SK287073B6 - N-Acyldipeptidový derivát, spôsob jeho prípravy a farmaceutický prostriedok, ktorý ho obsahuje - Google Patents
N-Acyldipeptidový derivát, spôsob jeho prípravy a farmaceutický prostriedok, ktorý ho obsahuje Download PDFInfo
- Publication number
- SK287073B6 SK287073B6 SK1887-2000A SK18872000A SK287073B6 SK 287073 B6 SK287073 B6 SK 287073B6 SK 18872000 A SK18872000 A SK 18872000A SK 287073 B6 SK287073 B6 SK 287073B6
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- cells
- antigen
- adjuvant
- solution
- minutes
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 30
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 14
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title description 7
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 78
- -1 3-dodecanoyloxytetradecanoylamino Chemical group 0.000 claims description 36
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 20
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 19
- 150000007529 inorganic bases Chemical class 0.000 claims description 14
- 150000007530 organic bases Chemical class 0.000 claims description 13
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 13
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 claims description 11
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 claims description 11
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 11
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims description 8
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 claims description 8
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 7
- 125000001476 phosphono group Chemical group [H]OP(*)(=O)O[H] 0.000 claims description 7
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 claims description 7
- 125000004442 acylamino group Chemical group 0.000 claims description 6
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 claims description 6
- 125000004423 acyloxy group Chemical group 0.000 claims description 4
- 125000005035 acylthio group Chemical group 0.000 claims description 4
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 claims description 4
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 4
- 125000004414 alkyl thio group Chemical group 0.000 claims description 4
- AWQMQPGIMRYOTA-UHFFFAOYSA-N C(CCCCCCCCCCC)(=O)OC(CC(=O)NC(CCO)C(NCCCC(CO)NC(CC(CCCCCCCCCCC)O)=O)=O)CCCCCCCCCCC.P(=O)(O)(O)O Chemical compound C(CCCCCCCCCCC)(=O)OC(CC(=O)NC(CCO)C(NCCCC(CO)NC(CC(CCCCCCCCCCC)O)=O)=O)CCCCCCCCCCC.P(=O)(O)(O)O AWQMQPGIMRYOTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- ZHAZEUCOQTWNRV-UHFFFAOYSA-N OC(CC(=O)NC(CCO)C(NCCCC(CO)NC(CC(CCCCCCCCCCC)OC(CCCCCCCCCCC)=O)=O)=O)CCCCCCCCCCC.P(=O)(O)(O)O Chemical compound OC(CC(=O)NC(CCO)C(NCCCC(CO)NC(CC(CCCCCCCCCCC)OC(CCCCCCCCCCC)=O)=O)=O)CCCCCCCCCCC.P(=O)(O)(O)O ZHAZEUCOQTWNRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- YKNRGTPXYVUFDH-UHFFFAOYSA-N [1-[[1-hydroxy-5-[[4-hydroxy-2-(3-hydroxytetradecanoylamino)butanoyl]amino]pentan-2-yl]amino]-1-oxotetradecan-3-yl] dodecanoate Chemical compound CCCCCCCCCCCC(O)CC(=O)NC(CCO)C(=O)NCCCC(CO)NC(=O)CC(CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCC YKNRGTPXYVUFDH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- DUVFGVANBUHUNU-UHFFFAOYSA-N [1-[[4-hydroxy-1-[[5-hydroxy-4-(3-hydroxytetradecanoylamino)pentyl]amino]-1-oxobutan-2-yl]amino]-1-oxotetradecan-3-yl] dodecanoate Chemical class CCCCCCCCCCCC(O)CC(=O)NC(CO)CCCNC(=O)C(CCO)NC(=O)CC(CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCC DUVFGVANBUHUNU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 150000002009 diols Chemical class 0.000 claims 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 36
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 29
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 abstract description 7
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 abstract description 4
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 abstract description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 abstract description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 abstract description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 114
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 92
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 88
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 85
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 85
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 85
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 80
- 239000000047 product Substances 0.000 description 54
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 46
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 45
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 44
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 43
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 42
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 42
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 42
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 37
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 35
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 35
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 34
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 33
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 33
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 33
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 31
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 31
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 29
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 29
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 28
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 28
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 26
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 25
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 24
- 230000004044 response Effects 0.000 description 24
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 24
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 23
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M sodium hydroxide Inorganic materials [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 23
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 22
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 22
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 22
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 21
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 21
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 19
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 19
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 19
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 19
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 17
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 17
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 16
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 101001095863 Enterobacteria phage T4 RNA ligase 1 Proteins 0.000 description 16
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 16
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 16
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 16
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 16
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 16
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 16
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 16
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 16
- MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N Nitric oxide Chemical compound O=[N] MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 15
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 14
- KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N Palladium Chemical compound [Pd] KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 14
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 14
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 13
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 13
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 13
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 13
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- SJRJJKPEHAURKC-UHFFFAOYSA-N N-Methylmorpholine Chemical compound CN1CCOCC1 SJRJJKPEHAURKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 12
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 12
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 12
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 12
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 12
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 12
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 12
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 12
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 11
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 11
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 11
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 description 11
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 11
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 11
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 11
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 11
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 11
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 11
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 10
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 10
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 210000001132 alveolar macrophage Anatomy 0.000 description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 10
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 10
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 10
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 10
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 10
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 9
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 9
- 238000001061 Dunnett's test Methods 0.000 description 9
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 9
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 9
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 9
- 238000007327 hydrogenolysis reaction Methods 0.000 description 9
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 9
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000012044 organic layer Substances 0.000 description 9
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 9
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 8
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 8
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 8
- 238000003818 flash chromatography Methods 0.000 description 8
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 8
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 8
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 8
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 8
- 238000001644 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy Methods 0.000 description 7
- YOETUEMZNOLGDB-UHFFFAOYSA-N 2-methylpropyl carbonochloridate Chemical compound CC(C)COC(Cl)=O YOETUEMZNOLGDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000002585 base Substances 0.000 description 7
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 7
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 7
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 7
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 7
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 7
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 7
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 7
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 7
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 7
- 238000003114 enzyme-linked immunosorbent spot assay Methods 0.000 description 7
- ARRNBPCNZJXHRJ-UHFFFAOYSA-M hydron;tetrabutylazanium;phosphate Chemical compound OP(O)([O-])=O.CCCC[N+](CCCC)(CCCC)CCCC ARRNBPCNZJXHRJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 7
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 7
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 6
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 6
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 6
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 6
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 6
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 6
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 6
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 description 6
- 230000009696 proliferative response Effects 0.000 description 6
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 6
- 241000894007 species Species 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 6
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 6
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229910000013 Ammonium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 5
- 238000011749 CBA mouse Methods 0.000 description 5
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 description 5
- 102100035793 CD83 antigen Human genes 0.000 description 5
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 5
- 101000946856 Homo sapiens CD83 antigen Proteins 0.000 description 5
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 description 5
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 5
- 241000222734 Leishmania mexicana Species 0.000 description 5
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 5
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 description 5
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 description 5
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 5
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 5
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 description 5
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 5
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 description 5
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 5
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 5
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 5
- 238000001460 carbon-13 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 5
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 5
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 5
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 5
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- MFPWEWYKQYMWRO-UHFFFAOYSA-N tert-butyl carboxy carbonate Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)OC(O)=O MFPWEWYKQYMWRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 5
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N L-homoserine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- 206010061269 Malignant peritoneal neoplasm Diseases 0.000 description 4
- AMQJEAYHLZJPGS-UHFFFAOYSA-N N-Pentanol Chemical compound CCCCCO AMQJEAYHLZJPGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 4
- 102000008299 Nitric Oxide Synthase Human genes 0.000 description 4
- 108010021487 Nitric Oxide Synthase Proteins 0.000 description 4
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical group OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 108010046334 Urease Proteins 0.000 description 4
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 229960005261 aspartic acid Drugs 0.000 description 4
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 4
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 4
- 238000009903 catalytic hydrogenation reaction Methods 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 4
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 4
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 4
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 4
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 229910000510 noble metal Inorganic materials 0.000 description 4
- 201000002524 peritoneal carcinoma Diseases 0.000 description 4
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 4
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 4
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 4
- 238000000425 proton nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 4
- IKRFTYQBIVDIMM-XMMPIXPASA-N (3r)-3-dodecanoyloxytetradecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCC[C@H](CC(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCC IKRFTYQBIVDIMM-XMMPIXPASA-N 0.000 description 3
- NDCDVTWILZGAIG-HXUWFJFHSA-N (3r)-3-phenylmethoxytetradecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCC[C@H](CC(O)=O)OCC1=CC=CC=C1 NDCDVTWILZGAIG-HXUWFJFHSA-N 0.000 description 3
- WOLIEXWPNGLLGF-SWGHGFEUSA-N 4-diphenoxyphosphoryloxy-2-[[(3r)-3-dodecanoyloxytetradecanoyl]amino]butanoic acid Chemical compound C=1C=CC=CC=1OP(=O)(OCCC(NC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCC)C(O)=O)OC1=CC=CC=C1 WOLIEXWPNGLLGF-SWGHGFEUSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000011603 BDIX rat Methods 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 3
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 3
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 3
- RHGKLRLOHDJJDR-BYPYZUCNSA-N L-citrulline Chemical compound NC(=O)NCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O RHGKLRLOHDJJDR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- 241000222722 Leishmania <genus> Species 0.000 description 3
- WMFOQBRAJBCJND-UHFFFAOYSA-M Lithium hydroxide Chemical compound [Li+].[OH-] WMFOQBRAJBCJND-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 102000011779 Nitric Oxide Synthase Type II Human genes 0.000 description 3
- 108010076864 Nitric Oxide Synthase Type II Proteins 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 108700020962 Peroxidase Proteins 0.000 description 3
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 3
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 3
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 3
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 3
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 3
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 3
- GCFJYMSKDBZKLP-ROJLCIKYSA-N benzyl n-[(4r)-5-hydroxy-4-[[(3r)-3-phenylmethoxytetradecanoyl]amino]pentyl]carbamate Chemical compound C([C@H](CO)NC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OCC=1C=CC=CC=1)CCNC(=O)OCC1=CC=CC=C1 GCFJYMSKDBZKLP-ROJLCIKYSA-N 0.000 description 3
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 244000309464 bull Species 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 3
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 3
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 3
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 3
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- 230000007689 endotoxicity Effects 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 3
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 3
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 3
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 3
- 229940030980 inova Drugs 0.000 description 3
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 3
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 3
- GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N lipid A (E. coli) Chemical class O1[C@H](CO)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCC)[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](OP(O)(O)=O)O1 GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N 0.000 description 3
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 3
- 229940087646 methanolamine Drugs 0.000 description 3
- MUMZUERVLWJKNR-UHFFFAOYSA-N oxoplatinum Chemical compound [Pt]=O MUMZUERVLWJKNR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 3
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 3
- 229910003446 platinum oxide Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 3
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 3
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 3
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 125000005931 tert-butyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(OC(*)=O)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- IGPABHSEKYCFIS-JWQCQUIFSA-N (3r)-n-[(2r)-5-amino-1-hydroxypentan-2-yl]-3-phenylmethoxytetradecanamide Chemical compound CCCCCCCCCCC[C@H](CC(=O)N[C@@H](CO)CCCN)OCC1=CC=CC=C1 IGPABHSEKYCFIS-JWQCQUIFSA-N 0.000 description 2
- UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N -2-Amino-4-hydroxybutanoic acid Natural products OC(=O)C(N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-OFKYTIFKSA-N 1-[(2r,4s,5r)-4-hydroxy-5-(tritiooxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO[3H])O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(C)=C1 IQFYYKKMVGJFEH-OFKYTIFKSA-N 0.000 description 2
- YSGCCSOQILPWFS-UHFFFAOYSA-N 2-methylpropyl 1-(2-methylpropoxy)-2h-quinoline-2-carboxylate Chemical compound C1=CC=C2N(OCC(C)C)C(C(=O)OCC(C)C)C=CC2=C1 YSGCCSOQILPWFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NHQDETIJWKXCTC-UHFFFAOYSA-N 3-chloroperbenzoic acid Chemical compound OOC(=O)C1=CC=CC(Cl)=C1 NHQDETIJWKXCTC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 4-Dimethylaminopyridine Chemical compound CN(C)C1=CC=NC=C1 VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000749837 Bos taurus Leukocyte cell-derived chemotaxin 1 Proteins 0.000 description 2
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N Butyric acid Chemical compound CCCC(O)=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000208199 Buxus sempervirens Species 0.000 description 2
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 description 2
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 description 2
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 2
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 2
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N Methylamine Chemical compound NC BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- RRDJTUCTAYHWPL-LGZXEJHPSA-N [(3R)-1-[[1-[[4-[[(3R)-3-hydroxytetradecanoyl]amino]-5-phosphonooxypentyl]amino]-1-oxo-4-phosphonooxybutan-2-yl]amino]-1-oxotetradecan-3-yl] dodecanoate Chemical compound C(CCCCCCCCCCC)(=O)O[C@@H](CC(=O)NC(C(=O)NCCCC(COP(=O)(O)O)NC(C[C@@H](CCCCCCCCCCC)O)=O)CCOP(=O)(O)O)CCCCCCCCCCC RRDJTUCTAYHWPL-LGZXEJHPSA-N 0.000 description 2
- KICIOUPMZRYVJD-FQLXRVMXSA-N [(3r)-1-[[(2r)-5-amino-1-hydroxypentan-2-yl]amino]-1-oxotetradecan-3-yl] dodecanoate Chemical compound CCCCCCCCCCC[C@H](CC(=O)N[C@@H](CO)CCCN)OC(=O)CCCCCCCCCCC KICIOUPMZRYVJD-FQLXRVMXSA-N 0.000 description 2
- AJXBEYHRMVEFPX-OFHFHILWSA-N [(3r)-1-[[4-diphenoxyphosphoryloxy-1-[[5-hydroxy-4-[[(3r)-3-hydroxytetradecanoyl]amino]pentyl]amino]-1-oxobutan-2-yl]amino]-1-oxotetradecan-3-yl] dodecanoate Chemical compound C=1C=CC=CC=1OP(=O)(OCCC(C(=O)NCCCC(CO)NC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)NC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCC)OC1=CC=CC=C1 AJXBEYHRMVEFPX-OFHFHILWSA-N 0.000 description 2
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 2
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 2
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 2
- 230000000240 adjuvant effect Effects 0.000 description 2
- QYPPJABKJHAVHS-UHFFFAOYSA-N agmatine Chemical compound NCCCCNC(N)=N QYPPJABKJHAVHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000003158 alcohol group Chemical group 0.000 description 2
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000001340 alkali metals Chemical class 0.000 description 2
- 229910052784 alkaline earth metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000001342 alkaline earth metals Chemical class 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 2
- 229960003121 arginine Drugs 0.000 description 2
- TZCUQQLCPJSERZ-UHFFFAOYSA-N benzyl 2-amino-4-diphenoxyphosphoryloxybutanoate Chemical compound C=1C=CC=CC=1COC(=O)C(N)CCOP(=O)(OC=1C=CC=CC=1)OC1=CC=CC=C1 TZCUQQLCPJSERZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HSDAJNMJOMSNEV-UHFFFAOYSA-N benzyl chloroformate Chemical compound ClC(=O)OCC1=CC=CC=C1 HSDAJNMJOMSNEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IQUWMULAWNLVIB-OAHLLOKOSA-N benzyl n-[(4r)-5-hydroxy-4-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]pentyl]carbamate Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)N[C@@H](CO)CCCNC(=O)OCC1=CC=CC=C1 IQUWMULAWNLVIB-OAHLLOKOSA-N 0.000 description 2
- WGQKYBSKWIADBV-UHFFFAOYSA-N benzylamine Chemical compound NCC1=CC=CC=C1 WGQKYBSKWIADBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 229960002173 citrulline Drugs 0.000 description 2
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 2
- 150000001879 copper Chemical class 0.000 description 2
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 2
- 239000007822 coupling agent Substances 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 2
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 description 2
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 2
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 239000012442 inert solvent Substances 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 230000017307 interleukin-4 production Effects 0.000 description 2
- 238000010829 isocratic elution Methods 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 2
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 210000005210 lymphoid organ Anatomy 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 150000004767 nitrides Chemical class 0.000 description 2
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 2
- 238000005897 peptide coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 2
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 2
- OJMIONKXNSYLSR-UHFFFAOYSA-N phosphorous acid Chemical compound OP(O)O OJMIONKXNSYLSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000002743 phosphorus functional group Chemical group 0.000 description 2
- 238000001394 phosphorus-31 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 description 2
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 2
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 2
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 description 2
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M potassium hydroxide Inorganic materials [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 150000003138 primary alcohols Chemical group 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 2
- 150000003385 sodium Chemical class 0.000 description 2
- AKHNMLFCWUSKQB-UHFFFAOYSA-L sodium thiosulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=S AKHNMLFCWUSKQB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 235000019345 sodium thiosulphate Nutrition 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 2
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 2
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 2
- 210000002303 tibia Anatomy 0.000 description 2
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 2
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 2
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 2
- QYYCZJUFHDLLOJ-CQSZACIVSA-N (2r)-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]-5-(phenylmethoxycarbonylamino)pentanoic acid Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)N[C@@H](C(O)=O)CCCNC(=O)OCC1=CC=CC=C1 QYYCZJUFHDLLOJ-CQSZACIVSA-N 0.000 description 1
- UDEVJXJNDJLGBO-XMMPIXPASA-N (2r)-2-dodecanoyloxytetradecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCC[C@H](C(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCC UDEVJXJNDJLGBO-XMMPIXPASA-N 0.000 description 1
- LDDMACCNBZAMSG-BDVNFPICSA-N (2r,3r,4s,5r)-3,4,5,6-tetrahydroxy-2-(methylamino)hexanal Chemical compound CN[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO LDDMACCNBZAMSG-BDVNFPICSA-N 0.000 description 1
- DIVNUTGTTIRPQA-UHFFFAOYSA-N (3,4-dimethoxyphenyl)methanamine Chemical compound COC1=CC=C(CN)C=C1OC DIVNUTGTTIRPQA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QEIFSLUFHRCVQL-UHFFFAOYSA-N (5-bromo-4-chloro-1h-indol-3-yl) hydrogen phosphate;(4-methylphenyl)azanium Chemical compound CC1=CC=C(N)C=C1.C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP(O)(=O)O)=CNC2=C1 QEIFSLUFHRCVQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ATRNZOYKSNPPBF-CYBMUJFWSA-N (R)-3-hydroxytetradecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCC[C@@H](O)CC(O)=O ATRNZOYKSNPPBF-CYBMUJFWSA-N 0.000 description 1
- SCYULBFZEHDVBN-UHFFFAOYSA-N 1,1-Dichloroethane Chemical compound CC(Cl)Cl SCYULBFZEHDVBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DIIIISSCIXVANO-UHFFFAOYSA-N 1,2-Dimethylhydrazine Chemical compound CNNC DIIIISSCIXVANO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WBVSERCLMQZOBK-UHFFFAOYSA-N 1-methylphenazine Chemical compound C1=CC=C2N=C3C(C)=CC=CC3=NC2=C1 WBVSERCLMQZOBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UCGPLXCYJOIXCO-UHFFFAOYSA-N 10-hydroxydecyl dihydrogen phosphate Chemical compound OCCCCCCCCCCOP(O)(O)=O UCGPLXCYJOIXCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RDQVRMLSWFDZJP-UHFFFAOYSA-N 10-phosphonooxydecyl dihydrogen phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OCCCCCCCCCCOP(O)(O)=O RDQVRMLSWFDZJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KJUGUADJHNHALS-UHFFFAOYSA-N 1H-tetrazole Chemical compound C=1N=NNN=1 KJUGUADJHNHALS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SXQWVGXLKTZECH-UHFFFAOYSA-N 2,2-diaminopentanoic acid Chemical class CCCC(N)(N)C(O)=O SXQWVGXLKTZECH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UHHATRNUKJGRBN-UHFFFAOYSA-N 2,5-diaminopentan-1-ol Chemical class NCCCC(N)CO UHHATRNUKJGRBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 2-amino-2-deoxy-D-glucopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 0.000 description 1
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GLVYLTSKTCWWJR-UHFFFAOYSA-N 2-carbonoperoxoylbenzoic acid Chemical compound OOC(=O)C1=CC=CC=C1C(O)=O GLVYLTSKTCWWJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LOEMDEDKAHXRTN-UHFFFAOYSA-N 2-nitrobenzenecarboperoxoic acid Chemical compound OOC(=O)C1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O LOEMDEDKAHXRTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 3-[3-[3,5-dihydroxy-6-methyl-4-(3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl)oxyoxan-2-yl]oxydecanoyloxy]decanoic acid;hydrate Chemical compound O.OC1C(OC(CC(=O)OC(CCCCCCC)CC(O)=O)CCCCCCC)OC(C)C(O)C1OC1C(O)C(O)C(O)C(C)O1 HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IKRFTYQBIVDIMM-UHFFFAOYSA-N 3-dodecanoyloxytetradecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCC(CC(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCC IKRFTYQBIVDIMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CWNPOQFCIIFQDM-UHFFFAOYSA-N 3-nitrobenzyl alcohol Chemical compound OCC1=CC=CC([N+]([O-])=O)=C1 CWNPOQFCIIFQDM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl Phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VYUWZHWCWZNWJC-IFDNYZKCSA-N 4-diphenoxyphosphoryloxy-2-[[(3r)-3-phenylmethoxytetradecanoyl]amino]butanoic acid Chemical compound C([C@@H](CCCCCCCCCCC)OCC=1C=CC=CC=1)C(=O)NC(C(O)=O)CCOP(=O)(OC=1C=CC=CC=1)OC1=CC=CC=C1 VYUWZHWCWZNWJC-IFDNYZKCSA-N 0.000 description 1
- PZEMWPDUXBZKJN-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxy-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]butanoic acid Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)NC(C(O)=O)CCO PZEMWPDUXBZKJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TYMLOMAKGOJONV-UHFFFAOYSA-N 4-nitroaniline Chemical compound NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 TYMLOMAKGOJONV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700031361 Brachyury Proteins 0.000 description 1
- HGLFTKPLWZSVLC-UHFFFAOYSA-N CC(C)(C)OC(=O)N(CC1=CC=CC=C1)C(CCO)C(=O)O Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)N(CC1=CC=CC=C1)C(CCO)C(=O)O HGLFTKPLWZSVLC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZHDQXTZTLWGMQX-UHFFFAOYSA-N CC(C)(C)OC(=O)ON(C(CCO)(CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)P(=O)(OC2=CC=CC=C2)OC3=CC=CC=C3 Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)ON(C(CCO)(CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)P(=O)(OC2=CC=CC=C2)OC3=CC=CC=C3 ZHDQXTZTLWGMQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- ATRNZOYKSNPPBF-UHFFFAOYSA-N D-beta-hydroxymyristic acid Natural products CCCCCCCCCCCC(O)CC(O)=O ATRNZOYKSNPPBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 238000011510 Elispot assay Methods 0.000 description 1
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 description 1
- 206010069767 H1N1 influenza Diseases 0.000 description 1
- AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N Hydroxylamine Chemical compound ON AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 206010023126 Jaundice Diseases 0.000 description 1
- QUOGESRFPZDMMT-UHFFFAOYSA-N L-Homoarginine Natural products OC(=O)C(N)CCCCNC(N)=N QUOGESRFPZDMMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 229930064664 L-arginine Natural products 0.000 description 1
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- QUOGESRFPZDMMT-YFKPBYRVSA-N L-homoarginine Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CCCCNC(N)=N QUOGESRFPZDMMT-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 238000011050 LAL assay Methods 0.000 description 1
- 108700041076 Leishmania glycoprotein gp63 Proteins 0.000 description 1
- 101100343567 Leishmania mexicana LMCPB gene Proteins 0.000 description 1
- 108700019799 Leishmania mexicana LmCPb Proteins 0.000 description 1
- 229940095083 Lymphocyte stimulant Drugs 0.000 description 1
- 102000007651 Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010046938 Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 1
- FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylacetamide Chemical compound CN(C)C(C)=O FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N N-Pteroyl-L-glutaminsaeure Natural products C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006181 N-acylation Effects 0.000 description 1
- RHGKLRLOHDJJDR-UHFFFAOYSA-N Ndelta-carbamoyl-DL-ornithine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=O RHGKLRLOHDJJDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100029438 Nitric oxide synthase, inducible Human genes 0.000 description 1
- 101710089543 Nitric oxide synthase, inducible Proteins 0.000 description 1
- IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M Nitrite anion Chemical compound [O-]N=O IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- QMGVPVSNSZLJIA-UHFFFAOYSA-N Nux Vomica Natural products C1C2C3C4N(C=5C6=CC=CC=5)C(=O)CC3OCC=C2CN2C1C46CC2 QMGVPVSNSZLJIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- SCKXCAADGDQQCS-UHFFFAOYSA-N Performic acid Chemical compound OOC=O SCKXCAADGDQQCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 241000224017 Plasmodium berghei Species 0.000 description 1
- 101150085390 RPM1 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000708948 Solva Species 0.000 description 1
- OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-M Superoxide Chemical compound [O-][O] OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010060804 Toll-Like Receptor 4 Proteins 0.000 description 1
- 102000008233 Toll-Like Receptor 4 Human genes 0.000 description 1
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-M Trifluoroacetate Chemical compound [O-]C(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 239000003875 Wang resin Substances 0.000 description 1
- 241000981595 Zoysia japonica Species 0.000 description 1
- KZGQEELTALTNQF-XWQMZJAGSA-N [(3R)-1-[[4-diphenoxyphosphoryloxy-4-[[(3R)-3-hydroxytetradecanoyl]amino]-1-oxo-1-(5-phosphonooxypentylamino)butan-2-yl]amino]-1-oxotetradecan-3-yl] dodecanoate Chemical compound OP(=O)(O)OCCCCCNC(C(CC(OP(=O)(OC1=CC=CC=C1)OC1=CC=CC=C1)NC(C[C@@H](CCCCCCCCCCC)O)=O)NC(C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(CCCCCCCCCCC)=O)=O)=O KZGQEELTALTNQF-XWQMZJAGSA-N 0.000 description 1
- ILFFIJKSQULGAJ-ODYCNIDGSA-N [(3r)-1-[(4-diphenoxyphosphoryloxy-1-oxo-1-phenylmethoxybutan-2-yl)amino]-1-oxotetradecan-3-yl] dodecanoate Chemical compound C=1C=CC=CC=1COC(=O)C(NC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCC)CCOP(=O)(OC=1C=CC=CC=1)OC1=CC=CC=C1 ILFFIJKSQULGAJ-ODYCNIDGSA-N 0.000 description 1
- RRDJTUCTAYHWPL-UHFFFAOYSA-N [1-[[1-[[4-(3-hydroxytetradecanoylamino)-5-phosphonooxypentyl]amino]-1-oxo-4-phosphonooxybutan-2-yl]amino]-1-oxotetradecan-3-yl] dodecanoate Chemical compound CCCCCCCCCCCC(O)CC(=O)NC(COP(O)(O)=O)CCCNC(=O)C(CCOP(O)(O)=O)NC(=O)CC(CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCC RRDJTUCTAYHWPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UKPMQOIXCQAAMQ-UHFFFAOYSA-N [1-[[5-[[2-(3-hydroxytetradecanoylamino)-4-phosphonooxybutanoyl]amino]-1-phosphonooxypentan-2-yl]amino]-1-oxotetradecan-3-yl] dodecanoate Chemical compound CCCCCCCCCCCC(O)CC(=O)NC(CCOP(O)(O)=O)C(=O)NCCCC(COP(O)(O)=O)NC(=O)CC(CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCC UKPMQOIXCQAAMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NERFNHBZJXXFGY-UHFFFAOYSA-N [4-[(4-methylphenyl)methoxy]phenyl]methanol Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1COC1=CC=C(CO)C=C1 NERFNHBZJXXFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000003862 amino acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 150000001414 amino alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 1
- 125000004097 arachidonyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])/C([H])=C([H])\C([H])([H])/C([H])=C([H])\C([H])([H])/C([H])=C([H])\C([H])([H])/C([H])=C([H])\C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000001124 arachidoyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 229940077388 benzenesulfonate Drugs 0.000 description 1
- SRSXLGNVWSONIS-UHFFFAOYSA-M benzenesulfonate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 SRSXLGNVWSONIS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- AGEZXYOZHKGVCM-UHFFFAOYSA-N benzyl bromide Chemical compound BrCC1=CC=CC=C1 AGEZXYOZHKGVCM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005574 benzylation reaction Methods 0.000 description 1
- 125000001584 benzyloxycarbonyl group Chemical group C(=O)(OCC1=CC=CC=C1)* 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactosamine Natural products NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- RRKTZKIUPZVBMF-IBTVXLQLSA-N brucine Chemical compound O([C@@H]1[C@H]([C@H]2C3)[C@@H]4N(C(C1)=O)C=1C=C(C(=CC=11)OC)OC)CC=C2CN2[C@@H]3[C@]41CC2 RRKTZKIUPZVBMF-IBTVXLQLSA-N 0.000 description 1
- RRKTZKIUPZVBMF-UHFFFAOYSA-N brucine Natural products C1=2C=C(OC)C(OC)=CC=2N(C(C2)=O)C3C(C4C5)C2OCC=C4CN2C5C31CC2 RRKTZKIUPZVBMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- TVFDJXOCXUVLDH-UHFFFAOYSA-N caesium atom Chemical class [Cs] TVFDJXOCXUVLDH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FJDQFPXHSGXQBY-UHFFFAOYSA-L caesium carbonate Chemical compound [Cs+].[Cs+].[O-]C([O-])=O FJDQFPXHSGXQBY-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000024 caesium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910001861 calcium hydroxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000011748 cell maturation Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- ITVPBBDAZKBMRP-UHFFFAOYSA-N chloro-dioxido-oxo-$l^{5}-phosphane;hydron Chemical compound OP(O)(Cl)=O ITVPBBDAZKBMRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 235000013477 citrulline Nutrition 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012230 colorless oil Substances 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- JZCCFEFSEZPSOG-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate pentahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.[Cu+2].[O-]S([O-])(=O)=O JZCCFEFSEZPSOG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- UOQACRNTVQWTFF-UHFFFAOYSA-N decane-1,10-dithiol Chemical compound SCCCCCCCCCCS UOQACRNTVQWTFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N diethanolamine Chemical compound OCCNCCO ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HPNMFZURTQLUMO-UHFFFAOYSA-N diethylamine Chemical compound CCNCC HPNMFZURTQLUMO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 1
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 1
- GIYJEMINTXWWNJ-UHFFFAOYSA-N dimethoxy-(2-methoxyphenyl)methanamine Chemical compound COC1=CC=CC=C1C(N)(OC)OC GIYJEMINTXWWNJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- KAKKHKRHCKCAGH-UHFFFAOYSA-L disodium;(4-nitrophenyl) phosphate;hexahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.[Na+].[Na+].[O-][N+](=O)C1=CC=C(OP([O-])([O-])=O)C=C1 KAKKHKRHCKCAGH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000000132 electrospray ionisation Methods 0.000 description 1
- 125000003989 eleostearoyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000002346 endotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 108010072542 endotoxin binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 229940083124 ganglion-blocking antiadrenergic secondary and tertiary amines Drugs 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 229960002442 glucosamine Drugs 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002743 glutamine Drugs 0.000 description 1
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 description 1
- 150000002337 glycosamines Chemical class 0.000 description 1
- 210000004013 groin Anatomy 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 description 1
- 238000003919 heteronuclear multiple bond coherence Methods 0.000 description 1
- 238000005570 heteronuclear single quantum coherence Methods 0.000 description 1
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007124 immune defense Effects 0.000 description 1
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000005040 ion trap Methods 0.000 description 1
- 229910052741 iridium Inorganic materials 0.000 description 1
- GKOZUEZYRPOHIO-UHFFFAOYSA-N iridium atom Chemical compound [Ir] GKOZUEZYRPOHIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000014413 iron hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- NCNCGGDMXMBVIA-UHFFFAOYSA-L iron(ii) hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[Fe+2] NCNCGGDMXMBVIA-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000001699 lower leg Anatomy 0.000 description 1
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910001862 magnesium hydroxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 108020004084 membrane receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 150000004706 metal oxides Chemical class 0.000 description 1
- GSYSFVSGPABNNL-UHFFFAOYSA-N methyl 2-dimethoxyphosphoryl-2-(phenylmethoxycarbonylamino)acetate Chemical group COC(=O)C(P(=O)(OC)OC)NC(=O)OCC1=CC=CC=C1 GSYSFVSGPABNNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JZMJDSHXVKJFKW-UHFFFAOYSA-M methyl sulfate(1-) Chemical compound COS([O-])(=O)=O JZMJDSHXVKJFKW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- RIWRFSMVIUAEBX-UHFFFAOYSA-N n-methyl-1-phenylmethanamine Chemical compound CNCC1=CC=CC=C1 RIWRFSMVIUAEBX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000242 pagocytic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052763 palladium Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000001312 palmitoyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 210000005164 penile vein Anatomy 0.000 description 1
- 239000012026 peptide coupling reagents Substances 0.000 description 1
- 210000004976 peripheral blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 201000002628 peritoneum cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 1
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 229940124531 pharmaceutical excipient Drugs 0.000 description 1
- UYWQUFXKFGHYNT-UHFFFAOYSA-N phenylmethyl ester of formic acid Natural products O=COCC1=CC=CC=C1 UYWQUFXKFGHYNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LFGREXWGYUGZLY-UHFFFAOYSA-N phosphoryl Chemical class [P]=O LFGREXWGYUGZLY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000865 phosphorylative effect Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002798 polar solvent Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 239000002510 pyrogen Substances 0.000 description 1
- 238000011046 pyrogen test Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012207 quantitative assay Methods 0.000 description 1
- 238000012113 quantitative test Methods 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 238000001953 recrystallisation Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 description 1
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 238000010183 spectrum analysis Methods 0.000 description 1
- 229940035637 spectrum-4 Drugs 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- UUCCCPNEFXQJEL-UHFFFAOYSA-L strontium dihydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[Sr+2] UUCCCPNEFXQJEL-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910001866 strontium hydroxide Inorganic materials 0.000 description 1
- FDDDEECHVMSUSB-UHFFFAOYSA-N sulfanilamide Chemical compound NC1=CC=C(S(N)(=O)=O)C=C1 FDDDEECHVMSUSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940124530 sulfonamide Drugs 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 201000010740 swine influenza Diseases 0.000 description 1
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 1
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 1
- MLGCXEBRWGEOQX-UHFFFAOYSA-N tetradifon Chemical compound C1=CC(Cl)=CC=C1S(=O)(=O)C1=CC(Cl)=C(Cl)C=C1Cl MLGCXEBRWGEOQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940033663 thimerosal Drugs 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- NQPDZGIKBAWPEJ-UHFFFAOYSA-N valeric acid Chemical compound CCCCC(O)=O NQPDZGIKBAWPEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C237/00—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups
- C07C237/02—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atoms of the carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton
- C07C237/04—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atoms of the carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated
- C07C237/06—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atoms of the carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having the nitrogen atoms of the carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C237/00—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups
- C07C237/02—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atoms of the carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton
- C07C237/22—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atoms of the carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton having nitrogen atoms of amino groups bound to the carbon skeleton of the acid part, further acylated
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C235/00—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms
- C07C235/02—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms having carbon atoms of carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms and singly-bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton
- C07C235/04—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms having carbon atoms of carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms and singly-bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated
- C07C235/10—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms having carbon atoms of carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms and singly-bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to an acyclic carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
- C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
- C07F9/02—Phosphorus compounds
- C07F9/06—Phosphorus compounds without P—C bonds
- C07F9/08—Esters of oxyacids of phosphorus
- C07F9/09—Esters of phosphoric acids
- C07F9/091—Esters of phosphoric acids with hydroxyalkyl compounds with further substituents on alkyl
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/02—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/06—Dipeptides
- C07K5/06191—Dipeptides containing heteroatoms different from O, S, or N
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Abstract
N-Acyldipeptidový derivát všeobecného vzorca (I), kde jednotlivé substituenty majú význam definovaný v nárokoch, má biologickú aktivitu, najmä imunomodulačné vlastnosti, a je použiteľný na zvýšenie imunity a na liečenie vírusových, parazitických, mikrobiálnych alebo plesňových chorôb ľudí a zvierat.
