DE69434926T2

DE69434926T2 - Menschlicher gewebsinhibitor von metalloproteinase-4

Info

Publication number: DE69434926T2
Application number: DE69434926T
Authority: DE
Inventors: John M. Gaithersburg GREENE; Craig A. Laytonsville ROSEN
Original assignee: Human Genome Sciences Inc
Current assignee: Human Genome Sciences Inc
Priority date: 1994-12-13
Filing date: 1994-12-13
Publication date: 2008-03-06
Anticipated expiration: 2014-12-14
Also published as: EP0815202A1; EP0815202B1; AU1724795A; US6448042B1; NZ279963A; AU708829B2; DE69434926D1; US20020115187A1; WO1996018725A1; US6828424B2; JPH10510986A; US6300310B1; EP0815202A4; ES2281898T3; US6391853B1; ATE354638T1

Description

Diese Erfindung betrifft neu identifizierte Polynucleotide, Polypeptide, die durch solche Polynucleotide codiert werden, die Verwendung solcher Polynucleotide und Polypeptide sowie die Produktion von solchen Polynucleotiden und Polypeptiden. Genauer gesagt sind die Polypeptide der vorliegenden Erfindung menschliche Gewebsinhibitoren von Metalloproteinase-4-Polypeptiden, die hierin nachstehend als „menschliche TIMP-4" (tissue inhibitor of metalloproteinase 4) bezeichnet werden. Die Erfindung betrifft auch die hemmende Wirkung solcher Polypeptide.
Die extrazelluläre Matrix ist eine komplexe Struktur, welche Kollagen, Proteoglycan, Glykosaminoglycan, Glycoproteine (Fibronectin, Chondronectin, Laminin) und in manchen Geweben Elastin enthält (Hay, E.D., J. Cell Biol., 91:205-223 (1981)).
Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) stellen die Hauptgruppe der Zinkbindenden Endopeptidasen dar, welche während des Umbaus von Bindegewebe während normaler physiologischer und mancher pathologischer Prozesse extrazelluläre Matrixproteine abbauen, zum Beispiel Bindegewebe, Kollagen und Gelatine. Die uneingeschränkte Aktivität von MMPs kann in erheblichem Gewebeschaden resultieren und diese Enzyme wurden mit einer Vielzahl an Erkrankungsvorgängen in Zusammenhang gebracht, einschließlich Tumor-Zellinvasion, Tumor-Angiogenese und rheumatoide Arthritis (Okada, Y. et al., J. Biol. Chem., 261:14245-14255 (1986)). Die MMPs werden aus den Zellen als inaktive Zymogene abgeschieden und ihre Aktivität in der extrazellulären Umgebung wird durch verschiedene Aktivatoren und Inhibitoren geregelt (Matrisian, L.M., Trends Genet., 6:121-125 (1990)).
Die Regulation von Metalloproteinase-vermittelter Proteolyse kann durch natürlich vorkommende Inhibitorproteine wie zum Beispiel den Gewebsinhibitor der Metalloproteinase (TIMP) stattfinden. Das Gleichgewicht zwischen der Produktion und Aktivierung der MMPs und ihrer Hemmung durch natürliche Inhibitoren wie zum Beispiel TIMP bestimmt sowohl in physiologischen als auch in pathologischen Zuständen, ob Bindegewebe abgebaut wird.
MMPs schließen etliche Proteinasen ein, beispielhaft dargestellt durch die interstitielle (Typ I) Kollagenase selbst, die Stromelysine (auch bekannt als Proteoglycanasen oder Transine), Fibroblasten und polymorphnucleäre Leukocyten-Gelatinasen (auch bekannt als Kollagen-IV-asen) und „pump-1" (mutmaßliche Metalloprotease 1, Gebärmutter-Metalloproteasen) [Goldberg et al., J. Biol. Chem. 2610:6600 (1986); Whitham et al., Biochem. J. 240:913 (1986); Breathnach et al, Nucleic Acids Res., 15:1139 (1987); Muller et al., Biochem. J., 253:187 (1988); Collier et al., J. Biol. Chem., 263:6579 (1988); Murphy et al., Biochem. J., 258:463 (1989); Quantin et al., Biochem. (N.Y.), 28:5327 (1989); Birkedal-Hansen, J. Oral Pathol., 17:445 (1988)].
Im Allgemeinen weist die Säugerfamilie der Proteasen eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften auf: (a) optimale proteolytische Aktivität bei etwa neutralem pH-Wert; (b) Abhängigkeit der Enzymaktivität von der Anwesenheit von Zink, wie durch den Verlust der Aktivität nach der Behandlung mit divalenten Metallionenchelatbildenenden Verbindungen offensichtlich ist, wie zum Beispiel 1.10 Phenanthrolin (vorzugsweise Chelatbildung mit Zink) oder EDTA (weniger eingeschränkte chelatbildende Eigenschaften; EDTA oder EGTA tragen auch zur Enzym-Inkativierung über Chelatbildung mit Calciumionen bei, die für die Enzymstabilität benötigt werden); (c) Hemmung durch TIMPs; (d) Abwesenheit einer wesentlichen Hemmung durch bekannte Inhibitoren von anderen Familien von neutralen, Zink-enthaltende Metalloproteasen wie zum Beispiel Thermolyse, Angiotensin-umwandelndes Enzym und „Enkephalinasen"; und (e) Biosynthese und Absonderung als latente Vorläuferformen (Zymogene), welche extrazelluläre Aktivierung benötigen. Die Aktivierung ist durch etliche Endoproteasen, quecksilberorganische Verbindungen und chaotrope Mittel erzielt worden.
Im Allgemeinen haben die Mitglieder der Familie der neutralen Metalloprotease-Enzyme charakteristische Substratspezifitäten. Kollagenase Typ I ist daher in ihrer Fähigkeit einzigartig, eine spezifische Peptidbindung innerhalb der natürlichen Faser des interstitiellen Kollagens (z.B. Typen I, II und II) zu spalten. Die Gelatinasen sind auf diesen Kollagenen nur schwach aktiv, sind aber im Stande, denaturierte interstitielle Kollagene abzubauen, sowie auch die nicht-fasrigen Kollagene, z.B. Typ IV, wie sie in der Basalmembran gefunden werden. Von Pump 1 ist berichtet worden, dass es bevorzugt auf denaturierte Kollagene (Gelatine) wirkt, obwohl sich sein Profil von dem der Stromelysine oder der Kollagenasen Typ IV unterscheidet. Sowohl die Stromelysine als auch die Gelatinasen sind auch im Stande, nicht-kollagenöse strukturelle Proteine wie zum Beispiel das Kernprotein von Proteoglycan und Elastin abzubauen. Makromoleküle, die in Zelle-zu-Substratum- und Zelle-zu-Zelle-Interaktionen beteiligt sind, wie zum Beispiel Laminin und Fibronectin, sind auch für den Abbau durch mehrere dieser Metalloproteasen empfänglich.
Enzyme dieser Familie werden durch synoviale und Hautfibroblasten, Chondrocyten, periphere mononucleäre Zellen, Keratinocyten und Zahnfleischgewebe erzeugt, und sie kommen auch innerhalb von Körnchen-Speichervesikel in polymorphnucleären Leukocyten (PMNLs) vor.
Derzeitige Information deutet darauf hin, dass es eine Familie von Metalloproteinase-Inhibitoren gibt, welche TIMP-1 (Gewebsinhibitor von Metalloproteinasen-1); TIMP-2; menschlichen TIMP-3, der cloniert, exprimiert und auf dem menschlichen Chromosom 22 kartiert wurde; und Hühner-Gewebsinhibitor der Metalloproteinase (ChIMP-5) umfasst. Das Polypeptid der vorliegenden Erfindung wurde mutmaßlich aufgrund von Aminosäure-Sequenzhomologie als ein neues menschliches TIMP-Polypeptid identifiziert.
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein neues reifes Polypeptid, welches menschlichen TIMP-4 darstellt, sowie biologisch aktive und diagnostisch oder therapeutisch nützliche Fragmente, Analoge und Derivate davon bereitgestellt.
Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung werden isolierte Nucleisäuremoleküle, welche menschlichen TIMP-4 codieren, einschließlich mRNAs, DNAs, cDNAs, genomischer DNA, sowie biologisch aktive und diagnostisch oder therapeutisch nützliche Fragmente, Analoge und Derivate davon bereitgestellt.
Gemäß noch einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Produktion eines solchen Polypeptids durch rekombinante Techniken, welche Züchten von rekombinanten prokaryontischen und/oder eukaryontischen Wirtszellen umfassen, die eine menschliche TIMP-4-Nucleinsäuresequenz enthalten, unter Bedingungen bereitgestellt, welche die Expression des Proteins und anschließende Gewinnung dieses Proteins fördern.
In Übereinstimmung mit noch einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Arzneimittel bereitgestellt, welches das menschliche TIMP-4-Protein der Erfindung enthält, welches bei der Ergänzung eines endogenen menschlichen TIMP-4s eines Patienten wirksam ist und dadurch diese Zustände erleichtert, umfassend zum Beispiel arthritische Erkrankungen wie rheumatoide und Osteoarthritis, Rheumatismus der Weichgewebe, Polychondritis und Sehnenentzündung; Knochenresorptionserkrankungen wie zum Beispiel Osteoporose, Paget-Krankheit, Hyperparathyreoidismus und Cholesteatom; vermehrte Kollagenzerstörung, die im Zusammenhang mit Diabetes auftritt; rezessive Varianten der dystrophischen Epidermolyse bullosa; peridontale Erkrankung, Alveolitis und ähnliche Folgen der Kollagenase-Produktion des Zahnfleisches; Geschwürbildung der Kornes; Geschwürbildung der Haut und des Magen-Darm-Trakts und abnormale Wundheilung; post-operative Zustände, in welchen die Kollagenasespiegel erhöht sind; Krebs durch Blockierung der Zerstörung von Gewebe-Basalmembranen, die zur Krebsmetastasierung führen; demyelierende Erkrankungen des zentralen und peripheren Nervensystems; Asthma; Glomerulosklerose; septischen Schock und Infektion; und Psoriasis.
In Übereinstimmung mit noch einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Antikörper gegen solche Polypeptide bereitgestellt.
In Übereinstimmung mit noch einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Nucleinsäuresonden bereitgestellt, die Nucleinsäuremoleküle von ausreichender Länge umfassen, um spezifisch an menschliche TIMP-4-Sequenzen zu hybridisieren.
In Übereinstimmung mit noch einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Antagonisten zu solchen Polypeptiden bereitgestellt, welche für therapeutische Zwecke eingesetzt werden können, zum Beispiel zur Umformung und Reparatur von Gewebe und für die Zerstörung von Narbengewebe.
In Übereinstimmung mit noch einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden diagnostische Tests für den Nachweis von Krankheiten bereitgestellt, die mit Mutationen in menschlichen TIMP-4-Sequenzen und der Überexpression des Polypeptids in Zusammenhang stehen.
Diese und andere Aspekte der vorliegenden Erfindung sollten für Fachleute aus den Lehren hierin offensichtlich sein.
Die folgenden Abbildungen sind veranschaulichend für die Ausführungsformen der Erfindung und sind nicht dazu gedacht, den Geltungsbereich der Erfindung einzuschränken, wie er durch die Ansprüche umfasst wird.
1 zeigt die cDNA-Sequenz und entsprechende davon abgeleitete Aminosäuresequenz des menschlichen Volllängen-TIMP-4-Polypeptids. Die Standard-Ein-Buchstaben-Abkürzungen für Aminosäuren werden verwendet. Die Sequenzierung wurde unter Verwendung eines automatisierten 373-DNA-Sequenziergeräts (Applied Biosystems, Inc.) durchgeführt. Es wird vorausgesagt, dass die Sequenzgenauigkeit größer als 97% ist.
2 ist ein Aminosäure-Sequenzvergleich zwischen dem Polypeptide der vorliegenden Erfindung und anderen menschlichen TIMP-Polypeptiden.
