ES2281373T3 - Regeneracion y transformacion de remolacha. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para la preparación de una planta transgénica de remolacha, comprendiendo el procedimiento: seleccionar una plántula de remolacha, comprendiendo la plántula una región cotiledónea y una región de hipocótilo; retirar la región cotiledónea y la mitad superior de la región de hipocótilo de la plántula; poner en contacto la región cotiledónea y la mitad superior de la región de hipocótilo con medio de micropropagación para formar un brote de micropropagación, comprendiendo el brote de micropropagación al menos una hoja o porción de la misma que comprende una base de la hoja, en la que dicha base de hoja comprende la posición inferior de la hoja donde la hoja está unida al brote micropropagado; retirar una hoja del brote de micropropagación en la base de la hoja; poner en contacto la base de la hoja con Agrobacteria formando un tejido que comprende una célula transgénica de remolacha; cultivar dicho tejido para formar un brote transgénico; cultivar el brote transgénico para formar un brote transgénico enraizado; y hacer crecer el brote transgénico enraizado para formar una planta transgénica de remolacha capaz de expresar una secuencia estructural de ácido nucleico exógeno, en el que: la Agrobacteria comprende un vector; y el vector comprende, operativamente unido en orientación 5'' a 3'': un promotor que dirige la transcripción de una secuencia estructural de ácido nucleico exógeno; una secuencia estructural de ácido nucleico exógeno; y un terminador de transcripción 3''.
Description
Regeneración y transformación de remolacha.
La invención se refiere a la preparación de
plantas de remolacha genéticamente transformadas. En particular, se
describen procedimientos y materiales para la transformación de
plantas de remolacha por medio de transferencia genética mediada
por Agrobacterium tumefaciens.
La sacarosa, conocida comúnmente como azúcar,
explica aproximadamente el 11% de la ingesta calórica de los seres
humanos en todo el mundo. La remolacha (Beta vulgaris) es una
de las dos fuentes agrícolas principales de azúcar comestible.
Aproximadamente el 40% del suministro de azúcar de todo el mundo
deriva de la remolacha, con la caña de azúcar como la otra fuente
agrícola principal de azúcar, que explica aproximadamente el 60%.
Países en Europa y en la antigua Unión Soviética producen
prácticamente todo su azúcar a partir de plantas de remolacha. En
los Estados Unidos, aproximadamente 30% del azúcar consumido deriva
de la remolacha.
Las plantas de remolacha son susceptibles de
sufrir una variedad de patógenos y pestes. Los daños virales,
fúngicos, bacterianos y producidos por insectos pueden reducir mucho
el rendimiento y la calidad del azúcar recogido. Las mejoras en la
resistencia a estos factores han sido lentas mediante procedimientos
clásicos de hibridación. La transformación de plantas de remolacha
por medio de técnicas modernas de biología molecular es atractiva,
aunque hasta recientemente, la remolacha ha probado ser altamente
resistente a la transformación.
Lindsey y Jones (Plant Cell Rep., 8:
71-74, 1989) describen la transformación de
protoplastos de remolacha por electroporación.
Catlin (Plant Cell Rep., 9:
285-288, 1990) informó del efecto de antibióticos en
la inhibición de la inducción de formación de callos y de
regeneración de plantas a partir de cotiledones de remolacha. Se
descubrió que la formación de callos es dependiente del genotipo.
Se descubrió que los antibióticos inhiben la formación de brotes.
Catlin propone que la regeneración por medio de explantes de
cotiledones combinada con protocolos de selección de antibióticos
probaría tener utilidad en la selección de callos transformados de
remolacha.
Jacq y col. (Plant Cell Rep., 12:
621-624, 1993) informaron de los efectos del
genotipo, acetosiringona, duración del precultivo y cocultivo en la
transformación de remolacha mediada por Agrobacterium. Se
escindieron explantes de hipocótilos y de cotiledones de plántulas
y se cocultivaron con Agrobacteria. Los transformantes se
cuantificaron por medio de ensayos histoquímicos y fluorométricos
de GUS. No se demostraron plantas transformadas.
Hall y col. (Documento WO 95/10178) describen un
procedimiento para transformar protoplastos de remolacha por medio
de un procedimiento con polietilenglicol, seguido por selección y
regeneración. Las frecuencias de transformación fueron de entre 2,5
x 10^{-5} y 6,1 x 10^{-4}.
Lindsey y Gallois (J. Exp. Botany, 41:
529-536, 1990) describen la transformación de
remolacha con Agrobacterium tumefaciens que contiene
vectores binarios. Se inocularon cortes de tejidos de bases de
brotes por inmersión en una suspensión bacteriana líquida, se
indujo la producción de brotes con
6-aminobencilpurina, y se seleccionó por
resistencia a antibióticos. Se transfirieron los brotes a medio de
inducción de raíces que contenía ácido
1-naftalenacético y kanamicina. Se obtuvo muy poco o
ningún éxito en la regeneración de brotes a partir de tejidos de
hojas.
Hall y col. (Nature Biotechnol. 14:
1133-1138, 1996) describen un procedimiento para
generar plantas de remolacha transgénicas a partir de células
guarda de los estomas de protoplastos. Se llevó a cabo una
transformación de ADN con polietilenglicol en protoplastos
derivados de células guarda de estomas. La selección de
transformantes se logró por resistencia a bialafos. La eficacia de
transformación estable para protoplastos fue entre 1,2 y 5,2 x
10^{-4}. Los protoplastos se regeneraron en callos y plantas.
Hayakawa y col. (Proc. Jap. Sugar Beet Technol.
36: 130-135, 1994) describen un procedimiento para
transformación de remolacha mediado por Agrobacterium. Las
semillas germinaron y se retiraron los cotiledones. Se dejaron
crecer los cotiledones hasta la aparición de hojas. Se cortaron
trozos de hojas y se transfirieron al medio para permitir la
formación de brotes. Se usaron los brotes para formar explantes, que
posteriormente se transformaron con Agrobacterium. Se
permitió que los explantes transformados formaran brotes, y
enraizaran posteriormente en medio adecuado.