Description
Oblasť techniky
Vynález sa týka odboru chémie, osobitne oblasti lekárskej chémie. Je zameraný na N-acyldipeptidový derivát odvodený od hydroxylovaných aminokyselín, ktorých voľné funkčné aminoskupiny sa acylujú kyselinami. Vynálezom sú teda N-acyldipeptidové deriváty odvodené od hydroxylovaných aminokyselín, ktorých voľné funkčné aminoskupiny sú acylované mastnými kyselinami. Charakteristickou vlastnosťou takýchto zlúčenín sú biologické aktivity, najmä imunomodulácia väčšia ako pri známych zlúčeninách zo stavu techniky.
Doterajší stav techniky
Vynález sa zameriava na pseudopeptidy označované ako analógy lipidov A. Lipidy A sú glykolipidové molekulárne entity, ktoré tvoria lipidové zakončenie liposacharidu (LPS), pričom je LPS zakotvený v bunkovej membráne gram negatívnej baktérie. Týmto entitám sa priraďuje výrazná imunostimulačná aktivita LPS (Rietschel a kol., Curr. Top. Microbiol. Immunol., 1996, 216, str. 39, Zaehringer a kol. Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 1994, 50, str. 211).
Lipidy A a ich analógy majú zaujímavé biologické pôsobenie ako imunomodulačné a protirakovinové činidlá (Shiba and Kotani, Daiichi Seiyaku Co., patentový spis číslo JP 61 227 586 A. Hasegawa a kol. Toho Pharmaceutical Industries, európsky patentový spis číslo EP 224 260. Kodem,a a kol. Suntory Ltd., európsky patentový spis číslo EP 688 289), všeobecne sú však charakterizované vysokou endotoxicitou.
Derivát lipidu A menom OM-174 (de-O-acylovaný E.coli lipid A) má zvláštny význam pre svoju veľmi nízku toxicitu a výrazné pôsobenie ako imunomodulačné a protirakovinové činidlo a ako adjuvant (Davies, Bauer, Hirt, Schulťhess, Laboratories OM S.A., svetový patentový spis číslo WO 95 14026). Komplexná štruktúra lipidov A a ich toxicita stimulovala výskum syntetických analógov, ako napríklad hybridu O-acylovaných O-glykosalovaných aminokyselín (Achiwa a kol., Chem. Pharm. Bull. 1994, 42, str. 2526, 1997, 45, str. 312, 1997, 45, str. 1089).
N-Acylované pseudopeptidy podľa vynálezu vytvárajú novú triedu syntetických analógov lipidu A zbavených ich toxicity a majúcich výrazné imunomodulačné vlastnosti.
Oxid dusíka NO a reaktívne oxygény, ako je superoxidový anión, majú významnú úlohu pri regulácii imúnneho systému. Tieto aktivity sú široko opísané (Bogdan C., Natural Immunol., 2001,2. str. 970 až 916 a citovaná literatúra).
Oxid dusíka NO má rôzne modulačné pôsobenie na zápalovú a imúnnu reakciu.
V živočíšnom tkanive sa NO generuje NO-syntázami (NOS), ktoré oxidujú L-arginín na L-citrullín. Niektoré formy NOS sú známe vrátane indukovateľného NOS (iNOS alebo NOS II) obsiahnutého v makrofágách, monocytoch a iných typov buniek podieľajúcich sa na zápalových procesoch. Induktorom NOS je LPS.
Interakcia lipopolysacharidov (LPS) s TLR4 receptorovými spúšťadlami je kaskátou javov vedúcich k aktivácii NFkB faktora, ktorý je zodpovedný za transkripciu INOS enzýmu. Oxid dusíka NO, produkovaný imunologický alebo chemicky stimulovanými makrofágmi, predstavuje antimikrobálnu aktivitu pripisovanú vytváraniu peroxynitrilu (ONOO).
Okrem tejto úlohy je oxid dusíka NO mocným regulátorom imúnnej reakcie. Obzvlášť sa charakterizuje ako inhibítor expresie génov zahrnutých v bunkovej proliferácii a najmä buniek T subtypov Thl. Zdá sa tiež , že inhibuje sekréciu cytokýnu svojimi T lympocytmi pri zápaloch.
Všeobecne tieto problémy opísal Coleman J. W. (Intemational Immunopharmacology 2001, 2, str. 1397 až 1406). Ako ďalšia príslušná literatúra sa uvádza najmä: Wink (Curr. Top. Celí. Regúl. 1995, 34, str. 159 až 187), Taylor-Robinson (Eur. J. Immunol, 1994, 24, str. 980 až 984), Bauer H. (Immunology 1997, 90, str. 205 až 211) Fehsel K (J. Ommunol. 1995, 155, str. 2858 až 2865).
Obzvlášť pre svoju schopnosť stimulácie oxidu dusíka NO je nutné považovať zlúčeniny podľa vynálezu ako činidlá schopné modulovať imúnnu reakciu organizmu a sú preto užitočné ako farmaceutické činidlá.
Podstata vynálezu
Podstatou vynálezu sú pseudopeptidy všeobecného vzorca (I)
X-O-(CH2)m-CH-(CH2)n-CONH-(CH2)p-CH-(CH2)(1-O-Y (I),
I I
NHR, NHR2 kde znamená
R! a R2 acylovú skupinu odvodenú od nasýtenej alebo nenasýtenej karboxylovej kyseliny s priamym alebo s rozvetveným reťazcom s 2 až 24 atómami uhlíka, ktorý je nesubstituovaný alebo obsahuje jeden alebo niekoľko substituentov vybraných zo súboru zahrnujúceho hydroxylovú skupinu, alkylovú skupinu, alkoxyskupinu, acyloxyskupinu, aminoskupinu, acylaminoskupinu, acyltioskupinu a alkyltioskupinu s 1 až 24 atómami uhlíka, m 1 až 4 nO, p 3 alebo 4 Q 1
X a Y atóm vodíka alebo fosfonoskupinu za podmienky, že znamená aspoň jeden substituent X a Y fosfonoskupinu.
Pokiaľ X a/alebo Y znamenajú kyslú skupinu v neutrálnej forme, ide o formu voľnej fosforečnej kyseliny. Ak je kyslá skupina vo forme s nábojom, ide o soľ fosforečnej kyseliny, najmä vytváranej adíciou organickej alebo anorgatickej zásady, výhodne terapeuticky prijateľnej. Pokiaľ zásady nie sú vhodné na terapeutické použitie, sú použiteľné napríklad na jednoduchú identifikáciu, na čistenie a na separáciu.
Zásady vytvárajúce soli určené na terapeutické použitie zahrnujú hlavne zásady alkalických kovov, ako sú napríklad hydroxid sodný, draselný alebo lítny, soli amóniové, zásady kovov alkalických zemín, ako hydroxid vápenatý, horečnatý a strontnatý, hydroxid železnatý, organické zásady, ako sú zásady odvodené od primárnych, sekundárnych a terciámych amínov, ako sú metylamín, dietylamín, monoetanolamín, dietanolamín, benzylamín, N-metylbenzylamín, veratrylamín, trimetoxybenzylamín, zásadité aminokyseliny, ako je lyzín a omitín alebo aminocukry.
Príklady zásad nevhodných na terapeutické účely sú brucín, strychnin, agmatín, homarín, glukozamín, N-metylglukozamín alebo N-metylmorfolín. Ako je uvedené, sú soli od nich odvodené vhodné na separačné a identifikačné účely.
Ak znamená m 1 a n 0, je príslušná molekula odvodená od serínu. Ak znamená m 2 a n 0, je molekula prichádzajúca do úvahy odvodená od homoserínu. Ak znamená m 3 a n 0, ide o petahomoserínové zlúčeniny. Ak znamená m 4 a n 0, ide o hexahonoserínovú zlúčeninu.
Ak znamená p 3 a q 1, môže ísť o citrullínovú, omitínovú alebo arginínovú zlúčeninu. Ak znamená p 4 a q 1, ide o homoarginínovú alebo lyzínovú zlúčeninu.
Z pseudopeptidov majú zvláštny význam nasledujúce zlúčeniny: 3-(3-dodekanoyloxytetradekanoylamino)-9-(3-hydroxytetradekanoylamino)-4-oxo-5-azadekán-1,10-diol-1 a/alebo 10-dihydrogenfosfát a ich adičné soli s organickou alebo s anorgatickou zásadou, 3-(3-dodekanoyloxytetradekanoylamino)-9-(3-hydroxytetradekanoylamino)-4-oxo-5-azadekán-1,10-diol-l,10-bis(dihydrogenfosfát) a jeho adičné soli s organickou alebo s anorganickou zásadou, 3-(3-hydroxytetradekanoylamino)-9-(3-dodekanoyloxytetradekanoylamino)-4-oxo-5-azadekán-1,10-diol-l,10-bis(dihydrogenfosfát) a jeho adičné soli s organickou alebo s anorganickou zásadou, 3-(3-dodekanoyloxytetradekanoylamino)-9-(3-hydroxytetradekanoylamino-4-oxo-5-azadekán-1,10-diol-1 -dihydrogenfosfát a jeho adičné soli s organickou alebo s anorganickou zásadou, 3 -(-hydroxytetradekanoylamino-9-(3-dodekanoyloxytetradekanoylamino)-4-oxo-5-azadekán-1,10-diol-1 -dihydrogenfosfát a jeho adičné soli s organickou alebo s anorganickou zásadou, 3-(3-hydroxytetradekanoylamino-9-(3-dodekanoyloxytetradekanoylamino)-4-oxo-5-azadekán-1,10-diol-10-dihydrogenfosfát a jeho adičné soli s organickou alebo s anorganickou zásadou.
Symboly R| a R2 znamenajú rovnaké alebo rôzne zvyšky nasýtených alebo nenasýtených acylových derivátov s rozvetveným alebo s priamym reťazcom, ktoré môžu obsahovať jeden alebo niekoľko substituentov vybraných zo súboru zahrnujúceho skupinu alkylovú, aminoskupinu, acylaminoskupinu, hydroxylovú skupinu, alkoxyskupinu, acyloxyskupinu, acyltioskupinu a alkyltioskupinu.
Príklady takýchto zvyškov acylovaných, substituovaných derivátov sú skupina ricinoleylová, 12-hydroxystearoylová, 2-hydroxy-3-metylbutyroylová, 3-hydroxy-2-aminopentanoylová, palmitoylová, elaidylová, eleostearoylová, arachidoylová, arachidonylová, gadoleylová, behenylová, erucylová, 8-metyldekanoylová, 9-metyldekanoylová, dokosohexanoylová alebo eikosapentanoylová. Významné acylové skupiny sú odvodené od 3- hydroxymyristovej kyseliny a od 3-lauroyloxymyristovej kyseliny.
Zlúčeniny všeobecného vzorca (I) a hlavne monofosforylované a bisfosforylované zlúčeniny označované OM-294-MP, (MP) a OM-294-DP (DP), majú zaujímavé farmakologické vlastnosti, hlavne so zreteľom na imunomoduláciu. Osobitne prichádzajú do úvahy na liečenie chorôb súvisiacich s nedostatkami imunitného obranného systému alebo s nadmernou expresiou imunitných reakcií závislých od použitých dávok. Môžu sa tiež používať pri liečení rakoviny a ako adjuvanty alebo látky podporujúce reakcie na formuláciu vakcín.
Vynálezom sú teda pseudopeptidy odvodené od hydroxylovaných aminokyselín, ktorých voľné funkčné aminoskupiny sú acylované mastnými kyselinami. Charakteristickou vlastnosťou takýchto zlúčenín sú biologické aktivity, najmä imunomodulácie väčšie ako zlúčenín známych zo stavu techniky.
Podstatou vynálezu je tiež spôsob prípravy N-acyldipeptidového derivátu všeobecného vzorca (I),
X-O-(CH2)m-CH-(CH2)n-CONH-(CH2)p-CH-(CH2)q-B-Y (I),
I I
NHR[ NHR2 kde znamená
Ri a R2 acylovú skupinu odvodenú od nasýtenej alebo nenasýtenej karboxylovej kyseliny s priamym alebo s rozvetveným reťazcom s 2 až 24 atómami uhlíka, ktorý je nesubstituovaný alebo obsahuje jeden alebo niekoľko substituentov vybraných zo súboru zahrnujúceho hydroxylovú skupinu, alkylovú skupinu, alkoxyskupinu, acyloxyskupinu, aminoskupinu, acylaminoskupinu, acyltioskupinu a alkyltioskupinu vždy s 1 až 24 atómami uhlíka, m 1 až 4 n 0, p 3 alebo 4
Q 1
X a Y atóm vodíka alebo fosfonoskupinu za podmienky, že znamená aspoň jeden substituent X a Y fosfonoskupinu, pri ktorom sa funkčné aminoskupiny v nekoncovej polohe (q+1) a v koncovej polohe omega diaminokyseliny všeobecného vzorca
H2N-(CH2)p-CHNH2(CH2)q4COOH chránia blokovacími skupinami, ktoré ľahko podliehajú acidolýze a hydrogenolýze, karboxylová funkčná skupina vždy vo voľnej forme sa necháva reagovať s redukčným činidlom na získanie zodpovedajúceho alkoholu, funkčná aminoskupina v nekoncovej polohe (q+1) sa uvoľňuje a potom sa acyluje aktívnym derivátom karboxylovej kyseliny všeobecného vzorca R2OH, kde R2 má uvedený význam, koncová funkčná aminoskupina v polohe omega sa následne uvoľňuje hydrogenolýzou za získania aminoalkoholu všeobecného vzorca (II)
H2N-(CH2)p-CH-(CH2)q-OH (II),
I nhr2 kde R2 znamená acylovú skupinu odvodenú od nasýtenej alebo od nenasýtenej karboxylovej kyseliny s priamym alebo s rozvetveným reťazcom s 2 až 24 atómami uhlíka, ktorý je nesubstituovaný alebo obsahuje jeden alebo niekoľko substituentov uvedených, p znamená 3 alebo 4 a q 1, aminoalkohol kondenzuje v prítomnosti peptidového kondenzačného činidla v inertnom rozpúšťadle spolu s derivátom omega-hydroxyaminokyseliny všeobecného vzorca (III)
XO-(CH2)m-CH-(CH2)n-COOH (III),
I
NHR] kde znamená
R] acylovú skupinu odvodenú od nasýtenej alebo od nenasýtenej karboxylovej kyseliny s priamym alebo s rozvetveným reťazcom s 2 až 24 atómami uhlíka, ktorý je nesubstituovaný alebo obsahuje jeden alebo niekoľko substituentov už definovaných, m 1 až 4 nO,
X skupinu dialkyloxyfosforylovú alebo diaryloxyfosforylovú vzorca (RO)2P
I o
za získania pseudopeptidu všeobecného vzorca (IV) (RO)2PO-(CH2)m-CH-(CH2)n-CONH-(CH2)p-CH-(CH2)q-OH (IV),
I I I
O NHR! NHR2 kde Ri, R2, n, m, p a q majú uvedený význam a R znamená skupinu, ktorá ľahko podlieha hydrogenolýze, voľná alkoholová funkčná skupina sa prípadne fosforyluje fosforylačným činidlom, prípadne za prítomnosti kopulačného činidla a podrobuje sa katalytickej hydrogenácii na uvoľnenie alkoholovej funkčnej skupiny prípadne prítomnej v acylovej skupine R2, a rovnako ako fosfátové funkčné skupiny po sekundárnej hydrogenolýze na odstránenie chrániacej skupiny z prípadne druhej fosfátovej skupiny za získania zlúčeniny všeobecného vzorca (V) (HO)2PO-(CH2)m-CH-(CH2)n-CONH-(CH2)p-CH-(CH2)q-OY (V),
Ψ I I
O NHR[ NHR2 kde Y znamená atóm vodíka alebo fosfónovú skupinu a R,, R2, n, m, p a q majú uvedený význam, ktorá sa prípadne prevádza na svoju soľ reakciou s organickou alebo s anorgatickou zásadou.
Stereochémia chirálnych centier acylaminoskupín je daná konfiguráciou použitých aminokyselín, zatiaľ čo stereochémia acylaminoskupín závisí od konfigurácie použitých mastných kyselín, použitých ako východiskových látok. Vychádzať je možné z diaminokyseliny s konfiguráciou L alebo D alebo s konfiguráciou racemickej povahy. Vychádzať je možné z hydroxylovanej aminokyseliny s konfiguráciou L, D alebo z racemickej zmesi. Vynález zahrnuje všetky tieto stereoizoméry alebo diastereoizoméry.
Spôsob podľa vynálezu je založený na nasledujúcich, bežne používaných operáciách, ktoré sú objasnené na reakčných schémach 1, 2 a 3 (obr. 33, 34 a 35).
1. Blokovanie funkčnej aminoskupiny v polohe ω reťazca omitínového derivátu sa uskutočňuje N-benzyloxykarbonylovou substitúciou po reakcii kyslej funkčnej skupiny so soľou medi, v alkalickom prostredí, reakciou tohto karboxylátu medi s benzylchlórmravčanom a uvoľnením karboxylovej funkčnej skupiny chelatáciou medi v kyslom prostredí za získania N-benzyloxykarbonylom substituovaného derivátu spôsobom opísaným v literatúre (Organic Preparations and Procedures Intemational, 23, str. 191 až 194, 1992).
2. Blokovanie funkčnej aminoskupiny v polohe a karboxylového podielu omitínového derivátu sa uskutočňuje íerc-butoxykarbonylovou substitúciou s použitím alkylpyrokarbonátu ako Zerc-butylpyrokarbonát v alkalickom prostredí. Tcrobutylpyrokarbonát reaguje so susednou funkčnou aminoskupinou za vzniku ω-benzyloxykarbonylaminokarboxylového derivátu a a-íerc-benzyloxykarbonylaminokarboxylového derivátu.
3. Prevedenie karboxylovej funkčnej skupiny na primárnu alkoholovú funkčnú skupinu sa uskutočňuje spôsobom opísaným v literatúre (Tetrahedron Letters 32, str. 923 až 926, 1991); toto prevedenie je založené na reakcii karboxylového derivátu s alkylchlórmravčanom, ako je izobutylchlórmravčan, za vzniku zmesového anhydridu, ktorý sa redukuje bórhydridom alkalického kovu alebo kovu alkalickej zeminy, čím sa získa zodpovedajúci hydroxylovaný derivát s primárnou alkoholovou funkčnou skupinou.
4. Odstránenie terc-butoxykarbonylovej skupiny v polohe a sa uskutočňuje pomocou trifluóroctovej kyseliny, ktorá súčasne umožní vytvorenie funkčnej aminoskupiny, ako to zodpovedá použitiu trifluóracetátu.
5. Acylácia takto uvoľnenej funkčnej aminoskupiny sa uskutočňuje z východiskovej soli trifluóroctovej kyseliny pomocou zmesového anhydridu pripraveného z kyseliny R2OH a alkylchlórmravčanu.
6. Uvoľnenie koncovej funkčnej aminoskupiny sa uskutočňuje hydrogenolýzou za prítomnosti katalyzátora na báze vzácnych kovov, ako je platina, paládium na uhlí alebo na irídiovom nosiči.
7. Peptidová kopulácia alebo väzba medzi aminozlúčeninou všeobecného vzorca (II) a fosforylderivátom všeobecného vzorca (III') sa uskutočňuje za prítomnosti kopulačného činidla, ako je l-izobutyloxy-2-izobutyloxykarbonyl-l,2-dihydrochinolín, v inertnom rozpúšťadle, ako je rozpúšťadlo obsahujúce halogén alebo za prítomnosti karbodiimidu. Získa sa tak zlúčenina podobná dipeptidu všeobecného vzorca (IV'), ktorého hydroxylová funkčná skupina prípadne vzniknutá acylovou skupinou R2 je blokovaná.
8. Hydroxylová funkčná skupina acylovej skupiny R2 sa uvoľňuje hydrogenolýzou za prítomnosti vzácneho kovu, ako je paládium na vhodnom nosiči napríklad na uhlí.
9. Fosforová skupina sa uvoľňuje katalytickou hydrogenáciou za prítomnosti oxidu vzácneho kovu, ako je oxid platiny.
10. Fosforylácia derivátu všeobecného vzorca (IV ) podobného dipeptidu, sa uskutočňuje dvojstupňovým spôsobom (Helv. Chim. Acta 70, str. 175, 1987). V prvom stupni sa nechá zlúčenina všeobecného vzorca (IV') reagovať s dialkyl-N,N-dialkylfosforoamiditom alebo s diaryl-N,N-dialkylfosforoamiditom za prítomnosti kopulačného činidla, ako je [lH]-tetrazol, v polárnom rozpúšťadle, ako je tetrahydrofurán; takto vytvorený fosfit sa oxiduje na fosfát aromatickou peroxykarboxylovou kyselinou, ako je napríklad kyselina peroxyftalová, m-chlórperbenzoová alebo nitroperoxybenzoová. Fosforová skupina Y (všeobecný vzorec (V)) sa uvoľňuje katalytickou hydrogenáciou za prítomnosti vzácneho kovu, ako je paládium na uhlí.
11. Fosforylácia homoserínového derivátu sa uskutočňuje difenylfosforylhalogenidom za prítomnosti pyridínu a Ν,Ν-dialkylaminopyridínu (Helv. Chim. Acta 58, str. 518, 1975) po zablokovaní funkčnej aminoskupiny ŕerc-butoxykarbonylovou skupinou s použitím terc-butylpyrokarbonátu v alkalickom prostredí a blokovaním karboxylovej funkčnej skupiny po vytvorení céziovej soli a benzyláciou benzylhalogenidom v dimetylformamide alebo dimetylacetamide.
12. Acylácia atómu dusíka homoserínového derivátu sa uskutočňuje tak, že sa odstráni chrániaca skupina z funkčnej aminoskupiny trifluóroctovou kyselinou za získania trifluóroctovej soli amínu a reakciou so zmesovým anhydridom, ktorý sa získa reakciou karboxylovej kyseliny RiOH a alkylchlórmravčanu za prítomnosti reaktívneho amínu napríklad N-metylmorfolínu.
Vynález sa ďalej týka medziproduktov všeobecného vzorca (II) a všeobecného vzorca (III) buď vo forme čistého enantioméru, alebo zmesi stereoizomérov.
Vynález sa tiež týka farmaceutických prostriedkov obsahujúcich ako účinnú látku najmenej jednu zlúčeninu všeobecného vzorca (I) v neutrálnej alebo nabitej forme, spolu s prísadou netoxického farmaceutický prijateľného inertného excipienta alebo nosiča.
Osobitne sa vynález týka farmaceutických prostriedkov obsahujúcich ako účinnú látku aspoň jednu soľ zlúčeniny všeobecného vzorca (I), spolu s organickou alebo minerálnou zásadou, určených na terapeutický účel.
Vynález sa týka tiež farmaceutických prostriedkov obsahujúcich zlúčeninu všeobecného vzorca (I) vo forme čistého enantioméru alebo vo forme zmesi stereoizomérov, v kombinácii alebo v prímesi farmaceutického excipienta alebo nosiča.
Ako farmaceutické prostriedky prichádzajú do úvahy prostriedky vhodné na mukózne, transkutánne, topické, parenterálne, digestívne alebo inhalačné podanie, ako sú poťahované alebo nepoťahované tablety, kapsuly, injekčné roztoky alebo suspenzie, spreje, gély, náplasti alebo roztoky na rýchlu absorpciu.
Predovšetkým sa zlúčeniny podľa vynálezu, prípadne neutralizované amínom alebo hydroxyalkylamínom, podávajú injektovaním vodných roztokov alebo suspenzií.
