropanol (1 :9, v/v), 0.05% TFA Débit: 1 ml/min Elution: Gradient A:B (80:20 à 0:100) en 20 minutes Température : 40°C 2.11.4. Analyses spectroscopiques
Spectrométrie de masse
Les spectres ES/MS (modes positif et négatif) ont été mesurés sur des spectromètres de masse de différents types (Finnigan LCQ, ion trap; Micromass Quattro II, triple stage quadrupole; Micromass Z-Bio-Q, triple stage quadrupole). Des analyses complémentaires de type MS/MS ont également été réalisées.
Résonance magnétique nucléaire Les spectres 1 H-RMN et 13C-RMN ont été mesurés sur des appareils d|e type Bruker DPX à 250.13 et 62.89 MHz.
2.11.5 Détermination de l'endotoxicité
L'endotoxicité des différents intermédiaires de synthèse et des pseudopeptidolipides portant un bras auxiliaire fonctionnalisé a été déterminée par le test Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) chromogénique cinétique (Charles River Endosafe produit R1708K, lot EK2251 E). Ce test LAL a été utilisé pour démontrer la faible endotoxicité des produits présentés dans l'invention.
Les résultats sont exprimés en EU (unité d'endotoxine) par rapport à une solution étalon standard internationale (EC-6). Pour cette série de dosage, 1 EU représente environ 0.08 ng de LPS E. coli 055 :B5.
Tableau des valeurs LAL obtenues pour les intermédiaires de synthèse et les pseudopeptidolipides portant un bras auxiliaire fonctionnalisé:
Figure imgf000058_0001
Les composés testés présentent une endotoxicite faible (< 0.0005% de celle du LPS de référence). Le greffage de différents bras auxiliaires fonctionnalisés sur la structure des pseudopeptidolipides ne modifie pas notablement l'endotoxicité de ces produits.
EXEMPLE 3
PREPARATION DES CONJUGUES
3.1. Conjugués avec le peptide FGFG
Comme le montrent les schémas de synthèses présentés dans les Figures 4, 7 12, 14, 16, 18 et 20, une réaction de dihydroxylation vicinale est réalisée sur les pseudopeptidolipides portant un bras auxiliaire de type oléfinique pour conduire à la formation d'une fonction diol stable. Une réaction d'oxydation périodique est ensuite effectuée pour créer une fonction aldéhyde sur le bras auxiliaire. Une réaction d'amination réductrice peut ensuite être réalisée pour coupler, par exemple, un peptide de petite taille tel que FGFG (Phénylalanine-Glycine-Phénylalanine-Glyçine, Sigma). Une étape de purification de l'aldéhyde est toutefois préférable
3.1.1. Purification de l'aldéhyde
Afin d'éliminer les sels présents en solution, une purification de l'aldéhyde est réalisée sur phase Bondapack C18 (Waters), 15-20 μm, 300 A, selon la procédure suivante :
- adsorption de l'échantillon après dissolution dans un mélange isopropanol-eau (1 :3)
- élution des sels avec un mélange isopropanol-eau (1 :9)
- élution de l'aldéhyde avec un volume minimum d'isopropanol
3.1.2. Couplage par amination réductrice
La réaction de couplage par amination réductrice est réalisée en solution aqueuse en respectant une stœchiométrie égale entre les fonctions aldéhyde (bras auxiliaire du pseudopeptidolipide) et les fonctions aminés disponibles sur le peptide ou la protéine à coupler. Dans l'exemple du peptide FGFG, 2 mg d'OM-197-FV7 purifié (1.86 μmol, 1 éq) ont été ajoutés à une solution de 0.8 mg de FGFG (1.86 μmol, 1 éq) dissous dans 1 ml H20-MeCN (1 :1) La solution est agitée pendant 30 minutes à température ambiante pour former l'imine. L'étape de réduction est ensuite effectuée par adjonction de 92 μl de NaBH3CN 1M (5.77 mg, 50 éq) pour former une liaison carbone-azote particulièrement stable (Figure 21). Le conjugué a été purifié dans un premier temps sur colonne Vydac C4 pour éliminer le peptide n'ayant pas réagi, puis sur phase Bondapack C18 (Waters) pour obtenir le sel de sodium (voir paragraphe : purification et analyse des composés selon l'invention). Le conjugué a ensuite été resolubilisé dans H20 stérile 0.01% triéthanolamine (TEoA) pour satisfaire aux conditions des tests d'activités biologiques. Le spectre de masse ES/MS enregistré après purification est présenté en Figure 23 et met en évidence un ion moléculaire [M+H]+ à m/z 1457.4, indiquant le couplage attendu. Les i ns visibles entre m/z 400 et 900 ont été identifiés par des analyses MS/MS comme étant des fragments provenant du pic moléculaire du peptide conjugué. Les ions correspondant au peptide FGFG initial (m/z 427.1 [M+H]+, m/z 853.0 [2M+H]+, Figure 22) n'ont pas été détectés.
3.2. Conjugués avec le peptide (NANPjβP∑Pso
Le composé OM-197-FV7 obtenu par le shéma de synthèse présenté en Figure 4 peut être couplé, par exemple, à un peptide d'intérêt pharmaceutique tel que (NANP)6P2P3o [Valmori et al., 1992, J. immunol. 149, 717-721], dont la séquence est la suivante :
(NANP)6QYIKANS FIGITEFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE
Le peptide (NANP)eP2P3o présente quatre sites de conjugaison possibles (amine terminale + trois lysines). 5 mg d'OM-197-FV7 purifié (4.64 μmol, 4 éq) ont été ajoutés à une solution de 7.49 mg de (NANP)6P2 3o (1.16 μmol, 1 éq) dissous dans 1 ml H2θ-isopropanol (1 :1) La solution est agitée pendant 30 minutes à température ambiante, puis l'étape de réduction est effectuée en ajoutant 230 μl de NaBHsCN 1 M (14.43 mg, 50 éq). ) La solution est agitée pendant deux heures à température ambiante. Le mélange réactionnel est ensuite dialyse contre H2O pendant 24 heures, (cassette de dialyse 3.5Kd, Slide-A-Lyzer, Pierce). L'analyse LC/ES-MS du mélange réactionnel montre la présence de trois types de molécules, comme le montrent les chromatogrammes présentés en Figure 24: Les pics correspondant au peptide libre (pic A), au peptide monoconjugué (pic B) et au peptide biconjugue (pic C) sont clairement visibles. Les enveloppes ioniques enregistrées pour Chacun d'eux sont présentées aux Figures 25, 26 et 27 et attestent d'une conjugaison covalente à une ou deux molécules de OM-197-FV pour le monoconjugué et le biconjugue, respectivement.
Figure 25 : Peptide (NANP)6P2P3o (peptide libre). PM: 6451 Ions à m/z 1076.2 (A6), 1291.2 (A5), 1613.7 (A4).
Figure 26 : Monoconjugué OM-197-FV-(NANP)6P2P3o. PM: 7481 Ions à m/z 1247.8 (B6), 1497.4 (B5), 1871.2 (B4).
Figure 27 : Biconjugue (OM-197-FV)2-(NANP)6P2P3o. PM: 8511
Ions à m/z 1419.6 (C6), 1703.3 (C5), 2129.1 (C4).
Les transformations de chacun de ces spectres ES/MS, présentées aux Figure 28, 29 et 30 permettent de mieux visualiser la conjugaison réalisée sur le peptide. L'analyse par SDS-PAGE des conjugués OM-197-FV-(NANP)6P2P3o a permis de mettre en évidence différentes bandes distinctes correspondant au peptide n'ayant pas réagi, au monoconjugué et au biconjugue. Dans les conditions électrophorétiques utilisées (gradient 10-20% polyacrylamide, tampon tris-tricine, Bio Rad, #161-1108), les standards en présence ont permis d'évaluer à environ mille uma la différence entre les bandes d'intérêts, confirmant le couplage de une ou deux molécules d'OM-197-FV sur le peptide.
3.3. Conjugués avec le peptide P2P30
D'autres peptides peuvent également être couplés par amination réductrice aux i ! composés portant un bras auxiliaire de type aldéhyde. On présentera pjar exemple le couplage d'OM-197-FV7 au peptide P2P30- Ce dernier correspond à la partie épitope T de la toxine tenanus toxoid et présente la séquence suivante: QYIKANS FIGITEFNNFTVSFWLRVP VSASHLE
Le peptide P2P30 présente cinq sites de conjugaison possibles (amine terminale + quatre lysines) et une masse de 4200 uma (spectres ES/MS en Figures 31 et 34). Cinq équivalents de OM-197-FV7 ont donc été engagés. Les conditions réactionnelles décrites ci-dessus ont été appliquées. Après dialyse contre H20 (cassette de dialyse 3.5Kd, Slide-A-Lyzer, Pierce), les spectres de masse des conjugués obtenus ont été mesurés par LC/ES-MS et comparés à ceux enregistrés pour le peptide libre. Le spectre ES/MS du monoconjugué OM-197-FV-P2P30 est présenté en Figure 32. Les ions multiplement chargés m/z 872.8 (A6), 1047.1 (A5), 1308.6 (A4) et 1744.4 (A3) constituent l'enveloppe ionique d'un conjugué de masse moléculaire de 5230 uma, correspondant au greffage d'une molécule! de OM-197- FV sur une molécule de peptide P2P3o par amination réductrice. Le spectre de masse transformé met particulièrement bien en évidence la masse attendue pour le monoconjugué OM-197-FV-P2P3o (Figure 35).
De même, le spectre de masse obtenu pour le biconjugue (OM-197-FV)2-P2P3o ne laisse aucun doute quant à la présence de deux molécules de OM-197-FV par unité de peptide. L'enveloppe ionique constituée par les ions m/z 1044.5 (A6), 1253.1 (A5), 1566.3 (A4) et 2088.4 (A3) (Figure 33), ainsi que le spectre transformé (Figure 36) attestent de la masse moléculaire attendue pour le biconjugue (6261 uma).
3.4. Conjugués avec le peptide (NANP)3CS. T3
Un couplage similaire peut être réalisé sur le peptide (NANP)sCS.T3 (TNO, PM: 3527uma, Figures 37 et 40), dont la séquence est la suivante :
NANPNANPNANPDIEA IAKMEKASSVFNVVNS Après dialyse contre H2O, les ions observés sur les spectres ES/MS indiquent des masses moléculaires de 4557 et 5587 uma, correspondant aux valeurs attendues pour les composés mono- et biconjugués, respectivement (Figures 38-39 et 41-42).