Fry y col. (Poster, Gordon Research Conference
on Plant Cell and Tissue Culture, 11-16 de Junio,
1989) describieron la transformación y regeneración de explantes de
cotiledones de remolacha inoculados con Agrobacterium
tumefaciens que contenían secuencias de ácidos nucleicos
exógenas.
A pesar de la cantidad de procedimientos de
transformación de remolacha disponibles, existe la necesidad de un
procedimiento de transformación más eficaz, que proporcione una
fuente constante de material de plantas para posteriores
experimentos, y que proporcione una alternativa a los procedimientos
existentes. La presente invención usa explantes de hojas en un
procedimiento de transformación mediado por Agrobacterium que
permite que el material de las plantas restante se propague in
vitro para futuros experimentos de transformación. La presente
invención proporciona procedimientos mejorados de producción de
plantas de remolacha transgénicas para impartir cualidades
deseables por ingeniería genética.
En un esfuerzo para desarrollar procedimientos
para la transformación eficaz de plantas de remolacha, se descubrió
que varias etapas de la invención son beneficiosas para lograr
mejores resultados y simplicidad experimental.
En un aspecto de la presente invención, se
descubrió que los explantes de hojas son beneficiosos para la
transformación posterior y tales explantes se prepararon fácilmente
a partir de hojas de brotes micropropagados. Los cultivos
micropropagados permiten al científico mantener un cultivo continuo,
reduciendo significativamente el tiempo que supone la preparación
de plantas de remolacha transgénicas. Con la facilidad de
mantenimiento de los cultivos micropropagados, un científico no
tiene que germinar semillas cada vez que comienza un procedimiento
de transformación. La micropropagación es además beneficiosa para
reducir o eliminar la aparición de tejidos quiméricos
indeseados.
Las características y detalles de la invención
se apreciarán más a la luz de la siguiente descripción detallada de
la invención.
Las siguientes figuras forman parte de la
presente memoria descriptiva y se incluyen además para demostrar
ciertos aspectos de la presente invención. La invención puede
entenderse mejor por referencia a uno o más de estos dibujos en
combinación con la descripción detallada de formas de realización
detalladas presentadas en este documento.
La presente invención describe un procedimiento
para la transformación eficaz de plantas de remolacha usando la
bacteria Agrobacterium tumefaciens como un agente de
administración de una secuencia de ácido nucleico exógena. La
secuencia de ácido nucleico exógena está de preferencia en la forma
de un vector de transformación de plantas. En la presente invención
puede usarse cualquier vector adecuado para la transformación de
plantas. Un plásmido o vector adecuado para la transformación de
plantas contiene típicamente un marcador de selección o de
información y elementos reguladores asociados como se describen,
junto con uno o más ácidos nucleicos capaces de expresarse en una
planta en una manera suficiente para conferir una característica o
un fenotipo particular deseable a la planta. Los ejemplos de genes
estructurales adecuados de interés abarcados por la presente
invención incluyen, pero no se limitan a, genes para la tolerancia a
insectos o pestes (bacterianas, fúngicas, por nematodos);
tolerancia a herbicidas; genes para mejoras de la calidad tales como
rendimiento, mejoras nutricionales; tolerancias ambientales o de
estrés; o cualquier
cambio deseable en la fisiología, crecimiento, desarrollo, morfología de la planta o producto(s) de la(s) planta(s).
cambio deseable en la fisiología, crecimiento, desarrollo, morfología de la planta o producto(s) de la(s) planta(s).
Como alternativa, las secuencias codificadoras
de ADN pueden afectar estos fenotipos codificando una molécula de
ARN no traducible que causa la inhibición dirigida de la expresión
de un gen endógeno, por ejemplo por medio de mecanismos mediados
por cosupresión o antisentido (ver, por ejemplo, Bird y col.,
Biotech. Gen. Engin. Rev. 9:207, 1991). El ARN podría ser también
una molécula catalítica de ARN (es decir, una ribozima) modificada
por ingeniería genética para escindir un producto de ARNm endógeno
deseado (ver por ejemplo, Gibson y Shillitoe, Mol. Biotech. 7:125,
1997). Por ello, cualquier gen que produce una proteína o ARNm que
expresa un cambio de fenotipo o de morfología de interés es útil
para la práctica de la presente invención.
Los ejemplos de ácidos nucleicos que pueden
introducirse por medio de los procedimientos de la presente
invención incluyen por ejemplo, secuencias de ADN o genes de otras
especies, o genes o secuencias que se originan con o están
presentes en las mismas especies, pero se incorporan en células
receptoras por procedimientos de ingeniería genética más que por
técnicas clásicas de reproducción o hibridación. Sin embargo, el
término exógeno se refiere también a genes que no están normalmente
presentes en la célula que se está transformando; o tal vez
simplemente no están presentes en la forma, estructura, etc., como
se encuentran en el segmento de ADN o gen transformante; o genes
que normalmente están presentes además del que uno desea, por
ejemplo, sobreexpresar. Por ello, el término gen o ADN
"exógeno" pretende referirse a cualquier gen o segmento de ADN
que se introduce en una célula receptora, sin tener en cuenta si un
gen similar pueda ya estar presente en tal célula. El tipo de ADN
incluido en ADN exógeno puede incluir ADN que ya está presente en
la célula de la planta, ADN de otra planta, ADN de un organismo
diferente, o un ADN generado de manera externa, tal como una
secuencia de ADN que contiene un mensaje complementario de un gen,
o una secuencia de ADN que codifica una versión sintética o
modificada de un gen.