Farmaceutické prostriedky podľa vynálezu sa používajú ako nosiče molekúl terapeutického významu kvôli svojej schopnosti vytvárať nekovalentné asociačné komplexy hydrofilnej alebo hydrofóbnej povahy. Ich charakter umožňuje vytváranie a transport molekúl terapeutického významu na membránové receptory samotné na bunkové steny a cytoplazmus. Môžu sa používať samostatne alebo spolu s molekulami terapeutického významu na podanie cestou orálnou, parenterálnou, rektálnou, topickou, transkutánnou alebo mukozálnou. Môžu sa používať samostatne alebo spolu s molekulami terapeutického významu na dočasnú ex-vivo inkubáciu s krvnými bunkami na konkurenčnú imunitu takýchto buniek pred reinjekciou buniek invivo parenterálnou cestou.
Molekuly MP a DP majú podobné vlastnosti pri použití ako adjuvanty imúnneho systému, napríklad pri vakcinácii v spojení s vhodnými antigénmi, proti vírusovým, parazitickým, mikrobiálnym alebo plesňovým ochoreniam. Naproti tomu majú však zlúčeniny podľa vynálezu zásadne odlišné vlastnosti so zreteľom na schopnosť viazať produkciu cytokínu alebo dozrievanie imunite konkurujúcich kmeňov buniek pochádzajúcich z hematopoetických a lymfoidných orgánov.
Zlúčenina MP uľahčuje dozrievanie a diferenciáciu monocytov na funkčné dendritické bunky v prítomnosti alebo v neprítomnosti vhodného antigénu, a tak prispieva k silnej humorálnej a celulámej imunite. Zlúčeniny DP pôsobia ako protinádorové činidlá.
Zlúčeniny podľa vynálezu sú významné obzvlášť pre svoju nízku toxicitu. Používajú sa v terapii ľudí a zvierat ako jednotlivé dávky 1 až 100 mg účinnej látky a v denných dávkach 1 až 300 mg účinnej látky. Vynález objasňujú, ale neobmedzujú nasledujúce príklady praktického uskutočnenia. Vynález objasňujú aj schémy 1 až 6 a obr. 33 až 38.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obr. 1 Indukovanie proliferácie buniek kmeňa kostnej drene
Na osi x je koncentrácia v μΜ, na osi y je OD v AU pri 490 nm-AU 490 nm
-- platí pre LPS E. coli
-Δ- platí pre OM-294-DP
-A- platí pre OM-294-MP platí pre slepú skúšku
Obr. 2 Indukcia produkcie NO v myších makrofágových bunkách
Na osi x je koncentrácia v μΜ, na osi y je nitrit (μΜ)
-- platí pre LPS E. coli
-Δ- platí pre OM-294-DP
-A- platí pre OM-294-MP
Obr. 3 Indukcia konjugátu dextrán-FITC. Na osi x sú stimuly média, LPS, OM-294-MP, OM-294-DP
Na osi y je absorpcia konjugátu dextrán-FITC (%)
Obr. 4 Absorpcia konjugátu dextrán-FITC: Od dávky závislý efekt pri nízkych koncentráciách. Od dávky závislá reakcia voči LPS & OM-294-MP na absorpcii dextránu.
Na osi xje koncentrácia v μΜ, na ose y je inhibícia v %.
platí pre LPS platí pre OM-294-MP
Obr. 5 Účinok závislý od dávky vyjadrený absorpciou konjugátu dextrán-FITC pri vysokých koncentráciách.
Percento inhibície absorpcie konjugátu FITC-dextrán
Na osi xje pg/ml, na osi y je % inhibície.
platí pre LPS platí pre OM-294-MP
Obr. 6 Expresia CD40 spoločne stimulujúceho povrchového markera
Na osi x sú stimuly média, LPS, OM-294-MP, OM-294-DP na osi y je stredná fluorescencia (%).
* p < 0,0005 § P <0,001
Obr. 7 Expresia CD86 spoločne stimulujúceho povrchového markera
Na osi x sú stimuly média, LPS, OM-294-MP, OM-294-DP na osi y je stredná fluorescencia (%).
* p < 0,0005 § P <0,05
Obr. 8 Expresia CD83 spoločne stimulujúceho povrchového markera
Na osi x sú stimuly média, LPS, OM-294-MP, OM-294-DP na osi y je stredná fluorescencia (%).
* p<0,0005 § P<0,l
Obr. 9 Expresia CD80 spoločne stimulujúceho povrchového markera
Na osi x sú stimuly média, LPS, OM-294-MP, OM-294-DP na osi y je stredná fluorescencia (%).
* p < 0,0005 § P < 0,5
Obr. 10 Účinok produktov OM-294-MP a OM-294-DP na produkciu α-TNF predendritickými bunkami v stupni DC-6. Na osi xje čas v hodinách, na osi y je α-TNF (pg/ml)
-ô- platí pre prostredie
-Δ- platí pre LPS platí pre OM-294-DP —+— platí pre OM-294-MP
Obr. 11 Účinok produktov OM-294-MP a OM-294-DP na produkciu IL-12 p70 predendritickými bunkami v stupni DC-6 (IFN=yIFN).
IL-12 p70 v supematantoch dendritických buniek (DC-6)
Na osi xje čas inkubácie v hodinách, na osi y je IL-12 p70 (pg/ml).
-o- platí pre prostredie
-·- platí pre LPS platí pre LPS + IFN
-X- platí pre OM-294-MP platí pre OM-294-MP + IFN
Obr. 12 Účinok produktov OM-294-MP na produkciu IL-12 p70 monocytov (IFN=yIFN).
IL-12 p70 v supematantoch monocytov
Na osi x je čas inkubácie v hodinách,
Na osi y je IL-12 p70 (pg/ml).
-o- platí pre prostredie
-·- platí pre LPS
-□- platí pre LPS + IFN
-X- platí pre OM-294-MP platí pre OM-294-MP + IFN
Obr. 13 ELISA 2 po prvom imunizačnom ošetrení.
Skúška na protilátky špecificky zamerané na PbCS His6-242-310, 3 týždne po prvej injekcii (ELISA č. 2). Na osi x je riedenie séra, na osi y absorbancia pri 405 nm.
platí pre Pb CS 242-310,6 His platí IFA/Pb CS 242-310,6 His platí pre OM-294-MP/Pb CS 242-310,6 His platí pre ΟΜ-294-DP/Pb CS 242-310,6 His platí pre OM-294-MP platí pre OM-294-DP
Obr. 14 ELISA 3 po druhom imunizačnom ošetrení.
Skúška na protilátky špecificky zamerané na PbCS His6-242-310, 4 týždne po druhej injekcii (ELISA č. 3)·
Na osi x je riedenie séra, na osi y absorbancia pri 405 nm.
- A - platí pre Pb CS 242-310,6 His
-Δ- platí IFA/Pb CS 242-310,6 His
- ♦- platí pre OM-294-MP/Pb CS 242-310,6 His
-0- platí pre ΟΜ-294-DP/Pb CS 242-310,6 His platí pre OM-294-MP
-+- platí pre OM-294-DP
Obr. 15 ELISA 4 po treťom imunizačnom ošetrení.
Skúška na protilátky špecificky zamerané na PbCS His6-242-310, 2 týždne po tretej injekcii (ELISA č. 4).
Na osi x je riedenie séra, na osi y absorbancia pri 405 nm.
-Á- platí pre Pb CS 242-310,6 His
-Δ- platí IFA/Pb CS 242-310,6 His
-¼ platí pre OM-294-MP/Pb CS 242-310,6 His
-0- piati pre ΟΜ-294-DP/Pb CS 242-310,6 His
-K- platí pre OM-294-MP
-+- platí pre OM-294-DP
Obr. 16 Protilátkový titer pred a po jednom, dvoch a troch imunizačných ošetreniach. Zmena titru protilátok špecificky zameraných na PbCS His6-242-310, po L, 2. a 3. injekcii.
Na osi x je ELISA č., na osi y je recipročná hodnota protilátkového titra.
Na osi x je riedenie séra, na osi y absorbancia pri 405 nm.
-Á- platí pre Pb CS 242-310,6 His
-Δ- platí IFA/Pb CS 242-310,6 His platí pre OM-294-MP/Pb CS 242-310,6 His
-0- platí pre ΟΜ-294-DP/Pb CS 242-310,6 His
-K- platí pre OM-294-MP —+— platí pre OM-294-DP
Obr. 17 ELISPOT y IFN produkujúci lymfocyty trieslových miazgových uzlín stimulovaných PbCS 245252 jeden týždeň po druhom imunizačnom ošetrení.
ELISPOT y IFN produkujúci lymfocyty trieslových miazgových uzlín jeden týždeň po druhom imunizačnom ošetrení.
Na osi x sú stimulátory, na osi y je počet špecifických lymfocytov na milión buniek (prázdny obdĺžnik - adjuvant samotný, plný obdĺžnik - adjuvant + antigén)
Obr. 18 ELISPOT y IFN produkujúci lymfocyty sleziny stimulovaných PbCS 245-252 jeden týždeň po druhom imunizačnom ošetrení.
ELISPOT y IFN produkujúci lymfocyty sleziny jeden týždeň po druhej imunizácii.
Na osi x sú stimulátory, na osi y je počet špecifických lymfocytov na milión buniek (prázdny obdĺžnik - adjuvant samotný, plný obdĺžnik - adjuvant + antigén)
Obr. 19 ELISPOT y IFN produkujúci lymfocyty sleziny stimulovaných PbCS 245 až 252 jeden týždeň po druhom imunizačnom ošetrení.
ELISPOT y IFN produkujúci lymfocyty trieslových miazgových uzlín jeden týždeň po tretej imunizácii.
Na osi x sú stimulátory, na osi y je počet špecifických lymfocytov na milión buniek (prázdny obdĺžnik - adjuvant samotný, plný obdĺžnik - adjuvant + antigén)
Obr. 20 ELISPOT y IFN produkujúci lymfocyty sleziny stimulovaných PbCS 245-252 tri týždne po tretej imunizácii.
ELISPOT y IFN produkujúci lymfocyty sleziny jeden týždeň po tretej imunizácii.
Na osi x sú stimulátory, na osi y je počet špecifických lymfocytov na milión buniek (prázdny obdĺžnik - adjuvant samotný, plný obdĺžnik - adjuvant + antigén)
Obr. 21 Elektroforetogram samotného OM-294-DP, samotného antigénu PbCS His6-242-310 samotného a komplexu PbCS His6-242-310- OM-294-DP.
Na osi x je čas (min.), na osi y je abs. [AU]
Obr. 22 Špecifické protilátky IgGl zamerané na H IN 1
Na osi x sú študované skupiny, na osi y sú zmluvné jednotky/ml (stred ± smerodajná odchýlka) (prázdny obdĺžnik - IgGl 14 dní, plný obdĺžnik - IgGl 28 dní, ** p < so zreteľom na B)
Obr. 23 Špecifické protilátky IgG2 zameraná na H IN 1
Na osi x sú študované skupiny, na osi y sú zmluvné jednotky/ml (stred ± smerodajná odchýlka) (prázdny obdĺžnik - IgG2 14 dní, plný obdĺžnik - IgG2 28 dní, **p < so zreteľom na B)
Obr. 24 Špecifické protilátky IgM zamerané na H1N1
Na osi x sú študované skupiny, na osi y sú zmluvné jednotky/ml (stred ± smerodajná odchýlka) (prázdny obdĺžnik - IgM 14 dní, plný obdĺžnik - IgM 28 dní, * , 0.05 ** p < so zreteľom na B)
Obr. 25 Špecifické protilátky IgGl zamerané na ovalbumín
Na osi x sú študované skupiny, na osi y sú zmluvné jednotky/ml (stred ± smerodajná odchýlka) (prázdny obdĺžnik - IgGl 14 dní, plný obdĺžnik - IgGl 28 dní, ** p < so zreteľom na B)
Obr. 26 Špecifické protilátky lgG2 zamerané na ovalbumín
Na osi x sú študované skupiny, na osi y sú zmluvné jednotky/ml (stred ± smerodajná odchýlka) (prázdny obdĺžnik - IgG2 14 dní, plný obdĺžnik - IgG2 28 dní, * < 0.05 ** p < so zreteľom na B)
Obr. 27 Špecifické protilátky IgM zamerané na ovalbumín
Na osi x sú študované skupiny, na osi y sú zmluvné jednotky/ml (stred ± smerodajná odchýlka) (prázdny obdĺžnik - IgM 14 dní, plný obdĺžnik - IgM 28 dní,
Obr. 28 Špecifické protilátky IgGl zamerané na TT
Na osi x sú študované skupiny, na osi y sú zmluvné jednotky/ml (stred + smerodajná odchýlka) (prázdny obdĺžnik - IgGl 14 dní, plný obdĺžnik - IgGl 28 dní, ** p < so zreteľom na B)
Obr. 29 Špecifické protilátky lgG2a zamerané na TT
Na osi x sú študované skupiny, na osi y sú zmluvné jednotky/ml (priemer ± smerodajná odchýlka) (prázdny obdĺžnik - IgG2 14 dní, plný obdĺžnik - IgG2 28 dní, ** p < so zreteľom na B)
Obr. 30 (a) Nárast imunitnej reakcie anti-gp63 vplyvom adjuvanta OM-294-MP: porovnanie s BCG.
Na osi x je gp 63 pg/ml, na osi y je absorpcia 3H-TdR (cpm x 10'3)gp63 pg/ml platí pre bez adjuvanta platí pre OM-294-MP platí pre BCG
Obr. 30 (b) γ IFN a IL-4 bez adjuvanta, s adjuvantom OM-294-MP a porovnanie s BCG.
Na osi x je gp63 pg/ml, na osi y sú cytokíny pg/ml
Obr. 31 (a) Reakcia in vitro lymfocytov miazgových uzlín odvodená od myší predbežne imunizovaných in vivo antigénom Lm CPb: Vplyv adjuvanta OM-294-MP.
Na osi x je Lm CPb (pg/ml), na osi y je pohltenie 3H-TdR (cpm x 10’3) platí neimunizované
- o - platí pre bez adj uvanta
-·- platí pre OM-294-MP
Obr. 31 (b) y IFN a IL-4, neimunizované, bez adjuvanta, s adjuvantom OM-294-MP.
Na osi x je Lm CPb pg/ml, na osi y sú cytokíny pg/ml
Obr. 32 (a) Nárast imunitnej reakcie anti-Lm CPb vplyvom adjuvanta OM-294-MP: porovnanie s BCG.
Na osi x je Lm CPb pg/ml, na osi y je absorpcia 3H-TdR (cpm x 10’3) —o— platí pre bez adjuvanta —·— platí pre OM-294-MP —platí pre BCG
Obr. 32 (b) y IFN a IL-4 bez adjuvanta, s adjuvantom OM-294-MP a porovnanie s BCG. Na osi x je Lm CPb pg/ml, na osi y sú cytokíny pg/ml
Obr. 33 Schéma syntézy 1
Obr. 34 Schéma syntézy 2
Obr. 35 Schéma syntézy 3
Obr. 36 Schéma syntézy 4
Obr. 37 Schéma syntézy 5
Obr. 38 Schéma syntézy 6
Obr. 39 Spektrum 1. Difosforylovaná zlúčenina. Spektrá ES-MS (kladný druh)
Zariadenie: Micromass Quatro II (Z-sprej)
Obr. 40 Spektrum 2. Monofosforylovaná zlúčenina. Spektrá ES-MS (kladný druh)
Zariadenie: Micromass Quatro II (Z-sprej)
Obr. 41 Spektrum 3. Difosforylovaná zlúčenina. Spektrá ES-MS (fragmentácia kladného druhu) Zariadenie: Hewlett-Packard MSD
Obr. 42 Spektrum 4. Monofosforylovaná zlúčenina. Spektrum ’H-NMR. Rozpúšťadlo: CDC13 + 0,1 % trietanolamín
Zariadenie: Varian Unity INOVA 500 MHz
Obr. 43 Spektrum 5. Monofosforylovaná zlúčenina. Spektrum 'H-NMR. Rozpúšťadlo: (objemovo 3 : 1) CDC13: CD3OD
Zariadenie: Varian Unity INOVA 500 MHz
Obr. 44 Spektrum 6. Monofosforylovaná zlúčenina. Spektrum 13C-NMR. Rozpúšťadlo: CDC13 Zariadenie: Bruker DPX 250 MHz
Obr. 45 Spektrum 7. Difosforylovaná zlúčenina. Spektrum 13C-NMR. Rozpúšťadlo: CDC13 Zariadenie: Bruker DPX 250 MHz
Obr. 46 Spektrum 8. Monofosforylovaná zlúčenina. Spektrum 3IP-NMR. Rozpúšťadlo: CDC13 Zariadenie: Bruker DPX 250 MHz
Obr. 47 Spektrum 9. Difosforylovaná zlúčenina. Spektrum 31P-NMR. Rozpúšťadlo: CDC13
Zariadenie: Bruker DPX 250 MHz
V príkladoch sa používajú nasledujúce skratky:
IBCF izobutylchlórmravčan
IDQ 1 -izobutyloxy-2-izobutyloxykarbonyl-1,2-dihydrochinolín
LPS liposacharid
TBAP tetrabutylamóniumfosfát
TeoA trietanolamín
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
4-(Difenyloxyfosforyloxy)-2-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]butánová kyselina
1. Na-terc-butyloxykarbonyl-DL-homoserín
Rozpustia sa 2 g homoserínu (16,78 mmol) vo 20 ml vody a do roztoku sa pridá 16,78 ml IM roztoku hydroxidu sodného a 3,006 g uhličitanu cézneho (9,23 mmol). Mieša sa počas 5 minút a roztok sa ochladí v kúpeli ľadu a vody. Pridá sa 60 ml dioxánu a terc-butylpyrokarbonátu. Reakčná zmes sa udržuje za miešania v kúpeli ľadovej vody počas 1 hodiny a potom pri teplote miestnosti počas 5 hodín. Rozpúšťadlo sa odstráni vo vákuu. Suchý zvyšok sa použije priamo v nasledujúcom stupni.
2. Na- 7erc-butyloxykarbonylbenzyl-DL-homoserinát
Do zvyšku zo stupňa 1 sa pridá 20 ml dimetylformamidu a rozpúšťadlo sa odparí do sucha a do reakčnej zmesi sa pridá 60 ml dimetylformamidu a 4,5 ml benzylbromidu (20,13 mmol). Vznikne biela zrazenina. Zmes sa mieša 16 hodín. Rozpúšťadlo sa odstráni vo vákuu. Zvyšok sa skoncentruje alebo extrahuje dvakrát 20 ml etylacetátu. Organická vrstva sa premyje postupne vodou (20 ml) a soľankou (20 ml) a vysuší sa bezvodým síranom horečnatým. Rozpúšťadlo sa odparí a zvyšok sa použije v nasledujúcom stupni.
3. Benzyl-Na-íerc-butyloxykarbonyl-0-(difenyloxyfosforyl)-DL-homoserinát
Zvyšok z predchádzajúceho stupňa sa vysuší vo vysokom vákuu a rozpustí sa v metylénchloride (60 ml). Do roztoku sa pridá 4,11 g 4-dimetylaminopyridínu (33,56 mmol) a reakčná zmes sa mieša 10 minút, potom sa pridá 12 ml pyridínu a 6,95 ml chlórfosfátu (33,56 mmol). Roztok sa mieša pri teplote miestnosti 18 hodín, premyje sa IN kyselinou chlorovodíkovou (5 x 20 ml), vodou (30 ml) a soľankou (30 ml). Organická vrstva sa vysuší bezvodým síranom horečnatým a rozpúšťadlo sa odstráni vo vákuu. Zvyšok sa čistí okamžitou chromatografiou (hexán/etylacetát = 4:1). Hlavná frakcia sa skoncentruje na vykryštalizovanie zvyšku. Získa sa 7,49 g fosforylovaného produktu (82,4 % výťažok). Teplota topenia 63,5 až 64,0 °C.
4. Benzyl-O-(difenyloxyfosforyl)-DL-homoserinát
Fosforylovaný produkt z predchádzajúceho stupňa (7,88 g, 15,4 mmol) sa rozpusti v 15 ml trifluóroctovej kyseliny a roztok sa udržuje za miešania 2,5 hodiny pri teplote miestnosti. Rozpúšťadlo sa odstráni vo vákuu a zvyšok sa vyčistí okamžitou chromatografiou (metanol/dichlórmetán = 10:1). Hlavná frakcia sa skoncentruje a zvyšok sa nechá vykryštalizovať pri teplote miestnosti. Získa sa 7,17 g fosforylovaného produktu (výťažok 88,9 %). Produkt sa použije v nasledujúcom stupni bez ďalšieho spracovania.
5. Benzyl 2-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]-4-(difenyloxyfosforyloxy)-butanoát
4,284 g (10,07 mmol) (R)-dodekanoyloxytetradekánovej kyseliny pripravenej spôsobom podľa Bull. Chem. Soc. Jpn. 60, str. 2205 až 2214 (1987) sa rozpustí v 30 ml tetrahydrofuránu a roztok sa ochladí na
SK 287073 Β6 teplotu -15 °C v ľadovom soľankovom kúpeli. Pridá sa 1,108 ml (10,07 mmol) N-metylmorfolínu a 1,31 ml (10,07 mmol) izobutylchlórmravčanu. Mieša sa 30 minút. Do reakčnej zmesi sa pridá 5,724 g (10,07 mmol) benzyl-0-(difenyloxyfosforyl)-DL-homoserinátu v zmesi 30 ml tetrahydrofuránu a 5 ml trietylamínu. Mieša sa cez noc pri teplote miestnosti, rozpúšťadlo sa odstráni vo vákuu a do zvyšku sa pridá 20 ml vody. Zmes sa extrahuje etylacetátom (2 x 30 ml). Organické vrstvy sa spoja, premyjú sa postupne vodou (20 ml), soľankou (20 ml) a vysušia sa síranom horečnatým. Rozpúšťadlo sa odparí a zvyšok sa čistí okamžitou chromatografiou (hexán/etylacetát 2 : 1, Rf = 0,29). Získa sa 7,455 g produktu, (87,1 % výťažok). Teplota topenia 31,0 až 32,1 °C.
‘H-NMR (CDCIj, 250 MHz), δ ppm: 7,4 - 7,1 (m, 15H), 6,90 (2d, 1H, V= 7,6 Hz, NH), 5,3 - 5,1 (m, 3H), 4,7 (m, 1H), 4,35 (m, 2H), 2,45 (m, 2H), 2,4 - 2,1 (m, 4H), 1,6 (m, 4H) 1,4 - 1,1 (m, 34H), 0,9 (t, 6H). 13C-NMR (CDCIj, 63 MHz) δ ppm: 173,01, 171,08, 169,66, 150,18 (d, 2JPC= 7,1 Hz), 135,01, 129,60, 128,33, 128,14, 127,96, 125,21, 119,80 (d, 3JP>C = 5,0 Hz), 70,69, 67,05, 65,19 (d, VP,c = 5,6 Hz), 49,13, 40,97,40,77 (2 diast.), 34,20, 33,98, 33,82,31,70,29,42,29,34,29,14, 28,94, 25,01,24,47,13,91.
6. 4-(Difenyloxyfosforyloxy)-2-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]butánová kyselina
Pripraví sa roztok benzylesteru získaného v stupni 5 (2,23 g, 2,6 mmol) v 300 ml metanolu s čistotou HPLC v trojhrdlovej banke a pridá sa 10 g 10 % paládia na uhlí. Vzduch sa z banky odsaje vo vákuu a banka sa naplní vodíkom za tlaku okolia. Reakčná zmes sa mieša jednu hodinu pri teplote miestnosti. Katalyzátor sa rýchlo odfiltruje na membráne a filtrát sa skoncentruje, tak sa získa bezfarebná kvapalina. Tento produkt je homogénny podľa chromatografíe na tenkej vrstve a NMR a použije sa bez ďalšieho čistenia v kopulačnom stupni. RF = 0,75 (dichlórmetán/metanol/ trietylamín 10 : 1 : 0,5).
‘H-NMR (CDCIj, 250 MHz), δ ppm: 7,4 - 7,1 (m, 10H), 6,85 (2d, 1H, NH), 5,15 (m, 1H), 4,6 (m, 1H), 4,35 (m, 2H), 2,45 (m, 2H), 2,4 - 2,15 (m, 4H), 1,6 (m, 4H), 1,4 - 1,1 (m, 34H), 0,9 (t, 6H).
13C-NMR (CDCIj, 63 MHz), δ ppm: 173,35, 171,30 (2 diast.), 172,75, 170,37, 150,0 (d, VP.c = 7,5 Hz), 129,55, 125,28, 119,71 (d, VP,c = 4,4 Hz), 70,78, 65,65, (d, VP.c = 5,9 Hz), 49,00, 40,77, 40,63 (2 diast.), 34,13, 33,86, 33,76, 31,59, 29,31, 29,25, 29,03, 28,82, 24,88, 24,68, 22,36, 13,76.
4-(Difenyloxyfosforyloxy)-2-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]butánová kyselina sa môže pripraviť podľa rovnakej reakčnej schémy náhradou v 5. stupni príkladu 1 (R)-3-dodekanoyloxytetradekánovej kyseliny kyselinou (R)-3-benzyloxytetradekánovou.
Príklad 2 (2R)-5-Amino-2-[(R)-3-benzyloxytetradekanoylamino]pentan-l-ol
1. Soľ D-omitínu s meďou
Do roztoku D-omitínu (5,25 g, 30 mmol) v 30 ml IM roztoku hydroxidu sodného, sa pridá 50 ml roztoku pentahydrátu síranu meďnatého (3,814 g, 15,3 mmol) vo vode. Mieša sa dve hodiny. Reakčná zmes sa odparí do sucha. Pridá sa 60 ml metanolu, tak vznikne červeno zafarbená pevná látka, ktorá sa oddelí a premyje sa postupne dioxánom a metanolom.
2. (2R)-5-Amino-5-benzyloxykarbonylamino)pentanoát medi
Červeno zafarbená pevná látka sa rozpustí v 40 ml IM sodného lúhu a 70 ml dioxánu, roztok sa ochladí v ľadovom kúpeli a pridá sa 5,14 ml (36 mmol) benzylchlórmravčanu. V miešaní sa pokračuje tri hodiny v ľadovom kúpeli a potom 15 hodín pri teplote miestnosti. Červeno zafarbená zrazenina sa zhromaždí a premyje sa 95 % etanolom (40 ml), vodou (50 ml) a etanolom (60 ml). Zrazenina sa vysuší v piecke (T do 45 °C, vo vákuu). Dvojstupňovým procesom sa získa 8,27 g produktu (93 % výťažok).
3. (2R)-5-(Benzyloxykarbonylamino)-2-(terc-butyloxykarbonylamino)pentánová kyselina
Soľ medi, získaná v stupni 2, sa rozpustí v 2M kyseline chlorovodíkovej (400 ml) a pridá sa etyléndiamíntetraoctová kyselina (8,15 g, 27,8 mmol). Zmes sa mieša 2,5 hodiny a neutralizuje sa pridaním sodného lúhu (približne 160 ml) do hodnoty pH 7. Vytvorí sa biela zrazenina. Zmes sa mieša 2,5 hodiny v ľadovom kúpeli. Zrazenina sa odfiltruje, premýva sa studenou vodou až do získania bezfarebného odtoku, vysuší sa v piecke pri teplote 60 °C. Pevná látka sa rozpustí vo 156 ml IM roztoku hydroxidu sodného a roztok sa ochladí v ľadovom kúpeli. Do roztoku sa pridá 7,7 g (35,2 mmol) íerc-butylpyrokarbonátu v dioxáne (160 ml). Zmes sa mieša 45 minút pri teplote 0 °C a 16 hodín pri teplote miestnosti. Organické rozpúšťadlo sa odparí a do zvyšku sa pridá 70 ml etylacetátu. Vodná vrstva sa okyslí 2N kyselinou chlorovodíkovou na hodnotu pH približne 3. Vodná vrstva sa znova extrahuje 100 ml etylacetátu. Organické vrstvy sa spoja a premyjú sa vodou (30 ml) a soľankou (30 ml). Rozpúšťadlo sa odstráni vo vákuu a vzniknutý bezfarebný olej sa čisti okamžitou chromatografiou (získa sa 8,42 g produktu v dvoch stupňoch (76,7 % výťažok). Rf = 0,19, dichlóretán/metanol 20 : 1).
4. (2R)-5-(Benzyloxykarbonylamino)-2-(/erc-butyloxykarbonylamino)pcntan-1 -ol
Do studeného roztoku (-15 °C) derivátu diaminopentánovej kyseliny získanej v stupni 3 (5,45 g, 14,8 mmol) v 60 ml tetrahydrofuránu sa pridá 1,654 ml (14,8 mmol) N-metylmorfolínu a 9,6 ml (14,8 mmol) izobutylchlórmravčanu (IBCF). Roztok sa mieša pri teplote -15 °C 1 minútu a pridá sa bórhydrid sodný (5,104 g, 44,6 mmol) v 10 ml vody. V miešaní sa pokračuje počas ďalších 10 minút, potom sa pridá 400 ml vody na ukončenie reakcie. Roztok sa extrahuje etylacetátom (2x 100 ml). Organické vrstvy sa spoja, premyjú sa postupne vodou (50 ml), soľankou (60 ml) a vysušia sa síranom horečnatým. Rozpúšťadlo sa odstráni a zvyšok sa rekryštalizuje zo zmesi etylacetátu. Získa sa 4,95 g produktu (94,9 % výťažok) s teplotou topenia 47,5 až 48 °C.
5. Odstránenie chrániacej skupiny z derivátu 2,5-diaminopentan-l-olu
Rozpustí sa 6,32 g (18 mmol) (2R)-5-(benzyloxykarbonylamino)-2-(íerc-butyloxykarbonylamino)pentan-1-olu, získaného v stupni 4, v 25 ml trifluóroctovej kyseliny a zmes sa mieša 2,5 hodiny pri teplote miestnosti. Rozpúšťadlo sa odparí a zvyšok sa čisti okamžitou chromatografiou (metanol/dichlórmetán 10 : 1). Získa sa bezfarebný sklovitý produkt, topiaci sa pri teplote miestnosti. Získa sa 5,45 g produktu v podobe soli trifluóroctovej kyseliny (výťažok 82,7 %). Hydrochloridová zlúčenina má teplotu topenia 133,0 až
134,3 °C (rekryštalizácia z metanolu).