3.5. Conjugués avec ovalbumine
Les protéines, comme l'ovalbumine par exemple, se prêtent particulièrement bien au couplage par amination réductrice. Les nombreuses lysines présentes dans la séquence (20 lysines pour l'ovalbumine) sont autant de sites de congailson possibles pour les pseupeptidolipides portant un bras auxiliaire fonctionnalisé avec un groupe aldéhyde. En variant la stœchiométrie de la réaction d'amination réductrice (ratio pseudopeptidolipide / protéine), différents degrés de conjugaison peuvent être obtenus.
1 mg d'OM-197-FV7 purifié (0.928 μmol, 10 éq) a été ajouté à une solution de 4 mg d'ovalbumine (0.09 μmol, 1 éq) dissous dans 5 ml H20. La solution est agitée pendant 30 minutes à température ambiante, puis l'étape de réduction est effectuée en ajoutant 46 μl de NaBHsCN 1M (2.89 mg, 50 éq). ) La solution est agitée pendant deux heures à température ambiante. Le mélange réactionnel est ensuite dialyse contre H20 pendant 24 heures, (cassette de dialyse 3.5Kd, Slide-A-Lyz^r, Pierce).
De par sa taille et une hétérogénéité propre, l'ovalbumine pose de nombreux problèmes analytiques. Par conséquent, la caractérisation d'un conjugué OM-197- FV-ovalbumine par spectrométrie de masse s'avère particulièrement délicate. Afin de mettre en évidence la réaction de conjugaison, des analyses SDS-PAGE ont été réalisées sur les différents lots de conjugués OM-197-FV-ovalbumine. Comme le montre le gel présenté en Figure 43j(è)(g radient 4-20% polyacrylamide), une masse supérieure d'environ 3000 uma à l'ovalbumine initiale (ligne 2) est observée pour les conjugués OM-197-FV-ovalbumine (lignes 3, 4 et 5). Cette différence de masse suggère ainsi la présence de plusieurs molécules de OM-197-FV par molécule d'ovalbumine. Les analyses LC/UV réalisées sur phase C4 confirment ce résultat. En effet, dans ces conditions, l'ovalbumine initiale apparaît clairement à Rt=11.3 min, alors qu'après la réaction de conjugaison, le pic correspondant à l'ovalbumine initiale a complètement disparu démontrant une réaction quantitative de l'ovalbumine. Le conjugué OM-197-FV-ovalbumine n'est par contre pas élue. Ce comportement chromatographique indique également la présence de plusieurs molécules d'OM- 197-FV sur l'ovalbumine, empêchant ainsi Pélution du conjugué dans ces conditions.
3.6. Conjugués avec hémagglutinine H1N1
La protéine d'hémagglutinine H1 N1 constitue également un exemple de choix pour illustrer le couplage entre les molécules de type OM-197 et un antigène de type protéinique.
1 mg d'OM-197-FV7 purifié (0.928 μmol, 15 éq) a été ajouté à une solution de 5 mg de H1N1 (hémagglutinine A / Beijing 262/95, Solvay Duphar, Weesp, NL) (0.06 μmol, 1 éq) dissous dans 8 ml H2O. La solution est agitée pendant 30 minutes à température ambiante, puis l'étape de réduction est effectuée en ajoutant 46 μl de NaBH3CN 1M (2.89 mg, 50 éq). La solution est agitée pendant deux heures à température ambiante. Le mélange réactionnel est ensuite dialyse contre H20 pendant 24 heures (cassette de dialyse 3.5 Kd).
Le conjugué OM-197-FV-H1N1 a été analysé par SDS-PAGE dans les conditions utilisées pour le conjugué OM-197-FV-ovalbumine (gradient 4-20% polyacrylamide). Les profils electrophoretiques obtenus pour la protéine initiale (ligne 6) et le conjugué avant et après dialyse (lignes 8 et 7, respectivement) sont présentés en Figure 4 ). La protéine H1 N1 apparaît sous la forme de trois bandes, dont deux correspondent aux sous-unités HA1 et HA2 décrites dans la littérature (Swiss-Prot, Swiss Institute of Bioinformatics, Geneva). Dans le cas des conjugués OM-197-FV-H1N1 , une différence de masse est observée pour chacune des bandes, mettant ainsi en évidence le couplage de molécules de OM-197-FV sur la protéine H1 N1. EXEMPLE 4
ETUDE PHARMACOLOGIQUE DES COMPOSES SELON L'INVENTION (IN-VITRO)
4.1. Test de détermination de l'endotoxicité
L'endotoxicité a été déterminée par le test Limulus Amoebocyte Lysate chromogenique cinétique (Charles River Endosafe produit R1708K lot EK2251 E). Ce test LAL a été utilisé pour démontrer la faible endotoxicite des antigènes couplés au produit de l'invention. Le principe biologique de ce test est basé sur l'initiation par les; endotoxines bactériennes d'une proenzyme présente dans le lysat des amoebocytes de Limulus (LAL) qui active une cascade de serine protéases. En présence d'un substrat incolore (S-2834 peptide couplé à la p-nitroaniline), le clivage du jchromophore conduit à la libération de p-nitroaniline (pNA) et au développement d'une coloration jaune qui peut être suivi spectrophotométriquement à 405 nm.
. endotoxine
1. proenzyme > enzyme
2. substrat > peptide + p-nitroaniline
Le test cinétique chromogenique est basé sur le fait que la quantité d'endotoxine est inversement proportionnelle au temps nécessaire pour atteindre une densité optique (D.O.) de 0.2. La concentration est déterminée par rapport à une courbe standard de 0.005 à 50 EU/ml.
Les résultats sont exprimés en EU (unité d'endotoxine) par rapport à une solution étalon standard internationale (EC-6). Pour cette série de dosage 1 EU représente environ 0.08 ng LPS E. coli 055 :B5. Tableau résultat LAL pour les différents produits de l'expérience d'immunisation avec les produits conjugués à l'ovalbumine :
Figure imgf000066_0001
II semblerait que le fait de coupler l'OM-197-FV à lOvalbumiπe crée une augmentation de l'activité LAL détectée. Cette augmentation est peut être due à un changement dans la manière dont la molécule d'OM-197-FV est présentée. Les autres produits de la série ovalbumine ont tous des activités LAL équivalentes. Les résultats LAL sont très variables et des différences entre les groupes de 3 à 4 x ne sont pas significatives. L'activité LAL maximale est de 2.4 ng équivalent LPS par injection (25 μg/injection) pour les produits de couplage, pour les autres groupes l'activité LAL maximale est de 0.012 ng équivalent LPS par injection.
Tableau résultat LAL pour les différents produits de l'expérience d'immunisation avec les produits conjugués à l'hémagglutinine H1 N1 :
Figure imgf000066_0002
Les produits de la série H1 N1 ont tous des activités LAL équivalentes. Les résultats LAL sont très variables et des différences entre les groupes de 3 à 4 x ne sont pas significatives. Le couplage n'a pas d'effet sur l'activité LAL. L'activité LAL maximale est de 0.008 ng. équivalent LPS par injection (5 μg/injection). Tableau résultat LAL pour les différents produits de l'expérience d'immunisation avec les produits conjugués au peptide (NANP)6P2P3o :
Figure imgf000067_0001
pas osa e en A car s agit 'une mu s on
Les produits de la série (NANP)δP2P3o ont tous des activités LAL équivalentes. Les résultats LAL sont très variables et des différences entre les groupes de 3 à 4 x ne sont pas significatives. Le couplage n'a pas d'effet sur l'activité LAL. L'activité LAL maximale est de 0.03 ng. équivalent LPS par injection (20 μg/injection).
4.2. Détermination de la prolifération des cellules souche de la moelle osseuse de souris stimulées par les produits de l'invention
4.2.1. Expérience de prolifération
Des souris mâles C57/BL6 de 6 semaines sont sacrifiées par inhalation de C02. Les os des membres postérieurs, la hanche, le tibia et le fémur sont prélevés. La moelle est extraite de la lumière osseuse par injection de milieu Eagle modifié par Dulbecco (milieu DH) au travers des extrémités qui ont été préalablement sectionnées. Les cellules souches sont lavées et remises en suspension dans du milieu DH complété par 20 % de sérum de veau foetal (SVF). La concentration cellulaire est ajustée à 500000 cellules/ml.
Les produits en solution dans le milieu DH additionné de 20 % SVF, d'acides aminés et d'antibiotiques, sont dilués en série directement dans la microplaque. Les produits sont testés en triplicat et chaque microplaque comprend un contrôle négatif composé de milieu seul. Le volume final dans chaque puits est de 100 μl. Pour certaines expériences les produits en solution dans l'isopropanol sont dilués dans le milieu DH avec 20 % de SVF, amené à sec par évaporation, et repris dans un volume équivalent d'eau. 100 μl de suspension cellulaire sont ajoutés aux dilutions de produits et les cellules sont incubées pendant 7 jours dans une étuve à 37 °C, sous 8 % de C02, saturée en humidité. La prolifération est déterminée par la mesure de l'oxydation d'un substrat chromogenique (XTT) dans les mitochondries des cellules vivantes (Cell Prolifération kit II # 1465 015 Boehringer Mannheim). A la fin de l'incubation, 50 μl de la solution XTT substrat sont ajoutés à chaque puits. Après 8 heures d'incubation à 37 °C sous 8 % de CO2 dans une étuve saturée en humidité, les microplaques sont lues au spectrophotomètre à 492 nm contre une référence à 690 nm. Les résultats sont exprimés en moyenne ± écart-type sous forme de courbe dose-réponse. Les valeurs du contrôle négatif composé de milieu DH (moyenne ± écart type) sont également indiquées sous forme graphique.
