ES2281898T3 - Inhibidor tisular humano de metaloproteinasa-4. - Google Patents
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Abstract
SE DESCRIBE UN INHIBIDOR DE LA METALOPROTEINASA JIDO HUMANA Y EL ADN (ARN) QUE CODIFICA PARA ESTE POLIPEPTIDO, Y UN PROCEDIMIENTO PARA PRODUCIR ESTE POLIPEPTIDO MEDIANTE TECNICAS DE RECOMBINACION. TAMBIEN SE DESCRIBEN PROCEDIMIENTOS PARA UTILIZAR ESTE POLIPEPTIDO PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES, INCLUYENDO LA ARTRITIS Y EL CANCER. TAMBIEN SE DESCRIBEN ANTAGONISTAS CONTRA ESTOS POLIPEPTIDOS Y SU UTILIZACION COMO AGENTE TERAPEUTICO PARA REABSORBER EL TEJIDO DE CICATRICES. TAMBIEN SE DESCRIBEN ENSAYOS DE DIAGNOSTICO PARA DETECTAR LOS NIVELES DE PROTEINA TIMP IA DE ACIDO NUCLEICO DE TIMP - 4 HUMANA.
Description
Inhibidor tisular humano de
metaloproteinasa-4.
Esta invención se refiere a polinucleótidos
recién identificados, polipéptidos codificados por tales
polinucleótidos, el uso de tales polinucleótidos y polipéptidos,
así como la producción de tales polinucleótidos y polipéptidos. Más
particularmente, los polipéptidos de la presente invención son
polipéptidos del inhibidor tisular humano de la
metaloproteinasa-4, más adelante se denomina
"TIMP-4 humano". La invención también se
refiere a la inhibición de la acción de tales polipéptidos.
La matriz extracelular es una estructura
compleja que contiene colágeno, proteoglicano, glicosaminoglicano,
glicoproteínas (fibronectina, condronectina, laminina) y en algunos
tejidos, elastina (Hay, E.D., J. Cell Biol.,
91:205-223 (1981)).
Las metaloproteinasas de la matriz (MMPs, del
Inglés "Matrix Metalloproteinases") constituyen el grupo
principal de endopeptidasas de unión a zinc que degradan las
proteínas de la matriz extracelular, por ejemplo, del tejido
conectivo, colágeno y gelatina, durante la remodelación del tejido
conectivo durante los procesos fisiológicos normales y algunos
patológicos. La actividad incontrolada de las MMPs puede dar como
resultado un considerable daño tisular, y estas enzimas han estado
implicadas en una diversidad de procesos de enfermedad, incluyendo
la invasión celular tumoral, la angiogénesis tumoral y la artritis
reumatoides (Okada, Y., et al., J. Biol. Chem.,
261:14.245-14.255 (1986)). Las MMPs se secretan a
partir de células como zimógenos inactivos y su actividad en el
ambiente extracelular está regulado por diversos activadores e
inhibidores (Matrisian, L.M., Trends Genet.,
6:121-125 (1990)).
La regulación de la proteolisis mediada por
metaloproteinasa puede darse mediante proteínas inhibidoras que se
dan de manera natural, tal como el inhibidor tisular de
metaloproteinasa (TIMP, del Inglés, "Tissue Inhibitor of
Metalloproteinase"). El equilibrio entre la producción y la
activación de las MMPs, y su inhibición por inhibidores naturales
tal como TIMP, determina, tanto en condiciones fisiológicas como
patológicas, si el tejido conectivo está degradado.
Las MMPs incluyen un número de proteasas,
ilustradas por la propia colagenasa intersticial (tipo I), las
estromelisinas (también conocidas como proteoglicanasas o
transinas), fibroblasto y gelatinasas de leucocito polimorfonuclear
(también conocidas como
colagen-IV-asas) y
"pump-1" (metaloproteasas 1 putativas,
metaloproteasas uterinas) [Goldberg et al., J. Biol.
Chem., 2.610:6.600 (1986); Whitman et al., Biochem.
J., 240:913 (1986); Breathnach et al., Nucleic Acids
Res., 15:1.139 (1987); Muller et al., Biochem. J.,
253:187 (1988); Collier et al., J. Biol. Chem.,
263:6.579 (1988); Murphy et al., Biochem. J., 258:463
(1989); Quantin et al., Biochem. (N.Y.), 28:5.327
(1989); Birkedal-Hansen, J. Oral Pathol.,
17:445 (1988)].
En general, la familia mamífera de proteasas
tiene una o más de las siguientes propiedades: (a) actividad
proteolítica óptima alrededor de pH neutro; (b) dependencia de la
actividad de la enzima en presencia de zinc, tan evidente por la
pérdida de actividad en el tratamiento con quelantes de ión metálico
divalente, tal como fenantrolina 1,10 (quelación preferencial de
zinc) o EDTA (propiedades de quelación menos restringidas; EDTA y
EGTA también contribuyen a la inactivación enzimática vía quelación
de iones calcio requeridos para la estabilidad enzimática); (c)
inhibición por TIMPs; (d) ausencia de inhibición significativa por
inhibidores conocidos de otras familias de metaloproteasas que
contienen zinc, neutrales, tal como termolisis, enzima convertidora
de la angiotensina y "encefalinasas"; y (e) biosíntesis y
secreción como formas precursoras latentes (zimógenos), que
requieren la activación extracelular. Se ha conseguido la activación
mediante un número de endoproteasas, agentes organomercuriales y
caotrópicos.
En general, los miembros de la familia de las
enzimas metaloproteasa neutras tienen distintivas especificidades de
sustrato. Por tanto, la colagenasa tipo I es única en su capacidad
de escindir un péptido específico unido en las fibrillas naturales
de los colágenos intersticiales (por ejemplo, tipos I, II y III).
Las gelatinasas son sólo escasamente activas en estos colágenos,
pero son capaces de degradar colágenos intersticiales
desnaturalizados, así como los colágenos no fibrilares, por
ejemplo, tipo IV, tal como se encuentran en la membrana basal. Se ha
informado que Pump 1 actúa preferentemente sobre los colágenos
desnaturalizados (gelatinas), aunque su perfil difiere del de las
estromelisinas o las colagenasas tipo IV. Tanto las estromelisinas
como las gelatinasas también son capaces de degradar las proteínas
estructurales no colagenosas, tal como la proteína central de
proteoglicano y elastina. Las macromoléculas implicadas en las
interacciones célula a sustrato y célula a célula, tal como laminina
y fibronectina, son también susceptibles a la degradación por varias
de estas metaloproteasas.
Las enzimas de esta familia se producen por
fibroblastos de piel y sinoviales, condrocitos, células
mononucleares periféricas, queratinocitos y tejido gingival. Estos
también existen dentro de las vesículas de almacenamiento granular
en leucocitos polimorfonucleares (PMNLs, del Inglés
"Polymorphonuclear Leukocytes").
La información actual sugiere que hay una
familia de inhibidores de metaloproteinasa que comprende
TIMP-1 (inhibidor tisular de
metaloproteinasas-1); TIMP-2;
TIMP-3 humano el cual se ha clonado, expresado y
mapeado en el cromosoma 22 humano; y el inhibidor tisular de
metaloproteinasa de pollo (ChIMP-5). El polipéptido
de la presente invención se ha identificado supuestamente como un
novedoso polipéptido de TIMP humano basado en la homología de la
secuencia de aminoácidos.
De acuerdo con un aspecto de la presente
invención, se ha proporcionado un novedoso polipéptido maduro que es
TIMP-4 humano, así como fragmentos biológicamente
activos y diagnósticamente o terapéuticamente útiles, análogos y
derivados de los mismos.
De acuerdo con otro aspecto de la presente
invención, se ha proporcionado moléculas de ácido nucleico aisladas
que codifican TIMP-4 humano, incluyendo ARNms, ADNs,
ADNcs, ADNs genómicos así como fragmentos biológicamente activos y
diagnósticamente o terapéuticamente útiles, análogos y derivados de
los mismos.
De acuerdo con un aspecto adicional de la
presente invención, se ha proporcionado un proceso para producir
dicho polipéptido mediante técnicas recombinantes que comprende el
cultivo de células huésped procariotas y/o eucariotas
recombinantes, que contienen una secuencia de ácido nucleico de
TIMP-4 humano bajo condiciones que promueven la
expresión de la proteína y la posterior recuperación de dicha
proteína.
De acuerdo con un aspecto adicional de la
presente invención, se ha proporcionado una composición farmacéutica
que contiene la proteína TIMP-4 humana de la
invención la cual es eficaz para complementar el
TIMP-4 humano endógeno de un enfermo y, de ese
modo, aliviar las enfermedades relacionadas con la insuficiente
actividad de TIMP-4 humano que incluyen, por
ejemplo, enfermedades artríticas tales como reumatoide y
osteoartritis, reumatismo de tejido suave, policondritis y
tendonitis; enfermedades de resorción de hueso, tal como
osteoporosis, enfermedad de Paget, hiperparatiroidismo y
colesteatoma; la destrucción de colágeno aumentada que se da
conjuntamente con la diabetes; las clases recesivas de
epidermolisis bulosa distrófica; enfermedad periodontal, alveolitis
y consecuencias relacionadas de la producción gingival de
colagenasa; ulceración corneal; ulceración de la piel y el tracto
gastrointestinal y curación anormal de heridas; enfermedades de post
operatorio en las cuales se aumentan los niveles de colagenasa;
cáncer mediante el bloqueo de la destrucción de las membranas
basales tisulares que conduce a la metástasis cancerosa;
enfermedades de desmielinación de los sistemas nerviosos centrales y
periféricos; asma; glomeruloesclerosis; choque séptico e infección;
y soriasis.
De acuerdo con un aspecto adicional de la
presente invención, se ha proporcionado un anticuerpo frente a tales
polipéptidos.
De acuerdo con otro aspecto de la presente
invención, se ha proporcionado sondas de ácido nucleico que
comprenden moléculas de ácido nucleico de suficiente longitud para
hibridar específicamente con las secuencias de
TIMP-4 humano.
De acuerdo con otro aspecto de la presente
invención, se han proporcionado antagonistas para tales polipéptidos
los cuales se pueden emplear con propósitos terapéuticos, por
ejemplo, para remodelar y reparar el tejido y para la destrucción
del tejido cicatriz.
De acuerdo con otro aspecto de la presente
invención, se han proporcionado ensayos de diagnóstico para detectar
enfermedades relacionadas con mutaciones en las secuencias de
TIMP-4 humano y la sobre expresión del
polipéptido.
Estos y otros aspectos de la presente invención
deberían estar claros para los expertos en la técnica a partir de
las enseñanzas de la presente memoria.
Los siguientes dibujos son ilustrativos de las
realizaciones de la invención y no se supone que limitan el alcance
de la invención tal como lo abarcado por las reivindicaciones.
La Figura 1 muestra la secuencia de ADNc y la
correspondiente secuencia de aminoácidos deducida del polipéptido
completo de TIMP-4 humano. Se usan las abreviaciones
estándar de una letra para los aminoácidos. La secuenciación se
realizó usando un secuenciador de ADN automatizado 373 (Applied
Biosystems, Inc.). Se prevé que la precisión de la secuenciación es
mayor que preciso al 97%.
La Figura 2 es una comparación de secuencia de
aminoácidos entre el polipéptido de la presente invención y otros
polipéptidos de TIMP humano.