3 zeigt die Ergebnisse einer Northern-Blot-Analyse, welche die verschiedenen menschlichen Gewebe anzeigt, in welchen menschlicher TIMP-4 exprimiert wird.
In Übereinstimmung mit einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine isolierte Nucleinsäure bereitgestellt (Polynucleotid), welche das reife Polypeptid, das die abgeleitete Aminosäuresequenz von 1 aufweist, oder das reife Polypeptid codiert, welches durch die cDNA des Clons codiert wird, der am 11. November 1994 als ATCC-Hinterlegungsnr. 75946 hinterlegt wurde.
Ein Polynucleotid, das ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, kann aus einem frühen Stadium des menschlichen Gehirns erhalten werden. Es enthält einen offenen Leserahmen und codiert ein Protein von 224 Aminosäureresten, von welchen ungefähr die ersten 29 Reste die Leader-Sequenz darstellen, sodass das reife Protein 195 Aminosäurereste umfasst. Das Polynucleotid dieser Erfindung wurde in einer cDNA-Bank entdeckt, die von einem menschlichen Gehirn im frühen Stadium stammte. Das Protein zeigt mit 48% Identität und 72% Ähnlichkeit über einen Bereich von 136 Aminosäuren den höchsten Homologiegrad zu menschlichem TIMP-2. Menschlicher TIMP-4 weist die charakteristischen 12 Cysteinaminosäuren auf, die in allen Mitgliedern der TIMP-Familie konserviert sind. Die 12 Cysteinreste sind in TIMP-1 und TIMP-2 alle durch Disulfidbrücken verbunden. Dieses Indiz deutet stark darauf hin, dass das Polypeptid der vorliegenden Erfindung ein neues Mitglied der TIMP-Familie ist.
Die Polynucleotide der vorliegenden Erfindung können in der Form von RNA oder in der Form von DNA vorliegen, wobei DNA cDNA, genomische DNA und synthetische DNA einschließt. Die DNA kann doppelsträngig oder einzelsträngig sein und, wenn sie einzelsträngig ist, kann sie den codierenden Strang oder den nicht-codierenden Strang (Anti-Sense) darstellen. Die Codierungsequenz, die das reife Polypeptid codiert, kann identisch zu der in 1 gezeigten Codierungsequenz, oder zu der des hinterlegten Clons sein oder kann eine unterschiedliche Codierungsequenz sein, wobei die Codierungssequenz als ein Ergebnis der Redundanz oder Degeneration des genetischen Codes das gleiche reife Polypeptid codiert wie die DNA von 1 oder die hinterlegte cDNA.
Das Polynucleotid, welches das reife Polypeptid von 1 oder das reife Polypeptid codiert, welches durch die hinterlegte cDNA codiert wird, kann umfassen: nur die Codierungsequenz für das reife Polypeptid; die Codierungssequenz für das reife Polypeptid und eine zusätzliche Codierungssequenz wie zum Beispiel eine Leader- oder eine sekretorische Sequenz oder eine Pro-Proteinsequenz; die Codierungssequenz für das reife Polypeptid (und wahlweise eine zusätzliche Codierungssequenz) und nicht-Codierungssequenz wie zum Beispiel Introns oder eine nicht-codierende Sequenz 5' und/oder 3' der Codierungssequenz für das reife Polypeptid.
Der Begriff „Polynucleotid, das ein Polypeptid codiert" schließt daher ein Polynucleotid ein, welches nur eine Codierungssequenz für das Polypeptid umfasst, sowie auch ein Polynucleotid, welches eine zusätzliche Codierungs- und/oder nicht-Codierungssequenz umfasst.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Varianten der hierin vorstehend beschriebenen Polynucleotide, welche Fragmente, Analoge und Derivate der Polypeptide, welche die abgeleitete Aminosäuresequenz von 1 aufweisen, oder des Polypeptids codieren, welches durch die cDNA des hinterlegten Clons codiert ist. Die Variante des Polynucleotids kann eine natürlich vorkommende allele Variante des Polynucleotids oder eine nicht natürlich vorkommende Variante des Polynucleotids sein.
Die vorliegende Erfindung umfasst daher Polynucleotide, welche das gleiche, wie in 1 gezeigte, reife Polypeptid oder das gleiche reife Polypeptid codieren, welches durch die cDNA des hinterlegten Clons codiert ist, sowie auch Varianten solcher Polynucleotide, wobei die Varianten ein Fragment, Derivat oder Analog des Polypeptids von 1 oder des durch die cDNA des hinterlegten Clons codierten Polypeptids codieren. Solche Nucleotidvarianten umfassen Deletionsvarianten, Substitutionsvarianten und Additions- oder Insertionsvarianten.
Wie hierin vorstehend angegeben, kann das Polynucleotid eine Codierungssequenz aufweisen, welche eine natürlich vorkommende allele Variante der in 1 gezeigten Codierungsequenz oder der Codierungssequenz des hinterlegten Clons ist. Wie im Fachgebiet bekannt, ist eine allele Variante eine alternierende Form einer Polynucleotidsequenz, die eine Substitution, Deletion oder Addition von einem oder mehreren Nucleotiden aufweisen kann, welche die Funktion des codierten Polypeptids nicht wesentlich verändert.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch Polynucleotide, wobei die Codierungssequenz für das reife Polypeptid im gleichen Leserahmen mit einer Polynucleotidsequenz verbunden sein kann, die in der Expression und Absonderung eines Polypeptids aus einer Wirtszelle hilft, zum Beispiel eine Leadersequenz, die als eine sekretorische Sequenz zur Transportkontrolle eines Polypeptids aus der Zelle wirkt. Das Polypeptid, welches eine Leadersequenz aufweist, ist ein Präprotein und kann die Leadersequenz durch die Wirtszelle zur Bildung einer reifen Form des Polypeptids gespalten aufweisen. Die Polynucleotide können auch ein Proprotein codieren, welches ein reifes Protein inklusive zusätzlicher 5'-Aminosäurereste ist. Ein reifes Protein, welches eine Prosequenz aufweist, ist ein Proprotein und ist eine inaktive Form des Proteins. Sobald die Prosequenz gespalten wird, bleibt ein aktives reifes Protein zurück.
Das Polynucleotid der Erfindung kann daher zum Beispiel ein reifes Protein oder ein Protein, welches eine Prosequenz aufweist, oder ein Protein codieren, welches sowohl eine Prosequenz als auch eine Präsequenz (Leader-Sequenz) aufweist.
Bei den Polynucleotiden der vorliegenden Erfindung kann die Codierungsequenz auch im Leserahmen verbunden mit einer Markersequenz vorliegen, welche die Reinigung des Polypeptids der vorliegenden Erfindung ermöglicht. Die Markersequenz kann ein Hexa-Histidin-Marker sein, bereitgestellt durch einen pQE-Vektor, um die Reinigung des reifen Polypeptids bereitzustellen, welches im Falle eines bakteriellen Wirts mit dem Marker verbunden ist, oder zum Beispiel kann die Markersequenz ein Hämagglutinin (HA)-Marker sein, wenn ein Säugerwirt, z.B. COS-7-Zellen, verwendet wird. Der HA-Marker entspricht einem Epitop, das aus dem Protein des Influenza-Hämagglutinin stammt (Wilson, I., et al., Cell, 37:767 (1984)). Die vorliegende Erfindung betrifft weiters Polynucleotide, die mit den hierin vorstehend beschriebenen Sequenzen hybridisieren, wenn mindestens 50% und vorzugsweise 70% Identität zwischen den Sequenzen vorliegen. Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere Polynucleotide, die unter stringenten Bedingungen an die hierin vorstehend beschriebenen Polynucleotide hybridisieren. Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff „stringente Bedingungen", dass Hybridisierung nur stattfinden wird, wenn mindestens 95% und vorzugsweise 97% Identität zwischen den Sequenzen besteht. Die Polynucleotide, welche an die hierin vorstehend beschriebenen Polynucleotide hybridisieren, codieren in einer bevorzugten Ausführungsform Polypeptide, die im Wesentlichen die gleiche biologische Funktion oder Aktivität wie das reife Polypeptid beibehalten, welches durch die cDNA von 1 oder die hinterlegte cDNA codiert wird.
Die hierin erwähnte(n) Hinterlegung(en) wird (werden) unter den Bedingungen des Budapester Vertrags zur Internationalen Anerkennung der Hinterlegung von Mirkroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren aufrechterhalten werden. Diese Hinterlegungen werden lediglich als eine Annehmlichkeit für Fachleute bereitgestellt und sind kein Geständnis, dass eine Hinterlegung unter 35 U.S.C. §112 benötigt wird. Die Sequenz der in den hinterlegten Materialen enthaltenen Polynucleotide sowie die Aminosäuresequenz der dadurch codierten Polypeptide sind hierin durch Bezugnahme eingeschlossen und sind im Falle irgendeines Konflikts mit irgendeiner Sequenzbeschreibung hierin maßgeblich. Es könnte zur Herstellung, Verwendung oder für den Verkauf der hinterlegten Materialien eine Lizenz benötigt werden und es wird hiermit keine solche Lizenz erteilt.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein menschliches TIMP-4-Polypeptid, das die abgeleitete Aminosäuresequenz von 1 aufweist oder das die Aminosäuresequenz aufweist, die durch die hinterlegte cDNA codiert ist, sowie Fragmente, Analoge und Derivate eines solchen Polypeptids.
Die Begriffe „Fragment", „Derivat" und „Analog", wenn sie sich auf das Polypeptid von 1 oder auf das durch die hinterlegte cDNA codierte Polypeptid beziehen, bedeuten ein Polypeptid, welches im Wesentlichen die gleiche biologische Funktion oder Aktivität wie ein solches Polypeptid beibehält. Ein Analog umfasst daher ein Proprotein, das durch Spaltung des Proproteinanteils aktiviert werden kann, um eine aktives reifes Polypeptid zu produzieren.
Das Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann ein rekombinantes Polypeptid, ein natürliches Polypeptid oder ein synthetisches Polypeptid sein, vorzugsweise ein rekombinantes Polypeptid.
Das Fragment, Derivat oder Analog des Polypeptids von 1 oder von dem, welches durch die hinterlegte cDNA codiert ist, kann (i) eines sein, in dem ein oder mehrere Aminosäurereste mit einem konservierten oder nicht-konservierten Aminosäurerest (vorzugsweise einem konservierten Aminosäurerest) substituiert sind und ein solcher substituierter Aminosäurerest kann oder kann nicht einer sein, der durch den genetischen Code codiert ist, oder (ii) einer sein, in dem eine oder mehrere der Aminosäurereste eine Substituentengruppe umfassen, oder (iii) eines sein, in dem das reife Polypeptid mit einer anderen Verbindung fusioniert ist, wie zum Beispiel einer Verbindung zur Verlängerung der Halbwertszeit des Polypeptids (zum Beispiel Polyethylenglycol), oder (iv) eines sein, in dem die zusätzlichen Aminosäuren an das reife Polypeptid fusioniert sind, wie zum Beispiel eine Leader oder sekretorische Sequenz oder eine Sequenz, die zur Reinigung des reifen Polypeptids oder einer Proproteinsequenz eingesetzt wird. Solche Fragmente, Derivate und Analoge werden aus den hierin erwähnten Lehren von Fachleuten als im Geltungsbereich erachtet.
Die Polypeptide und Polynucleotide der vorliegenden Erfindung werden vorzugsweise in einer isolierten Form bereitgestellt und sind vorzugsweise bis zur Homogenität gereinigt.