6. (2R)-5-(Benzyloxykarbonylamino)-2-[(R)-3-benzyloxytetradekanoylamino]pentan-l-ol
Do roztoku vopred vychladeného na teplotu -15 °C 5,27 g (15,8 mmol) (R)-3-benzyloxytetradekánovej kyseliny (Bull. Chem. Soc. Jpn., str. 2197 až 2204, 1987) v 30 ml tetrahydrofuránu sa pridá 1,89 ml (15,8 mmol) N-metylmorfolinu a 2,21 ml IBCF (15,8 mmol). Reakčná zmes sa udržuje za miešania 30 minút pri teplote -15 °C. Do roztoku sa pridá 5,25 g soli trifluóroctovej kyseliny podľa odseku 5 (14,4 mmol) v 30 ml tetrahydrofuránu a 1,44 ml trietylamínu. V miešaní sa pokračuje pri teplote miestnosti 16 hodín, potom sa pridá 30 ml vody a 60 ml etylacetátu. Organická vrstva sa oddelí a vodná vrstva sa znovu extrahuje etylacetátom (60 ml). Organické vrstvy sa spoja, premyjú sa postupne vodou (30 ml), soľankou (30 ml) a vysušia sa síranom horečnatým. Rozpúšťadlo sa odparí a zvyšok sa rekryštalizuje zo zmesi acetát/hexán. Získa sa 5,842 g produktu (výťažok 71,2 %). Teplota topenia = 117,5 až 118 °C. Rf = 0,32, etylacetát/petroleuméter 3 : 1.
'H-NMR (CDClj, 250 MHz) δ ppm: 7,4 - 7,2 (m, 10H), 6,5 (2d, 1H, N77), 5,1 (s, 2H), 4,9 (m, 1H, N//), 4,5 (2d, AB, 2H), 3,8 (m, 2H), 3,5 (m, 2H), 3,1 (m, 2H), 2,4 (m, 2H), 2,4 (m, 2H), 1,6 -1,4 (m, 6H), 1,4 -1,2 (m, 18H), 0,9 (t, 3H), 13C-NMR (CDC13, 63 MHz), δ ppm: 172,24, 156,49, 138,06, 136,53, 128,46, 128,04, 127,87, 76,39, 66,60, 65,44, 51,54,41,43,40,65, 33,76,31,87,29,61,29,30,28,01,26,47,25,05, 22,65,14,09.
7. (2R)-5-Amino-2-[(R)-3-benzyloxytetradekanoylamino]pentan-l-ol
Do trojhrdlovej banky sa vnesie 150 mg 20 % paládia na uhlí do roztoku (2R)-5-(benzyloxykarbonylamino)-2-[(R)-3-benzyloxytetradekanoylamino]pentan-l-olu (3,0 g, 5,27 mmol) a 6 ml trietylamínu v 300 ml etanolu čistoty HPLC. Vzduch sa z banky odstráni pri jej plnení vodíkom. Reakčná zmes sa mieša dve hodiny pri teplote miestnosti, katalyzátor sa odfiltruje cez membránu a filtrát sa skoncentruje, čím sa získa homogénna biela pevná hmota podľa chromatografie TLC a použije sa v nasledujúcom stupni bez ďalšieho čistenia. Rf = 0,2, dichlórmetán/metanol/ trietylamín 5:10:5, teplota topenia 47 až 48 °C.
'H-NMR /CDC13, 250 MHz), δ ppm: 7,4 - 7,2 (m, 5H), 6,75 (d, 1H, NH) 4,5 (2d, AB, 2H), 3,9 (m, 2H), 3,5 (m, 2H), 2,3 - 2,6 (m, 7H), 1,7 -1,2 (m, 24H), 0,9 (t, 3H), 13C-NMR (CDCIj, 63 MHz), δ ppm: 171,86, 138,13, 128,37, 127,87, 127,75, 76,81, 71,50, 64,57, 51,38, 41,51, 41,17, 33,89, 31,82, 29,26, 28,57, 28,03, 25,07, 22,60, 14,04.
(2R)-5-Amino-2-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]pentan-l-ol možno získať rovnakým postupom nahradením (R)-3-benzyloxytetradekánovej kyseliny v stupni 6 príkladu 2 (R)-3-dodekanoyloxytetradekánovou kyselinou.
Príklad 3 3-[(R)-3-Dodekanoyloxytetradekanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hydroxytetra-dekanoylamino]dekán-1,10-diol-1 -dihydrogenfosfát
1. Peptidová kopulácia
V roztoku (2RS)-4-(difenyloxyfosforyloxy)-2-[(R)-3-dodekanoyloxytetra-dekanoylamino]butánovej kysliny (1,0 mmol), získanej podľa príkladu 1, rozpustenej v 20 ml metylénchloridu, sa suspenduje 363,6 mg (1,2 mmol) l-izobutyloxy-2-izobutyloxykarbonyl-l,2-dihydrochinolinu (IDQ). Mieša sa počas 15 minút, pridá sa 1,0 mmol (2R)-5-amino-2-[(R)-benzyloxytetradekanoylamino]pentan-l-olu podľa príkladu 2, rozpusteného v 10 ml metylénchloridu a reakčná zmes sa mieša štyri hodiny.
Roztok sa skoncentruje a zvyšok sa čistí okamžitou chromatografiou (dichlórmetán/acetón = 5 : 2, Rf 0,23). Rozpúšťadlo sa odstráni, čím sa získa 0,620 g bezfarebnej hustej kvapaliny (výťažok 52,7 %), ktorou je fosforylovaná zlúčenina podobná dipeptidu. Rf = 0,49 dichlórmetán/metanol/trietylamín 10 : 1 : 0,5. ‘H-NMR (CDClj, 250 MHz), δ ppm: 7,40 - 7,15 (m, 15), 7,00 (m, 1H), 6,90 a 6,80 (2d, 2 diast., 1H), 6,65 (d, 1H) (3 x NH), 5,15 (m, 1H), 4,50 (m, 3H), 4,30 (m, 2H), 3,85 (m, 2H), 3,45 (m, 2H), 3,15 (m, 2H), 2,41 - 2,14 (m, 8H), 1,6 -1,4 (m, 8H), 1,4 -1,1 (m, 54H), 0,9 (t, 9H, 3CH3).
13C-NMR (CDC13, 63 MHz), δ ppm: 173,11, 171,68, 170,52 (2 diast.), 169,94 (2 diast.), 150,0 (d, JK = 7,2 Hz), 138,0 (2 diast.), 129,58, 127,99, 127,49, 127,26, 125,24, 119,73 (t, J?c = 5,0 Hz), 76,48, 71,12, 70,71, 65,86 (broad špín), 64,22, 50,96, 49,71 (broad spin), 41,46, 41,05, 39,07, 34,13, 34,00, 32,70, 31,61, 29,34, 29,06, 28,87, 27,98, 25,25, 24,92, 24,72, 22,38, 13,80.
2. l-(Difenyloxyfosforyloxy)-3-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hydroxytetradekanoylaminojdekan-10-ol
Roztok fosforylovanej zlúčeniny podobnej dipeptidu (488 mg, 0,42 mmol) skôr získanej a kyseliny octovej (1,9 ml) v 65 ml etanolu s čistotou HPLC sa zavedie do trojhrdlovej guľatej banky a pridá sa 200 mg 10 % paládia na uhlí. Vzduch sa vytesní vo vákuu a banka sa naplní vodíkom. Reakčná zmes sa mieša dve hodiny pri teplote miestnosti, potom sa katalyzátor odfiltruje membránovou filtráciou a rozpúšťadlo sa odstráni vo vákuu, čím sa získa surový produkt (92 % výťažok). Vzorka produktu sa čistí okamžitou chromatografiou (dichlórmetán/acetón 5 : 4, Rf = 0,24). Získa sa sklovitá pevná látka. Rf = 0,68, 5 : 2 metylénchlorid/metanol.
(13C-NMR (CDC13, 63 MHz) δ v ppm (objaví sa niekoľko signálov v tvare dubletu v dôsledku prítomnosti diastereomérov): 173,60, 173,15, 170,67, 170,60, 170,27, 170,07 150,24 (d), 129,92, 125,66, 120,05, 119,90 (2d), 71,11, 71,05, 68,83, 66,21 (broad spin), 64,71, 51,38; 50,32, 50,12, 43,25, 43,12, 41,66, 41,57, 39,30, 37,26, 34,45, 32,84, 31,86, 29,62, 29,5, 29,29, 29,13, 28,08, 25,57, 25,19, 24,97, 22,62, 14,03.
3. 3-[(R)-3-Dodekanoyloxytetradekanoylamino-4-oxo-5-aza]-9-[(R)-3-hydroxytetra-dekanoylamino]dekán-1,10-diol-1 -dihydrogenfosfát
V trojhrdlovej guľatej banke sa predbežne 10 minút aktivuje oxid platiny (137 mg) vodíkom v absolútnom etanole (5 ml). Pridá sa roztok l-(difenyloxyfosforyloxy)-3-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hydroxytetra-dekanoylamino]dekan-10-olu (411 mg, 0,38 mmol) v absolútnom etanole (20 ml). Vzduch sa vytesní vo vysokom vákuu a banka sa naplní vodíkom. Reakčná zmes sa mieša dve až tri hodiny pri teplote miestnosti, katalyzátor sa odfiltruje membránovou filtráciou a rozpúšťadlo sa odstráni vo vákuu, čím sa získa surový produkt v podobe bielej pevnej látky (98 % výťažok), Rf = 0,50, chloroform/metanol/voda 6:4: 0,6.
-[(R)-3 -Hydroxtetradekanoylamino-4-oxo-5-aza] -9-[(R)-3 -dodekanoyloxytetra-dekanoylaminojdekán-1,10-diol-1-dihydrogenfosfát je možné získať rovnakým postupom (schéma 3, obr. 35) použitím 4-(difenyloxyfosforyloxy)-2-[(R)-3-benzyloxytetradekanoylamino]butánovej kyseliny a (2R)-5-amino-2-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylaminojpentan-1 -olu.
Alebo sa 3-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino-4-oxo-5-aza]-9-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]dekán-l,10-diol-l-dihydrogenfosfát získa z asparágovej kyseliny nasledujúcim spôsobom (reakčná schéma 1, 5 a 6, obr. 33, 37 a 38): chránením voľnej funkčnej hydroxylovej skupiny (2R)-5-(benzyloxykarbonylamino)-2-[(R)-3-benzyloxytetradekanoylamino]pentan-l-olu benzyloxymetylovou skupinou, uvoľnením funkčnej 5-aminoskupiny tejto zlúčeniny hydrogenolýzou, uskutočnením peptidovej väzby tohto amínu s monoesterifikovaným derivátom D- alebo L-asparágovej kyseliny uchovaním jeho funkčnej aminoskupiny buď chrániacou skupinou, alebo skupinou (R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylovou, uvoľnením a redukciou koncovej karboxylovej funkčnej skupiny zmesovým anhydridom, prípadne odstránením chrániacej skupiny z funkčnej aminoskupiny odvodenej od asparágovej kyseliny, N-acyláciou derivátom (R)-3-dodekanoyloxytetradekánovej kyseliny, fosforyláciou funkčnej hydroxyskupiny na C] a nakoniec odblokovaním fosfátovej a hydroxylovej funkčnej skupiny hydrogenolýzou.
Príklad 4
Príprava 3-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hydroxy-tetradekanoylamino]dekán-1,10-diol-1,10-bis-(dihydrogenfosfátu) l-(Difenyloxyfosforyloxy)-3-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-benzyloxytetradekanoylamino]dekán-lO-ol (985 mg, 0,84 mmol) sa nechá reagovať 30 minút s dibenzyl-N,N'-dietylfosforamiditom (0,58 ml, 85 % čistoty) v prítomnosti [lH]-tetrazolu (182 mg) v tetrahydrofuráne (35 ml) pri teplote miestnosti. Fosfitový medziprodukt sa oxiduje prídavkom roztoku m-chlórperoxybenzoovej kyseliny (535 mg) v 25 ml metylénchloridu pri teplote 0 až -20 °C. Po 20 minútach sa pridá roztok tiosíranu sodného (20 ml) na neutralizáciu všetkého prebytočného oxidantu, potom sa organická vrstva zriedi éterom. Organická vrstva sa oddelí, premyje sa postupne vodným roztokom tiosíranu sodného (5 x 20 ml), roztokom hydrogenuhličitanu sodného (2 x 20 ml), vodnou kyselinou chlorovodíkovou (20 ml), vysuší sa síranom horečnatým a skoncentruje sa. Surový produkt sa čistí okamžitou chromatografiou na silikagéli (dichlórmetán/acetón =10:3). Takto získaný chránený difosforylovaný derivát (900 mg, 75 % výťažok) (Rf = 0,64, 5 : 2 dichlórmetán/acetón) sa katalytický hydrogenuje počas štyroch hodín v metanole s čistotou HPLC (1000 ml) za prítomnosti 10 % paládia na uhlí (300 mg) pri tlaku a teplote okolia. Katalyzátor sa odfiltruje membránovou filtráciou a filtrát sa skoncentruje za zníženého tlaku, čím sa získa surový 10-(dihydroxyfosforyloxy)-l-(difenyloxyfosforyloxy)-3-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]-4-oxo-5-aza-[(R)-3-Hydroxytetradekanoylamino]-dekán (Rf = 0,63, chloroform/metanol/voda 6:4: 0,6) s 89 % výťažkom. Tento produkt sa podrobí katalytickej hydrogenácii na oxide platiny (380 mg) v etanole s čistotou HPLC (130 ml) 24 hodín pri teplote a tlaku miestnosti. Katalyzátor sa odfiltruje membránovou filtráciou a filtrát sa skoncentruje, čím sa získa voľná bisdihydrogenfosfátová zlúčenina (Rf = 0,20, chloroform/metanol/voda, 6:4: 0,6).
3-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-dodekanoyloxytetra-dekanoylamino]dekán-l,10-diol-l,10-bis(dihydrogenfosfát) je možné získať tým, že sa vychádza zo 4-(difenyloxyfosforyloxy)-2-[(R)-benzyloxytetradekanoylaminoj-butánovej kyseliny a z (2R)-5-amino-2-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]-pentan-l-olu rovnakým postupom (schéma 3, obr. 35).
Alebo možno získať 3-[(R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hydroxytetradekanoylamino]dekán-l,10-diol-l,10-bis(dihydrogenfosfát) z asparágovej kyseliny nasledujúcim spôsobom (reakčná schéma 1, 4 a 6): uvoľnením funkčnej 5-aminoskupiny (2R)-5-(benzyloxykarbonylamino)-2-[(R)-3-benzyloxytetradekanoylamino]pentan-l-olu hydrogenolýzou, prevedením peptidovej väzby tohto amínu monoesterifikovaným derivátom D- alebo L-asparágovej kyseliny, ktorý má na funkčnej aminoskupine buď chrániacu skupinu, alebo (R)-3-dodekanoyloxytetradekanoylovú skupinu, uvoľnením a redukovaním koncovej karboxylovej funkčnej skupiny pomocou zmesového anhydridu, prípadne odstránením chrániacej skupiny z funkčnej aminoskupiny odvodenej od asparágovej kyseliny, potom N-acyláciou derivátom (R)-3-dodekanoyloxytetradekánovej kyseliny, fosforyláciou hydroxylovej funkčnej skupiny v Ci a Cw a nakoniec odblokovaním fosfátových a hydroxylových funkčných skupín hydrogenolýzou.
Príklad 5
Čistenie a analýza zlúčenín podľa vynálezu
1. Čistenie monofosforylovaných a difosforylovaných zlúčenín
Monofosforylované a difosforylované syntetické produkty sa rozpustia v zmesi vody a izopropanolu (objemovo 1 : 1) s 0,1 % trietylamínu na nastavenie hodnoty pH na 8 až 9. Postupne sa pridá potrebné množstvo 2M hydrogenuhličitanu amónneho na dosiahnutie koncentrácie 25 mM.
Čistenie sa uskutoční preparatívnou reverznou fázovou chromatografiou HPLC za nasledujúcich podmienok:
Stĺpec: Bondapack C18 Prep Pak, 40 x 200 mm, 15-20 pm, 30 nm Waters
Mobilná fáza:
A: izopropanol/voda (objemovo 1 : 1), 50 mM hydrogenuhličitanu amónneho B: izopropanol/voda (objemovo 2 : 8), 50 mM hydrogenuhličitanu amónneho Prietoková rýchlosť: 40 ml/min.
Elúcia: izokratická adsorpcia na stĺpci: 40 % B (60 % A), 10 minút Gradient A : B: 40 - 80 % B počas 10 minút Izokratická elúcia: 80 % B, 30 minút
Premývanie: 100 % B, 10 minút
Detekcia: UV, 210 nm (vlnová dĺžka)
Za uvedených elučných podmienok je retenčný čas monofosforylovanej zlúčeniny 25 až 30 minút, zatiaľ čo difosforylovanej zlúčeniny 18 až 25 minút. Ak sa zistí prítomnosť monofenylových produktov (neúplné odstránenie chrániacej skupiny pri defenylácii), je potrebný jemnejší stupeň čistenia. Toto ďalšie čistenie prebieha za nasledujúcich podmienok:
Stĺpec: Kromasil C18, 21 x 250 mm, 5 pm, 10 nm, Macherey-Nagel
Mobilná fáza:
A: izopropanol/voda (objemovo 1:1), 50 mM hydrogenuhličitanu amónneho B; izopropanol/voda (objemovo 2:8), 50 mM hydrogenuhličitanu amónneho Prietoková rýchlosť: 10 ml/min.
Elúcia: izokratická adsorpcia na stĺpci: 40 % B (60 % A), 10 minút
Izokratická elúcia: monofosforylovaná zlúčenina: 80 % B, 30 minút, difosforylovaná zlúčenina: 74 % B, 30 minút
Premývanie: 100 % B, 10 minút Detekcia: UV, 210 a 254 nm (vlnová dĺžka)
Frakcie obsahujúce monofosforylované a difosforylované zlúčeniny vo forme amóniových solí sa zhromaždia a skoncentrujú sa adsorpciou C 18 fáz Bondapack, 15-20 pm, 30 nm, Waters. Sodná soľ monofosforylovaných a difosforylovaných zlúčenín sa získa premytím roztokom 10 g/1 chloridu sodného v zmesi voda/izopropanol (objemovo 9 : 1). Po odstránení prebytku chloridu sodného pretečením 5 objemov zmesi voda/izopropanol (objemovo 9 : 1), sa zlúčenina eluuje čistým izopropanolom. Toto rozpúšťadlo sa odparí do sucha na rotačnej odparke. Konečné rozpustenie sa uskutoční požadovaným množstvom vody (v prípade monofosforylovanej zlúčeniny s prídavkom 0,1 % trietanolamínu) za získania cieľovej koncentrácie 2 mg/ml. Urobí sa sterilná filtrácia filtrom 0,2 pm Express Membráne, Millipore (ak je objem menší ako 50 ml, odporúča sa systém Steriflip, ak je objem väčší ako 50 ml, odporúča sa systém Steritop).
Pri spracovaní monofosforylovanej zlúčeniny je výhodné sonikovať roztok (3 x 10 sekúnd) pri teplote miestnosti pred sterilnou filtráciou.
2. Sledovanie a výťažok čistenia
Po ukončení každého stupňa sa frakcie analyzujú reverznou fázovou chromatografiou HPLC za týchto podmienok:
Stĺpec: Supelcosil C18, 3 pm, 4,6 x 150 mm, 10 nm, Supelco
Mobilná fáza:
A: voda/acetonitril (objemovo 1 : 1), 5 mM TBAP B: voda/izopropanol (objemovo 1 : 9). 5 mM TBAP TBAP: tetrabutylamóniumfosfát Prietoková rýchlosť: 1 ml/min.
Elúcia: gradient A : B (75 : 25 - 0 : 100) počas 37,5 minúty Detekcia: UV, 210 a 254 nm (vlnová dĺžka).
Pri takto uskutočnenej chromatografii sú pozorované retenčné časy monofosforylovaných zlúčenín 25,5 ±0,5 minút a difosforylovaných zlúčenín 20,8 ±0,5 minút. Výťažok čistenia monofosforylovaných zlúčenín je 57 až 94 % a difosforylovaných zlúčenín 71 až 92 %. Získa sa 311 mg monofosforylovaných zlúčenín a 189 mg difosforylovaných zlúčenín.
2. Skúška a analýza stupňa čistoty konečného produktu
Kvantitatívne skúšky a analýza stupňa čistoty produktov sa uskutočňujú pomocou HPLC/UV za opísaných prevádzkových podmienok chromatografie. Podľa týchto skúšok sú stupne čistoty získané pri jednotlivých monofosforylovaných a difosforylovaných skúšobných vzorkách 99 až 100 %. Na odhalenie prítomnosti neaktívnych nečistôt v UV oblasti sa uskutočňujú analýzy LC/ES-MS (pozitívny spôsob elektrosprejovej ionizácie). Na to sa nahradí (5 mM) tetrabutylamóniumfosfátu (25 mM) acetátu amónneho na splnenie požiadaviek ionizácie na elektrosprejovom rozhraní.
Na skúšanie konečných produktov sa používajú alternatívne spôsoby. Napríklad kvantitatívne analýzy celkových fosfátov (podľa Ames B. N., Methods in Enzymology VII, str. 115 až 117, 1966), aminokyselín (podľa Hughes a kol. J. Chromatography 389, sfr. 327 až 333, 1987) a acylových reťazcov (podľa Miller L. T., Hewlett Packard Application Note str. 228 až 237, 1984).
4. Spektrálna analýza
4.1 Hmotnostná spektrometria
Vynesú sa spektrá ES-MS (negatívne a pozitívne druhy) monofosforylovaných a difosforylovaných zlúčenín s použitím troch typov hmotnostných spektrometrov (Finnigan LCQ, ion trap, Micromass Quattro II, tripletový stav quadrupol, Hewlett Packard MSD, singlet quadrupol). Ako doplnok sa uskutočňujú tiež analýzy MS/MS. Spektrá dokazujúce identitu a čistotu uvedených produktov sú v dodatku.
ES-MS spektrá (pozitívny druh) Difosforylovaná zlúčenina: (Micromass Quattro II: spektrum 1, HP-MSD: Spektrum 3) (obr. 39 & 41).
V oblasti nízkych energií možno pozorovať hlavné pseudomolekuláme ióny pri pomere m/z 1014,6 [M + + H]+. Sodné prímesi pri pomere m/z 1036,6 [M + Na]+, 1058,6 [M + H + 2Na]+ a v 1080,5 [M + 2H + 3Na]+ sú tiež viditeľné.
V závislosti od stupňa fragmentácie možno pozorovať dva 916,5 [M-98+H]+ a 818,6 [M-98-H]+ fragmenty m/z, čo dokazuje prítomnosť dvoch fosforylovaných skupín na molekule. Ako je vyznačené spektrom 3 (obr. 41), kolíše relatívna intenzita pozorovaných iónov v závislosti od použitej úrovne energie. Monofosforylovaná zlúčenina:
(Micromass Quattro II: spektrum 2) (obr. 40)
Trochu odlišný ionizačný diagram sa získa pre monofosforylovanú zlúčeninu v dôsledku prítomnosti trietanolanímu (TeoA) v analyzovanom roztoku. Hlavný pseudomolekulámy ión možno pozorovať pri pomere m/z 934,4 [M + H]+, rovnako ako adukty sodné 956,3 [M + H]+ a draselné [M + K]+ pri pomere m/z
SK 287073 Β6
956.3 a 972,3. Viditeľná je aj druhá skupina aduktov pri pomere m/z 1083,4 [M + TEA + H]+ a pri pomere m/z 1105,3 [M + TeOH + Na]+ a pri pomere m/z 1121,3 [M + TeOH + K]+. Prítomnosť fosforylovej skupiny vnútri molekuly je viditeľná z fragmentu zistenom pri vysokej úrovni energie zodpovedajúcej pomeru m/z
836.4 [M-98 + H]+.
Spektrá ES-MS (negatívny druh)
Iónové druhy pozorované v negatívnom druhu spektier ES-MS monofosforylovaných zlúčenín a difosforylovaných zlúčenín v celku súhlasia s výsledkami získanými v pozitívnej forme.
Uskutočňujú sa tiež FAB ionizačné analýzy (pozitívna forma). Pri nízkej rozlišovacej úrovni vykazujú monofosforylované zlúčeniny sodné adukty pri pomere 956,5 [M + Na]+ a difosforylované zlúčeniny pri pomere m/z 1036,5 [M +Na]+.
Pri vysokej rozlišovacej úrovni (3-nitrobenzyl alkoholová matrica) je pozorovaný vrchol pri pomere m/z 956,667 pre monofosfátovú zlúčeninu zodpovedajúcu očakávanému molekulovému vzorcu C49H96OnN3PNa (predpokladaná hmotnosť: 956,668 uma).
Pre difosforylovanú zlúčeninu je zaznamenaný vrchol pri pomere m/z 1036,635, čo zodpovedá molekulovému vzorcu C49H97Oi4N3P2Na (vypočítaná hmotnosť: 1036,634 uma).
Zo všetkých uskutočnených analýz MS vyplýva vysoký stupeň čistoty získaných produktov.
4.2 Nukleárna magnetická rezonancia
Spektrá 'H-NMR a 13C-NMR monofosforylovaných a difosforylovaných zlúčenín sa zisťujú prístrojom DPX Brucker, pracujúcom pri frekvenciách 250,13 a 62,89 MHz a systémom Varian Unity Inova pracujúcom pri frekvenciách 500 až 499,87 a 125,7 MHz. Spektrá 31P-NMR sa zaznamenávajú pri 121,6 MHz (DPX Brucker). Spektrá, dokazujúce identitu a čistotu týchto produktov sú uvedené v dodatku. Spektrá *H-NMR (spektrá 4 & 5) (obr. 42 & 43)
Monofosforylovaná zlúčenina: Na spektrách zaznamenaných v CDC13 + 0,1 % trietanolamínu (TeoA) (spektrum A) sú viditeľné signály zodpovedajúce trom protónom pochádzajúcim od atómov dusíka N(5), N(2a) a N(2b) medzi 7 až 9,5 ppm (zväčšený pohľad spektrálneho okna). Signály pripisované H-N(2a) H-N(2b) sú viditeľné vo forme dvoch dubletov, ktoré dokazujú prítomnosť zmesi stereoizomérov. Ukazuje sa, že jeden diastereoizomér prevláda (ako dôsledok rôznych stupňov vyčistenia).
Difosforylovaná zlúčenina: Na spektrách zaznamenaných v CDC13-CD3OD (objemovo 3 : 1) (spektrum 5) už nie sú signály zodpovedajúce H-N(5), H-N(2a) a H-N(2b) viditeľné dôsledkom výmeny druhov v prítomnosti CD3OD.
Dodatočné informácie, týkajúce sa významu rôznych signálov, sa získajú pokusmi homonukleámej a heteronukleámej korelácie (*H + 'H-NMR: COSY, Ή-C-NMR: HSQC & HMBC).
Spektrá 13C-NMR (spektrá 6 & 7) (obr. 44 & 45)
Zaznamenávanie spektier l3C-NMR je neobyčajne namáhavé kvôli dosť nízkej rozpustnosti monofosforylovaných a difosforylovaných zlúčenín.
Spektrá 31P-NMR (spektrá 8 & 9) (obr. 46 & 47)
Pre monofosforylované a difosforylované zlúčeniny je pozorovaný jediný vrchol.
Príklad 5
Farmakologické štúdie zlúčenín podľa vynálezu
1. Stanovenie endotoxicity Limulovým chromogenickým testom
Endotoxicita sa zisťuje chromogénovým Limuls Amoeobocyte Lysate testom (Chromogenic LAL of Charles River Endosafe, šarža # EK412 E, Charleston, USA). Tento test sa zakladá na aktivácii lipopolysacharidom (LPS) alebo štrukturálne analogickými produktmi enzymatickej kaskády obsiahnutej v LAL. Táto enzymatická aktivácia sa prejavuje rozštiepením chromogénu viazaného na peptid pôsobením proteázy v konečnom štádiu tejto enzymatickej kaskády podľa nasledujúcej reakčnej schémy:
LSP alebo PRODUKT
Ψ
LAL aktivácia proteázy a hydrolýza peptid / chromogénové molekuly
Ψ
Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-p-nitroanilín -> Ac-Ile-Glu-Ala-Arg + p-nitroanilín (bezfarebný) sfarbený (405 nm)
Enzymatická reakcia sa uskutočňuje pri teplote 37 °C a časové vytváranie chromogénu sa meria pri 405 nm: V konečnom stave tejto skúšky určujúcej časový priebeh sa zaznamenáva čas potrebný na dosiahnutie OD 0,2 jednotiek a endotoxická aktivita sa vypočítava na základe štandardu LPS (štandardná krivka).
Výsledky sú vyjadrené v EU (endotoxínových jednotkách) vo vzťahu k štandardizovanej príprave liposacharidov E. coli. Týmto súborom skúšok zodpovedá 1 EU 0,08 mg ekvivalentu LPS.
Výsledky ukazujú na pomerne vysoký stupeň variability, aj keď je to normálne pri kvantitatívnych skúškach takéhoto druhu, ktoré poskytujú v zásade náznak magnitúdy. Testovanie LAL sa uskutočňuje hlavne na dokázanie neprítomnosti pyrogénov (horná medza koncentrácie endotoxínov) vo farmaceutických prostriedkoch. Záväzné je porovnať kvantitatívnu skúšku obsahu pyrogénu s danými dobre štandardizovanými jednotlivými sériami experimentov.
Výsledky
Výsledky (priemer ± smerodajná odchýlka) získané pri produktoch podľa vynálezu sú uvedené v tabuľke (A).
Tabuľka (A) - Aktivácia limulus amoebocyt lyzátu (LAL)
| Produkty | aktivácia LAL v EU/mg | aktivita LAL v ekvivalentoch ng eq.LPS/mg |
| OM-294-DP | 56+48 | 6,2 |
| OM-294-MP | 13 ±2 | 1,4 |
| E. coli LPS (referenčný) | 7,7+1,6 x 106 | 0,85 x 106 |
Zlúčeniny podľa vynálezu sú 106-krát menej aktívne ako LPS v teste LAL. OM-294-DP a OM-294-MP sú preto zaujímavými produktmi vzhľadom na svoju nízku toxicitu, v spojení so svojou schopnosťou sprostredkovávať biologické aktivity a pôsobia ako imunomodulátory (tak in vivo, ako aj in vitro).