La Figura 3 expone los resultados de un análisis
de transferencia tipo Northern que indica los diversos tejidos
humanos en los cuales se expresa el TIMP-4
humano.
De acuerdo con un aspecto de la presente
invención, se ha proporcionado un ácido nucleico aislado
(polinucleótido) que codifica el polipéptido maduro que tiene la
secuencia de aminoácidos deducida de la Figura 1 o el polipéptido
maduro codificado por el ADNc del clon depositado como Nº Depósito
ATCC 75946 el 11 de Noviembre de 1994.
Se puede obtener un polinucleótido que codifica
un polipéptido de la presente invención a partir de un cerebro
humano en primera fase. Este contiene un marco de lectura abierto y
codifica una proteína de 224 residuos de aminoácido de los cuales
aproximadamente los primeros 29 residuos representan la secuencia
líder de modo que la proteína madura comprende 195 residuos de
aminoácido. El polinucleótido de esta invención se descubrió en una
genoteca de ADNc derivada de un cerebro humano en fase temprana. La
proteína presenta el mayor grado de homología con el
TIMP-2 humano con un 48% de identidad y un 72% de
similitud sobre un tramo de 136 aminoácidos. El
TIMP-4 humano tiene la signatura de 12 aminoácidos
de cisteína, los cuales se conservan en todos los miembros de la
familia del TIMP. Los 12 residuos de cisteína están todos unidos a
disulfuro en TIMP-1 y TIMP-2. Esta
evidencia fuertemente sugiere que el polipéptido de la presente
invención es un miembro novedoso de la familia del TIMP.
El polinucleótido de la presente invención puede
estar en forma de ARN o en forma de ADN, dicho ADN incluye ADNc,
ADN genómico y ADN sintético. El ADN puede ser de cadena doble o de
cadena sencilla, y si es de cadena sencilla puede ser la cadena
codificadora o la cadena no codificadora (antisentido). La secuencia
codificadora, la cual codifica el polipéptido maduro, puede ser
idéntica a la secuencia codificadora mostrada en la Figura 1 o a la
del clon depositado o puede ser una secuencia codificadora
diferente, dicha secuencia codificadora, como resultado de la
redundancia o la degeneración del código genético, codifica el mismo
polipéptido maduro que el ADN de la Figura 1 o el ADNc
depositado.
El polinucleótido que codifica el polipéptido
maduro de la Figura 1 o el polipéptido maduro codificado por el ADNc
depositado puede incluir: únicamente la secuencia codificadora del
polipéptido maduro; la secuencia codificadora del polipéptido
maduro y la secuencia codificadora adicional tal como una secuencia
secretora o líder o una secuencia de proproteína; la secuencia
codificadora del polipéptido maduro (y opcionalmente la secuencia
codificadora adicional) y la secuencia no codificadora, tal como
intrones o la secuencia no codificadora 5' y/o 3' de la secuencia
codificadora del polipéptido maduro.
Por tanto, el término "polinucleótido que
codifica un polipéptido" abarca un polinucleótido que incluye
únicamente la secuencia codificadora para el polipéptido así como un
polinucleótido que incluye secuencia codificadora y/o no
codificadora adicional.
Además, la presente invención se refiere a
variantes de los polinucleótidos anteriormente descritos los cuales
codifican los fragmentos, análogos y derivados del polipéptido que
tiene la secuencia de aminoácidos deducida de la Figura 1 o el
polipéptido codificado por el ADNc del clon depositado. La variante
del polinucleótido puede ser una variante alélica del polinucleótido
que se da de manera natural o una variante del polinucleótido que no
se da de manera natural.
Por tanto, la presente invención incluye
polinucleótidos que codifican el mismo polipéptido maduro que el
mostrado en la Figura 1 o el mismo polipéptido maduro codificado por
el ADNc del clon depositado así como variantes de tales
polinucleótidos, codificando dichas variantes un fragmento, derivado
o análogo del polipéptido de la Figura 1 o el polipéptido
codificado por el ADNc del clon depositado. Tales variantes de
nucleótido incluyen variantes de deleción, variantes de sustitución
y variantes de adición o inserción.
Tal como se ha indicado anteriormente en la
presente memoria, el polinucleótido puede tener una secuencia
codificadora que es una variante alélica que se da de manera natural
de la secuencia codificadora mostrada en la Figura 1 o de la
secuencia codificadora del clon depositado. Tal como se conoce en la
técnica, una variante alélica es una forma alternativa de una
secuencia de polinucleótido que puede tener una sustitución,
deleción o adición de uno o más nucleótidos, lo cual no altera
sustancialmente la función del polipéptido codificado.
La presente invención también incluye
polinucleótidos, en los cuales la secuencia codificadora del
polipéptido maduro se puede fusionar en el mismo marco de lectura a
una secuencia de polinucleótido lo cual ayuda en la expresión y
secreción de un polipéptido a partir de una célula huésped, por
ejemplo, una secuencia líder que funciona como una secuencia
secretora para controlar el transporte de un polipéptido desde la
célula. El polipéptido que tiene una secuencia líder es una
preproteína y puede tener la secuencia líder escindida por la célula
huésped para formar la forma madura del polipéptido. Los
polinucleótidos también pueden codificar una proproteína que es la
proteína madura más residuos de aminoácidos 5' adicionales. Una
proteína madura que tiene una prosecuencia es una proproteína y es
una forma inactiva de la proteína. Una vez que se escinde la
prosecuencia se queda una proteína madura activa.
Por tanto, por ejemplo, el polinucleótido de la
presente invención puede codificar una proteína madura o una
proteína que tiene una prosecuencia o una proteína que tiene tanto
una prosecuencia como una presecuencia (secuencia líder).
Los polinucleótidos de la presente invención
también pueden tener la secuencia codificadora fusionada en el
marco a una secuencia señal la cual permite la purificación del
polipéptido de la presente invención. La secuencia señal puede ser
una etiqueta de hexahistidina administrada por un vector
pQE-9 para asegurar la purificación del polipéptido
maduro fusionado a la señal en el caso de un huésped bacteriano o,
por ejemplo, la secuencia señal puede ser una etiqueta de
hemaglutinina (HA) cuando se usa un huésped mamífero, por ejemplo,
células COS-7. La etiqueta de HA corresponde a un
epítopo derivado de la proteína hemaglutinina de la gripe (Wilson,
I., et al., Cell, 37:767 (1984)).
Además, la presente invención se refiere a
polinucleótidos que hibridan con las secuencias anteriormente
descritas si hay al menos 50% y preferentemente 70% de identidad
entre las secuencias. La presente invención particularmente se
refiere a polinucleótidos que hibridan bajo condiciones estrictas
con los polinucleótidos anteriormente descritos. Tal como se usa en
la presente invención, el término "condiciones estrictas"
quiere decir que la hibridación ocurrirá únicamente si hay al menos
95% y preferentemente al menos 97% de identidad entre las
secuencias. Los polinucleótidos que hibridan con los polinucleótidos
anteriormente descritos en una realización preferida codifican
polipéptidos que retienen sustancialmente la misma función o
actividad biológica que el polipéptido maduro codificado por el ADNc
de la Figura 1 o el ADNc depositado.
El(los) depósito(s)
referido(s) en la presente memoria se mantendrá(n) bajo los
términos del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento
Internacional del Depósito de Microorganismos con el propósito del
Procedimiento de Patente. Estos depósitos se proporcionan
simplemente por comodidad para los expertos en la técnica y no son
una admisión de que se requiera un depósito bajo 35 U.S.C.
\NAK112. La secuencia de los polinucleótidos contenidos en los
materiales depositados, así como la secuencia de aminoácidos de los
polipéptidos codificados así, se incorporan en la presente memoria
como referencia y son determinantes en el acontecimiento de
cualquier conflicto con cualquier descripción de secuencias de la
presente memoria. Se puede requerir una licencia para producir, usar
o vender los materiales depositados y ninguna de tales licencias es
concedida por la presente invención.
Además, la presente invención se refiere a un
polipéptido de TIMP-4 humano que tiene la secuencia
de aminoácidos deducida de la Figura 1 o que tiene la secuencia de
aminoácidos codificada por el ADNc depositado, así como fragmentos,
análogos y derivados de tal polipéptido.
Los términos "fragmento", "derivado" y
"análogo" cuando se refiere al polipéptido de la Figura 1 o al
codificado por el ADNc depositado, quiere decir un polipéptido que
retiene esencialmente la misma función o actividad biológica que
dicho polipéptido. Por tanto, un análogo incluye una proproteína que
se puede activar mediante escisión de la porción de proproteína para
producir un polipéptido maduro activo.
El polipéptido de la presente invención puede
ser un polipéptido recombinante, un polipéptido natural o un
polipéptido sintético, preferentemente un polipéptido
recombinante.
El fragmento, derivado o análogo del polipéptido
de la Figura 1 o el codificado por el ADNc depositado puede ser (i)
uno en el cual uno o más de los residuos de aminoácidos están
sustituidos con un residuo de aminoácidos conservado o no
conservado (preferentemente un residuo de aminoácidos conservado) y
tal residuo de aminoácidos sustituido puede o no puede ser uno
codificado por el código genético, o (ii) uno en el cual uno o más
de los residuos de aminoácidos incluye un grupo sustituyente, o
(iii) uno en el cual el polipéptido maduro se fusiona con otro
compuesto, tal como un compuesto para incrementar la semivida del
polipéptido (por ejemplo, polietilénglicol), o (iv) uno en el cual
los aminoácidos adicionales se fusionan al polipéptido maduro, tal
como una secuencia líder o secretora o una secuencia que se emplea
para la purificación del polipéptido maduro o una secuencia de
proproteína. Tales fragmentos, derivados y análogos se consideran
que están dentro del alcance de los expertos en la técnica a partir
de las enseñanzas de la presente memoria.
Los polipéptidos y polinucleótidos de la
presente invención preferentemente se proporcionan en una forma
aislada y preferentemente se purifican hasta la homogeneidad.
El término "aislado" quiere decir que el
material se extrae de su ambiente original (por ejemplo, el ambiente
natural si se da de forma natural). Por ejemplo, un polinucleótido o
polipéptido que se da de forma natural presente en un animal vivo
no se aisla, sino que se aisla el mismo polinucleótido o polipéptido
separado de alguno o todos los materiales coexistentes en el
sistema natural. Tales polinucleótidos podrían ser parte de un
vector y/o tales polinucleótidos o polipéptidos podrían ser parte de
una composición, e incluso aislarse en el sentido de que tal vector
o composición no sean parte de su ambiente natural.
La presente invención también se refiere a
vectores que incluyen polinucleótidos de la presente invención,
células huésped que se modifican por ingeniería genética con
vectores de la invención y la producción de los polipéptidos de la
invención mediante técnicas recombinantes.
Las células huésped se modifican por ingeniería
genética (transducidas o transformadas o transfectadas) con los
vectores de esta invención los cuales pueden ser, por ejemplo, un
vector de clonación o un vector de expresión. El vector puede
estar, por ejemplo, en forma de un plásmido, una partícula vírica,
un fago, etc. Las células huésped modificadas por ingeniería
genética se pueden cultivar en medios nutritivos convencionales tan
apropiados para activar promotores, seleccionar transformantes o
amplificar los genes de TIMP-4 humano. Las
condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y similares son
las previamente usadas con la célula huésped seleccionada para la
expresión y estarán claras para aquellos con un conocimiento normal
en la técnica.