Der Begriff „isoliert" bedeutet, dass das Material aus seiner ursprünglichen Umgebung entfernt wird (z.B. der natürlichen Umgebung, wenn es natürlich vorkommt). Zum Beispiel ist ein natürlich vorkommendes Polynucleotid oder Polypeptid, das in einem lebenden Tier vorhanden ist, nicht isoliert, aber das gleiche Polynucleotid oder Polypeptid, welches von manchen oder allen in dem natürlichen System daneben existierenden Materialien getrennt ist, ist isoliert. Solche Polynucleotide könnten Teil eines Vektors sein und/oder solche Polynucleotide oder Polypeptide könnten Teil einer Zusammensetzung sein und noch immer isoliert sein, da ein solcher Vektor oder eine solche Zusammensetzung nicht Teil ihrer natürlichen Umgebung sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Vektoren, die Polynucleotide der vorliegenden Erfindung umfassen, Wirtszellen, welche mit Vektoren der Erfindung genetisch manipuliert sind und die Produktion von Polypeptiden der Erfindung durch rekombinante Technik.
Wirtszellen sind mit den Vektoren dieser Erfindung genetisch manipuliert (transduziert oder transformiert oder transfiziert), die zum Beispiel ein Clonierungsvektor oder ein Expressionsvektor sein können. Der Vektor kann zum Beispiel in der Form eines Plasmids, eines viralen Partikels, eines Phagen usw. sein. Die manipulierten Wirtszellen können in herkömmlichen Nährmedien gezüchtet werden, die modifiziert sind, wie es für die Aktivierung von Promotoren, Selektion von Transformanten oder Amplifizierung des menschlichen TIMP-4-Gens geeignet ist. Die Kulturbedingungen wie Temperatur, pH-Wert und ähnliches sind jene, die vorher bei der zur Expression ausgewählten Wirtszelle verwendet wurden und werden für einen Fachmann mit normalem Fachwissen offensichtlich sein.
Die Polynucleotide der vorliegenden Erfindung können zur Produktion von Polypeptiden durch rekombinante Techniken eingesetzt werden. Die Polynucleotide können daher in jeden einer Vielzahl von Expressionsvektoren zur Expression eines Polypeptids eingeschlossen sein. Solche Vektoren umfassen chromosomale, nicht-chromosomale und synthetische DNA-Sequenzen, z.B. Derivate von SV40; bakterielle Plasmide; Phagen-DNA; Baculovirus; Hefeplasmide; Vektoren, abgeleitet aus Kombinationen von Plasmiden und Phagen-DNA, virale DNA wie zum Beispiel Vaccinia, Adenovirus, Geflügel-Pockenvirus und Pseudorabiesvirus. Jeder andere Vektor kann jedoch verwendet werden, solange er zur Replikation fähig und in dem Wirt lebensfähig ist.
Die geeignete DNA-Sequenz kann durch eine Vielzahl an Verfahren in den Vektor inseriert werden. Im Allgemeinen wird die DNA-Sequenz durch im Fachgebiet bekannte Verfahren in (eine) geeignete Restriktionsendonuclease-Stelle(n) inseriert. Solche und andere Verfahren werden als innerhalb des Anwendungsbereichs von Fachleuten angesehen.
Die DNA-Sequenz in dem Expressionsvektor ist mit (einer) geeigneten Expressions-Kontrollsequenz(en) (Promotor) funktionsfähig verbunden, um die mRNA-Synthese zu steuern. Als repräsentative Beispiele solcher Promotoren können erwähnt werden: LTR oder SV40-Promotor, der E. coli.-lac- oder -trp-, der Lambda-P_L-Phagenpromotor und andere Promotoren, von denen bekannt ist, dass sie die Expression von Genen in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen kontrollieren, oder ihre Viren. Der Expressionsvektor enthält auch eine Ribosomenbindungsstelle für die Translationsinitiation und einen Transkriptionsterminator. Der Vektor kann auch geeignete Sequenzen zur Amplifizierung der Expression enthalten.
Außerdem enthalten die Expressionsvektoren vorzugsweise einen oder mehrere selektierbare Markergene, um ein phänotypisches Merkmal zur Selektion der transformierten Wirtszellen bereitzustellen, wie zum Beispiel Dihydrofolatreduktase oder Neomycin-Resistenz für eukaryontische Zellkultur oder wie zum Beispiel Tetracyclin- oder Ampicillinresistenz in E. coli.
Der Vektor, welcher die hierin vorstehend beschriebene, geeignete DNA-Sequenz sowie einen geeigneten Promotor oder eine Kontrollsequenz enthält, kann eingesetzt werden, um einen geeigneten Wirt zu transformieren, um dem Wirt zu erlauben, das Protein zu exprimieren.
Als repräsentative Beispiele von geeigneten Wirten können erwähnt werden: bakterielle Zellen wie zum Beispiel E. coli, Streptomyces, Salmonella typhimurium; Pilzzellen wie zum Beispiel Hefe; Insektenzellen wie zum Beispiel Drosophila S2 und Sf9; tierische Zellen wie zum Beispiel CHO, COS oder Bowes-Melanom; Adenoviren; Pflanzenzellen usw. Die Auswahl eines geeigneten Wirtes wird aus den Lehren hierin als im Anwendungsbereich von Fachleuten erachtet.
Genauer gesagt schließt die vorliegende Erfindung auch rekombinante Konstrukte ein, umfassend eine oder mehrere der vorstehend allgemein beschriebenen Sequenzen. Die Konstrukte umfassen einen Vektor wie zum Bespiel ein Plasmid oder einen viralen Vektor, in den eine Sequenz der Erfindung in einer Vorwärts- oder Rückwärts-Orientierung inseriert worden ist. In einem bevorzugten Aspekt dieser Ausführungsform umfasst das Konstrukt ferner regulatorische Sequenzen, einschließlich zum Beispiel eines Promotors, welcher mit der Sequenz funktionsfähig verbunden ist. Eine große Anzahl an geeigneten Vektoren und Promotoren ist den Fachleuten bekannt und ist im Handel erhältlich. Die folgenden Vektoren werden als Beispiel bereitgestellt. Bakteriell: pQE70, pQE60, pQE-9 (Quiagen), pbs, pD10, Phagescript, psiX174, pBluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A (Stratagene); ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia). Eukaryontisch: pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia). Jedes/r andere Plasmid oder Vektor kann jedoch verwendet werden, solange sie in der Wirtszelle replizierbar und lebensfähig sind.
Promotorregionen können aus jedem gewünschten Gen unter Verwendung von CAT (Chloramphenicoltransferase)-Vektoren oder anderen Vektoren mit selektierbaren Markern isoliert werden. Zwei geeignete Vektoren sind PKK232-8 und PCM7. Besonders erwähnte bakterielle Promotoren schließen lacI, lacZ, T3, T7, gpt, Lambda P_R, P_L und trp ein. Eukaryontische Promotoren schließen den sehr frühen CMV-, HSV-Thymidinkinase-, frühen und späten SV40-Promotor, LTRs vom Retrovirus und Maus-Metallothionein-1-Promotor ein. Die Auswahl des geeigneten Vektors und Promotors liegt völlig innerhalb des Niveaus von durchschnittlichem Fachwissen.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Wirtszellen, welche die vorstehend beschriebenen Konstrukte enthalten. Die Wirtszelle kann eine höhere eukaryontische Zelle sein, wie zum Beispiel eine Säugerzelle, oder eine niedrigere eukaryontische Zelle wie zum Beispiel eine Hefezelle, oder die Wirtszelle kann eine prokaryontische Zelle sein, wie zum Beispiel eine bakterielle Zelle. Die Einführung des Konstrukts in die Wirtszelle kann durch Calciumphosphat-Transfektion, DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion oder Elektroporation bewerkstelligt werden (Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Basic Methods in Molecular Biology, (1986)).
Die Konstrukte in den Wirtszellen können in einer herkömmlichen Weise verwendet werden, um Genprodukte zu erzeugen, die durch die rekombinante Sequenz codiert werden. Alternativ können die Polypeptide der Erfindung synthetisch durch herkömmliche Peptidsythesegeräte erzeugt werden.
Reife Proteine können in Säugerzellen, Hefe, Bakterien oder anderen Zellen unter Kontrolle von geeigneten Promotoren exprimiert werden. Zellfreie Translationssysteme können auch eingesetzt werden, um solche Proteine unter Verwendung von RNAs zu produzieren, die aus DNA-Konstrukten der vorliegenden Erfindung stammen. Geeignete Clonierungs- und Expressionsvektoren zur Verwendung mit prokaryontischen und eukaryontischen Wirten werden durch Sambrook et al., Molekular Cloning: A Laborstory Manual, Zweite Auflage, Cold Spring Harbor, N. Y., (1989) beschrieben; die Offenbarung davon ist hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen.
Die Transkription der DNA, welche die Polypeptide der vorliegenden Erfindung codiert durch höhere Eukaryonten, wird durch Insertion einer Enhancersequenz in den Vektor erhöht. Enhancer sind cis-wirkende DNA-Elemente von normalerweise etwa 10 bis 300 bp, welche auf einen Promotor wirken, um seine Transkription zu erhöhen. Beispiele umfassen den SV40-Enhancer auf der späten Seite des Replikationsursprungs, Basenpaare 100 bis 270, einen früher Cytomegalievirus-Promotor-Enhancer, den Polyoma-Enhancer auf der späten Seite des Replikationsursprungs und Adenovirus-Enhancer.
Im Allgemeinen werden rekombinante Expressionsvektoren Replikationsursprünge und selektierbare Marker umfassen, welche die Transformation der Wirtszelle erlauben, z.B. das Ampicillin-Resistenzgen von E. coli und das S. cerevisiae-TRP1-Gen und einen von einem hoch-exprimierten Gen stammenden Promotor, um die Transkription einer strukturellen Sequenz stromabwärts zu steuern. Solche Promotoren können aus Operons stammen, die glycolytische Enzyme wie zum Beispiel unter anderem 3-Phosphoglyceratkinase (PGK), α-Faktor, saure Phosphatase oder Hitzeschockproteine codieren. Die heterologe strukturelle Sequenz ist in geeigneter Phase mit den Translationsinitiations- und Terminationssequenzen zusammengesetzt und vorzugsweise mit einer Leadersequenz, die im Stande ist, die Sekretion des translatierten Proteins in den periplasmatischen Raum oder ein extrazelluläres Medium zu lenken. Wahlweise kann die heterologe Sequenz ein Fusionsprotein einschließlich eines N-terminalen Identifikationspeptids codieren, welches die erwünschten Eigenschaften verleiht, z.B. Stabilisierung oder vereinfachte Reinigung des exprimierten rekombinanten Produkts.
Nützliche Expressionsvektoren für bakterielle Verwendungen werden durch Insertion einer strukturellen DNA-Sequenz, ein gewünschtes Protein codiert, gemeinsam mit geeigneten Translationsinitiations- und Terminationssignalen in einer funktionsfähigen Leserahmenphase mit einem funktionellen Promotor konstruiert. Der Vektor wird ein oder mehrere phänotypisch auswählbare Marker und einen Replikationsursprung umfassen, um die Beibehaltung des Vektors zu gewährleisten und, falls wünschenswert, um die Amplifikation innerhalb des Wirts zu gewährleisten. Geeignete prokaryontische Wirte zur Transformation umfassen E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium und verschiedene Arten innerhalb der Gattungen Pseudomonas, Streptomyces, und Staphylococcus, obwohl auch andere als ein Mittel der Wahl eingesetzt werden können.
Als ein bezeichnendes, aber nicht limitierendes Beispiel können nützliche Expressionsvektoren für bakterielle Verwendung einen selektierbaren Marker und bakteriellen Replikationsursprung umfassen, der aus im Handel erhältlichen Plasmiden stammt, die genetische Elemente des gut bekannten Clonierungsvektors pBR322 (ATCC 37017) enthält. Solche im Handel erhältliche Vektoren umfassen zum Beispiel pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden) und GEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, USA). Diese pBR322 „Rückgrat"-Abschnitte werden mit einem geeigneten Promotor und der zur exprimierenden strukturellen Sequenz kombiniert.
Nach der Transformation eines geeigneten Wirtsstammes und Züchtung des Wirtsstammes bis zu einer entsprechenden Zelldichte wird der ausgewählte Promotor durch geeignete Mittel induziert (z.B. Temperaturveränderung oder chemische Induktion) und die Zellen werden für eine weitere Dauer gezüchtet.