2. Stanovenie proliferácie kmeňa buniek myšej kostnej drene v reakcii na stimuláciu LPS alebo zlúčenín podľa vynálezu
Spôsob:
Vdychovaním oxidu uhličitého sa usmrtia dva šesť týždňové myšie samce C57/BL6 a nasleduje krčná dislokácia. Myši sa premyjú alkoholom a koža zadných končatín sa úplne odstráni. Prerušením kĺbov sa vyberú panvové, stehenné a holenné kosti. Skalpelom sa odstráni mäso. Kosti sa očistia a konce kostí sa zastrihnú nožnicami. Kostná dreň sa extrahuje z drieku kostí trojnásobným injektovaním modifikovaného prostredia Dulbecco Eagle (DH-médium) z vonkajších častí odstrihnutých nožnicami. Bunky sa suspendujú v DH médiu a odstreďujú sa 5 minút pri 300xg. Supematant sa odstráni a kmeňové bunky sa suspendujú v DH médiu doplnenom 20 % zárodočného teľacieho séra (FCS). Koncentrácia buniek sa upraví na 500 000 buniek/ml.
Produkty vopred rozpustené v DH médiu doplnenom FCS sa sériovo zriedia aminokyselinami a antibiotikami a vnesú sa priamo do 96-jamkových mikrotitračných doštičiek. Použitím súčiniteľa 3,16 sa pripraví 9 zriedení. Produkty sa testujú v sériách po šesť a každá mikrotitračná doštička zahrnuje negatívnu kontrolu obsahujúcu plné médium. Konečný objem v každej jamke je 100 μΐ. Mikrotitračné doštičky sa inkubujú jednu hodinu v inkubátore pri teplote 37 °C v prostredí s 8 % oxidu uhličitého pri 100 % relatívnej vlhkosti na pufrovanie média. Po jednej hodine sa do produktu pridá 100 μΐ bunkovej suspenzie a v inkubácii sa pokračuje sedem dní.
Proliferácia sa zisťuje meraním oxidácie chromogénového substrátu (XTT) v mitochondriách živých buniek.
Po siedmich dňoch sa mikrotitračné doštičky odstredia 5 minút pri 400 x g a 100 μΐ supematantnej kvapaliny sa odsaje a odstráni. Do každej jamky sa pridá 50 μΐ 1 mg/ml XTT 3-[l-fenylaminokarbonyl)-3,4-tetrazólium]bis[(4-metoxy-6-nitro)benzén-sulfonátu] sodného a 0,008 mg/ml PMS (N-metyldibenzopyrazín, metylsulfátu) v médiu RPM1. Po osemhodinovej inkubácii v inkubátore pri teplote 37 °C v prostredí s 8 % oxidu uhličitého pri 100 % relatívnej vlhkosti sa mikrotitračné doštičky odčítajú spektrofotometrom pri 480 nm oproti štandardu 690 nm.
Výsledky sa vyjadria ako priemerné hodnoty (± smerodajná odchýlka) vynesením dávky oproti krivke reakcie. Graficky sa znázornia tiež hodnoty negatívnej kontroly zložené z DH média (priemer ± smerodajná odchýlka všetkých experimentálnych dát).
V tomto pokuse vyvolávajú zlúčeniny podľa vynálezu významnú proliferáciu kmeňových buniek myšej kostnej drene. Miera takejto reakcie je skoro rovnaká ako miera vyvolaná E. coli LPS, ale minimálna koncentrácia potrebná na vyvolanie významnej reakcie je vyššia. Monofosforylovaný produkt vyvoláva miernejšiu reakciu ako difosforylovaný produkt. Obr. 1 znázorňuje reprezentatívny pokus odvodený zo súboru troch nezávislých štúdií uskutočnených na odlišných bunkových prípravkoch.
3. Stanovenie produkcie oxidu dusíka v supematantných kvapalinách makrofágových kultúr.
Spôsob
Vdychovaním oxidu uhličitého sa usmrtia dva šesť týždňové myšie samce C57/BL6 a nasleduje krčná dislokácia. Myši sa premyjú alkoholom a koža zadných končatín sa úplne odstráni. Prerušením kĺbov sa vyberú panvové, stehenné a holenné kosti. Skalpelom sa odstráni mäso. Kosti sa očistia a konce kostí sa zastrihnú nožnicami. Kostná dreň sa extrahuje z drieku kostí trojnásobným injektovaním 1 ml modifikovaného prostredia Dulbecco Eagle (DH-médium) do drieku kostí. Bunky sa resuspendujú v DH médiu a odstred’ujú sa 5 minút pri 300 x g. Supematant sa odstráni a kmeňové bunky sa resuspendujú v DH médiu doplnenom 20 % konského séra (HS) a 30 % L929 supematantu kultúry s hustotou 40 000 buniek/ml. L929 je fibroblastová myšia bunková línia, ktorej supematantná kvapalina je bohatá na makrofág (M-CSF) rastového faktora. Bunková suspenzia sa rozdelí na podiely po 12 ml v Petriho miskách, ktoré sa inkubujú osem dní v inkubátore pri teplote 37 °C v prostredí s 8 % oxidu uhličitého pri 100 % relatívnej vlhkosti. Po ôsmich dňoch sa kmeňové bunky rozdelia na dospelé makrofágové bunky. Makrofágové bunky sa zoškriabu po inkubácii 45 minút pri teplote 4 °C do studeného pufra PBS. Po odstredení a odstránení supematantu sa bunky resuspendujú v DH médiu doplnenom 5 % zárodočným teľacím sérom (FCS), glutamínom, asparagínom, arginmom, kyselinou folovou, merkaptoetanolom a antibiotikami (penicilínom a streptomycínom). Kmeňové bunky sa zhromaždia a ich hustota sa upraví na 700 000 buniek/ml:
Produkty, vopred rozpustené v DH médiu doplnenom FCS, sa sériovo zriedia aminokyselinami a antibiotikami priamo v 96-jamkových mikrotitračných doštičkách. Použitím súčiniteľa zriedenia 3,16 sa pripraví 9 až 10 zriedení v závislosti od produktov. Produkty sa testujú trikrát a každá mikrotitračná doštička obsahuje negatívnu kontrolu obsahujúcu plné médium. Konečný objem v každej jamke je 100 μΐ. Mikrotitračné doštičky sa inkubujú 1 hodinu v inkubátore pri teplote 37 °C v prostredí s 8 % oxidu uhličitého pri 100 % relatívnej vlhkosti na pufrovanie média. Po jednej hodine sa do produktu pridá 100 μΐ bunkovej suspenzie a inkubácia sa predĺži na 22 hodín.
Po 22 hodinách sa mikrotitračné doštičky odstredia 5 minút pri 400 x g a odsaje sa 100 μΐ supematantnej kvapaliny a prevedie sa do mikrotitračnej doštičky. Do každej jamky sa pridá 100 μΐ Griessovho činidla [5 mg/ml sulfanilamidu + 0,5 mg/ml N-(l-naftyletyléndiamín)hydrochloridu v 2,5 % vodnej fosforečnej kyseline], Mikrotitračné doštičky sa odčítajú spektrofotometrom pri vlnovej dĺžke 562 nm oproti referenčnej vlnovej dĺžke 690 nm. Koncentrácia nitridu je úmerná obsahu oxidu dusíka. Obsah nitridu sa určí pomocou štandardnej krivky, ktorá vyjadruje lineárnu závislosť v rozsahu 1 až 25 μΜ.
Výsledky sú vyjadrené ako priemer ± smerodajná odchýlka po odčítaní hodnoty negatívnej kontroly a zobrazia sa ako krivka závislosti dávky od reakcie.
Pri tomto pokuse vyvolávajú zlúčeniny podľa vynálezu produkciu oxidu dusíka myšími makrofágovými bunkami spôsobom konzistentným s krivkou závislosti dávky od reakcie. Difosforylovaný produkt vyvoláva proliferáciu v značne väčšej miere ako E. coli LPS, ale koncentrácia potrebná na vyvolanie významnej reakcie je vyššia. Monofosforylovaný produkt vyvoláva miernejšiu reakciu v porovnaní s reakciou vyvolávanou difosforylovaným produktom a E. coli LPS. Na obr. 2 je znázornený reprezentatívny pokus odvodený z 3 nezávislých meraní na rôznych bunkových prípravkoch.
4. Stanovenie schopnosti zlúčenín podľa vynálezu vyvolať produkciu α-TNF ľudskými alveolovými makrofágovými bunkami
Spôsob
Príprava alveolových makrofágových buniek: Ľudské alveolové makrofágové bunky sa získajú bronchoalveolovým prepláchnutím (BAL) pľúc pacientov trpiacich rakovinou pľúc. BAL sa uskutočňuje bezprostredne po chirurgickom zákroku pľúcneho tkaniva vrátane zdravej časti pľúcneho laloku. Preplachuje sa 0,8 % roztokom chloridu sodného pomocou 50 ml injekčnej striekačky. Získané bunky tvoria z 85 % makrofágové bunky a väčšina ostatných buniek sú lymfocyty. Po odstredení sa bunky suspendujú v médiu RPMI a červené krvinky sa odstránia odstredením na zariadení Ficoll Pack (pre výskum). Makrofágové bunky sa premyjú trikrát HBSS a naočkujú sa do 24-jamkových mikrotitračných doštičiek v množstve 1 ml na jamku obsahujúci celkom 1 000 000 buniek. Po jednohodinovej inkubácii pri teplote 37 °C výsledné makrofágové bunky priľnú a jamky sa premyjú trikrát 1 ml HBSS na odstránenie nepriľnutých buniek. Po premývacej operácii sa do každej jamky, obsahujúcej makrofágové bunky, pridá 1 ml RPMI.
Inkubácia s produktmi a skúška α-TNF: Alveolové makrofágové buky sa inkubujú pri teplote 37 °C v prostredí obsahujúcom 5 % oxidu uhličitého v prítomnosti 0,1 pg/ml, 1 pg/ml a 10 pg/ml nasledujúcich produktov:
- negatívne kontroly: RPMI,
- pozitívne kontroly: E. coli LPS (sérotyp 05:B5, Difco, Detroit, USA),
- monofosforylované zlúčeniny podľa vynálezu (OM-294-MP),
- difosforylované zlúčeniny podľa vynálezu (OM-294-DP).
Kultivačné supematanty sa získajú po 24 hodinách a analyzujú sa na obsah α-TNF (BioSource Cytoscreen Kit, Camarillo, CA, USA) s citlivosťou 1 pg/ml.
Výsledky
Monofosforylované a difosforylované deriváty podľa vynálezu vyvolávajú miernu produkciu α-TNF v koncentráciách takých malých, ako je 10 pg/ml. Monofosforylované deriváty podľa vynálezu vyvolávajú produkciu α-TNF vo väčšej miere ako difosforylované. Pozitívna kontrola LPS vyvoláva vo všetkých troch testovaných koncentráciách vysokú produkciu α-TNF. Výsledky sú v tabuľke (a).
Tabuľka (a) - Vyvolávanie produkcie α-TNF zlúčeninami OM-294-MP a OM-294-DP v ľudských alveolových makrofágových bunkách
| α-TNF [pg/ml] priemer 1 smerodajná odchýlka z 3 nezávislých pokusov | ||||
| Produkt | 0 pg/ml | 0,1 pg/ml | 1 pg/ml | 10 pg/ml |
| Negatívna kontrola RPMI | 195170 | |||
| Pozitívna kontrola: E. coli LPS | 7667 ±1155 | 985812148 | 1039013415 | |
| OM-294-MP-1 | 246138 | 353+75 | 10491295 | |
| OM-294-MP-2 | 205162 | 291±70 | 11241406 | |
| OM-294-DP-1 | 156166 | 117185 | 3291141 | |
| OM-294-DP-2 | 17+79 | 88+61 |
5. Stanovenie kapacity zlúčenín podľa vynálezu na inhibíciu produkcie α-TNF v ľudských alveolových makrofágových bunkách, v reakcii na E. coli Lipopolysacharidu (LPS)
Spôsob
Príprava alveolových makrofágových buniek: Ľudské alveolové makrofágové bunky sa získajú bronchoalveolovým prepláchnutím (BAL) pľúc pacientov trpiacich rakovinou pľúc. BAL sa uskutočňuje bezprostredne po chirurgickom zákroku pľúcneho tkaniva vrátane zdravej časti pľúcneho laloku. Preplachuje sa 0,8 % roztokom chloridu sodného pomocou 50 ml injekčnej striekačky. Získané bunky tvoria z 85 % makrofágové bunky a väčšina ostatných buniek sú lymfocyty. Po odstredení sa bunky suspendujú v médiu RPMI a červené krvinky sa odstránia odstredením na zariadení Ficoll Pack (pre výskum). Makrofágové bunky sa premyjú trikrát HBSS a naočkujú sa do 24-jamkových mikrotitračných doštičiek v množstve 1 ml na jamku obsahujúcu celkom 1 000 000 buniek. Inkubuje sa počas jednej hodiny pri teplote 37 °C, výsledné makrofágové bunky priľnú a jamky sa premyjú trikrát 1 ml HBSS na odstránenie nepriľnutých buniek. Po premývacej operácii sa do každej jamky, obsahujúcej makrofágové bunky, pridá 1 ml RPMI.
Inkubácia s produktami a skúška α-TNF: Alveolové makrofágové bunky sa inkubujú pri teplote 37 °C v prostredí obsahujúcom 5 % oxidu uhličitého v prítomnosti E. coli LPS (05 : B5 sérotyp Difco, Detroit, USA), pri 1 mg/ml, do ktorého sa súčasne pridajú nasledujúce produkty s koncentráciou 10 pg/ml:
- negatívna kontrola: RPMI,
- monofosforylované zlúčenina podľa vynálezu (OM-294-MP),
- difosforylované zlúčenina podľa vynálezu (OM-294-DP).
Kultivačné supematanty sa získajú po 24 hodinách a analyzujú sa na obsah α-TNF (BioSource Cytoscreen Kit, Camarillo, CA, USA) s citlivosťou 1 pg/ml.
Výsledky
Difosforylovaný derivát podľa vynálezu inhibuje produkciu α-TNF normálne vyvolávanú LPS. Monofosforylovaný derivát čiastočne inhibuje produkciu α-TNF vyvolávanú LPS. Výsledky testu sú uvedené v tabuľke (a).
SK 287073 Β6
Tabuľka (a) - Inhibícia produkcie α-TNF vyvolávanej LPS zlúčeninami OM-294-MP a OM-294-DP v ľudských alveolových makrofágových bunkách
| Produkt | α-TNF [pg/ml] | % inhibície |
| RPMI (negatívna kontrola) | 73 | - |
| E. coli LPS (1 pg/ml) (pozitívna kontrola) | 8170 | 0 |
| OM-294-MP-1 (10 pg/ml) + E. coli LPS (1 pg/ml) | 4577 | 44 |
| OM-294-MP-2 (10 pg/ml) + E. coli LPS (1 pg/ml) | 4789 | 41 |
| OM-294-DP-1 (10 pg/ml) + E. coli LPS (1 pg/ml) | 1267 | 84 |
| OM-294-DP-2 (10 pg/ml) + E. coli LPS (1 pg/ml) | 1280 | 84 |
6. Účinok produktov OM-294-MP a OM-294-DP na dendritické zrenie molekúl
Vyhodnocuje sa schopnosť produktov OM-294-MP a OM-294-DP vyvolávať zrenie predendritických buniek na dendritické bunky. Merajú sa nasledujúce parametre: Začleňovanie konjugátu FITC-dextrán a expresia povrchových markerov CD40, CD80, CD83, CD86.
Spôsob
Bunky: Izolujú sa mononukleované bunky periferálnej krvi z povlaku bielych krviniek šiestich zdravých darcov krvi. Darcovia neabsolvujú žiadne ošetrenie pred odberom krvi.
Príprava buniek:
Monocyty vyčistené priľnavou selekciou sa resuspendujú v médiu RPMI-1640 (Sigma-Aldrich: St. Louis, MO, USA) obsahujúcom 10 % zárodočného teľacieho séra, GM-CSF (10 ng/ml, IM-HGMI, Immungenex Corp., Los Angeles, CA, USA) a IL-4 (10 ng/ml, č. 204 IL, R & D Systém, Minneapolis, MN, USA) s hustotou 1 x 106 buniek/ml a rozdelia sa do Petriho misiek s priemerom 10 cm (P10, Falcon, Becton, Dickinson, Plymouth, UK) (10 x 106 buniek na misku P10) a kultivujú sa 6 dní (s výmenou čerstvého média po troch dňoch). Tieto bunky sa označujú ako predendritické bunky (DC-6). Zrenie predendritických buniek na dendritické sa dosahuje inkubáciou buniek OM-294-MP a OM-294-DP a LPS počas troch ďalších dní pri koncentráciách nastavených pod Product section. Deviaty deň (DC-9) sa bunky zhromaždia a analyzujú sa použitím rôznych indikátorov zrelosti dendritických buniek: posudzujú sa povrchové markery CD40, CD80, CD83, CD86 aj z hľadiska ich schopnosti odstraňovať konjugát FITC-Dextrán. Všetky tieto parametre sa analyzujú s použitím prístroja EPICS-XL-MCL model FACS (Counter Immunology, Hialeah, Fínsko) (Lanzavecchia a kol., J. Exp. Med. 179, str. 1109, (1994), Lanzavecchia a kol., J. Exp. Med. 182, str. 389 (1995)).
Analýza dát:
Expresia povrchových markerov sa vyjadruje percentom strednej fluorescencie buniek stimulovaných LPS (pozitívna kontrola). Odstránenie konjugátu FITC-Dextrán sa vypočíta s ohľadom na rýchlosť odstránenia buniek udržovaných v zásaditom prostredí a vyjadruje sa v percentách. Štatistická analýza Študentovým t-testom zahrnuje porovnanie dát získaných z rôznych testov s dátami pozitívnej kontroly. Miera významnosti dát je určená pri p < 0,05.
Produkty:
Zásobné roztoky OM-294-MP a OM-294-DP sa pripravia v koncentrácii 1 mg/ml v 0,9 % vodnom roztoku chloridu sodného, v prípade OM-294-MP s prídavkom 0,1 % trietylamínu. Roztoky sa inkubujú 20 minút pri teplote 37 °C za intenzívneho miešania počas troch minút, zriedia sa na 100 pg/ml v kultivačnom médiu RPMI-1640 a používajú sa buď v koncentrácii 10 mg/ml (obr. 3, 6, 7, 8), alebo v koncentráciách od 0,02 do 25 pg/ml (obr. 4, 5).
Referenčný produkt:
Lipopolysacharid E. coli (LPS, DIFCO, Detroit, MI. USA) ako zásobný roztok 5 mg/ml v PBS. Pripraví sa ako medziprodukt roztok 100 pg/ml v kultivačnom médiu RPMI 1640. Koncentrácie na testovanie sú buď 10 pg/ml (obr. 3, 6, 7, 8) alebo v koncentráciách 0,02 až 10 pg/ml (obr. 4, 5).
Výsledky
Nedozreté dendritické bunky (DC-6) pochádzajúce z diferenciácie monocytov, spojovacím pôsobením GM-CSF a IL-4, sú schopné začleňovať konjugát FIFC-Dextrán, Počas zrenia bunky strácajú schopnosť začleňovať konjugát FITC-Dextrán. Analýzy sa uskutočňujú po dosiahnutí diferenciačného stavu DC-9.
Výsledky sa vyjadrujú v percentách začlenenia konjugátu FITC-Dextrán pozorovaného v nestimulovaných bunkách (základné médium) (obr. 3). Bunky spracované LPS alebo OM-294-MP si uchovajú iba 10 % alebo OM-294-MP iba 19 % svojej fagocytovej kapacity, zatiaľ čo bunky stimulované OM-294-DP si plne uchovajú svoju schopnosť začleňovať konjugát FITC-Dextrán (98 až 99 %). Krivka závislosti reakcie od dávky naznačuje, že OM-294-MP má vynikajúcu kapacitu na vyvolávanie diferenciácie buniek DC-6 do DC9 pri koncentráciách od 0,02 pg/ml do 25 pg/ml (obr. 4), pričom boli testované nízke koncentrácie a obr. 5 na testovanie vyššej koncentrácie.
Iným kritériom na posúdenie zrelosti DC je expresia spolu stimulujúcich povrchových markerov. Testuje sa expresia CD40, CD80, CD83 a CD86. Výsledky sú vyjadrené v percentách priemernej fluorescencie založenej na expresii týchto markerov vyvolanej LPS.
OM-294-MP zvyšuje expresiu všetkých testovaných povrchových markerov: CD40 (39 %), CD80 (62 %), CD83 (60 %), CD86 (77 %) (obr. 6, 7, 8, 9).
OM-294-DP spôsobuje podobný účinok ako základné kultivačné médium na expresii skúmaných markerov. Tento efekt nepresahuje 20 % účinku LPS.
7. Účinok produktov OM-294-MP a OM-294-DP na produkciu α-TNF a IL-12 p70 monocytov a predendritických buniek za stavu DC-6
Bunky DC-6 (5 x 10s/500 pl média) sa stimulujú počas 4 hodín, 6 hodín a 24 hodín buď LPS (10 pg/ml), alebo OM-294-MP (10 pg/ml), alebo OM-294-DP (10 pg/ml).
Spôsob
Podmienky experimentov in vivo·. Získajú sa mononukleové bunky periférnej krvi z povlaku bielych krviniek šiestich zdravých darcov krvi (pred odberom krvi darcovia neabsolvovali žiadne liečenie). Monocyty sa izolujú na gradiente Ficoll, a potom sa čistia priľnavou selekciou. Voľne priľnuté bunky sa zhromaždia a jedna frakcia buniek sa uloží ako monocyty. Vyčistené monocyty sa resuspendujú do média DPMI-1640 obsahujúceho 10 % FCS v množstve 1 x 106 buniek/ml a rozdelia sa do Petriho misiek s priemerom 10 cm (P10, Falcon, Becton, Dickinson, Plymouth, UK) 10 x 106 buniek na misku P10. Bunky sa kultivujú šesť dní v plnom médiu RPMI 1640 obsahujúcom GM-CSF (10 ng/ml) a IL-4 (10 ng/ml). Na šiesty deň sa bunky zhromaždia, premyjú sa HBSS a naočkujú sa do 24-jamkovej doštičky s hustotou 5 x 105 buniek/jamka v 500 pl plného média RPMI a stimulujú sa LPS (10 pg/ml), OM-294-MP (10 pg/ml) alebo OM-294-DP (10 pg/ml). Postupom ELISA sa skúmajú ako α-TNF tak IL-12 p70 v supematantoch kultúry, ktoré sa spätne získajú po 4, 6 a 24 hodinách.
Produkty:
Produkty OM-294-MP a OM-294-DP (1 mg/ml zásobného roztoku v sterilnej vode) sa inkubujú 20 minút pri teplote 37 °C a intenzívne sa miešajú 3 minúty, načo sa zriedia na 100 mg/ml a použijú sa v konečnej koncentrácii 10 pg/ml v kultivačnom médiu RPMI 1640.
Referenčný produkt:
Lipopolysacharidy E. coli (LPS, DIFCO, Detroit, MI, USA), zásobný roztok 5 mg/ml v PBS, ako medziprodukt roztok 100 pg/ml v kultivačnom médiu: 100 pg/ml, použitý v konečnej koncentrácii 10 pg/ml. Test α-TNF a IL-12 p70:
Podľa dodávateľovej inštrukčnej príručky súpravou α-TNF KHC3012 kit spoločnosti Biosource, batch # PP003-J061703 (Biosource Intemational, Camarillo, CA, USA) ELISA sa vykoná skúška IL-12 p70 v kultivačných supematantoch spôsobom ELISA pomocou ľudskej OL-12 kit (č. D1200, dávka 990 6232, R & D Systém, Minneapolis, MN, USA).
Výsledky a-TNF
OM-294-MP stimuluje produkciu α-TNF bunkami DC-6 podobným spôsobom ako LPS, tak z hľadiska časového priebehu produkcie, ako aj z hľadiska koncentrácie α-TNF (obr. 10 ). Pri oboch produktoch je vrchol α-TNF medzi 6 až 24 hodinami. OM-294-DP má iba malý stimulačný účinok na produkciu a-TNF bunkami DC-6.
IL-12 p70
Všeobecne platí, že IL-12 sa vyvolá v prítomnosti γ IFN (LPS + γ INF, OM-294-MP + γ IFN) v monocytoch (obr. 12) a v bunkách DC-6 (obr. 11). Nástup produkcie cytokínu je skorší v DC ako v monocytoch.
8. Vyhodnotenie vlastností adjuvantov OM-294-MP a OM-294-DP v myšom imunizačnom modeli so syntetickým peptidom (Pb CS His6-242-310) C-terminálovej oblasti cirkumsporozoitového povrchového proteínu Plasmodium berghei
Spôsob Antigén:
Peptid Pb CS (HHHHHHGGMN NKNNNNDDSY IPSAEKILEFVKQIRDSITE EWSQCNVTCG SGIRVRKRKG SNKKAEDLTL EDIDTEI), ďalej nazývaný His6-242-310 zodpovedajúci sekvencií aminokyselín 242-310 cirkumsporozoitového kmeňa ANKA povrchového proteínu Plasmodium berghei plus N-terminálový úsek 6-histidínu, 2-cyklínu a jedného metionínového zvyšku sa získa spôsobom, ktorý opísali Merrifield a Athenon (Athenon a kol., Bioorg. Chem. 8, str. 350 až 351, 1979). Polypeptid sa pripraví na p-alkoxybenzylalkoholovej živici (Wangova živica), ktorá má stupeň substitúcie 0,4 mmol/g. V čase kopulácie 30 minút sa použije 10-násobný molámy prebytok derivátov F-moc aminokyselín. Peptid sa čistí chromatografiou vylučujúcou veľkosť (Sephadex G25, Pharmacia, Sweden), potom reverznou fázovou chromatografiou (W-Porex 5 C-4, 250 x 10 mm, Phenomenex, Torrance, CA, USA) s použitím 40-min. gradientu zmesi objemovo 10 až 50 % acetonitril/ 0,1 % trifluóroctovej kyseliny pri prietokovej rýchlosti 3 ml/min.
Zloženie aminokyselín peptidu sa určí spôsobom Knecht a Chang (Annal. Chem. 58, str. 2373 až 2379, 1986) a molekulová hmotnosť sa určí hmotnostnou spektrometriou s použitím prístroja model Voyager DE (Perspective Biosystem, Framingham, MA, USA). Zásobný roztok antigénu sa pripraví s koncentráciou 0,4 mg/ml v systéme 0,9 % chloridu sodného/ voda s hodnotou pH 8,0.
Adjuvanty:
Zásobné roztoky OM-294-DP a OM-294-MP sa pripravia s koncentráciou 1 mg/ml v 0,9 % vodnom roztoku chloridu sodného so začlenením 0,1 % trietylamínu pre OM-294-MP. Pozitívnou kontrolou je neúplný Freundov adjuvant (IFA od DIFCO, Detroit, MI, USA), negatívnou kontrolou je 0,9 % roztok chloridu sodného.
Zmes antigén - adjuvant:
Jeden objem antigénu a jeden objem adjuvantu sa tri minúty vírivo mieša.
Imunizačné režimy:
týždňové myšie samice BALB/c (6 myší v skupine) sa imunizujú trikrát, subkutánnym injektovaním do konca chvosta 0,1 ml nasledujúcich zmesí:
| Skupina | Adjuvant 0,05 mg/injekcia | Antigén 0,02 mg/injekcia | Počet myší |
| 1 | - | PbCS His6-242-310 | 6 |
| 2 | IFA | Pb CS His6-242-310 | 6 |
| 3 | OM-294-MP | Pb CS His6-242-310 | 6 |
| 4 | OM-294-DP | Pb CS His6-242-310 | 6 |
| 5 | OM-294-MP | - | 6 |
| 6 | OM-294-DP | - | 6 |
Imunizačná a odberová tabuľka
| Týždne | 0 | 3 | 4 | 7 | 9 |
| Imunizácia | Φ | Φ | Φ | ||
| Špeciálna reakcia na protilátky | Φ | Φ | Φ | Φ | |
| Reakcia CTL | Φ | Φ |
Odber vzorky lymfoidného orgánu a krvi:
Odber séra:
Odber krvi sa koná v týždňoch 0, 3, 7 a 9. Krv sa nechá ustáliť šesť minút pri teplote 37 °C a potom sa nechá stáť cez noc pri teplote 4 °C. Sérum sa zmrazí na teplotu -80 °C až do skúšky protilátky.
Získanie slabinových lymfatických uzlín a sleziny:
Časť z každej skupiny zvierat sa po 4 alebo 9 týždňoch usmrtí a chirurgicky sa odoberú lymfatické uzliny zo slabín a slezina.