Los polinucleótidos de la presente invención se
pueden emplear para producir polipéptidos mediante técnicas
recombinantes. Por tanto, por ejemplo, el polinucleótido se puede
incluir en uno cualquiera de una diversidad de vectores de
expresión para expresar un polipéptido. Tales vectores incluyen
secuencias de ADN cromosómico, no cromosómico y sintético, por
ejemplo, derivados de SV40; plásmidos bacterianos; ADN de fago;
baculovirus; plásmidos de levadura; vectores derivados de
combinaciones de plásmidos y ADN de fago, ADN vírico tal como de
Vaccinia, adenovirus, virus tipo fox de ave de corral, y de
la seudorrabia. Sin embargo, se puede usar cualquier otro vector
siempre que sea replicable y viable en el huésped.
La secuencia apropiada de ADN se puede insertar
en el vector mediante una diversidad de procedimientos. En general,
la secuencia de ADN se inserta en un(os) sitio(s) de
la endonucleasa de restricción apropiado(s) mediante
procedimientos conocidos en la técnica. Se considera que tales
procedimientos y otros están dentro del alcance de los expertos en
la técnica.
\newpage
La secuencia de ADN en el vector de expresión se
une operativamente a una(s) secuencia(s) de control de
expresión apropiada(s) (promotor) para dirigir la síntesis
de ARNm. Como ejemplos representativos de tales promotores, se
pueden mencionar: el promotor de LTR o SV40, lac o trp de E.
coli, el promotor P_{L} del fago lambda y otros promotores
conocidos para controlar la expresión de genes en células
procariotas o eucariotas o sus virus. El vector de expresión
también contiene un sitio de unión a ribosoma para el inicio de la
traducción y un terminador de la transcripción. El vector también
puede incluir secuencias apropiadas para la expresión de
amplificación.
Además, los vectores de expresión
preferentemente contienen uno o más genes señales seleccionables
para proporcionar un rasgo fenotípico para la selección de células
huésped transformadas tal como la resistencia a neomicina o
dihidrofolato reductasa para el cultivo de célula eucariota, o tal
como resistencia a tetraciclina o ampicilina en E. coli.
Se puede emplear el vector que contiene la
secuencia de ADN apropiada tal como la anteriormente descrita, así
como una secuencia control o promotor apropiada, para transformar un
huésped apropiado para permitir al huésped expresar la proteína.
Como ejemplos representativos de huésped
apropiados, se pueden mencionar: células bacterianas, tales como
E. coli, Streptomyces, Salmonella typhimurium; células
fúngicas, tal como levadura; células de insecto tales como S2 y Sf9
de Drosophila; células animales tales como CHO, COS o
melanoma de Bowes; adenovirus; células vegetales, etc. Se considera
que la selección de un huésped apropiado está dentro del alcance de
los expertos en la técnica a partir de las enseñanzas de la presente
memoria.
Más particularmente, la presente invención
también incluye construcciones recombinantes que comprenden una o
más de las secuencias tan ampliamente descritas anteriormente. Las
construcciones comprenden un vector, tal como un plásmido o vector
vírico, en el cual se ha insertado una secuencia de la invención, en
una orientación directa o inversa. En un aspecto preferido de esta
realización, la construcción comprende además secuencias
reguladoras, incluyendo, por ejemplo, un promotor, operablemente
unido a la secuencia. Gran número de los vectores y promotores
adecuados son conocidos por los expertos en la técnica y están
comercialmente disponibles. Se proporcionan los siguientes vectores
a modo de ejemplo. Bacterianos: pQE70, pQE60, pQE-9
(Qiagen), pbs, pD10, phagescript, psiX174, pbluescript SK, pbsks,
pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A (Stratagene); ptrc99a,
pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5
(Pharmacia). Eucariotas: pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG
(Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia). Sin embargo, se
puede usar cualquier otro plásmido o vector siempre que sean
replicables y viables en el huésped.
Las regiones promotores se pueden seleccionar a
partir de cualquier gen deseado usando vectores CAT (cloranfenicol
transferasa) u otros vectores con señales seleccionables. Dos
vectores apropiados son pKK232-8 y pCM7. Los
promotores bacterianos particulares nombrados incluyen: lacI, lacZ,
T3, T7, gpt, P_{R} de lambda, P_{L} y trp. Los promotores
eucariotas incluyen: inmediato temprano de CMV, timidin quinasa de
HSV, temprano y tardío de SV40, LTRs de retrovirus y
metalotioneina-I de ratón. La selección del vector y
promotor apropiado también está dentro del nivel de aquellos con un
conocimiento normal en la técnica.
En una realización adicional, la presente
invención se refiere a células huésped que contienen las
construcciones anteriormente descritas. La célula huésped puede ser
una célula eucariota superior, tal como una célula de mamífero, o
una célula eucariota inferior, tal como una célula de levadura, o la
célula huésped puede ser una célula procariota, tal como una célula
bacteriana. La introducción de la construcción dentro de la célula
huésped se puede efectuar mediante transfección por fosfato de
calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano o
electroporación. (Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Basic
Methods in Molecular Biology, (1986)).
Las construcciones en las células huésped se
pueden usar de una manera convencional para producir el producto
genético codificado por la secuencia recombinante. Si no, los
polipéptidos de la invención se pueden producir sintéticamente
mediante sintetizadores de péptido convencionales.
Las proteínas maduras se pueden expresar en
células de mamífero, levadura, bacterias u otras células bajo el
control de promotores apropiados. También se pueden emplear los
sistemas de traducción libre de célula para producir tales
proteínas usando derivados de ARNs de las construcciones de ADN de
la presente invención. Los vectores de clonación y expresión
apropiados para usar con los huésped procariotas y eucariotas están
descritos por Sambrook, et al., Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor, N.Y.,
(1989), cuya descripción se incorpora en la presente memoria como
referencia.
La transcripción del ADN codificador de los
polipéptidos de la presente invención por eucariotas superiores se
incrementa insertando una secuencia potenciadora en el vector. Los
potenciadores son elementos de ADN que actúan con cis, normalmente
aproximadamente entre 10 y 300 pb que actúan sobre un promotor para
incrementar su transcripción. Los ejemplos incluyen el potenciador
de SV40 sobre el último lado del origen de replicación de 100 a 270
pb, un potenciador de promotor temprano de citomegalovirus, el
potenciador de polioma sobre el último lado del origen de
replicación y potenciadores de adenovirus.
Generalmente, los vectores de expresión
recombinantes incluirán orígenes de replicación y señales
seleccionables que permitan la transformación de la célula huésped,
por ejemplo, el gen de resistencia a ampicilina de E. coli y
el gen TRP1 de S. cerevisiae, y un promotor derivado de un
gen altamente expresado para dirigir la transcripción de una
secuencia estructural en dirección 3'. Tales promotores pueden estar
derivados de operones codificadores de enzimas glicolíticas tales
como 3-fosfoglicerato quinasa (PGK, del Inglés
"Phosphoglycerate Kinase"), factor \alpha, fosfatasa ácida o
proteínas de golpe de calor, entre otras. La secuencia estructural
heteróloga se ensambla en la fase apropiada con las secuencias de
inicio y terminación de traducción, y preferentemente, una
secuencia líder capaz de dirigir la secreción de la proteína
traducida en el espacio periplásmico o en el medio extracelular.
Opcionalmente, la secuencia heteróloga puede codificar una proteína
de fusión incluyendo un péptido de identificación
N-terminal que imparte las características deseadas,
por ejemplo, estabilización o purificación simplificada del producto
recombinante
expresado.
expresado.
Los vectores de expresión útiles para el uso
bacteriano se construyen insertando una secuencia de ADN estructural
que codifica una proteína deseada junto con señales adecuadas de
inicio y terminación de la traducción en la fase de lectura
operable con un promotor funcional. El vector comprenderá uno o más
señales seleccionables fenotípicas y un origen de replicación para
asegurar el mantenimiento del vector y para, si se desea,
proporcionar la amplificación dentro del huésped. Huésped
procariotas adecuados para la transformación incluyen: E. coli,
Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium y diversas especies
dentro del género Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus, aunque
otros también se pueden emplear como materia de elección.
Como ejemplo representativo pero no limitante,
los vectores de expresión útiles para el uso bacteriano pueden
comprender una señal seleccionable y un origen bacteriano de
replicación derivado de plásmidos comercialmente disponibles
comprendiendo elementos genéticos del muy conocido vector de
clonación pBR322 (ATCC 37017). Tales vectores comerciales incluyen,
por ejemplo, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals,
Uppsala, Suecia) y GEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, USA). Estas
secciones de "cadena principal" de pBR322 se combinan con un
promotor apropiado y la secuencia estructural a expresar.
Después de la transformación de una cepa huésped
adecuada y el desarrollo de la cepa huésped hasta una densidad
celular apropiada, el promotor seleccionado es instala por medios
apropiados (por ejemplo, cambio de temperatura o instalación
química) y las células se cultivan durante un periodo adicional.
Generalmente se recogen las células mediante
centrifugación, se alteran por medios físicos o químicos y el
extracto en bruto resultante se retiene para una purificación
adicional.
Las células microbianas empleadas en la
expresión de proteínas se pueden alterar mediante cualquier método
convencional, incluyendo el ciclo de
congelación-descongelación, sonicación, alteración
mecánica o el uso de agentes de lisis celular, tales métodos son muy
conocidos por los expertos en la técnica.
También se pueden emplear diversos sistemas de
cultivo de células de mamífero para expresar la proteína
recombinante. Ejemplos de sistemas de expresión de mamífero incluyen
las líneas COS-7 de fibroblastos de riñón de mono,
descritos por Gluzman, Cell, 23:175 (1981), y otras líneas
celulares capaces de expresar un vector compatible, por ejemplo,
las líneas celulares C127, 3T3, CHO, HeLa y BHK. Los vectores de
expresión de mamífero comprenderán un origen de replicación, un
promotor y potenciador adecuado y también cualquier sitio de unión a
ribosoma necesario, sitio de poliadenilación, sitios donador y
aceptor de empalme, secuencias de terminación transcripcional y
secuencias no transcritas flanqueantes 5'. Las secuencias de ADN
derivadas de los sitios de corte y empalme y poliadenilación de SV40
se pueden usar para proporcionar los elementos genéticos no
transcritos requeridos.
Los polipéptidos de TIMP-4
humano se pueden recuperar y purificar a partir de cultivos de
células recombinantes mediante métodos que incluyen: precipitación
con sulfato de amonio o etanol, extracción ácida, cromatografía de
intercambio iónico o catiónico, cromatografía en fosfocelulosa,
cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad,
cromatografía en hidroxiapatita y cromatografía en lectina. Se
pueden usar las etapas de replegamiento proteico, si es necesario,
en la configuración final de la proteína madura. Finalmente, se
puede emplear la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC, del
Inglés "High Performance Liquid Chromatography") para las
etapas de purificación final.