4.2.2. Présentation des résultats
Prolifération des cellules souches de la moelle osseuse induite par des pseudopeptidolipides porteurs d'un bras auxiliaire fonctionnalisé La figure 44 présente l'activité des différents produits et montre l'influence du bras auxiliaire fonctionnalisé sur l'activité NO mesurée in vitro. Le bras contenant la fonction aldéhyde (OM-197-FV7) présente une capacité à induire la prolifération plus faible que ceux qui contiennent une fonction alcool (OM-197-FV8) ou diol (OM-197- FV6). De plus le maximum d'induction de la prolifération est décalé par rapport aux autres produits (à environ 5 μg/ml). Le pseudopeptidolipide monophénylé portant un bras auxiliaire diol (OM-197-FV6 monophénylphosphate) est très actif dans ce modèle in vitro, beaucoup plus que l'équivalent non phényle (OM-197-FV6). Le composé comprenant une charge positive sur son bras fonctionnalisé (OM-287- AC5) présente un profil d'activité différent des autres composés de la série. Il commence par être inactif et présente un pic d'activité maximal vers 1 μg/ml. Sa capacité à induire la prolifération des cellules souches est très importante. L'OM-197-MC comprenant une charge négative avec la fonction carbonyle est également très actif dans ce modèle, avec un maximum d'activité à environ 10 μg/ml. La figure 45 présente une comparaison de l'activité NO des pseudopeptidolipides par rapport au LPS utilisé comme contrôle positif. Bien qu'induisant la prolifération des cellules souches de la moelle osseuse de manière significative, une concentration plus forte que celle du contrôle positif (100 x) est nécessaire pour que les pseudopeptidolipides commencent à induire une activité NO. L'amplitude maximale est également beaucoup plus faible que celle induite par le LPS de E. coli.
4.3. Détermination de la production d'oxyde nitrique par des macrophages murins stimulés par les produits de l'invention
4.3.1. Expérience de production d'oxyde nitrique :
Des souris mâles C57/BL6 de 6 semaines sont sacrifiées par inhalation de CO2. Les os des membres postérieurs, la hanche, le tibia et le fémur sont prélevés. La moelle est extraite de la lumière osseuse par injection de milieu Eagle modifié par Dulbecco (milieu DH) au travers des extrémités qui ont été préalablement sectionnées. Les cellules souches sont lavées et remises en suspension (concentration cellulaire environ 40000 cellules/ml) dans du milieu DH complété par 20 % de sérum de cheval (SH) et 30 % de surnageant de L929. Les L929 sont une lignée de fibroblastes murins dont le surnageant est riche en facteur de croissance pour les macrophages (M-CSF). La suspension cellulaire est distribuée dans des boîtes de Pétri qui sont incubées 8 jours à 37 °C sous 8 % de CO2 dans une étuve saturée en humidité.
Après 8 jours les cellules souches se sont différenciées en macrophages matures. Les macrophages sont détachés par un passage au froid, lavés et resuspendus dans du milieu DH complété par 5 %> de sérum foetal de veau (SF ), des acides aminés et des antibiotiques. La concentration cellulaire est ajustée à 700000 cellules par ml.
Les produits en solution dans le milieu DH additionné de 5 % de SVF, d'acides aminés et d'antibiotiques, sont dilués en série directement dans la microplaque. Les produits sont testés en triplicat et chaque microplaque comprend un contrôle négatif composé de milieu seul. Le volume final dans chaque puits est de 100 μl. Pour certaines expériences les produits en solution dans l'isopropanol sont dilués dans le milieu DH avec 5 % de SVF, amené à sec par evaporation, et repris dans un volume équivalent d'eau (résultats figure 41). 100 μl de suspension cellulaire sont ajoutés aux dilutions de produits et les cellules sont incubées pendant 22 heures dans une étuve à 37 °C, sous 8 % de CO2, saturée en humidité. A la fin de l'incubation avec les produits, 100 μl de surnageant sont prélevés et la concentration de nitrite est déterminée par la réaction de Griess.
100 μl de réactif de Griess (5mg/ml de sulfanilamide + 0,5mg/ml de chlorhydrate de N-(1-naphthyléthylène diaminé)) dans de l'acide phosphorique à 2,5 % aqueux, sont ajoutés à chaque puits. Les microplaques sont lues au spectrophotomètre à 562 nm contre une référence à 690 nm. La concentration en nitrite est proportionnelle à celle de l'oxyde nitrique produit. La concentration en nitrite est déterminée par rapport à une courbe standard.
Les résultats sont exprimés après soustraction du contrôle négatif en moyenne ± écart type sous forme de courbe dose/réponse. 4.3.2. Présentation des résultats :
Activité NO des pseudopeptidolipides porteurs d'un bras auxiliaire fonctionnalisé La figure 46 présente l'activité des différents produits et montre l'influence du bras auxiliaire fonctionnalisé sur l'activité NO mesurée in vitro. Le bras contenant la fonction aldéhyde (OM-197-FV7) présente une activité plus faible que ceux qui contiennent une fonction alcool (OM-197-FV8) ou diol (OM-197-FV6). Une interaction de l'aldéhyde du composé OM-197-FV7 avec les protéines présentes dans le milieu de culture pourrait expliquer l'activité de ce produit. Le composé phényle semble également moins actif que le composé non phényle (OM-197-FV6). La solubilité plus faible du composé phényle pourrait expliquer cette baisse d'activité.
Le composé comprenant une charge positive sur son bras auxiliaire fonctionnalisé (OM-287-AC5) présente un profil d'activité différent des autres composés de la série. II commence par être inactif et présente un pic d'activité maximal vers 1 μg/ml. L'OM-197-MC comprenant une charge négative avec la fonction carbonyle est très actif dans ce modèle.
La figure 47 présente une comparaison de l'activité NO des pseudopeptidolipides par rapport au LPS utilisé comme contrôle positif. Bien qu'induisant une activité NO significative, une concentration plus forte que celle du contrôle positif (100 x) est nécessaire pour que les pseudopeptidolipides commencent à induire une activité NO. L'amplitude maximale est également beaucoup plus faible que celle induite par le LPS de E. coli.
4.4. Test de différentiation des cellules dendritiques
La capacité des produits de l'invention à induire la maturation des cellules pré- dendritiques en cellules dendritiques a été évaluée. Les paramètres suivants ont été mesurés: l'incorporation du Dextran-FITC et l'expression des molécules de surface CD83, CD86. 4.4.1. Protocole expérimental
Les cellules mononucléées du sang périphérique sont isolées à partir de "buffy coats" de donneurs sains. Les monocytes purifiés par adhérence sont remis en suspension dans du milieu RPMI-1640 (Sigma-AIdrich, St-Louis, MO, U.S.A.) contenant 10% de sérum de veau fœtal, du GM-CSF (10 ng/ml; IM-HGM1 , Immungenex Corp, Los Angeles, CA, U.S.A.) et de l'IL-4 (10 ng/ml; No 204-IL, R&D System, Minneapolis, MN, USA) à raison de 1 x 106 cellules/ml. Les cellules sont distribuées dans des boîtes de Pétri (P10, Falcon, Becton Dickinson, Plymouth, !UK) (10 x 106 cellules par boîte P10) et cultivées pendant 6 jours avec un changement de milieu après 3 jours. Les cellules ainsi obtenues sont appelées cellules prédendritiques (DC-6). La maturation des cellules prédendritiques en cellules dendritiques matures est réalisée par incubation avec les dilutions de produits ou de LPS (témoin positif) pendant 3 jours supplémentaires (voir sous produits). Au jour 9 (DC-9), les cellules sont récoltées, et les différents paramètres indicateurs de la maturation des cellules dendritiques: les molécules de surface CD83, CD86 ainsi que la capacité d'incorporer du Dextran-FITC sont évalués. Tous ces paramètres sont analysés par FACS EPICS-XL-MCL (Coulter Immunology, Hialeah, Finlande) (Lanzavecchia ét al., J. Exp. Med 179 (1994) 1109; Lanzavecchia ét al., J. Exp. Med 182 (1995) 389).
L'expression des molécules de surface est exprimée en % de la fluorescence moyenne des cellules stimulées par LPS (témoin positif) ; l'incorporation du Dextran est calculée par rapport à celle des cellules maintenues dans le milieu et est exprimée en %.
Produits : les solutions mères de OM-197-MC, OM-197-FV6, et OM-287-AC5 sont préparées à 0.5 mg/ml dans 0.9% NaCI/eau, additionnée de 0.1% triéthanolamine. Les solutions sont incubées à 37°C pendant 20 min, agités vigoureusement pendant 3 min puis dilués à 100 μg/ml dans du milieu de culture RPMI 1640 et utilisés en dilution à partir de 10 μg/ml jusqu'à 0.03 μg/ml.
Produit de référence : lipopolysaccharide de E. coli (LPS, DIFCO, Détroit, Ml, U.S.A.), solution stock 5 mg/ml dans PBS. Une solution intermédiaire est préparée à 100 μg/ml dans du milieu de culture RPM1 1640. Les concentrations testées sont des dilutions à partir de 1 μg/ml jusqu'à 0.03 μg/ml.
4.4.2. Evaluation des résultats
Les cellules dendritiques immatures (DC-6) issues de la différenciation des monocytes, par l'effet conjugué de GM-CSF et d'IL-4, sont capables d'incorporer le Dextran-FITC. Au cours du processus de maturation, les cellules perdent la capacité d'incorporer le Dextran-FITC. Les analyses sont effectuées au stade de différenciation DC-9.
Les résultats (Figure 48) sont exprimés en % de l'incorporation du Dextran-FITC observée dans les cellules non stimulées incubées avec le milieu seul. Les cellules traitées avec du LPS ou de IOM-287-AC5 ne conservent respectivement que 15% et 22%, de phagocytose, Il faut au moins 1 μg/ml d'OM-287-AC5 pour induire une diminution maximale d'incorporation de Dextran alors que 0.1 μg/ml de LPS induisent une diminution équivalente. 10 μg/ml d'OM-197-MC sont nécessaires pour induire une diminution de 22 % de la phagocytose. De plus pour des concentrations inférieures à 3 μg/ml il n'y a aucun effet de l'OM-197-MC sur la phagocytose. LOM-197-FV6 ne semble avoir aucun effet sur la maturation des cellules dendritiques.