Stanovenie protilátkového titra anti-Pb CS His6-242-310
Skúška protilátok, špecificky zameraná na antigén Pb CS His6-242-310, sa uskutočňuje spôsobom ELISA. Väzba antigénu sa uskutočňuje v mikrotitračných 96-jamkových doštičkách (Maxisorp F96, Nunc, DK) inkubáciou cez noc vo vlhkej komore pri teplote 4 °C v každej jamke obsahujúcej 0,1 ml PBS (fosfátom pufrovaná soľanka) obsahujúcom 0,001 mg/ml antigénu Pb CS His6-242-310. Blokovanie mikrotitračnej doštičky sa uskutočňuje PBS obsahujúcom 1 % albumínu hovädzieho séra (BSA, Fluka, Švajčiarsko). Doštičky sa premyjú PBS obsahujúcom 0,05 % Tweenu 20 (Sigma, St. Louis, MO, USA). Vzorky séra, zhromaždené v týždni 0, 3, 7 a 9, sa sériovo zriedia riediacim pufŕom (PBS obsahujúci 2,5 % prášku zberaného mlieka a 0,05 % Tweenu 20) a prenesú sa do mikrotitračnej doštičky a nechajú sa stáť 1 hodinu pri teplote miestnosti. Doštičky sa potom opláchnu PBS a vnesie sa do nich zriedený roztok obsahujúci myší polyklonálny antiimunoglobulín napojený na alkalickú fosfatázu (Sigma, St. Louis, MO, USA) a inkubujú sa jednu hodinu pri teplote miestnosti. Doštičky sa premyjú PBS a špecifické protilátky sa vyvolajú farebnou reakciou pridaním substrátu alkalickej fosfatázy, P-nitrofenylfosfátu (Sigma, St. Louis, MO, USA). Absorbancia pri 405 nm sa odčíta čítačom mikrotitračnej doštičky (Dynatech 25000 ELISA reader, Ashford, Middlesex, UK), každá vzorka séra sa meria dvakrát. Výsledky sú priemerom meraní so zreteľom na myši každej skupiny. Protilátkový titer je daný najvyšším zriedením dávajúcim významne pozitívnu reakciu, teda OD väčšiu, ako je úroveň šumu ± 3D.
Skúška ELISPOT
Protilátky, špecificky zamerané na myší γ-interferón (01E703B2), sú viazané inkubáciou cez noc pri teplote 4 °C vo vlhkej komore, pridaním protilátkového roztoku pri 50 pg/ml v mikrotitračnej doštičke ELISPOT, kde dno jamky je pokryté nitrocelulózou (Millipore, Molsheim, Francúzsko). Blokovanie sa uskutoční pridaním média DMEM (Life Technologies, Grand Island, NY, USA), ktoré obsahuje 10 % zárodočného teľacieho séra (FCS, Fakola, Švajčiarsko) a dvojhodinovým odstátím pri teplote 37 °C. Bunky, získané z lymfatických orgánov (zo slabinových lymfatických uzlín a zo sleziny) sa kultivujú v mikrotitračných doštičkách s hustotou 200 000 buniek/ jamka, sa spoločne kultivujú s 100 000 buniek P815 počas 24 hodín pri teplote 37 °C, prípadne v súťaži s krátkym peptidom PbCS 245 až 252. Po inkubácii sa bunky vyberú a po premytí sa pridá druhý myší anti-γ IFN protilátkový-biotínový komplex (ANI, 2 pg/ml v PBS s 1 % BSA) a inkubuje sa dve hodiny. Pridá sa streptavidín-alkalický fosfatázový konjugát (Boehringer Mannheim, Mannheim, Nemecko) a inkubuje sa jednu hodinu pri teplote 37 °C, vykoná sa trojité premytie PBS obsahujúcom 0,05 % Tweenu 20, nasledované trojitým premytím PBS. Prítomnosť anti-γ IFN imunitných komplexov sa demonštruje pridaním substrátu BCIP/NBT (Sigma, St. Louis, MO, USA). Táto reakcia sa ukončí premytím vodou z vodovodu. Miesta, ktoré sú pozitívne na γ IFN, sa pod stereomikroskopom odčítajú. Špecifický počet škvŕn je rozdielom medzi škvrnami odčítanými v prítomnosti buniek súťažiacich s peptidom a škvrnami odčítanými v neprítomnosti peptidu. Výsledky sú stredné hodnoty meraní, zaznamenané pre myši každej skupiny. Sú vyjadrené ako počet škvŕn na milión kultivovaných krvných buniek.
Výsledky
Protilátková reakcia:
Produkcia protilátok, špecificky zameraných na Pb CS His6-242-310, zistená spôsobom ELISA, je graficky znázornená pre myši, ktorým boli podané jedna, dve a tri imunizačné dávky. Kontrola zahrnuje jedinú dávku samotného antigénu a výsledky veľmi slabého protilátkového titra. Protilátkový titer s jednou samotnou dávkou antigénu v zmesi s OM-294-MP alebo prípadne OM-294-DP je takmer taký vysoký ako reakcia pozorovaná pri neúplnom Freundovom adjuvante (IFA) v zmesi s tým istým antigénom (obr. 13). Po dvoch dávkach OM-294-MP a OM-294-DP sú adjuvanty schopné vyvolať sérologickú reakciu, ktorá je prípadne väčšia ako reakcia IFA (obr. 14). Po troch dávkach sú schopné adjuvanty OM-294-MP a OM-294-DP vyvolať sérologickú reakciu, ktorá je vyššia ako reakcia IFA (obr. 15).
Obr. 13 ELISA 3 týždne po prvej imunizačnej dávke.
Obr. 14 ELISA 4 týždne po druhej imunizačnej dávke. Obr. 15 ELISA 2 týždne po tretej imunizačnej dávke.
Obr. 16 Protilátkový titer nameraný pred a po prvej, po druhej a po tretej imunizačnej dávke.
Protilátkové titre zvierat v každej skupine pred imunizačnou dávkou a po jednej, dvoch a troch imunizačných dávkach sú uvedené ako priemerné hodnoty (obr. 16).
Reakcia CTL:
Zistenie epitopu T-buniek Pb CS 245-252 obsiahnutého v Pb CS His6-242-310 použitého na imunizáciu je dobre predvedené testom ELISPOT. Reakcia T-lymfocytov zaznamenaná u imunizovaných zvierat (slabinové lymfatické uzliny a slezina, získané jeden týždeň po druhej dávke a prípadne dva týždne po tretej dávke) je doložená nárastom pozitívneho počtu dávok pre γ interferón (γ IFN). Výsledky uvedené na obr. 17, 18, 19 a 20 sú vypočítané ako priemerná hodnota meraní, dosiahnutá každým zriedením a pre myši každej skupiny. Sú vyjadrené počtom dávok na milión buniek v kultúre.
Výsledky oboch adjuvantov OM-294-MP a OM-294-DP znamenajú veľmi významný nárast reakcie CTL lymfocytov odvodených zo sleziny a slabinových lymfatických uzlín. Reakcie sleziny sú vyššie ako reakcie slabinových lymfatických uzlín. Aktivita CTL, vyvolaná adjuvantmi OM-294-MP a OM-294-DP je zreteľne nadriadená aktivite vyvolanej IFA.
9. Dôkaz nekovalentných komplexov antigénu OM- 294 kapilárnou elektroforézou
Na preukázanie nekovalentného vytvárania komplexu OM-294-DP a peptidu PbCSHis6-242-310 počas prípravy vakcíny sa použije kapilárna elektroforéza.
Spôsob hodnotu pH 7,4 IN roztokom hydroxidu sodného (Fluka č. 72072).
Kapilárna (nevrúbľovaná) trubica, rozdelená po zónach, dĺžka 30 cm, priemer 50 pm. Detekcia sa vykoná pri 200 nm použitím prístroja Beckman PACE MDQ (Beckman, Brea, CA, USA).
Podmienky separácie:
| Čas [min ] | Proces | Tlak | Rozpúšťadlo |
| 0,00 | Kapilárne premývanie | 138 kPa | voda |
| 3,00 | Kapilárne premývanie | 138 kPa | 1 N NaOH |
| 6,00 | Injektáž vzorky | 3,45 kPa | borátový pufer |
| 6,08 | Separácia | 30,0 KV | borátový pufer |
Antigény: Pb CS His6-242-310 syntetický peptid pri 1 mg/ml H2O
Adjuvant: OM-294-DP pri 1 mg/ml H2O
Zmes antigénu a adjuvantu: 250 pg/ml + 250 pg/'ml
Výsledky
Vytváranie komplexu antigén - adjuvant je možné pri príprave tohto vakcínového prostriedku na diagrame elektroforézy vymiznutím adjuvantového vrcholu a posunom antigénového vrcholu za vzniku nového vrcholu, ktorý je špecifický pre novovytvorený komplex (obr. 21).
10. Ošetrovanie peritoneálnej rakoviny vyvolanej injekciou buniek odvodených zo syngénnej nádorovej línie PROb krýs BDIX
Tento experiment má dokázať protinádorové pôsobenie OM-294-DP, podávaného v sériách, napríklad injektovaním krysám, ktoré majú makroskopické nádory veľkosti niekoľko milimetrov.
Spôsob
Zvieratá:
Kmeň In-bred krýs BDIX ustanovil H. Druckrey v roku 1937. Párik ktýs z Max Planckovho Inštitútu vo Fribourgu (FRA) bol počiatočným zdrojom tejto kolónie, ktorá bola udržovaná od roku 1971 systémom jedinej línie v domove laboratórnych zvierat. Podľa tohto systému sa vyčlení jediný pár sestra-brat za získania potomstva nasledujúcej generácie. Krysy použité pri tejto práci sú z ústavu Experimental Animal Breeding Center v Iffa-Credo (Arbresle, Francúzsko), ktorý pokračoval v chove pomocou prihlasovateľovho laboratória. Použité krysy sú samce vo veku 3 mesiace ± 1 týždeň.
Vyvolanie nádoru injektovaním PROb:
Pôvod buniek PROb:
Najskôr sa odvodila bunková línia DHD/K12 zo štepu karcinómového fragmentu hrubého čreva krysy inbred BDIX ošetrením 1,2-dimetylhydrazínom. Táto línia priľnutých buniek sa rozdelila do dvoch podskupín podľa ich citlivosti na ošetrenie trypsinom a bunky, ktoré nebolo možné ľahko oddeliť, sa nazvali DHD/K12-TR. Keď boli bunky DHD/K12-TR injektované do syngénnych DBIX krýs, vyvolali trvalo sa vyvíjajúce nádory. Táto línia bola klonovaná a v tomto výskume bol použitý iba kloň DHD/K-12-TRb, nazvaný PROb.
Kultivačné podmienky: Priľnuté bunky PROb sa pestovali v uzavretých fľašiach (Falcon, Becton, Dickinson, New Jersey, USA) pri teplote 37 °C v plnom médiu pochádzajúcom z Hamovho média F10 (BioWhittaker, Walkersville, USA), do ktorého bolo pridané 10 % zárodočné teľacie sérum (FCS, Anval, Betton, Francúzsko). Kultivačné médium sa vymieňalo každé tri dni. Po konfluencii, sa bunky uvoľnili alebo zoškriabali v priebehu troch až päť minút z podložky 2 ml roztokom EDTA/trypsín, nasledovali tri premytia ml toho istého roztoku počas dvoch až troch minút, bunky sa resuspendovali do plného média s prídavkom FCS na ukončenie trypsínovej reakcie. Neprítomnosť znečistenia v bunkách mykoplazmového a bakteriálneho pôvodu sa kontrolovala v pravidelných intervaloch vyfarbením DNA Hoechstovým fluoTochrómom 33258 (Aldrich Chimie, Steiheim, Nemecko).
Zavedenie peritoneálneho karcinómu:
Bunky PROb sa uvoľnia zo svojho podkladu spôsobom opísaným v odseku „kultivačné podmienky“ a bunky sa odčítajú v roztoku trypánovej modrej ako farbiaceho činidla, ktoré slúži ako prostriedok na posúdenie životaschopnosti buniek. Bunky sa suspendujú v Hamovom médiu F10. Pod éterovou anestéziou sa vyvolajú pobrušnicové karcinómy intraperitoneálnou injekciou 106 buniek PROb u syngénnych krýs BDIX. Injekcia nádorových buniek sa uskutoční na desiaty deň. Za týchto podmienok sa u všetkých krýs vyvinie peritoneálny karcinóm s produkciou krvavých zhlukov v útrobách a krysy hynú medzi 6. až 12. dňom po injektovaní buniek.
Liečenie peritoneálneho karcinómu:
S liečením sa začne 13. deň po injektovaní nádorových buniek, keď sa vytvorí karcinómová hmota v uzlinách s priemerom niekoľko milimetrov. Liečenie spočíva v injektovaní 10 i. v. injekciou OM-294-DP v množstve 1 mg/kg telesnej hmotnosti a v dávkach 0,6 mg/ml v 0,9 % roztoku chloridu sodného. Injekcie sa podávajú trikrát za týždeň (v pondelok, v stredu a v piatok) do penilovej žily. Kontrolná skupina je ošetrovaná samotným 0,9 % roztokom chloridu sodného.
Posúdenie účinnosti liečby:
V deň D42, 6 týždňov po injektovaní nádorových buniek, sa krysy usmrtia, otvoria a rozvoj karcinómu sa posudzuje slepou štúdiou. Meranie objemu karcinómu nie je možné uskutočniť, namiesto toho je možné karcinómy klasifikovať do 4 rôznych typov.
Podľa počtu a priemeru karcinómových uzlín sa definuje 5 tried: trieda 0: uzliny sú viditeľné, trieda 1: uzliny s priemerom 0,1 až 0,2 cm možno ľahko spočítať, trieda 2: sú viditeľné početné uzliny s priemerom 0,1 až 0,5 cm, trieda 3: brušná dutina je zaplnená uzlinami, z ktorých niektoré majú priemer 1 cm, trieda 4: brušná dutina je úplne zaplnená nádormi s veľkosťou niekoľko centimetrov.
Objem zhlukov a zmena hmotnosti zvierat:
Objem zhlukov sa meria dvojnásobným vážením zvierat. Skupina kontrolných neliečených krýs, ktorým bol injektovaný iba 0,9 % roztok chloridu sodného, umožňuje posudzovať normálny vývoj karcinómov a sledovať liečbu.
Posudzovanie účinnosti liečby:
Miera prežitia krýs v liečenej skupine sa porovnáva s mierou prežitia kontrolných skupín. Objemy karcinómov a zhlukov liečených krýs sa porovnávajú s meraniami krýs v kontrolnej skupine.
Štatistická analýza:
Štatistická významnosť účinkov imunoterapie sa určí pomocou Kruskall-Wallisovho testu na klasifikovanie karcinómov. Podobne sa uskutočňuje variačný analýzový test pre dáta objemu zhlukov a dlhodobý test sa uskutočňuje u krýs, ktoré prežijú.
Výsledky
Karcinómy: V tomto modeli preukázal OM-294-DP pozoruhodnú protinádorovú aktivitu. Táto aktivita je podrobnejšie vyjadrená počtom zvierat bez nádoru (trieda 0) a ďalej je rozdiel oproti kontrole s chloridom sodným významný (p<0,05) pre objem nádoru. Vplyv liečenia OM-294-DP na objem zhlukov je tiež významný (p<0,05).
| Liečba | Počet krýs s rakovinou patriacich do triedy | Účinok prostriedku (*) | Objem zhlukov v ml/krysa | Účinok produktu (**) | |||||
| 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | Rozsah | Priemer+σ | |||
| NaCl(i> | 1 | 0 | 1 | 0 | 7 | 0-84 | 38±29 | ||
| OM-294-DP<2) | 4 | 1 | 2 | 1 | 2 | p < 0,05 | 0-73 | 8+23 | p< 0,05 |
(*): Kruskall-Wallisov test, (**) Variačná analýza (1) : osem až desať krýs uhynulo na rakovinu pred usmrtením, jedna krysa pri D34 mala uzliny a žltačku, nebolo však možné presné stanovenie tried (kanibalizmus), jedna krysa pri D37 patrila do triedy 4, dve krysy pri D38 patrili do triedy 4, jedna pri D39 patrila do triedy 4, dve pri D40 patrili do triedy 4 a jedna pri D41 patrila do triedy 4. Jedna krysa triedy 0 mala po otvorení podkožný nádor, je pravdepodobné, že zlyhala injekcia nádorových buniek.
(2) : Jedna krysa pri D14 uhynula v čase prvej liečebnej injekcie, ďalšia rakovinou netrpela. Jedna z krýs usmrtených v triede 0 mala podkožný nádor (zlyhala injekcia nádorových buniek).
Prežitie:
Zvieratá boli usmrtené v deň D42. Prežitie bolo zistené v deň 42 po injekcii nádorových buniek, 90 % zvierat ošetrených OM-294-DP prežilo, zatiaľ čo v neošetrenej skupine zostalo nažive iba 20 % zvierat. Miera prežitia krýs je pôsobením OM-294-DP významne rozšírená (p<0,001).
Hmotnosť:
OM-294-DP nemá významný vplyv na zmeny hmotnosti v porovnaní so zvieratami ošetrenými iba samotným roztokom chloridu sodného podľa dát uvedených v tabuľke (b).
Tabuľka (b) - Hmotnostné zmeny krýs (stred ± smerodajná odchýlka)
| Dni | NaCl | OM-294-DP |
| 0 | 314±19 | 277±19 |
| 13 | 337±18 | 310±21 |
| 20 | 342+20 | 304±23 |
| 29 | 361+23 | 317±24 |
| 41 | 314+38 | 327±26 |
11. Vyhodnotenie vlastností adjuvantu OM-294-DP podľa úmrtnosti myšieho imunizačného modelu nosným podaním podjednotky ureázy B Heliobacter pylori.
Ukázalo sa, že myši môžu byť ochránené pred infekciou Heliobacter pylori, ak sú imunizované podjednotkou ureázy B Heliobacter pylori ústnym alebo nosným podaním za prítomnosti adjuvanta na báze cholera toxínu (CT) (Corthésy-Teulaz I. a kol., Gastroenterology 109, str. 115, 1995; Michetti P. a kol., Gastroenterology 116, str. 804, 1999; Saldinger P. F. a kol., Gastroenterology 115, str. 891, 1998). Táto humorálna reakcia na anti-Ure B, meraná v sére imunizovaných myší, je hlavne typu lgGl (reakcia Th2). Hodnotenie adjuvanta OM-294-DP sa uskutočňuje u myší BALB/c (n=6) imunizovaných štyrikrát v týždenných intervaloch nosným podaním ureázy B podjednotky (UreB) rekombinantného Heliobacter pylori za prítomnosti OM-294-DP. BALB/c kontrolné myši boli imunizované samotným adjuvantom OM-294-DP. Dva týždne po poslednej dávke sa od každej myši odoberie krv na stanovenie anti-UreB imunoglobulínov spôsobom ELISA (totálne lgG, lgGl a lgG2a).
Spôsob
Zvieratá:
Myši BALB/c/Ola/HsD (Harland, Horst, Holandsko) 24 myší.
Antigén:
HpUreB 1-569, exprimovaný ako rekombinantný proteín E. coli (kmeň M15, Qiagen, Hilden, Nemecko) opísaným spôsobom (Michetti P. a kol., Gastroenterology 107, str. 1002,1994).
Adjuvant:
OM-294-DP (zásobný roztok 2,2 mg/ml).
Imunizačné režimy:
Štyri skupiny po 6 myší:
Skupina A: 6 myší BALB/c sa imunizuje štyrikrát nosným podaním 25 pg samotného OM-294-DP (25 μΐ na dávku) raz v týždni po 4 po sebe nasledujúce týždne.
Skupina B: 6 myší BALB/c sa imunizuje štyrikrát nosným podaním 50 pg UreB 1-569 + 25 pg OM-294-DP (25 μΐ na dávku) raz v týždni po 4 po sebe nasledujúce týždne.
Dva týždne po poslednej imunizácii nosom sa odoberie krv z chvosta každej myši skupiny A a B.
Skúška na lgG v sére:
Poťahovací pufer (pH 9,6): na 1 liter uhličitanu sodného (15 mM, 1,59 g), hydrogenuhličitan sodný (34,8 mM, 2,93 g), Thimerosal (0,01 %), pufer PBS-Tween, hodnota pH 7,4: na 1 liter, chlorid sodný (137 mM, 8,0 g), dihydrogenfosforečnan draselný (1,5 mM, 0,2 g), hydrogenfosforečnan disodný (8,0 mM, 1,15 g), chlorid draselný (2,7 mM, 0,2 g), Tween 20 (0,1 % 1 ml), citrát/fosfátový pufer, hodnota pH 5,0: na 1 liter kyseliny citrónovej (44,4 mM, 9,32 g), hydrogenfosforečnan disodný (103 mM, 14,6 g), roztok substrátu lOx (0-fenyldiamín = OPD) 10-násobná koncentrácia): (10 mg/ml v citrátovom pufri): roztok azidu sodného: 1 %, ukončovaci roztok: 0,01 % azidu sodného v citrát/fosfátovom pufri 0,1 M, pH 5,0.
Spôsob:
Pripraví sa roztok antigénu (zásobný roztok UreB 1-569 pripravený 26. mája 1999, 0,5 mg/ml zásobného roztoku) v koncentrácii 5 pg/ml v poťahovacom pufri pH 9,6 (500 μΐ roztoku UreB na 50 ml pufra). Do každej jamky v froch 96-jamkových doštičkách s guľatým dnom sa pipetou nakvapká 100 μΐ (0,5 pg UreB na jamku). Doštičky sa inkubujú dve hodiny pri teplote 37 °C. Supernatant sa z doštičiek odstráni. Jamky sa blokujú prídavkom 100 pl systému PBS/0,1 % roztoku Tween + 5 % práškového mlieka na jamku. Doštičky sa inkubujú 30 minút pri teplote 37 °C. Blokovací roztok sa odstráni a jamky sa premyjú trikrát 100 pl roztoku PBS/Tween. Supemantanty sa odstránia. Pripraví sa roztok 1 : 200 každého testovaného myšieho séra v systéme PBS/0,1 % Tween pufra (5 pl séra v 1 ml PBS/Tween). Séra (100 pl) sa rozdelia po dvoch do troch doštičiek (1 doštička na detekciu celého lgG, 1 doštička na detekciu IgGl, 1 doštička na detekciu lgG2a). Inkubácia prebehne cez noc pri teplote 4 °C. Doštičky sa premyjú trikrát 100 pl pufra PBS-Tween. Jednotlivo sa pripravia roztoky 1 : 500 na biotín viazané protilátky celkového anti-lgG (Amersham, Cat#RPN 1177), protilátky anti-lgGl (Amersham, Cat#RPN 1180) a protilátky anti-lgG2a (Pharmingen Cat# približne 02012D) v pufri PBS/Tween. 100 pl roztoku protilátky celkového anti-lgG sa pridá do doštičky č. 1, 100 pl roztoku protilátky anti-lgGl sa pridá do doštičky č. 2 a 100 pl roztoku protilátky anti-lgG2a sa pridá do doštičky č. 3. Uskutoční sa jednohodinová inkubácia pri teplote 37 °C. V pufri PBS-Tween sa pripraví roztok 1 : 1000 streptavidínu-HRP (Dáko, Cat#p0397) a 100 pl roztoku sa pridá do každej jamky. Uskutoční sa jednohodinová inkubácia pri teplote 37 °C. Jamky sa premyjú trikrát pufrom PBS/Tween. Roztok substrátu sa pripraví 10-násobným zriedením roztoku OPD (lOx) v 0,1 M citrát/fosfátovom pufri. Do zriedeného roztoku OPD sa pridá 1 pl peroxidu vodíka. Do každej jamky sa pridá 50 pl roztoku substrátu. Počas 10 až 20 minút sa nechá vyvinúť zafarbenie. Reakcia sa ukončí pridaním 50 pl ukončovacieho pufra. Pomocou negatívnej kontroly ako slepej skúšky sa odčíta absorbancia pri 492 nm (pričom štandardné odčítanie je pri 620 nm).
Štatistická analýza:
Dáta pre stred ± smerodajná odchýlka (n=6) sa odvodia zo Študentovho t-testu. Úroveň významnosti je pri p<0,05.
Výsledky
U vopred imunizovaných myší UreB-1-569 + OM-294-DP podanom nosom sa vyvinula anti-UreB humorálna imunita: anti-UreB-1-569 IgGl je obsiahnutý v krvi.
Prítomnosť protilátok špecificky zameraných proti UreB Hp v myšom sére sa meria spôsobom ELISA. UreB (0,5 pl/jamka) sa rozdelí do 96-jamkových doštičiek s guľatým dnom spolu s uhličitanovým pufrom s hodnotou pH 9,6. Špecifické protilátky sa zistia pomocou králičích protilátok anti-lgG ako celku, anti-lgGl a anti-lgG2a. Výsledky sa udávajú ako odčítanie optickej hustoty (OD) pri 492 nm. Hodnoty OD 3 x väčšie ako namerané hodnoty v sére naivných myší sa považujú za pozitívne. Žiadne protilátky anti-UreB sa nenachádzajú v sére imunizovaných samotným OM-294-DP. U myší, ktoré boli imunizované Ure + OM294-DP sa tiež vyvinuli protilátky celkového UreB lgG (OD = 0,274 ± 0,130, p<0,05) a anti-UreB IgGl (OD = 0,212 ± 0,128, p<0,05), nevyvinuli sa však protilátky anti-UreB lgG2a (OD = 0,008 ± 0,005, nevýznamné).
U myší BALB/c imunizovaných podjednotkou ureázy B Heliobacter pylori nosným podaním (UreB) + OM-294-DP sa vyvinula humorálna reakcia anti-UreB najmä typu IgGl. OM-294-DP môže preto pôsobiť ako adjuvant pri podávaní nosnou cestou a podporovať vývoj humorálnej imunity typu Th2.
12. OM-294-MP a OM-294-DP v kombinácii s antigénom H1N1: Určenie špecifických protilátok vypestovaných v myšiach po jednom alebo po dvoch subkutánnych podaniach.
Spôsob
Účelom tejto štúdie je demonštrovať adjuvantný účinok OM-294-MP a OM-294-DP na chrípkový antigén H1N1 (262195 A/B Beijing haemagglutinin, Solva Duphar, Weesp, Holandsko). Skupina 60 myší BALB/c (samice staré 8 týždňov na začiatku ošetrovania) sa rozdelia do 6 skupín takto:
Tabuľka
| Skupina | Antigén konečná koncentrácia 2,5 pg na myš/injekcia | Adjuvanty konečná koncentrácia 50 ug na myš/injekcia | NaCl (0,9 %) | Injektovaný objem |
| A: NaCl | - | - | 150 μΐ | 150 μΐ |
| B:H1N1 | H1N1 (100 μΐ) | - | 50 μΐ | 150 μΐ |
| C: H1N1 + OM-294-MP | H1N1 (100 μΐ) | OM-294-MP (50 μΐ) | - | 150 μΐ |
| D: H1N1 + OM-294-DP | H1N1 (100 μΐ) | OM-294-MP (50 μΐ) | 100 μΐ | 150 μΐ |
| E: OM-294-MP | - | OM-284-MP (50 μΐ) | 100 μΐ | 150 μΐ |
| F: OM-294-DP | - | OM-284-DP (50 μΐ) | 100 μΐ | 150 μΐ |
Antigén:
Zásobný roztok H IN 1 sa pripraví v koncentrácii 25 pg/ml v 0,9 % roztoku chloridu sodného
Adjuvanty:
Zásobné roztoky OM-294-DP a OM-294-MP sa pripravia v koncentrácii 1 mg/ml vo vode na injektovanie s prídavkom 0,1 % trietanolamínu do OM-294-MP. Negatívnou kontrolou je 0,9 % roztok chloridu sodného bez antigénu.
Zmes antigén - adjuvant:
Pred trojminútovým vírivým miešaním sa adjuvanty udržujú 20 minút pri teplote 37 °C. Pridá sa antigén a roztok chloridu sodného (0,9 %), ako je uvedené v tabuľke a zmes antigénu a adjuvantu sa krátko vírivo mieša, a potom sa vnesie do rotačného miešača na 15 minút pri teplote miestnosti, a nakoniec sa zmes ako celok vírivo mieša tri minúty.
Imunizačný režim:
Injekcie sa podajú v deň 0 a 14. Zmesi uvedené v predchádzajúcej tabuľke sa podávajú subkutánne (75 μΐ na mieste a celkove 150 μΐ pre zviera). Vzorky krvi sa odoberajú 14. a 18. deň (očnicové vpichy). Test imunoglobulínov anti-HINl:
Duplicitne sa spôsobom ELISA skúšajú nasledujúce imunoglobulíny v sére, ktoré sú špecificky zamerané na H IN 1: lgGl, lgG2a a lgM. Mikrotitračné doštičky (NUNC Immunoplate, Roskilde, Dánsko) sa inkubujú (povlak cez noc) pri teplote 4 °C so 100 μΐ H1N1 (0,5 pg) v nátriumhydrogenuhličitanovom pufri s hodnotou pH 9,6. Po premytí 0,5 % Tween-20 (Merck Hohenbrunn, Nemecko) sa séra zriedia 50x, 200x a 800x (riediaci roztok: fosfátom pufrovaná soľanka (PBS) + 1 % albumínu hovädzieho séra (BSA Sigma, St. Louis, MO, USA) + 0,02 % Tween-20). Do jamiek sa vnesie 100 μΐ každej vzorky rozriedeného séra. Inkubácia pri teplote 37 °C trvá 45 minút.
Po druhom premytí sa lgGl, lgG2a a lgM špecificky zamerané na H1N1 inkubujú 30 minút pri teplote 37 °C spolu so 100 μΐ protilátok anti-lgGl (konjugát anti-myšia krysia protilátka-peroxidáza) (Serotex, Oxford, UK), konjugát lgG2a-peroxidázy (Pharmingen, San Diego, Ca, USA) a konjugát lgM-biotín (Pharmingen, San Diego, CA, USA), vopred zriedený pufrom PBS/BSA/Tween (250-, 1000-, 500-násobné zriedenie). Pre lgM je po mimoriadnom premytí potrebná tretia inkubácia (30 min. pri 37 °C) 1 : 100 zriedeným roztokom konjugátu streptavidín-peroxidáza (Dáko, Glostrup, Dánsko).
Po premytí sa pridá 100 μΐ roztoku fenylén-l,2-diamínu (OPD, Merck, Darmstadt, Nemecko) na detekciu sekundárnych peroxidázou kopulovaných protilátok anti-lgGl a anti-lgG2, zatiaľ čo pre lgM je použitým reakčným činidlom 3',3',5',5'-tetrametylbenzidín (TBM, Sigma, St. Louis, MO, USA). Po 20 minútovej inkubačnej prestávke pri teplote miestnosti sa reakcia ukončí prídavkom 100 μΐ 2N kyseliny sírovej. Hodnoty absorbancie sa odčítajú pri 490 nm doštičkovým čítacím zariadením Bio-Rad 3550.