Los polipéptidos de la presente invención pueden
ser un producto purificado de manera natural, o un producto de
procedimientos sintéticos químicos o producido mediante técnicas
recombinantes a partir de un huésped procariota o eucariota (por
ejemplo, por células bacterianas, de levadura, vegetales superiores,
de insecto y de mamífero en cultivo). Dependiendo del huésped
empleado en un procedimiento de producción recombinante, los
polipéptidos de la presente invención pueden ser glicosilados o
pueden ser no glicosilados. Los polipéptidos de la invención también
pueden incluir un residuo de aminoácido de metionina inicial.
La presente invención también está dirigida, en
parte, a TIMP-4 humano que tiene, como
característica definida, la capacidad de inhibir la acción de las
MMPs. El polipéptido de TIMP-4 humano se puede
emplear como inhibidor de la metaloproteinasa para prevenir la
invasión tumoral y la angiogénesis y la posterior metástasis. El
polipéptido de TIMP-4 humano también se puede
emplear para tratar enfermedades artríticas, tales como artritis
reumatoide y osteoartritis, reumatismo de tejido suave,
policondritis y tendonitis; y enfermedades de resorción de hueso,
tales como osteoporosis, enfermedad de Paget, hiperparatiroidismo y
colesteatoma. El TIMP-4 humano también se puede
emplear para prevenir la destrucción aumentada de colágeno que se da
conjuntamente con la diabetes, las clases recesivas de epidermolisis
bulosa distrófica, enfermedad periodontal y consecuencias
relacionadas de la producción gingival de colagenasa. El
TIMP-4 humano también se puede emplear para inhibir
la liberación de colagenasa de PMNL después de la infiltración
celular a la encía inflamada, incluyendo combatir la gran
susceptibilidad de los enfermos de diabetes a la enfermedad
periodontal.
El TIMP-4 humano también se
puede emplear para tratar la ulceración corneal, por ejemplo, la
inducida por álcali u otras quemaduras, por radiación, por Vitamina
E o deficiencia retinoide; ulceración de la piel y el tracto
gastrointestinal y curación anormal de heridas y enfermedades de
post operatorio incluyendo la anastomosis de colon, en las cuales se
incrementa los niveles de colagenasa.
El tumor mediado por MMPs se desarrolló in
situ. Por consiguiente, el TIMP-4 humano se
puede usar para bloquear la destrucción de las membranas basales
celulares, mecanismo por el cual las células cancerosas sufren
metástasis. Las MMPs han estado implicadas en la neovascularización
requerida para soportar el desarrollo tumoral y sobrevivir, en la
remodelación de tejido requerida para acomodar el desarrollo de los
tumores primarios y secundarios y en la penetración de las células
tumorales a través de las membranas basales de las paredes
vasculares durante la
metástasis.
metástasis.
Las MMPs son responsables de la degradación
localizada de la pared folicular durante la ovulación y la
degradación localizada de la pared uterina para la implantación de
blastocitos. Por consiguiente, el TIMP-4 humano se
puede emplear como anticonceptivo.
El TIMP-4 humano también se
puede emplear como factor de crecimiento general para tratar la
restenosis y enfermedades similares. El TIMP-4
humano se puede emplear particularmente como factor de crecimiento
para líneas celulares eritroides.
Otras enfermedades en las que se puede usar el
TIMP-4 humano para tratarlas incluyen: alveolitis,
asma, soriasis, glomeruloesclerosis y choque séptico puesto que las
MMPs están implicadas en la invasividad tisular de algunos
parásitos.
Se pueden usar fragmentos del gen completo de
TIMP-4 humano como sonda de hibridación para una
genoteca de ADNc para aislar el gen completo y aislar otros genes
que tengan una alta similitud de secuencia con el gen o similar
actividad biológica. Las sondas de este tipo pueden ser, por
ejemplo, entre 20 y 2.000 pares de bases. Sin embargo,
preferentemente, las sondas tienen entre 30 y 50 pares de bases. La
sonda también se puede usar para identificar un clon de ADNc
correspondiente a un transcrito completo y a un clon genómico o
clones que contengan el gen de TIMP-4 humano
completo incluyendo las regiones reguladoras y promotor, exones e
intrones. Un ejemplo de un cribado comprende el aislamiento de la
región codificadora del gen TIMP-4 humano usando la
secuencia de ADN conocida para sintetizar una sonda de
oligonucleótido. Los oligonucleótidos marcados que tienen una
secuencia complementaria a la del gen de la presente invención se
usan para cribar una genoteca de ADNc, ADN o ARNm genómico humano
para determinar qué miembros de la genoteca híbrida con la
sonda.
Esta invención también se refiere al uso del gen
de TIMP-4 humano como parte de un ensayo de
diagnóstico para detectar enfermedades o susceptibilidad a
enfermedades relacionadas con la presencia de TIMP-4
humano mutado.
Los individuos que portan mutaciones en el gen
de TIMP-4 humano se pueden detectar al nivel de ADN
mediante una diversidad de técnicas. Se pueden obtener los ácidos
nucleicos para diagnosis a partir de células de un enfermo, tal como
a partir de sangre, orina, saliva, biopsia de tejido y material de
autopsia. El ADN genómico se puede usar directamente para la
detección o se puede amplificar enzimáticamente usando PCR (Saiki
et al., Nature, 324:163-166 (1986))
antes del análisis. Con el mismo propósito también se puede usar ARN
o ADNc. Como ejemplo, los cebadores de PCR complementarios al ácido
nucleico que codifica el TIMP-4 humano se pueden
usar para identificar y analizar las mutaciones de
TIMP-4 humano. Por ejemplo, se pueden detectar
deleciones e inserciones mediante un cambio en el tamaño del
producto amplificado en comparación con el genotipo normal. Las
mutaciones puntuales se pueden identificar mediante la hibridación
del ADN amplificado con ARN de TIMP-4 humano
radiomarcado o si no, las secuencias de ADN antisentido de
TIMP-4 humano radiomarcadas. Las secuencias
perfectamente emparejadas se pueden distinguir de los híbridos mal
emparejados mediante la digestión por ARNasa A o por diferencias en
las temperaturas de fusión.
Los ensayos genéticos basados en las diferencias
de secuencia de ADN se pueden conseguir por la detección de la
alteración en la movilidad electroforética de fragmentos de ADN en
geles con o sin agentes de desnaturalización. Se pueden visualizar
pequeñas deleciones e inserciones de secuencia mediante la
electroforesis en gel de alta resolución. Se pueden distinguir los
fragmentos de ADN de diferentes secuencias sobre geles con gradiente
de formamida con desnaturalización en los cuales las movilidades de
los diferentes fragmentos de ADN se retardan en el gel en
diferentes posiciones de acuerdo con sus temperaturas de fusión
específica o de fusión parcial (véase, por ejemplo, Myers et
al., Science, 230:1.242 (1985)).
También se pueden revelar los cambios de
secuencia en localizaciones específicas mediante ensayos de
protección de nucleasa, tal como protección con ARNasa y S1 o el
método de escisión química (por ejemplo, Cotton et al.,
PNAS, USA, 85:4.397-4.401 (1985)).
Por tanto, se puede conseguir la detección de
una secuencia de ADN específica mediante métodos tales como la
hibridación, protección de ARNasa, escisión química, secuenciación
directa de ADN o el uso de enzimas de restricción, (por ejemplo,
Polimorfismos de la longitud del fragmento de restricción (RFLP, del
Inglés "Restriction Fragment Length Polymorphisms")) y la
transferencia tipo "Southern" del ADN genómico.
Además de la electroforesis en gel más
convencional y la secuenciación de ADN, las mutaciones también se
pueden detectar por análisis in situ.
La presente invención también se refiere a un
ensayo de diagnóstico para detectar los niveles alterados de la
proteína TIMP-4 humana en diversos tejidos ya que
una sobreexpresión de las proteínas en comparación con muestras de
tejido control normales puede detectar la presencia de una
enfermedad o susceptibilidad a una enfermedad regulada por
TIMP-4 humano. Los ensayos usados para detectar
niveles de proteína TIMP-4 humana en una muestra
derivada de un huésped son muy conocidos por los expertos en la
técnica e incluyen radioinmunoensayos, ensayos de unión
competitiva, análisis de transferencia tipo "Western", ensayos
tipo ELISA y ensayos tipo "sándwich". Un ensayo tipo ELISA
(Coligan et al., Current Protocols in Immunology,
1(2), Capítulo 6, (1991)) inicialmente comprende la
preparación de un anticuerpo específico al antígeno de
TIMP-4 humano, preferentemente un anticuerpo
monoclonal. Además se prepara un anticuerpo informativo frente al
anticuerpo monoclonal. Para que el anticuerpo informativo se una a
un reactivo detectable tal como radioactividad, fluorescencia o, en
este ejemplo, una enzima peroxidasa de rábano. Se extrae una muestra
de un huésped y se incuba en un soporte sólido, por ejemplo, un
plato de poliestireno, que une las proteínas en la muestra. A
continuación, se recupera cualquier sitio de unión a proteína libre
sobre el plato incubando con una proteína no específica como BSA. A
continuación, se incuba el anticuerpo monoclonal en el plato un
tiempo durante el cual los anticuerpos monoclonales se unen a
cualquier proteína TIMP-4 humana unida al plato de
poliestireno. Todo anticuerpo monoclonal no unido se lava con
tampón. Ahora, el anticuerpo informativo unido a la peroxidasa de
rábano se coloca en el plato dando como resultado la unión o el
anticuerpo informativo a cualquier anticuerpo monoclonal unido a
TIMP-4 humano. A continuación, se lava el
anticuerpo informativo no unido. A continuación, se añade los
sustratos de peroxidasa al plato y la cantidad de color
desarrollado en un periodo de tiempo dado es una medida de la
cantidad de proteína TIMP-4 humana presente en un
volumen dado de muestra de enfermo si se compara frente a una curva
patrón.
Se puede emplear un ensayo de competición en el
que los anticuerpos específicos a TIMP-4 humano se
unen a un soporte sólido y a TIMP-4 humano marcado y
se pasa una muestra derivada del huésped al soporte sólido y la
cantidad de marca detectada, por ejemplo, mediante cromatografía de
centelleo líquida, se puede correlacionar con una cantidad de
TIMP-4 humano en la muestra.
Un ensayo tipo "sándwich" es similar a un
ensayo tipo ELISA. En un ensayo tipo "sándwich" el
TIMP-4 humano se pasa a un soporte sólido y se une
a anticuerpo unido a un soporte sólido. A continuación, un segundo
anticuerpo se une al TIMP-4 humano. A continuación,
se pasa un tercer anticuerpo que está marcado y es específico al
segundo anticuerpo al soporte sólido y se une al segundo anticuerpo
y, a continuación, se puede cuantificar una cantidad.
Esta invención también proporciona un método de
cribado ("screening") de compuestos para identificar aquellos
que son agonistas o antagonistas al polipéptido de
TIMP-4 humano. Un ejemplo de tal método comprende
obtener tejido de mamífero que comprende una matriz extracelular,
por ejemplo, articulaciones radiocarpales bovinas. Se divide el
cartílago articular en discos más pequeños y se marcan con sulfato
de sodio ^{35}S (10 micro Ci/ml) en DMEM durante un tiempo
suficiente para que el cartílago incorpore el sulfato de sodio
marcado. A continuación, se añade una MMP, por ejemplo,
estromelisina o IL1 o TNF a los discos de cartílago bajo condiciones
apropiadas de modo que se dará normalmente la descomposición del
tejido. A continuación, se añade el TIMP-4 humano y
los compuestos a cribar a la mezcla de reacción durante un tiempo
suficiente para que la MMP descomponga normalmente los discos de
cartílago. A continuación, ser recoge el sobrenadante, el cual es el
medio fuera de los discos de cartílago y se recuenta la
radioactividad mediante un contador de centelleo líquido. A
continuación, se calcula el porcentaje de ^{35}S liberado en los
medios. Esta liberación de ^{35}S-GAG es
representativa del conjunto de proteoglicano en la matriz
extracelular del cartílago y refleja la degradación del
proteoglicano mediante la MMP. A continuación, se compara la
cantidad de ^{35}S-GAG, determinada por
cromatografía de centelleo líquida, con un ensayo control realizado
en ausencia del compuesto a cribar y, a continuación, se determina
la capacidad del compuesto para actuar como agonista o antagonista
de la acción del TIMP-4 humano.