L'expression des molécules de surface costimulatrices est un autre critère de maturation des DC. L'augmentation de l'expression des CD83 et CD86 (Figures 49 et 50) a été testée. Les résultats sont exprimés en % de la moyenne de fluorescence par rapport à l'expression de ces marqueurs induite par le LPS. Ces résultats corroborent parfaitement ceux obtenus à partir de la phagocytose. LOM-287-AC5 induit une augmentation de l'expression des molécules de surface dès 0.1 μg/ml, alors qu'il faut au moins 1 μg/ml pour que l'OM-197-MC commence , à augmenter l'expression de CD83 et de CD86. LOM-197-FV6 n'a aucun effet suir l'expression des molécules de surface caractéristique des cellules dendritiques. Ces résultats montrent un comportement très différent pour les pseudopeptidolipides en fonction de leur bras auxiliaire. LOM-287-AC5 montre une capacité exceptionnelle à induire une différenciation des cellules DC-6 en DC-9 déjà à partir de 0.1 μg/ml, alors qu'il faut des concentrations supérieures à 1 μg/ml pour que l'OM-197-MC commence à induire cette différentiation, et que IOM-197-FV6 est totalement dépourvu de ce type d'activité.
EXEMPLE 5
ETUDE PHARMACOLOGIQUE DES COMPOSES SELON L'INVENTION (IN-VIVO)
5.1. Evaluation des propriétés de pseudopeptidolipides portant un auxiliaire ι fonctionnalisé mélangé ou couplé au (NANP)βP2p3o dans un modèle d'immunisation de souris
5.1.1. Protocole expérimental
Antigène: le peptide (NANP)6P2P3o comprend la séquence répétée (NANP) de Plasmodium falciparum et deux séquences de la toxine tétanique (P2: 830-843 et P3o: 947-967) Ce peptide est connu comme étant un épitope T-helper et a démontré sa capacité à induire une réponse immunitaire élevée et de longue durée en présence d'adjuvants classiques. Le peptide a été obtenu par synthèse selon la méthode décrite dans la littérature (Valmori et al., 1992, J. immunol. 149, 717-721). La solution mère de l'antigène est préparée à 0.4 mg/ml dans 0.9% NaCI/eau à pH 8.0.
Adjuvants: les solutions mères des pseudopeptidolipides (OM-197-MP, OM-197-FV6 et OM-197-MC) sont préparées à 1 mg/ml dans 0.9% NaCI/eau, additionnée de 0.1%, triéthanolamine. Le témoin positif est constitué par l'adjuvant incomplet de Freund (IFA de Difco, Détroit, Ml, U.S.A.) et le témoin négatif est une solution de 0.9% NaCI/eau.
Dans le cadre de ce protocole expérimental, l'adjuvant et l'antigène sont formulés sous la forme de mélange ou de conjugués décrits précédemment. Deux types de conjugués (OM-197-FV)n-(NANP)6P2P3o ont été testés. Ceux-ci correspondent à des degrés de conjugaison différents, soit 1 , 2 ou 3 molécules de OM-197-FV par molécule de peptide (mélange de mono-, bi- et triconjugué, n=1 , 2 et 3, respectivement), soit 1 molécule de OM-197-FV par molécule de peptide (monoconjugué, n=1).
Immunisation: des souris femelles BALB/c âgées de 6 semaines (6 souris par groupe) sont immunisées à deux reprises, par injection sous-cutanée àj la base de la queue de 0.1 ml. Les quantités administrées sont de 20 μg d'antigène et de 50 μg d'adjuvant lors de la première injection et de 10 μg d'antigène et de 50 μg d'adjuvant lors de la seconde. Dans le cas des conjugués, la partie antigène est déterminante pour le calcul de la dose injectée.
Tableaux des groupes expérimentaux :
Figure imgf000076_0001
Schéma d'immunisation et des prélèvements :
Figure imgf000076_0002
Prélèvements du sang et des organes lymphoides :
Obtention du sérum: des prélèvements de sang sont effectués aux temps 0 et 5 semaines. Le sang est laissé reposer 60 min à 37°C, puis placé pendant une nuit à 4°C. Le sérum est ensuite congelé à -80°C jusqu'au dosage des anticorps. 5.1.2.
Figure imgf000077_0001
Le dosage des anticorps IgG dirigés spécifiquement contre l'antigène (NANP)6P2P3o est réalisé par ELISA. La fixation de l'antigène est effectuée en microplaque à 96 puits (Maxisorp F 96, Nunc, DK) par incubation pendant une nuit en chambre humide à 4°C avec dans chaque puits 0.1 ml de PBS (phosphate buffered saline) contenant 0.001 mg/ml d'antigène (NANP)βP2P3o. La saturation de la microplaque est effectuée avec du PBS contenant 1 % d'albumine sérique bovine (BSA, Fluka, CH). Les plaques sont lavées avec du PBS contenant 0.05% de Tween 20 (Sigma, Saint- Louis, MO, USA). Les sérums prélevés à 5 semaines sont dilués emsérie avec le tampon de dilution (PBS contenant 2.5% de lait en poudre dégraissé et 0.05%> de Tween 20), puis transférés dans la microplaque et laissés 1 h à température ambiante (TA). Les plaques sont ensuite lavées avec du PBS. La solution de dilution contenant l'anticorps polyclonal anti-immunoglobuline G de souris conjugué à la phosphatase alcaline (Sigma, Saint-Louis, MO, USA) est ajoutée aux plaques et incubée 1 h à TA. Les plaques sont lavées avec du PBS et les anticorps spécifiques mis en évidence par réaction colorimétrique avec le substrat de la phosphatase alcaline, le p-nitrophenylphosphate (Sigma, Saint-Louis, MO, USA.). L'absorbance à 405 nm est mesurée avec un lecteur de microplaque (Dynatech 25000 ELISA reader, Ashford, Middlesex, UK), chaque condition est déterminée en duplicat. Les résultats présentés sont la moyenne des absorbances mesurées à 405 nm obtenues pour les souris de chaque groupe.
5.1.3. Résultats : réponse spécifique
La production spécifique des anticorps IgG anti-(NANP)eP2P3o déterminée par ELISA, est présentée graphiquement pour les souris ayant reçu deux immunisations (Figure 51). Deux injections d'un mélange antigène + adjuvant (OM-197-FV6 ou OM-197-MC) induisent une réponse sérologique largement supérieure à celle observée lors de l'injection de l'antigène seul. L'immunisation avec le monoconjugué OM-197-FV-(NANP)6P2P3o induit une réponse en anticorps IgG légèrement supérieure à celle obtenue avec le mélange antigène + OM-197-FV6. Un degré de conjuguaison plus élevé (OM-197-FV)ι,2,3 -(NANP)6P2P3o n'améliore pas la réponse serologique contre cet antigène. Le mélange de l'adjuvant OM-197-MP et du monoconjugué OM-197-FV-(NANP)6P2P3o augmente de façon significative la réponse serologique à cet antigène et dépasse les valeurs obtenues avec le contrôle positif constitué du mélange (NANP)6P2P3o + IFA.
Des résultats similaires sont obtenus lorsque la capture des anticorps lest effectuée par ELISA en utilisant comme antigène le peptide (NANP)βNA (Figure 52).
5.2. Groupe d'immunisation ovalbumine : détermination d'anticorps spécifiques générés chez la souris après 1 et 2 administrations par voie sous-cutanée.
5.2.1. Description de l'expérience
Le but de cette étude est de comparer la réponse serologique induite par l'injection d'un mélange adjuvant + antigène (OM-197-MP + ovalbumine) à celle élicitée par un conjugué avec ce même antigène (OM-197-FV-ovalbumine). Pour la 30 souris i BALB/c (femelles, 8 semaines d'âge au début du traitement) ont été réparties dans les 3 groupes suivants :
Figure imgf000078_0001
Solutions :
• Groupe A: la solution mère d'antigène seul (ovalbumine, Fluka AG, Buchs, Suisse) été préparée à la concentration de 125 μg/ml dans H20 + 0.01% thiomersal.
• Groupe B: la solution mère du mélange antigène + adjuvant (ovalbumine + OM- 197-MP) contient 125 μg/ml d'ovalbumine et 250 μg/ml de OM-197-MP dans H20 + 0.01% thiomersal.
• Groupe C: la solution mère du conjugué OM-197-FV-ovalbumine est à la concentration de 125 μg/ml de protéine dans H20+ 0.01 % thiomersal.
Préparations des solutions pour l'injection : chaque solution mère est incubée 15 minutes à 37°C, puis dans chaque cas un volume adéquat de NaCI (14%) est ajouté à chaque solution pour obtenir une solution isotonique (0.9%, NaCI). Le tout est vortexé pendant 3 minutes.
Immunisations: les injections ont eu lieu à jours 0 et 14. Les solutions sont administrées par voie sous-cutanée (100 μl en 2 sites différents, au total 200 μl par animal). Les prises de sang ont eu lieu à jours 14 et 28 (ponction retro-orbitale).
Dosage des immunoglobulines anti-ovalbumine: les immunoglobulines sériques spécifiques pour ovalbumine suivantes ont été déterminées en duplicats par ELISA : lgG1 , lgG2a, et IgM. En bref, des plaques micropuits (NUNC Immunoplate, Roskilde, DK) ont été incubées (coating overnight) à 4°C avec 100 μl de ovalbumine (0.5 μg) dans un tampon bicarbonate (pH 9.6). Après lavage avec 0.5%, Tween-20 (Merck, Hohenbrunn, D) les sérums ont été dilués 50, 200 et 800 fois (solution de dilution: phosphate buffered saline (PBS) + 1 % d'albumine sérique bovine (BSA, Sigma, St. Louis, Mo, USA) + 0.02%, Tween-20)). 100 μl de chacun des sérums dilués ont été ajoutés aux puits. Cette incubation a duré 45 minutes à 37°C.
Après un second lavage, les lgG1 , lgG2a et IgM spécifiques pour ovalbumine sont incubées 30 minutes à 37°C avec 100 μl des anticorps (rat anti-souris) anti-lgG1 conjugués à la péroxydase (Serotec, Oxford, UK) , lgG2a conjugués à la peroxydase (Pharmingen, San Diego, CA, USA) et IgM conjugués à la biotine (Pharmingen, San Diego, CA, USA), dilués au préalable dans le tampon PBS/BSA Tween (dilutions : 250, 1000, et 500 fois respectivement). Pour les IgM, après un lavage supplémentaire, une 3eme incubation a été nécessaire (30 min à 37°C) avec une solution 1/100 de streptavidine conjuguée à la peroxidase (Dako, Glostrup, DK).