Los vectores de transformación de plantas
generalmente contienen una o más secuencias de ácido nucleico
codificadoras de interés bajo el control transcripcional de
secuencias reguladoras 5' y 3'. Tales vectores generalmente
comprenden, unidos operativamente en la secuencia en la dirección 5'
a 3', una secuencia promotora que dirige la transcripción de una
secuencia estructural de ácido nucleico secuencia abajo en una
planta; opcionalmente, una secuencia líder 5' no traducida; una
secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de interés; y
una región 3' no traducida que codifica una señal de poliadenilación
que funciona en células de plantas para causar la terminación de la
transcripción y la adición de nucleótidos de poliadenilato al
extremo 3' del ARNm que codifica la proteína. El promotor puede ser
homólogo o heterólogo a la secuencia estructural del ácido
nucleico. Las secuencias reguladoras 5' a 3' típicas incluyen un
sitio de inicio de la transcripción, un sitio de unión a ribosoma,
una señal de procesamiento del ARN, un sitio de terminación de la
transcripción, y/o una señal de poliadenilación. Los vectores de
transformación de plantas también contienen generalmente un
marcador de selección o de información. La expresión de la secuencia
del marcador de selección o de información da como resultado un
fenotipo que permite la diferenciación de tejidos de remolacha
transgénica y no transgénica.
En la presente invención puede usarse cualquier
marcador de selección adecuado para la transformación de plantas.
Los ejemplos de marcadores de selección informados como funcionales
en plantas incluyen EPSPS (Klee y col., Mol. Gen. Genet.
210(3): 437, 1987), neomicina fosfotransferasa (Loopstra y
col., Plant Mol. Biol. 15(1): 1, 1990), higromicina
fosfotransferasa (Meijer y col., Plant Mol. Biol. 16(5): 807,
1991), resistencia a metotrexato (Irdani y col., Plant Mol. Biol.
37(6): 1079, 1998), fosfinotricina acetil transferasa (Shen y
col., J. Gen. Virol. 76: 965, 1995), y resistencia a clorsulfuron
(Lee y col., Plant Cell 2(5): 415, 1990). Los marcadores de
información descritos como funcionales en plantas incluyen GFP (Niwa
y col., Plant J. 18(4): 455, 1999), GUS (Suzuki y col.,
Plant Cell. Physiol. 40(3): 289, 1999), CAT (Leisy y col.,
Plant Mol. Biol. 14(1): 41, 1990), y luciferasa (Macknight y
col., Plant Mol. Biol. 27(3): 457, 1995). En algunos casos,
la secuencia codificadora estructural de ácido nucleico puede
también funcionar como la secuencia del marcador de selección o de
información.
A la luz de esta descripción, resultarán
evidentes para los expertos en la técnica otros numerosos genes
marcadores de selección o de información posibles, elementos
reguladores, y otras secuencias de interés. Por consiguiente, la
anterior discusión tiene la intención de ser ejemplar más que
exhaustiva.
En particular, la invención está dirigida hacia
un procedimiento para la preparación de plantas transgénicas de
remolacha, comprendiendo el procedimiento: seleccionar una plántula
de remolacha, comprendiendo la plántula una región cotiledónea y
una región de hipocótilo; retirar la región cotiledónea y la mitad
superior de la región de hipocótilo de la plántula; poner en
contacto la región cotiledónea y la mitad superior de la región de
hipocótilo con medio de micropropagación para formar un brote de
micropropagación, comprendiendo el brote de micropropagación al
menos una hoja o porción de la misma que incluye la base de la hoja
en la que dicha base de hoja comprende la posición inferior de la
hoja donde la hoja está unida al brote micropropagado; retirar una
hoja del brote de micropropagación separando la hoja en la base de
la hoja; y poner en contacto el explante de la hoja en el área de
la base de la hoja con Agrobacteria. La hoja puede separarse
en la base de la hoja previo a la inoculación con
Agrobacterium por cualquier cantidad de procedimientos, pero
de preferencia se corta la hoja en la base de la hoja usando un
instrumento adecuado tal como un escalpelo y el área de corte se
pone en contacto con el cultivo de Agrobacterium. El explante
se cocultiva con Agrobacteria, en el que la
Agrobacteria comprende un vector, comprendiendo el vector,
operativamente unido en la orientación 5' a 3': un promotor que
dirige la transcripción de una secuencia estructural de ácido
nucleico; una secuencia estructural de ácido nucleico; y un
terminador de transcripción 3', y tras la incubación con
Agrobacterium, el explante infectado de la hoja comprende
una célula transgénica de remolacha.
El explante de hoja comprende la base de la hoja
definida en este documento como la porción inferior de la hoja
donde la hoja contacta con la región de la base del explante (ver
Figuras 5 y 6 para ilustraciones del cultivo micropropagado de
remolacha). En la presente invención puede usarse cualquier hoja que
comprende una base de hoja. Puede usarse la hoja entera o cualquier
porción de la misma que comprende la base de la hoja. De
preferencia, para el procedimiento de transformación se escinde la
hoja en la base de la hoja y se usa la hoja intacta que comprende
la base de la hoja. La base de la hoja comprende la porción inferior
de las hojas donde las hojas están unidas al brote micropropagado.
Por consiguiente el explante de hoja incluye cualquier hoja o
porción de una hoja que incluye la base de la hoja. En consecuencia,
el explante de hoja puede incluir pero no está limitado al 10%
inferior de la hoja, el 25% inferior, 50%, o la hoja entera o
porciones de la misma, comprendiendo todos una base de hoja. El
cultivo micropropagado de remolacha comprende múltiples capas de
hojas que están unidas en la base de hoja. Por consiguiente, puede
usarse cualquier hoja en cualquier capa incluyendo cualquier hoja
interna o externa que comprende una base de hoja (ver Figuras 5 y
6). De preferencia, se seleccionan las hojas más externas de modo
que las hojas más internas se dejan intactas. Las hojas restantes
pueden micropropagarse o almacenarse y cultivarse in vitro.
Las hojas restantes y las hojas emergidas nuevas pueden usarse más
tarde como una fuente de explante para futuros experimentos.
La Agrobacteria puede ser generalmente
cualquier Agrobacteria, y de preferencia es Agrobacterium
tumefaciens. Las cepas de preferencia incluirán pero no están
limitadas a la cepa C58 de Agrobacterium tumefaciens, una
cepa de tipo nopalina que se usa para mediar la transferencia de ADN
en células de plantas, cepas de tipo octopina tales como LBA4404 o
cepas de tipo succinamopina, por ejemplo, EHA101 o EHA105. El uso de
estas cepas para la transformación de plantas ha sido reseñado y los
procedimientos son familiares para los expertos en la técnica. La
secuencia estructural de ácido nucleico puede ser cualquier
secuencia transcribible que confiere una propiedad deseable a la
planta. De preferencia, la secuencia estructural de ácido nucleico
codifica una proteína o una secuencia de ARN complementaria.