Die Zellen werden üblicherweise durch Zentrifugation geerntet, durch physikalische oder chemische Mittel aufgebrochen und der verbleibende Rohextrakt wird für weitere Reinigung zurückbehalten.
Mikrobielle Zellen, die in der Expression von Proteinen eingesetzt werden können durch jedes zweckmäßige Verfahren aufgebrochen werden, einschließlich Zyklen von Einfrieren und Auftauen, Ultraschallbehandlung, mechanischen Aufbrechens oder der Verwendung von Zell-lysierenden Mitteln; solche Verfahren sind den Fachleuten gut bekannt.
Verschiedene Säugerzell-Kultursysteme können auch angewandt werden, um rekombinantes Protein zu exprimieren. Beispiele von Säuger-Expressionsystemen umfassen die COS-7-Linien von Affennieren-Fibroblasten, die durch Gluzman, Cell, 23:175 (1981) beschrieben wurden, und andere Zelllinien, die im Stande sind, einen kompatiblen Vektor zu exprimieren, zum Beispiel die C127-, 3T3-, CHO-, HeLa- und BHK-Zelllinien. Säuger-Expressionsvektoren werden einen Replikationsursprung, einen geeigneten Promotor und Enhancer und auch alle nötigen Ribosomenbindungsstellen, Polyadenylierungsstellen, Donor- und Akzeptor-Spleißstellen, transkriptionelle Terminationssequenzen und 5'-flankierende nicht-transkribierte Sequenzen umfassen. DNA-Sequenzen, die aus den SV40-Spleiß- und Polyadenylierungsstellen stammen, können verwendet werden, um die benötigten nicht-transkribierten genetischen Elemente bereitzustellen.
Die menschlichen TIMP-4-Polypeptide können aus rekombinanten Zellkulturen durch Verfahren einschließlich Ammoniumsulfat- oder Ethanolausfällung, Säureextraktion, Anionen- oder Kationenaustauschchromatographie, Phosphocellulose-Chromatographie, hydrophobe Chromatographie, Affinitäts-Chromatographie, Hydroxylapatit-Chromatographie und Lektin-Chromatographie gewonnen werden. Protein-Rückfaltungsschritte können, wenn nötig, bei der Fertigstellung der Konfiguration des reifen Proteins verwendet werden. Schlussendlich kann Hochleistungs-Flüssigkeitschromoatographie (HPLC) für die endgültigen Reinigungsschritte eingesetzt werden.
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung können ein natürlich gereinigtes Produkt oder ein Produkt aus chemischen synthetischen Verfahren sein oder durch rekombinante Techniken aus einem prokaryontischen oder eukaryontischen Wirt erzeugt sein (z.B. durch Bakterien, Hefe, höhere Pflanzen, Insekten und Säugerzellen in Kultur). Abhängig von dem in einem rekombinanten Produktionsverfahren eingesetzten Wirt können die Polypeptide der vorliegenden Erfindung glycosyliert sein oder können nicht-glycosyliert sein. Polypeptide der Erfindung können auch einen ersten Methionin-Aminosäurerest umfassen.
Die vorliegende Erfindung ist teilweise auch auf menschlichen TIMP-4 gerichtet, der als eine definierende Eigenschaft die Fähigkeit aufweist, die Wirkung von MMPs zu hemmen. Das menschliche TIMP-4-Polypeptid kann als ein Metalloproteinaseinhibitor eingesetzt werden, um die Tumorinvasion und Angiogenese und anschließende Metastasierung zu verhindern. Das menschliche TIMP-4-Polypeptid kann auch eingesetzt werden, um arthirtische Erkrankungen zu behandeln, wie zum Beispiel rheumatoide Arthritis und Osteoarthritis, Weichgewebe-Rheumathismus, Polychondritis und Tendonitis; und Knochen-Resorptionserkrankungen wie zum Beispiel Osteoporose, Paget-Erkrankung, Hyperparathyroidismus und Cholesteatom. Menschlicher TIMP-4 kann auch eingesetzt werden, um die beschleunigte Kollagenzerstörung zu verhindern, die in Assoziation mit Diabetes, den rezessiven Varianten von dystrophischer Epidermolyse bullosa, peridontaler Erkrankung und ähnlichen Konsequenzen der Produktion von Kollagenase durch das Zahnfleisch, auftritt. Menschlicher TIMP-4 kann auch eingesetzt werden, um PMNL-Kollagenasefreisetzung nach der zellulären Infiltration von entzündetem Zahnfleisch zu hemmen, einschließlich der Bekämpfung von größerer Anfälligkeit von Diabetespatienten für peridontale Erkrankungen.
Menschlicher TIMP-4 kann auch eingesetzt werden, um Geschwürbildung der Kornes, zum Beispiel jene, die durch Laugen oder andere Verbrennungen, durch Strahlung, durch Vitamin E- oder Retinoid-Mangel erhöht sind; Geschwürbildung der Haut und des Magen-Darm-Traktes und abnormale Wundheilung und post-operative Zustände einschließlich Colon-Anastomose, bei welchen die Kollagenasespiegel erhöht sind, zu behandeln.
MMPs vermitteln Tumorwachstum in situ. Demgemäß kann menschlicher TIMP-4 verwendet werden, um die Zerstörung der zellulären Basalmembranen zu blockieren, was ein Mechanismus ist, durch den Krebszellen metastasieren. MMPs sind mit der Neovaskularisierung, die benötigt wird, um das Tumorwachstum und -Überleben zu unterstützen, mit der Gewebeumformung, die benötigt wird, um wachsenden primären und sekundären Tumore Platz zu bieten, und mit der Penetration von Tumorzellen durch die Basalmembranen der vaskulären Wände während der Metastase in Zusammenhang gebracht worden.
MMPs sind für den lokalisierten Abbau der follikulären Wand während der Ovulation und für den lokalisierten Abbau der Uteruswand zur Implantation der Blastocyte verantwortlich. Demgemäß kann TIMP-4 als ein Verhütungsmittel eingesetzt werden.
Menschlicher TIMP-4 kann auch als ein allgemeiner Wachstumsfaktor eingesetzt werden, um Restenose und ähnliche Erkrankungen zu behandeln. Menschlicher TIMP-4 kann insbesondere als ein Wachstumsfaktor für erythroide Zelllinien eingesetzt werden.
Andere Erkrankungen, für deren Behandlung menschlicher TIMP-4 eingesetzt werden kann, umfassen Alveolitis, Asthma, Psoriasis, Glomerulosklerose und septischen Schock, da MMPs an der Invasivität mancher Parasiten in Gewebe beteiligt sind.
Die Fragmente des menschlichen Volllängen-TIMP-4-Gens können als eine Hybridisierungssonde für eine cDNA-Bank verwendet werden, um das Volllängengen zu isolieren und um andere Gene zu isolieren, die eine hohe Sequenzähnlichkeit zu dem Gen oder ähnliche biologische Aktivität aufweisen. Sonden dieser Art können zum Beispiel zwischen 20 und 2000 Basen lang sein. Vorzugsweise weisen die Sonden jedoch zwischen 30 und 50 Basenpaare auf. Die Sonde kann auch verwendet werden, um einen cDNA-Clon, der einem Volllängen-Transkript entspricht, und einen genomischen Clon oder Clone, welche das vollständige TIMP-4-Gen umfassen, einschließlich regulatorischer und Promotorregionen, Exons und Introns, zu identifizieren. Ein Beispiel einer Durchmusterung umfasst das Isolieren des Codierungsbereiches des menschlichen TIMP-4-Gens unter Verwendung der bekannten DNA-Sequenz, um eine Oligonucleotidsonde zu synthetisieren. Markierte Oligonucleotide, die eine Sequenz aufweisen, die komplementär zu jener des Gens der vorliegenden Erfindung ist, werden verwendet, um eine menschliche cDNA-Bank, genomische DNA oder RNA zu durchmustern, um zu bestimmen, an welche Mitglieder der Genbank die Sonde hybridisiert.
Diese Erfindung betrifft auch die Verwendung des menschlichen TIMP-4-Gens als Teil eines diagnostischen Tests zum Nachweis von Erkrankungen oder der Anfälligkeit für Krankheiten, die mit der Anwesenheit von mutiertem menschlichem TIMP-4 in Zusammenhang stehen.
Personen, die Mutationen im menschlichen TIMP-4-Gen tragen, können auf dem DNA-Niveau durch eine Vielzahl an Techniken nachgewiesen werden. Nucleinsäuren zur Diagnose können von den Zellen eines Patienten wie zum Beispiel aus dem Blut, Harn, Speichel, einer Gewebebiopsie und Autopsiematerial erhalten werden. Die genomische DNA kann direkt zum Nachweis verwendet werden oder kann enzymatisch vor der Analyse unter Verwendung von PCR amplifiziert werden (Saiki et al., Nature, 324:163-166 (1986)). RNA oder cDNA können auch für den gleichen Zweck verwendet werden. Als ein Beispiel können PCR-Primer verwendet werden, die komplementär sind zu der den menschlichen TIMP-4 codierenden Nucleinsäure, um menschliche TIMP-4-Mutationen zu identifizieren und zu analysieren. Zum Beispiel können Deletionen und Insertionen durch eine Veränderung in der Größe des amplifizierten Produktes im Vergleich zum normalen Genotyp verwendet werden. Punktmutationen können durch Hybridisierung von amplifizierter DNA an radioaktiv markierte menschliche TIMP-4-RNA oder alternativ an radioaktiv-markierte menschliche TIMP-4-Antisense-DNA-Sequenzen identifiziert werden. Perfekt passende Sequenzen können von nicht-passenden Duplexmolekülen durch Spaltung mit RNase A oder durch Unterschiede in Schmelztemperaturen unterschieden werden.
Genetische Überprüfung basierend auf DNA-Sequenzunterschieden kann durch Nachweis von Änderung der elektrophoretischen Mobilität von DNA-Fragmenten in Gelen mit oder ohne denaturierende Mittel erzielt werden. Kleine Sequenzdeletionen und -Insertionen können durch Gelelektrophorese mit hoher Auflösung sichtbar gemacht werden. DNA-Fragmente von unterschiedlichen Sequenzen können auf denaturierenden Formamid-Gradientengelen unterschieden werden, in welchen die Mobilitäten von unterschiedlichen DNA-Fragmenten im Gel bei unterschiedlichen Positionen gemäß ihrer spezifischen Schmelz- oder teilweisen Schmelztemperaturen verzögert werden (siehe z.B. Myers et al., Science, 230:1242 (1985)).
Sequenzveränderungen an spezifischen Stellen können auch durch Nuclease-Schutztests wie zum Beispiel RNase- und S1-Schutz oder chemische Spaltungsverfahren (z.B. Cotton et al., PNAS, USA, 85:4397-4401 (1985)) aufgedeckt werden.
Der Nachweis einer spezifischen DNA-Sequenz kann daher durch Verfahren wie zum Beispiel Hybridisierung, RNase-Schutz, chemische Spaltung, direkte DNA-Sequenzierung oder die Verwendung von Restriktionsenzymen (z.B. Restriktionfragment-Längenpolymorphismus (RFLP)) und Southern-Blotting von genomischer DNA erzielt werden.