Ejemplos de antagonistas potenciales de
TIMP-4 humano, además de los anteriormente
identificados, incluyen un anticuerpo, o en algunos casos, un
oligonucleótido, el cual se une al polipéptido. Si no, un
antagonista potencial puede ser una forma mutada del
TIMP-4 humano que reconoce los sustratos naturales
pero es inactiva y, de ese modo, previene la acción del
TIMP-4 humano.
Los antagonistas potenciales del
TIMP-4 humano también incluyen construcciones
antisentido preparadas usando tecnología antisentido. La tecnología
antisentido se puede usar para controlar la expresión del gen a
través de la formación de triple hélice o ARN o ADN antisentido,
ambos métodos se basan en la unión de un polinucleótido a ADN o
ARN. Por ejemplo, la porción codificadora 5' de la secuencia de
polinucleótido, la cual codifica los polipéptidos maduros de la
presente invención, se usa para diseñar un oligonucleótido de ARN
antisentido de entre aproximadamente 10 y 40 pares de bases en
longitud. Se diseña un oligonucleótido de ADN para ser
complementario a una región del gen implicado en la transcripción
(triple hélice - véase Lee et al., Nucl. Acids Res.,
6:3.073 (1979); Cooney et al., Science, 241:456
(1988); y Dervan et al., Science, 251:1.360 (1991)),
previniendo así la transcripción y la producción del
TIMP-4 humano. El oligonucleótido de ARN antisentido
hibrida con el ARNm in vivo y bloquea la traducción de la
molécula de ARNm en el TIMP-4 humano (antisentido -
Okano, J. Neurochem., 56:560 (1991); Oligodeoxynucleotides
as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca
Ratón, FL (1988)). Los oligonucleótidos anteriormente descritos
también se pueden repartir a células de modo que se pueda expresar
el ARN o ADN antisentido in vivo para inhibir la producción
de TIMP-4 humano.
Otro antagonista potencial de
TIMP-4 humano es una pequeña molécula que se une a y
ocupa el sitio activo del TIMP-4 humano previniendo
así que el TIMP-4 humano interactúe con las MMPs de
modo que se previene la actividad biológica normal. Ejemplos de
moléculas pequeñas incluyen, pero no se limitan a, péptidos pequeños
o moléculas como péptido, por ejemplo, una molécula unida a
péptido.
Los antagonistas de TIMP-4
humano se pueden emplear para reparar tejido y remodelar, por
ejemplo, cuando se desea la destrucción del tejido cicatriz. En
algunas situaciones, se puede desear la renovación o remodelación
aumentada del tejido conectivo, por ejemplo, en la resorción del
tejido cicatriz; en la involución uterina post parto; en la
remodelación de depósitos fibróticos en el pulmón, hígado o
articulaciones. Para controlar apropiadamente la renovación de las
proteínas de la matriz extracelular en estas situaciones se
requerirá un equilibrio entre las MMPs y el TIMP-4
humano para controlar apropiadamente la degradación.
Se pueden emplear los polipéptidos y las
agonistas o antagonistas que son también polipéptidos de acuerdo con
la presente invención mediante la expresión de tales polipéptidos
in vivo, lo cual con frecuencia se denomina "terapia
genética".
Por tanto, por ejemplo, las células de un
enfermo se pueden modificar por ingeniería genética con un
polinucleótido (ADN o ARN) ex vivo, con las células
modificadas por ingeniería genética a continuación se proporcionan
a un enfermo a tratar con el polipéptido. Tales métodos son muy
conocidos en la técnica. Por ejemplo, las células se pueden
modificar por ingeniería genética mediante procedimientos conocidos
en la técnica mediante el uso de una partícula retrovírica que
contiene ARN codificador de un polipéptido de la presente
invención.
Igualmente, las células se pueden modificar por
ingeniería genética in vivo para la expresión de un
polipéptido in vivo mediante, por ejemplo, procedimientos
conocidos en la técnica. Tal como se conoce en la técnica, se puede
administrar a un enfermo una célula productora para la producción de
una partícula retrovírica que contiene ARN codificador del
polipéptido de la presente invención para modificar por ingeniería
genética células in vivo y para la expresión del polipéptido
in vivo. Estos y otros métodos para la administración de un
polipéptido de la presente invención mediante tal método deberían
estar claros para los expertos en la técnica a partir de las
enseñanzas de la presente invención. Por ejemplo, el vehiculizante
de expresión para la modificación por ingeniería genética de
células puede ser a parte de un retrovirus, por ejemplo, un
adenovirus que se puede usar para modificar por ingeniería genética
las células in vivo después de la combinación con un
vehiculizante de reparto adecuado.
Los polipéptidos y agonistas o antagonistas de
la presente invención se pueden emplear en combinación con un
vehículo farmacéutico adecuado. Tales composiciones comprenden una
cantidad terapéuticamente eficaz del polipéptido y un vehículo o
excipiente farmacéuticamente aceptable. Tal vehículo incluye, pero
no se limita a: disolución salina, disolución salina tamponada,
dextrosa, agua, glicerol, etanol y combinaciones de los mismos. La
formulación debería adecuarse al modo de administración.
La invención también proporciona una paquete o
kit farmacéutico que comprende uno o más recipientes llenos con uno
o más de los ingredientes de las composiciones farmacéuticas de la
invención. Asociados a tal(es) recipiente(s)
puede haber un aviso en la forma prescrita por una agencia gubernamental reguladora de la producción, el uso y la venta de los compuestos farmacéuticos o productos biológicos, dicho aviso refleja la aprobación por la agencia de la producción, uso o venta para la administración humana. Además, las composiciones farmacéuticas se pueden emplear junto con otros compuestos terapéuticos.
puede haber un aviso en la forma prescrita por una agencia gubernamental reguladora de la producción, el uso y la venta de los compuestos farmacéuticos o productos biológicos, dicho aviso refleja la aprobación por la agencia de la producción, uso o venta para la administración humana. Además, las composiciones farmacéuticas se pueden emplear junto con otros compuestos terapéuticos.
Las composiciones farmacéuticas se pueden
administrar de una manera conveniente tal como por vías tópicas,
intravenosas, intraarticulares, intratumorales, intraperitoneales,
intramusculares, subcutáneas, intranasales o intradérmicas. Las
composiciones farmacéuticas se administran en una cantidad que es
eficaz para tratar y/o la profilaxis de la indicación específica.
En general, las composiciones farmacéuticas se administran en una
cantidad de al menos aproximadamente 10 \mug/kg de peso corporal y
en la mayoría de los casos se administrarán en una cantidad no en
exceso de aproximadamente 8 mg/kg de peso corporal por día y
preferentemente la dosificación es entre aproximadamente 10
\mug/kg y aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal diariamente,
teniendo en cuenta las vías de administración, los síntomas,
etc.
Las secuencias de la presente invención también
son valiosas para la identificación cromosómica. La secuencia se
guía específicamente y puede hibridar con una localización
particular en un cromosoma humano individual. Sin embargo, hay una
necesidad actual de identificar los sitios particulares en el
cromosoma. Pocos reactivos de señalización cromosómica basados en
los datos de secuencias actuales (polimorfismo de repetición) están
actualmente disponibles para señalizar la localización cromosómica.
El mapeo de ADNs en cromosomas de acuerdo con la presente invención
es una primera etapa importante en correlación con aquellas
secuencias con genes asociados con la enfermedad.
Brevemente, se puede hacer el mapeo de las
secuencias en cromosomas preparando cebadores de PCR
(preferentemente 15-25 pb) a partir del ADNc. El
análisis informático de la región no traducida 3' se usa para
seleccionar rápidamente los cebadores que no abarcan más de un exón
en el ADN genómico para evitar complicar el proceso de
amplificación. A continuación, se usan estos cebadores para la
selección por PCR de híbridos celulares somáticos que contienen
cromosomas humanos individuales. Únicamente aquellos híbridos que
contienen el gen humano correspondiente al cebador producirán un
fragmento amplificado.
El mapeo por PCR de los híbridos celulares
somáticos es un procedimiento rápido para asignar un ADN particular
a un cromosoma particular. Usando la presente invención con los
mismos cebadores de oligonucleótido, se puede conseguir la
sublocalización con paneles de fragmentos de cromosomas específicos
o conjuntos de grandes clones genómicos de una manera análoga.
Otras estrategias de mapeo que se pueden usar igualmente para hacer
el mapeo en su cromosoma incluyen la hibridación in situ, el
precribado con cromosomas ordenados por flujo marcados y la
preselección por hibridación con genotecas de ADNc específico de
cromosoma de construcción.
La hibridación in situ por fluorescencia
(FISH, del Inglés "Fluorescence In Situ Hybridization")
de clones de ADNc con una proliferación cromosómica de metafase se
puede usar para proporcionar una localización cromosómica precisa
en una etapa. Esta técnica se puede usar con ADNc tan corto como 500
ó 600 bases; sin embargo, los clones mayores de 2.000 pb tienen una
mayor similitud de unión a una localización cromosómica única con
suficiente intensidad de señal para la detección simple. La FISH
requiere el uso de los clones a partir de los cuales se derivó EST
(del Inglés "Expressed Sequence Tag"), y cuanto mayor mejor.
Por ejemplo, 2.000 pb es bueno, 4.000 es mejor y más de 4.000
probablemente no es necesario para conseguir buenos resultados en
un porcentaje razonable del tiempo. Para una revisión de esta
técnica, véase Verma et al., Human Chromosomes: a Manual
of Basic Techniques, Pergamon Press, Nueva York (1988).
Una vez que se ha mapeado una secuencia en una
localización cromosómica precisa, la posición física de la
secuencia en el cromosoma puede estar correlacionado con los datos
del mapa genético. Tales datos se encuentran, por ejemplo, en V.
McKusick, Mendelian Inheritance in Man (disponible en línea
de la "Johns Hopkins University Welch Medical Library"). A
continuación se identifica la relación entre los genes y las
enfermedades que se han mapeado en la misma región cromosómica a
través de análisis de unión. (herencia conjunta de genes físicamente
adyacentes).
A continuación, es necesario determinar las
diferencias en el ADNc o la secuencia genómica entre los individuos
afectados y no afectados. Si se observa una mutación en algunos o en
todos de los individuos afectados pero no en ninguno de los
individuos normales, entonces la mutación parece ser el agente
causativo de la enfermedad.
Con la resolución actual de las técnicas de
mapeo físico y mapeo genético, un ADNc precisamente localizado en
una región cromosómica asociada con la enfermedad podría ser uno de
entre 50 y 500 genes causativos potenciales. (Esto asume la
resolución de mapeo de 1 megabase y un gen por 20 kb).