Una forma de realización alternativa está
dirigida hacia procedimientos para la preparación de plantas
transgénicas de remolacha a partir de un cultivo de
micropropagación. Se cultiva un cultivo de micropropagación para
formar un brote micropropagado, comprendiendo el brote
micropropagado al menos un explante de hoja que incluye una base de
hoja; retirando una hoja en la base de la hoja del brote
micropropagado; y poniendo en contacto el explante de hoja en la
base de la hoja con Agrobacteria en el que: la
Agrobacteria comprende un vector, comprendiendo el vector,
operativamente unido en la orientación 5' a 3': un promotor que
dirige la transcripción de una secuencia estructural de ácido
nucleico; una secuencia estructural de ácido nucleico; y un
terminador de transcripción 3'. Tras la incubación con
Agrobacterium el explante de hoja infectado comprende una
célula transgénica de remolacha. La Agrobacteria puede
generalmente ser cualquier Agrobacteria, y de preferencia es
Agrobacterium tumefaciens. La secuencia estructural de ácido
nucleico puede ser cualquier secuencia transcribible que confiere
una propiedad deseable a la planta. De preferencia, la secuencia
estructural de ácido nucleico codifica una proteína o una secuencia
de ARN complementaria.
Como se estableció anteriormente, la invención
proporciona un procedimiento para la preparación de plantas
transgénicas de remolacha. El procedimiento; de preferencia
comprende seleccionar una plántula de remolacha, comprendiendo la
plántula de remolacha una región cotiledónea y una región de
hipocótilo; retirar la región cotiledónea y la mitad superior de la
región del hipocótilo de la plántula; poner en contacto la región
cotiledónea y la mitad superior de la región del hipocótilo con
medio de micropropagación para formar un brote micropropagado,
comprendiendo el brote micropropagado al menos una hoja que
comprende una base de hoja; retirar una hoja del brote
micropropagado en la base de la hoja; poner en contacto la hoja con
Agrobacteria en el área de la base de la hoja para formar
una hoja infectada en la que: la Agrobacteria comprende un
vector, vector que comprende, unido operativamente en orientación
5' a 3': un promotor que dirige la transcripción de una secuencia
estructural de ácido nucleico, una secuencia estructural de ácido
nucleico, y un terminador de transcripción 3'; cultivar el explante
de hoja infectada para formar un brote transgénico; cultivar el
brote transgénico para formar un brote transgénico con raíz; y
hacer crecer el brote enraizado transgénico para formar una planta
transgénica de remolacha. La Agrobacteria puede generalmente
ser cualquier Agrobacteria, y de preferencia es Agrobacterium
tumefaciens. La secuencia estructural de ácido nucleico puede
ser cualquier secuencia transcribible que confiere una propiedad
deseable a la planta. De preferencia, la secuencia estructural de
ácido nucleico codifica una proteína o una secuencia de ARN
complementaria. La semilla de remolacha puede esterilizarse por
cualquier procedimiento aceptable, y de preferencia poniendo en
contacto la semilla de remolacha con hidróxido de sodio,
hipoclorito de sodio, etanol o captano. La semilla de remolacha se
hace germinar de preferencia en la oscuridad o en condiciones de
baja luminosidad. El medio de micropropagación puede generalmente
ser cualquier medio de micropropagación aceptado en la técnica. Los
ejemplos de medios adecuados incluirían pero no se limitan a medios
basados en MS (Murashige and Skoog, Physiol. Plant, 15:473, 1962) o
medios basados en N6 (Chu y col., Scientia Sinica, 18:659, 1975)
suplementados con aditivos de medios que pueden incluir pero no se
limitan a aminoácidos, macroelementos, hierro, microelementos,
vitaminas y sustancias orgánicas, carbohidratos, componentes
indefinidos de medios tales como hidrolizados de caseína, un agente
gelificante adecuado tal como una forma de agar, tal como una
agarosa de bajo punto de fusión o Gelrite si se desea. Resulta
familiar para los expertos en la técnica la diversidad de medios de
cultivo de tejidos, que cuando se suplementan adecuadamente,
soportan el crecimiento y desarrollo de tejidos de plantas y son
adecuados para la transformación y regeneración de plantas. Estos
medios de cultivo de tejidos pueden adquirirse como una preparación
comercial, o prepararse y modificarse a medida. El medio
seleccionado puede suplementarse con aditivos adecuados dependiendo
de la etapa en el procedimiento de transformación. Por ejemplo,
para micropropagación, puede usarse un medio denominado en este
documento como medio de micropropagación que soporta el crecimiento
y mantenimiento de tejido de plantas in vitro. Por
consiguiente, en otras etapas del procedimiento de transformación
que incluyen pero no se limitan a germinación, inducción de brotes,
e inducción de raíces, se usan medios suplementados con aditivos
adecuados y pueden incluir pero no se limitan a medios tales como
Linsmaier y Skoog (Linsmaier and Skoog, Physiol. Plant., 18:100,
1965), Uchimiya y Murashige (Uchimiya y Murashige, Plant Physiol.
54:936, 1974), medio de Gamborg (Gamborg y col., Exp. Cell Res.,
50:151, 1968), Medio de McCown para Plantas Leñosas (McCown y Loyd,
Hort. Science, 16:453, 1981), Nitsch y Nitsch (Nitsch y Nitsch,
Science 163:85-87, 1969), y Schenk y Hildebrandt
(Schenk y Hildebrandt, Can J. Bot. 50:199, 1972) o derivaciones de
estos medios suplementados adecuadamente. Los expertos en la
técnica saben que los medios y suplementos de medios tales como
nutrientes y reguladores de crecimiento para uso en diversas etapas
del mantenimiento y transformación de la planta, y en las etapas de
regeneración además de otras condiciones de cultivo tales como la
intensidad de luz durante la incubación, pH, y temperaturas de
incubación pueden optimizarse para una variedad particular de
planta.