Après lavage, 100 μl d'une solution de 1 ,2 phenylène diaminé (OPD, Merck, Darmstadt, D) sont ajoutés pour détecter la péroxydase conjuguée aux anticorps secondaires anti-lgG1 , tandis que pour les lgG2a et IgM, le réactif utilisé est le 3',3',5',5'-tétramethylbenzidine (TMB, Sigma, St. Louis, Mo, USA). Après une incubation de 20 minutes à température ambiante, la réaction est stoppée par l'ajout de 100 μl de 2N H2S04. Les absorbances sont mesurées à 490 nm avec un lecteur de plaques Bio Rad 3550.
5.2.2. Résultats
Les résultats de chaque mesure à 490 nm sont exprimés en unités arbitraires (u.a) par ml. Ceci a été possible par comparaison de chaque échantillon avec une référence préparée à partir de dilutions d'un pool des échantillons à 28 jours provenants du groupe A (animaux injectés avec ovalbumine seule). Par définition le pool d'échantillons dilué 50 fois est à la concentration de 1000 u.a./ml. Les résultats individuels ont ensuite été corrigés selon le facteur de dilution correspondant (50, 200, ou 800 fois) et sont présentés dans les Figures 53, 54 et 55 : les cercles vides correspondent à la moyenne à 14 jours et les cercles pleins correspondent à la moyenne à 28 jours; abbréviation Ova = ovalbumine.
Ces résultats indiquent que le conjugué OM-197-FV-ovalbumine est particulièrement immunogène dans le modèle étudié, puisqu'il augmente de façon significative après la deuxième injection les anticorps spécifiques anti-ovalbumine produits par la souris, ceci quelque soit la sous-classe d'immunoglobuline analysée (lgG1 , lgG2a, et IgM). En particulier il faut relever l'augmentation très importante des lgG2a anti- ovalbumine (Figure 54) qui suggère une immunité préférentiellement orientée TH1. Le mélange non covalent ovalbumine + OM-197-MP donne une réponse lgG2a inférieure à celle obtenue avec le conjugué. 5.3. Groupe d'immunisation hémagglutinine H1N1 : détermination d'anticorps spécifiques générés chez la souris après 1 et 2 administrations par voie sous-cutanée.
5.3.1. Description de l'expérience
Le but de cette étude est de comparer la réponse serologique induite par l'injection d'un mélange adjuvant + antigène (OM-197-MP + H1N1) à celle elicitée par un conjugué avec ce même antigène (OM-197-FV-H1 N1). Pour cela 30 souris BALB/c (femelles, 8 semaines d'âge au début du traitement) ont été réparties dans les 3 groupes suivants :
Figure imgf000081_0001
5.3.2. Préparation des solutions injectées
• Groupe A: la solution mère de H1N1 (hémagglutinine A/Beijing 262/95, Solvay Duphar, Weesp, NL) a été préparée à la concentration de 25 μg/ml dans H20. • Groupe B: la solution mère H1N1 + OM-197-MP contient 25 μg/ml de H1 N1 et 500 μg/ml de OM-197-MP dans H20.
• Groupe C: la solution mère OM-197-FV- H1N1 (H1 N1 lié de façon covalente à OM-197-FV) est à la concentration de 25 μg/ml dans H20).
Chaque solution mère est incubée 15 minutes à 37°C, puis 135 μl de NaCI (14%) sont ajoutés à 2 ml de chaque solution. Le tout est vortexé pendant 3 minutes. 5.2.3. Injections et dosage des immunoglobulines anti-H1 1
Les injections ont eu lieu à jours 0 et 14. Les solutions sont administirées par voie sous-cutanée (50 μl en 2 sites différents, au total 100 μl par animal). Les prises de sang ont eu lieu à jours 14 (ponction retro-orbitale).
Les IgM spécifiques pour H1N1 ont été déterminées en duplicats par ELISA. En bref, des plaques micropuits (NUNC Immunoplate, Roskilde, DK) ont été incubées (coating overnighf) à 4°C avec 100 μl de H1 N1 (0.5 μg) dans un tampon bicarbonate (pH 9.6). Après lavage avec 0.5% Tween-20 (Merck, Hohenbrunn, D) les sérums ont été dilués 50, 200 et 800 fois (solution de dilution: phosphate buffered saline (PBS) + 1 % d'albumine sérique bovine (BSA, Sigma, St. Louis, Mo, USA) + 0.02% Tween- 20)). 100 μl de chacun des sérums dilués ont été ajoutés aux puits. Cette incubation a duré 45 minutes à 37°C.
Après un second lavage, les IgM spécifiques pour H1N1 sont incubées 30 minutes à 37°C avec 100 μl des anticorps (rat anti-souris) anti-lgM conjugués à la biotine (Pharmingen, San Diego, CA, USA), dilués au préalable dans le tampon Tween (dilution: 500 fois). Après un lavage supplémentaire, une troisième incubation (30 min à 37°C) a été effectuée avec une solution 1/100 de streptavidine conjuguée à la peroxidase (Dako, Glostrup, DK).
Après lavage, 100 μl d'une solution de 3',3',5',5'-tétraméthylbenzidine (TMB, Sigma, St. Louis, Mo, U.S.A.) sont ajoutés pour détecter la peroxydase conjuguée aux anticorps secondaires anti- IgM. Après une incubation de 20 minutes à température ambiante, la réaction est stoppée par l'ajout de 100 μl de 2N H2S04. Les absorbances sont mesurées à 490 nm avec un lecteur de plaques Bio Rad 3550.
5.3.4. Résultats
Les résultats de chaque mesure à 490 nm sont exprimés en Unités Arbitraires (U.A) par ml. Ceci a été possible par comparaison de chaque échantillon avec une référence préparée à partir de dilutions d'un pool des échantillons à 28 jours provenants du groupe A (animaux injectés avec H1N1 seul). Par définition le pool d'échantillons dilué 50 fois est à la concentration de 1000 U.A./ml. Les résultats individuels ont ensuite été corrigés selon le facteur de dilution correspondant (50, 200, ou 800 fois) et sont présentés dans la Figure 56 : les cercles pleins correspondent à la moyenne à 28 jours.
Les souris immunisées avec le conjugué OM-197-FV-H1 N1 montrent un titre d'anticorps IgM anti-H1N1 supérieur à celui du contrôle constitué par l'antigène H1N1 seul, ainsi qu'à celui du mélange OM-197-MP + H1 N1.

Claims

REVENDICATIONS
1. Nouveaux pseudodipeptides N-acylés porteurs d'un groupement acide sous forme neutre ou chargée, à l'une des extrémités du pseudodipeptide et porteurs à l'autre extrémité d'un bras auxiliaire fonctionnalisé, répondant à la formule générale I.
X-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-Y-(CH2)p-CH-(CH2)q-Z
I I 0) NHRi NHR2 dans laquelle Ri et R2 représentent chacun un groupe acyle dérivé d'un acide carboxylique ayant de 2 à 24 atomes de carbone, saturé ou insaturé, linéaire ou ramifié, non-substitué ou portant un ou des substituants choisis parmi les groupes hydroxyle, alkyle, aikoxy, acyloxy, amino, acylamino, acylthio et (alkyle en Ci - C24) thio les descripteurs m, n prennent une valeur variant de 0 à 10 les descripteurs p, q prennent une valeur variant de 1 à 10
X et Z représentent un groupe acide sous forme neutre ou chargée ou un bras auxiliaire fonctionnalisé, avec la limitation que l'un au moins des substituants X ou Z représente un bras auxiliaire fonctionnalisé,
Y représente O ou NH,
Le groupe acide X ou Z sera choisi de préférence parmi les groupements :
-carboxyle -carboxy [(Cι-C5)alkoxy]
-carboxy [(CrCsJalkylthio]
-phosphono [(C-i-CsJalkoxy]
-phosphono [(Cι-C-5)alkylthio]
-dihydroxyphosphoryloxy [(Cι-Cs)alkoxy] -dihydroxyphosphoryloxy
-hydroxysulfonyloxy
-hydroxysulfonyl [(Cι-C5)alkoxy] -hydroxysulfonyl [(C-ι-C5)alkylthio] -hydoxysulfonyloxy [(C C5)alkoxy] -hydoxysulfonyloxy [(Cι-Cs)alkylthio]
Un composé selon la revendication 1 dans lequel le groupe auxilliaire en X ou Z, répond à la formule générale (II)
A-(CO)r-(CH2)s-W (II)
A est O, S ou NH le descripteur r prend une valeur de 0 ou de 1 le descripteur s prend une valeur variant de 1 à 10
W est choisi parmi les groupements :
-formyle -acétyle
-cyano
-halogéno -amino
-bromo ou iodo-acétamido
-acylamido -diacylimido
-sulfhydryle
-alkylthio
-hydroxyle
-acyloxy -vinyle
-ethynyle
-carboxyle libre ou sous forme d'ester, d'anhydride mixte, d'amide ou d'hydrazide
-azido
-thiocyano
Un composé selon la revendication 1 ou 2 dans lequel lorsque le substituant X ou Z représente un groupe acide sous forme neutre, il s'agit de la forme carboxylique, sulfonique, phosphonique ou phosphorique libre.
4. Un composé selon la revendication 1 ou 2 dans lequel lorsqu'il s'agit d'un groupe acide sous forme chargée, il s'agit de la forme carboxylique, sulfonique, phosphonique ou phosphorique salifiée, notamment par addition d'une base minérale ou organique, de préférence thérapeutiquement compatible.
5. Un composé selon l'une des revendications 1 à 4 dans lequel, lorsque le substituant X ou Z représente un groupe auxiliaire de formule générale (III)
0-CO-(CH2)s-W (III) le descripteur s prend une valeur variant de 1 à 10, et plus particulièrement 4, 5 ou 6
W est choisi parmi les groupements :
-formyle
-amino et hydroxyle.