Zusätzlich zu mehr herkömmlicher Gelelektrophorese und DNA-Sequenzierung können Mutationen auch durch in situ-Analyse nachgewiesen werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen diagnostischen Test zum Nachweis von veränderten Mengen an menschlichem TIMP-4-Protein in verschiedenen Geweben, da eine Überexpression der Proteine, verglichen zu normalen Kontroll-Gewebeproben, die Anwesenheit einer Erkrankung oder Anfälligkeit für eine Krankheit nachweisen kann, die durch menschlichen TIMP-4 reguliert ist. Tests, die zum Nachweis von Mengen an menschlichem TIMP-4-Protein in einer Probe verwendet werden, die aus einem Wirt stammt, sind Fachleuten gut bekannt und umfassen Radioimmuntests, kompetitive Bindungstests, Western-Blot-Analyse, ELISA-Tests und „Sandwich"-Test. Ein ELISA-Test (Coligan, et al., Current Protocols in Immunology, 1(2), Kapitel 6, (1991)) umfasst anfänglich die Erzeugung eines Antikörpers, der für menschliches TIMP-4-Antigen spezifisch ist, vorzugsweise eines monoclonalen Antikörpers. Außerdem wird ein Reporterantikörper gegen den monoclonalen Antikörper erzeugt. An dem Reporterantikörper wird ein nachweisbares Reagenz angebracht, wie zum Beispiel Radioaktivität, Fluoreszenz oder in diesem Beispiel ein Meerrettich-Peroxydaseenzym. Eine Probe wird aus einem Wirt entfernt und auf einem festen Träger inkubiert, z.B. einer Polystyrolschale, welche die Proteine der Probe bindet. Alle freien Bindungsstellen auf der Schale werden dann durch Inkubation mit einem nicht-spezifischen Protein wie zum Beispiel BSA bedeckt. Als Nächstes wird ein monoclonaler Antikörper in der Schale inkubiert; während dieser Zeit lagern sich die monoclonalen Antikörper an alle menschlichen TIMP-4-Proteine an, die an die Polystyrolschale gebunden sind. Aller nicht-gebundener monoclonaler Antikörper wird mit Puffer weggewaschen. Der an Meerrettichperoxydase gebundene Reporterantikörper wird dann in die Schale gegeben, was in Bindung des Reporterantikörpers an alle monoclonalen Antikörper resultiert, die an menschliches TIMP-4 gebunden sind. Nicht gebundener Reporterantikörper wird dann weggewaschen. Peroxidasesubstrate werden dann zu der Schale hinzugefügt und die Farbmenge, die sich in einer bestimmten Zeitspanne entwickelt, ist ein Maß für die Menge an menschlichem TIMP-4-Protein, das in einem bestimmten Volumen an Patientenprobe vorhanden ist, wenn es gegen eine Standardkurve verglichen wird.
Ein Kompetitionstest kann angewandt werden, wobei Antikörper, die für menschlichen TIMP-4 spezifisch sind, an einen festen Träger befestigt werden und markierter menschlicher TIMP-4 und eine Probe, stammend aus dem Wirt, werden über den festen Träger geleitet und die Menge an nachgewiesener Markierung zum Beispiel durch Flüssigszintillationschromotographie kann mit der Menge von menschlichem TIMP-4 in der Probe korreliert werden.
Ein „Sandwich"-Test ist ähnlich einem ELISA-Test. In einem „Sandwich"-Test wird menschlicher TIMP-4 über einen festen Träger geleitet und bindet an einen Antikörper, der an einem festen Träger befestigt ist. Ein zweiter Antikörper wird dann an den menschlichen TIMP-4 gebunden. Ein dritter Antiköper, der markiert und spezifisch für den zweiten Antikörper ist, wird dann über den festen Träger geleitet und bindet an den zweiten Antikörper und eine Menge kann dann quantifiziert werden.
Diese Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Durchmusterung von Verbindungen bereit, um jene zu identifizieren, die Agonisten oder Antagonisten der menschlichen TIMP-4-Polypeptide sind. Ein Beispiel eines solchen Verfahrens umfasst den Erhalt von menschlichem Gewebe, umfassend eine extrazelluläre Matrix, zum Beispiel radiokarpale Gelenke vom Rind. Der Gelenkknorpel wird in kleinere Scheiben geschnitten und mit ³⁵S-Natriumsulfat (10 Mikro-Ci/ml) in DMEM für eine ausreichende Zeit markiert, damit der Knorpel das markierte Natriumsulfat einbauen kann. Ein MMP, zum Beispiel Stromelysin oder IL1 oder TNF, wird dann unter geeigneten Bedingungen zu den Knopelscheiben hinzugefügt, unter welchen der Gewebeabbau normalerweise stattfinden würde. Menschlicher TIMP-4 und die zu durchmusternden Verbindungen wurden dann zum Reaktionsgemisch für eine ausreichende Zeit hinzugefügt, damit die MMP die Knorpelscheiben normal abbaut. Der Überstand, der das Medium außerhalb der Knopelscheiben ist, wird dann gesammelt und Radioaktivität mit einem Flüssigszintillationszähler gezählt. Der Prozentsatz des ins Medium freigesetzten ³⁵S wird dann berechnet. Diese Freisetzung von ³⁵S-GAG ist für den Proteoglycanpool in der extrazellulären Knorpelmatrix charakteristisch und spiegelt den Proteoglycanabbau durch MMP wider. Die Menge an ³⁵S-GAG, wie sie durch Flüssigszintillationschromatographie bestimmt wurde, wird dann mit einem Kontrolltest verglichen, der in Abwesenheit der Verbindung gemacht wurde, die durchmustert werden soll, und die Fähigkeit der Verbindung, für die Wirkung von menschlichem TIMP-4 als Agonist oder Antagonist zu wirken, kann dann bestimmt werden.
Beispiele von möglichen menschlichen TIMP-4-Antagonisten zusätzlich zu jenen, die vorstehend identifiziert wurden, umfassen einen Antikörper oder in manchen Fällen ein Oligonucleotid, welches an das Polypeptid bindet. Alternativ kann ein möglicher Antagonist eine mutierte Form des menschlichen TIMP-4 darstellen, welcher natürliche Substrate erkennt, aber inaktiv ist und dadurch die Wirkung von menschlichem TIMP-4 verhindert.
Potentielle menschliche TIMP-4-Antagonisten umfassen auch Antisense Konstrukte, die unter Verwendung von Antisense-Technologie erzeugt wurden. Antisense-Technologie kann verwendet werden, um Genexpression durch die Bildung einer Tripelhelix oder Antisense-DNA oder -RNA zu kontrollieren; beide Verfahren basieren auf der Bindung eines Polynucleotids an DNA oder RNA. Zum Beispiel wird der codierende 5'-Teil der Polynucleotidsequenz, der das reife Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, verwendet, um ein Antisense-RNA-Oligonucleotid von etwa 10 bis 40 Basenpaaren Länge zu entwerfen. Ein DNA-Oligonucleotid wird entworfen, um zu einem Bereich des Gens komplementär zu sein, der an der Transkription beteiligt ist (Tripelhelix – siehe Lee et al., Nucl. Acids Res., 6:3073 (1979); Cooney et al., Science, 241:456 (1988); und Dervan et al., Science, 251: 1360 (1991)), wobei dadurch die Transkription und die Produktion von menschlichem TIMP-4 verhindert wird. Das Antisense-RNA-Oligonucleotid hybridisiert mit der mRNA in vivo und blockiert die Translation des mRNA-Moleküls in menschlichen TIMP-4 (Antisense – Okano, J. Neurochem., 56:560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRL Press, Boca Raton, FL (1988)). Die vorstehend beschriebenen Oligonucleotide können auch so an Zellen verabreicht werden, dass die Antisense-RNA oder -DNA in vivo exprimiert werden kann, um die Produktion von menschlichem TIMP-4 zu hemmen.
Ein anderer möglicher menschlicher TIMP-4-Antagonist ist ein kleines Molekül, das an die aktive Stelle von menschlichem TIMP-4 bindet und sie besetzt und dadurch verhindert, dass menschlicher TIMP-4 mit MMPs interagiert, sodass normale biologische Aktivität verhindert wird. Beispiele kleiner Moleküle umfassen kleine Peptide oder Peptid-ähnliche Moleküle wie zum Beispiel ein Peptid-gebundenes Molekül, sind aber nicht darauf beschränkt.
Die menschlichen TIMP-4-Antagonisten können zur Gewebereparatur und -Umformung eingesetzt werden, zum Beispiel wo die Zerstörung von Narbengewebe erwünscht ist. In manchen Situationen kann beschleunigte Bindegewebe-Umsatz oder -Umformung wünschenswert sein, z.B. in der Resorption von Narbengewebe; in der postpartalen Uterusinvolution; bei der Umformung von fibrotischen Ablagerungen in der Lunge, Leber oder den Gelenken. Um den Umsatz von extrazellulären Matrixproteinen in diesen Situationen entsprechend zu kontrollieren, würde, um den Abbau angemessen zu kontrollieren, ein Gleichgewicht zwischen den MMPs und menschlichem TIMP-4 benötigt werden.
Die Polypeptide und Agonisten oder Antagonisten, die auch Polypeptide sind, können gemäß der vorliegenden Erfindung durch Expression solcher Polypeptide in vivo eingesetzt werden, was oft als „Gen-Therapie" bezeichnet wird.
Zellen aus einem Patienten können daher zum Beispiel mit einem Polynucleotid (DNA oder RNA) ex vivo manipuliert werden, die manipulierten Zellen werden dann für einen Patienten bereitgestellt, der mit dem Polypeptid behandelt werden soll. Solche Verfahren sind im Fachgebiet gut bekannt. Zum Beispiel können Zellen durch im Fachgebiet bekannte Verfahren durch die Verwendung eines retroviralen Partikels manipuliert werden, der RNA enthält, die ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert.
Auf ähnliche Weise können Zellen, zum Beispiel durch im Fachgebiet bekannte Verfahren in vivo für die Expression eines Polypeptids in vivo manipuliert werden. Wie im Fachgebiet bekannt, kann eine Erzeugerzelle für die Erzeugung eines retroviralen Partikels, der die das Polypeptid der vorliegenden Erfindung codierende RNA enthält, an einen Patienten zur Manipulation von Zellen in vivo und zur Expression des Polypeptids in vivo, verabreicht werden. Dieses und andere Verfahren zur Verabreichung eines Polypeptids der vorliegenden Erfindung durch ein solches Verfahren sollten Fachleuten aus den Lehren der vorliegenden Erfindung offensichtlich sein. Zum Beispiel kann das Expressionsvehikel für die Manipulation von Zellen ein anderes als ein Retrovirus sein, zum Beispiel ein Adenovirus, welches verwendet werden kann, um Zellen in vivo nach der Kombination mit einem geeigneten Verabreichungsvehikel zu verändern.
Die Polypeptide und Agonisten oder Antagonisten der vorliegenden Erfindung können in Kombination mit einem geeigneten pharmazeutischen Träger eingesetzt werden. Solche Zusammensetzungen umfassen eine therapeutisch wirksame Menge des Polypeptids und einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder Excipient. Ein solcher Träger umfasst, ist aber nicht auf Kochsalzlösung, gepufferte Kochsalzlösung, Dextrose, Wasser, Glycerin, Ethanol und Kombinationen davon beschränkt. Die Rezeptur sollte für die Art der Verabreichung geeignet sein.
Die Erfindung stellt auch eine pharmazeutische Verpackung oder einen Kit bereit, umfassend einen oder mehrere Behälter, die mit einem oder mehreren Bestandteilen des Arzneimittels der Erfindung gefüllt sind. Ein Hinweis kann (einem) solchen Container(n) auch in der Form beigefügt sein, wie er von einer Regierungsbehörde zur Regulierung der Herstellung, Verwendung oder des Verkaufs von Arzneimitteln oder biologischen Produkten vorgeschrieben wird, wobei der Hinweis die Bewilligung der Behörde für Herstellung, Verwendung und Verkauf für Verabreichung an Menschen widerspiegelt. Außerdem können die Arzneimittel zusammen mit anderen therapeutischen Verbindungen eingesetzt werden.
Die Arzneimittel können in passender Weise verabreicht werden, wie zum Beispiel auf topischen, intravenösen oder intra-artikulären Wegen, in den Tumor, oder auf intraperitonealen, intramuskulären, subkutanen, intanasalen oder intradermalen Wegen. Die Arzneimittel werden in einer Menge verabreicht, die zur Behandlung und/oder Vorbeugung von spezifischen Indikationen wirkungsvoll ist. Im Allgemeinen werden die Arzneimittel in einer Menge von mindestens etwa 10 μg/kg Körpergewicht verabreicht und in den meisten Fällen werden sie in einer Menge von nicht mehr als 8 mg/kg Körpergewicht pro Tag verabreicht und vorzugsweise ist die Dosierung von etwa 10 μg/kg bis etwa 1 mg/kg Körpergewicht täglich, wobei man Verabreichungswege, Symptome usw. in Betracht zieht.