El siguiente protocolo experimental es
ilustrativo de la invención. Un experto apreciará que pueden hacerse
diversas modificaciones en materiales, medios, duración de los
procedimientos, temperatura, y condiciones de luminosidad sin
apartarse de la invención.
Las semillas pueden esterilizarse usando
cualquier procedimiento aceptable. El siguiente procedimiento ha
demostrado ser eficaz.
Se agregan semillas de remolacha a una solución
que contiene hidróxido de sodio aproximadamente 1N y se agitan
durante aproximadamente una hora a temperatura ambiente. Se decanta
el líquido, y se aclaran las semillas con agua destilada para
eliminar el hidróxido de sodio residual. Se agrega agua fría, y se
agitan las semillas durante aproximadamente una hora. Se retiran
las semillas del líquido, y se retira una pequeña porción de la
cubierta de la semilla de cada embrión para exponer una porción del
embrión de la semilla. Se aclaran las semillas brevemente con
etanol al 95%. Se decanta la solución de etanol, y se agitan las
semillas en una solución diluida al 2,5% p/v de hipoclorito de
sodio durante aproximadamente veinte minutos. Se elimina el líquido,
y se aclaran las semillas en agua destilada estéril tres veces. Se
agrega captano (un polvo humedecible usado como una solución acuosa
para el control de ciertas enfermedades fúngicas, Micro Flo Co.,
Lakeland, FL) y una pequeña cantidad de agua estéril suficiente
para cubrir las semillas. Se empapan las semillas durante al menos
una hora. Si se desea se puede continuar empapando las semillas
durante la noche.
Las semillas pueden hacerse germinar usando
cualquier procedimiento aceptable. El siguiente procedimiento ha
demostrado ser eficaz. En vez de las formulaciones de medios que se
describen a continuación, pueden resultar adecuadas otras
formulaciones de medios que incluyen pero no se limitan a aquellas
descritas anteriormente para promover la germinación.
Se transfieren las semillas desde la suspensión
de captano a placas que contienen medio MSMO (Tabla 1). Se colocan
aproximadamente 15 semillas en cada placa de germinación de 100 X 25
mm. Se colocan las placas en bolsas, de preferencia en bolsas
plásticas sin agujeros. De preferencia las semillas se hacen
germinar en la oscuridad y se colocan las bolsas en la oscuridad a
aproximadamente 20ºC-25ºC, de preferencia a
aproximadamente 23ºC-24ºC. La incubación en la
oscuridad puede realizarse de cualquier manera que incluye pero no
se limita a colocar las bolsas en una caja de cartón sellada. La
duración óptima de almacenamiento en la oscuridad varía por
genotipo de remolacha, pero típicamente variará entre dos y cuatro
semanas. El recubrimiento de las semillas se retira cuidadosamente
de las plántulas germinadas, y posteriormente se transfieren las
plántulas a recipientes que contienen medio MSMO. Se incuban las
plántulas a aproximadamente 23ºC-24ºC durante
aproximadamente 1-5 días, de preferencia
aproximadamente 2 días. El fotoperíodo durante la incubación se
mantiene en un ciclo de aproximadamente 16:8 luz:oscuridad.
\vskip1.000000\baselineskip
Los cultivos de brotes micropropagados pueden
iniciarse usando cualquier procedimiento aceptable. El siguiente
procedimiento ha demostrado ser eficaz en el laboratorio. Otras
formulaciones de medios como las descritas anteriormente pueden ser
adecuadas para iniciar los cultivos de brotes micropropagados en
lugar de las formulaciones de medios que se describen a
continuación.
Se retira cuidadosamente la mitad inferior de la
región del hipocótilo de las plántulas germinadas. Se transfieren
la porción de las plántulas que contiene cotiledones y la porción
superior del hipocótilo al medio MSMO que contiene 0,1 mg/l de
6-bencilaminopurina. Tras tres semanas de incubación
con iluminación como anteriormente, se transfieren los brotes a
medio fresco. Tras otras tres semanas, las hojas pueden usarse para
la transformación. De preferencia, se usan las hojas más externas y
las hojas más internas se usan para mantener el tejido in
vitro. Para mantenimiento de los cultivos micropropagados, tras
retirar las hojas para la transformación posterior, se transfiere
la región apical y más interna de la hoja (generalmente
aproximadamente 0,5-3,0 cm) a medio fresco para
mantener los cultivos de brotes micropropagados (ver Figuras 5 y 6).
La Figura 5 ilustra una vista superior de un cultivo micropropagado
de remolacha. La Figura 6 ilustra una vista lateral que representa
las hojas externas, hojas internas, el área de base de hojas, y el
área de corte o de herida donde se retiran las hojas en la base de
la hoja. Los cultivos micropropagados de remolacha de preferencia se
transfieren a medio fresco al menos una vez al mes para mantener
cultivos sanos y una fuente lista de tejidos para transformación.
Manteniendo el tejido de remolacha de esta manera, se dispone
constantemente de material de explante adecuado para transformación
sin necesidad de iniciar cultivos a partir de semillas, ahorrando al
menos un mes en el procedimiento.
Los cultivos bacterianos pueden prepararse
usando cualquier procedimiento aceptable. El siguiente procedimiento
ha demostrado ser eficaz en el laboratorio. Otras formulaciones de
medios pueden ser adecuadas para preparar cultivos bacterianos en
lugar de las formulaciones de medios descritas a continuación. Puede
usarse cualquier cepa adecuada de Agrobacterium para la
participación en los procedimientos de la invención, y resulta de
preferencia Agrobacterium tumefaciens. Los procedimientos
para el crecimiento y mantenimiento de cultivos de
Agrobacterium son conocidos por aquellos expertos en la
técnica.