Výsledky
Výsledky každého odčítania pri 490 nm sú uvedené v zmluvných jednotkách (A.U.) na ml. Každá vzorka sa porovnáva so štandardom pripraveným z premenných zriedení kúpeľa vzorky zhromaždenej zo skupiny B (zvieratá injektované iba H1N1) 28. deň. Kúpeľom vzorky je 50-násobný roztok s koncentráciou 1000 A.U./ml. Jednotlivé výsledky sa potom korigujú na zodpovedajúci násobok zriedenia (50x, 200x alebo 800x). Uvádzajú sa iba stredné hodnoty každej skupiny a smerodajná odchýlka (SD).
SK 287073 Β6
Tabuľka (a) - Imunoglobulíny špecificky zvýšené oproti H1N1 podtriedy lgGl (dohodnuté jednotky/ml ±smerodajná odchýlka, ** p<0,01 (Anova & Dunnettove testy).
| Skupiny | Deň 14 | Deň 28 |
| A: NaCI | 3±5 | 0+0 |
| B:H1N1 | 11161+5755 | 53950+23403 |
| C: H1N1 + OM-294-MP | 34411113719 | 228467**±109123 |
| D: H1NI + OM-294-DP | 30101+19061 | 382325**+201314 |
| E: OM-294-MP | 69+34 | 59+31 |
| F: OM-294-DP | 59+21 | 38+25 |
Tabuľka (b) - Imunoglobulíny špecificky zvýšené oproti H1N1 podtriedy lgG2a (dohodnuté jednotky/ml ±smerodajná odchýlka, ** p<0,01 (Anova & Dunnettove testy).
| Skupiny | Deň 14 | Deň 28 |
| A: NaCI | 0+0 | 0+0 |
| B:H1N1 | 26883+20779 | 50352+30846 |
| C: H1N1 + OM-294-MP | 179344**+139781 | 1622722**±986195 |
| D: H1N1 + OM-294-DP | 103630+96257 | 681441+1072710 |
| E: OM-294-MP | 1619+743 | 1767+1034 |
| F: OM-294-DP | 452+584 | 782+857 |
Tabuľka (c) - Imunoglobulíny špecificky zvýšené oproti H1N1 podtriedy lgM (dohodnuté jednotky/ml ismerodajná odchýlka, ** p<0,01 (Anova & Dunnettove testy).
| Skupiny | Deň 14 | Deň 28 |
| A: NaCI | 22102+5862 | 21531+3693 |
| B: H1N1 | 37787+15001 | 57306+26886 |
| C:H1N1 +OM-294-MP | 67936**±21334 | 95108+38669 |
| D: H1N1 + OM-294-DP | 598100*±18324 | 92920+26971 |
| E: OM-294-MP | 19065+4069 | 18018+1016 |
| F: OM-294-DP | 20756+7160 | 20944+9065 |
Tieto výsledky ukazujú, že adjuvanty OM-294-MP a OM-294-DP sú aktívne v skúmanom modeli, pretože významne zvyšujú titer protilátok, špecificky zvýšený oproti H1N1 u myší po jednej alebo dvoch injekciách (obr. 22,23, 24) nezávisle od uvažovanýchpodtried (lgGla, lgG2a a lgM).
13. OM-294-MP a OM-294-DP v kombinácii s ovalbumínovým antigénom: Určenie špecifických protilátok vzniknutých v myšiach po jednom alebo po dvoch subkutánnych podaniach.
Spôsob
Táto štúdia má ukázať účinok adjuvantov OM-294-MP a OM-294-DP na ovalbumínový antigén (Fluka Chemie, Buchs, Švajčiarsko). 50 myší BAKB/c (osem-týždňové samice na začiatku ošetrovania) sa rozdelí do 5 nasledujúcich skupín:
| Skupina | Antigén konečná koncentrácia 50 pg na myš/injekcia | Adjuvanty konečná koncentrácia 50 pg na myš/injekcia | NaCI | Injektovaný objem |
| A: NaCI | - | - | 150 μΐ | 150 μΐ |
| B: Ova | Ova (100 μΐ) | - | 50 μΐ | 150 μΐ |
| C: Ova + OM-294-MP | Ova (100 μΐ) | OM-294-MP(50 μΐ) | - | 150 μΐ |
| D: Ova + OM-294-DP | Ova (100 μΐ) | OM-294-DP(50 μΐ) | - | 150 μΐ |
| E: OM-294-MP | - | OM-294-MP(50 pl) | 100 μΐ | 150 μΐ |
Antigén:
Pripraví sa zásobný roztok ovalbumínu v koncentrácii 0,5 mg/ml v 0,9 % roztoku chloridu sodného.
Adjuvanty:
Zásobné roztoky OM-294-DP a OM-294-MP sa pripravia v koncentrácii 1 mg/ml vo vode na injektovanie s prídavkom 0,1 % trietanolamínu do OM-294-MP. Negatívnou kontrolou je 0,9 % roztok chloridu sodného bez antigénu.
Zmes antigén - adjuvant:
Pred trojminútovým vírivým miešaním sa adjuvanty udržujú 20 minút pri teplote 37 °C. Pridá sa antigén a roztok chloridu sodného (0,9 %), ako je uvedené v tabuľke a zmes antigénu a adjuvanta sa krátko vírivo mieša, a potom sa vnesie do rotačného miešača na 15 minút pri teplote miestnosti, a nakoniec sa zmes ako celok vírivo mieša tri minúty.
Imunizačný režim:
Injekcie sa podajú v deň 0 a 14. Zmesi uvedené v predchádzajúcej tabuľke sa podávajú subkutánne (75 μΐ na mieste a celkove 150 μΐ pre zviera). Vzorky krvi sa odoberajú 14. a 18. deň (očnicové vpichy).
Test imunoglobulínov anti-ovalbumínu:
Duplicitne sa spôsobom ELISA skúšajú nasledujúce imunoglobulíny v sére, ktoré sú špecificky zamerané na ovalbumín : IgGl, lgG2a a lgM. Mikrotitračné doštičky (NUNC Immunoplate, Roskilde, Dánsko) sa inkubujú (povlak cez noc) pri teplote 4 °C so 100 μΐ ovalbumínu (0,5 pg) v hydrogenuhličitanovom pufri s hodnotou pH 9,6. Po premytí 0,5 % Tween-20 (Merck Hohenbrunn, Nemecko) sa séra zriedia 50x, 200x a 800x (riediaci roztok: fosfátom pufiovaná soľanka (PBS) + 1 % albumínu hovädzieho séra (BSA Sigma, St. Louis, MO, USA) + 0,02 % Tween-20). Do jamiek sa vnesie 100 μΐ každej vzorky rozriedeného séra. Inkubácia pri teplote 37 °C trvá 45 minút.
Po druhom premytí sa IgGl, lgG2a a lgM špecificky zamerané na albumín inkubujú 30 minút pri teplote 37 °C spolu so 100 μΐ protilátok anti-lgGl (konjugát anti-myšia krysia protilátka-peroxidáza) (Serotex, Oxford, UK), konjugát lgG2a-peroxidázy (Pharmingen, San Diego, Ca, USA) a konjugát lgM-biotín (Pharmingen, San Diego, CA, USA), vopred zriedený pufrom PBSZBSA/Tween (250x, lOOOx, 500-násobné zriedenie). Pre lgM je po mimoriadnom premytí potrebná tretia inkubácia (30 min. pri 37 °C) 1 : 100 zriedeným roztokom konjugátu streptavidín-peroxidáza (Dáko, Glostrup, Dánsko).
Po premytí sa pridá 100 μΐ roztoku fenylén-l,2-diamínu (OPD, Merck, Darmstadt, Nemecko) na detekciou sekundárnych protilátok anti-lgGl a anti-lgG2 kopulovaných s peroxidázou, zatiaľ čo pre lgM je použitým reakčným činidlom 3',3',5',5'-tetrametylbenzidin (TBM, Sigma, St. Louis, MO, USA). Po 20 minútovej inkubačnej prestávke pri teplote miestnosti sa reakcia ukončí prídavkom 100 μΐ 2N kyseliny sírovej. Hodnoty absorbancie sa odčítajú pri 490 nm doštičkovým čítacím zariadením Bio-Rad 3550.
Výsledky
Výsledky každého odčítania pri 490 nm sú udané v zmluvných jednotkách (A.U.) na ml. Každá vzorka sa porovnáva so štandardom pripraveným z premenných zriedení kúpeľa vzorky zhromaždenej zo skupiny B (zvieratá injektované iba ovalbumínom) 28. deň. Kúpeľom vzorky je 50-násobný roztok s koncentráciou 1000 A.U./ml. Jednotlivé výsledky sa potom korigujú na zodpovedajúci násobok zriedenia (50x, 200x alebo 800x). Uvádzajú sa iba stredné hodnoty každej skupiny a smerodajná odchýlka (SD).
Tabuľka (a) - Imunoglobulíny špecificky zvýšené oproti ovalbumínu podtriedy IgGl (dohodnuté jednotky/ml ± smerodajná odchýlka, ** p<0,01 (Anova & Dunnettove testy).
| Skupiny | Deň 14 | Deň 28 |
| A: NaCI | 6±6 | 16±12 |
| B: Ova | 728±589 | 47743±46294 |
| C: Ova + OM-294-MP | 4361**±2513 | 284121**±164822 |
| D: Ova + OM-294-DP | 3240**+1794 | 277025**±173737 |
| E: OM-294-MP | 19±8 | 40+69 |
Tabuľka (b) - Imunoglobulíny špecificky zvýšené oproti ovalbumínu podtriedy lgG2a (dohodnuté jednotky/ml + smerodajná odchýlka, ** p<0,01 (Anova & Dunnettove testy).
| Skupiny | Deň 14 | Deň 28 |
| A: NaCl | 29961898 | 541411554 |
| B: Ova | 520111880 | 73162+107954 |
| C: Ova + OM-294-MP | 952416809 | 625663*1681232 |
| D: Ova + OM-294-DP | 18108**114958 | 601434*1624166 |
| E: OM-294-MP | 11253112169 | 419212104 |
Tabuľka (c) - Imunoglobulíny špecificky zvýšené oproti ovalbumínu podtriedy lgM (dohodnuté jednotky/ml 1 smerodajná odchýlka, ** p<0,01 (Anova & Dunnettove testy).
| Skupiny | Deň 14 | Deň 28 |
| A: NaCl | 1400916158 | 1228817136 |
| B: Ova | 19423113778 | 47998134035 |
| C: Ova + OM-294-MP | 2165219524 | 3824018822 |
| D: Ova + OM-294-DP | 25762110975 | 743991119781 |
| E: OM-294-MP | 1974215667 | 982712021 |
Tieto výsledky ukazujú, že adjuvanty OM-294-MP a OM-294-DP sú aktívne v skúmanom modeli, pretože významne zvyšujú titer protilátok, špecificky zvýšený oproti ovalbumínu u myší po jednej alebo dvoch injekciách (obr. 25, 26,27) nezávisle od uvažovaných podtried (lgGla, lgG2a a lgM).
14. OM-294-MP a OM-294-DP v kombinácii s antigénom TT (Tetanox toxoid): Určenie špecifických protilátok vzniknutých v myšiach po jednom alebo po dvoch subkutánnych podaniach.
Spôsob
Táto štúdia má ukázať účinok adjuvantov OM-294-MP a OM-294-DP na TT antigén (Fluka Chemie, Buchs, Švajčiarsko). 50 myší BAKB/c (osem-týždňové samice na začiatku ošetrovania) sa rozdelí do 5 nasledujúcich skupín:
| Skupina | Antigén konečná koncentrácia 50 pg na myš/injekciu | Adjuvanty konečná koncentrácia 50 pg na myš/injekciu | NaCl (0,9 %) | Injektovaný objem |
| A: NaCl | - | - | 150 pl | 150 pl |
| B: TT | TT(100pl) | - | 50 pl | 150 pl |
| C: TT + OM-294-MP | TT(100pl) | OM-294-MP(50 μΐ) | - | 150 pl |
| D: TT + OM-294-MP | TT(100 pl) | OM-294-DP(50 pl) | - | 150 pl |
Antigén:
Pripraví sa zásobný roztok TT v koncentrácii 0,2 mg/ml v 0,9 % roztoku chloridu sodného.
Adjuvanty:
Zásobné roztoky OM-294-DP a OM-294-MP sa pripravia v koncentrácii 1 mg/ml vo vode na injektovanie s prídavkom 0,1 % trietanolaminu do OM-294-MP. Negatívnou kontrolou je 0,9 % roztok chloridu sodného bez antigénu.
Zmes antigén - adjuvant:
Pred trojminútovým vírivým miešaním sa adjuvanty udržujú 20 minút pri teplote 37 °C. Pridá sa antigén a roztok chloridu sodného (0,9 %), ako je uvedené v tabuľke a zmes antigénu a adjuvanta sa krátko vírivo mieša, a potom sa vnesie do rotačného miešača na 15 minút pri teplote miestnosti, a nakoniec sa zmes ako celok vírivo mieša tri minúty.
Imunizačný režim:
Injekcie sa podajú v deň 0 a 14. Zmesi uvedené v predchádzajúcej tabuľke sa podávajú subkutánne (75 μΐ na mieste a celkove 150 μΐ pre zviera). Vzorky krvi sa odoberajú 14. a 18. deň (očnicové vpichy).
Test anti-TT imunoglobulínov:
Duplicitne sa spôsobom ELISA skúšajú nasledujúce imunoglobulíny v sére, ktoré sú špecificky zamerané na TT: lgGl, lgG2a a lgM. Mikrotitračné doštičky (NUNC Immunoplate, Roskilde, Dánsko) sa inkubujú (povlak cez noc) pri teplote 4 °C so 100 μΐ TT (0,5 pg) v hydrogenuhličitanovom pufri s hodnotou pH 9,6. Po premytí 0,5 % Tween-20 (Merck Hohenbrunn, Nemecko) sa séra zriedia 50x, 200x a 800x (riediaci roztok: fosfátom pufrovaná soľanka (PBS) + 1 % albumínu hovädzieho séra (BSA Sigma, St. Louis, MO, USA) + 0,02 % Tween-20). Do jamiek sa vnesie 100 μΐ každej vzorky rozriedeného séra. Inkubácia pri teplote 37 °C trvá 45 minút.
Po druhom premytí sa lgGl, lgG2a a lgM špecificky zamerané na TT inkubujú 30 minút pri teplote 37 °C spolu so 100 μΐ protilátok anti-lgGl (konjugát anti-myšia krysia protilátka-peroxidáza) (Serotex, Oxford, UK), konjugát lgG2a-peroxidázy (Pharmingen, San Diego, Ca, USA) a konjugát lgM-biotín (Pharmingen, San Diego, CA, USA), vopred zriedený pufrom PBS/BSA/Tween (250-, 1000-, 500-násobné zriedenie). Pre lgM je po mimoriadnom premytí potrebná tretia inkubácia (30 min. pri 37 °C) 1 : 100 zriedeným roztokom konjugátu streptavidín-peroxidáza (Dáko, Glostrup, Dánsko).
Po premytí sa pridá 100 μΐ roztoku fenylén-l,2-diamínu (OPD, Merck, Darmstadt, Nemecko) na detekciou sekundárnych peroxidázou kopulovaných protilátok anti-lgGl a anti-lgG2, zatiaľ čo pre lgM je použitým reakčným činidlom 3',3',5',5’-tetrametylbenzidín (TBM, Sigma, St. Louis, MO, USA). Po 20 minútovej inkubačnej prestávke pri teplote miestnosti sa reakcia ukončí prídavkom 100 μΐ 2N kyseliny sírovej. Hodnoty absorbancie sa odčítajú pri 490 nm doštičkovým čítacím zariadením Bio-Rad 3550.
Výsledky
Výsledky každého odčítania pri 490 nm sú udané v zmluvných jednotkách (A.U.) na ml. Každá vzorka sa porovnáva so štandardom pripraveným z premenných zriedení kúpeľa vzorky zhromaždenej zo skupiny B (zvieratá injektované iba TT) 28. deň. Kúpeľom vzorky je 50-násobný roztok s koncentráciou 1000 A.U./ml. Jednotlivé výsledky sa potom korigujú na zodpovedajúci násobok zriedenia (50x, 200x alebo 800x). Uvádzajú sa iba stredné hodnoty každej skupiny a smerodajná odchýlka (SD).
Tabuľka (a) - Imunoglobulíny špecificky zvýšené oproti TT podtriedy lgGl (dohodnuté jednotky/ml Ismerodajná odchýlka, ** p<0,01 (Anova & Dunnettove testy).
| Skupiny | Deň 14 | Deň 28 |
| A: NaCl | 112 | 011 |
| B:TT | 287111633 | 34367+15018 |
| C: TT + OM-294-MP | 8502**12020 | 78506**121660 |
| D: TT + OM-294-DP | 11620**12348 | 136463**±41025 |
Tabuľka (b) - Imunoglobulíny špecificky zvýšené oproti TT podtriedy lgG2a (dohodnuté jednotky/ml Ismerodajná odchýlka, ** p<0,01 (Anova & Dunnettove testy).
| Skupiny | Deň 14 | Deň 28 |
| A: NaCl | 351+506 | 53611046 |
| B: TT | 254712539 | 61387182269 |
| C: TT + OM-294-MP | 886916979 | 65881146635 |
| D: TT + OM-294-DP | 21969**125067 | 148365+134196 |
Tabuľka (c) - Imunoglobulíny špecificky zvýšené oproti TT podtriedy lgM (dohodnuté jednotky/ml ±smerodajná odchýlka, ** p<0,01 (Anova & Dunnettove testy).
| Skupiny | Deň 14 | Deň 28 |
| A: NaCl | Štandard | Štandard |
| B: TT | 9 zvierat <25 1 zviera <50 | 10 zvierat <25 |
| C: TT + OM-294-MP | 9 zvierat <25 1 zviera <1600 | 7 zvierat <25 1 zviera <100 2 zvieratá <1600 |
| D: TT + OM-294-DP | 7 zvierat <25 1 zviera <200 2 zvieratá <1600 | 10 zvierat <25 |
SK 287073 Β6
Tieto výsledky ukazujú, že adjuvanty OM-294-MP a OM-294-DP sú aktívne v skúmanom modeli, pretože významne zvyšujú titer protilátok, špecificky zvýšený oproti TT u myší po jednej alebo dvoch injekciách (obr. 28, 29). Na rozdiel od toho iba niekoľko zvierat produkovalo lgM, špecifický pre TT.
15. Vyhodnotenie adjuvantných vlastností OM-248-MP v imunizačnom modeli myší CBA subkutánnym podávaním antigénu Leishmania gp63
Myšiam CBA sa podáva gp63 dvoma subkutánnymi injekciami do chvosta v dávke 2 pg v 8-dňových intervaloch. Adjuvant OM-248-MP sa zmieša s oboma dávkami antigénu, BCG sa zmieša iba s prvou dávkou. Každej myši sa podá 2 x 50 pg OM-248-MP alebo 200 pg BCG. Kontrolná skupina sa injektuje antigénom samotným (bez adjuvanta). Desať dní po druhej injekcii sa bunky inguinálnych a periaortických miazgových uzlín (skupiny po 3 myšiach) kultivujú a proliferačná reakcia na vyčistený antigén gp63 sa skúma meraním absorpcie tymidínu (3H-TdR). In vitro produkcia cytokínu ako γ IFN a IL-4 sekretovaného lymfocytmi lymfatickej uzliny, vyvolaná in vitro gp63 antigénom, sa stanovuje tiež spôsobom ELISA (MIF 100 IFN a kity M4000 IL-4, R & D Systems, Európe Ltd., Abingdon, UK) v každej vzorke supematantu lymfocytovej kultúry miazgovej uzliny pred pridaním 3H-TdR.
Hodnoty uvedené v tabuľkách pre absorpciu 3H-TdR sú aritmetickým stredom ± smerodajná odchýlka (trojmo), vyjadreným v cpm a hodnoty, týkajúce sa cytokínov v supematantoch zodpovedajú aritmetickému priemeru ± smerodajná odchýlka, (trojmo) vyjadrenému v pg/ml.
Antigén:
Pripraví sa zásobný roztok gp63 v koncentrácii 40 mg/ml v 0,9 % roztoku chloridu sodného.,
Adjuvanty:
Zásobný roztok OM-294-MP sa pripraví v koncentrácii 1 mg/ml vo vode na injektovanie s prídavkom 0,1 % trietanolamínu do OM-294-MP. Negatívnou kontrolou je PBS roztok bez antigénu.
Zmes antigén - adjuvant:
Pred trojminútovým vírivým miešaním sa adjuvanty udržujú 20 minút pri teplote 37 °C. Pridá sa antigén (1 objem) a adjuvant (1 objem), pred inkubáciou sa vírivo krátko mieša 20 minút pri teplote 37 °C a nakoniec sa zmes ako celok vírivo mieša tri minúty.
Výsledky
V myšiach imunizovaných antigénom gp63 vyvoláva adjuvant OM-294-MP lepšiu reakciu lymfocytovej proliferácie (tabuľka (a) a obr. 30 (a)). Skutočne vzhľadom na kultúry zo zvierat, ktoré boli imunizované bez adjuvanta, je nárast miery proliferácie 3,1 až 6-násobok pre produkt OM-294-MP, zatiaľ čo nepresahuje 3,5-násobku pre BCG (2,6 až 3,5).
V takýchto lymfocytových kultúrach sa produkcia cytokínov meria v supematante (tabuľka (b) a obr. 30 (b)). Je zjavné, že antigén gp63 vyvoláva sekréciu γ IFN v množstvách ekvivalentných u myší ošetrených OM-294-MP alebo BCG ako adjuvantom. Na rozdiel od toho je zrejmé, že adjuvant OM-294-MP podporuje sekréciu podstatných množstiev IL-4 imunitnými lymfocytmi (anti-gp63), zatiaľ čo lymfocyty myší ošetrených BCG vylučujú menšie alebo dokonca nezistiteľné množstvo uvedeného cytokínu.
Tabuľka (a) - Účinok adjuvanta OM-294-MP na imunitnú reakciu oproti antigénu gp63, meraný proliferáciou myšieho lymfocytu T, ako reakcie na antigén gp63 in vitro
| gp63 in vitro (pg/ml) | Bez adjuvanta (cpm x 10'3/ml) | OM-294-MP (cpm x 10‘3/ml) | BCG (cmp x 10'3/ml) |
| 0 | l,4±0,4 | 2,8±0,7 | 5,3+1,1 |
| 0,16 | 18±5 | 65±11 | 47+9 |
| 0,31 | 17±5 | 92±11 | 57±17 |
| 0,62 | 16±4 | 93+13 | 54±13 |
| 1,25 | 13+2 | 39±7 | 44±9 |
Hodnoty uvedené v tabuľke (a) sú aritmetickým stredom ± smerodajná odchýlka (trojité kultúry).
Tabuľka (b) - Účinok adjuvanta OM-294-MP podávaného in vivo spoločne s antigénom gp63 na produkciu in vitro cytokŕnov lymfocytmi lymfatických uzlín
| ylFN koncentrácia (pg/ml) | |||
| gp63 in vitro | bez adjuvanta | 294-MP | BCG |
| 0 | <9 | <9 | 27 |
| 0,3 | 78 | 135 | 200 |
| 0,6 | 38 | 120 | 105 |
| IL-4 koncentrácia (pg/ml) | |||
| gp63 in vitro | bez adjuvanta | 294-MP | BCG |
| 0 | <8 | <8 | <8 |
| 0,3 | <15 | 125 | 15 |
| 0,6 | <8 | 83 | <8 |
Adjuvant OM-294-MP zvyšuje špecifickú reakciu T in vitro v myšiach CBA, ktoré boli imunizované gp63 (amfifilným antigénom parazita Leishmania), ako je zistené proliferáciou lymfocytov a antigénom vyvolanej produkcie y IFN a IL-4.
16. Účinnosť adjuvanta OM-294-MP počas anti-LmCPb T-primámej reakcie v imunizačnom modeli, založenom na myšiach CBA, pri subkutánnom podaní antigénu Leishmania mexicana LmCPb.
Spôsob
Myšiam CBA sa jedinou injekciou podáva do chvosta LmCPb v dávke 2 pg, buď v kombinácii s 50 pg adjuvanta OM-294-MP, alebo bez nej. Kontrolnej skupine sa podá jedna injekcia fyziologického soľankového pufta (neimunizované subjekty). Po 11 dňoch sa inguinálne a periaortické lymfatické uzliny (skupiny po troch myšiach) kultivujú a vyhodnocuje sa reakcia oproti vyčistenému antigénu LmCPb, oproti príprave úplných amastigotov Leishmania mexicana a oproti konkanavalínu A (Con A) meraním absorpcie trítiovaného tymidínu (3H-TdR). Taktiež sa spôsobom ELISA určí produkcia cytokínov γ IFN a LL-4 lymfocytmi lymfatických uzlín, vyvolaná in vitro antigénom LmCPb Leishmania mexicana alebo amastigotmi (kity MIFPP y IFN & M4000 OL-4, R & D Systems Európe Ltd. Abington, UK) s použitím vzorky supematantu lymfocytov lymfatických uzlín každej kultúry pred pridaním 3H-TdR.
Hodnoty, uvedené v tabuľkách pre absorpciu 3H-TdR, sú aritmetickým stredom ± smerodajná odchýlka (trojmo) vyjadreným v cpm a hodnoty, týkajúce sa cytokínov v supematante zodpovedajú aritmetickému stredu ± smerodajná odchýlka (trojmo) vyjadrenému v pg/ml pre produkciu cytokínov v supematantoch.
Antigén:
Pripraví sa zásobný roztok LmCPb v koncentrácii 40 mg/ml v PBS (2x)
Adjuvanty:
Zásobný roztok OM-294-MP sa pripraví v koncentrácii 1 mg/ml vo vode na injektovanie s prídavkom 0,1 % trietanolamínu do OM-294-MP. Negatívnou kontrolou je PBS roztok bez antigénu.
Zmes antigén - adjuvant:
Pred trojminútovým vírivým miešaním sa adjuvanty udržujú 10 minút pri teplote 37 °C. Pridá sa antigén (1 objem) a adjuvant (1 objem), pred inkubáciou sa vírivo krátko mieša 20 minút pri teplote 37 °C a nakoniec sa zmes ako celok vírivo mieša tri minúty.
Výsledky
V neprítomnosti akéhokoľvek stimulu v kultivačnom médiu podporuje adjuvant OM-294-MP vývoj lymfocytov, ktorý podlieha spontánnej proliferácii (tabuľka (a) a obr. 31 (a)) a sekrétaje stopové množstvá y IFN (tabuľka (b), obr. 31 (b)). Táto reakcia sa silno podporí pridaním vyčisteného antigénu LmCPb do kultúr alebo extraktu plného parazita. V tomto pokuse je zjavné, že adjuvant zreteľne vplýva na indukciu senzibilizovaných lymfocytov (anti-LmCPb), schopných sekrécie podstatných množstiev IL-4 (tabuľka (b) a obr. 31 (b)).
Tabuľka (a) Proliferatívna reakcia buniek lymfatických uzlín in vitro, imunizovaných in vivo pôsobením LmVP: účinok adjuvanta OM-294-MP
| 3H-TdR(cpmx 10'3/ml) | |||
| Antigén in vitro | Neimunizovaný | Bez adjuvanta | OM-294-MP |
| Bez stimulantu | 0,9±0,3 | 2,2±0,7 | 11±2 |
| LmCPb 0,6 pg/ml | 0,8±0,4 | l,7±0,l | 19±4 |
| LmCPb 1,7 pg/ml | 0,9±0,l | 4,6±1,6 | 40+4 |
| LmCPb 5 pg/ml | 1,3+0,8 | 7,2±0,6 | 80±5 |
| LmCPb 15 pg/ml | 2,6±0,4 | 16,2±2,1 | 140±10 |
| Amastigoty 1,9 x 10‘6/ml | 0,8+0,2 | 1,7+θ,Ι | 44+7 |
| Amastigoty 6 x 10'6/ml | l,5±0,2 | 4,6±0,6 | 79±6 |
| Amastigoty 17 x 10'6/ml | 2,9±0,6 | 7,2±0,6 | 119±4 |
| Con A 5 pg/ml | 123±33 | 193±17 | 196±10 |
Tabuľka (b) - Sekrécia in vitro cytokínov lymfocytmi lymfatických uzlín imunizovaných in vivo LmCPb. Účinok adjuvanta OM-294-MP na primárnu reakciu
| Produkcia y IFN (pg/ml) | |||
| Stimulátor in vitro | Neimunizovaný | Bez adjuvanta | OM-294-MP |
| bez stimulátora | <9 | <9 | 25 |
| LmCPb 15 pg/ml | <9 | 46 | 480 |
| Amastigoty 17 x 10'5/ml | <9 | 95 | 320 |
| Con A 5 pg/ml | >1800 | >1800 | >1800 |
| Produkcia IL-4 (pg/ml) | |||
| Stimulátor in vitro | Neimunizovaný | Bez adjuvanta | OM-294-MP |
| bez konkurencie | <8 | <8 | <8 |
| LmCPb 15 pg/ml | <8 | <8 | 130 |
| Amastigoty 17 x 10 5/ml | <8 | <8 | 65 |
| Con A 5 pg/ml | 92 | 190 | 360 |
Adjuvant OM-294-MP je tiež veľmi účinný počas primárnej reakcie T (po jedinej injekcii vakcíny). Vlastnosti účinku adjuvanta na túto reakciu (zvýšenie proliferácie lymfocytov, indukcia produkcie cytokínov) sú podobné vlastnostiam pozorovaným počas reakcie na injekciu vakcíny.