Die Sequenzen der vorliegenden Erfindung sind auch für die Chromosomenidentifizierung wertvoll. Die Sequenz ist spezifisch zielgerichtet und kann mit einer bestimmten Stelle auf einem einzelnen menschlichen Chromosom hybridisieren. Darüber hinaus besteht ein momentanes Bedürfnis für die Identifizierung von bestimmten Orten auf dem Chromosom. Wenige Chromosomenmarkierungsreagenzien, basierend auf eigentlichen Sequenzdaten (Wiederholungs-Polymorphismus) sind gegenwärtig für die Markierung von Chromosomenorten vorhanden. Gemäß der vorliegenden Erfindung ist die Kartierung von DNAs zu Chromosomen ist ein wichtiger erster Schritt bei der Korrelation dieser Sequenzen mit Genen, die mit Krankheit in Zusammenhang stehen.
Kurz gesagt können die Sequenzen durch Erzeugung von PCR-Primern (vorzugsweise 15-25 bp) aus der cDNA auf Chromosomen kartiert werden. Die Computeranalyse der nicht-translatierten 3'-Region wird verwendet, um Primer schnell auszuwählen, welche in der genomischen DNA nicht mehr als ein Exon umspannen, was den Amplifizierungsprozess komplizieren würde. Diese Primer werden dann für die PCR-Durchmusterung von somatischen Zellhybriden verwendet, die einzelne menschliche Chromosomen enthalten. Nur jene Hybride, die das menschliche Gen enthalten, welches dem Primer entspricht, werden ein amplifiziertes Fragment ergeben.
PCR-Kartierung von somatischen Zellhybriden ist ein rasches Verfahren, um eine bestimmte DNA einem bestimmten Chromosom zuzuordnen. Unter Verwendung der vorliegenden Erfindung kann mit den gleichen Oligonucleotidprimern in analoger Weise eine Unterlokalisierung mit Gruppen von Fragmenten von spezifischen Chromosomen oder Pools von großen genomischen Clonen erzielt werden. Andere Kartierungsstrategien, welche auf ähnliche Weise verwendet werden können, um DNA zu ihrem Chromosom zu kartieren, umfassen in situ-Hybridisierung, Vor-Durchmusterung mit markierten, durchflusssortierten Chromosomen und Vorauswahl durch Hybridisierung, um Chromosomen-spezifische cDNA-Banken zu konstruieren.
Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH) von cDNA-Clonen auf eine chromosomale Metaphase-Aufspreitung kann verwendet werden, um in einem Schritt eine genaue chromosomale Lokalisierung bereitzustellen. Diese Technik kann mit cDNA verwendet werden, die so kurz wie 500 oder 600 Basen ist; größere als 2.000 bp-Clone weisen jedoch für den einfachen Nachweis eine größere Bindungswahrscheinlichkeit an eine einzigartige chromosomale Lage mit ausreichender Signalintensität auf. FISH benötigt die Verwendung von Clonen, aus welchen der EST abgeleitet ist, und je länger, umso besser. Zum Beispiel sind 2.000 bp gut, 4.000 sind besser und mehr als 4.000 sind wahrscheinlich nicht nötig, um gute Ergebnisse in einer vernünftigen Zeitspanne zu erhalten. Für eine Zusammenfassung dieser Technik siehe Verma et al., Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques Pergamon Press, New York (1988).
Sobald eine Sequenz zu einem genauen Chromosomenort kartiert wurde, kann die physikalische Position der Sequenz auf dem Chromosom mit den genetischen Daten der Karte korreliert werden. Solche Daten werden zum Beispiel in V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man (erhältlich online durch Johns Hopkins University Welch Medical Library) gefunden. Die Beziehung zwischen Genen und Erkrankungen, welche zu der gleichen chromosomalen Region kartiert wurden, wird dann durch Verknüpfungsanalyse (gleichzeitige Vererbung von physikalisch nebeneinander liegenden Genen) identifiziert.
Als Nächstes ist es notwendig, die Unterschiede in der cDNA oder genomischen Sequenz zwischen betroffenen und nicht-betroffenen Personen zu bestimmen. Wenn eine Mutation in manchen oder allen der betroffenen Personen beobachtet wird, aber nicht in irgendwelchen normalen Personen, dann ist die Mutation wahrscheinlich der ursächliche Erreger der Erkrankung.
Mit der gegenwärtigen Auflösung von physikalischen und genetischen Kartierungstechniken könnte eine cDNA, welche genau an einer chromosomalen Region lokalisiert wurde, die mit der Erkrankung in Zusammenhang steht, eine von zwischen 50 bis 500 möglichen ursächlichen Genen darstellen. (Hier wird von 1 Megabase Kartierungsauflösung und einem Gen pro 20 kb ausgegangen).
Die Polypeptide, ihre Fragmente oder andere Derivate oder Analoge davon oder Zellen, die sie exprimieren, können als ein Immunogen verwendet werden, um Antikörper dagegen zu erzeugen. Diese Antikörper können zum Beispiel polyclonale oder monoclonale Antikörper sein. Die vorliegende Erfindung umfasst auch chimäre, Einzelketten und vermenschlichte Antikörper sowie auch Fab-Fragmente oder das Produkt einer Fab-Expressionsbank. Verschiedene im Fachgebiet bekannte Verfahren können für die Produktion solcher Antiköper und Fragmente verwendet werden.
Antikörper, die gegen die Polypeptide erzeugt wurden, die einer Sequenz der vorliegenden Erfindung entsprechen, können durch direkte Injektion der Polypeptide in ein Tier oder durch Verabreichung der Polypeptide an ein Tier, vorzugsweise nicht an einen Menschen, erhalten werden. Die so erhaltenen Antikörper werden dann an die Polypeptide selbst binden. Auf diese Weise kann sogar eine Sequenz verwendet werden, die nur ein Fragment des Polypeptids codiert, um Antikörper zu erzeugen, welche die gesamten nativen Polypeptide binden. Solche Antikörper können dann verwendet werden, um das Polypeptid aus dem Gewebe zu isolieren, welches dieses Polypeptid exprimiert.
Zur Erzeugung von monoclonalen Antikörpern kann jede Technik verwendet werden, welche die durch fortlaufende Zelllinienkulturen erzeugten Antikörper bereitstellt. Beispiele umfassen die Hybridomtechnik (Köhler und Milstein, 1975, Nature, 256:495-497), die Triom-Technik, die menschliche B-Zell-Hybridomtechnik (Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72) und die EBV-Hybridomtechnik für die Produktion von monoclonalen Antikörpern (Cole, et al., 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. Seiten 77-96).
Techniken, die für die Erzeugung von einzelkettigen Antikörpern beschrieben sind ( US-Patent 4.946.778 ), können adaptiert werden, um einzelkettige Antikörper gegen immunogene Polypeptidprodukte dieser Erfindung zu erzeugen. Außerdem können transgene Mäuse verwendet werden, um humanisierte Antikörper gegen immunogene Polypeptidprodukte dieser Erfindung zu exprimieren.
Die vorliegende Erfindung wird ferner unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele beschrieben; es muss jedoch klar sein, dass die vorliegende Erfindung nicht auf solche Beispiele beschränkt ist. Falls nicht anders angegeben, werden alle Teile und Mengen nach Gewicht angegeben.
Um das Verständnis der folgenden Beispiele zu erleichtern, werden bestimmte, oft vorkommende Verfahren und/oder Begriffe beschrieben werden.
„Plasmide" werden durch ein kleines p beschrieben, vorausgehend und/oder gefolgt von Großbuchstaben und/oder Zahlen. Die Ausgangsplasmide hierin sind entweder im Handel erhältlich, auf einer uneingeschränkten Basis öffentlich erhältlich oder können in Übereinstimmung mit veröffentlichen Verfahren aus erhältlichen Plasmiden konstruiert werden. Außerdem sind im Fachgebiet äquivalente Plasmide zu den beschriebenen bekannt und werden für einen durchschnittlich geschulten Fachmann offensichtlich sein.
„Spaltung" von DNA bezieht sich auf die katalytische Spaltung der DNA mit einem Restriktionsenzym, das nur auf eine bestimmte Sequenz in der DNA wirkt. Die verschiedenen, hierin verwendeten Restriktionsenzyme sind im Handel erhältlich und ihre Reaktionsbedingungen, Co-Faktoren und anderen Erfordernisse wurden so verwendet, wie sie einem durchschnittlich geschulten Fachmann bekannt wären. Für analytische Zwecke wird üblicherweise 1 μg Plasmid oder DNA-Fragment mit etwa 2 Einheiten Enzym in etwa 20 μl Pufferlösung verwendet. Zum Zweck der Isolierung von DNA-Fragmenten zur Plasmidkonstruktion werden üblicherweise 5 bis 50 μg DNA mit 20 bis 250 Einheiten Enzym in einem größeren Volumen gespalten. Geeignete Puffer und Substratmengen für besondere Restriktionsenzyme werden durch den Hersteller genau angegeben. Inkubationszeiten von etwa 1 Stunde bei 37°C werden gewöhnlich verwendet, können aber in Übereinstimmung mit den Anweisungen des Lieferanten variieren. Nach der Spaltung wird die Reaktion direkt auf einem Polyacrylamidgel einer Elektrophorese unterworfen, um das gewünschte Fragment zu isolieren.
Die Größenauftrennung des gespaltenen Fragments wird unter Verwendung eines 8 % Polyacrylamidgeis, beschrieben durch Goeddel, D. et al., Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980), durchgeführt.
„Oligonucleotide" beziehen sich entweder auf einzelsträngige Polydesoxynucleotide oder zwei komplementäre Polydesoxynucleotidstränge, die chemisch synthetisiert werden können. Solche synthetischen Oligonucleotide haben kein 5'-Phosphat und werden daher nicht an ein anderes Oligonucleotid ligieren, ohne dass mit einem ATP in der Anwesenheit einer Kinase ein Phosphat hinzugefügt wird. Ein synthetisches Oligonucleotid wird an ein Fragment ligieren, das nicht dephosphoryliert wurde.
„Ligierung" bezieht sich auf den Prozess der Bildung von Phosphodiesterbindungen zwischen zwei doppelsträngigen Nucleinsäurefragmenten (Maniatis, T., et al., id., S. 146). Wenn nicht anders bereitgestellt, kann Ligierung unter Verwendung von bekannten Puffern und Bedingungen mit 10 Einheiten T4 DNA-Ligase („Ligase") pro 0,5 μg von ungefähr äquimolaren Mengen des DNA-Fragments, das ligiert werden soll, ausgeführt werden.
Falls nicht anders angegeben, wurde die Transformation, wie beschrieben in dem Verfahren von Graham, F. und Van der Eb, A., Virology, 52:456-457 (1973), durchgeführt.