Se pueden usar los polipéptidos, sus fragmentos
u otros derivados, o análogos de los mismos, o células que los
expresan como inmunogen para producir anticuerpos para los mismos.
Estos anticuerpos pueden ser, por ejemplo, anticuerpos policlonales
o monoclonales. La presente invención también incluye anticuerpos
quiméricos, de cadena sencilla y humanizados, así como fragmentos
Fab, o el producto de una genoteca de expresión de Fab. Se pueden
usar diversos procedimientos conocidos en la técnica para la
producción de tales anticuerpos y fragmentos.
Los anticuerpos generados frente a los
polipéptidos correspondientes a una secuencia de la presente
invención se pueden obtener mediante inyección directa de los
polipéptidos en un animal o mediante la administración de los
polipéptidos a un animal, preferentemente no humano. A continuación,
el anticuerpo así obtenido se unirá a los propios polipéptidos. De
esta manera, se puede usar incluso una secuencia que codifica
únicamente un fragmento de los polipéptidos para generar
anticuerpos que se unen a los polipéptidos nativos completos. A
continuación, tales anticuerpos se pueden usar para aislar el
polipéptido del tejido que expresa ese polipéptido.
Para la preparación de los anticuerpos
monoclonales, se puede usar cualquier técnica que proporcione
anticuerpos producidos por cultivos de línea celular continuos. Los
ejemplos incluyen: la técnica de hibridoma (Kohler y Milstein,
1975, Nature, 256:495-497), la técnica de
trioma, la técnica de hibridoma de célula B humana (Kozbor et
al., 1983, Immunology Today 4:72), y la técnica de
hibridoma EBV para producir anticuerpos monoclonales humanos (Cole,
et al., 1985, en Monoclonal Antibodies and Cancer
Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96).
Las técnicas descritas para la producción de
anticuerpos de cadena sencilla (documento de Patente U.S. 4.946.778)
se pueden adaptar para producir anticuerpos de cadena sencilla para
los productos polipeptídicos inmunogénicos de esta invención.
Además, se pueden usar ratones transgénicos para expresar
anticuerpos humanizados para los productos polipeptídicos
inmunogénicos de esta invención.
La presente invención se describirá más en
referencia a los siguiente Ejemplos; sin embargo, se entiende que la
presente invención no se limita a tales Ejemplos. Todas las partes o
cantidades, al menos que se especifique lo contrario, están en
peso.
Para facilitar el entendimiento de los
siguientes Ejemplos se describirán ciertos métodos y/o términos que
se dan con frecuencia.
Los "plásmidos" se designan por una p
minúscula precedida y/o seguida de letras mayúsculas y/o números.
Los plásmidos iniciales de la presente memoria o bien están
comercialmente disponibles, disponibles públicamente sobre unas
bases no restringidas o se pueden construir a partir de plásmidos
disponibles de acuerdo con los procedimientos publicados. Además,
los plásmidos equivalentes a los descritos son conocidos en la
técnica y serán claros para aquellos con un conocimiento normal en
la técnica.
"Digestión" de ADN se refiere a la escisión
catalítica del ADN con una enzima de restricción que actúa
únicamente en ciertas secuencias en el ADN. La diversas enzimas de
restricción usadas en la presente memoria están comercialmente
disponibles y sus condiciones de reacción, cofactores y otros
requerimientos se usaron puesto que serían conocidas para aquellos
con un conocimiento normal en la técnica. Con propósitos analíticos,
generalmente se usa 1 \mug de plásmido o fragmento de ADN con
aproximadamente 2 unidades de enzima en aproximadamente 20 \mul de
disolución tampón. Con el propósito de aislar fragmentos de ADN
para la construcción de plásmido, generalmente se digieren entre 5
y 50 \mug de ADN con entre 20 y 250 unidades de enzima en un
volumen mayor. Los tampones apropiados y las cantidades de sustrato
para enzimas de restricción particulares están especificadas por el
fabricante. Normalmente se usan tiempos de incubación de
aproximadamente 1 hora a 37ºC, pero pueden variar de acuerdo con
las instrucciones del distribuidor. Después de la digestión la
reacción se somete a electroforesis directamente sobre un gel de
poliacrilamida para aislar el fragmento deseado.
La separación por tamaño de los fragmentos
escindidos se realiza usando gel de poliacrilamida al 8 por ciento
descrito por Goeddel, D. et al., Nucleic Acids Res.,
8:4.057 (1980).
"Oligonucleótidos" se refiere a o bien un
polideoxinucleótido de cadena sencilla o a dos cadenas de
polideoxinucleótido complementarias que se pueden sintetizar
químicamente. Tales oligonucleótidos sintéticos no tienen fosfato
5' y, por tanto, no se ligará a otro oligonucleótido sin añadir un
fosfato con un ATP en presencia de una quinasa. Un oligonucleótido
sintético se ligará a un fragmento que no se haya
desfosforilado.
"Ligación" se refiere al proceso de
formación de enlaces fosfodiester entre dos fragmentos de ácido
nucleico de doble cadena (Maniatis, T., et al., Id., p.
146). Al menos que se proporcione lo contrario, la ligación se
puede llevar a cabo usando tampones y condiciones conocidos con 10
unidades de ADN ligasa de T4 ("ligasa") por 0,5 \mug de
cantidades aproximadamente equimolares de los fragmentos de ADN a
ligar.
Al menos que se indique lo contrario, la
transformación se realizó tal como se describe en el método de
Graham, F. y Van der Eb, A., Virology,
52:456-457 (1973).
La secuencia de ADN codificadora de
TIMP-4 humano, ATCC Nº 75946, inicialmente se
amplifica usando cebadores de oligonucleótido de PCR
correspondientes al 5' y las secuencias de la proteína
TIMP-4 humana procesada (menos la secuencia
peptídica señal) y las secuencias 3' vector para el gen
TIMP-4. Se añadieron nucleótidos adicionales
correspondientes al TIMP-4 humano a las secuencias
5' y 3' respectivamente. El cebador de oligonucleótido 5' tiene la
secuencia 5' GCCAGAGGATCCTGCAGCTGCGCCCCGGCGCAC 3' que contiene un
sitio de enzima de restricción BamH1 seguido de 21 nucleótidos de
la secuencia codificadora de TIMP-4 humano
comenzando desde el supuesto aminoácido terminal del codón de la
proteína procesada. La secuencia 3' 5'
CGGCTTCTAGAACTAGGGCTGAAC
GATGTCAAC 3' contiene un sitio XbaI y está seguido por 18 nucleótidos del TIMP-4 humano. Los sitios de enzima de restricción corresponden a los sitios de enzima de restricción en el vector de expresión bacteriano pQE-9 (Qiagen, Inc. 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311). pQE-9 codifica la resistencia antibiótica (Amp^{r}), un origen de replicación bacteriano (ori), un operador promotor regulable por IPTG (P/O), un sitio de unión a ribosoma (RBS, del Inglés "Ribosome Binding Site"), una etiqueta de 6-His y sitios de enzima de restricción. A continuación, se digirió el pQE-9 con BamH1 y XbaI. Las secuencias amplificadas se ligaron en pQE-9 y se insertaron en el marco con la secuencia codificadora para la etiqueta de histidina y la RBS. A continuación, se usó la mezcla de ligación para transformar la cepa de E. coli m15/pREP4 disponible de Qiagen por el procedimiento descrito en Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989). m15/pREP4 contiene copias múltiples del plásmido pREP4, el cual expresa el represor lacI y también confiere resistencia a kanamicina (Kan^{r}). Los transformantes se identifican por su capacidad de desarrollarse en placas con LB y se seleccionaron las colonias resistentes a ampicilina/kanamicina. Se aisló el ADN plásmido y se confirmó mediante análisis de restricción. Los clones que contenían las construcciones deseadas se desarrollaron durante toda la noche (O/N) en cultivo líquido en medios LB complementados tanto con Amp (100 \mug/ml) como con Kan (25 \mug/ml). El cultivo (O/N) se usa para inocular un gran cultivo en una relación entre 1:100 y 1:250. Las células se desarrollaron a una densidad óptica 600 (O.D.^{600}) de entre 0,4 y 0,6. A continuación, se añadió IPTG ("Isopropil-B-D-tiogalacto piranosida") hasta una concentración final de 1 mM. IPTG induce al inactivar el represor lacI, el aclarado del P/O que conduce a la expresión genética incrementada. Las células se desarrollaron unas 3 a 4 horas extras. A continuación, se recogieron las células mediante centrifugación. Se solubilizó el precipitado celular en el agente caotrópico guanidina HCl 6 molar. Después de la aclaración, se purificó el TIMP-4 humano solubilizado a partir de esta disolución mediante cromatografía en una columna de Níquel-Quelato bajo condiciones que permitían la unión ajustada por proteínas que contienen la etiqueta de 6-His (Hochuli, E. et al., J. Chromatography, 411:177-184 (1984). Se eluyó el TIMP-4 humano (puro al 90%) de la columna en guanidina HCl 6 molar pH 5,0 y con el propósito de la renaturalización se ajustó a guanidina HCl 3 molar, fosfato de sodio 100 mM, glutationa 10 mmolar (reducida) y glutationa 2 mmolar (oxidada). Después de la incubación en esta disolución durante 12 horas la proteína se sometió a diálisis con fosfato de sodio 10 mmolar.
GATGTCAAC 3' contiene un sitio XbaI y está seguido por 18 nucleótidos del TIMP-4 humano. Los sitios de enzima de restricción corresponden a los sitios de enzima de restricción en el vector de expresión bacteriano pQE-9 (Qiagen, Inc. 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311). pQE-9 codifica la resistencia antibiótica (Amp^{r}), un origen de replicación bacteriano (ori), un operador promotor regulable por IPTG (P/O), un sitio de unión a ribosoma (RBS, del Inglés "Ribosome Binding Site"), una etiqueta de 6-His y sitios de enzima de restricción. A continuación, se digirió el pQE-9 con BamH1 y XbaI. Las secuencias amplificadas se ligaron en pQE-9 y se insertaron en el marco con la secuencia codificadora para la etiqueta de histidina y la RBS. A continuación, se usó la mezcla de ligación para transformar la cepa de E. coli m15/pREP4 disponible de Qiagen por el procedimiento descrito en Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989). m15/pREP4 contiene copias múltiples del plásmido pREP4, el cual expresa el represor lacI y también confiere resistencia a kanamicina (Kan^{r}). Los transformantes se identifican por su capacidad de desarrollarse en placas con LB y se seleccionaron las colonias resistentes a ampicilina/kanamicina. Se aisló el ADN plásmido y se confirmó mediante análisis de restricción. Los clones que contenían las construcciones deseadas se desarrollaron durante toda la noche (O/N) en cultivo líquido en medios LB complementados tanto con Amp (100 \mug/ml) como con Kan (25 \mug/ml). El cultivo (O/N) se usa para inocular un gran cultivo en una relación entre 1:100 y 1:250. Las células se desarrollaron a una densidad óptica 600 (O.D.^{600}) de entre 0,4 y 0,6. A continuación, se añadió IPTG ("Isopropil-B-D-tiogalacto piranosida") hasta una concentración final de 1 mM. IPTG induce al inactivar el represor lacI, el aclarado del P/O que conduce a la expresión genética incrementada. Las células se desarrollaron unas 3 a 4 horas extras. A continuación, se recogieron las células mediante centrifugación. Se solubilizó el precipitado celular en el agente caotrópico guanidina HCl 6 molar. Después de la aclaración, se purificó el TIMP-4 humano solubilizado a partir de esta disolución mediante cromatografía en una columna de Níquel-Quelato bajo condiciones que permitían la unión ajustada por proteínas que contienen la etiqueta de 6-His (Hochuli, E. et al., J. Chromatography, 411:177-184 (1984). Se eluyó el TIMP-4 humano (puro al 90%) de la columna en guanidina HCl 6 molar pH 5,0 y con el propósito de la renaturalización se ajustó a guanidina HCl 3 molar, fosfato de sodio 100 mM, glutationa 10 mmolar (reducida) y glutationa 2 mmolar (oxidada). Después de la incubación en esta disolución durante 12 horas la proteína se sometió a diálisis con fosfato de sodio 10 mmolar.