17. Vyhodnotenie vlastností adjuvantov OM-294-MP a OM-294-DP v myšom CBA imunizačnom modeli subkutánnym podaním antigénu LmCPb Leishmania mexicana: porovnanie s BCG
Spôsob
Myšiam CBA (8 myší v skupine) sa podáva 2 subkutánnymi injekciami do chvosta 3 až 5 pg LmCPb v 8-dňových intervaloch. Adjuvanty OM-294-MP a OM-294-DP sa zmiešajú s oboma dávkami antigénu, zatiaľ čo BCG sa zmieša iba s prvou dávkou. Každá myš dostane 2 x 50 pg adjuvanta OM alebo 200 pg BCG. 8 dní po poslednej injekcii sa inguinálne a periaortické lymfatické uzliny (skupiny po troch myšiach) odoberú a bunky sa kultivujú na skúmanie proliferatívnej reakcie na vyčistený antigén LmCPb, alebo prípadne na proliferatívnu reakciu oproti prostriedku amastigotov Leishmania mexicana ako celku alebo konkanavalinu A (Con A). Proliferatívna reakcia sa vyhodnocuje meraním absorpcie trítiovaného tymidínu (3H-TdR). Produkcia cytokínu γ IFN a IL-4 lymfocytmi lymfatických uzlín, vyvolaná in vitro antigénom LmCPb Leishmania mexicana alebo amastigotmi, sa určí spôsobom ELISA (kity MIFPP γ IFN & M4000 OL-4, R & D Systems Európe Ltd. Abington, UK) s použitím vzorky supematantu lymfocytov lymfatických uzlín každej kultúry pred pridaním 3H-TdR.
Hodnoty uvedené v tabuľkách sú aritmetickým stredom ± smerodajná odchýlka vyjadreným v percentách štandardu oproti protilátkovému titru, aritmetickým stredom + smerodajná odchýlka (trojmo) vyjadrené v cpm pre absorpciu 3H-TdR a aritmetickým stredom ± smerodajná odchýlka (trojmo) vyjadreným v pg/ml pre produkciu cytokínu.
Antigén:
Pripraví sa zásobný roztok LmCPb v koncentrácii 60 až 100 pg/ml v 0,9 % roztoku chloridu sodného.
Adjuvanty:
Zásobné roztoky OM-294-MP a OM-294-DP sa pripravia v koncentrácii 1 mg/ml vo vode na injektovanie s prídavkom 0,1 % trietanolamínu pre OM-294-MP. Negatívnou kontrolou je roztok PBS bez antigénu.
Zmes antigén - adjuvant:
Pred trojminútovým vírivým miešaním sa adjuvanty udržujú 10 minút pri teplote 37 °C. Pridá sa antigén (1 objem) a adjuvant (1 objem), pred inkubáciou sa vírivo krátko mieša 20 minút pri teplote 37 °C a nakoniec sa zmes ako celok vírivo mieša tri minúty.
Výsledky
V myšiach imunizovaných antigénom LmCPb (tabuľka (a) a (b), obr. 32 (a) a (b)) vyvolávajú produkty OM-294-MP a OM-294-DP podobný účinok, ako je pozorovaný u myší, ktoré vyvíjajú imunitnú reakciu oproti gp63. Preto v prítomnosti LmCPb (15 pg/'ml) je miera proliferácie kultúr odvodených od myší, ktoré boli imunizované antigénom plus adjuvantom OM-294-MP 23x vyššia a antigénom plus adjuvantom OM294-DP je 28x vyššia ako kultúry pochádzajúce od myší, ktorým bol podávaný antigén samotný (bez adjuvanta). Dopad BCG v týchto podmienkach je menší, pretože nárast proliferácie je iba 11-násobný. Podobné javy sú zjavné u kultúr, nadobudnutých vyčisteným antigénom alebo úplným extraktom parazitu Leishmania a pre všetky testované koncentrácie antigénu.
Produkcia γ IFN, ako reakcia na antigén LmCPb, má sklon byť o niečo vyššia s produktom OM-294-DP ako s BCG (tabuľka (b) a obr. 32 (b)). Je potrebné pripomenúť, že v tomto pokuse lymfocyty proliferujú a sekrétujú podstatné množstvo γ IFN, aj keď antigén nemusel byť pridaný do kultivačného média. V tomto prípade, sa adjuvant OM-294-DP javí ako trochu účinnejší ako BCG. Zreteľný rozdiel medzi adjuvantmi OM-294-MP, OM-294-DP a BCG je zrejmý, ako je uvedené, z hľadiska vývoja lymfocytov schopných produkovať IL-4. Množstvo produkovaného IL-4 vplyvom pôsobenia adjuvantov OM-294-MP a OM-294DP je významné, pretože súvisí s množstvom sekrétovaným lymfocytmi vystavenými účinku Con A, čo je silný, nešpecifický stimulant lymfocytov (tabuľka (a) a (b)).
Tabuľka (a)
Proliferatívna reakcia in vitro buniek lymfatických uzlín odvodených z myší imunizovaných in vivo pôsobením LmCPb: vplyv rôznych adjuvantov
| 3H-TdR(cpmxlO’3/ml) | ||||
| In vitro stimulátor | Bez adjuvanta | OM-294-DP | OM-294-MP | BCG |
| bez stimulátora | l,7±0,6 | 21,8±2,2 | 17,1 ±2,5 | 18,6±4,8 |
| LmCPb 0,6 pg/ml | 0,8±0,3 | 40,9±12,7 | 22,9±2,8 | 19,0±7,4 |
| LmCPb 1,7 pg/ml | 2,4±0,l | 57,2±10,9 | 34,1 ±4,1 | 39,8+5,7 |
| LmCPb 5 pg/ml | 2,8±0,6 | 70,2±9,2 | 70,3±6,4 | 44,0±10,4 |
| LmCPb 15 pg/ml | 4,3+0,1 | 100,0±6,5 | 124,2±12,0 | 46,2±0,3 |
| Amastigot 2 x 10’6/ml | 2,4±0,6 | 61,0±l,7 | 28,4±8,3 | 24,4±4,3 |
| Amastigot 6 x lO^/ml | 2,3±0,7 | 81,5+5,5 | 66,1±4,5 | 23,6±2,5 |
| Amastigot 17 x 10'6/ml | l,7±0,4 | 78,2±7,8 | 68,7±2,3 | 23,4±4,0 |
| Con A 5 pg/ml | 188,l±21,0 | 135,9±3,7 | 151,4±3,7 | 119,7±28,5 |
Hodnoty uvedené v tabuľke sú aritmetickým stredom + smerodajná odchýlka vyjadreným absorpciou indikátora (trojité kultúry)
Tabuľka (b) - Produkcia in vitro cytokínov lymfocytmi lymfatických uzlín, imunizovaných in vivo LmCPb antigénom: vplyv rôznych adjuvantov na reakciu
| Koncentrácia γ IFN (pg/ml) | ||||
| Stimulátor in vitro | Bez adjuvanta | OM-294-MP | OM-294-MP | BCG |
| Žiadny stimulátor | <9 | 460 | 240 | 280 |
| LmCPb 15 pg/ml | 44 | 520 | 360 | 460 |
| Amastigoty 17xl0’6/ml | 14 | >600 | >600 | 480 |
| Con A 5 pg/ml | 1200 | 1200 | 1900 | >3000 |
| Koncentrácia IL-4 (pg/ml) | ||||
| Stimulátor in vitro | Bez adjuvanta | OM-294-MP | OM-294-MP | BCG |
| Žiadny stimulátor | <15 | <8 | <8 | <8 |
| Koncentrácia γ IFN (pg/ml) | ||||
| Stimulátor in vitro | Bez adjuvanta | OM-294-MP | OM-294-MP | BCG |
| LmCPb 15 pg/ml | <15 | 110 | 88 | 26 |
| Amastigoty 17xl0'6/ml | <8 | 130 | 110 | 29 |
| Con A 5 pg/ml | 40 | 230 | 85 | 103 |
Adjuvanty OM-294-MP a OM-294-DP pôsobia účinne na imunitnú reakciu oproti rozpustnému antigénu proteázy Leishmania mCPb. Prejavuje sa to in vitro nárastom proliferatívnej reakcie nasledovanej indukciou produkcie γ IFN a IL-4 vo významných množstvách.
Príklad 6
Vodný roztok na injektovanie
| Zlúčenina príkladu III | 1,0 g |
| Polysorbát 80 | 0,2 g |
| Chlorid sodný | 9,0 g |
| Destilovaná voda na injektovanie | 1000 ml |
Hodnota pH roztoku sa nastaví na 7,5 0,1 M kyselinou chlorovodíkovou a roztok sa sterilizuje membránovou filtráciou na membráne 0,22 pm Steritop Express 1000 (membrána PES, 90 mM, SCGP T10 RE, Millipore Corporation, Bedford, MA, USA). Sterilným roztokom sa plnia ampuly po 1 ml.
Lyofilizovaný produkt
| Zlúčenina príkladu IV | 2,0 g |
| Polysorbát 80 | 0,2 g |
| Chlorid sodný | 9,0 g |
| Manitol | 10,0 g |
| Kyselina askorbová | 0,1 g |
| Destilovaná voda na injektovanie | 1000 ml |
Hodnota pH roztoku sa nastaví na 7,4 0,1 M kyselinou chlorovodíkovou a roztok sa sterilizuje membránovou filtráciou na membráne 0,22 pm Steritop Express 1000 (membrána PES, 90 mM, SCGP T10 RE, Millipore Corporation, Bedford, MA, USA). Sterilným roztokom sa plnia viacdávkové liekovky v množstve 1 ml na liekovku a sušia sa vymrazovaním.
Priemyselná využiteľnosť
Zlúčenina podobná N-acyl-dipeptidu vhodná na výrobu liečiv najmä proti nádorovým ochoreniam.
Claims (9)
1. N-Acyldipeptidový derivát všeobecného vzorca (I) (I)
NHR!
nhr2 kde znamená
R, a R2 acylovú skupinu odvodenú od nasýtenej alebo nenasýtenej karboxylovej kyseliny s priamym alebo s rozvetveným reťazcom s 2 až 24 atómami uhlíka, ktorý je nesubstituovaný alebo obsahuje jeden alebo niekoľko substituentov vybraných zo súboru zahrnujúceho hydroxylovú skupinu, alkylovú skupinu, alkoxyskupinu, acyloxyskupinu, aminoskupinu, acylaminoskupinu, acyltioskupinu a alkyltioskupinu vždy 1 až 24 atómami uhlíka, m 1 až 4, n 0, p 3 alebo 4, q 1
X a Y atóm vodíka alebo fosfonoskupinu za podmienky, že znamená aspoň jeden substituent X a Y fosfonoskupinu.
2. N-Acyldipeptidový derivát podľa nároku 1 všeobecného vzorca (I), v ktorom je aspoň jedna fosfonoskupina vo forme soli s anorganickou alebo s organickou zásadou.
3. N-Acyldipeptidový derivát podľa nároku 1 alebo 2 všeobecného vzorca (I), ktorým sú 1- a/alebo 10-dihydrogénfosfáty 3-(3-dodekanoyloxytetradekanoylamino)-9-(3-hydroxytetradekanoylamino)-4-oxo-5-azadekán-l,10-diolov a jeho adičné soli s organickou alebo s anorganickou zásadou.
4. N-Acyldipeptidový derivát podľa nároku 1 alebo 2 všeobecného vzorca (I), ktorým sú 1,10-bis(dihydrogenfosfát) 3-(3-dodekanoyloxytetradekanoylamino)-9-(3-hydroxytetradekanoylamino)-4-oxo-5-azadekán-l,10-diolu a jeho adičné soli s organickou alebo s anorganickou zásadou.
5. N-Acyldipeptidový derivát podľa nároku 1 alebo 2 všeobecného vzorca (I), ktorým sú 1,10-bis(dihydrogenfosfát) 3-(3-hydroxytetradekanoylamino)-9-(3-dodekanoyloxytetradekanoylamino)-4-oxo-5-azadekán-l,10-diol a jeho adičné soli s organickou alebo s anorganickou zásadou.
6. N-Acyldipeptidový derivát podľa nároku 1 alebo 2 všeobecného vzorca (I), ktorým sú 1-dihydrogenfosfát 3-(3-dodekanoyloxytetradekanoylamino)-9-(3-hydroxytetradodekanoylamino)-4-oxo-5-azadekán-1,10-diolu a jeho adičné soli s organickou alebo s anorganickou zásadou.
7. N-Acyldipeptidový derivát podľa nároku 1 alebo 2 všeobecného vzorca (I), ktorým sú 1-dihydrogenfosfát 3-(3-hydroxytetradekanoylamino)-9-(3-dodekanoyloxytetradekanoylamino)-4-oxo-5-azadekán-l,10-diolu a jeho adičné soli s organickou alebo s anorganickou zásadou.
8. N-Acyldipeptidový derivát podľa nároku 1 alebo 2 všeobecného vzorca (I), ktorým sú 10-dihydrogenfosfát 3-(3-hydroxytetradekanoylamino)-9-(3-dodekanoyloxytetradekanoylamino)-4-oxo-5-azadekán-l,10-diol a jeho adičné soli s organickou alebo s anorganickou zásadou.
9. Spôsob prípravy N-acyldipeptidového derivátu podľa nároku 1 alebo 2 všeobecného vzorca (I),
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9801396 | 1998-06-30 | ||
| PCT/IB1999/001170 WO2000000462A1 (fr) | 1998-06-30 | 1999-06-23 | Nouveaux pseudodipeptides acyles, leur mode de preparation et les compositions pharmaceutiques en renfermant |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SK18872000A3 SK18872000A3 (sk) | 2001-07-10 |
| SK287073B6 true SK287073B6 (sk) | 2009-11-05 |
Family
ID=9522667
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SK1887-2000A SK287073B6 (sk) | 1998-06-30 | 1999-06-23 | N-Acyldipeptidový derivát, spôsob jeho prípravy a farmaceutický prostriedok, ktorý ho obsahuje |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US7157092B1 (sk) |
| EP (1) | EP1091928B1 (sk) |
| JP (1) | JP4699609B2 (sk) |
| KR (1) | KR100766016B1 (sk) |
| CN (1) | CN1168702C (sk) |
| AR (1) | AR029877A1 (sk) |
| AT (1) | ATE355266T1 (sk) |
| AU (1) | AU761396B2 (sk) |
| BR (1) | BR9911329A (sk) |
| CA (1) | CA2337807C (sk) |
| CZ (1) | CZ302062B6 (sk) |
| DE (1) | DE69935330T2 (sk) |
| DK (1) | DK1091928T3 (sk) |
| EE (1) | EE04489B1 (sk) |
| ES (1) | ES2284275T3 (sk) |
| HU (1) | HUP0102475A3 (sk) |
| PL (1) | PL195764B1 (sk) |
| RU (1) | RU2223262C2 (sk) |
| SK (1) | SK287073B6 (sk) |
| TW (1) | TWI255808B (sk) |
| WO (1) | WO2000000462A1 (sk) |
Families Citing this family (68)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU761396B2 (en) * | 1998-06-30 | 2003-06-05 | Om Pharma | Novel acyl pseudodipeptides, preparation method and pharmaceutical compositions containing same |
| AU1581400A (en) * | 1999-12-22 | 2001-07-03 | Om Pharma | Acyl pseudopeptides bearing a functionalised auxiliary spacer |
| DE60234092D1 (de) * | 2001-01-30 | 2009-12-03 | Univ Virginia | Agonisten und antagonisten von sphingosin-1-phosphatrezeptoren |
| CN1599623B (zh) | 2001-09-14 | 2011-05-11 | 赛托斯生物技术公司 | 免疫刺激物向病毒样颗粒内的包装:制备方法与用途 |
| CA2487849A1 (en) | 2002-07-18 | 2004-01-29 | Cytos Biotechnology Ag | Hapten-carrier conjugates comprising virus like particles and uses thereof |
| KR20050115913A (ko) | 2003-03-26 | 2005-12-08 | 사이토스 바이오테크놀로지 아게 | Ｍｅｌａｎ―ａ 펩티드 유사체-바이러스-양-입자컨쥬게이트 |
| AU2005249212B2 (en) | 2004-05-28 | 2010-05-20 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Vaccine compositions comprising virosomes and a saponin adjuvant |
| GB0503337D0 (en) | 2005-02-17 | 2005-03-23 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Compositions |
| JP5869744B2 (ja) | 2005-03-23 | 2016-02-24 | グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム | Ｃｄ４ｔ細胞および／または改善された記憶ｂ細胞応答を誘導するためのインフルエンザウイルスおよび水中油型エマルジョンアジュバントの使用 |
| JP5484732B2 (ja) | 2005-12-14 | 2014-05-07 | サイトス バイオテクノロジー アーゲー | 過敏症の治療のための免疫賦活性核酸パッケージ粒子 |
| GB0607088D0 (en) | 2006-04-07 | 2006-05-17 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Vaccine |
| CA2808919C (en) | 2005-12-22 | 2016-04-19 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Streptococcus pneumoniae capsular saccharide vaccine |
| AU2007222135B2 (en) * | 2006-03-09 | 2012-02-02 | Om Pharma | Immunomodulatory compounds and treatment of diseases related to an overproduction of inflammatory cytokines |
| EP2476434A1 (en) | 2006-03-30 | 2012-07-18 | GlaxoSmithKline Biologicals S.A. | Immunogenic composition |
| ES2427994T3 (es) | 2006-06-12 | 2013-11-05 | Cytos Biotechnology Ag | Procesos para empaquetar oligonucleótidos en partículas de tipo viral de bacteriófagos de ARN |
| PL2422810T3 (pl) | 2006-07-17 | 2015-03-31 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Szczepionka przeciw grypie |
| BRPI0715581A2 (pt) | 2006-07-18 | 2013-04-24 | Glaxosmithkline Biolog Sa | proteÍna de fusço hÍbrida imunogÊnica, composiÇço, uso de uma proteÍna ou uma partÍcula, mÉtodo para tratar um paciente suscetÍvel À infecÇço por plasmàdio, sequÊncia de nucleotÍdeo, hospedeiro, e, processo para a produÇço de proteÍna |
| WO2008012538A2 (en) | 2006-07-25 | 2008-01-31 | The Secretary Of State For Defence | Live vaccine strains of francisella |
| EP2086582B1 (en) | 2006-10-12 | 2012-11-14 | GlaxoSmithKline Biologicals s.a. | Vaccine comprising an oil in water emulsion adjuvant |
| DK2137210T3 (en) | 2007-03-02 | 2017-01-30 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Hitherto unknown method and compositions |
| TW200908994A (en) | 2007-04-20 | 2009-03-01 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Vaccine |
| EP2687228B1 (en) | 2007-06-26 | 2017-07-19 | GlaxoSmithKline Biologicals S.A. | Vaccine comprising streptococcus pneumoniae capsular polysaccharide conjugates |
| EP2020240A1 (en) * | 2007-07-30 | 2009-02-04 | Paul-Ehrlich-Institut Bundesamt für Sera und Impfstoffe | Methods and substances for the treatment of Alzheimer's |
| ES2626634T3 (es) | 2007-12-19 | 2017-07-25 | The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine, Inc. | Formas solubles de la glucoproteína F del virus de Hendra y Nipah y usos de la misma |
| AU2008340949A1 (en) | 2007-12-24 | 2009-07-02 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Recombinant RSV antigens |
| KR20110009157A (ko) | 2008-04-16 | 2011-01-27 | 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. | 백신 |
| EP2374813A1 (en) | 2008-12-03 | 2011-10-12 | Proyecto de Biomedicina Cima, S.L. | Use of phenol-soluble modulins for vaccine development |
| WO2010079081A1 (en) | 2009-01-07 | 2010-07-15 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Methods for recovering a virus or a viral antigen produced by cell culture |
| GB0901423D0 (en) | 2009-01-29 | 2009-03-11 | Secr Defence | Treatment |
| GB0901411D0 (en) | 2009-01-29 | 2009-03-11 | Secr Defence | Treatment |
| JP5843615B2 (ja) | 2009-02-06 | 2016-01-13 | グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム | 密度勾配超遠心分離によるウイルスまたはウイルス抗原の精製 |
| AR075437A1 (es) | 2009-02-17 | 2011-03-30 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Composicion inmunogenica que comprende al menos un antigeno del virus del dengue inactivado y un adyuvante sin aluminio, metodo para producir dicha vacuna y su uso para preparar un medicamento |
| GB0906234D0 (en) | 2009-04-14 | 2009-05-20 | Secr Defence | Vaccine |
| US9492531B2 (en) | 2009-06-24 | 2016-11-15 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Recombinant RSV vaccines |
| MX2012000036A (es) | 2009-06-24 | 2012-02-28 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Vacuna. |
| DK3178490T3 (da) | 2009-07-15 | 2022-06-20 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | RSV F-proteinsammensætninger og fremgangsmåder til fremstilling af disse |
| GB0913680D0 (en) | 2009-08-05 | 2009-09-16 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Immunogenic composition |
| CA2774555A1 (en) | 2009-09-25 | 2011-03-31 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Immunodiffusion assay for influenza virus |
| GB0919117D0 (en) | 2009-10-30 | 2009-12-16 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Process |
| WO2011101332A1 (en) | 2010-02-16 | 2011-08-25 | Proyecto De Biomedicina Cima, S.L. | Compositions based on the fibronectin extracellular domain a for the treatment of melanoma |
| CN102858961A (zh) | 2010-05-03 | 2013-01-02 | 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 | 新方法 |
| GB201009273D0 (en) | 2010-06-03 | 2010-07-21 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Novel vaccine |
| US20130216613A1 (en) | 2010-10-15 | 2013-08-22 | Guy Jean Marie Fernand Pierre Baudoux | Cytomegalovirus gb antigen |
| EP2505640A1 (en) | 2011-03-29 | 2012-10-03 | Neo Virnatech, S.L. | Vaccine compositions for birnavirus-borne diseases |
| US20140072622A1 (en) | 2011-05-17 | 2014-03-13 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Vaccine against streptococcus pneumoniae |
| JP2015514696A (ja) | 2012-03-18 | 2015-05-21 | グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム | ヒト・パピローマウイルスに対するワクチン接種方法 |
| CA2879939A1 (en) | 2012-08-06 | 2014-02-13 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Novel method |
| US20140037680A1 (en) | 2012-08-06 | 2014-02-06 | Glaxosmithkline Biologicals, S.A. | Novel method |
| BE1022174B1 (fr) | 2013-03-15 | 2016-02-24 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Vaccin |
| EP3632458A1 (en) | 2013-07-26 | 2020-04-08 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Methods and pharmaceutical compositions for the treatment of bacterial infections |
| KR20160040290A (ko) | 2013-08-05 | 2016-04-12 | 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. | 조합 면역원성 조성물 |
| ES2778928T3 (es) | 2013-08-30 | 2020-08-12 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Producción a gran escala de virus en cultivos celulares |
| CN104436157A (zh) | 2013-09-23 | 2015-03-25 | 恩金生物有限公司 | 流感疫苗和治疗 |
| WO2015130584A2 (en) | 2014-02-25 | 2015-09-03 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Lipid nanoparticle vaccine adjuvants and antigen delivery systems |
| WO2015165480A1 (en) | 2014-04-30 | 2015-11-05 | Institute For Research In Biomedicine | Human cytomegalovirus vaccine compositions and method of producing the same |
| JP6664338B2 (ja) | 2014-06-13 | 2020-03-13 | グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム | 免疫原性組合せ物 |
| WO2016180852A1 (en) | 2015-05-12 | 2016-11-17 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Methods for preparing antigen-specific t cells from an umbilical cord blood sample |
| WO2016207408A1 (en) | 2015-06-26 | 2016-12-29 | Institute For Research In Biomedicine | Novel vaccines in prevention and treatment of malaria |
| GB201614799D0 (en) | 2016-09-01 | 2016-10-19 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Compositions |
| WO2018162450A1 (en) | 2017-03-06 | 2018-09-13 | Fundación Para La Investigación Médica Aplicada | New inmunostimulatory compositions comprising an entity of cold inducible rna-binding protein with an antigen for the activation of dendritic cells |
| EP3581201A1 (en) | 2018-06-15 | 2019-12-18 | GlaxoSmithKline Biologicals S.A. | Escherichia coli o157:h7 proteins and uses thereof |
| US11911553B2 (en) * | 2018-07-06 | 2024-02-27 | Fenwal, Inc. | Systems and methods for concentrating cells with a syringe and a centrifuge |
| EP4004018A1 (en) | 2019-07-24 | 2022-06-01 | GlaxoSmithKline Biologicals SA | Modified human cytomegalovirus proteins |
| CN112329267B (zh) * | 2020-11-26 | 2022-08-16 | 中国核动力研究设计院 | 一种基于特征线法的组合几何中子输运处理方法及装置 |
| MX2023006320A (es) | 2020-12-02 | 2023-06-14 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Cadena donante complementada fimh. |
| WO2022161598A1 (en) | 2021-01-26 | 2022-08-04 | Eth Zurich | Antibodies broadly targeting coronaviruses and uses thereof |
| WO2022162012A2 (en) | 2021-01-26 | 2022-08-04 | Eth Zurich | Antibodies broadly targeting coronaviruses and uses thereof |
| WO2023144665A1 (en) | 2022-01-28 | 2023-08-03 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Modified human cytomegalovirus proteins |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61227586A (ja) * | 1985-03-30 | 1986-10-09 | Dai Ichi Seiyaku Co Ltd | ジサツカライド誘導体およびその塩 |
| US4746742A (en) * | 1985-11-28 | 1988-05-24 | Toho Yakuhin Kogyo Kabushiki Kaisha | Analogs of nonreducing monosaccharide moiety of lipid A |
| DE4229877C2 (de) * | 1992-09-04 | 1994-09-15 | Max Delbrueck Centrum | Phospho- bzw. Phosphono-(N-acyl)-serine und ihre Herstellung |
| EP0668289A4 (en) * | 1993-09-07 | 1998-10-21 | Suntory Ltd | NEW DISACCHARIDE DERIVATIVE. |
| DK0729473T3 (da) * | 1993-11-17 | 2000-10-30 | Deutsche Om Arzneimittel Gmbh | Glucosamin-disaccharider, fremgangsmåde til deres fremstilling farmaceutisk sammensætning deraf og deres anvendelse |
| AU761396B2 (en) * | 1998-06-30 | 2003-06-05 | Om Pharma | Novel acyl pseudodipeptides, preparation method and pharmaceutical compositions containing same |
-
1999
- 1999-06-23 AU AU42848/99A patent/AU761396B2/en not_active Ceased
- 1999-06-23 DK DK99957636T patent/DK1091928T3/da active
- 1999-06-23 KR KR1020007015066A patent/KR100766016B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1999-06-23 AT AT99957636T patent/ATE355266T1/de not_active IP Right Cessation
- 1999-06-23 JP JP2000557223A patent/JP4699609B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1999-06-23 PL PL99345040A patent/PL195764B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1999-06-23 EE EEP200000791A patent/EE04489B1/xx not_active IP Right Cessation
- 1999-06-23 WO PCT/IB1999/001170 patent/WO2000000462A1/fr active IP Right Grant
- 1999-06-23 CZ CZ20004893A patent/CZ302062B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1999-06-23 DE DE69935330T patent/DE69935330T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-06-23 CA CA2337807A patent/CA2337807C/fr not_active Expired - Fee Related
- 1999-06-23 BR BR9911329-5A patent/BR9911329A/pt not_active Application Discontinuation
- 1999-06-23 EP EP99957636A patent/EP1091928B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1999-06-23 RU RU2001102614/04A patent/RU2223262C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1999-06-23 SK SK1887-2000A patent/SK287073B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1999-06-23 CN CNB998077615A patent/CN1168702C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1999-06-23 ES ES99957636T patent/ES2284275T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-06-23 HU HU0102475A patent/HUP0102475A3/hu unknown
- 1999-06-23 US US09/720,045 patent/US7157092B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-06-30 AR ARP990103172A patent/AR029877A1/es active IP Right Grant
- 1999-07-30 TW TW088112968A patent/TWI255808B/zh not_active IP Right Cessation
-
2006
- 2006-02-28 US US11/363,691 patent/US20060148678A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE69935330T2 (de) | 2007-10-31 |
| ATE355266T1 (de) | 2006-03-15 |
| JP2002519338A (ja) | 2002-07-02 |
| US7157092B1 (en) | 2007-01-02 |
| AU4284899A (en) | 2000-01-17 |
| PL345040A1 (en) | 2001-11-19 |
| HUP0102475A2 (hu) | 2001-11-28 |
| RU2223262C2 (ru) | 2004-02-10 |
| CN1168702C (zh) | 2004-09-29 |
| KR20010083078A (ko) | 2001-08-31 |
| ES2284275T3 (es) | 2007-11-01 |
| DE69935330D1 (de) | 2007-04-12 |
| US20060148678A1 (en) | 2006-07-06 |
| PL195764B1 (pl) | 2007-10-31 |
| WO2000000462A1 (fr) | 2000-01-06 |
| CA2337807A1 (fr) | 2000-01-06 |
| BR9911329A (pt) | 2001-10-16 |
| SK18872000A3 (sk) | 2001-07-10 |
| DK1091928T3 (da) | 2007-07-23 |
| EE200000791A (et) | 2002-02-15 |
| CA2337807C (fr) | 2012-08-21 |
| EP1091928A1 (fr) | 2001-04-18 |
| AU761396B2 (en) | 2003-06-05 |
| CZ20004893A3 (en) | 2001-05-16 |
| EE04489B1 (et) | 2005-06-15 |
| JP4699609B2 (ja) | 2011-06-15 |
| KR100766016B1 (ko) | 2007-10-11 |
| CZ302062B6 (cs) | 2010-09-22 |
| TWI255808B (en) | 2006-06-01 |
| EP1091928B1 (fr) | 2007-02-28 |
| AR029877A1 (es) | 2003-07-23 |
| CN1306504A (zh) | 2001-08-01 |
| HUP0102475A3 (en) | 2001-12-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| SK287073B6 (sk) | N-Acyldipeptidový derivát, spôsob jeho prípravy a farmaceutický prostriedok, ktorý ho obsahuje | |
| US7799762B2 (en) | Acyl pseudodipeptides which carry a functionalised auxialiary arm | |
| KR100711561B1 (ko) | 면역학적 보조제 화합물 | |
| EP2039361A2 (en) | Use of immunomodulatory compounds | |
| JP2003518086A5 (sk) | ||
| AU690520B2 (en) | Prophylactic and remedy for viral diseases in respiratory tract | |
| US20130022628A1 (en) | Acyl pseudopeptides which carry a functionalized auxiliary arm | |
| KR100898844B1 (ko) | 작용기화된 보조 아암을 가진 아실 슈도디펩티드 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of maintenance fees |
Effective date: 20130623 |