6. Un composé selon l'une des revendications 1 à 5 répondant à la formule générale IV
X-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-NH-(CH2)p-CH-(CH2)q-Z
Figure imgf000086_0001
NHR-, NHR2
dans laquelle Ri et R2 représentent chacun un groupe acyle dérivé d'un acide carboxylique ayant de 2 à 24 atomes de carbone, saturé ou insaturé, linéaire ou ramifié, non-substitué ou portant un ou plusieurs substituants choisis dans le groupe formé de hydroxyle, alkyle, aikoxy, acyloxy, amino, acylamino, acylthio et (alkyl en Ci - C24) thio les descripteurs m, n prennent une valeur variant de 0 à 10 les descripteurs p, q prennent une valeur variant de 1 à 10 et dans laquelle l'un des substituants X ou Z est un carboxyle ou un radical dihydroxyphosphoryloxy ou un groupe carboxy [(C-ι-C-5)aIkoxy] ou carboxy [(Cι-Cδ)alkylthio] et dans laquelle l'autre est un radical 6-aminohexanoyloxy, un radical 6-oxohexanoyloxy, un radical 6-hydroxyhexanoyloxy ou un radical 6,7-dihydroxyheptanoyloxy.
7. A titre de composés actuellement préférés selon l'une des revendications 1 à 6, un composé choisi dans le groupe formé de :
- l'acide N-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoylamino]-D-aspartique, α-N-{(4R)-5- hydroxy-4-[(R)-3-hydroxytétra-decanoylamino] pentyl}amide et ses sels d'addition avec une base minérale ou organique,
- le 3-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3- hydroxytétra décanoylamino]-décan-1 , 10-diol 1 -dihydrogénophosphate 10-
(6-oxohexanoate) et ses sels d'addition avec une base minérale ou organique,
- l'acide N-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoylamino]-D-aspartique, α-N-{(4R)- 5-hydroxy-4-[(R)-3-hydroxytétra-decanoylamino] pentyl}amide 5-O-(6-oxo- hexanoate) et ses sels d'addition avec une base minérale ou organique, - le 3-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3- hydroxytétra-décanoylamino]-décan-1 ,10-diol 1-dihydrogéno-phosphate (6- aminohexanoate) et ses sels d'addition avec une base minérale ou organique,
- le 3-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3- hydroxytétra décanoylamino]-décan-1 ,10-diol 1-dihydrogéno-phosphate 10-(6- hydroxyhexanoate) et ses sels d'addition avec une base minérale oiji organique,
- et le 2-[(R)-3-dodécanoyloxytétradécanoylamino]-4-(dihydroxyphosphoryloxy) butanoate de {2-[(R)-3-hydroxytétradécanoylamino]-5-(6-oxohexyl)amino} pentyle et ses sels d'addition avec une base minérale ou organique.
8. A titre de composés préférés selon la revendication 1 , un composé de formule générale I choisi dans le groupe formé :
- du composé dans lequel X = dihydroxyphosphoryloxy, Y = NH, Z = auxiliaire 6-oxohexanoyloxy, R1 = 3-lauryloxy-myristyle, R2 = 3-hydroxymyristyle, m = 2, n= 0, p = 3, q = 1 ; - du composé dans lequel X = -dihydroxyphosphoryloxy, Y = NH, Z = auxiliaire
6-aminohexanoyloxy, R1 = 3-lauryloxymyristyle, R2 = 3-hydroxymyristyle, m = 2, n= 0, p = 3, q = 1 ; - du composé dans lequel X = carboxyle, Y = NH, Z = auxiliaire 6-oxohexanoyloxy, R1 = 3-lauryloxymyristyle, R2 = 3-hydroxymyristyle, m = 1 , n= 0, p = 3, q = 1 ;
- du composé dans lequel X = dihydroxyphosphoryloxy, Y = NH, Z = auxiliaire 6-hydroxylhexanoyloxy, R1 = 3-lauryloxymyristyle, R2 = 3-hydroxymyristyle, m =
2, n= 0, p = 3, q = 1 ;
- du composé dans lequel X = dihydroxyphosphoryloxy, Y = O, Z = auxiliaire (6-oxohexyl)amino, R1 = 3-lauryloxymyristyle, R2 = 3-hydroxymyristyle, m = 2, n= 0, p = 1 , q = 3 ; - du composé dans lequel X = -carboxyméthoxy, Y = NH, Z = auxiliaire
6-oxohexanoyloxy, R1 = 3-lauryloxymyristyle, R2 = 3-hydroxymyristyle, m = 1 , n= 0, p = 3, q = 1 ;
- du composé dans lequel X = carboxyméthylthio, Y = NH, Z = auxiliaire 7- aminoheptanoyloxy, R1 = 3-myristoyloxymyristyle, R2 = 3-hydroxymyristyle, m =1 , n = 0, p = 3, q = 1 ;
- du composé dans lequel X = -0-CH2-CH(COOH)2, Y = NH, Z = auxiliaire 6-oxohexanoyloxy, R1 = 3-lauryloxymyristyle, R2 = 3-hydroxymyristyle, m = 1 , n= 0, p = 3, q = 1 ;
- du composé I dans lequel X = dihydroxyphosphoryloxy, Y = NH, Z = auxiliaire 6-(bromoacétamido)hexanoyloxy, R1 = 3-lauryloxymyristyle, R2 =
3-hydroxymyristyle, m = 2, n= 0, p = 3, q = 1 ;
- et du composé J dans lequel X = dihydroxyphosphoryloxy, Y = NH, Z = auxiliaire 6-oxohexanoyloxy, R1 = 3-hydroxymyristyle, R2 = 3-lauryloxymyristyle, m = 2, n= 0, p = 3, q = 1.
9. Procédé d'obtention des pseudodipeptides N-acylés selon la revendication 1 , porteurs d'un groupement acide sous forme neutre ou chargée à l'une des extrémités du pseudodipeptide et porteurs à l'autre extrémité d'un auxiliaire fonctionnalisé, répondant à la formule générale I, qui consiste en ce qu'on bloque les fonctions amine en position (q+1 ) et YH en position ω d'un acide aminé ω- fonctionnalisé par des réactifs de blocage orthogonaux, en ce qu'on soumet la fonction carboxylique restée libre à l'action d'un agent réducteur pour former l'alcool correspondant, on libère la fonction amine en position (q+1) que l'on acyle à l'aide d'un dérivé fonctionnel d'un acide carboxylique de formule R2OH dans laquelle R2 est défini comme précédemment, puis libère la fonction terminale pour obtenir l'amino alcool fonctionnalisé de formule générale V
Y-(CH2)p-CH-(CH2)q-OH (V)
I
NHR2
dans laquelle Y représente HO ou NH2, R2 représente un groupe acyle dérivé d'acide carboxylique ayant de 2 à 24 atomes de carbone, saturé ou non-saturé, non-substitué ou portant un ou plusieurs substituants définis comme ci-dessus, p et q représentent chacun un nombre entier variant de 1 à 10 que l'on condense en présence d'un agent de condensation peptidique dans un solvant inerte, avec un dérivé d'un acide aminé ω-fonctionnalisé de formule générale VI
X-(CH2)m-CH-(CH2)n-COOH (VI)
I NHR1
dans laquelle Ri est un groupe acyle dérivé d'un acide carboxylique ayant de 2 à 24 atomes de carbone, saturé ou non-saturé, non-substitué ou portant un ou plusieurs substituants définis comme précédemment, m et n est un nombre entier variant de 0 à 10 et X est un groupe acide défini comme précédemment qui peut être sous forme estérifiée pour former le pseudodipeptide de formule générale VII
X-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-Y-(CH2)p-CH-(CH2)q-OH I I (VII)
NHR1 NHR2 dans laquelle les substituants Ri, R2ι et les descripteurs m, n, p et q sont définis comme précédemment, dont on peut -si désiré- substituer, alkyler ou acyler la fonction alcool terminal libre par un réactif de substitution, d'alkylation ou d'acylation de formule générale VIII,
A-(CO)r(CH2)s-W (VIII) dans laquelle A est un groupe partant, une fonction OH, SH ou NH2 le descripteur r est 1 ou 0 le descripteur s varie de 1 à 10 et de préférence entre 2 et 6,
W est choisi de préférence parmi les groupements, -formyle, -acétyle, -cyano, - halogéno, -amino, -bromo ou iodoacétamido, -acylamido, -diacylimido, - sulfhydryle, -alkylthio, -hydroxyle, -acyloxy, -vinyle, -ethynyle, -carboxyle libre ou présent sous forme d'ester, d'anhydride mixte, d'amide ou d'hydrazide, -azido, - thiocyano ou leurs précurseurs, si nécessaire en présence d'un agent de couplage, et de le soumettre à une hydrogénation catalytique ou à un autre processus de déprotection de façon à obtenir le dérivé de formule générale I
X-(CH2)m-CH-(CH2)nCO-Y-(CH2)p-CH-(CH2)q-Z (I) I I
NH NH
I I
Figure imgf000090_0001
dans laquelle et les substituants X, Y, Z, Ri, R2, n, m, p et q ont les significations fournies antérieurement,
10. Procédé d'obtention des phosphopseudodipeptides de formule générale IV
X-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-NH-(CH2)p-CH-(CH2)q-Z (IV)
I I
Figure imgf000090_0002
dans laquelle Ri et R2 représentent chacun un groupe acyle dérivé d'un acide carboxylique ayant de 2 à 24 atomes de carbone, saturé ou insaturé, linéaire ou ramifié, non-substitué ou portant un ou plusieurs substituants choisis dans le groupe formé de hydroxyle, alkyle, aikoxy, acyloxy, amino, acylamino, acylthio et (alkyl en C1-C-24) thio les descripteurs m, p et q prennent une valeur allant de 1 à 10 le descripteur n prend une valeur allant de 0 à 10 dans laquelle X et Z représentent chacun un groupement acide ou un auxiliaire fonctionnalisé caractérisé en ce qu'on bloque les fonctions amine en position (q+1) et en ω d'un acide diaminé de formule H2N(CH2)pCHNH2(CH2)q-ιCOOH par des réactifs de blocage labiles par acidolyse et hydrogénolyse, respectivement, soumet la fonction carboxylique restée libre à l'action d'un agent réducteur pour former l'alcool correspondant, libère la fonction amine en (q+1) que l'on acyle à l'aide d'un dérivé fonctionnel d'un acide carboxylique de formule R2OH dans laquelle R2 est défini comme précédemment, puis libère la fonction amine terminale par hydrogénolyse pour obtenir l'amino alcool de formule générale IX
H2N-(CH2)p-CH-(CH2)q-OH (IX)
NHR2
dans laquelle R2 représente un groupe acyle dérivé d'acide carboxylique ayant de 2 à 24 atomes de carbone, saturé ou non-saturé, non substitué ou portant un ou plusieurs substituants définis comme ci-dessus, p et q représentent un nombre entier variant de 1 à 10 que l'on condense en présence d'un agent de condensation peptidique dans un solvant inerte avec un dérivé d'acide aminé ω-hydroxylé de formule générale VI
X-(CH2)m-CH-(CH2)n-COOH (VI)
I dans laquelle Ri est un groupe acyle dérivé d'un acide carboxylique ayant de 2 à 24 atomes de carbone, saturé ou non-saturé, non substitué ou portant un ou plusieurs substituants m est un nombre entier variant de 1 à 10 n est un nombre entier variant de 0 à 10 et X est un groupe dialkyloxy- ou diaryloxy-phosphoryloxy de formule (RO)2 P-0
O pour former le pseudodipeptide de formule générale X
(RO)2PO-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-NH-(CH2)p-CH-(CH2)q-OH (X) , I I
O NHRi NHR2
dans laquelle les substituants Ri, R2 et les descripteurs m, n, p et q sont définis comme précédemment, et R est un radical labile par hydrogénolyse, dont on peut -si désiré- substituer, alkyler ou acyler la fonction alcool terminal libre par un réactif de substitution, d'alkylation ou d'acylation de formule générale VIII,
A-(CO)r(CH2)s-W (VIII) dans laquelle A est un groupe partant, une fonction OH, SH ou NH2 le descripteur r a une valeur de 0 ou 1 le descripteur s variant de 1 à 10, et de préférence de 2 à 6 W est choisi de préférence parmi les groupements, -formyle, -acétyle, -cyano, - halogéno, -amino, -bromo ou iodoacétamido, -acylamido, -diacylimido, - sulfhydryle, -alkylthio, -hydroxyle, -acyloxy, -vinyle, -ethynyle, -carboxyle libre ou sous forme d'ester, d'anhydride mixte, d'amide ou d'hydrazide, -azido, -thiocyano ou leurs précurseurs, si nécessaire en présence d'un agent de couplage, et de le soumettre à une hydrogénation catalytique ou à un autre processus de déprotection de façon à obtenir le dérivé de formule générale XI (HO)2 P-0-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-NH-(CH2)p-CH-(CH2)q-0-(CO)r(CH2)s-W I I
O NH NH (XI)
I I R! R2
dans laquelle les substituants W, R-i, R2, m, n, p, q, r, s ont les significations fournies antérieurement.