Beispiel 1
Bakterielle Expression und Reinigung von menschlichem TIMP-4
Die DNA-Sequenz, die menschliches TIMP-4 codiert, ATCC #75946, wird zunächst unter Verwendung von PCR-Oligonucleotidprimern amplifiziert, die den 5'- und Sequenzen des prozessierten menschlichen TIMP-4-Proteins (ohne die Signalpeptidsequenzen) und den Vektorsequenzen 3' vom TIMP-4-Gen entsprechen. Zusätzliche Nucleotide, entsprechend dem menschlichen TIMP-4, wurden zu den 5'- bzw. 3'-Sequenzen hinzugefügt. Der 5'-Oligonucleotidprimer hat die Sequenz
5' GCCAGAGGATCCTGCAGCTGCGCCCCGGCGCAC 3'
und enthält eine BamHI-Restriktionsenzymstelle, gefolgt vo 21 Nucleotiden der menschlichen TIMP-4-Codierungssequenz, beginnend bei dem Codon der vermeintlichen terminalen Aminosäure des prozessierten Proteins. Die 3'- Sequenz
5' CGGCTTCTAGAACTAGGGCTGAACGATGTCAAC 3'
enthält eine XbaI-Stelle, gefolgt von 18 Nucleotiden des menschlichen TIMP-4. Die Restriktionsenzymstellen entsprechen den Restriktionsenzymstellen auf dem bakteriellen Expressionsvektor pQE-9 (Quiagen, Inc. 9259 Eton Avenue, Chatsworth, KA, 91311). pQE-9 codiert antibiotische Resistenz (Amp^r), einen bakteriellen Replikationsursprung (ori), einen IPTG-regulierbaren Promotor-Operator (P/O), eine Ribosomenbindungsstelle (RBS), ein 6-His-Marker und Restriktionsenzymstellen. pQE-9 wurde dann mit BamHI und XbaI gespalten. Die amplifizierten Sequenzen wurden in pQE-9 ligiert und wurden im Leserahmen mit der Sequenz inseriert, die den Histidin-Marker und die RBS codiert. Das Ligierungsgemisch wurde dann verwendet, um den E. coli-Stamm m15/pREP4 zu transformieren, der von Quiagen durch das Verfahren, beschrieben in Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Laborstory Press, (1989), erhältlich ist. m15/pREP4 enthält mehrfache Kopien des Plasmids pREP4, welches den lacI-Repressor exprimiert und auch Kanamycinrestistenz (Kan^r) verleiht. Transformanten wurden durch ihre Fähigkeit, auf LB-Platten zu wachsen, identifiziert und Ampicillin/Kanamycin-resistente Kolonien wurden ausgewählt. Plasmid-DNA wurde isoliert und durch Restriktionsanalyse bestätigt. Clone, die das gewünschte Konstrukt enthielten, wurden über Nacht (OIN) in flüssiger Kultur in LB-Medium gezüchtet, das sowohl mit Amp (100 μg/ml) und Kan (25 μg/ml) ergänzt war. Die OIN-Kultur wurde dann verwendet, um eine große Kultur bei einem Verhältnis von 1:100 bis 1:250 zu inokulieren. Die Zellen wurden bis zu einer optischen Dichte 600 (OD₆₀₀) von 0,4 bis 0,6 gezüchtet. IPTG („Isopropyl-B-D-thiogalactopyranosid") wurde dann zu einer Endkonzentration von 1 mM hinzugefügt. IPTG induziert durch Inaktivierung des lacI-Repressors, wobei die Freilegung des P/O zu erhöhter Genexpression führt. Zellen wurden zusätzliche 3 bis 4 Stunden gezüchtet. Die Zellen wurden dann durch Zentrifugation geerntet. Das Zellpellet wurde in dem chaotrophen Mittel 6 M Guanidin-HCl solubilisiert. Nach der Klärung wurde solubilisiertes menschlicher TIMP-4 aus dieser Lösung durch Chromatographie auf einer Nickel-Chelatsäule unter Bedingungen gereinigt, welche die feste Bindung durch Proteine erlaubt, welche den 6-His-Marker enthalten (Hochuli, E. et al., J. Chromatography 411:177-184 (1984). Menschlicher TIMP-4 (90% rein) wurde aus der Säule in 6 M Guanidin-HCl, pH-Wert 5.0, eluiert und zum Zwecke der Renaturierung auf 3 M Guanidin-HCl, 100 mM Natriumphosphat, 10 mM Glutathion (reduziert) und 2 mM Glutathion (oxidiert), eingestellt. Nach der Inkubation in dieser Lösung für 12 Stunden wurde das Protein gegen 10 mM Natriumphosphat dialysiert.
Beispiel 2
Expression von rekombinantem menschlichem TIMP-4 in COS-Zellen
Die Expression von menschlichem TIMP-4-HA wird von einem Vektor pcDNAI/Amp (Invitrogen) durchgeführt, der enthält: 1) SV40-Replikationsursprung, 2) Ampicillinresistenzgen, 3) E. coli-Replikationsursprung, 4) CMV-Promotor, gefolgt von einer Polylinkerregion, einem SV40-Intron und einer Polyadenylierungsstelle. Ein DNA-Fragment, welches den gesamten menschlichen TIMP-4-Vorläufer codiert, und ein HA-Marker, im Leserahmen an sein 3'-Ende fusioniert, wurden in die Polylinkerregion des Vektors cloniert; die rekombinante Proteinexpression wird daher durch den CMV-Promotor gesteuert. Das HA-Marker entspricht, wie vorstehend beschrieben, einem Epitop, abgeleitet aus dem Influenza-Hämagglutininprotein (I. Wilson, H. Niman, R. Heighten, A. Cherenson, M. Connolly, und R. Lerner, 1984, Cell 37:767). Die Fusion des HA-Markers an das Zielprotein erlaubt den einfachen Nachweis des rekombinanten Proteins mit einem Antikörper, der das HA-Epitop erkennt.
Die Strategie der Plasmidkonstruktion ist beschrieben, wie folgt:
Die DNA-Sequenz ATCC # 75946, welche das menschliche TIMP-4 codiert, wurde durch PCR unter Verwendung von zwei Primern konstruiert: der 5'-Primer
5' GCCAGAGGATCCGCCACCATGCCTGGGAGCCCTCGGCCC 3'
enthält eine BamHI-Stelle, gefolgt von 21 Nucleotiden der codierenden Sequenz des menschlichen TIMP-4, beginnend beim Initiationscodon; die 3' Sequenz 5' CGGCTTCTAGAATCAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGGGCTGAACGATGTCAAC 3' enthält komplementäre Sequenzen zu einer XbaI-Stelle, zum Translations-Stoppcodon, HA-Marker und zu den letzten 18 Nucleotiden der codierenden Sequenz des menschlichen TIMP-4 (nicht einschließlich des Stoppcodons). Das PCR-Produkt enthält daher eine BamHI-Stelle, die menschliche TIMP-4-codierende Sequenz, gefolgt von dem im Leserahmen verbundenen HA-Marker, ein Translations-Terminations-Stoppcodon neben dem HA-Marker und eine XbaI-Stelle. Das durch PCR amplifizierte DNA-Fragment und der Vektor, pcDNAI/Amp, wurden mit den BamHI- und XbaI-Restriktionsenzymen gespalten und ligiert. Das Ligierungsgemisch wurde in den E. coli-Stamm SURF transformiert (erhältlich durch Stratagene Cloning Systems, 11099 North Torreg Pines Road, La Jolla., KA 92037), die transformierte Kultur wurde auf Ampicillin-Mediumplatten ausplattiert und resistente Kolonien wurden ausgewählt. Die Plasmid-DNA wurde aus Transformanten isoliert und durch Restriktionsanalyse auf die Anwesenheit des richtigen Fragments untersucht. Für die Expression des rekombinanten menschlichen TIMP-4 wurden COS-Zellen mit dem Expressionsvektor durch das DEAE-DEXTRAN-Verfahren transfiziert (J. Sambrook, E. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Laborstory Press, (1989)). Die Expression des menschlichen TIMP-4-HA-Proteins wurde durch Radiomarkierung und Immunpräzipitationsverfahren nachgewiesen (E. Harlow, D. Lane, Antibodies: A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Laborstory Press, (1988)). Die Zellen wurden zwei Tage nach der Transfektion für 8 Stunden mit ³⁵S-Cystein markiert. Kulturmedien wurden dann gesammelt und die Zellen wurden mit Detergens lysiert (RIPA-Puffer (150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,1% SDS, 0,5% DOC, 50 mM Tris, pH-Wert 7,5) (Wilson, I. et al., id. 37:767 (1984)). Sowohl Zelllysate als auch Kulturmedien wurden mit einem HA-spezifischen monoclonalen Antikörper ausgefällt. Die ausgefällten Proteine wurden auf 15% SDS-PAGE-Gelen analysiert.
Beispiel 3
Clonierung und Expression von TIMP-4 unter Verwendung des Baculovirus-Expressionssystems
Die DNA-Sequenz, welche das Volllängen-TIMP-4-Protein, ATCC # 75946 codiert, wurde unter Verwendung von PCR-Oligonucleotidprimern amplifiziert, welche den 5'- und 3'-Sequenzen des Gens entsprechen:
Der 5'-Primer hatte die Sequenz
5' GCCAGAGGATCCATGCCTGGGAGCCCTCGGCCC 3'
und enthält eine BamHI-Restriktionsenzymstelle (Fett gedruckt), gleich nach den ersten 21 Nucleotiden des TIMP-4-Gens (das Initiationscodon für die Translation „ATG" ist unterstrichen).
Der 3'-Primer hat die Sequenz
5' CGGCTTCTAGAACTAGGGCTGAACGATGTCAAC 3'
und enthält die Spaltungsstelle für die Restriktionsendonuclease XbaI und 18 Nucleotide komplementär zur der nicht-translatierten 3'-Sequenz des TIMP-4-Gens. Die amplifizierten Sequenzen wurden unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Kits („Geneclean", BIO 101 Inc., La Jolla, CA) aus einem 1% Agarosegel isoliert. Das Fragment wurde dann mit den Endonuleasen BamHI und XbaI gespalten und dann nochmals auf einem 1% Agarosegel gereinigt. Dieses Fragment wurde als F2 bezeichnet.
Der Vektor pA2 (Modifikation des pVL941-Vektors, nachstehend besprochen) wird für die Expression des TIMP-4-Proteins unter Verwendung des Baculovirus-Expressionssystems verwendet (für eine Zusammenfassung siehe: Summers, M.D. und Smith, G. E. 1987, A manual of methods for baculovirus vectors and insect cell culture procedures, Texas Agricultural Experimental Station Bulletin Nr. 1555). Dieser Expressionsvektor enthält den starken Polyhedrin-Promotor des nucleären Autographs californica-Polyeden Virus (AcMNPV), gefolgt durch die Erkennungsstellen für die Restriktionsendonuclease BamHI und XbaI. Die Polyadenylierungsstelle des Affenvirus (SV) 40 wird für die effiziente Polyadenylierung verwendet. Für eine einfache Selektion von rekombinanten Viren wird das beta-Galactosidasegen aus E. coli in der gleichen Orientierung wie der Polyhedrinpromotor inseriert, gefolgt durch das Polyadenylierungsignal des Polyhedringens. Die Polyhedrinsequenzen werden an beiden Seiten durch virale Sequenzen für die Zell-vermittelte homologe Rekombination von co-transfizierter viraler Wildtyp-DNA flankiert. Viele andere Baculovirusvektoren könnten anstatt pRG1 verwendet werden, wie zum Beispiel pAc373, pVL941 und pAcIM1 (Luckow, V.A. und Summers, M.D. Virology, 170:31-39).
Das Plasmid wurde mit den Restriktionsenzymen BamHI und XbaI gespalten. Die DNA wurde dann aus einem 1 % Agarosegel unter Verwendung des im Handel erhältlichen Kits isoliert („Geneclean” BIO 101 Inc., La Jolla, KA.). Diese Vektor-DNA wurde als V2 bezeichnet.
Fragment F2 und das Plasmid V2 wurden mit T4-DNA-Ligase ligiert. E. coli HB101-Zellen wurden dann transformiert und Bakterien unter Verwendung der Enzyme BamHI und XbaI identifiziert, die das Plasmid mit dem TIMP-4-Gen enthielten (pBacTIMP-4). Die Sequenz des clonierten Fragments wurde durch DNA-Sequenzierung bestätigt.
5 μg des Plasmids pBacTIMP-4 wurden mit 1,0 μg eines im Handel erhältlichen, linearisierten Baculovirus („BaculoGold^TM Baculovirus DNA", Pharmingen, San Diego, KA.) unter Verwendung des Lipofektionsverfahrens co-transfiziert (Feigner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:7413-7417 (1987)).