La expresión de TIMP-4 HA humano
está derivada de un vector pcDNAI/Amp (Invitrogen) que contiene: 1)
origen de replicación de SV40, 2) gen de resistencia a ampicilina,
3) origen de replicación de E. coli, 4) promotor de CMV
seguido por una región "polylinker", un intrón de SV40 y un
sitio de poliadenilación. Un fragmento de ADN codificador del
precursor entero de TIMP-4 humano y una etiqueta de
HA fusionadas en el marco a su extremo 3' se clonó en la región
"polylinker" del vector, por lo tanto, la expresión proteica
recombinante está dirigida por el promotor de CMV. La etiqueta de
HA corresponde a un epítopo derivado de la proteína hemaglutinina
de la gripe tal como se ha descrito previamente (I. Wilson, H.
Niman, R. Heighten, A. Cherenson, M. Connolly y R. Lerner, 1984,
Cell 37:767). La fusión de etiqueta de HA a la proteína diana
permite la fácil detección de la proteína recombinante con un
anticuerpo que reconoce el epítopo HA.
La estrategia de construcción de plásmido se
describe a continuación:
Se construyó la secuencia de ADN ATCC Nº 75946,
que codifica el TIMP-4 humano, mediante PCR usando
dos cebadores: el cebador 5' 5'
GCCAGAGGATCCGCCACCATGCCTGGGAGCCCTCGGCCC 3' contiene un sitio BamHI
seguido de 21 nucleótidos de la secuencia codificadora de
TIMP-4 humano comenzando desde el codón de
iniciación; la secuencia 3' 5'
CGGTTCTAGAATCAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGGGCTGAAC
GATG 3' contiene secuencias complementarias a un sitio XbaI, codón de parada de traducción, etiqueta de HA y los últimos 18 nucleótidos de la secuencia codificadora de TIMP-4 humano (sin incluir el codón de parada). Por lo tanto, el producto de PCR contiene un sitio BamHI, la secuencia codificadora de TIMP-4 humano seguida por etiqueta de HA fusionada en el marco, un codón de parada de la terminación de traducción próximo a la etiqueta de HA y un sitio XbaI. El fragmento de ADN amplificado por PCR y el vector, pcDNAI/Amp, se digirieron con enzimas de restricción BamHI y XbaI y se ligaron. La mezcla de ligación se transformó en la cepa SURE de E. coli (disponible por Stratagene Cloning Systems, 11099 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037) el cultivo transformado se cultivó sobre placas con medios de ampicilina y se seleccionaron las colonias resistentes. Se aisló el ADN plásmido de los transformantes y se examinó mediante análisis de restricción para la presencia del fragmento correcto. Para la expresión del TIMP-4 humano recombinante, se sometieron a transfección células COS con el vector de expresión mediante el método de DEAE-DEXTRANO (J. Sambrook, E. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)). Se detectó la expresión de la proteína TIMP-4 humano HA mediante el método de radiomarcaje e inmunoprecipitación (E. Harlow, D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1988)). Se marcaron las células durante 8 horas con ^{35}S-cisteina dos días después de la transfección. A continuación, se recogieron los medios de cultivo y las células se sometieron a lisis con detergente (tampón RIPA (NaCl 150 mM, NP-40 al 1%, SDS al 0,1%, DOC al 0,5%, Tris 50 mM, pH 7,5)(Wilson, I. et al., Id. 37:767 (1984)). Se precipitaron tanto el lisado celular como los medios de cultivo con un anticuerpo monoclonal específico a HA. Se analizaron las proteínas precipitadas sobre geles de SDS-PAGE.
GATG 3' contiene secuencias complementarias a un sitio XbaI, codón de parada de traducción, etiqueta de HA y los últimos 18 nucleótidos de la secuencia codificadora de TIMP-4 humano (sin incluir el codón de parada). Por lo tanto, el producto de PCR contiene un sitio BamHI, la secuencia codificadora de TIMP-4 humano seguida por etiqueta de HA fusionada en el marco, un codón de parada de la terminación de traducción próximo a la etiqueta de HA y un sitio XbaI. El fragmento de ADN amplificado por PCR y el vector, pcDNAI/Amp, se digirieron con enzimas de restricción BamHI y XbaI y se ligaron. La mezcla de ligación se transformó en la cepa SURE de E. coli (disponible por Stratagene Cloning Systems, 11099 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037) el cultivo transformado se cultivó sobre placas con medios de ampicilina y se seleccionaron las colonias resistentes. Se aisló el ADN plásmido de los transformantes y se examinó mediante análisis de restricción para la presencia del fragmento correcto. Para la expresión del TIMP-4 humano recombinante, se sometieron a transfección células COS con el vector de expresión mediante el método de DEAE-DEXTRANO (J. Sambrook, E. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)). Se detectó la expresión de la proteína TIMP-4 humano HA mediante el método de radiomarcaje e inmunoprecipitación (E. Harlow, D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1988)). Se marcaron las células durante 8 horas con ^{35}S-cisteina dos días después de la transfección. A continuación, se recogieron los medios de cultivo y las células se sometieron a lisis con detergente (tampón RIPA (NaCl 150 mM, NP-40 al 1%, SDS al 0,1%, DOC al 0,5%, Tris 50 mM, pH 7,5)(Wilson, I. et al., Id. 37:767 (1984)). Se precipitaron tanto el lisado celular como los medios de cultivo con un anticuerpo monoclonal específico a HA. Se analizaron las proteínas precipitadas sobre geles de SDS-PAGE.
Se amplificó la secuencia de ADN codificadora de
la proteína TIMP-4 completa, ATCC Nº 75946, usando
cebadores de oligonucleótido de PCR correspondientes a las
secuencias 5' y 3' del gen.
El cebador 5' tiene la secuencia 5'
GCCAGAGGATCCATGCCTGGGAGCCCTCGGCCC 3' y contiene un sitio de
enzima de restricción BamHI (en negrita) justo detrás de los
primeros 21 nucleótidos del gen de TIMP-4 (el codón
de iniciación para la traducción "ATG" está subrayado).
El cebador 3' tiene la secuencia 5'
CGGCTTCTAGAACTAGGGCTGAACGATGTCAAC 3' y contiene el sitio de escisión
para la endonucleasa de restricción XbaI y 18 nucleótidos
complementarios a la secuencia no traducida 3' del gen
TIMP-4. Se aislaron las secuencias amplificadas a
partir de un gel de agarosa al 1% usando un kit comercialmente
disponible ("Geneclean", BIO 101 Inc., La Jolla, Ca.). A
continuación, se digirió el fragmento con las endonucleasas BamHI y
XbaI y, a continuación, se purificó de nuevo sobre un gel de agarosa
al 1%. Este fragmento se designó F2.
Se usó el vector pA2 (modificación del vector
pVL941, tratado más adelante) para la expresión de la proteína
TIMP-4 usando el sistema de expresión de baculovirus
(para revisión véase: Summers, M.D. y Smith, G.E. 1987, A manual
of methods for baculovirus vectors and insect cell culture
procedures, Texas Agricultural Experimental Station Bulletin Nº
1.555). Este vector de expresión contiene el promotor de polihedrina
fuerte del virus de polihedrosis nuclear de Autographa
californica (AcMNPV, del Inglés "Autographa californica
nuclear Polyhedrosis Virus") seguido de los sitios de
reconocimiento para las endonucleasas de restricción BamHI y XbaI.
El sitio de poliadenilación del virus de simio (SV, del Inglés
"Simian Virus") 40 se usa para la poliadenilación eficiente.
Para una fácil selección de los virus recombinantes se inserta el
gen beta-galactosidasa de E. coli en la
misma orientación que el promotor de polihedrina seguido de la señal
de poliadenilación del gen de polihedrina. Las secuencias de
polihedrina están flanqueadas a ambos lados por secuencias víricas
para la recombinación homóloga mediada por célula del ADN vírico de
tipo natural sometido a transfección conjunta. Se podrían usar
muchos otros vectores de baculovirus en lugar de pRG1 tal como
pAc373, pVL941 y pAcIM1 (Luckow, V.A. y Summers, M.D.,
Virology, 170:31-39).
Se digirió el plásmido con las enzimas de
restricción BamHI y XbaI. A continuación, se aisló el ADN a partir
de un gel de agarosa al 1% usando el kit comercialmente disponible
("Geneclean" BIO 101 Inc., La Jolla, Ca.). Este ADN vector se
designa V2.
El fragmento F2 y el plásmido V2 se ligaron con
la ADN ligasa T4. A continuación, las células HB101 de E.
coli se transformaron y se identificaron las bacterias que
contenían el plásmido (pBacTIMP-4) con el gen
TIMP-4 usando las enzimas BamHI y XbaI. Se confirmó
la secuencia del fragmento clonado mediante secuenciación de
ADN.
Se sometió a transfección conjunta 5 \mug del
plásmido pBacTIMP-4 con 1,0 \mug de un baculovirus
linearizado comercialmente disponible ("ADN de baculovirus
BaculoGold^{TM}", Pharmingen, San Diego, CA.) usando el método
de lipofección (Felgner et al., Proc. Natl. Acad.
Sci., USA, 84:7.413-7.417 (1987)).
Se mezclaron 1 \mug de ADN vírico
BaculoGold^{TM} y 5 \mug del plásmido pBacTIMP-4
en un pocillo estéril de una placa microtiter que contenía 50 \mul
de medio de Grace libre de suero (Life Technologies Inc.,
Gaithersburg, MD). Más tarde se añadieron 10 \mul de Lipofectina
más 90 \mul de medio de Grace, se mezclaron y se incubaron durante
15 minutos a temperatura ambiente. A continuación, se añadió gota a
gota la mezcla de transfección a las células de insecto Sf9 (ATCC
CRL 1711) sembradas en una placa de cultivo de tejido de 35 mm con 1
ml de medio de Grace sin suero. La placa se inclinó atrás y adelante
para mezclar la disolución recién añadida. A continuación, se
incubó la placa durante 5 horas a 27ºC. Después de 5 horas se
extrajo la disolución de transfección de la placa y se añadió 1 ml
de medio de insecto de Grace complementado con suero de ternera
fetal al 10%. La placa se volvió a poner en un incubador y se
continuó el cultivo a 27ºC durante cuatro días.