11. Procédé d'obtention des phosphopseudodipeptides de formule générale XII
X-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-0-(CH2)q-CH-(CH2)p-Z (XII)
I I
NHR-, NHR2
dans laquelle R-, et R2 représentent chacun un groupe acyle dérivé d'un acide carboxylique ayant de 2 à 24 atomes de carbone, saturé ou insaturé, linéaire ou ramifié, non-substitué ou portant un ou plusieurs substituants choisis dans le groupe formé de hydroxyle, alkyle, aikoxy, acyloxy, amino, acylamiho, acylthio et (alkyl en C-, - C-24) thio les descripteurs m, p et q prennent une valeur allant de 1 à 10 le descripteur n prend une valeur allant de 0 à 10 dans laquelle X et Z représentent chacun un groupement acide ou un auxiliaire fonctionalisé qui consiste en ce qu'on bloque les fonctions amine en position (q+1) et en ω d'un acide diaminé de formule H2N(CH2)pCHNH2(CH2)q-ιCOOH par des réactifs de blocage labiles par acidolyse et hydrogénolyse, respectivement, soumet la fonction carboxylique restée libre à l'action d'un agent réducteur pour former l'alcool correspondant, libère la fonction amine en (q+1) que l'on acyle à l'aide d'un dérivé fonctionnel d'un acide carboxylique de formule R2OH dans laquelle R2 est défini comme précédemment, libère la fonction amine terminale par hydrogénolyse puis alkyle la fonction amine avec un triflate d'alkyle ω-fonctionnalisé pour obtenir l'amino alcool de formule générale XI 11 W-(CH2)sNH-(CH2)p-CH-(CH2)q-OH (XIII)
NHR2
dans laquelle R2 représente un groupe acyle dérivé d'acide carboxylique ayant de 2 à 24 atomes de carbone, saturé ou non-saturé, non substitué ou portant un ou plusieurs substituants définis comme ci-dessus, p et q représentent un nombre entier variant de 1 à 10 le descripteur s variant de 1 à 10, et de préférence entre 2 et 7 que l'on condense en présence d'un agent de condensation dans un solvant inerte avec un dérivé d'acide aminé ω-hydroxylé de formule générale VI
X-(CH2)m-CH-(CH2)n-COOH (VI)
I
Figure imgf000094_0001
dans laquelle Ri est un groupe acyle dérivé d'un acide carboxylique ayant de 2 à 24 atomes de carbone, saturé ou non-saturé, non substitué ou portant un ou plusieurs substituants m est un nombre entier variant de 1 à 10 n est un nombre entier variant de 0 à 10 et X est un groupe dialkyloxy- ou diaryloxy-phosphoryloxy de formule (RO)2 P-0
O pour former le pseudodipeptide de formule générale XIV
(RO)2PO-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-0-(CH2)q-CH-(CH2)p-NH-(CH2)sW (XIV) , I I O NHR! NHR2
dans laquelle les substituants Ri, R2 et les descripteurs m, n, p, q et s sont définis comme précédemment, et R est un radical labile par hydrogénolyse, puis le soumettre à une hydrogénation catalytique ou à un autre processus de déprotection de façon à obtenir le dérivé de formule générale XV
W étant choisi de préférence parmi les groupements, -formyle, -acétyle, -cyano, - halogéno, -bromo ou iodoacétamido, -acylamido, -diacylimido, -acyloxy, -vinyle, - ethynyle, -carboxyle libre ou sous forme d'ester, d'anhydride mixte, d'amide ou d'hydrazide, -azido, -thiocyano ou leurs précurseurs.
(HO)2 P-0-(CH2)m-CH-(CH2)nCO-0-(CH2)q-CH-(CH2)p-NH-(CH2)s-W I I (xv)
O NH Ri NHR2
dans laquelle les substituants W, R1 τ R2, m, n, p, q, r, et s ont les significations fournies antérieurement.
12. Procédé d'obtention des carboxypseudodipeptides de formule générale IV
X-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-NH-(CH2)p-CH-(CH2)q-Z (IV)
I I
NH^ NHR2
dans laquelle Ri et R2 représentent chacun un groupe acyle dérivé d'un acide carboxylique ayant de 2 à 24 atomes de carbone, saturé ou insaturé, linéaire ou ramifié, non-substitué ou portant un ou plusieurs substituants choisis dans le groupe formé de hydroxyle, alkyle, aikoxy, acyloxy, amino, acylamino, acylthio et
(alkyl en CrC24) thio les descripteurs m, p et q prennent une valeur allant de 1 à 10 le descripteur n prend une valeur allant de 0 à 10 dans laquelle X et Z représentent chacun un groupement acide ou un auxiliaire fonctionnalisé qui consiste en ce qu'on bloque les fonctions amine en position (q+1) et en ω d'un acide diaminé de formule H2N(CH2)pCHNH2(CH2)q-ιCOOH par des réactifs de blocage labiles par acidolyse et hydrogénolyse, respectivement, soumet la fonction carboxylique restée libre à l'action d'un agent réducteur pour former l'alcool correspondant, libère la fonction amine en (q+1) que l'on acyle à l'aide d'un dérivé fonctionnel d'un acide carboxylique de formule R2OH dans laquelle R2 est défini comme précédemment, puis libère la fonction amine terminale par hydrogénolyse pour obtenir l'amino alcool de formule générale IX
H2N-(CH2)p-CH-(CH2)q-OH (IX)
I NHR2
dans laquelle R2 représente un groupe acyle dérivé d'acide carboxylique ayant de 2 à 24 atomes de carbone, saturé ou non-saturé, non substitué ou portant un ou plusieurs substituants définis comme ci-dessus, P et q représentent un nombre entier variant de 1 à 10 que l'on condense en présence d'un agent de condensation peptidique dans un solvant inerte avec un dérivé fonctionnel d'ω-carboxy amino acide de formule générale VI
X-(CH2)m-CH-(CH2)n-COOH (VI)
I
NHR
dans laquelle Ri est un groupe acyle dérivé d'un acide carboxylique ayant de 2 à 24 atomes de carbone, saturé ou non-saturé, non substitué ou portant un ou plusieurs substituants m est un nombre entier variant de 1 à 10 n est un nombre entier variant de 0 à 10 et X est un radical RO-CO- pour former le pseudodipeptide de formule générale XVI RO-CO-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-NH-(CH2)P-CH-(CH2)q-OH (XVI)
I I
NHR-, NHR2
dans laquelle les substituants Ri, R2 et les descripteurs m, n, p et q sont définis comme précédemment, et R est un groupe labile par hydrogénolyse, dont on peut -si désiré- substituer, alkyler ou acyler la fonction alcool terminal libre par un réactif de substitution, d'alkylation ou d'acylation de formule générale
VIII,
A-(CO)r-(CH2)s-W (VIII) dans laquelle A est un groupe partant, une fonction OH, SH ou NH2 le descripteur r est 1 ou 0 le descripteur s varie de 1 à 10, et de préférence de 2 à 6
W est choisi de préférence parmi les groupements, -formyle, -acétyle, -cyano, - halogéno, -amino, -bromo ou iodoacétamido, -acylamido, -diacylimido, - sulfhydryle, -alkylthio, -hydroxyle, -acyloxy, -vinyle, -ethynyle, -carboxyle libre ou sous forme d'ester, d'anhydride mixte, d'amide ou d'hydrazide, -azido, -thiocyano ou leurs précurseurs, si nécessaire en présence d'un agent de couplage, et de le soumettre à une hydrogénation catalytique ou à un autre processus de déprotection de façon à obtenir le dérivé de formule générale XVII
HO-CO-(CH2)m-CH-(CH2)nCO-NH-(CH2)p-CH-(CH2)q-0-(CO)r-(CH2)s-W
I I
NH NH (XVII)
I I
Ri R2
dans laquelle les substituants W, Ri, R2, m, n, p, q, r, s ont les significations fournies antérieurement.