1 μg BaculoGold^TM-Virus-DNA und 5 μg des Plasmids pBacTIMP-4 wurden in einer sterilen Vertiefung einer Mikrotiterplatte gemischt, die 50 μl serumfreies Grace-Medium (Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD) enthielt. Danach wurden 10 μl Lipofektin und 90 μl Grace-Medium hinzugefügt, gemischt und für 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurde das Transfektionsgemisch tropfenweise zu den Sf9-Insektenzellen (ATCC CRL 1711) hinzugefügt, die in einer 35 mm-Gewebekulturplatte mit 1 ml Grace-Medium ohne Serum ausgesät waren. Die Platte wurde hin und her geschwenkt, um die neu hinzugefügte Lösung zu mischen. Die Platte wurde dann für 5 Stunden bei 27°C inkubiert. Nach 5 Stunden wurde die Transfektionslösung aus der Platte entfernt und 1 ml Grace-Insektenmedium wurde hinzugefügt, das mit 10% fötalem Kälberserum ergänzt war. Die Platte wurde zurück in den Inkubator gestellt und die Kultivierung bei 27°C für vier Tage fortgesetzt.
Nach vier Tagen wurde der Überstand gesammelt und ein Plaquetest durchgeführt, ähnlich wie beschrieben von Summers und Smith (vorstehend). Als eine Modifikation wurde ein Agarosegel mit „Blue Gal" (Life Technologies Inc., Gaithersburg) verwendet, welches eine einfache Isolierung von blau gefärbten Plaques erlaubt. (Eine detaillierte Beschreibung eines „Plaque-Tests" kann auch in dem Benutzerhandbuch für Insektenzellenkultur und Baculovirologie gefunden werden, welches durch Life Technologies Inc., Gaithersburg vertrieben wird, Seiten 9-10).
Vier Tagen nach der seriellen Verdünnung wurden die Viren zu den Zellen hinzugefügt und blau gefärbte Plaques wurden mit der Spitze einer Eppendorf-Pipette abgenommen. Der die rekombinanten Viren enthaltende Agar wurde dann in einem Eppendorf-Röhrchen resuspendiert, das 200 μl Grace-Medium enthielt. Der Agar wurde durch eine kurze Zentrifugation entfernt und der Überstand, der das rekombinanten Baculovirus enthielt, wurde verwendet, um Sf9-Insektenzellen zu infizieren, die in 35 mm-Schalen ausgesät waren. Vier Tage später wurden die Überstände dieser Kulturschalen geerntet und dann bei 4°C gelagert.
Sf9-Zellen wurden in Grace-Medium gezüchtet, das mit 10% Hitzeinaktiviertem, fötalem Rinderserum ergänzt war. Die Zellen wurden mit dem rekombinanten Baculovirus V-TIMP-4 bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 2 infiziert. Sechs Stunden Später wurde das Medium entfernt und mit SF900 II-Medium ohne Methionin und Cystein ersetzt (Life Technologies Inc., Gaithersburg). 42 Stunden später wurden 5 μCi ³⁵S-Methionin und 5 μCi ³⁵S-Cystein (Amersham) hinzugefügt. Die Zellen wurden für 16 Stunden weiter inkubiert, bevor sie durch Zentrifugation geerntet wurden, und die markierten Proteine wurden durch SDS-PAGE und Autoradiographie sichtbar gemacht.
Beispiel 4
Expressionsmuster von menschlichem TIMP-4 in menschlichen Geweben 20 μg Gesamt-RNA aus jedem der vorstehenden Gewebe wurden denaturiert und auf einem 1,2% Formaldehyd-Agarosegel laufen gelassen und über Nacht auf einen Nylonfilter mittels Kapillarblotverfahren überführt. RNA wurde auf dem Filter durch UV-Quervernetzung immobilisiert. Eine zufällige Primersonde wurde aus der EcoRI-XhoI-Insertion der teilweisen TIMP-4-Nucleinsäuresequenz erzeugt und verwendet, um den Blot durch Hybridisierung über Nacht in Church-Puffer mit 100 μg/ml denaturierter Heringssperma-DNA als einem Blockierungsmittel zu testen. Waschen wurde sequentiell mit 2 × SSC/0,1% SDS und 0,2 × SSC/0,1% SDS bei 65°C durchgeführt. Größenmarker waren die BRL-RNA-Leiter und ribosomale 18S- und 28S-RNA-Banden. 3. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Polynucleotid, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (a) Polynucleotiden, die zumindest die reife Form des Polypeptids mit der abgeleiteten Aminosäuresequenz wie in 1 dargestellt codieren; (b) Polynucleotiden mit der codierenden Sequenz wie in 1 dargestellt, die zumindest die reife Form des Polypeptids codieren; (c) Polynucleotiden, die das Polypeptid mit der Aminosäuresequenz von zumindest der reifen Form des Polypeptids codieren, das durch die cDNA enthalten in ATCC 75946 codiert wird; (d) Polynucleotiden mit der codierenden Sequenz der cDNA enthalten in ATCC 75946, die zumindest die reife Form des Polypeptids codieren; (e) Polynucleotiden, die ein Fragment eines Polypeptids codieren, das durch ein Polynucleotid nach einem von (a) bis (d) codiert wird, wobei das Fragment Metalloproteinaseaktivität hemmt; (f) Polynucleotiden, deren Komplementärstrang unter stringenten Bedingungen mit einem Polynucleotid wie in einem von (a) bis (d) definiert hybridisiert, und welche ein Polypeptid codieren, das Metalloproteinaseaktivität hemmt; (g) Polynucleotiden, die zumindest zu 95% identisch sind mit einem der Polynucleotide wie in einem von (a) bis (d) definiert, und welche ein Polypeptid codieren, das Metalloproteinaseaktivität hemmt; oder der Komplementärstrang eines solchen Polynucleotids.
Polynucleotid nach Anspruch 1, welches DNA ist.
DNA nach Anspruch 2, welche genomische DNA ist.
Polynucleotid nach Anspruch 1, welches RNA ist.
Vektor, der das Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 enthält.
Vektor nach Anspruch 5, wobei das Polynucleotid funktionell verknüpft ist mit Expressionskontrollsequenzen, die Expression in prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszellen ermöglichen.
Wirtszelle, die mit dem Vektor nach Anspruch 5 oder 6 gentechnisch verändert ist.
Verfahren für die Herstellung eines Polypeptids, das durch das Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 codiert wird, umfassend das Züchten der Wirtszelle nach Anspruch 7 und das Gewinnen des Polypeptids, das durch das Polynucleotid codiert wird, aus der Kultur.
Verfahren zur Herstellung von Zellen, die in der Lage sind, ein Polypeptid zu exprimieren, das von dem Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 codiert wird, umfassend das gentechnische Modifizieren der Zellen in vitro mit dem Vektor nach Anspruch 5 oder 6.
Polypeptid mit der Aminosäuresequenz, die durch ein Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 codiert wird, oder das erhältlich ist durch das Verfahren nach Anspruch 8.
Polypeptid nach Anspruch 10, wobei das Polypeptid eine Aminosäuresequenz hat, bestehend aus: (a) der Aminosäuresequenz des Polypeptids wie in 1 dargestellt; (b) der Aminosäuresequenz der reifen Form des Polypeptids wie in 1 dargestellt; (c) der Aminosäuresequenz des Polypeptids, das durch die cDNA enthalten in ATCC 75946 codiert wird; (d) der Aminosäuresequenz des reifen Polypeptids, das durch die cDNA enthalten in ATCC 75946 codiert wird; (e) der Aminosäuresequenz eines Fragments des Polypeptids nach einem von (a) bis (d), wobei das Fragment Metalloproteinaseaktivität hemmt; und (f) der Aminosäuresequenz eines Polypeptids, das durch ein Polynucleotid codiert wird, das zumindest zu 95% identisch ist mit dem Polynucleotid wie in 1 dargestellt, wobei das Polypeptid Metalloproteinaseaktivität hemmt.
Antikörper, der spezifisch an das Polypeptid nach Anspruch 11(a) bis (e) bindet.
Antagonist des Polypeptids nach Anspruch 11, wobei der Antagonist den Antikörper nach Anspruch 12 oder ein Antisensekonstrukt ist, welches spezifisch hybridisiert mit einem Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1(a) bis 1(f) oder nach den Ansprüchen 2 bis 4, insofern diese sich auf Ansprüche 1(a) bis 1(f) rückbeziehen.
Verfahren zur Identifizierung von Antagonisten und Agonisten von TIMP-4, umfassend: (a) das Kombinieren von Zellen, dem Polypeptid nach Anspruch 10, einem MMP, einer zu screenenden Verbindung und einer Reaktionsmischung umfassend ein Substrat, das von dem MMP abgebaut werden kann, wobei das Substrat markiert ist; (b) das Messen der Konzentration des Markers, der von dem Substrat freigesetzt wird; und (c) das Bestimmen, ob die Verbindung die Freisetzung des Markers von dem Substrat verstärkt oder blockiert.
Arzneimittel, umfassend das Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 4, den Vektor nach den Ansprüchen 5 oder 6, das Polypeptid nach Anspruch 10, den Antikörper nach Anspruch 12 und/oder den Antagonisten nach Anspruch 13 und gegebenenfalls einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Diagnostische Zusammensetzung, umfassend das Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder den Antikörper nach Anspruch 12.
Verfahren zur Diagnose einer Erkrankung oder der Anfälligkeit für eine Erkrankung, die in Verbindung steht mit einer Mutation in der TIMP-4-Nucleinsäuresequenz in einer Nucleinsäure, die von einem Individuum erhalten wurde, umfassend: (a) das Inkontaktbringen der Nucleinsäuren mit einer Sonde umfassend das Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 unter Hybridisierungsbedingungen, und (b) das Bestimmen einer Mutation in der TIMP-4-Nucleinsäuresequenz.
Diagnostisches Verfahren zur Analyse der Anwesenheit eines TIMP-4-Polypeptids in einer Probe, die von einem Wirt erhalten wurde, umfassend: (a) das Inkontaktbringen der Probe mit dem Antikörper nach Anspruch 12; und (b) das Bestimmen der Menge des gebundenen Antikörpers und dadurch das Nachweisen des TIMP-4-Polypeptids.
Verwendung des Polypeptids nach Anspruch 10, des Polynucleotids nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder des Vektors nach Anspruch 5 oder 6 für die Herstellung eines Arzneimittels zur Prävention von Tumorinvasion und Angiogenese und anschließenden Metastasen, zur Behandlung von arthritischen Erkrankungen, Knochenresorptionserkrankungen, zur Prävention der fortgeschrittenen Kollagenschädigung, die in Verbindung mit Diabetes auftritt, der rezessiven Varianten der dystrophischen Epidermolysis bullosa, periodontaler Erkrankung und der damit verbundenen Folgen der Produktion von Kollagenase durch das Zahnfleisch, zur Hemmung von PMNL-Kollagenasefreisetzung nach zellulärer Infiltration in das entzündete Zahnfleisch, einschließlich der Bekämpfung der erhöhten Anfälligkeit von Diabetespatienten für periodontale Erkrankungen, zur Behandlung von Hornhautulzeration, zur Prävention von Tumorzellenmetastase, zur Behandlung von Restenose-Alveolitis, Asthma, Psoriasis, Glomerulosklerose oder septischem Schock.
Verwendung des Antagonisten nach Anspruch 13 und/oder des Polynucleotids nach einem der Ansprüche 1 bis 4 für die Herstellung eines Arzneimittels für die Reparatur von Gewebe und das Umbilden von Narbengewebe.
Antikörper nach Anspruch 12, welcher ein polyclonaler Antikörper ist.
Antikörper nach Anspruch 12, welcher ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (a) einem monoclonalen Antikörper; (b) einem chimären Antikörper; (c) einem humanisierten Antikörper; (d) einem Einzelketten-Antikörper; und (e) einem Fab-Fragment.
Antikörper nach Anspruch 12, welcher markiert ist.
Antikörper nach Anspruch 23, wobei die Markierung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (a) einem Enzym; (b) einem fluoreszenten Marker; und (c) einem radioaktiven Marker.
Antikörper nach Anspruch 12, wobei der Antikörper in einem Westernblot oder in einem ELISA oder in beiden spezifisch an das Polypeptid bindet.
Zelle, die den Antikörper nach Anspruch 12 produziert.
Hybridom, das den Antikörper nach Anspruch 12 produziert.