Después de cuatro días se recogió el
sobrenadante y se realizó un ensayo en placa similar al descrito por
Summers y Smith (supra). Como modificación se usó un gel de
agarosa con "Blue Gal" (Life Technologies Inc., Gaithersburg)
lo cual permite un fácil aislamiento de las placas teñidas de azul.
(También se puede encontrar una descripción detallada de un
"ensayo en placa" en la guía del usuario para el cultivo
celular de insecto y la baculovirología distribuida por Life
Technologies Inc., Gaithersburg, páginas 9-10).
Cuatro días después de la dilución en serie, se
añadieron los virus a las células y se cogieron con la punta de una
pipeta Eppendorf las placas teñidas de azul. A continuación se
resuspendió el agar que contenía los virus recombinantes en un tubo
Eppendorf que contenía 200 \mul de medio de Grace. Se extrajo el
agar mediante una breve centrifugación y se usó el sobrenadante que
contenía los baculovirus recombinantes para infectar células Sf9
sembradas en platos de 35 mm. Cuatro días después se recogieron los
sobrenadantes de estos platos de cultivo y, a continuación, se
almacenaron a 4ºC.
Las células Sf9 se desarrollaron en medio de
Grace complementado con FBS inactivado por calor al 10%. Las células
se infectaron con el baculovirus recombinante
V-TIMP-4 a una multiplicidad de
infección (MDI) de 2. Seis horas después se extrajo el medio y se
reemplazó con medio SF900 II menos metionina y cisteína (Life
Technologies Inc., Gaithersburg). 42 horas después se añadieron 5
\muCi de ^{35}S-metionina y 5 \muCi de
^{35}S cisteína (Amersham). Las células se incubaron más durante
16 horas antes de que se recogieran mediante centrifugación y se
visualizaron las proteínas marcadas mediante
SDS-PAGE y autorradiografía.
Se desnaturalizaron 20 \mug del ARN total de
cada uno de los anteriores tejidos y se corrieron sobre un gel de
agarosa con formaldehído al 1,2% y se transfirieron por capilaridad
sobre un filtro de nailon durante toda la noche. El ARN se
inmovilizó sobre el filtro por entrecruzamiento por UV. Se preparó
una sonda cebador al azar a partir del inserto
EcoRI-Xhol de la secuencia parcial de ácido nucleico
de TIMP-4 y se usó para sondar la transferencia
mediante hibridación durante toda la noche en tampón Church con 100
\mug/ml de ADN de esperma de arenque desnaturalizado como agente
bloqueador. El lavado se realizó de manera secuencial con 2 x
SSC/SDS al 0,1% y 0,2 x SSC/SDS al 0,1% a 65 grados Celsius. Las
señales de tamaño fueron ladder de ARN de BRL y bandas de ARN
ribosómico 18S y 28S. Figura 3.
(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: GREENE, ET AL.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: TIMP-4 humano
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIA2: 2
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN PARA LA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: CARELLA, BYRNE, BAIN, GILFILLAN, CECCHI, STEWART Y
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipOLSTEIN
\hfill
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 6 BECKER FARM ROAD
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: ROSELAND
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: NEW JERSEY
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EE.UU.
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 07068
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA DE LECTURA INFORMÁTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: DISQUETE DE 3,5 PULGADAS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PS/2
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA: WORD PERFECT 5.1
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: presentado con la presente memoria
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: FERRARO, GREGORY D.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 36.134
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- REFERENCIA/NÚM. DE EXPEDIENTE: 325800-278
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: 201-994-1700
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: 201-994-1744
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 675 PARES DE BASES
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: SENCILLA
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 224 AMINOÁCIDOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: AMINOÁCIDO
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: PROTEÍNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2
Claims (27)
1. Un polinucleótido seleccionado entre el
grupo que consiste en:
- (a)
- polinucleótidos que codifican al menos la forma madura del polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos deducida tal como la mostrada en la Figura 1;
- (b)
- polinucleótidos que tienen la secuencia codificadora tal como la mostrada en la Figura 1 que codifica al menos la forma madura del polipéptido;
- (c)
- polinucleótidos que codifican el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de al menos la forma madura del polipéptido codificado por el ADNc contenido en ATCC 75946;
- (d)
- polinucleótidos que tienen la secuencia codificadora del ADNc contenido en ATCC 75946 codificador de al menos la forma madura del polipéptido;
- (e)
- polinucleótidos que codifican un fragmento de un polipéptido codificado por un polinucleótido de uno cualquiera del punto (a) al (d), en los que el fragmento inhibe la actividad de la metaloproteinasa;
- (f)
- polinucleótidos cuya cadena complementaria híbrida bajo condiciones estrictas con un polinucleótido tal como el definido en uno cualquiera del punto (a) al (d) y los cuales codifican un polipéptido que inhibe la actividad de la metaloproteinasa; y
- (g)
- polinucleótidos idénticos al menos al 95% a un polinucleótido como el definido en uno cualquiera del punto (a) al (d) y los cuales codifican un polipéptido que inhibe la actividad de la metaloproteinasa;
o la cadena complementaria de tal
polinucleótido.
2. El polinucleótido de la reivindicación 1,
el cual es ADN
3. El ADN de la reivindicación 2, el cual es
ADN genómico.
4. El polinucleótido de la reivindicación 1,
el cual es ARN.
5. Un vector que contiene el polinucleótido de
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
6. El vector de la reivindicación 5, en el
cual el polinucleótido se une operativamente a las secuencias de
control de expresión permitiendo la expresión en células huésped
procariotas o eucariotas.
7. Una célula huésped modificada por
ingeniería genética con el vector de la reivindicación 5 ó 6.
8. Un proceso para producir un polipéptido
codificado por el polinucleótido de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, comprendiendo el cultivo de la célula
huésped de la reivindicación 7 y la recuperación del polipéptido
codificado por dicho polinucleótido a partir del cultivo.
9. Un proceso para producir células capaces de
expresar un polipéptido codificado por el polinucleótido de una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, comprendiendo la
modificación por ingeniería genética de células in vitro con
el vector de la reivindicación 5 ó 6.
10. Un polipéptido que tiene la secuencia de
aminoácidos codificada por un polinucleótido de una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 4 u obtenible mediante el proceso de la
reivindicación 8.
11. El polipéptido de la reivindicación 10, en
el que dicho polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que
consiste en:
- (a)
- la secuencia de aminoácidos del polipéptido mostrado en la Figura 1;
- (b)
- la secuencia de aminoácidos de la forma madura del polipéptido mostrado en la Figura 1;
- (c)
- la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado por el ADNc contenido en ATCC 75946;
- (d)
- la secuencia de aminoácidos del polipéptido maduro codificado por el ADNc contenido en ATCC 75946;
- (e)
- la secuencia de aminoácidos de un fragmento del polipéptido de uno cualquiera del punto (a) al (d), en la que el fragmento inhibe la actividad de la metaloproteinasa; y
\newpage
- (f)
- la secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado por un polinucleótido idéntico al menos al 95% al polinucleótido mostrado en la Figura 1, en la que el polipéptido inhibe la actividad de la metaloproteinasa.
12. Un anticuerpo específicamente unido al
polipéptido de la reivindicación 11(a) a (e).
13. Un antagonista del polipéptido de la
reivindicación 11, en el que el antagonista es el anticuerpo de la
reivindicación 12 o una construcción antisentido que híbrida
específicamente con un polinucleótido de una cualquiera de las
reivindicaciones 1(a) a 1(f) o de las reivindicaciones
2 a 4 hasta donde se vuelven a remitir a las reivindicaciones
1(a) a 1(f).
14. Un proceso para identificar antagonistas y
agonistas de TIMP-4 que comprende:
- (a)
- combinar células, el polipéptido de la reivindicación 10, una MMP, un compuesto a cribar y una mezcla de reacción que contenga un sustrato capaz de degradación por la MMP, en el que se marca dicho sustrato;
- (b)
- medir la concentración de la marca liberada del sustrato; y
- (c)
- determinar si el compuesto aumenta o bloquea la liberación de la marca del sustrato.
15. Una composición farmacéutica que comprende
el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4,
el vector de la reivindicación 5 ó 6, el polipéptido de la
reivindicación 10, el anticuerpo de la reivindicación 12 y/o el
antagonista de la reivindicación 13 y opcionalmente un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
16. Una composición de diagnóstico que
comprende el polinucleótido de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, o el anticuerpo de la reivindicación
12.
17. Un proceso para diagnosticar una enfermedad
o susceptibilidad a enfermedad relacionada con una mutación en la
secuencia de ácido nucleico de TIMP-4 en un ácido
nucleico obtenido a partir de un sujeto, que comprende:
- (a)
- poner en contacto dichos ácidos nucleicos con una sonda que comprende el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 bajo condiciones de hibridación, y
- (b)
- determinar una mutación en la secuencia de ácidos nucleico de TIMP-4.
18. Un proceso de diagnóstico para analizar la
presencia de un polipéptido de TIMP-4 en una muestra
obtenida a partir de un huésped, que comprende:
- (a)
- poner en contacto dicha muestra con el anticuerpo de la reivindicación 12; y
- (b)
- determinar la cantidad de anticuerpo unido así y de ese modo detectar el polipéptido de TIMP-4.
19. El uso del polipéptido de la reivindicación
10, el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a
4 o el vector de la reivindicación 5 ó 6 para la preparación de una
composición farmacéutica para la prevención de la invasión tumoral
y la angiogénesis y posterior metástasis, para el tratamiento de
enfermedades artríticas, enfermedades de resorción de hueso, para
la prevención de la destrucción de colágeno aumentada que se da
conjuntamente con la diabetes, las clases recesivas de
epidermolisis bulosa distrófica, enfermedad periodontal y
consecuencias relacionadas de la producción gingival de colagenasa,
para la inhibición de la liberación de colagenasa de PMNL después
de la infiltración celular a la encía inflamada, incluyendo combatir
la mayor susceptibilidad de los enfermos de diabetes la enfermedad
periodontal, para el tratamiento de la ulceración corneal, para
prevenir la metástasis celular tumoral, para el tratamiento de
alveolitis restenosis, asma, soriasis, glomeruloesclerosis o choque
séptico.
20. El uso del antagonista de la reivindicación
13 y/o el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones
1 a 4 para la preparación de una composición farmacéutica para
reparar el tejido y remodelar el tejido cicatriz.
21. El anticuerpo de la reivindicación 12, el
cual es un anticuerpo policlonal.
22. El anticuerpo de la reivindicación 12, el
cual se selecciona entre el grupo que consiste en:
- (a)
- un anticuerpo monoclonal;
- (b)
- un anticuerpo quimérico;
- (c)
- un anticuerpo humanizado;
- (d)
- un anticuerpo de cadena sencilla; y
- (e)
- un fragmento Fab.
23. El anticuerpo de la reivindicación 12, el
cual está marcado.
24. El anticuerpo de la reivindicación 23, en
el cual la marca se selecciona entre el grupo que consiste en:
- (a)
- una enzima;
- (b)
- una marca fluorescente; y
- (c)
- una marca radioactiva.
25. El anticuerpo de la reivindicación 12, en
el que dicho anticuerpo se une específicamente a dicho polipéptido
en una transferencia tipo "Western" o en un tipo ELISA o en
ambos.
26. Una célula que produce el anticuerpo de la
reivindicación 12.
27. Un hibridoma que produce el anticuerpo de
la reivindicación 12.
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