Los Agrobacterium tumefaciens que
contienen la secuencia de ADN exógeno para transferir a la remolacha
se plaquean típicamente en medio LB que contiene antibióticos
selectivos (ver por ejemplo medio LBsck suplementado con
espectinomicina, cloranfenicol, y kanamicina, Tabla 2). Las
bacterias se cultivan a temperatura ambiente durante
aproximadamente dos a tres días. Las bacterias se usan para iniciar
los cultivos líquidos en LBsck dos días antes de la transformación
con el objeto de lograr una densidad celular adecuada. Las bacterias
se diluyen aproximadamente 100 veces en medio ABsck (Tabla 3) o
medio YEP (Tabla 4). Se usan aproximadamente 2 ml de medio por
cultivo, aunque un experto en la técnica reconocerá que variar la
escala del cultivo no impactará significativamente en el
crecimiento de las bacterias. Se deja incubar los cultivos durante
la noche en un agitador orbital. Los cultivos bacterianos se
diluyen aproximadamente 12,5 veces en medio ABsck o medio ABsck
suplementado con acetosiringona 200 \muM, de preferencia con un
volumen total de aproximadamente 50 ml. Se colocan los cultivos en
un agitador orbital y se incuban aproximadamente a 26ºC durante la
noche. Se controla el cultivo hasta que alcanza una densidad
celular de aproximadamente 3,0 x 10^{9} células/ml, que
corresponde a una DO_{600} de aproximadamente 1. Se ajusta el
volumen con medio TXD (Tabla 5) para dar una densidad celular de
aproximadamente 1 x 10^{9} células/ml.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Sales de AB (500 ml): 10 g de NH_{4}Cl, 12,5 g
de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 1,5 g de KCl, 0,1 g de CaCl_{2} o
0,132 g de CaCl_{2}\cdot2H_{2}O, 25 mg de FeSO_{4} o 45,55
mg de FeSO_{4}\cdot7H2O.
Tampón de AB (500 ml): 39,33 g de
K_{2}HPO_{4}\cdot3H_{2}O o 30,0 g de K_{2}HPO_{4}, 11,5
g de NaH_{2}PO_{4}\cdot2H_{2}O.
Las placas de cocultivo pueden prepararse usando
cualquier formulación de medio aceptable. Pueden resultar adecuadas
otras formulaciones diferentes de las descritas a continuación.
Se vierte en las placas que contienen 1/10 de
medio MS (Tabla 6) de preferencia suplementado con acetosiringona
200 \muM y ácido galacturónico 1 mM. La acetosiringona y el ácido
galacturónico se agregan al medio MS tras el autoclavado. Se coloca
un papel de filtro estéril en la parte superior del medio sólido y
se humedece con medio TXD previo al uso con los explantes.
Los explantes pueden realizarse usando cualquier
procedimiento aceptable. El siguiente procedimiento ha demostrado
ser eficaz. Otras formulaciones de medios como las descritas
anteriormente pueden resultar adecuadas para realizar explantes en
lugar de las formulaciones de medios que se describen a
continuación.
Se escinden hojas de los brotes micropropagados
y se transfieren a una placa de petri que contiene papel de filtro
estéril humedecido con medio TXD. En la presente invención pueden
usarse hojas de cualquier parte del brote micropropagado. En
consecuencia, puede usarse cualquier hoja interna o externa para
posterior transformación. De preferencia se usan las hojas más
externas. La hoja incluye el filo de la hoja y la base de la hoja y
puede escindirse de cualquier manera. De preferencia se retiran las
hojas cortando la hoja en la base de hoja (ver Figura 6) para que la
hoja esté intacta en primer lugar y el sitio de la herida esté en la
base de la hoja. Tras escindir aproximadamente 25 hojas de los
brotes micropropagados, se transfieren los explantes al cultivo
bacteriano diluido y se incuban. La duración de la incubación de los
explantes de hojas con Agrobacterium puede durar cualquier
período de tiempo. De preferencia el período de incubación con
Agrobacterium es de hasta sesenta minutos, de más
preferencia aproximadamente quince a veinte minutos y la incubación
se realiza de una manera que expone el sitio de la herida al cultivo
de Agrobacterium. De preferencia el sitio más bajo de la
herida del explante de hoja en la base de la hoja está en contacto
con el cultivo de Agrobacterium. Se retiran los explantes del
cultivo bacteriano, se secan con papel de filtro estéril tal como
papel de filtro Whatman, y se transfieren a placas de cocultivo.
El período de cocultivo puede durar cualquier
período de tiempo, De preferencia la duración del cocultivo es de
hasta cinco días. De más preferencia, el período de cocultivo es
desde aproximadamente dos hasta cinco días. De más preferencia aún,
el período de cocultivo es de cuatro días. Se colocan las placas de
cocultivo en bolsas plásticas selladas y se incuban durante
aproximadamente cuatro días a aproximadamente
22ºC-24ºC. Se usa un fotoperíodo de aproximadamente
16:8 luz:oscuridad para la incubación.
De manera opcional, pueden escindirse las hojas
de brotes micropropagados como se describió anteriormente, y
transferirse directamente a placas de cocultivo durante un período
de precultivo durante la noche a aproximadamente
22ºC-24ºC previo al agregado del cultivo bacteriano.
Aunque es de preferencia el precultivo durante la noche, resulta
también eficaz precultivar al menos durante aproximadamente seis
horas. Tras el período de precultivo, se infectan los explantes con
Agrobacterium agregando la suspensión bacteriana directamente
a los explantes en las placas de cocultivo. Tras una incubación de
aproximadamente veinte minutos, pueden eliminarse las bacterias por
cualquier manera que incluye la aspiración y los explantes pueden
permanecer en las mismas placas durante el período de
cocultivo.
Los explantes pueden cultivarse y seleccionarse
usando cualquier procedimiento aceptable. El siguiente procedimiento
ha demostrado ser eficaz. Otras formulaciones de medios como las
descritas anteriormente pueden ser adecuadas para cultivo y
selección en lugar de las formulaciones de medios que se describen a
continuación.