13. Les énantiomères et les diastéréoisomères des composés de formule générale I, IV ou XII selon la revendication 1.
14. Un mode d'exécution du procédé selon la revendication 9, dans lequel le blocage de la fonction amine en ω sur la chaîne d'un dérivé d'ornithine est effectué par N-benzyloxycarbonylation, après réaction initiale de la fonction acide avec un sel de cuivre, en milieu alcalin, réaction de ce carboxylate de cuivre avec du chloroformiate de benzyle et libération de la fonction carboxylique par chélation du cuivre en milieu acide, pour obtenir le dérivé N-benzyloxycarbonylé.
15. Un mode d'exécution du procédé selon la revendication 9, dans lequel la réduction de la fonction carboxylique libre est effectuée en utilisant, le complexe borane-sulfure de diméthyle ou en faisant réagir le dérivé carboxylique avec un chloroformiate d'alkyle pour former un anhydride mixte que l'on réduit ensuite au moyen d'un borohydrure de métal alcalin ou alcalinoterreux, pour obtenir le dérivé hydroxyle correspondant ayant une fonction alcool primaire.
16. Un mode d'exécution du procédé selon la revendication 9, dans lequel l'élimination du groupe benzyloxy méthyle est effectuée par hydrogénolyse dans un solvant hydroxylique contenant de la triéthylamine.
17. Un mode d'exécution du procédé selon la revendication 9, dans lequel l'aminé libérée est couplée avec l'acide α-acylamino ω-phosphorylé carboxylique en présence d'IDQ ou d'un autre réactif de couplage peptidique poμr donner un pseudodipeptide phosphorylé protégé.
18. Un mode d'exécution du procédé selon la revendication 9, dans lequel l'acide α- acylamino ω-phosphorylé carboxylique est acylé à l'oxygène avec un acide ω- fonctionnalisé en présence d'EDCI ou un autre agent d'estérification en un ester alcénylé.
19. Un mode d'exécution du procédé selon la revendication 9, dans lequel la fonction alcenyle de l'ester alcénylé est soumis à une réaction de dihydroxylation en un diol vicinal que l'on soumet à une oxydation périodique pour obtenir une fonction aldéhyde.
20. Un mode d'exécution du procédé selon la revendication 9, dans lequel l'acide α- acylamino ω-phosphorylé carboxylique est acylé à l'oxygène avec un acide ω- amino-alkanoique.
21. Un mode d'exécution du procédé selon la revendication 9, dans lequel une réaction de déprotection complète par hydrogénolyse en présence de catalyseurs appropriés fourni un pseudodipeptide portant un auxiliaire aminoalkanoyle.
22. Un mode d'exécution du procédé selon la revendication 9, dans lequel le partenaire acide de la réaction de couplage est un dérivé d'acide aspartique ou d'acide glutamique obtenu par acylation de la fonction amine de l'ester β-benzylique de l'acide aminé par un dérivé d'acide gras en présence d'un agent d'acylation pour obtenir un ester β-benzylique N-acyl aspartique ou glutamique.
23. Un mode d'exécution du procédé selon la revendication 9, dans lequel le dérivé N-acylé est couplé à un amino alcool portant une amine secondaire puis le pseudodipeptide ainsi obtenu est soumis à une réaction d'hydrogénolyse en présence d'un catalyseur pour fournir le pseudodipeptide portant une fonction carboxylique.
24. Un mode d'exécution du procédé selon la revendication 9, dans lequel la fonction hydroxyle du pseudodipeptide est acylée à l'aide d'un acide ω-fonctionnalisé par un groupe alcénylé et on soumet le groupe alcénylé aux réactions de dihydroxylation puis de déprotection et d'oxydation périodique.
25. Un mode d'exécution du procédé selon la revendication 9, dans lequel la fonction hydroxyle du pseudodipeptide est acylée à l'aide d'un acide ω-aminoalkanoique et on soumet le composé aux réactions de déprotection.
26. Un mode d'exécution du procédé selon la revendication 9, dans lequel l'amino alcool obtenu par réduction de l'ornithine ou de la lysine est alkyle par un triflate d'ω-alcényle que l'on couple avec un acide α-acylaminé ώ-phosphorylé carboxylique en présence d'un agent d'acylation comme l'EDCI, pμis soumet le groupe alcénylé à une réaction de dihydroxylation en présence ; de tétroxyde d'osmium, élimine les groupes protecteurs, et oxyde la fonction diol vicinal par le périodate de sodium pour obtenir un composé à fonction aldéhyde.
27. Un mode d'exécution du procédé selon la revendication 9 dans lequel on soumet un dérivé N-protégé de la serine à une O-alkylation, on élimine le groupe protecteur de la fonction amine par acidolyse, on acyle à nouveau la fonction amine avec un dérivé d'acide gras 3-hydroxylé en présence d'un agent d'acylation pour obtenir un dérivé N-acylé O-alkylé de la serine que l'on couple avec un aminoalcool en présence d'un agent de couplage peptidique puis acyle la fonction OH libre avec un acide alkanoïque ω-fonctionnalisé.
28. Un mode d'exécution du procédé selon la revendication 9 dans lequel l'acide aminé de départ est la cystéine ou l'homocystéine que l'on alkyle par le bromoacétate de p-methoxybenzyle puis acyle à l'azote avec un dérivé d'acide gras 3-hydroxylé, couple le dérivé S-alkylé et N-acylé ainsi obtenu avec le
5-amino 2-[3-hydroxytetradecanoylamino]pentan-1-ol en présence d'un agent de couplage peptidique pour obtenir un produit de condensation dont on acyle la fonction alcool primaire libre par un acide alcanoïque ω-fonctionnalisé, et si désiré soumet le produit en résultant à une réaction de déprotection.
29. Un mode d'exécution du procédé selon la revendication 9 dans lequel on soumet un dérivé p-méthoxybenzyloxycarbonylé de la serine à une O-alkylation à l'aide du méthylène malonate de dibenzyle en milieu alcalin, libère la fonction amine par traitement acide puis acyle la fonction amine libérée avec un acide gras 3-hydroxylé en présence d'un agent d'acylation, puis couple le dérivé N-acylé
O-alkylé ainsi obtenu avec un amino alcool en présence d'un agent de couplage peptidique pour former un pseudodipeptide que l'on acyle ensuite sur la fonction OH libre avec un acide alkanoïque ω-fonctionnalisé par un radical alcénylé ou aminé, soumet le dérivé alcénylé à une réaction de dihydroxylation puis de déprotection par hydrogénolyse puis à une oxydation périodique pour obtenir un dérivé portant un bras auxiliaire oxoalcanoïque et un groupe malonylé.
30. Un mode d'exécution du procédé selon la revendication 9 dans lequel en partant de l'ester benzylique de l'homoserine O-phosphorylée, on procède à une N-acylation avec l'acide 3-benzyloxytétradécanoïque, soumet l'ester de benzyle à une hydrogénolyse sélective, soumet le dérivé résultant à une N-acylation par l'acide 3-dodécanoyloxytétradécanoïque en présence d'un agent de couplage et libère la fonction ω-aminée par hydrogénolyse sélective, couple cette amine avec un dérivé N-3-benzyloxytétradécanoyl O-diphényloxyphosphoryle de l'homoserine en présence d'un agent de couplage peptidique pour obtenir un pseudodipeptide que l'on acyle avec un acide alkanoïque ω-fonctionnalisé par un alcénylé ou un amino, en présence d'une carbodiimide et dans le cas d'un dérivé alcénylé soumet celui-ci aux réactions de dihydroxylation puis de déprotection par hydrogénolyse en présence d'un catalyseur et d'oxydation périodique, pour conduire à un pseudodipeptide portant un bras auxiliaire comportant une fonction aldéhyde.
31. A titre de produits nouveaux nécessaires pour la réalisation des composés de formule générale I selon la revendication 1 , les composés de formule IV
X-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-NH-(CH2)p-CH-(CH2)q-Z (IV)
I I
Figure imgf000101_0001
dans laquelle Ri et R2 représentent chacun un groupe acyle dérivé d'un acide carboxylique ayant de 2 à 24 atomes de carbone, saturé ou insaturé, linéaire ou ramifié, non-substitué ou portant un ou plusieurs substituants choisis parmi un hydroxyle, un alkyle, un aikoxy, un acyloxy, un amino, un acylamino, un acylthio et un (alkyl en Ci - C24) thio les descripteurs m, p et q prennent une valeur allant de 1 à 10 le descripteur n prend une valeur allant de 0 à 10 dans laquelle X et Z représentent chacun un groupement acide ou un bras espaceur fonctionalisé ;
- les composés de formule générale XVI :
R-CO-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-NH-(CH2)p-CH-(CH2)q-OH (XVI)
I I
Figure imgf000102_0001
dans laquelle les substituants Ri, R2 et les descripteurs m, n, p et q sont définis comme précédemment, et R est un groupe labile par hydrogénolyse
- et les composés de formule générale XVII
HO-CO-(CH2)m-CH-(CH2)n-CO-NH-(CH2)p-CH-(CH2)q-0-(CO)r-(CH2)s-W
I I NH NH (XVII)
I I
Figure imgf000102_0002
dans laquelle A est de l'oxygène et les substituants W, Ri, R2, m, n, p, q, r, s ont les significations fournies antérieurement ceux-ci étant sous forme énantiomérique pure ou sous forme de mélanges de stéréoisomères.
32. Les compositions pharmaceutiques renfermant à titre de principe actif au moins un composé de formule générale I selon la revendication 1 , sous forme neutre ou chargée, en association ou en mélange avec un excipient ou un véhicule inerte, non toxique, pharmaceutiquement acceptable.
33. Les compositions pharmaceutiques selon la revendication 32, renfermant à titre de principe actif au moins un sel d'un composé de formule générale I, avec une base minérale ou organique, thérapeutiquement compatible.
34. Les compositions pharmaceutiques selon la revendication 32, à base d'un composé de formule générale I, sous forme énantiomériquement pure ou sous forme de mélange de stéréoisomères, en association ou en mélange avec un excipient ou un véhicule pharmaceutique.
35. Les composés selon la revendication 1, greffés sur un antigène pour moduler la réponse immunitaire, et les compositions pharmaceutiques qui renferment de tels conjugués.
36. Les composés selon la revendication 1, greffés sur un composé pharmacophore pour en améliorer l'action thérapeutique et/ou son ciblage, et les compositions pharmaceutiques renfermant de tels composés.
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