Los explantes se transfieren de las placas de
cocultivo a un medio de cultivo. De preferencia, el medio de
cultivo es un medio basado en MS suplementado con 0,5 mg/l de
bencilaminopurina (BAP) o benciladenina (BA), 0,05 mg/l de ácido
1-naftalenacético, 500 mg/l de carbenicilina, y 100
mg/l de cefotaxima. Las condiciones de cocultivo pueden variar
dependiendo del marcador de selección. Para la selección con
glifosato de (N-fosfonometilglicina), se colocan
los explantes infectados en un medio de retardo sin el agregado del
agente selectivo glifosato. La duración del período de retardo
depende del genotipo usado. Se realizan experimentos con cada
genotipo para determinar la duración óptima del período de retardo.
Típicamente, el período de retardo puede presentarse durante hasta
diez días. De preferencia el período de retardo sin selección es de
aproximadamente dos a siete días. De más preferencia aún, el
período de retardo sin selección es de aproximadamente seis días a
aproximadamente 24ºC de preferencia en bolsas plásticas con
agujeros. Se realizan experimentos con cada genotipo para determinar
el nivel óptimo de agente selectivo. Para la selección con
glifosato, tras un período de retardo, se transfieren los explantes
infectados del medio de retardo (sin glifosato) a un medio basado en
MS suplementado con 0,50 mg/l de benciladenina, 0,05 mg/l de ácido
1-naftalenacético, 500 mg/l de carbenicilina, 100
mg/l de cefotaxima, y glifosato 0,05-0,10 mM (de
preferencia glifosato aproximadamente 0,075 mM). Los explantes
pueden cultivarse durante aproximadamente dos a cuatro semanas en
el medio de selección. De preferencia, los explantes se cultivan
durante aproximadamente tres, cuatro semanas aproximadamente a 24ºC,
de preferencia en bolsas plásticas con agujeros. Se usa un
fotoperíodo de aproximadamente 16:8 luz:oscuridad para el período de
cultivo. Los explantes se transfieren al mismo medio que contiene
el agente de selección adecuado cada tres semanas. Generalmente,
son suficientes dos a tres transferencias para identificar una
planta transgénica.
La micropropagación y el enraizamiento pueden
realizarse usando cualquier procedimiento adecuado. El siguiente
procedimiento demostró ser eficaz. Otras formulaciones de medios
como las descritas anteriormente pueden resultar adecuadas para la
micropropagación y el enraizamiento en lugar de las formulaciones de
medios que se describen a continuación.
La micropropagación es beneficiosa para reducir
o eliminar tejidos quiméricos indeseables. El uso de
micropropagación es especialmente útil para obtener las plantas
transgénicas deseadas y ahorra tiempo al eliminar la necesidad de
obtener material de plantas de partida a partir de semillas.
El tejido puede mantenerse en una cantidad de
recipientes de cultivo de tejidos que incluyen pero no se limita a
placas de petri y copas de sundae.
Los brotes transformados se transfieren al medio
de micropropagación que contiene medio basado en MS suplementado
con 0,5 mg/l de 6-benciladenina, 500 mg/l de
carbenicilina, y 100 mg/l de cefotaxima. Los brotes se cultivan y
dividen en este medio hasta la obtención del número deseado de
brotes. De preferencia, para la selección con glifosato, puede
agregarse glifosato al medio de micropropagación para ayudar en la
selección del material clónico. Por material clónico como se usa en
este documento se entiende que el brote entero está transformado y
no contiene material quimérico de plantas que está constituido por
tejido transformado y no transformado. Se enraizan los brotes
individuales en 1/2 de medio MS suplementado con 5 mg/l de ácido
indolbutírico, 100 mg/l de cefotaxima, y 500 mg/l de carbenicilina.
Las raíces deberían aparecer en aproximadamente 4-12
semanas. Los brotes enraizados pueden transplantarse en el suelo,
de preferencia Metro Mix 350 (Metro Mix es una marca registrada de
Scotts Company, Marysville, OH).
Los siguientes ejemplos se incluyen para
demostrar formas de realización de preferencia de la invención. Los
expertos en la técnica apreciarán que las técnicas descritas en los
ejemplos que siguen representan técnicas que los autores de la
invención han descubierto que funcionan bien en la práctica de la
invención, y por lo tanto puede considerarse que constituyen modos
de preferencia para su práctica. Sin embargo, los expertos en la
técnica podrían, a la luz de la presente descripción, apreciar que
pueden realizarse muchos cambios en las formas de realización
específicas que se describen y obtenerse un resultado igual o
similar sin apartarse del espíritu y alcance de la invención.
Todas las construcciones descritas en los
Ejemplos son vectores de transformación de plantas de doble borde
que contienen un origen de replicación de E. coli (ori322),
un origen de replicación de un amplio intervalo de huéspedes
(ori-V), y una región codificadora (Spc/Str) para
Tn7 adeniltransferasa, que confiere resistencia a espectinomicia y
a estreptomicina. Para la transformación de plantas, la cepa
bacteriana huésped usada fue Agrobacterium tumefaciens, cepa
ABI. El promotor, región codificadora y terminadores 3' se indican
entre paréntesis.
P-e35S es el promotor para ARN
35S de CaMV que contiene una duplicación de la región -90 a -300
como se describe en la Patente de EEUU Nº 5.424.200;
P-FMV es el promotor 35S del Virus del Mosaico de
Figwort como se describe en la Patente de EEUU Nº 5.378.619;
P-aa-chit es el promotor para
quitinasa ácida de Arabidopsis como describen Samac y Shah (Plant
Cell 3:1063, 1991); AEPSPS/CTP2 es la región del péptido de tránsito
de EPSPS de Arabidopsis (ácido
5-enolpiruvil-3-fosfoshikímico
sintasa) como se describe en la Patente de EEUU Nº 5.633.435;
CP4syn es la región codificadora para CP4 EPSPS (secuencia
sintética) como se describe en la Patente de EEUU Nº 5.633.435; fbp
es la secuencia codificadora para fructosa
1,6-bisfosfatasa de E. coli como describen
Hamilton y col. (Nucleic Acids Res. 16: 8707, 1988); glgC16 es un
gen de ADP glucosa fosforilasa de E. coli como se describe
en la Patente de EEUU Nº 5.648.249; mz SPS es la región codificadora
para sacarosa fosfato sintasa de maíz como se describe en la
Patente de EEUU Nº 5.750.869; E9 3' es el extremo 3' del gen rbc del
guisante E9, que funciona como una señal de poliadenilación; 7S es
la señal de terminación 3' del gen de la proteína de almacenamiento
de semillas de soya 7S; GUS: 1 es la secuencia codificadora del gen
de beta-glucuronidasa de E. coli (Jefferson,
R. A., Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU. 83: 8447-8451,
1987) modificada para contener un sitio de restricción NcoI
(CCATGG) en el codón de inicio.
Se escindieron las hojas más externas
directamente de los brotes micropropagados de remolacha y se usaron
como explantes para transformación. Se cortaron las hojas en la base
de la hoja y se incubaron con Agrobacterium para que el área
de la base de la hoja estuviera en contacto con el cultivo de
Agrobacterium. La cepa ABI de Agrobacterium
tumefaciens contenía la construcción pMON17303
(P-e35S/mz SPS/E9 3',
P-FMV/CP4syn/E9 3'; Figura 1) y el procedimiento de
transformación fue como el descrito en la Descripción Detallada de
la Invención. No se usó precultivo en las transformaciones que
usan esta construcción. La selección de células transformadas se
realizó usando glifosato 0,075 mM. A partir de 573 explantes, se
obtuvieron 3 plantas transformadas para una eficacia de
transformación de 0,5%.
Se escindieron las hojas más externas
directamente de los brotes micropropagados de remolacha y se usaron
como explantes para transformación. Se cortaron las hojas en la base
de la hoja y se incubaron con Agrobacterium para que el área
de la base de la hoja estuviera en contacto con el cultivo de
Agrobacterium. La cepa ABI de Agrobacterium
tumefaciens contenía la construcción pMON13819
(P-e35S/fbp/E9 3', P-FMV/CP4syn/E9
3'; Figura 2). La transformación y la selección se realizaron como
se describió en el Ejemplo 2 y en la Descripción Detallada de la
Invención. A partir de 1875 explantes, se obtuvieron 52 plantas
transformadas para una eficacia de transformación de 3%.
Se escindieron las hojas más externas
directamente de los brotes micropropagados de remolacha y se usaron
como explantes para transformación. Se cortaron las hojas en la base
de la hoja y se incubaron con Agrobacterium para que el área
de la base de la hoja estuviera en contacto con el cultivo de
Agrobacterium. La cepa ABI de Agrobacterium
tumefaciens contenía la construcción pMON13835
(P-e35S/mz SPS/E9 3',
P-FMV/CP4syn/E9 3'; Figura 3). La transformación y
la selección se realizaron como se describió en el Ejemplo 2 y en la
Descripción Detallada de la Invención. A partir de 2580
explantes, se obtuvieron 12 plantas transformadas para una eficacia
de transformación de 0,5%.
Se escindieron las hojas más externas
directamente de los brotes micropropagados de remolacha y se usaron
como explantes para transformación. Se cortaron las hojas en la base
de la hoja y se incubaron con Agrobacterium para que el área
de la base de la hoja estuviera en contacto con el cultivo de
Agrobacterium. La cepa ABI de Agrobacterium
tumefaciens contenía la construcción pMON 13851
(P-e35S/mzSPS/E93'/P-FMV/CP4syn/E93';
Figura 4). La transformación y la selección se realizaron como se
describió en el Ejemplo 2 y en la Descripción Detallada de la
Invención, con el agregado de una etapa de precultivo durante la
noche previo a contactar el tejido de las plantas con
Agrobacteria. A partir de 2890 explantes, se obtuvieron 14
plantas transformadas para una eficacia de transformación de
0,5%.
Claims (9)
1. Un procedimiento para la preparación de una
planta transgénica de remolacha, comprendiendo el procedimiento:
seleccionar una plántula de remolacha,
comprendiendo la plántula una región cotiledónea y una región de
hipocótilo;
retirar la región cotiledónea y la mitad
superior de la región de hipocótilo de la plántula;
poner en contacto la región cotiledónea y la
mitad superior de la región de hipocótilo con medio de
micropropagación para formar un brote de micropropagación,
comprendiendo el brote de micropropagación al menos una hoja o
porción de la misma que comprende una base de la hoja, en la que
dicha base de hoja comprende la posición inferior de la hoja donde
la hoja está unida al brote micropropagado;
retirar una hoja del brote de micropropagación
en la base de la hoja;
poner en contacto la base de la hoja con
Agrobacteria formando un tejido que comprende una célula transgénica
de remolacha;
cultivar dicho tejido para formar un brote
transgénico;
cultivar el brote transgénico para formar un
brote transgénico enraizado; y
hacer crecer el brote transgénico enraizado para
formar una planta transgénica de remolacha capaz de expresar una
secuencia estructural de ácido nucleico exógeno,
en el que:
la Agrobacteria comprende un vector;
y
el vector comprende, operativamente unido en
orientación 5' a 3': un promotor que dirige la transcripción de una
secuencia estructural de ácido nucleico exógeno; una secuencia
estructural de ácido nucleico exógeno; y un terminador de
transcripción 3'.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que la hoja o porción de la misma comprende una hoja externa o
porción de la misma.
3. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que la hoja o porción de la misma comprende una hoja interna o
porción de la misma.
4. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que la semilla de remolacha se germina en la oscuridad.
5. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que el medio de micropropagación comprende medio MSMO y
aproximadamente 0,1 mg/l de 6-aminobencilpurina.
6. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que el agente de selección comprende glifosato.
7. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que la Agrobacteria es Agrobacterium
tumefaciens.
8. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que la secuencia estructural de ácido nucleico codifica una
proteína o una secuencia de ARN complementaria.
9. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que la hoja o porción de la misma que comprende una base de hoja
se precultiva previamente a la etapa de contacto con
Agrobacteria.
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